專利名稱：與可調(diào)流式電穿孔室相關(guān)的方法和裝置的制作方法
與可調(diào)流式電穿孔室相關(guān)的方法和裝置
背景技術(shù)：
本申請(qǐng)要求2004年5月12日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)序列號(hào)60/570,317的優(yōu)
先權(quán)，該申請(qǐng)已完整納入本文作為參考。
I. 發(fā)明領(lǐng)域
本發(fā)明涉及用瞬時(shí)電場處理細(xì)胞的領(lǐng)域，更具體涉及細(xì)胞的電穿孔。更具體地 說，本發(fā)明涉及用于可調(diào)流式電穿孔(flow electroporation)的方法、電穿孔室及相關(guān)裝置。
II. 相關(guān)領(lǐng)域的描述
自從1970年代早期開始電穿孔就被用于將分子插入到動(dòng)物或植物細(xì)胞內(nèi)。研究 者證實(shí)，細(xì)胞暴露于短暫持續(xù)的高壓電場中可導(dǎo)致細(xì)胞膜上形成通道，分子，其中 包括大分子如蛋白質(zhì)和DNA，可通過該通道進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。這些通道被稱為電孔洞 (electropore)，是由高壓電場造成的細(xì)胞膜局部破裂引起的通透性升高區(qū)。這些孔洞 存在的時(shí)間雖然短暫，但是足以滿足大分子如質(zhì)粒DNA分子進(jìn)入細(xì)胞的需要。細(xì)胞 雖然能夠耐受這些孔洞的形成，但是，如果形成的孔洞過多，其產(chǎn)生的過程以及由 此導(dǎo)入的分子也可能會(huì)殺死細(xì)胞。由于這種電穿孔過程會(huì)導(dǎo)致電流(雖然短暫)通過傳 導(dǎo)性的細(xì)胞懸液，因此，根據(jù)焦耳定律電極會(huì)產(chǎn)生熱量。這種熱量可使細(xì)胞懸液的 溫度升高，如果熱量過多，會(huì)使細(xì)胞的溫度升高到足以導(dǎo)致細(xì)胞死亡的程度。初期 進(jìn)行電穿孔時(shí)用的是特殊的容器，其中有彼此相對(duì)的電極，二者之間可產(chǎn)生基本均 勻的電場。最方便的是用兩個(gè)平板電極，分別固定在矩形容器或矩形室相對(duì)的兩個(gè) 壁上。將準(zhǔn)備進(jìn)行電穿孔的細(xì)胞懸液與操作者希望將其導(dǎo)入到細(xì)胞內(nèi)的分子混合， 加入到容器或室內(nèi)，然后將其置于兩個(gè)電極之間，這樣細(xì)胞懸液就會(huì)混入到與電極 接觸的液體中。為了影響分子通過電穿孔導(dǎo)入到細(xì)胞內(nèi)的效果，在電極上通以一次 或多次短時(shí)間的高壓電場脈沖，從而對(duì)電極之間的細(xì)胞懸液施以高壓電場脈沖。目 甜市場上最常見的電穿孔容器的容積都有限，每次處理的細(xì)胞懸液量很小(通常低于 1 ml)。如果每次加入到容器內(nèi)進(jìn)行電穿孔的細(xì)胞量很小，那么對(duì)大體積的細(xì)胞懸液進(jìn)行電穿孔就是不切實(shí)際的。
一般來說，對(duì)大體積的細(xì)胞進(jìn)行電穿孔必須保持無菌。重復(fù)在容器內(nèi)加樣以及 混合集中電穿孔的細(xì)胞是不可能保持無菌的。雖然這種電穿孔法方便而簡單，能夠 滿足許多研究者進(jìn)行小規(guī)模細(xì)胞電穿孔的要求，但是，還需要尋找其他的方法，特 別是能夠方便地對(duì)大體積的細(xì)胞進(jìn)行電穿孔，同時(shí)又能保持無菌環(huán)境的方法。在封 閉的無菌環(huán)境內(nèi)對(duì)大體積的細(xì)胞進(jìn)行電穿孔可使電穿孔用于人類的細(xì)胞治療。因此， 在整個(gè)操作過程中能形成并保持封閉的無菌流動(dòng)通路的方法和裝置是我們最需要 的。
在20世紀(jì)80年代，有一些研究者開始研究用于處理大體積細(xì)胞的流式電穿孔 法(美國專利4,752,586， 5,612,207， 6,074,605， 6,090,617，本文都已完整納入作為參 考)。 一般來說，用于電穿孔的流動(dòng)裝置包含兩個(gè)平行電極，要進(jìn)行電穿孔的細(xì)胞懸 液持續(xù)而穩(wěn)定地流過兩個(gè)電極之間，直到整個(gè)細(xì)胞懸液都進(jìn)行了電穿孔。在細(xì)胞懸 液穩(wěn)定地流過兩個(gè)電極之間時(shí)，高壓脈沖被施加到細(xì)胞上。在電極上重復(fù)施加高壓 脈沖會(huì)導(dǎo)致熱量的產(chǎn)生，因此必須通過冷卻裝置將熱量帶走，防止電極和細(xì)胞懸液 的溫度過高。流式電穿孔裝置包含帶電極和接口的電穿孔室，細(xì)胞懸液可通過接口 注入。電極與能給電極提供高壓脈沖的電路相連。高壓脈沖由程序控制計(jì)算機(jī)控制。 現(xiàn)在已開發(fā)出了流式電穿孔系統(tǒng)，該系統(tǒng)能夠?qū)^大體積的細(xì)胞進(jìn)行電穿孔，能夠 制備出已導(dǎo)入目的分子的活細(xì)胞。
電穿孔的條件因細(xì)胞類型的不同而不同，還因期望導(dǎo)入到細(xì)胞內(nèi)的分子的類型 不同而不同。對(duì)于任何一個(gè)特定類型的細(xì)胞來說，都存在一個(gè)最佳的處理?xiàng)l件，其 中包括最佳電壓的最佳脈沖次數(shù)以及以最佳間隔時(shí)間進(jìn)行脈沖的持續(xù)時(shí)間。為了使 施加到細(xì)胞上的電脈沖次數(shù)達(dá)到最佳，在使用本領(lǐng)域所描述的流式電穿孔裝置吋， 細(xì)胞懸液通過電穿孔室、在電極之間的流速以及脈沖的速率都是可以選擇的，從而 對(duì)一定體積的細(xì)胞懸液進(jìn)行最佳次數(shù)的脈沖。例如，對(duì)于一個(gè)特定細(xì)胞來說，如果 已知每個(gè)細(xì)胞上施加的最佳脈沖數(shù)是2，通過電穿孔室的體積是1 ml，那么，流速 就設(shè)定為每一單位時(shí)間1 ml，每一單位時(shí)間內(nèi)施加的脈沖次數(shù)為2。如果以這種方 式進(jìn)行電穿孔，在這個(gè)例子中每個(gè)細(xì)胞就會(huì)受到2次脈沖。但是，細(xì)胞懸液通過電 穿孔室的水動(dòng)力學(xué)流動(dòng)不會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞以相同的速率通過室以及在電極之間流動(dòng)。由 于離室壁遠(yuǎn)的地方比靠近室壁的地方流速高，因此，在電極之間向液流中心流動(dòng)的 細(xì)胞通過電極之間的區(qū)域所需要的時(shí)間會(huì)低于單位時(shí)間，其受到的脈沖次數(shù)可能會(huì) 少于2次，而靠近室壁流動(dòng)的細(xì)胞通過電極之間的區(qū)域所需要的時(shí)間會(huì)高于單位時(shí)間，其受到的脈沖次數(shù)可能高于2次。由于在這個(gè)例子中每個(gè)細(xì)胞受到的最佳脈沖 次數(shù)為2次，但是，很明顯并不是每個(gè)細(xì)胞都受到了最佳次數(shù)的脈沖，因此，細(xì)胞 懸液的整體電穿孔效果就不是最佳的。
如上所述，按照焦耳定律，電穿孔必然會(huì)在細(xì)胞懸液內(nèi)產(chǎn)生熱量。由于在流式 電穿孔法中液流是穩(wěn)定而持續(xù)的，其產(chǎn)生的熱量也是持續(xù)的，因此，從電穿孔室中 帶走熱量的裝置必須能夠平衡產(chǎn)生的熱量從而避免電穿孔室的溫度上升到不可接受 的程度。在兩次電穿孔之間進(jìn)行冷卻吋這個(gè)過程可以不保持連續(xù)性。
如上文所討論的，電穿孔的最佳條件根據(jù)電穿孔的特定細(xì)胞類型以及想要通過 電穿孔導(dǎo)入到細(xì)胞內(nèi)的分子類型的不同而不同。利用試驗(yàn)的方法解決這個(gè)問題是可 能的，利用靜態(tài)的室有組織地改變電穿孔的條件，然后將確定于這些試驗(yàn)的最佳條 件應(yīng)用到流式電穿孔系統(tǒng)中。這個(gè)方法有兩個(gè)缺點(diǎn)。第一，由于進(jìn)行大量樣品的靜 態(tài)室電穿孔需要耗費(fèi)大量的時(shí)間，因此，用于每次靜態(tài)電穿孔的細(xì)胞在試驗(yàn)中也會(huì) 發(fā)生改變。第二，使用這種方法只是因?yàn)槿藗冋J(rèn)為靜態(tài)室電穿孔的最佳條件與流式 電穿孔是一樣的，但是并不知道這是否真實(shí)。我們期望的是利用一個(gè)細(xì)胞樣品就能 夠確定使用同一個(gè)裝置進(jìn)行所有電穿孔試驗(yàn)的最佳條件，這個(gè)條件可用于治療或其 他目的所需的細(xì)胞大規(guī)模電穿孔。
某些分子，其中最明顯的是mRNA，在人們期望通過電穿孔將分子導(dǎo)入其內(nèi)的 細(xì)胞內(nèi)是不穩(wěn)定的。對(duì)于mRNA來說，這可能是由細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)或細(xì)胞表面上存在 的核酶造成的。在這種情況下，我們希望分子在被導(dǎo)入到細(xì)胞內(nèi)前處于此不穩(wěn)定條 件下的時(shí)間縮短到最短。在利用靜態(tài)室進(jìn)行電穿孔時(shí)，分子(如，mRNA)與細(xì)胞混合， 然后手工加到室內(nèi)，液體一旦注入到電穿孔裝置內(nèi)就馬上進(jìn)行電穿孔。在進(jìn)行這些 手工操作步驟期間，粘附到細(xì)胞上的某些分子可能被破壞。在電穿孔前立刻使被導(dǎo) 入分子與細(xì)胞在封閉的無菌環(huán)境中自動(dòng)混合的方法是我們所期望的。
在本領(lǐng)域所描述的持續(xù)流動(dòng)系統(tǒng)中，除了在電極上施加脈沖的時(shí)間與細(xì)胞在電 極之間開始流動(dòng)的吋間需要協(xié)調(diào)之外，脈沖與細(xì)胞流動(dòng)之間不需要"期間處理"的 協(xié)調(diào)。
既有持續(xù)流式電穿孔的優(yōu)點(diǎn)，特別是能在無菌封閉系統(tǒng)內(nèi)對(duì)大體積的細(xì)胞進(jìn)行 電穿孔，又能保證每個(gè)細(xì)胞都受到最佳次數(shù)的脈沖的方法和裝置是我們所期望的。
發(fā)明概述
本發(fā)明的實(shí)施方式包括電穿孔法以及能進(jìn)行大體積電穿孔的相關(guān)電穿孔裝置和設(shè)備。在某些方面，本發(fā)明能平衡熱量的產(chǎn)生以避免室的溫度升高到不可接受的程 度。另外，電脈沖可以被優(yōu)化以處理單位體積的目的樣品和/或處理全部或部分目的 樣品。本文所用的術(shù)語"單位體積"或"單位"是指灌滿或部分灌滿電穿孔室所需 的樣品或液體的體積。 一個(gè)單位一般是指暴露于一個(gè)特定電脈沖或一系列電脈沖的 一部分樣品。每一個(gè)單位都可以被稱為樣品的一個(gè)部分。單位可由操作者確定，并 且可以通過注入或排出電穿孔室或者通過改變液體流過室的速率來調(diào)整單位的大 小。每個(gè)單位都可以是樣品的不連續(xù)部分，通過在兩個(gè)或多個(gè)樣品單位之間加入非 樣品氣體或液體。在許多實(shí)施方式中，樣品的處理可在閉合系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行，即，限制 外部環(huán)境接觸裝置或設(shè)備容器的內(nèi)部、流動(dòng)通路和電穿孔裝置的室的系統(tǒng)。這種封 閉系統(tǒng)可用于保持無菌和樣品的完整性。
本發(fā)明的實(shí)施方式包括流式電穿孔處理方法，該方法包括調(diào)節(jié)樣品流過電穿孔 室的速率。 一般來說，樣品以單位的形式處理，該單位是由重復(fù)循環(huán)注滿或排出電 穿孔室而產(chǎn)生的。循環(huán)通過電穿孔室的每一個(gè)樣品單位都暴露在相同或不同的電脈 沖或條件下。在某些方面，樣品的單位是通過在未處理和已處理的樣品體積之間設(shè) 置一個(gè)邊界而形成的。邊界可將非樣品氣體或液體循環(huán)到兩個(gè)或多個(gè)樣品單位或部 分之間的室內(nèi)而提供。非樣品氣體或液體一般由一定體積的未處理樣品置換出室。 可通過從電穿孔室中排出已處理的樣品、將樣品主動(dòng)泵入電穿孔室、將非樣品液體 或氣體主動(dòng)泵入電穿孔室或上述過程的組合使非樣品液體或氣體流入電穿孔室。
"泵送"是指提供一個(gè)壓力梯度從而給液體或氣體施加一個(gè)運(yùn)動(dòng)力。例如，這 種運(yùn)動(dòng)力可由重力或被泵入液體的表面張力所產(chǎn)生的力來提供。給氣體或液體施加 運(yùn)動(dòng)力的裝置，特別是給細(xì)胞懸液施加運(yùn)動(dòng)力的裝置，被稱為泵裝置。泵裝置包括 在系統(tǒng)內(nèi)產(chǎn)生壓力差以調(diào)節(jié)液體或氣體在流動(dòng)通路內(nèi)流動(dòng)速度的各種機(jī)器。己知的 各種泵裝置包括而不限于旋轉(zhuǎn)泵、擺動(dòng)泵、離心泵、空運(yùn)泵或噴射泵。泵裝置可包 括活塞、蠕動(dòng)裝置、橫隔膜、體積可變的容器、壓縮氣體、螺旋輥、渦輪、螺絲、 齒輪傳動(dòng)型機(jī)械以產(chǎn)生可調(diào)節(jié)的液體或氣體流。
在某些特殊的方面，循環(huán)是通過改變樣品流過電穿孔室的1、 2、 3、 4或更多接
口的速度來產(chǎn)生的。"接口"是指液體流入或流出電穿孔室所通過的開口。應(yīng)當(dāng)考慮 的是，電穿孔室可以作為歧管(manifold)來引導(dǎo)液體的流動(dòng)，但是其他實(shí)施方式可以 使用，可以使用或不使用不作為電穿孔室一部分的歧管。樣品或非樣品液體或氣體 的循環(huán)一般由l、 2、 3、 4、 5、 6或更多個(gè)泵裝置、閥門或其他液體調(diào)節(jié)裝置的不同 組合來調(diào)節(jié)。在一個(gè)實(shí)施例中，邊界可通過將樣品滴過室來提供，其中樣品滴在通過兩個(gè)電極之間時(shí)暴露于一個(gè)或多個(gè)電脈沖之下。
本發(fā)明的其他實(shí)施方式包括流式電穿孔室，該電穿孔室包含帶至少兩個(gè)電極和
至少3個(gè)接口的室，其中，(i)第一接口用于樣品流入室；(ii)第二接口用于已處理樣 品流出室；和(iii滯三接口用于非樣品液體或氣體流入或流出室，其中，在樣品流入 室時(shí)非樣品液體或氣體流出室，在樣品流出室時(shí)非樣品液體或氣體流入室。第一接 口與一個(gè)或多個(gè)樣品容器形成流體連通。第二接口與一個(gè)或多個(gè)已處理樣品容器形 成流體連通。第三接口與一個(gè)儲(chǔ)存容器形成流體連通，其中當(dāng)室注滿或部分注滿樣 品時(shí)儲(chǔ)存容器內(nèi)盛有全部或部分非樣品液體或氣體。在某些實(shí)施方式中，室至少有 四個(gè)接口。第四接口與樣品容器、已處理樣品容器、非樣品氣體或液體儲(chǔ)器、試劑 容器(如洗滌緩沖液、清洗溶液、冷卻溶液等)或上述容器的組合形成流體連通。
在其他實(shí)施方式中，流式電穿孔裝置包含通過第一室接口與電穿孔室發(fā)生流體 連通從而形成第一流動(dòng)通路的至少1、 2、 3、 4或更多個(gè)樣品容器；通過第二室接口 與電穿孔室發(fā)生流體連通從而形成第二流動(dòng)通路的至少1、 2、 3、 4或更多個(gè)已處理 樣品容器；以及通過第三室接口與電穿孔室發(fā)生流體連通從而形成第三流動(dòng)通路的 至少一個(gè)非樣品液體或氣體儲(chǔ)器。非樣品氣體或液體儲(chǔ)器可以是非樣品氣體或液體 容器、樣品容器的一部分、已處理樣品容器的一部分、電穿孔室的'部分、或其不 同組合。第二流動(dòng)通路可以和第一流動(dòng)通路的一個(gè)或多個(gè)樣品容器及第三流動(dòng)通路 的非樣品儲(chǔ)存容器形成流體連通，后者相對(duì)于第二流動(dòng)通路的已處理樣品容器來說 處于電穿孔室的遠(yuǎn)處。在某些方面，裝置還包含可操控地連接到至少1、 2、 3、 4或 更多個(gè)流動(dòng)通路上的至少1、 2、 3、 4或更多個(gè)泵。樣品容器、已處理樣品容器、非 樣品液體或氣體儲(chǔ)器或上述容器的不同組合可以是可折疊的、可擴(kuò)張的或固定體積 的容器。在本發(fā)明的其他方面，裝置內(nèi)的液流可由裝置的1、 2、 3、 4、 5、 6或更多 流動(dòng)通路的開放或閉合來控制。不同流動(dòng)通路可交替開放和閉合，優(yōu)選的是從樣品 容器到電穿孔室的流動(dòng)通路和從已處理容器到電穿孔室的流動(dòng)通路交替開放和閉 合，其中，在電穿孔循環(huán)期間二者不會(huì)同時(shí)開放。液流可由1、 2、 3、 4、 5、 6或更 多個(gè)閥門，1、 2、 3、 4、 5、 6或更多個(gè)泵裝置，或者上述裝置的不同組合來控制。 在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，泵是蠕動(dòng)泵，更優(yōu)選的是，蠕動(dòng)泵是全壓縮蠕動(dòng)泵。
在其他的實(shí)施方式中，流式電穿孔裝置可包含通過第一室接口與電穿孔室形成 流體連通的至少l、 2、 3、 4或更多個(gè)樣品容器和通過第二室接口與樣品容器形成流 體連通的電穿孔室，形成第一流動(dòng)通路；至少l、 2、 3、 4或更多個(gè)已處理樣品容器 通過第三室接口與電穿孔室形成流體連通，電穿孔室通過第四室接口與已處理樣品
10容器形成流體連通，形成第二流動(dòng)通路。1、 2、 3、 4或更多個(gè)已處理樣品容器還可 作為非樣品氣體或液體儲(chǔ)存容器。在某些方面，非樣品氣體或液體儲(chǔ)存容器與樣品 容器或已處理樣品容器結(jié)合在一起，或者和二者都結(jié)合在一起。裝置還可以包含可 操控地連接到至少1、 2、 3、 4、 5、 6或更多個(gè)流動(dòng)通路上的至少1、 2、 3、 4或更 多個(gè)泵裝置。樣品容器、已處理樣品容器或者二者都可以是可折疊的、可擴(kuò)張的或 固定體積的容器。在許多方面，裝置內(nèi)的液流是由裝置的一個(gè)或多個(gè)流動(dòng)通路的開 放或閉合來控制的。在某些實(shí)施方式中，第一和第二流動(dòng)通路交替開放和閉合。液 流通常由一個(gè)或多個(gè)泵裝置調(diào)節(jié)或控制，優(yōu)選的是泵，更優(yōu)選的是蠕動(dòng)泵，更優(yōu)選 的是全壓縮蠕動(dòng)泵。液流還可由閥門、泵裝置或其組合的不同組合來調(diào)節(jié)或控制。
應(yīng)當(dāng)注意的是，本文描述的所有方法或組合物的實(shí)現(xiàn)都與本文所描述的其他方 法或組合物有關(guān)。
單詞"一"或"一個(gè)"與權(quán)利要求和/或說明書中的術(shù)語"包含"連用時(shí)是指"一 個(gè)"，但是也可以指"一個(gè)或多個(gè)"、"至少一個(gè)"、以及"一個(gè)或一個(gè)以上"。
權(quán)利要求中所用的術(shù)語"或"的意思是"和/或"，除非明確地指出只表示二者 選一，或者二者是互相排斥的，盡管說明書支持只是二者選一和"和/或"的定義。
本發(fā)明的其他目的、特征和優(yōu)點(diǎn)通過閱讀下面的詳細(xì)說明就可以清楚。但是應(yīng) 當(dāng)理解的是，詳細(xì)描述和特定的實(shí)施例在用于說明本發(fā)明的特殊實(shí)施方式的同時(shí)， 只是以說明的方式提供，因?yàn)楸绢I(lǐng)域的技術(shù)人員通過閱讀這個(gè)詳細(xì)說明就可以清楚 地理解本發(fā)明精神和范圍內(nèi)的各種改變和修飾。
附圖簡述
下面的附圖構(gòu)成了本說明書的一部分，用于進(jìn)一步證明本發(fā)明的某些方面。通 過參考這些附圖中的一個(gè)或多個(gè)并結(jié)合本文所提供的特殊實(shí)施方式的詳細(xì)描述可以 更好地理解本發(fā)明。


圖1是電穿孔過程一個(gè)典型循環(huán)的示意圖。
圖2是電穿孔過程第一典型構(gòu)成的示意圖。
圖3是電穿孔過程第二典型構(gòu)成的示意圖。
圖4是電穿孔過程第三典型構(gòu)成的示意圖。
圖5是電穿孔室的一個(gè)實(shí)施方式的圖解。
圖6是電穿孔室的一個(gè)實(shí)施方式的分解圖。
圖7是電穿孔室的另一個(gè)實(shí)施方式的分解圖。圖8是本發(fā)明電穿孔室的另一個(gè)公開實(shí)施方式的透視圖。
圖9是本發(fā)明電穿孔室的另一個(gè)公開實(shí)施方式的分解透視圖。
圖10是安裝到電穿孔裝置內(nèi)的電穿孔室的示意圖。
圖11描述的是Jurkat細(xì)胞在電穿孔后24小時(shí)進(jìn)行碘化丙錠(PI)和GFP熒光分
析的結(jié)果。
圖12A-12C描述的是Jurkat細(xì)胞在電穿孔后24小時(shí)通過FACS分析得到的熒光 強(qiáng)度直方圖。圖12A是對(duì)照轉(zhuǎn)染。圖12B是400 pL靜態(tài)轉(zhuǎn)染。圖12C是100 mL可 變流式轉(zhuǎn)染(flow transfection)。
圖13描述的是連續(xù)循環(huán)的電穿孔所收集的各個(gè)組分的分析結(jié)果。 圖14描述的是包含活塞型泵裝置的本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式。 圖15描述的是一個(gè)封閉的一次性單沖程泵送系統(tǒng)。
說明性實(shí)施方式的描述
本發(fā)明的實(shí)施方式包括用于電穿孔的各種新型設(shè)備和方法。更具體地說，某些 實(shí)施方式提供了用于將分子、化合物或組合物導(dǎo)入到細(xì)胞或細(xì)胞組分內(nèi)的流式電穿 孔裝置和方法，其中的細(xì)胞或細(xì)胞組分包括而不限于細(xì)菌、真菌、植物細(xì)胞、動(dòng)物 細(xì)胞、培養(yǎng)的細(xì)胞、原代細(xì)胞、紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板、干細(xì)胞、基因改造的干 細(xì)胞或干細(xì)胞的擴(kuò)增群。在某些方面，瞬時(shí)高壓電場如果使用太高的電壓或持續(xù)時(shí) 間過長會(huì)打亂細(xì)胞的代謝及殺死某些細(xì)胞。由于不同類型的細(xì)胞在用瞬時(shí)電場處理 時(shí)所受到的瞬吋電場的影響是不同的，例如通過電穿孔將分子加載或?qū)氲郊?xì)胞內(nèi) 的那些電場，因此，不同的細(xì)胞所受到的殺傷是不同的，因而某些細(xì)胞可能被從細(xì) 胞群中清除。在另外一些方面，分子不需要被導(dǎo)入，但是樣品通過暴露到電場中進(jìn) 行處理。在另外的實(shí)施方式中，目的不是將外源分子導(dǎo)入到細(xì)胞內(nèi)，而是修飾被處 理的細(xì)胞，即，在暴露到電場中之前、期間或之后使細(xì)胞接觸某些其他的藥理試劑 或條件一殺死是修飾的極端例子。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的裝置將進(jìn)行細(xì)胞 電穿孔的電穿孔室與裝置內(nèi)細(xì)胞懸液的可調(diào)流動(dòng)或可變流動(dòng)組合在一起，這種裝置 P了使電穿孔室的重復(fù)注入和排空與電脈沖互相協(xié)調(diào)。優(yōu)選的是，室與其相關(guān)的流動(dòng) 通路和容器形成一個(gè)閉合無菌環(huán)境。本發(fā)明的其他優(yōu)點(diǎn)包括裝置能夠提供更均勻的 細(xì)胞脈沖。這種新型可調(diào)流式電穿孔室以單位體積的形式對(duì)細(xì)胞懸液進(jìn)行電穿孔。 各個(gè)組分或單位體積由流過電穿孔室的樣品體積決定，其間由非樣品氣體或液體物 理分隔，或者由其他方式如閥門的開放和閉合將其彼此分隔。樣品體積之間的分隔有利于分別收集每一獨(dú)立的體積，其中連續(xù)體積的樣品可能不會(huì)經(jīng)歷相同的電穿孔 條件，或者其中連續(xù)體積的樣品可能會(huì)包含細(xì)胞和分子的不同組合來進(jìn)行電穿孔加
載。應(yīng)當(dāng)注意的是，本發(fā)明的方法和裝置，其中包括電穿孔室，可用于包裹各種細(xì) 胞群內(nèi)的各種物質(zhì)，也可用于使細(xì)胞暴露于已包含、正包含或?qū)幚碓噭┗驐l 件的電場中。暴露于電場本身就是對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理。
木發(fā)明的某些實(shí)施方式包括處理方法，其中有可調(diào)液流或氣流通過室。因此， 這個(gè)處理方法被稱為連續(xù)流。但是，在某些實(shí)施方式中，樣品流或已處理樣品流在 處理過程中流速可以減緩或停止，這樣，液流或氣流作為一個(gè)整體而不是作為特定 的樣品、液體或氣體流過室被描述為連續(xù)流。電穿孔過程一般包含流過室的樣品流， 其中的樣品以固定體積的部分或單位體積的形式被處理。在細(xì)胞懸液的兩個(gè)部分進(jìn) 行電穿孔的間歇期由流入電穿孔室的非樣品液體或氣體將樣品分隔成獨(dú)立的不同組 分。
在某些實(shí)施方式中，樣品可被分成多個(gè)組分。另外，每個(gè)被處理的樣品組分可 以被分別分類、收集和/或儲(chǔ)存或分成特定的組。產(chǎn)物或已處理樣品組分可以是幾個(gè) 已處理樣品的混合物或者一次一個(gè)。在本發(fā)明中沒有任何事情可干擾本技術(shù)的使用 者用一個(gè)樣品部分填滿室，然后加入其他溶液，進(jìn)行電穿孔，并收集得到的產(chǎn)物。
在本發(fā)明的某些方面，不同樣品組分可暴露于不同的脈沖或試劑中。例如，開 始時(shí)全部或部分樣品或同一組合物的一個(gè)樣品用一個(gè)范圍的條件處理以便于快速地 確定最佳的電穿孔條件。另外，使用者可以希望得到細(xì)胞群或細(xì)胞的不同組分，其 中包含已暴露于各種電穿孔條件下的細(xì)胞。
在某些實(shí)施方式中，"在線混合"樣品組分也是可以考慮的。例如，某些試劑可 能對(duì)電穿孔混合物中的細(xì)胞或其他電穿孔靶標(biāo)或試劑不穩(wěn)定或有害。因此，我們希 望在進(jìn)行電脈沖前臨時(shí)加入這些組分，即，不要提前混合，或者不要只在電穿孔前 的短時(shí)間內(nèi)混合電穿孔樣品的一個(gè)或多個(gè)組分。
本發(fā)明的其他實(shí)施方式包括新型可調(diào)流式電穿孔室，該電穿孔室可使細(xì)胞可調(diào) 節(jié)地流入和流出電穿孔室，這樣，細(xì)胞在接受高壓脈沖時(shí)流入或流出室的速率要低 于脈沖間隙或系列脈沖時(shí)。細(xì)胞的流速不需要降低到0以體現(xiàn)可調(diào)流的優(yōu)勢，但是 在電穿孔期間降低流速是我們所期望的。本發(fā)明的實(shí)施方式還可以暫時(shí)協(xié)調(diào)為電極 提供高壓脈沖的電子元件和使細(xì)胞懸液在電極之間流動(dòng)的裝置。使細(xì)胞懸液流動(dòng)的 裝置(給液體氣體提供運(yùn)動(dòng)力)是指泵裝置。泵裝置包括在系統(tǒng)內(nèi)產(chǎn)生壓力差以調(diào)節(jié)液 體或氣體在流動(dòng)通路內(nèi)的流速的各種機(jī)器。已知的泵裝置包括而不限于重力泵、旋
13轉(zhuǎn)泵、擺動(dòng)泵、離心泵、空運(yùn)泵或噴射泵，泵還可以包括活塞、蠕動(dòng)裝置、橫隔膜、 體積可變的容器、壓縮氣體、螺旋輥、渦輪、螺絲或齒輪傳動(dòng)型機(jī)械以產(chǎn)生可調(diào)節(jié) 的液體或氣體流。
本發(fā)明還提供了可方便地在細(xì)胞懸液進(jìn)行電穿孔的間歇期內(nèi)冷卻電穿孔室的裝 置。向電穿孔室內(nèi)注入細(xì)胞懸液與從電穿孔室中排出細(xì)胞懸液之間的時(shí)間間隔是可 以調(diào)節(jié)的，以確保在對(duì)細(xì)胞懸液進(jìn)行電穿孔前電穿孔室的溫度不耍高于某個(gè)特定溫度。
與本文所描述的主要原則一致的對(duì)基本設(shè)計(jì)的其他修改也包括在本發(fā)明之內(nèi)。 在各種實(shí)施方式中，樣品和產(chǎn)物管道或流動(dòng)通路只與室的空腔匹配，即，室可作為 樣品流動(dòng)的歧管存在，在新的樣品組分達(dá)到前室可完全或部分排空。本文所用的術(shù) 語"流動(dòng)通路"是指組件或部件的集成，通過隧道、管道、導(dǎo)管或通路的形式進(jìn)行 流體連通，流體如液體或氣體可通過該通路。本文所用的術(shù)語"流體連通"是指流 動(dòng)通路的兩個(gè)或多個(gè)部件之間直接或間接的功能性連接，該聯(lián)通可使液體在部件之 間及流動(dòng)通路內(nèi)流動(dòng)。例如，如果液體能從樣品容器流到室內(nèi)，那么就可以說樣品 容器與室有"流體連通"。
一個(gè)可產(chǎn)生流體連通的流動(dòng)通路的例子是包括一個(gè)容器和-個(gè)室的通路，二者 之間由帶一個(gè)裝置的管道相連，該裝置用于調(diào)節(jié)液體或氣體流過通路的速率，這種 裝置包括一個(gè)全壓縮蠕動(dòng)泵或者一個(gè)位于容器和室之間的閥門。調(diào)節(jié)裝置可操控地 連接到容器和室之間的任何位置上。術(shù)語"可操控地連接"與流速調(diào)節(jié)裝置連用時(shí) 是指調(diào)節(jié)裝置與液體或氣體之間的直接或間接聯(lián)通，這樣可以某種方式調(diào)節(jié)液體或 氣體的流速，如允許流動(dòng)或禁止流動(dòng)。調(diào)節(jié)裝置不一定和液體或氣體直接接觸，如， 可彎曲管上的夾子(例如，參見圖15)。
在某些實(shí)施方式中，裝置的一個(gè)或多個(gè)流動(dòng)通路可以是無菌通路。就是說，從 樣品源中流出的樣品和從室流向已處理樣品容器的已處理樣品可以處于閉合系統(tǒng) 內(nèi)。封閉系統(tǒng)可在適當(dāng)?shù)臒o菌條件下準(zhǔn)備，這樣在處理過程中可以使樣品保持無菌。 另外，容器、管道、電穿孔室都是一次性的。本文所用的術(shù)語"一次性"是指所設(shè) 計(jì)和組裝的部件足夠便宜，即使不是大多數(shù)使用者，也是很多使用者都認(rèn)為在經(jīng)濟(jì) 上沒有重復(fù)使用該部件的必要，在使用一次后就可以將其丟棄。
本發(fā)明的裝置和方法還可以包含其他各種處理組分。例如，在循環(huán)中間或一定 次數(shù)的循環(huán)之后用于洗滌、清潔或冷卻室的溶液，如洗滌緩沖液。在裝置停止使用 時(shí)也可用洗滌緩沖液冷卻電極和室。I.流式電穿孔法的描述
圖l是一個(gè)示意圖，代表了本文所描述的可調(diào)或斷續(xù)流式電穿孔法的一個(gè)典型 電穿孔循環(huán)?？?panel)l描述的是非樣品液體或氣體從室中的排出，框2描述的是在 非樣品液體或氣體從室中排出的同時(shí)將待電穿孔樣品注入室?？?和4描述的是在 樣品從流入到流出的流動(dòng)過程中對(duì)樣品進(jìn)行電穿孔?？?和6描述的是在已處理樣 品從室中排出的同時(shí)注入非樣品液體或氣體。本發(fā)明的方面包括通過電穿孔室的1、 2、 3、 4、 5、 6或更多個(gè)接口所發(fā)生的流入、流出或者流入及流出。流入和流出可通 過同一接口，也可以通過不同的接口。室本身可作為歧管使用，或者在室外樣品源 與室之間、收集點(diǎn)與室之間、或者兩個(gè)樣品源與收集點(diǎn)之間的位置上設(shè)置獨(dú)立的歧 管。本發(fā)明的實(shí)施方式并不要求都使用歧管。
在樣品注入室的過程中，液體可以是噴出并滲到室的空腔內(nèi)。這種噴射可能會(huì) 對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生水動(dòng)力學(xué)壓力，或者會(huì)在細(xì)胞懸液內(nèi)產(chǎn)生泡沫或氣泡。在處理活細(xì)胞時(shí) 最好要避免產(chǎn)生水動(dòng)力學(xué)壓力和泡沫或氣泡。當(dāng)我們希望提高電穿孔處理過程的通 量時(shí)，液體噴射、水動(dòng)力學(xué)壓力和氣泡形成就會(huì)成為問題。如果使用者想盡量縮短 用細(xì)胞懸液注滿和排空室所需的時(shí)間，可以選擇會(huì)導(dǎo)致液體噴射的流速，但其負(fù)面 效果比更快流速獲得的優(yōu)點(diǎn)更加顯著。如下文所示，在某些條件下，液體可能會(huì)從 入口噴入室內(nèi)，并且可能會(huì)滲透到其本不應(yīng)當(dāng)存在的系統(tǒng)空腔內(nèi)。避免出現(xiàn)這種問 題的一個(gè)方法是根據(jù)水動(dòng)力學(xué)領(lǐng)域的成熟原理設(shè)置一個(gè)筆直通道，或者制作一個(gè)測 試室，可以從中觀察注入的細(xì)胞懸液流，例如用透明材料制作室的表面。利用這種 測試室可以觀察液體噴射狀況或者氣泡或泡沫的產(chǎn)生情況，從而有可能避免產(chǎn)生噴 射或形成氣泡或泡沫。
在一種解決噴射問題的方法中，考慮使少量體積(一滴)的液體離開垂直放置的圓 管上的開口。當(dāng)液體處于管中時(shí)由泵或其他方式所產(chǎn)生的跨圓管兩端的壓力差推動(dòng)。 當(dāng)液體從圓管中流出時(shí)繼續(xù)延慣性方向流動(dòng)。如果流動(dòng)的方向是朝上，那么肯定對(duì) 游離的液滴不會(huì)施加力，發(fā)明者能夠根據(jù)能量守恒原理估算出其在空氣中運(yùn)行的距 離，該原理認(rèn)為液滴的動(dòng)能與勢能之和為常數(shù)(公式l)-
公式l: ，f + ，^^常數(shù)
其中
附是液滴的質(zhì)量， F^是其速度，g是重力加速度，以及 AW是液滴位于圓管開口上方的高度。
由于液滴在離開圓管的那一刻所具有的全部機(jī)械能基本都是動(dòng)能，因此常數(shù)等 于'/2ltlV。2，其中V。是液流的平均線性速率，它等于體積流率與管道截面積之比。當(dāng) 液滴到達(dá)其最高點(diǎn)時(shí)，其速度為0，利用關(guān)系式(公式2)可計(jì)算出其高度。在設(shè)計(jì)系 統(tǒng)時(shí)可以將這些力考慮進(jìn)去，通過改變流動(dòng)通路的形狀、電穿孔室的幾何構(gòu)型以及 調(diào)節(jié)系統(tǒng)內(nèi)液流所使用的壓力就可以使系統(tǒng)的設(shè)計(jì)達(dá)到最優(yōu)化。
例如，以5 mL/s的速度泵送細(xì)胞懸液通過內(nèi)徑(ID)為1/8英寸的圓管。其平均 線性速率就是 63cm/s，根據(jù)層流原理，圓管中心的最大線性速率將達(dá)到平均速率的 兩倍，因此K。值可達(dá)126 cm/s。假設(shè)g等于980 cm/s2，那么可以得到hmax = 8 cm。 這個(gè)例子可比擬處理室的特征形狀，因此，在指定的條件下噴射是可能的。
解決噴射問題的方法包括而不限于下列例子流速增加兩倍h,皿就會(huì)增加4倍， 在流速為10 mL/s時(shí)噴射高度將達(dá)到30 cm以上，這就意味著細(xì)胞懸液絕對(duì)是通過噴 射進(jìn)入室內(nèi)而不是緩慢流進(jìn)室內(nèi)的。另一方面，管道的截面積增加2倍噴射高度將 會(huì)下降4倍，因此，如果流速確定，我們所選擇的供應(yīng)管道和入口的直徑應(yīng)盡可能 地大以使噴射和對(duì)懸液內(nèi)細(xì)胞的干擾降低到最小。根據(jù)解決問題的這個(gè)原理，可以 通過試驗(yàn)流速、接口直徑、流動(dòng)通路等的不同組合來確定更有效的解決方法。
本發(fā)明的方法可利用具有不同構(gòu)型的裝置來實(shí)現(xiàn)。在第-一個(gè)實(shí)施例中，裝置的 構(gòu)型包括圖5或圖8所示的電穿孔室或其修改構(gòu)型。參照?qǐng)D2，樣品源30通過第一 流動(dòng)通路31與室11形成流體連通，31通過室接口 17與室相連。從樣品源30向室 11的流動(dòng)通過閥門32調(diào)節(jié)。室11與已處理樣品儲(chǔ)存罐36之間由第二流動(dòng)通路37 通過第二接口 18相連。流動(dòng)通路37內(nèi)的流動(dòng)由第二閥門38調(diào)節(jié)。非樣品液體或氣 體源35通過第三流動(dòng)通路33與室11形成流體連通。流動(dòng)通路33提供了非樣品氣 體或液體儲(chǔ)存罐35與室11之間的流體連通。第三流動(dòng)通路33包含驅(qū)動(dòng)液體流入流 動(dòng)通路并與之連接的泵34或其他裝置。第三流動(dòng)通路33通過第三接口 19連接到室 11上。
圖2所示的是一個(gè)典型的系統(tǒng)初始構(gòu)型，其中的室11含有非樣品液體或氣體， 樣品源30包含靶細(xì)胞、靶物質(zhì)、試劑或其不同組合的溶液。當(dāng)閥門32開放而閥門 38關(guān)閉時(shí)，泵34可將室11內(nèi)的非樣品液體或氣體排空。另外，也可以將樣品泵入室內(nèi)以替換或壓縮非樣品液體或氣體。當(dāng)非樣品氣體離開室11或在室內(nèi)被壓縮時(shí)， 來自樣品源30的樣品流入室11內(nèi)。 一旦室ll注滿了樣品，就利用電極向室內(nèi)發(fā)送
電脈沖。暴露于電流之中的樣品被認(rèn)為是己處理樣品。當(dāng)閥門32關(guān)閉而閥門38開
放時(shí)，非樣品液體或氣體被泵入室ll內(nèi)。通過排空已處理樣品可將非樣品液體或氣
體主動(dòng)泵入或吸入室內(nèi)。已處理樣品通過流動(dòng)通路37流到標(biāo)記為收集袋36的儲(chǔ)存 罐或收集點(diǎn)內(nèi)。這個(gè)過程可循環(huán)數(shù)次，其間可以改變電脈沖，也可以不改變，直到 全部或部分起始體積的樣品被處理完。
參照?qǐng)D3，本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式包括通過第一流動(dòng)通路31與室11形成流體 連通的樣品源30， 31通過室接口 17與室11相連。從樣品源30向室11的流動(dòng)由標(biāo) 記為32的閥門調(diào)節(jié)。非樣品液體或氣體源與已處理樣品儲(chǔ)存罐或收集點(diǎn)結(jié)合形成非 樣品液體或氣體/己處理樣品儲(chǔ)存罐39。室11由第二流動(dòng)通路37通過第二接口 18 與非樣品液體或氣體/已處理樣品儲(chǔ)存罐39相連。第二閥門38可調(diào)節(jié)流動(dòng)通路37 內(nèi)的液流。非樣品液體或氣體/已處理樣品儲(chǔ)存罐39通過第三流動(dòng)通路41與室11 形成流體連通。流動(dòng)通路41在非樣品液體或氣體Z己處理樣品儲(chǔ)存罐39與泵34之間 分叉形成第四流動(dòng)通路42。第三流動(dòng)通路41可操控地與泵34或驅(qū)動(dòng)液體在流動(dòng)通 路內(nèi)流動(dòng)的其他方式相連。第三通路41通過第三接口 19與室11相連。
圖3所示的是一個(gè)典型的系統(tǒng)初始構(gòu)型，其中的室11和非樣品液體或氣體/已 處理樣品儲(chǔ)存罐39含有非樣品液體或氣體，樣品源30包含靶細(xì)胞、試劑、靶物質(zhì) 或其不同組合的溶液。當(dāng)閥門32開放而閥門38關(guān)閉時(shí)，泵34可驅(qū)動(dòng)室11內(nèi)的非 樣品液體或氣體流過流動(dòng)通路42進(jìn)入樣品源30。當(dāng)非樣品氣體離開室11時(shí)，來自 于樣品源30的樣品流入室11。 一旦室注滿了樣品，就利用電極向室內(nèi)發(fā)送電脈沖。 暴露于電流之中的樣品被認(rèn)為是已處理樣品。當(dāng)閥門32關(guān)閉而閥門38開放時(shí)，非 樣品液體或氣體從非樣品液體或氣體/已處理樣品儲(chǔ)存罐39通過流動(dòng)通路41被泵入 室11內(nèi)。已處理樣品流過流動(dòng)通路37進(jìn)入非樣品液體或氣體/已處理樣品儲(chǔ)存罐39。 這個(gè)過程可循環(huán)數(shù)次，直到全部或部分起始體積的樣品被處理完。
在其他的實(shí)施方式中，電穿孔室10具有圖4所示的構(gòu)型。參照?qǐng)D4，樣品源30 通過流動(dòng)通路31與室11形成流體連通，后者通過室接口 17與室相連。從樣品源30 向室11的流動(dòng)由閥門32或泵43調(diào)節(jié)，閥門32是可選的。室11由第二流動(dòng)通路37 通過第二接口 18與非樣品液體或氣體/己處理樣品儲(chǔ)存罐39相連。流動(dòng)通路37內(nèi)的 流動(dòng)由第二閥門38(可選的)或第一泵34調(diào)節(jié)。非樣品液體或氣體源與已處理樣品儲(chǔ) 存罐或收集點(diǎn)結(jié)合形成非樣品液體或氣體/已處理樣品儲(chǔ)存罐39。非樣品液體或氣體
17/已處理樣品儲(chǔ)存罐39通過第三流動(dòng)通路44與室11形成流體連通。第三流動(dòng)通路 44可操控地與第一泵34或驅(qū)動(dòng)液體在流動(dòng)通路內(nèi)流動(dòng)的其他方式相連。第三流動(dòng)通 路44通過第四接口 20與室11相連。室11通過接口 19和第四流動(dòng)通路45與樣品 源30相連。第二泵43可操控地與第四流動(dòng)通路45相連。
圖4所示的是一個(gè)典型的系統(tǒng)初始構(gòu)型，其中的室11和非樣品液體或氣體/已 處理樣品儲(chǔ)存罐39含有非樣品液體或氣體，樣品源30包含靶細(xì)胞、試劑、靶物質(zhì) 或其不同組合的溶液。當(dāng)閥門32開放而閥門38關(guān)閉時(shí)，或者第一泵34抑制第二通 路37和第三流動(dòng)通路44內(nèi)的液流時(shí)，第二泵43可驅(qū)動(dòng)室11內(nèi)的非樣品液體或氣 體流過流動(dòng)通路45進(jìn)入樣品源30。當(dāng)非樣品氣體離開室11時(shí)，來自于樣品源30 的樣品通過流動(dòng)通路31流入室11。 一旦室注滿了預(yù)定體積的樣品，就利用電極向室 內(nèi)發(fā)送電脈沖。暴露于電流之中的樣品被認(rèn)為是已處理樣品。當(dāng)閥門32關(guān)閉或者第 二泵43抑制第一流動(dòng)通路31和第四流動(dòng)通路45內(nèi)的液流且閥門38開放時(shí)，非樣 品液體或氣體由第一泵34從非樣品液體或氣體/已處理樣品儲(chǔ)存罐39通過流動(dòng)通路 44泵入室11內(nèi)。這個(gè)過程可循環(huán)數(shù)次，直到全部或部分起始體積的樣品被處理完。
II.流式電穿孔裝置的描述
電穿孔室組件可用于選擇性地區(qū)隔生物單位，如細(xì)胞，這些生物單位由外部源 進(jìn)入電穿孔室組件內(nèi)。然后在生物或化學(xué)物質(zhì)存在的情況下對(duì)生物單位進(jìn)行電穿孔， 使物質(zhì)進(jìn)入生物單位膜上瞬時(shí)開放的孔道內(nèi)。生物單位被電穿孔后移出電穿孔室， 進(jìn)行下一步的處理，然后再對(duì)另一部分或單位體積的細(xì)胞懸液進(jìn)行電穿孔。下面根 據(jù)木發(fā)明的典型實(shí)施方式對(duì)電穿孔室的結(jié)構(gòu)和構(gòu)造進(jìn)行詳細(xì)描述。
本發(fā)明的某些實(shí)施方式包括用于對(duì)粒子，尤其是活細(xì)胞的懸液進(jìn)行電處理的電 穿孔室，其中包含帶有一個(gè)或多個(gè)流入口和一個(gè)或多個(gè)流出口的電穿孔室。電穿孔 室包括兩個(gè)或多個(gè)壁，其構(gòu)型可接受并儲(chǔ)存由一個(gè)或多個(gè)流入口流入的樣品，如， 懸液中的細(xì)胞，或非樣品液體或氣體。室還包括一對(duì)電極， 一個(gè)電極至少形成室的 一個(gè)壁。每個(gè)電極都與一個(gè)電源形成電子聯(lián)通，從而使流過室的細(xì)胞懸液暴露于兩 個(gè)電極之間形成的電場中。
圖5所示的是本發(fā)明的一個(gè)典型電穿孔室。參照?qǐng)D5，電穿孔室10包含室11。 壁12確定了室的形狀，墊圈13位于壁12中間。壁12可以是電極板。墊圈13在壁 12中間提供了一個(gè)空間形成室11。壁12和墊圈13由固定裝置14固定，14有相連 的電極間隔15。固定裝置14包括而不限于螺釘、夾子、拴、鑄模材料如鑄模塑料等。在圖5所示的實(shí)施方式中，電穿孔室10有4個(gè)接口第一接口 17、第二接口 18、 第三接口 19和第四接口20，在某些實(shí)施方式中第四接口20是可選的。每個(gè)接口都
與樣品源、非樣品液體或氣體、試劑源、已處理樣品儲(chǔ)存罐或儲(chǔ)存各種溶液和試劑 的各種容器形成流體連通。
圖5所示的電穿孔室10的分解圖顯示在圖6中。參照?qǐng)D6，電穿孔室10包含 室ll。室11的形狀由壁/電極12及位于壁之間的墊圈13確定。墊圈13在壁12之 間提供一個(gè)空間形成室11。壁12和墊圏13由固定裝置14固定，14有相連的間隔 15。固定裝置14包括而不限于螺釘、夾子、拴、鑄模材料如鑄模塑料等。在圖6所 示的實(shí)施方式中，室有4個(gè)接口第一接口 17、第二接口 18、第三接口 19和第四 接口 20，在某些實(shí)施方式中第四接口 20是可選的。每個(gè)接口都與樣品源、非樣品液 體或氣體、試劑源、已處理樣品儲(chǔ)存罐或各種容器形成流體連通。
電穿孔室10的另一個(gè)實(shí)施方式的分解圖顯示于圖7中。參照?qǐng)D7，電穿孔室10 包含室ll。室11的形狀由室的壁/電極12及位于壁之間的墊圈13確定。墊圈13在 壁12之間提供一個(gè)空間形成室11。壁12和墊圈13由固定裝置14固定，14有相連 的間隔裝置15。固定裝置14包括而不限于螺釘、夾子、拴、鑄模材料如鑄模塑料等。 在圖5所示的實(shí)施方式中，室有4個(gè)接口第一接口 17、第二接口 18、第三接口 19 和第四接口20，在某些實(shí)施方式中第四接口 20是可選的。在這個(gè)實(shí)施方式中，接口 (17、 18、 19、 20)孔所處的平面和室11的壁12所處的平面是同一個(gè)平面。每個(gè)接口 都與樣品源、非樣品液體或氣體、試劑源、已處理樣品儲(chǔ)存罐或各種容器形成流體 連通。
電穿孔室的另一個(gè)實(shí)施方式顯示于圖8中。參照?qǐng)D8，電穿孔室21包含三個(gè)接 口(17、 18和19)。室的形狀由壁12確定，墊圈13位于壁12之間。壁12可以是電 極，或者其上連接電極。墊圈13在壁12之間提供一個(gè)空間形成室11。壁12和墊圈 13由固定裝置14固定，14有相連的間隔15。固定裝置14包括而不限于螺釘、夾子、 拴、鑄模材料如鑄模塑料等。在圖8所示的實(shí)施方式中，室有3個(gè)接口第一接口 17、第二接口 18和第三接口 19。每個(gè)接口都與下述的樣品源、非樣品液體或氣體、 試劑源、已處理樣品儲(chǔ)存罐或各種容器形成流體連通。
參照?qǐng)D9所示的圖8的分解圖，電穿孔室21包含室11和三個(gè)接口(17、 18和 19)。室的形狀由壁12確定，墊圈13位于壁12之間。壁12可以是電極，或者其上 連接電極。墊圈13在壁12之間提供一個(gè)空間形成室11。壁12和墊圈13由固定裝 置14固定，14有相連的間隔15。固定裝置14包括而不限于螺釘、夾子、拴、鑄模材料如鑄模塑料等。在圖5所示的實(shí)施方式中，室有3個(gè)接口第一接口17、第二 接口 18和第三接口 19。每個(gè)接口都與樣品源、非樣品液體或氣體、試劑源、已處理 樣品儲(chǔ)存罐或各種容器形成流體連通。
在圖5-9所示的本發(fā)明的實(shí)施方式中，包含室11的墊圈13位于電極板12之間， 墊圈13的厚度與電極間隔15的厚度相同。墊圈13通常和相對(duì)的電極板12 —起形 成密封。墊圈13可由硅膠、其他合成或天然橡膠或其他聚合物、或者其他非導(dǎo)電性 材料制成。墊圈13內(nèi)的空間形成一個(gè)或多個(gè)室11。墊圈13內(nèi)的正方形、矩形或其 他切割空間定義了室11的構(gòu)型。室11的大小和形狀與電極板12的大小和形狀是成 比例的。
再參照?qǐng)D5-9，電穿孔室10或21可由兩個(gè)相對(duì)的電極板12構(gòu)建。 一般來說， 電極板可由鐵、鋼、銅、鋁或其他導(dǎo)電性金屬或金屬合金制成。電極板12還可以包 被金、鉑、鋅、碳或其他電鍍材料以增強(qiáng)其導(dǎo)電性。每個(gè)電極板12都有一個(gè)或多個(gè) 電子終端22與流式電穿孔系統(tǒng)的電源線路聯(lián)通。
電極板12通常由一個(gè)或多個(gè)電極間隔15隔離。電極間隔15的厚度決定和固定 了電極12之間的間隙。只需改變電極間隙15就可以將電極12之間的間隙調(diào)整到期 望的數(shù)值。這種間隙的寬度可根據(jù)液體體積和電場強(qiáng)度來調(diào)整，但是一般都要大于3 mm，優(yōu)選的是約0.01 mm到2 cm，更優(yōu)選的是約0.1 mm到1 cm。在其他實(shí)施方式 中，間隙的寬度大于3mm，優(yōu)選的是約4mm到約2cm，更優(yōu)選的是約5mm到約 lcm。圖14描述的是本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方式的實(shí)施例，其中至少帶一個(gè)接口的活塞 裝置用作本文所描述的電穿孔室。在這個(gè)特殊類型的裝置中，活塞用于置換樣品體 積。根據(jù)該圖所描述的基本原理產(chǎn)生的裝置或方法不需要加入非樣品氣體或液體。
電極間隔15通常由電絕緣材料制成，如塑料、陶瓷、橡膠或其他非傳導(dǎo)性聚合 材料或其他材料。
在一個(gè)實(shí)施方式中，電穿孔室組件包括帶有一個(gè)或多個(gè)孔洞的電極板12。每個(gè) 孔洞還可以是流入口、流出口、或者非樣品液體或氣體入口/出口，分別作為連接流 式電穿孔裝置的流入/流出流動(dòng)通路的接口。
電穿孔室還可以包含一個(gè)或多個(gè)附件以便于使組件緊密組裝。在本發(fā)明的不同 實(shí)施方式中，附件14包括緊固件如螺絲、螺栓、鉚釘、螺桿或夾子，用于將電極板 12插到墊圈13和室11的預(yù)期位置上。在本發(fā)明的電穿孔室11的其他實(shí)施方式中， 附件14可通過粘附、其他接合技術(shù)或封裝裝置固定。
附件可以是附孔，其大小和位置可容納螺桿。這種螺桿可直接插到附孔內(nèi)或者插到電極板的套管內(nèi)，螺桿可被固定以固定電穿孔室。在使用傳導(dǎo)性電極間隔的實(shí) 施方式中，相對(duì)的電極板之間的絕緣可通過絕緣的電極板套管來實(shí)現(xiàn)。
在其他實(shí)施方式中， 一個(gè)或兩個(gè)相對(duì)的電極板12還可以包含帶有冷卻元件的界 面。冷卻元件可以是熱電冷卻元件，或者通過與水或其他冷卻劑直接接觸、通過散 熱裝置通風(fēng)來冷卻，或者通過其他冷卻裝置驅(qū)散電穿孔過程中產(chǎn)生的熱量，電穿孔 過程通常都是產(chǎn)熱過程。
在本發(fā)明的另外一個(gè)方面，電穿孔室與一個(gè)封閉的一次性單沖程泵送系統(tǒng)可操 控地連接在一起，這種泵送系統(tǒng)不需要止回閥，如圖15所示。許多氣泵都使用擺動(dòng) 的彈性膜，需要止回閥使空氣定向流動(dòng)。由于變速流系統(tǒng)的許多實(shí)施方式都有止回 閥作為系統(tǒng)的一部分，因此電穿孔室的注入/排出過程可在帶彈性膜的活塞的一個(gè)沖 程中完成。
因此，具有這個(gè)特征的處理室是很便宜的，并且是一個(gè)完全密封的單位，在變 速流處理過程中可達(dá)到十分精確的樣品運(yùn)送。參照?qǐng)D15，處理室的組件包括而不限 于硅膠墊圈13、電極12、塑料體50和彈性膜52。電穿孔室11的壁和非樣品液體或 氣體容器35(見圖2)可由墊圈形成。墊圈13可以是單片結(jié)構(gòu)的。在這種實(shí)施方式中， 有活塞54;由步進(jìn)電機(jī)和裝置表面上的計(jì)算機(jī)控制的壓縮線性執(zhí)行機(jī)構(gòu)56。帶有這 種單沖程活塞機(jī)器的本發(fā)明的實(shí)施方式包含兩個(gè)擠壓閥門，如上面的圖2所描述(閥 門32和38)。接口 17、 18和19的典型位置也顯示在圖15中。
本文所描述的特殊實(shí)施方式是以舉例說明的方式描述本發(fā)明，不能解釋為將本 發(fā)明限制在特殊實(shí)施例上。
本發(fā)明的某些方面包括在電穿孔裝置(圖IO)中插入本發(fā)明的電穿孔室和各種處 理構(gòu)件。在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的流式電穿孔裝置包含如下構(gòu)件包 含電穿孔室的組件；容納樣品、已處理樣品和非樣品液體或氣體以及可用于本發(fā)明 的其他試劑的各種容器；提供高壓脈沖的電子元件和電路；控制電路和液流的計(jì)算 機(jī)；以及與計(jì)算機(jī)連接的監(jiān)視器，監(jiān)視器可使操作者評(píng)估數(shù)據(jù)、向計(jì)算機(jī)輸入數(shù)值 或程序。
本發(fā)明利用可調(diào)流式電穿孔開發(fā)出新的電穿孔法和電穿孔裝置。本文所舉例說 明的及描述的方法包括細(xì)胞懸液的可調(diào)流動(dòng)和電穿孔。本發(fā)明的室可以組裝，因此 其價(jià)值很低，可以一次性使用。不同構(gòu)型的電穿孔室都可用于本發(fā)明中，如本文所 描述的實(shí)施例。當(dāng)細(xì)胞懸液處于電極之間時(shí)，細(xì)胞懸液接受預(yù)先確定電參數(shù)的一次 或多次電脈沖，電參數(shù)包括電壓、持續(xù)時(shí)間和脈沖之間的短暫間隙(如果有多次脈沖)。
21根據(jù)細(xì)胞類型的不同以及人們想通過電穿孔導(dǎo)入到細(xì)胞內(nèi)的可能分子的不同，所選 擇的最佳電參數(shù)也是不同的。適宜的電參數(shù)是本領(lǐng)域所熟知的，利用試驗(yàn)確定適于 新類型細(xì)胞的最佳電參數(shù)的方法也是大家所熟知的。適于多種類型的哺乳動(dòng)物細(xì)胞 的一個(gè)典型參數(shù)是l kV/cm， 1 ms的脈沖寬度。目的分子、化合物或組合物隨著濃 度梯度和/或電梯度彌散到細(xì)胞內(nèi)。本發(fā)明還能夠給細(xì)胞施加一定強(qiáng)度范圍內(nèi)的電場。 一般來說，用于本發(fā)明的電場強(qiáng)度要高于約0.5 kV/cm;優(yōu)選約1 kV/cm到3.5 kV/cm。 處理過程開始于在電穿孔室上連接管道，管道與容器內(nèi)的溶液和細(xì)胞懸液相通， 這個(gè)過程應(yīng)該在無菌環(huán)境中進(jìn)行。電穿孔室可卡到裝置的受位上，通過閉合可折面 板將其固定。細(xì)胞懸液和/或其他試劑的注入可通過給一個(gè)或多個(gè)泵、闊門或其組合 下達(dá)指令使細(xì)胞懸液在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間、以適當(dāng)?shù)乃俣攘魅腚姶┛资叶瓿?。?dāng)一部分 細(xì)胞懸液位于電極之間的電穿孔室中時(shí)，給電極提供進(jìn)而也給懸液中的細(xì)胞施加設(shè) 定電壓、持續(xù)吋間和間歇時(shí)間的電脈沖。在施加所需的電脈沖后，給一個(gè)或多個(gè)泵、 閥門或其組合下達(dá)指令，從電穿孔室中排出細(xì)胞懸液。另外也可以下達(dá)指令將一部 分新的細(xì)胞懸液注入到電穿孔室內(nèi)。已進(jìn)行電穿孔的細(xì)胞懸液與未進(jìn)行電穿孔的細(xì) 胞分開收集。上述一系列事件可由計(jì)算機(jī)控制使其在時(shí)間上協(xié)調(diào)進(jìn)行，計(jì)算機(jī)與提 供電脈沖的電路以及影響和控制細(xì)胞懸液流入和流出電穿孔室的泵、閥門或其組合 可操控地連接。操作者通過可操控地連接到計(jì)算機(jī)上的監(jiān)視器的圖形界面和鍵盤向 計(jì)算機(jī)內(nèi)輸入給細(xì)胞懸液施加的電脈沖以及流入和流出電穿孔室的細(xì)胞懸液的流速 和持續(xù)時(shí)間。下面將詳細(xì)描述本發(fā)明的流式電穿孔系統(tǒng)的實(shí)施例。
A. —次性電穿孔室及其相關(guān)組件(一次性裝置)
一次性裝置包括本文所描述的各種容器(如PVC袋)、PVC管、接頭、硅膠泵管
以及電穿孔室。與血液或其他細(xì)胞材料接觸的所有塑料組件都可以用醫(yī)用級(jí)iv類材
料D
電穿孔室(見圖5)包括兩個(gè)電鍍有約100微英寸純金(99.9%)的低碳鋼(99+°/。鐵) 電極。電極通常為20mm長、整體寬度為77pm。當(dāng)電極平行放置時(shí)，棒狀電極之 間的最大距離為154 pm。在組裝過程中， 一般將電極插到電極墊圈內(nèi)，然后將其夾 到隔板和平板之間。平行棒狀電極之間的正常間隙為3mm。電穿孔室的內(nèi)容積約為 1.6mL。
電極可用包被金屬層或其他電傳導(dǎo)性化合物的任何非傳導(dǎo)性材料制備。 在某些實(shí)施方式中，可有l(wèi)、 2、 3、 4、 5、 6或更多個(gè)容器或源連接到一次性裝置上。容器包括而不限于可折疊的、可擴(kuò)張的或固定體積的容器。第一容器被稱為 樣品源或樣品容器，可容納細(xì)胞懸液，可以包含，也可以不包含通過電穿孔過程插 入到細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)D如果不包含插入到細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)，那么就需要有第二容器來容 納這些物質(zhì)，這些物質(zhì)在進(jìn)入電穿孔室前或者在電穿孔室內(nèi)在線混合。第一容器(也 可以是第二容器)與PVC或其他適宜的管線相連，如果其構(gòu)型中包含閥門，那么液體 可通過任何指定的閥門流入電穿孔室的第一接口(流入口)。在某些實(shí)施方式中，可以 考慮使用帶一個(gè)接口的電穿孔室來實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。本發(fā)明的其他實(shí)施方式包含其他容 器，這些容器與來自樣品容器的管線相連，可向室內(nèi)提供試劑或其他樣品。匯聚的 溶液可在到達(dá)電穿孔室之前、期間或之后混合。
在其他的實(shí)施方式中，電穿孔室的第二接口(流出口)至少與1、 2、 3、 4或更多
個(gè)容器相通，可以有一個(gè)或多個(gè)介入裝置引導(dǎo)溶液從電穿孔室流到適當(dāng)?shù)娜萜鲀?nèi)。 在其他的構(gòu)型中，可以連接一個(gè)容納廢物的容器，該容器可容納使用者希望丟棄的 任何液體。第二或第三容器或袋被稱為已處理樣品容器或產(chǎn)物容器。已處理樣品容 器或產(chǎn)物容器可容納經(jīng)過電穿孔的細(xì)胞或經(jīng)電穿孔處理的其他產(chǎn)物。
第三或第四容器可容納各種非樣品液體或氣休，非樣品液體或氣體用于將樣品 分隔成不連續(xù)的體積或單位體積。非樣品液體或氣體容器可與已處理樣品容器或樣 品容器合并，這樣可以將非樣品液體或氣體從己處理樣品容器轉(zhuǎn)移到另一個(gè)容器內(nèi)， 后者在樣品處理過程中可以是樣品源容器。在某些方面，容納非樣品液體或氣體的 儲(chǔ)存罐可與室合并，只要非樣品液體或氣體可以被壓縮以使電極處于正確的位置上 進(jìn)行電穿孔就可以。
如較早前所提及的，其他各種容器都可以合并到本文所舉例說明的構(gòu)型內(nèi)。這 些其他的容器可供應(yīng)其他的試劑、細(xì)胞等。其他的容器也可以用作廢物容器或用作
分隔已處理樣品的容器。在各種實(shí)施方式中，本發(fā)明的電穿孔室可包含1、 2、 3或 更多對(duì)電極。在室包含一對(duì)以上電極的情況下，當(dāng)施加脈沖時(shí)只有處于電極對(duì)之間 的細(xì)胞懸液能被有效電穿孔或完全電穿孔。如果需要，可以設(shè)置多個(gè)電穿孔室以便 于更快速地進(jìn)行更大體積的電穿孔。本文所用的術(shù)語電穿孔區(qū)是指室內(nèi)的一個(gè)區(qū)域， 流過該區(qū)域的材料被暴露于強(qiáng)度足以影響電穿孔的電場中。根據(jù)本發(fā)明，我們希望 確定電穿孔室電穿孔區(qū)相對(duì)壁至少一部分的兩個(gè)成對(duì)電極形成了電穿孔區(qū)內(nèi)那些相 對(duì)壁的基本部分。如本文所述，如果電極所處的位置使在電極對(duì)上施加電壓差時(shí)在 它們之間存在基本均勻的電場，那么我們就說電極是一對(duì)。本文所用的術(shù)語基本部 分是指大于約50%，優(yōu)選的是大于約60%，更優(yōu)選的是大于約70%、 80%、 90%，最優(yōu)選的是約100%。
優(yōu)選的是，電穿孔室作為無菌單位供一次性使用。因此，電穿孔室的組件優(yōu)選 用能抵抗滅菌過程如高壓滅菌、輻射滅菌或化學(xué)滅菌的材料制備。
適用于本文所述的裝置組件的材料包括被批準(zhǔn)可用于接觸內(nèi)部體液的生物相容 性醫(yī)用材料，這些材料應(yīng)該符合US PV1或ISO 10993標(biāo)準(zhǔn)。另外，材料在至少使用 一次的過程中與本發(fā)明所用的溶劑接觸時(shí)應(yīng)當(dāng)不會(huì)發(fā)生實(shí)質(zhì)性降解。材料一般都可 以通過輻射滅菌或環(huán)氧乙烷(EtO)滅菌方法滅菌。這種合適材料包括可拉伸的材料， 例如用于制備管線時(shí)，和/或可澆鑄的材料，例如用于制備硬容器時(shí)。用于制備本發(fā) 明的各種組件的材料包括而不限于尼龍、聚丙烯、聚碳酸酯、丙烯酸酯、聚砜、聚 偏(二)氟乙烯(PVDF)、氟彈性體如DuPont Dow Elastomers L.L.C.的VITON、熱塑性 的彈性體如Monsanto的SANTOPRENE、聚氯乙烯(PVC)、聚四氟乙烯(PTFE)、聚 苯醚(PFE)、全氟烷氧基共聚物(PFA)如E. I. du Pont de Nemours and Company的 TEFLON PFA，以及上述物質(zhì)的組合。
在很多情況下，參考電穿孔處理的通量或在一定時(shí)間內(nèi)處理的細(xì)胞懸液量是很 重要的。由于電穿孔單位體積的細(xì)胞懸液需要一定量的能量，因此，在一定的時(shí)間 內(nèi)，電穿孔的細(xì)胞懸液體積越大，在相同的時(shí)間內(nèi)所消耗的能量越多。給細(xì)胞懸液 加上電壓就會(huì)產(chǎn)生流經(jīng)懸液的電流，細(xì)胞懸液是有電阻的。根據(jù)焦耳定律，這個(gè)電 流會(huì)產(chǎn)生熱量。由于給室及其內(nèi)容物提供的大多數(shù)電能都轉(zhuǎn)化成了熱能，因此，給 室及其內(nèi)容物提供的電功率(P)與做功時(shí)間及室內(nèi)所產(chǎn)生的熱之間的關(guān)系式為P = Q/t，其中Q為熱，t為時(shí)間。
電穿孔所產(chǎn)生的熱量可使細(xì)胞懸液的溫度升高，至少是瞬時(shí)升高。由于我們不 希望細(xì)胞的溫度超過45°C，因此最好提供一種冷卻細(xì)胞懸液和電穿孔室的方法以避 免細(xì)胞達(dá)到不可接受的溫度。暴露于這種高溫下所產(chǎn)生的損傷效應(yīng)與暴露的時(shí)間長 短有關(guān)，因此在進(jìn)行電穿孔后要盡快冷卻。由于在電穿孔過程中電穿孔室反復(fù)地接 受高壓脈沖進(jìn)而產(chǎn)生熱量，因此，冷卻電穿孔室和已電穿孔的細(xì)胞是尤其重要的。 但是，雖然在一般情況下是通過使細(xì)胞懸液與金屬部分立刻接觸進(jìn)行冷卻，金屬部 分由Peltier元件或氣流或液流依次冷卻，但是對(duì)冷卻過程也有一些原則限制。在很 多情況下，電穿孔過程的設(shè)計(jì)者忽視或忘記了這樣一個(gè)事實(shí)，即金屬的熱傳導(dǎo)性比 水(或生物緩沖液)的熱傳導(dǎo)性要高的多，這就意味著熱量從流動(dòng)管道向冷卻單位的轉(zhuǎn) 移總是受到水或細(xì)胞懸液自身熱傳導(dǎo)性的限制。在這種情況下，選擇具有合適幾何 形狀的流動(dòng)管道是十分重要的，這樣才能以最有效的途徑完成熱量轉(zhuǎn)移。B.樣品流的調(diào)節(jié)
與本發(fā)明相關(guān)的各種液體和/或氣體流可由一個(gè)或多個(gè)泵裝置、閥門或其他裝置 調(diào)節(jié)，這些裝置可促進(jìn)、抑制或完全阻止流動(dòng)，或者調(diào)節(jié)流動(dòng)。這可通過一個(gè)或多 個(gè)將細(xì)胞懸液或其他液體泵送到電穿孔室內(nèi)的泵、 一個(gè)或多個(gè)將細(xì)胞懸液或其他液 休泵出電穿孔室的泵、或其組合來完成。另外還可以通過能夠改變電穿孔室內(nèi)的氣 壓或容積的泵或其他裝置使細(xì)胞懸液流入或流出電穿孔室。在某些實(shí)施方式中，重 力可用于使單位體積的樣品在一對(duì)電極之間移動(dòng)?？捎玫拈y門包括擠壓閥、蝶形閥 和/或球形閥，這些閥門可使流動(dòng)通路完全或部分開放或閉合。在許多實(shí)施方式中， 所使用的泵可調(diào)節(jié)和計(jì)量裝置內(nèi)流動(dòng)的液體。許多裝置內(nèi)的液體泵送都是相似的。 根據(jù)使用目的的不同，被轉(zhuǎn)移、分散或計(jì)量的液體可以是試驗(yàn)樣品，也可以是各種 試劑和洗滌溶液。在將裝置設(shè)計(jì)成可處理更小體積的液體時(shí)，就更需要-1分精確的 計(jì)量泵。
有時(shí)可用離心泵或主動(dòng)置換泵來完成液體轉(zhuǎn)移。離心泵通過旋轉(zhuǎn)渦輪將能量轉(zhuǎn) 移給液體，渦輪能轉(zhuǎn)化成液壓，液壓可使液體流動(dòng)。這種類型的泵是壓力和液體依 賴型的， 一般不能用于計(jì)量，因?yàn)樗鼈冊(cè)诟淖冞M(jìn)入和排出條件時(shí)不能維持很精確的 液體流動(dòng)。其優(yōu)點(diǎn)在于在低壓下就可以提供高流速。
主動(dòng)置換泵通過捕獲固定體積的液體并利用齒輪、活塞、隔膜、葉片或其他裝 置移動(dòng)此液體來運(yùn)行。這些泵一般都以低速運(yùn)行，對(duì)排出和抽吸條件的變化不敏感， 只是通過調(diào)節(jié)速度和置換來控制流動(dòng)。這些特征使主動(dòng)轉(zhuǎn)換泵成為計(jì)量液體的好裝 置。因此計(jì)量泵被定義為被設(shè)計(jì)成能夠在特定容積范圍內(nèi)提供十分精確且可重復(fù)的 流動(dòng)的主動(dòng)置換裝置。主動(dòng)置換計(jì)量泵通常被歸類為旋轉(zhuǎn)泵或往復(fù)泵。旋轉(zhuǎn)泵包括 齒輪泵、裂片泵、葉片泵和滾壓泵(蠕動(dòng)泵)。往復(fù)泵包括隔膜泵、活塞泵和風(fēng)箱泵。
C.其他組件
電穿孔裝置如本文所描述的那些電穿孔裝置包含各種其他組件，如一個(gè)或多個(gè) 電子模塊接口、計(jì)算機(jī)、監(jiān)視器以及其他電子電路和本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易使用的 軟件。有關(guān)電穿孔系統(tǒng)的總體設(shè)計(jì)以及對(duì)這種系統(tǒng)的其他各種組件的描述見已公開 的美國專利申請(qǐng)No. 200400292240、 20030073238、 20030059945和20010001064，
木文已納入作為參考。
25實(shí)施例
下面的實(shí)施例用于證明本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解的 是，實(shí)施例中所描述的技術(shù)代表發(fā)明者所發(fā)現(xiàn)的能成功實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)，因此應(yīng) 當(dāng)被認(rèn)為構(gòu)成了用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的優(yōu)選模式。但是，本領(lǐng)域的技術(shù)人員通過閱讀本 說明書后應(yīng)當(dāng)理解，只要不偏離本發(fā)明的精神和范圍，對(duì)本文所描述的特殊實(shí)施方 式進(jìn)行多種修改也能得到類似的或一致的結(jié)果。
實(shí)施例l可變流式電穿孔
我們利用可調(diào)或可變流式電穿孔進(jìn)行了一個(gè)典型的電穿孔試驗(yàn)。Jurkat細(xì)胞作為 一個(gè)模型系統(tǒng)，GFP表達(dá)載體作為轉(zhuǎn)化的模型化合物。所有的細(xì)胞密度都為4xl07 Jurkat細(xì)胞/mL,質(zhì)粒濃度為每毫升100微克pTM2質(zhì)粒DNA(約5 Kb)，該質(zhì)?？杀?達(dá)eGFP(綠色熒光蛋fi)。試驗(yàn)過程為從室中排出非樣品液體或氣體；同時(shí)向室內(nèi) 注入含Jurkat細(xì)胞和GFP載體的樣品。在樣品從流入到流出的過程中對(duì)單位體積的 樣品進(jìn)行電穿孔。從室內(nèi)排出已處理的樣品，同時(shí)注入非樣品液體或氣體。圖U顯 示的是對(duì)照細(xì)胞、用400 (aL靜態(tài)處理方法處理的細(xì)胞以及用100 mL可變流動(dòng)處理 方法處理的細(xì)胞，檢測碘化丙錠熒光或GFP熒光。圖12是用直方圖表示的對(duì)照細(xì) 胞(圖12A)、用400 靜態(tài)處理方法處理的細(xì)胞(圖12B)和用100 mL可變流式方法 處理的細(xì)胞(圖12C)的GFP熒光的FACS分析結(jié)果。圖13顯示的是利用可變流式電 穿孔法處理14個(gè)連續(xù)樣品組分所得到的單位樣品與單位樣品之間結(jié)果的一致性。通 過分析GFP轉(zhuǎn)染情況及細(xì)胞存活率將細(xì)胞分為死細(xì)胞、未轉(zhuǎn)染的活細(xì)胞和已轉(zhuǎn)染的 活細(xì)胞。參考資料
以下參考資料被納入本文作為參考，其程度為程序性地例舉或?qū)ξ闹刑岬降膬?nèi)容 進(jìn)行補(bǔ)充。
美國專利4,752,586 美國專利5,612,207 美國專利6,074,605 芙國專利6,090,617 美國專利申請(qǐng)20010001064 美國專利申請(qǐng)20030059945 美國專利申請(qǐng)20030073238 美國專利申請(qǐng)200400292240
權(quán)利要求
1. 一種流式電穿孔法，該方法包括調(diào)節(jié)通過電穿孔室的樣品流，其中，所述樣品以分隔單位的形式進(jìn)行處理。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述樣品流通過至少一個(gè)閉合流動(dòng)通路。
3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述單位通過降低樣品通過電穿孔室 的流速而形成。
4. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述單位通過在未處理的樣品體積與 已處理的樣品體積之間提供邊界而形成。
5. 如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述邊界是氣體或液體。
6. 如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述邊界是通過將非樣品氣體或液體 循環(huán)入兩個(gè)或多個(gè)樣品組分之間的室內(nèi)而提供的。
7. 如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述非樣品氣體或液體被一定體積未 處理的樣品置換出室。
8. 如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述非樣品氣體或液體通過從室中排 空巳處理樣品而流入室內(nèi)。
9. 如權(quán)利耍求6所述的方法，其特征在于，通過改變通過第一接口和第二接口的 杼品流來實(shí)現(xiàn)循環(huán)。
10. 如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，通過一個(gè)或多個(gè)閥門調(diào)節(jié)循環(huán)。
11. 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，樣品在進(jìn)入電穿孔室之前或期間混合。
12. —種流式電穿孔室，其包括a) 具有至少兩個(gè)電極的室；以及b) 至少三個(gè)接口，其中(i)第一接口用于樣品流入室；(ii)第二接口用于己處理 樣品流出室；禾叩ii)第三接口用于非樣品液體或氣體流入或流出室，其中，當(dāng)樣品流 入室時(shí)非樣品液體或氣體流出室，當(dāng)已處理樣品流出室時(shí)非樣品液體或氣體流入室。
13. 如權(quán)利要求12所述的室，其特征在于，所述第一接口與一個(gè)或多個(gè)樣品容器形 成流體連通。
14. 如權(quán)利要求12所述的室，其特征在于，所述第二接口與一個(gè)或多個(gè)已處理樣品 容器形成流體連通。
15. 如權(quán)利要求12所述的室，其特征在于，所述第三接口與儲(chǔ)存容器形成流體連通， 其中當(dāng)室內(nèi)注滿或部分注滿樣品體積時(shí)儲(chǔ)存容器容納全部或部分非樣品液體或氣體。
16. 如權(quán)利要求12所述的室，其特征在于，所述室具有至少4個(gè)接口。
17. 如權(quán)利要求16所述的室，其特征在于，至少第四接口與樣品容器、已處理樣品 容器、非樣品氣體或液體儲(chǔ)存容器或試劑容器形成流體連通。
18. —種流式電穿孔裝置，該裝置包括a) 至少一個(gè)樣品容器，該容器通過第一室接口與電穿孔室流體連通，形成第一 流動(dòng)通路；以及b) 至少-一個(gè)已處理樣品容器，該容器通過第二室接口與電穿孔室流體連通，形 成第二流動(dòng)通路。
19. 如權(quán)利要求18所述的裝置，該裝置還包括至少一個(gè)非樣品液體或氣體儲(chǔ)器，該 儲(chǔ)器通過第三室接口與電穿孔室流體連通，形成第三流動(dòng)通路。
20. 如權(quán)利要求18所述的裝置，其特征在于，所述第一和第二接口是同一個(gè)接口。
21. 如權(quán)利要求19所述的裝置，其特征在于，至少一個(gè)流動(dòng)通路是閉合流動(dòng)通路。
22. 如權(quán)利要求21所述的裝置，其特征在于，所述第一、第二和第三流動(dòng)通路是閉 合流動(dòng)通路。
23. 如權(quán)利要求19所述的裝置，其特征在于，所述非樣品氣體或液體儲(chǔ)器是非樣品 氣體或液體容器。
24. 如權(quán)利要求19所述的裝置，其特征在于，所述非樣品氣體或液體儲(chǔ)器是樣品容 器、已處理樣品容器或者既是樣品容器又是已處理樣品容器。
25. 如權(quán)利要求19所述的裝置，其特征在于，所述第二流動(dòng)通路與第一流動(dòng)通路的 樣品容器和第三流動(dòng)通路的非樣品儲(chǔ)器流體連通，第三流動(dòng)通路的非樣品儲(chǔ)器相對(duì)于 第二流動(dòng)通路上的已處理樣品容器來說處于電穿孔室的遠(yuǎn)端。
26. 如權(quán)利要求19所述的裝置，該裝置還包括與至少一個(gè)流動(dòng)通路可操控連接的至 少一個(gè)泵裝置。
27. 如權(quán)利要求19所述的裝置，其特征在于，所述樣品容器是可折疊的、可擴(kuò)張的 或固定體積的。
28. 如權(quán)利要求19所述的裝置，其特征在于，所述已處理樣品容器是可折疊的、可 擴(kuò)張的或固定體積的。
29. 如權(quán)利要求23所述的裝置，其特征在于，所述非樣品氣體或液體容器是可折疊 的、可擴(kuò)張的或固定體積的。
30. 如權(quán)利要求19所述的裝置，其特征在于，所述裝置內(nèi)的液流通過裝置一個(gè)或多 個(gè)流動(dòng)通路的開放或閉合來引導(dǎo)。
31. 如權(quán)利要求19所述的裝置，其特征在于，所述第一和第二流動(dòng)通路交替開放和閉合。
32.如權(quán)利要求19所述的裝置，其特征在于，所述液流由一個(gè)或多個(gè)閥門調(diào)節(jié)。
33.如權(quán)利要求19所述的裝置，其特征在于，所述液流由一個(gè)或多個(gè)泵裝置調(diào)節(jié)。
34.如權(quán)利要求33所述的裝置，其特征在于，所述泵裝置是泵。
35.如權(quán)利要求34所述的裝置，其特征在于，所述泵是蠕動(dòng)泵。
36.如權(quán)利耍求35所述的裝置，其特征在于，所述蠕動(dòng)泵是全壓縮蠕動(dòng)泵。
37.如權(quán)利要求19所述的裝置，其特征在于，所述液流由閥門調(diào)節(jié)。
38.如權(quán)利要求37所述的裝置，其特征在于，所述液流由泵裝置調(diào)節(jié)。
39.一種流式電穿孔裝置，該裝置包括-a) 至少--個(gè)通過第一室接口與電穿孔室流體連通的樣品容器，該電穿孔室通過 第二室接口與樣品容器流體連通，形成第一流動(dòng)通路；b) 至少 -個(gè)通過第二室接口與電穿孔室流體連通的已處理樣品容器，該電穿孔 室通過第四室接口與已處理樣品容器流休連通，形成第二流動(dòng)通路。
40. 如權(quán)利要求39所述的裝置，其特征在于，所述已處理樣品容器也用作非樣品氣 體或液體儲(chǔ)器。
41. 如權(quán)利要求40所述的裝置，其特征在于，所述非樣品氣體或液體儲(chǔ)器是樣品容 器、已處理樣品容器或者既是樣品容器又是已處理樣品容器。
42. 如權(quán)利要求39所述的裝置，該裝置還包括與至少一個(gè)流動(dòng)通路可操控連接的至 少一個(gè)泵。
43. 如權(quán)利要求39所述的裝置，其特征在于，所述樣品容器是可折疊的、oj擴(kuò)張的 或固定體積的。
44. 如權(quán)利要求39所述的裝置，其特征在于，所述已處理樣品容器是可折疊的、可 擴(kuò)張的或固定體積的。
45. 如權(quán)利要求39所述的裝置，其特征在于，所述裝置內(nèi)的液流通過裝置一個(gè)或多 個(gè)流動(dòng)通路的開放或閉合來引導(dǎo)。
46. 如權(quán)利要求39所述的裝置，其特征在于，所述第一和第二流動(dòng)通路交替開放和 閉合。
47. 如權(quán)利要求39所述的裝置，其特征在于，所述液流由'個(gè)或多個(gè)泵裝置調(diào)節(jié)。
48. 如權(quán)利要求47所述的裝置，其特征在于，所述泵裝置是泵。
49. 如權(quán)利要求48所述的裝置，其特征在于，所述泵是蠕動(dòng)泵。
50. 如權(quán)利要求49所述的裝置，其特征在于，所述蠕動(dòng)泵是全壓縮蠕動(dòng)泵。
51. 如權(quán)利要求39所述的裝置，其特征在于，所述液流由閥門調(diào)節(jié)。
52. 如權(quán)利要求51所述的裝置，其特征在于，所述液流由泵裝置調(diào)節(jié)。
全文摘要
電穿孔室及其相關(guān)裝置將作為歧管調(diào)節(jié)樣品流動(dòng)的電穿孔室的特征與流式電穿孔裝置的特征結(jié)合在一起形成可調(diào)流式電穿孔裝置。本發(fā)明還包括一種新型可調(diào)流式電穿孔室，這種電穿孔室可改變條件使其中的樣品在一個(gè)完全密封(無菌)的系統(tǒng)內(nèi)以獨(dú)立組分或獨(dú)立體積的形式受到均一的處理。
文檔編號(hào)C12M3/00GK101426929SQ200580015262
公開日2009年5月6日 申請(qǐng)日期2005年5月12日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月12日
發(fā)明者L·李, N·肖帕斯, S·澤庫諾夫 申請(qǐng)人:麥克賽特股份有限公司