專(zhuān)利名稱(chēng)：一個(gè)水稻dreb類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物中一種與脅迫相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因與應(yīng)用，特別是涉及及一個(gè)來(lái)源于水稻EREBP/AP2家族的DREB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因與其在培育抗逆性提高的植物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
干旱、鹽堿和寒冷等環(huán)境脅迫嚴(yán)重影響植物的生長(zhǎng)與發(fā)育，常使農(nóng)作物大面積減產(chǎn)。植物激素脫落酸(Abscisic Acid，ABA)是誘導(dǎo)果實(shí)脫落的主要激素，也是一類(lèi)重要的信號(hào)因子，在提高植物對(duì)環(huán)境脅迫的耐受性方面起到重要作用。ABA含量增加，可誘導(dǎo)植物產(chǎn)生適應(yīng)于脅迫的生理和分子方面的變化，例如關(guān)閉氣孔以阻止水分進(jìn)一步地散失，加強(qiáng)根部吸收水分的能力，細(xì)胞膜功能的變化，以及通過(guò)激活轉(zhuǎn)錄因子或轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子而誘導(dǎo)功能基因的表達(dá)等，從而使植物的耐脅迫性提高(Moons等，planta，1997，202443-454)。最新的分子生物學(xué)研究表明，大多數(shù)與脅迫相關(guān)基因的表達(dá)受外源ABA的誘導(dǎo)，證明脅迫基因和脫落酸信號(hào)途徑存在明顯的交叉。盡管目前人們對(duì)于脅迫信號(hào)傳導(dǎo)途徑的了解還不完全，但可以肯定ABA是一個(gè)主要的生理信號(hào)或″脅迫激素″，在相關(guān)基因?qū)γ{迫的響應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。
近幾年，國(guó)際上已克隆了一些參與脅迫信號(hào)傳導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子基因，如MYB，MYC，bZIP和DREB/CBF等，其中干旱應(yīng)答元件結(jié)合蛋白DREB/CBF(dehydration-responsiveelement binding proteins/c-repeat binding factors)是植物特異的轉(zhuǎn)錄因子乙烯應(yīng)答元件結(jié)合蛋白EREBP/AP2(ethylene responsive element bindingprotein/APETALA2)家族的亞家族，其顯著特征是含有高度保守、由大約60個(gè)氨基酸殘基組成的DNA結(jié)合域，即所謂的AP2結(jié)構(gòu)域(AP2 domain)，而該結(jié)構(gòu)域以外的其它序列缺少明顯的相似性。AP2結(jié)構(gòu)域包含兩個(gè)特別保守的元件，分別被命名為YRG元件和RAYD元件(Weigel等，Plant Cell，1995，7(4)388-389；OKAMURO等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1997，947076-7081)。EREBP/AP2家族在擬南芥中有144個(gè)成員，估計(jì)在水稻中的數(shù)目也大致相同。近年來(lái)，已從擬南芥等模式植物中克隆了一些DREB亞家族轉(zhuǎn)錄因子的基因，它們?cè)诳鼓嬷械闹匾哉饾u被認(rèn)識(shí)。例如，利用酵母單雜交技術(shù)，從擬南芥中分離出兩個(gè)DREB類(lèi)基因，DREB1A(CBF3)和DREB2A(Liu等，PlantCell，1998，101391-1406)。DREB1A受低溫脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，而DREB2A受干旱脅迫誘導(dǎo)表達(dá)。這兩個(gè)基因編碼的蛋白均能與抗旱相關(guān)基因rd29A啟動(dòng)子區(qū)的DRE元件結(jié)合并激活rd29A的表達(dá)。在轉(zhuǎn)基因擬南芥中，DREB1A超表達(dá)可顯著提高轉(zhuǎn)基因植株抗干旱和寒冷的能力。這類(lèi)DREB蛋白是不依賴(lài)于ABA的脅迫信號(hào)傳導(dǎo)鏈的重要組成部分。
此外，近期在對(duì)擬南芥EREBP/AP2類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子的研究中，克隆到了幾個(gè)受ABA誘導(dǎo)表達(dá)的DREB基因，如擬南芥的DREB1A，DREB1B，DREB1C和DREB1D(Knight等，PlantPhysiology，2004，1351710-1717)。DREB1D在轉(zhuǎn)基因擬南芥中超表達(dá)，可激活含有DRE/CRT元件的、與抗寒冷和干旱相關(guān)基因的表達(dá)(Haake等，Plant physiology，2002，130639-648)。ABI4是一個(gè)受ABA誘導(dǎo)表達(dá)的、編碼DREB轉(zhuǎn)錄因子的基因(Ruth R.Finkelstein等，Plant Cell，1998，101043-1054；Soderman等，Plant Physiology，2000，1241752-1765)。abi4的缺失突變體對(duì)脫落酸抑制萌發(fā)的作用不敏感，而ABI4的異位表達(dá)，則導(dǎo)致根部的生長(zhǎng)對(duì)脫落酸抑制作用更加敏感。在獨(dú)立篩選的擬南芥抗鹽突變體中，發(fā)現(xiàn)了ABI4位點(diǎn)的突變體(Quesada等，Genetics，2000，154421-436)，表明上述基因在植物的抗逆反應(yīng)中起到重要作用。
進(jìn)一步的轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)證明DREB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子基因在植物的抗逆分子育種中具有較大的實(shí)際意義和廣闊的應(yīng)用前景。如由煙草花葉病毒CaMV 35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)擬南芥DREB1B在轉(zhuǎn)基因煙草中表達(dá)，提高了轉(zhuǎn)基因煙草抗冷凍脅迫的能力(Jaglo-Ottosen等，Science，1998 Apr 3，280(5360)104-6)。超表達(dá)DREB1A的轉(zhuǎn)基因擬南芥與野生型植株相比，具有更強(qiáng)的耐干旱、鹽和冷凍脅迫的能力(Liu等，Plant Cell，1998，10，1391-1406)。超表達(dá)DREB1D顯著提高轉(zhuǎn)基因擬南芥的的干旱耐性(Haake等，Plant Physiology，2002，130639-648)。
Dubouzet等(Plant Journal，2003，33751-763)從水稻中分離了5個(gè)DREB類(lèi)基因(OsDREB1A，OsDREB1B，OsDREB1C，OsDREB1D和OsDREB2A)。其中OsDREB1A和OsDREB1B的表達(dá)受寒冷誘導(dǎo)，而OsDREB2A的表達(dá)受干旱和高鹽誘導(dǎo)。OsDREB1A的超表達(dá)導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因植物與野生型植株相比，對(duì)干旱、高鹽和冷凍脅迫具有更高的耐受性，表明EREBP/AP2轉(zhuǎn)錄因子中的DREB亞家族成員在水稻的抗逆反應(yīng)中同樣發(fā)揮著重要作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一個(gè)可受脫落酸誘導(dǎo)表達(dá)的水稻EREBP/AP2家族的DREB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因。
本發(fā)明所提供的DREB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子，名稱(chēng)為ARAG1，來(lái)源于稻屬水稻(Oryza sativaL.ssp.japonica)，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)序列表中的SEQ ID №1；2)將序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一至十個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有轉(zhuǎn)錄激活功能的調(diào)控植物抗逆性的蛋白質(zhì)。
序列表中的SEQ ID №1由225個(gè)氨基酸殘基組成，自氨基端(N端)第47位-第113位氨基酸殘基為保守的AP2結(jié)構(gòu)域，自氨基端第50位-第52位氨基酸殘基為AP2結(jié)構(gòu)域中保守的YRG元件，自氨基端第87位-第90位氨基酸殘基為AP2結(jié)構(gòu)域中保守的RAYD元件，自氨基端第62位為DBEB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子特別保守的纈氨酸(V14)，自氨基端第67位為DBEB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子特別保守的谷氨酸(E19)，自N端第37位-第43位氨基酸殘基為核定位序列，自N端第11位-第31位氨基酸殘基為富含絲氨酸(S)和蘇氨酸(T)的轉(zhuǎn)錄激活域。
編碼水稻DREB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子ARAG1的基因(ARAG1)，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №2的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №1的DNA序列；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
所述高嚴(yán)謹(jǐn)條件為在6×SSC或(6×SSPE)，0.1％SDS，2×Denhardt溶液中，65℃條件下雜交；在0.1×SSC，0.1％SDS溶液中，65℃條件下洗膜。
序列表中的SEQ ID №2由678個(gè)堿基組成，其編碼序列為自5’端第1-678位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)；自5’端第139到第339位堿基為AP2保守結(jié)構(gòu)域的編碼序列，自5’端第148到156第位堿基編碼AP2結(jié)構(gòu)域中保守的YRG元件，自5’端第259到第270位堿基編碼AP2結(jié)構(gòu)域中保守的RAYD元件，自5’端第184到第186位堿基編碼DBEB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子特別保守的纈氨酸(V14)，自5’端第199到第201位堿基編碼DBEB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子特別保守的谷氨酸(E19)，自5’端第109到第129位堿基編碼核定位序列，自5’端第31到第93位堿基為編碼富含絲氨酸(S)和蘇氨酸(T)的轉(zhuǎn)錄激活域。
含有本發(fā)明基因的表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和宿主菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
擴(kuò)增ARAG1中任一片段的引物對(duì)也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種提高植物耐逆性的方法。
本發(fā)明所提供的提高植物耐旱性的方法，是將所述水稻DREB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子ARAG1基因?qū)胫参锝M織或細(xì)胞，得到耐逆性提高的植物。
所述水稻DREB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子ARAG1基因可通過(guò)含有所述水稻DREB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子ARAG1基因的植物表達(dá)載體導(dǎo)入外植體；用于構(gòu)建所述植物表達(dá)載體的出發(fā)載體可為任意一種雙元農(nóng)桿菌載體或可用于植物微彈轟擊的載體等，如pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)。
使用ARAG1構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強(qiáng)型、組成型、組織特異型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，如花椰菜花葉病毒(CAMV)35S啟動(dòng)子、泛生素基因Ubiquitin啟動(dòng)子(pUbi)等，它們可單獨(dú)使用或與其它的植物啟動(dòng)子結(jié)合使用；此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個(gè)序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號(hào)和起始密碼子的來(lái)源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來(lái)自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。
為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所用植物表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入可在植物中表達(dá)的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(GUS基因、螢光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標(biāo)記物(慶大霉素標(biāo)記物、卡那霉素標(biāo)記物等)或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因(如抗除莠劑基因)等。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標(biāo)記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。
以pCAMBIA 1302為出發(fā)載體，構(gòu)建的含有所述水稻DREB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子ARAG1基因的植物表達(dá)載體為p1302-35s-ARAG1-GFP。
攜帶有本發(fā)明ARAG1的植物表達(dá)載體可通過(guò)使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞或組織培育成植株。被轉(zhuǎn)化的植物宿主既可以是水稻、小麥、大豆、煙草、擬南芥、玉米或棉花等。
本發(fā)明提供了一個(gè)來(lái)源于水稻EREBP/AP2家族的DREB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子。實(shí)驗(yàn)證明，其編碼基因ARAG1可受脫落酸誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)低濃度的ABA處理30分鐘，可將該基因的表達(dá)量(以轉(zhuǎn)錄本判斷)提高3倍以上。此外，干旱、高鹽等逆境脅迫也能誘導(dǎo)該基因表達(dá)。利用ARAG1的反義基因載體敲除(抑制)內(nèi)源ARAG1的表達(dá)，顯著增加了轉(zhuǎn)基因植株對(duì)ABA的敏感性。利用基因超表達(dá)載體增加該基因在體內(nèi)的表達(dá)量，可顯著提高轉(zhuǎn)基因植株對(duì)干旱、高鹽等逆境脅迫的耐性。因此，通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將本發(fā)明的基因?qū)胫参锼拗鳎傻玫娇垢珊?、高鹽等逆境脅迫能力增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植物(作物)，并培育出抗霉雨誘導(dǎo)的在穗發(fā)芽的新品種，如對(duì)在水飽和介質(zhì)中生長(zhǎng)至3葉期的野生型對(duì)照與ARAG1超表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株，進(jìn)行干旱處理(缺水)9天，對(duì)照幼苗完全死亡，而超表達(dá)ARAG1的轉(zhuǎn)基因植株的幼苗約有50％仍能存活；另一方面，由于ABA是誘導(dǎo)果實(shí)脫落的主要激素，因而該基因也可用于防止果實(shí)脫落等分子育種中。本發(fā)明在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。


圖1為RT-PCR半定量法分析ARAG1在水稻不同器官中表達(dá)特性的結(jié)果圖2為RT-PCR半定量法分析受低溫、ABA和干旱短時(shí)間脅迫誘導(dǎo)后ARAG1表達(dá)特性的結(jié)果圖3A為RT-PCR半定量法分析受不同濃度ABA(2、10、50和100μM)處理0.5h后ARAG1表達(dá)特性的結(jié)果圖3B為RT-PCR半定量法分析受不同濃度ABA(2、10、50和100μM)處理1h后ARAG1表達(dá)特性的結(jié)果圖3C為RT-PCR半定量法分析受不同濃度ABA(2、10、50和100μM)處理2h后ARAG1表達(dá)特性的結(jié)果圖3D為RT-PCR半定量法分析受不同濃度ABA(2、10、50和100μM)處理4h后ARAG1表達(dá)特性的結(jié)果圖4為RT-PCR半定量法分析受不同時(shí)間干旱(0.5、1、2和3h)處理后ARAG1表達(dá)特性的結(jié)果圖5為半定量RT-PCR法檢測(cè)ARAG1反義轉(zhuǎn)基因植株中內(nèi)源ARAGl表達(dá)水平的結(jié)果圖6為Western blot檢測(cè)ARAG1反義轉(zhuǎn)基因植株中內(nèi)源ARAG1蛋白表達(dá)水平的結(jié)果圖7為半定量RT-PCR法檢測(cè)ARAG1超表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株中內(nèi)源ARAG1表達(dá)水平的結(jié)果圖8為Western blot檢測(cè)ARAG1超表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株中內(nèi)源ARAG1蛋白表達(dá)水平的結(jié)果具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法，所用引物均由上海生工合成。
實(shí)施例1、編碼水稻DREB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子ARAG1的基因(ARAG1)的cDNA全長(zhǎng)序列的獲得、ARAG1的分子結(jié)構(gòu)分析及該基因在水稻基因組中的拷貝數(shù)分析一、編碼水稻DREB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子ARAG1的基因(ARAG1)的cDNA全長(zhǎng)序列的獲得1、RNA的提取及第一鏈cDNA的合成用Trizol試劑盒(GIBICO-BR公司)分別從水稻穎花中提取總RNA，隨后用無(wú)RNase的DNase(TaRaKa公司)除去RNA中殘留的DNA，得到無(wú)DNA污染的RNA。參照Ding等的方法(Ding等，Sexual Plant Reproduction，2002，15205-212)合成第一鏈cDNA。反應(yīng)體系及反應(yīng)條件為將5μg RNA和0.5μg oligo-dT15引物混合，加無(wú)菌水使混合物體積達(dá)12μl，70℃保溫10分鐘，轉(zhuǎn)至冰浴中，加入4μl5X第一鏈緩沖液，1μl10mM dNTPs，2ul 0.1mM DTT，42℃預(yù)熱2分鐘后，加入1μl SuperScript II RNA水解酶H-逆轉(zhuǎn)錄酶(200U/μl，GIBCO-BRL公司)，42℃反應(yīng)50分鐘，合成第一鏈cDNA，最后70℃加熱15分鐘，使逆轉(zhuǎn)錄酶失活。
二、ARAG1 cDNA全長(zhǎng)序列的獲得以擬南芥EREBP基因的核苷酸序列為探針，在NCBI水稻數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行TBLAST搜索，發(fā)現(xiàn)一段位于水稻第二條染色體上的DNA序列(GenBank號(hào)AJ307662，自5’端第305291位-第305968位堿基)。該序列編碼的蛋白含有一個(gè)AP2結(jié)構(gòu)域，和擬南芥中控制脅迫誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子DREB1A的AP2結(jié)構(gòu)域氨基酸殘基序列的相似性達(dá)73％。將該基因命名為ARAG1。根據(jù)該段DNA序列設(shè)計(jì)引物PCR擴(kuò)增ARAG1的cDNA序列，引物序列如下wp231f(正義引物)5’-ATCCATGGACGACTCGTCGTTC-3’(帶下劃線堿基為限制性?xún)?nèi)切酶Nco I的識(shí)別位點(diǎn))；wp231r(反義引物)5’-CGACTAGTGTAGTACTCCCACAGAAGTG-3’(帶下劃線堿基為限制性?xún)?nèi)切酶Spe I的識(shí)別位點(diǎn))以步驟一合成的第一鏈cDNA為模板，在引物wp231f和引物wp231r的引導(dǎo)下，PCR擴(kuò)增擴(kuò)增ARAG1的cDNA序列。50μl PCR反應(yīng)體系為25μl 2×GC PCR buffer，2μl 10mM dNTPs，2μl 10μM wp231F引物，2μl 10μM wp231R引物，1.5μl第一鏈cDNA，1μl LA Taq酶(大連Takara生物公司)。PCR反應(yīng)條件為先94℃1min；然后94℃30秒，55℃30秒，72℃1min，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃10min。反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，回收并純化約678bp的目的片段，將其克隆到載體pGEM-T(Promega公司)中，篩選陽(yáng)性克隆，進(jìn)行測(cè)序，將含有ARAG1cDNA序列的重組質(zhì)粒載體命名為ARAG1-pGEM-T，測(cè)序結(jié)果表明ARAG1具有序列表中SEQ ID №2的核苷酸序列，序列表中的SEQ ID №2由678個(gè)堿基組成，堿基“GC”的含量高達(dá)73％，其編碼序列為自5’端第1-678位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID№2的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)；自5’端第139到第339位堿基為AP2保守結(jié)構(gòu)域的編碼序列，編碼22個(gè)氨基酸，自5’端第148到第156位堿基為AP2保守結(jié)構(gòu)域的YRG元件的編碼序列，自5’端第259到第270位堿基為AP2保守結(jié)構(gòu)域的RAYD元件的編碼序列，自5’端第109到第129位堿基編碼核定位序列，自5’端第184到第186位堿基為纈氨酸的編碼序列，自5’端第199到第201位堿基為谷氨酸的編碼序列，將ARAG1編碼的蛋白質(zhì)命名為ARAG1。
三、ARAG1編碼蛋白ARAG1的分子結(jié)構(gòu)分析經(jīng)推測(cè)ARAG1所編碼的蛋白質(zhì)ARAG1的分子量是23.1kD，等電點(diǎn)(PI)為5.0。通過(guò)與國(guó)際數(shù)據(jù)庫(kù)Genbank/DDBJ/EMLK聯(lián)網(wǎng)，將ARAG1的氨基酸殘基序列與已知的擬南芥的TINY、DREBs/CBFs，水稻的OsDREB1A、OsDREB2A、OsDREB1B、OsDREB1C、OsDREB1D以及玉米的DBF2等AP2/EREBP蛋白的氨基酸殘基序列用BLAST軟件進(jìn)行同源性分析。結(jié)果ARAG1與上述AP2/EREBP蛋白只在AP2結(jié)構(gòu)域具有較高的相似性，其AP2結(jié)構(gòu)域與玉米DBF2和擬南芥TINY、DREB1DAP2結(jié)構(gòu)域的相似性分別達(dá)到93％、81％和73％。ARAG1的AP2結(jié)構(gòu)域包含了AP2結(jié)構(gòu)域中特別保守的YRG和RAYD元件，自氨基端(N端)第50位-第52位氨基酸殘基為AP2結(jié)構(gòu)域中保守的YRG元件，自氨基端第87位-第90位氨基酸殘基為AP2結(jié)構(gòu)域中保守的RAYD元件，以及DBEB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子共有的幾個(gè)特別保守的氨基酸，如自氨基端第62位纈氨酸(V14)和自氨基端第67位的谷氨酸(E19)，表明ARAG1是DREB亞家族的成員。而ARAG1與上述AP2/EREBP蛋白在其它區(qū)域的相似性很低，其全長(zhǎng)氨基酸殘基序列與玉米DBF2和擬南芥TINY、DREB1D氨基酸殘基序列的一致性分別僅為45％，38％和35％，與其它已克隆的DREB蛋白氨基酸殘基序列的一致性低于35％，表明ARAG1是一個(gè)新的DREB類(lèi)蛋白。蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明，緊鄰AP2結(jié)構(gòu)域的上游，自N端第37位-第43位氨基酸殘基為核定位信號(hào)；而在N末端和C末端分別具有富含絲氨酸、蘇氨酸和酸性氨基酸殘基的區(qū)域，可能作為轉(zhuǎn)錄激活域起作用，其中，自5’端第37到第93位堿基為富含絲氨酸的編碼序列，自5’端第31到第36位堿基為蘇氨酸的編碼序列。
四、ARAG1在水稻基因組中的拷貝數(shù)分析確定ARAG1在水稻基因組中的拷貝數(shù)，具體方法為提取水稻的基因組DNA，分別用限制性?xún)?nèi)切酶BamHI、Kpn I、Sac I和Sal I對(duì)其進(jìn)行完全酶切，然后用α-32P dCTP標(biāo)記的ARAG1的全長(zhǎng)cDNA作探針與上述酶切產(chǎn)物進(jìn)行Southern blot雜交。已知上述四種限制性?xún)?nèi)切酶均在探針ARAG1的cDNA上沒(méi)有切點(diǎn)，結(jié)果BamHI、Sac I和Sal I都有三條雜交帶，表明ARAG1在水稻基因組中存在三個(gè)拷貝。對(duì)ARAG1的cDNA序列在NCBI上進(jìn)行TBLATN分析，結(jié)果在基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索到包含有ARAG1的另外兩個(gè)BAC克隆，分別為位于水稻第二條染色體上OJ1112_F09(GenBank號(hào)AP005289)和位于水稻第四條染色體上的OSJNBb0034G17(GenBank號(hào)AL663000)。對(duì)ARAG1 cDNA和上述兩個(gè)BAC克隆所編碼蛋白的氨基酸殘基序列進(jìn)行相似性分析，結(jié)果兩個(gè)BAC克隆的編碼蛋白與ARAG1氨基酸殘基序列的相似性分別為65％和39％，AP2結(jié)合域的相似性分別達(dá)到97％和93％，且基因序列中都不含內(nèi)含子，將上述兩個(gè)BAC克隆的基因分別命名為ARAG1.1和ARAG1.2。
實(shí)施例2、ARAG1的體外表達(dá)及其多克隆抗體的制備一、ARAG1的體外表達(dá)在GenBank中對(duì)ARAG1的cDNA序列做BLAST分析，選取特異性最強(qiáng)的片段(自5’端第408位-第680位堿基)用于原核表達(dá)載體的構(gòu)建。具體方法為首先據(jù)此特異性片段設(shè)計(jì)一對(duì)PCR擴(kuò)增引物，引物序列如下wp324F(5’端引物)5’-ACTGAATTCGGCCTCCTCCGCCAATGC-3’(帶下劃線堿基為限制性?xún)?nèi)切酶EcoR I的識(shí)別位點(diǎn))；wp324R(3’端引物)5’-CGACTCGAGTTGTAGTACTCCCACAGAAG-3’(帶下劃線堿基為限制性?xún)?nèi)切酶Xho I的識(shí)別位點(diǎn))然后，以重組質(zhì)粒載體ARAG1-pGEM-T為模板，在引物wp324F和引物wp324R的引導(dǎo)下，PCR擴(kuò)增該片段，并在片段兩端分別引入限制性?xún)?nèi)切酶EcoR I和Xho I的識(shí)別位點(diǎn)，50μl PCR反應(yīng)體系為25μl 2×GC PCR buffer，2μl 10mM dNTPs，2μl 10μM wp324F引物，2μl 10μM wp324R引物，1μl質(zhì)粒載體ARAG1-pGEM-T，1μl LA Taq酶(大連Takara生物公司)。PCR反應(yīng)條件為先94℃1min；然后94℃30秒，55℃30秒，72℃1min，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃10min。反應(yīng)結(jié)束后，回收并純化約273bp的PCR產(chǎn)物，對(duì)其用限制性?xún)?nèi)切酶EcoR I和Xho I進(jìn)行雙酶切，將酶切產(chǎn)物與經(jīng)同樣酶雙酶切的載體pGEX-4T-3(Amersham公司)連接，得到含有ARAG1的重組表達(dá)載體，命名為pGEX-ARAG1。用CaCl2法將融合表達(dá)載體pGEX-ARAG1轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，將篩選出的陽(yáng)性克隆送基康公司測(cè)序，得到正確轉(zhuǎn)化有pGEX-ARAG1的陽(yáng)性重組子，用于ARAG1的原核表達(dá)。挑取陽(yáng)性重組子，將其接種于LB液體培養(yǎng)基中，在37℃下振蕩培養(yǎng)，再將處于對(duì)數(shù)期的培養(yǎng)物中加入IPTG至終濃度為1mM，誘導(dǎo)ARAG1的表達(dá)，再在相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，離心收集菌體，通過(guò)溶菌酶裂解菌體(具體方法參見(jiàn)文獻(xiàn)Worrall，Methods Mol Biol 1996，5931-7)，對(duì)裂解物進(jìn)行12％SDS-PAGE檢測(cè)，結(jié)果經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)了約37KD的蛋白，與預(yù)期結(jié)果相符，回收目的蛋白并對(duì)其進(jìn)行純化，得到融合蛋白GST-ARAG1。
二、ARAG1多克隆抗體的制備將步驟一獲得的經(jīng)純化的融合蛋白GST-ARAG1與弗氏佐劑混合后，對(duì)新西蘭大白兔用肌肉注射的方式進(jìn)行免疫(具體方法參見(jiàn)文獻(xiàn)Hanly等，ILAR J 1995，3793-118)，經(jīng)多次加強(qiáng)免疫后，得到ARAG1的多克隆抗血清，經(jīng)純化后得到ARAG1的多克隆抗體。
實(shí)施例3、ARAG1在水稻不同器官的表達(dá)特性分析及其受ABA和干旱脅迫誘導(dǎo)后的表達(dá)特性分析一、ARAG1在水稻不同器官的表達(dá)特性分析通過(guò)半定量RT-PCR的方法分析基因ARAG1在水稻不同器官的表達(dá)特性。用Trizol試劑盒(Invitrogen)提取分別來(lái)源于水稻穎花、葉、幼芽、初生根、正在發(fā)育的種子、成熟的種子和正在萌發(fā)的種子的總RNA并合成各自第一鏈cDNA，反應(yīng)體系及反應(yīng)條件為將5μg RNA和0.5μg oligo-dT15引物混合，加無(wú)菌水使混合物體積達(dá)12μl，70℃保溫10分鐘，轉(zhuǎn)至冰浴中，加入4μl 5X第一鏈緩沖液，1μl 10mM dNTPs，2ul 0.1mM DTT，42℃預(yù)熱2分鐘后，加入1μl SuperScript II RNA水解酶H-逆轉(zhuǎn)錄酶(200U/μl，GIBCO-BRL公司)，42℃反應(yīng)50分鐘，合成第一鏈cDNA，最后70℃加熱15分鐘，使逆轉(zhuǎn)錄酶失活。然后分別以上述不同器官的第一鏈cDNA為模板，在ARAG1的特異性引物wp231f和wp231r的引導(dǎo)下，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以水稻微管蛋白基因tubulin A(tub.A)作對(duì)照(引物序列參見(jiàn)文獻(xiàn)Ding等，Sex Plant Reprod，2001，13285-288)。50μl PCR反應(yīng)體系為1μl第一鏈cDNA，10pmoles引物wp231f，10pmoles引物wp231r，200μM dNTPs，2X GC PCR緩沖液25μl和2.5U的LA Taq聚合酶(大連Takara公司)。PCR反應(yīng)條件為先94℃1分鐘；再94℃40秒，55℃30秒，72℃1分鐘，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后72℃10分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，回收678bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。RT-PCR分析結(jié)果如圖1所示(泳道B、F、L、R、I、D、G分別表示ARAG1在水稻的芽、穎花、葉、根、未成熟種子、干種子和正在萌發(fā)的種子不同器官的中的表達(dá)情況；tubulin A基因做對(duì)照；以不同器官的RNA做量參)，結(jié)果ARAG1在水稻的穎花和初生根中優(yōu)勢(shì)表達(dá)，在葉和幼芽中幾乎不表達(dá)，做進(jìn)一步地分析結(jié)果，ARAG1在正處于發(fā)育階段的種子的胚中表達(dá)，而在成熟的種子中不表達(dá)，然而當(dāng)成熟的種子重新處于萌發(fā)階段的時(shí)候，ARAG1重新開(kāi)始表達(dá)。
二、ARAG1受ABA和干旱脅迫誘導(dǎo)后的表達(dá)特性分析1、ARAG1受低溫、ABA和干旱短時(shí)間脅迫誘導(dǎo)后的表達(dá)特性分析將正常萌發(fā)一周的水稻幼苗，分成三個(gè)大組，分別用4℃的低溫、100μM脫落酸(ABA)和干旱(將水稻幼苗置于濾紙上)短時(shí)間處理30min，以野生型水稻為對(duì)照(WT，不作任何處理)，處理結(jié)束后，剪取幼苗的根各100mg，用Trizol試劑盒提取經(jīng)不同脅迫處理植株的總RNA，按照與步驟一相同的方法分析ARAG1經(jīng)短時(shí)間低溫、ABA和干旱脅迫處理的表達(dá)特性，同樣用水稻微管蛋白基因tubulin A做對(duì)照，每組重復(fù)三次，用2DE Image Master 2002.01軟件分析各條帶，將數(shù)據(jù)取平均值±SD，電泳及數(shù)據(jù)分析結(jié)果如圖2所示(WT、D、A、C分別表示野生型對(duì)照、經(jīng)干旱處理植株、經(jīng)ABA處理植株和經(jīng)冷處理植株)，在100μM ABA脅迫下，ARAG1的表達(dá)水平在短時(shí)間內(nèi)(30min)成倍地增加，干旱脅迫的誘導(dǎo)作用雖然不如ABA那樣顯著，但ARAG1的表達(dá)量也有較大幅度的增加，然而在4℃低溫脅迫下，ARAG1的表達(dá)水平在短時(shí)間內(nèi)幾乎沒(méi)有什么變化。用下述實(shí)驗(yàn)對(duì)ARAG1受ABA和干旱脅迫誘導(dǎo)后表達(dá)特性的做進(jìn)一步分析。
2、ARAG1受ABA和干旱短時(shí)間脅迫誘導(dǎo)后表達(dá)特性的進(jìn)一步分析將正常萌發(fā)一周的水稻幼苗，分成二個(gè)大組，組一再按ABA處理時(shí)間分成4個(gè)小組，分別用2、10、50和100μM ABA處理0.5、1、2和4h，以野生型水稻為對(duì)照(WT，不作任何處理)；組二按干旱處理時(shí)間分成4個(gè)小組，每組分別進(jìn)行干旱處理0.5、1、2和3h，以野生型水稻為對(duì)照(WT，不作任何處理)，用與步驟1相同的方法分析經(jīng)不同濃度和不同時(shí)間ABA處理和不同時(shí)間干旱脅迫處理后ARAG1的表達(dá)特性，以水稻微管蛋白基因tubulin A做對(duì)照，每組重復(fù)三次，用2DE Image Master 2002.01軟件分析各條帶，將數(shù)據(jù)取平均值±SD。經(jīng)不同濃度和不同時(shí)間ABA處理后ARAG1表達(dá)特性的電泳及數(shù)據(jù)分析結(jié)果如圖3A-圖3D所示(圖3A為用2、10、50和100mM ABA處理0.5小時(shí)的結(jié)果，圖3B為用2、10、50和100mM ABA處理1小時(shí)的結(jié)果，圖3C為用2、10、50和100mM ABA處理2小時(shí)的結(jié)果，圖3D為用2、10、50和100mM ABA處理4小時(shí)的結(jié)果，WT表示野生型對(duì)照)，當(dāng)ABA的處理時(shí)間為0.5h時(shí)，隨著的ABA處理濃度從2μM增加到100μM，ARAG1的表達(dá)量也隨之增加，兩者呈現(xiàn)出線性關(guān)系；當(dāng)材料的ABA處理時(shí)間延長(zhǎng)到60分鐘時(shí)，在2μM ABA處理的水稻根部，ARAG1的表達(dá)量稍有增加，在經(jīng)10μM ABA處理的水稻根部，ARAG1的表達(dá)量持續(xù)增加，然而在50和100μM ABA處理的水稻根部，ARAG1的表達(dá)量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)逐步下降，濃度越高，下降越快；當(dāng)ABA處理的時(shí)間延長(zhǎng)到2小時(shí)的時(shí)候，ARAG1的表達(dá)量迅速下降；ABA處理的時(shí)間到4小時(shí)的時(shí)候，ARAG1的表達(dá)量基本恢復(fù)到與野生型植株一致的水平，證明ARAG1的表達(dá)受ABA的反饋抑制。經(jīng)不同不同時(shí)間干旱脅迫處理后ARAG1表達(dá)特性的電泳及數(shù)據(jù)分析結(jié)果如圖4所示(0.5、1、2、3分別表示經(jīng)0.5、1、2、3小時(shí)干旱處理的結(jié)果，WT表示野生型對(duì)照)，結(jié)果表明ARAG1對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)也具有明顯的時(shí)間特性。隨著干旱處理的時(shí)間延長(zhǎng)，ARAG1的表達(dá)量也逐漸增加，在經(jīng)干旱處理1小時(shí)后，ARAG1的表達(dá)量達(dá)到高峰，以后隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，ARAG1的表達(dá)量逐漸下降，證明ARAG1的表達(dá)同樣受到于旱脅迫的反饋抑制。
實(shí)施例4、轉(zhuǎn)化有ARAG1反義基因的轉(zhuǎn)基因水稻的獲得及內(nèi)源ARAG1表達(dá)水平的檢測(cè)一、轉(zhuǎn)化有ARAG1反義基因的轉(zhuǎn)基因水稻的獲得及分子檢測(cè)1、ARAG1反義載體的構(gòu)建依據(jù)ARAG1的cDNA序列，設(shè)計(jì)一對(duì)引物PCR擴(kuò)增ARAG1的反義基因，引物序列如下wp62f(正義引物)5’-GAGCTCTCTTTCCACGTCGCGAGAG-3’(帶下劃線堿基為限制性?xún)?nèi)切酶Sac I的識(shí)別位點(diǎn))；wp62r(反義引物)5’-TCTAGACGGGTTGTACATGCAGGCT-3’(帶下劃線堿基為限制性?xún)?nèi)切酶Xba I的識(shí)別位點(diǎn))然后，以水稻基因組DNA為模板，在引物wp62f和引物wp62r的引導(dǎo)下，PCR擴(kuò)增ARAG1的反義基因，并在基因序列兩端分別引入限制性?xún)?nèi)切酶Sac I和Xba I的識(shí)別位點(diǎn)，50ul PCR反應(yīng)體系為2X PCR緩沖液25μl，1ul水稻基因組DNA(100ng)，10pmoles正義引物wp62f，10pmoles反義引物wp62r，200uM dNTPs，2.5單位LA Taq DNA聚合酶(5U/ul，大連Takara生物公司)。PCR反應(yīng)條件為先94℃1分鐘；再94℃40秒，55℃30秒，72℃30秒，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后72℃10分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，回收并純化約974bp的PCR產(chǎn)物，對(duì)其用限制性?xún)?nèi)切酶Xba I和Sac I進(jìn)行雙酶切，將酶切產(chǎn)物與經(jīng)同樣酶雙酶切的含有CaMV 35s啟動(dòng)子的載體pBI121(CLONTECH公司)用T4 DNA連接酶連接，得到含有ARAG1反義基因的重組載體，命名為pBI121-ARAG1。最后對(duì)pBI121-ARAG1用限制性?xún)?nèi)切酶EcoR I和HindIII進(jìn)行雙酶切，將酶切產(chǎn)物(含有CaMV 35s啟動(dòng)子和ARAG1反義基因片斷)與經(jīng)同樣酶雙酶切的植物表達(dá)載體pCAMBIA1301(CAMBIA公司)用T4 DNA連接酶連接，得到含有ARAG1反義基因的重組植物表達(dá)載體，命名為p1301-35s-ARAG1。
2、獲得轉(zhuǎn)化有ARAG1反義基因的轉(zhuǎn)基因水稻將含有ARAG1反義基因的重組植物表達(dá)載體p1301-35s-ARAG1通過(guò)凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105，長(zhǎng)出菌斑后挑取農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化克隆提質(zhì)粒，用PCR的方法做鑒定，引物為ARAG1特異引物wp62f和wp62r。然后進(jìn)一步用ARAG1的5’端引物wp62f和35S啟動(dòng)子特異引物(5’-CCTTCGCAAGACCCTTCCTC-3’)進(jìn)行PCR鑒定。將鑒定出的陽(yáng)性克隆用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化水稻的愈傷組織，經(jīng)50ug/mL潮霉素抗性篩選，得到轉(zhuǎn)化有p1301-35s-ARAG1的水稻愈傷組織。經(jīng)培養(yǎng)、再生后獲得轉(zhuǎn)化有ARAG1反義基因的轉(zhuǎn)基因水稻幼苗(具體的轉(zhuǎn)化及培養(yǎng)方法可參閱文獻(xiàn)Hiei等，Plant J 1994，6271-282)。
3、轉(zhuǎn)化有ARAG1反義基因的轉(zhuǎn)基因水稻的檢測(cè)對(duì)步驟2獲得的轉(zhuǎn)基因植株通過(guò)微量法提取基因組DNA，并以此為模板，在潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(hygromycin phosphotransferase)基因特異引物WP148F(5’-TGCTGCTCCATACAAGCCAACC-3’)和引物WP148R(5’-AAGACCTGCCTGAAACCGAACT-3’)的引導(dǎo)下，進(jìn)行PCR檢測(cè)，可擴(kuò)增出約470bp片段的為轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性株系，進(jìn)而利用α-32P-dCTP標(biāo)記的潮霉素片斷為探針對(duì)經(jīng)PCR鑒定為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行Southern雜交確認(rèn)。對(duì)經(jīng)上述方法鑒定為轉(zhuǎn)化有ARAG1反義基因的株系用GUS染色法進(jìn)一步確定，得到轉(zhuǎn)化有ARAG1反義基因的轉(zhuǎn)基因水稻。
二、ARAG1反義轉(zhuǎn)基因植株中內(nèi)源ARAG1表達(dá)水平的檢測(cè)1、半定量RT-PCR法檢測(cè)ARAG1反義轉(zhuǎn)基因植株中內(nèi)源ARAG1的表達(dá)水平選取四株步驟一獲得的陽(yáng)性ARAG1反義轉(zhuǎn)基因株系，分別命名為R1、R3、R9、R10，用半定量RT-PCR的方法對(duì)其內(nèi)源ARAG1的表達(dá)水平進(jìn)行分析。具體方法為提取陽(yáng)性ARAG1反義轉(zhuǎn)基因株系的總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄得到的第一鏈cDNA，再以此為模板，分別在ARAG1反義片段的內(nèi)部引物wp231f及wp231r，以及引物wp231f和WP261R(5’-ATTCTTTTGGTCATGCGTGGAA-3’)的引導(dǎo)下，PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株中整合的ARAG1反義基因片段的轉(zhuǎn)錄情況及ARAG1在植株中的整體轉(zhuǎn)錄情況，以tubulin A(引物序列為T(mén)ub15’-TCAGATGCCCAGTGACAGA-3’和Tub25’-TTGGTGATCTCGGCAACAGA-3’)和水稻野生型植株為對(duì)照，每組重復(fù)三次，用2DE Image Master 2002.01軟件分析各條帶，將數(shù)據(jù)取平均值±SD。檢測(cè)結(jié)果如圖5所示(1為用引物wp231f及wp231r檢測(cè)反義ARAG1的表達(dá)量，2為用引物wp231f和WP261R檢測(cè)在轉(zhuǎn)基因植株中的ARAG1的總體表達(dá)量；R1、R3、R9、R10分別表示步驟一獲得的ARAG1反義轉(zhuǎn)基因株系R1、R3、R9、R10，WT為水稻野生型植株)，表明陽(yáng)性ARAG1反義轉(zhuǎn)基因株系中內(nèi)源ARAG1的表達(dá)水平與對(duì)照相比明顯降低。
2、Western blot檢測(cè)ARAG1反義轉(zhuǎn)基因植株中內(nèi)源ARAG1蛋白的表達(dá)水平用Western blot法檢測(cè)ARAG1蛋白的表達(dá)情況，以tubulin A作為定量對(duì)照，具體方法為按照Salekdeh等(Proteomics 2002，21131-1145)的方法提取陽(yáng)性ARAG1反義轉(zhuǎn)基因株系的總蛋白，用12％的SDS-PAGE電泳對(duì)總蛋白進(jìn)行分離(Laemmli，Nature 1970，227680-685)，將膠上的蛋白通過(guò)半干法以1mA/cm2穩(wěn)流轉(zhuǎn)移到PVDF膜上(轉(zhuǎn)膜液10mM CAPS，10％(v/v)甲醇)，轉(zhuǎn)膜時(shí)間為2小時(shí)。將膜在封閉液(含3％BSA的TBS緩沖液(TBS緩沖液20mM Tris-Cl pH7.5，150mM NaCl))中封閉2小時(shí)，然后將膜在含有ARAG1多克隆抗體(實(shí)施例2制備)(1∶10000稀釋)的雜交液(成分與封閉液相同)中37℃溫育1小時(shí)，用TTBS(0.05％Tween-20，20mM Tris-ClpH7.5，150mM NaCl)洗膜3次，每次5分鐘。然后將膜轉(zhuǎn)移到含有堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗兔的二抗(1∶2000稀釋?zhuān)A美公司)雜交液中37℃溫育1小時(shí)，用TTBS洗膜3次，每次5分鐘，然后在TBS(20mM Tris-Cl pH7.5，150mM NaCl)緩沖液中洗兩次，每次5分鐘。最后用NBT/BCIP顯色液(華美公司)顯色，檢測(cè)雜交信號(hào)。結(jié)果如圖6所示(R1、R3、R9、R10分別表示步驟一獲得的ARAG1反義轉(zhuǎn)基因株系R1、R3、R9、R10，WT為水稻野生型植株)，表明陽(yáng)性ARAG1反義轉(zhuǎn)基因株系中ARAG1蛋白的表達(dá)水平與對(duì)照相比也顯著降低。
實(shí)施例5、ARAG1超表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻的獲得及內(nèi)源ARAG1表達(dá)水平的檢測(cè)一、ARAG1超表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻的獲得及分子檢測(cè)1、ARAG1超表達(dá)載體的構(gòu)建以實(shí)施例1構(gòu)建的含有ARAG1 cDNA序列的質(zhì)粒載體ARAG1-pGEM-T為模板，在引物實(shí)施例1中的引物wp231f和引物wp231r的引導(dǎo)下，PCR擴(kuò)增ARAG1的全長(zhǎng)cDNA，并在基因序列兩端分別引入限制性?xún)?nèi)切酶Nco I和Spe I的識(shí)別位點(diǎn)，50ul PCR反應(yīng)體系為2X PCR緩沖液25μl，1ul ARAG1-pGEM-T質(zhì)粒(50ng)，10pmoles正義引物wp231f，10pmoles反義引物wp231r，200uM dNTPs，2.5單位LA Taq DNA聚合酶(5U/ul)。PCR反應(yīng)條件為先94℃2分鐘；再94℃40秒，55℃30秒，72℃1分鐘，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后72℃10分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，回收并純化約678bp的PCR產(chǎn)物，對(duì)其用限制性?xún)?nèi)切酶Nco I和Spe I進(jìn)行雙酶切，將酶切產(chǎn)物與經(jīng)同樣酶雙酶切的含綠色熒光蛋白基因GFP的載體pCAMBIA 1302(CAMBIA，Canberra，Australia)用T4DNA連接酶連接，得到在植物中超表達(dá)ARAG1的重組載體，命名為p1302-35s-ARAG1-GFP，其中ARAG1與GFP構(gòu)成融合基因。
2、ARAG1超表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻的獲得將ARAG1的植物超表達(dá)載體p1302-35s-ARAG1-GFP通過(guò)凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105，長(zhǎng)出菌斑后挑取農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化克隆提質(zhì)粒，用PCR的方法做鑒定，引物為ARAG1特異引物wp231f和wp231r。將鑒定出的陽(yáng)性克隆用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化水稻的愈傷組織，經(jīng)50ug/mL潮霉素抗性篩選，得到轉(zhuǎn)化有p1302-35s-ARAG1-GFP的水稻愈傷組織。經(jīng)培養(yǎng)、再生后獲得轉(zhuǎn)化有ARAG1超表達(dá)載體p1302-35s-ARAG1-GFP的轉(zhuǎn)基因水稻幼苗(具體的轉(zhuǎn)化及培養(yǎng)方法可參閱文獻(xiàn)Hiei等，Plant J 1994，6271-282)。
3、ARAG1超表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻的分子檢測(cè)對(duì)步驟2獲得的轉(zhuǎn)基因植株通過(guò)微量法提取基因組DNA，并以此為模板，在潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(hygromycin phosphotransferase)基因特異引物WP148F(5’-TGCTGCTCCATACAAGCCAACC-3’)和引物WP148R(5’-AAGACCTGCCTGAAACCGAACT-3’)的引導(dǎo)下，進(jìn)行PCR檢測(cè)，可擴(kuò)增出約470bp片段的為轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性株系，進(jìn)而利用α-32P-dCTP標(biāo)記的潮霉素片斷為探針對(duì)經(jīng)PCR鑒定為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行Southern雜交確認(rèn)，得到ARAG1超表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻。
二、ARAG1超表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株中內(nèi)源ARAG1表達(dá)水平的檢測(cè)1、半定量RT-PCR法檢測(cè)ARAG1超表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株中內(nèi)源ARAG1的表達(dá)水平選取三株步驟一獲得的陽(yáng)性超表達(dá)ARAG1轉(zhuǎn)基因株系，分別命名為G2、G5、G8，用半定量RT-PCR的方法對(duì)其內(nèi)源ARAG1的表達(dá)水平進(jìn)行分析，具體方法為提取陽(yáng)性ARAG1反義轉(zhuǎn)基因株系的總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄得到的第一鏈cDNA，再以此為模板，分別在ARAG1引物wp231f和wp231r，以及GFP基因特異引物wp161F(5’-GGTCTAGAATGAGTAAAGGAGAAG-3’)和Wp161R(5’-ATGAGCTCACTGCAGGTCTGGACA-3’)的引導(dǎo)下，PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株中ARAG1的整體轉(zhuǎn)錄情況及轉(zhuǎn)基因植株中GFP的整體轉(zhuǎn)錄情況，以tubulin A(引物序列為T(mén)ub15’-TCAGATGCCCAGTGACAGA-3’和Tub25’-TTGGTGATCTCGGCAACAGA-3’)和水稻野生型植株為對(duì)照，每組重復(fù)三次，用2DEImage Master 2002.01軟件分析各條帶，將數(shù)據(jù)取平均值±SD。檢測(cè)結(jié)果如圖7所示(1為用引物wp231f和wp231r檢測(cè)ARAG1的表達(dá)量，2為用引物wp161F和wp161R檢測(cè)在轉(zhuǎn)基因植株中GFP的總體表達(dá)量；G2、G5、G8分別表示步驟一獲得的ARAG1超表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系2、5、8，WT為水稻野生型植株)，表明陽(yáng)性ARAG1超表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系的內(nèi)源ARAG1的表達(dá)水平與對(duì)照相比明顯增加。
2、Western blot檢測(cè)ARAG1超表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株中內(nèi)源ARAG1蛋白的表達(dá)水平用Western blot法檢測(cè)ARAG1超表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株中ARAG1蛋白的表達(dá)情況，以tubulin A作為定量對(duì)照，具體方法與實(shí)施例4相同，結(jié)果如圖8所示(G2、G5、G8分別表示步驟一獲得的ARAG1超表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系G2、G5、G8，WT為水稻野生型植株)，表明轉(zhuǎn)基因株系的ARAG1蛋白表達(dá)水平與對(duì)照相比也顯著增加。
實(shí)施例6、ARAG1反義轉(zhuǎn)基因植株和ARAG1超表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株的表型分析及其種子對(duì)ABA抑制種子萌發(fā)作用的敏感性檢測(cè)一、ARAG1反義轉(zhuǎn)基因植株和ARAG1超表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株的表型分析對(duì)實(shí)施例4鑒定出的四個(gè)ARAG1反義轉(zhuǎn)基因株系(ARAG1-ant，R1，R3，R9，R10)和實(shí)施例5鑒定出的三個(gè)ARAG1超表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系(ARAG1-ox，G2、G5、G8)作表型分析，以野生型為對(duì)照，結(jié)果ARAG1-ox株系T1代和T2代的株高稍大于野生型對(duì)照，而ARAG1-ant株系的株高與野生型對(duì)照無(wú)明顯差別。ARAG1-ox和ARAG1-ant株系每株的分蘗數(shù)、枝梗數(shù)、籽粒數(shù)與對(duì)照相比無(wú)明顯差異。籽粒的重量有差異，四個(gè)ARAG1-ant株系(R1，R3，R9，R10)的種子千粒重(thousand grain weights)均小于野生型對(duì)照，而其中兩個(gè)ARAG1-ox株系(G2，G8)均大于野生型對(duì)照(P值＜0.01)。
二、ARAG1反義轉(zhuǎn)基因植株和ARAG1超表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株的種子對(duì)ABA抑制種子萌發(fā)作用的敏感性檢測(cè)取野生型、ARAG1反義轉(zhuǎn)基因株系R9T2代和ARAG1超表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系G2 T2代的種子各30粒，去皮后，將種子在暗中25℃用水浸泡24小時(shí)，使種子萌動(dòng)。然后將不同類(lèi)型的種子各分成5份，分別放置在含有不同ABA濃度(0、2、4、6、8mM ABA)的水溶液的飽和的濾紙上，在25℃黑暗的條件下使其萌發(fā)，每隔一定的天數(shù)統(tǒng)計(jì)種子的萌發(fā)率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。以這些種子的初生根或芽的長(zhǎng)度超過(guò)2mm作為種子已經(jīng)萌發(fā)的標(biāo)志。結(jié)果在正常的萌發(fā)條件下(0mM ABA)，野生型的種子在浸種后兩天(48小時(shí))萌發(fā)率達(dá)到了96％，在第三天(72小時(shí))達(dá)到了100％。ARAG1-ox的種子(G2T2)具有與野生型種子相似的萌發(fā)率，而ARAG1-ant的種子(R9 T2)，盡管在第三天能夠100％萌發(fā)，但它在第兩天(48小時(shí))的萌發(fā)率只有75.9％，表明ARAG1-ant的種子與野生型相比萌發(fā)能力有所降低。2mM ABA處理組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，野生型與ARAG1-ox種子的萌發(fā)率分別在浸種后第4天達(dá)到了85％和60％，而ARAG1-ant種子不能夠萌發(fā)。為做進(jìn)一步驗(yàn)證，分別在浸種后第4、7、10天統(tǒng)計(jì)0、2、4、6、8mM ABA處理組種子的萌發(fā)率，統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明隨著ABA濃度的增加，種子的萌發(fā)率逐漸降低。在第4天時(shí)，0、2、4、6和8mMABA處理組種子的萌發(fā)率分別為100％、85％、57％、40％和30％。ARAG1-ox株系具有與野生型對(duì)照相似的對(duì)ABA抑制作用的敏感性，而ARAG1-ant種子在相同的條件下完全不能萌發(fā)。當(dāng)處理時(shí)間延長(zhǎng)到10天時(shí)，野生型和ARAG1-ox株系的種子在低于6mM ABA濃度下，可以全部萌發(fā)，大約有95％的種子可以在8mM ABA處理?xiàng)l件下萌發(fā)。與此形成對(duì)照的是，ARAG1-ant的種子在0、2、4、6和8mM ABA處理?xiàng)l件下，萌發(fā)率分別只有83％、49％、29％和13％。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明對(duì)ARAG1基因的反義抑制，引起了對(duì)ABA抑制萌發(fā)的超敏感。
實(shí)施例7、檢測(cè)ARAG1反義轉(zhuǎn)基因植株和ARAG1超表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株幼苗生長(zhǎng)的影響取野生型、ARAG1反義轉(zhuǎn)基因株系R9 T2代和ARAG1超表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系G2 T2代的種子各30粒，去皮后，將種子在暗中25℃用水浸泡24小時(shí)，使種子萌動(dòng)。然后將這些種子放置在不含ABA的、無(wú)菌水飽和的濾紙上，在25℃黑暗的條件下萌發(fā)三天。最后將不同類(lèi)型的種子各分成5份，分別放置在含有不同ABA濃度(0、2、4、8mM ABA)的水溶液里，繼續(xù)生長(zhǎng)7天。分別在第2、4、6、8、10天統(tǒng)計(jì)初生根的長(zhǎng)度、株高、不定根和側(cè)根的數(shù)目。結(jié)果在正常生長(zhǎng)條件下(0mM ABA)，第10天時(shí)野生型植株的平均株高達(dá)到4.5cm，ARAG1-ox(T2G2)植株的平均株高與野生型植株相似，而ARAG1-ant(T2R9)植株的平均株高比野生型植株的短24％，表明對(duì)ARAG1基因的反義抑制導(dǎo)致植株生長(zhǎng)的緩慢。ARAG1-ant(T2 R9)植株初生根的平均長(zhǎng)度比野生型植株的短8％，不定根和側(cè)根的數(shù)目比野生型植株的分別減少11％和21％。作為正對(duì)照，ARAG1-ox(T2 G2)植株不定根和側(cè)根的數(shù)目比野生型植株的分別多11％和21％。2mM ABA處理組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常生長(zhǎng)條件下生長(zhǎng)的幼苗相比，野生型幼苗的株高被抑制了42％，ARAG1-ox幼苗枝條生長(zhǎng)的抑制程度接近(54％)，而ARAG1-ant幼的株高抑制程度僅為75％。為做進(jìn)一步驗(yàn)證，分別統(tǒng)計(jì)2、4、8mM ABA處理組的株高。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明隨著ABA濃度的增加，野生型幼苗的株高逐漸降低。用4mM和8mM ABA處理時(shí)，抑制程度分別達(dá)到53％和63％。隨著ABA處理濃度地增加，ARAG1-ox幼苗具有與野生型植株相似的對(duì)ABA的敏感性，抑制程度接近，然而在相同條件下，ARAG1-ant幼苗的生長(zhǎng)幾乎完全被抑制(抑制程度分別達(dá)到92％和96％)。進(jìn)一步檢測(cè)初生根的生長(zhǎng)對(duì)ABA的敏感性，在2mM ABA處理?xiàng)l件下，野生型和ARAG1-ox初生根的長(zhǎng)度與正常條件下生長(zhǎng)的植株相比分別減少了19％和15％，而ARAG1-ant幼苗的初生根的長(zhǎng)度比正常條件下生長(zhǎng)的對(duì)照植株減少了43％。當(dāng)ABA的濃度增加到4mM和8mM時(shí)，經(jīng)處理的野生型植株的比正常條件下生長(zhǎng)的對(duì)照植株初生根的長(zhǎng)度分別減少了50％和74％，ARAG1-ox初生根的受抑制程度與野生型的相似，分別達(dá)到49％和74％，而ARAG1-ant幼苗初生根的生長(zhǎng)幾乎被完全抑制，受抑制程度與正常條件下生長(zhǎng)的對(duì)照植株相比，分別達(dá)到88％和98％。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段，對(duì)ARAG1基因的反義抑制，使轉(zhuǎn)基因植株的幼苗對(duì)外源ABA處理高度敏感。
實(shí)施例8、檢測(cè)ARAGl超表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株對(duì)干旱和鹽脅迫的耐性一、檢測(cè)ARAGl超表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株對(duì)干旱脅迫的耐性將在土壤中正常生長(zhǎng)兩周(至3葉期)的野生型和實(shí)施例5獲得的ARAG1超表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系G2、G5、G8的幼苗，斷水處理9天，然后恢復(fù)澆水，在正常條件下培養(yǎng)5天，結(jié)果野生型對(duì)照植株全部死亡，而ARAG1超表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系G2和G5的死亡率分別為45％和55％。表明ARAGl超表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株比野生型對(duì)照植株具有更強(qiáng)的耐干旱能力。
二、檢測(cè)ARAGl超表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株對(duì)鹽脅迫的耐性將實(shí)施例4獲得的四個(gè)ARAG1反義轉(zhuǎn)基因株系R1、R3、R9、R10和實(shí)施例5獲得的ARAGl超表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系G2、G5、G8T2代及野生型植株的種子在1/2MS瓊脂培養(yǎng)基上萌發(fā)10天，然后將幼苗小心從培養(yǎng)基上取出，將幼苗的根部浸在500mM NaCl溶液中6個(gè)小時(shí)，最后將幼苗轉(zhuǎn)移到土壤中，在正常條件下培養(yǎng)5天。統(tǒng)計(jì)存活率，結(jié)果45％的ARAG1超表達(dá)植株經(jīng)上述NaCl溶液處理后可以存活，而野生型和ARAG1反義轉(zhuǎn)基因植株完全死亡。表明ARAG1超表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株比野生型對(duì)照植株具有更強(qiáng)的耐鹽能力。
實(shí)施例9、ARAG1蛋白的GFP熒光定位將實(shí)施例5構(gòu)建的ARAG1超表達(dá)(融合表達(dá))載體p1302-35s-ARAG1-GFP通過(guò)凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105，然后用Yang等(Plant J 2000，22543-551)的方法再將陽(yáng)性重組子導(dǎo)入洋蔥表皮中進(jìn)行培養(yǎng)，以只導(dǎo)入pCAMBIA-1302空載體的洋蔥表皮細(xì)胞為對(duì)照。利用熒光顯微鏡(Zeiss)在FITC慮光片下檢測(cè)GFP熒光信號(hào)。結(jié)果在對(duì)照細(xì)胞中GFP信號(hào)均勻分布于細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中，而在導(dǎo)入p1302-35s-ARAG1-GFP融合表達(dá)載體的細(xì)胞中GFP信號(hào)主要存在于細(xì)胞核中，表明ARAG1是一核蛋白。
序列表<160>2<210>1<211>225<212>PRT<213>稻屬水稻(Oryza sativa L.ssp.japonica)<400>1Met Asp Asp Ser Ser Phe Gly Ser Glu Pro Thr Thr Ser Ser Ser Gly1 5 10 15Gly Glu Ala Pro Ala Ser Pro Pro Ser Thr Ala Ser Ser Ser Ser Asp20 25 30Gly Ala Gly Gly Lys Lys Lys Arg Pro Arg Lys Asp Gly His His Pro35 40 45Thr Tyr Arg Gly Val Arg Met Arg Ser Trp Gly Lys Trp Val Ser Glu50 55 60Ile Arg Glu Pro Arg Lys Lys Ser Arg Ile Trp Leu Gly Thr Phe Ala65 70 75 80Thr Ala Glu Met Ala Ala Arg Ala His Asp Val Ala Ala Leu Ala Ile85 90 95Lys Gly Arg Ala Ala His Leu Asn Phe Pro Asp Leu Ala His Glu Leu100 105 110Pro Arg Pro Ala Thr Ala Ala Pro Lys Asp Val Gln Ala Ala Ala Ala115 120 125Leu Ala Ala Ala Ala Asp Phe Pro Ala Ser Ser Ala Asn Ala Gly Ala130 135 140Ser Asn Asn Pro Asp Gly Ser Asp Asp Ala Ser Ala Gly Ser Ala Ser145 150 155 160Pro Pro Pro Pro Pro Asp Ala Ala Asp Asp Ala Leu Phe Asp Leu Pro165 170 175
Asp Leu Leu Leu Asp Leu Arg Tyr Gly Pro Pro Ser Ser Gly Leu Ser180 185 190Cys Ala Ser Ser Trp Glu Asp Glu Val Gly Leu Ile Ser Gly Ala Gly195 200 205Ala Ala Ala Ala Gly Val Phe Arg Leu Glu Glu Pro Leu Leu Trp Glu210 215 220Tyr225<210>2<211>678<212>DNA<213>稻屬水稻(Oryza sativa L.ssp.japonica)<400>2atggacgact cgtcgttcgg ttccgagccg accacgtcct cctcgggcgg ggaggcgccg 60gcctccccgc cgtccaccgc gtcgtcgtcc tcagacggcg ccggcggcaa gaagaagcgg120ccgcgcaagg acgggcacca cccgacgtac cgcggggtgc gcatgcggag ctggggcaag180tgggtgtcgg agatcaggga gccgcggaag aagtcgcgca tctggctggg caccttcgcc240accgccgaga tggccgcgcg cgcgcacgac gtcgccgcgc tcgccatcaa gggccgcgcc300gcgcacctca acttcccgga cctcgcccac gagctgccgc gcccggccac cgcggcgccc360aaggacgtcc aggccgcagc cgcgctcgcc gccgccgccg acttcccggc ctcctccgcc420aatgcgggcg ccagcaataa ccccgacgga tcggacgacg cgagcgccgg gtccgcctcg480ccgcccccgc cgccggacgc cgctgacgac gcgctgttcg acctccccga cctcctcctc540gacctcagat acggcccgcc cagctcgggc ctctcgtgcg cgtcgtcttg ggaagacgaa600gtgggcttaa tctccggcgc cggtgccgcc gccgccggcg tgttccgcct ggaggagcca660cttctgtggg agtactaa 678
權(quán)利要求
1.水稻的DREB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)序列表中的SEQ ID №1；2)將序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一至十個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有轉(zhuǎn)錄激活功能的調(diào)控植物抗逆性的蛋白質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的水稻的DREB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子，其特征在于所述蛋白具有序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列。
3.編碼權(quán)利要求1所述的水稻DREB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子的基因，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID№2的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №1的DNA序列；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的水稻DREB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子的基因，其特征在于所述基因具有序列表中SEQ ID №2的DNA序列。
5.含有權(quán)利要求3所述基因的表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和宿主菌。
6.一種提高植物耐逆性的方法，是將權(quán)利要求3所述的水稻的DREB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子基因?qū)胫参锝M織或細(xì)胞，得到耐逆性提高的植物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述水稻的DREB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子基因通過(guò)含有所述水稻DREB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子基因的植物表達(dá)載體導(dǎo)入植物組織或細(xì)胞。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于用于構(gòu)建所述植物表達(dá)載體的出發(fā)載體為pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述植物表達(dá)載體為p1302-35s-ARAG1-GFP。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述植物宿主為水稻、小麥、大豆、煙草、擬南芥、玉米或棉花。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一個(gè)水稻DREB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因與應(yīng)用。其目的是提供一個(gè)來(lái)源于水稻EREBP/AP2家族的DREB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因與其在培育抗逆性提高的植物中的應(yīng)用。該轉(zhuǎn)錄因子是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)序列表中的SEQ ID №1；2)將序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一至十個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有轉(zhuǎn)錄激活功能的調(diào)控植物抗逆性的蛋白質(zhì)。通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將本發(fā)明的基因?qū)胫参锼拗鳎傻玫娇垢珊?、高鹽等逆境脅迫能力增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植物(作物)，并可培育出抗霉雨誘導(dǎo)的在穗發(fā)芽的新品種；另一方面，由于ABA是誘導(dǎo)果實(shí)脫落的主要激素，因而該基因也可用于防止果實(shí)脫落等分子育種中。本發(fā)明在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N15/82GK1772764SQ20051011254
公開(kāi)日2006年5月17日 申請(qǐng)日期2005年10月10日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月10日
發(fā)明者王臺(tái), 趙利峰 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院植物研究所