專利名稱：李屬壞死環(huán)斑病毒外殼蛋白基因及其專用檢測引物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及李屬壞死環(huán)斑病毒外殼蛋白基因及其專用檢測引物。
背景技術(shù)：
李屬壞死環(huán)斑病毒(PNRSV)寄主范圍廣，傳播方式多樣，它可以侵染櫻桃、桃、杏、李等核果類果樹，引起嚴(yán)重的危害。檢測該病害的傳統(tǒng)方法是通過用植物汁液摩擦接種草本指示植物或是將待檢測植物的接穗嫁接到木本指示植物上，然后再依據(jù)指示植物上的癥狀反應(yīng)來對病害做出鑒定。但上述傳統(tǒng)的生物學(xué)檢測方法存在著一些明顯不足，如需要占用較大的空間、花費(fèi)時間長、并且指示植物的癥狀表現(xiàn)易受環(huán)境因素的影響等。
RT-PCR方法同樣具有簡便、快速、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，并且可以通過對擴(kuò)增得到的序列進(jìn)行分析，了解病毒株系的分子特征。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供李屬壞死環(huán)斑病毒外殼蛋白(cp)基因。
本發(fā)明所提供的李屬壞死環(huán)斑病毒外殼蛋白基因，名稱為PNRSV-cp，來源于李屬壞死環(huán)斑病毒(prunus necrotic ringspot virus)，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)序列表中SEQ ID №2的DNA序列；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID №1或SEQ ID №2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
所述高嚴(yán)謹(jǐn)條件為在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％ SDS的溶液中，65℃條件下雜交并洗膜。
序列表中的SEQ ID №1由643個堿基組成，其編碼序列為自5’端第3位至641位，編碼具有序列表中SEQ ID №3的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，編碼李屬壞死環(huán)斑病毒外殼蛋白的部分氨基酸殘基序列。序列表中的SEQ ID №2由675組成，其編碼序列為自5’端第第1位至672位，編碼具有序列表中SEQ ID №4的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。
李屬壞死環(huán)斑病毒外殼蛋白基因PNRSV-cp的編碼蛋白(PNRSV-cp)，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)
1)序列表中的SEQ ID №3；2)序列表中的SEQ ID №4；3)將序列表中SEQ ID №3或SEQ ID №4的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至十個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且構(gòu)成李屬壞死環(huán)斑病毒外殼的蛋白質(zhì)。
序列表中的SEQ ID №3由213個氨基酸殘基組成，SEQ ID №4由224個氨基酸殘基組成。
含有本發(fā)明基因PNRSV-cp的表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和宿主菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
擴(kuò)增PNRSV-cp中任一片段的引物對也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
本發(fā)明的另一個目的是提供一對上述李屬壞死環(huán)斑病毒外殼蛋白基因的專用檢測引物。
本發(fā)明所提供的上述李屬壞死環(huán)斑病毒外殼蛋白基因的專用檢測引物，是由序列表中SEQ ID №5和SEQ ID №6或是由序列表中SEQ ID №7和SEQ ID №8組成的引物對組成的引物對。
序列表中的SEQ ID №5由20個堿基組成，序列表中的SEQ ID №6由20個堿基組成；序列表中的SEQ ID №7由29個堿基組成，序列表中的SEQ ID №8由27個堿基組成。
本發(fā)明提供了李屬壞死環(huán)斑病毒外殼蛋白基因及其專用檢測引物。該引物可用于李屬壞死環(huán)斑病毒的RT-PCR檢測，該檢測方法具有簡便、快速、準(zhǔn)確以及能同時檢測大量樣品的優(yōu)點(diǎn)。此外，用表達(dá)本發(fā)明基因獲得的蛋白免疫動物而獲得的抗血清也可用于李屬壞死環(huán)斑病毒的檢測。本發(fā)明建立了李屬壞死環(huán)斑病毒的RT-PCR等分子生物學(xué)檢測的技術(shù)體系，為該病害的檢驗(yàn)檢疫提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支持，具有較高的實(shí)際應(yīng)用價值。
下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。


圖1為RT-PCR擴(kuò)增的河北昌黎桃樹病葉中PNRSV cp基因片段的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果圖2為攜帶有河北昌黎桃樹病葉中PNRSV cp基因片段的陽性克隆質(zhì)粒的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果圖3為攜帶有河北昌黎桃樹病葉中PNRSV cp基因片段的陽性克隆質(zhì)粒的酶切和PCR鑒定結(jié)果圖4為RT-PCR擴(kuò)增的北京櫻桃病葉中PNRSV cp基因片段的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果圖5為攜帶有北京櫻桃病葉中PNRSV cp基因片段的陽性克隆質(zhì)粒的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果圖6為攜帶有北京櫻桃病葉中PNRSV cp基因片段的陽性克隆質(zhì)粒的酶切和PCR鑒定結(jié)果圖7為攜帶有重組質(zhì)粒pET-PNRSVCP的重組子經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后的總蛋白的SDS-PAGE和Western blot檢測結(jié)果具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法，所用引物合成及測序工作均由上海博亞生物公司完成。
實(shí)施例1、河北昌黎桃樹PNRSV感病樣品的RT-PCR檢測稱取采自河北昌黎的桃樹病葉0.1g，使用Sangon公司的TRIZOL試劑盒并按試劑盒的說明書進(jìn)行操作，提取上述植物材料的總RNA。將提取物溶解于30μl經(jīng)DEPC處理的ddH2O中，-70℃保存?zhèn)溆?。然后用RT-PCR的方法對上述病樣進(jìn)行檢測，具體方法如下1)根據(jù)GenBank中的PNRSV的外殼蛋白(cp)基因的核苷酸序列(GenBank號AF013285、AF013286、AF013287、AF034989、AF034990、AF034991)設(shè)計(jì)引物，正向引物自5’端對應(yīng)于PNRSV的cp基因的第13-32位堿基，反向引物與PNRSV的cp基因的自5’端第636-655位堿基反向互補(bǔ)，引物序列如下P1(正向引物)5’-TTTGCAATCATACCCACGCT-3’(序列表中的SEQ ID №5)；P2(反向引物)5’-TCATCGACCAGCAAGACATC-3’(序列表中的SEQ ID №6)。
2)以上述染病植物材料的總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA序列，反轉(zhuǎn)錄體系均為ddH2O(2.5μl)，M-MLV RT 5×緩沖液(Promega公司，2.0μl)，dNTPs(鼎國公司，每種10mM，1.0μl)，反轉(zhuǎn)錄引物P2(0.5μl)，Ribonuclease Inhibitor HPRI(TaKaRa，40u/μl，0.5μl)，總RNA(3.0μl)，M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(Promega公司，0.5μl)。反轉(zhuǎn)錄條件為42℃水浴1h。
3)然后以上述合成的cDNA產(chǎn)物為模板，在引物P1和引物P2的引導(dǎo)下，PCR擴(kuò)增PNRSV的cp基因片段，PCR反應(yīng)體系為ddH2O(22.1μl)，10×PCR緩沖液(TaKaRa公司，3.0μl)，dNTPs(鼎國公司，每種10mM，0.6μl)，引物P1(1.0μl)，引物P2(1.0μl)，模板(即步驟2)的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，2.0μl)，Taq DNA聚合酶(Takara公司，2.5u/μl，0.5μl)。PCR反應(yīng)條件為先94℃ 3min；然后94℃ 30sec，55℃ 30sec，72℃ 1min，共35個循環(huán)；最后72℃ 10min。反應(yīng)結(jié)束后，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測(電泳緩沖液為0.5×TAE)，電泳結(jié)束后將凝膠在10μg/mL溴化乙錠中染色15-20min，用Alpha凝膠成像儀觀察并記錄結(jié)果，結(jié)果如圖1(泳道M為DNA Marker，泳道1為PPV cp基因的RT-PCR產(chǎn)物，泳道2為ToRSV cp基因的RT-PCR產(chǎn)物，泳道3為河北昌黎桃樹病葉PNRSV cp基因的RT-PCR產(chǎn)物)，泳道1的PPV cp基因和泳道2的ToRSV cp基因的擴(kuò)增方法如下擴(kuò)增ToRSV cp基因所用的引物為(根據(jù)GenBank中的ToRSV的cp基因的核苷酸序列(GenBank號AF135407、AF135408、AF135409、AF135410、AF135411、AF135412、AF135413、AF135414)設(shè)計(jì)引物，正向引物自5’端對應(yīng)于ToRSV的cp基因的第362-380位堿基，反向引物與ToRSV的cp基因的自5’端第1327-1346位堿基反向互補(bǔ))，引物序列為ToRSV-F(正向引物)5’-GACGTCTGTGTGGTCATGG-3’ToRSV-R(反向引物)5’-CCAACAAGTGGTTGCACTGT-3’擴(kuò)增ToRSV cp基因所用的模板是以提取自接種了ToRSV的昆諾藜葉片的總RNA，ToRSV-R作為引物，按照實(shí)施例1中的步驟2)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到的。
擴(kuò)增PPV cp基因所用的引物為(根據(jù)GenBank中的PPV的cp基因的核苷酸序列(GenBank號X81078、X81082、X57975、X57976、X81084、X81080、X81076)設(shè)計(jì)引物，正向引物自5’端對應(yīng)于PPV的cp基因的第275-294位堿基，反向引物與PPV的cp基因的自5’端第835-856位堿基反向互補(bǔ))，引物序列為PPV-F5’-ACAGAGACAGGGACGTCGAT-3’PPV-R5’-CTGCCTTCATCTGGATATGAGC-3’擴(kuò)增PPV cp基因所用的模板是以提取自桃樹病葉的總RNA，以PPV-R作為引物，按照實(shí)施例1中的步驟2)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到的。
采用博大泰克公司的DNA回收試劑盒回收并純化長度約640bp的目的DNA片段。
4)將上述回收并純化的目的片段與載體pMD 18-T進(jìn)行連接，連接體系為回收的目的DNA片段5.0μl，連接Solution I(TaKaRa公司)4.5μl，pMD 18-T(TaKaRa公司)0.5μl。16℃水浴反應(yīng)12-24小時。然后將連接產(chǎn)物用熱擊轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆，采用堿裂解法提質(zhì)粒，并進(jìn)行1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測(電泳緩沖液用0.5×TAE，電壓5V/cm)，質(zhì)粒的電泳結(jié)果如圖2(泳道1為載體pMD 18-T，泳道2-6為所提取的可能攜帶有河北昌黎桃樹病葉PNRSV cp基因RT-PCR產(chǎn)物的1-5號克隆的質(zhì)粒)所示，電泳圖中可以看出5號質(zhì)粒大于pMD 18-T載體，表明目的片段可能已連接入載體中。再對5號重組質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶EcoR I和HindIII進(jìn)行酶切鑒定，酶切體系為ddH2O 13.0μl，10×H緩沖液2.0μl，重組質(zhì)粒4.0μl，EcoR I 0.5μl，HindIII0.5μl。酶切條件為37℃水浴12-24小時。對上述酶切產(chǎn)物進(jìn)行1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測。用PCR的方法做進(jìn)一步鑒定，反應(yīng)體系為ddH2O 25.9μl，10×PCR緩沖液(TaKaRa公司)3.0μl，dNTPs(鼎國公司，10mM每種)0.6μl，引物P1 1.0μl，引物P21.0μl，模板(質(zhì)粒)0.2μl，Taq DNA聚合酶(TaKaRa公司，2.5u/μl)，0.5μl。PCR反應(yīng)條件與步驟3)中的相同。酶切和PCR驗(yàn)證結(jié)果如圖3(泳道M為DNA Marker，泳道1為攜帶有河北昌黎桃樹病葉PNRSV cp基因RT-PCR產(chǎn)物的陽性克隆的PCR檢測結(jié)果，泳道2為河北昌黎桃樹病葉PNRSV cp基因的RT-PCR產(chǎn)物，泳道3為攜帶有河北昌黎桃樹病葉PNRSV cp基因RT-PCR產(chǎn)物的陽性克隆的酶切鑒定結(jié)果，泳道4為攜帶有河北昌黎桃樹病葉PNRSV cp基因RT-PCR產(chǎn)物的陽性克隆質(zhì)粒)所示，5號質(zhì)粒經(jīng)酶切得到了大小約341bp和273bp的酶切片段，PCR驗(yàn)證也得到了大小約為640bp的片段，酶切和PCR驗(yàn)證均與預(yù)期結(jié)果相符，表明目的片段已正確連入載體中。對含有5號質(zhì)粒的大腸桿菌的測序結(jié)果表明，經(jīng)PCR擴(kuò)增，從昌黎感病桃樹病葉中擴(kuò)增的PNRSV的cp基因片段是具有序列表中SEQ ID №1的核苷酸序列。對上述序列進(jìn)行同源性分析，分析結(jié)果表明所擴(kuò)增的DNA片段確實(shí)為PNRSV cp基因的片段，與GenBank中的PNRSV AF171株系的cp基因的相似性為99％。序列表中的SEQ ID №1由643個堿基組成，其編碼序列為自5’端第3位至第641位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID №3的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。
實(shí)施例2、北京櫻桃病樣中PNRSV CP基因的克隆櫻桃病葉的總RNA的提取方法同實(shí)施例1。
櫻桃病樣中PNRSV CP基因克隆的具體方法如下1)根據(jù)已發(fā)表的PNRSV的外殼蛋白(cp)基因的核苷酸序列(GenBank號AF013285、AF013286、AF013287、AF034989、AF034990、AF034991)設(shè)計(jì)引物，正向引物自5’端第10-29位堿基對應(yīng)于PNRSV的cp基因的第1-20位堿基，反向引物自5’端第10-27位堿基與PNRSV的cp基因的自5’端第655-672位堿基反向互補(bǔ)，引物序列如下P35’-CCGAAGCTTATGGTTTGCCGAATTTGCAA-3’(序列表中的SEQ ID №7)；P45’-TTGCTCGAGGATCTCAAGCAGGTCCTC-3’(序列表中的SEQ ID №8)。
2)以所提取的櫻桃病葉中的總RNA為模板，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以獲得PNRSV CP基因的cDNA。反轉(zhuǎn)錄的方法同實(shí)施例1中的步驟2)。
3)然后以上述合成的cDNA產(chǎn)物為模板，在引物P3和引物P4的引導(dǎo)下，PCR擴(kuò)增PNRSV的cp基因，PCR反應(yīng)體系與實(shí)施例1中步驟3)中相同，PCR反應(yīng)條件為先94℃ 3min；然后94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 50s，共35個循環(huán)；然后72℃ 10min。北京櫻桃病葉PNRSV CP基因的RT-PCR結(jié)果見圖4(泳道M為Lambda DNA/HindIII+EcoR I DNA Marker，泳道1為北京櫻桃病葉PNRSV CP基因的RT-PCR產(chǎn)物)。采用博大泰克公司的DNA回收試劑盒回收并純化目的片段。
4)將上述回收并純化的目的片段與載體pMD 18-T進(jìn)行連接，連接體系為回收的目的片段5.0μl，連接Solution I(TaKaRa)4.5μl，pMD 18-T(TaKaRa)0.5μl。16℃水浴反應(yīng)12-24小時。然后將兩種連接產(chǎn)物用熱擊轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆，采用堿裂解法提質(zhì)粒，并進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(電泳緩沖液用0.5×TAE，電壓5V/cm)，質(zhì)粒的電泳結(jié)果如圖5(泳道1為載體pMD 18-T，泳道2-8分別為攜帶有北京櫻桃病葉PNRSV RT-PCR產(chǎn)物的2-8號陽性克隆的質(zhì)粒)。電泳圖中可以看出5、7、8號質(zhì)粒大于pMD 18-T載體，表明目的片段可能已連接入載體中。再對重組質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Hind III進(jìn)行酶切鑒定，酶切體系及條件同實(shí)施例1中的步驟4)。采用引物P3和P4用PCR的方法做進(jìn)一步鑒定，PCR反應(yīng)體系反應(yīng)條件與實(shí)施例1中步驟3)中相同。酶切和PCR驗(yàn)證結(jié)果如圖6(泳道M為Lambda DNA/HindIII+EcoR I DNA Marker，泳道1-3分別為攜帶有北京櫻桃病葉PNRSV RT-PCR產(chǎn)物的5、7、8號陽性克隆的PCR鑒定結(jié)果，泳道4-6分別為攜帶有北京櫻桃病葉PNRSV RT-PCR產(chǎn)物的5、7、8號陽性克隆的酶切鑒定結(jié)果，泳道7為北京櫻桃病葉PNRSV RT-PCR產(chǎn)物)所示，7號質(zhì)粒經(jīng)酶切得到了大小約400bp和275bp的酶切片段，PCR驗(yàn)證也得到了大小約為670bp的片段，酶切和PCR驗(yàn)證均與預(yù)期結(jié)果相符，表明目的片段已正確連入載體中。對含有7號質(zhì)粒的大腸桿菌的測序結(jié)果表明，經(jīng)PCR擴(kuò)增，從北京感病櫻桃病葉中擴(kuò)增到了的PNRSV的cp基因的完整序列，該片段具有序列表中SEQ ID№2的核苷酸序列。對上述序列進(jìn)行同源性分析，分析結(jié)果表明所擴(kuò)增的DNA片段確實(shí)為PNRSV cp基因，與GenBank中PNRSV的AF157和AF158株系的cp基因的相似性均為99％。序列表中的SEQ ID №2由675個堿基組成，其編碼序列為自5’端第1位至第672位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID №4的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。
實(shí)施例3、PNRSV-cp蛋白的鑒定用下述方法對實(shí)施例2獲得的PNRSV-cp蛋白基因進(jìn)行鑒定，具體過程包括以下步驟一、PNRSV-cp的原核表達(dá)及檢測1)櫻桃病樣中PNRSV cp基因的RT-PCR擴(kuò)增按照實(shí)施例1中的方法提取櫻桃病葉的總RNA，參照實(shí)施例2中的步驟1)、2和3)RT-PCR擴(kuò)增PNRSV cp基因。
2)PNRSV-cp原核表達(dá)表達(dá)載體的構(gòu)建用DNA回收試劑盒回收并純化步驟1)擴(kuò)增的目的片段，將其用限制性內(nèi)切酶HindIII和Xho I酶切后，與經(jīng)相同酶雙酶切的質(zhì)粒載體pET-22b(+)(Novagen公司)用T4DNA連接酶(TaKaRa公司)進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性重組子，提質(zhì)粒進(jìn)行測序，測序結(jié)果表明擴(kuò)增到了序列正確的PNRSV-cp，將構(gòu)建正確的含有PNRSV-cp的原核表達(dá)載體命名為pET-PNRSVCP。
3)PNRSV-cp的原核表達(dá)及SDS-PAGE檢測將pET-PNRSVCP轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)篩選挑取陽性單菌落于3mL LB液體培養(yǎng)基中(含氨芐青霉素60μg/mL)，37℃振動培養(yǎng)12-24小時后，用新鮮LB液體培養(yǎng)基(含氨芐青霉素60μg/mL)按1∶100比例進(jìn)行稀釋，再振蕩培養(yǎng)至OD600值達(dá)到0.4-1.0，加入IPTG至終濃度為1mmol/L，繼續(xù)于37℃培養(yǎng)6-8h。培養(yǎng)結(jié)束后，離心收集菌體，加入1/10體積的上樣緩沖液，振蕩懸浮，100℃煮沸5min，進(jìn)行12％ SDS-PAGE檢測(濃縮膠電壓為8V/cm，分離膠為15V/cm)，電泳結(jié)束后，用考馬斯亮藍(lán)R-250染色1h，再室溫?fù)u床上脫色3h，結(jié)果如圖7所示(泳道M為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道1為攜帶有重組質(zhì)粒pET-PNRSVCP的重組子經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后的總蛋白，泳道2為攜帶有空載體pET-22b(+)的重組子經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后的總蛋白)，表明陽性重組子經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后獲得了分子量大小為29.0KD的蛋白，與預(yù)期結(jié)果相符。
4)誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的Western blot檢測及純化對步驟3)獲得的誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行Western blot檢測(方法參照Towbin H.E.Electrophore transfer of protein from polyacrylamide gels to nitrocellulosesheetsprocedure and some application.Proc natl acad sci USA，1979，764350-4354)，以PNRSV的抗體(BIOREBA公司)為一抗，以堿性磷酸酯酶標(biāo)記的A蛋白(Sigma公司)為二抗，用NBT/BCIP顯色，并參照Hager等的方法(Hager D.A.，BurgessR.R.Elution of proteins from sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel，removal of sodium dodecyl sulfate and renaturation of enzymatic acitivity.Analytical Biochemistry.1980，10976-86)對凝膠染色，如圖7所示(泳道M為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道3為攜帶有重組質(zhì)粒pET-PNRSVCP的重組子經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后的總蛋白的Western blot分析結(jié)果)，切下29.0KD的目標(biāo)條帶，按1∶1的比例(W/V)加入PBS緩沖液(8g NaCl，0.2g KCl，1.97g Na2HPO4·12H2O，0.24g KH2PO4，定容至1L，pH7.4)于冰浴中研磨，12000g離心10min，取上清，-20℃保存。用紫外分光測定法測定回收蛋白含量，方法為；測定回收產(chǎn)物在260nm和280nm處的吸光值，再根據(jù)公式蛋白質(zhì)濃度(mg/mL)＝1.45OD280-0.74OD260計(jì)算即可。結(jié)果用上述方法表達(dá)的蛋白濃度為0.274mg/mL，表明PNRSV-cp在大腸桿菌中獲得大量表達(dá)。
二、抗血清的制備及其效價測定對實(shí)驗(yàn)兔耳靜脈取血2mL，制備少量正常血清作為陰性對照。向步驟一經(jīng)表達(dá)、純化的PNRSV-cp表達(dá)產(chǎn)物中加入等體積的福氏不完全佐劑進(jìn)行乳化，免疫一只德國大白兔，共分五次進(jìn)行免疫注射第一次肌肉注射結(jié)合皮下注射，第二次肌肉注射結(jié)合皮下注射，第三、四次耳靜脈注射(純化的蛋白不加佐劑)，第五次肌肉注射，每次免疫劑量為0.1mg，每隔5d注射一次。最后一次注射7d后靜脈少量采血測定效價，然后每周耳靜脈大量取血約20mL，共取三次，將制備的抗血清加入0.02％的疊氮化鈉，-20℃保存。將采集抗血清進(jìn)行一系列(稀釋倍數(shù)依次為128、256、512、1024)稀釋后，以PNRSV感病的櫻桃葉片汁液作為抗原包板，以健康的櫻桃葉片汁液為對照，用ACP-ELISA方法測定抗血清的效價，結(jié)果抗血清稀釋1024倍后仍能表現(xiàn)明顯的陽性反應(yīng)，同時與健康的櫻桃葉片汁液沒有明顯的血清學(xué)反應(yīng)，表明本發(fā)明所獲得的PNRSV-cp基因確實(shí)為PNRSV的cp基因，其編碼蛋白可用于李屬壞死環(huán)斑病毒的檢測。
序列表<160>8<210>1<211>643<212>DNA<213>李屬壞死環(huán)斑病毒(Prunus necrotic ringspot virus)<400>1tttgcaatca tacccacgct ggtggatgcc gttcttgcaa gaagtgccat ccgaatggag 60ctctggtccc actcagggct caacagaggg ctgtgaataa cccgaataga aacccgaata120gggcttcgag tggtatcgga ccagtggtcc gaccacaacc ggtcgtgaag accatttgga180ccgtgagagg tccgaatgta cctccccgaa ttcctaaggg gtttgtggca catagtcacc240gagaggtgac gacgacagag gtggtgaagt acttgagcat cgacttcacg accactctcc300ctcagttgat gggtcaaaat ttgaccctat tgactgttat agtccgaatg aactctatga360gttcgaatgg ttggattggg atggtggagg actataaggt ggaacaacct gatggtccga420atgccctgtc taggaagggg ttcttgaagg accaaccgag aggttggcag ttcgaacctc480cttccgattt agatttcgac acttttgcgc gtacgcatcg tgtcgttatc gaattcaaga540ccgaagtgcc cgctggggcc aaggtcttgg ttagggattt gtacgtagtg gtaagtgatt600taccacgagt gcaaattccg actgatgtct tgctggtcga tga 643<210>2<211>675<212>DNA<213>李屬壞死環(huán)斑病毒(Prunus necrotic ringspot virus)<400>2atggtttgcc gaatttgcaa tcatacccac gctggtggat gccgttcttg caagaagtgc60
catccgaatg atgctctggt cccactcagg gctcaacaaa gggctgcgaa taacctgaat120aggaacccga ctaaggtttc gagcggtata ggacctgcgg tccgaccgca accggtcgtg180aagaccactt ggaccgtgag gggtccgaat gtgcctcccc gaattcccaa gggttatgga240gcacataatc accgagaggt gatgacgaca gaggcagtga agtacttgag tattgacttc300acgaccactc tccctcagtt gatgggtcag aatttgacct tattaactgt tatagtccga360atgaactcta tgagttcgaa tggttggatt gggatggtgg aggactataa ggtggatcaa420cctgatggtc cgaatgcctt gtctaggaag gggttcttga aggaccaacc gagaggttgg480cagtccgaac ctccctccga tttagatttc gacaactttg cgcgtacgca tcgtgtcctc540atcgaattca agaccgaagt ggccgctggg gccaaggtct tggttaggga tttgtacgta600gtggtaagtg atttaccacg agtgcaaatt ccgactgatg tcttgctggt cgatgaagac660ctgcttgaga tctag 675<210>3<211>213<212>PRT<213>李屬壞死環(huán)斑病毒(Prunus necrotic ringspot virus)<400>3Cys Asn His Thr His Ala Gly Gly Cys Arg Ser Cys Lys Lys Cys His1 5 10 15Pro Asn Gly Ala Leu Val Pro Leu Arg Ala Gln Gln Arg Ala Val Asn20 25 30Asn Pro Asn Arg Asn Pro Asn Arg Ala Ser Ser Gly Ile Gly Pro Val35 40 45Val Arg Pro Gln Pro Val Val Lys Thr Ile Trp Thr Val Arg Gly Pro50 55 60Asn Val Pro Pro Arg Ile Pro Lys Gly Phe Val Ala His Ser His Arg65 70 75 80Glu Val Thr Thr Thr Glu Val Val Lys Tyr Leu Ser Ile Asp Phe Thr85 90 95Thr Thr Leu Pro Gln Leu Met Gly Gln Asn Leu Thr Leu Leu Thr Val100 105 110
Ile Val Arg Met Asn Ser Met Ser Ser Asn Gly Trp Ile Gly Met Val115 120 125Glu Asp Tyr Lys Val Glu Gln Pro Asp Gly Pro Asn Ala Leu Ser Arg130 135 140Lys Gly Phe Leu Lys Asp Gln Pro Arg Gly Trp Gln Phe Glu Pro Pro145 150 155 160Ser Asp Leu Asp Phe Asp Thr Phe Ala Arg Thr His Arg Val Val Ile165 170 175Glu Phe Lys Thr Glu Val Pro Ala Gly Ala Lys Val Leu Val Arg Asp180 185 190Leu Tyr Val Val Val Ser Asp Leu Pro Arg Val Gln Ile Pro Thr Asp195 200 205Val Leu Leu Val Asp210<210>4<211>224<212>PRT<213>李屬壞死環(huán)斑病毒(Prunus necrotic ringspot virus)<400>4Met Val Cys Arg Ile Cys Asn His Thr His Ala Gly Gly Cys Arg Ser1 5 10 15Cys Lys Lys Cys His Pro Asn Asp Ala Leu Val Pro Leu Arg Ala Gln20 25 30Gln Arg Ala Ala Asn Asn Leu Asn Arg Ash Pro Thr Lys Val Ser Ser35 40 45Gly Ile Gly Pro Ala Val Arg Pro Gln Pro Val Val Lys Thr Thr Trp50 55 60Thr Val Arg Gly Pro Asn Val Pro Pro Arg Ile Pro Lys Gly Tyr Gly65 70 75 80Ala His Asn His Arg Glu Val Met Thr Thr Glu Ala Val Lys Tyr Leu
85 90 95Ser Ile Asp Phe Thr Thr Thr Leu Pro Gln Leu Met Gly Gln Asn Leu100 105 110Thr Leu Leu Thr Val Ile Val Arg Met Asn Ser Met Ser Ser Asn Gly115 120 125Trp Ile Gly Met Val Glu Asp Tyr Lys Val Asp Gln Pro Asp Gly Pro130 135 140Asn Ala Leu Ser Arg Lys Gly Phe Leu Lys Asp Gln Pro Arg Gly Trp145 150 155 160Gln Ser Glu Pro Pro Ser Asp Leu Asp Phe Asp Asn Phe Ala Arg Thr165 170 175His Arg Val Leu Ile Glu Phe Lys Thr Glu Val Ala Ala Gly Ala Lys180 185 190Val Leu Val Arg Asp Leu Tyr Val Val Val Ser Asp Leu Pro Arg Val195 200 205Gln Ile Pro Thr Asp Val Leu Leu Val Asp Glu Asp Leu Leu Glu Ile210 215 220<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>5tttgcaatca tacccacgct 20<210>6<211>20<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>
<400>6tcatcgacca gcaagacatc 20<210>7<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>7ccgaagctta tggtttgccg aatttgcaa 29<210>8<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>8ttgctcgagg atctcaagca ggtcctc 2權(quán)利要求
1.李屬壞死環(huán)斑病毒外殼蛋白基因，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)序列表中SEQ ID №2的DNA序列；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID №1或SEQ ID №2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的李屬壞死環(huán)斑病毒外殼蛋白基因，其特征在于所述基因?yàn)樾蛄斜碇械腟EQ ID №1或SEQ ID №2。
3.權(quán)利要求1所述的李屬壞死環(huán)斑病毒外殼蛋白基因的編碼蛋白，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)序列表中的SEQ ID №3；2)序列表中的SEQ ID №4；3)將序列表中SEQ ID №3或SEQ ID №4的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至十個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且構(gòu)成李屬壞死環(huán)斑病毒外殼的蛋白質(zhì)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的李屬壞死環(huán)斑病毒外殼蛋白基因的編碼蛋白，其特征在于所述蛋白具有序列表中SEQ ID №3或SEQ ID №4的氨基酸殘基序列。
5.含有權(quán)利要求1所述基因的表達(dá)載體。
6.含有權(quán)利要求5所述表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。
7.含有權(quán)利要求5所述表達(dá)載體的宿主菌。
8.權(quán)利要求1所述的李屬壞死環(huán)斑病毒外殼蛋白基因的專用檢測引物，是由序列表中SEQ ID №5和SEQ ID №6或是由序列表中SEQ ID №7和SEQ ID №8組成的引物對。
9.權(quán)利要求8所述的李屬壞死環(huán)斑病毒外殼蛋白基因的專用檢測引物在檢測李屬壞死環(huán)斑病毒中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求3所述的李屬壞死環(huán)斑病毒外殼蛋白基因的編碼蛋白在檢測李屬壞死環(huán)斑病毒中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了李屬壞死環(huán)斑病毒外殼蛋白基因及其專用檢測引物。該基因是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)序列表中SEQID №2的DNA序列；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID №1或SEQ ID№2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。其專用檢測引物是由序列表中SEQ ID №5和SEQ ID №6或是由序列表中SEQ ID №7和SEQ ID №8組成的引物對。本發(fā)明建立了李屬壞死環(huán)斑病毒的RT－PCR等分子生物學(xué)檢測的技術(shù)體系，為該病害的檢驗(yàn)檢疫提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支持，具有較高的實(shí)際應(yīng)用價值。
文檔編號C12Q1/68GK1800398SQ200510132479
公開日2006年7月12日 申請日期2005年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月20日
發(fā)明者范在豐, 馬云霞, 陳招榮, 李懷方 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)