專利名稱：諾瓦克病毒表達(dá)量檢測(cè)試劑盒及其專用引物與探針的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種諾瓦克病毒表達(dá)量檢測(cè)試劑盒及其專用引物與探針，尤指一種定量檢測(cè)標(biāo)本中諾瓦克病毒(Norovirus)的量并區(qū)分出其基因型的檢測(cè)試劑盒及其專用引物與探針，屬于病毒核酸的檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
Norovirus(曾稱作諾瓦克樣病毒，Norwalk-like virus)，1972年首次從美國(guó)俄亥俄州諾瓦克城爆發(fā)的急性胃腸炎患者糞便標(biāo)本中分離出來(lái)，是一種直徑27μm的RNA病毒。最近Norovirus(NoV)被認(rèn)為是食源性疾病爆發(fā)最重要的病原，其通過人傳人方式傳播的多為二、三代患者，而初發(fā)事件多是通過污染食品以及水、尤其是新鮮海產(chǎn)品引起的爆發(fā)流行，已成為日益嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。美國(guó)每年有2300萬(wàn)例胃腸炎，其中5萬(wàn)例需住院治療、300例死亡，是由NoV引起的；美國(guó)的疾病預(yù)防控制中心(CDC)僅在2002年11月～12月間，就接到來(lái)自華盛頓、新罕布什爾和紐約3個(gè)州的104起NoV引起的胃腸炎爆發(fā)報(bào)告。歐洲10個(gè)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)的數(shù)據(jù)顯示，NoV應(yīng)該對(duì)1995年～2000年間超過85％的病毒性食源性疾病負(fù)責(zé)。據(jù)日本IASR(Infectious AgentsSurveillance Report)監(jiān)測(cè)網(wǎng)報(bào)道，僅2003年10月一個(gè)月，在青森、巖手和滋賀縣三個(gè)縣就相繼發(fā)生4起NoV引起的胃腸炎爆發(fā)；同時(shí)日本冬季兒童腹瀉的主要病原也是NoV。繼2002年CDC報(bào)道NoV通過食品引起的爆發(fā)迅速上升后，食品中、尤其是新鮮海產(chǎn)品中NoV的研究便成為人們十分關(guān)注的課題。我國(guó)由于對(duì)NoV本身的認(rèn)識(shí)不足、相關(guān)研究少、檢測(cè)手段落后、誤診率高或不能確診等影響因素，至今尚未見NoV引起食源性疾病爆發(fā)的報(bào)道。
目前國(guó)內(nèi)外對(duì)食品、尤其是新鮮海產(chǎn)品中NoV的研究因受檢測(cè)技術(shù)的限制而裹足不前。由于NoV原型株不能用細(xì)胞株培養(yǎng)、也不能建立動(dòng)物模型，傳統(tǒng)的檢測(cè)方法是用電鏡檢查患者的糞便標(biāo)本，因其分辨率低(接近106～107個(gè)病毒/克濃度時(shí)才能被檢測(cè)到)，而不能用于檢測(cè)食品或水標(biāo)本中較低濃度的病毒，加之電鏡調(diào)查成本高、標(biāo)本難獲得，只限于進(jìn)行小規(guī)模標(biāo)本的調(diào)查；免疫電鏡技術(shù)可使敏感度提高10～100倍，但與操作者的經(jīng)驗(yàn)和技能間關(guān)系密切，因而假陰性率較高。酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)可檢測(cè)濃度在104～106/ml的臨床標(biāo)本(雙分血清)，但由于NoV不同株間殼衣蛋白抗原具有相當(dāng)大的變異性，降低了該法的特異性和敏感性，且材料來(lái)源有限，限制了該法的使用。
熒光定量RT-PCR技術(shù)的出現(xiàn)，為我們提供了一個(gè)定量檢測(cè)病毒RNA的準(zhǔn)確方法，所謂實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性熒光探針，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程。目前常用的Taqman熒光探針為寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收，故檢測(cè)不到熒光；在PCR擴(kuò)增過程中，Taq酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)。在PCR擴(kuò)增過程中，每個(gè)循環(huán)結(jié)束后檢測(cè)一次熒光強(qiáng)度，整個(gè)反應(yīng)結(jié)束后，便可得到一條工作曲線，根據(jù)該曲線可對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析。
在本發(fā)明中，我們采用了目前最先進(jìn)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)，在保持高敏感性的前提下盡量減少假陽(yáng)性的干擾?？朔顺Ｒ?guī)PCR檢測(cè)技術(shù)的諸多難題，如產(chǎn)物電泳費(fèi)時(shí)、溴化乙啶毒性、易出現(xiàn)假陽(yáng)性、特異性低等難題。本發(fā)明試劑盒可以對(duì)牡蠣、人糞便中諾瓦克病毒(Norovirus，NoV)的含量進(jìn)行定量檢測(cè)，并可區(qū)分其基因型(GG I型、GG II型)。本發(fā)明試劑盒對(duì)諾瓦克病毒進(jìn)行定量及分型檢測(cè)將有助于該病毒的流行病學(xué)研究，并可為分析海鮮產(chǎn)品中NoV的基因型與人群流行NoV基因型的關(guān)系、中國(guó)NoV基因型與國(guó)際NoV基因型的比較分析以及海產(chǎn)品的NoV污染特點(diǎn)、流行變異趨勢(shì)及其規(guī)律研究提供方便快捷的檢測(cè)工具；亦可為我國(guó)NoV的研究、預(yù)防和控制NoV經(jīng)新鮮海產(chǎn)品介導(dǎo)引起大規(guī)模的爆發(fā)提供方便快捷的檢測(cè)工具。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供檢測(cè)諾瓦克病毒的專用引物與探針。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種靈敏、快速、操作簡(jiǎn)便的諾瓦克病毒表達(dá)量檢測(cè)試劑盒。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案檢測(cè)諾瓦克病毒的引物與探針，具有如下核苷酸序列1.CCATGTTCCGYTGGATGCGNTTYC；2.TGGGGCGTCCTTAGACGCCATCAT；3.TGCCCAGACAAGAGTCAATGTTTA；4.AGCAGCGTCATTCGACGCCATCT；
5.GACAGGAGATYGCGATCTCCTGYCC；6.CTAAGCACATGGGAGGGCGATCGCAA；其中N為A，C，G，或T；Y為T/U或C。
本發(fā)明試劑盒包含樣品前處理液A、樣品前處理液B、樣品前處理液C、樣品前處理液D、RNA提取試劑、無(wú)RNA酶的水、逆轉(zhuǎn)錄引物、反轉(zhuǎn)錄緩沖液、dNTP混合物、0.1M DTT、逆轉(zhuǎn)錄酶保存液、GG I型PCR反應(yīng)液、GG II型PCR反應(yīng)液、GG I型探針、GG II型探針、GG I型UNG酶保存液、GG II型UNG酶保存液、GGI型標(biāo)準(zhǔn)品、GG II型標(biāo)準(zhǔn)品、GG I型質(zhì)控品、GG II型質(zhì)控品。
(1)樣品前處理液A為0.05M的甘氨酸緩沖液(pH 9.5，25℃)1000ml中含0.05mol的甘氨酸、0.15mol NaCI，溶劑為水；(2)樣品前處理液B為16％的聚乙二醇6000(PEG6000)溶液1000ml中含160克的PEG6000、0.3mol的NaCI，溶劑為水；(3)樣品前處理液C為0.15M的Na2HPO4溶液(pH 9.0，25℃)1000ml中含0.15mol的Na2HPO4，溶劑為水；(4)樣品前處理液D為PBS緩沖液1000ml中含1.47mmol的KH2PO4、136.9mmol的NaCl、2.68mmol的KCl、7.96mmol的Na2HPO4·12H2O，溶劑為水；(5)RNA提取試劑為Trizol試劑；(6)無(wú)RNA酶的水制備方法為向去離子水加入DEPC(焦碳酸二乙酯)，至終濃度為0.05％(V/V)，37℃放置2小時(shí)，121℃，20min高壓，備用；(7)逆轉(zhuǎn)錄引物為隨機(jī)引物六引物，用去離子水溶解成100μmol/L的使用液；(8)反轉(zhuǎn)錄緩沖液1000ml中含250mmol的Tris-HCl(pH 8.3，25℃)、375mmol的KCl、15mmol的MgCl2，溶劑為水；(9)dNTP混合物1000ml中含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各10mmol，溶劑為水(pH7.0-7.5，25℃)；(10)逆轉(zhuǎn)錄酶保存液1000ml中含20mmol的Tris-HCl(pH 7.5，25℃)、100mmol的NaCl、0.1mmol的EDTA、1.0mmol的DTT、500ml的甘油、0.1ml的Nonidet p-40、2.0×108U的逆轉(zhuǎn)錄酶(M-MLV)、水；(11)GG I型PCR反應(yīng)液1000ml中含20mmol的Tris-HCI(pH8.3，25℃)、3.0mmol的MgCI2、100mmol的KCI、0.4μmol的上下游引物(/L)、1.0×105U的Taq酶、400nmol的dATP、400nmol的dCTP、400nmol的dGTP、800nmol的dUTP、，溶劑為水；上、下游引物序列分別為P15’-CCATGTTCCGYTGGATGCGNTTYC-3’P25’-TGGGGCGTCCTTAGACGCCATCAT-3’(12)GG II型PCR反應(yīng)液1000ml中含20mmol的Tris-HCI(pH8.3，25℃)、3.0mmol的MgCI2、100mmol的KCI、0.4μmol的上下游引物(/L)、1.0×105U的Taq酶、400nmol的dATP、400nmol的dCTP、400nmol的dGTP、800nmol的dUTP，溶劑為水；上、下游引物序列分別為P15’-TGCCCAGACAAGAGTCAATGTTTA-3’P25’-AGCAGCGTCATTCGACGCCATCT-3’(13)GG I型探針為熒光標(biāo)記探針，其序列為5’-FAM-GACAGGAGATYGCGATCTCCTGYCC-TAMRA-3’；(14)GG II型探針為熒光標(biāo)記探針，其序列為5’-FAM-CTAAGCACATGGGAGGGCGATCGCAA-TAMRA-3’；(15)GG I型UNG酶1000ml中含50ml的甘油、30mmol的Tris-HCl(pH7.5，25℃)、150mmol的NaCl、1.0mmol的EDTA、1.0mmol的DTT、0.5ml的Tween 20、1.0×106U的UNG酶，溶劑為水；(16)GGII型UNG酶1000ml中含50ml的甘油、30mmol的Tris-HCl(pH 7.5，25℃)、150mmol的NaCl、1.0mmol的EDTA、1.0mmol的DTT、0.5ml的Tween 20、1.0×106U的UNG酶，溶劑為水；(17)GG I型標(biāo)準(zhǔn)品的序列為1 CCATGTTCCG CTGGATGCGT TTCCATGATC TGAGTTTGTG GACAGGAGAT CGCGATCTCC61 TGCCCGATTA TGTAAATGAT GATGGCGTCT AAGGACGCCC CA(18)GGII型標(biāo)準(zhǔn)品的序列為1 TGCCCAGACA AGAGTCAATG TTTAGGTGGA TGAGGTTCTC AGATCTAAGC ACATGGGAGG61 GCGATCGCAA TCTGGCTCCC AGTTTTGTGA ATGAAGATGG CGTCGAATGA CGCTGCT(19)GG I型質(zhì)控品分為陽(yáng)性質(zhì)控品與陰性質(zhì)控品，陽(yáng)性質(zhì)控品為含有GG I型RNA的樣品，陰性質(zhì)控品為不含GG I型RNA的樣品。
(20)GG II型質(zhì)控品分為陽(yáng)性質(zhì)控品與陰性質(zhì)控品，陽(yáng)性質(zhì)控品為含有GG II型RNA的樣品，陰性質(zhì)控品為不含GG II型RNA的樣品。
本發(fā)明試劑盒的規(guī)格為20份/盒；樣品前處理試劑及RNA提取試劑保存于4℃；RT-PCR試劑保存于-20℃，盡量減少反復(fù)凍融。
本發(fā)明試劑盒的制備過程(具體的制備步驟見實(shí)施例1)1.設(shè)計(jì)引物、探針并合成；制備標(biāo)準(zhǔn)品。
2.按發(fā)明內(nèi)容中的制備方法制備無(wú)RNA酶的水。
3.制備陽(yáng)性對(duì)照品及陰性對(duì)照品。
4.按發(fā)明內(nèi)容中的濃度要求配制樣品前處理液A、樣品前處理液B、樣品前處理液C、樣品前處理液D、逆轉(zhuǎn)錄引物、反轉(zhuǎn)錄緩沖液、dNTP混合物、0.1M DTT、逆轉(zhuǎn)錄酶保存液、GG I型PCR反應(yīng)液、GG II型PCR反應(yīng)液、GG I型探針、GG II型探針、GG I型UNG酶保存液、GG II型UNG酶保存液、GG I型標(biāo)準(zhǔn)品、GG II型標(biāo)準(zhǔn)品、GG I型質(zhì)控品、GG II型質(zhì)控品。
5.按本發(fā)明試劑盒的規(guī)格對(duì)上述各組分進(jìn)行分裝。
本發(fā)明試劑盒的使用方法自備試劑及材料無(wú)菌的50ml離心管、無(wú)菌的三角燒瓶(100ml)、無(wú)RNA酶的1.5ml離心管、無(wú)RNA酶的0.5ml離心管、無(wú)RNA酶的槍頭(量程為1ml，200μl，10μl，2μl)；氯仿、異丙醇、無(wú)水乙醇。
儀器ABI PRISM5700、ABI PRISM 7000、iCycle或其它類似的熒光定量檢測(cè)儀。
樣品要求新鮮或-20℃保存的牡蠣或人糞便，并按下列步驟進(jìn)行樣品的前處理(一)牡蠣的前處理(濃縮液的制備)注3個(gè)牡蠣的消化腺為1個(gè)樣品，1批可檢3～10個(gè)樣品，注意避免樣品間的交叉污染。
(1)用竹簽、手術(shù)刀等切斷牡蠣的貝柱，打開殼。
(2)去除外膜，將消化腺(深色物質(zhì))周圍的脂肪組織(白色物質(zhì))盡量用手術(shù)刀、小鑷子等去除，取出消化腺。
(3)將消化腺置勻漿器中快速勻漿后，將勻漿液放入滅菌的三角燒瓶中，加入7倍體積的樣品前處理液A，室溫下充分振蕩后分裝于50ml離心管中，4℃，3000g，30min離心。
(4)將上清液轉(zhuǎn)移至新的無(wú)菌的50ml離心管中，調(diào)PH值至7.5，加入等體積的樣品前處理液B，輕微混勻，4℃沉淀4小時(shí)后，4℃，3000g，30min離心。
(5)棄上清，沉淀用1.5ml樣品前處理液C重懸，室溫下100rpm振蕩20分鐘后，分裝于1.5ml的無(wú)RNA酶的離心管中，4℃，10000g，30min離心。
(6)將上清夜移至新的1.5ml的無(wú)RNA酶的離心管中，并調(diào)節(jié)PH值7.4，置于-20℃中保存，備用。
(二)糞便樣品的前處理(濃縮液的制備)注操作時(shí)既要注意糞便的感染性，又要注意避免樣品間的交叉污染。
用樣品前處理液D將糞便制成10％(g/ml)的懸液。
劇烈振蕩后，4℃，12000rpm，20min離心。
取上清于1.5ml的無(wú)RNA酶的離心管中，置于-20℃中保存，備用。
操作步驟(一)、RNA提取1.取牡蠣樣品濃縮液或糞便樣品濃縮液300μl，加入1ml RNA提取試劑，上下顛倒混勻后，加入200μl氯仿，劇烈搖動(dòng)15sec，冰盒中放置3min。
4.4℃，12000g離心15min，若離心前管中出現(xiàn)分層可重新?lián)u動(dòng)使之混勻。
5.取出離心管，吸上清于另一無(wú)RNA酶的1.5ml離心管中，注意不要吸入中間的DNA層。加入700μl的異丙醇，冰盒中放置10min，之后12000g，4℃離心10min。
6.棄離心管中的液體，加入75％乙醇1ml，上下顛倒3-5次，室溫放置2分鐘，7500g，4℃，離心5min；重復(fù)洗滌一次。
7.棄管中液體，室溫下倒置10min，加入20-50μl的DEPC處理過的水，溶解RNA。冰盒放置備用或-70℃保存。
(二)、RT反應(yīng)1.將RT試劑盒中各組分混勻，短暫離心。
2.在0.5ml PCR管中準(zhǔn)備RNA/引物混合物，表格如下表1


3.65℃孵育5min，冰盒放置至少1min。
4.將裝有DTT、M-MLV及逆轉(zhuǎn)錄緩沖液的離心管從-20℃中取出，置于冰盒上待其緩慢融化后，短暫離心，將DTT及逆轉(zhuǎn)錄緩沖液全部加入M-MLV管中配制成混合液，混勻，短暫離心，置于冰盒上備用，5.向RNA/引物混合物每管加入7μl上述混合液，混勻，短暫離心收集。
6.25℃，孵育5min；之后37℃，孵育50min。
7.70℃，15min終止反應(yīng)，冰上冷卻或-20℃保存。
(三)、PCR擴(kuò)增注a.一個(gè)樣品的RT產(chǎn)物要同時(shí)用GG I，GG II型引物進(jìn)行檢測(cè)，并需同時(shí)制備兩型的標(biāo)準(zhǔn)曲線；以便對(duì)陽(yáng)性樣品進(jìn)行分型及定量檢測(cè)。
b.每次檢測(cè)均應(yīng)設(shè)立陽(yáng)性及陰性對(duì)照。
1.將裝有PCR緩沖液、UNG酶及探針的離心管從-20℃中取出，置于冰盒上待其緩慢融化后，短暫離心，將探針及PCR緩沖液全部加入U(xiǎn)NG酶管中配制成PCR反應(yīng)液，混勻，短暫離心，置于冰盒上備用，使用后剩余PCR反應(yīng)混合液可放入-20℃冰箱中保存。
按下列組成配制PCR體系表2

PCR反應(yīng)條件37℃10分鐘；95℃15分鐘；(95℃15秒，56℃1分鐘，40個(gè)循環(huán))。
2.標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作將標(biāo)準(zhǔn)品貯存液(2×106copies/ul)梯度稀釋為2×105，2×104，2×103，2×102，2×101copies/ul，5個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液各取5ul為模板同待測(cè)樣品一同進(jìn)行PCR擴(kuò)增，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。
(四)、結(jié)果分析1.使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀的隨機(jī)軟件進(jìn)行文件的保存及閾值的設(shè)定。
2.選中不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)的孔并標(biāo)注標(biāo)準(zhǔn)值，進(jìn)行分析，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線及相關(guān)信息。
3.選中所有樣品檢測(cè)孔，應(yīng)用相應(yīng)進(jìn)行分析，得出待測(cè)樣品的起始模板數(shù)，進(jìn)而計(jì)算出樣品中的拷貝數(shù)。
本發(fā)明建立了利用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)檢測(cè)牡蠣或人糞便樣品中Norovirus表達(dá)量及其基因分型的方法，標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果表明本發(fā)明試劑盒操作簡(jiǎn)便，性能優(yōu)越。
1.本發(fā)明試劑盒的樣品前處理方法具有以下優(yōu)點(diǎn)(1).操作簡(jiǎn)便；(2).使用安全，操作過程無(wú)有機(jī)溶液污染；(3).所得病毒顆粒的濃度及純度均較高。
2.本發(fā)明試劑盒采用進(jìn)口的高效優(yōu)質(zhì)逆轉(zhuǎn)錄酶及熱啟動(dòng)Taq DNA聚合酶，利用設(shè)計(jì)合理的引物及探針，可保證檢測(cè)結(jié)果的敏感性、特異性及可重復(fù)性。
3.利用基因工程技術(shù)，獲得特異標(biāo)準(zhǔn)品，設(shè)定為2×101、2×102、2×103、2×104、2×105copies/μl，標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)性大于0.99，可準(zhǔn)確定量待測(cè)基因的拷貝數(shù)。
4.本發(fā)明試劑盒采用熒光定量PCR作為檢測(cè)方法，同時(shí)應(yīng)用UNG酶防污染體系，一舉克服了常規(guī)PCR技術(shù)的諸多難題，如產(chǎn)物電泳費(fèi)時(shí)、溴化乙啶毒性、易出現(xiàn)假陽(yáng)性、特異性低等難題。
5.本發(fā)明試劑盒具有很高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，其意義在于(1).監(jiān)測(cè)食品是否被諾瓦克病毒污染的有力工具；(2).輔助患者的早期診斷，為治療爭(zhēng)取時(shí)間；(3).患者臨床治療效果的評(píng)價(jià)；(4).海產(chǎn)品諾瓦克病毒污染特點(diǎn)、流行變異趨勢(shì)及其規(guī)律研究方便快捷的檢測(cè)工具。
下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步敘述，以使公眾對(duì)發(fā)明內(nèi)容有更深入的了解，并非對(duì)本發(fā)明的限制，凡依照本發(fā)明公開內(nèi)容所做出的任何本領(lǐng)域的等同替換均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。


圖1為GG I型標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)結(jié)果圖。
圖2為GG I型標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
圖3為GG II型標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)結(jié)果圖。
圖4為GG II型標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1.諾瓦克病毒表達(dá)量檢測(cè)試劑盒制備及應(yīng)用一、試劑盒的制備
(一)、材料及設(shè)備PEG6000(進(jìn)口分裝，化學(xué)純)購(gòu)自廣東汕頭市西隴化工廠；NaCl(分析純)購(gòu)自中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司；Na2HPO4·12H2O(分析純)購(gòu)自中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司；甘氨酸(進(jìn)口分裝，TBD產(chǎn)品號(hào)G7403)購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所；KH2PO4(分析純)購(gòu)自中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司；KCI(分析純)購(gòu)自中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司；Trizol試劑購(gòu)自Invitrogen公司；氯仿(分析純)購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；異丙醇(分析純)購(gòu)自中國(guó)上海五聯(lián)化工廠；無(wú)水乙醇(分析純)購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；DEPC購(gòu)自BIO BASICINC公司；瓊脂糖購(gòu)自BIO BASIC INC公司；溴化乙錠購(gòu)自華美生物技術(shù)有限公司；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、DTT(二硫蘇糖醇，0.1M)購(gòu)自Invitrogen公司；隨機(jī)引物、dNTP混合物、GG I型引物及探針、GG II型引物及探針均由上海生工生物技術(shù)公司合成；UNG酶購(gòu)自Invitrogen公司；熒光定量PCR試劑購(gòu)自ABgene公司；感受態(tài)細(xì)菌(DH5α)、標(biāo)準(zhǔn)品(GG I型、GG II)自制；Taq酶、Oligo(dT)、T-載體、普通PCR擴(kuò)增試劑盒購(gòu)自Takara公司；DNA純化試劑盒、質(zhì)粒提取試劑購(gòu)自杭州維特潔生化技術(shù)有限公司；1-15K型微量高速低溫離心機(jī)、2-5型低速常溫離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Sigma公司；超速低溫離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Hettich公司，3111型恒溫水套式CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Forma公司；超低溫冰箱購(gòu)自日本SANYO公司；超凈工作臺(tái)購(gòu)自上海智誠(chéng)生物設(shè)備公司；Biometra PCR儀購(gòu)自Biometra公司；ABI7000型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀、測(cè)序試劑、377測(cè)序儀、購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystems公司。
(二)、引物及探針設(shè)計(jì)與合成以諾瓦克病毒(GG I及GG II型)全長(zhǎng)cDNA序列為模板，使用ABI7000型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)Applied Biosystems公司)隨機(jī)軟件分析TaqMan引物和探針位點(diǎn)，同時(shí)考慮病毒基因組RNA序列情況，從中選擇最佳組合。
GG I標(biāo)準(zhǔn)品引物序列與檢測(cè)用PCR引物序列相同，上下游引物序列分別為P15’-CCATGTTCCGYTGGATGCGNTTYC-3’；P25’-TGGGGCGTCCTTAGACGCCATCAT-3’熒光探針序列為5’-FAM-GACAGGAGATYGCGATCTCCTGYCC-TAMRA-3’，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。
GG II標(biāo)準(zhǔn)品引物序列與檢測(cè)用PCR引物序列相同，上下游引物序列分別為P15’-TGCCCAGACAAGAGTCAATGTTTA-3’；
P25’-AGCAGCGTCATTCGACGCCATCT-3’熒光探針序列為5’-FAM-CTAAGCACATGGGAGGGCGATCGCAA-TAMRA-3’，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。
(三)、制備無(wú)RNA酶的水向去離子水加入DEPC(焦碳酸二乙酯)，至終濃度為0.05％(V/V)，37℃放置2小時(shí)后，121℃，高壓20min，備用。
(四)、標(biāo)準(zhǔn)品制備1.病毒RNA的提取利用本發(fā)明試劑盒方法濃縮已確診由諾瓦克病毒引起腹瀉的病人糞便樣品(來(lái)源于中國(guó)疾病預(yù)防控制中心)并提取病毒RNA。
2.逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(1)將RT試劑盒中各組分混勻，短暫離心。
(2)在0.5ml PCR管中準(zhǔn)備RNA/引物混合物，表格如下表3

(3)65℃孵育5min，冰盒放置至少1min。
(4)將裝有DTT、M-MLV及逆轉(zhuǎn)錄緩沖液的離心管從-20℃中取出，置于冰盒上待其緩慢融化后，短暫離心，將DTT及逆轉(zhuǎn)錄緩沖液全部加入M-MLV管中配制成混合液，混勻，短暫離心，置于冰盒上備用，(5)向RNA/引物混合物每管加入7μl上述混合液，混勻，短暫離心收集。
(6)25℃，孵育5min；之后37℃，孵育50min。
(7)70℃，15min終止反應(yīng)，冰上冷卻或-20℃保存。
3.PCR擴(kuò)增(GG I及GG II型同時(shí)擴(kuò)增)按下列組成配制PCR反應(yīng)液表4


PCR反應(yīng)條件94℃3分鐘；(94℃30秒，56℃30秒，72℃50秒，35個(gè)循環(huán))；72℃7分鐘。
4.擴(kuò)增產(chǎn)物的獲得(1)制備1.2％瓊脂糖凝膠，將所得PCR產(chǎn)物電泳，在紫外燈下切取含目的DNA的瓊脂，用紙巾擦干后，切碎，稱重，按照100mg＝100μl的比例確定膠的體積。
(2)按照DNA gel extraction kit說(shuō)明書中的比例加入DE-A液，60℃加熱至完全熔化。
(3)加入0.5倍體積于DE-A液的DE-B液，混勻；加入異丙醇，使其終濃度為20％。
(4)將上述液體轉(zhuǎn)入制備管中，5500rpm離心1min，棄濾液。
(5)加入0.5ml buffer W1后，5500rpm離心1min，棄濾液。
(6)加入0.7ml buffer W2，5500rpm離心1min，棄濾液。
(7)再加入0.7ml buffer W2，5500rpm離心1min，棄濾液；12000rpm，離心1min，以甩干濾膜基質(zhì)。
(8)將制備管置于新的1.5ml離心管中，在silica膜中央加入25μl水，室溫靜置1min后，12000rpm，離心1min洗脫DNA。
5.擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆及鑒定(1)重組克隆載體的構(gòu)建10μl體系中，加入1μl T載體，4μl DNA樣品，加入5μl連接buffer，16℃過夜(10-14小時(shí))。
取5μl連接產(chǎn)物，加入到100μl感受態(tài)細(xì)胞中，混勻后冰浴40min，置于42℃水中熱休克90s，冰浴2min。
加入無(wú)抗生素的LB培養(yǎng)基400μl，于37℃搖床上以150rpm的速度混合振搖45min后，將離心管中液體均勻地涂布于LA平板上，37℃平放20min后，倒置培養(yǎng)10-14小時(shí)。
(2)重組載體的鑒定(質(zhì)粒的提取方法/PCR鑒定)
A.觀察LA平板上的菌落，隨機(jī)挑取長(zhǎng)得較好的菌落，分別轉(zhuǎn)至裝有5ml LA培養(yǎng)基的大試管中，編號(hào)后置37℃搖床中，250rpm，振搖8-14小時(shí)左右，至OD600≈0.4。
B.取1.5ml培養(yǎng)物至離心管中，4℃，11000rpm離心30s，棄盡上清液。
C.100μl預(yù)冷的堿裂解液I重懸沉淀，劇烈振蕩混勻后加入200μl新配置的堿裂解液II，混勻后，冰浴3min，再加入150μl預(yù)冷的堿裂解液III，顛倒混勻后冰浴3-5min；4℃，11000rpm離心5min后將上清轉(zhuǎn)移至另一離心管中。
D.加入等體積的酚/氯仿(1∶1)，振蕩后4℃，11000rpm離心2min，再將上清轉(zhuǎn)移至另一離心管。
E.加入1/10體積的3M NaAc溶液和2.5倍無(wú)水乙醇，混勻后，室溫靜置10min，4℃，11000rpm離心10min后棄上清。
F.加入1ml 70％乙醇，振蕩漂洗后4℃，11000rpm離心2min；棄去上層液體。
G.加入少量無(wú)水乙醇，4℃，11000rpm離心2min，棄去乙醇后，室溫倒置10min，加入30μl蒸餾水溶解質(zhì)粒DNA。
H.取適量的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過電泳圖像確定所取菌落是否是所要的目的菌落。
6.質(zhì)粒測(cè)序經(jīng)美國(guó)Applied Biosystems公司的377測(cè)序儀測(cè)序，制備的標(biāo)準(zhǔn)品其序列與預(yù)期完全相符，標(biāo)準(zhǔn)品序列如下(為插入T載體中的片段)GG I型1 CCATGTTCCG CTGGATGCGT TTCCATGATC TGAGTTTGTG GACAGGAGAT CGCGATCTCC61 TGCCCGATTA TGTAAATGAT GATGGCGTCT AAGGACGCCC CAGG II型1 TGCCCAGACA AGAGTCAATG TTTAGGTGGA TGAGGTTCTC AGATCTAAGC ACATGGGAGG61 GCGATCGCAA TCTGGCTCCC AGTITTGTGA ATGAAGATGG CGTCGAATGA CGCTGCT(五)、陽(yáng)性對(duì)照品和陰性對(duì)照品的制備陽(yáng)性對(duì)照品為分別含有GG I及GG II型諾瓦克病毒RNA的RNA樣品，陰性對(duì)照品為不含有GG I及GG II型諾瓦克病毒RNA的RNA樣品，RNA提取方法與上述方法相同。
(六)、按發(fā)明內(nèi)容中的濃度要求配制樣品前處理液A、樣品前處理液B、樣品前處理液C、樣品前處理液D、逆轉(zhuǎn)錄引物、反轉(zhuǎn)錄緩沖液、dNTP混合物、0.1M DTT、逆轉(zhuǎn)錄酶保存液、GG I型PCR反應(yīng)液、GG II型PCR反應(yīng)液、GG I型探針、GG II型探針、GG I型UNG酶保存液、GG II型UNG酶保存液、GG I型標(biāo)準(zhǔn)品、GG II型標(biāo)準(zhǔn)品、GG I型質(zhì)控品、GG II型質(zhì)控品。
(七)、按本發(fā)明試劑盒的規(guī)格對(duì)上述各組分進(jìn)行分裝。
實(shí)施例2.試劑盒的應(yīng)用一、標(biāo)本檢測(cè)牡蠣樣品60份，腹瀉病人糞便20人，正常人糞便10份；應(yīng)用本發(fā)明的試劑盒進(jìn)行樣品前處理及病毒RNA提取，取8μl RNA，在20μl總反應(yīng)體系內(nèi)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄后，用檢測(cè)用上下游引物及探針在ABI公司7000型定量PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增(GG I及GG II型同時(shí)檢測(cè))，同時(shí)應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果經(jīng)相應(yīng)軟件處理，計(jì)算出檢測(cè)標(biāo)本病毒RNA的表達(dá)量。
二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.GG I型標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)結(jié)果見圖1，標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。
2.GG II型標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)結(jié)果見圖3，標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖4。
3.牡蠣樣品檢測(cè)結(jié)果30個(gè)牡蠣樣品中有10為陽(yáng)性，其余20個(gè)樣品為陰性，具體結(jié)果見下表表5

4.人糞便樣品檢測(cè)結(jié)果20例腹瀉病人中有13例為陽(yáng)性，其余7例為陰性；10例正常人糞便均為陰性，結(jié)果見下表表6

序列表<110>中國(guó)疾病預(yù)防控制中心營(yíng)養(yǎng)與食品安全所<120>諾瓦克病毒表達(dá)量檢測(cè)試劑盒及其專用引物與探針<130>
<160>8<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>24<212>DNA<213>人工合成<220>
<221>misc_feature<222>(12)..(12)<223>n is a，c，g，or t，y is t/u or c<400>1ccatgttccg ytggatgcgn ttyc 24<210>2<211>24<212>DNA<213>人工合成
<400>2tggggcgtcc ttagacgcca tcat 24<210>3<211>25<212>DNA<213>人工合成<400>3gacaggagat ygcgatctcc tgycc 25<210>4<211>102<212>DNA<213>人工合成<400>4ccatgttccg ctggatgcgt ttccatgatc tgagtttgtg gacaggagat cgcgatctcc60tgcccgatta tgtaaatgat gatggcgtct aaggacgccc ca 102<210>5<211>24<212>DNA<213>人工合成<400>5
tgcccagaca agagtcaatg ttta 24<210>6<211>23<212>DNA<213>人工合成<400>6agcagcgtca ttcgacgcca tct23<210>7<211>26<212>DNA<213>人工合成<400>7ctaagcacat gggagggcga tcgcaa 26<210>8<211>117<212>DNA<213>人工合成<400>8tgcccagaca agagtcaatg tttaggtgga tgaggttctc agatctaagc acatgggagg60gcgatcgcaa tctggctccc agttttgtga atgaagatgg cgtcgaatga cgctgct 11權(quán)利要求
1.檢測(cè)諾瓦克病毒的引物與探針，具有如下核苷酸序列(1)CCATGTTCCGYTGGATGCGNTTYC；(2)TGGGGCGTCCTTAGACGCCATCAT；(3)TGCCCAGACAAGAGTCAATGTTTA；(4)AGCAGCGTCATTCGACGCCATCT；(5)GACAGGAGATYGCGATCTCCTGYCC；(6)CTAAGCACATGGGAGGGC GATCGCAA；其中N為A，C，G，或T；Y為T/U或C。
2.諾瓦克病毒熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于該試劑盒包含樣品前處理液A、樣品前處理液B、樣品前處理液C、樣品前處理液D、RNA提取試劑、無(wú)RNA酶的水、逆轉(zhuǎn)錄引物、反轉(zhuǎn)錄緩沖液、DNTP混合物、0.1M DTT、逆轉(zhuǎn)錄酶保存液、GG I型PCR反應(yīng)液、GG II型PCR反應(yīng)液、GG I型探針、GG II型探針、GG I型UNG酶保存液、GG II型UNG酶保存液、GG I型標(biāo)準(zhǔn)品、GG II型標(biāo)準(zhǔn)品、GG I型質(zhì)控品、GG II型質(zhì)控品。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的諾瓦克病毒熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述試劑盒包含(1)樣品前處理液A為0.05M的甘氨酸緩沖液，pH9.51000ml中含0.05mol的甘氨酸、0.15mol NaCI，溶劑為水；(2)樣品前處理液B為16％的聚乙二醇6000溶液1000ml中含160克的PEG6000、0.3mol的NaCI，溶劑為水；(3)樣品前處理液C為0.15M的Na2HPO4溶液，pH9.01000ml中含0.15mol的Na2HPO4，溶劑為水；(4)樣品前處理液D為PBS緩沖液1000ml中含1.47mmol的KH2PO4、136.9mmol的NaCl、2.68mmol的KCl、7.96mmol的Na2HPO4·12H2O，溶劑為水；(5)RNA提取試劑為Trizol試劑；(6)無(wú)RNA酶的水；(7)逆轉(zhuǎn)錄引物為隨機(jī)引物六引物，用去離子水溶解成100μmol/L的使用液；(8)反轉(zhuǎn)錄緩沖液1000ml中含250mmol的Tris-HCl，pH8.3、375mmol的KCl、15mmol的MgCl2，溶劑為水；(9)dNTP混合物1000ml中含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各10mmol，溶劑為水，pH7.0-7.5；(10)逆轉(zhuǎn)錄酶保存液1000ml中含20mmol的Tris-HCl，pH7.5、100mmol的NaCl、0.1mmol的EDTA、1.0mmol的DTT、500ml的甘油、0.1ml的Nonidet p-40、2.0×108U的逆轉(zhuǎn)錄酶、水；(11)GG I型PCR反應(yīng)液1000ml中含20mmol的Tris-HCI，pH8.3、3.0mmol的MgCI2、100mmol的KCI、0.4μmol的上下游引物/L、1.0×105U的Taq酶、400nmol的dATP、400nmol的dCTP、400nmol的dGTP、800nmol的dUTP，溶劑為水；上、下游引物序列分別為P15’-CCATGTTCCGYTGGATGCGNTTYC-3’P25’-TGGGGCGTCCTTAGACGCCATCAT-3’(12)GG II型PCR反應(yīng)液1000ml中含20mmol的Tris-HCI，pH8.3、3.0mmol的MgCI2、100mmol的KCI、0.4μmol的上下游引物/L、1.0×105U的Taq酶、400nmol的dATP、400nmol的dCTP、400nmol的dGTP、800nmol的dUTP，溶劑為水；上、下游引物序列分別為P15’-TGCCCAGACAAGAGTCAATGTTTA-3’P25’-AGCAGCGTCATTCGACGCCATCT-3’(13)GG I型探針為熒光標(biāo)記探針，其序列為5’-FAM-GACAGGAGATYGCGATCTCCTGYCC-TAMRA-3’；(14)GG II型探針為熒光標(biāo)記探針，其序列為5’-FAM-CTAAGCACATGGGAGGGCGATCGCAA-TAMRA-3’；(15)GG I型UNG酶1000ml中含50ml的甘油、30mmol的Tris-HCl，pH7.5，25℃、150mmol的NaCl、1.0mmol的EDTA、1.0mmol的DTT、0.5ml的Tween 20、1.0×106U的UNG酶，溶劑為水；(16)GG II型UNG酶1000ml中含50ml的甘油、30mmol的Tris-HCl，pH7.5、150mmol的NaCl、1.0mmol的EDTA、1.0mmol的DTT、0.5ml的Tween 20、1.0×106U的UNG酶，溶劑為水；(17)GG I型標(biāo)準(zhǔn)品的序列為1 CCATGTTCCG CTGGATGCGT TTCCATGATC TGAGTTTGTG GACAGGAGAT CGCGATCTCC61 TGCCCGATTA TGTAAATGAT GATGGCGTCT AAGGACGCCC CA(18)GG II型標(biāo)準(zhǔn)品的序列為1 TGCCCAGACA AGAGTCAATG TTTAGGTGGA TGAGGTTCTC AGATCTAAGC ACATGGGAGG61 GCGATCGCAA TCTGGCTCCC AGTTTTGTGA ATGAAGATGG CGTCGAATGA CGCTGCT。(19)GG I型質(zhì)控品分為陽(yáng)性質(zhì)控品與陰性質(zhì)控品，陽(yáng)性質(zhì)控品為含有GG I型RNA的樣品，陰性質(zhì)控品為不含GG I型RNA的樣品。(20)GG II型質(zhì)控品分為陽(yáng)性質(zhì)控品與陰性質(zhì)控品，陽(yáng)性質(zhì)控品為含有GG II型RNA的樣品，陰性質(zhì)控品為不含GG II型RNA的樣品。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的諾瓦克病毒熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述(6)無(wú)RNA酶的水的制備方法為向去離子水加入焦碳酸二乙酯，至終濃度為0.05％V/V，37℃放置2小時(shí)，121℃，20min高壓，備用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種諾瓦克病毒表達(dá)量檢測(cè)試劑盒及其專用引物與探針，屬于病毒核酸的檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。該試劑盒包含樣品前處理液A、樣品前處理液B、樣品前處理液C、樣品前處理液D、RNA提取試劑、無(wú)RNA酶的水、隨機(jī)引物、反轉(zhuǎn)錄緩沖液、dNTP混合物、0.1M DTT、逆轉(zhuǎn)錄酶儲(chǔ)存液、GG I型PCR反應(yīng)液、GG II型PCR反應(yīng)液、GG I型探針、GG II型探針、GG I型UNG酶、GG II型UNG酶、GG I型標(biāo)準(zhǔn)品、GG II型標(biāo)準(zhǔn)品、GG I型質(zhì)控品、GG II型質(zhì)控品。本發(fā)明所提供的試劑盒可用于牡蠣或人糞便中諾瓦克病毒RNA表達(dá)的檢測(cè)，可以為諾瓦克病毒的研究、預(yù)防和控制諾瓦克病毒經(jīng)新鮮海產(chǎn)品介導(dǎo)引起大規(guī)模的爆發(fā)提供方便快捷的檢測(cè)工具。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1814807SQ200510127520
公開日2006年8月9日 申請(qǐng)日期2005年12月5日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月5日
發(fā)明者李蓉, 程民 申請(qǐng)人:中國(guó)疾病預(yù)防控制中心營(yíng)養(yǎng)與食品安全所