專利名稱：稻曲病菌的實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)稻曲病菌的實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒，包括稻曲病菌特異性引物和與之相匹配的熒光標(biāo)記探針，適用于對(duì)農(nóng)田環(huán)境中(包括土壤中越冬菌量以及稻田浮萍和水稻植株上)稻曲病菌進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)；也可以用于水稻種子帶菌檢測(cè)以及比較稻曲病菌不同菌株在不同水稻品種植株中的增殖速度。
背景技術(shù)：
由Ustilaginoidea virens(Cooke)Tak.引起的稻曲病是一種世界性水稻真菌病害，在中國、日本和印度等國家危害較重。稻曲病是一種水稻穗部病害，病菌將谷粒轉(zhuǎn)變成稻曲球，表面覆蓋大量粉狀、墨綠色的厚垣孢子。該病顯著地影響水稻產(chǎn)量和稻米品質(zhì)，發(fā)病嚴(yán)重的年份產(chǎn)量損失率為30-50％，并且加工后的稻米混有大量厚垣孢子。稻曲病菌厚垣孢子含有真菌毒素Ustilaxin。日本研究者的動(dòng)物毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，厚垣孢子水浸出液和微量UstilaxinA能引起鼠肝臟和腎臟壞死，劑量較大時(shí)引起前胃潰瘍、糜爛和胸腺萎縮。我國研究者的試驗(yàn)也表明用混有稻曲病粒的谷糠飼養(yǎng)家畜、家禽能引起慢性中毒，使其內(nèi)臟發(fā)生病變。
20世紀(jì)50年代稻曲病在我國開始輕微發(fā)生，80開始年代由次要病害上升為主要病害，并遍及全國各主要水稻種植區(qū)。目前我國大多數(shù)優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)的常規(guī)稻主栽品種及雜交稻組合對(duì)稻曲病都表現(xiàn)感病，甚至高度感病，加之環(huán)境中積累了大量的菌源，稻曲病在各水稻種植區(qū)頻繁暴發(fā)成災(zāi)。自20世紀(jì)80年代以來，日本對(duì)混入病粒的稻米在流通階段通常不予評(píng)定等級(jí)。我國在稻曲病發(fā)病嚴(yán)重的年份，加工出的稻米甚至呈淡綠色，食用后對(duì)人體健康極為不利。當(dāng)前，我國人民對(duì)農(nóng)產(chǎn)品的需求已經(jīng)逐漸從數(shù)量型消費(fèi)向質(zhì)量型消費(fèi)轉(zhuǎn)變，隨著人們對(duì)綠色食品的日益重視，稻曲病對(duì)我國稻米無公害生產(chǎn)的影響將日益突出。
20世紀(jì)50年代日本最早開始研究稻曲病的發(fā)生規(guī)律，目前國內(nèi)外研究者普遍認(rèn)為稻曲病為單循環(huán)病害。但是由于人工接種技術(shù)不成熟的限制，迄今，水稻對(duì)稻曲病抗性遺傳研究還是空白，因而難以培育抗病品種，長期以來，防治一直以噴施化學(xué)農(nóng)藥為主。稻曲病為穗部病害，若待發(fā)現(xiàn)癥狀再進(jìn)行防治為時(shí)已晚，因此監(jiān)測(cè)病原菌的群體動(dòng)態(tài)，是適時(shí)有效防治該病、實(shí)現(xiàn)農(nóng)藥安全減量使用的前提。
采用人工分離培養(yǎng)和常規(guī)的顯微鏡觀察可以檢查土壤中越冬厚垣孢子的數(shù)量；但是稻田中微生物種類繁多，稻曲病菌生長速度緩慢，并且厚垣孢子萌發(fā)產(chǎn)生的菌絲和分生孢子沒有特異的形態(tài)特征，采用顯微鏡觀察和分離培養(yǎng)等病理學(xué)手段都難以鑒定，因此無法了解水稻生長季節(jié)田間稻曲病菌的數(shù)量變化和對(duì)植株的侵染及其在植株中的增殖狀況。
分子檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展為檢測(cè)稻曲病菌提供了可能。研究表明核糖體ITS區(qū)的核酸序列具有區(qū)別真菌種的潛能。在前期研究中，申請(qǐng)者等全面研究了稻曲病及其同科(麥角菌科)近緣真菌的18S rRNA、ITS1、5.8S rRNA和ITS2核酸序列的系統(tǒng)發(fā)育(序列已登錄NCBI/Genbank，Acc No.AB092689，AB092943-AB092957，AB065423，AB038594，AB065432等)，經(jīng)與22種近緣真菌該區(qū)核酸序列進(jìn)行比較，設(shè)計(jì)了稻曲病菌特異性引物，建立了PCR檢測(cè)方法(Zhou et al，J.Phytopathology，2003，151(9)513-518)。
PCR方法可以特異地從土壤和植物組織中檢測(cè)稻曲病菌，具有常規(guī)植物病理學(xué)檢測(cè)方法無法替代的特異性好和靈敏性高的優(yōu)點(diǎn)。但是，這種傳統(tǒng)的PCR方法測(cè)定的都是PCR的終產(chǎn)物，而不是起始DNA的拷貝數(shù)。由于PCR的終產(chǎn)物與起始模板量之間沒有線形關(guān)系，所以根據(jù)最終的PCR產(chǎn)物量不能計(jì)算出起始DNA拷貝數(shù)。
熒光定量PCR是通過實(shí)時(shí)監(jiān)控PCR體系中的熒光信號(hào)，對(duì)樣本中初始模板進(jìn)行定量分析的一項(xiàng)新技術(shù)。建立稻曲病菌的熒光定量PCR檢測(cè)方法，將有效地監(jiān)測(cè)該病菌在環(huán)境中及水稻植株中的數(shù)量，為稻曲病發(fā)生的預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)和快速鑒定水稻品種的抗性差異提供一種新技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種稻曲病菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒，可以快速準(zhǔn)確地定量檢測(cè)稻曲病菌，特異性好、靈敏性高。
本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種熒光定量PCR試劑盒在對(duì)稻曲病流行監(jiān)測(cè)預(yù)報(bào)以及研究稻曲病菌在水稻植株中增殖速度、種子帶菌檢測(cè)等方面的應(yīng)用。
本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)稻曲病菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒包括標(biāo)準(zhǔn)陽性DNA模板、熒光定量反應(yīng)液。
標(biāo)準(zhǔn)陽性DNA模板由含有插入目標(biāo)片段的pUCm-T(購自Sangon公司)載體制備而成。標(biāo)準(zhǔn)品的制備過程為采用引物ITS4和ITS5擴(kuò)增稻曲病菌的ITS區(qū)，PCR產(chǎn)物電泳后切下含有目標(biāo)片段的凝膠，目標(biāo)片段用凝膠試劑盒回收純化后與pUCm-T載體16℃過夜連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂平板培養(yǎng)，挑取白斑，采用引物為US1-3/US2-5和UF1/UR1進(jìn)行PCR鑒定。陽性克隆通過序列分析進(jìn)一步鑒定結(jié)果的可靠性。選擇PCR和序列分析均為陽性的克隆，接種到含有氨卞青霉素的LB培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，用SDS堿解法制備質(zhì)粒DNA。DNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)A260定量，經(jīng)10倍梯度稀釋為250ng-250fg/μl，保存于-20℃。
熒光定量反應(yīng)液由正義引物UF1、反義引物UR1、熒光探針(Taqman)、10×PCR buffer、1mmol dNTP、25mM Mg2+、Taq DNA聚合酶組成。
為避免由于引物?；暂^低，PCR反應(yīng)中出現(xiàn)假陰性結(jié)果或?qū)Ψ悄繕?biāo)真菌產(chǎn)生非特異擴(kuò)增，本發(fā)明在系統(tǒng)分析稻曲病菌ITS區(qū)、18S rRNA和5.8S rRNA核酸序列系統(tǒng)發(fā)育的基礎(chǔ)上，采用軟件CLUSTAL，與麥角菌科近緣真菌的該區(qū)序列進(jìn)行比較，尋找稻曲病菌特異性序列區(qū)域；選擇稻曲病菌特異性序列區(qū)域，設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光PCR引物和探針，通過Blastnpogram(Http://www.Ncbi.nlm.nil.gov/blast)比較所設(shè)計(jì)的引物和探針序列與其它生物種是否具有顯著的同源性。本發(fā)明設(shè)計(jì)的稻曲病菌引物和探針序列與其它生物種沒有顯著同源性。正義引物UF1序列為5’-GAGGGCACCCGGAACCAG-3’，反義引物UR1序列為5’-CACTCAGACATGCATTGGAAAACA-3’，擴(kuò)增片段為77bp(圖1)。熒光探針UP1序列為5’FAM-CGCCCGCCGGAGGATACAACCAAA-TAMRA 3’，探針5’端標(biāo)記熒光發(fā)射基團(tuán)FAM(6-羧基熒光素)，靠近3’端標(biāo)以熒光淬滅基團(tuán)TAMRA，UF1、UR1和UP1在稻曲病菌基因組ITS序列上的位置如下 Ustilaginoidea virens 18S rRNA，ITS1，5.8S rRNA，ITS2部分序列NCBI登錄號(hào)為AB092956。US3-3/US4-5和US1-3/US2-5擴(kuò)增子長度分別為380bp和232bp。
本發(fā)明優(yōu)化的熒光定量PCR反應(yīng)體系總體積為25μl，其中10×PCR buffer 2.5μl，10μmol正義引物UF1和反義引物UR1各1μl，20μmol熒光探針UP1 1μl，1mmol dNTP 2μl，25mmolMg2+2μl，5U/μl Taq DNA聚合酶0.5μl(自制)，標(biāo)準(zhǔn)品10倍梯度稀釋液或待檢測(cè)樣品DNA溶液1μl。PCR采用兩步法，擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?5℃ 10min，95℃ 15s、60℃ 1min 40個(gè)循環(huán)。
在本發(fā)明提供的檢測(cè)稻曲病菌熒光定量PCR試劑盒中，熒光探針UP1的5′端標(biāo)記有報(bào)告基團(tuán)FAM，3′端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)TAMRA。當(dāng)探針完整的時(shí)候，報(bào)告基團(tuán)所發(fā)射的熒光能量被淬滅基團(tuán)吸收，儀器檢測(cè)不到信號(hào)。隨著PCR進(jìn)行，TaqDNA聚合酶在鏈延伸過程中遇到與模板結(jié)合的探針，其3′→5′外切核酸酶活性就會(huì)將探針切斷，報(bào)告基團(tuán)遠(yuǎn)離淬滅基團(tuán)，其能量不能被吸收，即產(chǎn)生熒光信號(hào)，報(bào)告基團(tuán)所釋放的熒光可以被定量檢測(cè)儀內(nèi)的熒光計(jì)檢測(cè)，模板每復(fù)制一次，就有一個(gè)探針被切斷，伴隨一個(gè)熒光信號(hào)的釋放。由于被釋放的熒光基團(tuán)數(shù)目和PCR產(chǎn)物數(shù)量是一對(duì)一的關(guān)系，所以熒光量的增加與PCR產(chǎn)物的積累量呈比例關(guān)系。CT(Threshold Cycle)值是PCR過程中熒光量的積累超過基底熒光量的循環(huán)數(shù)。利用陽性梯度標(biāo)準(zhǔn)模板的CT值制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)待測(cè)樣品的CT值可準(zhǔn)確測(cè)出該樣品的起始濃度。
本發(fā)明提供的稻曲病菌熒光定量PCR試劑盒，針對(duì)稻曲病菌基因組ITS區(qū)特異的靶序列設(shè)計(jì)探針和引物，通過優(yōu)化反應(yīng)體系(引物和探針濃度、Mg2+濃度、擴(kuò)增程序等)的優(yōu)化，采用定量檢測(cè)系統(tǒng)(包括ABI Prism系統(tǒng)、PE Applied Bioasystems、Bio-Rad)，可用于各種來源稻曲病菌的定量檢測(cè)。按照Ari M.Hietala et al的推算方法(Applied andEnvironmental Microbiology，2003，69(6)4413-4420)，實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的稀釋限點(diǎn)10fg質(zhì)粒DNA/μl相當(dāng)于0.3個(gè)細(xì)胞。
本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了使用本發(fā)明的試劑盒對(duì)稻曲病菌進(jìn)行檢測(cè)的方法，該方法的實(shí)驗(yàn)步驟為從待測(cè)樣品提取DNA；將加入標(biāo)準(zhǔn)品及待測(cè)樣品的熒光定量反應(yīng)液上機(jī)，用熒光定量檢測(cè)儀進(jìn)行PCR檢測(cè)；通過比較待測(cè)樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的循環(huán)域值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測(cè)樣品的起始DNA濃度。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果1)特異性好、鑒定快速引物和探針均包括稻曲病菌的特異性序列，檢測(cè)特異性高。環(huán)境中，特別是稻田水中微生物種類繁多，稻曲病菌的分生孢子及其萌發(fā)產(chǎn)生的菌絲均沒有特異性的形態(tài)特征，并且生長速度緩慢，本發(fā)明克服了顯微觀察和分離培養(yǎng)等常規(guī)植物病理學(xué)方法耗時(shí)以及結(jié)果具有不確定性的缺點(diǎn)(觀察或分離到菌絲難以確定是否為稻曲病菌)。
2)準(zhǔn)確定量、靈敏度高與普通PCR檢測(cè)相比，本發(fā)明可以準(zhǔn)確定量，目標(biāo)DNA在100ng-10fg/μl濃度范圍內(nèi)，都有很好的線性關(guān)系；同時(shí)檢測(cè)具重復(fù)性好的特點(diǎn)，一組樣品三次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)的Cp變異系數(shù)小于1.2％。雖然Nested PCR檢測(cè)的靈敏性與熒光定量PCR相近，但是不能定量，并且檢測(cè)所用時(shí)間明顯長于熒光定量PCR。
3)實(shí)用性好、應(yīng)用范圍廣可以定量檢測(cè)土壤、水稻生長季節(jié)空氣和稻田中稻曲病菌，適用于稻曲病菌田間動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，同時(shí)可用于稻曲病菌在水稻植株的中的增殖速度和種子帶菌的定量檢測(cè)。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施實(shí)例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)理解，下列實(shí)例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明要求保護(hù)范圍。應(yīng)用實(shí)例中DNA提取采用的是試劑盒，實(shí)際應(yīng)用中也可以采用CTAB等方法。
實(shí)施例1水稻生長季節(jié)田間浮萍上稻曲病菌菌量的檢測(cè)在北京市昌平區(qū)中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)基地，選取兩塊稻田一塊為2004年稻曲病重發(fā)生田，另一塊位于重病稻田下游的2004年之前一直種植大豆、2004年第一年種植水稻的田塊，兩塊田種植的水稻品種均為稻曲病感病品種優(yōu)質(zhì)1號(hào)，水稻育苗和插秧期相同。2005年7月15日從上述兩塊稻田的水面取浮萍，將從田間取回的浮萍立即進(jìn)行凍干處理。取凍干標(biāo)樣5mg，采用Epicentre公司的MasterPureTMDNA Purification Kit提取、純化DNA。DNA溶解于20μl TE緩沖液，取1μl DNA溶液作模板，進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。
熒光定量PCR反應(yīng)體系總體積為25μl，其中10×PCR buffer 2.5μl，10μmol正義引物UF1和反義引物UR1各1μl，20μmol熒光探針UP1 1μl，1mmol dNTP 2μl，25mmol Mg2+2μl，5U/μlTaq DNA聚合酶0.5μl(自制)，模板1μl。模板包括標(biāo)準(zhǔn)品10倍梯度稀釋液(25ng/μl、2ng/μl、200pg/μl、20pg/μl、200fg/μl)和待測(cè)樣品DNA溶液。PCR采用兩步法，擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?5℃ 10min，95℃ 15s、60℃ 1min 40個(gè)循環(huán)。
循環(huán)結(jié)束后，采用儀器自帶的分析軟件，分析擴(kuò)增結(jié)果(圖2)、制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖3)，計(jì)算待測(cè)樣品稻曲病菌DNA含量。結(jié)果表明標(biāo)準(zhǔn)品有極好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.9985；待測(cè)樣品有明顯的熒光信號(hào)增加，并且具有很好的動(dòng)力學(xué)曲線，反應(yīng)體系中重病田和2004年種植大豆的稻田中稻曲病菌DNA量分別為47.5pg和14.1pg。
表1熒光定量PCR的CT值和樣品的DNA含量

上述結(jié)果表明稻曲病菌在水稻的生長季節(jié)可以附著在水面的浮萍上，位于稻田下游、第一年種植水稻的田塊在7月中旬浮萍也可以檢測(cè)到稻曲病菌，但是該田塊水面的浮萍數(shù)量顯著少于重病田。通過顯微鏡觀察，在豆田中未看到厚垣孢子，我們推測(cè)豆田中的稻曲病菌可能是上游重病田中的厚垣孢子萌發(fā)產(chǎn)生的菌絲或分生孢子隨水流進(jìn)入到豆田、并在豆田中進(jìn)一步增殖。2005年10月調(diào)查兩塊地的發(fā)病情況，采用平行跳躍取樣法，每塊地取9點(diǎn)，每點(diǎn)取5穴，調(diào)查發(fā)病穴數(shù)、發(fā)病穗數(shù)，計(jì)算病穴率和病穗率。重病田的平均病穴率和病穗率分別為100％和44.02％；2004年種植大豆的田塊平均病穴率和病穗率分別為95.56％和20.84％，因此我們推斷適時(shí)清除水面的浮萍可能有效地降低田間的菌源，降低發(fā)病率。本試驗(yàn)表明采用熒光定量PCR檢測(cè)田間稻曲病菌的數(shù)量和動(dòng)態(tài)，將為深入研究該病的發(fā)生規(guī)律和防治提供有用的信息。
實(shí)施例2水稻生殖生長期植株小穗內(nèi)部稻曲病菌的檢測(cè)2004年8月初于水稻生殖生長期在沈陽東陵區(qū)汪家鄉(xiāng)稻田取樣，樣本為破口期幼穗。對(duì)樣本進(jìn)行反復(fù)清洗，鏡檢確認(rèn)樣本表面無菌絲和孢子后，采用Epicentre公司的MasterPureTMDNA Purification Kit提取、純化DNA。每個(gè)幼穗的DNA溶解于20μlTE緩沖液，取1μl DNA溶液作模板，采用引物對(duì)US3-3/US4-5(第一輪)和US1-3/US2-5(第二輪)對(duì)各樣品進(jìn)行Nested PCR(巢式PCR)檢測(cè)，第二輪PCR以1μl第一輪PCR產(chǎn)物為模板。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2％瓊脂糖電泳檢測(cè)。
選取瓊脂糖電泳檢測(cè)第一輪擴(kuò)增后在瓊脂糖凝膠上無可見擴(kuò)增帶、第二輪擴(kuò)增有可見擴(kuò)增帶產(chǎn)生的樣品進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。熒光定量PCR反應(yīng)體系總體積為25μl，其中10xPCR buffer 2.5μl，10μmol正義引物UF1和反義引物UR1各1μl，20μmol熒光探針UP1 1μl，1mmol dNTP 2μl，25mmol Mg2+2μl，5U/μl Taq DNA聚合酶0.5μl(自制)，模板1μl。模板包括標(biāo)準(zhǔn)品10倍梯度稀釋液(25ng/μl、2ng/μl、200pg/μl、20pg/μl、200fg/μl)和待測(cè)樣品DNA溶液。PCR采用兩步法，擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?5℃ 10min，95℃ 15s、60℃ 1min 40個(gè)循環(huán)。
循環(huán)結(jié)束后，采用儀器自帶的分析軟件，分析擴(kuò)增結(jié)果(圖4)、制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算待測(cè)樣品稻曲病菌DNA含量，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測(cè)樣品反應(yīng)體系中稻曲病菌的DNA量為36.7fg，表明在水稻破口期稻曲病菌已侵入水稻植株，但是在植株中還未大量增殖。采用Nested PCR檢測(cè)稻曲病菌從擴(kuò)增到電泳檢測(cè)需要將近5小時(shí)，而熒光定量PCR檢測(cè)全程僅需要1.5小時(shí)即可完成，因此，與傳統(tǒng)的PCR檢測(cè)方法相比，使用該熒光定量PCR方法不僅可以對(duì)待測(cè)樣品中稻曲病菌定量，而且可以明顯縮短檢測(cè)所需要的時(shí)間。


圖1是引物對(duì)US1-3/US2-5(A)、US3-3/US4-5(B)和UF1/UR1(C)擴(kuò)增稻曲病菌基因組DNA和含有稻曲病菌ITS區(qū)質(zhì)粒DNA產(chǎn)物CK1為水的陰性對(duì)照，CK2反應(yīng)的模板為水稻DNA，1和2的模板為2個(gè)稻曲病菌菌株的基因組DNA，3和4的模板為陽性標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒DNA。M為100bp Marker(鼎國生物技術(shù)有限公司)。
圖2實(shí)例1熒光定量PCR擴(kuò)增曲線縱軸為Delta Rn；橫軸為Cycle Number，曲線a，b，c，d和e的模板為陽性標(biāo)準(zhǔn)品，反應(yīng)體系中DNA含量分別為1ng，100pg，10pg，1pg和10fg；曲線f為重病田的待測(cè)樣品；曲線g為重病田下游田塊的待測(cè)樣品。
圖3實(shí)例1熒光定量PCR擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)曲線縱軸為Ct，橫軸為Log CO；標(biāo)準(zhǔn)誤為0.998542圖4實(shí)例2熒光定量PCR擴(kuò)增曲線縱軸為Delta Rn；橫軸為Cycle Number，曲線a，b，c，d和e的模板為陽性標(biāo)準(zhǔn)品，反應(yīng)體系中DNA含量分別為1ng，100pg，10pg，1pg和10fg；曲線f為待測(cè)樣品。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)稻曲病菌的熒光定量PCR試劑盒，該試劑盒包括正義引物UF1、反義引物UR1、熒光探針(Taqman)、10×PCR buffer、1mmol dNTP、25mM Mg2+、Taq DNA聚合酶(自制)組成。正義引物UF1序列為5’-GAGGGCACCCGGAACCAG-3’，反義引物UR1序列為5’-CACTCAGACATGCATTGGAAAACA-3’，擴(kuò)增片段為77bp。熒光探針UP1序列為5’FAM-CGCCCGCCGGAGGATACAACCAAA-TAMRA 3’，探針5’端標(biāo)記熒光發(fā)射基團(tuán)FAM(6-羧基熒光素)，靠近3’端標(biāo)以熒光淬滅基團(tuán)TAMRA。標(biāo)準(zhǔn)陽性由插入ITS區(qū)的pUCm-T載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α增殖后提取的質(zhì)粒DNA，DNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)A260定量并10倍梯度稀釋。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)稻曲病菌的熒光定量PCR試劑盒，其特征是熒光定量PCR反應(yīng)體系總體積為25μl，其中10×PCR buffer 2.5μl，10μmol正義引物UF1和反義引物UR1各1μl，20μmol熒光探針UP1 1μl，1mmol dNTP 2μl，25mmol Mg2+2μl，5U/μl Taq DNA聚合酶0.5μl，標(biāo)準(zhǔn)品10倍梯度稀釋液或待檢測(cè)樣品DNA溶液1μl。PCR采用兩步法，擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?5℃10min，95℃15s、60℃1min40個(gè)循環(huán)。
3.權(quán)利要求1所述的檢測(cè)稻曲病菌的熒光定量PCR試劑盒，可以應(yīng)用于對(duì)農(nóng)田環(huán)境中(包括土壤中越冬菌量以及稻田浮萍和水稻植株上)稻曲病菌進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，以及檢測(cè)水稻種子帶菌、比較稻曲病菌不同菌株在不同水稻品種植株中的增殖速度。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)稻曲病菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR的試劑盒及其應(yīng)用。該試劑盒利用熒光探針(Taqman)和正義引物、反義引物和陽性標(biāo)準(zhǔn)品，建立了實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系，可以快速、定量地檢測(cè)稻曲病菌。適用于對(duì)農(nóng)田環(huán)境中(包括土壤中越冬菌量以及稻田浮萍和水稻植株上)稻曲病菌進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)；也可以用于水稻種子帶菌檢測(cè)以及比較稻曲病菌在不同水稻品種中的增殖速度。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1851448SQ20051012635
公開日2006年10月25日 申請(qǐng)日期2005年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月8日
發(fā)明者周永力, 謝學(xué)文, 徐建龍, 王疏, 黎志康 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所