專利名稱：一種培育抗蟲小麥的方法及其專用基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種培育抗蟲小麥的方法及其專用基因。
背景技術(shù)：
小麥作為一種重要的谷類作物，是世界人口糧食的主要來源。在我國(guó)，小麥?zhǔn)堑诙蠹Z食作物，而蚜蟲是小麥生產(chǎn)中的重要害蟲之一。近年來，隨著麥田水肥條件的改善和農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境的變化，麥蚜蟲害日趨加重，已成為嚴(yán)重限制小麥高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)和優(yōu)質(zhì)的重要障礙。
利用種間雜交、反交、選育等一系列傳統(tǒng)的遺傳學(xué)方法選育據(jù)有抗蟲特質(zhì)的新品種費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，而且只能將同種或近源種的等位基因引入待改良的作物之中?，F(xiàn)有的重要經(jīng)濟(jì)作物種質(zhì)庫(kù)中抗蟲資源相應(yīng)較少，而轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以不受種屬的限制，將編碼具殺蟲活性產(chǎn)物的外源基因?qū)氲睫r(nóng)作物中，其表達(dá)產(chǎn)物可以影響害蟲的消化功能，抑制害蟲的生長(zhǎng)發(fā)育甚至是殺死害蟲，從而使植物獲得對(duì)害蟲的耐性，減少或者替代農(nóng)藥的使用。因此，轉(zhuǎn)基因技術(shù)的迅速發(fā)展，為人類進(jìn)行分子水平育種開辟了廣闊道路，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義與應(yīng)用價(jià)值。
雪花蓮凝集素(Galanthus nivalis agglutinin；GNA)是從石蒜科植物雪花蓮中分離的甘露糖特異結(jié)合凝集素，是目前研究較為清楚的植物凝集素。GNA是由相同亞基組成的四聚體結(jié)構(gòu)，共有12個(gè)甘露糖結(jié)合位點(diǎn)，并具有較高的熱、酸穩(wěn)定性(VanDamme.et al.Biosynthesis，primary structure and molecular cloning of snowdroplectin(Galanthus nivalis L.)lectin.Eur J Biochem，1991，20223-30)。免疫化學(xué)反應(yīng)表明，GNA不僅能結(jié)合水稻害蟲稻褐飛虱的腸上皮細(xì)胞，而且能被吸收，并與血淋巴及其周圍組織結(jié)合，因此具有較好的抗蟲特性。體外人工喂食抗蟲試驗(yàn)表明，雪花蓮凝集素對(duì)具有刺吸式口器的同翅目害蟲(如麥蚜、稻飛虱等)都具有較好的抗性，殺蟲效果明顯(Powell，K，S，Gatehouse，A.M.R，Hilder，V.A，et al.A Differentanti-metabolic effect of related lectins towards nymphal stages of Nilaparvatalugens.Entomol.Exp.Appl，75，61-65)。相關(guān)研究表明，GNA對(duì)蚜蟲的天敵兩星瓢蟲沒有直接的危害(Down R E，F(xiàn)ord L，Woodhouse S D，et al.Snowdrop lectin(GNA)has no acute toxic effects on a beneficial insect predator，the 2-spat ladybird(Adalia bipunctata L.).J Insect Physiol，2000，46(4)379-391)，并且對(duì)人畜無害(Pusztai A，Ewen S W，Grant G，et al.Antinutritive effects of wheat-germagglutinin and other N-acetylglucosamine-specific lectins.Br J Nutri，1993，70313-321)。
Rao等(Rao K，Rathore K S，Hodges T K.Expression of snowdrop lectin(GNA)in transgenic rice plants confers resistance to rice brown planthopper.ThePlant Journal，1998，15(4)469-477)獲得了用水稻蔗糖合酶RSS1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GNA基因的轉(zhuǎn)基因水稻，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因水稻對(duì)稻飛虱的存活、發(fā)育、繁殖等方面產(chǎn)生不同程度的影響，具明顯的抑蟲效果。王關(guān)林等(Wang G-L(王關(guān)林)，Liu Y-H(劉彥泓)，GouSh-H(郭紹華)et al.Study on transformation of snowdrop lectin gene tochrysanthemum and aphid resistance of transgenic plants.Acta Genetica Sinica<遺傳學(xué)報(bào)>，2004，31(12)1434-1438(in Chinese with English abstract))首次將雪花蓮凝集素基因整合入菊花基因組中，并利用小鼠眼底靜脈血對(duì)表達(dá)的凝集素進(jìn)行了活性檢測(cè)，得到了一些抗蟲菊花品種。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種培育抗蟲小麥的方法及其專用基因。
本發(fā)明所提供的用于培育抗蟲小麥的基因，名稱為sGNA，具有下述核苷酸序列之一(1)序列表中序列1的核苷酸序列；(2)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可以與序列表中序列1的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。
所述高嚴(yán)謹(jǐn)條件可為在2×SSPE(或2×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在68℃下雜交并洗膜。
其中，序列表中序列1的核苷酸序列，由477個(gè)核苷酸組成，名稱為sGNA，編碼序列表中序列2的蛋白。
本發(fā)明所提供的培育抗蟲小麥的方法，是將上述用于培育抗蟲小麥的基因?qū)胄←?，篩選得到的可表達(dá)雪花蓮凝集素的轉(zhuǎn)基因植株即為抗蟲小麥。
所述用于培育抗蟲小麥的基因，可通過插入現(xiàn)有的植物表達(dá)載體得到的重組表達(dá)載體導(dǎo)入小麥。
所述含有用于培育抗蟲小麥的基因的重組表達(dá)載體可通過基因槍法、使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化小麥細(xì)胞或組織。
所述植物表達(dá)載體可為Ti類質(zhì)粒載體或病毒載體或基因槍轉(zhuǎn)化用常規(guī)載體。
所述用于培育抗蟲小麥的基因可由番茄核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亞基的啟動(dòng)子起始轉(zhuǎn)錄。
所述番茄核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亞基的啟動(dòng)子序列可具有序列表中序列3的核苷酸序列。
所述用于培育抗蟲小麥的基因通過pBAC202導(dǎo)入小麥，所述pBAC202如圖1所示。
所述小麥優(yōu)選為煙農(nóng)15、京冬8和中優(yōu)9507。
所述pBAC202通過基因槍法導(dǎo)入小麥。
本發(fā)明的方法特別適合于培育抗蚜蟲小麥。
本發(fā)明構(gòu)建了含有人工合成并進(jìn)行了密碼子優(yōu)化的sGNA(synthesized GNA)基因的表達(dá)載體pBAC202，以番茄核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亞基(Small subunit ofribulose-1，5-bisphospate carboxylase，rbcS)的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)目的基因在葉肉細(xì)胞特異表達(dá)。并以玉米Ubi1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的bar基因，作為篩選標(biāo)記。以國(guó)內(nèi)廣為推廣的優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)小麥品種，如煙農(nóng)15、京冬8、中優(yōu)9507為受體材料，利用PDS1000/He高壓氦氣基因槍系統(tǒng)轉(zhuǎn)化小麥的幼胚及幼穗，獲得了42株轉(zhuǎn)基因小麥植株及其后代株系。對(duì)轉(zhuǎn)基因后代植株進(jìn)行了DNA點(diǎn)雜交、PCR及PCR-Southern驗(yàn)證，確認(rèn)外源sGNA基因已成功整合到小麥基因組中。進(jìn)一步的凝集素活性檢測(cè)表明，小麥葉片中表達(dá)的凝集素可使紅細(xì)胞凝集，具有正常的生物學(xué)活性。轉(zhuǎn)基因植株在人工飼養(yǎng)條件下進(jìn)行抗蚜蟲實(shí)驗(yàn)，測(cè)得蚜蟲平均抑制率為47％，抑制率最高可達(dá)73％，部分株系表現(xiàn)出較好的抑蟲效果，具有潛在利用價(jià)值。本發(fā)明的方法得到的轉(zhuǎn)基因植物對(duì)具有刺吸式口器的同翅目害蟲，如麥蚜、稻飛虱等都具有較好的抗性。


圖1為表達(dá)載體pBAC202示意2為轉(zhuǎn)基因小麥植株的分化與田間移栽3為小麥轉(zhuǎn)化植株(T2代)的DNA點(diǎn)雜交結(jié)果4為轉(zhuǎn)基因植株(T2代)目的基因(sGNA)的PCR檢測(cè)結(jié)果5為轉(zhuǎn)基因植株(T2代)目的基因(sGNA)的PCR-Southern雜交檢測(cè)結(jié)果6轉(zhuǎn)基因植株的蚜蟲抑制曲線圖具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法如無特別說明，均為常規(guī)方法。
T0表示由小麥的愈傷組織得到的轉(zhuǎn)基因植株，T1表示T0代自交產(chǎn)生的種子及由它所長(zhǎng)成的植株，T2表示T1代自交產(chǎn)生的種子及由它所長(zhǎng)成的植株。
小麥?zhǔn)荏w材料包括京冬8號(hào)、煙農(nóng)15、中優(yōu)9507。
實(shí)施例1、培育抗蚜蟲小麥1、植物表達(dá)載體pBAC202的構(gòu)建對(duì)GNA基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化，人工合成了sGNA(為了和GNA基因相區(qū)別，將進(jìn)行密碼子優(yōu)化合成的基因分別命名為sGNA)。sGNA具有序列表中序列1的核苷酸序列，編碼具有序列表中序列2的氨基酸。該氨基酸序列與GNA基因編碼的GNA的序列相同。
質(zhì)粒的構(gòu)建方法及后續(xù)的篩選鑒定過程參見文獻(xiàn)(Sambrook，J，F(xiàn)ritsch，E.F，Maniatis，T，Molecular Cloning-A Laboratory Manual，2nd ed.，New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989.)。具體方法如下1)用SacI和EcoRI雙酶切質(zhì)粒pSP72(購(gòu)自Promega公司)，插入約260bp的根癌農(nóng)桿菌胭脂堿合成酶基因NOS 3’終止子序列(用SacI和EcoRI雙酶切質(zhì)粒載體pBARGUS得到約260bp的根癌農(nóng)桿菌胭脂堿合成酶基因NOS 3’終止子序列，其中pBARGUS按照文獻(xiàn)Vasil，et al，Bio/technology，10667-674，1992描述的方法構(gòu)建)。構(gòu)建成的質(zhì)粒定名為pBPC18。
2)以番茄的基因組DNA為模版，上游引物P1C TGGCTCGAGAAGCTTGCAAGTAATAAACCATATG；下游引物P25′CGTTGGATCCTCTAGATGCTGAAAACCAAG。進(jìn)行PCR克隆獲得的1.2kb rbcS啟動(dòng)子片段(Genbank Access No.S44160的自5′端第1至1139位堿基的DNA片段)，采用TA克隆方法插入pGEM-T(Promega)，經(jīng)DNA測(cè)序驗(yàn)證正確后，用HindIII和BamHI雙酶切，插入pBPC18的HindIII與BamHI位點(diǎn)。將合成的sGNA基因(477bp)經(jīng)BamHI/SacI酶切，插入pBPC18的的BamHI和SacI位點(diǎn)。構(gòu)建成的質(zhì)粒定名為pBAC201。pBAC201經(jīng)EcoRI酶切，補(bǔ)平，加HindIII linker后，定名為pBAC201H3。
3)質(zhì)粒pAHC25(Weeks，JT，et al，Rapid production of transgenic wheat plantsby dire-ct bombardment of cultured immature embryos.Plant Physiology，1021077-1084，1993)經(jīng)HindIII/EcoRI酶切，獲得2.9kb片段。插入到pSP72的HindIII/EcoRI位點(diǎn)。構(gòu)建成的質(zhì)粒定名為pBPC26。
4)質(zhì)粒pBAC201H3用HindIII酶切，回收1.9kb片段，插入質(zhì)粒pBPC26的HindIII位點(diǎn)。構(gòu)建成的質(zhì)粒定名為pBAC202(見圖1)。pBAC202以番茄核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亞基(Small subunit of ribulose-1，5-bisphospate carboxylase，rbcS)的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)目的基因sGNA在葉肉細(xì)胞特異表達(dá)，并以玉米Ubi1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的bar基因，作為篩選標(biāo)記。
2、植物表達(dá)載體pBAC202轉(zhuǎn)化小麥以京冬8號(hào)、煙農(nóng)15和中優(yōu)9507品種為受體品種，選取幼穗、幼胚作為外植體。利用Bio-Rad的PDS1000/He系統(tǒng)、按照文獻(xiàn)(張曉東，梁榮奇，陳緒清等，優(yōu)質(zhì)HMW谷蛋白亞基轉(zhuǎn)基因小麥的獲得及其遺傳穩(wěn)定性和品質(zhì)性狀分析，科學(xué)通報(bào)，2003，48(5)474-479)描述的方法用基因槍微彈轟擊轉(zhuǎn)化的外植體在含10mg/ml草丁膦(Basta)的培養(yǎng)基上進(jìn)行抗性選擇，并進(jìn)而經(jīng)過分化再生培養(yǎng)獲得幼苗，最后移栽到田間種植(圖2)，獲得42株T0代轉(zhuǎn)基因再生植株，其中京冬8號(hào)(10株)、煙農(nóng)15(20株)和中優(yōu)9507(12株)，然后由42株T0代轉(zhuǎn)基因再生植株得到42株T1代轉(zhuǎn)基因再生植株，其中京冬8號(hào)(10株)、煙農(nóng)15(20株)和中優(yōu)9507(12株)，然后由T1代轉(zhuǎn)基因再生植株得到42株T2代轉(zhuǎn)基因再生植株，其中京冬8號(hào)(10株)、煙農(nóng)15(20株)和中優(yōu)9507(12株)。圖2中A篩選的愈傷組織，B愈傷組織的分化，C移栽成活的轉(zhuǎn)化植。
3、轉(zhuǎn)pBAC202植株的分子分析(1)轉(zhuǎn)pBAC202再生植株的點(diǎn)雜交及PCR檢測(cè)用CTAB法分別提取轉(zhuǎn)pBAC202京冬8號(hào)(5株)、轉(zhuǎn)pBAC202煙農(nóng)15(11株)和轉(zhuǎn)pBAC202中優(yōu)9507(4株)品種T2代小麥幼苗總基因組DNA，根據(jù)sGNA基因的序列設(shè)計(jì)特異引物，上游引物P1為5’-ATGGCTAAGGCAAGCCTCCTCAT，下游引物P2為5-TCATTACTTTGCCGTCACGAGC。以pBAC202為模板，利用P1和P2為引物PCR擴(kuò)增自序列1的5′端第1至477位脫氧核苷酸，按Roche公司的PCR DIG Probe Synthesis Kit的使用手冊(cè)提供的步驟合成探針。以未轉(zhuǎn)化的植株作為陰性對(duì)照，以質(zhì)粒pBAC202作為陽(yáng)性對(duì)照，對(duì)上述提取的轉(zhuǎn)pBAC202植株基因組DNA進(jìn)行點(diǎn)雜交檢測(cè)。按Bio-Rad公司Bio-Dot點(diǎn)雜交儀的使用手冊(cè)進(jìn)行點(diǎn)膜，按Roche公司的DIG DNA Labeling andDetection Kit的使用手冊(cè)進(jìn)行點(diǎn)雜交和檢測(cè)。結(jié)果如圖3所示，結(jié)果表明有10株雜交信號(hào)呈陽(yáng)性(箭頭示)，其中5株京冬8號(hào)品種轉(zhuǎn)基因植株中有3株雜交信號(hào)成陽(yáng)性，11株煙農(nóng)15品種轉(zhuǎn)基因植株中有5株雜交信號(hào)成陽(yáng)性，4株中優(yōu)9507品種轉(zhuǎn)基因植株中有2株雜交信號(hào)成陽(yáng)性。圖3中箭頭所指的是雜交信號(hào)為陽(yáng)性的雜交點(diǎn)。
將點(diǎn)雜交信號(hào)成陽(yáng)性的10株轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PCR檢測(cè)，使用引物P15-ATGGCTAAGGCAAGCCTCCTCAT和P35CTCATAAATAACGTCATGCATTAC-3’，其中P3可與載體pBAC202中的Nos的3’序列特異結(jié)合。反應(yīng)體系為總體積為25μl，10×PCR緩沖液2.5μl，引物(10μM)各1μl，dNTPs 2μl，ddH2O 13μl，Taq酶1U，MgCl22μl，模板DNA 1μg。其循環(huán)擴(kuò)增程序?yàn)橄?4℃預(yù)變性5min；然后94℃變性40s，55℃退火40s，72℃延伸35s，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。PCR檢測(cè)結(jié)果表明5株京冬8號(hào)品種轉(zhuǎn)基因植株中有3株可擴(kuò)增得到612bp的sGNA基因和Nos的3’序列的特異片段，11株煙農(nóng)15品種轉(zhuǎn)基因植株中有5株可擴(kuò)增得到612bp的sGNA基因和Nos的3’序列的特異片段，4株中優(yōu)9507品種轉(zhuǎn)基因植株中有2株可擴(kuò)增得到612bp的sGNA基因和Nos的3’序列的特異片段。10株T2代轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測(cè)結(jié)果如圖4所示，表明所獲得的點(diǎn)雜交信號(hào)成陽(yáng)性的10株轉(zhuǎn)基因植株(泳道3～12)與陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒(泳道1)都能擴(kuò)增出了612bp的sGNA基因和Nos的3’序列的特異片段，陰性對(duì)照(非轉(zhuǎn)基因植物，泳道2)沒有擴(kuò)增帶，表明外源sGNA基因已經(jīng)整合到轉(zhuǎn)pBAC202小麥基因組中。圖4中M為分子量標(biāo)準(zhǔn)(泳道M為分子量標(biāo)準(zhǔn)D2000)，泳道1為質(zhì)粒pBAC202，泳道2為陰性對(duì)照(非轉(zhuǎn)基因植物)，泳道3～12(其植株編號(hào)分別為4、5、6、7、10、15、18、20、21、40)為轉(zhuǎn)基因植株，其中，泳道3-5為京冬8號(hào)品種的轉(zhuǎn)基因植株，泳道6-10為煙農(nóng)15品種的轉(zhuǎn)基因植株，泳道11、12為9507品種的轉(zhuǎn)基因植株。
(2)轉(zhuǎn)pBAC202植株的PCR-Southern雜交鑒定用地高辛(DIG)標(biāo)記612bp的sGNA基因和Nos的3’序列作為探針對(duì)轉(zhuǎn)pBAC202植株進(jìn)行PCR-Southern雜交鑒定，步驟如下以質(zhì)粒pBAC202為模板，利用上述特異引物P1、P3進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后按照Roche公司的PCR DIG Probe Synthesis Kit的使用手冊(cè)提供的步驟對(duì)探針進(jìn)行DIG標(biāo)記，用1％瓊脂糖凝膠電泳，回收612bp的片段，將回收的DNA片段于100℃煮沸5min，迅速置于冰上驟冷，使其完全變性。
以未轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植株為陰性對(duì)照，質(zhì)粒pBAC202為陽(yáng)性對(duì)照，對(duì)步驟(1)篩選后的轉(zhuǎn)pBAC202植株基因組DNA利用引物P1、P3進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為和反應(yīng)條件同步驟1。擴(kuò)增產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠電泳后，將膠置于0.25mol/L HCl中脫嘌呤15min，重蒸水洗兩次，0.5mol/L NaOH變性30min；立即用785型真空吸印儀(Bio-Rad)轉(zhuǎn)印到尼龍膜上，轉(zhuǎn)膜液為10×SSC，真空吸壓為2.032×104Pa，轉(zhuǎn)印90min。轉(zhuǎn)膜后用2×SSC洗膜5min，膜置于254nm紫外燈下照射4min。然后，用標(biāo)記好的探針雜交。按照Roche公司的DIG DNA Labeling and Detection Kit的使用手冊(cè)提供的方法檢測(cè)信號(hào)。PCR-Southern雜交結(jié)果如圖5所示，雜交結(jié)果表明，圖5中泳道1的陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒pBAC202與泳道3～12(其植株編號(hào)分別為4、5、6、7、10、15、18、20、21、40)等轉(zhuǎn)基因植株(泳道3-5京冬8號(hào)品種的轉(zhuǎn)基因植株，泳道6-10為煙農(nóng)15品種的轉(zhuǎn)基因植株，泳道11、12為9507品種的轉(zhuǎn)基因植株)均在612bp處有特異條帶，而泳道2的非轉(zhuǎn)基因植株在此處沒有出現(xiàn)特異雜交信號(hào)。分子雜交進(jìn)一步證明了外源基因已穩(wěn)定整合到了小麥的基因組中。
4、轉(zhuǎn)基因小麥葉片蛋白提取液的凝血活性檢測(cè)雪花蓮凝集素具有紅細(xì)胞的凝集活性，因此利用凝集實(shí)驗(yàn)是GNA表達(dá)量及表達(dá)活性檢測(cè)的有效方式。
取健康公雞翅靜脈血5ml左右，加到含有Alsever氏液(葡萄糖2.05g，檸檬酸鈉0.8g，檸檬酸0.055g，氯化鈉0.42g，加水至100ml)的10ml離心管中，經(jīng)2000r/min離心，3min，離心結(jié)束后，用吸管吸去上清液和紅細(xì)胞上層的白細(xì)胞薄膜(目的是祛除血清、白細(xì)胞及血小板)，棄之，隨后再補(bǔ)以生理鹽水至10ml，混勻后再次離心，反復(fù)3至4次，至上層液體清亮為止。最后吸取1ml紅細(xì)胞泥，加入到49ml的生理鹽水中，制成2％紅細(xì)胞懸液。分別取PCR和Southen雜交結(jié)果成陽(yáng)性的轉(zhuǎn)pBAC202植株與非轉(zhuǎn)化的植株(對(duì)照)葉片各1g，各加入2ml PBS溶液(pH7.2)于勻漿器中制成勻漿，5000r/min離心30min收集上清液。取樣品提取液1ml分別置于干燥小試管中，各加入1ml紅細(xì)胞懸液，混勻后靜置0.5小時(shí)，凝血反應(yīng)充分后，取上部溶液1ml，于島津UV-120-02紫外可見分光光度計(jì)中測(cè)定620nm下的吸光度值，上述方法參考文獻(xiàn)(王關(guān)林，劉彥泓，郭紹華等。雪花蓮凝集素基因轉(zhuǎn)化菊花及轉(zhuǎn)基因植株的抗蚜性研究，遺傳學(xué)報(bào)，2004，31(12)1434-1438；于敏，袁萍萍，章瑩瑩，植物凝集素的部分生物學(xué)活性分析，安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2002，30(1)155-156)。每個(gè)樣品的測(cè)定實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，并計(jì)算平均值作為最終測(cè)定結(jié)果。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)pBAC202植株的葉片可使雞血紅細(xì)胞凝集。表1列出了對(duì)照植株和轉(zhuǎn)pBAC202植株(T2)的A620的吸光值。表達(dá)的凝集素可使紅細(xì)胞發(fā)生凝集反應(yīng)，并發(fā)生凝集沉降作用，葉片蛋白提取液上部溶液的吸光值將隨之下降。表1表明，經(jīng)分子水平檢測(cè)成陽(yáng)性的轉(zhuǎn)pBAC202植株，A620的吸光值均不同程度的小于對(duì)照(非轉(zhuǎn)基因植株)，表明sGNA基因在各轉(zhuǎn)化植株均有不同程度的表達(dá)，其中編號(hào)20的植株具有較高的凝血活性。上述檢測(cè)結(jié)果初步表明，雪花蓮凝集素在小麥葉片內(nèi)已得到表達(dá)，具有一定的生物學(xué)活性，在轉(zhuǎn)基因小麥內(nèi)已完成正常的表達(dá)。
表1 部分轉(zhuǎn)化植株葉片蛋白提取液的凝血活性檢測(cè)結(jié)果

注6、7、10、15、18、、20、21為轉(zhuǎn)pBAC202植株。
5、轉(zhuǎn)基因小麥葉片抑制蚜蟲實(shí)驗(yàn)配置1/2MS培養(yǎng)基，倒入培養(yǎng)皿鋪制平板。將待檢測(cè)的轉(zhuǎn)基因小麥(其植株編號(hào)分別為4、5、6、7、10、15、18、20、21、40)及未轉(zhuǎn)基因小麥(對(duì)照)的新鮮葉片，剪成0.5cm寬，4cm長(zhǎng)，置于培養(yǎng)基上，每皿放置三片，保持葉片新鮮并避免污染。每皿接種5頭等齡禾谷縊管蚜(Phopalosiphum padi)，蚜蟲可在培養(yǎng)基表面自由活動(dòng)，連續(xù)觀察1周，每天統(tǒng)計(jì)一次成蟲及幼蟲數(shù)目，并計(jì)算抑蚜率(王志斌，郭三堆，表達(dá)Cry IA/gna雙價(jià)抗蟲基因煙草兼抗棉鈴蟲和蚜蟲.科學(xué)通報(bào)，1999，44(19)2068-2075)。蚜蟲培養(yǎng)條件參見文獻(xiàn)(李彩霞，高麗鋒，高玲玲等，全純?nèi)斯I(yíng)養(yǎng)液飼養(yǎng)蚜蟲的研究.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1997，17(3)225-228)。抗蚜效果的評(píng)價(jià)按如下公式計(jì)算，蚜口密度抑制率％＝(對(duì)照植株蟲數(shù)—轉(zhuǎn)化植株蟲數(shù))/對(duì)照植株蟲數(shù)×100％；平均蚜口密度抑制率％＝各個(gè)克隆的蚜口密度抑制率之和/克隆個(gè)數(shù)×100％(吳昌銀，葉志彪，李漢霞等。雪花蓮?fù)庠茨鼗蜣D(zhuǎn)化番茄。植物學(xué)報(bào)，2000，42(7)719-723)。
經(jīng)過一周的抗蚜實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)，轉(zhuǎn)pBAC202植株都具有不同程度的抑制蚜蟲效果，抑制蚜口密度從19％～73％不等，對(duì)麥蚜的平均抑制率為47％。其中3株轉(zhuǎn)pBAC202京冬8號(hào)植株的抑制率分別為24％、41％、37％，3株轉(zhuǎn)pBAC202煙農(nóng)15植株的抑制率分別為46％、21％、42％，2株轉(zhuǎn)pBAC202中優(yōu)9507植株的抑制率分別為34％、73％。步驟4中所述編號(hào)為20的轉(zhuǎn)pBAC202中優(yōu)9507植株抗蟲效果較好，如圖6所示，蚜蟲抑制率為73％，其凝集素的活性也較高，說明凝集素的表達(dá)與蚜蟲抗性存在一定的正相關(guān)關(guān)系。圖6中，中優(yōu)9507(CK)為未轉(zhuǎn)基因的中優(yōu)9507對(duì)照；蚜蟲數(shù)目為每片葉片的平均蚜蟲數(shù)。
序列表<160>3<210>1<211>477<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>1atggctaagg caagcctcct cattttggcc gccatcttcc ttggtgtcat cactccatct 60tgcctgagcg acaacattct gtactccggt gagactctct ctactgggga gtttctcaac120tacggaagtt tcgtttttat catgcaagag gactgcaacc tggtcttgta cgacgtggac180aagccaatct gggcaactaa cactggcggc ctctcccgta gctgcttcct cagcatgcag240actgatggga acctcgtggt gtacaaccca agcaacaaac cgatttgggc aagcaacact300ggaggccaga atgggaatta cgtgtgcatc cttcagaagg atcggaacgt tgtgatctac360ggaactgatc gttgggccac tggaacccac accggccttg ttggtatccc agcatcccca420ccctcagaga agtaccctac tgctggaaag attaagctcg tgacggcaaa gtaatga 477<210>2<211>157<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>2Met Ala Lys Ala Ser Leu Leu Ile Leu Ala Ala Ile Phe Leu Gly Val1 5 10 15
Ile Thr Pro Ser Cys Leu Ser Asp Asn Ile Leu Tyr Ser Gly Glu Thr20 25 30Leu Ser Thr Gly Glu Phe Leu Asn Tyr Gly Ser Phe Val Phe Ile Met35 40 45Gln Glu Asp Cys Asn Leu Val Leu Tyr Asp Val Asp Lys Pro Ile Trp50 55 60Ala Thr Asn Thr Gly Gly Leu Ser Arg Ser Cys Phe Leu Ser Met Gln65 70 75 80Thr Asp Gly Asn Leu Val Val Tyr Asn Pro Ser Asn Lys Pro Ile Trp85 90 95Ala Ser Asn Thr Gly Gly Gln Asn Gly Asn Tyr Val Cys Ile Leu Gln100 105 110Lys Asp Arg Asn Val Val Ile Tyr Gly Thr Asp Arg Trp Ala Thr Gly115 120 125Thr His Thr Gly Leu Val Gly Ile Pro Ala Ser Pro Pro Ser Glu Lys130 135 140Tyr Pro Thr Ala Gly Lys Ile Lys Leu Val Thr Ala Lys145 150 155<210>3<211>1143<212>DNA<213>番茄(Lycopersicum esculentum Mill)<400>3gcatgtaata aaccatatga ttgagtgaat ggactttttg tgccagacag attttagcta 60tatagcttgt agaaaatttt aatattttta tttagtattt ttcaacgtac taaaagaaaa120aaaaaagtat atagtcgttt gttactagta tgcgttaatt atgatttcta tttaccacaa180aaattgtaat tgtttgattt cgtgtgattg cttggtaaat aagttgatta attcgaacgt240tctgttatta tcgttgattc tttggtttta ttacaccaat gtggattgct acgtgacata300gcggtaaaac tttttcgtac atttgtaatt cgtgatctaa ttagacaaca tcaatcttgc360ttcttggggt cgctaagaga aaaattcgag aaaaaaaatc cattatacag gaaactacgg420
aaaattactt gttctaattt atttggtcta aaatataaga aataataaac tacccgattt 480tttaattgtt ttttattgga aataaaagaa aaccttttca tatatataga aactaggaga 540tgttatggtc cacacataca aaggataaga acatttccaa gttgcgacca aggaacaata 600tttgattttg aacttgaaat tacaaaaaaa ataaaatgat ttgcatggaa acaaaagaaa 660atctgaatgt gtctgcccaa aggaatggtc tccaaatgca agcaaaacgg ctacaaagta 720gcagccaata taaattcaga atgacaacaa aacaaataaa acactgaccc aaaatgaaat 780taaccaacca ttttcactca ttccttaccc cttttaggat gagataagac tattctcatt 840ctgacacgtg gcaccctttc ttgtggctta attaatatat ctaattatta ttatagctca 900cccaccctcc acgcccaaat taatgtcatt aagatggagt tatatttcta cttaatagat 960tcgataaaat tctacttttg aaatgtgaac aagggcatga tccaatggtt acaaatgggt 1020tggttaattt gtgtccgtta gatgggaaag ttaagtgaat ccttatcatt atatatagag 1080ggagagacta gaaagcaata accctcttga gttcaagata agcacttggt tttcagcatc 1140taa 114權(quán)利要求
1.用于培育抗蟲小麥的基因，具有下述核苷酸序列之一(1)序列表中序列1的核苷酸序列；(2)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可以與序列表中序列1的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因，其特征在于所述用于培育抗蟲小麥的基因具有序列表中序列1的核苷酸序列。
3.一種培育抗蟲小麥的方法，是將權(quán)利要求1或2所述的用于培育抗蟲小麥的基因?qū)胄←湥Y選得到的可表達(dá)雪花蓮凝集素的轉(zhuǎn)基因植株即為抗蟲小麥。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述用于培育抗蟲小麥的基因由番茄核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亞基的啟動(dòng)子起始轉(zhuǎn)錄。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述用于培育抗蟲小麥的基因通過pBAC202導(dǎo)入小麥，所述pBAC202如圖1所示。
6.根據(jù)權(quán)利要求3-5中任一所述的方法，其特征在于所述小麥為煙農(nóng)15、京冬8和中優(yōu)9507。
7.根據(jù)權(quán)利要求3-5中任一所述的方法，其特征在于所述抗蟲小麥為抗蚜蟲小麥。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種培育抗蟲小麥的方法及其專用基因。本發(fā)明用于培育抗蟲小麥的基因，具有下述核苷酸序列之一(1)序列表中序列1的核苷酸序列；(2)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可以與序列表中序列1的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。該基因?qū)胄←溨酗@著提高了小麥的抗蟲性。
文檔編號(hào)C12N15/82GK1800396SQ20051013006
公開日2006年7月12日 申請(qǐng)日期2005年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月8日
發(fā)明者張曉東, 陳緒清, 梁榮奇, 楊鳳萍, 張立全, 高澤發(fā) 申請(qǐng)人:北京市農(nóng)林科學(xué)院