專利名稱：：病毒純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于從宿主細(xì)胞中純化病毒、特別是純化重組腺病毒的領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：病毒，無論是天然發(fā)生的還是其重組形式的，均可用于疫苗接種和基因治療領(lǐng)域。許多病毒或者病毒樣顆?？梢园踩行У卦谒拗骷?xì)胞中增殖(見例如WO01/38362，其描述了各種病毒在宿主細(xì)胞E1永生化的視網(wǎng)膜細(xì)胞中的增殖)。重組腺病毒是用于基因治療和疫苗接種的一類優(yōu)選的病毒載體。這些重組腺病毒通常至少在E1區(qū)域具有缺陷，并在提供E1區(qū)域的互補(bǔ)細(xì)胞(例如293細(xì)胞)或者E1-永生化的視網(wǎng)膜細(xì)胞如PER.C6TM細(xì)胞中增殖(見例如美國專利5,994,128)。病毒在宿主細(xì)胞中增殖之后，基本上對(duì)于所有應(yīng)用，在進(jìn)一步應(yīng)用之前均需要從宿主細(xì)胞中純化病毒。國際專利申請(qǐng)WO98/22588描述了生產(chǎn)和純化腺病毒載體的方法。所述方法包括培養(yǎng)宿主細(xì)胞、用腺病毒感染所述宿主細(xì)胞、收獲并裂解宿主細(xì)胞、濃縮粗制裂解物、更換所述粗制裂解物的緩沖液、用核酸酶處理該裂解物、以及使用層析進(jìn)一步純化病毒。一些其它出版物描述了從宿主細(xì)胞中純化病毒的方法，大多數(shù)注重使用特異性層析基質(zhì)從宿主細(xì)胞裂解物中純化病毒，見例如美國專利6,008,036、6,586,226、5,837,520、6,261,823、6,537,793和國際專利申請(qǐng)WO00/50573、WO02/44348和WO03/078592所述。大多數(shù)所述方法應(yīng)用核酸酶處理步驟降解DNA雜質(zhì)。盡管一些方法描述了不同的層析基質(zhì)，但仍需要從宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中純化病毒的替代及優(yōu)選改良方法。本發(fā)明提供了這樣的方法。附圖描述圖1已知的收獲細(xì)胞方法(T/B)與本發(fā)明的方法(B/T)的示意圖，見實(shí)施例1所述。TTriton，BBenzonase，p.i.感染后。圖2在T/B及B/T方法(示意圖見圖1)后澄清除去宿主細(xì)胞蛋白。圖中示出了5個(gè)單獨(dú)純化的處理中樣品(inprocesssamples)的銀染SDS-PAGE(4-12％bis-trisNuPAGE，Invitrogen)分析(樣品見實(shí)施例1和表1所述)。第2組來自T/B收獲方法，其中裂解后加入核酸酶；第3-7組來自B/T收獲方法，其中核酸酶在裂解之前加入。將收獲物(泳道1)通過0.5μmClarigard濾膜(泳道2)澄清，隨后用0.8/0.45μmSartopore2濾膜(泳道3)過濾。M標(biāo)記物，以kD表示的Mw在旁邊示出。圖3在處理期間用高鹽滲濾除去組蛋白(見實(shí)施例2)。圖中示出了銀染SDS-PAGE。A.滲透物，樣品1初始滲透物；24x濃度之后；3第1個(gè)DFV0.3MNaCl；4第3個(gè)DFV0.6MNaCl；5第4個(gè)DFV0.6MNaCl；6第5個(gè)DFV1.0MNaCl；7第6個(gè)DFV1.0MNaCl；8第7個(gè)DFV0.3MNaCl；9第9個(gè)DFV0.3MNaCl。M標(biāo)記物，以kD表示的Mw在旁邊示出。B.滲余物，樣品1起始樣品，24x濃度之后；3第1個(gè)DFV0.3MNaCl；4第2個(gè)DFV0.6MNaCl；5第6個(gè)DFV0.6MNaCl；6第7個(gè)DFV1.0MNaCl；7第8個(gè)DFV1.0MNaCl；8第9個(gè)DFV0.3MNaCl；9第9個(gè)DFVmillex(樣品8的0.22μm過濾物)。M標(biāo)記物，以kD表示的Mw在旁邊示出。圖4本發(fā)明優(yōu)選方法的示意圖(見實(shí)施例1)。圖5從重組病毒制備物中除去埃博拉病毒核蛋白(NP)(見實(shí)施例3實(shí)驗(yàn)3.1詳述)。圖中示出銀染SDS-PAGE(4-12％bis-trisNuPAGE，Invitrogen)。A起始材料，B與1％Tween20溫育，C與2.5MNaCl溫育。箭頭表示NP。圖6從重組病毒制備物中除去埃博拉病毒核蛋白的實(shí)驗(yàn)(見實(shí)施例3實(shí)驗(yàn)3.3詳述)。圖7從重組病毒制備物中除去埃博拉病毒核蛋白(NP)的非還原SDS-PAGE(第1組)和Western印跡(第2組)分析(見實(shí)施例3實(shí)驗(yàn)3.3詳述)。泳道A、B、C分別含有產(chǎn)物A、B和C(見圖6和實(shí)驗(yàn)3.3所述)。對(duì)于Western印跡分析，使用識(shí)別NP的抗體。箭頭表示NP。圖8從重組病毒中除去埃博拉病毒核蛋白(NP)的RP-HPLC分析。對(duì)產(chǎn)物A、B和C進(jìn)行分析。詳見實(shí)施例3實(shí)驗(yàn)3.3所述。縱軸是AU(×10-3)。在橫軸(洗脫時(shí)間)下，箭頭1表示異己酮蛋白的峰，箭頭2表示NP的峰。圖9示出使用高鹽和過濾從重組病毒制備物中除去埃博拉病毒核蛋白的SDS-PAGE(A組)和Western印跡(B組)分析。在陰離子交換層析后，將樣品用含有5MNaCl的溶液進(jìn)行緩沖液更換。將樣品直接經(jīng)過0.45μmMillipac20濾膜(Millipore)過濾。泳道1過濾之前，泳道2過濾之后。對(duì)于Western印跡分析，使用識(shí)別NP的抗體。箭頭表示NP。圖10加樣于Q-XL柱(A組)和帶電濾膜(B組)上的Ad35TFF滲余物的層析圖。B組中的圓圈表示額外的峰，其僅分離自使用帶電濾膜的病毒峰。圖11帶電濾膜層析的兩種級(jí)分的圓盤離心分析。A組示出Ad35病毒峰的沉降模式圖，B組示出額外峰的沉降模式圖(圖10中的圓形所示)。圖12層析級(jí)分Ad35的SDS-PAGE分析(見實(shí)施例6)。4-12％bis-tris凝膠用銀染色。凝膠A示出帶電濾膜級(jí)分的電泳。1標(biāo)記物，2起始物，3流經(jīng)液，4峰1(圖10中圓形所示)，5Ad35峰。凝膠B示出Q-XL級(jí)分的電泳。1起始物，2流經(jīng)液，3Ad35峰。發(fā)明描述本發(fā)明提供了一種從宿主細(xì)胞中純化病毒的方法，所述方法包括如下步驟a)培養(yǎng)感染病毒的宿主細(xì)胞，b)向細(xì)胞培養(yǎng)物中加入核酸酶，c)裂解所述宿主細(xì)胞以提供包含所述病毒的裂解物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括d)澄清所述裂解物。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括e)優(yōu)選使用至少一個(gè)層析步驟進(jìn)一步純化所述腺病毒。本發(fā)明的方法與迄今為止已揭示的方法最重要的差別是在那些方法中是在細(xì)胞裂解之后或者在純化過程的較晚階段加入核酸酶。根據(jù)本發(fā)明，核酸酶是在細(xì)胞裂解之前加入。如本發(fā)明所揭示，現(xiàn)在意外地發(fā)現(xiàn)這導(dǎo)致優(yōu)于僅在細(xì)胞裂解之后加入核酸酶的方法的改良。在本發(fā)明的方法中，與在細(xì)胞裂解之后加入核酸酶的方法相比，得自本發(fā)明這種方法的純化的病毒批次含有較少的宿主細(xì)胞DNA。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述病毒是重組腺病毒。在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟b)使用的核酸酶是benzonase。在一個(gè)實(shí)施方案中，裂解宿主細(xì)胞的步驟(步驟c)使用去污劑進(jìn)行，在一個(gè)實(shí)施方案中所述去污劑是Triton-X100。在一個(gè)實(shí)施方案中，裂解物的澄清(步驟d)包括深層過濾(depthfiltration)和膜過濾。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述膜過濾使用孔徑大小為0.8μm和0.45μm的濾膜組合進(jìn)行，例如使用包含孔徑大小為0.8μm和0.45μm的兩個(gè)不對(duì)稱聚醚砜濾膜的組合濾膜，如SartoporeTM-2組合濾膜。在一個(gè)實(shí)施方案中，將澄清的裂解物(得自步驟d)進(jìn)行超濾和/或滲濾。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，滲濾導(dǎo)致針對(duì)包含0.8-2.0MNaCl或者提供相等離子強(qiáng)度的另一種鹽的溶液的緩沖液更換(bufferexchange)。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，病毒的進(jìn)一步純化(步驟e)包括陰離子交換層析。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述病毒的進(jìn)一步純化(步驟e)包括大小排阻層析步驟，優(yōu)選以組分離模式(groupseparationmode)進(jìn)行。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，步驟e)同時(shí)包括陰離子交換層析和大小排阻層析。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，澄清的裂解物和進(jìn)一步純化的病毒(得自步驟d)處于沒有去污劑、氯化鎂和蔗糖的緩沖液中。另一方面，本發(fā)明提供了包含選自如下一組轉(zhuǎn)基因的重組腺病毒批次埃博拉病毒(Ebola)核蛋白、埃博拉病毒糖蛋白、惡性瘧原蟲(Plasmodiumfalciparum)環(huán)子孢子基因和麻疹病毒血凝素，所述重組腺病毒批次特征在于每1E11個(gè)病毒顆粒含有少于0.1ng宿主細(xì)胞DNA。本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種生產(chǎn)包含編碼核酸結(jié)合蛋白的核酸序列的病毒的方法，所述方法包括如下步驟a)培養(yǎng)已經(jīng)感染病毒的宿主細(xì)胞，b)將所述宿主細(xì)胞的培養(yǎng)物及其中產(chǎn)生的所述病毒進(jìn)行宿主細(xì)胞的裂解，以提供包含所述病毒的裂解物，c)將病毒進(jìn)行陰離子交換層析，其特征在于在陰離子交換層析之后，將含有病毒的混合物用包含至少1MNaCl或者提供相等離子強(qiáng)度的另一種鹽的溶液進(jìn)行緩沖液更換。優(yōu)選地，所述溶液包含至少1.5MNaCl、更優(yōu)選至少2MNaCl、更優(yōu)選至少3MNaCl、更優(yōu)選大約5MNaCl，或者提供相等離子強(qiáng)度的另一種鹽。優(yōu)選地，將所述病毒使用孔徑優(yōu)選不大于1.2μm的親水性濾膜過濾和/或通過大小排阻層析而進(jìn)一步純化。所述病毒優(yōu)選是重組病毒，更優(yōu)選是重組腺病毒。所述核酸結(jié)合蛋白可以是核蛋白，如出血熱病毒的核蛋白，所述出血熱病毒例如為埃博拉病毒、馬爾堡病毒(Marburgvirus)或者拉沙病毒(Lassavirus)，優(yōu)選埃博拉病毒。發(fā)明詳述宿主細(xì)胞本發(fā)明的宿主細(xì)胞可以是所希望的病毒可以在其中繁殖的任何宿主細(xì)胞。例如，重組腺病毒載體的繁殖在可以互補(bǔ)腺病毒中的缺陷的宿主細(xì)胞中進(jìn)行。這些宿主細(xì)胞優(yōu)選地在其基因組中具有至少一個(gè)腺病毒E1序列，從而能互補(bǔ)在E1區(qū)域中具有缺失的重組腺病毒。另外，所述腺病毒可在E3區(qū)域中具有缺失，這在Ad基因組中是不重要的，因此不必互補(bǔ)這種缺失?？梢允褂萌魏位パa(bǔ)E1的宿主細(xì)胞，如E1永生化的人視網(wǎng)膜細(xì)胞例如911(見美國專利5,994,128)、E1-轉(zhuǎn)化的羊水細(xì)胞(見EP專利1230354)、E1-轉(zhuǎn)化的A549細(xì)胞(見例如WO98/39411，美國專利5,891,690)、GH329HeLa(Gaoetal，2000，HumanGeneTherapy11213-219)、293等等。優(yōu)選PER.C6TM細(xì)胞(美國專利5,994,128)或者衍生自其中的細(xì)胞被用作宿主細(xì)胞，因?yàn)樗鼈冞m于各種不同病毒包括但非限于重組腺病毒的繁殖(見例如WO01/38362)。用于重組腺病毒載體的繁殖的進(jìn)一步的細(xì)胞系和方法例如在美國專利6,492,169和WO03/104467中公開?？梢灾苯佑米魉拗骷?xì)胞以繁殖病毒的或者可以被轉(zhuǎn)變?yōu)榛パa(bǔ)宿主細(xì)胞以用于復(fù)制缺陷病毒的其它有用哺乳動(dòng)物細(xì)胞系的實(shí)例是Vero和HeLa細(xì)胞及中國倉鼠卵巢細(xì)胞系、W138、BHK、COS-7、HepG2、3T3、RIN和MDCK細(xì)胞，這些細(xì)胞為本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知。本發(fā)明的宿主細(xì)胞被培養(yǎng)以增加細(xì)胞和病毒數(shù)目和/或病毒效價(jià)。培養(yǎng)細(xì)胞使得其可以代謝和/或生長和/或分裂和/或產(chǎn)生本發(fā)明感興趣的病毒。這可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法實(shí)現(xiàn)，所述方法包括但不限于為細(xì)胞提供營養(yǎng)物，例如在合適的培養(yǎng)基中。所述方法可包括附著在表面生長、懸浮生長，或者這些生長的組合。培養(yǎng)例如可以在培養(yǎng)皿、滾瓶或者生物反應(yīng)器中使用分批培養(yǎng)、補(bǔ)料分批培養(yǎng)、連續(xù)系統(tǒng)、中空纖維等方式進(jìn)行。為了實(shí)現(xiàn)通過細(xì)胞培養(yǎng)而大規(guī)模(連續(xù))生產(chǎn)病毒，本領(lǐng)域優(yōu)選使細(xì)胞能懸浮生長，并優(yōu)選使細(xì)胞在不含動(dòng)物或人衍生的血清或者動(dòng)物或人衍生的血清成分的條件下培養(yǎng)。本領(lǐng)域熟知合適的培養(yǎng)條件(見例如TissueCulture，AcademicPress，KruseandPaterson，editors(1973)，和R.I.Freshney，CultureofanimalcellsAmanualofbasictechnique，fourthedition(Wiley-LissInc.，2000，ISBN0-471-34889-9)。本發(fā)明包括培養(yǎng)感染病毒的宿主細(xì)胞使其裂解。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知培養(yǎng)宿主細(xì)胞并使其感染病毒的方法。感染宿主細(xì)胞例如可簡便地將病毒在生理?xiàng)l件下暴露于合適的宿主細(xì)胞，使得宿主細(xì)胞攝取該病毒。對(duì)于某些病毒，甚至不需要用病毒本身開始，因?yàn)榭梢允褂煤怂嵝蛄性谂囵B(yǎng)的細(xì)胞中重建該病毒。適于培養(yǎng)宿主細(xì)胞以產(chǎn)生腺病毒的一些方面和系統(tǒng)也可見于WO98/22588，p.11-28。培養(yǎng)細(xì)胞及在宿主細(xì)胞中繁殖病毒的方法在例如美國專利6,168,944、5,994,134、6,342,384、6,168,941、5,948,410、5,840,565、5,789,390、6,309,650、6,146,873和國際專利申請(qǐng)WO01/38362、WO01/77304和WO03/084479中也有描述。病毒本發(fā)明的方法適用于廣泛的病毒，包括但不限于腺病毒、痘病毒、虹彩病毒、皰疹病毒、乳多空病毒、副粘病毒、正粘病毒(如流感病毒)、反轉(zhuǎn)錄病毒、腺伴隨病毒、痘苗病毒、輪狀病毒等等，特別優(yōu)選腺病毒。所述病毒優(yōu)選是重組病毒，但可以包括臨床分離株、減毒的疫苗株等等。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明用于濃縮攜帶異源轉(zhuǎn)基因的重組病毒，優(yōu)選腺病毒，以用于基因治療或者疫苗接種。只是為了例證目的，本發(fā)明將更詳細(xì)地描述重組腺病毒，但無限于此之意。腺病毒優(yōu)選地，腺病毒載體在病毒復(fù)制所需的腺病毒基因組E1區(qū)域(例如E1a和/或E1b區(qū)域)的至少一個(gè)必需基因功能中具有缺陷。在某些實(shí)施方案中，所述載體在E1區(qū)域的至少一個(gè)必需基因功能和至少部分非必需的E3區(qū)域(例如E3區(qū)域的XbaI切除)中具有缺陷。腺病毒載體可以是“多重缺陷的”，這是指腺病毒載體在腺病毒基因組的兩或多個(gè)區(qū)域的每一個(gè)區(qū)域均具有一或多個(gè)必需基因功能缺陷。例如，前述E1缺陷的或者E1-、E3-缺陷的腺病毒載體可以進(jìn)一步在E4區(qū)域的至少一個(gè)必需基因和/或E2區(qū)域的至少一個(gè)必需基因(例如E2A區(qū)域和/或E2B區(qū)域)中具有缺陷。缺失全部E4區(qū)域的腺病毒載體可激發(fā)較低的宿主免疫應(yīng)答。合適的腺病毒載體例如包括缺少如下結(jié)構(gòu)的腺病毒載體(a)全部或部分E1區(qū)域和全部或部分E2區(qū)域，(b)全部或部分E1區(qū)域、全部或部分E2區(qū)域、及全部或部分E3區(qū)域，(c)全部或部分E1區(qū)域、全部或部分E2區(qū)域、全部或部分E3區(qū)域、及全部或部分E4區(qū)域，(d)至少部分E1a區(qū)域、至少部分E1b區(qū)域、至少部分E2a區(qū)域、及至少部分E3區(qū)域，(e)至少部分E1區(qū)域、至少部分E3區(qū)域、及至少部分E4區(qū)域，及(f)所有必需腺病毒基因產(chǎn)物(例如僅包含ITR和包裝信號(hào)的腺病毒擴(kuò)增子)。在缺失腺病毒基因組必需區(qū)域的情況中，這些區(qū)域編碼的功能需被反式提供，優(yōu)選通過宿主細(xì)胞反式提供，即當(dāng)腺病毒缺失部分或全部E1、E2和/或E4區(qū)域時(shí)，這些區(qū)域需存在于宿主細(xì)胞中，例如整合進(jìn)基因組中，或者以所謂的輔助腺病毒或者輔助質(zhì)粒形式存在。復(fù)制缺陷的腺病毒載體可以使用腺病毒或者嵌合腺病毒的任何病毒物種、病毒株、亞型，或者這些病毒物種、病毒株或者亞型的混合物作為載體DNA的來源而產(chǎn)生(見例如WO96/26281，WO00/03029)，它們例如可以為腺病毒載體提供具有感染某些希望細(xì)胞類型的能力。腺病毒載體可以是能在細(xì)胞中生長的任何腺病毒載體，其一些主要部分(盡管不必需是實(shí)質(zhì)上地)衍生自或者基于腺病毒基因組。腺病毒載體可包含野生型腺病毒C群、特別是血清型5(即Ad5)或者Ad2的腺病毒基因組。腺病毒載體還可以包含衍生自腺病毒B群例如Ad11、Ad35、Ad51等的腺病毒基因組或者至少一種纖維蛋白(見例如WO00/70071)，這些實(shí)施方案具有在種群中很少遇到針對(duì)這些血清型的中和抗體的優(yōu)勢，并且賦予靶定其它類型細(xì)胞的可能性，因?yàn)檫@些腺病毒載體的向性與衍生自Ad5的那些載體不同。當(dāng)然，本領(lǐng)域技術(shù)人員已知也可以應(yīng)用任何其它血清型。本領(lǐng)域技術(shù)人員意識(shí)到使用例如美國專利6,492,169或者WO03/104467及其參考文獻(xiàn)當(dāng)中所論述的方法而繁殖特異于宿主細(xì)胞的不同血清型的腺病毒載體的可能性。本領(lǐng)域熟知腺病毒載體、構(gòu)建腺病毒載體的方法及繁殖腺病毒載體的方法，見例如美國專利No.5,559,099、5,837,511、5,846,782、5,851,806、5,994,106、5,994,128、5,965,541、5,981,225、6,040,174、6,020,191和6,113,913，及ThomasShenk，″AdenoviridaeandtheirReplication″，M.S.Horwitz，″Adenoviruses″，Chapters67and68，respectively，inVirology，B.N.Fieldsetal.，eds.，3ded.，RavenPress，Ltd.，NewYork(1996)及其它參考文獻(xiàn)所揭示。本領(lǐng)域熟知腺病毒載體的構(gòu)建，其包括標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)的應(yīng)用，例如Sambrooketal.，MolecularCloning，aLaboratoryManual，2ded.，ColdSpringHarborPress，ColdSpringHarbor，N.Y.(1989)，Watsonetal.，RecombinantDNA，2ded.，ScientificAmericanBooks(1992)及Ausubeletal.，CurrentProtocolsinMolecularBiology，WileyIntersciencePublishers，NY(1995)，及其它參考文獻(xiàn)所述。轉(zhuǎn)基因在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的病毒是野生型病毒，或者在本發(fā)明的宿主細(xì)胞中仍具有感染力的其突變體或一部分。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述病毒是包含異源信息的重組病毒，其可用于基因治療目的中的治療性方案，或者作為抗原用于免疫接種目的。優(yōu)選使用例如腺病毒載體。所述異源信息是指“轉(zhuǎn)基因(transgene)”。本發(fā)明的方法可適用于包含任何轉(zhuǎn)基因的病毒、優(yōu)選腺病毒，因此轉(zhuǎn)基因自身的性質(zhì)對(duì)于本發(fā)明無關(guān)重要。一些可能的轉(zhuǎn)基因例如在WO98/22588，p.42-49中描述?？纱嬖谟诒景l(fā)明的病毒中的轉(zhuǎn)基因例如可以是治療性基因，如腫瘤抑制基因，包括但不限于p53、p16、APC、DCC、NF-1、WT-1、p21、BRCA1、BRCA2等；酶，如胞嘧啶脫氨酶、HGPRT、葡糖腦苷脂酶、HSV胸苷激酶或者人胸苷激酶等等；激素，如生長激素、促乳素、紅細(xì)胞生成素、絨毛膜促性腺激素、甲狀腺刺激激素、瘦素(leptin)、ACTH、血管緊張素、胰島素、胰高血糖素、促生長素抑制素、降鈣素、加壓素等等；白細(xì)胞介素和細(xì)胞因子，如IL-1、IL-3、IL-12、G-CSF、GM-CSF、TNF等等；在特殊疾病中缺少或突變的置換基因(replacementgene)，如ADA、因子IX、CFTR等等；其它治療基因如血管發(fā)生抑制劑、細(xì)胞周期抑制劑等等；抑制例如癌基因表達(dá)的反義構(gòu)建體，所述癌基因如ras、myc、jun、bcl、abl等等；以及疫苗抗原如病毒抗原，例如衍生自小核糖核酸病毒、冠狀病毒、披膜病毒、黃病毒、彈狀病毒、副粘病毒、正粘病毒、痘病毒、嗜肝DNA病毒、呼腸孤病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒、皰疹病毒等等，及例如更特異性的來自流感病毒(具有潛在抗原例如HA和/或NA)、乙型肝炎病毒(具有潛在抗原乙型肝炎表面抗原)、西尼羅腦炎病毒(WestNileVirus)、狂犬病病毒、SARS-CoV、單純皰疹病毒1和2、麻疹病毒，小痘病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、HIV(具有潛在抗原例如HIV-1衍生的gag、env、nef，或者其修飾物，包括密碼子優(yōu)化的形式，見例如WO02/22080所述)、埃博拉病毒、馬爾堡病毒，拉沙病毒的抗原；或者細(xì)菌抗原、真菌抗原、寄生蟲(包括錐蟲、絳蟲、線蟲、蠕蟲、瘧原蟲等等)抗原等等。顯而易見，本領(lǐng)域技術(shù)人員可選擇可用于所設(shè)計(jì)的治療方案的感興趣的基因，其用于基因治療和/或免疫接種，并且不限于上述那些基因。同樣顯而易見，轉(zhuǎn)基因的控制區(qū)域優(yōu)選地存在于用于表達(dá)所述轉(zhuǎn)基因的重組病毒載體中，例如包括啟動(dòng)子和聚腺苷酸化信號(hào)。這些均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，在此不需要進(jìn)一步描述。一些控制區(qū)域在WO98/22588，p.49-55中論述。本發(fā)明使用的一些腺病毒在實(shí)施例中進(jìn)一步論述。裂解宿主細(xì)胞在腺病毒感染后，所述病毒在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制并從而被擴(kuò)增。腺病毒感染最終導(dǎo)致被感染的細(xì)胞裂解。腺病毒的裂解特性因此使得可以用兩種不同形式進(jìn)行病毒生產(chǎn)。第一種形式是在細(xì)胞裂解之前使用外部因素使細(xì)胞裂解而收獲病毒。第二種形式是在產(chǎn)生的病毒使得細(xì)胞(幾乎)完全裂解之后收獲病毒上清(見例如美國專利6,485,958所述，其描述了不用外部因素使得宿主細(xì)胞裂解而收獲腺病毒)。對(duì)于后一種形式，需要較長的溫育時(shí)間以達(dá)到完全的細(xì)胞裂解及因此的高病毒產(chǎn)量。另外，宿主細(xì)胞成分逐漸流至培養(yǎng)基中可能對(duì)于獲得的病毒的完整性和產(chǎn)量有害處。因此，本發(fā)明優(yōu)選使用外部因素主動(dòng)裂解細(xì)胞?？捎糜谥鲃?dòng)裂解細(xì)胞的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知，例如WO98/22588，p.28-35所論述。這方面有用的方法例如是冷凍-解凍、固體剪切(solidshear)、高滲和/或低滲性裂解、液體剪切(liquidshear)、超聲、高壓擠壓、去污劑裂解、上述方法的組合等。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，使用至少一種去污劑使細(xì)胞裂解。使用去污劑進(jìn)行裂解的優(yōu)勢是這是一種簡便的方法，并且可易于規(guī)模生產(chǎn)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞是使用中空纖維超濾通過剪切裂解的，如WO03/084479所述。去污劑根據(jù)本發(fā)明可以使用的去污劑及其應(yīng)用方式為本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知。一些實(shí)例例如在WO98/22588，p.29-33中揭示。本文所用術(shù)語“去污劑”可包括陰離子、陽離子、兩性離子和非離子去污劑。去污劑例如包括但非限于?；悄懰?，脫氧膽酸，?；敲撗跄懰?，鯨蠟(cetylpyridium)，殺藻胺，ZWITTERGENT-3-14，CHAPS(3-[3-Cholamidopropyl]dimethylammoniol)-1-丙磺酸鹽水合物，Aldrich)，BigCHAP，DeoxyBigCHAP，TritonX-100，TritonX-114，C12E8，辛基-B-D-吡喃葡糖苷，PLURONIC-F68，TWEEN-20，TWEEN-80(CALBIOCHEMBiochemicals)，Thesit，NP-40，Brij-58，辛基葡糖苷等。本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚去污劑的濃度可以在例如大約0.1％-5％(w/w)范圍內(nèi)變化。在某些實(shí)施方案中，所述去污劑以大約1％(w/w)的濃度存在于裂解溶液中。在本發(fā)明人的一些前導(dǎo)性實(shí)驗(yàn)中，使用Triton與使用一些其它測試的去污劑(Tween20、Tween80、脫氧膽酸)相比產(chǎn)生較低粘性的溶液。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，使用的去污劑是TritonX-100。核酸酶本發(fā)明應(yīng)用核酸酶除去污染的即主要是宿主細(xì)胞的核酸。適用于本發(fā)明的核酸酶例如包括Benzonase、Pulmozyme或者本領(lǐng)域通用的任何其它DNA酶和/或RNA酶。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述核酸酶是Benzonase，其通過水解特定核苷酸之間的內(nèi)部磷酸二酯鍵使核酸快速水解，從而降低細(xì)胞裂解物的粘性。Benzonase可商購自MerckKGaA(編號(hào)W214950)。應(yīng)用的核酸酶的濃度優(yōu)選在1-100單位/ml范圍。根據(jù)本發(fā)明，所述核酸酶在細(xì)胞裂解之前使用。其可以在裂解步驟之前幾秒鐘加入(或者實(shí)際上同時(shí)加入)，但優(yōu)選在裂解步驟之前至少1分鐘加入到培養(yǎng)物中。然后將加入了核酸酶的細(xì)胞培養(yǎng)物在高于處理溫度的溫度溫育，例如在大約40℃，或者在培養(yǎng)溫度(例如在大約35℃-37℃)、或者在室溫(大約20℃)或者更低溫度溫育，在較低溫度溫育通常需要較長的時(shí)間達(dá)到相同的結(jié)果(見Benzonase手冊(cè)MerckKGaA編號(hào)W214950)。作為非限制性例子，溫育可以在例如大約37℃進(jìn)行大約10分鐘，之后裂解細(xì)胞。顯然，核酸酶可以并優(yōu)選在裂解步驟之后仍然可以主動(dòng)降解核酸，在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，在裂解之后細(xì)胞與核酸內(nèi)切酶的溫育延長大約50分鐘(導(dǎo)致核酸酶處理的總時(shí)間為大約1小時(shí)，這個(gè)時(shí)間可以更長，因?yàn)轭A(yù)期核酸酶仍發(fā)揮作用直至其在隨后的純化步驟中被除去)。這個(gè)時(shí)間與WO98/22588公開的溫育過夜的時(shí)間相比顯著縮短。當(dāng)然，較長的溫育時(shí)間，例如2小時(shí)或者過夜或者更長時(shí)間溫育(在Benzonase手冊(cè)MerckKGaA編號(hào)W214950中，提供了溫育時(shí)間直至30小時(shí)的數(shù)據(jù))，本發(fā)明的方法也是可能的，但這不是獲得可接受的結(jié)果所必需的。很清楚在這些實(shí)施方案中使用的裂解步驟(即，將含有在其中產(chǎn)生的病毒的細(xì)胞進(jìn)行裂解)是指應(yīng)用外部因素如去污劑進(jìn)行的裂解步驟(見上面“裂解宿主細(xì)胞”所述)。顯然，在培養(yǎng)在其中腺病毒進(jìn)行繁殖的細(xì)胞期間，一些細(xì)胞在沒有任何外部裂解因素的情況下由于病毒而已經(jīng)被裂解。因此，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，當(dāng)開始核酸酶處理時(shí)，這種在沒有外部因素的情況下發(fā)生的宿主細(xì)胞裂解低于50％，優(yōu)選低于40％，更優(yōu)選低于30％，更優(yōu)選低于20％，即優(yōu)選當(dāng)細(xì)胞存活力分別為至少50％、60％、70％、80％時(shí)加入核酸酶。盡管非優(yōu)選(見上述)，但可以使用在沒有外部因素的情況下依賴于宿主細(xì)胞裂解的方法。包含“自發(fā)”裂解的方法已經(jīng)被描述，其中不提倡使用Benzonase(見美國專利6,485,958)。然而，根據(jù)本發(fā)明，在培養(yǎng)的晚期階段期間，即優(yōu)選當(dāng)病毒在其中繁殖的宿主細(xì)胞仍具有至少5％、優(yōu)選至少10％、更優(yōu)選至少20％存活力時(shí)(即當(dāng)分別低于95％、90％、80％的細(xì)胞裂解時(shí))，在這種系統(tǒng)中加入核酸酶也是有益的。預(yù)期當(dāng)應(yīng)用這樣的步驟時(shí)將改良獲得的病毒的質(zhì)量。因此本發(fā)明的另一方面提供了一種從宿主細(xì)胞中純化能裂解宿主細(xì)胞的病毒的方法，所述方法包括如下步驟a)培養(yǎng)包含能裂解所述宿主細(xì)胞的病毒的宿主細(xì)胞，b)在無外部因素裂解細(xì)胞的情況下在病毒釋放進(jìn)培養(yǎng)液之后收獲病毒，其特征在于在95％的宿主細(xì)胞被裂解之前向培養(yǎng)物中加入核酸酶。在某些實(shí)施方案中，在90％、優(yōu)選80％的宿主細(xì)胞被裂解之前向培養(yǎng)物中加入核酸酶。在本發(fā)明這些方面中加入核酸酶的最佳時(shí)刻(即相應(yīng)于被裂解的細(xì)胞的最佳百分比)依賴于加入的核酸酶的量及溫育期間核酸酶的比活性的降低，這個(gè)時(shí)刻可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定，現(xiàn)在本發(fā)明的發(fā)明人揭示了向培養(yǎng)物自身中加入核酸酶的優(yōu)點(diǎn)。顯而易見，根據(jù)本發(fā)明這個(gè)方面獲得的裂解物可以應(yīng)用本文所述的方法和步驟進(jìn)一步純化，如經(jīng)過濾和層析純化。國際專利申請(qǐng)WO03/097797描述了從細(xì)胞裂解物中純化腺病毒顆粒的另外的方法，包括加入選擇性沉淀劑以沉淀雜質(zhì)DNA。盡管在該申請(qǐng)中闡述了當(dāng)使用其所述方法時(shí)不需要核酸酶步驟，但這一步驟還是在后期階段被應(yīng)用以得到更好的結(jié)果。本發(fā)明的方法，包括在宿主細(xì)胞裂解之前加入核酸酶的步驟，可以與在裂解后加入選擇性沉淀劑組合，從而使得在過程后期加入核酸酶的步驟(如在WO03/097797中所優(yōu)選的)潛在多余。國際專利申請(qǐng)WO02/070673應(yīng)用連續(xù)離心方法從宿主細(xì)胞中分離病毒將細(xì)胞培養(yǎng)物在使細(xì)胞有效濃縮為粒狀沉淀(pellet)的條件下進(jìn)行連續(xù)離心，將粒狀沉淀細(xì)胞在有效裂解細(xì)胞的條件下從離心機(jī)中排至收集容器中，從而獲得裂解物。顯然，這種方法的細(xì)胞裂解也在本發(fā)明“裂解宿主細(xì)胞”的范圍內(nèi)，因此預(yù)期這種方法應(yīng)從本發(fā)明中獲益，即在進(jìn)行連續(xù)離心方法之前向細(xì)胞培養(yǎng)物中加入核酸酶，由此改良的方法在裂解物及最終的純化產(chǎn)物中產(chǎn)生較低量的核酸污染。澄清(clarification))在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，包含病毒的宿主細(xì)胞被澄清。澄清可以通過除去細(xì)胞碎片和其它雜質(zhì)的過濾步驟進(jìn)行。合適的濾膜可利用纖維素濾膜、再生的纖維素纖維、纖維素纖維組合無機(jī)過濾助劑(例如硅藻土，珍珠巖，煅制氧化硅)、纖維素纖維組合無機(jī)過濾助劑及有機(jī)樹脂，或者其任何組合，及聚合物濾膜(例如包括但不限于尼龍、聚丙烯、聚醚砜)，以達(dá)到有效除去及可接受的回收。通常地，優(yōu)選但非必需多階段的方法。例如兩階段或三階段的方法包括經(jīng)一個(gè)流經(jīng)濾膜(coursefilter)除去較大的沉淀物和細(xì)胞碎片，隨后通過標(biāo)稱孔徑大于0.2微米但小于1微米的第二個(gè)分級(jí)濾膜(stagefilter)濾清。最佳的組合可以是沉淀物大小分布以及其它變量的函數(shù)。另外，也可以使用應(yīng)用相對(duì)緊密的濾膜或者離心的單級(jí)操作進(jìn)行澄清。更通常地，任何澄清方法包括無流動(dòng)(dead-end)過濾、微濾、離心、或者過濾助劑(例如硅藻土)的主體加料與無流動(dòng)或深層過濾組合(其提供了適當(dāng)澄清度的濾液，在隨后的步驟中不淤塞濾膜和/或樹脂)，均可用于本發(fā)明的澄清步驟中。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用深層過濾和膜過濾。這方面可商購的產(chǎn)物例如在WO03/097797，p.20-21中提及?？梢允褂玫臑V膜可由不同的材料組成，可以孔徑大小不同，并且可以組合使用。這些濾膜可以商購自一些供應(yīng)商。本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在本發(fā)明的方法中某些濾膜與其它濾膜相比，出乎意料地得到了更好的結(jié)果，提供更加改良的澄清(見實(shí)施例4)。因此，在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，組合使用0.8μm和0.45μm的濾膜，優(yōu)選Sartopore-2濾膜，進(jìn)行澄清。超濾/滲濾在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，在整個(gè)過程中對(duì)病毒懸浮液進(jìn)行至少一次超濾/滲濾，例如以濃縮病毒和/或進(jìn)行緩沖液更換，和/或濃縮和滲濾澄清的收獲物。根據(jù)本發(fā)明的方法用于濃縮病毒的過程可包括任何過濾過程(例如超濾(UF))，其中病毒的濃度通過迫使稀釋劑穿經(jīng)濾膜而增加，從而稀釋劑被從病毒制備物中除去，而病毒不能通過該濾膜，由此以濃縮的形式保留在病毒制備物中。UF在例如MicrofiltrationandUltrafiltrationPrinciplesandApplications，L.ZemanandA.Zydney(MarcelDekker，Inc.，NewYork，NY，1996)中詳細(xì)描述。一種優(yōu)選的過濾方法是切向流過濾(TangentialFlowFiltration，TFF)，例如在MILLIPORE目錄中題目為″PharmaceuticalProcessFiltrationCatalogue″pp.177-202(Bedford，Massachusetts，1995/96)的文章中描述。TFF廣泛用于生物處理工業(yè)，用于細(xì)胞收獲、澄清和產(chǎn)物(包括病毒)濃縮。這個(gè)系統(tǒng)由三個(gè)不同的工業(yè)生產(chǎn)液流組成補(bǔ)料溶液、滲透物和滲余物。根據(jù)應(yīng)用情況，可以使用不同孔徑的濾膜。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，滲余物是產(chǎn)物，如果需要可進(jìn)行進(jìn)一步純化。對(duì)于這個(gè)實(shí)施方案，選擇的特殊超濾膜的孔徑要足夠小得能保留病毒，但足夠大得能有效地清除雜質(zhì)。根據(jù)廠商和膜類型，對(duì)于腺病毒而言，標(biāo)稱分子量截?cái)嘀?NMWC)在100-1000kDa之間是合適的，例如具有300kDa或者500kDaNMWC的膜。膜的組成可以是但不限于再生纖維素、聚醚砜、聚砜或其衍生物。膜可以是扁片狀或者是中空纖維。UF通常是指使用孔徑小于0.1μm的濾膜進(jìn)行過濾。產(chǎn)物通常被保留，而體積通過滲透而減少。生物制藥業(yè)中對(duì)于TFF最常用的兩種幾何結(jié)構(gòu)是平板&框架以及中空纖維模塊。進(jìn)行超濾和微濾的中空纖維裝置由Amicon和Ramicon在1970年代前期揭示(Cheryan，M.UltrafiltrationHandbook)，目前還有多家供應(yīng)商，包括Spectrum和A/GTechnology。中空纖維模塊由具有致密外層的自持纖維的陣列組成，使膜具有滲透選擇性。纖維直徑范圍是0.5mm-3mm。中空纖維模塊的一個(gè)優(yōu)勢是能提供從小膜面積(ca.16cm2)直至非常大膜面積(ca.28m2)的濾膜，使得可以線性和簡便地?cái)U(kuò)大規(guī)模。在本發(fā)明的某些優(yōu)選實(shí)施方案中，中空纖維用于TFF。據(jù)報(bào)道這些中空纖維與平面篩選膜(flatscreenmembrane)相比剪切較少，而病毒顆粒/感染單位(VP/IU)比率更好。在某些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明使用0.05μm的中空纖維。使用超濾膜的滲濾(DF)或者緩沖液更換是除去和更換鹽、糖、從結(jié)合的物質(zhì)中經(jīng)非水性溶劑分離游離的物質(zhì)、除去低分子量材料或者快速改變離子和/或pH環(huán)境的一種理想方式。微溶質(zhì)通過向超濾的溶液中以與UF速度相同的速度加入溶劑而被最有效地除去。這樣以恒定體積從溶液中洗去微量物質(zhì)，純化保留的病毒。本發(fā)明利用DF步驟更換裂解物的緩沖液，之后進(jìn)行進(jìn)一步層析或者其它純化步驟。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，通過TFF進(jìn)行DF以進(jìn)行緩沖液更換，其中加入緩沖液等于除去滲透物?？梢栽诩兓牟煌瑫r(shí)期使用UF/DF濃縮和/或緩沖液更換本發(fā)明的病毒懸浮液，例如純化裂解物和/或已經(jīng)經(jīng)過層析的那些進(jìn)一步純化的病毒懸浮液。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，裂解物通過UF/DF濃縮5倍，將所得濃縮的病毒懸浮液使用恒定體積的滲濾方法用6個(gè)滲濾體積(DFV)的包含1MNaCl的緩沖液進(jìn)行緩沖液更換。發(fā)現(xiàn)這種高鹽濃度顯著改良所得病毒的性質(zhì)，因?yàn)樵S多不希望的蛋白質(zhì)在這個(gè)步驟期間被去除(見實(shí)施例2)。因此本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案是將澄清的裂解物用包含0.8-2.0MNaCl、例如大約1MNaCl或者提供相等離子強(qiáng)度的另一種鹽的溶液更換。本領(lǐng)域技術(shù)人員明白鹽的陰離子和陽離子均可以改變。在將所述病毒懸浮液進(jìn)行陰離子交換層析之前，可以用包含0.4MNaCl或者提供相等離子強(qiáng)度的另一種鹽的緩沖液進(jìn)行緩沖液更換。在一個(gè)實(shí)施方案中，這可以通過恒定體積滲濾方法，使用4個(gè)DFV的希望的緩沖液而實(shí)現(xiàn)。進(jìn)一步純化根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，已經(jīng)通過本發(fā)明的方法獲得的病毒懸浮液優(yōu)選在裂解物澄清之后例如通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法進(jìn)行進(jìn)一步純化。這可以例如通過密度梯度離心方法而實(shí)現(xiàn)，如WO98/22588，p.59-61所論述。然而，優(yōu)選進(jìn)一步純化應(yīng)使用至少一個(gè)層析步驟，例如WO98/22588，p.61-70所論述。已經(jīng)描述了進(jìn)一步純化病毒的許多方法，其中包括層析步驟。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道這些方法，并且可以改變應(yīng)用層析步驟的實(shí)際方式以優(yōu)化本發(fā)明的方法。例如可以通過組合陰離子交換和陽離子交換層析步驟純化某些病毒，見美國專利6,008,036所論述。也可以應(yīng)用羥磷灰石介質(zhì)純化腺病毒，見WO02/44348所論述。也可以使用反向吸附步驟，例如WO03/097797，p.26所描述。對(duì)于腺病毒純化，優(yōu)選使用至少一個(gè)陰離子交換層析步驟。在陰離子交換層析步驟之后，所述病毒可以是足夠純的。然而在某些實(shí)施方案中，進(jìn)一步進(jìn)行大小排阻層析步驟以增加純化過程的強(qiáng)度。這個(gè)步驟可以在陰離子交換層析步驟之前或之后進(jìn)行。顯然，也可以將其它純化步驟與陰離子交換層析步驟適當(dāng)?shù)亟M合。陰離子交換層析在純化腺病毒中的應(yīng)用已經(jīng)充分描述，這方面因此為本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知。已經(jīng)應(yīng)用了許多不同的層析基質(zhì)純化腺病毒并且是合適的，本領(lǐng)域技術(shù)人員可易于發(fā)現(xiàn)純化該病毒的最佳陰離子交換材料，例如如下文獻(xiàn)的指導(dǎo)。美國專利5,837,520(也見于Huygheetal.，1995，HumanGeneTherapy61403-1416)描述了一種純化腺病毒的方法，其中將宿主細(xì)胞裂解物用核酸酶處理，隨后進(jìn)行陰離子交換和金屬離子親和層析。美國專利6,485,958描述了使用強(qiáng)陰離子交換層析方法純化重組腺病毒。陰離子交換層析已經(jīng)與流化床層析柱(fluidizedbedcolumn)一起應(yīng)用以純化腺病毒顆粒，見WO00/50573所述。另外，純化腺病毒顆粒的膨脹床(expandedbed)陰離子交換層析及進(jìn)行陰離子交換層析的某些層析樹脂已經(jīng)在美國專利6,586,226中描述。除了陰離子交換層析柱之外，陰離子交換膜層析產(chǎn)品如Pall(例如MustangTM系列)和Sartorius(例如Sartobind系列)生產(chǎn)的那些產(chǎn)品也是合適的。關(guān)于這些濾膜的應(yīng)用及其在腺病毒純化中的優(yōu)點(diǎn)見例如WO03/078592所述。顯然，這些濾膜的應(yīng)用也在本文所用術(shù)語“陰離子交換層析”的范圍內(nèi)。美國專利6,537,793描述了使用離子交換層析從宿主細(xì)胞中純化腺病毒的方法，特別教導(dǎo)優(yōu)選使用QSepharoseXL類型層析支持物。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，腺病毒使用QSepharoseXL層析柱進(jìn)一步純化。如上所述，所述方法可進(jìn)一步適當(dāng)?shù)貞?yīng)用大小排阻層析步驟。國際申請(qǐng)WO97/08298描述了使用某些層析基質(zhì)以防止對(duì)病毒的損害的腺病毒純化方法，包括陰離子交換和大小排阻步驟。美國專利6,261,823描述了一種純化腺病毒的方法，其中將腺病毒制備物進(jìn)行陰離子交換層析，隨后進(jìn)行大小排阻層析。在大小排阻步驟中，可以從低分子量的雜質(zhì)中進(jìn)行病毒顆粒的組分離。根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方案，將大約15-30％、優(yōu)選大約20％的柱體積加樣于大小排阻層析柱中(大小排阻層析的組分離模式)。因此，在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的方法制備的腺病毒懸浮液使用陰離子交換層析步驟和大小排阻層析步驟進(jìn)一步純化。WO03/078592描述了使用高通量陰離子交換濾膜(即含有陰離子交換基團(tuán)的帶電濾膜)進(jìn)行腺病毒(Ad5)純化。如下描述了這種帶電濾膜與陰離子交換層析柱相比的優(yōu)勢(i)較快的流速；(ii)較高的結(jié)合容量；(iii)較高的病毒回收程度；(iv)對(duì)于臨床應(yīng)用不需要包裝或者清潔確認(rèn)；(v)當(dāng)使用一次性濾筒時(shí)無有效期或者貯存問題。如上所述，這種陰離子交換濾膜的使用是本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，并且是被認(rèn)為包括在本發(fā)明的“陰離子交換層析”范圍內(nèi)的一個(gè)實(shí)施方案。然而，除了是柱層析的等價(jià)物之外，本發(fā)明人還令人驚訝地發(fā)現(xiàn)使用陰離子交換濾膜與使用陰離子交換層析柱相比純化腺病毒血清型35(Ad35)的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)未摻入腺病毒顆粒中的某些腺病毒蛋白質(zhì)通過使用陰離子交換濾膜而不是通過陰離子交換層析柱而從腺病毒顆粒中分離出。這些游離的腺病毒蛋白質(zhì)先前在重組腺病毒顆粒制備物中未被發(fā)現(xiàn)，并且通常檢測不到，但是現(xiàn)在可以使用如下步驟而除去將包含游離腺病毒蛋白質(zhì)的重組腺病毒制備物用含有陰離子交換基團(tuán)的帶電濾膜進(jìn)行過濾。使用帶電濾膜的這種效果在WO03/078592中未注意到。另外，WO03/078592未公開應(yīng)用陰離子交換濾膜純化Ad35或者B亞群的其它腺病毒顆粒。本發(fā)明因此提供了一種從重組腺病毒制備物中除去游離腺病毒蛋白質(zhì)的方法，包括如下步驟將包含游離腺病毒蛋白質(zhì)的重組腺病毒制備物用含有陰離子交換基團(tuán)的帶電濾膜進(jìn)行過濾。不希望受理論的約束，但確信B亞群的重組腺病毒顆?？赡艿妮^低穩(wěn)定性(見例如WO2004/001032)產(chǎn)生迄今未被檢測到的似乎未摻入腺病毒顆粒中的游離腺病毒蛋白質(zhì)。因此，本發(fā)明的這種特殊方法可以特別有益于純化B亞群的重組腺病毒，如Ad35、Ad11等等。然而，這種方法也可以改良更穩(wěn)定的基于Ad5或Ad2的腺病毒的純化。本發(fā)明提供了使用陰離子交換濾膜從重組腺病毒制備物中除去游離的(即未摻入病毒顆粒中的)腺病毒蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，所述重組腺病毒制備物包含重組B亞群腺病毒，如重組Ad35。本發(fā)明還提供了一種純化重組的B亞群腺病毒顆粒如Ad35顆粒的方法，所述方法包括將重組B亞群如Ad35顆粒用陰離子交換濾膜進(jìn)行純化步驟。適用于本發(fā)明這些方法中的陰離子交換濾膜為本領(lǐng)域所已知并且可商購(見WO03/078592，段落[40]-[41])，例如可購自Pall(例如MustangTM系列)和Sartorius(例如Sartobind系列)。緩沖液根據(jù)本發(fā)明，在病毒純化期間可使用許多種緩沖液。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，用于UF/DF和陰離子交換層析的緩沖液通常含有0.4-1.0MNaCl/50mMTRISpH7.5，其中NaCl的濃度根據(jù)進(jìn)行的步驟而定。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，在澄清之后使用的緩沖液不含去污劑、氯化鎂和蔗糖。這些添加劑的缺乏使得這些緩沖液與已知已確立的方案中使用的那些緩沖液不同。然而無論如何，當(dāng)應(yīng)用本發(fā)明的方法時(shí)，獲得了純化的和基本上未聚集的腺病毒。使用不含這些添加劑的緩沖液的優(yōu)點(diǎn)是較易于制備、較廉價(jià)、并且不需要檢驗(yàn)這些添加劑的去除情況。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，將腺病毒在組分離期間及最后的貯存期間用緩沖液進(jìn)行緩沖液更換，所述緩沖液也用于AdenovirusWorldStandard(Hogansonetal，Developmentofastableadenoviralvectorformulation，BioprocessingMarch2002，p.43-48)20mMTrispH8，25mMNaCl，2.5％甘油。顯然，可以使用許多其它緩沖液，適合純化的(腺)病毒制備物貯存及藥物學(xué)給藥的配方的一些實(shí)例可例如見歐洲專利No.0853660和國際專利申請(qǐng)WO99/41416、WO99/12568、WO00/29024、WO01/66137、WO03/049763所述。具有特異性插入體的載體在本領(lǐng)域，通常認(rèn)為轉(zhuǎn)基因自身與純化方法無關(guān)。然而，如本文所示，轉(zhuǎn)基因在特定情況中可通過其在宿主細(xì)胞或病毒中的表達(dá)影響病毒的性質(zhì)或者可對(duì)純化病毒的過程有影響。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的一種這樣的非限制性的特殊情況是其中所述轉(zhuǎn)基因是埃博拉病毒核蛋白。使用標(biāo)準(zhǔn)的純化方法純化含有埃博拉病毒核蛋白基因的腺病毒載體導(dǎo)致表達(dá)的埃博拉病毒核蛋白的共純化。未觀察到一些其它轉(zhuǎn)基因表達(dá)的蛋白質(zhì)的共純化(例如未觀察到與埃博拉病毒糖蛋白dTM(Sudan)、埃博拉病毒糖蛋白dTM(Zaire)、麻疹血凝素蛋白(MV-H)的共純化)。這提示埃博拉病毒核蛋白與腺病毒之間的特異性相互作用，這種作用似乎依賴于埃博拉病毒核蛋白的特性。預(yù)期其它核酸結(jié)合蛋白具有相似的特性，并預(yù)期與腺病毒相互作用導(dǎo)致共純化。對(duì)于具有這種轉(zhuǎn)基因包括核酸結(jié)合蛋白如核蛋白如埃博拉病毒核蛋白的腺病毒，將緩沖液更換為鹽濃度高于1MNaCl及使用例如2-5MNaCl緩沖液以改良終產(chǎn)物質(zhì)量是有益的(見實(shí)施例3)。緩沖液更換可適當(dāng)?shù)赝ㄟ^TFF進(jìn)行?；蛘撸梢允褂闷渌彌_液更換方法，例如通過添加固體材料或者濃縮的溶液，鹽可以直接逐步加入病毒懸浮液中。本發(fā)明的這個(gè)方面與本發(fā)明的其它方面組合是有益的，例如與在細(xì)胞裂解之前加入核酸酶組合，但不限于此。本文描述了使用這種高鹽緩沖液出乎意料地未導(dǎo)致聚集問題，也未導(dǎo)致純化的病毒顆粒的感染性或完整性顯著劣化。在本發(fā)明的這個(gè)方面中，緩沖液更換步驟優(yōu)選在病毒從陰離子交換層析中洗脫之后進(jìn)行，優(yōu)選在進(jìn)一步純化步驟之前進(jìn)行，這種進(jìn)一步純化步驟例如是以組分離模式進(jìn)行的大小排阻步驟。這一最后步驟可用于濾清病毒懸浮液，即除去在陰離子交換后可能仍存在的少量雜質(zhì)，也可以用于直接在組分離柱上進(jìn)行緩沖液更換?；蛘?，代替大小排阻層析，進(jìn)一步純化步驟可包括通過親水性濾膜過濾包含高濃度鹽的病毒懸浮液，所述濾膜例如是DuraporePVDF濾膜(例如Millipore的Millipac)或者Sartopore2濾膜。所述濾膜優(yōu)選孔徑為1.2μm，更優(yōu)選孔徑更小例如1.0μm，更優(yōu)選孔徑更小例如為0.8μm、0.45μm或者0.22μm。出乎意料地發(fā)現(xiàn)埃博拉病毒的核蛋白(NP)在這些條件下通過被濾膜滯留而從重組腺病毒中分離，而NP(分子量為大約100kD)預(yù)期與腺病毒一起通過濾膜孔。使用這些濾膜提供了從病毒中分離核蛋白的快速方案，這種方法不需要在高鹽濃度中延長溫育時(shí)間，同時(shí)可以從病毒中完全除去核蛋白(圖9)。當(dāng)然，在這種過濾步驟后仍可以應(yīng)用大小排阻層析步驟，以除去其它少量污染物和/或進(jìn)行緩沖液更換。使用高鹽除去DNA結(jié)合蛋白是本發(fā)明的一方面，預(yù)期可用于除了腺病毒之外的其它病毒。在這種情況中可以應(yīng)用另一個(gè)柱層析步驟代替陰離子交換層析。重要的因素似乎是要在應(yīng)用高鹽步驟之前充分除去污染物，當(dāng)然這種除去可以通過除了陰離子交換層析之外的其它方式進(jìn)行，對(duì)于重組腺病毒也如此。因此，本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種生產(chǎn)包含編碼核酸結(jié)合蛋白的核酸序列的病毒的方法，所述方法包括如下步驟a)培養(yǎng)已經(jīng)感染了病毒的宿主細(xì)胞；b)將所述宿主細(xì)胞的培養(yǎng)物和其中產(chǎn)生的所述病毒進(jìn)行宿主細(xì)胞的裂解，提供包含所述病毒的裂解物；c)將病毒進(jìn)行陰離子交換層析，其特征在于在陰離子交換層析后將含有病毒的混合物用包含至少1MNaCl或者提供相等離子強(qiáng)度的另一種鹽的溶液進(jìn)行緩沖液更換。優(yōu)選地，將病毒使用至少一個(gè)包含親水性濾膜過濾的步驟和/或使用至少一個(gè)包含大小排阻層析的步驟而進(jìn)一步純化。對(duì)于這些實(shí)施方案，將包含至少1MNaCl或者提供相等離子強(qiáng)度的另一種鹽的溶液稱作“高鹽”溶液。顯然，本領(lǐng)域技術(shù)人員已知陰離子和陽離子均可以被改變，只要提供足夠的離子強(qiáng)度而無沉淀或者其它不希望的副作用如病毒失活即可，因?yàn)樗龇椒ê芸赡芤蕾囉谄茐腄NA結(jié)合蛋白與純化的病毒之間的離子相互作用。例如，NaCl可以部分或全部由其它的鹽代替，例如由KCl、磷酸鈉、CsCl、LiCl、(NH4)2SO4、NH4Cl、NaBr、NaI、KBr、KI、KNO3、NaHCO3、KHSO4等等代替。本發(fā)明實(shí)施例中使用的5×稀釋的緩沖液(包含5MNaCl)電導(dǎo)率為78-79mS/cm。根據(jù)本發(fā)明，現(xiàn)在可以例如容易地對(duì)含有其它鹽并具有相似或更高電導(dǎo)率的緩沖液進(jìn)行測試，以測試其從部分純化的病毒中除去DNA結(jié)合蛋白的適合性。預(yù)期這個(gè)實(shí)施方案直至飽和的NaCl濃度(即大約6MNaCl)都將是有效的，但因?yàn)橐恍?shí)際的原因優(yōu)選使用不飽和的緩沖液，例如5MNaCl。優(yōu)選地，所述溶液包含至少1.5MNaCl，或者提供相等離子強(qiáng)度的另一種鹽。更優(yōu)選地，所述溶液包含至少2MNaCl，或者提供相等離子強(qiáng)度的另一種鹽。更優(yōu)選地，所述溶液包含至少3MNaCl，或者提供相等離子強(qiáng)度的另一種鹽。更優(yōu)選地，所述溶液包含至少4MNaCl，或者提供相等離子強(qiáng)度的另一種鹽。更優(yōu)選地，所述溶液包含至少5MNaCl，或者提供相等離子強(qiáng)度的另一種鹽。包含病毒的高鹽溶液可溫育一定時(shí)間，優(yōu)選至少1小時(shí)，更優(yōu)選至少2小時(shí)。一般地，實(shí)施例示出當(dāng)溫育時(shí)間更長、至少直至過夜溫育時(shí)，從病毒中純化的DNA結(jié)合蛋白增多。另外，較高的離子強(qiáng)度看起來改良純化。因此，可以想像即使在1M或者1.5MNaCl的離子強(qiáng)度和延長的溫育時(shí)間例如至少2天或1周的情況下，也可以從病毒中純化DNA結(jié)合蛋白。這可以通過本發(fā)明所述的實(shí)驗(yàn)常規(guī)檢測。在包含5MNaCl的緩沖液中過夜溫育表達(dá)埃博拉病毒核蛋白的重組腺病毒從病毒中除去了污染性的核蛋白至低于檢測限，因此這是本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述病毒是一種重組腺病毒。在某些實(shí)施方案中，所述核酸結(jié)合蛋白是病毒的核蛋白。在某些實(shí)施方案中，所述核酸結(jié)合蛋白是埃博拉病毒核蛋白。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，緩沖液更換步驟在陰離子交換層析之后及過濾和/或大小排阻層析步驟之前進(jìn)行。進(jìn)一步優(yōu)選包括用核酸酶處理裂解物，其中根據(jù)本發(fā)明的其它方面優(yōu)選在細(xì)胞裂解完成之前向細(xì)胞培養(yǎng)物中加入核酸酶。代替高鹽，或者除了高鹽之外，可以加入去污劑以從污染性的DNA結(jié)合蛋白中純化病毒。在一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，本發(fā)明人示出加入1％Tween20在表達(dá)埃博拉病毒核蛋白的重組腺病毒中顯著降低污染性的核蛋白。當(dāng)然，也可以適當(dāng)?shù)販y試其它去污劑，濃度可以變化(例如在大約0.2％-5％之間)，以發(fā)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明從重組病毒制備物中除去DNA結(jié)合蛋白的最佳條件。在這個(gè)方面，優(yōu)選加入至少1％的去污劑。然而，本發(fā)明人的第一個(gè)實(shí)驗(yàn)表明高鹽溫育具有更高的再現(xiàn)性，并因此是優(yōu)選的。重組腺病毒的批次一方面，本發(fā)明提供了包含選自如下一組的轉(zhuǎn)基因的重組腺病毒批次埃博拉病毒核蛋白、埃博拉病毒糖蛋白、惡性瘧原蟲環(huán)子孢子基因、麻疹病毒血凝素，所述批次的特征在于每1E11病毒顆粒含有少于0.1ng宿主細(xì)胞DNA。當(dāng)然，這些轉(zhuǎn)基因與天然發(fā)現(xiàn)的野生型序列(包括所有分離株或亞型)相比任選可含有缺失、添加和/或突變，這些轉(zhuǎn)基因在本發(fā)明的范圍內(nèi)。顯然，如果不是審批目的所需的，對(duì)于對(duì)對(duì)象進(jìn)行給藥，提供這種具有低劑量污染性宿主細(xì)胞DNA的批次是有益的。在優(yōu)選的方面，所述批次特征在于每1011個(gè)病毒顆粒含有少于0.08ng、優(yōu)選少于0.06ng、更優(yōu)選少于0.04ng宿主細(xì)胞DNA。實(shí)施例如下實(shí)施例是為了通過本發(fā)明的某些實(shí)施方案進(jìn)一步例證本發(fā)明，而無限制本發(fā)明范圍之意。實(shí)施例1向細(xì)胞培養(yǎng)物中而非向宿主細(xì)胞裂解物中加入核酸酶改良病毒純化方法在這個(gè)實(shí)施例中，示出在細(xì)胞裂解之前向細(xì)胞培養(yǎng)物中加入核酸酶減少最終純化的產(chǎn)物中殘留的宿主細(xì)胞DNA的量。在實(shí)驗(yàn)1和實(shí)驗(yàn)2中，將10升PERC.6細(xì)胞培養(yǎng)物在感染腺病毒載體后2.5天用1％TritonX-100(Sigma)裂解。在裂解后30分鐘，加入Benzonase(MerckKgaA，50單位/ml)和MgCl2(2mM)。再過30分鐘后，將TritonX-100/Benzonase(T/B)收獲物通過過濾澄清。這是根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)。在實(shí)驗(yàn)3-8中，將Benzonase(50U/ml)和MgCl2(2mM)加入10升PERC.6細(xì)胞培養(yǎng)物中(感染后2.5天)，溫育10分鐘后將細(xì)胞用1％TritonX-100裂解。再溫育50分鐘后，通過過濾澄清Benzonase/TritonX-100(B/T)收獲物。這兩種方法的不同之處在于核酸酶(Benzonase)和去污劑(TritonX-100)加入的順序傳統(tǒng)上首先裂解細(xì)胞，隨后加入核酸酶(在此稱作T/B收獲物)，而在本發(fā)明的方法中，首先加入核酸酶，隨后使細(xì)胞裂解(在此稱作B/T收獲物)。見圖1所示。然后將樣品進(jìn)一步純化。通過深層過濾(0.5μmClarigard濾膜，Millipore)進(jìn)行澄清，隨后經(jīng)過0.8/0.45μmSartopore2(Sartorius)濾膜進(jìn)一步澄清。將澄清物經(jīng)過0.05μm中空纖維(Spectrum)濃縮5倍，隨用用6體積的1.0MNaCl/50mMTRISpH7.5和4體積的0.4MNaCl/50mMTrispH7.5滲濾。將經(jīng)滲濾的滲余物加樣于SepharoseQ-XL(Amersham)柱上，用0.55MNaCl/50mMTRISpH7.5洗脫病毒級(jí)分。將此級(jí)分進(jìn)一步純化并用Sepharose4FF(Amersham)柱進(jìn)行緩沖液更換。將產(chǎn)生的純化產(chǎn)物使用中空纖維(0.05μm孔徑，Spectrum)濃縮至希望的濃度，經(jīng)0.22μm濾膜過濾并等份。通過Q-PCR分析純化的產(chǎn)物樣品中殘留的宿主細(xì)胞DNA。T/B處理導(dǎo)致在進(jìn)一步后續(xù)處理之后DNA含量減少，可以正好符合對(duì)終產(chǎn)物(filledandfinishedmaterial)的要求?；铙w病毒配制品中殘留的宿主細(xì)胞DNA的規(guī)定量是＜10ng/劑(假定一劑含有1E11病毒顆粒)。如表1所示，顛倒TritonX-100和Benzonasea步驟顯著減少了純化產(chǎn)物中殘余的宿主細(xì)胞DNA的量在主動(dòng)裂解細(xì)胞之前加入核酸酶可以使殘余宿主細(xì)胞DNA的量減少10-40倍，直至小于0.1ng/μl病毒顆粒。另外，從SDS-PAGE分析(圖2)中顯然可見通過深層過濾和膜過濾B/T收獲物，在澄清期間除去了許多宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)，其中包括顯著量的組蛋白(在凝膠上分子量為大約10-20kD，通過質(zhì)譜分析證實(shí))，而這些蛋白質(zhì)顯然仍存在于澄清的T/B收獲物中。因此，本發(fā)明的方法明顯優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)已知的那些方法。不希望受理論約束，對(duì)于實(shí)驗(yàn)1和2(T/B)與實(shí)驗(yàn)3-8(B/T)之間差別的解釋可包括1.通過加入Benzonase，由于病毒的產(chǎn)生而從裂解的細(xì)胞中釋出的DNA可能已經(jīng)被消化。只要DNA從Triton裂解的細(xì)胞中一釋出，存在的Benzonase立即消化該DNA，從而防止大的DNA聚集體形成。未聚集的DNA的消化可能比大的DNA聚集體的消化效率更高。2.Benzonase的總溫育時(shí)間增加30分鐘，導(dǎo)致更有效的消化(見Benzonase手冊(cè)MerckKGaA編號(hào)W214950)。3.當(dāng)DNA在釋出后立即被消化時(shí)，可能形成較大的組蛋白復(fù)合物，這些較大的顆粒通過澄清濾膜滯留。在澄清期間組蛋白-DNA復(fù)合物的滯留可能也有助于減少殘留的宿主細(xì)胞DNA。一些陰離子交換樹脂已經(jīng)被測試，例如QAE550C和SuperQ650M(購自Tosoh)，QSepharoseHP，ANXSepharose4FF，DEAESepharose，QSepharoseXL，QSepharoseBigBead和QSepharoseFF(購自Amersham)。盡管所有這些樹脂均適于純化重組腺病毒，但我們發(fā)現(xiàn)基于從宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)和宿主細(xì)胞DNA中分離病毒和流動(dòng)特性，QSepharoseXL最適合我們的目的。一些大小排阻樹脂被測試，例如SephacrylS300，SephacrylS500Sepharose4FF和Sepharose6FF(均購自Amersham)。盡管所有這些樹脂均適于純化重組腺病毒，但我們發(fā)現(xiàn)基于從宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)和DNA中分離病毒的能力，Sepharose4FF最適于我們的目的?；谶@些及其它結(jié)果(見下文)，本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方法示于圖4。實(shí)施例2用高鹽緩沖液進(jìn)行緩沖液更換改良病毒處理將PER.C6細(xì)胞在10L生物反應(yīng)器中生長并用Ad5.Adapt.MV-H(用麻疹病毒血凝素作為轉(zhuǎn)基因，在WO2004/037294中描述)感染。感染后2.5天，將細(xì)胞用1％TritonX-100裂解，30分鐘后加入Benzonase(50單位/ml)和MgCl2并再溫育30分鐘。將收獲物經(jīng)過0.5μmClarigard濾膜及隨后經(jīng)過MillistakDE30/60濾膜(Millipore)過濾澄清。將澄清的收獲物用等體積的0.6MNaCl/50mMHEPESpH7.5稀釋，導(dǎo)致終濃度為0.3MNaCl，將稀釋的澄清收獲物用500kDflatscreencassette(Biomax500，Pellicon2moduleMillipore)濃縮4倍，隨后用2個(gè)滲濾體積(DFV)的0.3MNaCl/50mMHEPESpH7.5；2個(gè)DFV的0.6MNaCl/50mMHEPESpH7.5；2個(gè)DFV的1.0MNaCl/50mMHEPESpH7.5及3個(gè)DFV的0.3MNaCl/50mMHEPESpH7.5滲濾。測定產(chǎn)生的滲透物的電導(dǎo)率，并通過SDS-PAGE分析樣品(圖3)。數(shù)據(jù)示出當(dāng)滲透物(及因此的滲余物)的鹽濃度在0.55和0.85MNaCl范圍或更高時(shí)，組蛋白(在凝膠上分子量為大約10-20kD，通過質(zhì)譜分析證實(shí))穿過濾膜孔。一種可能的解釋是在這些鹽條件下靜電相互作用被破壞，導(dǎo)致組蛋白從復(fù)合物中釋出，穿過500kD孔。從這個(gè)實(shí)驗(yàn)中推斷在UF/DF步驟期間導(dǎo)入高鹽緩沖液可以更有效地除去宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)，特別是組蛋白。盡管在這個(gè)實(shí)施例中首先使細(xì)胞裂解，隨后用核酸酶處理(T/B)，但預(yù)期針對(duì)高鹽強(qiáng)度(高于0.55MNaCl，例如1MNaCl)的緩沖液進(jìn)行滲濾在本發(fā)明的方法中也是有益的，其中在細(xì)胞裂解之前向其中加入核酸酶(B/T，見實(shí)施例1)，盡管在B/T方法中已經(jīng)只有少量組蛋白污染(見圖2)。因此，在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，澄清的裂解物用包含0.8-2.0MNaCl、優(yōu)選大約1MNaCl或者提供相等離子強(qiáng)度的另一種鹽的溶液更換(見實(shí)施例1和圖4)。實(shí)施例3從重組病毒制備物中除去污染的核蛋白具有埃博拉病毒核蛋白作為轉(zhuǎn)基因的重組腺病毒的產(chǎn)生如實(shí)施例5所描述。在這個(gè)實(shí)施例中描述了這種病毒的純化。實(shí)驗(yàn)3.1Ad5dE3x.Adapt.Ebo.NP使用所述方案純化(見實(shí)施例1，圖4)。這種方法導(dǎo)致表達(dá)的埃博拉病毒核蛋白(NP)轉(zhuǎn)基因與病毒的共純化。將終產(chǎn)物(filledandfinishedproduct)用含有5MNaCl(終濃度為2.5M)或者2％Tween20(終濃度為1％)的緩沖液以1∶2稀釋，在室溫溫育1小時(shí)，之后加樣于Sepharose4FF柱上。對(duì)空的(void)和滯留級(jí)分通過SDS-PAGE分析。結(jié)果(圖5)示出空的級(jí)分含有不含污染性完整NP的5型腺病毒。迄今為止，用高鹽獲得的結(jié)果看起來可再現(xiàn)，而用去污劑的則不能再現(xiàn)，因此優(yōu)選高鹽。然而對(duì)于去污劑的最佳條件可以通過改變使用的去污劑及其濃度而測試。結(jié)論Ad5dE3x.Adapt.Ebo.NP載體可以從埃博拉病毒核蛋白中純化，所述純化通過在含有2.5MNaCl或者1％Tween、優(yōu)選2.5MNaCl的緩沖液中溫育，隨后在4FFsepharose上分離而實(shí)現(xiàn)。實(shí)驗(yàn)3.2Ad5dE3x.Adapt.Ebo.NP使用所述方案純化(見實(shí)施例1，圖4)。終產(chǎn)物使用10kD膜用含有1、2、3或者5MNaCl的50mMTRIS緩沖液pH7.5透析。將Ad5.Ebo.NP在這些緩沖液中溫育2小時(shí)或者過夜，之后加樣于Sepharose4FF柱上。對(duì)空的和滯留的級(jí)分通過SDS-PAGE分析。結(jié)果示出空的級(jí)分含有明顯較少NP的5型腺病毒。如表2所示，NP除去的量與鹽濃度和溫育時(shí)間相關(guān)。結(jié)論通過在含有2-5MNaCl的緩沖液中溫育，隨后在4FFsepharose上分離，Ad5dE3x.Adapt.Ebo.NP載體可以從埃博拉病毒核蛋白中純化。在4FF柱分離之前較長的溫育時(shí)間和較高的鹽濃度產(chǎn)生較高純度的Ad5.Ebo.NP載體(除去更多的核蛋白)。使用相同的方法，以較長時(shí)間溫育(例如2天，1周)對(duì)1M和1.5MNaCl濃度進(jìn)行測試，以發(fā)現(xiàn)在這些鹽強(qiáng)度下進(jìn)行較長時(shí)間溫育是否可以滿足純化需要。實(shí)驗(yàn)3.3這個(gè)實(shí)驗(yàn)示于圖6。將PERC.6細(xì)胞在10L生物反應(yīng)器中生長并用Ad5.dE3x.Adapt.Ebo.NP感染。感染后2.5天，向細(xì)胞培養(yǎng)物中加入Benzonase(50單位/ml)和MgCl2，10分鐘后將細(xì)胞用1％TritonX-100裂解，再溫育50分鐘。將收獲物經(jīng)過0.5μmClarigard濾膜澄清，隨后經(jīng)過Sartopore2濾膜(0.8/0.45μm，Sartorius)澄清。將澄清的收獲物分成兩部分。一部分使用0.5μm中空纖維(Spectrum)濃縮5倍并用含有5MNaCl/50mMTrispH7.5的緩沖液滲濾。這樣導(dǎo)致跨膜壓力(TMP)增加和滲透物流量減少，同時(shí)滲余物看起來變?yōu)榘咨该鞫冉档停砻鞯鞍踪|(zhì)沉淀。將澄清的收獲物的第二部分使用0.5μm中空纖維(Spectrum)濃縮5倍，并用6DFV的1.0MNaCl/50mMTRISpH7.5及隨后用4DFV的0.4MNaCl/50mMTRISpH7.5滲濾。最終的滲余物經(jīng)過SepharoseQ-XL柱(Amersham)純化。將Q-XL洗脫物也分成兩部分。將一部分以組分離模式(加樣20％柱體積)經(jīng)過大小排阻柱(Sepharose4FF)進(jìn)一步純化并用25mMNaCl/20mMTRIS/2.5％甘油(配制緩沖液)進(jìn)行緩沖液更換，這樣產(chǎn)生圖6所示產(chǎn)物A。將另一部分使用0.05μm中空纖維(Spectrum)用6DFV的5MNaCl/50mMTRISpH7.5滲濾，這被進(jìn)一步稱作高鹽病毒級(jí)分。盡管中空纖維的孔徑(0.05μm，大約800kD)足夠大，可以通過100kD核蛋白，但在滲透物中無核蛋白可被檢測到，并且在滲余物中核蛋白的量未見減少?？赡苁且换蚨鄠€(gè)TFF參數(shù)的調(diào)節(jié)(例如剪切增加)可以改良核蛋白的純化。我們進(jìn)一步使用大小排阻(組分離)方法實(shí)現(xiàn)這個(gè)目標(biāo)。將高鹽病毒級(jí)分再次分成兩部分，一部分經(jīng)過大小排阻(組分離)柱直接純化并用配制緩沖液進(jìn)行緩沖液更換(圖6中產(chǎn)物B)，而第二部分在室溫貯存過夜，之后經(jīng)過大小排阻(組分離)柱純化和進(jìn)行緩沖液更換(圖6中產(chǎn)物C)。對(duì)這三個(gè)純化的產(chǎn)物進(jìn)行分析以確定純度、感染性、產(chǎn)量、聚集和轉(zhuǎn)基因表達(dá)。SDS-PAGE和Western分析示于圖7，示出完整的核蛋白以及NP降解產(chǎn)物(通過質(zhì)譜分析證實(shí)是NP降解產(chǎn)物)分別從產(chǎn)物A、B和C中逐步增加地被除去。反向分析(RP-HPLC)(圖8)示出完整核蛋白以及NP降解產(chǎn)物(在39分鐘洗脫)的量通過進(jìn)行高鹽滲濾步驟從大約50％(產(chǎn)物A)降低至＜5％(產(chǎn)物B)，在5MNaCl中室溫貯存過夜后甚至低于檢測限度1％(產(chǎn)物C)。使用這兩種分析方法均未觀測到對(duì)病毒蛋白的作用。轉(zhuǎn)基因表達(dá)示出，感染性未受影響及無聚集發(fā)生(對(duì)于所有這三個(gè)產(chǎn)物A、B和C)。顯然，重組病毒在高鹽中甚至溫育過夜也不導(dǎo)致病毒質(zhì)量的明顯降低。代替使用或者除了使用延長溫育時(shí)間的高鹽和隨后的大小排阻層析之外，將用5MNaCl緩沖液更換的病毒懸浮液直接使用0.45μm親水性濾膜(Millipac20)過濾。出乎意料地，這樣導(dǎo)致NP完全從病毒中除去(圖9)。使用不同孔徑(例如1.2、1.0、0.8、0.22μm)的濾膜重復(fù)這個(gè)實(shí)驗(yàn)以確定可能的孔徑范圍。對(duì)0.8/0.45μmSartopore-2組合也進(jìn)行了測試。這個(gè)過濾步驟可適當(dāng)?shù)嘏c隨后的大小排阻層析步驟組合，并且在高鹽溶液中可能需要較短的病毒溫育時(shí)間，使得處理時(shí)間可能縮短。結(jié)論1.用5MNaCl對(duì)澄清的收獲物進(jìn)行滲濾是不可能的，可能是因?yàn)榘l(fā)生宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)沉淀。2.高度純化的Ad5dE3x.Adapt.Ebo.NP在5MNaCl中溫育，隨后在Sepharose4FF上分離或者通過親水性濾膜過濾導(dǎo)致Ad5dE3x.Adapt.Ebo.NP從埃博拉病毒核蛋白中純化。3.使得溫育步驟從2小時(shí)延長至過夜導(dǎo)致殘留的核蛋白從＜5％進(jìn)一步減少至＜1％。通過親水性濾膜的過濾可減少需要的溫育時(shí)間而獲得相同的結(jié)果。因此，可以通過在至少2MNaCl、優(yōu)選至少3MNaCl、更優(yōu)選5MNaCl中溫育而從表達(dá)核酸結(jié)合蛋白如核蛋白，例如埃博拉病毒核蛋白的重組病毒中除去這些蛋白質(zhì)，從而純化成批的這種病毒。實(shí)施例4測試用于澄清的不同濾膜將PER.C6細(xì)胞在10L生物反應(yīng)器中生長，并在獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中用不同的重組腺病毒感染。在感染后2.5天，將細(xì)胞用1％TritonX-100裂解，30分鐘后加入Benzonase(50單位/ml)和MgCl2并再溫育30分鐘。將收獲物用于澄清實(shí)驗(yàn)。深層濾膜例如Clarigard和Polygard濾膜具有高度回收(＞90％)及良好的除去細(xì)胞碎片能力(顯微鏡分析)，發(fā)現(xiàn)其可適合用作初始的澄清濾膜。然而，過濾物看起來仍然是乳白色的。發(fā)現(xiàn)MillistakDE30/60和CE50不太適合用于過濾T/B收獲物，因?yàn)闀?huì)喪失病毒(20-45％)。在后來的級(jí)分中，產(chǎn)量增加但乳白色的滲余物降低，表明達(dá)到過濾容量。對(duì)一些濾膜進(jìn)行測試以進(jìn)一步澄清通過Clarigard過濾產(chǎn)生的過濾物；例如Milligard0.5μm、1.2μm和1.2/0.22μm，Durapore0.22和0.65μm，Lifegard1.0和2.0μm(全部Millipore)和Sartopore-20.8/0.45μm(Sartorius)。Sartopore2濾膜在這些測試的濾膜中是唯一具有乳白色物良好滯留、高容量(＞20ml/cm2)以及高病毒產(chǎn)量(＞95％)的濾膜。將澄清的收獲物使用平板篩(flatscreen)或者中空纖維模塊濃縮和滲濾。測試一些濾膜過濾終滲余物的情況，優(yōu)選0.45μm孔徑，以使得終滲余物適于層析，所述濾膜例如Millipack20，Lifegard1.0μm，Polygard0.6μm，InterceptQ、Milligard1.2/0.5μm。同樣，Sartopore2濾膜是測試的那些濾膜中唯一具有乳白色物良好滯留、高容量以及高病毒產(chǎn)量(＞95％)的濾膜。盡管這些實(shí)驗(yàn)使用T/B收獲物進(jìn)行，但隨后的實(shí)驗(yàn)證實(shí)上述結(jié)果也同樣產(chǎn)生于根據(jù)本發(fā)明的B/T收獲物，因此使用本發(fā)明的方法，Sartopore2濾膜提供非常好的結(jié)果。因此，對(duì)于本發(fā)明方法中的澄清步驟，優(yōu)選使用0.8μm和0.45μm濾膜的組合，優(yōu)選使用Sartopore2濾膜。實(shí)施例5不同的重組腺病毒的產(chǎn)生和純化使用本發(fā)明的方法純化各種重組腺病毒。這些病毒可例如根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法，通過在包裝細(xì)胞中基因組的左側(cè)端部分(有時(shí)稱作“銜接子質(zhì)粒(adapter-plasmid)”，用于方便地克隆轉(zhuǎn)基因)和右側(cè)端部分的同源重組而產(chǎn)生，例如EP0955373、WO03/104467和WO2004/001032所述。病毒可以在本領(lǐng)域已知的包裝細(xì)胞中增殖，這些包裝細(xì)胞例如為293細(xì)胞、PER.C6TM細(xì)胞(例如在ECACC中以保藏號(hào)96022940保藏的細(xì)胞，見美國專利5,994,128所述)或者表達(dá)Ad35的E1B55K蛋白的PER.E1B55K細(xì)胞(見美國專利6,492,169所述)。根據(jù)本發(fā)明的方法純化的重組腺病毒的構(gòu)建在這個(gè)實(shí)施例中描述。具有埃博拉病毒轉(zhuǎn)基因的腺病毒pAdapt.EbolaNP的產(chǎn)生使用正向引物64015′GCACCGGTGCCGCCATGGATTCTCGTCCTCA3′(SEQ.ID.NO.1)和反向引物64015′GCGCTAGCTCACTGATGATGTTGCAG3′(SEQ.ID.NO.2)，將編碼埃博拉病毒Zaire亞型核蛋白的基因通過聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增，以導(dǎo)入限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)和最佳翻譯起始的共有序列(KozakM，1987，AtleastsixnucleotidesprecedingtheAUGinitiatorcodonenhancetranslationinmammaliancells.JMolBiol.20947-950)，以在pAdAptTM中定向克隆(見EP0955373)。PCR反應(yīng)在BiometraT1或T3熱循環(huán)儀中進(jìn)行，使用10μm每種引物、0.75μlVRC6401的微量制備的DNA(見WO03/028632)、1.5單位PwoDNA聚合酶、5μl0×PCR緩沖液、0.5μl20mMdNTP，在如下條件下進(jìn)行反應(yīng)1個(gè)循環(huán)5′94℃、1′50℃、4′72℃；5個(gè)循環(huán)1′94℃、1′50℃、4′72℃；20個(gè)循環(huán)1′94℃、1′62℃、4′72℃；1個(gè)循環(huán)1′94℃、1′62℃、10′72℃。隨后將正確大小的PCR產(chǎn)物用PinAI(AgeI的同切點(diǎn)酶)消化，連接進(jìn)用PinAI和HpaI消化的pAdAptTM載體中。在將片段在室溫連接2小時(shí)后，將50％的混合物通過熱激轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5αT1R細(xì)胞，并鋪板于補(bǔ)加了50μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂平板上。挑取20個(gè)菌落并在補(bǔ)加了氨芐青霉素的LB中在37℃生長過夜。微量制備的DNA使用QiagenminiprepSpin試劑盒根據(jù)廠商指導(dǎo)進(jìn)行提取。在用HindIII和XbaI進(jìn)行限制酶分析之后，選擇正確的克隆，通過DNA序列分析進(jìn)一步檢測。pAdapt.EbolaGP(Z)的產(chǎn)生使用正向引物6001(5′CCCAAGCTTGCCGCCATGGGCGTTACAGG3′)(SEQ.ID.NO.3)和反向引物6001(5′GGCTCTAGATTACTAAAAGACAAATTTGC3′)(SEQ.ID.NO.4)，將編碼埃博拉病毒Zaire亞型全長糖蛋白的基因通過PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)在BiometraT1或T3熱循環(huán)儀中進(jìn)行，使用10μM每種引物、100ng和25ngVRC6001的DNA(見WO03/028632)、1.5單位PwoDNA聚合酶、5μl10×PCR緩沖液、0.5μl20mMdNTP，在如下條件下進(jìn)行反應(yīng)1個(gè)循環(huán)5′94℃、1′55℃、4′72℃；5個(gè)循環(huán)1′94℃、1′55℃、4′72℃；20個(gè)循環(huán)1′94℃、1′64℃、4′72℃；1個(gè)循環(huán)1′94℃、1′64℃、10′72℃。隨后將正確大小的PCR產(chǎn)物用HindIII和XbaI消化，連接進(jìn)同樣消化的pAdAptTM載體中。在室溫將片段連接2小時(shí)后，將50％的混合物通過熱激轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5αT1R細(xì)胞，并鋪板于補(bǔ)加50μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂平板上。挑取菌落并在37℃在補(bǔ)加氨芐青霉素的LB平板上生長過夜。微量制備的DNA使用QiagenminiprepSpin試劑盒根據(jù)廠商指導(dǎo)進(jìn)行提取。在用HindIII和XbaI進(jìn)行限制酶分析后，選擇正確的克隆并通過DNA序列分析進(jìn)一步檢測。pAdapt.EbolaGPdTM(Z)和pAdapt.EbolaGPdTM(S)的產(chǎn)生如上述相似地將編碼缺失C末端29個(gè)氨基酸的長跨膜結(jié)構(gòu)域的埃博拉病毒Zaire亞型和Sudan/Gulu糖蛋白的密碼子優(yōu)化的序列(分別為GPdTM(Z)和GPdTM(S)，也見WO03/028632所述)克隆進(jìn)pAdapt中。具有埃博拉病毒轉(zhuǎn)基因的重組腺病毒的產(chǎn)生將具有不同插入體的pAdapt質(zhì)粒(pAdapt.EbolaNP、pAdapt.EbolaGP(Z)、pAdapt.EbolaGPdTM(S)、pAdapt.EbolaGPdTM(Z))，用于通過與包含腺病毒5型基因組的剩余部分的質(zhì)粒(質(zhì)粒pWE/Ad.AflII-rITRspΔE3，其是在E3區(qū)域(XbaI區(qū)域)具有1878bp缺失的pWE/Ad.AflII-rITRsp(見EP0955373)，其用于腺病毒基因組的右端)根據(jù)熟知的方法(例如EP0955373所述方法)進(jìn)行同源重組形成重組腺病毒，產(chǎn)生分別稱作Ad5dE3x.Adapt.Ebo.NP、Ad5dE3x.Adapt.Ebo.GP(Z)、Ad5dE3x.Adapt.Ebo.GPdTM(S)和Ad5dE3x.Adapt.Ebo.GPdTM(Z)的病毒。當(dāng)然，所述轉(zhuǎn)基因可以相似地克隆進(jìn)不同血清型的腺病毒載體中，如克隆進(jìn)Ad35中，產(chǎn)生衍生自那些血清型的重組腺病毒(見例如WO00/70071所述)。具有瘧原蟲轉(zhuǎn)基因的腺病毒pAdapt.CS.PFalc和pAdapt535.CS.Pfalc的產(chǎn)生如WO2004/055187所述，合成惡性瘧原蟲的密碼子優(yōu)化的環(huán)子孢子(CS)基因并克隆進(jìn)pCR-script(Stratagene)中，產(chǎn)生克隆02-659。將CS基因克隆進(jìn)pAdapt和pAdapt535(見WO2004/001032)中，以分別產(chǎn)生重組Ad5和重組Ad35載體。將克隆02-659和兩種pAdapt載體均用HindIII和BamHI消化并連接。在室溫將片段連接2小時(shí)后，將50％的混合物通過熱激轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5αT1R細(xì)胞，鋪板于補(bǔ)加了50μg/ml氨芐青霉素LB瓊脂上。挑取菌落并在補(bǔ)加氨芐青霉素的LB中在37℃生長。微量制備的DNA使用QiagenminiprepSpin試劑盒進(jìn)行提取。在用HindIII和XbaI進(jìn)行限制酶分析后，選擇正確的克隆并通過DNA序列分析進(jìn)一步檢測。如下產(chǎn)生具有惡性瘧原蟲CS基因的重組腺病毒血清型5(見例如EP0955373所述，也見于WO2004/055187所述)。將pAdapt.CS.Pfalc用PacI限制酶消化以釋放Ad基因組的左端部分。含有Ad5基因組右端部分的質(zhì)粒pWE/Ad.AflII-rITRspΔE3在E3區(qū)域缺失1878bp(XbaI缺失)，并且也用PacI消化。將消化的構(gòu)建體共轉(zhuǎn)染進(jìn)如在ECACC中以保藏號(hào)96022940保藏的PER.C6細(xì)胞中?；谥丿B序列的同源重組，形成稱作Ad5ΔE3.CS.Pfalc的重組病毒。相似地產(chǎn)生具有惡性瘧原蟲CS基因的重組腺病毒血清型35，但是現(xiàn)在PacI消化的pAdapt535.CS.Pfalc用作病毒基因組的左端，NotI-消化的pWE.Ad35.pIX-rITRΔE3(見WO2004/001032)用作病毒基因組的右端，將這兩個(gè)載體均轉(zhuǎn)染進(jìn)PER-E1B55K生產(chǎn)細(xì)胞(具有衍生自Ad35的E1B-55K序列；細(xì)胞已經(jīng)在美國專利6,492,169中描述)中?；谥丿B序列的同源重組，形成稱作Ad35ΔE3.CS.Pfalc的重組病毒。當(dāng)然，也可以將Ad35病毒主干(backbone)中的E4-orf6蛋白改變?yōu)锳d5的E4-orf6，以使得這種病毒可以在表達(dá)Ad5的E1B蛋白的包裝細(xì)胞如PER.C6或者293細(xì)胞上繁殖(見WO03/104467)。Ad5ΔE3.CS.Pfalc和Ad35ΔE3.CS.Pfalc根據(jù)本發(fā)明的方法純化。另外，基于具有Ad35主干的pAdapt535.CS.Pfalc，構(gòu)建了具有CS基因的Ad35載體，其在E3中有缺失并另外包含Ad5的E4-orf6，這個(gè)載體進(jìn)一步稱作Ad35.CS。將一些腺病毒載體在2-20L規(guī)模用所述方法純化(實(shí)施例1，圖4)Ad5dE3x.Adapt.Ebo.GPdTM(Z)、Ad5dE3x.Adapt.Ebo.GPdTM(S)、Ad5dE3x.Adapt.Ebo.NP和Ad5dE3x.Adapt.Empty。對(duì)終產(chǎn)物(FilledandFinished，F(xiàn)&F)通過反向和SDS-PAGE分析純度，發(fā)現(xiàn)被純化為接近同質(zhì)(homogeneity)(除了在具有埃博拉病毒核蛋白作為轉(zhuǎn)基因的載體制備物中存在埃博拉病毒核蛋白之外)。殘留的宿主細(xì)胞DNA的量通過Q-PCR測定，并且低于100pgDNA/1E11VP(如表1所示)。通過在320和260nm測定光密度及通過圓盤離心而測定聚集。無一批次示出聚集。在所有批次中均通過低于10的VP/IU比率示出潛力，在A549細(xì)胞中示出轉(zhuǎn)基因表達(dá)。根據(jù)規(guī)模，最終產(chǎn)量范圍是20-50％2L24-26％(n＝2)；10L30-37％(n＝3)；20L46％(n＝1)。實(shí)施例6使用陰離子交換層析與使用帶電濾膜純化Ad35將PER.C6細(xì)胞在攪拌罐中生長至細(xì)胞密度為大約1百萬個(gè)細(xì)胞/ml。用Ad35.CS載體感染細(xì)胞，MOI為40。在病毒產(chǎn)生4天后，將感染的細(xì)胞培養(yǎng)物如實(shí)施例1所述用Benzonase和TritonX-100處理(B/T方法)。如實(shí)施例1所述澄清B/T收獲物。將澄清的收獲物通過TFF濃縮5倍(使用0.05μm中空纖維)，隨后用10個(gè)滲濾體積的0.1MNaCl、0.05％PS80、50mMTrispH7.5滲濾。將濃縮和滲濾的滲余物經(jīng)0.45μm濾膜過濾，加樣于捕獲柱或?yàn)V膜上。作為一個(gè)捕獲步驟，測試Q-XL柱(3ml柱，15cm柱床高度)或者Sartobind75濾膜(含有陰離子基團(tuán)的帶電濾膜，Sartorius)。將結(jié)合的成分在基于TRIS的緩沖液中以0-1MNaCl梯度洗脫。帶電濾膜的洗脫模式示出在梯度開始處的一個(gè)額外峰，其與Ad35峰分離。與Q-XL樹脂、0.39MNaCl(從0.19開始，以0.53MNaCl結(jié)束)相比，Ad35病毒峰在較高鹽濃度0.44MNaCl(從0.41開始，以0.49MNaCl結(jié)束)以更尖銳的峰洗脫自帶電濾膜。將洗脫級(jí)分通過SDS-PAGE、HPLC-AEX、圓盤離心和TCID50分析。當(dāng)通過HPLC-AEX層析和圓盤離心分析時(shí)，額外峰未表現(xiàn)是完整的Ad35病毒顆粒(圖11)。對(duì)層析級(jí)分進(jìn)行SDS-PAGE分析示出如下結(jié)果(圖12)在兩種實(shí)驗(yàn)中均未觀測到蛋白質(zhì)或者觀測到極低量蛋白質(zhì)。帶電濾膜層析的額外峰示出一些但非全部的Ad35蛋白質(zhì)。在額外峰中，病毒蛋白質(zhì)IIIa、V、VI和VII看起來不見了，而病毒蛋白質(zhì)II、III、IV和52.55k存在。從這些分析中可以推斷帶電濾膜可以從完整的病毒顆粒中分離出病毒蛋白質(zhì)，而Q-XLsepharose不能。如果未發(fā)生分離，則很可能不能被如RP-HPLC或SDS-PAGE等評(píng)估純度的測定檢測到，因?yàn)樵陬~外峰中存在的所有蛋白質(zhì)也均存在于完整的病毒粒中。表1通過將T/B顛倒為B/T收獲方法，在純化的產(chǎn)物樣品中殘余宿主細(xì)胞DNA的量的減少。收獲物在2-20L規(guī)模純化。詳細(xì)描述參見序列表<110>克魯塞爾荷蘭公司<120>病毒純化方法<130>0100WO00ORD<160>4<170>PatentInversion3.2<210>1<211>31<212>DNA<213>Artificial<220><223>primerforward6401<400>1gcaccggtgccgccatggattctcgtcctca31<210>2<211>26<212>DNA<213>Artificial<220><223>primerreverse6401<400>2gcgctagctcactgatgatgttgcag26<210>3<211>29<212>DNA<213>Artificial<220><223>primerforward6001<400>3cccaagcttgccgccatgggcgttacagg29<210>4<211>29<212>DNA<213>Artificial<220><223>primerreverse6001<400>4ggctctagattactaaaagacaaatttgc29權(quán)利要求1.一種從宿主細(xì)胞中純化病毒的方法，所述方法包括如下步驟a)培養(yǎng)感染病毒的宿主細(xì)胞，b)向細(xì)胞培養(yǎng)物中加入核酸酶，和c)裂解所述宿主細(xì)胞以提供包含所述病毒的裂解物。2.權(quán)利要求1的方法，所述方法進(jìn)一步包括d)澄清所述裂解物。3.權(quán)利要求1或2的方法，所述方法進(jìn)一步包括e)使用至少一個(gè)層析步驟進(jìn)一步純化所述病毒。4.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的方法，其中所述病毒是重組腺病毒。5.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的方法，其中步驟b)的核酸酶是Benzonase。6.權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的方法，其中裂解宿主細(xì)胞的步驟c)使用去污劑進(jìn)行。7.權(quán)利要求6的方法，其中所述去污劑是Triton-X100。8.權(quán)利要求2-7任一項(xiàng)的方法，其中步驟d)包括深層過濾和膜過濾。9.權(quán)利要求8的方法，其中所述膜過濾使用0.8μm和0.45μm濾膜組合進(jìn)行。10.權(quán)利要求3-9任一項(xiàng)的方法，其中在步驟e)之前將澄清的裂解物進(jìn)行超濾和/或滲濾。11.權(quán)利要求10的方法，其中進(jìn)行滲濾的澄清的裂解物針對(duì)包含0.8-2.0MNaCl、優(yōu)選大約1MNaCl或者提供相等離子強(qiáng)度的另一種鹽的溶液進(jìn)行更換。12.權(quán)利要求4-11任一項(xiàng)的方法，其中步驟e)包括陰離子交換層析。13.權(quán)利要求12的方法，其中所述陰離子交換層析使用包含陰離子交換基團(tuán)的帶電濾膜進(jìn)行。14.權(quán)利要求4-13任一項(xiàng)的方法，其中步驟e)包括大小排阻層析。15.權(quán)利要求4-14任一項(xiàng)的方法，其中步驟e)包括e.i)陰離子交換層析，和e.ii)大小排阻層析。16.權(quán)利要求15的方法，其中將含有所述重組腺病毒的混合物在所述陰離子交換層析與大小排阻層析步驟之間，用包含至少2MNaCl或者提供相等離子強(qiáng)度的另一種鹽的溶液進(jìn)行緩沖液更換。17.權(quán)利要求4-16任一項(xiàng)的方法，其中步驟d)及隨后步驟中使用的緩沖液不含去污劑、氯化鎂和蔗糖。18.一種純化能裂解宿主細(xì)胞的病毒的方法，所述方法包括如下步驟a)培養(yǎng)包含能裂解宿主細(xì)胞的所述病毒的宿主細(xì)胞，b)在病毒釋放進(jìn)未加入外部裂解因素的培養(yǎng)液中之后收獲病毒，其特征在于在95％的宿主細(xì)胞被裂解之前將核酸酶加入培養(yǎng)物中。19.一種生產(chǎn)包含編碼出血熱病毒核蛋白的核酸序列的病毒的方法，所述方法包括如下步驟a)培養(yǎng)已經(jīng)感染所述病毒的宿主細(xì)胞，b)裂解包含所述病毒的宿主細(xì)胞培養(yǎng)物以提供包含所述病毒的裂解物，c)將所述病毒進(jìn)行陰離子交換層析，其特征在于在陰離子交換層析之后含有病毒的混合物用包含至少1MNaCl或者提供相等離子強(qiáng)度的另一種鹽的溶液和/或用包含至少1％去污劑的溶液進(jìn)行緩沖液更換。20.權(quán)利要求19的方法，其中含有所述病毒的混合物用包含至少1MNaCl或者提供相等離子強(qiáng)度的另一種鹽的溶液進(jìn)行至少一次緩沖液更換。21.權(quán)利要求19或者20的方法，其中所述病毒是重組腺病毒。22.權(quán)利要求19-21任一項(xiàng)的方法，其中所述出血熱病毒是埃博拉病毒。23.權(quán)利要求20-22任一項(xiàng)的方法，其中所述溶液包含至少1.5MNaCl或者提供相等離子強(qiáng)度的另一種鹽。24.權(quán)利要求23的方法，其中所述溶液包含至少2MNaCl或者提供相等離子強(qiáng)度的另一種鹽。25.權(quán)利要求24的方法，其中所述溶液包含至少3MNaCl或者提供相等離子強(qiáng)度的另一種鹽。26.權(quán)利要求25的方法，其中所述溶液包含大約5MNaCl或者提供相等離子強(qiáng)度的另一種鹽。27.權(quán)利要求19-26任一項(xiàng)的方法，進(jìn)一步包括用孔徑為1.2μm或更小的親水性濾膜過濾經(jīng)過緩沖液更換的含有病毒的混合物。28.權(quán)利要求27的方法，其中所述孔徑為大約0.45μm或者大約0.22μm。29.權(quán)利要求19-28任一項(xiàng)的方法，進(jìn)一步包括將經(jīng)過緩沖液更換的含有病毒的混合物進(jìn)行大小排阻層析。30.一種從重組腺病毒制備物中除去游離腺病毒蛋白的方法，包括如下步驟將包含游離腺病毒蛋白的重組腺病毒制備物用含有陰離子交換基團(tuán)的帶電濾膜進(jìn)行過濾。31.權(quán)利要求30的方法，其中所述重組腺病毒制備物包含B亞群重組腺病毒。32.權(quán)利要求30或31的方法，其中所述重組腺病毒是Ad35重組腺病毒。全文摘要本發(fā)明提供了一種從宿主細(xì)胞中純化病毒的方法，所述方法包括如下步驟a)培養(yǎng)宿主細(xì)胞，b)用病毒感染所述宿主細(xì)胞，c)用核酸酶處理所述細(xì)胞培養(yǎng)物，d)裂解所述宿主細(xì)胞以提供包含所述病毒的裂解物。所述病毒優(yōu)選是重組腺病毒。本發(fā)明還提供了一種純化重組病毒的方法，所述重組病毒表達(dá)一種能結(jié)合核酸的異源蛋白質(zhì)，所述方法包括如下步驟a)培養(yǎng)宿主細(xì)胞，b)用所述重組病毒感染所述宿主細(xì)胞，c)裂解所述宿主細(xì)胞以提供包含所述重組病毒的裂解物，d)將所述重組病毒進(jìn)行陰離子交換層析和大小排阻層析，其特征在于將含有病毒的混合物用包含至少2MNaCl或者提供相等離子強(qiáng)度的另一種鹽的溶液進(jìn)行至少一次緩沖液更換。文檔編號(hào)C12N7/00GK1922308SQ200580005682公開日2007年2月28日申請(qǐng)日期2005年2月21日優(yōu)先權(quán)日2004年2月23日發(fā)明者米蘭達(dá)·韋格曼,埃米爾·約安內(nèi)斯·約瑟夫斯·瑪麗亞·范考文申請(qǐng)人:克魯塞爾荷蘭公司