專利名稱：脂肪酶粉末、其制備方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種可適用于各種酯化反應(yīng)、酯交換反應(yīng)等中的脂肪酶粉末，其制備方法，脂肪酶粉末浸漬或浸潤在油脂中而成的脂肪酶組合物，使用該脂肪酶粉末的油脂的酯交換方法等。
背景技術(shù)：
脂肪酶廣泛地用于脂肪酸等各種羧酸與一元醇或多元醇等醇類的酯化反應(yīng)、多個(gè)羧酸酯之間的酯交換反應(yīng)等中。其中，酯交換反應(yīng)不僅作為動植物油脂類的改質(zhì)方法，而且作為各種脂肪酸的酯、糖酯和類固醇的制備方法是重要的技術(shù)。當(dāng)將作為油脂水解酶的脂肪酶用作這些反應(yīng)的催化劑時(shí)，可在室溫至約70℃左右的溫和條件下進(jìn)行酯交換反應(yīng)，與以往的化學(xué)反應(yīng)相比，不僅抑制副反應(yīng)、降低能耗，而且由于作為催化劑的脂肪酶是天然物質(zhì)，因此安全性也較高。另外，可以根據(jù)其底物特異性或位置特異性高效地生產(chǎn)目標(biāo)物。然而，即使將脂肪酶就那樣地直接用于酯交換反應(yīng)中也不會充分表現(xiàn)出其活性，而且難以將原本為水溶性的脂肪酶均勻地分散到油性原料中，其回收也困難。因此，以往通常將脂肪酶固定到一些載體上，例如陰離子交換樹脂(專利文獻(xiàn)1)、酚醛吸附樹脂(專利文獻(xiàn)2)、疏水性載體(專利文獻(xiàn)3)、陽離子交換樹脂(專利文獻(xiàn)4)、螯合樹脂(專利文獻(xiàn)5)等上來用于酯化反應(yīng)或酯交換反應(yīng)等中。
如上所述，以往將脂肪酶固定化后用于酯交換反應(yīng)中，但是所述固定化脂肪酶不僅伴隨有固定化處理導(dǎo)致的原有脂肪酶活性的損失，而且使用多孔性載體時(shí)原料和產(chǎn)物堵塞細(xì)孔，其結(jié)果帶來酯交換率的降低。而且，在利用以往固定化脂肪酶進(jìn)行的酯交換反應(yīng)中，由于載體所持有的水分被帶入到反應(yīng)體系中，因此難以避免副反應(yīng)，例如在油脂類的酯交換反應(yīng)中的甘油二酯或甘油一酯的生成等。
鑒于上述狀況，已開發(fā)了各種使用脂肪酶粉末的技術(shù)。例如，提出了一種酯交換反應(yīng)方法，其在惰性有機(jī)溶劑的存在下或不存在下，將脂肪酶粉末分散到含有酯的原料中進(jìn)行酯交換反應(yīng)，以使在酯交換反應(yīng)時(shí)將分散脂肪酶粉末顆粒的90％或其以上保持在粒徑1～100μm的范圍內(nèi)(專利文獻(xiàn)6)。還提出了將含有磷脂和脂溶性維生素的酶溶液進(jìn)行干燥，使用所得到的酶粉末的技術(shù)(專利文獻(xiàn)7)。
然而，需要一種脂肪酶活性和穩(wěn)定性進(jìn)一步提高了的脂肪酶粉末。
專利文獻(xiàn)1日本專利特開昭60-98984號公報(bào)專利文獻(xiàn)2日本專利特開昭61-202688號公報(bào)專利文獻(xiàn)3日本專利特開平2-138986號公報(bào)專利文獻(xiàn)4日本專利特開平3-61485號公報(bào)專利文獻(xiàn)5日本專利特開平1-262795號公報(bào)專利文獻(xiàn)6日本專利第2668187號公報(bào)專利文獻(xiàn)7日本專利特開2000-106873號公報(bào)發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種脂肪酶活性和穩(wěn)定性提高了的脂肪酶粉末。
本發(fā)明又一目的在于提供一種1，3選擇性提高了的脂肪酶粉末。
本發(fā)明的又一目的在于提供一種將上述脂肪酶粉末浸漬或浸潤于油脂中而成的脂肪酶組合物。
本發(fā)明的又一目的在于提供一種上述脂肪酶粉末的制備方法。
本發(fā)明的又一目的在于提供一種使用上述脂肪酶粉末來進(jìn)行的油脂的酯交換方法。
本發(fā)明的這些目的和其它目的，從以下的描述將變得清楚。
本發(fā)明是基于如下發(fā)現(xiàn)完成的，即，當(dāng)使用動物乳的固體成分對脂肪酶進(jìn)行造粒、作成粉末狀時(shí)，脂肪酶活性和穩(wěn)定性就會顯著提高，并且在脂肪酶為1，3特異性脂肪酶時(shí)，其1，3選擇性將顯著提高。
即，本發(fā)明提供一種脂肪酶粉末，其特征在于，該脂肪酶粉末是含有脂肪酶、和動物乳的固體成分的造粒物。
本發(fā)明還提供一種脂肪酶組合物，該脂肪酶組合物在油脂中浸漬或浸潤有上述脂肪酶粉末。
本發(fā)明還提供一種脂肪酶粉末的制備方法，其特征在于，將動物乳或得自動物乳的奶油添加到含有脂肪酶的水溶液中，進(jìn)行噴霧干燥、冷凍干燥或溶劑沉淀。
本發(fā)明還提供一種酯交換用或酯化用脂肪酶，其含有上述脂肪酶粉末。
本發(fā)明還提供一種油脂的酯交換方法，其特征在于，使用酯交換用脂肪酶。
具體實(shí)施例方式
作為在本發(fā)明中使用的脂肪酶，可以列舉脂蛋白脂肪酶、單酰甘油脂肪酶、二酰甘油脂肪酶、三酰甘油脂肪酶、半乳糖脂肪酶、磷脂酶等。其中優(yōu)選三酰甘油脂肪酶。
作為產(chǎn)生這些脂肪酶的微生物，有細(xì)菌、酵母、絲狀菌、放線菌等不受特別限定，可以列舉假單胞菌屬(Psudomonas sp.)、產(chǎn)堿桿菌屬(Alcaligenes sp.)、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter sp.)、葡萄球菌屬(Staphylococcus sp.)、球擬酵母屬(Torulopsis sp.)、埃希氏菌屬(Escherichia sp.)、日本假絲酵母屬(Mycotorulasp.)、丙酸桿菌屬(Propionibacterium sp.)、色桿菌屬(Chromobacterium sp.)、黃單胞菌屬(Xanthomonas sp.)、乳酸桿菌屬(Lactobacillus sp.)、梭菌屬(Clostridium sp.)、假絲酵母屬(Candida sp.)、地霉屬(Geotrichum sp.)、復(fù)膜孢酵母屬(Saccharomycopsis sp.)、諾卡氏菌屬(Nocardia sp.)、鐮刀菌屬(Fusarium sp.)、曲霉屬(Aspergillus sp.)、青霉屬(Penicillum sp.)、毛霉菌屬(Mucor sp.)、根霉屬(Rhizopussp.)、須霉屬(Phycomyces sp.)、柄銹菌屬(Puccinia sp.)、桿菌屬(Bacillus sp.)、鏈霉菌屬(Streptomyces sp.)、嗜熱真菌屬(Thermomyces sp.)等。
其中，本發(fā)明優(yōu)選1，3-特異性脂肪酶，特別優(yōu)選得自根毛霉菌屬(Rhizomucor sp.)和產(chǎn)堿桿菌屬的1，3-特異性脂肪酶，更優(yōu)選得自根毛霉菌屬的米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)和得自產(chǎn)堿桿菌屬的Alcaligenes sp.的1，3-特異性脂肪酶。另外，米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)以往也有被歸屬于毛霉菌屬(Mucor sp.)的情況。
本發(fā)明優(yōu)選得自根霉屬和嗜熱真菌屬的1，3-特異性脂肪酶，特別是得自米根霉(Rhizopus oryzae)和棉狀嗜熱絲孢菌(Thermomyces lanuginosus)的1，3-特異性脂肪酶。
作為本發(fā)明中使用的動物乳，可以列舉牛乳、山羊乳等。其中，優(yōu)選牛乳，特別是，作為動物乳的固體成分，優(yōu)選牛乳的固體成分或得自牛乳的奶油的固體成分。
脂肪酶與動物乳的比例，可以是各種比例，以動物乳的固體成分計(jì)，優(yōu)選為脂肪酶質(zhì)量的0.1～20倍的量，更優(yōu)選為1～20倍的量。
本發(fā)明的脂肪酶粉末，必須含有動物乳的固體成分和脂肪酶，此外還可以含有脂肪酶的培養(yǎng)基成分等。
本發(fā)明的脂肪酶粉末，優(yōu)選其水分含量為10質(zhì)量％或10質(zhì)量％以下，特別優(yōu)選為6.5～8.5質(zhì)量％。
本發(fā)明的脂肪酶粉末的粒徑可以是任意的，但優(yōu)選脂肪酶粉末的90質(zhì)量％或90質(zhì)量％以上，其粒徑為1～100μm。平均粒徑優(yōu)選為20～80μm，更優(yōu)選為20～50μm。另外，脂肪酶粉末優(yōu)選為球狀。
脂肪酶粉末的粒徑，可以使用例如HORIBA公司的粒度分布測定裝置(LA-500)來測定。
本發(fā)明的脂肪酶粉末，可以通過例如將動物乳或得自動物乳的奶油添加到含有脂肪酶的水溶液中，經(jīng)噴霧干燥、冷凍干燥或溶劑沉淀之后進(jìn)行干燥的方法獲得。在這里，作為在溶劑沉淀法中使用的溶劑，可以列舉例如乙醇、丙酮、甲醇、異丙醇和己烷等，也可以使用它們的混合溶劑。其中，為了進(jìn)一步提高脂肪酶粉末的活性，優(yōu)選使用乙醇或丙酮。另外，溶劑沉淀之后的干燥例如可以通過減壓干燥來進(jìn)行。
在這里，作為含有脂肪酶的水溶液，可以列舉除去菌體的脂肪酶培養(yǎng)液、精制培養(yǎng)液、由它們獲得的脂肪酶粉末再次溶解·分散在水中得到的溶液、市售的脂肪酶粉末再次溶解·分散在水中得到的溶液、市售的液體脂肪酶等。而且，為了進(jìn)一步提高脂肪酶活性，更優(yōu)選除去了鹽類等低分子成分的溶液；另外，為了進(jìn)一步提高粉末的特性，更優(yōu)選除去了糖等低分子成分的溶液。
作為脂肪酶培養(yǎng)液，可以列舉例如，含有大豆粉、蛋白胨、玉米浸液、K2HPO4、(NH4)2SO4、MgSO4·7H2O等的水溶液。作為它們的濃度，大豆粉是0.1～20質(zhì)量％，優(yōu)選1.0～10質(zhì)量％，蛋白胨是0.1～30質(zhì)量％，優(yōu)選0.5～10質(zhì)量％，玉米浸液是0.1～30質(zhì)量％，優(yōu)選0.5～10質(zhì)量％，K2HPO4是0.01～20質(zhì)量％，優(yōu)選0.1～5質(zhì)量％。另外，(NH4)2SO4是0.01～20質(zhì)量％，優(yōu)選0.05～5質(zhì)量％，MgSO4·7H2O是0.01～20質(zhì)量％，優(yōu)選0.05～5質(zhì)量％。培養(yǎng)條件最好控制如下培養(yǎng)溫度為10～40℃，優(yōu)選20～35℃；通氣量為0.1～2.0VVM，優(yōu)選0.1～1.5VVM；攪拌轉(zhuǎn)速為100～800rpm，優(yōu)選200～400rpm；pH為3.0～10.0，優(yōu)選4.0～9.5。
菌體的分離優(yōu)選通過離心分離、膜過濾等進(jìn)行。另外，鹽類和糖等低分子成分的除去可以通過UF膜(ultrafiltrationmenbrane，超濾膜)處理來進(jìn)行。具體地說，進(jìn)行UF膜處理，將含有磷脂酶的水溶液濃縮至體積的1/2量，然后添加與濃縮液等量的磷酸緩沖液，將該操作重復(fù)1～5次，可以獲得除去了低分子成分的含有脂肪酶的水溶液。
離心分離優(yōu)選控制在200～20,000×g，膜過濾優(yōu)選由MF膜(microfiltration membrane，微濾膜)、壓濾機(jī)等將壓力控制在3.0kg/m2以下。菌體內(nèi)酶的情況下，優(yōu)選用均化器、韋林摻合器、超聲破碎、法式壓濾壺(French press)、球磨機(jī)等將細(xì)胞破碎，用離心分離、膜過濾等除去細(xì)胞殘?jiān)?。均化器的攪拌轉(zhuǎn)速為500～30,000rpm，優(yōu)選1,000～15,000rpm；韋林摻合器的轉(zhuǎn)速為500～10,000rpm，優(yōu)選1,000～5,000rpm。攪拌時(shí)間較佳為0.5～10分鐘，優(yōu)選1～5分鐘。超聲破碎較佳在1～50KHz，優(yōu)選在10～20KHz的條件下進(jìn)行。球磨機(jī)優(yōu)選使用直徑0.1～0.5mm左右的玻璃制小球。
在本發(fā)明中，作為含有脂肪酶的水溶液，優(yōu)選使用含有5～30質(zhì)量％固體成分的水溶液。
添加的動物乳或得自動物乳的奶油，以其固體成分計(jì)，優(yōu)選是含有脂肪酶的水溶液的固體成分質(zhì)量的0.1～20倍的量，更優(yōu)選是0.3～10倍的量，最優(yōu)選是0.3～5倍的量。
在這里，含有脂肪酶的水溶液中的固體成分濃度、以及動物乳或得自動物乳的奶油中的固體成分濃度，可以使用例如糖度計(jì)((株)シ一·アイ·エス公司制造的BRX-242)，作為Brix.％(糖度％)求出。
添加動物乳或得自動物乳的奶油之后，優(yōu)選將含有脂肪酶的水溶液的pH調(diào)節(jié)到6～7.5。特別優(yōu)選將pH調(diào)節(jié)到7.0以下，更優(yōu)選將pH調(diào)節(jié)到6.5～7.0的范圍內(nèi)。pH調(diào)節(jié)優(yōu)選在即將進(jìn)行噴霧干燥等干燥工序之前進(jìn)行，也可以在其之前的任意工序中進(jìn)行，也可以預(yù)先調(diào)節(jié)含有脂肪酶的水溶液的pH，以使其在即將進(jìn)行干燥工序之前的p H在上述范圍內(nèi)。pH調(diào)節(jié)中可使用各種堿性劑和酸，優(yōu)選使用氫氧化鈉等堿金屬氫氧化物。
另外，在干燥工序之前的中途的工序中，也可以濃縮含有脂肪酶的水溶液。濃縮方法沒有特別的限制，可以列舉蒸發(fā)器、閃蒸器、UF膜濃縮、MF膜濃縮、利用無機(jī)鹽類的鹽析、利用溶劑的沉淀法、利用離子交換纖維素等的吸附法、利用吸水性凝膠的吸水法等。較佳優(yōu)選UF膜濃縮、蒸發(fā)器。作為用于UF膜濃縮中的模件，優(yōu)選餾分分子量3,000～100,000、優(yōu)選6,000～50,000的平膜或中空纖維膜，材質(zhì)優(yōu)選為聚丙烯腈類、聚磺酸類等。
噴霧干燥優(yōu)選使用例如噴嘴逆流式、盤逆流式、噴嘴并流式、盤并流式等的噴霧干燥機(jī)進(jìn)行，更優(yōu)選盤并流式。噴霧干燥優(yōu)選控制在如下條件進(jìn)行噴霧器轉(zhuǎn)速為4,000～20,000rpm，加熱的入口溫度為100～200℃，出口溫度為40～100℃。
另外，冷凍干燥(freeze drying)也是優(yōu)選的，例如優(yōu)選通過實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的少量用冷凍干燥機(jī)，經(jīng)塔板式冷凍干燥來進(jìn)行。進(jìn)一步，也可以通過減壓干燥調(diào)制。
這樣制得的脂肪酶粉末可以就那樣地直接使用，然而從操作性的角度出發(fā)，優(yōu)選作為浸漬或浸潤到油脂中的脂肪酶組合物來使用。在這里，脂肪酶組合物中的油脂的質(zhì)量，相對于脂肪酶粉末優(yōu)選是0.1～20倍，更優(yōu)選是1～20倍。
可以通過如下方法容易地獲得該脂肪酶組合物在通過噴霧干燥等來制造的脂肪酶粉末中添加油脂，用攪拌器或三一電動機(jī)(three-one motor)等均勻攪拌的方法；或者在噴霧干燥器的粉末回收部預(yù)先添加油脂，回收后均勻攪拌，通過過濾除去過量油脂的方法。
作為含浸到脂肪酶粉末中的油脂，沒有特別的限制，可以列舉菜籽油、大豆油、高油酸向日葵油、橄欖油、紅花油、玉米油、棕櫚油、芝麻油等的植物油，三油酸甘油酯(甘油三油酸酯)、三辛酸甘油酯(甘油三辛酸酯)、三乙酸甘油酯(甘油三醋酸酯)、三丁酸甘油酯(甘油三丁酸酯)等的三?；视皖悾舅狨?，甾醇酯等的一種或多種的混合物。
在脂肪酶為1，3-特異性脂肪酶的情況下，特別是得自米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)或產(chǎn)堿桿菌屬(Alcaligenes sp.)的脂肪酶的情況下，根據(jù)本發(fā)明，該脂肪酶的1，3-選擇性極其高，因此可適宜將該脂肪酶粉末作為酯交換用脂肪酶或酯化用脂肪酶來使用。使用該脂肪酶粉末，按照常規(guī)方法，可以有效地進(jìn)行油脂等的酯交換反應(yīng)、油脂與脂肪酸酯的酯交換反應(yīng)、醇解和酸解的酯交換反應(yīng)、或者甘油與脂肪酸的酯化反應(yīng)。
根據(jù)本發(fā)明，可提供一種脂肪酶活性和穩(wěn)定性提高了的脂肪酶粉末。另外，在脂肪酶為1，3-特異性脂肪酶的情況下，其1，3選擇性顯著提高，可以以極高的比例將原料甘油三酯2位上的脂肪酸殘基保持在酯交換制品中。
下面通過實(shí)施例更詳細(xì)地描述本發(fā)明。
實(shí)施例1
脂肪酶溶解·分散于水溶液中的形態(tài)的ノボザイムズジヤパン(株)公司制造的得自米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)的液體脂肪酶(商品名稱Palatase 20000L)，將其用UF模件(旭化成工業(yè)(株)公司制造的SIP-0013)除去低分子成分，得到含有脂肪酶的水溶液1(固體成分濃度20.1質(zhì)量％)。具體地說，在冰冷卻下對液體脂肪酶(Palatase 20000L)進(jìn)行UF膜處理，濃縮到其體積的1/2量，然后添加與濃縮液等量的pH 7的0.01M磷酸緩沖液。對所得的溶液，進(jìn)行同樣的UF膜處理之后添加磷酸緩沖液的操作，重復(fù)2次該操作，然后再進(jìn)行UF膜處理，得到的脂肪酶濃縮液作為含有脂肪酶的水溶液1。
相對于20ml該含有脂肪酶的水溶液1，添加20ml的牛乳(小巖井乳業(yè)(株)公司制造的小巖井牛乳おいしさしたて固體成分濃度12.9質(zhì)量％)。使用氫氧化鈉水溶液將由此獲得的溶液調(diào)節(jié)到pH 6.8～6.9。
脂肪酶濃縮液(＝含有脂肪酶的水溶液1)∶牛乳的體積比是1∶1，牛乳的固體成分是含有脂肪酶的水溶液1的固體成分質(zhì)量的0.64倍的量。
使用噴霧干燥器(SD-1000型東京理化器械(株)公司制造)，在入口溫度130℃、干燥空氣量0.7～1.1m3/min、噴霧壓力11～12Kpa的條件下將該溶液進(jìn)行噴霧，得到脂肪酶粉末。脂肪酶粉末顆粒的形狀為球狀，脂肪酶粉末的90質(zhì)量％或90質(zhì)量％以上，其粒徑在1～100μm的范圍內(nèi)，平均粒徑為7.6μm。粒徑是使用HORIBA公司的粒度分布測定裝置(LA-500)測定的。
另外，通過以下方法測定含有脂肪酶的水溶液中的固體成分濃度和牛乳的固體成分濃度。
用糖度計(jì)((株)シ一·アイ·エス公司制造的BRX-242)測定，作為Brix.％求出。
實(shí)施例2在實(shí)施例1中得到的脂肪酶濃縮液中添加與濃縮液等量的水，得到含有脂肪酶的水溶液2(脂肪酶濃縮液∶水的體積比是1∶1)。下面，除了用含有脂肪酶的水溶液2代替實(shí)施例1中含有脂肪酶的水溶液1之外，與實(shí)施例1相同地操作得到脂肪酶粉末。脂肪酶濃縮液∶水∶牛乳的體積比是0.5∶0.5∶1，牛乳的固體成分是含有脂肪酶的水溶液(UF)的固體成分質(zhì)量的1.05倍的量。
實(shí)施例3在實(shí)施例1中得到的脂肪酶濃縮液中添加與濃縮液等量的pH 7的0.01M磷酸緩沖液，得到含有脂肪酶的水溶液3(脂肪酶濃縮液∶緩沖液的體積比是1∶1)。下面，除了用含有脂肪酶的水溶液3代替實(shí)施例1中含有脂肪酶的水溶液1之外，與實(shí)施例1相同地操作得到脂肪酶粉末。脂肪酶濃縮液∶磷酸緩沖液∶牛乳的體積比是0.5∶0.5∶1，牛乳的固體成分是含有脂肪酶的水溶液的固體成分質(zhì)量的1.03倍的量。
實(shí)施例4在實(shí)施例1中得到的脂肪酶濃縮液中添加與濃縮液等量的pH8的0.01M磷酸緩沖液，得到含有脂肪酶的水溶液4(脂肪酶濃縮液∶緩沖液的體積比是1∶1)。相對于20ml該含有脂肪酶的水溶液4，添加10ml的牛乳(小巖井乳業(yè)(株)公司制造的小巖井牛乳おいしさしたて固體成分濃度12.9質(zhì)量％)。使用氫氧化鈉水溶液將由此獲得的溶液調(diào)節(jié)到pH6.8～6.9。
脂肪酶濃縮液∶磷酸緩沖液∶牛乳的體積比是0.5∶0.5∶0.5，牛乳的固體成分是含有脂肪酶的水溶液的固體成分質(zhì)量的0.52倍的量。
下面，與實(shí)施例1相同地操作，得到脂肪酶粉末。
實(shí)施例5
在實(shí)施例1中得到的脂肪酶濃縮液中添加與濃縮液等量的pH 8的0.01M磷酸緩沖液，得到含有脂肪酶的水溶液5(脂肪酶濃縮液∶緩沖液的體積比是1∶1)。相對于20ml該含有脂肪酶的水溶液5，添加2ml的鮮奶油(商品名稱北海道純正奶油35，高梨乳業(yè)(株)制造，固體成分濃度43質(zhì)量％)。使用氫氧化鈉水溶液將由此獲得的溶液調(diào)節(jié)到pH 6.8～6.9。
脂肪酶濃縮液∶磷酸緩沖液∶鮮奶油的體積比是0.5∶0.5∶0.1，鮮奶油的固體成分是含有脂肪酶的水溶液的固體成分質(zhì)量的0.34倍的量。
下面，與實(shí)施例1相同地操作，得到脂肪酶粉末。
實(shí)施例6在實(shí)施例1中得到的脂肪酶濃縮液中添加與濃縮液等量的pH8的0.01M磷酸緩沖液，得到含有脂肪酶的水溶液6(脂肪酶濃縮液∶緩沖液的體積比是1∶1)。相對于20ml該含有脂肪酶的水溶液6，添加20ml的澤西牛乳(Jersey cow milk)(阿蘇小國ジヤ一ジ一4.5牛乳阿蘇農(nóng)業(yè)共同組合制造，固體成分濃度13.2質(zhì)量％)。使用氫氧化鈉水溶液將由此獲得的溶液調(diào)節(jié)到pH 6.8～6.9。
脂肪酶濃縮液∶磷酸緩沖液∶牛乳的體積比是0.5∶0.5∶1，牛乳的固體成分是含有脂肪酶的水溶液的固體成分質(zhì)量的1.06倍的量。下面，與實(shí)施例1相同地操作，得到脂肪酶粉末。
實(shí)施例7除了作為粉末化的方法進(jìn)行冷凍干燥來代替噴霧干燥之外，與實(shí)施例1相同地操作而得到脂肪酶粉末。冷凍干燥如下進(jìn)行將調(diào)節(jié)到pH6.8～6.9的含有脂肪酶的水溶液加入回收燒瓶中，用干冰甲醇凍結(jié)，然后用東京理化器械(株)公司制造的冷凍干燥器(FDU-830)，在0.15托(Torr)下冷凍干燥1～2天。干燥后，用研缽輕輕粉碎，得到脂肪酶粉末。
比較例1除了不添加牛乳之外，與實(shí)施例3相同地操作，得到脂肪酶粉末。脂肪酶濃縮液∶磷酸緩沖液的體積比是1∶1。
按照如下方法測定由此獲得的脂肪酶粉末的脂肪酶活性。結(jié)果示于表-1中。
脂肪酶活性在以1∶1(w)的比例混合三油酸甘油酯與三辛酸甘油酯而成的油中加入粉末脂肪酶，在60℃下進(jìn)行反應(yīng)。隨時(shí)間取樣10μl，用1.5ml己烷稀釋后，過濾掉粉末脂肪酶得到的溶液作為氣相色譜分析的樣品。通過氣相色譜(柱DB-1ht)分析并按照下式求得反應(yīng)速率。氣相色譜條件是，柱溫初期150℃，升溫15℃/min，最終370℃，除此之外的條件與后述的1，3-選擇性試驗(yàn)中的相同。
反應(yīng)速率(％)＝{C34area/(C24area+C34area)}×100式中，C24代表三辛酸甘油酯，C34代表三辛酸甘油酯的一個(gè)脂肪酸被C18取代了的物質(zhì)，area是它們的峰面積。
根據(jù)各時(shí)間下的反應(yīng)速率，利用分析軟件(Origin ver.6.1)求得反應(yīng)速率常數(shù)K值。脂肪酶活性以比較例1的K值設(shè)為100時(shí)的相對活性來表示。
表-1

表中，bf(7)代表pH 7的0.01M磷酸緩沖液，bf(8)代表pH8的0.01M磷酸緩沖液。另外，除了實(shí)施例7之外，進(jìn)行噴霧干燥。
由表-1的結(jié)果可知，根據(jù)本發(fā)明，脂肪酶的酶活性顯著提高。
接下來，采用下面的方法測定實(shí)施例1、實(shí)施例7及比較例1的脂肪酶粉末的1，3-選擇性。
1，3-選擇性的測定方法使用1摩爾的1，3-二棕櫚酸-2-油酸-甘油酯(Gryceryl-1，3-Palmitate-2-Oleate(POP))和3摩爾的辛酸乙酯(C8Et)作為反應(yīng)底物，添加脂肪酶粉末使其根據(jù)酶活性成為底物的0.5～5w％，在60℃下進(jìn)行反應(yīng)，隨時(shí)間抽樣，并用己烷稀釋。對該樣品進(jìn)行GC分析，并按照下式求得1·3位(C16:0Et)和2位(C18:1Et)的反應(yīng)速率。
C16:0Et(％)＝{C16:0Et area/(C16Et+C18:1Et area+C8Et area)}×100C18:1Et(％)＝{C18:1Et area/(C16Et+C18:1Et area+C8Et area)}×100根據(jù)各時(shí)間下的各反應(yīng)速率，利用分析軟件(Origin ver.6.1)求得反應(yīng)速率常數(shù)K。此時(shí)，最終反應(yīng)速率的值是可變的。求出以2位的反應(yīng)性設(shè)為1時(shí)的1，3位的反應(yīng)性。
<GC條件>
柱DB-1ht 5m注入量1μl載體氣氦氣汽化室溫度360℃檢測器溫度370℃柱溫初期50℃，升溫15℃/min，最終370℃結(jié)果示于表-2中。
表-2

由表-2的結(jié)果可知，根據(jù)本發(fā)明，1，3-特異性脂肪酶的1，3-選擇性顯著提高。
接下來，采用下面的方法測定實(shí)施例1和比較例1中得到的各脂肪酶粉末的穩(wěn)定性。
穩(wěn)定性測定方法5g三辛酸甘油酯和5g三油酸甘油酯在60℃下反應(yīng)24小時(shí)～72小時(shí)，將各批次的初期活性的降低程度進(jìn)行繪圖，并由總反應(yīng)時(shí)間和活性的降低稱度計(jì)算出半衰期。
其結(jié)果，實(shí)施例1中得到的脂肪酶粉末的半衰期是913小時(shí)，比較例1中得到的脂肪酶粉末的半衰期是234小時(shí)，因此，可知根據(jù)本發(fā)明的脂肪酶粉末，穩(wěn)定性提高2倍或2倍以上。
實(shí)施例8將名糖產(chǎn)業(yè)公司制造的粉末脂肪酶(商品名稱脂肪酶QL，得自產(chǎn)堿桿菌屬)懸浮于水中，得到含有脂肪酶的水溶液(固體成分濃度2.0質(zhì)量％)。相對于20ml該含有脂肪酶的水溶液，添加2ml牛乳(小巖井乳業(yè)(株)公司制造的小巖井牛乳おいしさしたて固體成分濃度12.9質(zhì)量％)。含有脂肪酶的水溶液∶牛乳的體積比是10∶1，牛乳的固體成分是含有脂肪酶的水溶液的固體成分質(zhì)量的0.65倍的量。使用氫氧化鈉水溶液將由此獲得的溶液調(diào)節(jié)到pH 6.8～6.9。
使用噴霧干燥器(SD-1000型東京理化器械(株)公司制造)，在噴出口溫度130℃、干燥空氣量0.7～1.1m3/min、噴霧壓力11～12Kpa的條件下對該溶液進(jìn)行噴霧，得到脂肪酶粉末。脂肪酶粉末顆粒的形狀為球狀，脂肪酶粉末的90質(zhì)量％或90質(zhì)量％以上，其粒徑在1～100μm的范圍內(nèi)，平均粒徑為35μm。粒徑是使用HORIBA公司的粒度分布測定裝置(LA-500)測定的。
比較例2除了未添加牛乳之外，與實(shí)施例8相同地操作，通過噴霧干燥得到脂肪酶粉末。
測定這些脂肪酶粉末的脂肪酶活性，以比較例1的脂肪酶粉末的活性設(shè)為1時(shí)的相對值來表示。將總結(jié)結(jié)果示于表-3中。
表-3

由表-3的結(jié)果可知，根據(jù)本發(fā)明，脂肪酶活性提高約2倍。
實(shí)施例9在實(shí)施例1中得到的脂肪酶粉末中加入5倍量的菜籽油，使脂肪酶粉末含浸于菜籽油中，過濾除去過量的油脂，制得脂肪酶粉末/菜籽油的質(zhì)量％為55/45的脂肪酶組合物。
比較例3將天野エンザイム(株)公司制造的得自米根霉(Rhizopusoryzae)的粉末(冷凍干燥)脂肪酶(脂肪酶D“アマノ”)以5質(zhì)量％的濃度再懸浮于水中，使用噴霧干燥器(SD-1000型東京理科器械(株)公司制造)，在入口溫度130℃、干燥空氣量0.7～1.1m3/min、噴霧壓力11～12Kpa的條件下進(jìn)行噴霧，得到脂肪酶粉末。
實(shí)施例10將與比較例3相同的粉末(冷凍干燥)脂肪酶(脂肪酶D“アマノ”)以5質(zhì)量％的濃度再懸浮于水中，相對于5ml該脂肪酶溶液，添加10ml牛乳(明治乳業(yè)(株)公司制造的明治おいしい牛乳固體成分濃度12.9質(zhì)量％)。使用噴霧干燥器(SD-1000型東京理科器械(株)公司制造)，在入口溫度130℃、干燥空氣量0.7～1.1m3/min、噴霧壓力11～12Kpa的條件下進(jìn)行噴霧，得到脂肪酶粉末。
實(shí)施例11將與比較例3相同的粉末(冷凍干燥)脂肪酶(脂肪酶D“アマノ”)以5質(zhì)量％的濃度再懸浮于水中，相對于5ml該脂肪酶溶液，添加10ml牛乳(明治乳業(yè)(株)公司制造的明治おいしい牛乳固體成分濃度12.9質(zhì)量％)。將該脂肪酶溶液慢慢添加到150ml預(yù)先冷卻到0℃以下的乙醇中，得到沉淀物。用離心分離機(jī)(ベツクマン公司制造GS-6KR)，在3000rpm、10分鐘的條件下，回收所得的沉淀物，然后用干燥機(jī)(東京理科器械(株)公司制造FDU-830)減壓干燥16～20小時(shí)，得到脂肪酶粉末。
測定這些脂肪酶粉末的活性，以比較例3的脂肪酶粉末的活性設(shè)為100時(shí)的相對值來表示?？偨Y(jié)結(jié)果示于表-4中。
表-4

由表-4的結(jié)果可知，根據(jù)本發(fā)明，脂肪酶活性顯著提高。
比較例4將天野エンザイム(株)公司制造的得自米根霉(Rhizopusoryzae)的粉末脂肪酶(脂肪酶F-AP 15)以15質(zhì)量％的濃度再懸浮于水中，使用噴霧干燥器(SD-1000型東京理科器械(株)公司制造)，在入口溫度130℃、干燥空氣量0.7～1.1m3/min、噴霧壓力11～12Kpa的條件下進(jìn)行噴霧，得到脂肪酶粉末。
實(shí)施例12將與比較例4相同的粉末脂肪酶(脂肪酶F-AP15)以15質(zhì)量％的濃度再懸浮于水中，相對于10ml該脂肪酶溶液，添加10ml牛乳(明治乳業(yè)(株)公司制造的明治おいしい牛乳固體成分濃度12.9質(zhì)量％)。使用噴霧干燥器(SD-1000型東京理科器械(株)公司制造)，在入口溫度130℃、干燥空氣量0.7～1.1m3/min、噴霧壓力11～12Kpa的條件下進(jìn)行噴霧，得到脂肪酶粉末。
測定這些脂肪酶粉末的活性，以比較例4的脂肪酶粉末的活性設(shè)為100時(shí)的相對值來表示?？偨Y(jié)結(jié)果示于表-5中。
表-5

由表-5的結(jié)果可知，根據(jù)本發(fā)明，脂肪酶活性顯著提高。
比較例5使用噴霧干燥器(SD-1000型東京理科器械(株)公司制造)，在入口溫度130℃、干燥空氣量0.7～1.1m3/min、噴霧壓力11～12Kpa的條件下，對ノボザイムズジヤパン(株)公司制造的得自棉狀嗜熱絲孢菌(Thermomyces lanuginosus)的液體脂肪酶(商品名稱Lipozyme T1 100L)進(jìn)行噴霧，得到脂肪酶粉末。
實(shí)施例13相對于1ml的與比較例5相同的液體脂肪酶(商品名稱Lipozyme T1 100L)，添加10ml牛乳(明治乳業(yè)(株)公司制造的明治おいしい牛乳固體成分濃度12.9質(zhì)量％)。使用噴霧干燥器(SD-1000型東京理科器械(株)公司制造)，在入口溫度130℃、干燥空氣量0.7～1.1m3/min、噴霧壓力11～12Kpa的條件下，將該脂肪酶溶液進(jìn)行噴霧，得到脂肪酶粉末。
比較例6使用10ml的與比較例5相同的液體脂肪酶(商品名稱Lipozyme T1 100L)，慢慢添加到60ml預(yù)先冷卻到0℃以下的乙醇中，得到沉淀物。用離心分離機(jī)(ベツクマン公司制造GS-6KR)，在3000rpm、3分鐘的條件下，回收所得沉淀物，然后用干燥機(jī)(東京理科器械(株)公司制造FDU-830)減壓干燥16～18小時(shí)，得到脂肪酶粉末。
實(shí)施例14相對于1ml的與比較例5相同的液體脂肪酶(商品名稱Lipozyme T1 100L)，添加10ml牛乳(明治乳業(yè)(株)公司制造的明治おいしい牛乳固體成分濃度12.9質(zhì)量％)。將該脂肪酶溶液慢慢添加到60ml預(yù)先冷卻到0℃以下的乙醇中，得到沉淀物。用離心分離機(jī)(ベツクマン公司制造GS-6KR)，在3000rpm、3分鐘的條件下，回收所得沉淀物，然后用干燥機(jī)(東京理科器械(株)公司制造FDU-830)減壓干燥16～20小時(shí)，得到脂肪酶粉末。
測定這些脂肪酶粉末的活性，以比較例5的脂肪酶粉末活性設(shè)為100時(shí)的相對值來表示?？偨Y(jié)結(jié)果示于表-6中。
表-6

由表-6的結(jié)果可知，根據(jù)本發(fā)明，脂肪酶活性顯著提高。
權(quán)利要求
1.一種脂肪酶粉末，其特征在于，該脂肪酶粉末是含有脂肪酶、和動物乳的固體成分的造粒物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脂肪酶粉末，所述脂肪酶是1，3-特異性脂肪酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的脂肪酶粉末，所述1，3-特異性脂肪酶是得自根毛霉菌屬或產(chǎn)堿桿菌屬的脂肪酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的脂肪酶粉末，所述1，3-特異性脂肪酶是得自根霉屬和嗜熱真菌屬的1，3-特異性脂肪酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的脂肪酶粉末，所述1，3-特異性脂肪酶是得自米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)的1，3-特異性脂肪酶。
6.根據(jù)權(quán)利要求1～5中任一項(xiàng)所述的脂肪酶粉末，所述動物乳的固體成分是牛乳的固體成分或得自牛乳的奶油的固體成分。
7.根據(jù)權(quán)利要求1～6中任一項(xiàng)所述的脂肪酶粉末，該脂肪酶粉末的水分含量為10質(zhì)量％或10質(zhì)量％以下。
8.根據(jù)權(quán)利要求1～7中任一項(xiàng)所述的脂肪酶粉末，該脂肪酶粉末通過將動物乳或得自動物乳的奶油添加到含有脂肪酶的水溶液中，進(jìn)行噴霧干燥、冷凍干燥或溶劑沉淀而獲得。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的脂肪酶粉末，在添加動物乳或得自動物乳的奶油之后，含有脂肪酶的水溶液的pH被調(diào)節(jié)到6～7.5。
10.根據(jù)權(quán)利要求1～9中任一項(xiàng)所述的脂肪酶粉末，所述脂肪酶粉末的90質(zhì)量％或90質(zhì)量％以上，其粒徑為1～100μm。
11.一種脂肪酶組合物，該脂肪酶組合物在油脂中浸漬或浸潤有權(quán)利要求1～10中任一項(xiàng)所述的脂肪酶粉末。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的脂肪酶組合物，前述脂肪酶組合物中的油脂的質(zhì)量，相對于脂肪酶粉末是0.1～20倍。
13.一種脂肪酶粉末的制備方法，其特征在于，將動物乳或得自動物乳的奶油添加到含有脂肪酶的水溶液中，進(jìn)行噴霧干燥、冷凍干燥或溶劑沉淀。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的制備方法，所添加的動物乳或得自動物乳的奶油，以其固體成分計(jì)，是含有脂肪酶的水溶液中固體成分質(zhì)量的0.1～20倍量。
15.根據(jù)權(quán)利要求13或14所述的制備方法，在添加動物乳或得自動物乳的奶油之后，將含有脂肪酶的水溶液的pH調(diào)節(jié)到6～7.5。
16.根據(jù)權(quán)利要求13～15中任一項(xiàng)所述的制備方法，所述含有脂肪酶的水溶液是除去菌體的脂肪酶培養(yǎng)液或其精制培養(yǎng)液。
17.根據(jù)權(quán)利要求13～16中任一項(xiàng)所述的制備方法，所述脂肪酶是得自根毛霉菌屬或產(chǎn)堿桿菌屬的脂肪酶。
18.一種酯交換用或酯化用脂肪酶，其含有權(quán)利要求1～10中任一項(xiàng)所述的脂肪酶粉末。
19.一種油脂的酯交換方法，其特征在于，使用權(quán)利要求18所述的酯交換用脂肪酶。
全文摘要
提供一種脂肪酶粉末，該脂肪酶粉末是含有脂肪酶、和動物乳的固體成分的造粒物；一種脂肪酶組合物，在油脂中浸漬或浸潤有該脂肪酶粉末；以及一種脂肪酶粉末的制備方法，該方法包括將動物乳或得自動物乳的奶油添加到含有脂肪酶的水溶液中，進(jìn)行噴霧干燥、冷凍干燥或溶劑沉淀。根據(jù)本發(fā)明可以提供脂肪酶活性和穩(wěn)定性提高了的脂肪酶粉末。
文檔編號C12P7/64GK1806043SQ20058000054
公開日2006年7月19日 申請日期2005年4月8日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月8日
發(fā)明者鈴木順子, 根岸聰, 新井有里, 櫻井智香 申請人:日清奧利友集團(tuán)株式會社