專利名稱：海島棉受體類似蛋白激酶基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及海島棉受體類似蛋白激酶基因的克隆，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
(二)技術(shù)背景棉花是重要的經(jīng)濟(jì)作物，棉纖維是主要的紡織原料。而棉花的病害比較多，我國(guó)枯、黃萎病尤其嚴(yán)重，給棉花生產(chǎn)造成很大的損失。種植抗病品種是防治病害的最經(jīng)濟(jì)有效的方法。陸地棉是我國(guó)棉花的主栽品種，陸地棉抗枯萎病育種非常成功，但黃萎病抗病品種的培育一直是育種家的一大難題，主要原因在陸地棉中找不到免疫或高抗的黃萎病抗源。
棉花黃萎病是Carpenter于1914年在美國(guó)弗吉尼亞州發(fā)現(xiàn)并報(bào)道的，它是由大麗輪枝菌引起的一種真菌性病害。半個(gè)多世紀(jì)以來，棉花黃萎病不僅蔓延至整個(gè)美國(guó)棉區(qū)，也在世界各主要產(chǎn)棉國(guó)相繼發(fā)現(xiàn)。該病主要分布于秘魯、巴西、阿根廷、澳大利亞、剛果、印度、中國(guó)、以色列、前蘇聯(lián)等30多個(gè)國(guó)家和地區(qū)，尤其在前蘇聯(lián)最為嚴(yán)重。我國(guó)棉花黃萎病是由于1935年引進(jìn)美國(guó)斯字棉4B棉種而傳入的，以后隨著棉種的繁殖和調(diào)運(yùn)，棉花黃萎病在我國(guó)各主要產(chǎn)棉區(qū)逐漸傳播開來。20世紀(jì)90年代以來，我國(guó)棉花黃萎病擴(kuò)展蔓延迅猛，其中1993年棉花黃萎病爆發(fā)成災(zāi)，發(fā)病面積達(dá)266.67萬(wàn)hm2，損失皮棉1億公斤以上。1995年、1996年棉花黃萎病在全國(guó)范圍內(nèi)連續(xù)大發(fā)生，給棉花生產(chǎn)造成極大的損失。2000年棉花黃萎病在新疆危害嚴(yán)重，其中農(nóng)五師2.67萬(wàn)hm2棉田中有0.67萬(wàn)hm2重病田。
本專利所克隆的基因受體類似蛋白激酶(GbRKL)，是蛋白質(zhì)激酶中的一種。蛋白激酶在信號(hào)傳導(dǎo)過程中起著重要作用，而受體蛋白激酶是蛋白激酶中的重要一類，也是信號(hào)分子的重要受體。受體激酶包含有多個(gè)基因家族。在識(shí)別與轉(zhuǎn)導(dǎo)膜外信號(hào)方面發(fā)揮著重要的作用。蛋白激酶主要是通過催化受體蛋白的可逆磷酸化來傳遞各類信號(hào)的。植物受體激酶具有酪氨酸的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，但含有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶基因的序列特征。受體蛋白激酶參與了植物許多由激素和胞外環(huán)境信號(hào)引起的生理生化過程，如，自交不親和、調(diào)節(jié)胚乳和花粉的發(fā)育、花的脫落、油菜素類固醇信號(hào)反應(yīng)、環(huán)境脅迫及植物抗病等。在已克隆的抗病基因中水稻的Xa21、擬南芥的PBS1、大麥的RPG1、番茄的PTO都含有受體蛋白激酶保守結(jié)構(gòu)域。
植物受體類似蛋白激酶依其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)可分為三類第一類含有受體類似激酶區(qū)與一個(gè)N端胞外S區(qū)；第二類除了受體類似激酶區(qū)外還有一個(gè)富含亮氨酸重復(fù)；第三類只含有激酶區(qū)，沒有明顯的配基結(jié)合區(qū)，但其功能的發(fā)揮也需要一段保守氨基酸序列。已克隆的番茄PTO、大麥的RPG1基因?qū)儆诘谌惣っ富?，PTO所編碼的129～224位氨基酸參與了病原物的識(shí)別及與無(wú)毒基因AvrPto的相互作用。RPG1基因編碼兩個(gè)激酶區(qū)，具體作用機(jī)理還不清楚。分析克隆的棉花GbRLK基因含有一個(gè)保守的激酶區(qū)和一個(gè)跨膜區(qū)，它只編碼一個(gè)預(yù)測(cè)的蛋白激酶區(qū)，有一段跨膜區(qū)，而N端區(qū)沒有找到與已克隆的它的這些結(jié)構(gòu)與番茄的PTO結(jié)構(gòu)非常相似，GbRLK與PTO的功能區(qū)(129～224氨基酸)非常保守，可能它們?cè)谂c病原物的相互作用中有相似的作用機(jī)理。
Genbank中已注冊(cè)的與激酶有關(guān)的棉花序列有14條，其中已知功能的都是參與棉花纖維的發(fā)育，而與抗病有關(guān)的棉花激酶類基因還未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容技術(shù)問題本發(fā)明的目的是克隆一個(gè)海島棉受體類似蛋白激酶基因(GbRLK)cDNA的全長(zhǎng)序列，以此設(shè)計(jì)出一對(duì)GbRLK的特異性引物利用RT-PCR方法，檢測(cè)其在接菌黃萎病后的抗性海島棉品種海7124中不同時(shí)期根中的表達(dá)情況，并用Northern雜交對(duì)其結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。
技術(shù)方案海島棉受體類似蛋白激酶基因(GbRLK)，長(zhǎng)度為1536bp，序列為SEQ IDNO.1，如下ACTATTTTTGCTGCACTTTTATGTCCTCTTTCAGGTCCATTCCAGGGACAGGTGATCATGGCGATGATCAATTCCCGGATATAAAAGAAATCACTAAGCCGTTCAACCAGGCCTTTACTATAATTATCGTAGCCACTATAGGTATAATTTCAATTGCTTTGCTTTTTGTTTGGATTCATGTAAATTCTAACTAATATTTCTTACATATTGCAGTGGCCTTACTTATTAAGGTATTTTTTATAGCATACGTATGCCGTCTATGCCGTGAAAGACTTGGAAGAGAAAGCAGCGATAGTGTTTGCCCAGAAACTCAATCTATAACACTAAACATGGATAAATTCCTGAACGAAATGGAAAAGGAGAAGCCTAGTCGGTTTACCTCCCAACAGCTACGGATTGCGACCGATAATTTCACCAATTTACTTGGTTCGGGTGGCTTTGGAACTGTTTATAAAGGAATTTTTAGTAACGGAACCATGGTAGCTGTCAAAGTCCTGCATGGAGATTCCGATAAAAGGATAGAAGAGCAGTTCATGGCGGAAGTGAGTACAATCGGAAGAGTTCACCATGTTAATCTGGTTCGACTTTACGGTTTCTGTTTTGACCTGAATCTTAGAGCTCTCGTATACGAGTACATGGTAAATGGTTCGCTTGACAAGTTTTTATTTGGTGAAGACAAGAAACTGGGATTCCAACAGCTTCAAGCAATAGCAATAGGCACTGCTAAAGGGATTGCTTACTTGCACGAAGAATGCCAACAACGGATTATCCACTACGACATAAAACCAGGAAATATTCTATTGGATGCCAACTTCTTGCCTAAAGTGGCGGATTTCGGATTAGCCAAGCTTTGTAACAGGGAAAAGACACATGTAACAATGACAAGAGGAAGGGGTACTCCTGGATATGCAGCACCAGAGCTTTGGATGCCATATCCTATTACACATAAATGTGATGTTTACAGCTTTGGGATGTTATTGTTTGAGATCATTGGTAAGAGAAGGAACCTTGATACAAATCTACCTGAAAGCCAAGAATGGTTTCCAAGATGGGTATGGAAAAATACTGAGACTGAAAATCATGTGGAGTTAATGATGGTCTGCGGAATTGAGGATATGGATAGAGATACGGCGGAGAGAATGATGAAAACAGCTTTGTGGTGCATTCAATATCGGCCTGAATCGAGGCCTTTGATGAGCATCGTGGTGAAAATGTTGGAAGGAGGAGTGGAGATTCCTGCACCTTCAAATCCTTTTGAAGCTTCTTCAATGGAGCCTAATAGTAATACCTCTACTAGCACCGATACCTCTAGTTGTTCAGAGTCGTCTTCATTACTAGCAAGCTCTGCTTCAATACATGCAACTCCTGTCATGAAAAAATATGAAATTGAAATGGTCACAATTTATTAGA
TAATGTGCTTCCAGAATACAAAATGTTAATGGCCATCTATAAATATATTCTGACGCTATAGATCATTATCCAAGAAGCTTTCTTTGTTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGTACTAGTCGACGCGTGGCC注下劃線為潛在加尾信號(hào)。
GbRLK的RT-PCR引物為F5’-GAAGAGCAGTTCATGGCGGA-3’R5’-ACAAAGCTTGGCTAATCCGA-3’擴(kuò)增Northern雜交探針?biāo)靡颋5’-GCCAAGAATGGTTTCCAAGAT-3’R5’-ACATTTTGTATTCTGGAAGCACA-3’5’RACE所用引物GSP15’-AGCAATCCCTTTAGCA-3’GSP25’-AAAACAGAAACCGTAAAGTCG-3’GSP35’-ATGGTGAACTCTTCCGATTGT-3’本發(fā)明克隆受體類似蛋白激酶基因(GbRLK)的技術(shù)路線是1.利用其它作物中已克隆的激酶類抗病基因保守域設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，從海島棉海7124中進(jìn)行PCR擴(kuò)增?；厥疹A(yù)期大小的片段，將回收的片段連入pGEM-T easy Vector(Promega)。挑取10個(gè)陽(yáng)性克隆送上海英俊生物技術(shù)有限公司測(cè)序。
2.測(cè)序結(jié)果經(jīng)手工去除載體序列后，在NCBI的非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLASTx分析。
3.將BLASTx分析結(jié)果與激酶類有關(guān)的7條序列用DNAstar進(jìn)行連續(xù)開放閱讀框(ORF)分析，發(fā)現(xiàn)3條具有連續(xù)的ORF。
4.用具有連續(xù)ORF的3條序列設(shè)計(jì)特異引物。分析其在接菌黃萎病病菌VD8后的海盜棉品種海7124根組織中不同時(shí)期的表達(dá)情況。其中有一條受黃萎病誘導(dǎo)表達(dá)的(圖1)。
5.利用該序列設(shè)計(jì)三條5′RACE引物與兩條3′RACE引物，以接菌黃萎病后96小時(shí)的海7124根組織為材料，獲得其全長(zhǎng)cDNA。
6.用RT-PCR產(chǎn)物對(duì)其表達(dá)用Northern雜交進(jìn)行驗(yàn)證，與RT-PCR結(jié)果完全吻合(圖2)。并做了生物信息學(xué)的初步分析。
有益效果本發(fā)明海島棉受體類似蛋白激酶基因(GbRLK)是從黃萎病處理的海島棉根組織中經(jīng)侯選基因與RACE技術(shù)得到的。RT-PCR與Northern檢測(cè)因其僅在黃萎病處理后96小時(shí)表達(dá)，且該基因編碼蛋白與植物防衛(wèi)反應(yīng)有關(guān)，因此以該基因?yàn)榘谢驅(qū)γ藁ㄟM(jìn)行轉(zhuǎn)化，在一定程度上可有效的提高棉花的黃萎病抗性，因而具有一定的經(jīng)濟(jì)及社會(huì)效益。以此基因?yàn)榘谢?，通過基因工程的方法改良目前棉花黃萎病的抗性，為棉花的抗病育種提供基因資源，盡快培育高抗黃萎病的棉花品種，并應(yīng)用于棉花生產(chǎn)。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)表現(xiàn)在(1)利用已克隆的同類基因的保守域克隆與目的基因的相關(guān)片段，通過cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)技術(shù)，克隆其全長(zhǎng)cDNA。在克隆全長(zhǎng)cDNA的眾多方法中，該方法費(fèi)用少、快速而且高效。
(2)本發(fā)明所克隆的基因編碼受體類似蛋白激酶，從現(xiàn)有的資料可知，受體類似蛋白激酶基因是一類基因家族，它們不僅在植物正常的生理過程中發(fā)揮著重要的功能，而且是植物識(shí)別病原菌引發(fā)抗病信號(hào)傳導(dǎo)的主要基因之一。因此本發(fā)明所克隆的基因與棉花的抗病有著直接的關(guān)系。
(3)以此基因作為靶基因，對(duì)棉花進(jìn)行轉(zhuǎn)化理論上可直接有效地提高其黃萎病抗性，獲得高抗黃萎病的棉花品種，極大地減少因病害帶來的棉花生產(chǎn)的損失，帶來可觀的經(jīng)濟(jì)效益。
(4)目前轉(zhuǎn)基因的外源基因大部分來源于微生物，這類轉(zhuǎn)基因作物對(duì)安全性評(píng)價(jià)要求嚴(yán)格。本專利報(bào)道的基因來源于棉花，再導(dǎo)入棉花不存在安全性評(píng)價(jià)問題。同時(shí)，與棉花抗病相關(guān)的基因目前國(guó)內(nèi)外申請(qǐng)的專利很少，本專利是目前具有中國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的為數(shù)不多的專利之一。該專利的申請(qǐng)可提高中國(guó)棉花科研水平在國(guó)際同行中的地位。
(5)通過該基因的功能預(yù)測(cè)，表明該基因是一個(gè)在黃萎病誘導(dǎo)后特異表達(dá)的基因，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將該基因?qū)朊藁?，使其過量表達(dá)，獲得的轉(zhuǎn)基因植株將在黃萎病侵染棉花時(shí)大量表達(dá)，有望達(dá)到大大提高棉花抗黃萎病的目的。


圖1 RT-PCR檢測(cè)受體類似蛋白激酶基因(GbRLK)在接菌黃萎病后海7124根組織中不同時(shí)期表達(dá)特點(diǎn)，0h，24h，48h，96h，144h分別表示接菌黃萎病后的時(shí)間。圖1中EF1α為棉花的組成性表達(dá)基因，作為內(nèi)標(biāo)，證明RNA模板的一致性。GbRLK表示目的基因。
圖2 Northern檢測(cè)受體類似蛋白激酶基因(GbRLK)在接菌黃萎病后海7124根組織中不同時(shí)期表達(dá)特點(diǎn)，0h，24h，48h，96h，144h分別表示接菌黃萎病后的時(shí)間。圖中地rRNA表示核糖體RNA，作為Northern雜交上樣量的對(duì)照。
圖3 受體類似蛋白激酶基因(GbRLK)預(yù)測(cè)的氨基酸序列與已注冊(cè)的棉花中的激酶類基因或序列的進(jìn)化樹。沒有命名的序列用登錄號(hào)表示。
具體實(shí)施方式
1.利用其它作物中已克隆的激酶類抗病基因保守域設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，從海島棉海7124中進(jìn)行PCR擴(kuò)增?；厥疹A(yù)期大小的片段，將回收的片段連入pGEM-T easy Vector(Promega公司)。挑取10個(gè)陽(yáng)性克隆送上海英俊生物技術(shù)有限公司測(cè)序。
2.測(cè)序結(jié)果用DNAstar軟件手工去除載體序列后，在NCBI的非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLASTx分析。
3.將BLASTx分析結(jié)果中與激酶類有關(guān)的7條序列用DNAstar進(jìn)行連續(xù)開放閱讀框(ORF)分析，找到3條具有連續(xù)的ORF(測(cè)序編號(hào)分別為L(zhǎng)354，L355，L361)。
4.用具有連續(xù)ORF的3條序列設(shè)計(jì)特異引物。分析其在接菌黃萎病病菌VD8(陸家云等，1983)后的海盜棉品種海7124根組織中不同時(shí)期的表達(dá)情況。其中有一條受黃萎病誘導(dǎo)表達(dá)(圖1)。利用該序列設(shè)計(jì)三條5′RACE引物與兩條3′RACE引物GbRLK的RT-PCR引物為F5’-GAAGAGCAGTTCATGGCGGA-3’R5’-ACAAAGCTTGGCTAATCCGA-3’擴(kuò)增Northern雜交探針?biāo)靡颋5’-GCCAAGAATGGTTTCCAAGAT-3’R5’-ACATTTTGTATTCTGGAAGCACA-3’5’RACE所用引物GSP15’-AGCAATCCCTTTAGCA-3’GSP25’-AAAACAGAAACCGTAAAGTCG-3’GSP35’-ATGGTGAACTCTTCCGATTGT-3’以接菌黃萎病后96小時(shí)的海7124根組織為材料，獲得其全長(zhǎng)cDNA。
5.用RT-PCR產(chǎn)物對(duì)其表達(dá)用Northern雜交進(jìn)行驗(yàn)證，與RT-PCR結(jié)果完全吻合(圖2)。
6.對(duì)已克隆的激酶類抗病基因做了生物信息學(xué)的初步分析6.1以此基因的最大ORF推斷的氨基酸序列經(jīng)BLAST(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)功能比較，該基因與水稻S-受體激酶PK3前體具有56％的一致性，72％的相似性(E值1e-98)。
6.2用Expasy pI/Mw程序(http//us.expasy.org/tool s/pi_tool.html)對(duì)GbRLK預(yù)測(cè)的氨基酸序列進(jìn)行了一級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)，該基因理論上的等電點(diǎn)pI＝5.9，分子量Mw＝40.65kDa。
6.3ProtComp Version 6(http//sunl.softberry.com/berry.phtml)預(yù)測(cè)GbRLK定位于質(zhì)膜，LOCtree預(yù)測(cè)其定位于細(xì)胞質(zhì)，TMpred(http//www.ch.embnet.org//software/TMPRED form.html)預(yù)測(cè)它含有一段跨膜區(qū)(28～46位氨基酸)，可見該蛋白為跨膜蛋白。
6.4利用ScanProsite(http//www.expasy.org/tools/scanprosite/)程序搜索GbRLK預(yù)測(cè)的氨基酸序列的保守基元，發(fā)現(xiàn)其26～310位為蛋白質(zhì)激酶區(qū)。
6.5同源關(guān)系樹分析(MEGA3軟件)(圖3)，GbRLK與棉花中已注冊(cè)的登錄號(hào)為AAT64017和AAT64032的兩條序列遺傳距離最近。這兩條序列屬于預(yù)測(cè)的蛋白激酶，含有亮氨酸重復(fù)序列與跨膜區(qū)。
7.通過該基因的功能預(yù)測(cè)，表明該基因是一個(gè)在黃萎病誘導(dǎo)后特異表達(dá)的基因，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將該基因?qū)朊藁?，使其過量表達(dá)，獲得的轉(zhuǎn)基因植株將在黃萎病侵染棉花時(shí)大量表達(dá)，有望達(dá)到大大提高棉花抗黃萎病的目的。
序列表<110>南京農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>海島棉受體類似蛋白激酶基因及其應(yīng)用<130>說明書<140>00<141>2005-12-20<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>SEQ ID NO.1<211>1536<212>DNA<213>Gossypium barbadense(海島棉)<220>
<221>gene<222>(1)..(1536)<223>
<400>1actatttttg ctgcactttt atgtcctctt tcaggtccat tccagggaca ggtgatcatg60gcgatgatca attcccggat ataaaagaaa tcactaagcc gttcaaccag gcctttacta120taattatcgt agccactata ggtataattt caattgcttt gctttttgtt tggattcatg180taaattctaa ctaatatttc ttacatattg cagtggcctt acttattaag gtatttttta240tagcatacgt atgccgtcta tgccgtgaaa gacttggaag agaaagcagc gatagtgttt300gcccagaaac tcaatctata acactaaaca tggataaatt cctgaacgaa atggaaaagg360agaagcctag tcggtttacc tcccaacagc tacggattgc gaccgataat ttcaccaatt420tacttggttc gggtggcttt ggaactgttt ataaaggaat ttttagtaac ggaaccatgg480tagctgtcaa agtcctgcat ggagattccg ataaaaggat agaagagcag ttcatggcgg540aagtgagtac aatcggaaga gttcaccatg ttaatctggt tcgactttac ggtttctgtt600ttgacctgaa tcttagagct ctcgtatacg agtacatggt aaatggttcg cttgacaagt660ttttatttgg tgaagacaag aaactgggat tccaacagct tcaagcaata gcaataggca720
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1.海島棉受體類似蛋白激酶基因，長(zhǎng)度為1536bp，序列為SEQ ID NO.1，如下ACTATTTTTGCTGCACTTTTATGTCCTCTTTCAGGTCCATTCCAGGGACAGGTGATCATGGCGATGATCAATTCCCGGATATAAAAGAAATCACTAAGCCGTTCAACCAGGCCTTTACTATAATTATCGTAGCCACTATAGGTATAATTTCAATTGCTTTGCTTTTTGTTTGGATTCATGTAAATTCTAACTAATATTTCTTACATATTGCAGTGGCCTTACTTATTAAGGTATTTTTTATAGCATACGTATGCCGTCTATGCCGTGAAAGACTTGGAAGAGAAAGCAGCGATAGTGTTTGCCCAGAAACTCAATCTATAACACTAAACATGGATAAATTCCTGAACGAAATGGAAAAGGAGAAGCCTAGTCGGTTTACCTCCCAACAGCTACGGATTGCGACCGATAATTTCACCAATTTACTTGGTTCGGGTGGCTTTGGAACTGTTTATAAAGGAATTTTTAGTAACGGAACCATGGTAGCTGTCAAAGTCCTGCATGGAGATTCCGATAAAAGGATAGAAGAGCAGTTCATGGCGGAAGTGAGTACAATCGGAAGAGTTCACCATGTTAATCTGGTTCGACTTTACGGTTTCTGTTTTGACCTGAATCTTAGAGCTCTCGTATACGAGTACATGGTAAATGGTTCGCTTGACAAGTTTTTATTTGGTGAAGACAAGAAACTGGGATTCCAACAGCTTCAAGCAATAGCAATAGGCACTGCTAAAGGGATTGCTTACTTGCACGAAGAATGCCAACAACGGATTATCCACTACGACATAAAACCAGGAAATATTCTATTGGATGCCAACTTCTTGCCTAAAGTGGCGGATTTCGGATTAGCCAAGCTTTGTAACAGGGAAAAGACACATGTAACAATGACAAGAGGAAGGGGTACTCCTGGATATGCAGCACCAGAGCTTTGGATGCCATATCCTATTACACATAAATGTGATGTTTACAGCTTTGGGATGTTATTGTTTGAGATCATTGGTAAGAGAAGGAACCTTGATACAAATCTACCTGAAAGCCAAGAATGGTTTCCAAGATGGGTATGGAAAAATACTGAGACTGAAAATCATGTGGAGTTAATGATGGTCTGCGGAATTGAGGATATGGATAGAGATACGGCGGAGAGAATGATGAAAACAGCTTTGTGGTGCATTCAATATCGGCCTGAATCGAGGCCTTTGATGAGCATCGTGGTGAAAATGTTGGAAGGAGGAGTGGAGATTCCTGCACCTTCAAATCCTTTTGAAGCTTCTTCAATGGAGCCTAATAGTAATACCTCTACTAGCACCGATACCTCTAGTTGTTCAGAGTCGTCTTCATTACTAGCAAGCTCTGCTTCAATACATGCAACTCCTGTCATGAAAAAATATGAAATTGAAATGGTCACAATTTATTAGATAATGTGCTTCCAGAATACAAAATGTTAATGGCCATCTATAAATTATTCTGACGCTATAGATCATTATCCAAGAAGCTTTCTTTGTTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGTACTAGTCGACGCGTGGCC注下劃線為潛在加尾信號(hào)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的海島棉受體類似蛋白激酶基因，其特征在于，該基因的RT-PCR引物為F5’-GAAGAGCAGTTCATGGCGGA-3’R5’-ACAAAGCTTGGCTAATCCGA-3’擴(kuò)增Northern雜交探針?biāo)靡颋5’-GCCAAGAATGGTTTCCAAGAT-3’R5’-ACATTTTGTATTCTGGAAGCACA-3’5′RACE所用引物GSP15’-AGCAATCCCTTTAGCA-3’GSP25’-AAAACAGAAACCGTAAAGTCG-3’GSP35’-ATGGTGAACTCTTCCGATTGT-3’3′RACE所用引物GSP1CGACTTTACGGTTTCTGTTTGSP2AAGAATGCCAACAACGGATTA。
3.權(quán)利要求1或2所述海島棉受體類似蛋白激酶基因?yàn)榘谢虻膽?yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及海島棉受體類似蛋白激酶基因的克隆，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。克隆了一個(gè)海島棉受體類似蛋白激酶(GbRLK)基因cDNA的全長(zhǎng)序列，以此設(shè)計(jì)出一對(duì)GbRLK的特異性引物利用RT－PCR方法，檢測(cè)其在接菌黃萎病后的抗性海島棉品種海7124中不同時(shí)期根中的表達(dá)情況，并用Northern雜交對(duì)其結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。因RT－PCR與Northern雜交顯示該基因只在黃萎病處理后96小時(shí)表達(dá)。故該基因與黃萎病抗性有直接的關(guān)系，且該基因編碼蛋白產(chǎn)物與植物防衛(wèi)反應(yīng)的信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)，以此基因?yàn)榘谢?，通過基因工程的方法改良目前棉花黃萎病的抗性，可盡快培育高抗黃萎病的棉花品種，并應(yīng)用于棉花生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12N9/12GK1974772SQ20051013490
公開日2007年6月6日 申請(qǐng)日期2005年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月30日
發(fā)明者張?zhí)煺? 高玉龍, 郭旺珍 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)