專利名稱：一種轉(zhuǎn)基因食用菌及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程育種，具體地涉及抗低溫冷凍的轉(zhuǎn)基因食用菌以及獲得該轉(zhuǎn)基因食用菌的方法。
背景技術(shù)：
高溫型的食用菌，例如草菇在常規(guī)低溫(4℃)條件下，其菌絲會發(fā)生自溶而死亡，子實(shí)體會發(fā)軟、液化和腐爛。這一特性嚴(yán)重地限制了高溫型食用菌的生產(chǎn)、新鮮菌的流通、低溫冷凍保鮮和出口創(chuàng)匯以及菌種的低溫貯藏。因此，培育抗低溫冷凍的新品種就顯得尤為重要。
抗冷凍蛋白(antifreeze proteins，AFPs)是一類具有降低生物體液冰點(diǎn)和抑制冰晶生長的生物活性蛋白，在低溫生物的生存中起著重要的作用。目前，已從魚類、昆蟲、植物、真菌、細(xì)菌中分離得到了許多種類的抗冷凍蛋白，其中魚類、昆蟲和植物已克隆分離到了抗冷凍蛋白基因。在這些抗冷凍蛋白基因中研究和應(yīng)用較多的是魚類抗冷凍蛋白基因，它已廣泛用于轉(zhuǎn)化魚類、植物等，并獲得了抗冷凍或耐寒的轉(zhuǎn)基因魚和轉(zhuǎn)基因植物。而昆蟲的抗凍蛋白的活性具有比所有已知北極魚的抗冷凍蛋白活性高出10-30倍，甚至100倍，因而昆蟲的抗冷凍蛋白基因(afp)日益受到重視。我們從生活在瑞典北歐的一種鱗翅目昆蟲的幼蟲(Budworm)中克隆分離到了具有很強(qiáng)抗冷凍活性的抗冷凍蛋白基因(afp)。

發(fā)明內(nèi)容
(一)要解決的技術(shù)問題本發(fā)明的目的在于提供抗低溫冷凍的轉(zhuǎn)基因食用菌菌株。
本發(fā)明的另一個目的在于提供獲得抗低溫冷凍食用菌的方法。
(二)技術(shù)方案本發(fā)明為一種轉(zhuǎn)基因食用菌，該轉(zhuǎn)基因食用菌基因組中整合了抗冷凍蛋白基因。
本發(fā)明所述的轉(zhuǎn)基因食用菌中，抗冷凍蛋白基因序列為SEQ ID NO1，或?yàn)镾EQ ID NO1經(jīng)改變、缺失或增加一個或若干個核苷酸而其表達(dá)產(chǎn)物仍具有抗冷凍蛋白活性的序列。
本發(fā)明所述的轉(zhuǎn)基因食用菌中，抗冷凍蛋白基因序列與SEQ ID NO1所示核苷酸序列有80％以上的同源性且其表達(dá)產(chǎn)物仍具有抗冷凍蛋白活性。
本發(fā)明所述的轉(zhuǎn)基因食用菌，該食用菌是草菇。
本發(fā)明還公開了一種該轉(zhuǎn)基因食用菌的制備方法，包括a.構(gòu)建含有SEQ ID NO1所示核苷酸序列的重組表達(dá)質(zhì)粒；b.將PDSB培養(yǎng)基上生長健壯的食用菌菌絲體在超凈臺上分割成小菌塊，小菌塊平鋪于墊有兩層吸足PDSB培養(yǎng)基的濾紙的培養(yǎng)皿中間形成直徑約6cm的圓圈；c.吸取50μL的金粉懸浮液，邊渦旋邊分別加入5.0μL的1μg/μL重組表達(dá)質(zhì)粒、50μL 2.5M的CaCl2、20μL的新鮮配置的除菌亞精胺，繼續(xù)渦旋10min，靜置1min，12,000r/min離心5min，棄盡上清；之后加入140μL的70％的酒精，充分渦旋，12,000r/min離心5min，棄盡上清；再加入140μL無水酒精，充分渦旋，12,000r/min離心5min，棄盡上清；最后再加入50μL的無水酒精，充分渦旋后，制成了DNA微彈；d.在基因槍的超凈工作臺里，吸取8μL的DNA微彈均勻地涂布在大載片上，涂布成直徑1cm的小圓圈；e.打開基因槍電源，設(shè)定好基因槍的轟擊參數(shù)，把包裹重組表達(dá)質(zhì)粒的微彈轟擊進(jìn)食用菌的菌絲體中；f.取出轟擊后的菌絲體，置于28℃的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行過渡培養(yǎng)2-3天，之后轉(zhuǎn)移到含有選擇因子的PDSA平板上進(jìn)行初步篩選，培養(yǎng)一周；g.在超凈臺中，把能在篩選培養(yǎng)基上生長的菌絲體切割成0.1×0.5cm的長方塊轉(zhuǎn)移進(jìn)含有更高濃度選擇因子的PDSB液體選擇培養(yǎng)基中，置于28℃，轉(zhuǎn)速為150-180r/min的搖床上培養(yǎng)3周；h.3周后，選擇有生長的菌塊，進(jìn)一步切割成薄的小菌塊，在選擇培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)3周后，獲得轉(zhuǎn)化菌株。
本發(fā)明所述的制備方法步驟e的基因槍轟擊參數(shù)為氦氣壓力1100Psi，真空壓26inchesHg，靶距離6cm，轟擊次數(shù)1次。
(三)有益效果本發(fā)明將具有很強(qiáng)抗冷凍活性的抗冷凍蛋白基因(afp)，利用基因槍轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入食用菌菌絲體中，即利用基因工程的手段培育抗寒的食用菌新菌株，從而克服了食用菌常規(guī)育種培育抗寒新菌株的困難，為食用菌的遺傳育種成功開辟一條新的育種途徑——基因工程育種；并使受低溫限制的高溫型食用菌的生產(chǎn)、新鮮菌的流通、低溫冷凍保鮮以及菌種的低溫貯藏等問題得到解決。


圖1表達(dá)載體pCAMBIA1301圖；圖2草菇表達(dá)載體pCTH823圖；圖3轉(zhuǎn)基因草菇基因組DNA的抗冷凍蛋白基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果。泳道M是DNA marker，泳道a是陽性對照，泳道b-f，h-k是轉(zhuǎn)基因草菇的不同菌株，泳道g是空白對照，泳道1是質(zhì)粒pGTHP4；圖4轉(zhuǎn)基因草菇的Southern Blotting分子雜交檢測結(jié)果。泳道M是DNAmarker；泳道a-i是轉(zhuǎn)基因草菇的不同菌株，泳道j是質(zhì)粒pGTHP4，泳道k是對照菌株；圖5轉(zhuǎn)基因草菇F1代菌絲基因組DNA的PCR擴(kuò)增結(jié)果。泳道1為非轉(zhuǎn)基因草菇親代，泳道2-8和泳道10為F1代轉(zhuǎn)基因草菇，泳道9為非轉(zhuǎn)基因草菇F1代，泳道11為陽性質(zhì)粒pGTHP4；M為DNA marker DL2000。
具體實(shí)施例方式
所用的培養(yǎng)基為常規(guī)的草菇菌絲培養(yǎng)基，它們的配方分別為PDSA去皮馬鈴薯200g，葡萄糖20g，KH2PO43g，MgSO41.5g，維生素B15-10mg，瓊脂20g，H2O 1L；PDSB去皮馬鈴薯200g，葡萄糖20g，KH2PO43g，MgSO41.5g，維生素B15-10mg，H2O 1L；
DTB葡萄糖20g，胰蛋白胨2.0g，KH2PO40.6g，MgSO40.5g，維生素B10.5g，H2O 1L。
實(shí)施例1 重組質(zhì)粒構(gòu)建以AFP1(5’-TGCAGGAATCGGCACGAGGAA-3’)和AFP2(5’-GACTTTCATGGCTTAATTAGC-3’)為引物，采用RT-PCR技術(shù)從生活在瑞典的北歐Budworm中擴(kuò)增得到抗冷凍蛋白基因(afp)。把a(bǔ)fp基因與T-Vector載體連接，形成重組質(zhì)粒pGTHP4；接頭的設(shè)計(jì)與合成，依據(jù)與限制性內(nèi)切酶BstZ I和BstE II酶切后留下的粘性末端堿基相匹配并在接頭中間增加酶切位點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)要求設(shè)計(jì)合成兩條Oligo核苷酸，即5’-GGCCGCCATGGA-TGGTAACCAAGATCTAG-3’(29bp)和5’-GTAACCTAGATCTTGGTTACC-ATCCATGGC-3’(30bp)，退火后即為連接接頭，其中包括了Nco，BstE II，Bgl II 3個酶切位點(diǎn)。接頭由上海生物工程公司合成提供。
以限制性內(nèi)切酶Bst EII和Nco I雙酶解質(zhì)粒pCAMBIA1301(來自澳大利亞國際農(nóng)業(yè)分子生物學(xué)應(yīng)用中心，該質(zhì)粒完整的載體圖見圖1)該質(zhì)粒含有CaMV 35S啟動子，潮霉素抗性基因，CaMV 35S polyA終止子，Nos polyA終止子)，酶解產(chǎn)物以1％的凝膠電泳分離，以凝膠DNA提取Kit(購自QIAGEN公司)回收含有35S啟動子、潮霉素抗性基因的大片段。以限制性內(nèi)切酶Bst ZI和Nco I雙酶解質(zhì)粒pGTHP4，以同樣的方法回收含有afp基因的小片段。把回收的大片段和小片段通過粘端連接后，再加入接頭進(jìn)行環(huán)化連接，構(gòu)建了草菇表達(dá)載體pCTH823。pCTH823表達(dá)載體含有抗冷凍蛋白基因、CaMV 35S啟動子，潮霉素抗性基因afp，CaMV 35S polyA終止子，Nos polyA終止子(圖2)。
實(shí)施例2 DNA微彈的制備吸取50μL的金粉懸浮液(直徑為0.1μm，濃度為60mg/mL)，邊渦旋邊分別加入5.0μL的質(zhì)粒pCTH823(1μg/μL)、50μL 2.5M的CaCl2、20μL的亞精胺(過濾滅菌，現(xiàn)配現(xiàn)用)，繼續(xù)渦旋10min，靜置1min，12,000r/min離心5min，棄盡上清；之后加入140μL的70％的酒精，充分渦旋，12,000r/min離心5min，棄盡上清；再加入140μL無水酒精，充分渦旋，12,000r/min離心5min，棄盡上清；最后再加入50μL的無水酒精，充分渦旋后，制成了DNA微彈。
實(shí)施例3 DNA微彈轟擊進(jìn)入草菇的菌絲體(1)選擇在PDSA培養(yǎng)基上生長健壯的草菇菌絲體，生長約5天，生長溫度為28℃，于超凈臺上分割成3mm見方的小菌塊。取小菌塊平鋪于墊有兩層吸足PDSB培養(yǎng)基的濾紙的培養(yǎng)皿(d＝9cm)中間形成直徑約6cm的圓圈；(2)在基因槍的超凈工作臺里，吸取8μL的DNA微彈均勻地涂布在大載片(Macrocarrier)上，涂布成直徑約1cm的小圓圈；(3)打開電源，設(shè)定好基因槍的轟擊參數(shù)，用70％的酒精擦洗基因槍內(nèi)壁及可裂圓片安裝帽(Rupture disk retaining cap)。涼干后，把可裂圓片裝進(jìn)安裝帽的槽中，之后固定在基因槍上方；把涂有DNA微彈的大載片裝入大載片架中并蓋上大載片蓋，固定在已安裝上阻擋網(wǎng)的微彈發(fā)射臺(MicrocarrierLaunch Assembly)上；在距微彈發(fā)射臺6cm處裝進(jìn)(1)中已備好的草菇小菌塊，關(guān)上基因槍門；打開抽真空開關(guān)(VAC)，當(dāng)真空壓達(dá)到26 inchesHg時，將VAC鍵轉(zhuǎn)至HOLD鍵，然后按下FIRE鍵使氦氣壓力達(dá)到1100Psi時轟擊。之后，按下VENT鍵以消除真空，當(dāng)真空壓降為零時，打開基因槍門，取出已轟擊過草菇小菌塊；實(shí)施例4 草菇轉(zhuǎn)化子的篩選取轟擊后的草菇小菌塊置于28℃的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行過度培養(yǎng)2-3天，之后轉(zhuǎn)移到含有潮霉素(50μg/mL)的PDSA平板上培養(yǎng)一周，進(jìn)行初步篩選；在超凈臺中，把能在篩選培養(yǎng)基上生長的草菇菌絲體切割成0.1×0.5cm的長方塊轉(zhuǎn)移進(jìn)含有潮霉素的PDSB液體選擇培養(yǎng)基中，潮霉素含量為40μg/mL。置于28℃，150-180r/min的搖床上培養(yǎng)3周；3周后，選擇有生長的菌塊，進(jìn)一步切割成薄的小菌塊，轉(zhuǎn)移至含有潮霉素(40μg/mL)的DTB液體選擇培養(yǎng)基中，于28℃在150-180r/min的搖床上繼續(xù)培養(yǎng)3周，以獲得草菇轉(zhuǎn)化菌株。
經(jīng)3輪篩選后，轉(zhuǎn)基因草菇能在含有潮霉素的選擇培養(yǎng)基上生長，而對照不能含有潮霉素的選擇培養(yǎng)基上生長。表明獲得了草菇轉(zhuǎn)基因菌株。
實(shí)施例5PCR鑒定草菇轉(zhuǎn)化子用常規(guī)PCR方法鑒定草菇轉(zhuǎn)化子，PCR產(chǎn)物用10g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測，并觀察到特異性條帶(圖3)。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因草菇的基因組中含有目的基因抗冷凍蛋白基因。
實(shí)施例6 轉(zhuǎn)基因草菇的Southern Blotting分子雜交檢測(1)以限制性內(nèi)切酶Hind III酶切轉(zhuǎn)基因草菇和對照的總DNA，反應(yīng)體系為(2)ddH2O 16.0μL10X Buffer 4.0μLHind III(10U/μL) 3.0μL總DNA(1.21μg/μL) 17.0μL總體積 40.0μL質(zhì)粒pGAFP4的酶切反應(yīng)體系為ddH2O 8.0μL10X Buffer 1.5μLSal I(10U/μL) 0.5μLpGAFP4(10pg/μL) 5.0μL總體積 15.0μL加樣完畢，置于37℃溫度下酶切過夜。
(2)配制0.8％的Agrose膠，酶切產(chǎn)物全部點(diǎn)樣，并以20V的電壓電泳過夜。
(3)DNA轉(zhuǎn)膜a)取出凝膠，在凝膠旁放一標(biāo)尺并在紫外燈下照相；b)將凝膠放入一白磁盤中，加入0.2M HCl室溫下?lián)u動15min，之后，以ddH2O稍沖洗。
c)加入300mL變性液(1M NaCl，0.5M NaOH)，室溫下輕輕搖動，變性處理2×20min。然后，以ddH2O沖洗干凈；d)加入300mL的中和液(3M NaCl，0.5M Tris-HCl(pH7.4)，室溫下輕搖2×20min，中間換一次溶液，以ddH2O沖洗干凈；e)在一白瓷盤上橫架一比膠板寬的塑料板，剪一普通濾紙橫鋪于塑料板上，兩端垂浸于瓷盤20×SSC的溶液中，形成一類似弓橋結(jié)構(gòu)；f)在“弓橋”上放2-3張與電泳膠一樣大小的3MM濾紙，以20×SSC溶液濕透，除去氣泡；g)在電泳膠的右上角切去一小塊，倒放在3MM濾紙上，小心趕走所有氣泡；h)切一張比與電泳膠略大或一樣大小的尼龍雜交膜(剪去右角)，放入20×SSC溶液表面，膜濕后浸入20×SSC溶液約2-3min；i)將浸濕的尼龍膜平鋪在電泳膠上，小心去除期間氣泡；j)在尼龍雜交膜上放置3張以20×SSC溶液濕透的3MM濾紙，以保鮮膜封住膠周圍的所有濾紙，使得瓷盤中的溶液只能通過凝膠往上吸；k)在3MM濾紙上放一疊10cm厚的吸水紙，上面放一本約0.5Kg重的書，室溫放置過夜。
l)取下重物及吸水紙，在尼龍膜上用鉛筆標(biāo)記電泳膠的加樣孔的位置。將尼龍膜放入6×SSC溶液約5min，室溫自然干燥10分鐘，在80℃下烘烤1小時，使DNA牢固結(jié)合在膜上。
(4)DNA分子雜交I.探針的制備a.目的片段的擴(kuò)增與回收以Primer AFP1和Primer AFP2為引物，對質(zhì)粒pGAFP4進(jìn)行PCR擴(kuò)增，利用QIAquick Gel Extraction Kit回收afp基因片段。
b.標(biāo)記探針探針標(biāo)記采用Prime-It II Random Primer Labeling Kit(購自STRATAGENE公司)上的說明進(jìn)行，即
1)在1.5mL的離心管中分別加入1μL(30ng/μL)的THP探針，23μL的ddH2O，10μL的隨機(jī)寡核苷酸引物，渦旋混勻后，置于100℃的HeatBlock中變性5min；2)稍離心后，加入10μL 5×dCTP Primer Buffer、5μL labeled CTP、1μLKlenow酶，渦旋混勻后置于37℃水浴中5min；3)加入2μL的stop混合液以終止反應(yīng)，置于冰上2min；4)取一探針純化柱，加入標(biāo)記好的探針，離心以去除多余的32P，之后，置于100℃的Heat Block中加熱5min。
II預(yù)雜交和雜交a.將干燥的尼龍膜放入塑料盒中，用2×SSC溶液搖動洗滌10min后取出，以3M濾紙吸干多余的溶液，置于UV Cross link箱中以1200×100微居里的能量照射1h；b.更換塑料盒中的2×SSC溶液，放入尼龍膜在室溫下?lián)u動1h；c.把尼龍膜放入雜交筒中，加入20mL的預(yù)雜交液(1mM EDTA(pH 8)，0.5MNaH2PO4(pH 7.2)，7％ SDS，1％ BSA)并在65℃下雜交6h；d.棄去預(yù)雜交液，加入20mL的新預(yù)雜交液和50μL探針，在65℃下雜交過夜。
(5)洗膜和放射自顯影a.倒出雜交液于一廢液瓶里，加入20mL的洗液1(5％ SDS，40mM NaH2PO4)，在65℃下洗滌30min后倒到廢液瓶里，重復(fù)1次。
b.加入20mL的洗液2，在65℃下洗滌30min后倒到水槽里，用吸水紙吸干膜上的水滴，用同位素檢查儀檢查膜上探針信號的強(qiáng)弱；c.用保鮮膜包裹尼龍膜，標(biāo)好記號，在暗室中將X光片覆蓋在尼龍膜上，再加一增感屏，夾緊暗盒，在-80℃下曝光2天。
d.沖洗曝光后的X光片，可觀察到凝膠電泳中與探針雜交的DNA帶(圖4)。圖4顯示了9個轉(zhuǎn)基因草菇的樣品中均產(chǎn)生了與afp探針雜交的雜交帶(a-i泳道)，而對照沒有雜交帶(k泳道)，說明這9個受檢樣品中，afp確已整合到草菇基因組中。
實(shí)施例7 轉(zhuǎn)基因草菇低溫生長試驗(yàn)按常規(guī)方法制備PDSA平板，每個平板接入2塊黃豆大小的轉(zhuǎn)基因草菇菌種，以非轉(zhuǎn)化子為對照，置于4℃冰箱里，培養(yǎng)16天。
3天之前每隔12h取出一個處理，3天之后每天取出一個處理，置于28℃的溫度條件下培養(yǎng)。結(jié)果轉(zhuǎn)基因草菇在4℃培養(yǎng)1-2周還能正常生長，而對照已死亡。
實(shí)施例8 轉(zhuǎn)基因草菇F1代生長試驗(yàn)(1)制作栽培種栽培種的培養(yǎng)基配方為廢棉93％，麩皮5％，石膏1％，石灰1％，按培養(yǎng)基配方分別稱取足夠量的培養(yǎng)料，以料水比1∶1.6的比例進(jìn)行混勻，分裝于菌種瓶中，每瓶裝干料120g，高壓滅菌(1.176×105Pa，121℃，2h)。
(2)接種在超凈工作臺上接入黃豆大小的草菇菌種于菌種瓶中，33℃培養(yǎng)，7-10天后菌絲長滿瓶，即為栽培種。
(1)框栽試驗(yàn)框栽培養(yǎng)基配方為廢棉98％，石膏1％，石灰1％。按培養(yǎng)基配方分別稱取足夠量的培養(yǎng)料，以料水比1∶1.6的比例進(jìn)行混勻，裝袋，常壓殺菌2.5h。
(2)在21cm×25cm×10cm的塑料框中鋪上一層保鮮膜，先在框底鋪一薄層(1cm)栽培種，然后鋪一層配制好的培養(yǎng)基(約4.5cm)，再鋪一層栽培種(約1.5cm)，如此接種至2層培養(yǎng)基3層菌種。每框裝干料510g，菌種半瓶，每個處理重復(fù)一次，之后，置于可人工控制溫濕度的菇房內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)及出菇。
(3)待草菇出菇以后，收集草菇擔(dān)孢子，此孢子即為轉(zhuǎn)基因草菇F1代的擔(dān)孢子。
(4)按常規(guī)方法配制含有潮霉素的選擇培養(yǎng)基PDA平板，把用無菌水稀釋的草菇擔(dān)孢子液涂布在選擇培養(yǎng)基PDA平板。
(5)結(jié)果轉(zhuǎn)基因草菇F1代的擔(dān)孢子能在選擇培養(yǎng)基上生長，而對照的孢子不能生長。這說明了轉(zhuǎn)基因草菇F1代的擔(dān)孢子中含有外源潮霉素抗性基因，說明用基因槍轉(zhuǎn)化法把外源基因轉(zhuǎn)化進(jìn)草菇的菌絲體中是可以遺傳的。
(6)隨機(jī)挑取在潮霉素平板上生長的轉(zhuǎn)基因草菇F1代菌絲，轉(zhuǎn)接于PDA平板上，收集菌絲，提取基因組DNA，進(jìn)行PCR鑒定。PCR鑒定的結(jié)果如圖5所示，表明轉(zhuǎn)基因草菇F1代菌絲體的基因組中含有抗冷凍蛋白基因，這進(jìn)一步說明了afp基因可在草菇菌絲體中穩(wěn)定表達(dá)。
序列表<110>華南農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>一種轉(zhuǎn)基因食用菌及其制備方法<160>1<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>411<212>DNA<213>Budworm<400>1tgcaggaatc ggcacgagga aagacatatt tttttttagt ttcaaaagtt gtgtacattt 60ttctcaagta tcatgaagtg tttaatgctg atcatggctc tagccattat caacactgta120tcttctgatg gctcgtgtac aaacacgaac tctcagctca gcgcaaactc caagtgcgaa180aaatcgacgt tgaccaactg ctacgtcgat aaaagcgagg tttacggcac tacctgtaca240ggaagccgat tcgacggagt cactataacg acttcaacat ctaccggttc acgtatttca300ggccctggat gcaagatttc cacttgcatt atcaccgggg gtgtacctgc tccatcagct360gcttgcaaga tttctggatg tactttcagt gctaattaag ccatgaaagt c 41權(quán)利要求
1.一種轉(zhuǎn)基因食用菌，其特征在于該轉(zhuǎn)基因食用菌基因組中整合了抗冷凍蛋白基因。
2.如權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因食用菌，其特征在于抗冷凍蛋白基因序列為SEQ ID NO1，或?yàn)镾EQ ID NO1經(jīng)改變、缺失或增加一個或若干個核苷酸而其表達(dá)產(chǎn)物仍具有抗冷凍蛋白活性的序列。
3.如權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因食用菌，其特征在于抗冷凍蛋白基因序列與SEQ ID NO1所示核苷酸序列有80％以上的同源性且其表達(dá)產(chǎn)物仍具有抗冷凍蛋白活性。
4.如權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因食用菌，其特征在于所述的食用菌是草菇、蘑菇、平菇、香菇。
5.一種權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因食用菌的制備方法，包括a.構(gòu)建含有SEQ ID NO1所示核苷酸序列的重組表達(dá)質(zhì)粒；b.將PDSB培養(yǎng)基上生長健壯的食用菌菌絲體在超凈臺上分割成小菌塊，小菌塊平鋪于墊有兩層吸足PDSB培養(yǎng)基的濾紙的培養(yǎng)皿中間形成直徑6cm的圓圈；c.吸取50μL的金粉懸浮液，邊渦旋邊分別加入5.0μL的1μg/μL重組表達(dá)質(zhì)粒、50μL 2.5M的CaCl2、20μL的新鮮配置的除菌亞精胺，繼續(xù)渦旋10min，靜置1min，12,000r/min離心5min，棄盡上清；之后加入140μL的70％的酒精，充分渦旋，12,000r/min離心5min，棄盡上清；再加入140μL無水酒精，充分渦旋，12,000r/min離心5min，棄盡上清；最后再加入50μL的無水酒精，充分渦旋后，制成了DNA微彈；d.在基因槍的超凈工作臺里，吸取8μL的DNA微彈均勻地涂布在大載片上，涂布成直徑1cm的小圓圈；e.打開基因槍電源，設(shè)定好基因槍的轟擊參數(shù)，把包裹重組表達(dá)質(zhì)粒的微彈轟擊進(jìn)食用菌的菌絲體中；f.取出轟擊后的菌絲體，置于28℃的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行過渡培養(yǎng)2-3天，之后轉(zhuǎn)移到含有選擇因子的PDSA平板上進(jìn)行初步篩選，培養(yǎng)一周；g.在超凈臺中，把能在篩選培養(yǎng)基上生長的菌絲體切割成0.1×0.5cm的長方塊轉(zhuǎn)移進(jìn)含有更高濃度選擇因子的PDSB液體選擇培養(yǎng)基中，置于28℃，轉(zhuǎn)速為150-180r/min的搖床上培養(yǎng)3周；h.3周后，選擇有生長的菌塊，進(jìn)一步切割成薄的小菌塊，在選擇培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)3周后，獲得轉(zhuǎn)化菌株。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征是步驟e的基因槍轟擊參數(shù)為氦氣壓力1100Psi，真空壓26inchesHg，靶距離6cm，轟擊次數(shù)1次。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種轉(zhuǎn)基因食用菌，該轉(zhuǎn)基因食用菌基因組中整合了抗冷凍蛋白基因afp。本發(fā)明進(jìn)一步公開了該轉(zhuǎn)基因食用菌的制備方法。本發(fā)明為食用菌的遺傳育種開辟一條新的育種途徑——基因工程育種；并使受到低溫限制的高溫型食用菌的生產(chǎn)、新鮮菌的流通、低溫冷凍保鮮以及菌種的低溫貯藏等問題得到解決。
文檔編號C12N15/79GK1800347SQ20051012640
公開日2006年7月12日 申請日期2005年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月8日
發(fā)明者郭麗瓊, 林俊芳, 熊盛 申請人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)