專(zhuān)利名稱(chēng)：用于形成結(jié)構(gòu)確定的有機(jī)分子的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于形成有機(jī)分子的方法，更具體地，涉及用于形成有機(jī)分子的方法，該方法包括將水解酶與有機(jī)反應(yīng)物接觸。
許多有機(jī)分子的生物分子機(jī)制基本上是不確定的。特別是，含有硅的有機(jī)分子是多種植物、動(dòng)物和微生物系統(tǒng)中的生長(zhǎng)和生物功能所必需的，然而這些相互作用的分子機(jī)制實(shí)際上是未知的。二氧化硅生物合成領(lǐng)域內(nèi)的自然系統(tǒng)的體外研究是復(fù)雜的。包括仿生方法在內(nèi)的早期的機(jī)制研究常常不能識(shí)別硅酸及其類(lèi)似物的化學(xué)。例如，據(jù)測(cè)定silicatein在二氧化硅微粒的形成過(guò)程中可催化四乙氧基硅烷的縮聚。然而，由于產(chǎn)品及隨后的分析的限制，該研究不能區(qū)分silicatein在生物硅化過(guò)程中的水解和縮合反應(yīng)中的作用。
因此，仍然需要形成結(jié)構(gòu)確定的有機(jī)分子和材料，特別是有機(jī)硅分子的改良的方法。
因此，本發(fā)明貫注于形成有機(jī)分子的方法。方法包括將水解酶與有機(jī)反應(yīng)物接觸。有機(jī)反應(yīng)物包含下式(R1)4-nX(OR2)n或 其中，X選自硅和鍺；R1選自烷基、鹵烷基、不飽和烷基、芳基、醇、環(huán)氧(epoxy)、醚、胺、-(OXR42)y-OXR43及其組合；R2選自烷基、氫、醚及其組合；R3選自烷基、不飽和烷基、芳基、氫及其組合；R4選自烷基、鹵烷基、不飽和烷基、芳基、氫、羥基、烷氧基、醇、環(huán)氧、醚、胺、-(OXR42)y-OXR43及其組合；n是0-4的整數(shù)；y是0或大于0的整數(shù)；和z是3或大于3的整數(shù)。水解酶包括脂酶、蛋白酶、磷酸酯酶、酯酶、角質(zhì)酶(cutinase)或其組合。水解酶催化有機(jī)反應(yīng)物的水解和縮合從而形成有機(jī)分子。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了形成有機(jī)硅分子的方法。該方法包括將水解酶與有機(jī)硅反應(yīng)物接觸。該有機(jī)硅反應(yīng)物包含下式(R1)4-nSi(OR2)n或 其中，R1選自烷基、鹵烷基、不飽和烷基、芳基、醇、環(huán)氧、醚、胺、-(OSiR42)y-OSiR43及其組合；R2選自烷基、氫、醚及其組合；R3選自烷基、不飽和烷基、芳基、氫及其組合；R4選自烷基、鹵烷基、不飽和烷基、芳基、氫、羥基、烷氧基、醇、環(huán)氧、醚、胺、-(OSiR42)y-OSiR43及其組合；n是0-4的整數(shù)；y是0或大于0的整數(shù)；和z是3或大于3的整數(shù)。水解酶包括脂酶、蛋白酶、磷酸酯酶、酯酶、角質(zhì)酶或其組合。水解酶催化有機(jī)硅反應(yīng)物的水解和縮合從而形成有機(jī)硅分子。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了形成有機(jī)硅中間體分子的方法。該方法包括將水解酶與有機(jī)硅反應(yīng)物接觸。該有機(jī)硅反應(yīng)物包含下式(R1)4-nSi(OR2)n或 其中，R1選自烷基、鹵烷基、不飽和烷基、芳基、醇、環(huán)氧、醚、胺、-(OSiR42)y-OSiR43及其組合；R2選自烷基、氫、醚及其組合；R3選自烷基、不飽和烷基、芳基、氫及其組合；R4選自烷基、鹵烷基、不飽和烷基、芳基、氫、羥基、烷氧基、醇、環(huán)氧、醚、胺、-(OSiR42)y-OSiR43及其組合；n是0-4的整數(shù)；y是0或大于0的整數(shù)；和z是3或大于3的整數(shù)。水解酶包括脂酶、蛋白酶、磷酸酯酶、酯酶、角質(zhì)酶或其組合。水解酶催化有機(jī)硅反應(yīng)物的水解和縮合從而形成有機(jī)硅中間體分子。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了形成有機(jī)硅分子的方法。該方法包括將水解酶與有機(jī)硅中間體反應(yīng)物接觸。該有機(jī)硅中間體反應(yīng)物包含下式(R1)4-nSi(OR2)n或 其中，R1選自烷基、鹵烷基、不飽和烷基、芳基、醇、環(huán)氧、醚、胺、-(OSiR42)y-OSiR43及其組合；R2是氫；R4選自烷基、鹵烷基、不飽和烷基、芳基、氫、羥基、烷氧基、醇、環(huán)氧、醚、胺、-(OSiR42)y-OSiR43及其組合；n是0-4的整數(shù)；和y是0或大于0的整數(shù)；a+b等于z；和z是3或大于3的整數(shù)。水解酶包括脂酶、蛋白酶、磷酸酯酶、酯酶、角質(zhì)酶或其組合。水解酶催化有機(jī)硅中間體反應(yīng)物的縮合從而形成有機(jī)硅分子。
在目前確定的反應(yīng)條件下合成有機(jī)分子的能力是有利的，因?yàn)樵摲磻?yīng)條件有助于有機(jī)反應(yīng)物水解并縮合從而形成有機(jī)分子。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，本發(fā)明的其它優(yōu)勢(shì)將會(huì)由于下面的詳細(xì)描述而變得明顯，其中顯示并描述了本發(fā)明的備選示例性實(shí)施方案。正如將會(huì)認(rèn)識(shí)到的，本發(fā)明可包括其它不同的、顯而易見(jiàn)的方面和實(shí)施方案，它們?nèi)慷嘉幢畴x本發(fā)明。因此，應(yīng)該把附圖和描述看作本質(zhì)上是說(shuō)明性的而并不是限制。


圖1說(shuō)明了胰蛋白酶原的一級(jí)結(jié)構(gòu)；圖2說(shuō)明了胰蛋白酶原的活化；圖3說(shuō)明了三甲基乙氧基硅烷陰性對(duì)照反應(yīng)的GC-FID色譜圖；圖4說(shuō)明了三小時(shí)后蛋白酶催化的縮合的研究；圖5說(shuō)明了三小時(shí)后縮合對(duì)照反應(yīng)；圖6說(shuō)明了α-胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶不純研究；圖7說(shuō)明了三甲基硅烷醇的縮合的蛋白質(zhì)抑制；圖8說(shuō)明了溫度對(duì)于胰蛋白酶催化的三甲基硅烷醇縮合的影響；圖9說(shuō)明了胰蛋白酶在中性介質(zhì)中的熱變性作為胰蛋白酶濃度的函數(shù)的研究；
圖10說(shuō)明了在25℃下胰蛋白酶催化的三甲基硅烷醇的縮合；圖11說(shuō)明了飽和的三甲基硅烷醇與胰蛋白酶的摩爾比研究；圖12說(shuō)明了胰蛋白酶在25℃下的自解；圖13說(shuō)明了提出的胰蛋白酶催化的三甲基硅烷醇縮合的反應(yīng)機(jī)制；圖14說(shuō)明了不同胰蛋白酶種類(lèi)的活性的pH研究；圖15說(shuō)明了pH對(duì)于胰蛋白酶催化的三甲基硅烷醇縮合的影響；圖16說(shuō)明了三甲基硅烷醇和pH對(duì)于胰蛋白酶活性的影響；圖17說(shuō)明了三小時(shí)后的水解和縮合對(duì)照反應(yīng)；圖18說(shuō)明了在10℃下胰蛋白酶催化的三甲基乙氧基硅烷的水解和縮合；圖19說(shuō)明了在10℃下胰蛋白酶催化的三甲基乙氧基硅烷水解以及三甲基硅烷醇縮合的轉(zhuǎn)化數(shù)。
圖20說(shuō)明了胰蛋白酶催化的三甲基烷氧基硅烷的水解和縮合；圖21說(shuō)明了胰蛋白酶催化的乙氧基硅烷的水解和縮合；圖22說(shuō)明了胰蛋白酶催化的1，1-二甲基-1-硅雜-2-氧雜環(huán)己烷的水解和縮合；圖23說(shuō)明了三甲基乙氧基硅烷反應(yīng)的蛋白質(zhì)抑制；圖24說(shuō)明了不同來(lái)源的胰蛋白酶催化的三甲基乙氧基硅烷的水解和縮合；圖25說(shuō)明了鈣對(duì)于胰蛋白酶催化的三甲基硅烷醇縮合的影響；以及圖26說(shuō)明了在25℃下14小時(shí)后角質(zhì)酶催化的三甲基硅烷醇的縮合。
在形成有機(jī)分子中的水解和縮合反應(yīng)的研究是復(fù)雜的。具體而言地，這樣的反應(yīng)由于二氧化硅、硅酸鹽和硅酸對(duì)pH、濃度和溫度的增強(qiáng)的敏感性而在生物硅化過(guò)程中是復(fù)雜的。因而，本發(fā)明通過(guò)利用水解酶來(lái)形成結(jié)構(gòu)確定的有機(jī)分子(更具體地為有機(jī)硅分子)克服了這樣的復(fù)雜性。具體而言，如在下列反應(yīng)順序中顯示的，水解酶非特異性地促進(jìn)了有機(jī)反應(yīng)物(A)的水解從而形成有機(jī)中間體反應(yīng)物(B)并隨后選擇性地催化有機(jī)中間體反應(yīng)物(B)的縮合從而形成有機(jī)分子(C)。
(反應(yīng)I) (反應(yīng)II) (反應(yīng)III) 反應(yīng)(I)、(II)和(III)的有機(jī)反應(yīng)物(A)是水解酶選擇性地催化有機(jī)反應(yīng)物水解和縮合的可接受的底物。有機(jī)反應(yīng)物(A)的反應(yīng)位點(diǎn)含有促使有機(jī)反應(yīng)物(A)的水解和縮合從而最終形成有機(jī)分子(C)的電正性原子(例如硅或鍺)。因此，結(jié)構(gòu)上確定的有機(jī)分子可使用反應(yīng)(I)、(II)和(III)的有機(jī)反應(yīng)物(A)來(lái)形成。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員將會(huì)想到多種可在反應(yīng)物中利用的無(wú)機(jī)元素X，在此可使用其中的任何一種。在一個(gè)實(shí)施方案中，X選自硅和鍺。另外，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將會(huì)想到在上述反應(yīng)中可用作R1、R2、R3和R4的多種取代基，在此可使用其中的任何一種。同樣，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，有機(jī)結(jié)構(gòu)的R基團(tuán)不必須是同一重復(fù)單元。而是，對(duì)于每一個(gè)重復(fù)單元可獨(dú)立地選擇R基團(tuán)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，R1選自烷基、鹵烷基、不飽和烷基、芳基、醇、環(huán)氧、醚、胺、-(OXR42)y-OXR43及其組合，其中R4選自烷基、鹵烷基、不飽和烷基、芳基、氫、羥基、烷氧基、醇、環(huán)氧、醚、胺、-(OXR42)y-OXR43及其組合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，R2選自烷基、氫、醚及其組合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，R3選自烷基、不飽和烷基、芳基和氫。在上面詳述的每個(gè)實(shí)施方案中，將會(huì)進(jìn)一步理解，烷基、鹵烷基、不飽和烷基和烷氧基可以是具有一個(gè)碳或多于一個(gè)碳的取代基。而且，在上述反應(yīng)中，n定義為0-4的整數(shù)；y定義為0或大于0的整數(shù)；和z是3或大于3的整數(shù)。另外，整個(gè)本申請(qǐng)所使用的*表示環(huán)狀結(jié)構(gòu)，即沒(méi)有確定的末端基團(tuán)。
有機(jī)反應(yīng)物(A)可以是單官能的或多官能的。例如，有機(jī)反應(yīng)物(A)的式可選自(R1)4X、(R1)3X(OR2)1、(R1)2X(OR2)2、(R1)1X(OR2)3和X(OR2)4。雙官能有機(jī)反應(yīng)物的具體實(shí)例包括但不限于(CH3)2Si(OCH3)2、(CH3)(CF3CH2CH2)Si(OCH3)2、(C6H5)(CH3)Si(OCH3)2和(CH3CH2)2Ge(OCH2CH3)2。三-和四-官能有機(jī)反應(yīng)物的具體實(shí)例分別包括但不限于(CH3)Si(OCH2CH3)3和Si(OCH2CH3)4。有機(jī)反應(yīng)物還可以是線性的、分支的、樹(shù)脂狀的或環(huán)狀的。在一個(gè)實(shí)施方案中，線性、環(huán)狀和分支的有機(jī)分子在最初與水解酶相互作用后可以是完全羥基化的。環(huán)狀、線性和分支的有機(jī)反應(yīng)物的具體實(shí)例分別包括但不限于1，3，5，7-四甲基-1，3，5，7-四甲氧基-環(huán)四硅氧烷、1，3-雙(羥基)四甲基二硅氧烷和[(HO)2(CH3)SiO]3SiCH3。
一旦確定合適的有機(jī)反應(yīng)物，將該有機(jī)反應(yīng)物與水解酶接觸以便催化有機(jī)分子的形成。水解酶可源于細(xì)菌、真菌或哺乳動(dòng)物來(lái)源，或者該水解酶可源于任何其它合適的來(lái)源。該酶通常作為可溶的溶液或異質(zhì)的混懸液存在，并且該酶可以經(jīng)凍干或固定化。在一個(gè)特殊的實(shí)施方案中，水解酶選自脂酶、蛋白酶、磷酸酯酶、酯酶、角質(zhì)酶及其組合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，水解酶包括脂酶例如南極假絲酵母(Candida antarctica)脂酶、南極假絲酵母脂酶B、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)脂酶、麥胚脂酶或其組合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，水解酶包括蛋白酶例如胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶或其組合。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，水解酶是胰蛋白酶或與胰蛋白酶至少70％同源的酶。在Lys6-Ile7肽鍵水解并形成β-胰蛋白酶(即二硫化物交聯(lián)的單多肽鏈)后胰蛋白酶原(圖1-2)得以活化。與新的N-末端異亮氨酸殘基的疏水性相互作用導(dǎo)致形成已知參與底物識(shí)別的區(qū)域，例如結(jié)合結(jié)構(gòu)域和氧陰離子孔(oxyanion hole)。如這些區(qū)域所確定的，胰蛋白酶選擇性地水解與堿性殘基(即精氨酸＞賴(lài)氨酸＞＞天然氨基酸)鄰接的肽鍵?；罨?，Lys131-Ser132和Lys176-Asp177鍵的自溶解分別導(dǎo)致形成α-胰蛋白酶(即交聯(lián)的兩鏈結(jié)構(gòu))和假胰蛋白酶(pseudotrypsin)(即交聯(lián)的三鏈結(jié)構(gòu))。
值得注意的是，活化反應(yīng)和結(jié)構(gòu)變化引起催化性三聯(lián)體的區(qū)域(即Ser183-His46-Asp177，圖1和SEQ ID NO1)的細(xì)微變化。基于這些區(qū)域，胰蛋白酶由于口袋底部的天冬氨酸殘基的靜電引力而與底物中的堿性殘基例如精氨酸和賴(lài)氨酸具有親和力。在這些區(qū)域內(nèi)，非共價(jià)相互作用參與了在整個(gè)酶促反應(yīng)中的底物的穩(wěn)定。商業(yè)的胰蛋白酶制劑含有占優(yōu)的α-和β-胰蛋白酶及其他消化的酶污染物的混合物?；谝患?jí)結(jié)構(gòu)，胰蛋白酶的分子量是23,305。而且，可向該反應(yīng)加入鈣以有助于水解酶的反應(yīng)活性，特別是提高酶的穩(wěn)定性。
除非另外說(shuō)明，在本說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)中使用的表示成分的量、特性例如分子量、反應(yīng)條件等的所有數(shù)字應(yīng)理解為在所有情況下是帶有術(shù)語(yǔ)“約”的。因此，除非另外說(shuō)明，在下面的說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)中列出的數(shù)字特性是近似值，其可根據(jù)在本發(fā)明的實(shí)施方案中所尋求獲得的期望特性而改變。雖然，闡明本發(fā)明的寬范圍的數(shù)字范圍和參數(shù)是近似值，但在具體實(shí)施例中列出的數(shù)值是盡可能精確地報(bào)導(dǎo)的?？墒?，任何數(shù)值固有地含有在它們各自的測(cè)量中存在的誤差必然引起的某些誤差。
反應(yīng)的濃度、溫度和pH可如下面詳細(xì)列出的而改變。具體而言，水解酶的濃度通常大于1mg/mL。在另一個(gè)實(shí)施方案中，水解酶的濃度為約10mg/mL-約80mg/mL。在另一個(gè)實(shí)施方案中，水解酶的濃度為約20mg/mL-約60mg/mL。在另一個(gè)實(shí)施方案中，水解酶的濃度是約40mg/mL。在一個(gè)實(shí)施方案中，有機(jī)反應(yīng)物與酶的摩爾比小于或等于約40000∶1。在另一個(gè)實(shí)施方案中，有機(jī)反應(yīng)物與酶的摩爾比小于或等于約1000∶1。
反應(yīng)溫度通常在約5℃和90℃之間。在另一個(gè)實(shí)施方案中，反應(yīng)在約20℃-約50℃的溫度下進(jìn)行。在另一個(gè)實(shí)施方案中，反應(yīng)在約25℃的溫度下進(jìn)行。反應(yīng)的pH通常為約5.0-約8.0。在一個(gè)實(shí)施方案中，反應(yīng)的pH為7.0。
另外，反應(yīng)可以在無(wú)溶劑的(干凈的(neat))條件下進(jìn)行，或者反應(yīng)可以利用含水溶液或溶劑進(jìn)行。合適的溶劑包括但不限于，水可混溶的有機(jī)溶劑如THF和乙腈，以及相對(duì)無(wú)水的有機(jī)溶劑例如甲苯和己烷。
為了使本發(fā)明更容易理解，可參考下面的實(shí)施例，所述的實(shí)施例旨在舉例說(shuō)明本發(fā)明，而不是用于限制本發(fā)明范圍。
實(shí)施例材料蛋白質(zhì)和肽黑曲霉(Aspergillus niger)脂酶(Amano脂酶A，#53，478-1)、N-α-苯甲?；?L-精氨酸乙酯(BAEE，#B4500)、N-苯甲酰基-L-酪氨酸乙酯(BTEE，#B6125)、牛胰α-胰凝乳蛋白酶(#C-4129)、用TLCK處理的牛胰α-胰凝乳蛋白酶(#C3142)、牛胰磷脂酶A2(P-8913)、牛胰胰蛋白酶(#T4665)、用TPCK處理的牛胰胰蛋白酶(#T1426)、牛血清白蛋白(BSA，#B4287)、南極假絲酵母脂酶(#62299)、解脂假絲酵母(Candidalipolytica)脂酶(#62303)、大西洋鱈(Gadus morhua)胰蛋白酶(#T9906)、豬胃胃蛋白酶(#P7012)、爪哇毛霉(Mucor javanicus)脂酶(#62304)、Novozyme 435(固定化的南極假絲酵母脂酶B，～1％蛋白質(zhì)，#53，732-2)、番木瓜乳汁木瓜蛋白酶(#P4762)、婁地青霉(Penicillium roqueforti)脂酶(#62308)、豬β-球蛋白(#G2512)、豬胰羧肽酶B(#C9584)、豬胰彈性蛋白酶(#E0258)、豬胰脂酶(#L-3126)、豬胰胰蛋白酶(#T0303)、蛋白酶(枯草桿菌蛋白酶，Carlsberg，#P8038)、洋蔥假單胞菌(Pseudomonas cepacia)脂酶(Amano lipase PS，#53，464-1)、螢光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)脂酶(#62321)、米黑根毛霉脂酶(#62291)、來(lái)自大豆的胰蛋白酶抑制劑(來(lái)自大豆的Popcorn抑制劑，#T9128)、來(lái)自大豆的胰蛋白酶-胰凝乳蛋白酶抑制劑(Bowman-Birk抑制劑，#T9777)、鹽酸N-α-對(duì)甲苯磺?；?L-賴(lài)氨酸氯甲基酮(TLCK，#T7254)、N-甲苯磺?；?L-苯丙氨酸氯甲基酮(TPCK，#T4376)、麥胚脂酶(#62306)從Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)購(gòu)買(mǎi)。牛腎組織蛋白酶L(#219418)、人肝組織蛋白酶L(#219402)和Paramecium tetraurelia組織蛋白酶L(#219412)從Calbiochem，EMD Biosciences(San Diego，CA)購(gòu)買(mǎi)。在玉米中表達(dá)的重組的牛的胰蛋白酶(#TRY，CAS#9002-07-7)從ProdiGene(College Station，TX)購(gòu)買(mǎi)。角質(zhì)酶變體由GenencorInternational，Inc.(Palo Alto，CA)提供。
水超純水從Dow Corning Corporation(Midland，MI)的Milli-Q系統(tǒng)獲得。Trizma預(yù)調(diào)制的晶體pH 7.0(Tris-HCl，#T3503)、pH 7.5(Tris-HCl，#T4128)、pH 7.8(Tris-HCl，#T4503)、pH 8.0(Tris-HCl，#T4753)和pH 9.0(Tris-HCl，#T6003)從Sigma-Aldrich購(gòu)買(mǎi)。緩沖液pH 4.00(鄰苯二甲酸氫鉀，#SB101)、pH 5(氫氧化鈉-檸檬酸，#A015860101)，pH 6.00(一堿價(jià)的磷酸鉀-氫氧化鈉，#SB104)和pH10.00(碳酸鉀-硼酸鉀-氫氧化鉀，#SB115)從Fisher Scientific(Pittsburgh，PA)購(gòu)買(mǎi)。
有機(jī)和無(wú)機(jī)分子乙腈(#A996-4)、丙酮(#A929-4)、五氧化二磷(#A244)、2-丙醇(#A451-4)、四氫呋喃(#T427-1)和甲苯(#T291-4)從FisherScientific購(gòu)買(mǎi)。乙酸(#A6283)、氯化鈣(#C3881)、十二烷(#44010)、乙醇(#45，984-4)、己醇(#H13303)、鹽酸(#33，925-3)、氫化鋁鋰(#19，987-7)、氯化鈉(#20，443-9)和碳酸氫鈉(#34，094-4)從Sigma-Aldrich購(gòu)買(mǎi)。四乙二醇單甲基醚(#T1372)從TCI America(Portland，OR)購(gòu)買(mǎi)。二乙基二乙氧基鍺烷(#GED 3404.2)從Gelest，Inc.(Tullytown，PA)購(gòu)買(mǎi)。HPLC級(jí)的有機(jī)溶劑在整個(gè)實(shí)施例中使用。
基于硅的分子三甲基硅烷醇(CAS#1066-40-6，#12848-72)、七甲基羥基四環(huán)硅氧烷(#11050-134B)、六甲基環(huán)三硅氧烷(#E-459-80，cut #3)、八甲基環(huán)四硅氧烷(#E-1927-93-2，lot #2)、1，3，5-三甲基-1，3，5-三(3，3，3-三氟丙基)環(huán)三硅氧烷(LS Trimer)、1，3，5，7-四甲基-1，3，5，7-四(3，3，3-三氟丙基)環(huán)四硅氧烷(#H-1387-145)和2，4，6，8-三甲基-2，4，6，8-四苯基-環(huán)四硅氧烷(#1923-44A)從DowCorning Corporation獲得。3-氨丙基二甲基乙氧基硅烷(#SIA0603.0)、雙(三甲基甲硅烷基)乙酰胺(#SIB1846.0)、二甲基二甲氧基硅烷(#SID 4123.0)、1，1-二甲基-1-硅雜-2-氧雜環(huán)己烷(#SID4234.0)、3-環(huán)氧丙氧基丙基二甲基乙氧基硅烷(#SIG5825)、六甲基二硅氧烷(#SIH6115.0)、三甲基乙氧基硅烷(#SIT8515.0)和三苯基乙氧基硅烷(#SIT8652.0)從Gelest，Inc.(Tullytown，PA)購(gòu)買(mǎi)。六甲基二硅氮烷(#37921-2)和四乙氧基硅烷(#23620-9)從Sigma-Aldrich購(gòu)買(mǎi)。苯基二甲基乙氧基硅烷(#P0161)從UnitedChemical Technologies，Inc.(Bristol，PA)購(gòu)買(mǎi)。甲基三乙氧基硅烷(#M9050)從Huls America，Inc.(Bristol，PA)購(gòu)買(mǎi)。
三甲基烷氧基硅烷的合成合成了具有極性和非極性離去基團(tuán)的兩種三甲基烷氧基硅烷。用雙(三甲基甲硅烷基)乙酰胺將四乙二醇單甲基醚(TGME)和己醇甲硅烷基化，以分別獲得目標(biāo)極性(Me3SiO(CH2CH2O)4CH3)和非極性(Me3SiOC6H13)硅烷。
實(shí)施例1生物催化研究該研究貫注于酶在烷氧基硅烷的體外水解和縮合過(guò)程中催化硅氧烷鍵形成的能力的定量測(cè)試。由于在形成具有單個(gè)硅氧烷鍵的分子的過(guò)程中選擇單官能的硅烷作為反應(yīng)物，因此建立嚴(yán)格的方法來(lái)制備玻璃器皿，并通過(guò)氣相色譜法(GC)分離和定量分析反應(yīng)產(chǎn)物。
萃取效率的測(cè)量定義為反應(yīng)物和產(chǎn)物的百分比產(chǎn)率。物料衡算(mass balance)等于萃取值的總和。根據(jù)色譜法結(jié)果，在25℃下THF的萃取效率與乙醚、二氯甲烷和甲苯相比較是優(yōu)異的?；趦纱屋腿?，通過(guò)THF通常獲得大于98％的物料衡算。
基于一式三次的測(cè)量，分析物的響應(yīng)系數(shù)得以計(jì)算并確定為相關(guān)于三個(gè)量級(jí)范圍內(nèi)的濃度(即0.1-10％(w/w))呈線性。如圖3中顯示的，將烷氧基硅烷、硅烷醇和二硅氧烷分析物通過(guò)色譜法進(jìn)行解析。解析這些分析物的能力對(duì)于區(qū)分酶在生物硅化期間在水解和縮合反應(yīng)中的作用來(lái)說(shuō)是必需的。相較而言，因?yàn)楫a(chǎn)物及隨后的分析的限制，甘桔荔枝海綿(Tethya aurantia)(即silicatein)和Equisetumtelmateia植物(即生物聚合體)研究，包括silicatein-模擬方法(即二嵌段多肽)，不能區(qū)分蛋白質(zhì)或多肽在生物硅化期間在水解和縮合反應(yīng)中的作用。
實(shí)施例2酶催化的縮合研究該研究貫注于用三甲基硅烷醇進(jìn)行酶篩選以便評(píng)價(jià)各種酶催化硅氧烷鍵形成的能力?；趶母式劾笾＞d(silicatein)、Cylindrotheca fusiformis diatom(silaffin)和Equisetumtelmateia植物(生物聚合體提取物)分離的蛋白質(zhì)的相似性，選擇了一系列脂酶和絲氨酸-蛋白酶作為同源蛋白水解酶。除了催化相當(dāng)?shù)姆磻?yīng)(即酰胺和/或酯鍵的水解)，水解酶中的活性位點(diǎn)由類(lèi)似的絲氨酸-組氨酸-天冬氨酸催化性三聯(lián)體組成。與對(duì)照反應(yīng)比較，用三甲基硅烷醇篩選了在表1中詳細(xì)描述的哺乳動(dòng)物、真菌和細(xì)菌的脂酶和蛋白酶。在該研究中，對(duì)照反應(yīng)定義為非酶促反應(yīng)。具體而言，將在不存在蛋白質(zhì)的情況下進(jìn)行的試驗(yàn)定義為陰性對(duì)照反應(yīng)。蛋白質(zhì)分子例如牛血清白蛋白和豬γ-球蛋白用于研究非特異性蛋白質(zhì)催化。
表1酶篩選
1南極假絲酵母脂酶B固定在丙烯酸類(lèi)樹(shù)脂珠(Novozyme435)上。
反應(yīng)之前，將玻璃小瓶用丙酮(×2)和乙醇(×2)漂洗，干燥，并將其于25℃在存在乙酸(0.2mmol)的情況下用六甲基二硅氮烷(1mmol)進(jìn)行甲硅烷基化30分鐘。隨后，將所述小瓶用乙醇(×2)漂洗并在110℃的烘箱中干燥。確定甲硅烷基化的玻璃小瓶沒(méi)有污染具有三甲基硅烷醇或六甲基二硅氧烷的反應(yīng)體系。
在1.3mL甲苯或1.1mL水中以5∶1的三甲基硅烷醇(225mg)與蛋白質(zhì)(45mg脂酶、蛋白酶或BSA)的重量比配制反應(yīng)體系。將甲苯在氫化鋁鋰上干燥(‘干甲苯’，11ppm水)，和用Milli-Q水進(jìn)行水合(‘濕甲苯’，467ppm水)。在Aquatest IV滴定器(PhotovoltCorporation，New York，NY)上進(jìn)行Karl Fischer滴定來(lái)測(cè)量甲苯中的水含量。將Milli-Q水(‘水’)用50mM Tris-HCl緩沖液，pH7.0(‘緩沖的pH 7’)緩沖。三甲基硅烷醇在水中估計(jì)的溶解度是4.2％(即42.56mg/mL)。基于該配制，在水中進(jìn)行的兩相反應(yīng)用三甲基硅烷醇(～200mg/mL)飽和。封閉的(用螺旋蓋蓋住的)反應(yīng)于25℃并伴隨磁力攪拌在惰性玻璃小瓶中進(jìn)行6天。分離并通過(guò)GC定量分析反應(yīng)產(chǎn)物。分析之前，將含水的反應(yīng)體系在存在NaCl時(shí)用THF萃取(×2)并通過(guò)Whatman Autovial5 0.45μm的Teflon過(guò)濾器(#AV115NPUORG)進(jìn)行過(guò)濾。
結(jié)果總結(jié)于表2中。與陰性對(duì)照和非特異性蛋白(即BSA)反應(yīng)相較而言，觀察到所選擇的脂酶以及胰蛋白酶和α-胰凝乳蛋白酶在溫和條件下于形成六甲基二硅氧烷的過(guò)程中催化三甲基硅烷醇的縮合。據(jù)測(cè)定，在表2中用(√)選中的酶比陰性對(duì)照反應(yīng)催化超過(guò)十倍的三甲基硅烷醇縮合；而且，在有機(jī)和含水介質(zhì)中比BSA反應(yīng)分別催化超過(guò)三倍或十倍的三甲基硅烷醇縮合。相反，在表2中未用(√)選中的酶催化模型縮合反應(yīng)的能力與對(duì)照反應(yīng)基本沒(méi)有不同?？偠灾谒邢鄬?duì)的縮合速率增加。與脂酶相反，蛋白酶將僅與水溶性底物相互作用。三甲基硅烷醇估計(jì)的在水中的溶解度是4.2％(即42.56mg/mL)。
表2六天后酶催化的縮合研究
1南極假絲酵母脂酶B固定在丙烯酸類(lèi)樹(shù)脂珠(Novozyme435)上。
實(shí)施例3蛋白酶-催化的硅烷醇反應(yīng)基于來(lái)自牛胰腺的胰蛋白酶和α-胰凝乳蛋白酶的異常的活性(表2)，將蛋白酶確定為目標(biāo)催化劑。因而，選擇一系列絲氨酸-、半胱氨酸-、天冬氨酸-和金屬-蛋白酶以評(píng)估它們?cè)谥行越橘|(zhì)(pH 7.0)中催化具有硅氧烷鍵的分子形成的能力(方案1)。
方案1蛋白酶催化的三甲基硅烷醇的縮合。
與對(duì)照反應(yīng)比較，用三甲基硅烷醇篩選在表3中詳述的蛋白酶催化硅氧烷縮合的能力。相較而言，在酶催化的縮合研究中進(jìn)行的最初反應(yīng)進(jìn)行六天，而在本研究中進(jìn)行3小時(shí)。
表3蛋白酶篩選
反應(yīng)之前，將玻璃小瓶甲硅烷基化。在0.5mL的50mM Tris-HCl緩沖的Milli-Q水，pH 7.0中以4∶1的三甲基硅烷醇(80mg)與蛋白質(zhì)(20mg蛋白酶、BSA或γ-球蛋白)的重量比(～1000∶1硅烷醇與蛋白酶的摩爾比)配制反應(yīng)體系。
基于三甲基硅烷醇在水中估計(jì)的溶解度(42.56mg/mL)，三甲基硅烷醇的濃度(～160mg/mL)飽和了含水介質(zhì)并產(chǎn)生兩相反應(yīng)混合物。將反應(yīng)產(chǎn)物分離，并如圖4中所說(shuō)明的通過(guò)GC進(jìn)行定量分析。在分析之前，將含水反應(yīng)體系在存在NaCl時(shí)用THF萃取(×2)并通過(guò)WhatmanAutovial5 0.45μm Teflon過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾。
胰蛋白酶和α-胰凝乳蛋白酶在溫和條件下優(yōu)先催化三甲基硅烷醇的縮合。將中性介質(zhì)(pH 7.0)用于區(qū)分酶催化和化學(xué)催化。因?yàn)榇呋瘏^(qū)域的特異性，蛋白酶是底物選擇性的。選取三甲基硅烷醇作為模型硅烷醇來(lái)研究酶在具有單個(gè)硅氧烷鍵的分子的形成中的作用。值得注意的是，三種來(lái)源的組織蛋白酶L不催化縮合反應(yīng)。相反，盡管證明silicatein與組織蛋白酶L是高度同源的，但silicatein催化微粒二氧化硅和硅倍半氧烷的形成。酶的活性取決于非天然有機(jī)硅底物的官能度。
與原材料比較，在陰性對(duì)照、非特異性蛋白(即BSA、γ-球蛋白)、小分子(即CaCl2、咪唑、N-甲基咪唑)和多肽(即聚L-賴(lài)氨酸)反應(yīng)中未觀察到實(shí)質(zhì)性的三甲基硅烷醇縮合(圖5)。除了蛋白質(zhì)之外，還選取了小分子來(lái)基于催化活性的胰蛋白酶的官能度獨(dú)立地評(píng)估非特異性催化。由于需要鈣來(lái)使胰蛋白酶的活性和穩(wěn)定性最大化，所以將胰蛋白酶用氯化鈣處理。類(lèi)似于在胰蛋白酶表面上的氨基-官能性殘基，將咪唑、N-甲基咪唑和聚L-賴(lài)氨酸用于評(píng)估在中性介質(zhì)中的堿催化(base catalysis)。同樣，在含水介質(zhì)(pH＝6.8)中未觀察到BSA和聚L-賴(lài)氨酸催化四乙氧基硅烷的縮聚。
實(shí)施例4不純研究因?yàn)閷?duì)堿性殘基如精氨酸和賴(lài)氨酸的增強(qiáng)的偏好性，鹽酸N-α-對(duì)甲苯磺?；?L-賴(lài)氨酸氯甲基酮選擇性地且不可逆地抑制胰蛋白酶活性而不影響α-胰凝乳蛋白酶的活性。TLCK通過(guò)烷基化催化性三聯(lián)體中的組氨酸殘基來(lái)抑制胰蛋白酶。用TLCK處理α-胰凝乳蛋白酶后，在重復(fù)的縮合試驗(yàn)中產(chǎn)物收率明顯減少(圖6)。
基于TLCK對(duì)照反應(yīng)的產(chǎn)物收率(圖6)，α-胰凝乳蛋白酶不催化三甲基硅烷醇的縮合。備選地，將經(jīng)N-甲苯磺?；?L-苯丙氨酸氯甲基酮(一種不可逆的胰凝乳蛋白酶抑制劑)處理的胰蛋白酶用于補(bǔ)充經(jīng)TLCK處理的α-胰凝乳蛋白酶試驗(yàn)。因?yàn)橐饶榈鞍酌笇?duì)疏水性殘基如苯丙氨酸有特異性，因而TPCK通過(guò)烷基化催化性三聯(lián)體中的組氨酸殘基來(lái)抑制胰凝乳蛋白酶?；谏V法結(jié)果(圖6)和彈性蛋白酶的無(wú)活性(圖4)，確定與α-胰凝乳蛋白酶相反，胰蛋白酶催化三甲基硅烷醇的縮合。此外，在最初的酶催化的縮合研究中觀察到胰蛋白酶和α-胰凝乳蛋白酶的異常活性(表2)是因?yàn)橐鹊鞍酌覆患儭?br> 實(shí)施例5胰蛋白酶催化的硅烷醇的縮合在反應(yīng)之前，將玻璃小瓶甲硅烷基化。分離反應(yīng)產(chǎn)物并通過(guò)GC進(jìn)行定量分析。分析之前，將含水的反應(yīng)體系在存在NaCl時(shí)用THF萃取(×2)，并通過(guò)Whatman Autovial5 0.45μm的Teflon過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾。在這些研究中，對(duì)照反應(yīng)定義為非酶促反應(yīng)。具體而言，在不存在蛋白質(zhì)時(shí)進(jìn)行的試驗(yàn)定義為陰性對(duì)照反應(yīng)。
蛋白質(zhì)抑制研究進(jìn)行蛋白質(zhì)抑制研究以研究酶活性位點(diǎn)在模型硅烷醇縮合反應(yīng)中的作用。具體來(lái)說(shuō)，用來(lái)自大豆的兩種截然不同的天然多肽抑制劑抑制胰蛋白酶和α-胰凝乳蛋白酶，所述的抑制劑是來(lái)自大豆的胰蛋白酶-胰凝乳蛋白酶抑制劑(即Bowman-Birk抑制劑，BBI)和胰蛋白酶抑制劑(即Kunitz大豆胰蛋白酶抑制劑或Popcorn抑制劑，PCI)。
所述大豆抑制劑是具有非常確定的抑制位點(diǎn)的高度穩(wěn)定的蛋白質(zhì)。盡管這些蛋白質(zhì)抑制劑來(lái)自相同來(lái)源，但多肽的氨基酸序列、三級(jí)結(jié)構(gòu)和特性是不同的。BBI和PCI蛋白質(zhì)分別含有71個(gè)(MW＝7,975)和181個(gè)(MW＝21,700)氨基酸。BBI含有選擇性地抑制胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的雙重獨(dú)立的區(qū)域。這些區(qū)域內(nèi)的反應(yīng)位點(diǎn)確定為L(zhǎng)ys16-Ser17(胰蛋白酶)和Leu43-Ser44(胰凝乳蛋白酶)。抑制反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)和平衡是獨(dú)立的。PCI通過(guò)與Arg63-Ile64反應(yīng)位點(diǎn)相互作用來(lái)選擇性地抑制胰蛋白酶。
反應(yīng)前，在加入三甲基硅烷醇之前，在攪拌的中性介質(zhì)(pH 7.0)中將酶用過(guò)量的抑制劑(即分別地，＞1∶1(w/w)或4∶1的BBI對(duì)蛋白酶的摩爾比，和2∶1的PCI對(duì)蛋白酶的摩爾比)抑制2小時(shí)。用4∶1的單體與酶的重量比(～1000∶1的硅烷醇與蛋白酶的摩爾比)配制反應(yīng)體系，并在25℃下反應(yīng)3小時(shí)。分離反應(yīng)產(chǎn)物并通過(guò)GC進(jìn)行定量分析(圖7)。
基于標(biāo)準(zhǔn)的酶活性測(cè)定法，BBI(98％)和PCI(91％)完全抑制了胰蛋白酶，而B(niǎo)BI(63％)部分抑制α-胰凝乳蛋白酶。與對(duì)照反應(yīng)比較，蛋白質(zhì)抑制劑完全抑制了蛋白酶催化的縮合反應(yīng)。因?yàn)棣?胰凝乳蛋白酶受PCI抑制，所以證實(shí)了在α-胰凝乳蛋白酶中存在胰蛋白酶。此外，盡管BBI部分抑制α-胰凝乳蛋白酶，但未觀察到縮合。雖然不希望受理論束縛，但看起來(lái)，活性位點(diǎn)的三級(jí)結(jié)構(gòu)、官能度以及胰蛋白酶的催化性三聯(lián)體直接涉及三甲基硅烷醇的體外縮合。
溫度研究研究了溫度對(duì)于胰蛋白酶以及對(duì)酶催化的縮合反應(yīng)的影響。反應(yīng)之前，攪拌緩沖的含水胰蛋白酶溶液(pH 7.0)并將其在恒溫水浴(+/-0.1℃)中在設(shè)定的溫度下平衡20分鐘。用4∶1的單體與酶的重量比(～1000∶1的硅烷醇與胰蛋白酶的摩爾比值)配制反應(yīng)體系，并在設(shè)定的溫度下反應(yīng)3小時(shí)。在熱變性試驗(yàn)中，在25℃下進(jìn)行縮合反應(yīng)之前，將胰蛋白酶在50mM Tris-HCl緩沖的Milli-Q水(pH 7.0)中獨(dú)立地沸騰20分鐘和3小時(shí)。分離反應(yīng)產(chǎn)物并通過(guò)GC進(jìn)行定量分析(圖8)。
與對(duì)照反應(yīng)比較，胰蛋白酶在寬的溫度范圍內(nèi)顯示出催化活性。反應(yīng)的最適溫度是約25℃。在讓胰蛋白酶溶液(40mg/mL)沸騰不同的時(shí)間(即20分鐘對(duì)3小時(shí))后，胰蛋白酶催化的縮合反應(yīng)的速率由于熱變性程度而減少。盡管酶促反應(yīng)的速率可隨溫度而增加，但已經(jīng)報(bào)道，由于分解，在水中高溫使酶(包括胰蛋白酶)可逆地去折疊并不可逆地失活。
因?yàn)榉磻?yīng)速率取決于熱變性程度，所以在中性介質(zhì)(pH 7.0)中，將天然的底物N-α-苯甲?；?L-精氨酸乙酯(BAEE)用于研究作為濃度的函數(shù)的煮沸過(guò)的胰蛋白酶溶液的活性。在0.5mL的50mMTris-HCl緩沖的Milli-Q水(pH 7.0)中制備不同濃度的胰蛋白酶(即2-40mg/mL)。在測(cè)量煮沸過(guò)的胰蛋白酶的活性之前將該溶液沸騰20分鐘，所述胰蛋白酶活性的測(cè)量通過(guò)記錄在253nm時(shí)由于N-α-苯甲酰基-L-精氨酸的形成而引起的吸光度的變化來(lái)進(jìn)行。所述經(jīng)分光光度法測(cè)量的活性數(shù)據(jù)在圖9中說(shuō)明。
如通過(guò)BAEE的水解速率測(cè)量的，煮沸過(guò)的胰蛋白酶溶液的活性在低濃度時(shí)由于增加的變性而降低。相較而言，硅烷醇縮合速率的相對(duì)減少(圖8)與在高蛋白質(zhì)濃度時(shí)胰蛋白酶的穩(wěn)定性增強(qiáng)(圖9)相關(guān)聯(lián)?；跓嶂亓糠治觯鹊鞍酌冈趶氖覝氐?00℃時(shí)經(jīng)歷了小的質(zhì)量損失，和在225℃時(shí)經(jīng)歷了嚴(yán)重的質(zhì)量損失。熱特性曲線(thermalprofile)支持在物理分解之前可能的水分損失?？梢?jiàn)，回收的樣品是顯著炭化的。在差示熱分析圖中，由于酶中的結(jié)晶相或有序相，在40℃時(shí)觀察到不可逆的吸熱熔化(Tm)。盡管不希望受理論束縛，但看起來(lái)，在第二次熱循環(huán)過(guò)程中胰蛋白酶由于缺少重復(fù)的吸熱熔化而不可逆地變性。
時(shí)間研究在25℃下，經(jīng)24小時(shí)的時(shí)間，研究了胰蛋白酶催化的三甲基硅烷醇的縮合。在中性介質(zhì)(pH 7.0)中以4∶1的單體與酶的重量比(～1000∶1的硅烷醇與胰蛋白酶的摩爾比)配制獨(dú)立的反應(yīng)體系，并以指定的24小時(shí)的時(shí)間進(jìn)行反應(yīng)。在25℃下，胰蛋白酶催化的三甲基硅烷醇的縮合在三小時(shí)后基本上完成。基于該縮合反應(yīng)的化學(xué)計(jì)量，產(chǎn)生每摩爾的六甲基二硅氧烷(HMDS)消耗兩摩爾的三甲基硅烷醇(物料衡算，圖10)。相反，在中性介質(zhì)(pH 7.0)以及有機(jī)溶劑(甲苯)中，用六甲基二硅氧烷研究了胰蛋白酶催化的縮合反應(yīng)的可逆性。因?yàn)樵谏V法結(jié)果中未觀察到三甲基硅烷醇，所以在任一介質(zhì)中未觀察到胰蛋白酶催化硅氧烷鍵的水解。雖然胰蛋白酶理論上由于微觀可逆性定律而催化硅氧烷鍵的水解，但在這些條件下逆反應(yīng)是不利的。
基于三甲基硅烷醇在水中估計(jì)的溶解度(42.56mg/mL)，三甲基硅烷醇(～160mg/mL)的濃度飽和了含水介質(zhì)并產(chǎn)生兩相的反應(yīng)混合物。因?yàn)榈鞍酌笇⒅慌c水溶性的底物反應(yīng)，所以胰蛋白酶催化的三甲基硅烷醇的縮合要求在水相中發(fā)生。雖然該縮合反應(yīng)在水中進(jìn)行，但通過(guò)產(chǎn)物的相分離促進(jìn)了酶催化的反應(yīng)。在存在水時(shí)，產(chǎn)物即六甲基二硅氧烷的不可混溶性改變平衡并促進(jìn)縮合反應(yīng)。因?yàn)槿谆柰榇硷柡土撕橘|(zhì)，因此反應(yīng)物由于縮合反應(yīng)的動(dòng)態(tài)平衡將繼續(xù)進(jìn)入水相。此外，由于二硅氧烷產(chǎn)物在水相中的不可混溶性，水解或逆反應(yīng)將會(huì)受到嚴(yán)重的妨礙。
時(shí)間實(shí)施例過(guò)程中的縮合速率分析了在時(shí)間研究過(guò)程中的縮合速率，以便開(kāi)始研究在25℃下由胰蛋白酶催化的反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)。基于所提出的反應(yīng)的時(shí)間-獨(dú)立的化學(xué)計(jì)量，定義了縮合速率(V)的等式(等式1)和理論速率的等式(等式2)。
V＝-0.5*(δ[Me3SiOH]/δt)＝1*(δ[HMDS]/δt) (等式1)V＝kR[Me3SiOH]α[胰蛋白酶]β(等式2)在等式1中，縮合速率定義為反應(yīng)物或產(chǎn)物的濃度(即[摩爾濃度]＝摩爾/升)隨時(shí)間的變化(例如δ[HMDS]/δt)。在等式2中，定義了每種反應(yīng)物的試驗(yàn)速率常數(shù)(KR)和分反應(yīng)級(jí)數(shù)(即α和β)?？偡磻?yīng)級(jí)數(shù)是分級(jí)數(shù)的總合(即α+β)。由于在縮合反應(yīng)過(guò)程中未消耗胰蛋白酶(即催化劑)，因而將該項(xiàng)包含在速率常數(shù)(KR’)內(nèi)，并將理論的速率方程(等式2)如等式3定義中定義的進(jìn)行簡(jiǎn)化。一般的速率方程如等式4所描述。
V＝KR’[Me3SiOH]α，KR’＝KR[胰蛋白酶]β(等式3)V＝-0.5*(δ[Me3SiOH1/δt)＝kR’[Me3SiOH]α，α＝1或2 (等式4)因?yàn)樵诖蠖鄶?shù)縮合反應(yīng)過(guò)程中三甲基硅烷醇飽和了溶液，所以三甲基硅烷醇的絕對(duì)量實(shí)際上可能是恒定的。若給定恒定濃度的三甲基硅烷醇和胰蛋白酶(即催化劑)，則這些反應(yīng)條件將導(dǎo)致零-級(jí)的理論速率方程(等式2)。換而言之，縮合的速率近似于恒定。由于HMDS的縮合或形成的最初(＜3小時(shí))和最終(＞3小時(shí))的速率是常數(shù)或線性的，因而數(shù)據(jù)集(data set)顯示支持該估計(jì)?；谝鹊鞍酌傅臐舛?即[Et]＝[胰蛋白酶]＝1.7mM)和縮合速率(即V＝-δ[Me3SiOH]/δt＝0.0064M/m～2δ[HMDS]/δt＝0.0072M/m)，當(dāng)用底物完全飽和酶時(shí)，在單位時(shí)間內(nèi)由酶分子將底物分子轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化數(shù)(Kcat)或數(shù)目的相對(duì)值經(jīng)計(jì)算為在25℃下每分鐘(m-1)4.0次反應(yīng)或每秒鐘(s-1)0.066次反應(yīng)。
因?yàn)橐鹊鞍酌赣捎谌谆柰榇荚谒杏邢薜娜芙舛榷赡苁遣伙柡偷?，因而將轉(zhuǎn)化數(shù)處理為相對(duì)值。若相對(duì)轉(zhuǎn)化數(shù)等于0.066s-1，胰蛋白酶催化的每次縮合反應(yīng)之間的時(shí)間間隔經(jīng)計(jì)算為15s。較于其他酶和它們的生理學(xué)底物的最大轉(zhuǎn)化數(shù)，在25℃時(shí)胰蛋白酶催化的三甲基硅烷醇的縮合的轉(zhuǎn)化數(shù)比所引用的值低幾個(gè)數(shù)量級(jí)(即～10-10,000,000)。例如，胰蛋白酶催化的三甲基硅烷醇的縮合的轉(zhuǎn)化數(shù)比天然胰凝乳蛋白酶催化的水解反應(yīng)慢約1500倍。
實(shí)施例6單體與酶的摩爾比的評(píng)估將三甲基硅烷醇的縮合速率作為單體與酶的摩爾比的函數(shù)進(jìn)行研究。在緩沖的水中(pH 7.0)用恒定量的三甲基硅烷醇(160mg/mL)和不同量的胰蛋白酶(2-198mg/mL)配制摩爾比。封閉的(用螺旋蓋蓋住的)反應(yīng)在25℃下在磁力攪拌的同時(shí)進(jìn)行3小時(shí)。分離反應(yīng)產(chǎn)物并通過(guò)GC進(jìn)行定量分析(圖11)。
基于色譜法的結(jié)果，測(cè)定出反應(yīng)速率依賴(lài)于胰蛋白酶的量。此外，由于在稀濃度的胰蛋白酶(即＜20mg/ml)時(shí)可能自解，這些試驗(yàn)變量之間的相互作用是復(fù)雜的。由于稀胰蛋白酶溶液的穩(wěn)定性降低(圖12)，因而在整個(gè)縮合研究中在40mg/mL的胰蛋白酶溶液中配制1000∶1的單體與酶的摩爾比。
由于反應(yīng)用恒定濃度的三甲基硅烷醇進(jìn)行，則使用簡(jiǎn)化的理論速率方程(等式5)來(lái)初步評(píng)估關(guān)于胰蛋白酶的分反應(yīng)級(jí)數(shù)。如果胰蛋白酶的分反應(yīng)級(jí)數(shù)是一級(jí)(β＝1)，則縮合速率(V)與胰蛋白酶濃度的比值是恒定值(等式6)。
V＝KR’[胰蛋白酶]β，KR’＝KR[Me3SiOH]α(等式5)KR’＝V/[胰蛋白酶]1(等式6)因?yàn)榭s合反應(yīng)以固定的時(shí)間(即3小時(shí))進(jìn)行，所以形成的六甲基二硅氧烷的量(μmole)與縮合速率相關(guān)(即V＝[HMDS]3小時(shí))?？偨Y(jié)色譜法的結(jié)果顯示，計(jì)算出的六甲基二硅氧烷與胰蛋白酶的摩爾比確實(shí)近似于常數(shù)。換而言之，縮合速率似乎與胰蛋白酶的濃度成正比(理論上的黑線，圖11)。
如所觀察到的，若以10為系數(shù)減少胰蛋白酶的量，則產(chǎn)物收率以10為系數(shù)減少。該試驗(yàn)觀察證明胰蛋白酶在位于中性介質(zhì)中的三甲基硅烷醇的縮合中的催化劑作用，并證明其通過(guò)簡(jiǎn)單的酶-底物中間體進(jìn)行。
實(shí)施例7胰蛋白酶催化的不飽和三甲基硅烷醇溶液的縮合的動(dòng)力學(xué)研究由于蛋白酶只與水溶性底物相互作用，所以在不飽和介質(zhì)中減少三甲基硅烷醇的濃度(＜42.56mg/mL)以研究作為單體濃度的函數(shù)的縮合速率。調(diào)節(jié)三甲基硅烷醇的量(～10-40mg/mL，～60-222μmole)以在40mg/mL中性(pH 7.0)胰蛋白酶溶液中產(chǎn)生均質(zhì)溶液。反應(yīng)在25℃和15℃下在磁力攪拌的同時(shí)進(jìn)行。淬滅獨(dú)立的反應(yīng)后，一小時(shí)內(nèi)每15分鐘分離反應(yīng)產(chǎn)物并通過(guò)GC進(jìn)行定量分析。
將差異法(differential method)用于測(cè)定關(guān)于三甲基硅烷醇的分反應(yīng)級(jí)數(shù)。計(jì)算理論速率方程(等式3)的對(duì)數(shù)以產(chǎn)生線性方程(等式7)，其中斜率(α)等于三甲基硅烷醇的分反應(yīng)級(jí)數(shù)。
Log(V)＝αLog[Me3SiOH]+Log(kR’) (等式7)畫(huà)出在25℃(α＝0.9)和15℃(α＝1.0)時(shí)的Log(V)對(duì)Log[Me3SiOH]的圖之后，估計(jì)三甲基硅烷醇的分反應(yīng)級(jí)數(shù)為一級(jí)。三甲基硅烷醇的不同速率方程(differential rate equation)的圖是線性的。相關(guān)系數(shù)(R2)值分別是94％和98％。由于確定反應(yīng)速率線性地依賴(lài)于三甲基硅烷醇在40mg/mL的中性(pH 7.0)胰蛋白酶溶液中的可溶量，因而所述反應(yīng)關(guān)于三甲基硅烷醇似乎是一級(jí)的。正如所推測(cè)的，縮合速率顯示出與三甲基硅烷醇和胰蛋白酶的濃度都成比例。
此外，將利-伯二氏方程(Lineweaver-Burk equation)用于研究胰蛋白酶催化的三甲基硅烷醇縮合的能力以擬合Michaelis-Menten動(dòng)力學(xué)模型。于在25℃和15℃下的時(shí)間研究過(guò)程中獲得的色譜法數(shù)據(jù)集產(chǎn)生了線性的利-伯二氏曲線。基于試驗(yàn)的利-伯二氏曲線的線性方程，計(jì)算出相對(duì)的米氏(Michaelis constant)常數(shù)(Km)和最大速率(Vmax)值(表4)。
表4相對(duì)的Michaelis-Menten動(dòng)力學(xué)值。
盡管Michaelis-Menten動(dòng)力學(xué)值是相對(duì)的，但大的Km值說(shuō)明酶-底物中間體的結(jié)合強(qiáng)度弱。相較而言，這些Km值比其他酶的Km值大幾個(gè)數(shù)量級(jí)(即～1,000-25,000,000)。例如，在25℃下胰蛋白酶催化的三甲基硅烷醇縮合的相對(duì)Km值比胰凝乳蛋白酶催化的乙?；?L-色氨酰胺水解約大1200倍。
因?yàn)橄鄬?duì)Km值大并且Vmax值低，所以在縮合反應(yīng)中胰蛋白酶-硅烷醇中間體的形成顯示為限速步驟。這與這樣的事實(shí)是一致的，即在含水介質(zhì)中三甲基硅烷醇未使胰蛋白酶飽和。因此，胰蛋白酶-硅烷醇中間體的縮合或水解的速率必定比酶中間體的形成要快。
基于硅烷醇縮合反應(yīng)的化學(xué)計(jì)量和縮合速率，推測(cè)胰蛋白酶催化的三甲基硅烷醇的縮合具有與酰胺和酯鍵的蛋白水解類(lèi)似的反應(yīng)機(jī)制(圖13)。由于被催化性三聯(lián)體的電荷中繼系統(tǒng)活化和穩(wěn)定，認(rèn)為絲氨酸的親核氧原子攻擊三甲基硅烷醇的電正性硅原子。等價(jià)于酰基-酶復(fù)合物，將會(huì)形成甲硅烷基化的胰蛋白酶中間體，隨后失去水。另外，組氨酸的氮原子能與中間體中的硅原子形成穩(wěn)定的五價(jià)配位物?；谒俾史匠桃约按蟮南鄬?duì)Km值和低的Vmax值，胰蛋白酶-硅烷醇中間體的形成顯示為限速步驟。這與這樣的事實(shí)是一致的，即有機(jī)硅分子比類(lèi)似的烴類(lèi)胰蛋白酶底物大。隨后，甲硅烷基化的胰蛋白酶中間體可以參與與三甲基硅烷醇或水的縮合或水解反應(yīng)，導(dǎo)致分別形成六甲基二硅氧烷(產(chǎn)物)或三甲基硅烷醇(反應(yīng)物)。因?yàn)樵诤橘|(zhì)中三甲基硅烷醇未使胰蛋白酶飽和，所以胰蛋白酶-硅烷醇中間體的縮合或水解的速率必定比酶中間體的形成快。無(wú)論如何，將會(huì)在任一反應(yīng)完成時(shí)回收胰蛋白酶。
實(shí)施例8胰蛋白酶pH研究實(shí)際上，胰蛋白酶催化的水解的最適pH值為約8。然而，這是種類(lèi)依賴(lài)性的。如用天然底物(BAEE)所測(cè)量的，作為pH值的函數(shù)研究了不同來(lái)源的胰蛋白酶的活性(圖14)。
基于分光光度法的數(shù)據(jù)，哺乳動(dòng)物的胰蛋白酶活性(包括重組酶)作為pH值的函數(shù)的特性曲線是相似的。在pH 7.0時(shí)觀測(cè)到哺乳動(dòng)物來(lái)源的牛的胰蛋白酶具有最高的活性。相較而言，大西洋鱈的胰蛋白酶的最適pH值顯示為更酸性。由于需要鈣以獲得胰蛋白酶的最大活性和穩(wěn)定性，因而相對(duì)活性的差別可能是由于鈣的不同水平?；陔姼信己系入x子-原子發(fā)射光譜分析，商業(yè)來(lái)源的胰蛋白酶中存在的鈣的量顯示出明顯不同。
胰蛋白酶的鈣活化引起酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)改變。具體來(lái)說(shuō)，鈣由于增加了螺旋含量或改變了β-結(jié)構(gòu)而產(chǎn)生一個(gè)緊湊的結(jié)構(gòu)。已經(jīng)推測(cè)該構(gòu)象變化是經(jīng)證明的增強(qiáng)的酶活性和熱穩(wěn)定性的原因。由于胰蛋白酶活性在存在＞10mM(理想地，20mM或400ppm)的鈣時(shí)是最佳的，因而與牛胰胰蛋白酶相比較，豬胰胰蛋白酶和重組的牛的胰蛋白酶中鈣水平減少與它們的活性相關(guān)聯(lián)。
隨后，將牛胰胰蛋白酶催化三甲基硅烷醇縮合反應(yīng)的能力作為pH值的函數(shù)進(jìn)行研究。在緩沖于pH 4.0-pH 10.0的含水介質(zhì)中，以4∶1的單體與酶的重量比(～1000∶1的硅烷醇與胰蛋白酶的摩爾比)配制反應(yīng)體系，并在25℃下反應(yīng)3小時(shí)。分離反應(yīng)產(chǎn)物并通過(guò)GC進(jìn)行定量分析(圖15)?；谏V法的結(jié)果，酶催化的縮合反應(yīng)依賴(lài)于pH值。硅烷醇的縮合反應(yīng)在pH 7.0時(shí)最適宜。相較而言，在陰性對(duì)照反應(yīng)中觀測(cè)到酸和堿催化的硅烷醇縮合；主要地，在pH值小于4和大于10時(shí)觀測(cè)到(圖15)。
由于給出用BAEE測(cè)量的天然水解活性特性曲線(圖14)，其在pH 7以上時(shí)顯示出活性，則進(jìn)一步研究了在pH值＞7.0時(shí)的產(chǎn)率減少。正如通過(guò)BAEE的水解速率所測(cè)量的，在緩沖于pH 7.0-pH 9.0的含水介質(zhì)中，在用三甲基硅烷醇進(jìn)行的縮合反應(yīng)的開(kāi)始(t＝5分鐘)和結(jié)束(t＝3小時(shí))時(shí)分析了牛胰胰蛋白酶的活性。該分光光度法測(cè)量的活性數(shù)據(jù)在圖16中說(shuō)明。
與天然的pH值活性特性曲線(牛的胰蛋白酶，圖16)比較，在堿性的緩沖的水(pH 7.5-pH 9.0)中，三甲基硅烷醇幾乎立即部分地抑制(＞50％)胰蛋白酶。盡管在中性介質(zhì)(pH 7.0)中三甲基硅烷醇不抑制胰蛋白酶，但含水溶液的堿性使反應(yīng)物的抑制作用增強(qiáng)了50-65％。由于胰蛋白酶在存在三甲基硅烷醇的情況下不變性，推測(cè)在堿性介質(zhì)中水解(BAEE，圖16)和縮合(三甲基硅烷醇，圖15)反應(yīng)的抑制是由于催化性區(qū)域的其他羥基-官能性殘基的甲硅烷基化。這將直接或間接地減少與活性位點(diǎn)的接近以及胰蛋白酶的活性。當(dāng)pH減少時(shí)，這些種類(lèi)將易于水解(酸催化作用)，該水解會(huì)使得活性位點(diǎn)能夠參與胰蛋白酶的催化功能。相反，在高的pH值時(shí)，甲硅烷基化的酶的更長(zhǎng)的壽命將抑制BAEE的水解和三甲基硅烷醇的縮合。這些結(jié)果進(jìn)一步證明，胰蛋白酶的活性位點(diǎn)在三甲基硅烷醇的體外縮合中的催化劑作用。
實(shí)施例9胰蛋白酶催化的三甲基乙氧基硅烷的水解和縮合研究了在模型烷氧基硅烷即三甲基乙氧基硅烷的體外水解和縮合過(guò)程中胰蛋白酶在形成具有單個(gè)硅氧烷鍵的分子中的作用。
反應(yīng)前，由于可能存在殘留的氯-官能性硅烷，用碳酸氫鈉預(yù)處理烷氧基硅烷。在中性介質(zhì)(pH 7.0)中以4∶1的三甲基乙氧基硅烷與蛋白質(zhì)的重量比(～1000∶1的烷氧基硅烷與胰蛋白酶的摩爾比)配制反應(yīng)體系，并在25℃下反應(yīng)3小時(shí)?；谌谆已趸柰樵谒械墓烙?jì)的溶解度(1mg/mL)，三甲基乙氧基硅烷(～160mg/mL)的濃度飽和了含水介質(zhì)并產(chǎn)生兩相的反應(yīng)混合物。分離反應(yīng)產(chǎn)物并通過(guò)GC進(jìn)行定量分析(圖17)。
雖然觀察到各種不同的水解速率，但與原材料比較，在陰性對(duì)照、非特異性蛋白(即BSA、γ-球蛋白)、小分子(即CaCl2、咪唑、N-甲基咪唑)和多肽(即聚L-賴(lài)氨酸)反應(yīng)中未觀察到實(shí)質(zhì)性的三甲基乙氧基硅烷縮合。盡管未觀察到BSA和聚L-賴(lài)氨酸催化四乙氧基硅烷或三甲基乙氧基硅烷的縮合(圖17)，但在中性介質(zhì)(pH 7.0)中BSA和聚L-賴(lài)氨酸以不同速率促進(jìn)了三甲基乙氧基硅烷的水解以及三甲基硅烷醇的形成。
在存在胰蛋白酶時(shí)，3小時(shí)內(nèi)在25℃下于中性介質(zhì)(pH 7.0)中，三甲基乙氧基硅烷在六甲基二硅氧烷的形成過(guò)程中得以水解(100％)和縮合(84％)(圖17)。由于在溫度＜25℃時(shí)縮合的相對(duì)速率減小(圖8)，因而在10℃下以規(guī)定的3小時(shí)的時(shí)間進(jìn)行三甲基乙氧基硅烷反應(yīng)的時(shí)間研究。分離反應(yīng)產(chǎn)物并通過(guò)GC進(jìn)行定量分析(圖18)。
基于水解和縮合反應(yīng)的化學(xué)計(jì)量，形成2摩爾的三甲基硅烷醇時(shí)消耗2摩爾的三甲基乙氧基硅烷，這產(chǎn)生了1摩爾的六甲基二硅氧烷(物料衡算，圖18)。分析在時(shí)間研究過(guò)程中獲得的色譜法數(shù)據(jù)集以便研究在10℃下胰蛋白酶催化的水解和縮合反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)。比較而言，三甲基乙氧基硅烷在最初的30分鐘內(nèi)容易水解，隨后在形成六甲基二硅氧烷過(guò)程中縮合。
計(jì)算了水解和縮合反應(yīng)中關(guān)于反應(yīng)物的分反應(yīng)級(jí)數(shù)以及轉(zhuǎn)化數(shù)(kcat)。因?yàn)橐鹊鞍酌赣捎谌谆已趸柰樵谒械挠邢奕芙舛榷赡苁遣伙柡偷?，所以將轉(zhuǎn)化數(shù)處理為相對(duì)值。由于相對(duì)轉(zhuǎn)化數(shù)等于0.53s-1，因而在10℃時(shí)胰蛋白酶催化的每次水解反應(yīng)之間的時(shí)間經(jīng)計(jì)算為約2s或者每分鐘30次反應(yīng)。盡管這與溶菌酶的最大轉(zhuǎn)化數(shù)相當(dāng)，但在10℃時(shí)胰蛋白酶催化的三甲基乙氧基硅烷水解的轉(zhuǎn)化數(shù)比胰凝乳蛋白酶催化的水解反應(yīng)慢大約200倍。由于相對(duì)轉(zhuǎn)化數(shù)等于0.048s-1，因而在10℃時(shí)胰蛋白酶催化的縮合反應(yīng)之間的時(shí)間間隔經(jīng)計(jì)算為約20s或每分鐘3次反應(yīng)。
基于相對(duì)轉(zhuǎn)化數(shù)，在10℃下胰蛋白酶催化的三甲基乙氧基硅烷水解的速率(0.53s-1)比三甲基硅烷醇的縮合(0.048s-1)快一個(gè)數(shù)量級(jí)(10倍)(圖19)。相較而言，在25℃下胰蛋白酶催化的三甲基硅烷醇的縮合速率(kcat＝0.066s-1)比在10℃下進(jìn)行的反應(yīng)快約38％。
實(shí)施例10烷氧基硅烷研究因?yàn)橐鹊鞍酌复呋柩跬殒I的形成，因而選擇備選的單官能的烷氧基硅烷作為底物以研究在溫和條件下胰蛋白酶選擇性地催化有機(jī)-官能性(organo-functional)烷氧基硅烷的體外水解和縮合的能力。最初，選擇兩種另外的具有相當(dāng)極性(即四乙二醇單甲基醚)和非極性(即己醇)離去基團(tuán)的三甲基烷氧基硅烷，用于在中性介質(zhì)(pH 7.0)中研究作為反應(yīng)物的溶解度的函數(shù)的胰蛋白酶活性。
以4∶1的單體與酶的重量比(＞400∶1的烷氧基硅烷與胰蛋白酶的摩爾比)配制兩相反應(yīng)體系，并在25℃下反應(yīng)3小時(shí)。分離反應(yīng)產(chǎn)物并通過(guò)GC進(jìn)行定量分析(圖20)。相較而言，在水中乙二醇-官能性硅烷顯示出比三甲基己氧基硅烷更易混溶?；谏V法的結(jié)果，胰蛋白酶催化三甲基己氧基硅烷部分水解而不縮合。盡管胰蛋白酶在乙二醇-官能性硅烷的水解中的作用是不確定的，但胰蛋白酶催化了產(chǎn)物即三甲基硅烷醇的縮合。在3個(gè)小時(shí)的反應(yīng)過(guò)程中不同的水解和縮合反應(yīng)的相對(duì)速率是未知的。
隨后，選取四種有機(jī)-官能性烷氧基硅烷，用于研究胰蛋白酶的活性怎樣由于不同的與底物的空間和電子相互作用而變化。該四種有機(jī)-官能性烷氧基硅烷是苯基二甲基乙氧基硅烷(PhMe2SiOEt)、三苯基乙氧基硅烷(Ph3SiOEt)、3-環(huán)氧丙氧基丙基二甲基乙氧基硅烷((環(huán)氧)Me2SiOEt)和氨丙基二甲基乙氧基硅烷((H2N(CH2)3)Me2SiOEt)。
以4∶1的單體與酶的重量比(＞300∶1的烷氧基硅烷與胰蛋白酶的摩爾比)配制兩相反應(yīng)體系，并在25℃下反應(yīng)3小時(shí)。分離反應(yīng)產(chǎn)物并通過(guò)GC進(jìn)行定量分析(圖21)。基于色譜法的結(jié)果，觀察到胰蛋白酶優(yōu)先催化三甲基乙氧基硅烷和3-環(huán)氧丙氧基丙基二甲基乙氧基硅烷的水解和縮合。相較而言，在存在胰蛋白酶時(shí)，苯基二甲基乙氧基硅烷水解但不縮合，而三苯基乙氧基硅烷既不水解也不縮合。由于胰蛋白酶催化區(qū)域內(nèi)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的證明了的特質(zhì)，酶活性降低看來(lái)是由于苯基-官能性底物的疏水性和空間體積的增加。盡管胰蛋白酶對(duì)堿性殘基的親和力，但當(dāng)存在和不存在胰蛋白酶時(shí)氨丙基二甲基乙氧基硅烷都完全水解和縮合。堿性氨基-官能性烷氧基硅烷催化二硅氧烷產(chǎn)物的形成，其通過(guò)具有伯胺的額外配位(extra-coordinate)中間體而穩(wěn)定。
備選地，選取兩種具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)的硅-官能性分子以進(jìn)一步研究胰蛋白酶催化Si-O鍵的裂解和形成的能力。以4∶1的單體與酶的重量比配制兩相反應(yīng)體系，并在25℃下反應(yīng)3小時(shí)(方案2-3)。分離反應(yīng)產(chǎn)物并通過(guò)GC進(jìn)行定量分析(圖22)。
方案2胰蛋白酶催化的1，1-二甲基-1-硅雜-2-氧雜環(huán)己烷的水解和縮合。
R＝甲醇(carbinol)(即(CH2)4OH)。
方案3胰蛋白酶催化的七甲基羥基四環(huán)硅氧烷的縮合。
基于色譜法的結(jié)果，在形成甲醇-官能性二硅氧烷的過(guò)程中，胰蛋白酶催化1，1-二甲基-1-硅雜-2-氧雜環(huán)己烷的開(kāi)環(huán)水解以及羥丁基二甲基硅烷醇的縮合(方案2)。胰蛋白酶不催化的七甲基羥基四環(huán)硅氧烷的縮合。不管它們的環(huán)結(jié)構(gòu)，這些有機(jī)硅分子以及得到的中間體和產(chǎn)物是不同的。相較而言，環(huán)硅氧烷在空間上比環(huán)烷氧基硅烷大。類(lèi)似于堿性殘基(方案4)，甲醇-官能性硅烷醇中間體據(jù)推測(cè)是一種可接受的底物，因?yàn)槠渚哂信c在胰蛋白酶催化性區(qū)域內(nèi)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的天冬氨酸殘基形成氫鍵的能力。
胰蛋白酶結(jié)合結(jié)構(gòu)域方案4已確定的(賴(lài)氨酸和精氨酸)和提出的(硅烷醇)在胰蛋白酶的結(jié)合結(jié)構(gòu)域內(nèi)的氫鍵鍵合。
與對(duì)照反應(yīng)比較，據(jù)報(bào)道在pH 6.8的含水介質(zhì)中胰蛋白酶不催化硅酸前體即四乙氧基硅烷的縮聚。在該研究中，在以4∶1的單體與酶的重量比配制并于25℃下進(jìn)行3小時(shí)的重復(fù)反應(yīng)中未觀察到反應(yīng)產(chǎn)物。具體而言，在3個(gè)小時(shí)的反應(yīng)過(guò)程中胰蛋白酶不水解或縮合四乙氧基硅烷。相較而言，7天的反應(yīng)后，在形成含有二氧化硅和胰蛋白酶的固體復(fù)合物的過(guò)程中觀察到胰蛋白酶催化四乙氧基硅烷的縮聚。在該研究中胰蛋白酶的活性位點(diǎn)在四乙氧基硅烷的縮聚中的作用是不確定的?？偠灾?，觀察到了胰蛋白酶在溫和條件下選擇性地催化有機(jī)-官能性烷氧基硅烷的水解和縮合。
實(shí)施例11蛋白質(zhì)抑制研究進(jìn)行了蛋白質(zhì)抑制研究以研究酶活性位點(diǎn)在三甲基乙氧基硅烷的水解和縮合中的作用。反應(yīng)前，在攪拌的中性介質(zhì)(pH 7.0)中用過(guò)量的Bowman-Birk抑制劑(4∶1的BBI與胰蛋白酶的摩爾比)和Popcorn抑制劑(2∶1的PCI與胰蛋白酶的摩爾比)獨(dú)立地抑制胰蛋白酶2小時(shí)?；跇?biāo)準(zhǔn)的酶活性測(cè)定法，BBI(98％)和PCI(91％)完全抑制了胰蛋白酶。以4∶1的單體與酶的重量比(～1000∶1的三甲基乙氧基硅烷與胰蛋白酶的摩爾比)配制反應(yīng)體系，并在25℃下反應(yīng)3小時(shí)。分離反應(yīng)產(chǎn)物并通過(guò)GC進(jìn)行定量分析(圖23)。
雖然觀察到經(jīng)處理的酶催化三甲基乙氧基硅烷的水解，但與對(duì)照反應(yīng)相比較，三甲基硅烷醇的縮合完全受到抑制。特別是，在存在BBI-(24％)和PCI-(6％)抑制的胰蛋白酶時(shí)水解百分比減少。熱變性后，胰蛋白酶活性相當(dāng)于蛋白質(zhì)抑制和先前的變性試驗(yàn)。從而，看起來(lái)與胰蛋白酶(包括活性位點(diǎn))的非特異性相互作用促進(jìn)了三甲基乙氧基硅烷的水解。然而，測(cè)定出胰蛋白酶的活性位點(diǎn)在溫和條件下選擇性地催化三甲基硅烷醇的體外縮合。
實(shí)施例12用不同來(lái)源的胰蛋白酶的三甲基乙氧基硅烷的水解和縮合盡管多種來(lái)源(例如，哺乳動(dòng)物、魚(yú))的胰蛋白酶是相似的(例如，三級(jí)結(jié)構(gòu))，但它們的選擇性和活性可能不同。因此，在25℃下于中性介質(zhì)(pH 7.0)中評(píng)估了豬胰腺、大西洋鱈和重組的牛的胰蛋白酶催化三甲基乙氧基硅烷的水解和三甲基硅烷醇的縮合的能力。盡管該pH對(duì)于這些不同來(lái)源的胰蛋白酶可能不是最佳的，但使用了中性pH來(lái)使酸和堿催化的水解和縮合最小化。分離反應(yīng)產(chǎn)物并通過(guò)GC進(jìn)行定量分析(圖24)。
基于色譜法的結(jié)果，觀測(cè)到來(lái)自豬胰腺(即哺乳動(dòng)物)的胰蛋白酶與大西洋鱈(即魚(yú))的胰蛋白酶相反，催化了水解和縮合反應(yīng)。與用天然底物測(cè)量的pH特性曲線(圖14)類(lèi)似，在中性介質(zhì)(pH 7.0)中來(lái)自牛胰腺的胰蛋白酶的活性大于其他來(lái)源的胰蛋白酶(包括重組酶)的活性。來(lái)自大西洋鱈的胰蛋白酶的失活看起來(lái)是由于pH(圖14)。由于需要鈣來(lái)獲得胰蛋白酶的最大活性和穩(wěn)定性，因而這些觀測(cè)結(jié)果可能是由于不同的最適pH范圍和/或鈣水平。
胰蛋白酶的鈣活化引起酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)的變化。由于在存在＞10mM的鈣時(shí)胰蛋白酶的活性是最佳的，因而在含有20mM CaCl2的中性介質(zhì)(pH 7.0)中研究了胰蛋白酶催化三甲基硅烷醇縮合的能力。以4∶1的單體與酶的重量比(～1000∶1的硅烷醇對(duì)胰蛋白酶的摩爾比)配制反應(yīng)體系，并在25℃下反應(yīng)三小時(shí)。分離反應(yīng)產(chǎn)物并通過(guò)GC進(jìn)行定量分析(圖25)。
較于初始來(lái)源的胰蛋白酶，通過(guò)重組牛和豬胰腺的胰蛋白酶催化的反應(yīng)的產(chǎn)率測(cè)量的活性分別增加了65％和125％。相較而言，牛胰腺和大西洋鱈的胰蛋白酶催化的反應(yīng)的產(chǎn)率沒(méi)有變化。在不存在氯化鈣時(shí)(圖24)，在三甲基硅烷醇形成過(guò)程中豬胰腺的胰蛋白酶和重組的牛的胰蛋白酶催化了三甲基乙氧基硅烷的完全水解。在存在氯化鈣時(shí)，豬胰腺的胰蛋白酶和重組的牛的胰蛋白酶的活性增加提供了間接的證據(jù)表明，催化性區(qū)域的三級(jí)結(jié)構(gòu)直接參與了三甲基硅烷醇的體外縮合?；谒夂涂s合反應(yīng)的產(chǎn)率，商業(yè)來(lái)源的牛胰胰蛋白酶(即886ppmCa)顯示出在中性介質(zhì)(pH 7.0)中是最佳的。相較而言，當(dāng)在商業(yè)來(lái)源的大西洋鱈胰蛋白酶中存在2.1％的鈣時(shí)，20mM的氯化鈣的可能的影響是可忽略不計(jì)的。胰蛋白酶來(lái)源的底物選擇性和活性顯示出是不同的，盡管它們有相似的三級(jí)結(jié)構(gòu)。
實(shí)施例13基于硅的單體的酶催化的縮聚和開(kāi)環(huán)聚合研究了在溫和條件下，胰蛋白酶在基于硅的單體的體外縮聚和開(kāi)環(huán)聚合過(guò)程中催化硅氧烷鍵形成的能力。
胰蛋白酶催化的甲基三乙氧基硅烷的縮聚既知了胰蛋白酶在模型硅氧烷縮合反應(yīng)中的催化作用，則將胰蛋白酶在三官能的烷氧基硅烷即甲基三乙氧基硅烷于溫和條件下的縮聚中用作催化劑。以4∶1的甲基三乙氧基硅烷(0.091g，511μmol，3.25mmol Si)對(duì)胰蛋白酶(0.022g，0.9μmol)的重量比(～500的單體對(duì)酶的摩爾比)在中性介質(zhì)(pH 7.0)中配制反應(yīng)體系，并在25℃下反應(yīng)七天(方案5)。
方案5胰蛋白酶催化的甲基三乙氧基硅烷的縮聚。
分離固體和液體反應(yīng)產(chǎn)物，并通過(guò)紅外光譜法、顯微術(shù)和質(zhì)譜法技術(shù)選擇性地進(jìn)行表征。
基于胰蛋白酶和固體反應(yīng)產(chǎn)物的漫反射紅外傅立葉變換光譜，確定分離的固體為含有甲基硅倍半氧烷樹(shù)脂和胰蛋白酶的混合物的復(fù)合物質(zhì)。相較而言，在存在用胰蛋白酶獲得的對(duì)照光譜時(shí)，觀測(cè)到甲基硅倍半氧烷樹(shù)脂的光譜峰。具體而言，在存在與胰蛋白酶相關(guān)的光譜峰時(shí)，觀測(cè)到對(duì)稱(chēng)的甲基變形(deformation)(MeSiO3/2，靠近1270cm-1)、硅氧烷不對(duì)稱(chēng)拉伸(stretch)(SiOSi，靠近1000-1130cm-1)以及不對(duì)稱(chēng)甲基搖擺(rock)和硅-碳拉伸(MeSiO3/2，778cm-1)。觀測(cè)到該固體含有大小在約200μm-1.5mm范圍內(nèi)的稠的附聚物。附聚物顆粒的粗糙表面由亞微細(xì)粒的圓顆粒組成。基于能量色散光譜學(xué)(SEM-EDS)分析，顆粒表面據(jù)測(cè)定含有硅、氧、碳和硫。這些元素與甲基硅倍半氧烷和胰蛋白酶的官能度一致。由于在萃取過(guò)程中使用鹽(NaCl)，因而該表面也含有鈉和氯?；诳s聚反應(yīng)的硅(Si)的化學(xué)計(jì)量，胰蛋白酶催化的縮聚反應(yīng)產(chǎn)生12％的固體(0.011g，0.39mmolSi)。相較而言，在陰性對(duì)照反應(yīng)中沒(méi)有觀測(cè)到固體沉淀。
分離液體反應(yīng)產(chǎn)物并通過(guò)電噴霧電離質(zhì)譜法(ESI MS)進(jìn)行表征。盡管在光譜結(jié)果中沒(méi)有觀測(cè)到甲基三乙氧基硅烷，但在不存在胰蛋白酶時(shí)沒(méi)有觀測(cè)到相當(dāng)?shù)募谆已趸柰榈乃夂涂s合。主要地，在ESI MS譜中觀測(cè)到了乙氧基-官能性低分子量寡聚物(例如，二聚體、三聚體、四聚體)和環(huán)狀硅氧烷。較之陰性對(duì)照反應(yīng)，胰蛋白酶促進(jìn)甲基三乙氧基硅烷的完全水解以及隨后的縮聚。線性的、環(huán)狀的和分支的硅氧烷分子完全被羥基化了。盡管胰蛋白酶促進(jìn)烷氧基-官能性硅樹(shù)脂的水解，但在該研究中沒(méi)有確定胰蛋白酶的活性位點(diǎn)在這些分子中的縮聚反應(yīng)中的作用。
盡管ESI MS結(jié)果是定性的，但固相和液相中的反應(yīng)產(chǎn)物完全清楚地說(shuō)明了該縮聚反應(yīng)。存在胰蛋白酶時(shí)附聚的硅倍半氧烷沉淀之前，在甲基三乙氧基硅烷的縮聚期間線性的、環(huán)狀的和分支的寡聚物的形成類(lèi)似于二氧化硅的聚合行為。
胰蛋白酶催化的環(huán)狀硅氧烷的開(kāi)環(huán)聚合探究了在溫和條件下胰蛋白酶在環(huán)狀硅氧烷的開(kāi)環(huán)聚合期間催化Si-O鍵的裂解和形成的能力。具體而言，選取了五種環(huán)狀硅氧烷用于研究胰蛋白酶的活性由于與底物的不同空間和電子相互作用而如何變化，這五種環(huán)狀硅氧烷是六甲基環(huán)三硅氧烷、八甲基環(huán)四硅氧烷、三甲基三(三氟丙基)環(huán)三硅氧烷、四甲基四(三氟丙基)環(huán)四硅氧烷和四甲基四苯基環(huán)四硅氧烷。
以4∶1的單體對(duì)酶的重量比配制兩相的反應(yīng)體系，并在中性介質(zhì)(pH 7.0)中于25℃反應(yīng)8天。分離反應(yīng)產(chǎn)物并通過(guò)GC進(jìn)行定性分析(表5)。
表525℃下胰蛋白酶催化的環(huán)狀硅氧烷的開(kāi)環(huán)聚合
1GC環(huán)狀面積百分比的值是定性的。
基于色譜法的數(shù)據(jù)，沒(méi)有觀測(cè)到胰蛋白酶催化環(huán)狀硅氧烷鍵的水解。如先前報(bào)道的，在25℃下在中性介質(zhì)(pH 7.0)中胰蛋白酶不能水解六甲基二硅氧烷。由于蛋白酶僅與水溶性底物相互作用，因而水解反應(yīng)會(huì)由于環(huán)狀硅氧烷在水相中的不可混溶性而受到嚴(yán)重的阻礙。盡管胰蛋白酶理論上由于微觀可逆性定律而催化硅氧烷鍵的水解，但逆反應(yīng)是不利的。
實(shí)施例14角質(zhì)酶催化的三甲基硅烷醇的縮合進(jìn)行了一種模型研究，其中選取了單官能的硅烷來(lái)集中于在三甲基硅烷醇的體外縮合過(guò)程中的具有單個(gè)硅氧烷鍵的分子的形成(方案6)。該生物催化的反應(yīng)體系以5∶1的三甲基硅烷醇對(duì)蛋白質(zhì)的重量比(即～1,300∶1的三甲基硅烷醇對(duì)角質(zhì)酶的摩爾比，0.3μmol角質(zhì)酶)并以～10∶1的溶劑對(duì)單體的重量比在50mM Tris-HCl緩沖的Milli-Q水(pH 7.0)中配制。封閉的(用螺旋蓋蓋上的)兩相反應(yīng)在惰性玻璃小瓶中于25℃下伴隨磁力攪拌進(jìn)行14小時(shí)。特別是，該反應(yīng)在甲硅烷基化的玻璃器皿中進(jìn)行。因?yàn)楣柰榇?官能性的玻璃表面可以與三甲基硅烷醇反應(yīng)，所以需要經(jīng)甲硅烷基化的玻璃器皿來(lái)產(chǎn)生惰性的玻璃表面。分析前，用THF在存在NaCl時(shí)萃取含水反應(yīng)體系，并通過(guò)Whatman Autovial5 0.45μm Teflon過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾。反應(yīng)產(chǎn)物通過(guò)氣相色譜-火焰電離檢測(cè)(GC-FID)進(jìn)行定量分析(圖26)。
在該研究中，對(duì)照反應(yīng)定義為非酶促反應(yīng)。在不存在蛋白時(shí)進(jìn)行的試驗(yàn)定義為陰性對(duì)照反應(yīng)。蛋白質(zhì)分子例如牛血清白蛋白(BSA)和豬γ-球蛋白(球蛋白)用于研究非特異性蛋白質(zhì)催化。較于原材料(三甲基硅烷醇，Me3SiOH)，在陰性對(duì)照和非特異性蛋白質(zhì)反應(yīng)中沒(méi)有觀測(cè)到實(shí)質(zhì)性的三甲基硅烷醇的縮合。總而言之，角質(zhì)酶在溫和條件下在六甲基二硅氧烷(HMDS)的形成過(guò)程中催化了三甲基硅烷醇的縮合。雖然該縮合反應(yīng)在水中進(jìn)行，但通過(guò)產(chǎn)物的相分離可促進(jìn)該酶催化的反應(yīng)。在存在水時(shí)，產(chǎn)物即六甲基二硅氧烷的不可混溶性改變了平衡并促進(jìn)縮合反應(yīng)。由于三甲基硅烷醇飽和了含水介質(zhì)，因而反應(yīng)物將會(huì)由于縮合反應(yīng)的動(dòng)態(tài)平衡而繼續(xù)進(jìn)入水相中。
方案6生物催化的三甲基硅烷醇的縮合。
實(shí)施例15角質(zhì)酶催化的二甲基二甲氧基硅烷的水解和縮合選取二甲基二甲氧基硅烷(DMDM)作為模型底物來(lái)探究角質(zhì)酶在溫和條件下催化多官能的烷氧基硅烷的體外水解和縮合的能力(方案7)。由于反應(yīng)混合物中增加的硅烷醇的濃度，溫和反應(yīng)條件(即低溫，中性pH)使化學(xué)催化的縮合最小化。該生物催化的反應(yīng)最初在50mMTris-HCl緩沖的Milli-Q水(pH 7.0)中以～60％的容積效率用～10∶1的烷氧基硅烷對(duì)角質(zhì)酶的重量比(即～1,800∶1的DMDM對(duì)角質(zhì)酶的摩爾比，～5μmol角質(zhì)酶)進(jìn)行配制。容積效率定義為測(cè)量為反應(yīng)體系中液體總重量(即DMDM+水)的百分比的單體的重量％。封閉的(用螺旋蓋蓋上的)兩相反應(yīng)在惰性玻璃小瓶中于25℃下伴隨磁力攪拌進(jìn)行24小時(shí)。特別是，反應(yīng)在甲硅烷基化的玻璃器皿中進(jìn)行。因?yàn)樵谠撗芯恐泄柰榇?官能性的玻璃表面可以與烷氧基硅烷反應(yīng)，所以需要經(jīng)甲硅烷基化的玻璃器皿來(lái)產(chǎn)生惰性的玻璃表面。分析前，用THF在存在NaCl時(shí)萃取含水反應(yīng)體系，并通過(guò)Whatman Autovial5 0.45μmTeflon過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾。反應(yīng)產(chǎn)物通過(guò)GC-FID進(jìn)行定性分析(即面積百分比，表6)。
概而言之(表6)，在24-小時(shí)期間～5μmol角質(zhì)酶催化的縮聚程度不顯著大于在不存在角質(zhì)酶時(shí)進(jìn)行的陰性對(duì)照反應(yīng)。因此，角質(zhì)酶催化的縮聚反應(yīng)用增加量的酶(即～500∶1的DMDM對(duì)角質(zhì)酶的摩爾比，～20μmol角質(zhì)酶)以更長(zhǎng)時(shí)期的時(shí)間(5天)重復(fù)進(jìn)行?；诮?jīng)過(guò)延長(zhǎng)的時(shí)間(5天對(duì)24小時(shí))以兩種酶濃度(20μmol對(duì)5μmol)獲得的縮聚程度，觀測(cè)到角質(zhì)酶催化DMDM的水解和縮合(表7)。雖然該縮合反應(yīng)在水中進(jìn)行，但通過(guò)產(chǎn)物的相分離可促進(jìn)該酶催化的反應(yīng)?；贒MDM在水中的估計(jì)溶解度(～32mg/mL)，DMDM的濃度(～1500mg/mL)飽和了含水介質(zhì)并產(chǎn)生兩相反應(yīng)混合物。由于線性硅氧烷分子的鏈長(zhǎng)度增加或環(huán)狀硅氧烷形成，這些分子相分開(kāi)進(jìn)入有機(jī)相。
方案7角質(zhì)酶催化的二甲基二甲氧基硅烷的水解和縮合。
表6在25℃下24小時(shí)后角質(zhì)酶催化的二甲基二甲氧基硅烷的水解和縮合
1標(biāo)準(zhǔn)化的面積百分比的值從定性色譜法數(shù)據(jù)(GC)中計(jì)算得到。
2Lx＝二甲基線性硅氧烷x＝ZO-(Me2SiO)x-Z，其中x＝1-6，和Z＝H和/或Me，Me＝CH3。
Dy＝二甲基環(huán)狀硅氧烷y＝[Me2SiO]y，其中y＝3-4，Me＝CH3。
表7在25℃下5天后角質(zhì)酶催化的二甲基二甲氧基硅烷的水解和縮合
1標(biāo)準(zhǔn)化的面積百分比的值從定性色譜法數(shù)據(jù)(GC)中計(jì)算得到。
2Lx＝二甲基線性硅氧烷x＝ZO-(Me2SiO)x-Z，其中x＝1-7，和Z＝H和/或Me，Me＝CH3。
Dy＝二甲基環(huán)狀硅氧烷y＝[Me2SiO]y，其中y＝3-4，Me＝CH3。
實(shí)施例16胰蛋白酶催化的二乙基二乙氧基鍺烷的水解和縮合選取二乙基二乙氧基鍺烷作為備選底物以探究牛胰胰蛋白酶在溫和條件下催化烷氧基-官能性鍺分子的體外水解和縮合的能力(方案8)。由于反應(yīng)混合物中的增加的羥基濃度，溫和反應(yīng)條件(即低溫，中性pH)使化學(xué)催化的縮合最小化。在50mM Tris-HCl緩沖的Milli-Q水中以～5∶1的溶劑對(duì)單體的重量比并用～5∶1的單體對(duì)酶的重量比(～500∶1的二乙基二乙氧基鍺烷與胰蛋白酶的摩爾比，～1μmol胰蛋白酶)配制反應(yīng)體系。封閉的(用螺旋蓋蓋上的)兩相反應(yīng)在惰性玻璃小瓶中于25℃下伴隨磁力攪拌進(jìn)行24小時(shí)。特別是，反應(yīng)在經(jīng)甲硅烷基化的玻璃器皿中進(jìn)行。由于硅烷醇-官能性的玻璃表面可以與單體反應(yīng)，因而需要經(jīng)硅烷基化的玻璃器皿來(lái)產(chǎn)生惰性玻璃表面。分析之前，將含水的反應(yīng)體系在存在NaCl時(shí)用THF萃取，并通過(guò)WhatmanAutovial5 0.45μm的Teflon過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾。反應(yīng)產(chǎn)物通過(guò)氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)和電噴霧電離質(zhì)譜(ESI MS)進(jìn)行分析。較于在不存在酶時(shí)進(jìn)行的陰性對(duì)照反應(yīng)，觀測(cè)到胰蛋白酶在優(yōu)先形成六乙基環(huán)三鍺氧烷([Et2GeO]3，其中Et＝CH2CH3)的過(guò)程中催化二乙基二乙氧基鍺烷的水解和縮合。
方案8胰蛋白酶催化的二乙基二乙氧基鍺烷的水解和縮合。
序列表序列表<110>Brandstadt，Kurt F<120>用于形成結(jié)構(gòu)確定的有機(jī)分子的方法<130>40218-132<140>10/791,951<141>2004-03-03<160>1<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>229<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>胰蛋白酶原<400>1Val Asp Asp Asp Asp Lys Ile Val Gly Gly Tyr Thr Cys Gly Ala Asn1 5 10 15Thr Val Pro Tyr Gln Val Ser Leu Asn Ser Gly Tyr His Phe Cys Gly20 25 30Gly Ser Leu Ile Asn Ser Gln Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Tyr35 40 45Lys Ser Gly Ile Gln Val Arg Leu Gly Asn Asp Asn Ile Asn Val Val50 55 60Glu Gly Asn Gln Gln Phe Ile Ser Ala Ser Lys Ser Ile Val His Pro65 70 75 80
Ser Tyr Asn Ser Asn Thr Leu Asn Asn Asp Ile Met Leu Ile Lys Leu85 90 95Lys Ser Ala Ala Ser Leu Asn Ser Arg Val Ala Ser Ile Ser Leu Pro100 105 110Thr Ser Cys Ala Pro Ala Gly Thr Gln Cys Leu Ile Ser Gly Trp Gly115 120 125Asn Thr Lys Ser Ser Gly Thr Ser Tyr Pro Asp Val Leu Lys Cys Leu130 135 140Lys Ala Pro Ile Leu Ser Asn Ser Ser Cys Lys Ser Ala Tyr Pro Gly145 150 155 160Gln Ile Thr Ser Asn Met Phe Cys Ala Gly Tyr Leu Glu Gly Gly Lys165 170 175Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Val Val Cys Ser Gly Lys180 185 190Leu Gln Gly Ile Val Ser Trp Gly Ser Gly Cys Ala Gln Lys Asn Lys195 200 205Pro Gly Val Tyr Thr Lys Val Cys Asn Tyr Val Ser Trp Ile Lys Gln210 215 220Thr Ile Ala Ser Asn22權(quán)利要求
1.形成有機(jī)分子的方法，所述的方法包括將水解酶與有機(jī)反應(yīng)物接觸，其中有機(jī)反應(yīng)物包含下式(R1)4-nX(OR2)n或 其中X選自硅和鍺；R1選自烷基、鹵烷基、不飽和烷基、芳基、醇、環(huán)氧、醚、胺、-(OXR42)y-OXR43及其組合；R2選自烷基、氫、醚及其組合；R3選自烷基、不飽和烷基、芳基、氫及其組合；R4選自烷基、鹵烷基、不飽和烷基、芳基、氫、羥基、烷氧基、醇、環(huán)氧、醚、胺、-(OXR42)y-OXR43及其組合；n是0-4的整數(shù)；y是0或大于0的整數(shù)；和z是3或大于3的整數(shù)；水解酶包括角質(zhì)酶；并且水解酶催化有機(jī)反應(yīng)物的水解和縮合從而形成有機(jī)分子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中水解酶進(jìn)一步包括脂酶、蛋白酶、磷酸酯酶、酯酶或其組合。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中有機(jī)反應(yīng)物的式選自(R1)4X、(R1)3X(OR2)1、(R1)2X(OR2)2、(R1)1X(OR2)3和X(OR2)4。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中水解酶的濃度等于或大于1mg/mL。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中水解酶的濃度是約20mg/mL-約60mg/mL。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中水解酶的濃度是約40mg/mL。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中有機(jī)反應(yīng)物與酶的摩爾比小于或等于約40000∶1。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中反應(yīng)在約5.0-約8.0的pH下進(jìn)行。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中反應(yīng)在約7.0的pH下進(jìn)行。
10.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中反應(yīng)在含水溶液、溶劑中或在無(wú)溶劑條件下進(jìn)行。
11.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中反應(yīng)在約5℃至約90℃之間的溫度下進(jìn)行。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中反應(yīng)在約20℃至約50℃之間的溫度下進(jìn)行。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中反應(yīng)在約25℃的溫度下進(jìn)行。
14.形成有機(jī)硅分子的方法，所述的方法包括將水解酶與有機(jī)硅反應(yīng)物接觸，其中有機(jī)硅反應(yīng)物包含下式(R1)4-nSi(OR2)n或 其中R1選自烷基、鹵烷基、不飽和烷基、芳基、醇、環(huán)氧、醚、胺、-(OSiR42)y-OSiR43及其組合；R2選自烷基、氫、醚及其組合；R3選自烷基、不飽和烷基、芳基、氫及其組合；R4選自烷基、鹵烷基、不飽和烷基、芳基、氫、羥基、烷氧基、醇、環(huán)氧、醚、胺、-(OSiR42)y-OSiR43及其組合；n是0-4的整數(shù)；y是0或大于0的整數(shù)；和z是3或大于3的整數(shù)；水解酶包括角質(zhì)酶；并且水解酶催化有機(jī)硅反應(yīng)物的水解和縮合從而形成有機(jī)硅分子。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中，水解酶進(jìn)一步包括脂酶、蛋白酶、磷酸酯酶、酯酶或其組合。
16.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中有機(jī)硅反應(yīng)物的式選自(R1)4Si、(R1)3Si(OR2)1、(R1)2Si(OR2)2、(R1)1Si(OR2)3和Si(OR2)4。
17.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中水解酶的濃度等于或大于1mg/mL。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中水解酶的濃度是約20mg/mL-約60mg/mL。
19.根據(jù)其權(quán)利要求18的方法，其中水解酶的濃度是約40mg/mL。
20.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中有機(jī)硅反應(yīng)物與酶的摩爾比小于或等于約40000∶1。
21.根據(jù)權(quán)利要求14，其中反應(yīng)在約5.0-約8.0的pH下進(jìn)行。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中反應(yīng)在約7.0的pH下進(jìn)行。
23.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中反應(yīng)在含水溶液、溶劑中或在無(wú)溶劑條件下進(jìn)行。
24.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中反應(yīng)在約5℃至約90℃之間的溫度下進(jìn)行。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中反應(yīng)在約20℃至約50℃之間的溫度下進(jìn)行。
26.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其中反應(yīng)在約25℃的溫度下進(jìn)行。
27.形成有機(jī)硅中間體分子的方法，所述的方法包括將水解酶與有機(jī)硅反應(yīng)物接觸，其中有機(jī)硅反應(yīng)物包含下式(R1)4-nSi(OR2)n或 其中R1選自烷基、鹵烷基、不飽和烷基、芳基、醇、環(huán)氧、醚、胺、-(OSiR42)y-OSiR43及其組合；R2選自烷基、氫、醚及其組合；R3選自烷基、不飽和烷基、芳基、氫及其組合；R4選自烷基、鹵烷基、不飽和烷基、芳基、氫、羥基、烷氧基、醇、環(huán)氧、醚、胺、-(OSiR42)y-OSiR43及其組合；n是0-4的整數(shù)；y是0或大于0的整數(shù)；和z是3或大于3的整數(shù)；水解酶包括角質(zhì)酶；并且水解酶催化有機(jī)硅反應(yīng)物的水解從而形成有機(jī)硅中間體分子。
28.形成有機(jī)硅分子的方法，所述的方法包括將水解酶與有機(jī)硅中間體反應(yīng)物接觸，其中有機(jī)硅中間體反應(yīng)物包含下式(R1)4-nSi(OR2)n或 其中R1選自烷基、鹵烷基、不飽和烷基、芳基、醇、環(huán)氧、醚、胺、-(OSiR42)y-OSiR43及其組合；R2是氫；R3選自烷基、不飽和烷基、芳基、氫及其組合；R4選自烷基、鹵烷基、不飽和烷基、芳基、氫、羥基、烷氧基、醇、環(huán)氧、醚、胺、-(OSiR42)y-OSiR43及其組合；n是0-4的整數(shù)；和y是0或大于0的整數(shù)；a+b等于z；z是3或大于3的整數(shù)；水解酶包括角質(zhì)酶；并且水解酶催化有機(jī)硅中間體反應(yīng)物的縮合從而形成有機(jī)硅分子。
29.形成有機(jī)鍺烷分子的方法，所述的方法包括將水解酶與有機(jī)鍺烷反應(yīng)物接觸，其中有機(jī)鍺烷反應(yīng)物包含下式(R1)4-nGe(OR2)n或 其中R1選自烷基、鹵烷基、不飽和烷基、芳基、醇、環(huán)氧、醚、胺、-(OGeR42)y-OGeR43及其組合；R2選自烷基、氫、醚及其組合；R3選自烷基、不飽和烷基、芳基、氫及其組合；R4選自烷基、鹵烷基、不飽和烷基、芳基、氫、羥基、烷氧基、醇、環(huán)氧、醚、胺、-(OGeR42)y-OGeR43及其組合；n是0-4的整數(shù)；y是0或大于0的整數(shù)；和z是3或大于3的整數(shù)；水解酶包括脂酶、蛋白酶、磷酸酯酶、酯酶、角質(zhì)酶或其組合；并且水解酶催化有機(jī)鍺烷反應(yīng)物的水解和縮合從而形成有機(jī)鍺烷分子。
30.根據(jù)權(quán)利要求29的方法，其中水解酶包括脂酶，并且該脂酶選自南極假絲酵母脂酶、南極假絲酵母脂酶B、米黑根毛霉脂酶、麥胚脂酶或其組合。
31.根據(jù)權(quán)利要求29的方法，其中水解酶包括蛋白酶，并且該蛋白酶選自胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶或其組合。
32.根據(jù)權(quán)利要求31的方法，其中所述蛋白酶是胰蛋白酶。
33.根據(jù)權(quán)利要求29的方法，其中有機(jī)硅反應(yīng)物的式選自(R1)4Ge、(R1)3Ge(OR2)1、(R1)2Ge(OR2)2、(R1)1Ge(OR2)3和Ge(OR2)4。
34.根據(jù)權(quán)利要求29的方法，其中水解酶的濃度等于或大于1mg/mL。
35.根據(jù)權(quán)利要求34的方法，其中水解酶的濃度是約20mg/mL-約60mg/mL。
36.根據(jù)其權(quán)利要求35的方法，其中水解酶的濃度是約40mg/mL。
37.根據(jù)權(quán)利要求29的方法，其中有機(jī)硅反應(yīng)物與酶的摩爾比小于或等于約40000∶1。
38.根據(jù)權(quán)利要求29的方法，其中反應(yīng)在約5.0-約8.0的pH下進(jìn)行。
39.根據(jù)權(quán)利要求38的方法，其中反應(yīng)在約7.0的pH下進(jìn)行。
40.根據(jù)權(quán)利要求29的方法，其中反應(yīng)在含水溶液、溶劑中或在無(wú)溶劑條件下進(jìn)行。
41.根據(jù)權(quán)利要求29的方法，其中反應(yīng)在約5℃至90℃之間的溫度下進(jìn)行。
42.根據(jù)權(quán)利要求41的方法，其中反應(yīng)在約20℃至50℃之間的溫度下進(jìn)行。
43.根據(jù)權(quán)利要求42的方法，其中反應(yīng)在約25℃的溫度下進(jìn)行。
44.形成有機(jī)鍺烷中間體分子的方法，所述的方法包括將水解酶與有機(jī)鍺烷反應(yīng)物接觸，其中有機(jī)鍺烷反應(yīng)物包含下式(R1)4-nGe(OR2)n或 其中R1選自烷基、鹵烷基、不飽和烷基、芳基、醇、環(huán)氧、醚、胺、-(OGeR42)y-OGeR43及其組合；R2自烷基、氫、醚及其組合；R3選自烷基、不飽和烷基、芳基、氫及其組合；R4選自烷基、鹵烷基、不飽和烷基、芳基、氫、羥基、烷氧基、醇、環(huán)氧、醚、胺、-(OGeR42)y-OGeR43及其組合；n是0-4的整數(shù)；y是0或大于0的整數(shù)；和z是3或大于3的整數(shù)；水解酶包括脂酶、蛋白酶、磷酸酯酶、酯酶、角質(zhì)酶或其組合；并且水解酶催化有機(jī)鍺烷反應(yīng)物的水解從而形成有機(jī)鍺烷中間體分子。
45.形成有機(jī)鍺烷分子的方法，所述的方法包括將水解酶與有機(jī)鍺烷中間體反應(yīng)物接觸，其中有機(jī)鍺烷中間體反應(yīng)物包含下式(R1)4-nGe(OR2)n或 其中R1選自烷基、鹵烷基、不飽和烷基、芳基、醇、環(huán)氧、醚、胺、-(OGeR42)y-OGeR43及其組合；R2是氫；R3選自烷基、不飽和烷基、芳基、氫及其組合；R4選自烷基、鹵烷基、不飽和烷基、芳基、氫、羥基、烷氧基、醇、環(huán)氧、醚、胺、-(OGeR42)y-OGeR43及其組合；n是0-4的整數(shù)；和y是0或大于0的整數(shù)；a+b＝z；z是3或大于3的整數(shù)；水解酶包括脂酶、蛋白酶、磷酸酯酶、酯酶、角質(zhì)酶或其組合；并且水解酶催化有機(jī)鍺烷中間體反應(yīng)物的縮合從而形成有機(jī)鍺烷分子。
全文摘要
本發(fā)明提供了形成有機(jī)分子的方法，方法包括將水解酶與有機(jī)反應(yīng)物接觸。也提供了用于形成有機(jī)硅分子的方法，方法包括將角質(zhì)酶與有機(jī)硅反應(yīng)物接觸。還提供了用于形成有機(jī)鍺烷分子的方法，方法包括將水解酶與有機(jī)鍺烷反應(yīng)物接觸。
文檔編號(hào)C12P7/00GK1946850SQ200580012962
公開(kāi)日2007年4月11日 申請(qǐng)日期2005年3月3日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月3日
發(fā)明者K·F·布蘭德施塔特, T·H·萊恩, J·C·薩姆, J·C·麥考利夫 申請(qǐng)人:陶氏康寧公司, 金克克國(guó)際有限公司