專利名稱：：水解卵磷脂產(chǎn)物的酶促生產(chǎn)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及來自天然產(chǎn)品的磷脂-甘油三酯混合物，例如卵磷脂的酶促水解法，特別是涉及水解卵磷脂產(chǎn)物的生產(chǎn)，并涉及由這些方法獲得的水解卵磷脂產(chǎn)物。參考文獻(xiàn)D.Adlercreutz等人，Synthesisofphosphatidylcholinewithdifferentfattyacidinsn-1positionbylipase-catalyzedesterificationandtransesterificationreaction.Biotechnol.Bioeng.78403-411(2002)A.Bastida等人，Asinglesteppurifcation，immobilization，andhyperactivationoflipasesviainterfacialadsorptiononstronglyhydrophobicsupports.BiotechnologyandBioengineering58(5)486-493(1998)V.M.Balcao等人，BioreactorswithimmobilizedlipasesStateoftheart.EnzymeandMicrobialTechnology18391-416(1995).G.F.Bickerstaff等人，ImmobilizationofEnzymesandCells.Humana，Toyawa，NJ，1997.U.T.Bornscheuer等人，Optimizinglipasesandrelatedenzymesforefficientapplication.TrendsinBiotechnology20(10)433-437(2002).O.Chmiel等人，Processfortheinteresterificationofphospholipids.美國專利US5,989,599(1999).W.Cho等人，EfficientimmobilizationofphospholipaseA2.MethodsinMolecularBiology109303-307(1999).R.Fernandez-Lafuente等人，Immobilizationoflipasesbyselectiveadsorptiononhydrophobicsupports.ChemistryandPhysicsofLipids93(1-2)185-97(1998年6月).M.J.Hass等人，Thehydrolysisofphosphatidylcholinebyanimmobilizedlipaseoptimizationofhydrolysisinorganicsolvents.JournaloftheAmericanOilChemists’Society70(2)111-17(1993).M.Hass等人，Enzymicphosphatidylcholinehydrolysisinorganicsolventsanexaminationofselectedcommerciallyavailablelipases.JournaloftheAmericanOilChemists’Society71(5)483-90(1994).M.J.Hass等人，Theenzymichydrolysisoftriglyceride-phospholipidmixturesinanorganicsolvent.JournaloftheAmericanOilChemists’Society72(5)519-25(1995).F.Hara等人，Comparativestudyofcommericiallyavailablelipasesinhydrolysisreactionofphosphatidylcholine.JournaloftheAmericanOilChemists’Society74(9)1129-1132(1997).F.D.Gunstone，Enzymesasbiocatalystsinthemodificationofnaturallipids.JournaloftheScienceofFoodandAgriculrture791535-1549(1999).A.E.Ivanov等人，Methodsfortheimmobilizationoflipasesandtheiruseforestersynthesis.JournalofMolecularCatalysisBEnzymatic3303-309(1997).B.Jirjis等人，Methodforremovingphospholipidsfromvegetableoilmiscella，methodforconditioningapolymericmicrofiltrationmembrane，andmembrane.美國專利USNo.6,207,209(2001).B.Jirjis等人，Methodandapparatusforprocessingvegetableoilmiscella，methodforconditioningapolymericmicrofiltrationmembrane，membrane，andlecithinproduct.美國專利USNo.6,833,149(2004).S.T.Kang等人，Characteristicsofimmobilizedlipase-catalyzedhydrolysisofoliveoilofhighconcentrationinreversephasesystem.BiotechnologyandBioengineering33(11)1469-76(1989).F.X.Malcata等人，Kineticsandmechanismsofreactionscatalysedbyimmobilizedlipase.EnzymeandMicrobialTechnology14(6)426-46(1992年6月).F.X.Malcata等人，Immobilizedlipasereactorsformodificationoffatsandoils-areview.JournaloftheAmericanOilChemistsSociety67(12)890-910(1990).K.Mosbach等人，MethodsinEnzymology，Vol.137ImmobilizedEnzymesandCells.AcademicPress，SanDiego，CA，1988.A.Mustranta等人，Comparisonoflipasesandphospholipasesinthehydrolysisofphospholipids.ProcessBiochemistry30(5)393-401(1995).I.C.Omar等人，HydrolysisoftriglyceridesbyimmobilizedthermostablelipasefromHumicolalanuginosa.AgriculturalandBiologicalChemistry52(1)99-105(1988).M.V.Ramachandra等人，HydrolysisofoilsbyusingimmobilizedlipaseenzymeAreview.BiotechnologyandBioprocessEngineering7(2)57-66(2002).B.Sas等人，Improvedmethodfortheconversionoflecithinintolysolecithin.PCT公開WO00/52190(2000).J.F.Shaw等人，Lipolyticactivitiesofalipaseimmobilizedonsixselectedsupportingmaterials.BiotechnologyandBioengineering35(2)132-7(1990).D.K.Shen等人，CharacterisationandexpressionofphospholipasesBfromtheopportunisticfungusAspergillusfumigatus.FEMSMicrobiologyLetters239(1)87-93(2004).
背景技術(shù)：
：卵磷脂和改性卵磷脂作為增溶劑、乳化劑和其它類型的添加劑廣泛用在工業(yè)中，包括食品和制藥工業(yè)。卵磷脂獲自各種動(dòng)物或植物來源，例如大豆或蛋黃，并包括磷脂與甘油三酯的混合物，以及較少量的化合物如糖脂類、碳水化合物、脂肪酸和/或甾醇。據(jù)發(fā)現(xiàn)，卵磷脂中磷脂的部分水解能改進(jìn)乳化性能。這種改性最常見是通過用磷脂酶A1和/或A2(它們分別選擇性水解磷脂的第一或第二甘油脂肪酸，以產(chǎn)生溶血磷脂)處理卵磷脂來實(shí)現(xiàn)。據(jù)發(fā)現(xiàn)，在卵磷脂或部分水解的卵磷脂中加入甘油單酯和二酯也能改進(jìn)最終產(chǎn)品的性能，例如面粉的烘焙特性或人造黃油(尤其是具有較低脂肪含量，例如60wt％脂肪或更低的那些)的防濺性能(參見例如，EP專利No.253429；美國專利No.3,505,074；PCT公開No.WO02/49444)?？墒褂眠@些組合物以改進(jìn)抗陳化性能的食品和飼料產(chǎn)品的進(jìn)一步例子包括冷凍面團(tuán)、焙烤產(chǎn)品，乳化肉產(chǎn)品、冰淇淋、調(diào)味品和其它乳劑系統(tǒng)。目前，通過在卵磷脂中加入這些組分，制備了包含更高量甘油單酯和二酯的卵磷脂產(chǎn)品?？梢酝ㄟ^卵磷脂和相關(guān)組合物的酶促水解以受控方式直接制備這些產(chǎn)品。
發(fā)明內(nèi)容I.綜述一方面，本發(fā)明提供了生產(chǎn)包含水解磷脂、甘油單酯和甘油二酯的水解產(chǎn)物的方法，該方法包括(a)使來自植物油的包含磷脂組分和甘油三酯組分的原材料在水或有機(jī)溶劑介質(zhì)中與第一酶接觸；和(b)隨后使步驟(a)的產(chǎn)物與第二酶接觸，第二酶與第一酶不同；其中所述酶之一是能有效地將磷脂水解的磷脂酶或脂酶，另一種酶是能有效地將甘油三酯水解的磷脂酶或脂酶。在所選實(shí)施方案中，第二酶是脂酶，第一酶是磷脂酶，例如磷脂酶A1和/或A2。在一種這樣的實(shí)施方案中，第一酶是磷脂酶A2。在另一實(shí)施方案中，第一酶是磷脂酶D。該實(shí)施方案可以在所述接觸步驟(b)之前進(jìn)一步包括使步驟(a)的產(chǎn)物與磷脂酶A1和/或A2反應(yīng)。在另一實(shí)施方案中，第一酶是磷脂酶C。在該方法以及本文提供的所有水解方法中，原材料優(yōu)選來自天然存在來源，例如蛋黃或植物油。優(yōu)選地，原材料直接來自天然存在來源，即不添加外加磷脂、甘油三酯、甘油單/二酯或脂肪酸組分。原材料可以是卵磷脂物質(zhì)，例如具有至少50wt％，優(yōu)選至少60wt％的丙酮不溶物(A.I.)含量。(除非另行說明，否則本文所述的比例均是重量百分比)?；蛘?，可以使用具有較低A.I.值，例如10wt％-50wt％的原材料。水解產(chǎn)物優(yōu)選為水解卵磷脂產(chǎn)物，即含有至少50％，更優(yōu)選至少56％丙酮不溶物。水解產(chǎn)物優(yōu)選具有小于45mgKOH/克的酸值。在進(jìn)一步實(shí)施方案中，水解產(chǎn)物包含至少60％丙酮不溶物。上述方法的步驟(a)和(b)可以在水介質(zhì)或在有機(jī)溶劑(例如烴溶劑)中進(jìn)行。在后一種情況下，原材料可以是植物油膜脫膠法的滲余物。在這一方面的一種實(shí)施方案中，步驟(a)和(b)在能有效地將水解磷脂、甘油單酯和甘油二酯與釋放的脂肪酸分離的膜存在下進(jìn)行。在相關(guān)方面，本發(fā)明進(jìn)一個(gè)提供了生產(chǎn)包含水解磷脂、甘油單酯和甘油二酯的水解產(chǎn)物的另一方法，該方法包括使包含磷脂組分和甘油三酯組分的原材料在非質(zhì)子有機(jī)溶劑中與第一和第二酶接觸，其中第一酶是能有效地將磷脂水解的磷脂酶或脂酶，第二酶與第一酶不同，是能有效地將甘油三酯水解的脂酶或磷脂酶，優(yōu)選脂酶。在一種實(shí)施方案中，原材料與第一和第二酶同時(shí)接觸；在另一實(shí)施方案中，這些酶以任意順序依次使用。也就是說，“第一”酶可以在“第二”酶之前，之后或與其同時(shí)使用。優(yōu)選地，第一酶(即能有效地將磷脂水解的酶)是磷脂酶A1和/或A2。在一種實(shí)施方式中，第一酶是磷脂酶A2。非質(zhì)子有機(jī)溶劑可以是烴溶劑，例如己烷。在一種實(shí)施方式中，卵磷脂原材料是植物油膜脫膠過程的滲余物。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包含至少兩種選自磷脂、水解磷脂、甘油單酯、甘油二酯或甘油三酯的組分的水解產(chǎn)物的生產(chǎn)方法，該方法包括使包含磷脂組分和甘油三酯組分的原材料在有機(jī)溶劑介質(zhì)中與脂酶或磷脂酶C接觸，其中原材料是植物油膜脫膠過程的滲余物。在一種實(shí)施方案中，酶是脂酶，且水解產(chǎn)物包含磷脂和甘油二酯，在一些情況下還包含甘油單酯。在另一實(shí)施方案中，酶是磷脂酶C，水解產(chǎn)物包含磷脂、甘油三酯和甘油二酯。在此情況下，該方法進(jìn)一步包括使水解產(chǎn)物與磷脂酶A1和/或A2反應(yīng)。在進(jìn)一步方面，本發(fā)明提供了生產(chǎn)包含磷脂、甘油單酯和甘油二酯的水解產(chǎn)物的方法，該方法包括使來自植物油的包含磷脂組分和甘油三酯組分的原材料在水溶劑中在不存在磷脂酶的情況下與脂酶接觸。優(yōu)選地，脂酶在接觸條件下能有效地選擇性水解甘油三酯。本文公開的各種方法優(yōu)選還包括去除或鈍化酶和去除溶劑介質(zhì)的步驟。在這些步驟之后，可以進(jìn)一步將水解產(chǎn)物配制成食品。在相關(guān)方面，本發(fā)明提供了水解卵磷脂產(chǎn)物，其中該產(chǎn)物包含水解磷脂、甘油單酯和甘油二酯，并通過上述任何方法制成，其中原材料直接來自植物油，且該方法包括去除或鈍化酶并去除溶劑介質(zhì)的步驟。水解卵磷脂產(chǎn)物基本由原材料的組分和由原材料通過酶的反應(yīng)獲得的水解物質(zhì)組成。優(yōu)選地，水解卵磷脂產(chǎn)物包含至少50％，更優(yōu)選至少56％的丙酮不溶物并具有小于45mgKOH/克的酸值。在所選實(shí)施方式中，產(chǎn)物包含至少60％丙酮不溶物。在進(jìn)一步相關(guān)方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的水解卵磷脂產(chǎn)物的食品，和通過將本發(fā)明的水解卵磷脂產(chǎn)物與另外的可食用的成分結(jié)合來配制食品的方法。在本發(fā)明的下列詳述中將更充分地描述本發(fā)明的上述和其它目的和特征。II.卵磷脂或相關(guān)組合物的酶促改性法本發(fā)明提供了生產(chǎn)包含磷脂和/或水解磷脂、甘油單酯和甘油二酯(后兩種組分共同稱為甘油單/二酯)的水解產(chǎn)物的方法。通常，產(chǎn)物還包括未水解的磷脂和甘油三酯。水解磷脂通常為溶血磷脂，也可包括磷脂酸和/或溶血磷脂酸。按照本發(fā)明，直接通過如下所述原材料的酶促處理，在不單獨(dú)添加任何上述組分的情況下，來生產(chǎn)水解產(chǎn)物。原材料優(yōu)選來自植物油；例如獲自傳統(tǒng)植物油處理的材料。在優(yōu)選實(shí)施方式中，該方法產(chǎn)生水解卵磷脂產(chǎn)物，其包含至少50％、優(yōu)選至少56％、更優(yōu)選至少60％的丙酮不溶物(主要由磷脂和/或水解磷脂組成)并具有低于45mgKOH/克的酸值。原材料本文公開的方法使用含有磷脂組分(優(yōu)選至少10％，更優(yōu)選至少25％，最優(yōu)選至少40wt％)和甘油三酯組分的原材料。當(dāng)原材料包含與“卵磷脂”立法標(biāo)準(zhǔn)相符的丙酮不溶物(主要由磷脂組成)含量時(shí)，原材料可以被稱作卵磷脂原材料。這種丙酮不溶物含量通常為至少50wt％；例如56wt％，或60wt％或更高。原材料優(yōu)選來自天然存在的來源，例如蛋黃或植物油，其中“植物油”包括任何從植物種子、果實(shí)或堅(jiān)果中榨取的油。常見例子包括向日葵油、油菜籽油、菜籽油、棉籽油、及特別是大豆油。原材料優(yōu)選來自天然存在的來源，即不添加外加磷脂、甘油三酯、甘油單/二酯或脂肪酸組分。方便地，可以經(jīng)由天然存在材料，通常是植物油，例如大豆油的常規(guī)加工來生產(chǎn)原材料。在優(yōu)選實(shí)施方式中，原材料是通過植物油的水或膜脫膠獲得的材料。例如，在典型的粗制大豆油加工程序中，將大豆去皮并用己烷提取以產(chǎn)生包括己烷和粗制大豆油的提取物(溶劑混合油)。除磷脂、糖、固醇、固醇葡糖苷、脂肪酸和其它較少量組分外，粗制大豆油還包含甘油酯油作為主要組分。在稱作“脫膠”的過程中將磷脂與溶劑混合油中大部分甘油酯油分離。在常規(guī)水脫膠法中，這通常是通過去除己烷溶劑、用熱水或蒸汽使磷脂水化并離心分離來進(jìn)行的。去除部分或所有水以產(chǎn)生粗制卵磷脂材料，其通常含有大約60-65％的丙酮不溶物，其余部分主要是甘油三酯和較少量的其它組分，例如糖、固醇葡糖苷和/或脂肪酸。這種材料可用作本發(fā)明所述方法中的原材料。最近，開發(fā)出大豆油的膜脫膠法，其通常產(chǎn)生比水脫膠法更純凈的產(chǎn)品。參看，例如，Jirjis等人，美國專利Nos.6,207,209和6,833,149。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，通過這種方法提供原材料。在膜脫膠法中，將在烴溶劑(通常是己烷)中的植物油溶劑混合油加到膜上，產(chǎn)生與溶劑混合油的磷脂含量相比不含磷脂的滲透物流和富含磷脂的滲余物流。含或不含己烷溶劑的滲余物都可用作本發(fā)明方法中的原材料。可以通過改變分離條件，例如滲余物-滲透物比率、分離時(shí)間和/或分離階段的數(shù)量來改變這種滲余物中的磷脂含量。(參見例如Jiriis等人，如上引用)。滲余物中的磷脂含量(除溶劑在外)可以是，例如，大約10％至大約85％，通常大約50％-85％。反應(yīng)條件一般可以在水介質(zhì)中進(jìn)行反應(yīng)，其中脂質(zhì)物質(zhì)通常以膠束或泡囊之類的聚集體形式存在。本文所用的“水介質(zhì)”是指水，或包含水和較少量的另一種水混溶性溶劑的溶劑介質(zhì)。優(yōu)選地，水介質(zhì)包含最多10％，更優(yōu)選最多5％的另一種水混溶性溶劑。更優(yōu)選地，水介質(zhì)包含少于1％或不含另一種溶劑。反應(yīng)還可以在有機(jī)溶劑介質(zhì)中進(jìn)行。本文所用的術(shù)語“有機(jī)溶劑介質(zhì)”是指有機(jī)溶劑，優(yōu)選非質(zhì)子溶劑(即，不是醇或胺)，更優(yōu)選為非極性溶劑，但是可以理解的是，反應(yīng)介質(zhì)應(yīng)當(dāng)包括足量的水以發(fā)生水解。優(yōu)選地，水的含量為能有效地促進(jìn)水解和使酯交換最小化的量?？梢允褂美缢柡腿軇┫蚍磻?yīng)介質(zhì)中添加水，或者其可以通過原材料中的夾帶或殘余水提供。在所選實(shí)施方案中，本文所述的水解法在能有效抑制水解磷脂與釋放的脂肪酸發(fā)生酯交換的條件下進(jìn)行。這種條件可以包括存在足以抑制酯化的水，或存在使釋放的脂肪酸螯合的鹽。例如，可以在反應(yīng)混合物中加入鹽或弱堿以使釋放的脂肪酸螯合。這種鹽可以是，例如，過量氯化鈣。氯化鈣通常作為離子活化劑用在使用磷脂酶的反應(yīng)中?；蛘呋虼送猓梢栽诰哂心軓姆磻?yīng)混合物中有效去除脂肪酸的組成和孔徑大小的膜的存在下進(jìn)行反應(yīng)。這一特征可用于提高水解產(chǎn)物的丙酮不溶物(A.I.)含量。在本文所述的方法中可以改變的其它反應(yīng)條件包括，例如，酶狀態(tài)(例如，是否固定化)、溫度、pH、其它添加劑的存在和濃度、和底物濃度。示例性條件如下所述。C.雙酶水解法在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，原材料在使用兩種不同酶的雙酶法中水解。具體而言，使用第一酶，通常是磷脂酶(或如下所述的磷脂反應(yīng)性脂酶)將原材料中的磷脂水解成溶血磷脂和/或磷脂酸，并使用第二酶，通常是脂酶(或有時(shí)是具有脂酶活性的磷脂酶)將甘油三酯水解成甘油單/二酯。優(yōu)選地，第一酶是用于磷脂水解的磷脂酶，例如磷脂酶A2，第二酶是用于甘油三酯水解的脂酶。(注意，在這種情況下“第一”和“第二”的使用不一定代表了反應(yīng)的時(shí)間順序)。相對(duì)于不同水解組分的相對(duì)存在量，兩種不同酶的使用可以在所得產(chǎn)物組成的范圍上提供比單酶法具有更大的靈活性。如下進(jìn)一步描述，這兩種酶可以同時(shí)或以任意順序依次使用。更通常，兩種不同酶各自是磷脂酶或脂酶，其中一種酶用于將原材料中的磷脂水解成例如溶血磷脂，另一種用于將原材料中的甘油三酯水解成甘油單/二酯。通常，一種酶是選擇性水解磷脂的磷脂酶，另一種是選擇性水解甘油三酯的脂酶。(本文所用的“選擇性”是指在相同條件下，酶使特定底物(例如磷脂)水解的程度大于使不同底物(例如甘油三酯)水解的程度)。水解“程度”是指底物被水解的摩爾百分比。選擇性酶使一種底物水解的程度與使另一種底物水解的程度相比，可以相差2(factor)或更多倍，相差大約5或更多倍，或相差大約25或大約50或更多倍。如下所述，一些脂酶已知能使磷脂水解，有時(shí)水解程度高于它們使甘油三酯水解的程度。相反，盡管較不常見，但一些磷脂酶已知能使甘油三酯水解，有時(shí)水解程度高于它們使磷脂水解的程度。通常，這些酶的活性和選擇性取決于反應(yīng)條件。因此，兩種酶的選擇可以包括脂酶和磷脂酶的不同組合，只要在反應(yīng)條件下，一種酶具有顯著和/或選擇性脂酶活性，另一種酶具有顯著和/或選擇性磷脂酶活性。(本文所用的“顯著”活性是指在給定一組反應(yīng)條件下，酶使至少1摩爾％，優(yōu)選至少5摩爾％，更優(yōu)選至少10摩爾％或至少25摩爾％的特定底物水解)。如下進(jìn)一步描述，當(dāng)在水溶劑中進(jìn)行時(shí)，雙酶反應(yīng)有利地在第一階段中使用磷脂酶(或磷脂選擇性酶)，并在后一階段中使用脂酶(或甘油三酯選擇性酶)。在有機(jī)溶劑中的反應(yīng)可以以任意順序依次或同時(shí)使用這兩種酶。后一反應(yīng)優(yōu)選在來自膜脫膠過程的滲余物上進(jìn)行。C1.在水介質(zhì)中的雙酶反應(yīng)在一種實(shí)施方式中，如上所述在水介質(zhì)中進(jìn)行雙酶法。這種反應(yīng)的原材料包含如上所述的磷脂組分和甘油三酯組分，優(yōu)選直接來自植物油。這種原材料可以是例如，如上所述獲自大豆油的水脫膠的粗材料。然而，來自膜脫膠過程的原材料也可以在水介質(zhì)中水解。當(dāng)在水介質(zhì)中進(jìn)行水解時(shí)，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，甘油三酯的初始水解可以造成介質(zhì)粘度極大提高。因此，當(dāng)雙酶法在水介質(zhì)中進(jìn)行時(shí)，優(yōu)選使原材料首先與能有效地將磷脂選擇性水解的酶(例如磷脂酶或磷脂選擇性脂酶)接觸。在足夠的反應(yīng)時(shí)間后，并任選在回收中間產(chǎn)物之后，使該材料隨后與能有效地將甘油三酯選擇性水解的酶(例如脂酶或具有脂酶活性的磷脂酶)接觸。通常，這種方法中的第一酶是磷脂酶，例如磷脂酶A2，第二酶是脂酶，優(yōu)選甘油三酯選擇性脂酶。下面在章節(jié)V和VI中提供了這些方法的實(shí)施例。如下進(jìn)一步論述，可以將酶固定，這有利于將它們從反應(yīng)混合物中去除?；蛘?，在反應(yīng)完成時(shí)通過熱處理將未固定的酶鈍化。C2.在有機(jī)溶劑中的雙酶反應(yīng)雙酶法也可以在包含足以進(jìn)行水解的水，優(yōu)選足以促進(jìn)水解并抑制酯交換的水的有機(jī)溶劑介質(zhì)中，優(yōu)選非質(zhì)子溶劑中進(jìn)行。優(yōu)選在有機(jī)溶劑中提供原材料。在一種實(shí)施方案中，該方法是在植物油(通常是大豆油)的膜脫膠法中獲得的滲余物上進(jìn)行。如美國專利Nos6,207,209和6,833,149中所述的典型滲余物包含預(yù)加工油中存在的大部分磷脂，因?yàn)檫@些化合物在烴溶劑中形成不會(huì)滲透過膜孔的大聚集體。然而，如上所述，通過改變膜分離過程中使用的條件；例如通過改變滲余物-滲透物比率，可以獲得具有不同磷脂含量的滲余物。滲余物通常還包含顯著量的甘油三酯。有機(jī)溶劑可以是在反應(yīng)條件下為惰性的任何溶劑，包括例如低分子量酯或酮、鹵代烴、或優(yōu)選為烴。優(yōu)選的烴溶劑包括鏈烷、環(huán)烷烴和簡單的芳烴，例如，苯及其含有最多具有四個(gè)碳原子的烷基取代基的同系物。烴的例子包括苯、甲苯、二甲苯、C3-C6環(huán)烷烴、C5-C8烷烴、和它們的混合物，例如石油醚、以及C5-C8鏈烯烴。當(dāng)雙酶法在有機(jī)溶劑中進(jìn)行時(shí)，兩種酶可以如上所述依次添加，并任選分離中間產(chǎn)物?；蛘撸?dāng)使用有機(jī)溶劑介質(zhì)時(shí)，可以同時(shí)使用兩種酶。下面在章節(jié)V和VI中提供了這兩種反應(yīng)類型的例子?？梢栽谀軌蛴行У貙⑺猱a(chǎn)物組分(例如磷脂、水解磷脂、甘油三酯、甘油單酯和/或甘油二酯)與釋放的脂肪酸分離的膜存在下進(jìn)行本方法，特別是在有機(jī)溶劑中進(jìn)行時(shí)。可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法選擇適宜的膜組成、孔徑大小和操作壓力，從而使游離脂肪酸選擇性通過該膜。該特征可以有效地提高水解產(chǎn)物的丙酮不溶物(A.I.)含量。如下進(jìn)一步論述，可以將酶固定化，這有利于將它們從反應(yīng)混合物中去除。在反應(yīng)完成之后，通常通過加熱，將未固定的酶鈍化。D.單酶法在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，如上所述，來自植物油膜脫膠法的滲余物被用作單酶水解法中的原材料，其中所述酶是磷脂酶，或優(yōu)選為脂酶。如上所述，并如下在章節(jié)III中進(jìn)一步所述，許多脂酶具有顯著的磷脂酶活性并能有效地使甘油三酯(水解成甘油單/二酯)和磷脂(水解成溶血磷脂)水解。酶制品中這些活性的比率通常隨著反應(yīng)條件，特別是溶劑和pH值而變化。優(yōu)選地，如本文所述，磷脂是甘油三酯選擇性的。當(dāng)該酶是脂酶時(shí)，具有50％或更大A.I.的水解產(chǎn)物(可以是水解卵磷脂產(chǎn)物)通常包含甘油單/二酯、甘油三酯和磷脂，并還可以包含水解磷脂，例如溶血磷脂。下面在章節(jié)V和VI中給出這些反應(yīng)的例子。在另一單酶實(shí)施方案中，來自植物油的包含磷脂和甘油三酯的原材料與脂酶在水介質(zhì)中反應(yīng)。原材料可以來自如上所述的植物油(尤其是大豆油)的加工過程。如上所述，該材料優(yōu)選直接來自這種來源，即其不包含外加磷脂、甘油三酯、甘油單/二酯，或脂肪酸組分。脂酶優(yōu)選為如本文所述的甘油三酯選擇性脂酶。還考慮酶是磷脂酶C時(shí)的單酶反應(yīng)。同樣，原材料可以來自植物油，尤其是大豆油的加工過程，并且優(yōu)選直接來自這種來源。該反應(yīng)被認(rèn)為產(chǎn)生含磷脂、甘油三酯和甘油二酯并且不含明顯量的甘油單酯或溶血磷脂的產(chǎn)物。如果需要，這種產(chǎn)物可以進(jìn)一步與磷脂酶A反應(yīng)以生產(chǎn)進(jìn)一步包含溶血磷脂的產(chǎn)物。III.適用于在本發(fā)明的方法中使用的酶A.磷脂酶如上所述，本發(fā)明的方法可以使用磷脂酶將原材料中的磷脂(在一些情況下為甘油三酯)水解。磷脂酶容易購得。如下所示，常見的磷脂酶根據(jù)磷脂中被該酶水解的鍵可分為A1、A2、C和D。(酶的磷脂酶B族共享(share)了磷脂酶、溶血磷脂酶和溶血磷脂酶-轉(zhuǎn)酰酶活性(Shen等人，2004)，而且由于較低的選擇性而通常較不優(yōu)選)。本發(fā)明的雙酶法通常使用磷脂酶A1(EC3.1.1.32)和/或A2(EC3.1.1.4)，其通過去除一個(gè)?；鶄?cè)鏈產(chǎn)生溶血磷脂。在另一實(shí)施方式中，磷脂酶D(EC3.1.4.4)可以單獨(dú)或與磷脂酶A1或A2結(jié)合使用以提供磷脂酸和/或溶血磷脂酸。在進(jìn)一步實(shí)施方式中，磷脂酶C可以與磷脂/甘油三酯原材料反應(yīng)以生產(chǎn)包含磷脂、甘油三酯和甘油二酯且不含明顯量的甘油單酯或溶血磷脂的產(chǎn)物。如果需要，這種產(chǎn)物可以進(jìn)一步與磷脂酶A反應(yīng)以生產(chǎn)進(jìn)一步包含溶血磷脂的產(chǎn)物。在所選實(shí)施方案中，磷脂酶D單獨(dú)或與磷脂酶A1或A2結(jié)合使用以生產(chǎn)含有磷脂酸或溶血磷脂酸組分的水解卵磷脂產(chǎn)物。其還可以與選自乙醇胺、絲氨酸或肌醇的醇結(jié)合使用以分別提高水解卵磷脂產(chǎn)物中的PE、PS或PI含量。單獨(dú)用磷脂酶A1或A2使卵磷脂水解是本領(lǐng)域中公知的。參看，例如，GB專利No.1215868(1970)，其描述了傳統(tǒng)方法，其中卵磷脂與磷脂酶A2在存在鈣離子的水乳狀液中反應(yīng)以提供溶血卵磷脂。提純包括用丙酮萃取，這去除了脂肪酸和甘油酯之類的丙酮可溶物。Hirai等人(美國專利No.5,955,327)描述了水合卵磷脂與磷脂酶A1或A2在水介質(zhì)中反應(yīng)，然后用丙酮分相以分離溶血卵磷脂產(chǎn)物。Yesair(美國專利No.5,716,814)描述了下述方法——其中使磷脂酰膽堿和甘油單酯的混合物與磷脂酶A2反應(yīng)以生產(chǎn)溶血磷脂-甘油單酯-脂肪酸組合物。在一些情況下，如上所述，磷脂酶可以表現(xiàn)出顯著的和/或選擇性脂酶活性。例如，如上所引的Mustranta等人，1995報(bào)道了磷脂酶A1制品(A.niger)在水介質(zhì)中具有2∶1脂酶/磷脂酶活性比率。這種磷脂酶可在本發(fā)明的方法中用于使甘油三酯水解。然而，更通常地，如下所述的脂酶用于使甘油三酯水解。B.脂酶獲自動(dòng)物、植物或微生物來源的許多不同的脂酶(也稱為三酰甘油水解酶；EC3.1.1.3)是已知的和/或可購得的，通常為固定化形式。這些酶的活性和選擇性可以相差很大，即特定酶制品表現(xiàn)出的脂酶活性、磷脂酶活性和/或酯酶活性的程度可以相差很大。關(guān)于商業(yè)脂酶制品的活性和選擇性的信息通常由生產(chǎn)商提供。酶活性和選擇性通常隨著反應(yīng)條件(例如，反應(yīng)是在有機(jī)還是水介質(zhì)中進(jìn)行，酶是否固定化，等等)以及特定制品的純度而改變?？梢杂绊懨傅姆磻?yīng)性和選擇性的其它參數(shù)包括pH值、底物濃度和溶劑極性(參見，例如Hass等人，1995，1994；如上引用)如果需要，使用本領(lǐng)域已知的方法，可以憑經(jīng)驗(yàn)對(duì)給定反應(yīng)條件組合評(píng)測(cè)特定酶制品對(duì)不同底物(例如磷脂和甘油三酯)的活性。例如，A.Mustranta等人(如上引用)通過滴定經(jīng)30分鐘反應(yīng)制成的釋放的脂肪酸，在水乳狀液中對(duì)各種脂酶和磷脂酶的每一個(gè)測(cè)定大豆磷脂酰膽堿的水解程度(即磷脂酶活性)。用橄欖油進(jìn)行了類似的反應(yīng)以測(cè)定脂酶活性。在該報(bào)道中，A.niger脂酶和P.cyclopium脂酶均表現(xiàn)出磷脂酶活性，雖然脂酶活性更高，特別是對(duì)A.niger脂酶而言。該報(bào)道還發(fā)現(xiàn)磷脂酶A2制品的磷脂酶選擇性比磷脂酶A1制品高得多。M.Haas等人(1995，如上引用)通過三種脂酶和一種磷脂酶(各自可以固定化形式購得)的每一個(gè)測(cè)定磷脂和甘油三酯的水解程度。在水中用酶單獨(dú)處理這些組分；在水飽和己烷中處理組分混合物。通過釋放的脂肪酸的滴定并通過產(chǎn)物脂質(zhì)混合物的HPLC分析測(cè)定水解程度。在該報(bào)道中，發(fā)現(xiàn)溶劑介質(zhì)對(duì)反應(yīng)性和選擇性具有很大影響。例如，來自R.miehei和C.rugosa的脂酶在這兩種溶劑介質(zhì)中對(duì)甘油三酯的反應(yīng)性均比對(duì)磷脂的反應(yīng)性高得多，而來自C.antarctica的第三種脂酶在水中表現(xiàn)出與R.miehei類似的選擇性，但是在己烷中沒有反應(yīng)。磷脂酶(Amano磷脂酶B)在己烷中僅使磷脂水解，并且在水中沒有反應(yīng)。在另一分析中，F(xiàn).Hara等人(如上引用)通過各種脂酶在反向(reverse)膠束系統(tǒng)中超過24小時(shí)和超過48小時(shí)以測(cè)定磷脂酰膽堿的水解程度。對(duì)于受試的脂酶，通過色譜分析測(cè)得的其水解程度從0至100％不等。例如，在所述反應(yīng)條件下，來自M.javanicus(LipaseM10，AmanoPharmaceuticals)、M.miehei(LipozymeIM2G，NovoNordisk)和豬胰(PancreatinF，Amano)的脂酶使磷脂酰膽堿100％水解；來自Rhizopussp.(LipaseF，Amano)和R.delemar(NewlaseF，Amano)的脂酶使大約35-45％水解；來自A.niger(LipaseA6，Amano)和C.cylindrica(LipaseAY30，Amano)的脂酶幾乎或完全不導(dǎo)致水解。如上文引用的文章和本領(lǐng)域中其它文章所示，脂酶通常表現(xiàn)出顯著的磷脂酶活性。本文中可稱作“磷脂反應(yīng)性”脂酶的酶可在本文所述的雙酶法中用作第一酶?！傲字磻?yīng)性”脂酶可以定義為這樣一種酶——在合適的反應(yīng)條件(例如下述示例性反應(yīng)中所列的那些)下，其有效地使反應(yīng)中存在的至少1摩爾％，優(yōu)選至少5％，更優(yōu)選至少10％或至少25摩爾％的磷脂水解。這些反應(yīng)條件可以包括在水介質(zhì)中反應(yīng)，使用占60％AI(丙酮不溶物)0.001至0.2％的酶，在大約40-60℃4至24小時(shí)；或在有機(jī)溶劑中反應(yīng)，使用相同量的酶，在大約20-60℃1至24小時(shí)。更通常地，雙酶反應(yīng)中的第一酶是磷脂酶，且脂酶用作本文所述的雙酶法中的第二酶，或作為以原材料中甘油三酯組分的選擇性水解為目標(biāo)的方法中的單酶。出于這些目的，優(yōu)選脂酶可以定義為下述酶——其在給定反應(yīng)條件下對(duì)脂酶活性是選擇性的；也就是說，在反應(yīng)條件下，脂酶對(duì)酰基甘油的水解程度比脂酶對(duì)?；字乃獬潭却?，優(yōu)選大2倍或更多。(如上所述，反應(yīng)條件包括，例如，溶劑、酶狀態(tài)(例如是否固定化)、溫度、pH值、離子添加劑的存在和濃度、和底物濃度)?！八獬潭取笔侵傅孜锉凰獾哪柊俜直?；即轉(zhuǎn)化成甘油單/二酯的甘油三酯的百分比，或轉(zhuǎn)化成溶血磷脂的磷脂的百分比。更優(yōu)選地，該程度為大約大5倍，最優(yōu)選大約大25或大約50倍。這些酶在本文中也被稱作“甘油三酯選擇性”脂酶，或有效地將甘油三酯選擇性水解的脂酶。C.酶的固定化本文所述的方法中使用的酶可以被固定化，用于此的各種材料和方法是本領(lǐng)域中已知的；下面描述示例性程序。通常，酶固定化可延長酶的有效壽命，簡化產(chǎn)物提純，并通常提高了酶的催化活性。在其上固定酶用的材料包括二氧化硅、多孔玻璃、Celite、硅藻土、離子交換樹脂、和各種其它聚合基材(包括聚酰胺、聚丙烯、聚乙二醇、聚糖，例如纖維素、瓊脂糖和烷基改性瓊脂糖，和甲殼質(zhì)或殼聚糖)。聚合基材可以以例如膜、中空纖維或珠粒形式提供。在一種實(shí)施方案中，在反應(yīng)中用于分離脂肪酸的膜也可用于酶的固定化。固定化通常通過簡單吸附實(shí)現(xiàn)，但是可以包括共價(jià)連接，例如連接到氨基或醛改性二氧化硅上。在文獻(xiàn)中可獲得酶固定化的詳盡描述，包括對(duì)脂酶和磷脂酶固定化的具體描述。參考文獻(xiàn)的例子包括K.Mosbached，1988；F.X.Malcata等人，1990，1992；V.M.Balcao等人，1995；A.E.Ivanov等人，1997；G.F.Bickerstaffed，1997；Bastida等人，1998；R.Fernandez-Lafuente等人，1998；W.Cho等人，1999；U.T.Bornscheuer等人，2002；M.V.Ramachandra等人，2002；和D.Adlercreutz等人，2002；以上均在上文“參考文獻(xiàn)”中引用。酶通常以固定化形式出售。IV.水解產(chǎn)物本發(fā)明還提供了通過本文所述的酶促水解反應(yīng)獲得的水解產(chǎn)物，包含磷脂和/或水解磷脂、甘油單酯和甘油二酯，并通常包含磷脂和甘油三酯。水解磷脂可以包括溶血磷脂、磷脂酸和/或溶血磷脂酸。水解磷脂通常是溶血磷脂，例如通過磷脂酶A1或A2的反應(yīng)生成的。在各種實(shí)施方式中，水解產(chǎn)物含有至少0.5wt％、至少1wt％、至少2.5wt％、至少5wt％、至少7.5wt％、至少10wt％、至少15wt％、至少20wt％、至少25wt％、至少30wt％、至少35wt％、至少40wt％或至少45wt％的甘油單/二酯。轉(zhuǎn)化成甘油單/二酯的甘油三酯的摩爾百分比優(yōu)選為至少25％，更優(yōu)選至少50％，最多75％或更多。本文所述的方法的產(chǎn)物如果組成符合卵磷脂的標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)(這可能隨國家而改變)，則被稱作“水解卵磷脂”或“水解卵磷脂產(chǎn)物”。例如，按照歐洲的E322標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)，“卵磷脂”是指“由動(dòng)物或植物食品通過物理方法獲得的磷脂組分的混合物”；它們還可以包括“使用無害和適宜的酶制得的水解物質(zhì)”。按照該標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)，“卵磷脂”包含至少60％丙酮不溶物并具有小于35mgKOH/克的酸值，“水解卵磷脂”包含至少56％丙酮不溶物并具有小于45mgKOH/克的酸值。本發(fā)明的水解卵磷脂產(chǎn)物可以來自包含通過物理法獲自動(dòng)物或植物食品的磷脂混合物的卵磷脂原材料。例如，卵磷脂原材料可以獲自，粗制大豆油的水脫膠或膜脫膠。本發(fā)明的水解產(chǎn)物基本由直接來自植物油的原材料的組分，和由原材料使用無害和適宜的酶(如本文所述，具體是脂酶，在多數(shù)情況下是磷脂酶)獲得的水解物質(zhì)組成。原材料優(yōu)選是通過植物油(例如大豆油)的脫膠獲得的卵磷脂材料?！盎居?..組成”是指水解產(chǎn)物可以包含，例如，水，但是其不包含除如上所述的原材料組分和由其生成的水解物質(zhì)以外的脂質(zhì)組分。其不含殘留酶活性。V.示例性反應(yīng)程序下列反應(yīng)僅是示例性的，不是為了限制本發(fā)明。這些程序通常提及“卵磷脂”原材料；然而，如上所述，可以使用包含各種磷脂和甘油三酯量的原材料。例如，來自膜脫膠法的滲余物可以根據(jù)如上所述的分離條件包括大約10％至大約85％的磷脂。A.在水介質(zhì)中反應(yīng)；依次添加兩種酶將具有55％-75％丙酮不溶物(AI)含量的流體卵磷脂與占60％AI的0.1至10％，優(yōu)選大約5-8％的水和占60％AI的0.001至0.2％的磷脂酶A2合并。盡管所用酶的量取決于特定酶的活性，所用LecitaseTM的典型量為大約0.017％。如果需要，調(diào)節(jié)pH值至對(duì)酶有利的值，加入CaCl2以激活酶。可以使用過量CaCl2有效地使釋放的脂肪酸螯合。反應(yīng)在大約40-60℃進(jìn)行4至24小時(shí)。干燥后得到包含溶血卵磷脂的產(chǎn)物，其量由反應(yīng)時(shí)間和溫度和酶濃度決定。在該產(chǎn)物中加入占60％AI的0.001至0.2％，優(yōu)選0.1至0.2％的脂酶。如果需要，調(diào)節(jié)pH值至對(duì)酶有利的值，并加入CaCl2。反應(yīng)在大約40-60℃進(jìn)行4至24小時(shí)。干燥后得到包含溶血卵磷脂并還包含甘油單/二酯的卵磷脂產(chǎn)物，其量由反應(yīng)時(shí)間和溫度和酶濃度決定。優(yōu)選地，脂酶濃度和其它參數(shù)能有效地生產(chǎn)含有至少0.5wt％、至少1wt％、至少2.5wt％、至少5wt％、至少7.5wt％、至少10wt％、至少15wt％、至少20wt％、至少25wt％、至少30wt％、至少35wt％、至少40wt％或至少45wt％甘油單/二酯的水解產(chǎn)物。B.在有機(jī)溶劑中水解；依次添加兩種酶將作為膜脫膠法的滲余物(如美國專利6,207,209中所述)獲得的具有55％-80％丙酮不溶物(AI)含量的流體卵磷脂與可以固定化的占60％AI的0.001至0.2％的磷脂酶A2合并。如果需要，調(diào)節(jié)pH值至對(duì)酶有利的值，加入CaCl2以激活酶。可以使用過量CaCl2有效地使釋放的脂肪酸螯合。反應(yīng)在大約20-60℃進(jìn)行1至24小時(shí)?；厥展潭ɑ福稍锖蟮玫桨苎蚜字漠a(chǎn)物，其量由反應(yīng)時(shí)間和溫度和酶濃度決定。在該產(chǎn)物中加入可以固定化的優(yōu)選占60％AI的0.001至0.2％的脂酶。如果需要，調(diào)節(jié)pH值至對(duì)酶有利的值，并加入CaCl2。反應(yīng)在大約20-60℃進(jìn)行1至24小時(shí)?；厥展潭ɑ福稍锖蟮玫桨苎蚜字⑦€包含甘油單/二酯的卵磷脂產(chǎn)物，其量由反應(yīng)時(shí)間和溫度和酶濃度測(cè)定。在優(yōu)選實(shí)施方案中，在具有能有效地從反應(yīng)混合物中選擇性去除脂肪酸的組成和孔徑大小的膜存在下進(jìn)行反應(yīng)。優(yōu)選地，脂酶濃度和其它參數(shù)有效地生產(chǎn)含有至少0.5wt％、至少1wt％、至少2.5wt％、至少5wt％、至少7.5wt％、至少10wt％、至少15wt％、至少20wt％、至少25wt％、至少30wt％、至少35wt％、至少40wt％或至少45wt％甘油單/二酯的水解卵磷脂產(chǎn)物。轉(zhuǎn)化成甘油單/二酯的甘油三酯的摩爾百分比優(yōu)選為至少25％，更優(yōu)選至少50％，多達(dá)75％或更高。C.在有機(jī)溶劑中的水解；同時(shí)添加兩種酶將作為膜脫膠法的滲余物(如美國專利6,207,209中所述)獲得的具有55％-80％丙酮不溶物(AI)含量的流體卵磷脂與各自可以固定化的各自占60％AI的0.001至0.2％的磷脂酶A2和甘油三酯選擇性脂酶合并。如果需要，調(diào)節(jié)pH值至對(duì)酶有利的值，并加入CaCl2。反應(yīng)在大約20-60℃進(jìn)行1至24小時(shí)。在優(yōu)選實(shí)施方式中，在具有能有效地從反應(yīng)混合物中選擇性去除脂肪酸的組成和孔徑大小的膜存在下進(jìn)行反應(yīng)。回收固定化酶，干燥后得到包含溶血卵磷脂和甘油單/二酯的卵磷脂產(chǎn)物，各自的量由反應(yīng)時(shí)間和溫度和各自的酶濃度決定。優(yōu)選地，脂酶濃度和其它參數(shù)有效地生產(chǎn)含有至少0.5wt％、至少1wt％、至少2.5wt％、至少5wt％、至少7.5wt％、至少10wt％、至少15wt％、至少20wt％、至少25wt％、至少30wt％、至少35wt％、至少40wt％或至少45wt％甘油單/二酯的水解卵磷脂產(chǎn)物。轉(zhuǎn)化成甘油單/二酯的甘油三酯的摩爾百分比優(yōu)選為至少25％，更優(yōu)選至少50％，多達(dá)75％或更高。D.在水介質(zhì)中反應(yīng)；依次添加兩種酶(磷脂酶D和脂酶)將具有55％-75％丙酮不溶物(AI)含量的流體卵磷脂與占60％AI的0.1至10％的水和占60％AI的0.0001至0.5％的磷脂酶D合并。如果需要，調(diào)節(jié)pH值至對(duì)酶有利的值，加入CaCl2以激活酶。反應(yīng)在大約40-60℃進(jìn)行4至24小時(shí)。干燥后得到包含磷脂酸的產(chǎn)物，其量由反應(yīng)時(shí)間和溫度和酶濃度決定。在該產(chǎn)物中加入優(yōu)選占60％AI的0.001至0.2％的脂酶。如果需要，調(diào)節(jié)pH值至對(duì)酶有利的值，并加入CaCl2。反應(yīng)在大約40-60℃進(jìn)行4至24小時(shí)。干燥后得到包含磷脂酸并還包含甘油單/二酯的卵磷脂產(chǎn)物，其量由反應(yīng)時(shí)間和溫度和酶濃度決定。優(yōu)選地，脂酶濃度和其它參數(shù)能有效地生產(chǎn)含有至少0.5wt％、至少1wt％、至少2.5wt％、至少5wt％、至少7.5wt％、至少10wt％、至少15wt％、至少20wt％、至少25wt％、至少30wt％、至少35wt％、至少40wt％或至少45wt％甘油單/二酯的水解產(chǎn)物。轉(zhuǎn)化成甘油單/二酯的甘油三酯的摩爾百分比優(yōu)選為至少25％，更優(yōu)選至少50％，多達(dá)75％或更高。E.在水介質(zhì)中反應(yīng)；依次添加磷脂酶D、磷脂酶A2和脂酶)進(jìn)行如上文D中所述的方法的第一階段以提供包含磷脂酸的產(chǎn)物，其量由反應(yīng)時(shí)間和溫度和酶濃度決定。在該產(chǎn)物中加入占60％AI的0.001至0.2％的磷脂酶A2。如果需要，調(diào)節(jié)pH值至對(duì)酶有利的值，并加入CaCl2。反應(yīng)在大約40-60℃進(jìn)行4至24小時(shí)。干燥后得到包含溶血磷脂、溶血磷脂酸并任選包含磷脂酸的卵磷脂產(chǎn)物，其量由反應(yīng)時(shí)間和溫度和酶濃度決定。在該產(chǎn)物中加入占60％AI的0.001至0.2％，優(yōu)選0.1至0.2％的脂酶。如果需要，調(diào)節(jié)pH值至對(duì)酶有利的值，并加入CaCl2。反應(yīng)在大約40-60℃進(jìn)行4至24小時(shí)。干燥后得到包含溶血磷脂、溶血磷脂酸、任選包含磷脂酸并還包含甘油單/二酯的卵磷脂產(chǎn)物，其量由反應(yīng)時(shí)間和溫度和酶濃度決定。優(yōu)選地，脂酶濃度和其它參數(shù)能有效地生產(chǎn)含有至少0.5wt％、至少1wt％、至少2.5wt％、至少5wt％、至少7.5wt％、至少10wt％、至少15wt％、至少20wt％、至少25wt％、至少30wt％、至少35wt％、至少40wt％或至少45wt％甘油單/二酯的水解產(chǎn)物。轉(zhuǎn)化成甘油單/二酯的甘油三酯的摩爾百分比優(yōu)選為至少25％，更優(yōu)選至少50％，多達(dá)75％或更高。在使用磷脂酶D的反應(yīng)的變化形式中，在反應(yīng)混合物中與磷脂酶D一起包含選自乙醇胺、L-絲氨酸、肌醇或膽堿鹽的醇，以改變最終產(chǎn)物中磷脂的分布(即PE/PS/PI/PC比率)。F.在有機(jī)溶劑中水解；單酶將作為膜脫膠法的滲余物(如美國專利6,207,209中所述)獲得的具有20％-80％丙酮不溶物(AI)含量的流體卵磷脂與可以固定化的占60％AI的大約0.1至0.2％量的甘油三酯選擇性脂酶合并。如果需要，調(diào)節(jié)pH值至對(duì)酶有利的值，并加入CaCl2?？梢允褂眠^量CaCl2有效地使釋放的脂肪酸螯合。反應(yīng)在大約20-60℃進(jìn)行1至24小時(shí)。在優(yōu)選實(shí)施方式中，在具有能有效地從反應(yīng)混合物中選擇性去除脂肪酸的組成和孔徑大小的膜存在下進(jìn)行反應(yīng)?；厥展潭ɑ?，干燥后得到包含甘油單/二酯的卵磷脂產(chǎn)物，其量由反應(yīng)時(shí)間和溫度和各自的酶濃度決定。優(yōu)選地，脂酶濃度和其它參數(shù)有效地生產(chǎn)含有至少0.5wt％、至少1wt％、至少2.5wt％、至少5wt％、至少7.5wt％、至少10wt％、至少15wt％、至少20wt％、至少25wt％、至少30wt％、至少35wt％、至少40wt％或至少45wt％甘油單/二酯的水解卵磷脂產(chǎn)物。轉(zhuǎn)化成甘油單/二酯的甘油三酯的摩爾百分比優(yōu)選為至少25％，更優(yōu)選至少50％，多達(dá)75％或更高。VI.實(shí)施例下列實(shí)施例用于舉例說明而非限制本發(fā)明。酶的固定化可以如D.Adlercreutz等人，2002中所述那樣進(jìn)行酶的固定化。在下列實(shí)施例中使用兩種如下所述制備的共軛物。共軛物I如下將LecitaseUltra固定在MP1000(Membrana，AccurelSystems，Obernberg，Germany)上。使用25ml乙醇(95％)潤濕MP1000(3g)，并加入在350ml20mM磷酸鹽緩沖液(pH7)中的2.5mlLecitaseUltra(一種磷脂酶A)。在0℃攪拌1小時(shí)后，過濾分離固定化酶，并減壓干燥。共軛物II以類似方法，使用100ml乙醇(95％)潤濕MP1000(15g)，并加入在350ml20mM磷酸鹽緩沖液(pH7)中的7.5mlLecitaseUltra。在0℃攪拌1小時(shí)后，過濾分離固定化酶，并減壓干燥。實(shí)施例I用磷脂酶A使卵磷脂水解如在專利No.6,207,209中所述的來自膜脫膠法的具有55％-80％丙酮不溶物(AI)含量的流體卵磷脂滲余物如下再造將通過干燥這種滲余物獲得的106.4克卵磷脂(AI65.13，AV17.89mgKOH/克)和14.08克水溶解在564.5g己烷中。將該溶液(60ml)與200mg固定化LecitaseUltra(共軛物I，如上制備)合并。反應(yīng)在室溫下進(jìn)行20小時(shí)，并過濾回收固定化酶。干燥得到具有35.1mgKOH/g酸值和下列組成(通過酸值，P-NMR和GC)的產(chǎn)物17.8％脂肪酸、0.1％甘油單酯、0.6％甘油二酯、26.2％甘油三酯、42.0％磷脂和2.5％溶血磷脂。實(shí)施例II依次的雙酶反應(yīng)如專利6,207,209中所述來自膜脫膠法的具有55％-80％丙酮不溶物(AI)含量的流體卵磷脂滲余物如下再造將通過干燥這種滲余物獲得的106.4克卵磷脂(AI65.13，AV17.89mgKOH/g)和14.08g水溶解在564.5g己烷中。將該溶液(60ml)與200mg固定化LecitaseUltra(共軛物I，如上制成)合并。反應(yīng)在室溫下進(jìn)行20小時(shí)，并過濾回收固定化酶。在該濾液中加入20mgLipozyme。反應(yīng)在室溫下進(jìn)行4小時(shí)，并過濾回收固定化酶。干燥得到具有62.5mgKOH/g酸值和下列組成(通過酸值，P-NMR和GC)的產(chǎn)物31.5％脂肪酸、2.3％甘油單酯、5.7％甘油二酯、9.4％甘油三酯、30.8％磷脂和8.4％溶血磷脂。實(shí)施例III同時(shí)的雙酶反應(yīng)如專利6,207,209中所述來自膜脫膠法的具有55％-80％丙酮不溶物(AI)含量的流體卵磷脂滲余物如下再造將通過干燥這種滲余物獲得的106.4克卵磷脂(AI65.13，AV17.89mgKOH/g)和14.08g水溶解在564.5g己烷中。將該溶液(60ml)與200mg固定化LecitaseUltra(共軛物II，如上制成)和10mgLipozyme合并。反應(yīng)在室溫下進(jìn)行8小時(shí)，并過濾回收固定化酶。干燥得到具有54.3mgKOH/g酸值和下列組成(通過酸值，P-NMR和GC)的產(chǎn)物27.3％脂肪酸、3.8％甘油單酯、5.4％甘油二酯、3.1％甘油三酯、44.6％磷脂和1.9％溶血磷脂。實(shí)施例IV同時(shí)的雙酶反應(yīng)使用100mg共軛物II，而不是200mg，重復(fù)實(shí)施例III的程序。干燥得到具有下列組成(通過酸值，P-NMR和GC)的產(chǎn)物26％脂肪酸、3.6％甘油單酯、5.2％甘油二酯、3.1％甘油三酯、46％磷脂和1.1％溶血磷脂。實(shí)施例V同時(shí)的雙酶反應(yīng)使用400mg共軛物II，而不是200mg，重復(fù)實(shí)施例III的程序。干燥提供具有下列組成(通過酸值，P-NMR和GC)的產(chǎn)物30.8％脂肪酸、3.9％甘油單酯、4.3％甘油二酯、2.4％甘油三酯、43.6％磷脂和2.6％溶血磷脂。實(shí)施例VI用脂酶使卵磷脂水解如專利6,207,209中所述來自膜脫膠法的具有55％-80％丙酮不溶物(AI)含量的流體卵磷脂滲余物如下再造將通過干燥這種滲余物獲得的106.4g卵磷脂(AI65.13，AV17.89mgKOH/克)和14.08g水溶解在564.5g己烷中。將該溶液(60ml)與10mgLipozyme合并。反應(yīng)在室溫下進(jìn)行20小時(shí)，并過濾回收固定化酶。干燥得到具有52.1mgKOH/g酸值和下列組成(通過酸值，P-NMR和GC)的產(chǎn)物26.2％脂肪酸、4.0％甘油單酯、5.3％甘油二酯、3.8％甘油三酯、47.4％磷脂和0.8％溶血磷脂。下表I和II概括了上述反應(yīng)的結(jié)果。(PL＝磷脂；LPL＝溶血磷脂；TG＝甘油三酯；DG＝甘油二酯；MG＝甘油單酯；FA＝脂肪酸)。表I顯示了水解產(chǎn)物中組分的分布(按重量百分比計(jì))。表II顯示了水解產(chǎn)物中的甘油三酯、甘油二酯和甘油單酯(以硬脂酰甘油酯的分子量為基礎(chǔ))相對(duì)于這三種組分總量的近似摩爾比?？梢钥闯?，在除I外的所有實(shí)施例中，轉(zhuǎn)化成甘油單/二酯的甘油三酯的摩爾比為大約60％或更高，最高至大約85％。表I表IIVII.用途按照本發(fā)明制成的水解產(chǎn)物，包括水解卵磷脂產(chǎn)物，可用在已經(jīng)使用卵磷脂、水解卵磷脂、用甘油單/二酯加強(qiáng)營養(yǎng)的卵磷脂或相關(guān)產(chǎn)物的任何用途中。本發(fā)明的水解產(chǎn)物可以按照卵磷脂或水解卵磷脂配制領(lǐng)域已知的方法配制成這樣的產(chǎn)品。水解產(chǎn)物可用作例如乳化劑、表面活性劑、穩(wěn)定劑、脫模劑、潤濕劑、分散劑、潤滑劑、粘度控制劑、結(jié)晶劑、軟化劑、潤膚劑、防塵劑或高營養(yǎng)成分。可以使用水解產(chǎn)物的各種用途包括食品、飼料、技術(shù)、化妝品、和制藥/營養(yǎng)品用途。示例性食品用途包括巧克力、巧克力衍生物、面包、糖果、糖衣、奶制品、奶酪產(chǎn)品、食用面糊產(chǎn)品、人造黃油、起酥油、脂肪混合物、乳狀液、噴淋油、調(diào)味品、速溶可可、牛奶、非奶蛋白粉、脫模劑、湯、沙司、蛋黃醬、調(diào)味品、肉、肉汁、肉罐頭、人造肉(meatanalogues)、面包改良劑、飲料、能量飲料、小吃、餐后甜點(diǎn)(例如冰淇淋和冰棒)、膳食改良劑、，面包改良劑、口香糖、色料、香料混合物、乳化劑混合物、嬰兒食品和抗氧化劑。在具體實(shí)施例方式中，本發(fā)明的包含甘油單/二酯的水解卵磷脂產(chǎn)物可用于改進(jìn)烹調(diào)產(chǎn)品(例如人造黃油或起酥油)的防濺性能。本文所提供的這種產(chǎn)品優(yōu)選通過脂酶(單獨(dú)或與磷脂酶結(jié)合)將卵磷脂原材料水解形成。示例性飼料用途包括用于魚、蝦、小牛(作為代乳品)、豬、母豬、小豬、貂、家禽和寵物的飼料中具有高營養(yǎng)值的乳化劑和來源。示例性技術(shù)用途包括作為分散劑用在例如油漆、油墨、涂料、磁帶和磁盤中，作為軟化劑用在例如皮革和織物中，作為乳化劑用在例如莊稼保護(hù)和農(nóng)用化肥中，或用在潤滑劑、油、粘合劑、吸附劑、絮凝劑、防腐劑、陶瓷、玻璃、洗滌劑、金屬加工、紙產(chǎn)品、石油產(chǎn)品、影印、照相、聚合物、橡膠和織物中。示例性化妝品用途包括作為分散劑用在唇膏和指甲油中和作為乳化劑/穩(wěn)定劑用在香波、乳霜和乳液中。示例性制藥/營養(yǎng)品用途包括用作磷脂的天然來源，例如磷脂酰膽堿和維生素E。因此，本發(fā)明進(jìn)一步包括在如上所述的產(chǎn)品，特別是在食品中配制通過本文所述的任何本發(fā)明的方法制成的水解產(chǎn)物，特別是水解卵磷脂產(chǎn)物的方法。本發(fā)明還涉及包含通過本文所述的任何本發(fā)明的方法制成的水解產(chǎn)物，特別是水解卵磷脂產(chǎn)物的產(chǎn)品，尤其是食品。權(quán)利要求1.一種生產(chǎn)包含水解磷脂、甘油單酯和甘油二酯的水解產(chǎn)物的方法，該方法包括(a)使來自植物油的包含磷脂組分和甘油三酯組分的原材料在水或有機(jī)溶劑介質(zhì)中與第一酶接觸；和(b)隨后使步驟(a)的產(chǎn)物與第二酶接觸，第二酶與第一酶不同；其中所述酶之一是能有效地將所述磷脂水解的磷脂酶或脂酶，另一種是能有效地將所述甘油三酯水解的磷脂酶或脂酶。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述第二酶是脂酶。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述第一酶是磷脂酶。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述第一酶是磷脂酶A1和/或A2。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述原材料是由植物油的水或膜脫膠制得的卵磷脂材料。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述溶劑介質(zhì)是水溶劑。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述溶劑介質(zhì)包括有機(jī)溶劑。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述有機(jī)溶劑是烴溶劑。9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述原材料是來自植物油膜脫膠法的滲余物。10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述第一酶是磷脂酶D。11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，該方法進(jìn)一步包括在所述接觸步驟(b)之前使步驟(a)的產(chǎn)物與磷脂酶A1和/或A2反應(yīng)。12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述第一酶是磷脂酶C。13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述產(chǎn)物是包含至少50％丙酮不溶物的水解卵磷脂產(chǎn)物。14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述產(chǎn)物具有小于45mgKOH/g的酸值。15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述產(chǎn)物包含至少56％丙酮不溶物。16.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，該方法進(jìn)一步包括下列步驟(c)去除或鈍化所述酶；和(d)去除所述溶劑介質(zhì)。17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，該方法進(jìn)一步包括將所述水解產(chǎn)物配制到食品中。18.一種生產(chǎn)包含水解磷脂、甘油單酯和甘油二酯的水解產(chǎn)物的方法，該方法包括使包含磷脂組分和甘油三酯組分的原材料在非質(zhì)子有機(jī)溶劑中與第一和第二酶接觸，其中所述第一酶是能有效地將所述磷脂水解的磷脂酶或脂酶，且所述第二酶與所述第一酶不同，是能有效地將所述甘油三酯水解的脂酶或磷脂酶。19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中能有效地將所述甘油三酯水解的所述第二酶是脂酶。20.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述原材料與所述第一和第二酶同時(shí)接觸。21.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述原材料與所述第一和第二酶以任意順序依次接觸。22.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述第一酶是磷脂酶A1和/或A2。23.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述原材料是來自植物油膜脫膠法的滲余物。24.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述產(chǎn)物是包含至少56％丙酮不溶物并具有小于45mgKOH/g酸值的水解卵磷脂產(chǎn)物。25.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述非質(zhì)子有機(jī)溶劑是烴溶劑。26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中所述溶劑是己烷。27.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，該方法進(jìn)一步包括下列步驟(c)去除或鈍化所述酶；和(d)去除所述溶劑介質(zhì)。28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，該方法進(jìn)一步包括將所述水解產(chǎn)物配制到食品中。29.一種生產(chǎn)包含至少兩種選自磷脂、水解磷脂、甘油單酯、甘油二酯或甘油三酯的組分的水解產(chǎn)物的方法，該方法包括使包含磷脂組分和甘油三酯組分的原材料在有機(jī)溶劑介質(zhì)中與脂酶或磷脂酶C接觸，其中所述原材料是來自植物油膜脫膠法的滲余物。30.根據(jù)權(quán)利要求29的方法，其中所述酶是脂酶，且所述水解產(chǎn)物包含磷脂和甘油二酯。31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中所述水解產(chǎn)物進(jìn)一步包含甘油單酯。32.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中所述酶是磷脂酶C，且所述水解產(chǎn)物包含磷脂、甘油三酯和甘油二酯。33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，該方法進(jìn)一步包括使所述水解產(chǎn)物與磷脂酶A1和/或A2反應(yīng)。34.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中所述原材料是獲自植物油的水或膜脫膠的卵磷脂材料。35.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中所述產(chǎn)物是包含至少50％丙酮不溶物并具有小于45mgKOH/g酸值的水解卵磷脂產(chǎn)物。36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中所述水解卵磷脂產(chǎn)物包含至少56％丙酮不溶物。37.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，該方法進(jìn)一步包括下列步驟(c)去除或鈍化所述酶；和(d)去除所述溶劑介質(zhì)。38.根據(jù)權(quán)利要求37的方法，該方法進(jìn)一步包括將所述水解產(chǎn)物配制到食品中。39.一種生產(chǎn)包含磷脂、甘油單酯和甘油二酯的水解產(chǎn)物的方法，該方法包括使來自植物油的包含磷脂組分和甘油三酯組分的原材料在水溶劑中在不存在磷脂酶的情況下與脂酶接觸。40.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中所述原材料是獲自植物油的水或膜脫膠的卵磷脂材料。41.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中所述產(chǎn)物是包含至少50％丙酮不溶物并具有小于45mgKOH/g酸值的水解卵磷脂產(chǎn)物。42.根據(jù)權(quán)利要求41所述的方法，其中所述產(chǎn)物包含至少56％丙酮不溶物。43.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，該方法進(jìn)一步包括下列步驟(c)去除或鈍化所述酶；和(d)去除所述溶劑介質(zhì)。44.根據(jù)權(quán)利要求43的方法，該方法進(jìn)一步包括將所述水解產(chǎn)物配制到食品中。45.一種水解卵磷脂產(chǎn)物，其中所述產(chǎn)物包含水解磷脂、甘油單酯和甘油二酯，并通過根據(jù)權(quán)利要求16、27、37和43任一項(xiàng)所述的方法制成；其中所述產(chǎn)物基本由所述原材料的組分和由原材料通過所述酶的反應(yīng)獲得的水解物質(zhì)組成。46.根據(jù)權(quán)利要求45所述的產(chǎn)物，該產(chǎn)物包含至少50％丙酮不溶物并具有小于45mgKOH/g的酸值。47.根據(jù)權(quán)利要求46所述的產(chǎn)物，包含至少56％丙酮不溶物。全文摘要本發(fā)明涉及卵磷脂和相關(guān)材料的酶促改性法，和通過這種改性獲得的水解產(chǎn)物。一種具體實(shí)施方案提供了生產(chǎn)包含水解磷脂、甘油單酯和甘油二酯的水解產(chǎn)物的方法。例如，這種方法可以包括下列步驟(a)使原材料，例如包括磷脂組分和甘油三酯組分的卵磷脂，在水或有機(jī)溶劑介質(zhì)中與有效地將磷脂水解的第一酶接觸；和(b)隨后使步驟(a)的產(chǎn)物與有效地將甘油三酯水解的第二酶接觸。文檔編號(hào)C12P9/00GK1981046SQ200580014814公開日2007年6月13日申請(qǐng)日期2005年4月7日優(yōu)先權(quán)日2004年4月9日發(fā)明者H·施米特,M·海爾曼,F·布魯澤,M·施奈德,J·范德希波申請(qǐng)人:嘉吉公司