專利名稱：使用具有升高的烯醇化酶活性的重組腸桿菌制備l－蘇氨酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使用腸桿菌科的重組微生物制備L-氨基酸、特別是L-蘇氨酸的方法，所用菌株中eno基因是增強(qiáng)的，特別是過表達(dá)的，本發(fā)明還涉及這些微生物。
背景技術(shù)：
L-氨基酸，特別是L-蘇氨酸，被用于人用藥及制藥工業(yè)，被用于食品業(yè)，特別被用于動(dòng)物營養(yǎng)。
已知L-氨基酸是通過腸桿菌科菌株，特別是大腸桿菌(Escherichia coli(E.coli)和粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens)的發(fā)酵而生產(chǎn)的。由于L-氨基酸的極其重要性，人們一直在進(jìn)行改良生產(chǎn)方法的嘗試。生產(chǎn)方法的改良可涉及發(fā)酵措施如攪拌和供氧，或涉及營養(yǎng)培養(yǎng)基的組成如發(fā)酵期間的糖濃度，或涉及產(chǎn)物形式的逐步發(fā)展(例如通過離子交換層析)，或涉及微生物本身的固有產(chǎn)量性質(zhì)。
為改良這些微生物的產(chǎn)量性質(zhì)，可使用誘變、選擇及突變體選擇等方法。以此方法可獲得抗代謝物例如蘇氨酸類似物α-氨基-β-羥基戊酸(AHV)抗性的菌株，或者對于調(diào)節(jié)重要的代謝物是營養(yǎng)缺陷的并產(chǎn)生L-氨基酸例如L-蘇氨酸的菌株。
近年來，通過擴(kuò)增各個(gè)氨基酸生物合成基因并研究其對生產(chǎn)的作用，重組DNA技術(shù)的方法也已經(jīng)用于改良生產(chǎn)L-氨基酸的腸桿菌科菌株。關(guān)于大腸桿菌和沙門氏菌的細(xì)胞和分子生物學(xué)的概括信息見于Neidhardt(ed)E.coil and Salmonella，Cellular and MolecularBiology，2nd Edition，ASM Press，Washington，D.C.，USA(1996)。
發(fā)明目的本發(fā)明的目的是提供新的措施以改良L-氨基酸，特別是L-蘇氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了腸桿菌科的重組微生物，所述微生物含有增強(qiáng)的或過表達(dá)的編碼烯醇化酶的eno基因或其等位基因，并以改良的方式生產(chǎn)L-氨基酸，特別是L-蘇氨酸。
在所有情況中，進(jìn)行對比的出發(fā)點(diǎn)是對于eno基因未重組的及含有未增強(qiáng)的eno基因的微生物。
這些微生物特別包括腸桿菌科的微生物，其中編碼一種多肽的多核苷酸是增強(qiáng)的，所述多肽的氨基酸序列與選自由SEQ ID No4、SEQID No6和SEQ ID No8組成的一組的氨基酸序列至少90％，特別是至少95％，優(yōu)選至少98％或者至少99％，特別優(yōu)選99.7％，非常優(yōu)選100％相同。
優(yōu)選與SEQ ID No4、SEQ ID No6或SEQ ID No8的序列相同的氨基酸序列。
所述微生物含有增強(qiáng)的或過表達(dá)的選自如下一組的多核苷酸a)具有SEQ ID No3、SEQ ID No5或SEQ ID No7所示核苷酸序列的多核苷酸；b)具有在遺傳密碼簡并范圍內(nèi)相應(yīng)于SEQ ID No3、SEQ ID No5或SEQ ID No7的核苷酸序列的多核苷酸；c)具有在嚴(yán)格條件下與互補(bǔ)于SEQ ID No3、SEQ ID No5或SEQID No7的序列雜交的序列的多核苷酸序列；d)具有含有中性功能有義突變體(neutral-function sense mutant)的SEQ ID No3、SEQ ID No5或SEQ ID No7序列的多核苷酸；
其中所述多核苷酸編碼烯醇化酶。
本發(fā)明還提供了一種使用腸桿菌科的重組微生物經(jīng)發(fā)酵生產(chǎn)L-氨基酸，特別是L-蘇氨酸的方法，所述微生物特別已經(jīng)生產(chǎn)L-氨基酸并且其中至少eno基因或者編碼其基因產(chǎn)物的核苷酸序列是增強(qiáng)的。
發(fā)明詳述優(yōu)選應(yīng)用所描述的微生物。
當(dāng)下文提及L-氨基酸或氨基酸時(shí)，是指選自如下一組的一或多種氨基酸，包括其鹽L-天冬酰胺，L-蘇氨酸，L-絲氨酸，L-谷氨酸，L-甘氨酸，L-丙氨酸，L-半胱氨酸，L-纈氨酸，L-甲硫氨酸，L-脯氨酸，L-異亮氨酸，L-亮氨酸，L-酪氨酸，L-苯丙氨酸，L-組氨酸，L-賴氨酸，L-色氨酸，L-精氨酸和L-高絲氨酸。特別優(yōu)選L-蘇氨酸。
文中術(shù)語“增強(qiáng)”描述了微生物中由相應(yīng)的DNA編碼的一或多種酶或蛋白質(zhì)的胞內(nèi)活性或濃度增加，例如通過使基因的拷貝數(shù)增加至少1個(gè)、將強(qiáng)力啟動(dòng)子與所述基因功能上連接或者使用編碼具有高活性的相應(yīng)酶或蛋白質(zhì)的基因或等位基因進(jìn)行，并且任選地組合這些措施。
等位基因一般是指特定基因的另一種形式，所述形式通過核苷酸序列中的差異加以區(qū)別。
由核苷酸序列即ORF、基因或等位基因編碼的蛋白質(zhì)，或者編碼的核糖核酸一般稱作基因產(chǎn)物。
通過增強(qiáng)措施，相應(yīng)蛋白質(zhì)的活性或濃度基于野生型蛋白質(zhì)的活性或濃度或者基于相應(yīng)的酶或蛋白質(zhì)未重組的微生物或親代菌株中所述蛋白質(zhì)的活性或濃度一般增加至少10％、25％、50％、75％、100％、150％、200％、300％、400％或500％，直至最大1000％或2000％。未重組的微生物或親代菌株是指對其未實(shí)施本發(fā)明的措施的微生物。
本發(fā)明還提供了通過發(fā)酵腸桿菌科的重組微生物制備L-氨基酸的方法，特征在于a)將產(chǎn)生所需的L-氨基酸的腸桿菌科的微生物在適于eno基因產(chǎn)物形成的條件下在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并且所述微生物中eno基因或其等位基因是增強(qiáng)的，特別是過表達(dá)的；b)濃縮培養(yǎng)基或者所述微生物細(xì)胞中所需的L-氨基酸；c)分離所需的L-氨基酸，發(fā)酵肉湯中的組分和/或其生物量的全部或部分(≥0-100％)任選地保留在已經(jīng)分離的產(chǎn)物中或被完全移走。
本發(fā)明還提供了具有增強(qiáng)的eno基因的微生物，特別是重組微生物，其可以從葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、糖蜜、任選淀粉、任選纖維素或者從甘油和乙醇中生產(chǎn)L-氨基酸。它們是選自埃希氏菌屬、歐文氏菌屬(Erwinia)、普羅威登斯菌屬(Providencia)和沙雷氏菌屬的腸桿菌科代表性菌株。優(yōu)選埃希氏菌屬和沙雷氏菌屬。提及的是埃希氏菌屬，特別是大腸桿菌菌種，及沙雷氏菌屬，特別是粘質(zhì)沙雷氏菌菌種。
重組微生物一般是通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)或接合或者這些方法的組合，使用含有所需的基因、這種基因的等位基因或其一部分和/或增強(qiáng)該基因表達(dá)的啟動(dòng)子的載體而產(chǎn)生。這種啟動(dòng)子可以是通過所述基因上游的內(nèi)源調(diào)節(jié)序列增強(qiáng)突變產(chǎn)生的啟動(dòng)子，或者與該基因融合的有效啟動(dòng)子。
特別生產(chǎn)L-蘇氨酸的埃希氏菌屬菌株，特別是大腸桿菌菌種的合適菌株例如是-大腸桿菌H4581(EP 0 301 572)-大腸桿菌KY10935(Bioscience Biotechnology and Biochemistry61(11)1877-1882(1997)-大腸桿菌VNIIgenetika MG442(US-A-4278,765)
-大腸桿菌VNIIgenetika M1(US-A-4,321,325)-大腸桿菌VNIIgenetika 472T23(US-A-5,631,157)-大腸桿菌BKIIM B-3996(US-A-5,175,107)-大腸桿菌kat 13(WO 98/04715)-大腸桿菌KCCM-10132(WO 00/09660)生產(chǎn)L-蘇氨酸的沙雷氏菌屬菌株，特別是粘質(zhì)沙雷氏菌菌種的合適菌株例如是-粘質(zhì)沙雷氏菌HNr21(Applied and EnvironmentalMicrobiology 38(6)1045-1051(1979))-粘質(zhì)沙雷氏菌TLr156(Gene 57(2-3)151-158(1987))-粘質(zhì)沙雷氏菌T-2000(Applied Biochemistry andBiotechnology 37(3)255-265(1992))。
腸桿菌科生產(chǎn)L-蘇氨酸的菌株優(yōu)選具有選自如下一組的一或多種遺傳或表型特征α-氨基-β-羥基戊酸抗性、硫代賴氨酸(thialysine)抗性、乙硫氨酸抗性、α-甲基絲氨酸抗性、二氨基琥珀酸抗性、α-氨基丁酸抗性、疏螺旋體素抗性、環(huán)戊烷-羧酸抗性、利福平抗性、纈氨酸類似物例如纈氨酸氧肟酸抗性、嘌呤類似物例如6-二甲基氨基嘌呤抗性、需要L-甲硫氨酸、任選地不完全及可補(bǔ)償?shù)匦枰狶-異亮氨酸、需要內(nèi)消旋二氨基庚二酸、含有蘇氨酸的二肽營養(yǎng)缺陷、L-蘇氨酸抗性、蘇氨酸萃余物抗性、L-高絲氨酸抗性、L-賴氨酸抗性、L-甲硫氨酸抗性、L-谷氨酸抗性、L-天冬氨酸抗性、L-亮氨酸抗性、L-苯丙氨酸抗性、L-絲氨酸抗性、L-半胱氨酸抗性、L-纈氨酸抗性、氟丙酮酸敏感性、缺陷的蘇氨酸脫氫酶、任選地蔗糖利用能力、蘇氨酸操縱子的增強(qiáng)、高絲氨酸脫氫酶I-天冬氨酸激酶I的增強(qiáng)、優(yōu)選地反饋抗性形式、高絲氨酸激酶的增強(qiáng)、蘇氨酸合酶的增強(qiáng)、天冬氨酸激酶的增強(qiáng)、任選地反饋抗性形式、天冬氨酸半醛脫氫酶的增強(qiáng)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的增強(qiáng)、任選地反饋抗性形式、磷酸烯醇丙酮酸合酶的增強(qiáng)、轉(zhuǎn)氫酶的增強(qiáng)、RhtB基因產(chǎn)物的增強(qiáng)、RhtC基因產(chǎn)物的增強(qiáng)、YfiK基因產(chǎn)物的增強(qiáng)、丙酮酸羧化酶的增強(qiáng)、及乙酸形成的弱化。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在eno基因或其等位基因增強(qiáng)，特別是過表達(dá)后，腸桿菌科的微生物以改良的方式生產(chǎn)L-氨基酸，特別是L-蘇氨酸。
大腸桿菌基因的核苷酸序列屬于現(xiàn)有技術(shù)范疇(見下文參考)，也可見于Blattner等公布的大腸桿菌基因組序列(Science 2771453-1462(1997))。已知宿主內(nèi)源的酶(甲硫氨酸氨肽酶)可以分裂掉N末端的甲硫氨酸。
同樣從也屬于腸桿菌科的弗氏志賀氏菌(Shigella flexneri)和鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)中eno基因的核苷酸序列也是已知的。
通過但非限于如下數(shù)據(jù)描述eno基因描述烯醇化酶，磷酸丙酮酸水合酶功能烯醇化(分裂掉水)在糖酵解中使2-磷酸甘油酸成為磷酸烯醇丙酮酸EC No. EC 4.2.1.11參考文獻(xiàn)Spring TG.和Wold F.；The Journal of BiologicalChemistry 246(22)6797-6802(1971)Klein et al.；DNA Sequence 6(6)351-355(1996)Gulick et al.；Biochemistry 40(51)15716-15724(2001)Kaga et al.；Bioscience，Biotechnology andBiochemistry 66(10)2216-2220(2002)登記號 AE000361
在如下參考及其他參考中描述了鼠傷寒沙門氏菌的eno基因Garrido-Pertierra A.；Revista Espanola de Fisiologia 36(1)33-39(1980)。
核苷酸序列可見于National Library of Medicine(Bethesda，MD，USA)的National Center for Biotechnology Information(NCBI)的數(shù)據(jù)庫；European Molecular Biologies Laboratories(EMBL，Heidelberg，Germany or Cambridge，UK)的核苷酸序列數(shù)據(jù)庫或者日本的DNA數(shù)據(jù)庫(DDBJ，Mishima，Japan)。
為了更加清楚，大腸桿菌eno基因的已知核苷酸序列示于SEQ IDNo3，弗氏志賀氏菌(AE015293)和鼠傷寒沙門氏菌(AE008835)的eno基因的已知序列示于SEQ ID No5或SEQ ID No7。由這些讀框編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列示作SEQ ID No4、SEQ ID No6或SEQ IDNo8。
根據(jù)本發(fā)明可以使用正文參考中所描述的基因。也可以使用得自遺傳密碼簡并或者由于中性功能的“有義突變”所致的基因的等位基因。優(yōu)選使用內(nèi)源基因。
“內(nèi)源基因”或者“內(nèi)源核苷酸序列”是指一個(gè)物種種群中存在的基因或等位基因或核苷酸序列。
Eno基因的含有中性功能有義突變的合適等位基因包括但不限于導(dǎo)致其編碼的蛋白質(zhì)中有至多50個(gè)、或者至多40個(gè)、或者至多30個(gè)、或者至多20個(gè)、優(yōu)選至多10或至多5個(gè)、特別優(yōu)選至多3個(gè)、或者至多2個(gè)或者至少1個(gè)保守氨基酸置換。
在芳香族氨基酸的情況中，保守置換是指苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸的彼此互換。在疏水性氨基酸的情況中，保守置換是指亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸的彼此互換。在極性氨基酸的情況中，保守置換是指谷氨酰胺和天冬酰胺的彼此互換。在堿性氨基酸的情況中，保守置換是指精氨酸、賴氨酸和組氨酸的彼此互換。在酸性氨基酸的情況中，保守置換是指天冬氨酸和谷氨酸的彼此互換。在含有羥基基團(tuán)的氨基酸的情況中，保守置換是指絲氨酸和蘇氨酸的彼此互換。所有其它氨基酸置換均稱作非保守氨基酸置換。
同樣，可以使用編碼所述蛋白質(zhì)的變體的那些核苷酸序列，其另外在N或C末端延長或縮短至少1個(gè)氨基酸。這種延長或縮短不超過50，40，30，20，10，5，3或2個(gè)氨基酸或者氨基酸基團(tuán)。
合適的等位基因還包括編碼其中插入(插入)或除去(缺失)至少一個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)的那些基因。這種稱作插入/缺失(indel)的改變的最大數(shù)目可涉及2，3，5，10，20但在任何情況下不超過30個(gè)氨基酸。
合適的等位基因進(jìn)一步包括通過雜交，特別是在嚴(yán)格條件下雜交可獲得的那些等位基因，所述雜交使用SEQ ID No3、SEQ ID No5或SEQ ID No7或其一部分，特別是編碼區(qū)或與其互補(bǔ)的序列進(jìn)行。
通過雜交方式鑒別DNA序列的指導(dǎo)可見于例如但不限于Boehringer Mannheim GmbH的手冊“The DIG System Users Guide forFilter Hybridization”(Mannheim，Germany，1993)及Liebl et al.(International Journal of Systematic Bacteriology 41255-260(1991))所述。雜交在嚴(yán)格條件下發(fā)生，也就是說只有其中探針和靶序列(即用探針處理的多核苷酸)至少80％相同的雜交體形成。已知雜交的嚴(yán)格性，包括洗滌步驟，是通過改變緩沖液組分、溫度和鹽濃度而影響或決定的。雜交反應(yīng)通常在與洗滌步驟相比相對低的嚴(yán)格條件下進(jìn)行(Hybaid Hybridisation Guide，Hybaid Limited，Teddington，UK，1996)。
可以在大約50℃-68℃應(yīng)用相應(yīng)于5×SSC緩沖液的緩沖液進(jìn)行雜交反應(yīng)。探針也可以和與其序列低于80％相同性的多核苷酸雜交。這種雜交體較不穩(wěn)定，在嚴(yán)格條件下通過洗滌除去。這可以例如通過使鹽濃度降低至2×SSC及任選地隨后為0.5×SSC(The DIGSystem User′s Guide for Filter Hybridisation，Boehringer Mannheim，Mannheim，Germany，1995)，溫度為大約50℃-68℃，大約52℃-68℃，大約54℃-68℃，大約56℃-68℃，大約58℃-68℃，大約60℃-68℃，大約62-68℃，大約64℃-68℃，大約66℃-68℃而實(shí)現(xiàn)。優(yōu)選大約64℃-68℃或者大約66℃-68℃的溫度范圍。任選地可以使鹽濃度降低至相應(yīng)于0.2×SSC或0.1×SSC。與所應(yīng)用的探針的序列或者與SEQ ID No3、SEQ ID No5或SEQ ID No7所示核苷酸序列例如至少80％或者至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或者至少99％相同的多核苷酸片段可以通過使雜交溫度從50℃逐步(每步大約1-2℃)升高至68℃而分離。關(guān)于雜交的進(jìn)一步指導(dǎo)可以所謂的試劑盒形式商購(例如DIG Easy Hyb，得自Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，Germany，Catalogue No.1603558)。以這種方式獲得的核苷酸序列編碼與SEQ ID No4、SEQ IDNo6或SEQ ID No8所示氨基酸序列至少90％相同，特別優(yōu)選至少95％相同，優(yōu)選至少98％或至少99％相同，特別優(yōu)選至少99.7％相同的多肽。
為實(shí)現(xiàn)增強(qiáng)，例如可以增加所述基因的表達(dá)或者酶蛋白質(zhì)的催化性質(zhì)。這兩種措施可任選地組合。
因此，例如可以增加相應(yīng)基因的拷貝數(shù)，或者可以突變結(jié)構(gòu)基因上游的啟動(dòng)子和調(diào)節(jié)區(qū)或者核糖體接合位點(diǎn)。摻入結(jié)構(gòu)基因上游的表達(dá)盒以同樣方式發(fā)揮作用。通過可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，另外可以在經(jīng)發(fā)酵生產(chǎn)L-蘇氨酸期間增加表達(dá)，另外使用使得隨著時(shí)間發(fā)生另外的基因表達(dá)的用于基因表達(dá)的啟動(dòng)子也是更加有利的。該表達(dá)同樣通過延長m-RNA的壽命而改良。另外，酶活性也通過防止酶蛋白質(zhì)的降解而增加。所述基因或基因構(gòu)建體可以存在于不同數(shù)目拷貝的質(zhì)粒中，或者可以整合進(jìn)染色體中并擴(kuò)增?；蛘?，所述基因的過表達(dá)可另外通過改變培養(yǎng)基的組分和培養(yǎng)程序而實(shí)現(xiàn)。
過表達(dá)的方法在現(xiàn)有技術(shù)領(lǐng)域中充分描述，例如由Makrides et al.(Microbiological Reviews 60(3)，512-538(1996))所描述。通過使用載體，拷貝數(shù)增加至少1個(gè)?？梢允褂玫妮d體是例如US 5,538,873所述的質(zhì)粒。也可以使用的載體是噬菌體，例如EP 0332448所述的噬菌體Mu或者噬菌體lambda(λ)。拷貝數(shù)的增加也可以通過在染色體的另外的位點(diǎn)摻入另外的拷貝而實(shí)現(xiàn)，例如摻入噬菌體λ的att位點(diǎn)中(Yu和Court，Gene 223，77-81(1998))。US 5,939,307揭示了通過摻入表達(dá)盒或者啟動(dòng)子，例如將tac啟動(dòng)子、trp啟動(dòng)子、lpp啟動(dòng)子或者噬菌體λ的PL啟動(dòng)子和PR-啟動(dòng)子摻入例如染色體蘇氨酸操縱子的上游，可以實(shí)現(xiàn)表達(dá)增加。噬菌體T7的啟動(dòng)子、gear-box啟動(dòng)子或者nar啟動(dòng)子可以同樣方式使用。也可以如EP 0 593 792所述的使用這些表達(dá)盒或啟動(dòng)子以過表達(dá)質(zhì)粒結(jié)合的基因。通過使用lacIQ等位基因，可對質(zhì)粒結(jié)合的基因的表達(dá)加以控制(Glascock和Weickert，Gene 223，221-231(1998))。另外，啟動(dòng)子的活性可以通過插入和/或缺失而置換一或多個(gè)核苷酸，從而修飾其序列而增加。隨著時(shí)間的另外的基因表達(dá)可以例如Walker et al.(Journal of Bacteriology 1811269-80(1999))所述，通過使用生長期依賴性fis啟動(dòng)子而實(shí)現(xiàn)。
這方面的全面指導(dǎo)可見于例如但不限于Chang和Cohen(Journalof Bacteriology 1341141-1156(1978))、Hartley和Gregori(Gene 13347-353(1981))、Amann和Brosius(Gene 40183-190(1985))、Broer etal.(Proceedings of the National Academy of Sciences of the UnitedStates of America 8021-25(1983))、LaVallie et al.(BIO/TECHNOLOGY 11187-193(1993))、PCT/US97/13359、Llosa etal.(Plasmid 26222-224(1991))、Quandt和Klipp(Gene 80161-169(1989))、Hamilton et al.(Journal of Bacteriology 1714617-4622(1989))、Jensen和Hammer(Biotechnology and Bioengineering 58191-195(1998))和已知的遺傳學(xué)和分子生物學(xué)教科書。
可以使用在腸桿菌中可復(fù)制的質(zhì)粒載體，例如衍生自pACYC184(Bartoloméet al.；Gene 10275-78(1991))、pTrc99A(Amann et al.；Gene 69301-315(1988))的克隆載體或者pSC101衍生物(Vocke和Bastia；Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80(21)6557-6561(1983))。在本發(fā)明的方法中可以使用用質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化的菌株，其中所述質(zhì)粒載體至少攜帶eno基因或者編碼其基因產(chǎn)物的核苷酸序列或等位基因。
術(shù)語“轉(zhuǎn)化”是指分離的核酸被宿主(微生物)攝取。
也可以通過序列置換(Hamilton et al.；(Journal of Bacteriology1714617-4622(1989))、接合或轉(zhuǎn)導(dǎo)將影響特定基因表達(dá)的突變轉(zhuǎn)移至各種菌株中。
關(guān)于遺傳學(xué)和分子生物學(xué)術(shù)語的更詳細(xì)的解釋見于已知的遺傳學(xué)和分子生物學(xué)教科書，例如Birge(Bacterial and BacteriophageGenetics，4th ed.，Springer Verlag，New York(USA)，2000)或者Berg、Tymoczko和Stryer(Biochemistry，5th ed.，F(xiàn)reeman和Company，New York(USA)，2002)或者Sambrook et al.(MolecularCloning，A Laboratory Manual，(3 volume set)，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor(USA)，2001)。
除了增強(qiáng)eno基因之外，增強(qiáng)已知蘇氨酸生物合成途徑的一或多種酶或者糖回補(bǔ)代謝的酶或者生產(chǎn)還原的煙堿腺嘌呤二核苷酸磷酸的酶或者糖酵解的酶或者PTS酶或者硫代謝的酶，對于使用腸桿菌科的菌株生產(chǎn)L-氨基酸，特別是L-蘇氨酸是有益的。一般優(yōu)選使用內(nèi)源基因。
因此，例如可以同時(shí)增強(qiáng)選自如下一組的一或多個(gè)基因●thrABC操縱子的至少一個(gè)基因，其編碼天冬氨酸激酶、高絲氨酸脫氫酶、高絲氨酸激酶和蘇氨酸合酶(US-A-4,278,765)，●谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)的pyc基因，其編碼丙酮酸羧化酶(WO 99/18228)，
●pps基因，其編碼磷酸烯醇丙酮酸合酶(Molecular and GeneralGenetics 231(2)332-336(1992))，●ppc基因，其編碼磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(WO 02/064808)，●pntA和pntB基因，其編碼嘧啶轉(zhuǎn)氫酶的亞基(European Journal ofBiochemistry 158647-653(1986))，●rhtB基因，其編碼授予高絲氨酸抗性的蛋白質(zhì)(EP-A-0 994 190)，●rhtC基因，其編碼授予蘇氨酸抗性的蛋白質(zhì)(EP-A-1 013 765)，●谷氨酸棒桿菌的thrE基因，其編碼蘇氨酸輸出載體蛋白(WO01/92545)，●gdhA基因，其編碼谷氨酸脫氫酶(Nucleic Acids Research 115257-5266(1983)；Gene 23199-209(1983))，●pgm基因，其編碼葡糖磷酸變位酶(WO 03/004598)，●fba基因，其編碼果糖二磷酸醛縮酶(WO 03/004664)，●ptsHIcrr操縱子的ptsH基因，其編碼磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)PTS的磷酸組氨酸蛋白己糖磷酸轉(zhuǎn)移酶(WO 03/004674)，●ptsHIcrr操縱子的ptsI基因，其編碼磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)PTS的酶I(WO 03/004674)，●ptsHIcrr操縱子的crr基因，其編碼磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)PTS的葡萄糖特異性IIA成分(WO 03/004674)，●ptsG基因，其編碼葡萄糖特異性IIBC成分(WO 03/004670)，●lrp基因，其編碼亮氨酸調(diào)節(jié)子的調(diào)節(jié)物(WO 03/004665)，●fadR基因，其編碼fad調(diào)節(jié)子的調(diào)節(jié)物(WO 03/038106)，●iclR基因，其編碼主要中間代謝(central intermediate metabolism)的調(diào)節(jié)物(WO 03/038106)，●ahpCF操縱子的ahpC基因，其編碼烷基氫過氧化物還原酶的小亞基(WO 03/004663)，
●ahpCF操縱子的ahpF基因，其編碼烷基氫過氧化物還原酶的大亞基(WO 03/004663)，●cysK基因，其編碼半胱氨酸合酶A(WO 03/006666)，●cysB基因，其編碼cys調(diào)節(jié)子的調(diào)節(jié)物(WO 03/006666)，●cysJIH操縱子的cysJ基因，其編碼NADPH亞硫酸還原酶的黃素蛋白(WO 03/006666)，●cysJIH操縱子的cysI基因，其編碼NADPH亞硫酸還原酶的血紅蛋白(WO 03/006666)，●cysJIH操縱子的cysH基因，其編碼腺苷酰硫酸還原酶(WO03/006666)，●rseABC操縱子的rseA基因，其編碼具有抗sigmaE活性的膜蛋白(WO 03/008612)，●rseABC操縱子的rseC基因，其編碼sigmaE因子的全局調(diào)節(jié)物(WO 03/008612)，●sucABCD操縱子的sucA基因，其編碼2-酮戊二酸脫氫酶的脫羧酶亞基(WO 03/008614)，●sucABCD操縱子的sucB基因，其編碼2-酮戊二酸脫氫酶的二氫硫辛酸轉(zhuǎn)琥珀酰酶(dihydrolipoyltranssuccinase)E2亞基(WO03/008614)，●sucABCD操縱子的sucC基因，其編碼琥珀酰-CoA合成酶的β-亞基(WO 03/008615)，●sucABCD操縱子的sucD基因，其編碼琥珀酰-CoA合成酶的α-亞基(WO 03/008615)，●aceE基因，其編碼丙酮酸脫氫酶復(fù)合物的E1成分(WO 03/076635)，●aceF基因，其編碼丙酮酸脫氫酶復(fù)合物的E2成分(WO 03/076635)，●rseB基因，其編碼sigmaE因子活性的調(diào)節(jié)物(MolecularMicrobiology 24(2)355-371(1997))，
●大腸桿菌的開放讀框(ORF)yodA的基因產(chǎn)物(登錄號AE000288，National Center for Biotechnology Information(NCBI，Bethesda，MD，USA)，DE10361192.4)，●大腸桿菌的開放讀框(ORF)yaaU的基因產(chǎn)物(登錄號AE005181，National Center for Biotechnology Information(NCBI，Bethesda，MD，USA)，DE10361268.8)，●malT基因，其編碼麥芽糖調(diào)節(jié)子的陽性轉(zhuǎn)錄激活物(Gene 42201-208(1986)。
除了增強(qiáng)eno基因之外，選自如下一組的一或多個(gè)基因的弱化、特別是消除或者降低其表達(dá)對于L-氨基酸、特別是L-蘇氨酸的生產(chǎn)是有益的●tdh基因，其編碼蘇氨酸脫氫酶(Journal of Bacteriology 1694716-4721(1987))，●mdh基因，其編碼蘋果酸脫氫酶(E.C.1.1.1.37)(Archives inMicrobiology 14936-42(1987))，●大腸桿菌的開放讀框(orf)yjfA的基因產(chǎn)物(登錄號AAC77180，National Center for Biotechnology Information(NCBI，Bethesda，MD，USA)，WO 02/29080))，●大腸桿菌的開放讀框(off)ytfP的基因產(chǎn)物(登錄號AAC77179，National Center for Biotechnology Information(NCBI，Bethesda，MD，USA)，WO 02/29080))，●pckA基因，其編碼磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶(WO 02/29080)，●poxB基因，其編碼丙酮酸氧化酶(WO 02/36797)，●dgsA基因，其編碼磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)的DgsA調(diào)節(jié)物(WO02/081721)，也稱作mlc基因，●fruR基因，其編碼果糖阻抑物(WO 02/081698)，也稱作cra基因，
●rpoS基因，其編碼sigma38因子(WO 01/05939)，也稱作katF基因，●aspA基因，其編碼天冬氨酸銨裂合酶(WO 03/008603)。
文中術(shù)語“弱化”是指降低或消除微生物中由相應(yīng)的DNA編碼的一或多種酶的胞內(nèi)活性或濃度，例如通過使用比在相應(yīng)酶或蛋白質(zhì)未重組的微生物或親代菌株中弱的啟動(dòng)子，或者使用編碼具有低活性的相應(yīng)酶或蛋白質(zhì)的基因或等位基因，或者使相應(yīng)的酶或蛋白質(zhì)或者開放讀框或者基因失活及任選地組合這些措施進(jìn)行。
通過弱化措施，相應(yīng)蛋白質(zhì)的活性或濃度與野生型蛋白質(zhì)的活性或濃度相比，或者與相應(yīng)酶或蛋白質(zhì)未重組的微生物或親代菌株中所述蛋白質(zhì)的活性或濃度相比，一般降低至0-75％，0-50％，0-25％，0-10％或者0-5％。未重組的微生物或親代菌株是指對其未實(shí)施本發(fā)明的措施的微生物。
為實(shí)現(xiàn)弱化，例如可以降低或消除基因或開放讀框的表達(dá)或者酶蛋白的催化性質(zhì)?？扇芜x地組合這兩種措施。
基因表達(dá)的降低可通過合適的培養(yǎng)、通過遺傳修飾(突變)基因表達(dá)的信號結(jié)構(gòu)、或者也可以通過反義RNA技術(shù)而產(chǎn)生。基因表達(dá)的信號結(jié)構(gòu)是例如阻抑物基因、激活物基因、操縱子、啟動(dòng)子、弱化子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、起始密碼子和終止子。這方面的信息可見例如但不限于Jensen和Hammer(Biotechnology and Bioengineering 58191-195(1998))、Carrier和Keasling(Biotechnology Progress 1558-64(1999))、Franch和Gerdes(Current Opinion in Microbiology 3159-164(2000))及已知的遺傳學(xué)和分子生物學(xué)教科書所述，所述教科書例如Knippers(″Molekulare Genetik[Molecular Genetics]″，6th edition，Georg ThiemeVerlag，Stuttgart，Germany，1995)或者Winnacker(″Gene und Klone[Genes and Clones]″，VCH Verlagsgesellschaft，Weinheim，Germany，1990)的教科書。
本領(lǐng)域已知導(dǎo)致酶蛋白催化性質(zhì)改變或降低的突變。例如Qiu和Goodman(Journal of Biological Chemistry 2728611-8617(1997))，Yano et al.(Proceedings of the National Academy of Sciences of theUnited States of America 955511-5515(1998))，Wente和Schachmann(Journal of Biological Chemistry 26620833-20839(1991))所進(jìn)行的研究工作。概括性描述可見于已知的遺傳學(xué)和分子生物學(xué)教科書，例如Hagemann的教科書(″Allgemeine Genetik[General Genetics]″，GustavFischer Verlag，Stuttgart，1986)。
可能的突變是轉(zhuǎn)換、顛換、插入和缺失至少1個(gè)堿基對或核苷酸。根據(jù)突變所致氨基酸置換對酶活性的影響，稱作“錯(cuò)義突變(missensemutation)”或“無義突變(nonsense mutation)”。錯(cuò)義突變導(dǎo)致蛋白質(zhì)中一個(gè)特定的氨基酸置換為另一個(gè)，特別是非保守氨基酸置換。該蛋白質(zhì)的功能性或活性被這種方式削弱，降低至0-75％，0-50％，0-25％，0-10％或者0-5％。無義突變在基因的編碼區(qū)中導(dǎo)致終止密碼子并因此導(dǎo)致翻譯過早中斷。在基因中插入或缺失至少一個(gè)堿基對導(dǎo)致移碼突變，這樣導(dǎo)致?lián)饺氩徽_的氨基酸或者翻譯過早中斷。如果終止密碼子由于突變的結(jié)果在編碼區(qū)內(nèi)形成，這樣也導(dǎo)致翻譯的過早終止。至少一或多個(gè)密碼子的缺失典型地也導(dǎo)致酶活性的完全喪失。
關(guān)于產(chǎn)生這些突變的指導(dǎo)是本領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)，可見于已知的遺傳學(xué)和分子生物學(xué)教科書，例如Knippers(″Molekulare Genetik[Molecular Genetics]″，6th edition，Georg Thieme Verlag，Stuttgart，Germany，1995)；Winnacker(″Gene und Klone[Genes and Clones]″，VCH Verlagsgesellschaft，Weinheim，Germany，1990)或者Hagemann(″Allgemeine Genetik[General Genetics]″，Gustav FischerVerlag，Stuttgart，1986)。
基因中合適的突變可以通過基因或等位基因置換而摻入合適的菌株中。
常用的方法是由Hamilton et al.(Journal of Bacteriology 1714617-4622(1989))所述的借助于有條件地復(fù)制pSC101衍生物pMAK705進(jìn)行基因置換的方法。同樣可以使用現(xiàn)有技術(shù)中描述的其它方法，例如Martinez-Morales et al.(Journal of Bacteriology 1817143-7148(1999))或者Boyd et al.(Journal of Bacteriology 182842-847(2000))所述方法。
也可以通過接合或者轉(zhuǎn)導(dǎo)將特定基因中的突變或者影響特定基因或者開放讀框表達(dá)的突變移至各個(gè)菌株中。
除了eno基因的增強(qiáng)之外，消除不希望的副反應(yīng)對于L-氨基酸，特別是L-蘇氨酸的生產(chǎn)可能是有益的(Nakayama″Breeding of AminoAcid Producing Microorganisms″，inOverproduction of MicrobialProducts，Krumphanzl，Sikyta，Vanek(eds.)，Academic Press，London，UK，1982)。
根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的微生物可通過分批法培養(yǎng)(分批培養(yǎng))、補(bǔ)料分批法培養(yǎng)(補(bǔ)料方法)、重復(fù)補(bǔ)料分批法培養(yǎng)(重復(fù)補(bǔ)料方法)或者連續(xù)培養(yǎng)(DE102004028859.3或者US5,763,230)。已知的培養(yǎng)方法的概述見Chmiel的教科書(Bioprozesstechnik 1.Einführung in dieBioverfahrenstechnik(Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1991))或者Storhas的教科書(Bioreaktoren und periphere Einrichtungen(ViewegVerlag，Braunschweig/Wiesbaden，1994))中所述。
所用培養(yǎng)基必須以適當(dāng)方式符合特定菌株的要求。關(guān)于各種微生物培養(yǎng)基的闡述見于美國細(xì)菌學(xué)會(huì)(American Society for Bacteriology)的“普通細(xì)菌學(xué)方法手冊(Manual of Methods for GeneralBacteriology)”(美國華盛頓D.C.，1981)。
可使用的碳源包括糖及碳水化合物，例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、糖蜜、淀粉和任選地纖維素；油和脂肪如豆油、葵花油、花生油和椰脂；脂肪酸如棕櫚酸、硬脂酸和亞油酸；醇如甘油和乙醇；及有機(jī)酸如乙酸。這些物質(zhì)可單獨(dú)或混合使用。
可使用的氮源包括含氮的有機(jī)化合物如胨、酵母提取物、肉膏、麥芽提取物、玉米浸液、大豆粉和尿素；或無機(jī)化物如硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、碳酸銨和硝酸銨。氮源可單獨(dú)或混合使用。
可使用的磷源包括磷酸、磷酸二氫鉀或磷酸氫二鉀，或相應(yīng)含鈉的鹽。培養(yǎng)基另外還必須含有生長所必需的金屬鹽如硫酸鎂或硫酸鐵。最后，除了上述物質(zhì)之外，還可使用生長必需物質(zhì)如氨基酸和維生素。此外，可將適當(dāng)前體加入培養(yǎng)基中。上述起始物質(zhì)可以單批形式加入到培養(yǎng)基中或在培養(yǎng)期間以適當(dāng)?shù)姆绞窖a(bǔ)加。
發(fā)酵通常在pH5.5-9.0進(jìn)行，特別是在pH6.0-8.0進(jìn)行?？梢赃m當(dāng)方式加入堿性化合物如NaOH、KOH、氨或氨水，或酸性化合物如磷酸或硫酸，以控制培養(yǎng)物的pH值。抗泡沫劑例如脂肪酸聚乙二醇酯可用于控制泡沫產(chǎn)生。可向培養(yǎng)基中加入具有選擇性作用的合適的物質(zhì)例如抗生素以保持質(zhì)粒的穩(wěn)定性?？上蚺囵B(yǎng)物中充入氧氣或含氧氣體混合物，例如空氣，以保持有氧條件。培養(yǎng)溫度通常在20℃～45℃，優(yōu)選30℃-40℃。持續(xù)培養(yǎng)直至L-氨基酸或L-蘇氨酸形成最大量。此目的通常在10～160小時(shí)范圍內(nèi)達(dá)到。
L-氨基酸的分析可以通過陰離子交換層析，隨后進(jìn)行茚三酮衍生化作用進(jìn)行，如Spackman等(Analytical Chemistry，301190-1206(1958))所述，或者可以通過反相HPLC進(jìn)行，如Lindroth等(AnalyticalChemistry 511167-1174(1979))所述。
本發(fā)明的方法用于發(fā)酵生產(chǎn)L-氨基酸，例如L-蘇氨酸、L-異亮氨酸、L-纈氨酸、L-甲硫氨酸、L-高絲氨酸、L-色氨酸和L-賴氨酸，特別是L-蘇氨酸。
如下微生物根據(jù)布達(dá)佩斯條約保藏在德國微生物保藏中心(DSMZ，德國不倫瑞克)●大腸桿菌菌株MG442，保藏號DSM 16574。
本發(fā)明借助于下文實(shí)施例得以更詳細(xì)地說明。
使用的大腸桿菌基本培養(yǎng)基(M9)和完全培養(yǎng)基(LB)由J.H.Miller(A Short Course in Bacterial Genetics(1992)，Cold Spring HarborLaboratory Press)描述。從大腸桿菌中分離質(zhì)粒DNA及所有限制、連接、Klenow和堿性磷酸酶處理技術(shù)均根據(jù)Sambrook等(MolecularCloning-A Laboratory Manual(1989)Cold Spring Harbor LaboratoryPress)所述方法實(shí)施。除非特別說明，大腸桿菌的轉(zhuǎn)化通過Chung等(Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States ofAmerica 862172-2175(1989))所述方法實(shí)施。
菌株的制備和轉(zhuǎn)化的溫育溫度為37℃。
實(shí)施例1表達(dá)質(zhì)粒pTrc99Aeno的構(gòu)建將大腸桿菌K12的eno基因使用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和合成的寡核苷酸擴(kuò)增。從大腸桿菌E.coli K12 MG1655(登記號AE000361，Blattner et al.(Science 2771453-1474(1997))的eno基因的核苷酸序列開始，合成PCR引物(MWG Biotech，Ebersberg，Germany)。引物含有限制酶的序列，在如下所示的核苷酸序列中以下劃線標(biāo)示。引物eno1含有XabI的限制切割位點(diǎn)，引物eno2含有HindIII的限制切割位點(diǎn)。
eno15′-GTTTGTCTAGAGTTTCAGTTTAACTAGTGAC-3′(SEQ ID No1)
eno25′-CCGGAGGCTGGCAAGCTTAAATCAG-3′(SEQ ID No2)用于PCR的大腸桿菌K12MG1655的染色體DNA使用QiagenGenomic-tips 100/G(QIAGEN，Hilden，Germany)根據(jù)廠商指導(dǎo)分離。使用特異性引物在標(biāo)準(zhǔn)PCR條件(Innis et al.(1990)PCR Protocols.AGuide to Methods and Applications，Academic Press)下使用Vent-DNA聚合酶(New England BioLabs，F(xiàn)rankfurt，Germany)可以擴(kuò)增出大小大約為1381bp的DNA片段(SEQ ID No3)。
將擴(kuò)增的eno片段用限制酶HindIII和XbaI限制性酶切，并且在純化(Purification Kit，QIAGEN，Hilden，Germany)后在0.8％瓊脂糖凝膠中檢測。將載體pTrc99A(Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)用限制酶HindIII和XbaI切割，并與限制性切割后的eno片段連接。將大腸桿菌菌株TOP10 One Shot(TOPO TA Cloning Kit，Invitrogen，Groningen，The Netherlands)用連接混合物轉(zhuǎn)化，在加入50μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂上選擇攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞。成功的克隆可通過用限制酶HindIII/XbaI和PvuI對分離的質(zhì)粒DNA進(jìn)行對照切割證實(shí)。該質(zhì)粒稱作pTrc99Aeno(

圖1)。
實(shí)施例2用菌株MG442/pTrc99Aeno制備L-蘇氨酸生產(chǎn)L-蘇氨酸的大腸桿菌菌株MG442在專利說明書US-A-4,278,765中描述，根據(jù)布達(dá)佩斯條約以保藏號CMIM B-1628保藏在俄羅斯國家工業(yè)微生物保藏中心(VKPM，俄羅斯莫斯科)及以保藏號DSM 16574保藏在德國微生物保藏中心(DSMZ，德國不倫瑞克)。
將菌株MG442用實(shí)施例1所述的表達(dá)質(zhì)粒pTrc99Aeno和載體pTrc99A轉(zhuǎn)化，在具有50μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂上選擇攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞。成功的轉(zhuǎn)化可通過用在分離質(zhì)粒DNA之后用酶HindIII/XbaI進(jìn)行對照切割證實(shí)。以這種方式形成菌株MG442/pTrc99Aeno和MG442/pTrc99A。然后在具有如下組分的基本培養(yǎng)基上進(jìn)一步增殖所選擇的單個(gè)菌落3.5g/l Na2HPO4*2H2O，1.5g/l KH2PO4，1g/l NH4Cl，0.1g/l MgSO4*7H2O，2g/l葡萄糖，20g/l瓊脂，50mg/l氨芐青霉素。在于100ml錐形瓶中的10ml分批培養(yǎng)物中檢測L-蘇氨酸的形成。為此，接種含有如下組分的10ml預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基2g/l酵母提取物，10g/l(NH4)2SO4，1g/l KH2PO4，0.5g/lMgSO4*7H2O，15g/l CaCO3，20g/l葡萄糖，50mg/l氨芐青霉素，并將該批次在37℃以180rpm在Kühner AG(Birsfelden，Switzerland)的ESR溫育器上溫育16小時(shí)。
將此預(yù)培養(yǎng)物的250μl轉(zhuǎn)接于10ml生產(chǎn)培養(yǎng)基中(25g/l(NH4)2SO4，2g/l KH2PO4，1g/l MgSO4*7H2O，0.03g/lFeSO4*7H2O，0.018g/l MnSO4*1H2O，30g/l CaCO3，20g/l葡萄糖，50mg/l氨芐青霉素)，并將該混合物在37℃溫育48小時(shí)。為了完全誘導(dǎo)eno基因的表達(dá)，在平行批次中加入100mg/l異丙基β-D-硫代半乳糖糖苷(IPTG)。以相同方式研究起始菌株MG442中L-蘇氨酸的形成，但是培養(yǎng)基中不加入氨芐青霉素。在溫育后，培養(yǎng)物懸浮液的光密度(OD)使用Dr.Lange(Düsseldorf，Germany)的LP2W光度計(jì)在660nm測定波長進(jìn)行測定。
然后在無菌過濾的培養(yǎng)物上清中使用Eppendorf-BioTronik(Hamburg，Germany)氨基酸分析儀經(jīng)離子交換層析和用茚三酮檢測進(jìn)行的過柱后反應(yīng)而確定形成的L-蘇氨酸的濃度。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果示于表l。
表1
附圖簡述圖1含有eno基因的質(zhì)粒pTrc99Aeno的圖譜長度數(shù)據(jù)是大約值。所用縮寫和名稱具有如下含義●Amp氨芐青霉素抗性基因●lacItrc啟動(dòng)子的阻抑蛋白的基因●Ptrctrc啟動(dòng)子區(qū)域，IPTG-可誘導(dǎo)的●enoeno基因的編碼區(qū)●5S5S rRNA區(qū)●rrnBTrRNA終止子區(qū)域。
限制酶的縮寫具有如下含義●HindIII來自流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)RC的限制性核酸內(nèi)切酶●PvuI來自普通變形菌(Proteus vulgaris)的限制性核酸內(nèi)切酶●XbaI來自野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris)的限制性核酸內(nèi)切酶序列表<110>德古薩股份公司<120>使用具有升高的烯醇化酶活性的重組腸桿菌制備L-蘇氨酸的方法<130>020479 BT<160>8<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>31<212>DNA<213>Artificial sequence<220>
<221>Primer<222>(1)..(31)<223>eno1<400>1gtttgtctag agtttcagtt taactagtga c 31<210>2<211>25<212>DNA<213>Artificial sequence<220>
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<221>CDS<222>(46)..(1344)
<223>eno gene<400>3gtttgtctag agtttcagtt taactagtga cttgaggaaa accta atg tcc aaa atc 57Met Ser Lys Ile1gta aaa atc atc ggt cgt gaa atc atc gac tcc cgt ggt aac ccg act105Val Lys Ile Ile Gly Arg Glu Ile Ile Asp Ser Arg Gly Asn Pro Thr5 10 15 20gtt gaa gcc gaa gta cat ctg gag ggt ggt ttc gtc ggt atg gca gct153Val Glu Ala Glu Val His Leu Glu Gly Gly Phe Val Gly Met Ala Ala25 30 35gct ccg tca ggt gct tct act ggt tcc cgt gaa gct ctg gaa ctg cgc201Ala Pro Ser Gly Ala Ser Thr Gly Ser Arg Glu Ala Leu Glu Leu Arg40 45 50gat ggc gac aaa tcc cgt ttc ctg ggt aaa ggc gta acc aaa gct gtt249Asp Gly Asp Lys Ser Arg Phe Leu Gly Lys Gly Val Thr Lys Ala Val55 60 65gct gcg gta aac ggc ccg atc gct cag gcg ctg att ggc aaa gat gct297Ala Ala Val Asn Gly Pro Ile Ala Gln Ala Leu Ile Gly Lys Asp Ala70 75 80aaa gat cag gct ggc att gac aag atc atg atc gac ctg gac ggc acc345Lys Asp Gln Ala Gly Ile Asp Lys Ile Met Ile Asp Leu Asp Gly Thr85 90 95 100gaa aac aaa tcc aaa ttc ggc gcg aac gca atc ctg gct gta tct ctg393Glu Asn Lys Ser Lys Phe Gly Ala Asn Ala Ile Leu Ala Val Ser Leu105 110 115gct aac gcc aaa gct gct gca gct gct aaa ggt atg ccg ctg tac gag441Ala Asn Ala Lys Ala Ala Ala Ala Ala Lys Gly Met Pro Leu Tyr Glu120 125 130cac atc gct gaa ctg aac ggt act ccg ggc aaa tac tct atg ccg gtt489His Ile Ala Glu Leu Asn Gly Thr Pro Gly Lys Tyr Ser Met Pro Val135 140 145ccg atg atg aac atc atc aac ggt ggt gag cac gct gac aac aac gtt537Pro Met Met Asn Ile Ile Asn Gly Gly Glu His Ala Asp Asn Asn Val150 155 160gat atc cag gaa ttc atg att cag ccg gtt ggc gcg aaa act gtg aaa585Asp Ile Gln Glu Phe Met Ile Gln Pro Val Gly Ala Lys Thr Val Lys165 170 175 180gaa gcc atc cgc atg ggt tct gaa gtt ttc cat cac ctg gca aaa gtt633Glu Ala Ile Arg Met Gly Ser Glu Val Phe His His Leu Ala Lys Val185 190 195ctg aaa gcg aaa ggc atg aac act gct gtt ggt gac gaa ggt ggc tat681
Leu Lys Ala Lys Gly Met Asn Thr Ala Val Gly Asp Glu Gly Gly Tyr200 205 210gcg ccg aac ctg ggt tcc aac gct gaa gct ctg gct gtt atc gct gaa729Ala Pro Asn Leu Gly Ser Asn Ala Glu Ala Leu Ala Val Ile Ala Glu215 220 225gct gtt aaa gct gct ggt tat gaa ctg ggc aaa gac atc act ttg gcg777Ala Val Lys Ala Ala Gly Tyr Glu Leu Gly Lys Asp Ile Thr Leu Ala230 235 240atg gac tgc gca gct tct gaa ttc tac aaa gat ggt aaa tac gtt ctg825Met Asp Cys Ala Ala Ser Glu Phe Tyr Lys Asp Gly Lys Tyr Val Leu245 250 255 260gct ggc gaa ggc aac aaa gcg ttc acc tct gaa gaa ttc act cac ttc873Ala Gly Glu Gly Asn Lys Ala Phe Thr Ser Glu Glu Phe Thr His Phe265 270 275ctg gaa gaa ctg acc aaa cag tac ccg atc gtt tct atc gaa gac ggt921Leu Glu Glu Leu Thr Lys Gln Tyr Pro Ile Val Ser Ile Glu Asp Gly280 285 290ctg gac gaa tct gac tgg gac ggt ttc gca tac cag acc aaa gtt ctg969Leu Asp Glu Ser Asp Trp Asp Gly Phe Ala Tyr Gln Thr Lys Val Leu295 300 305ggc gac aaa atc cag ctg gtt ggt gac gac ctg ttc gta acc aac acc1017Gly Asp Lys Ile Gln Leu Val Gly Asp Asp Leu Phe Val Thr Asn Thr310 315 320aag atc ctg aaa gaa ggt atc gaa aaa ggt atc gct aac tcc atc ctg1065Lys Ile Leu Lys Glu Gly Ile Glu Lys Gly Ile Ala Asn Ser Ile Leu325 330 335 340atc aaa ttc aac cag atc ggt tct ctg acc gaa act ctg gct gca atc1113Ile Lys Phe Asn Gln Ile Gly Ser Leu Thr Glu Thr Leu Ala Ala Ile345 350 355aag atg gcg aaa gat gct ggc tac act gca gtt atc tct cac cgt tct1161Lys Met Ala Lys Asp Ala Gly Tyr Thr Ala Val Ile Ser His Arg Ser360 365 370ggc gaa act gaa gac gct acc atc gct gac ctg gct gtt ggt act gct1209Gly Glu Thr Glu Asp Ala Thr Ile Ala Asp Leu Ala Val Gly Thr Ala375 380 385gca ggc cag atc aaa act ggt tct atg agc cgt tct gac cgt gtt gct1257Ala Gly Gln Ile Lys Thr Gly Ser Met Ser Arg Ser Asp Arg Val Ala390 395 400aaa tac aac cag ctg att cgt atc gaa gaa gct ctg ggc gaa aaa gca1305Lys Tyr Asn Gln Leu Ile Arg Ile Glu Glu Ala Leu Gly Glu Lys Ala405 410 415 420ccg tac aac ggt cgt aaa gag atc aaa ggc cag gca taa gactgacttt 1354
Pro Tyr Asn Gly Arg Lys Glu Ile Lys Gly Gln Ala425 430atctgattta agcttgccag cctccgg 1381<210>4<211>432<212>PRT<213>Escherichia coli<400>4Met Ser Lys Ile Val Lys Ile Ile Gly Arg Glu Ile Ile Asp Ser Arg1 5 10 15Glv Asn Pro Thr Val Glu Ala Glu Val His Leu Glu Gly Gly Phe Val20 25 30Gly Met Ala Ala Ala Pro Ser Gly Ala Ser Thr Gly Ser Arg Glu Ala35 40 45Leu Glu Leu Arg Asp Gly Asp Lys Ser Arg Phe Leu Gly Lys Gly Val50 55 60Thr Lvs Ala Val Ala Ala Val Asn Gly Pro Ile Ala Gln Ala Leu Ile65 70 75 80Gly Lys Asp Ala Lys Asp Gln Ala Gly Ile Asp Lys Ile Met Ile Asp85 90 95Leu Asp Gly Thr Glu Asn Lys Ser Lys Phe Gly Ala Asn Ala Ile Leu100 105 110Ala Val Ser Leu Ala Asn Ala Lys Ala Ala Ala Ala Ala Lys Gly Met115 120 125Pro Leu Tvr Glu His Ile Ala Glu Leu Asn Gly Thr Pro Gly Lys Tyr130 135 140Ser Met Pro Val Pro Met Met Asn Ile Ile Asn Gly Gly Glu His Ala145 150 155 160Asp Asn Asn Val Asp Ile Gln Glu Phe Met Ile Gln Pro Val Gly Ala165 170 175Lys Thr Val Lys Glu Ala Ile Arg Met Gly Ser Glu Val Phe His His180 185 190Leu Ala Lys Val Leu Lys Ala Lys Gly Met Asn Thr Ala Val Gly Asp195 200 205Glu Gly Gly Tyr Ala Pro Asn Leu Gly Ser Asn Ala Glu Ala Leu Ala210 215 220Val Ile Ala Glu Ala Val Lys Ala Ala Gly Tyr Glu Leu Gly Lys Asp225 230 235 240
Ile Thr Leu Ala Met Asp Cys Ala Ala Ser Glu Phe Tyr Lys Asp Gly245 250 255Lys Tyr Val Leu Ala Gly Glu Gly Asn Lys Ala Phe Thr Ser Glu Glu260 265 270Phe Thr His Phe Leu Glu Glu Leu Thr Lys Gln Tyr Pro Ile Val Ser275 280 285Ile Glu Asp Gly Leu Asp Glu Ser Asp Trp Asp Gly Phe Ala Tyr Gln290 295 300Thr Lys Val Leu Gly Asp Lys Ile Gln Leu Val Gly Asp Asp Leu Phe305 310 315 320Val Thr Asn Thr Lys Ile Leu Lys Glu Gly Ile Glu Lys Gly Ile Ala325 330 335Asn Ser Ile Leu Ile Lys Phe Asn Gln Ile Gly Ser Leu Thr Glu Thr340 345 350Leu Ala Ala Ile Lys Met Ala Lys Asp Ala Gly Tyr Thr Ala Val Ile355 360 365Ser His Arg Ser Gly Glu Thr Glu Asp Ala Thr Ile Ala Asp Leu Ala370 375 380Val Gly Thr Ala Ala Gly Gln Ile Lys Thr Gly Ser Met Ser Arg Ser385 390 395 400Asp Arg Val Ala Lys Tyr Asn Gln Leu Ile Arg Ile Glu Glu Ala Leu405 410 415Gly Glu Lys Ala Pro Tyr Asn Gly Arg Lys Glu Ile Lys Gly Gln Ala420 425 430<210>5<211>1299<212>DNA<213>Shigella flexneri<220>
<221>CDS<222>(1)..(1299)<223>eno coding region<400>5atg tcc aaa atc gta aaa atc atc ggt cgt gaa atc atc gac tcc cgt48Met Ser Lys Ile Val Lys Ile Ile Gly Arg Glu Ile Ile Asp Ser Arg1 5 10 15ggt aac ccg act gtt gaa gcc gaa gta cat ctg gag ggt ggt ttc gtc96Glv Asn Pro Thr Val Glu Ala Glu Val His Leu Glu Gly Gly Phe Val20 25 30
ggt atg gca gct gct ccg tca ggt gct tct act ggt tcc cgt gaa gct144Gly Met Ala Ala Ala Pro Ser Gly Ala Ser Thr Gly Ser Arg Glu Ala35 40 45ctg gaa ctg cgc gat ggc gac aaa tcc cgt ttc ctg ggt aaa ggc gta192Leu Glu Leu Arg Asp Gly Asp Lys Ser Arg Phe Leu Gly Lys Gly Val50 55 60acc aaa gct gtt gct gcg gta aac ggc ccg atc gct cag gcg ctg att240Thr Lys Ala Val Ala Ala Val Asr Gly Pro Ile Ala Gln Ala Leu Ile65 70 75 80ggc aaa gat gct aaa gat cag gct ggc att gac aag atc atg atc gac288Gly Lys Asp Ala Lys Asp Gln Ala Gly Ile Asp Lys Ile Met Ile Asp85 90 95ctg gac ggc acc gaa aac aaa tcc aaa ttc ggc gcg aac gca atc ctg336Leu Asp Gly Thr Glu Asn Lys Ser Lys Phe Gly Ala Asn Ala Ile Leu100 105 110gct gta tct ctg gct aac gcc aaa gct gct gca gct gct aaa ggt atg384Ala Val Ser Leu Ala Asn Ala Lys Ala Ala Ala Ala Ala Lys Gly Met115 120 125ccg ctg tac gag cac atc gct gaa ctg aac ggt act ccg ggc aaa tac432Pro Leu Tyr Glu His Ile Ala Glu Leu Asn Gly Thr Pro Gly Lys Tyr130 135 140tcc atg ccg gtt ccg atg atg aac atc atc aac ggt ggt gag cac gct480Ser Met Pro Val Pro Met Met Asn Ile Ile Asn Gly Gly Glu His Ala145 150 155 160gac aac sac gtt gat atc cag gaa ttc atg att cag ccg gtt ggc gcg528Asp Asn Asn Val Asp Ile Gln Glu Phe Met Ile Gln Pro Val Gly Ala165 170 175aaa act gtg aaa gaa gcc atc cgc atg ggt tct gaa gtt ttc cat cac576Lys Thr Val Lys Glu Ala Ile Arg Met Gly Ser Glu Val Phe His His180 185 190ctg gca aaa gtt ctg aaa gcg aaa ggc atg aac act gct gtt ggt gac624Leu Ala Lys Val Leu Lys Ala Lys Gly Met Asn Thr Ala Val Gly Asp195 200 205gaa ggt ggc tat gcg ccg aac ctg ggt tcc aac gct gaa gct ctg gct672Glu Gly Gly Tyr Ala Pro Asn Leu Gly Ser Asn Ala Glu Ala Leu Ala210 215 220gtt atc gct gaa gct gtt aaa gct gct ggt tat gaa ctg ggc aaa gac720Val Ile Ala Glu Ala Val Lys Ala Ala Gly Tyr Glu Leu Gly Lys Asp225 230 235 240atc act ctg gcg atg gac tgc gca gct tct gaa ttc tac aaa gat ggt768Ile Thr Leu Ala Met Asp Cys Ala Ala Ser Glu Phe Tyr Lys Asp Gly245 250 255aaa tac gtt ctg gct ggc gaa ggc aac aaa gcg ttc acc tct gaa gaa816
Lys Tyr Val Leu Ala Gly Glu Gly Asn Lys Ala Phe Thr Ser Glu Glu260 265 270ttc act cac ttc ctg gaa gaa ctg acc aaa cag tac ccg atc gtt tct864Phe Thr His Phe Leu Glu Glu Leu Thr Lys Gln Tyr Pro Ile Val Ser275 280 285atc gaa gac ggt ctg gac gaa tct gac tgg gac ggt ttc gca tac cag912Ile Glu Asp Gly Leu Asp Glu Ser Asp Trp Asp Gly Phe Ala Tyr Gln290 295 300acc aaa gtt ctg ggc gac aaa atc cag ctg gtt ggt gac gac ctg ttc960Thr Lys Val Leu Gly Asp Lys Ile Gln Leu Val Gly Asp Asp Leu Phe305 310 315 320gta acc aac acc aag atc ctg aaa gaa ggt atc gaa aaa ggt atc gct1008Val Thr Asn Thr Lys Ile Leu Lys Glu Gly Ile Glu Lys Gly Ile Ala325 330 335aac tcc atc ctg atc aaa ttc aac cag atc ggt tct ctg acc gaa act1056Asn Ser Ile Leu Ile Lys Phe Asn Gln Ile Gly Ser Leu Thr Glu Thr340 345 350ctg gct gca atc aag atg gcg aaa gat gct ggc tac act gca gtt atc1104Leu Ala Ala Ile Lys Met Ala Lys Asp Ala Gly Tyr Thr Ala Val Ile355 360 365tct cac cgt tct ggt gaa act gaa gat gct acc atc gct gat ctg gct1152Ser His Arg Ser Gly Glu Thr Glu Asp Ala Thr Ile Ala Asp Leu Ala370 375 380gtt ggt act gct gca ggc cag atc aaa act ggt tct atg agc cgt tct1200Val Gly Thr Ala Ala Gly Gln Ile Lys Thr Gly Ser Met Ser Arg Ser385 390 395 400gac cgt gtt gct aaa tac aac cag ctg att cgt atc gaa gaa gct ctg1248Asp Arg Val Ala Lys Tyr Asn Gln Leu Ile Arg Ile Glu Glu Ala Leu405 410 415ggc gaa aaa gca ccg tac aac ggt cgt aaa gag atc aaa ggc cag gca1296Gly Glu Lys Ala Pro Tyr Asn Gly Arg Lys Glu Ile Lys Gly Gln Ala420 425 430taa1299<210>6<211>432<212>PRT<213>Shigella flexneri<400>6Met Ser Lys Ile Val Lys Ile Ile Gly Arg Glu Ile Ile Asp Ser Arg1 5 10 15Glv Asn Pro Thr Val Glu Ala Glu Val His Leu Glu Gly Gly Phe Val
20 25 30Gly Met Ala Ala Ala Pro Ser Gly Ala Ser Thr Gly Ser Arg Glu Ala35 40 45Leu Glu Leu Arg Asp Gly Asp Lys Ser Arg Phe Leu Gly Lys Gly Val50 55 60Thr Lys Ala Val Ala Ala Val Asn Gly Pro Ile Ala Gln Ala Leu Ile65 70 75 80Gly Lys Asp Ala Lys Asp Gln Ala Gly Ile Asp Lys Ile Met Ile Asp85 90 95Leu Asp Gly Thr Glu Asn Lys Ser Lys Phe Gly Ala Asn Ala Ile Leu100 105 110Ala Val Ser Leu Ala Asn Ala Lys Ala Ala Ala Ala Ala Lys Gly Met115 120 125Pro Leu Tyr Glu His Ile Ala Glu Leu Asn Gly Thr Pro Gly Lys Tyr130 135 140Ser Met Pro Val Pro Met Met Asn Ile Ile Asn Gly Gly Glu His Ala145 150 155 160Asp Asn Asn Val Asp Ile Gln Glu Phe Met Ile Gln Pro Val Gly Ala165 170 175Lys Thr Val Lys Glu Ala Ile Arg Met Gly Ser Glu Val Phe His His180 185 190Leu Ala Lys Val Leu Lys Ala Lys Gly Met Asn Thr Ala Val Gly Asp195 200 205Glu Gly Gly Tyr Ala Pro Asn Leu Gly Ser Asn Ala Glu Ala Leu Ala210 215 220Val Ile Ala Glu Ala Val Lys Ala Ala Gly Tyr Glu Leu Gly Lys Asp225 230 235 240Ile Thr Leu Ala Met Asp Cys Ala Ala Ser Glu Phe Tyr Lys Asp Gly245 250 255Lys Tyr Val Leu Ala Gly Glu Gly Asn Lys Ala Phe Thr Ser Glu Glu260 265 270Phe Thr His Phe Leu Glu Glu Leu Thr Lys Gln Tyr Pro Ile Val Ser275 280 285Ile Glu Asp Gly Leu Asp Glu Ser Asp Trp Asp Gly Phe Ala Tyr Gln290 295 300Thr Lys Val Leu Gly Asp Lys Ile Gln Leu Val Gly Asp Asp Leu Phe305 310 315 320Val Thr Asn Thr Lys Ile Leu Lys Glu Gly Ile Glu Lys Gly Ile Ala
325 330 335Asn Ser Ile Leu Ile Lys Phe Asn Gln Ile Gly Ser Leu Thr Glu Thr340 345 350Leu Ala Ala Ile Lys Met Ala Lys Asp Ala Gly Tyr Thr Ala Val Ile355 360 365Ser His Arg Ser Gly Glu Thr Glu Asp Ala Thr Ile Ala Asp Leu Ala370 375 380Val Gly Thr Ala Ala Gly Gln Ile Lys Thr Gly Ser Met Ser Arg Ser385 390 395 400Asp Arg Val Ala Lys Tyr Asn Gln Leu Ile Arg Ile Glu Glu Ala Leu405 410 415Gly Glu Lys Ala Pro Tyr Asn Gly Arg Lys Glu Ile Lys Gly Gln Ala420 425 430<210>7<211>1299<212>DNA<213>Salmonella typhimurium<220>
<221>CDS<222>(1)..(1299)<223>eno coding region<400>7atg tcc aaa atc gtt aaa gtc atc ggt cgt gaa atc atc gac tcc cgt48Met Ser Lys Ile Val Lys Val Ile Gly Arg Glu Ile Ile Asp Ser Arg1 5 10 15ggt aac ccg act gtt gaa gct gaa gta cac ctg gaa ggt ggt ttc gta96Gly Asn Pro Thr Val Glu Ala Glu Val His Leu Glu Gly Gly Phe Val20 25 30ggt atg gcg gcg gct ccg tca ggt gct tct act ggt tcc cgc gaa gcg144Gly Met Ala Ala Ala Pro Ser Gly Ala Ser Thr Gly Ser Arg Glu Ala35 40 45ctg gaa ctg cgc gat ggc gac aaa tcc cgt ttc ctg ggt aaa ggc gta192Leu Glu Leu Arg Asp Gly Asp Lys Ser Arg Phe Leu Gly Lys Gly Val50 55 60acc aaa gct gtt ggc gcg gtt aac ggc ccg atc gct cag gct att ctt240Thr Lys Ala Val Gly Ala Val Asn Gly Pro Ile Ala Gln Ala Ile Leu65 70 75 80ggc aaa gac gct aaa gac cag gct ggc atc gac aaa atc atg atc gac288Gly Lys Asp Ala Lys Asp Gln Ala Gly Ile Asp Lys Ile Met Ile Asp85 90 95ctg gac ggt act gaa aac aaa tct aac ttc ggt gca aac gcc att ctg336Leu Asp Gly Thr Glu Asn Lys Ser Asn Phe Gly Ala Asn Ala Ile Leu
100 105 110gct gtc tct ctg gct aac gcc aaa gct gct gct gcc gct aaa ggt atg384Ala Val Ser Leu Ala Asn Ala Lys Ala Ala Ala Ala Ala Lys Gly Met115 120 125ccg ctg tac gag cac att gct gaa ctg aat ggc acg ccg ggc aaa tac432Pro Leu Tyr Glu His Ile Ala Glu Leu Asn Gly Thr Pro Gly Lys Tyr130 135 140tcc atg ccg gtt ccg atg atg aac atc atc aac ggc ggc gag cac gct480Ser Met Pro Val Pro Met Met Asn Ile Ile Asn Gly Gly Glu His Ala145 150 155 160gac aac aac gtc gac atc cag gaa ttc atg atc cag ccg gtt ggc gcg528Asp Asn Asn Val Asp Ile Gln Glu Phe Met Ile Gln Pro Val Gly Ala165 170 175aaa acg gtt aaa gaa gcc atc cgt atg ggt tct gaa gtt ttc cat cac576Lys Thr Val Lys Glu Ala Ile Arg Met Gly Ser Glu Val Phe His His180 185 190ctg gca aaa gtg ctg aaa ggc aaa ggc atg aac acc gct gtg ggt gac624Leu Ala Lys Val Leu Lys Gly Lys Gly Met Asn Thr Ala Val Gly Asp195 200 205gaa ggc ggc tat gcg ccg aac ctg ggt tcc aac gct gaa gcg ctg gct672Glu Gly Gly Tyr Ala Pro Asn Leu Gly Ser Asn Ala Glu Ala Leu Ala210 215 220gtt atc gct gaa gcg gtt aaa gcg gct ggt tac gag ctg ggt aaa gac720Val Ile Ala Glu Ala Val Lys Ala Ala Gly Tyr Glu Leu Gly Lys Asp225 230 235 240atc acc ctg gcg atg gac tgc gca gca tct gaa ttc tac aaa gac ggt768Ile Thr Leu Ala Met Asp Cys Ala Ala Ser Glu Phe Tyr Lys Asp Gly245 250 255aaa tac gtt ctg gct ggc gaa ggc aac aaa gcg ttc acc tcc gaa gaa816Lys Tyr Val Leu Ala Gly Glu Gly Asn Lys Ala Phe Thr Ser Glu Glu260 265 270ttc acc cac ttc ctg gaa gaa ctg acc aaa cag tac ccg atc gtt tcc864Phe Thr His Phe Leu Glu Glu Leu Thr Lys Gln Tyr Pro Ile Val Ser275 280 285atc gaa gat ggt ctg gac gag tct gac tgg gac ggt ttt gca tac cag912Ile Glu Asp Gly Leu Asp Glu Ser Asp Trp Asp Gly Phe Ala Tyr Gln290 295 300acc aaa gta ctg ggc gac aaa atc cag ctg gtt ggt gsc gac ctg ttc960Thr Lys Val Leu Gly Asp Lys Ile Gln Leu Val Gly Asp Asp Leu Phe305 310 315 320gta acc aac acc aaa atc ctg aaa gaa ggc atc gag aaa ggc atc gct1008Val Thr Asn Thr Lys Ile Leu Lys Glu Gly Ile Glu Lys Gly Ile Ala325 330 335
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Pro Leu Tyr Glu His Ile Ala Glu Leu Asn Gly Thr Pro Gly Lys Tyr130 135 140Ser Met Pro Val Pro Met Met Asn Ile Ile Asn Gly Gly Glu His Ala145 150 155 160Asp Asn Asn Val Asp Ile Gln Glu Phe Met Ile Gln Pro Val Gly Ala165 170 175Lys Thr Val Lys Glu Ala Ile Arg Met Gly Ser Glu Val Phe His His180 185 190Leu Ala Lys Val Leu Lys Gly Lys Gly Met Asn Thr Ala Val Gly Asp195 200 205Glu Gly Gly Tyr Ala Pro Asn Leu Gly Ser Asn Ala Glu Ala Leu Ala210 215 220Val Ile Ala Glu Ala Val Lys Ala Ala Gly Tyr Glu Leu Gly Lys Asp225 230 235 240Ile Thr Leu Ala Met Asp Cys Ala Ala Ser Glu Phe Tyr Lys Asp Gly245 250 255Lys Tyr Val Leu Ala Gly Glu Gly Asn Lys Ala Phe Thr Ser Glu Glu260 265 270Phe Thr His Phe Leu Glu Glu Leu Thr Lys Gln Tyr Pro Ile Val Ser275 280 285Ile Glu Asp Gly Leu Asp Glu Ser Asp Trp Asp Gly Phe Ala Tyr Gln290 295 300Thr Lys Val Leu Gly Asp Lys Ile Gln Leu Val Gly Asp Asp Leu Phe305 310 315 320Val Thr Asn Thr Lys Ile Leu Lys Glu Gly Ile Glu Lys Gly Ile Ala325 330 335Asn Ser Ile Leu Ile Lys Phe Asn Gln Ile Gly Ser Leu Thr Glu Thr340 345 350Leu Ala Ala Ile Lys Met Ala Lys Asp Ala Gly Tyr Thr Ala Val Ile355 360 365Ser His Arg Ser Gly Glu Thr Glu Asp Ala Thr Ile Ala Asp Leu Ala370 375 380Val Gly Thr Ala Ala Gly Gln Ile Lys Thr Gly Ser Met Ser Arg Ser385 390 395 400Asp Arg Val Ala Lys Tyr Asn Gln Leu Ile Arg Ile Glu Glu Ala Leu405 410 415Gly Glu Lys Ala Pro Tyr Asn Gly Arg Lys Glu Ile Lys Gly Gln Ala420 425 430
權(quán)利要求
1.腸桿菌科的重組微生物，其含有增強(qiáng)的或過表達(dá)的編碼烯醇化酶的eno基因，并以改良的方式生產(chǎn)L-氨基酸。
2.權(quán)利要求1的微生物，其中編碼其氨基酸序列與選自由SEQ IDNo4、SEQ ID No6和SEQ ID No8組成的一組的氨基酸序列至少90％相同的多肽的多核苷酸是增強(qiáng)的。
3.權(quán)利要求2的微生物，其含有過表達(dá)的或增強(qiáng)的相應(yīng)于eno基因的選自如下一組的多核苷酸a)具有SEQ ID No3、SEQ ID No5或SEQ ID No7所示核苷酸序列的多核苷酸；b)具有在遺傳密碼簡并范圍內(nèi)相應(yīng)于SEQ ID No3、SEQ IDNo5或SEQ ID No7的核苷酸序列的多核苷酸；c)具有在嚴(yán)格條件下與互補(bǔ)于SEQ ID No3、SEQ ID No5或SEQ ID No7的序列雜交的序列的多核苷酸序列；d)具有含有中性功能有義突變體的SEQ ID No3、SEQ IDNo5或SEQ ID No7序列的多核苷酸。
4.權(quán)利要求2的微生物，其中所述多肽具有與選自由SEQ IDNo4、SEQ ID No6和SEQ ID No8組成的一組的序列至少95％相同的氨基酸序列。
5.權(quán)利要求2的微生物，其中所述多肽具有與SEQ ID No4、SEQID No6或SEQ ID No8的序列100％相同的氨基酸序列。
6.權(quán)利要求1-5的微生物，其中它們是使用含有eno基因、這個(gè)基因的等位基因或者其一部分和/或啟動(dòng)子的載體通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)或接合或者這些方法的組合產(chǎn)生的。
7.權(quán)利要求1或6的微生物，其中所述eno基因或者等位基因的拷貝數(shù)增加至少1個(gè)。
8.權(quán)利要求7的微生物，其中所述eno基因的拷貝數(shù)增加至少1個(gè)是通過將ORF或等位基因整合進(jìn)微生物的染色體中而實(shí)現(xiàn)的。
9.權(quán)利要求7的微生物，其中所述eno基因的拷貝數(shù)增加至少1個(gè)是通過在染色體外復(fù)制的載體實(shí)現(xiàn)的。
10.權(quán)利要求1或2的微生物，其中為了實(shí)現(xiàn)增強(qiáng)，a)eno基因上游的啟動(dòng)子和調(diào)節(jié)區(qū)或者核糖體結(jié)合位點(diǎn)被突變，或者b)表達(dá)盒或啟動(dòng)子摻入在eno基因的上游。
11.權(quán)利要求1或2的微生物，其中所述eno基因是在增強(qiáng)該基因表達(dá)的啟動(dòng)子控制下。
12.權(quán)利要求1-11的微生物，其中eno基因產(chǎn)物(蛋白質(zhì))的濃度或活性通過eno基因的增強(qiáng)而在eno基因未重組的微生物或親代菌株中基因產(chǎn)物的活性或濃度的基礎(chǔ)上增加至少10％。
13.權(quán)利要求1-12的微生物，其中所述微生物選自埃希氏菌屬、歐文氏菌屬、普羅威登斯菌屬和沙雷氏菌屬。
14.權(quán)利要求13的微生物，其中所需的L-氨基酸的生物合成途徑的其它基因被另外增強(qiáng)，特別是過表達(dá)。
15.權(quán)利要求1-14的微生物，其中它們產(chǎn)生L-蘇氨酸。
16.通過發(fā)酵腸桿菌科的重組微生物制備L-氨基酸的方法，其中a)將產(chǎn)生所需的L-氨基酸的微生物在培養(yǎng)基中在所需的L-氨基酸在培養(yǎng)基中或者在細(xì)胞中濃縮的條件下培養(yǎng)，并且所述微生物中eno基因或者編碼其基因產(chǎn)物的核苷酸序列或等位基因是增強(qiáng)的、特別是過表達(dá)的；b)分離所需的L-氨基酸，發(fā)酵肉湯中的組分和/或其生物量的全部或部分(≥0-100％)保留在已經(jīng)分離的產(chǎn)物中或被完全移走。
17.權(quán)利要求16的方法，其中應(yīng)用權(quán)利要求1-15的微生物。
18.權(quán)利要求16或17的方法，其中為了制備L-蘇氨酸，發(fā)酵腸桿菌科微生物，所述微生物中選自如下一組的一或多個(gè)基因同時(shí)另外被增強(qiáng)、特別是過表達(dá)18.1 thrABC操縱子的至少一個(gè)基因，其編碼天冬氨酸激酶、高絲氨酸脫氫酶、高絲氨酸激酶和蘇氨酸合酶，18.2 谷氨酸棒桿菌的pyc基因，其編碼丙酮酸羧化酶，18.3 pps基因，其編碼磷酸烯醇丙酮酸合酶，18.4 ppc基因，其編碼磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，18.5 pntA和pntB基因，其編碼嘧啶轉(zhuǎn)氫酶亞基，18.6 rhtB基因，其編碼授予高絲氨酸抗性的蛋白質(zhì)，18.7 rhtC基因，其編碼授予蘇氨酸抗性的蛋白質(zhì)，18.8 棒桿菌thrE基因，其編碼蘇氨酸輸出載體蛋白，18.9 gdhA基因，其編碼谷氨酸脫氫酶，18.10 pgm基因，其編碼葡糖磷酸變位酶，18.11 fba基因，其編碼果糖二磷酸醛縮酶，18.12 ptsH基因，其編碼磷酸組氨酸蛋白己糖磷酸轉(zhuǎn)移酶，18.13 ptsI基因，其編碼磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)酶I，18.14 crr基因，其編碼葡萄糖特異性IIA成分，18.15 ptsG基因，其編碼葡萄糖特異性IIBC成分，18.16 lrp基因，其編碼亮氨酸調(diào)節(jié)子的調(diào)節(jié)物，18.17 fadR編碼fad調(diào)節(jié)子的調(diào)節(jié)物，18.18 iclR基因，其編碼主要中間代謝的調(diào)節(jié)物，18.19 ahpC基因，其編碼烷基氫過氧化物還原酶的小亞基，18.20 ahpF基因，其編碼烷基氫過氧化物還原酶的大亞基，18.21 cysK基因，其編碼半胱氨酸合酶A，18.22 cysB基因，其編碼cys調(diào)節(jié)子的調(diào)節(jié)物，18.23 cysJ基因，其編碼NADPH亞硫酸還原酶的黃素蛋白，18.24 cysI基因，其編碼NADPH亞硫酸還原酶的血紅蛋白，18.25 cysH基因，其編碼腺苷酰硫酸還原酶，18.26 rseA基因，其編碼具有抗sigmaE活性的膜蛋白，18.27 rseC基因，其編碼sigmaE因子的全局調(diào)節(jié)物，18.28 sucA基因，其編碼2-酮戊二酸脫氫酶的脫羧酶亞基，18.29 sucB基因，其編碼2-酮戊二酸脫氫酶的二氫硫辛酸轉(zhuǎn)琥珀酰酶E2亞基，18.30 sucC基因，其編碼琥珀酰-CoA合成酶β-亞基，18.31 sucD基因，其編碼琥珀酰-CoA合成酶α-亞基，18.32 aceE基因，其編碼丙酮酸脫氫酶復(fù)合物的E1成分，18.33 aceF基因，其編碼丙酮酸脫氫酶復(fù)合物的E2成分，18.34 rseB基因，其編碼sigmaE因子活性的調(diào)節(jié)物，18.35 大腸桿菌的開放讀框(ORF)yodA的基因產(chǎn)物，18.36 大腸桿菌的開放讀框(ORF)yaaU的基因產(chǎn)物。
19.權(quán)利要求16-18的方法，特征在于應(yīng)用其中降低所需的L-氨基酸形成的代謝途徑至少被部分弱化的微生物。
20.權(quán)利要求19的方法，其中為了制備L-蘇氨酸，發(fā)酵腸桿菌科微生物，所述微生物中選自如下一組的一或多個(gè)基因同時(shí)另外被弱化、特別是其表達(dá)被消除或降低20.1 tdh基因，其編碼蘇氨酸脫氫酶，20.2 mdh基因，其編碼蘋果酸脫氫酶，20.3 大腸桿菌開放讀框(ORF)yjfA的基因產(chǎn)物，20.4 大腸桿菌開放讀框(ORF)ytfP的基因產(chǎn)物，20.5 pckA基因，其編碼磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶，20.6 poxB基因，其編碼丙酮酸氧化酶，20.7 dgsA基因，其編碼磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)的DgsA調(diào)節(jié)物，20.8 fruR基因，其編碼果糖阻抑物，20.9 rpoS基因，其編碼sigma38因子，和20.10 aspA基因，其編碼天冬氨酸銨裂合酶。
21.權(quán)利要求16-20的方法，其中制備的L-氨基酸選自L-天冬酰胺、L-絲氨酸、L-谷氨酸、L-甘氨酸、L-丙氨酸、L-半胱氨酸、L-纈氨酸、L-甲硫氨酸、L-脯氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-酪氨酸、L-苯丙氨酸、L-組氨酸、L-賴氨酸、L-色氨酸、L-精氨酸和L-高絲氨酸。
22.權(quán)利要求21的方法，其中制備的L-氨基酸選自L-異亮氨酸、L-纈氨酸、L-甲硫氨酸、L-高絲氨酸、L-色氨酸和L-賴氨酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及制備L－氨基酸，特別是L－蘇氨酸的方法，其中進(jìn)行如下步驟a)發(fā)酵產(chǎn)生所需的L－氨基酸的腸桿菌科微生物，其中eno基因或者編碼該基因產(chǎn)物的核苷酸序列或等位基因是增強(qiáng)的；b)濃縮培養(yǎng)基或者微生物細(xì)胞中所需的L－氨基酸；和c)分離所需的L－氨基酸。
文檔編號C12P13/08GK1910286SQ200580002970
公開日2007年2月7日 申請日期2005年1月18日 優(yōu)先權(quán)日2004年1月23日
發(fā)明者梅希特希爾德·里平 申請人:德古薩股份公司