專利名稱：棒狀細(xì)菌metK基因的等位基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了編碼S-腺苷甲硫氨酸合成酶(EC2.5.1.6)變體的棒狀細(xì)菌metK基因的等位基因以及使用含有這些等位基因的細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)L-甲硫氨酸的方法。
現(xiàn)有技術(shù)化學(xué)化合物，特別是L-氨基酸、維生素、核苷及核苷酸和D-氨基酸在人類醫(yī)學(xué)、制藥工業(yè)、化妝品、食品工業(yè)和動物營養(yǎng)中已有使用。
已知許多這些化合物通過發(fā)酵棒狀細(xì)菌菌株，特別是谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)來生產(chǎn)。由于其非常重要，人們不斷努力改進(jìn)生產(chǎn)方法。對該方法的改進(jìn)涉及發(fā)酵技術(shù)，例如攪拌和氧供給，或者涉及營養(yǎng)培養(yǎng)基組成，如發(fā)酵過程中的糖濃度，或者涉及通過例如離子交換層析純化產(chǎn)物，或者涉及微生物自身的內(nèi)在行為特性。
誘變、選擇和突變體選擇的方法已被用來改進(jìn)這些微生物的行為特性。如此，可以獲得對抗代謝物有抗性的或者對于用于調(diào)控的代謝物是營養(yǎng)缺陷性的并產(chǎn)生氨基酸的菌株。已知的抗代謝物例如是賴氨酸類似物S-(2-氨乙基)-半胱氨酸或者甲硫氨酸類似物α-甲基-甲硫氨酸、乙硫氨酸、正亮氨酸、N-乙酰正亮氨酸、S-三氟甲基高半胱氨酸、2-氨基-5-庚烯酸、硒代甲硫氨酸、氨基亞砜甲硫氨酸(methionine sulfoximine)、methoxine及1-氨基環(huán)戊烷羧酸。
近年來，重組DNA技術(shù)的方法也已經(jīng)通過擴(kuò)增各個生物合成基因和研究對氨基酸生產(chǎn)的作用而用于改進(jìn)生產(chǎn)L-氨基酸的棒桿菌屬(Corynebacterium)菌株。
編碼谷氨酸棒桿菌的S-腺苷甲硫氨酸合成酶的metK基因的核苷酸序列已經(jīng)保藏在GenBank，保藏號為AJ290443。還可以參見專利申請WO01/00843，鑒別號(identification code)AX063959，SEQ IDNo.241。
metK基因編碼棒狀細(xì)菌的S-腺苷甲硫氨酸合成酶(EC2.5.1.6)，其消耗ATP催化甲硫氨酸降解為S-腺苷甲硫氨酸(SAM)(Groβmann etal.，F(xiàn)EMS Microbiology Letters 19399-102(2000))。所述核苷酸序列示于SEQ ID No.1，同時相關(guān)的蛋白質(zhì)示于SEQ ID No.2。細(xì)胞形成的甲硫氨酸在蛋白質(zhì)生物合成中被消耗或者被S-腺苷甲硫氨酸合成酶切割產(chǎn)生SAM。SAM是細(xì)胞的主要甲基供體(Cantoni inSalvatore et al.，The Biochemistry of Adenosylmethionine.Columbia University Press，New York557-577(1977))。而且其對metB、metX和metY基因的參與甲硫氨酸生物合成的基因產(chǎn)物具有抑制作用，所述metB基因編碼胱硫醚γ合酶(cystathionine gamma-synthase)(Kase&Nakayama，Agricultural and Biological Chemistry 38(11)2235-2242(1974)，而所述metX基因編碼高絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶，metY基因編碼O-乙酰高絲氨酸硫化氫解酶(Rey，degree dissertation，F(xiàn)aculty of Biology，University ofBielefeld，2000)。
在生產(chǎn)L-甲硫氨酸時，因此希望使用S-腺苷甲硫氨酸合成酶沒有活性的或者活性弱化和/或metK基因表達(dá)降低的細(xì)菌。
大腸桿菌(Escherichia coli)中降低metK活性的突變導(dǎo)致在細(xì)胞分裂、DNA甲基化和脂肪酸生物合成方面的大范圍功能失常(Greeneet al.，Journal of Bacteriology 115(1)57-67(1973)和Newman et al.，Journal of Bacteriology 180(14)3614-3619(1998)。Wei&Newman(Molecular Microbiology 43(6)1651-1656(2002)描述metK是大腸桿菌K12的必需基因并且完全喪失S-腺苷甲硫氨酸合成酶活性顯示對細(xì)胞是致死性的。
通過弱化metK基因或者S-腺苷甲硫氨酸合成酶的活性，可以減少甲硫氨酸的降解并因此減少形成的S-腺苷甲硫氨酸的量及減少對基因metB、metX和metY的參與甲硫氨酸生物合成的產(chǎn)物的抑制。這導(dǎo)致細(xì)胞的甲硫氨酸生產(chǎn)提高。
近來，谷氨酸棒桿菌的S-腺苷甲硫氨酸合成酶通過突變編碼其的DNA序列而被修飾，如此所得蛋白質(zhì)與野生型酶相比顯示了明顯降低的活性(WO03/100072)。如所述申請

圖1所示，第94位半胱氨酸被取代為丙氨酸的修飾的S-腺苷甲硫氨酸合成酶具有大約20％的活性。
棒狀細(xì)菌的L-甲硫氨酸和SAM的微生物生物合成的過程和調(diào)節(jié)非常復(fù)雜并且還涉及細(xì)胞中多個水平的不同代謝途徑。因此不可能預(yù)測對微生物菌株的生長、其重要代謝途徑的平衡和L-甲硫氨酸的生產(chǎn)的影響，但可能獲得S-腺苷甲硫氨酸合成酶的殘余活性。因此希望獲得最大可能數(shù)目的活性程度不同的S-腺苷甲硫氨酸合成酶的變體。
發(fā)明目的本發(fā)明的目的是提供棒狀細(xì)菌、特別是谷氨酸棒桿菌的S-腺苷甲硫氨酸合成酶(MetK蛋白質(zhì))的廣泛范圍的新的變體，其與野生型相比具有降低的活性。與S-腺苷甲硫氨酸合成酶野生型酶相比，這些變體具有至少一個突變，這些變體是本發(fā)明的主題。
本發(fā)明另一個目的是提供新的改進(jìn)的發(fā)酵生產(chǎn)L-氨基酸特別是L-甲硫氨酸的方法。

發(fā)明內(nèi)容
如下提到L-氨基酸或者氨基酸時是指一或多個蛋白質(zhì)氨基酸(proteinogenic amino acid)，包括其鹽，所述氨基酸選自L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-蘇氨酸、L-絲氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-甘氨酸、L-丙氨酸、L-半胱氨酸、L-纈氨酸、L-甲硫氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-酪氨酸、L-苯丙氨酸、L-組氨酸、L-賴氨酸、L-色氨酸、L-精氨酸和L-脯氨酸。特別優(yōu)選L-甲硫氨酸。
蛋白質(zhì)氨基酸指發(fā)生在天然蛋白質(zhì)，即微生物、植物、動物和人類蛋白質(zhì)中的氨基酸。它們作為蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)單位，在蛋白質(zhì)中它們通過肽鍵互相連接。
如下提到L-甲硫氨酸或甲硫氨酸時也指其鹽，如鹽酸甲硫氨酸(methionine hydrochloride)或硫酸甲硫氨酸(methionine sulfate)。
一個基因的不同變體，例如編碼具有S-腺苷甲硫氨酸合成酶活性的酶的metK基因的本發(fā)明的變體也稱為“等位基因”(RmppLexikon der Biotechnologie und Gentechnik，2nd edition 1999，ThiemeVerlag Stuttgart，Germany)。一個基因的不同等位基因在核苷酸序列上是不同的。
本發(fā)明提供了來自棒狀細(xì)菌特別是谷氨酸棒桿菌的編碼S-腺苷甲硫氨酸合成酶的可復(fù)制的核苷酸序列(DNA)，其中SEQ ID No.2中的相關(guān)氨基酸序列除了第200位的L-纈氨酸之外含有每一個蛋白質(zhì)氨基酸。
本發(fā)明還提供了來自棒狀細(xì)菌特別是谷氨酸棒桿菌編碼S-腺苷甲硫氨酸合成酶的可復(fù)制的核苷酸序列(DNA)，其中相關(guān)氨基酸序列在第200位含有L-天冬氨酸，示于SEQ ID No.4。
本發(fā)明還提供了來自棒狀細(xì)菌特別是谷氨酸棒桿菌的編碼S-腺苷甲硫氨酸合成酶的可復(fù)制的核苷酸序列(DNA)，其堿基序列在第599位含有L-天冬氨酸，示于SEQ ID No.3。
本發(fā)明還提供了來自棒狀細(xì)菌特別是谷氨酸棒桿菌的編碼S-腺苷甲硫氨酸合成酶的可復(fù)制的核苷酸序列(DNA)，其中SEQ ID No.2中的相關(guān)氨基酸序列除了第322位的L-異亮氨酸之外含有每一個蛋白質(zhì)氨基酸。
本發(fā)明還提供了來自棒狀細(xì)菌特別是谷氨酸棒桿菌的編碼S-腺苷甲硫氨酸合成酶的可復(fù)制的核苷酸序列(DNA)，其中相關(guān)氨基酸序列在第322位含有L-亮氨酸，示于SEQ ID No.6。
本發(fā)明還提供了來自棒狀細(xì)菌特別是谷氨酸棒桿菌的編碼S-腺苷甲硫氨酸合成酶的可復(fù)制的核苷酸序列(DNA)，其堿基序列在第964位含有胞嘧啶，示于SEQ ID No.5。
本發(fā)明還提供了來自棒狀細(xì)菌特別是谷氨酸棒桿菌的編碼S-腺苷甲硫氨酸合成酶的可復(fù)制的核苷酸序列(DNA)，其中SEQ ID No.2的堿基序列中第1201位的胞嘧啶被缺失。由于產(chǎn)生的核苷酸序列讀框的移位，SEQ ID No.2所示的metK基因的編碼區(qū)延伸了13個核苷酸序列“taaaaatctgatg”，其中“t”表示胸腺嘧啶，“a”表示腺嘌呤，“c”表示胞嘧啶及“g”表示鳥嘌呤。所述序列示于SEQ ID No.7。
本發(fā)明還提供了來自棒狀細(xì)菌特別是谷氨酸棒桿菌的編碼S-腺苷甲硫氨酸合成酶的可復(fù)制的核苷酸序列(DNA)，其中相關(guān)氨基酸序列比SEQ ID No.2的長4個氨基酸，且在氨基酸序列的第401-411位具有氨基酸L-丙氨酸、L-谷氨酰胺、L-脯氨酸、L-絲氨酸、L-絲氨酸、L-半胱氨酸、L-脯氨酸、L-賴氨酸、L-天冬酰胺、L-亮氨酸和L-甲硫氨酸。該序列示于SEQ ID No.8。
本發(fā)明還提供了含有本發(fā)明核苷酸序列并任選可在棒狀細(xì)菌中復(fù)制的質(zhì)粒(載體)。
本發(fā)明還提供了分離的棒狀細(xì)菌，其含有本發(fā)明的核苷酸序列或者其編碼的具有弱化的催化性質(zhì)的S-腺苷甲硫氨酸合成酶蛋白質(zhì)，和/或其中編碼S-腺苷甲硫氨酸合成酶的核苷酸序列以弱化的方式表達(dá)。
關(guān)于這一點(diǎn)，術(shù)語“弱化”指降低或抑制微生物的一或多種酶或蛋白質(zhì)的細(xì)胞內(nèi)活性，其中酶被相應(yīng)的DNA編碼，這例如通過使用編碼具有低活性的相應(yīng)酶的基因或等位基因或滅活(inactivate)相應(yīng)基因或酶或蛋白質(zhì)來實(shí)現(xiàn)以及任選地通過組合這些方法來實(shí)現(xiàn)。
弱化方法將相同蛋白質(zhì)的活性或濃度通常降低到野生型蛋白質(zhì)的活性或濃度的0-75％、0-50％、0-25％、0-10％或0-5％或起始微生物中該蛋白質(zhì)的活性或濃度的0-75％、0-50％、0-25％、0-10％或0-5％。
蛋白質(zhì)濃度的降低可以通過1-和2-向(dimensional)蛋白質(zhì)凝膠分離以及隨后用適當(dāng)?shù)脑u估軟件光學(xué)鑒定凝膠上的蛋白質(zhì)濃度來檢測。在棒狀細(xì)菌中制備蛋白質(zhì)凝膠以及鑒定所述蛋白質(zhì)的一個常用方法是Hermann等描述的方法(Electrophoresis，221712-23(2001))。也可以通過使用特異于待檢測的蛋白質(zhì)的抗體的Western印跡雜交(Sambrook et al.，Molecular Cloning.A Laboratory Manual.2nd ed.，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989)以及隨后用適當(dāng)?shù)能浖鈱W(xué)評估確定濃度(Lohaus&Meyer(1998)Biospektrum 532-39；Lottspeich(1999)Angewandte Chemie 1112630-2647)來分析蛋白質(zhì)濃度。DNA結(jié)合蛋白質(zhì)的活性可以通過DNA條帶遷移分析(DNA band shift assays，也稱為凝膠滯留(gelretardation))測量，如例如教科書″Bioanalytik″(Lottspeich/Zorbas，Spektrum Akademischer Verlag GmbH，Heidelberg，Germany(1998)andapplied in Wilson et al.(Journal of Bacteriology 1832151-2155(2001))所述。DNA結(jié)合蛋白質(zhì)對其它基因表達(dá)的作用可以通過多種充分描述的報(bào)道基因分析方法檢測(Sambrook et al.，Molecular CloningALaboratory Mannual.2nd ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，N.Y.，1989)。
一種蛋白質(zhì)的催化性質(zhì)的弱化可以通過多種酶測試方法檢測。有多種酶測試方法可以用于確定S-腺苷甲硫氨酸合成酶的活性。在將甲硫氨酸酶促轉(zhuǎn)化為SAM的過程中，ATP被轉(zhuǎn)化為焦磷酸和正磷酸。一種適當(dāng)?shù)臏y試方法基于通過鉬酸鹽復(fù)合物光度測定無機(jī)磷酸并在Fiske&Subbarrow(Journal of Biology and Chemistry 66375-400(1925))中描述。其基于在還原條件下通過鉬酸鹽和正磷酸鹽(游離的無機(jī)磷酸鹽)形成藍(lán)色的鉬酸鹽復(fù)合物。
弱化可以通過降低或抑制metK基因的表達(dá)或者基因產(chǎn)物的催化性質(zhì)來實(shí)現(xiàn)。任選組合這兩種方法。
可以通過適當(dāng)控制培養(yǎng)物或者通過遺傳修飾(突變)基因表達(dá)的信號結(jié)構(gòu)來降低基因表達(dá)。基因表達(dá)的信號結(jié)構(gòu)例如是阻抑物基因、激活物(activator)基因、操縱基因、啟動子、弱化子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、起始密碼子和終止子。本領(lǐng)域技術(shù)人員將在例如以下文獻(xiàn)中發(fā)現(xiàn)關(guān)于這一點(diǎn)的信息專利申請WO 96/15246、Boyd&Murphy(Journal of Bacteriology 1705949-5952(1988))、Voskuil&Chambliss(Nucleic Acids Research 263584-3590(1998))、Pátek等(Microbiology1421297-309(1996)和Journal of Biotechnology 104311-323(2003))以及已知的遺傳學(xué)和分子生物學(xué)教科書，例如Knippers的教科書(“Molekulare Genetik”，6th edition，Georg Thieme Verlag，Stuttgart，Germany，1995)或者Winnacker的(“Gene und Klone”，VCH Verlagsgesellschaft，Weinheim，Germany，1990)。
一個基因表達(dá)調(diào)節(jié)的例子是將要弱化的基因克隆置于可通過添加計(jì)量(metered quantities)的IPTG(異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)誘導(dǎo)的啟動子的控制之下，所述啟動子例如是trc啟動子或tac啟動子。適于這個目的的載體例如是大腸桿菌表達(dá)載體pXK99E(WO0226787；根據(jù)布達(dá)佩斯條約于2001年7月31日將DH5alpha/pXK99E保藏于德國微生物保藏中心(Deutsche Sammlung für Mikroorganismen undZellkulturen，DSMZ，Braunschweig，Germany)，保藏號DSM 14440)或者pVWEx2(Wendisch，Ph.D.thesis，F(xiàn)orschungszentrum Jülich reports，Jül-3397，ISSN 0994-2952，Jülich，Germany(1997))，其允許克隆的基因在谷氨酸棒桿菌中進(jìn)行IPTG-依賴性表達(dá)。
這個方法例如被用于專利申請WO0226787以通過將載體pXK99EdeaD整合進(jìn)谷氨酸棒桿菌的基因組中而調(diào)節(jié)deaD基因的表達(dá)以及被Simic等(Applied and Environmental Microbiology 683321-3327(2002))通過將載體pK18mobglyA′整合進(jìn)谷氨酸棒桿菌而調(diào)節(jié)glyA基因的表達(dá)。
另一種特異性降低基因表達(dá)的方法是反義方法，其中將短寡聚脫氧核苷酸或載體導(dǎo)入靶細(xì)胞中以合成較長的反義RNA。該反義RNA能夠特異性結(jié)合特異性mRNA的互補(bǔ)片段并降低其穩(wěn)定性或阻斷其可譯性(translatability)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在Srivastava等(AppliedEnvironmental Microbiology 2000Oct；66(10)4366-4371)中發(fā)現(xiàn)這種例子。
通過以不同方法在一個基因中摻入突變，可以獲得一個基因的編碼具有修飾的催化性質(zhì)的酶蛋白的不同等位基因。
例如，誘變可以通過常規(guī)體內(nèi)誘變方法使用誘變物質(zhì)如N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍(NTG)、甲磺酸乙酯(EMS)或紫外線進(jìn)行。這些和其它方法例如在the Manual of Methods for General Bacteriology(American Society for Microbiology，Washington，1981)中描述。
誘變還可以通過使用體外方法如用hydroxylamine處理來進(jìn)行(Miller，J.H.A Short Course in Bacterial Genetics.A Laboratory Manualand Handbook for Escherichia coli and related Bacteria，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，1992)或者聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，如Newton & Graham的手冊所述(PCR，Spektrum AkademischerVerlag，Heidelberg，1994)。
另一種可能導(dǎo)入隨機(jī)突變到基因中的方法是使用在通過PCR擴(kuò)增基因時顯示高錯誤率的特異性DNA聚合酶(例如Stratagene的GeneMorph PCR Mutagenesis試劑盒中的Mutazyme DNA聚合酶)。如此可以產(chǎn)生廣泛范圍的突變。被突變的基因隨后通過遺傳工程方法被再次導(dǎo)入起始生物體中。
在現(xiàn)有技術(shù)和遺傳學(xué)及分子生物學(xué)的已知教科書中可以發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生這種突變的進(jìn)一步指導(dǎo)，例如Knippers的教科書(″Molekulare Genetik″，6th edition，Georg Thieme Verlag，Stuttgart，Germany，1995)、Winnacker的教科書(″Gene und Klone″，VCH Verlagsgesellschaft，Weinheim，Germany，1990)或者Hagemann的教科書(″Allgemeine Genetik″，GustavFischer Verlag，Stuttgart，1986)。
誘變后，細(xì)胞可以置于瓊脂平板上，溫育后，對所需性質(zhì)進(jìn)行篩選。例如，對特異性性質(zhì)如對特異抗代謝物的抗性、對不同代謝物的營養(yǎng)缺陷型或者利用特異糖的能力的選擇可以通過將細(xì)胞在合適的選擇性培養(yǎng)基上影印培養(yǎng)而完成。一個這種實(shí)例描述于專利DE4203320，其中谷氨酸棒桿菌菌株DSM5714被誘變并且通過篩選發(fā)現(xiàn)具有提高的L-賴氨酸分泌系統(tǒng)活性的突變體。
另一方面，通過靶向測序(targeted sequencing)個體基因(individual genes)，可以發(fā)現(xiàn)一個基因的不同等位基因。
使用現(xiàn)有技術(shù)中描述的誘變方法產(chǎn)生了本發(fā)明的編碼S-腺苷甲硫氨酸合成酶變體的metK等位基因，其特征在于第200位或322位的氨基酸取代，或者基于核苷酸序列的第1201位的一個堿基缺失而使氨基酸序列延伸至411個氨基酸，其伴有起自第401位的取代。
為了獲得具有弱化的S-腺苷甲硫氨酸合成酶活性的酶，借助于Fiske&Subbarrow(Journal of Biology and Chemistry 66375-400(1925))所述檢測無機(jī)磷酸的測試對由通過所述誘變方法獲得的metK基因的等位基因編碼的具有S-腺苷甲硫氨酸合成酶活性的不同的酶測試了其活性。編碼與野生型酶相比具有降低的S-腺苷甲硫氨酸合成酶活性的酶的metK基因的等位基因可以使用遺傳工程方法，如Schwarzer&Pühler(Bio/Technology 9，84-87(1991))所述的″基因置換(genereplacement)″方法再次導(dǎo)入起始生物體中或棒桿菌屬的其它菌株中。這種方法常規(guī)用于谷氨酸棒桿菌基因的有目的突變中。
突變可以是轉(zhuǎn)換、顛換、插入和缺失。根據(jù)氨基酸取代對酶活性的作用，突變已知有″錯義″突變或″無義″突變。一個基因中至少一個堿基對的插入或缺失導(dǎo)致讀框移位突變，其結(jié)果是插入不正確的氨基酸或者翻譯提前終止。缺失兩個或更多密碼子典型地導(dǎo)致完全破壞酶活性。制備這種突變的教導(dǎo)屬于現(xiàn)有技術(shù)，可以見于遺傳學(xué)和分子生物學(xué)教科書，如Knippers的教科書(″Molekulare Genetik″，6th edition，Georg Thieme Verlag，Stuttgart，Germany，1995)、Winnacker的教科書(″Gene und Klone″，VCH Verlagsgesellschaff，Weinheim，Germany，1990)或者Hagemann的教科書(″Allgemeine Genetik″，Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1986)。
在基因置換方法中，突變?nèi)缛笔?、插入或堿基取代是在要研究的基因中體外產(chǎn)生并且將產(chǎn)生的等位基因克隆到谷氨酸棒桿菌的非復(fù)制型載體中?？梢钥紤]的載體例如是pK18mob、pK19mob、pK18mobsacB或pK19mobsacB(Schfer等，Gene 145，69-73(1994))或pESB30(Onishi等，Applied Microbiology and Biotechnology 58217-223(2002))。然后將這個載體通過接合或轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)移至希望的谷氨酸棒桿菌宿主中。對接合方法的描述例如見Schfer等(Journal of Bacteriology1721663-1666(1990)和Applied and Environmental Microbiology 60756-759(1994))。轉(zhuǎn)化方法的描述例如見Thierbach等(AppliedMicrobiology and Biotechnology 29，356-362(1988))、Dunican&Shivnan(Biotechnology 7，1067-1070(1989))和Tauch等(FEMSMicrobiological Letters 123，343-347(1994))。通過實(shí)現(xiàn)整合的第一次“交換(crossing over)”以及實(shí)現(xiàn)切除(excision)的適當(dāng)?shù)牡诙巍敖粨Q”的同源重組后，突變或等位基因被摻入在靶基因或靶序列中。對這個方法的描述見于Schwarzer&Pühler(Bio/Technology 984-87(1991))并被例如Mckel等用于在谷氨酸棒菌的ilvA基因中用丙氨酸取代氨基酸序列第323位的氨基酸纈氨酸(Molecular MicrobiologySep；13(5)833-842(1994))。使用載體pESB30以及借助于轉(zhuǎn)化，Onishi等(Applied Microbiology and Biotechnology 58217-223(2002))將點(diǎn)突變導(dǎo)入谷氨酸棒桿菌的hom、lysC和pyc基因中。
谷氨酸棒桿菌中的不同遺傳工程方法如轉(zhuǎn)化、接合、不同克隆載體以及自我克隆(self cloning)的綜述可見于Kirchner&Tauch(Journal of Biotechnology 104287-299(2003))。
如此可以在metK基因中摻入缺失、插入或者堿基取代。
本發(fā)明提供了編碼S-腺苷甲硫氨酸合成酶變體的、新的可復(fù)制的優(yōu)選地內(nèi)源的核苷酸序列(DNA)，其示于SEQ ID No.3、SEQ ID No.5和SEQ ID No.7。
″內(nèi)源基因″或者″內(nèi)源核苷酸序列″是指存在于一個物種群體中的基因或核苷酸序列。
本發(fā)明還涉及含有所述的核苷酸序列并且任選在棒狀細(xì)菌中復(fù)制的載體(質(zhì)粒)。
還請求保護(hù)棒狀細(xì)菌，其中存在編碼S-腺苷甲硫氨酸合成酶的核苷酸序列的所述核苷酸序列，優(yōu)選地這些序列被過表達(dá)。
本發(fā)明提供了生產(chǎn)L-甲硫氨酸或含有L-甲硫氨酸的飼料添加劑的方法，其中進(jìn)行以下步驟a)發(fā)酵棒狀細(xì)菌，在所述棒狀細(xì)菌中內(nèi)源metK基因的等位基因在適于形成metK基因的產(chǎn)物S-腺苷甲硫氨酸合成酶的條件下被過表達(dá)。
b)從發(fā)酵肉湯中分離L-甲硫氨酸或含有L-甲硫氨酸的飼料添加劑，其中棒狀細(xì)菌形成L-甲硫氨酸，任選地c)具有來自發(fā)酵肉湯的成分(constituents)和/或生物量(≤100％)。
本發(fā)明還提供了生產(chǎn)L-甲硫氨酸或含有L-甲硫氨酸的飼料添加劑的方法，其中通常進(jìn)行以下步驟a)發(fā)酵含有編碼S-腺苷甲硫氨酸合成酶的內(nèi)源核苷酸序列的棒狀細(xì)菌，其中在相關(guān)氨基酸序列中第200位的L-纈氨酸被另一個蛋白質(zhì)氨基酸優(yōu)選L-天冬氨酸取代；或者第322位的L-異亮氨酸被另一種蛋白質(zhì)氨基酸優(yōu)選L-亮氨酸取代；或者蛋白質(zhì)相對于野生型蛋白質(zhì)長4個氨基酸，并且氨基酸序列的自第401-411位具有氨基酸L-丙氨酸、L-谷氨酰胺、L-脯氨酸、L-絲氨酸、L-絲氨酸、L-半胱氨酸、L-脯氨酸、L-賴氨酸、L-天冬酰胺、L-亮氨酸和L-甲硫氨酸。
所述內(nèi)源metK基因的等位基因在適于形成metK基因產(chǎn)物S-腺苷甲硫氨酸合成酶的條件下被過表達(dá)。
b)在發(fā)酵肉湯中積累L-甲硫氨酸，c)從發(fā)酵肉湯中分離L-甲硫氨酸或含有L-甲硫氨酸的飼料添加劑，任選地d)具有來自發(fā)酵肉湯和/或生物量的成分(＞0至100％)。
蛋白質(zhì)氨基酸應(yīng)指是蛋白質(zhì)或多肽成分的所有氨基酸。這些特別是L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-蘇氨酸、L-絲氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、甘氨酸、L-丙氨酸、L-半胱氨酸、L-纈氨酸、L-甲硫氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-酪氨酸、L-苯丙氨酸、L-組氨酸、L-賴氨酸、L-色氨酸、L-脯氨酸和L-精氨酸。
metK基因的野生形式存在于棒狀細(xì)菌特別是棒桿菌屬的野生型菌株中，其示于SEQ ID No.1。野生型蛋白質(zhì)示于SEQ ID No.2。
在棒桿菌屬中，可以特別提及的是本領(lǐng)域已知的谷氨酸棒桿菌。已知的野生型谷氨酸棒桿菌菌株例如是谷氨酸棒桿菌ATCC13032醋谷棒桿菌(Corynebacterium acetoglutamicum)ATCC15806嗜乙酰乙酸棒桿菌(Corynebacterium acetoacidophilum)ATCC13870Corynebacterium melassecola ATCC17965Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)ATCC14067乳發(fā)酵短桿菌(Brevibacterium lactofermentum)ATCC13869及百合花棒桿菌(Brevibacterium divaricatum)ATCC 14020，或者例如L-甲硫氨酸生產(chǎn)菌株谷氨酸棒桿菌ATCC21608。
具有″ATCC″名稱的菌株可以得自美國典型培養(yǎng)物中心(American Type Culture Collection，Manassas，VA，USA)。具有″FERM″名稱的菌株可以得自日本國立產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所(NationalInstitute of Advanced Industrial Science and Technology，AIST TsukubaCentral 6，1-1-1 Higashi，Tsukuba Ibaraki，Japan)。所述Corynebacterium thermoaminogenes菌株(FERM BP-1539)和其它菌株(FERM BP-1540、FERM BP-1541和FERM BP-1542)在US-A5,250,434中描述。
使用現(xiàn)有技術(shù)描述的誘變方法生產(chǎn)的本發(fā)明的編碼S-腺苷甲硫氨酸合成酶變體的metK等位基因的特征在于第200位或322位的氨基酸取代或者基于核苷酸序列的第1201位的一個堿基缺失而使氨基酸序列延伸至411個氨基酸，其具有起自第401位的取代。
當(dāng)使用體外方法時，借助于聚合酶鏈反應(yīng)從野生型菌株的分離的全長DNA中擴(kuò)增現(xiàn)有技術(shù)描述的metK基因，該基因任選被克隆進(jìn)適當(dāng)?shù)馁|(zhì)粒載體中，且然后將該DNA用于誘變方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員在Gait的教科書，Oligonucleotide SynthesisA Practical Approach(IRLPress，Oxford，UK，1984)及Newton&Graham的教科書PCR(SpektrumAkademischer Verlag，Heidelberg，Germany，1994)中發(fā)現(xiàn)通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增DNA序列的指導(dǎo)。用上述方法選擇和研究適當(dāng)?shù)膍etK等位基因。
本發(fā)明提供了新的metK等位基因，其編碼S-腺苷甲硫氨酸合成酶的變體，示于SEQ ID No.3、SEQ ID No.5和SEQ ID No.7。
除了使用本發(fā)明的metK等位基因，增強(qiáng)特別是過表達(dá)或者弱化特別是抑制或降低特定生物合成途徑、糖酵解、回補(bǔ)代謝、檸檬酸(三羧酸)循環(huán)、戊糖磷酸循環(huán)、氨基酸輸出及任選調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)中的一或多個酶的表達(dá)對于生產(chǎn)L-氨基酸可以是額外有利的。還可以使用這些基因的不同等位基因，其例如編碼與野生型蛋白質(zhì)相比具有增強(qiáng)的或弱化活性的蛋白質(zhì)(酶)或者其編碼與野生型蛋白質(zhì)相比對不同產(chǎn)物的抑制具有降低的易感性的蛋白質(zhì)(酶)且其對氨基酸特別是L-甲硫氨酸的生產(chǎn)具有有利作用。通常優(yōu)選使用內(nèi)源基因。
″內(nèi)源基因″或″內(nèi)源核苷酸序列″指存在于一個物種群體中的基因或核苷酸序列以及其等位基因。
關(guān)于這一點(diǎn)，術(shù)語″增強(qiáng)″指微生物中被相應(yīng)的DNA編碼的一或多種酶或蛋白質(zhì)的胞內(nèi)活性或濃度增加，例如通過增加基因的拷貝數(shù)，通過使用強(qiáng)啟動子或者編碼具有提高的活性的相應(yīng)的酶或蛋白質(zhì)的基因或等位基因以及任選通過組合這些方法而實(shí)現(xiàn)這種增加。相應(yīng)的酶蛋白活性的增加也可以通過降低對抑制劑的敏感性而達(dá)到。
相對于野生型蛋白質(zhì)的活性或濃度或者起始微生物中蛋白質(zhì)的活性或濃度，增強(qiáng)特別是過表達(dá)方法增加了相應(yīng)蛋白質(zhì)的活性或濃度至少10％、25％、50％、75％、100％、150％、200％、300％、400％或500％，最多1000％或2000％。
因此為了生產(chǎn)L-甲硫氨酸，除了使用metK基因的變體，可以同時增強(qiáng)特別是過表達(dá)一組甲硫氨酸生產(chǎn)的基因中的一或多個基因?！寮琢虬彼嵘a(chǎn)的基因或等位基因″指所有的優(yōu)選地內(nèi)源的開放讀框、基因或等位基因，其擴(kuò)增/過表達(dá)可以導(dǎo)致甲硫氨酸生產(chǎn)的改進(jìn)。
包括于這些之中的是以下開放讀框、基因或等位基因accBC，accDA，aecD，cstA，cysD，cysE，cysH，cysK，cysN，cysQ，dps，eno，fda，gap，gap2，gdh，gnd，glyA，hom，homFBR，lysC，lysCFBR，metA，metB，metE，metH，metY，msiK，opcA，oxyR，ppc，ppcFBR，pgk，pknA，pknB，pknD，pknG，ppsA，ptsH，ptsI，ptsM，pyc，pyc P458S，sigC，sigD，sigE，sigH，sigM，tal，thyA，tkt，tpi，zwal，zwf和zwf A213T。這些列于并且注釋于表1。
表1甲硫氨酸生產(chǎn)的基因和等位基因





除了使用metK基因的變體，同時弱化特別是抑制或降低選自對于生長或甲硫氨酸的生產(chǎn)是非必需的一組基因或等位基因中的一或多個的基因的表達(dá)對于L-甲硫氨酸的生產(chǎn)可以是更有利的。
包括在這些中的是以下開放讀框、基因或等位基因ccpA1，ccpA2，citA，citB，citE，ddh，gluA，gluB，gluC，gluD，luxR，luxS，lysR1，lysR2，lysR3，menE，metD，metK，pck，pgi，poxB和zwa2。這些列于并注釋于表2。
表2對于甲硫氨酸生產(chǎn)是非必需的基因和等位基因


最后，除了使用metK基因的變體，抑制非所需的次級反應(yīng)對于生產(chǎn)氨基酸特別是L-甲硫氨酸也可以是有利的(Nakayama″Breedingof Amino Acid Producing Microorganisms″，inOverproduction ofMicrobial Products，Krumphanzl，Sikyta，Vanek(eds.)，Academic press，London，UK，1982)。
本發(fā)明還提供了根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的微生物，并且為了生產(chǎn)L-氨基酸其可以使用分批方法(batch process)或補(bǔ)料分批方法(fed batchprocess)或重復(fù)補(bǔ)料分批方法(repeated fed batch process)連續(xù)或不連續(xù)培養(yǎng)。已知培養(yǎng)方法的總結(jié)可見于Chmiel的教科書(Bioprozesstechnik 1.Einführung in die Bioverfahrenstechnik(GustavFischer Verlag，Stuttgart，1991))或者Storhas的教科書(Bioreaktoren undperiphere Einrichtungen(Vieweg Verlag，Braunschweig/Wiesbaden，1994))。
要使用的培養(yǎng)基必需足以滿足特定菌株的要求。對不同微生物的培養(yǎng)基的描述在美國細(xì)菌學(xué)會(the American Society forBacteriology)的″Manual of Methods for GeneralBacteriology″(Washington D.C.，USA，1981)。
可以使用的碳源包括糖和碳水化合物如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、糖蜜、淀粉和纖維素，油和脂肪如大豆油、葵花油、花生油和椰子油，脂肪酸如棕櫚酸、硬脂酸和亞油酸，醇如甘油和乙醇及有機(jī)酸如乙酸。這些物質(zhì)可以單獨(dú)使用或作為混合物使用。
可以使用的氮源包括含氮有機(jī)化合物，如胨、酵母提取物、肉類提取物、麥精、玉米漿、大豆面粉和尿素，或者無機(jī)化合物，如硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、碳酸銨和硝酸銨。氮源可以單獨(dú)使用或作為混合物使用。
可以使用的磷源包括磷酸、磷酸二氫鉀或磷酸氫二鉀或相應(yīng)的含有鈉的鹽。培養(yǎng)基必需額外含有金屬鹽，如硫酸鎂或硫酸鐵，其對生長是必需的。最后，除了上述物質(zhì)外還可以使用必需的生長促進(jìn)物質(zhì)，如氨基酸和維生素。還可以向培養(yǎng)基中加入適當(dāng)?shù)那绑w。上述飼料物質(zhì)在培養(yǎng)時可以加入培養(yǎng)物作為一個單一的批次或適當(dāng)?shù)匮a(bǔ)料。
適當(dāng)?shù)厥褂脡A性化合物如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氨或氨水或酸性化合物如磷酸或硫酸控制培養(yǎng)物的pH?？梢允褂孟輨┤缰舅峋奂憾减タ刂破鹋?。可以通過向培養(yǎng)基中加入適當(dāng)?shù)倪x擇性作用物質(zhì)，例如抗生素來維持質(zhì)粒穩(wěn)定性。將氧或含氧的氣體混合物如空氣導(dǎo)入培養(yǎng)物中以維持有氧條件。培養(yǎng)物的溫度通常是20℃-45℃，且優(yōu)選25℃-40℃。連續(xù)培養(yǎng)所述培養(yǎng)物直至形成最大數(shù)量的所需產(chǎn)物。這個目標(biāo)通常在10-160小時內(nèi)達(dá)到。
現(xiàn)有技術(shù)已知確定L-氨基酸的方法?？梢岳缤ㄟ^陰離子交換層析和隨后的茚三酮衍生化進(jìn)行分析，如Spackman等所述(AnalyticalChemistry，30，(1958)，1190)或者通過逆向HPLC進(jìn)行分析，如Lindroth等所述(Analytical Chemistry(1979)511167-1174)。本領(lǐng)域技術(shù)人員還可以在Ashman等(inTschesche(ed.)，Modern Methods inProtein Chemistry.155-172，de Gruyter，Berlin 1985)中發(fā)現(xiàn)關(guān)于這一點(diǎn)的信息。
本發(fā)明的方法可以用于發(fā)酵生產(chǎn)L-甲硫氨酸。
可以任選通過添加L-甲硫氨酸來調(diào)節(jié)L-甲硫氨酸的濃度至所需的值。
借助于以下舉例性實(shí)施方案可以更詳細(xì)地解釋本發(fā)明。
實(shí)施例1在ATCC13032ΔmetD菌株的ccpA1基因中摻入缺失1.1構(gòu)建交換載體pK 18mobsacBΔccpA1用于實(shí)驗(yàn)的親代菌株是菌株ATCC13032ΔmetD，其在編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物MetD的基因中攜帶一個缺失。其構(gòu)建的描述見WO02097096。
基因ccpA1的序列是已知的且可見于專利申請US683267。
為了在基因ccpA1中摻入缺失，從菌株ATCC13032通過Eikmanns等所述方法(Microbiology 1401817-1828(1994))分離染色體DNA?；诨騝cpA1的序列，選擇下述的寡核苷酸以通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)通過基因Soeing方法(Horton，Molecular Biotechnology 393-98(1995))產(chǎn)生ccpA1缺失等位基因。
引物ccpA1-del1(另見SEQ ID No.9)5′-GCTA-GAATTC-AAGGCCACATTGACCAGTTC-3′引物ccpA1-del2(另見SEQ ID No.10)5′-TGTGACCTAGGCTTGACTTT-ATTTAAAT-ATGATCCTGCACCAATCCTT-3′引物ccpA1-del3(另見SEQ ID No.11)5′-AAGGATTGGTGCAGGATCAT-ATTTAAAT-AAAGTCAAGCCTAGGTCACA-3′引物ccpA1-del4(另見SEQ ID No.12)5′-GCTA-GAATTC-ATCTCATCCAAGTGGTGCGA-3′通過MWG Biotech(Ebersberg，Germany)合成所示引物且PCR反應(yīng)通過Innis等的標(biāo)準(zhǔn)PCR方法(PCR Protocols.A Guide to Methodsand Applications，1990，Academic Press)使用Platinum Pfx DNA聚合酶(Invitrogen，Karlsruhe，Germany)進(jìn)行。
引物ccpA1-del1和ccpA1-del4都含有一個插入的、限制酶EcoRI的切割位點(diǎn)，且引物ccpA1-del2和ccpA1-del3含有一個插入的、限制酶SwaI的切割位點(diǎn)，這些切割位點(diǎn)在上述核苷酸序列中用下劃線標(biāo)示。
引物ccpA1-del2由兩個核苷酸序列區(qū)域組成，一個結(jié)合ccpA1的起始密碼子前的“上游”區(qū)而另一個結(jié)合ccpA1的終止密碼子后的“下游”區(qū)。這兩個區(qū)域被插入的SwaI限制酶位點(diǎn)分開。引物ccpA1-del3與引物ccpA1-del2反向互補(bǔ)。
借助于聚合酶鏈反應(yīng)，引物ccpA1-del1和ccpA1-del2可以擴(kuò)增一個513堿基對(bp)的DNA片段，而引物ccpA1-del3和ccpA1-del4可以擴(kuò)增一個651bp的DNA片段。通過隨后在0.8％瓊脂糖凝膠中進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增物，用QIAquick Gel Extraction試劑盒(Qiagen，Hilden，Germany)從瓊脂糖凝膠中分離擴(kuò)增物，這些擴(kuò)增物在使用引物ccpA1-del1和ccpA1-del4的另一個PCR反應(yīng)中一起用作DNA模板。這導(dǎo)致產(chǎn)生大小為1116bp的ccpA1缺失衍生物。擴(kuò)增產(chǎn)物隨后在0.8％瓊脂糖凝膠中檢測。
用限制性內(nèi)切核酸酶EcoRI切割ccpA1缺失衍生物，在0.8％瓊脂糖凝膠中檢測之后，用QIAquick Gel Extraction試劑盒(Qiagen，Hilden，Germany)從瓊脂糖凝膠中分離并用于和可移動克隆載體(mobilizable cloning vector)pK 18mobsacB連接，如Schfer等，Gene，14，69-73(1994)所述。載體pK18mobsacB預(yù)先用限制酶EcoRI切割并且隨后用蝦堿性磷酸酶(Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，Germany，Product Description SAP，Product No.1758250)去磷酸化。然后將制備的載體與ccpA1缺失衍生物混合并用T4DNA連接酶處理(Amersham-Pharmacia，F(xiàn)reiburg，Germany)。
然后將大腸桿菌菌株DH5αmcr(Grant，1990，Proceedings of theNational Academy of Sciences U.S.A.，874645-4649)用連接混合物(ligation batch)(Hanahan，In.DNA cloning.A practical approach.Vol.1.ILR-Press，Cold Spring Harbor，New York，1989)電穿孔。通過在補(bǔ)充了25mg/l的卡那霉素的LB瓊脂(Merck，Darmstadt，Germany)上將轉(zhuǎn)化混合物鋪板來進(jìn)行攜帶質(zhì)粒細(xì)胞的選擇。
借助于Qiagen的QIAprep Spin Miniprep試劑盒，從轉(zhuǎn)化體中分離質(zhì)粒DNA并通過用限制酶EcoRI和SwaI切割來證實(shí)。所述質(zhì)粒稱為pK18mobsacBΔccpA1。菌株稱為大腸桿菌DH5αmcr/pK18mobsacBΔccpA1。
1.2.谷氨酸棒桿菌菌株ATCC13032ΔmetD中ccpA1基因的缺失誘變實(shí)施例1.1中提及的載體pK18mobsacBΔccpA1通過Tauch等(1989 FEMS Microbiology Letters 123343-347)的電穿孔方法電穿孔轉(zhuǎn)化進(jìn)菌株谷氨酸棒桿菌ATCC13032ΔmetD中。載體不能在ATCC13032ΔmetD中獨(dú)立復(fù)制，且其只有在整合入染色體后才能保留在細(xì)胞中。通過將電穿孔混合物在補(bǔ)加了15mg/l卡那霉素的LB瓊脂(Merck，Darmstadt，Germany)上鋪板進(jìn)行具有整合的pK18mobsacBΔccpA1的克隆的選擇。將生長的克隆在具有25mg/l卡那霉素的LB瓊脂平板上鋪板并在33℃溫育16小時。
為了切除質(zhì)粒以及完整ccpA1基因的染色體拷貝，將克隆在LB培養(yǎng)基(Merck，Darmstadt，Germany)上非選擇性溫育過夜，然后在具有10％蔗糖的LB瓊脂上培養(yǎng)。質(zhì)粒pK18mobsacB含有sacB基因的拷貝，其將蔗糖轉(zhuǎn)化為對谷氨酸棒桿菌是毒性的果聚糖蔗糖(levansucrose)。因此只有整合的pK18mobsacBΔccpA1被再次切除的那些克隆能在具有蔗糖的LB瓊脂上生長。切除時，與質(zhì)粒一起可以切除完整的ccpA1基因的染色體拷貝或者ccpA1缺失衍生物。
為了證明染色體中ccpA1基因被缺失，在交換載體被切除后，10個不同克隆的ccpA1區(qū)通過PCR擴(kuò)增。首先，通過Eikmanns等(Microbiology 1401817-1828(1994))的方法從10個克隆中分離染色體DNA。為進(jìn)行PCR反應(yīng)，使用以下引物ccpA1-A1(另見SEQ ID No.13)5′-CCTGCACACCACCGCTGAAT-3′ccpA1-E1(另見SEQ ID No.14)
5′-CAGCCGCACCAGCTCATCTT-3所示引物通過MWG Biotech(Ebersberg，Germany)合成并且通過Innis等(PCR Protocols.A Guide to Methods and Applications，1990，Academic Press)的標(biāo)準(zhǔn)PCR方法使用Platinum Pfx DNA聚合酶(Invitrogen，Karlsruhe，Germany)進(jìn)行PCR反應(yīng)。
引物ccpA1-A1結(jié)合ccpA1缺失衍生物之前的ccpA1的“上游”區(qū)，而引物ccpA1-E1結(jié)合ccpA1缺失衍生物之后的“下游”區(qū)。如果ccpA1基因的缺失摻入菌株ATCC13032ΔmetD的基因組，擴(kuò)增的PCR片段的大小大約是1.4k。在存在ccpA1野生型基因時，擴(kuò)增的PCR片段的大小大約是2.7kb。
使用所述PCR方法，如此鑒定了具有預(yù)計(jì)的1.4kb的擴(kuò)增ccpA1缺失片段的克隆。這個克隆被稱為谷氨酸棒桿菌ATCC13032ΔmetDΔccpA1。
實(shí)施例2將突變metKI322L摻入菌株ATCC13032ΔmetDΔccpA1SEQ ID No.5所示的metK等位基因的核苷酸序列在核苷酸序列的第964位含有腺嘌呤-胞嘧啶顛換(Transversion)，導(dǎo)致在所得的氨基酸序列的第322位的氨基酸異亮氨酸被替代為亮氨酸。這個突變在下文稱作metKI322L。
2.1.構(gòu)建交換載體pK18mobsacB_metKI322L首先，通過Eikmanns等(Microbiology 1401817-1828(1994))的方法從菌株ATCC13032中分離染色體DNA。根據(jù)metK基因的序列以及周圍區(qū)域，其對于谷氨酸棒桿菌是已知的，選擇下述的寡核苷酸產(chǎn)生metKI322L交換等位基因(exchange allele)。
metK-1(另見SEQ.ID.No.15)
5′-TGCGACCTCCTCATGTGTAA-3′metK-2(另見SEQ.ID.No.16)5′-AGGTTGTCGTCGCCATCATT-3′所示引物通過MWG Biotech(Ebersberg，Germany)合成并且通過Innis等(PCR Protocols.A Guide to Methods and Applications，1990，Academic Press)的標(biāo)準(zhǔn)PCR方法使用Platinum Pfx DNA聚合酶(Invitrogen，Karlsruhe，Germany)進(jìn)行PCR反應(yīng)。
引物metK-1結(jié)合metK的起始密碼子之前的“上游”區(qū)，而引物metK-2結(jié)合metK的終止密碼子之后的“下游”區(qū)。
在聚合酶鏈反應(yīng)的幫助下，引物metK-1和metK-2可以擴(kuò)增含有metK基因的大約2.3kb的DNA片段。
隨后在0.8％瓊脂糖凝膠上通過瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增物。然后使用Zero Blunt TOPO試劑盒(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)將大約2.3kb的擴(kuò)增物連接到載體pCRBlunt II-TOPO。之后根據(jù)廠商手冊，用連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株Top 10(Grant et al.，Proceedings ofthe National Academy of Sciences USA，87(1990)4645-4649)。通過將轉(zhuǎn)化混合物在補(bǔ)加了25mg/l卡那霉素的LB瓊脂上鋪板(Sambrock etal.，Molecular Cloning，a laboratory manual.2nd ed.Cold Spring Harbor，New York，1989)來選擇攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞。使用Eppendorf PerfectprepPlasmid Mini試劑盒(Eppendorf，Hamburg，Germany)分離質(zhì)粒DNA并且使用限制性內(nèi)切核酸酶EcoRI通過限制切割檢測。
含有metK基因的、被克隆的DNA片段的核苷酸序列通過Agowa(Berlin，Germany)確定。獲得的質(zhì)粒被命名為pCRII_metK。
使用QuikChange site-directed mutagenesis試劑盒(Stratagene，LaJolla，Ca，USA)根據(jù)廠商手冊進(jìn)行定點(diǎn)誘變(Site-directedmutagenesis)以將metK基因的氨基酸序列的第322位異亮氨酸交換為亮氨酸。metK野生型基因和等位基因metKI322L的核苷酸序列(見SEQ.ID.No.1和SEQ.ID.No.5)用于設(shè)計(jì)以下用于線性擴(kuò)增的引物metK-I322La(另見SEQ ID No.17)5’-CAGGTTGCATACGCC(CTT)GGACGCGCAAAG-3’metK-I322Lb(另見SEQ ID No.18)5’-CTTTGCGCGTCC(AAG)GGCGTATGCAACCTG-3’所示引物通過MWG Biotech(Ebersberg，Germany)合成。在上述核苷酸序列中，用括號表示亮氨酸的密碼子，其將取代第322位的異亮氨酸。通過PfuTurbo DNA聚合酶，在這個實(shí)施例中描述的質(zhì)粒pCRII_metK與兩個引物一起用于線性擴(kuò)增，所述引物每一個與質(zhì)粒的一條鏈互補(bǔ)。引物延伸產(chǎn)生了具有缺口的環(huán)狀鏈的突變質(zhì)粒。用DpnI處理線性擴(kuò)增的產(chǎn)物；這個內(nèi)切核酸酶特異性切割甲基化的和半甲基化的模板DNA。將新合成的缺口的突變載體DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株XL1 Blue(Bullock，F(xiàn)ernandez and Short，BioTechniques(5)376-379(1987))。轉(zhuǎn)化后，XL1 Blue細(xì)胞修復(fù)突變質(zhì)粒中的缺口。在含有100mg/L卡那霉素的LB培養(yǎng)基(Merck，Darmstadt，Germany)上選擇轉(zhuǎn)化體。在從一個轉(zhuǎn)化體中分離質(zhì)粒DNA后，用限制性內(nèi)切核酸酶EcoRI切割質(zhì)粒并且通過隨后在0.8％瓊脂糖凝膠上的瓊脂糖凝膠電泳檢測。
通過Agowa(Berlin，Germany)確定分離的質(zhì)粒中的metK DNA片段的核苷酸序列，其含有攜帶metKI322L突變的metK等位基因，在本文中稱為“metKI322L等位基因”。獲得的質(zhì)粒命名為pCRII_metKI322L并示于圖1。
攜帶metKI322L等位基因的克隆的DNA片段通過用限制性酶EcoRI完全切割載體pCRII_metKI322L而分離。在瓊脂糖凝膠(0.8％)上分離后，用QIAquick Gel Extraction試劑盒(Qiagen，Hilden，Germany)從瓊脂糖凝膠中分離攜帶metKI322L等位基因的、大小為大約2.4kb的DNA片段。
這樣處理的攜帶metKI322L等位基因的DNA片段用于和可移動克隆載體pK18mobsacB(Schfer et al.，Gene 1469-73(1994))連接。其預(yù)先用限制酶EcoRI切割，然后用蝦堿性磷酸酶(Roche DiagnosticsGmbH，Mannheim，Germany)去磷酸化。將載體DNA與該DNA片段混合并用T4DNA連接酶處理混合物(Amersham-Pharmacia，F(xiàn)reiburg，Germany)。
然后用連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株DH5αmcr(Grant，1990，Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A.，874645-4649)。通過將轉(zhuǎn)化混合物在補(bǔ)加了50mg/l卡那霉素的LB瓊脂上鋪板(Sambrook et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual.2nd Ed.，ColdSpring Harbor，New York，1989)來進(jìn)行攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞的選擇。
用Eppendorf Perfectprep Plasmid Mini試劑盒(Eppendorf，Hamburg，Germany)從轉(zhuǎn)化體中分離質(zhì)粒DNA并且通過使用一次限制性內(nèi)切核酸酶EcoRI和一次限制性內(nèi)切核酸酶BamHI的限制性切割來檢測。該質(zhì)粒稱為pK18mobsacB_metKI322L并示于圖2。菌株稱為大腸桿菌DH5αmcr/pK18mobsacB_metKI322L。
2.2.谷氨酸棒桿菌菌株ATCC13032ΔmetDΔccpA1的metK基因的誘變通過Tauch等(1989FEMS Microbiology Letters 123343-347)的電穿孔方法將載體pK18mobsacB_metKI322L電穿孔進(jìn)谷氨酸棒桿菌ATCC13032ΔmetDΔccpA1中。載體在ATCC13032ΔmetDΔccpA1中不能獨(dú)立復(fù)制而只有在其整合進(jìn)染色體后才能被保留在細(xì)胞中。
通過將轉(zhuǎn)接合混合物在補(bǔ)加了25mg/l卡那霉素和50mg/l萘啶酮酸的LB瓊脂上鋪板來進(jìn)行轉(zhuǎn)接合子的選擇，即具有整合的pK18mobsacB_metKI322L的克隆的選擇。然后將卡那霉素抗性的轉(zhuǎn)接合子在補(bǔ)加了卡那霉素(25mg/l)的LB瓊脂平板上涂布并在33℃溫育24小時。為選擇其中質(zhì)粒的切割是由于第二次重組事件結(jié)果造成的突變體，將克隆在LB液體培養(yǎng)基中非選擇性培養(yǎng)30小時，然后涂布在補(bǔ)加了10％蔗糖的LB瓊脂上并在33℃溫育24小時。
如同起始質(zhì)粒pK18mobsacB，質(zhì)粒pK18mobsacB_metKI322L除了卡那霉素抗性基因還含有編碼枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的果聚糖蔗糖酶(levansucrase)的sacB基因的拷貝。可被蔗糖誘導(dǎo)的sacB基因的表達(dá)導(dǎo)致形成果聚糖蔗糖酶，其催化合成對谷氨酸棒桿菌是毒性的產(chǎn)物果聚糖。因此，只有其中整合的pK18mobsacB_metKI322L由于第二次重組事件而被切除的那些克隆才能在補(bǔ)加了蔗糖的LB瓊脂上生長。根據(jù)第二次重組事件相對于突變位點(diǎn)的位置，在切除過程中發(fā)生等位基因置換或突變摻入，或者野生型等位基因保留在宿主的染色體中。
然后尋找其中發(fā)生所希望的取代，即摻入突變metKI322L的克隆。為此，確定了具有表型“在存在蔗糖的情況下生長”和“在存在卡那霉素的情況下不生長”的10個克隆的metK基因的序列。這樣，鑒定了攜帶突變metKI322L的克隆。這個菌株被命名為谷氨酸棒桿菌ATCC13032ΔmetDΔccpA1_metKI322L。
實(shí)施例3用表達(dá)載體pCREmetAEY轉(zhuǎn)化菌株ATCC13032ΔmetDΔccpA1和ATCC13032ΔmetDΔccpA1_metKI322L含有谷氨酸棒桿菌的甲硫氨酸生物合成的基因metX、metE和metY的表達(dá)載體pCREmetAEY(US6942996)通過Tauch等(1989FEMSMicrobiology Letters 123343-347)的電穿孔方法電穿孔進(jìn)菌株谷氨酸棒桿菌ATCC13032ΔmetDΔccpA1_metKI322L和ATCC13032ΔmetDΔccpA1中。通過將轉(zhuǎn)化混合物在補(bǔ)加了25mg/l卡那霉素的LB瓊脂上鋪板(Sambrock et al.，Molecular Cloning，alaboratory manual.2nd ed.Cold Spring Harbor，New York，1989)來進(jìn)行攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞的選擇。在每種情況中，通過常規(guī)方法(Peters-Wendisch et al.，Microbiology 144915-927(1998))從一個卡那霉素抗性轉(zhuǎn)化體中分離質(zhì)粒DNA并且通過限制性切割來檢測。所得菌株稱為ATCC13032ΔmetDΔccpA1/pCREmetAEY和ATCC13032ΔmetDΔccpA1_metKI322L/pCREmetAEY。
實(shí)施例4甲硫氨酸的生產(chǎn)得自實(shí)施例3的谷氨酸棒桿菌菌株ATCC13032ΔmetDΔccpA1/pCREmetAEY和ATCC13032ΔmetDΔccpA1_metKI322L/pCREmetAEY在適于生產(chǎn)甲硫氨酸的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并且確定培養(yǎng)基上清中的甲硫氨酸含量。
為此，首先將菌株在LB瓊脂平板上在33℃溫育24小時。從這個瓊脂平板培養(yǎng)物開始，接種預(yù)培養(yǎng)物(preculture)(在100ml錐形瓶中10ml培養(yǎng)基)。培養(yǎng)基MM用作預(yù)培養(yǎng)物的培養(yǎng)基。
培養(yǎng)基MMCSL(玉米漿)5g/lMOPS(嗎啉代丙烷磺酸) 20g/l葡萄糖(單獨(dú)高壓滅菌) 50g/l鹽(NH4)2SO425g/lKH2PO41.0g/lMgSO4*7H2O 1.0g/lCaCl2*2H2O 10mg/l
FeSO4*7H2O 10mg/lMnSO4*H2O5.0mg/l生物素(過濾除菌)0.01mg/l維生素B12(過濾除菌) 0.02mg/l硫胺素*HCl(過濾除菌)0.2mg/lCaCO325g/l用氨水將CSL、MOPS和鹽溶液調(diào)節(jié)為pH 7并高壓滅菌。然后加入無菌底物和維生素溶液，以及干燥狀態(tài)的高壓滅菌的CaCO3。
將預(yù)培養(yǎng)物在33℃以及240rpm的搖床上溫育16小時。從這個預(yù)培養(yǎng)物接種主培養(yǎng)物，以便主培養(yǎng)物的起始OD(660nm)是0.1。培養(yǎng)基MM也用于主培養(yǎng)物。
在具有擋板(baffles)的100ml Erlenmeyer燒瓶中在10ml體積中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)在33℃以及80％大氣濕度下進(jìn)行。
72小時后，在660nm的測量波長用Biomek 1000(BeckmannInstruments GmbH，Munich)確定OD。用Eppendorf-BioTronik(Hamburg，Germany)的氨基酸分析儀通過離子交換層析和柱后茚三酮衍生化檢測法(post-column derivation with ninhydrindetection)確定形成的甲硫氨酸量。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果示于表1。
表1

附圖簡述圖1質(zhì)粒pCRII_metKI322L圖譜圖2質(zhì)粒pK18mobsacB_metKI322L圖譜所用簡寫和命名具有以下含義。當(dāng)給出堿基對(bp)的數(shù)值時，這是在可重復(fù)性測量的范圍內(nèi)獲得的大約值。
pUC origin復(fù)制起點(diǎn)pUCKm卡那霉素抗性基因metKI322L 含有metKI322L等位基因的克隆的DNA片段sacB sacB基因oriV pMB1的ColE1-類似起點(diǎn)EcoRI 限制酶EcoRI的切割位點(diǎn)BamHI 限制酶BamHI的切割位點(diǎn)RP4-mob RP4可移動位點(diǎn)(mobilization site)
序列表<110>德古薩股份公司<120>棒狀細(xì)菌metK基因的等位基因<130>040313BT<160>18<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>1224<212>DNA<213>Corynebacterium glutamicum<220>
<221>CDS<222>(1)..(1221)<223>metK wildtype gene<400>1gtg gct cag cca acc gcc gtc cgt ttg ttc acc agt gaa tct gta act48Met Ala Gln Pro Thr Ala Val Arg Leu Phe Thr Ser Glu Ser Val Thr1 5 10 15gag gga cat cca gac aaa ata tgt gat gct att tcc gat acc att ttg96Glu Gly His Pro Asp Lys Ile Cys Asp Ala Ile Ser Asp Thr Ile Leu20 25 30gac gcg ctg ctc gaa aaa gat ccg cag tcg cgc gtc gca gtg gaa act144Asp Ala Leu Leu Glu Lys Asp Pro Gln Ser Arg Val Ala Val Glu Thr35 40 45gtg gtc acc acc gga atc gtc cat gtt gtt ggc gag gtc cgt acc agc192Val Val Thr Thr Gly Ile Val His Val Val Gly Glu Val Arg Thr Ser50 55 60gct tac gta gag atc cct caa tta gtc cgc aac aag ctc atc gaa atc240Ala Tyr Val Glu Ile Pro Gln Leu Val Arg Asn Lys Leu Ile Glu Ile65 70 75 80gga ttc aac tcc tct gag gtt gga ttc gac gga cgc acc tgt ggc gtc288Gly Phe Asn Ser Ser Glu Val Gly Phe Asp Gly Arg Thr Cys Gly Val85 90 95tca gta tcc atc ggt gag cag tcc cag gaa atc gct gac ggc gtg gat336Ser Val Ser Ile Gly Glu Gln Ser Gln Glu Ile Ala Asp Gly Val Asp100 105 110aac tcc gac gaa gcc cgc acc aac ggc gac gtt gaa gaa gac gac cgc384Asn Ser Asp Glu Ala Arg Thr Asn Gly Asp Val Glu Glu Asp Asp Arg115 120 125gca ggt gct ggc gac cag ggc ctg atg ttc ggc tac gcc acc aac gaa432Ala Gly Ala Gly Asp Gln Gly Leu Met Phe Gly Tyr Ala Thr Asn Glu130 135 140
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<221>CDS<222>(1)..(1221)<223>metK allele<220>
<221>mutation<222>(964)..(964)<223>Transversionadenine-->cytosine<400>5gtg gct cag cca acc gcc gtc cgt ttg ttc acc agt gaa tct gta act48Met Ala Gln Pro Thr Ala Val Arq Leu Phe Thr Ser Glu Ser Val Thr1 5 10 15gag gga cat cca gac aaa ata tgt gat gct att tcc gat acc att ttg96Glu Gly His Pro Asp Lys Ile Cys Asp Ala Ile Ser Asp Thr Ile Leu20 25 30gac gcg ctg ctc gaa aaa gat ccg cag tcg cgc gtc gca gtg gaa act144Asp Ala Leu Leu Glu Lys Asp Pro Gln Ser Arg Val Ala Val Glu Thr35 40 45gtg gtc acc acc gga atc gtc cat gtt gtt ggc gag gtc cgt acc agc192Val Val Thr Thr Gly Ile Val His Val Val Gly Glu Val Arg Thr Ser50 55 60gct tac gta gag atc cct caa tta gtc cgc aac aag ctc atc gaa atc240Ala Tyr Val Glu Ile Pro Gln Leu Val Arg Asn Lys Leu Ile Glu Ile65 70 75 80gga ttc aac tcc tct gag gtt gga ttc gac gga cgc acc tgt ggc gtc288Gly Phe Asn Ser Ser Glu Val Gly Phe Asp Gly Arg Thr Cys Gly Val85 90 95tca gta tcc atc ggt gag cag tcc cag gaa atc gct gac ggc gtg gat336Ser Val Ser Ile Gly Glu Gln Ser Gln Glu Ile Ala Asp Gly Val Asp100 105 110aac tcc gac gaa gcc cgc acc aac ggc gac gtt gaa gaa gac gac cgc384Asn Ser Asp Glu Ala Arg Thr Asn Gly Asp Val Glu Glu Asp Asp Arg115 120 125gca ggt gct ggc gac cag ggc ctg atg ttc ggc tac gcc acc aac gaa432Ala Gly Ala Gly Asp Gln Gly Leu Met Phe Gly Tyr Ala Thr Asn Glu130 135 140acc gaa gag tac atg cct ctt cct atc gcg ttg gcg cac cga ctg tca480Thr Glu Glu Tyr Met Pro Leu Pro Ile Ala Leu Ala His Arg Leu Ser145 150 155 160
cgt cgt ctg acc cag gtt cgt aaa gag ggc atc gtt cct cac ctg cgt528Arg Arg Leu Thr Gln Val Arg Lys Glu Gly Ile Val Pro His Leu Arg165 170 175cca gac gga aaa acc cag gtc acc ttc gca tac gat gcg caa gac cgc576Pro Asp Gly Lys Thr Gln Val Thr Phe Ala Tyr Asp Ala Gln Asp Arg180 185 190cct agc cac ctg gat acc gtt gtc atc tcc acc cag cac gac cca gaa624Pro Ser His Leu Asp Thr Val Val Ile Ser Thr Gln His Asp Pro Glu195 200 205gtt gac cgt gca tgg ttg gaa acc caa ctg cgc gaa cac gtc att gat672Val Asp Arg Ala Trp Leu Glu Thr Gln Leu Arg Glu His Val Ile Asp210 215 220tgg gta atc aaa gac gca ggc att gag gat ctg gca acc ggt gag atc720Trp Val Ile Lys Asp Ala Gly Ile Glu Asp Leu Ala Thr Gly Glu Ile225 230 235 240acc gtg ttg atc aac cct tca ggt tcc ttc att ctg ggt ggc ccc atg768Thr Val Leu Ile Asn Pro Ser Gly Ser Phe Ile Leu Gly Gly Pro Met245 250 255ggt gat gcg ggt ctg acc ggc cgc aag atc atc gtg gat acc tac ggt816Gly Asp Ala Gly Leu Thr Gly Arg Lys Ile Ile Val Asp Thr Tyr Gly260 265 270ggc atg gct cgc cat ggt ggt gga gca ttc tcc ggt aag gat cca agc864Gly Met Ala Arg His Gly Gly Gly Ala Phe Ser Gly Lys Asp Pro Ser275 280 285aag gtg gac cgc tct gct gca tac gcc atg cgt tgg gta gca aag aac912Lys Val Asp Arg Ser Ala Ala Tyr Ala Met Arg Trp Val Ala Lys Asn290 295 300atc gtg gca gca ggc ctt gct gat cgc gct gaa gtt cag gtt gca tac960Ile Val Ala Ala Gly Leu Ala Asp Arg Ala Glu Val Gln Val Ala Tyr305 310 315 320gcc ctt gga cgc gca aag cca gtc gga ctt tac gtt gaa acc ttt gac1008Ala Leu Gly Arg Ala Lys Pro Val Gly Leu Tyr Val Glu Thr Phe Asp325 330 335acc aac aag gaa ggc ctg agc gac gag cag att cag gct gcc gtg ttg1056Thr Asn Lys Glu Gly Leu Ser Asp Glu Gln Ile Gln Ala Ala Val Leu340 345 350gag gtc ttt gac ctg cgt cca gca gca att atc cgt gag ctt gat ctg1104Glu Val Phe Asp Leu Arg Pro Ala Ala Ile Ile Arg Glu Leu Asp Leu355 360 365ctt cgt ccg atc tac gct gac act gct gcc tac ggc cac ttt ggt cgc1152Leu Arg Pro Ile Tyr Ala Asp Thr Ala Ala Tyr Gly His Phe Gly Arg370 375 380act gat ttg gac ctt cct tgg gag gct atc gac cgc gtt gat gaa ctt1200Thr Asp Leu Asp Leu Pro Trp Glu Ala Ile Asp Arg Val Asp Glu Leu385 390 395 400
cgc gca gcc ctc aag ttg gcc taa1224Arg Ala Ala Leu Lys Leu Ala405<210>6<211>407<212>PRT<213>Corynebacterium glutamicum<400>6Met Ala Gln Pro Thr Ala Val Arg Leu Phe Thr Ser Glu Ser Val Thr1 5 10 15Glu Gly His Pro Asp Lys Ile Cys Asp Ala Ile Ser Asp Thr Ile Leu20 25 30Asp Ala Leu Leu Glu Lys Asp Pro Gln Ser Arg Val Ala Val Glu Thr35 40 45Val Val Thr Thr Gly Ile Val His Val Val Gly Glu Val Arg Thr Ser50 55 60Ala Tyr Val Glu Ile Pro Gln Leu Val Arg Asn Lys Leu Ile Glu Ile65 70 75 80Gly Phe Asn Ser Ser Glu Val Gly Phe Asp Gly Arg Thr Cys Gly Val85 90 95Ser Val Ser Ile Gly Glu Gln Ser Gln Glu Ile Ala Asp Gly Val Asp100 105 110Asn Ser Asp Glu Ala Arg Thr Asn Gly Asp Val Glu Glu Asp Asp Arg115 120 125Ala Gly Ala Gly Asp Gln Gly Leu Met Phe Gly Tyr Ala Thr Asn Glu130 135 140Thr Glu Glu Tyr Met Pro Leu Pro Ile Ala Leu Ala His Arg Leu Ser145 150 155 160Arg Arg Leu Thr Gln Val Arg Lys Glu Gly Ile Val Pro His Leu Arg165 170 175Pro Asp Gly Lys Thr Gln Val Thr Phe Ala Tyr Asp Ala Gln Asp Arg180 185 190
Pro Ser His Leu Asp Thr Val Val Ile Ser Thr Gln His Asp Pro Glu195 200 205Val Asp Arg Ala Trp Leu Glu Thr Gln Leu Arg Glu His Val Ile Asp210 215 220Trp Val Ile Lys Asp Ala Gly Ile Glu Asp Leu Ala Thr Gly Glu Ile225 230 235 240Thr Val Leu Ile Asn Pro Ser Gly Ser Phe Ile Leu Gly Gly Pro Met245 250 255Gly Asp Ala Gly Leu Thr Gly Arg Lys Ile Ile Val Asp Thr Tyr Gly260 265 270Gly Met Ala Arg His Gly Gly Gly Ala Phe Ser Gly Lys Asp Pro Ser275 280 285Lys Val Asp Arg Ser Ala Ala Tyr Ala Met Arg Trp Val Ala Lys Asn290 295 300Ile Val Ala Ala Gly Leu Ala Asp Arg Ala Glu Val Gln Val Ala Tyr305 310 315 320Ala Leu Gly Arg Ala Lys Pro Val Gly Leu Tyr Val Glu Thr Phe Asp325 330 335Thr Asn Lys Glu Gly Leu Ser Asp Glu Gln Ile Gln Ala Ala Val Leu340 345 350Glu Val Phe Asp Leu Arg Pro Ala Ala Ile Ile Arg Glu Leu Asp Leu355 360 365Leu Arg Pro Ile Tyr Ala Asp Thr Ala Ala Tyr Gly His Phe Gly Arg370 375 380Thr Asp Leu Asp Leu Pro Trp Glu Ala Ile Asp Arg Val Asp Glu Leu385 390 395 400Arg Ala Ala Leu Lys Leu Ala405<210>7<211>1236
<212>DNA<213>Corynebacterium glutamicum<220>
<221>CDS<222>(1)..(1233)<223>metK allele<220>
<221>mutation<222>(1201)..(1201)<223>frame shift mutationdeletion of the base cytosine<400>7gtg gct cag cca acc gcc gtc cgt ttg ttc acc agt gaa tct gta act48Met Ala Gln Pro Thr Ala Val Arg Leu Phe Thr Ser Glu Ser Val Thr1 5 10 15gag gga cat cca gac aaa ata tgt gat gct att tcc gat acc att ttg96Glu Gly His Pro Asp Lys Ile Cys Asp Ala Ile Ser Asp Thr Ile Leu20 25 30gac gcg ctg ctc gaa aaa gat ccg cag tcg cgc gtc gca gtg gaa act144Asp Ala Leu Leu Glu Lys Asp Pro Gln Ser Arg Val Ala Val Glu Thr35 40 45gtg gtc acc acc gga atc gtc cat gtt gtt ggc gag gtc cgt acc agc192Val Val Thr Thr Gly Ile Val His Val Val Gly Glu Val Arg Thr Ser50 55 60gct tac gta gag atc cct caa tta gtc cgc aac aag ctc atc gaa atc240Ala Tyr Val Glu Ile Pro Gln Leu Val Arg Asn Lys Leu Ile Glu Ile65 70 75 80gga ttc aac tcc tct gag gtt gga ttc gac gga cgc acc tgt ggc gtc288Gly Phe Asn Ser Ser Glu Val Gly Phe Asp Gly Arg Thr Cys Gly Val85 90 95tca gta tcc atc ggt gag cag tcc cag gaa atc gct gac ggc gtg gat336Ser Val Ser Ile Gly Glu Gln Ser Gln Glu Ile Ala Asp Gly Val Asp100 105 110aac tcc gac gaa gcc cgc acc aac ggc gac gtt gaa gaa gac gac cgc384Asn Ser Asp Glu Ala Arg Thr Asn Gly Asp Val Glu Glu Asp Asp Arg115 120 125gca ggt gct ggc gac cag ggc ctg atg ttc ggc tac gcc acc aac gaa432Ala Gly Ala Gly Asp Gln Gly Leu Met Phe Gly Tyr Ala Thr Asn Glu130 135 140acc gaa gag tac atg cct ctt cct atc gcg ttg gcg cac cga ctg tca480Thr Glu Glu Tyr Met Pro Leu Pro Ile Ala Leu Ala His Arg Leu Ser145 150 155 160cgt cgt ctg acc cag gtt cgt aaa gag ggc atc gtt cct cac ctg cgt528Arg Arg Leu Thr Gln Val Arg Lys Glu Gly Ile Val Pro His Leu Arg165 170 175
cca gac gga aaa acc cag gtc acc ttc gca tac gat gcg caa gac cgc576Pro Asp Gly Lys Thr Gln Val Thr Phe Ala Tyr Asp Ala Gln Asp Arg180 185 190cct agc cac ctg gat acc gtt gtc atc tcc acc cag cac gac cca gaa624Pro Ser His Leu Asp Thr Val Val Ile Ser Thr Gln His Asp pro Glu195 200 205gtt gac cgt gca tgg ttg gaa acc caa ctg cgc gaa cac gtc att gat672Val Asp Arg Ala Trp Leu Glu Thr Gln Leu Arg Glu His Val Ile Asp210 215 220tgg gta atc aaa gac gca ggc att gag gat ctg gca acc ggt gag atc720Trp Val Ile Lys Asp Ala Gly Ile Glu Asp Leu Ala Thr Gly Glu Ile225 230 235 240acc gtg ttg atc aac cct tca ggt tcc ttc att ctg ggt ggc ccc atg768Thr Val Leu Ile Asn Pro Ser Gly Ser Phe Ile Leu Gly Gly Pro Met245 250 255ggt gat gcg ggt ctg acc ggc cgc aag atc atc gtg gat acc tac ggt816Gly Asp Ala Gly Leu Thr Gly Arg Lys Ile Ile Val Asp Thr Tyr Gly260 265 270ggc atg gct cgc cat ggt ggt gga gca ttc tcc ggt aag gat cca agc864Gly Met Ala Arg His Gly Gly Gly Ala Phe Ser Gly Lys Asp Pro Ser275 280 285aag gtg gac cgc tct gct gca tac gcc atg cgt tgg gta gca aag aac912Lys Val Asp Arg Ser Ala Ala Tyr Ala Met Arg Trp Val Ala Lys Asn290 295 300atc gtg gca gca ggc ctt gct gat cgc gct gaa gtt cag gtt gca tac960Ile Val Ala Ala Gly Leu Ala Asp Arg Ala Glu Val Gln Val Ala Tyr305 310 315 320gcc att gga cgc gca aag cca gtc gga ctt tac gtt gaa acc ttt gac1008Ala Ile Gly Arg Ala Lys Pro Val Gly Leu Tyr Val Glu Thr Phe Asp325 330 335acc aac aag gaa ggc ctg agc gac gag cag att cag gct gcc gtg ttg1056Thr Asn Lys Glu Gly Leu Ser Asp Glu Gln Ile Gln Ala Ala Val Leu340 345 350gag gtc ttt gac ctg cgt cca gca gca att atc cgt gag ctt gat ctg1104Glu Val Phe Asp Leu Arg Pro Ala Ala Ile Ile Arg Glu Leu Asp Leu355 360 365ctt cgt ccg atc tac gct gac act gct gcc tac ggc cac ttt ggt cgc1152Leu Arg Pro Ile Tyr Ala Asp Thr Ala Ala Tyr Gly His Phe Gly Arg370 375 380act gat ttg gac ctt cct tgg gag gct atc gac cgc gtt gat gaa ctt1200Thr Asp Leu Asp Leu Pro Trp Glu Ala Ile Asp Arg Val Asp Glu Leu385 390 395 400gcg cag ccc tca agt tgg cct aaa aat ctg atg tag1236
Ala Gln Pro Ser Ser Trp Pro Lys Asn Leu Met405 410<210>8<211>411<212>PRT<213>Corynebacterium glutamicum<400>8Met Ala Gln Pro Thr Ala Val Arg Leu Phe Thr Ser Glu Ser Val Thr1 5 10 15Glu Gly His Pro Asp Lys Ile Cys Asp Ala Ile Ser Asp Thr Ile Leu20 25 30Asp Ala Leu Leu Glu Lys Asp Pro Gln Ser Arg Val Ala Val Glu Thr35 40 45Val Val Thr Thr Gly Ile Val His Val Val Gly Glu Val Arg Thr Ser50 55 60Ala Tyr Val Glu Ile Pro Gln Leu Val Arg Asn Lys Leu Ile Glu Ile65 70 75 80Gly Phe Asn Ser Ser Glu Val Gly Phe Asp Gly Arg Thr Cys Gly Val85 90 95Ser Val Ser Ile Gly Glu Gln Ser Gln Glu Ile Ala Asp Gly Val Asp100 105 110Asn Ser Asp Glu Ala Arg Thr Asn Gly Asp Val Glu Glu Asp Asp Arg115 120 125Ala Gly Ala Gly Asp Gln Gly Leu Met Phe Gly Tyr Ala Thr Asn Glu130 135 140Thr Glu Glu Tyr Met Pro Leu Pro Ile Ala Leu Ala His Arg Leu Ser145 150 155 160Arg Arg Leu Thr Gln Val Arg Lys Glu Gly Ile Val Pro His Leu Arg165 170 175Pro Asp Gly Lys Thr Gln Val Thr Phe Ala Tyr Asp Ala Gln Asp Arg180 185 190Pro Ser His Leu Asp Thr Val Val Ile Ser Thr Gln His Asp Pro Glu
195 200 205Val Asp Arg Ala Trp Leu Glu Thr Gln Leu Arg Glu His Val Ile Asp210 215 220Trp Val Ile Lys Asp Ala Gly Ile Glu Asp Leu Ala Thr Gly Glu Ile225 230 235 240Thr Val Leu Ile Asn Pro Ser Gly Ser Phe Ile Leu Gly Gly Pro Met245 250 255Gly Asp Ala Gly Leu Thr Gly Arg Lys Ile Ile Val Asp Thr Tyr Gly260 265 270Gly Met Ala Arg His Gly Gly Gly Ala Phe Ser Gly Lys Asp Pro Ser275 280 285Lys Val Asp Arg Ser Ala Ala Tyr Ala Met Arg Trp Val Ala Lys Asn290 295 300Ile Val Ala Ala Gly Leu Ala Asp Arg Ala Glu Val Gln Val Ala Tyr305 310 315 320Ala Ile Gly Arg Ala Lys Pro Val Gly Leu Tyr Val Glu Thr Phe Asp325 330 335Thr Asn Lys Glu Gly Leu Ser Asp Glu Gln Ile Gln Ala Ala Val Leu340 345 350Glu Val Phe Asp Leu Arg Pro Ala Ala Ile Ile Arg Glu Leu Asp Leu355 360 365Leu Arg Pro Ile Tyr Ala Asp Thr Ala Ala Tyr Gly His Phe Gly Arg370 375 380Thr Asp Leu Asp Leu Pro Trp Glu Ala Ile Asp Arg Val Asp Glu Leu385 390 395 400Ala Gln Pro Ser Ser Trp Pro Lys Asn Leu Met405 410<210>9<211>30<212>DNA<213>Artificial sequence
<220>
<223>Primer ccpA1-del1<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(30)<223>Primer ccpA1-del1<400>9gctagaattc aaggccacat tgaccagttc 30<210>10<211>48<212>DNA<213>Artificial sequence<220>
<223>Primer ccpA1-del2<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(48)<223>Primer ccpAl-del2<400>10tgtgacctag gcttgacttt atttaaatat gatcctgcac caatcctt 48<210>11<211>48<212>DNA<213>Artificial sequence<220>
<223>Primer ccpA1-del3<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(48)<223>Primer ccpA1-del3<400>11aaggattggt gcaggatcat atttaaataa agtcaagcct aggtcaca 48<210>12<211>30<212>DNA<213>Artificial sequence<220>
<223>Primer ccpA1-del4<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(30)<223>Primer ccpA1-del4<400>12gctagaattc atctcatcca agtggtgcga 30<210>13<211>20<212>DNA<213>Corynebacterium glutamicum<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(20)<223>Primer ccpA1-A1<400>13cctgcacacc accgctgaat 20<210>14<211>20<212>DNA<213>Corynebacterium glutamicum<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(20)<223>Primer ccpA1-E1<400>14cagccgcacc agctcatctt 20<210>15<211>20<212>DNA<213>Corynebacterium glutamicum<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(20)<223>Primer metK-1<400>15tgcgacctcc tcatgtgtaa 20<210>16<211>20<212>DNA<213>Corynebacterium glutamicum<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(20)<223>Primer metK-2<400>16aggttgtcgt cgccatcatt 20<210>17<211>30<212>DNA<213>Corynebacterium glutamicum<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(30)<223>Primer metK-I322La<400>17caggttgcat acgcccttgg acgcgcaaag 30<210>18<211>30<212>DNA<213>Corynebacterium glutamicum<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(30)<223>Primer metK-I322Lb<400>18ctttgcgcgt ccaagggcgt atgcaacctg 30
權(quán)利要求
1.來自棒狀細(xì)菌且編碼具有S-腺苷甲硫氨酸合成酶酶活性的多肽的可復(fù)制的核苷酸序列(DNA)，其中在相關(guān)氨基酸序列中，SEQ IDNo.2的第200位的L-纈氨酸或者SEQ ID No.2的第322位的L-異亮氨酸被另一種蛋白質(zhì)氨基酸取代。
2.權(quán)利要求1的來自棒狀細(xì)菌且編碼蛋白S-腺苷甲硫氨酸合成酶的可復(fù)制的核苷酸序列(DNA)，其中相關(guān)氨基酸序列在第200位含有L-天冬氨酸(SEQ ID No.4)；或者在第322位含有L-亮氨酸(SEQ ID No.6)；或者其中該蛋白相對于野生型蛋白質(zhì)延伸了4個氨基酸，且氨基酸序列從401-411位具有氨基酸L-丙氨酸、L-谷氨酰胺、L-脯氨酸、L-絲氨酸、L-絲氨酸、L-半胱氨酸、L-脯氨酸、L-賴氨酸、L-天冬酰胺、L-亮氨酸和L-甲硫氨酸(SEQ ID No.8)。
3.權(quán)利要求1的來自棒狀細(xì)菌且編碼蛋白S-腺苷甲硫氨酸合成酶的可復(fù)制的核苷酸序列(DNA)，其堿基序列在第599位含有腺嘌呤(SEQ ID No.3)或者在第964位含有胞嘧啶(SEQ ID No.5)或者在第1201位缺失了胞嘧啶(SEQ ID No.7)。
4.含有權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的核苷酸序列并任選在棒狀細(xì)菌中復(fù)制的質(zhì)粒(載體)。
5.含有權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的核苷酸序列的棒狀細(xì)菌。
6.含有權(quán)利要求4的載體的細(xì)菌。
7.分離的棒狀細(xì)菌，其含有編碼具有S-腺苷甲硫氨酸合成酶酶活性的多肽的核苷酸序列，其中在相關(guān)氨基酸序列中，SEQ ID No.2的第200位的L-纈氨酸或者SEQ ID No.2的第322位的L-異亮氨酸被另一種蛋白質(zhì)氨基酸取代；或者其中蛋白質(zhì)相對于野生型蛋白質(zhì)延伸了4個氨基酸，且氨基酸序列的第401-411位具有氨基酸L-丙氨酸、L-谷氨酰胺、L-脯氨酸、L-絲氨酸、L-絲氨酸、L-半胱氨酸、L-脯氨酸、L-賴氨酸、L-天冬酰胺、L-亮氨酸及L-甲硫氨酸。
8.一種生產(chǎn)L-甲硫氨酸或者含有L-甲硫氨酸的飼料添加劑的方法，其中進(jìn)行以下步驟a)發(fā)酵棒狀細(xì)菌，在所述棒狀細(xì)菌中內(nèi)源metK基因的等位基因在適于形成metK基因產(chǎn)物S-腺苷甲硫氨酸合成酶的條件下被過表達(dá)；b)從發(fā)酵肉湯中分離L-甲硫氨酸或者含有L-甲硫氨酸的飼料添加劑，其中棒狀細(xì)菌形成L-甲硫氨酸，任選地c)具有來自發(fā)酵肉湯的成分和/或生物量(≤100％)。
9.權(quán)利要求8的方法，其特征在于使用含有metK基因的等位基因的棒狀細(xì)菌，其中在相關(guān)氨基酸序列中，SEQ ID No.2的第200位的L-纈氨酸或者SEQ ID No.2的第322位的L-異亮氨酸被另一種蛋白質(zhì)氨基酸取代。
10.權(quán)利要求8的方法，其特征在于使用L-甲硫氨酸的生物合成途徑中另外的基因被過表達(dá)的微生物。
11.權(quán)利要求8的方法，其特征在于為了生產(chǎn)L-氨基酸或者含有L-氨基酸的飼料添加劑，L-氨基酸的生物合成途徑中另外的基因也被過表達(dá)。
12.權(quán)利要求8的方法，其特征在于使用這樣的微生物，所述微生物中的降低L-甲硫氨酸形成的代謝途徑被至少部分弱化或抑制。
13.一種生產(chǎn)L-甲硫氨酸或含有L-甲硫氨酸的飼料添加劑的方法，其中進(jìn)行以下步驟a)發(fā)酵含有編碼S-腺苷甲硫氨酸合成酶的內(nèi)源核苷酸序列的棒狀細(xì)菌，其中在相關(guān)氨基酸序列中，第200位的L-纈氨酸被另一種蛋白質(zhì)氨基酸取代，優(yōu)選被L-天冬氨酸取代；或者第322位的L-異亮氨酸被另一種蛋白質(zhì)氨基酸取代，優(yōu)選被L-亮氨酸取代，b)在發(fā)酵肉湯中積累L-甲硫氨酸，c)從發(fā)酵肉湯中分離L-甲硫氨酸或含有L-甲硫氨酸的飼料添加劑，任選地d)具有來自發(fā)酵肉湯的成分和/或生物量(＞0至100％)。
全文摘要
本發(fā)明涉及來自棒狀細(xì)菌的、編碼S－腺苷甲硫氨酸合成酶的metK基因的等位基因，以及涉及使用含有這些等位基因的細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)L－甲硫氨酸的方法。
文檔編號C12P13/12GK1807636SQ200510127129
公開日2006年7月26日 申請日期2005年11月17日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月17日
發(fā)明者納塔莉·席施卡, 布麗吉特·巴瑟 申請人:德古薩股份公司