專利名稱：利用含有巨細(xì)胞病毒增強(qiáng)子和雞β－肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子的雜合啟動(dòng)子制造負(fù)鏈RNA病毒載體 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于負(fù)鏈RNA病毒載體的制備方法。
背景技術(shù)：
傳統(tǒng)上，負(fù)鏈RNA病毒的回收，主要是使用表達(dá)T7RNA聚合酶的重組痘苗病毒(vTF7-3Fuerst，T.R.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83，8122-8126(1986)，MVA-T7Sutter，G.等.FEBS Lett.3719-12(1995))和在T7啟動(dòng)子控制下表達(dá)NP、P、L基因和負(fù)鏈RNA病毒基因組的質(zhì)粒(Kolakofsky等，EMBO J.146087-6094(1995)；Kato，A.等，Genes Cells 1569-579(1996))。通過重組痘苗病毒表達(dá)的T7RNA聚合酶的作用，提供了NP、P、L和反基因組(antigenome)RNA，并在痘苗病毒加帽酶的作用下，在NP、P和L的mRNA的5’末端形成帽子結(jié)構(gòu)。然后所述mRNA被翻譯成蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)與反基因組RNA相互作用，構(gòu)成功能性的RNP。然后，從反基因組RNP復(fù)制基因組RNP，進(jìn)而發(fā)生病毒蛋白質(zhì)的翻譯，開始感染周期，之后所述病毒被回收。
雖然可以通過使用重組痘苗病毒回收負(fù)鏈RNA病毒載體，但制備最終的載體制品時(shí)必須除去痘苗病毒，因而耗費(fèi)成本和時(shí)間。在載體用于基因治療時(shí)，從安全性考慮，也希望載體的回收最好不使用痘苗病毒。
非專利文獻(xiàn)1Fuerst T.R.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83，8122-8126(1986)非專利文獻(xiàn)2Sutter，G.等.FEBS Lett.3719-12(1995)非專利文獻(xiàn)3Kolakofsly等，EMBO J.146087-6094(1995)非專利文獻(xiàn)4Kato，A.等，Genes Cells 1569-579(1996)本發(fā)明的公開本發(fā)明要解決的問題本發(fā)明提供了利用含有巨細(xì)胞病毒增強(qiáng)子和雞β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子的雜合啟動(dòng)子，不使用痘苗病毒而制造負(fù)鏈RNA病毒載體的方法。
解決問題的手段迄今為止，在數(shù)種單股負(fù)鏈病毒(mononegaviruses)中開發(fā)了不使用重組痘苗病毒的病毒回收方法。其中之一是使用持久的表達(dá)T7RNA聚合酶的哺乳動(dòng)物細(xì)胞株。在這些方法中，由于沒有例如使用痘苗病毒時(shí)的加帽酶，為了表達(dá)NP、P和L蛋白質(zhì)，使用具有IRES序列的表達(dá)質(zhì)粒，該序列可以進(jìn)行不依賴加帽的翻譯。至今已報(bào)道了使用該方法進(jìn)行牛呼吸道合胞病毒(Bovine respiratory syncytial virus，BRSV)(Ursula等，J.Virol.73251-259)、狂犬病毒(Rabies Virus)(Stefan等，J.Virol.733818-3825(1999))、新城疫病毒(NDV)(Newcastle disease Virus)(Romer-Oberdorfer等，J.General Virology 802987-2995(1999))、仙臺(tái)病毒(F.Iseni等，EMBO J.Vol.215141-5150(2002))的回收。對(duì)于SV5，報(bào)道了使用BSR-T7/5細(xì)胞(即如上述同樣的細(xì)胞)，利用T7RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄反基因組，和利用來自細(xì)胞的RNA聚合酶II表達(dá)NP、P和L蛋白質(zhì)的方法(David L.Waning等，J.Virol.769284-9297(2002))，其中所述質(zhì)粒是通過CAG啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的pCAGGS質(zhì)粒。
第二個(gè)方法是已報(bào)道的狂犬病毒的回收方法，該方法中NP、P、L和基因組全部用巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子來驅(qū)動(dòng)(K.Inoue，等，J.Virological Method.107229-236(2003))。該方法中將錘頭核酶添加到反基因組的5’末端以正確地切割出基因組的末端，因而該方法不使用T7RNA聚合酶的表達(dá)細(xì)胞株也可以回收病毒。
但是，這些方法全都是重建具有傳播能力的病毒的方法。迄今為止，還沒有不使用痘苗病毒來重建無傳播能力的病毒的例子。為了重建缺失了傳播能力的病毒，必須使編碼包膜構(gòu)成蛋白的基因從病毒基因組中缺失掉，并在重建病毒時(shí)反式地提供包膜構(gòu)成蛋白而形成感染性病毒粒子。因此，為了高效地重建缺失型病毒，需要比重建傳播型病毒更高效的病毒生產(chǎn)系統(tǒng)。
本發(fā)明人為了開發(fā)更有效地生產(chǎn)和回收負(fù)鏈RNA病毒的方法，對(duì)病毒生產(chǎn)細(xì)胞中病毒基因組轉(zhuǎn)錄的驅(qū)動(dòng)方法進(jìn)行了改良。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過用含有巨細(xì)胞病毒增強(qiáng)子和雞β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子的雜合啟動(dòng)子(稱為CA啟動(dòng)子)來直接或間接地驅(qū)動(dòng)負(fù)鏈RNA病毒基因組RNA的轉(zhuǎn)錄及與該基因組RNA形成核蛋白的全部負(fù)鏈RNA病毒蛋白質(zhì)的表達(dá)，可以實(shí)現(xiàn)高效的病毒生產(chǎn)。本發(fā)明中基因組RNA是這樣轉(zhuǎn)錄的在CA啟動(dòng)子的調(diào)控下，將編碼負(fù)鏈RNA病毒基因組RNA的DNA可操作地連接，由CA啟動(dòng)子直接誘導(dǎo)基因組RNA的轉(zhuǎn)錄；或者，先在編碼基因組RNA的DNA上游連接來自噬菌體RNA聚合酶的信號(hào)序列，由CA啟動(dòng)子表達(dá)該RNA聚合酶，再以該RNA聚合酶誘導(dǎo)基因組RNA的轉(zhuǎn)錄。通過該方法，可以無需使用痘苗病毒而生產(chǎn)高效價(jià)的病毒。
藉此，本發(fā)明人使用上述的方法，首次不使用痘苗病毒而成功地回收了負(fù)鏈RNA病毒缺失了屬于包膜構(gòu)成蛋白的F蛋白，或M蛋白，或F和M蛋白的非傳播型負(fù)鏈RNA病毒。本發(fā)明的方法使在完全不使用痘苗病毒的情況下生產(chǎn)出高效價(jià)的負(fù)鏈RNA病毒成為可能，因此可用于基因治療等具有高度安全性的病毒的制備。
由此，本發(fā)明涉及負(fù)鏈RNA病毒的制造方法，其特征在于使用CA啟動(dòng)子來誘導(dǎo)負(fù)鏈RNA病毒基因組RNA的轉(zhuǎn)錄及與該基因組RNA形成核蛋白的負(fù)鏈RNA病毒蛋白質(zhì)的表達(dá)；更具體地，涉及各權(quán)利要求項(xiàng)所述的發(fā)明。而且本發(fā)明還涉及包括各權(quán)利要求項(xiàng)所述發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)(或者全部)的所希望的組合的發(fā)明，具體地，包含引用同一獨(dú)立權(quán)利要求項(xiàng)(涉及別的權(quán)利要求所述的發(fā)明中所不包含的發(fā)明的權(quán)利要求)的權(quán)利要求項(xiàng)(即從屬權(quán)利要求項(xiàng))所述發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)的所希望的組合的發(fā)明。各獨(dú)立權(quán)利要求項(xiàng)所述的發(fā)明也包括包含其從屬權(quán)利要求項(xiàng)的任意組合的發(fā)明。由此，本發(fā)明涉及[1].負(fù)鏈RNA病毒載體的制造方法，其特征在于用含有巨細(xì)胞病毒增強(qiáng)子和雞β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子的啟動(dòng)子誘導(dǎo)病毒生產(chǎn)細(xì)胞中的(i)該負(fù)鏈RNA病毒的基因組RNA或其互補(bǔ)鏈的轉(zhuǎn)錄，及(ii)與該基因組RNA形成核蛋白的負(fù)鏈RNA病毒蛋白質(zhì)的表達(dá)。
.[1]所述的方法，其包括在所述產(chǎn)生病毒的細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄與含有巨細(xì)胞病毒增強(qiáng)子和雞β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子的啟動(dòng)子可調(diào)控地連接的編碼核酶以及負(fù)鏈RNA病毒的基因組RNA或其互補(bǔ)鏈的DNA的步驟；其中所述核酶具有在該核酶與基因組RNA或其互補(bǔ)鏈之間切斷轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的活性。
.[1]所述的方法，其包括在所述產(chǎn)生病毒的細(xì)胞中表達(dá)與含有巨細(xì)胞病毒增強(qiáng)子和雞β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子的啟動(dòng)子可調(diào)控地連接的編碼噬菌體RNA聚合酶的DNA的步驟；及在所述產(chǎn)生病毒的細(xì)胞中通過該RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄與該RNA聚合酶的識(shí)別序列可調(diào)控地連接的編碼負(fù)鏈RNA病毒基因組RNA或其互補(bǔ)鏈的DNA的步驟。
.[2]所述的方法，其中所述核酶是錘頭核酶。
.[3]所述的方法，其中所述編碼RNA聚合酶的DNA在所述病毒生產(chǎn)細(xì)胞中作為游離基因表達(dá)。
.[3]所述的方法，其中所述編碼RNA聚合酶的DNA從所述病毒生產(chǎn)細(xì)胞的染色體表達(dá)。
.[3]、[5]、或[6]所述的方法，其中所述噬菌體選自SP6噬菌體、T3噬菌體和T7噬菌體。
.[1]到[7]的任一項(xiàng)的方法，其中所述負(fù)鏈RNA病毒是仙臺(tái)病毒。
.[1]到[8]的任一項(xiàng)的方法，其中所述基因組RNA或其互補(bǔ)鏈缺失了一個(gè)或多個(gè)編碼包膜構(gòu)成蛋白質(zhì)的基因；且其中進(jìn)一步包括在所述細(xì)胞內(nèi)表達(dá)編碼包膜構(gòu)成蛋白的DNA的步驟。
.該DNA是，與含有巨細(xì)胞病毒增強(qiáng)子和雞β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子的啟動(dòng)子可調(diào)控地連接的編碼核酶和負(fù)鏈RNA病毒基因組RNA或其互補(bǔ)鏈的DNA，其中所述核酶具有在該核酶與所述負(fù)鏈RNA病毒基因組RNA或其互補(bǔ)鏈之間切斷轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的活性。
.[10]所述的DNA，其中所述基因組RNA或其互補(bǔ)鏈缺失了一個(gè)或多個(gè)編碼包膜構(gòu)成蛋白質(zhì)的基因。
.[10]或[11]的DNA，其中所述負(fù)鏈RNA病毒是仙臺(tái)病毒。
.[10]到[12]的任一項(xiàng)的DNA，其中所述核酶是錘頭核酶。
.[10]到[13]的任一項(xiàng)的DNA，其中所述DNA可以被重組酶誘導(dǎo)表達(dá)。
.[14]的DNA，其中所述重組酶是Cre或Flp。
.與含有巨細(xì)胞病毒增強(qiáng)子和雞β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子的啟動(dòng)子可調(diào)控性地連接的編碼噬菌體RNA聚合酶的DNA。
.[16]的DNA，其中所述噬菌體選自SP6噬菌體、T3噬菌體和T7噬菌體。
.[16]或[17]的DNA，其中所述DNA可以被重組酶誘導(dǎo)表達(dá)。
.[18]的DNA，其中所述重組酶是Cre或Flp。
.保持有[10]到[15]的任一項(xiàng)的DNA的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
.[20]的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其是所述細(xì)胞是生產(chǎn)負(fù)鏈RNA病毒的細(xì)胞。
.[20]或[21]的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中所述基因組RNA或其互補(bǔ)鏈缺失了一個(gè)或多個(gè)編碼包膜構(gòu)成蛋白質(zhì)的基因。
.[20]到[22]的任一項(xiàng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中所述負(fù)鏈RNA病毒是仙臺(tái)病毒。
.保持有[16]到[19]的任一項(xiàng)的DNA的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
.[24]的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其是所述細(xì)胞是生產(chǎn)負(fù)鏈RNA病毒的細(xì)胞。
.[24]或[25]的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其進(jìn)一步保持有與所述RNA聚合酶的識(shí)別序列可調(diào)控地連接的編碼負(fù)鏈RNA病毒的基因組RNA或其互補(bǔ)鏈的DNA。
.[26]的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中所述基因組RNA或其互補(bǔ)鏈缺失了一個(gè)或多個(gè)編碼包膜構(gòu)成蛋白質(zhì)的基因。
.[25]到[27]的任一項(xiàng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中所述負(fù)鏈RNA病毒是仙臺(tái)病毒。
附圖簡述[

圖1]pCAGGS(B型)和pCAGGS(BSX)的構(gòu)建程序[圖2]pCALNdLWE-zeo-NP(Z)的構(gòu)建程序[圖3]pCAGGS-P4C(-)的構(gòu)建程序[圖4]pCAGGS-L(TDK)的構(gòu)建程序[圖5]pCAGGS-F的構(gòu)建程序[圖6]pCAGGS-F5R的構(gòu)建程序[圖7]pCAGGS-F5R的構(gòu)建程序(續(xù)圖6)[圖8]pCAGGS-T7的構(gòu)建程序[圖9]pCAGGS-SeV及pCAGGS-SeV/ΔF-GFP的構(gòu)建程序[圖10]pCAGGS-SeV及pCAGGS-SeV/ΔF-GFP的構(gòu)建程序(續(xù)圖9)[圖11]pCAGGS-SeV的構(gòu)建程序(續(xù)圖10)[圖12]用HamRbz法回收的傳播型SeV載體的HA測定結(jié)果的照片[圖13]通過CIU測定考察HamRbz法中使基因組DNA的量變化時(shí)SeV/ΔF-GFP的回收效率的結(jié)果[圖14]考察HamRbz法回收SeV/ΔF-GFP時(shí)，使用pCAGGS-F和pCAGGS-F5R的SeV/ΔF-GFP回收效率的結(jié)果。使用pCAGGS-F5R的回收效率明顯提高。
用pCAGGS-T7法回收的傳播型SeV(SeV(TDK)18+GFP)的HA測定結(jié)果的照片。只有用未稀釋的BHK-21、BHK/T7和293T接種雞卵時(shí)檢出了HA活性。
表示通過CIU測定考察pCAGGS-T7法中改變基因組DNA的量時(shí)SeV/ΔF-GFP的回收效率的結(jié)果。盡管使用5μg基因組DNA時(shí)回收效率最佳，但回收效率在使用0.5-5.0μg基因組DNA時(shí)幾乎沒有變化。
通過CIU測定考察pCAGGS-T7法中改變導(dǎo)入試劑時(shí)SeV/ΔF-GFP的回收效率的結(jié)果。使用磷酸鈣的回收效率等于或大于使用TransIT-LT-1的回收效率。
通過CIU測定考察pCAGGS-T7法中改變細(xì)胞種類時(shí)SeV/ΔF-GFP的回收效率的結(jié)果。從所有的被試細(xì)胞中都回收到了病毒?；厥招实捻樞蚴荁HK/T7＞BHK-21＞293T＞LLC-MK2(但使用BHK/T7時(shí)沒有添加pCAGGS-T7)。
通過CIU測定比較HamRbz法和pCAGGS-T7法的SeV/ΔF-GFP回收效率的結(jié)果。pCAGGS-T7法的重建效率優(yōu)于HamRbz法。
通過pCAGGS-T7法的SeV/ΔM-GFP的重建。
通過pCAGGS-T7法的SeV/ΔMΔF-GFP的重建。
使用CA啟動(dòng)子的載體重建和使用CMV啟動(dòng)子的載體重建的比較結(jié)果。使用CA啟動(dòng)子的載體重建的效率高得多。
本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案本發(fā)明涉及負(fù)鏈RNA病毒載體的制備方法，其特征在于通過用含有巨細(xì)胞病毒增強(qiáng)子和雞β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子的雜合啟動(dòng)子(本發(fā)明稱之為CA啟動(dòng)子)來誘導(dǎo)病毒生產(chǎn)細(xì)胞中負(fù)鏈RNA病毒基因組RNA的轉(zhuǎn)錄及與該基因組RNA形成核蛋白(RNP)的全部負(fù)鏈RNA病毒蛋白質(zhì)的表達(dá)。本發(fā)明的方法用CA啟動(dòng)子直接或間接地誘導(dǎo)負(fù)鏈RNA病毒基因組RNA的轉(zhuǎn)錄。用CA啟動(dòng)子直接誘導(dǎo)負(fù)鏈RNA病毒基因組RNA的轉(zhuǎn)錄時(shí)，在CA啟動(dòng)子的調(diào)控下，與編碼負(fù)鏈RNA病毒基因組RNA(負(fù)鏈)或其互補(bǔ)鏈(正鏈)的DNA連接。這里，“可調(diào)控地連接”是指將編碼目的基因的DNA連接在該啟動(dòng)子下游，以使得該目的基因依照啟動(dòng)子的活性被轉(zhuǎn)錄。用CA啟動(dòng)子間接誘導(dǎo)負(fù)鏈RNA病毒基因組RNA的轉(zhuǎn)錄時(shí)，例如構(gòu)建與CA啟動(dòng)子可調(diào)控地連接的編碼RNA聚合酶的DNA，和與該RNA聚合酶的識(shí)別序列的調(diào)控下，可調(diào)控地連接的編碼負(fù)鏈RNA病毒基因組RNA或其互補(bǔ)鏈(即可以是正鏈也可以是負(fù)鏈)的DNA，并將它們導(dǎo)入細(xì)胞。這里，“RNA聚合酶的識(shí)別序列”是指作為該聚合酶引發(fā)轉(zhuǎn)錄的信號(hào)的DNA序列。通過將該識(shí)別序列與編碼負(fù)鏈RNA病毒基因組RNA或其互補(bǔ)鏈的DNA連接，可通過該聚合酶使負(fù)鏈RNA病毒的基因組RNA或反基因組RNA轉(zhuǎn)錄。CA啟動(dòng)子誘導(dǎo)RNA聚合酶的表達(dá)，該RNA聚合酶誘導(dǎo)負(fù)鏈RNA病毒基因組的轉(zhuǎn)錄。如實(shí)施例所示，通過RNA聚合酶的誘導(dǎo)間接地誘導(dǎo)負(fù)鏈RNA病毒基因組RNA的轉(zhuǎn)錄比用CA啟動(dòng)子直接誘導(dǎo)負(fù)鏈RNA病毒基因組RNA的轉(zhuǎn)錄可以制造效價(jià)更高的病毒。
“與基因組RNA構(gòu)成RNP的蛋白質(zhì)”是指與負(fù)鏈RNA病毒基因組RNA形成復(fù)合體，并且是基因組RNA的復(fù)制及基因組編碼的基因的表達(dá)所需要的病毒蛋白質(zhì)群體。為了如上所述表達(dá)這些蛋白質(zhì)，可以使用將這些蛋白質(zhì)的編碼序列簡單地連接在CA啟動(dòng)子下游的表達(dá)載體。由此可以用CA啟動(dòng)子直接誘導(dǎo)該蛋白質(zhì)群體的表達(dá)。這些蛋白質(zhì)是除了病毒包膜的形成病毒核心的蛋白質(zhì)，典型地為N(nucleocapsid，核衣殼)、P(phospho-，磷-)和L(large，大)蛋白。因病毒種類不同，其命名可能也會(huì)不同，但其對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員是顯然自明的(Anjeanette Robert等，Virology 2471-6(1998))。例如N有時(shí)也可以稱為NP。
本發(fā)明的負(fù)鏈RNA病毒載體的制備方法，具體步驟包括(a)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中用CA啟動(dòng)子誘導(dǎo)負(fù)鏈RNA病毒基因組RNA或其互補(bǔ)鏈的轉(zhuǎn)錄及構(gòu)成該負(fù)鏈RNA病毒的核蛋白(RNP)的病毒蛋白的表達(dá)；和(b)回收從該細(xì)胞中生產(chǎn)的負(fù)鏈RNA病毒或其增殖產(chǎn)物。
負(fù)鏈RNA病毒基因組RNA或其互補(bǔ)鏈(反基因組RNA)與構(gòu)成負(fù)鏈RNA病毒RNP的病毒蛋白共同形成RNP?；蚪M編碼的病毒蛋白被表達(dá)，從而在細(xì)胞內(nèi)使基因組RNA和反基因組RNA得以擴(kuò)增，然后被包膜構(gòu)成蛋白質(zhì)包被后形成病毒粒子。通過回收病毒粒子可以得到病毒。
生成的病毒可以適當(dāng)?shù)財(cái)U(kuò)增。攜帶包膜基因的傳播型病毒在感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞時(shí)通過一般的病毒擴(kuò)增循環(huán)就可以得到增殖。而對(duì)于缺失了包膜構(gòu)成蛋白質(zhì)的編碼基因的沒有傳播能力的病毒，則可以通過將其導(dǎo)入表達(dá)包膜構(gòu)成蛋白的細(xì)胞(輔助細(xì)胞)而增殖感染性的病毒。
在本發(fā)明中“含有巨細(xì)胞病毒增強(qiáng)子和雞β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子的啟動(dòng)子”(CA啟動(dòng)子)是指含有(i)巨細(xì)胞病毒(CMV)的IE(立即早期)基因的增強(qiáng)子序列，及(ii)雞β-肌動(dòng)蛋白基因的啟動(dòng)子序列的啟動(dòng)子。對(duì)于CMV IE增強(qiáng)子，可以使用來自所希望的CMV株的立即早期基因的增強(qiáng)子，例如包含序列號(hào)1的核苷酸序列的DNA。
另外，對(duì)于雞β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子，可以使用包含雞β-肌動(dòng)蛋白基因的基因組DNA的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的具有啟動(dòng)子活性的DNA片段。關(guān)于雞β-肌動(dòng)蛋白基因啟動(dòng)子的核苷酸序列的報(bào)道有例如T.A.Kost等(Nucl.Acids.Res.11，8287-8286，1983)。雞β-肌動(dòng)蛋白基因啟動(dòng)子是具有較高的G(鳥嘌呤)和C(胞嘧啶)含量、且含有例如TATA盒(Ann.Rev.Biochem.50，349-383，1981)和CCAAT盒(Nucl.Acids.Res.8，127-142，1980)等啟動(dòng)子特征性序列的基因片段。雞β-肌動(dòng)蛋白基因啟動(dòng)子中，從原本的β-肌動(dòng)蛋白結(jié)構(gòu)基因的翻譯起始密碼子(ATG)的上游-909位點(diǎn)的G(鳥嘌呤)到-7位置的G(鳥嘌呤)的區(qū)域被認(rèn)為是內(nèi)含子。由于該內(nèi)含子具有促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的活性，優(yōu)選使用至少含有此內(nèi)含子的一部分的基因組DNA片段。具體地，這樣的雞β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子的例子有，例如，含有序列號(hào)2的核苷酸序列的DNA。內(nèi)含子接納體序列(intron acceptor sequence)優(yōu)選使用別的基因的內(nèi)含子接納體序列，例如可以使用兔β-球蛋白的剪接接納體序列(splicing acceptorsequence)。具體地，可以使用位于兔β-球蛋白的起始密碼子前面緊鄰的第二內(nèi)含子的接納體位點(diǎn)。更具體地，可以使用例如含有序列號(hào)3的核苷酸序列的DNA。本發(fā)明中，CA啟動(dòng)子優(yōu)選為這樣的DNACMV IE增強(qiáng)子序列的下游連接含有部分所述內(nèi)含子的雞β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子，在其下游附加所希望的內(nèi)含子接納體序列。例如，序列號(hào)4的核苷酸序列的DNA。為表達(dá)蛋白質(zhì)，可以將此序列最后的ATG作為起始密碼子，再附加上目的蛋白質(zhì)的編碼序列。另外，為轉(zhuǎn)錄負(fù)鏈RNA病毒基因組，將編碼負(fù)鏈RNA病毒基因組RNA或其互補(bǔ)鏈(正鏈或負(fù)鏈都可以)的DNA連接在上述內(nèi)含子接納體序列的下游。但是如后所述，內(nèi)含子接納體序列和編碼負(fù)鏈RNA病毒基因組的DNA之間，優(yōu)選地插入編碼自身剪切型核酶的DNA。
雜合啟動(dòng)子所用的CMV增強(qiáng)子序列及雞β-肌動(dòng)蛋白基因啟動(dòng)子，其序列可能因分離株或分離個(gè)體不同而具有多樣性。另外，這些序列可以作輕微的改變以添加或刪除限制酶識(shí)別位點(diǎn)或插入接頭序列。具體地，這些序列即使和序列號(hào)4所示的序列不完全一致，只要其具有同等或更高(例如70％或更高，優(yōu)選80％或更高，90％或更高，或100％或更高)的啟動(dòng)子活性，就可以適用。向核苷酸序列中導(dǎo)入變異的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的(Molecular cloninga laboratory manual.，3rd ed.，Joseph Sambrook，David W.Russell.Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001)。CMV增強(qiáng)子序列和雞β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子序列的變體有例如Genbank登錄號(hào)AF334827、AY237157、AJ575208及X00182等，這些序列可以用于本發(fā)明。要從上面的序列中特別確定構(gòu)建CA啟動(dòng)子所必需的序列，可以與序列號(hào)1或2進(jìn)行比對(duì)，并選擇相匹配的區(qū)域。另外，可以從pCAGGS(Niwa，H.等.(1991)Gene.108193-199、特開平3-168087(未實(shí)審已公開的日本專利申請(qǐng)))或pCALNdLw(Arai，T.等.J.Virology 72，1998，p1115-1121)中切割出DNA用于構(gòu)建CA啟動(dòng)子。
如上所述的CMV IE增強(qiáng)子序列和雞β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子的變體包括如下的序列，它們包含在序列號(hào)1所示的CMV IE增強(qiáng)子序列和序列號(hào)2所示的雞β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子中具有30％或以下，優(yōu)選20％或以下，更優(yōu)選15％或以下，更優(yōu)選10％或以下，更優(yōu)選5％或以下，更優(yōu)選3％或以下的核苷酸取代、缺失和/或插入的核苷酸序列，并表現(xiàn)同等的啟動(dòng)子活性。這些序列分別與序列號(hào)1或序列號(hào)2所示的核苷酸序列顯示出高度的同源性。高度的同源性是指例如具有70％或以上，更優(yōu)選75％或以上，更優(yōu)選80％或以上、更優(yōu)選85％或以上，更優(yōu)選90％或以上，更優(yōu)選93％或以上，更優(yōu)選95％或以上，更優(yōu)選96％或以上的同一性的核苷酸序列。核苷酸序列的同一性可以利用例如BLAST程序(Altschul，S.F.等，1990，J.Mol.Biol.215403-410)來確定。例如在NCBI(National Centerfor BiotechnologyInformation，國立生物技術(shù)信息中心)的BLAST網(wǎng)頁中關(guān)閉所有包含低復(fù)雜度(low complexity)的過濾器(filter)，用默認(rèn)的參數(shù)進(jìn)行檢索(AlschulS.F.等(1993)Nature Genet.3266-272；Madden，T.L.等(1996)Meth.Enzymol.266131-141；Altschul，S.F.等(1997)Nucleic Acids Res.253389-3402；Zhang，J.& Madden，T.L.(1997)Genome Res.7649-656)。例如可以利用比較兩個(gè)序列的blast2sequences程序(Tatiana A等(1999)FEMS Microbiol Lett.174247-250)進(jìn)行兩個(gè)序列的比對(duì)并確定序列的同一性。缺口與錯(cuò)配同樣處理；例如計(jì)算對(duì)于序列號(hào)1所示的全部序列和序列號(hào)2所示的全部序列的同一性的值。具體地說，計(jì)算比對(duì)中序列號(hào)1或2的總核苷酸數(shù)(包含缺口)中一致的核苷酸數(shù)的比例。比對(duì)中序列號(hào)1或2以外的缺口被排除在計(jì)算之外。
另外，CMV增強(qiáng)子序列和雞β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子序列可以通過雜交分別從CMV的基因組核酸和雞基因組DNA中分離。本發(fā)明中使用的CMV增強(qiáng)子和雞β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子可以是分別與序列號(hào)1所示核苷酸序列或序列號(hào)2所示核苷酸序列或其互補(bǔ)序列在嚴(yán)緊條件下雜交的DNA，也可以是與上述具有同等的啟動(dòng)子活性的DNA。在雜交時(shí)，可以通過例如從序列號(hào)1所示核苷酸序列或序列號(hào)2所示核苷酸序列或它們的互補(bǔ)序列的核苷酸序列制備探針，或者從預(yù)雜交的DNA制備探針，再通過檢測這些探針是否與其他DNA雜交而進(jìn)行鑒定。嚴(yán)緊的雜交條件包括例如在含有5×SSC、7％(W/V)SDS、100μg/ml變性鮭精DNA、5×Denhardt’s溶液(1×Denhardt’s溶液含0.2％聚乙烯吡咯烷酮，0.2％牛血清白蛋白和0.2％Ficoll)的溶液中，在60℃，優(yōu)選65℃，更優(yōu)選68℃進(jìn)行雜交，然后在與雜交相同的溫度下，在2×SSC中，優(yōu)選1×SSC中，更優(yōu)選0.5×SSC中，更優(yōu)選0.1×SSC中振蕩洗滌2小時(shí)。
本發(fā)明的負(fù)鏈RNA病毒制造方法的實(shí)施方式之一是在病毒生產(chǎn)細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄與CA啟動(dòng)子可調(diào)控地連接的編碼核酶和負(fù)鏈RNA病毒的基因組RNA或其互補(bǔ)鏈的DNA的方法。從該DNA轉(zhuǎn)錄的早期轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物包含核酶和負(fù)鏈RNA病毒基因組RNA(正鏈或負(fù)鏈)。這里，核酶被設(shè)計(jì)為具有在該核酶和負(fù)鏈RNA病毒基因組之間切斷的活性。轉(zhuǎn)錄的RNA中的核酶順式或反式地作用，在該核酶與負(fù)鏈RNA病毒基因組RNA之間切斷，從而生成具有正確的基因組末端的負(fù)鏈RNA病毒基因組RNA(Inoue，K.等J.Virol.Methods 107 2003，229-236)。在使用核酶的方法中，只要DNA轉(zhuǎn)錄生成RNA，具有正確末端的負(fù)鏈RNA病毒基因組RNA就會(huì)自動(dòng)生成，因此該方法具有病毒的制造方法簡便，不需要特別的細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)。
切斷特定序列的核酶可以基于公知的技術(shù)設(shè)計(jì)。例如錘頭核酶，在自然中可以從類病毒等中分離到(J.M.Buzayan等，Nature，1986，323349-353；G.A.Prody等，Science，1986，2311577-1580)；其本身有具有3個(gè)環(huán)和3個(gè)螺旋的錘狀結(jié)構(gòu)，除了順式作用外，還可以通過將具有催化活性的RNA區(qū)域與目標(biāo)RNA分離而進(jìn)行反式作用。這樣的核酶例如具有1個(gè)環(huán)和1個(gè)螺旋，并與目標(biāo)序列形成類環(huán)(quasi-loop)(Turner，P.C.，The Biochemistry of theHammerhead Ribozyme.于Scanlon，KJ.和Kashani-Sabet，M.編，Ribozymesin the Gene Therapy of Cancer(Medical Intelligence UNIT 4)中，R.G.LandesCompany，1998；3-14)。錘頭核酶的結(jié)構(gòu)是十分清楚的；煙草環(huán)斑病毒的核酶特異性地切斷NUH(N＝A、G、C或U；H＝A、C或U)的核苷酸序列的3’側(cè)。因此，有可能造出特異性地切斷所希望的目標(biāo)RNA中含有UC、UU或UA序列的部位的核酶(M.Koizumi等，F(xiàn)EBS Lett.239285，1988；小泉誠及大塚榮子，蛋白質(zhì)核酸酵素，352191，1990；M.Koizumi等，Nucleic AcidRes.177059，1989)。
另外，發(fā)夾型核酶也可用于本發(fā)明。發(fā)夾型核酶在例如煙草環(huán)斑病毒的衛(wèi)星RNA的負(fù)鏈中被發(fā)現(xiàn)(J.M.Buzayan，Nature 323349，1986)。已經(jīng)證明也可設(shè)計(jì)這種核酶使得其以目標(biāo)特異性的方式切斷RNA(Y.Kikuchi和N.Sasaki，Nucleic Acids Res.196751，1992；菊池洋，化學(xué)と生物30112，1992)。
可以對(duì)這些核酶作合適的改變。已知有利用體外進(jìn)化系統(tǒng)改變天然核酶而獲得高活性的修飾核酶的方法(Joyce.1992.Selective AmplificationTechniques for Optimization of Ribozyme Function.于Antisense RNA and DNA中，pp.353-372.Wiley-Liss Inc.)。還可以使用以二聚體形式發(fā)揮功能的核酶。
具有RNA切斷活性的核酶一般含有催化活性所必需的序列和識(shí)別目標(biāo)RNA所必需的目標(biāo)識(shí)別序列。錘頭核酶的催化所必需的序列包括但不限于，例如，5’-1C2U3G4A5N6G7A8N9N10N11N12N13N14N15N16N17N18N19N20G21A22A23A24N-3’(序列號(hào)5)。這里N為G、A、U或C；并且設(shè)計(jì)5’-8N9N10N11N-3’和5’-16N17N18N19N-3’為彼此互補(bǔ)序列以使堿基對(duì)得以形成。例如5’-8N9N10N11N-3’包括但不限于5’-GUCC-3’；并且5’-16N17N18N19N-3’包括但不限于5’-GGAC-3’。12N13N14N15N的四個(gè)堿基優(yōu)選地形成環(huán)。這里，也可以不是4個(gè)核苷酸，而是約2-7個(gè)核苷酸(即N2～7)，例如約3～5個(gè)核苷酸(即N3～5)。23A24N與目標(biāo)識(shí)別序列重疊，使24N成為與上述目標(biāo)位點(diǎn)NUH中的N互補(bǔ)的核苷酸。例如5’-GUGA-3’。更具體的序列顯示在實(shí)施例中。在該序列兩端加上目標(biāo)識(shí)別序列。目標(biāo)識(shí)別序列設(shè)定為與核酶和負(fù)鏈RNA病毒基因組之間的序列互補(bǔ)的序列。
本發(fā)明的方法的另一個(gè)實(shí)施方式是在病毒生產(chǎn)細(xì)胞中表達(dá)與CA啟動(dòng)子可調(diào)控地連接的編碼噬菌體RNA聚合酶的DNA。這里，使所述病毒生產(chǎn)細(xì)胞含有連接在所述RNA聚合酶識(shí)別序列的下游并編碼負(fù)鏈RNA病毒基因組RNA或其互補(bǔ)鏈的DNA。表達(dá)的RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄連接在所述RNA聚合酶識(shí)別序列的下游的編碼負(fù)鏈RNA病毒基因組RNA的DNA，生成病毒基因組RNA。所用的RNA聚合酶包括識(shí)別特定的序列(RNA聚合酶的目標(biāo)序列，一般也稱為啟動(dòng)子序列)并起始轉(zhuǎn)錄的所希望的噬菌體來源的RNA聚合酶，具體有例如大腸桿菌T3噬菌體和T7噬菌體，及沙門氏菌SP6噬菌體等(Kreig，P.A.和Melton，D.A.1987.In vitro RNA synthesis with SP6RNA polymerase.Methods Enzymol.155397-15；Milligan，J.F.，Groebe，D.R.，Witherell，G.W.，和Uhlenbeck，O.C.1987.Oligoribonucleotide synthesis usingT7RNA polymerase and synthetic DNA templates.Nucleic Acids Res.158783-798；Pokrovskaya，I.D.和Gurevich，V.V.1994.In vitro transcriptionPreparative RNA yields in analytical scale reactions.Anal.Biochem.220420-23)。
T3、T7及SP6的典型的識(shí)別序列(啟動(dòng)子序列)如下所示。這里“+1”表示第一個(gè)被轉(zhuǎn)錄的核苷酸。
+1T7TAATACGACTCACTATAGGGAGA (序列號(hào)6)T3AATTAACCCTCACTAAAGGGAGA (序列號(hào)7)SP6ATTTAGGTGACACTATAGAAGNG (序列號(hào)8)(N＝A，G，C，或T)-17到-1的區(qū)域是轉(zhuǎn)錄所必需的，且必須是雙鏈。另外在上述+1到+6中，最初兩個(gè)核苷酸(+1和+2)為GP(P＝嘌呤(A或G))對(duì)于實(shí)現(xiàn)高效轉(zhuǎn)錄是重要的，其余的核苷酸可以換成別的核苷酸。優(yōu)選地，使用上面下劃線部分所示的序列。負(fù)鏈RNA病毒的基因組的cDNA緊接在上述RNA聚合酶的識(shí)別序列的下游。為了高效率地制備病毒，可以轉(zhuǎn)錄正鏈。
上述的負(fù)鏈RNA病毒基因組的轉(zhuǎn)錄載體及噬菌體RNA聚合酶的表達(dá)載體可以是所希望的DNA載體或者導(dǎo)入細(xì)胞后轉(zhuǎn)變?yōu)镈NA的載體如反轉(zhuǎn)錄病毒，通常使用質(zhì)粒載體。載體可以是在導(dǎo)入細(xì)胞后作為附加體存在和表達(dá)的載體，或者是整合到細(xì)胞染色體中表達(dá)的染色體整合型載體。例如使用質(zhì)粒時(shí)，可以通過轉(zhuǎn)染瞬時(shí)表達(dá)，或者也可以選擇質(zhì)粒整合到染色體的穩(wěn)定導(dǎo)入株。特別地，穩(wěn)定地表達(dá)噬菌體RNA聚合酶的細(xì)胞株是有用的，因?yàn)樗鼈兛梢院喕《旧a(chǎn)的程序，使穩(wěn)定地生產(chǎn)高效價(jià)的病毒成為可能(參見實(shí)施例2)。另外，載體可以是持久性表達(dá)的，也可以是能在必要的時(shí)候誘導(dǎo)表達(dá)的誘導(dǎo)表達(dá)型載體。例如，可以使用序列特異性的重組酶(重組酶)實(shí)現(xiàn)誘導(dǎo)表達(dá)?？捎糜诖四康牡闹亟M酶包括Cre重組酶和FLP重組酶。通過在CA啟動(dòng)子與所述核酶或RNA聚合酶的編碼序列之間插入被重組酶的目標(biāo)序列所側(cè)翼包夾的DNA，可以使所述表達(dá)響應(yīng)于重組酶而被誘導(dǎo)。
Cre是噬菌體P1所具有的約38kDa的環(huán)化重組酶，特異性地在loxP位點(diǎn)之間產(chǎn)生位點(diǎn)特異性DNA重組(Sauer B，Henderson N.1988.Site-specificDNA recombination in mammalian cells by the Cre recombinase ofbacteriophage P1.Proc Natl Acad Sci USA 855166-70；Sternberg N，HamiltonD.1981Bacteriophage P1 site-specific recombination.I.Recombinationbetween loxP sites.J Mol Biol 150467-86；Brian Sauer，Methods ofEnzymology；1993，Vol.225，890-900；Nagy A.2000.Cre recombinasetheuniversal reagent for genome tailoring.Genesis 2699-109)。loxP是包括8bp的間隔區(qū)的13bp的不對(duì)稱反向重復(fù)序列(ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT；下劃線部分是反向重復(fù)序列)(序列號(hào)9)。
FLP重組酶是來自酵母釀酒酵母(Saccaromyces cerevisiae)的2μm質(zhì)粒的約49kDa的翻轉(zhuǎn)酶重組酶(flippase recombinase)，其以FLP重組酶目標(biāo)(FLP recombinase target，F(xiàn)RT)序列作為目標(biāo)進(jìn)行重組(Utomo AR，NikitinAY，Lee WH.1999.Temporal，spatial，and cell type-specific control ofCre-mediated DNA recombination in transgenic mice.Nat Biotechnol 171091-6；Broach，J.R.，Guarascio，V.R. & Jayaram，M.(1982)Cell 29，227-34；Cox M.M.(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80，4223-227；Vetter，D.，Andrews，B.J.，Roberts-Beatty，L.& Sadowski，P.D.(1983)Proc.Natl.Acad.Sci USA 80，7284-288；Abremski，K.& Hoess，R.(1984)J.Biol.Chem.259，1509-514；Stark，W.M.，Boocock，M.R.& Sherratt，D.J.(1992)Trends Genet.9，413-21)。和loxP一樣，F(xiàn)RT序列也是由包括8bp的間隔區(qū)的13bp的重復(fù)序列構(gòu)成的(GAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAGGAACTTC；序列號(hào)10)(Andrews，B.J.等(1985).The FLP Recombinase of the 2 Micron Circle DNAof YeastInteraction with its Target Sequences.Cell 40，795-803)。另外，也可以利用上述loxP位點(diǎn)和FRT位點(diǎn)的變異序列進(jìn)行目標(biāo)特異性的重組(Baszczynski，Christopher L.等，美國專利申請(qǐng)20040003435)。
為了構(gòu)建通過重組酶可誘導(dǎo)表達(dá)的DNA，將被一對(duì)重組酶目標(biāo)序列所側(cè)翼包夾的DNA插入到CA啟動(dòng)子與核酶或噬菌體RNA聚合酶的編碼序列之間。在這種狀態(tài)下，由于被插入的DNA片段所妨礙，無法由CA啟動(dòng)子表達(dá)負(fù)鏈RNA病毒的基因組(其附加了核酶)或噬菌體RNA聚合酶。但是，重組酶作用于DNA后，目標(biāo)序列所側(cè)翼包夾的DNA被切割出，使負(fù)鏈RNA病毒的基因組或噬菌體RNA聚合酶得以由CA啟動(dòng)子表達(dá)。這樣，就可以通過重組酶誘導(dǎo)由CA啟動(dòng)子所驅(qū)動(dòng)的表達(dá)。優(yōu)選地，使被重組酶目標(biāo)序列側(cè)翼包夾的DNA中包含轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)和/或終止密碼子，以在重組酶不作用時(shí)，切實(shí)地阻斷連接在下游的負(fù)鏈RNA病毒基因組或噬菌體RNA聚合酶基因的表達(dá)。另外，還可以在被重組酶目標(biāo)序列側(cè)翼包夾的DNA中插入合適的標(biāo)記基因。
本說明書所述的用于制造病毒的DNA和細(xì)胞可以適當(dāng)?shù)亟M合成制備病毒用的試劑盒。例如本發(fā)明涉及如下的試劑盒。
(1-1)制備負(fù)鏈RNA病毒的試劑盒，其包含與CA啟動(dòng)子可調(diào)控地連接的且編碼噬菌體RNA聚合酶的DNA，和與該RNA聚合酶的識(shí)別序列可調(diào)控地連接且編碼負(fù)鏈RNA病毒基因組或其互補(bǔ)鏈的DNA。
(1-2)上述(1-1)所述的試劑盒，其還包含與CA啟動(dòng)子可調(diào)控地連接且編碼與RNA形成RNP的負(fù)鏈RNA病毒蛋白質(zhì)的DNA。
(1-3)上述(1-1)或(1-2)所述的試劑盒，其中所述基因組RNA或其互補(bǔ)鏈缺失了一個(gè)或多個(gè)編碼包膜構(gòu)成蛋白質(zhì)的基因。
(1-4)上述(1-1)到(1-3)的任一項(xiàng)所述的試劑盒，其進(jìn)一步含有編碼包膜構(gòu)成蛋白質(zhì)的基因。
(1-5)上述(1-1)到(1-4)的任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中編碼包膜構(gòu)成蛋白質(zhì)的DNA與CA啟動(dòng)子可調(diào)控地連接。
(1-6)上述(1-1)到(1-5)的任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中所述負(fù)鏈RNA病毒是仙臺(tái)病毒。
(1-7)上述(1-1)到(1-6)的任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中所述噬菌體選自SP6噬菌體、T3噬菌體和T7噬菌體。
(1-8)上述(1-1)到(1-7)的任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中所述RNA聚合酶的可以被重組酶誘導(dǎo)表達(dá)。
(1-9)上述(1-8)所述的試劑盒，其中所述重組酶是Cre或Flp。
(2-1)制造負(fù)鏈RNA病毒的試劑盒，其包含保持有與CA啟動(dòng)子可調(diào)控地連接且編碼噬菌體RNA聚合酶的DNA、和與該RNA聚合酶的識(shí)別序列可調(diào)控地連接并編碼負(fù)鏈RNA病毒的基因組RNA或其互補(bǔ)鏈的DNA的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
(2-2)上述(2-1)所述的試劑盒，其進(jìn)一步包含與CA啟動(dòng)子可調(diào)控地連接，且編碼與RNA形成RNP的負(fù)鏈RNA病毒蛋白質(zhì)的DNA。
(2-3)上述(2-1)或(2-2)所述的試劑盒，其中所述基因組RNA或其互補(bǔ)鏈缺失了一個(gè)或多個(gè)編碼包膜構(gòu)成蛋白質(zhì)的基因。
(2-4)上述(2-1)到(2-3)的任一項(xiàng)所述的試劑盒，其進(jìn)一步含有編碼包膜構(gòu)成蛋白質(zhì)的基因。
(2-5)上述(2-1)到(2-4)的任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中編碼包膜構(gòu)成蛋白質(zhì)的DNA與CA啟動(dòng)子可調(diào)控地連接。
(2-6)上述(2-1)到(2-5)的任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中所述負(fù)鏈RNA病毒是仙臺(tái)病毒。
(2-7)上述(2-1)到(2-6)的任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中所述噬菌體選自SP6噬菌體、T3噬菌體和T7噬菌體。
(2-8)上述(2-1)到(1-7)的任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中所述RNA聚合酶可以被重組酶誘導(dǎo)表達(dá)。
(2-9)上述(2-8)所述的試劑盒，其中所述重組酶是Cre或Flp。
(3-1)制備負(fù)鏈RNA病毒的試劑盒，其包含(i)與CA啟動(dòng)子可調(diào)控地連接、并編碼核酶和負(fù)鏈RNA病毒基因組RNA或其互補(bǔ)鏈的DNA，其中所述核酶具有在該核酶和負(fù)鏈RNA病毒基因組RNA或其互補(bǔ)鏈之間切斷轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的活性；和(ii)與CA啟動(dòng)子可調(diào)控地連接，且編碼與RNA形成RNP的負(fù)鏈RNA病毒蛋白質(zhì)的DNA。
(3-2)上述(3-1)所述的試劑盒，其中所述基因組RNA或其互補(bǔ)鏈缺失了一個(gè)或多個(gè)編碼包膜構(gòu)成蛋白質(zhì)的基因。
(3-3)上述(3-1)或(3-2)所述的試劑盒，其進(jìn)一步含有編碼包膜構(gòu)成蛋白質(zhì)的DNA。
(3-4)上述(3-1)到(3-3)的任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中編碼包膜構(gòu)成蛋白質(zhì)的DNA與CA啟動(dòng)子可調(diào)控地連接。
(3-5)上述(3-1)到(3-4)的任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中所述負(fù)鏈RNA病毒是仙臺(tái)病毒。
(3-6)上述(3-1)到(3-5)的任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中所述噬菌體選自SP6噬菌體、T3噬菌體和T7噬菌體。
(3-7)上述(3-1)到(1-6)的任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中所述RNA聚合酶的可以被重組酶誘導(dǎo)表達(dá)。
(3-8)上述(3-7)所述的試劑盒，其中所述重組酶是Cre或Flp。
另外，“可以被重組酶誘導(dǎo)表達(dá)”是指被該重組酶的識(shí)別序列所側(cè)翼包夾的DNA插入CA啟動(dòng)子與下游DNA之間，當(dāng)除去被重組酶識(shí)別序列所側(cè)翼包夾的DNA時(shí)，可被CA啟動(dòng)子下游的DNA誘導(dǎo)表達(dá)。
本發(fā)明中“負(fù)鏈RNA病毒”是指含有負(fù)鏈(與有義地編碼病毒蛋白質(zhì)的鏈互補(bǔ)的反義鏈)RNA作為基因組的病毒。負(fù)鏈RNA(minus strand RNA)又稱為負(fù)鏈RNA(negative strand RNA)。用于本發(fā)明的負(fù)鏈RNA病毒具體地如單鏈負(fù)鏈RNA病毒(又稱非分節(jié)型(non-segmented)負(fù)鏈RNA病毒)。“單鏈負(fù)鏈(negative strand)RNA病毒”指基因組中具有單鏈負(fù)鏈(即“單鏈負(fù)鏈(minus strand)”)的RNA病毒。這樣的病毒包括屬于副粘病毒科(Paramyxoviridae，包括副粘病毒屬(Paramyxovirus)、麻疹病毒屬(Morbillivirus)、腮腺炎病毒屬(Rubulavirus)、及肺病毒屬(Pneumovirus))、彈狀病毒科(Rhabdoviridae，包括水泡性病毒屬(Vesiculovirus)、狂犬病毒屬(Lyssavirus)及短暫熱病毒屬(Ephemerovirus))、纖絲病毒科(Filoviridae)、正粘病毒科(Orthomyxoviridae，包括流感病毒A、B、C，及索戈托樣病毒(Thogoto-likeviruses))、本揚(yáng)病毒科(Bunyaviridae，包括本揚(yáng)病毒屬(Bunyavirus)、漢坦病毒屬(Hantavirus)、內(nèi)羅病毒屬(Nairovirus)及白蛉病毒屬(Phlebovirus))等等病毒。
另外，“負(fù)鏈RNA病毒載體”是指用作將基因?qū)爰?xì)胞的載體的基于負(fù)鏈RNA病毒的有感染力的病毒。這里“感染力”是指負(fù)鏈RNA病毒載體保持細(xì)胞粘附能力和向被粘附的細(xì)胞內(nèi)部導(dǎo)入載體所含基因的能力。另外“基因”是指本發(fā)明中制造的負(fù)鏈RNA病毒載體所具有的任何遺傳物質(zhì)，不限于外源基因。換言之，負(fù)鏈RNA病毒載體可以帶有也可以不帶有外源基因。本發(fā)明的方法適用于有傳播能力的病毒載體的制備，也適用于無傳播能力的缺陷型載體的制備。特別是具有能夠高效地制備無傳播能力的缺陷型載體的優(yōu)點(diǎn)。這里“有傳播能力”是指病毒載體感染宿主細(xì)胞時(shí)，病毒在該細(xì)胞中復(fù)制，產(chǎn)生感染性的病毒粒子。
“重組病毒”是指通過重組多核苷酸產(chǎn)生的病毒或該病毒的擴(kuò)增產(chǎn)物?！爸亟M多核苷酸”是指兩端或者一端以與自然狀態(tài)不同的方式連接的多核苷酸。具體而言，重組多核苷酸是多聚核苷酸鏈的連接被人為地改變(切斷和/或連接)的多核苷酸。重組多核苷酸可以通過組合多核苷酸合成、核酸酶處理、連接酶處理等手段，利用公知的基因重組方法來產(chǎn)生。重組病毒可以通過表達(dá)編碼由基因操作構(gòu)建的病毒基因組的多核苷酸，并重建病毒而產(chǎn)生。例如，已知有從編碼病毒基因組的cDNA重建病毒的方法(Y.Nagai，A.Kato，Microbiol.Immunol.，43，613-624(1999))。
本發(fā)明中“基因”指遺傳物質(zhì)，編碼轉(zhuǎn)錄單位的核酸。基因可以是RNA也可以是DNA。本發(fā)明中編碼蛋白質(zhì)的核酸稱為該蛋白質(zhì)的基因。另外，一般地，基因也可以不編碼蛋白質(zhì)，例如基因也可以編碼核酶或反義RNA等功能性RNA。一般地，基因可以是天然存在的或人工設(shè)計(jì)的序列。另外，本發(fā)明中“DNA”包含單鏈和雙鏈的DNA。另外，“編碼蛋白質(zhì)”是指多核苷酸有義地或反義地含有編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列的ORF，使得該蛋白質(zhì)可以在合適的條件下表達(dá)。
本發(fā)明中適用的負(fù)鏈RNA病毒包括，例如，副粘病毒科的仙臺(tái)病毒(Sendai virus)、新城疫病毒(Newcastle disease virus)、腮腺炎病毒(Mumpsvirus)、麻疹病毒(Measles virus)、呼吸道合胞病毒(respiratory syncytialvirus)、牛瘟麻疹病毒(rinderpest virus)、溫?zé)岵〔《?distemper virus)、猿猴副流感病毒(SV5)、人副流感病毒1、2、3型、正粘病毒科(Orthomyxoviridae)的流感病毒(Influenza virus)、彈狀病毒科(Rhabdoviridae)的水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus)、狂犬病毒(Rabies virus)等等。
可用于本發(fā)明的病毒的例子還包括，例如，仙臺(tái)病毒(SeV)、人副流感病毒-1(human parainfluenza virus-1)(HPIV-1)、人副流感病毒-3(HPIV-3)、海豹溫?zé)岵《?phocine distemper virus)(PDV)、犬溫?zé)岵《?canine distempervirus)(CDV)、海豚麻疹病毒(dolphin molbillivirus)(DMV)、小反芻動(dòng)物瘟病毒(peste-des-petits-ruminants virus)(PDPR)、麻疹病毒(measles virus)(MV)、牛瘟麻疹病毒(rinderpest virus)(RPV)、亨德拉病毒(hendra virus)(Hendra)、Nipah病毒(Nipah)、人副流感病毒-2(HPIV-2)、猿猴副流感病毒5(simian parainfluenza virus)(SV5)、人副流感病毒-4a(HPIV-4a)、人副流感病毒-4b(HPIV-4b)、腮腺炎病毒(Mumps)、及新城疫病毒(NDV)。更優(yōu)選的例子是選自仙臺(tái)病毒(SeV)、人副流感病毒-1(HPIV-1)、人副流感病毒-3(HPIV-3)、海豹溫?zé)岵《?PDV)、貓溫?zé)岵《?CDV)、海豚麻疹病毒(DMV)、小反芻動(dòng)物瘟病毒(PDPR)、麻疹病毒(MV)、牛瘟麻疹病毒(RPV)、亨德拉病毒(Hendra)和Nipah病毒(Nipah)的病毒。
本發(fā)明制造的負(fù)鏈RNA病毒更優(yōu)選地為屬于副粘病毒亞科(包括呼吸道病毒屬(Respirovirus)、腮腺炎病毒屬和麻疹病毒屬)的病毒或其衍生物，更優(yōu)選為屬于呼吸道病毒屬(genus Respirovirus)(也稱副粘病毒屬(Paramyxovirus))的病毒或其衍生物。所述衍生物包括在無損于病毒的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)能力的條件下進(jìn)行了基因修飾或化學(xué)修飾的病毒等。可應(yīng)用于本發(fā)明的呼吸病毒屬病毒包括，例如，人副流感病毒-1(HPIV-1)、人副流感病毒-3(HPIV-3)、牛副流感病毒-3(BPIV-3)、仙臺(tái)病毒(Sendai virus；也稱鼠副流感病毒-1)、及猿猴副流感病毒-10(SPIV-10)等。本發(fā)明中副粘病毒最優(yōu)選為仙臺(tái)病毒。這些病毒可以來自天然株、野生株、變異株、實(shí)驗(yàn)室傳代株及人工構(gòu)建株等等。
負(fù)鏈RNA病毒載體上所攜帶的基因以反義方向位于病毒基因組RNA中?！安《净蚪MRNA”是指具有下述功能的RNA該RNA與負(fù)鏈RNA病毒的病毒蛋白質(zhì)一起形成核蛋白(RNP)；通過該RNP表達(dá)基因組中所包含的基因；從而復(fù)制該基因組RNA并形成子RNP。一般地，在負(fù)鏈RNA病毒基因組中具有這樣的構(gòu)造病毒基因以反義序列的形式排列在3’前導(dǎo)序列區(qū)(leader region)和5’尾隨序列區(qū)(trailer region)之間。各個(gè)基因的ORF之間存在轉(zhuǎn)錄終止序列(E序列)-間插序列(I序列)-轉(zhuǎn)錄起始序列(S序列)，藉此各基因的ORF的編碼RNA被作為單獨(dú)的順反子轉(zhuǎn)錄。本發(fā)明病毒中的基因組RNA含有編碼N(nucleocapsid，核衣殼)、P(phospho-，磷-)和L(large，大)蛋白的反義RNA，所述蛋白是該RNA所編碼的基因群的表達(dá)及該RNA自身的自主復(fù)制所必需的病毒蛋白質(zhì)。另外，該RNA也可以編碼病毒粒子形成所必需的M(matrix，基質(zhì))蛋白。進(jìn)一步地，該RNA還可以編碼病毒粒子感染所必需的包膜蛋白。負(fù)鏈RNA病毒的包膜蛋白包括例如引起細(xì)胞膜融合的蛋白質(zhì)F(fusion，融合)蛋白及粘附細(xì)胞所必需的HN(血凝素-神經(jīng)氨酸酶(hemagglutinin-neuroaminidase))蛋白。但是對(duì)于某些類型的細(xì)胞，HN蛋白不是感染所必需的(Markwell，M.A.等，Proc.Natl.Acad.Sci USA 82(4)978-982(1985))，只需F蛋白就可以完成感染。另外，該RNA也可以編碼F蛋白和/或HN蛋白以外的病毒包膜蛋白。
例如各種屬于副粘病毒亞科的病毒中的各個(gè)基因一般用下面的方式表示。一般地，NP基因也可表示為“N”。另外，HN在沒有神經(jīng)氨酸酶活性時(shí)表示為H。
呼吸道病毒屬 NPP/C/VMFHN-L彈狀病毒屬NPP/V MFHN (SH) L麻疹病毒屬NPP/C/VMFH -L
例如，仙臺(tái)病毒的各個(gè)基因的數(shù)據(jù)庫登記號(hào)如下NP基因?yàn)镸29343，M30202，M30203，M30204，M51331，M55565，M69046和X17218；P基因?yàn)镸30202，M30203，M30204，M55565，M69046，X00583，X17007和X17008；M基因?yàn)镈11446，K02742，M30202，M30203，M30204，M69046，U31956，X00584和X53056；F基因?yàn)镈00152，D11446，D17334，D17335，M30202，M30203，M30204，M69046，X00152和X02131；HN基因?yàn)镈26475，M12397，M30202，M30203，M30204，M69046，X00586，X02808和X56131；L基因?yàn)镈00053，M30202，M30203，M30204，M69040，X00587，和X58886。其他病毒所編碼的病毒基因例如，N基因有CDV，AF014953；DMV，X75961；HPIV-1，D01070；HPIV-2，M55320；HPIV-3，D10025；Mapuera，X85128；Mumps，D86172；MV，K01711；NDV，AF064091；PDPR，X74443；PDV，X75717；RPV，X68311；SeV，X00087；SV5，M81442；和Tupaia，AF079780；P基因有CDV，X51869；DMV，Z47758；HPIV-1，M74081；HPIV-3，X04721；HPIV-4a，M55975；HPIV-4b，M55976；Mumps，D86173；MV，M89920；NDV；M20302；PDV，X75960；RPV，X68311；SeV，M30202；SV5，AF052755；和Tupaia，AF079780；C基因有CDV，AF014953；DMV，Z47758；HPIV-1，M74081；HPIV-3，D00047；MV，ABO16162；RPV，X68311；SeV，AB005796；和Tupaia，AF079780；M基因有CDV，M12669；DMV，Z30087；HPIV-1，S38067；HPIV-2，M62734；HPIV-3，D00130；HPIV-4a，D10241；HPIV-4b，D10242；Mumps，D86171；MV，AB012948；NDV，AF089819；PDPR，Z47977；PDV，X75717；RPV，M34018；SeV，U31956；和SV5，M32248；F基因有CDV，M21849；DMV，AJ224704；HPN-1，M22347；HPIV-2，M60182；HPIV-3，X05303；HPIV-4a，D49821；HPIV-4b，D49822；Mumps，D86169；MV，AB003178；NDV，AF048763；PDPR，Z37017；PDV，AJ224706；RPV，M21514；SeV，D17334；和SV5，AB021962；FIN(H或G)基因有CDV，AF”2189；DMV，AJ224705；HPIV-1，U709498；HPIV-2，D000865；HPIV-3，AB012132；HPIV-4A，M34033；HPIV-4B，AB006954；Mumps，X99040；MV，K01711；NDV，AF204872；PDPR，Z81358；PDV，Z36979；RPV，AF132934；SeV，U06433；和SV-5，S76876。但是每種病毒都有多個(gè)已知的株，由于病毒株的不同，也可以包括上述序列以外的序列的基因。
這些編碼蛋白質(zhì)的ORF及外來基因的ORF在基因組RNA中通過上述的E-I-S序列被反義地排列。對(duì)基因組RNA中最接近3’末端的ORF而言，只有3’前導(dǎo)序列區(qū)和該ORF之間的S序列是必需的，E和I序列不是必需的。而對(duì)基因組RNA中離5’末端最近的ORF而言，只有5’尾隨序列區(qū)和該ORF之間的E序列是必需的，I和S序列不是必需的。另外，利用例如IRES(internal ribosome entry segment，內(nèi)部核糖體進(jìn)入片段)序列，兩個(gè)ORF可以作為同一個(gè)順反子而被轉(zhuǎn)錄。在這種情況下，這兩個(gè)ORF之間的E-I-S序列不是必需的。例如，野生型副粘病毒中，典型的RNA基因組在3’前導(dǎo)序列之后順序地排列著反義地編碼N、P、M、F、HN和L蛋白的6個(gè)ORF，接下來在另一端具有5’尾隨序列區(qū)。本發(fā)明中，病毒基因的排列方向并不限于上面所述的方式，但優(yōu)選地，和野生型病毒相似，在3’前導(dǎo)序列之后順序地排列著反義地編碼N、P、M、F、HN和L蛋白的ORF，然后排列著5’尾序列。在某些種類的病毒中病毒基因不同，但各個(gè)病毒基因仍優(yōu)選地如上所述與野生型類似地排列。一般地，保持著N、P和L基因的載體在細(xì)胞內(nèi)自主地從RNA基因組表達(dá)基因，從而使基因組RNA得以復(fù)制。進(jìn)一步，通過F基因、HN基因等編碼包膜的刺突蛋白質(zhì)的基因以及M基因的作用，感染性的病毒粒子得以形成并被釋放到細(xì)胞外。由此，這樣的載體就成了具有傳播能力的病毒載體。要讓該載體攜帶外源基因時(shí)，可如后所述，將外源基因插入該基因組中的非蛋白質(zhì)編碼區(qū)域。
另外，負(fù)鏈RNA病毒載體也可以缺失野生型病毒所具有的任一基因。例如，缺失了病毒包膜構(gòu)成蛋白質(zhì)的基因的病毒可以用作高度安全性的基因?qū)胼d體。根據(jù)本發(fā)明的方法，可以在不使用痘苗病毒載體的條件下回收高效價(jià)的缺失了病毒包膜構(gòu)成蛋白質(zhì)的基因的病毒?！鞍?gòu)成蛋白質(zhì)”是指作為病毒包膜成分的病毒蛋白質(zhì)，包括暴露在包膜表面、在對(duì)細(xì)胞的粘附及感染中起作用的刺突蛋白質(zhì)，和在包膜形成等中起作用的基質(zhì)蛋白等。具體地，包膜構(gòu)成蛋白質(zhì)的基因包括例如F、HN和M基因，根據(jù)病毒種類不同還可以包括H、M1和G等基因。缺失了一個(gè)或者多個(gè)這樣的包膜構(gòu)成蛋白質(zhì)基因的病毒在感染細(xì)胞中不能形成感染性的病毒粒子，因此具有高度的安全性。這樣的病毒可以通過例如從外源提供缺失的基因產(chǎn)物而被重建?；蛘?，也可以用完全不同的包膜蛋白來補(bǔ)全病毒的感染性。這樣的包膜蛋白包括，例如VSV-G。即，只要能保證病毒的形成和感染性，在缺失了包膜構(gòu)成蛋白質(zhì)基因的病毒的構(gòu)建中所用到的包膜蛋白質(zhì)基因并不只限于缺失掉的基因。這樣制備的病毒可以與野生型病毒類似地粘附到宿主細(xì)胞并引起細(xì)胞融合，但由于導(dǎo)入細(xì)胞的病毒基因組有病毒基因的缺失，其不能形成具有同原載體相同的感染力的子代病毒粒子。因此，該載體可以作為一次性基因?qū)氲陌踩牟《据d體而被使用(WO00/70055、WO00/70070及WO03/025570；Li，H.-O.等，J.Virol.74(14)6564-6569(2000))。從基因組缺失的基因包括，例如，F(xiàn)基因、HN基因、M基因或其任意組合。例如，通過將表達(dá)缺失了F基因的重組負(fù)鏈RNA病毒基因組的質(zhì)粒、F蛋白的表達(dá)載體和NP、P及L蛋白的表達(dá)載體共同轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞，可以重建重組病毒(見實(shí)施例4-5)。另外，例如，也可以利用染色體中整合了F基因的宿主細(xì)胞來制造病毒。此時(shí)，為使F基因可以誘導(dǎo)表達(dá)，優(yōu)選地使用前面所述的重組酶目標(biāo)序列，使表達(dá)可以被重組酶特異性地誘導(dǎo)。這些在病毒生產(chǎn)細(xì)胞中表達(dá)的蛋白質(zhì)的氨基酸序列不一定要與病毒來源的序列一樣，可以引入變異或用其他病毒的同源的基因來取代，只要其在核酸導(dǎo)入過程中的活性與天然型相比同樣或更高。
另外，如前所述，本發(fā)明還可以制被如下的重組病毒，其包膜中含有與病毒基因組所由來的病毒的包膜蛋白不同的蛋白質(zhì)。例如，重建病毒時(shí)，通過在細(xì)胞中表達(dá)與骨骼病毒基因組原本編碼的包膜蛋白不同的包膜蛋白，可以制備包含所希望的包膜蛋白的重組病毒。對(duì)于這樣的蛋白并無特別限制?？梢允褂媚軌蛸x予細(xì)胞感染能力的所希望的蛋白質(zhì)。例如，其他病毒的包膜蛋白，如水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus；VSV)的G蛋白(VSV-G)等。VSV-G蛋白可以來自任意VSV株。例如可以使用但不限于Indiana血清型株(J.Virology 39519-528(1981))來源的VSV-G蛋白。另外，本發(fā)明的載體可以包括其他病毒來源的包膜蛋白的任意組合。例如，上述蛋白質(zhì)優(yōu)選地包括來源于感染人細(xì)胞的病毒的包膜蛋白。對(duì)于這樣的蛋白沒有特別的限制，包括反轉(zhuǎn)錄病毒的兼嗜性包膜蛋白。例如可以使用來自鼠白血病病毒(MuLV)4070株的包膜蛋白。另外，還可以使用MuMLV 10A1來源的包膜蛋白(例如pCL-10A1(Imgenex)(Naviaux R.K.等，J.Virol.705701-5705(1996))。另外，作為皰疹病毒科(Herpesviridae)的蛋白質(zhì)，包括例如單純皰疹病毒的gB、gD、gH和gp85蛋白、EB病毒的gp350、gp220蛋白等。作為嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)的蛋白質(zhì)，有乙型肝炎病毒的S蛋白。這些蛋白質(zhì)也可以作為融合蛋白的形式使用，所述融合蛋白中胞外域與F蛋白或HN蛋白的胞內(nèi)域結(jié)合。如此，用于本發(fā)明的病毒載體包括假型病毒載體，該載體含有來源于基因組來源的病毒之外的病毒的包膜蛋白，例如VSV-G蛋白等。如果在病毒基因組中設(shè)計(jì)使得上述包膜蛋白不被RNA基因組所編碼，則病毒粒子感染細(xì)胞后，這些蛋白質(zhì)是不會(huì)被病毒載體表達(dá)的。
另外，本發(fā)明還可以，例如，制備這樣的病毒，在其包膜表面含有可粘附特定細(xì)胞的粘附因子、配體、受體等蛋白質(zhì)，抗體或其片段，或者在胞外域中具有上述蛋白、在胞內(nèi)域中具有來源于負(fù)鏈RNA病毒包膜蛋白的多肽的嵌合蛋白質(zhì)等等。藉此，可以控制病毒載體的感染的特異性。這些蛋白可以由病毒基因組編碼，也可以在病毒重建時(shí)，通過病毒基因組以外的基因(例如在其他表達(dá)載體或宿主染色體上存在的基因)的表達(dá)來提供。
另外，在病毒載體中，例如為了降低病毒蛋白質(zhì)引起的免疫原性，或者為了提高RNA的轉(zhuǎn)錄效率或復(fù)制效率，病毒所含的任意病毒基因可以從野生型基因改變而來。具體地，例如可以考慮改變作為復(fù)制因子的N、P和L基因中的至少一個(gè)，從而提高轉(zhuǎn)錄或復(fù)制功能。另外，作為包膜蛋白之一的HN蛋白具有作為紅細(xì)胞凝集素的血凝素(hemagglutinin)活性和神經(jīng)氨酸酶(neuraminidase)活性，例如如果可以降低前者的活性，則可以提高病毒在血液中的穩(wěn)定性；又例如通過改變后者的活性，則可以調(diào)節(jié)感染能力。另外，還可以通過改變F蛋白來調(diào)節(jié)膜結(jié)合能力。另外，例如，通過解析可作為細(xì)胞表面的抗原分子的F蛋白和/或HN蛋白的抗原表位，可以利用它們制備與這些蛋白質(zhì)相關(guān)的抗原性降低的重組病毒載體。
另外，負(fù)鏈RNA病毒載體還可以缺失附屬基因(accessory gene)。例如通過敲除SeV的附屬基因之一的V基因，SeV針對(duì)小鼠等宿主的病原性顯著降低，而培養(yǎng)細(xì)胞中的基因表達(dá)和復(fù)制不受妨礙(Kato，A等，1997，J.Virol.717266-7272；Kato，A.等，1997，EMBO J.16578-587；Curran，J.等，WO01/04272，EP1067179)。這些減毒的載體作為無毒性的體內(nèi)或回體基因?qū)胗幂d體特別有用。
負(fù)鏈RNA病毒是優(yōu)秀的基因?qū)胼d體，它只在宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，由于沒有DNA相，它不會(huì)整合(integration)到染色體中(Lamb，R.A和Kolakofsky，D.，ParamyxoviridaeThe viruses and theirreplication.于Fields BN，Knipe DM，Howley PM編，F(xiàn)ields of virology.Vol.2.Lippincott-Raven PublishersPhiladelphia，1996，pp.1177-1204)。因此，不會(huì)產(chǎn)生由于染色體異常而導(dǎo)致的惡變和永生化等安全方面的問題。負(fù)鏈RNA病毒的這個(gè)特征對(duì)其載體化時(shí)的安全性有很大的貢獻(xiàn)。至于表達(dá)異源基因的結(jié)果，例如仙臺(tái)病毒顯示即使經(jīng)過連續(xù)多代的傳代，基本上沒有發(fā)現(xiàn)核苷酸變異；基因組穩(wěn)定性高；長期穩(wěn)定地表達(dá)插入的異源基因(Yu，D.等，Genes Cells 2，457-466(1997))。另外，由于不具有核衣殼結(jié)構(gòu)蛋白，其在導(dǎo)入基因的大小或包裝上的靈活性等性質(zhì)上都具有長處。由此，提示負(fù)鏈RNA病毒載體可成為新型用于人基因治療的高效率載體。有傳播能力的SeV載體可以導(dǎo)入至少5kb的外源基因，通過添加轉(zhuǎn)錄單位，其可以同時(shí)表達(dá)2種以上的基因。
特別地，雖然已知仙臺(tái)病毒對(duì)嚙齒類具有病原性且會(huì)導(dǎo)致肺炎，但其對(duì)人則沒有病原性。這一點(diǎn)也得到了先前關(guān)于使用非人類靈長類經(jīng)鼻給藥野生型仙臺(tái)病毒后，并不顯示嚴(yán)重的有害作用的報(bào)道的支持(Hurwitz，J.L.等，Vaccine 15533-540，1997；Bitzer，M.等，J.Gene Med，5543-553，2003；Slobod，K.S.等，Vaccine 223182-3186，2004)。仙臺(tái)病毒的這些特征提示該病毒可以應(yīng)用于人類的治療。
病毒載體可以在其基因組RNA中編碼所希望的外源基因。含有外源基因的重組病毒載體是通過將外源基因插入上述病毒載體的基因組中而得到的。外源基因的插入位置可以選擇，例如病毒基因組的非蛋白質(zhì)編碼區(qū)域中的所希望的位點(diǎn)，例如可以插入基因組RNA的3’前導(dǎo)序列區(qū)域與最接近3’末端的病毒蛋白質(zhì)ORF之間，和/或最接近5’末端的病毒蛋白質(zhì)ORF與5’尾隨序列區(qū)域之間。另外，在缺失M、F或HN基因等包膜構(gòu)成蛋白基因的基因組中，可以在該缺失區(qū)域插入編碼外源基因的核酸。當(dāng)向副粘病毒導(dǎo)入外源基因時(shí)，優(yōu)選上述的插入，使得插入基因組的片段的多核苷酸的鏈長為6的倍數(shù)(Journal of Virology，Vol.67，No.8，4822-4830，1993)。使得插入的外源基因和病毒ORF之間構(gòu)成E-I-S序列。通過E-I-S序列可以將2個(gè)或更多的外源基因串聯(lián)插入。
為了便于在cDNA中插入外源基因，可以設(shè)計(jì)用于向編碼基因組RNA的cDNA中插入外來基因的克隆位點(diǎn)。該位點(diǎn)可以是例如基因組的非蛋白質(zhì)編碼區(qū)域的所希望的位置，具體地，可以在3’前導(dǎo)序列區(qū)域和接近3’末端的病毒蛋白質(zhì)ORF之間、各病毒蛋白質(zhì)ORF之間、和/或接近5’末端的病毒蛋白質(zhì)ORF與5’尾隨序列區(qū)域之間插入。在缺失包膜構(gòu)成蛋白基因的基因組中，可以在該缺失區(qū)域設(shè)計(jì)克隆位點(diǎn)?？寺∥稽c(diǎn)可以是例如限制酶的識(shí)別序列?？寺∥稽c(diǎn)也可以是具有多種限制酶識(shí)別序列的所謂多克隆位點(diǎn)?？寺∥稽c(diǎn)還可以存在基因組中的多個(gè)位置，以使得多個(gè)外源基因可以被插入基因組中的不同位置。
載體所攜帶的外源基因的表達(dá)水平可以通過附加在該基因上游(負(fù)鏈(minus或negative鏈)的3’側(cè))的轉(zhuǎn)錄起始序列的種類而調(diào)節(jié)(WO01/18823)。另外，可以通過外源基因的插入基因組的位置來控制，越靠近負(fù)鏈的3’末端插入表達(dá)水平就越高，而越靠近5’末端插入表達(dá)水平越低。這樣，可以合適地控制外源基因的插入位置，以得到該基因的所希望的表達(dá)水平，且使其與前后的病毒蛋白編碼基因處于最適合的組合中。一般地，由于認(rèn)為外源基因高表達(dá)是有利的，優(yōu)選將外源基因與高效的轉(zhuǎn)錄起始序列連接，并在負(fù)鏈基因組3’末端附近插入。具體地，在3’前導(dǎo)序列區(qū)和最接近3’末端的病毒蛋白質(zhì)ORF之間插入?；蛘撸部梢栽谧罱咏?’末端的病毒蛋白質(zhì)基因和第二個(gè)最接近的病毒蛋白質(zhì)基因的ORF之間，或者從最接近3’末端的第二個(gè)和第三個(gè)病毒蛋白質(zhì)基因的ORF之間插入。在野生型副粘病毒中，最接近基因組的3’末端的病毒蛋白質(zhì)基因是N基因，第二個(gè)最接近基因是P基因，第三個(gè)最接近基因是M基因。反過來，當(dāng)不希望導(dǎo)入的基因的高表達(dá)時(shí)，可以通過例如盡量把外源基因的插入位置設(shè)計(jì)到負(fù)鏈基因組的5’一側(cè)，或使用低效的轉(zhuǎn)錄起始序列等，降低來自病毒載體的表達(dá)的水平，從而獲得合適的效果。
當(dāng)編碼外源基因的核酸插入基因組時(shí)附加的序列可以使用，例如，負(fù)鏈RNA病毒的所希望的S序列可以使用，對(duì)于仙臺(tái)病毒而言，可以優(yōu)選地使用3’-UCCCWVUUWC-5’(W＝A或C；V＝A，C，或G)(序列號(hào)11)的序列。特別優(yōu)選3’-UCCCAGUUUC-5’(序列號(hào)12)、3’-UCCCACUUAC-5’(序列號(hào)13)、及3’-UCCCACUUUC-5’(序列號(hào)14)。這些序列用編碼正鏈的DNA序列表示分別為5’-AGGGTCAAAG-3’(序列號(hào)15)、5’-AGGGTGAATG-3’(序列號(hào)16)及5’-AGGGTGAAAG-3’(序列號(hào)17)。作為仙臺(tái)病毒載體的E序列，優(yōu)選例如3’-AUUCUUUUU-5’(序列號(hào)18)(編碼正鏈的DNA則是5’-TAAGAAAAA-3’(序列號(hào)19))。I序列可以是例如任何3個(gè)核苷酸，具體地可以使用3’-GAA-5’(在正鏈DNA中則為’5-CTT-3’)。
為制備負(fù)鏈RNA病毒載體，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，利用CA啟動(dòng)子來誘導(dǎo)含有負(fù)鏈RNA病毒基因組RNA的RNP的重構(gòu)所必需的蛋白質(zhì)，即N、P及L蛋白的表達(dá)及編碼負(fù)鏈RNA病毒基因組RNA的cDNA的轉(zhuǎn)錄?？梢酝ㄟ^轉(zhuǎn)錄生成負(fù)鏈基因組(即與病毒基因組相同的反義鏈)或正鏈(反基因組?；蚪MRNA的互補(bǔ)鏈)，來重建病毒RNP。為了提高載體的重建效率，優(yōu)選形成正鏈。優(yōu)選地，RNA末端盡量正確地反映3’前導(dǎo)序列和5’尾隨序列的末端，就像在天然病毒基因組中一樣。這可由如上所述在轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的5’端附加自剪切型的核酶，使核酶正確地切割出負(fù)鏈RNA病毒基因組的末端而實(shí)現(xiàn)。或者，在另外的實(shí)施方案中，利用噬菌體的RNA聚合酶的識(shí)別序列作為轉(zhuǎn)錄起始序列，在細(xì)胞中表達(dá)該RNA聚合酶，以正確地控制轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的5’端。
為了控制轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的3’端，可以例如使轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的3’端編碼自剪切型的核酶，使該核酶正確地切割出3’端(Hasan，M.K.等，J.Gen.Virol.782813-2820，1997；Kato，A.等，1997，EMBO J.16578-587及Yu，D.等，1997，Genes Cells 2457-466)。核酶可以使用丁型肝炎病毒的反基因組鏈(antigenomic strand)來源的自剪切核酶。
例如重組仙臺(tái)病毒可以按照本說明書的公開以及Hasan，M.K.等，J.Gen.Virol.782813-2820，1997；Kato，A.等，1997，EMBO J.16578-587及Yu，D.等，1997，Genes Cells 2457-466等的描述如下所述構(gòu)建。
納入外源基因時(shí)，首先，準(zhǔn)備含有目的外源基因的cDNA核苷酸序列的DNA樣品。優(yōu)選地，DNA樣品以25ng/μl或25ng/μl以上的濃度用電泳確認(rèn)其為單一質(zhì)粒。下面，以利用NotI位點(diǎn)向編碼病毒基因組RNA的DNA插入外源基因?yàn)槔右哉f明。在目的cDNA核苷酸序列中含有NotI識(shí)別位點(diǎn)時(shí)，優(yōu)選事先使用定點(diǎn)誘變等手段，使核苷酸序列變化而其所編碼的氨基酸序列不變，而除去該NotI位點(diǎn)。用PCR從該樣品中擴(kuò)增并回收目的基因片段。通過在兩個(gè)引物的5’部分附加NotI位點(diǎn)使擴(kuò)增片段的兩端成為NotI位點(diǎn)。使引物中含有E-I-S序列，以使得插入病毒基因組之后的外源基因的ORF與其兩側(cè)的病毒基因的ORF之間置有E-I-S序列。合成DNA的長度設(shè)計(jì)為使得包含附加的E-I-S序列的最終插入片段的鏈長為6的倍數(shù)個(gè)核苷酸(即所謂“6法則”(rule of six)；Kolakofski，D.等，J.Virol.72891-899，1998；Calain，P.和Roux，L.，J.Virol.674822-4830，1993；Calain，P.和Roux，L.，J.Virol.674822-4830，1993；)。E-I-S序列例如可以在插入片段的寡聚DNA的3’側(cè)使用仙臺(tái)病毒的S序列、I序列和E序列，例如分別為5’-CTTTCCACCCT-3’(序列號(hào)20)、5’-AAG-3’、及5’-CTTTCACCCT-3’(序列號(hào)21)。
PCR可以通過使用Taq聚合酶或其他DNA聚合酶的常規(guī)方法進(jìn)行。擴(kuò)增的目的片段用NotI消化后，插入pBluescript等質(zhì)粒載體的NotI位點(diǎn)。通過測序確認(rèn)所得PCR產(chǎn)物的核苷酸序列，選擇序列正確的質(zhì)粒。用NotI從該質(zhì)粒中切割出插入序列，克隆到含有基因組cDNA的質(zhì)粒的NotI位點(diǎn)中。另外，也可以不通過質(zhì)粒載體的介導(dǎo)，將所述片段直接插入基因組cDNA的NotI位點(diǎn)而得到重組仙臺(tái)病毒cDNA。
例如，重組仙臺(tái)病毒基因組RNA可以根據(jù)文獻(xiàn)記載的方法構(gòu)建(Yu，D.等，Genes Cells 2457-466，1997；Hasan，M.K.等，J.Gen.Virol.782813-2820，1997)。例如，合成在外源基因的有義鏈的3’端連接了E-I-S序列的雙鏈DNA。將其插入到編碼基因組正鏈的cDNA的所希望的S序列的緊鄰3’側(cè)。例如，在編碼正鏈基因組的cDNA中，首先在所希望的病毒蛋白質(zhì)基因的編碼序列與轉(zhuǎn)錄該基因的S序列之間放置限制酶位點(diǎn)(例如NotI位點(diǎn))，利用此限制酶位點(diǎn)，在該位點(diǎn)插入編碼外源基因E-I-S序列的DNA。(Tokusumi，T等，(2002)Virus Res 86(1-2)，33-8)。
如此制得的編碼病毒基因組RNA的DNA在細(xì)胞內(nèi)通過CA啟動(dòng)子在上述病毒蛋白質(zhì)(L、P及N)存在下轉(zhuǎn)錄，可以高效地重建病毒載體。本發(fā)明的方法可以應(yīng)用于各種重組病毒的重建方法(WO97/16539；WO97/16538；WO03/025570；Durbin，A.P.等，1997，Virology 235323-332；Whelan，S.P.等，1995，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 928388-8392；Schnell M.J.等，1994，EMBOJ.134195-4203；Radecke，F(xiàn).等，1995，EMBO.J.145773-5784；Lawson，N.D.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 924477-4481；Garcin，D.等，1995，EMBO J.146087-6094；Kato，A.等，1996，Genes Cells 1569-579；Baron，M.D.和Barrett，T，1997，J.Virol.711265-1271；Bridgen，A.和Elliott，R.M.，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9315400-15404)。通過將本發(fā)明的方法應(yīng)用于上述的方法，能夠從DNA高效地重建包括副流感病毒、水泡性口炎病毒、狂犬病毒、麻疹病毒、牛瘟病毒、仙臺(tái)病毒等的負(fù)鏈RNA病毒。編碼病毒基因組的DNA缺失F基因、HN基因和/或M基因等包膜構(gòu)成蛋白基因時(shí)，雖然其本身不形成感染性的病毒粒子，但通過另外將這些缺失的基因和/或編碼別的病毒的包膜蛋白的基因?qū)爰?xì)胞并表達(dá)，仍可以形成感染性的病毒粒子(Hirata，T等，2002，J.Virol.Methods.104125-133；Inoue，M.等，2003，J.Virol.776419-6429)。在病毒生產(chǎn)細(xì)胞中表達(dá)包膜構(gòu)成蛋白時(shí)，這些包膜構(gòu)成蛋白也優(yōu)選地通過CA啟動(dòng)子表達(dá)。為此，將編碼包膜構(gòu)成蛋白的基因連接到CA啟動(dòng)子的下游。這樣，就可以通過CA啟動(dòng)子直接表達(dá)包膜構(gòu)成蛋白。
具體的方法包括，例如，一過性地產(chǎn)生病毒的方法。例如，一種方法是將在CA啟動(dòng)子控制下轉(zhuǎn)錄編碼核酶及負(fù)鏈RNA病毒基因組RNA或其互補(bǔ)鏈的DNA的載體和在CA啟動(dòng)子控制下表達(dá)構(gòu)成含有負(fù)鏈RNA病毒基因組RNA的RNP的病毒蛋白的載體共同轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在構(gòu)成RNP的病毒蛋白的存在下，通過CA啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄負(fù)鏈RNA病毒基因組RNA或反基因組RNA而形成功能性的RNP，從而重建病毒。
另外，在其他方法中，將含有與CA啟動(dòng)子控制下編碼噬菌體RNA聚合酶的DNA的載體、含有連接在該RNA聚合酶的識(shí)別序列下游的編碼負(fù)鏈RNA病毒基因組RNA或其互補(bǔ)鏈的DNA的載體、和在CA啟動(dòng)子控制下表達(dá)構(gòu)成含有負(fù)鏈RNA病毒基因組RNA的RNP的病毒蛋白(N、L和P)的載體共同轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在構(gòu)成RNP的病毒蛋白的存在下，通過CA啟動(dòng)子表達(dá)RNA聚合酶，通過該RNA聚合酶表達(dá)負(fù)鏈RNA病毒基因組RNA或其互補(bǔ)鏈而形成功能性的RNP，從而重建病毒。通過回收在細(xì)胞中生產(chǎn)的負(fù)鏈RNA病毒或其擴(kuò)增產(chǎn)物，可以獲得負(fù)鏈RNA病毒載體。
用于轉(zhuǎn)染的載體優(yōu)選為例如質(zhì)粒。既可以使各個(gè)質(zhì)粒分別表達(dá)一種蛋白質(zhì)，也可以使一個(gè)質(zhì)粒表達(dá)多種蛋白質(zhì)。為此，可以使一個(gè)質(zhì)粒具有多個(gè)啟動(dòng)子，也可以利用IRES通過一個(gè)啟動(dòng)子產(chǎn)生多種蛋白質(zhì)。例如通過IRES等非啟動(dòng)子機(jī)制由一個(gè)啟動(dòng)子表達(dá)2個(gè)以上的蛋白質(zhì)時(shí)，若該啟動(dòng)子是CA啟動(dòng)子，則認(rèn)為這些蛋白質(zhì)是由CA啟動(dòng)子表達(dá)的。但優(yōu)選地使構(gòu)成含有負(fù)鏈RNA病毒基因組RNA的RNP的病毒蛋白(N、L和P)至少分別由不同的CA啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)其表達(dá)。如上述借助轉(zhuǎn)染的一過性病毒生產(chǎn)具有不使用特殊的細(xì)胞也可迅速地制造病毒的優(yōu)點(diǎn)。
用核酸轉(zhuǎn)染細(xì)胞可以使用例如磷酸鈣法(Graham，F(xiàn).L.和Van Der Eb，J.Virology，1973，52456；Wigler，M和Silverstein S.1977，Cell 11223)、使用各種轉(zhuǎn)染試劑的方法或電穿孔法等。磷酸鈣法可以根據(jù)Chen和Okayama(Chen，C和Okayama，H.，1987，Mol.Cell.Biol.72745)以2-4％CO2、35℃、15-24小時(shí)、沉淀混合液中的DNA濃度20-30μg/ml的條件實(shí)施。轉(zhuǎn)染試劑可以使用DEAE-葡聚糖(Sigma#D-9885分子量5×105)、DOTMA(Roche)、Superfect(QIAGEN#301305)、DOTAP、DOPE、DOSPER(Roche#1811169)、TransIT-LT1(Mirus，Product No.MIR2300)等。為了防止轉(zhuǎn)染試劑和DNA的復(fù)合體在內(nèi)體中分解，可以加入氯喹(Calos，M.P.1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 803015)。另外，電穿孔法由于沒有細(xì)胞選擇性而具有較高的通用性，通過優(yōu)化脈沖電流持續(xù)時(shí)間、脈沖形狀、電場(電極的間隙，電壓)強(qiáng)度、緩沖液的電導(dǎo)、DNA濃度和細(xì)胞密度應(yīng)用電穿孔法。對(duì)于將DNA導(dǎo)入細(xì)胞以重建病毒，轉(zhuǎn)染試劑法是適用的，因?yàn)槠洳僮骱啽悴⒖梢允褂么罅康募?xì)胞進(jìn)行多個(gè)樣品的檢測。優(yōu)選地，可以使用Superfect Transfection Reagent(QIAGEN，Cat No.301305)、DOSPERLiposomal Transfection Reagent(Roche，Cat No.1811169)、或TransIT-LT1(Mirus，Product No.MIR2300)等，但不限于此。
本發(fā)明的病毒制造方法的其他實(shí)施方式中，由病毒生產(chǎn)細(xì)胞的染色體表達(dá)病毒生成所必需的蛋白質(zhì)和/或RNA。這樣的方法具體有，例如，使用哺乳動(dòng)物細(xì)胞株的方法，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞在其染色體中整合了由CA啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的負(fù)鏈RNA病毒基因組RNA或其互補(bǔ)鏈的DNA，或由CA啟動(dòng)子表達(dá)的噬菌體來源的RNA聚合酶的DNA。通過克隆轉(zhuǎn)化細(xì)胞并選擇高表達(dá)量的細(xì)胞，可以制備能夠生產(chǎn)更高效價(jià)的病毒的細(xì)胞。因此，該細(xì)胞可用于穩(wěn)定地生產(chǎn)高效價(jià)的病毒。在這些細(xì)胞株中，還優(yōu)選地使得通常條件下病毒基因組RNA和RNA聚合酶不被CA啟動(dòng)子所表達(dá)，而可隨著刺激被誘導(dǎo)表達(dá)?？梢允褂蒙鲜鰈oxP和FRT誘導(dǎo)性地由CA啟動(dòng)子表達(dá)基因。制備病毒時(shí)，通過表達(dá)Cre重組酶和FLP重組酶，誘導(dǎo)CA啟動(dòng)子引起的表達(dá)。
在上述細(xì)胞中，可以通過在構(gòu)成含有負(fù)鏈RNA病毒基因組RNA的RNP的病毒蛋白(N、L和P)的存在下轉(zhuǎn)錄病毒基因組RNA或其互補(bǔ)鏈來重建負(fù)鏈RNA病毒。RNP構(gòu)成蛋白可以通過用編碼它們的質(zhì)粒載體進(jìn)行轉(zhuǎn)染來提供。轉(zhuǎn)染中使用的質(zhì)粒載體的量如下例示在用核酶切割出負(fù)鏈RNA病毒基因組的方法(例如HamRbz法)中，可使用NP表達(dá)質(zhì)粒0.1μg到2μg(更優(yōu)選0.3μg)；P表達(dá)質(zhì)粒0.1μg到2μg(更優(yōu)選0.5μg)、L表達(dá)質(zhì)粒0.5μg到4.5μg(更優(yōu)選2.0μg)、F表達(dá)質(zhì)粒0.1μg到5μg(更優(yōu)選0.5μg)、編碼病毒基因組RNA(正鏈或負(fù)鏈)的質(zhì)粒0.5μg-5μg(更優(yōu)選5μg)。例如制造SeV時(shí)，轉(zhuǎn)染中可以以如下的量使用實(shí)施例記載的各種質(zhì)粒。
pCAGGS-NP 0.1μg-2μg(更優(yōu)選0.3μg)pCAGGS-P 0.1μg-2μg(更優(yōu)選0.5μg)pCAGGS-L(TDK) 0.5μg-4.5μg(更優(yōu)選2.0μg)pCAGGS-F5R 0.1μg-5μg(更優(yōu)選0.5μg)pCAGGS-SeV 0.5μg-5μg(更優(yōu)選5μg)(pCAGGS-SeV/ΔF-GFP)
在通過噬菌體RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄負(fù)鏈RNA病毒基因組的方法中，可使用NP表達(dá)質(zhì)粒0.1μg到2μg(更優(yōu)選0.5μg)；P表達(dá)質(zhì)粒0.1μg到2μg(更優(yōu)選0.5μg)、L表達(dá)質(zhì)粒0.5μg到4.5μg(更優(yōu)選2.0μg)、F表達(dá)質(zhì)粒0.1μg到5μg(更優(yōu)選0.5μg)、編碼病毒基因組RNA(正鏈或負(fù)鏈)的質(zhì)粒0.5μg到5μg(更優(yōu)選5μg)。例如制造SeV時(shí)，轉(zhuǎn)染中可以如下的量使用實(shí)施例記載的各種質(zhì)粒。
pCAGGS-NP 0.1μg-2μg(更優(yōu)選0.5μg)pCAGGS-P 0.1μg-2μg(更優(yōu)選0.5μg)pCAGGS-L(TDK) 0.5μg-4.5μg(更優(yōu)選2.0μg)pCAGGS-F5R 0.1μg-5μg(更優(yōu)選0.5μg)pCAGGS-SeV 0.5μg-5μg(更優(yōu)選5μg)(pCAGGS-SeV/ΔF-GFP)轉(zhuǎn)染后經(jīng)過大約48-72小時(shí)的培養(yǎng)，回收細(xì)胞，反復(fù)凍融約3次破壞細(xì)胞，用含有RNP的破碎物再次轉(zhuǎn)染細(xì)胞，然后培養(yǎng)?；蛘撸厥张囵B(yǎng)上清，將其加入細(xì)胞培養(yǎng)液使細(xì)胞感染，然后培養(yǎng)?？梢酝ㄟ^例如與lipofectamine或多聚陽離子脂質(zhì)體等形成復(fù)合物并導(dǎo)入細(xì)胞來進(jìn)行轉(zhuǎn)染。具體地，可以使用各種轉(zhuǎn)染試劑，例如DOTMA(Roche)、Superfect(QIAGEN#301305)、DOTAP、DOPE、DOSPER(Roche#1811169)、TransIT-LT1(Mirus，Product No.MIR2300)等。為了防止轉(zhuǎn)染試劑和DNA的復(fù)合體在內(nèi)體中被分解，可以加入氯喹(Calos，M.P.1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 803015)。在RNP轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞中，隨著RNP的病毒基因表達(dá)和RNP復(fù)制，病毒被擴(kuò)增。通過將所得的病毒溶液(培養(yǎng)上清)適當(dāng)?shù)叵♂尣⒅貜?fù)進(jìn)行擴(kuò)增，可以除去可能混入的污染物。但是，本發(fā)明由于不使用表達(dá)T7RNA聚合酶的痘苗病毒，故而具有不需要通過重復(fù)擴(kuò)增除去痘病毒白的優(yōu)點(diǎn)。所得的載體可以在-80℃保存。為重建缺失了包膜構(gòu)成蛋白編碼基因的非傳播型病毒，可以使用表達(dá)包膜構(gòu)成蛋白的細(xì)胞(輔助細(xì)胞)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，或者與表達(dá)包膜構(gòu)成蛋白的載體共轉(zhuǎn)染。另外，還可以在轉(zhuǎn)染細(xì)胞上用表達(dá)包膜構(gòu)成蛋白的細(xì)胞進(jìn)行疊層培養(yǎng)來擴(kuò)增包膜構(gòu)成蛋白基因缺陷型病毒(參考國際
發(fā)明者飯?zhí)镎虏? 伴浩志, 井上誠, 平田隆洋, 長谷川護(hù) 申請(qǐng)人:株式會(huì)社載體研究所