專利名稱：重組修飾的纖溶酶的制作方法
背景技術(shù)：
人纖溶酶原是包含791個氨基酸殘基的單鏈蛋白。通過對酶原中Arg561-Val562肽鍵的單一的裂解，導(dǎo)致纖溶酶原激活成為纖溶酶。所得到的纖溶酶分子是雙鏈的二硫鍵連接的絲氨酸蛋白酶，具有胰蛋白酶樣特異性(在Lys和Arg之后裂解)。
纖溶酶的氨基-末端重鏈(殘基1-561，大約60kDa)由五個三環(huán)域(kringle)組成，各自包含大約80個氨基酸殘基。所述三環(huán)域負(fù)責(zé)纖溶酶原的調(diào)控特性，如與激活抑制劑例如Cl-1離子的相互作用；與激活刺激劑例如ε-氨基己酸的相互作用；與哺乳動物和細(xì)菌細(xì)胞的相互作用；和與其他蛋白的相互作用，如纖溶酶生理學(xué)底物血纖蛋白和纖溶酶抑制劑α2-抗纖溶酶。在所有五個三環(huán)域中，三環(huán)域1是最多功能的一種；業(yè)已證實(shí)了它的賴氨酸-結(jié)合活性負(fù)責(zé)引起纖溶酶與α2-抗纖溶酶和血纖蛋白的相互作用。參見Wiman，B.，et al.，Biochim.Biophys.Acta 579142-154(1979)；和Lucas，M.A.，et al.，J.Biol.Chem.2584249-4256(1983)。
纖溶酶的C-末端輕鏈(殘基562-791，大約25kDa)是典型的絲氨酸蛋白酶，與胰蛋白酶同源，并且包含典型的絲氨酸蛋白酶催化三聯(lián)體His603，Asp646和Ser741。纖溶酶原包含24個二硫鍵和在Asn289和Thr346上的2個糖基化位點(diǎn)。
業(yè)已證實(shí)彈性蛋白酶對纖溶酶原的有限的蛋白水解產(chǎn)生三個片段(Sottrup-Jensen，L.，et al.，Prog.Chem.Fibrinol.Thrombol.，3191-209(1978))。第一個片段，K1-3，包括前三個三環(huán)域，并且能夠以兩種形式分離，Tyr79-Val338和Tyr79-Val354。第二個片段K4相當(dāng)于第四個三環(huán)域，并且包括殘基Val355-Ala440。最后一個是C-末端片段(所謂的小-纖溶酶原)，包括殘基Val443-Asn791，并且由第五個三環(huán)域和絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域組成。小-纖溶酶原能夠以與纖溶酶原相同的方式被激活，形成小-纖溶酶。
由于全長纖溶酶原分子的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)未證實(shí)可用于纖溶酶原的重組生產(chǎn)。纖溶酶原是以不溶性的內(nèi)含體形式生產(chǎn)的，并且不能夠從那種狀態(tài)再折疊。另外，纖溶酶原在哺乳動物細(xì)胞中的表達(dá)由于纖溶酶原在細(xì)胞內(nèi)激活形成纖溶酶和所致的細(xì)胞毒性而復(fù)雜化。用昆蟲細(xì)胞生產(chǎn)具有完全活性的纖溶酶原是可能的，不過，由于產(chǎn)量低該系統(tǒng)不適合大規(guī)模生產(chǎn)。
因此，需要修飾過的重組蛋白，它具備纖溶酶/纖溶酶原的理想特征，同時缺乏某些負(fù)面特征，并且能夠以較大數(shù)量在細(xì)菌細(xì)胞中生產(chǎn)。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了包含編碼多肽的核苷酸序列的多核苷酸，所述多肽具有與天然人纖溶酶原的三環(huán)域同源的單一的N-末端三環(huán)域；和與人纖溶酶原中的相應(yīng)結(jié)構(gòu)域同源的C-末端結(jié)構(gòu)域激活位點(diǎn)和絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域；其中，所述多肽能結(jié)合固定化的賴氨酸。所述N-末端三環(huán)域可與天然人纖溶酶原的三環(huán)域1或三環(huán)域4同源。
在某些實(shí)施方案中，所述編碼的多肽與SEQ ID NO2所示出的序列的同一性為至少90％，95％，或98％。另外，所述編碼的多肽可以是SEQ ID NO2所示出的序列。
所述多核苷酸的核苷酸序列可以是SEQ ID NO1所示出的序列或其簡并變體。所述核苷酸序列可以編碼一種多肽，其具有與天然人纖溶酶原的三環(huán)域1或三環(huán)域4結(jié)構(gòu)域同源的N-末端三環(huán)域；和與人纖溶酶原中的相應(yīng)結(jié)構(gòu)域同源的C-末端結(jié)構(gòu)域激活位點(diǎn)和絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域。所述核苷酸序列還可以編碼這樣的多肽，其具有單一的N-末端三環(huán)域，它與天然人纖溶酶原的三環(huán)域1或三環(huán)域4結(jié)構(gòu)域至少90％相同；和與人纖溶酶原的激活位點(diǎn)和絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域的同一性為至少90％的C-末端結(jié)構(gòu)域。所述編碼的多肽能夠結(jié)合固定化的賴氨酸。
另一方面，本發(fā)明提供了多肽，其具有N-末端三環(huán)域，與天然人纖溶酶原的三環(huán)域同源；和與人纖溶酶原中的相應(yīng)結(jié)構(gòu)域同源的C-末端結(jié)構(gòu)域激活位點(diǎn)和絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域。
在某些實(shí)施方案中，所述多肽可具有與天然人纖溶酶原的三環(huán)域1或三環(huán)域4同源的N-末端三環(huán)域。
在某些實(shí)施方案中，所述多肽可以表現(xiàn)出纖維蛋白溶解活性，該活性可以被α2-抗纖溶酶抑制，抑制速度比α2-抗纖溶酶對小-纖溶酶的纖維蛋白溶解活性的抑制速度快至少大約5倍。被α2-抗纖溶酶抑制的速度還可以比對小-纖溶酶的抑制速度快至少大約10倍，20倍，30倍，或40倍。
在某些實(shí)施方案中，所述多肽能夠結(jié)合固定化的賴氨酸。所述固定化的賴氨酸可以是結(jié)合在固體支持基質(zhì)上的選自下列一組的賴氨酸賴氨酸-瓊脂糖，賴氨酸-BIOGEL(BioRad，Hercules，CA)，賴氨酸-HYPERD(Pall Life Sciences，East Hills，NY，一種賴氨酸-水凝膠)，賴氨酸-SEPHAROSE(SEPHAROSE是一種交聯(lián)的瓊脂糖)。所述固定化的賴氨酸可以是賴氨酸-SEPHAROSE。
在某些實(shí)施方案中，所述多肽可表現(xiàn)出對血纖蛋白原的結(jié)合親和力比小-纖溶酶對血纖蛋白原的結(jié)合親和力低。
在某些實(shí)施方案中，所述多肽可表現(xiàn)出對部分裂解的血纖蛋白的結(jié)合親和力比小-纖溶酶對部分裂解的血纖蛋白的結(jié)合親和力高。
在某些實(shí)施方案中，所述多肽可以具有位于纖溶酶原激活位點(diǎn)和纖溶酶原絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域的N-末端的單一的三環(huán)域，其中，所述三環(huán)域與天然人纖溶酶原的三環(huán)域1或三環(huán)域4的氨基酸序列同一性，比與天然人纖溶酶原的三環(huán)域5的序列同一性多至少一個殘基。對于這些實(shí)施方案來說，可以理解的是，本發(fā)明多肽的三環(huán)域區(qū)相對于人纖溶酶原的三環(huán)域1和三環(huán)域4的天然序列的保守性置換就與三環(huán)域5作同一性比較目的而言不被認(rèn)為與所述天然序列不同。
在某些實(shí)施方案中，所述多肽可以具有SEQ ID NO2所示出的氨基酸序列，及其保守性置換。所述多肽可以在相對位置具有與SEQ IDNO2所示出的氨基酸序列的76位上的殘基(其為精氨酸)類似的殘基。
另一方面，本發(fā)明包括含有本發(fā)明的多核苷酸的載體，以及含有所述載體的培養(yǎng)的宿主細(xì)胞。
附圖的簡要說明

圖1是在通過蛋白酶剪切激活之后天然纖溶酶的示意圖。K1-K5是三環(huán)域區(qū)1-5；而SP是絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域。“α2-AP”是三環(huán)域1上的α2-抗纖溶酶結(jié)合部位。
圖2是本發(fā)明的纖溶酶原缺失變體的示意圖，使用圖1所示的相同的命名，并且顯示K2-5的缺失。
圖3顯示人纖溶酶原的氨基酸序列，顯示19個殘基的前導(dǎo)序列，編號為-19至-1，并且纖溶酶原序列顯示為1-791號殘基(參見SEQ IDNO3(人纖溶酶原的cDNA序列；和SEQ ID NO4，所編碼的氨基酸序列，如圖3所示)。示出了多種特征，包括以下特征Δ-纖溶酶原序列(加陰影的)；三環(huán)域1-5(雙下劃線)；糖基化位點(diǎn)Asn289和Thr346(粗體)；纖溶酶原激活A(yù)rg-Val激活位點(diǎn)(粗體)；和三環(huán)域1中的賴氨酸-結(jié)合部位(加下劃線并且具有特定的位置編號)。
圖4顯示天然人纖溶酶(原)的五個三環(huán)域(1-5)之間的多肽序列比較。與三環(huán)域1中相同的相對位置上的氨基酸殘基相同的氨基酸殘基用下劃線表示。
圖5顯示非還原的(泳道1)和還原的(泳道2)Δ-纖溶酶原制劑的8-25％梯度的SDS-PAGE。通過鏈激酶(泳道3)，組織纖溶酶原激活物(tPA)(泳道4)，和尿激酶(泳道5)將Δ-纖溶酶原激活成Δ-纖溶酶，導(dǎo)致了由通過兩個二硫鍵連接的三環(huán)域1(K1)和絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域(SP)組成的雙鏈分子的形成。
圖6是通過尿激酶激活Δ-纖溶酶原的示意圖。將尿激酶(5.8nM)添加到溫度為37℃的在含有1.0mM S-2251的PBS中的5μMΔ-纖溶酶原溶液中。在405nm波長下監(jiān)測吸光度的增加。
圖7是顯示Δ-纖溶酶原與賴氨酸-SEPHAROSE 4B結(jié)合的色譜圖將0.5mg純化的Δ-纖溶酶原加樣到賴氨酸-SEPHAROSE 4B柱(1×3cm)上，該柱用Tris-緩沖的鹽水，pH 7.4平衡。結(jié)合的蛋白由0-20mM梯度的ε-氨基己酸(ε-ACA)作為單一的峰從所述柱上洗脫。在280nm處的吸光度和ε-ACA濃度作為洗脫液體積的函數(shù)表現(xiàn)在所述曲線圖上。
圖8顯示Δ-纖溶酶原與血纖蛋白的結(jié)合。將不同濃度的Δ-纖溶酶原與血纖蛋白凝塊一起在微量滴定板中在37℃下溫育1小時。在溫育之后，用PBS充分洗滌所述凝塊，并且向每一個孔中添加0.1mg/mltPA的溶液。在37℃下溫育2小時之后，除去液體，并且用1)0μl的1M NaOH重配殘留的固體凝塊。通過測定這些重配凝塊的280nm的吸光度來定量殘留血纖蛋白的數(shù)量。由Δ-纖溶酶原結(jié)合血纖蛋白導(dǎo)致的纖維蛋白溶解的程度在所述曲線圖上以Δ-纖溶酶原濃度的函數(shù)形式作圖(實(shí)線)。虛線表示試驗(yàn)數(shù)據(jù)與結(jié)合方程的最佳擬合。
圖9顯示在非還原的(泳道1)和還原的條件(泳道2)下的起始Δ-纖溶酶原的8-25％梯度的SDS-PAGE，以及同樣是在非還原的(泳道3)和還原的(泳道4)條件下的最終的Δ-纖溶酶制劑的8-25％梯度的SDS-PAGE。
圖10顯示纖溶酶，小-纖溶酶，微-纖溶酶，和Δ-纖溶酶的示意圖，以及酶活性的相應(yīng)表征(針對底物S-2251(D-Val-Leu-Lys-對硝基苯胺(p-nitroanilide)，DiaPharma Group有限公司，West Chester，OH)的kcat和KM)。
圖11是Δ-纖溶酶誘導(dǎo)的收縮全血凝塊溶解的示意圖。向每一個凝塊(0.8×7cm)注入1ml體積的載體(酸化鹽水，pH 3.6)，纖溶酶(1.0mg/ml)，或Δ-纖溶酶(0.44mg/ml)，并且在37℃下讓凝塊溶解進(jìn)行1小時。
本發(fā)明的說明為了提供具有全長纖溶酶的血纖蛋白-和抗纖溶酶-結(jié)合特性的簡單的非糖基化分子，本發(fā)明提供了纖溶酶原的缺失突變體。在該突變體(在本文中被稱為Δ-纖溶酶原)中，位于與三環(huán)域1同源的結(jié)構(gòu)域和激活位點(diǎn)之間的天然氨基酸序列的至少一部分缺失了。一方面，與人纖溶酶原的天然三環(huán)域1結(jié)構(gòu)域同源的結(jié)構(gòu)域可以直接連到纖溶酶原的絲氨酸蛋白酶部分，或它的同源性功能類似物，基本上只有包含纖溶酶原激活位點(diǎn)的間插天然序列保留在這兩個結(jié)構(gòu)域之間。
本發(fā)明的Δ-纖溶酶(原)可表征為Δ-纖溶酶的較低分子量(37，198Da)可以產(chǎn)生增加的比活性(每毫克蛋白)；缺少天然蛋白中見到的至少兩個糖基化位點(diǎn)(參見圖3)，結(jié)合相對低的分子量，有利于利用相對廉價的細(xì)菌和酵母表達(dá)系統(tǒng)重組生產(chǎn)這種蛋白；Δ-纖溶酶原可以通過纖溶酶原激活物tPA，尿激酶，和鏈激酶激活；與天然三環(huán)域1同源的結(jié)構(gòu)域的存在，保持了纖溶酶的血纖蛋白-結(jié)合特性，這對于溶解血栓的效力來說是重要的；α2-抗纖溶酶-結(jié)合部位在與三環(huán)域1同源的結(jié)構(gòu)域上的存在使得Δ-纖溶酶能夠被纖溶酶的這種生理學(xué)抑制劑迅速抑制(一種能夠阻止出血的特征)；Δ-纖溶酶的大小較小有利于其被α2-巨球蛋白抑制，相對天然纖溶酶來說進(jìn)一步減小了出血并發(fā)癥的機(jī)會。在特定實(shí)施方案中，三環(huán)域5(它保留了對完整的未消化過的血纖蛋白(原)的原始結(jié)合部位)的缺乏，使得可以使用Δ-纖溶酶而減少對循環(huán)血纖蛋白原的消耗。
一般來說，本發(fā)明提供了重組纖溶酶(原)分子，它具有單一的三環(huán)域區(qū)，位于激活位點(diǎn)和絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域的N-末端，相對小-纖溶酶(原)來說具有某些優(yōu)點(diǎn)。盡管本發(fā)明的Δ-纖溶酶原多肽只具有一個三環(huán)域區(qū)，并就這樣位于激活位點(diǎn)的N-末端，某些實(shí)施方案包括位于所述激活位點(diǎn)的N-末端的額外序列。額外的N-末端序列可來自纖溶酶原的天然三環(huán)域區(qū)的序列。
本發(fā)明的N-末端三環(huán)域包括天然纖溶酶(原)的三環(huán)域1和4的三環(huán)域序列，及其功能性等同物。具體地講，參見下面的討論，其中提供了有關(guān)保留多肽變體的功能的指南，包括保留參與或影響賴氨酸結(jié)合的殘基。
定義如在本文中使用的，術(shù)語多肽的“結(jié)構(gòu)域”和“區(qū)”一般是同義的，除非作出了相反的說明。在與諸如“三環(huán)域”或“絲氨酸蛋白酶”等的公認(rèn)的結(jié)構(gòu)或功能命名一起引用時，所述術(shù)語會引入與至少某些特征相關(guān)的多肽特征，這些特征被普遍認(rèn)可并且理解為與對應(yīng)所述命名的多肽結(jié)構(gòu)相關(guān)。
在本文中使用的″培養(yǎng)的宿主細(xì)胞″表示包含業(yè)已通過任何方法導(dǎo)入細(xì)胞的異源DNA的原核或真核細(xì)胞，所述方法例如電穿孔，磷酸鈣沉淀，顯微注射，轉(zhuǎn)化和病毒感染等。
在本文中使用的″異源的″表示″具有不同的天然來源″或表示非天然狀態(tài)。例如，如果培養(yǎng)的宿主細(xì)胞是用來自其他生物，特別是來自其他物種的DNA或基因轉(zhuǎn)化的，所述基因相對于該培養(yǎng)的宿主細(xì)胞來說是異源的，并且相對于攜帶所述基因的培養(yǎng)的宿主細(xì)胞的后代來說也是異源的。類似地，“異源的”表示來自并且插入相同的天然原始細(xì)胞類型的核苷酸序列，不過它是以非天然狀態(tài)存在的，例如，不同的拷貝數(shù)或處于不同的調(diào)控元件的控制下。
″載體″分子是可以插入異源核酸的核酸分子，隨后可以將它導(dǎo)入合適的培養(yǎng)的宿主細(xì)胞。載體優(yōu)選具有一個或多個復(fù)制起點(diǎn)，以及一個或多個可以插入重組DNA的位點(diǎn)。載體通常具有便利手段，通過它可以從沒有載體的細(xì)胞中選擇具有載體的細(xì)胞，例如，它們編碼耐藥性基因。常見的載體包括質(zhì)粒，病毒基因組，和(主要是在酵母和細(xì)菌中)″人工染色體″。
在本文中使用的術(shù)語″轉(zhuǎn)錄控制序列″表示核酸序列，如起始序列，增強(qiáng)子序列和啟動子序列，其誘導(dǎo)，抑制，或以其他方式控制可操作地與它連接的蛋白編碼核酸序列的轉(zhuǎn)錄。
術(shù)語″多肽″在本文中可以與術(shù)語″肽″和″蛋白″交換使用。
術(shù)語“多核苷酸”和“核酸”在本文中可以交換使用，并且可以表示包含對本文所述目的必要的信息的任何核酸。就是說，所述核酸可以是DNA或RNA，是單鏈的或雙鏈的，或其他核酸，只要所述多聚物能夠體現(xiàn)合適的信息就行，例如就所編碼的肽而言，并且可以包括互補(bǔ)序列，例如，核酸聚合體的正義鏈和反義鏈。
術(shù)語多肽的″變體″表示改變了一個或多個氨基酸的氨基酸序列。變體可以具有″保守性″改變，其中，置換的氨基酸具有類似的結(jié)構(gòu)或化學(xué)特性，例如，用異亮氨酸置換亮氨酸。另外，變體可以具有″非保守性″變化，例如，用色氨酸置換甘氨酸。類似的次要變化還可以包括氨基酸缺失或插入或這兩者。一種具體形式的″變體″多肽是″功能性等同的″多肽，即，表現(xiàn)出與本發(fā)明的多肽實(shí)例大體上類似的體內(nèi)或體外活性的多肽，正如下面更詳細(xì)地披露的。可以使用本領(lǐng)域眾所周知的計(jì)算機(jī)程序?qū)ふ覜Q定哪一個氨基酸殘基可以被置換，插入或缺失，而又不消除生物學(xué)或免疫學(xué)活性的指南，例如，DNASTAR軟件(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)。另外，下面提供了具體的指南，包括在被以全文形式收作本文參考的引用的參考文獻(xiàn)中提供的指南。
在本文中使用的術(shù)語“N-末端”和“C-末端”表示它們所應(yīng)用的任何氨基酸序列或多肽結(jié)構(gòu)域或結(jié)構(gòu)的相對位置。根據(jù)本說明書可以了解相對定位。就是說，“N-末端”特征位于比在相同上下文中討論的另一特征至少更靠近多肽分子的N-末端(所述另-個特征可能稱為處于第一種特征的“C-末端”)。類似地，在本文中術(shù)語“5’-”和“3’-”可用于表示多核苷酸中的特征的相對位置。
在這里所指的Δ-纖溶酶原/纖溶酶多肽表示具有“與天然人纖溶酶原的三環(huán)域同源”的N-末端結(jié)構(gòu)域，表現(xiàn)出與纖溶酶原的天然三環(huán)域類似的結(jié)構(gòu)和功能特征。另外，在本文中所指的Δ-纖溶酶原/纖溶酶多肽具有“與三環(huán)域1同源”的N-末端結(jié)構(gòu)域，表現(xiàn)出類似于天然三環(huán)域1的特征，至少達(dá)到所述多肽對ω-氨基羧酸類(和功能性同系物，如反-4-氨甲基環(huán)己烷-1-羧酸，一種環(huán)酸)的親和力比三環(huán)域5高的程度。例如，參見Chang，Y.，et al.，Biochemistry 373258-3271(1998)，被收作本文參考，有關(guān)用于比較分離的三環(huán)域多肽與以下化合物的結(jié)合的條件和方案5-氨基戊酸(5-APnA)；6-氨基己酸(6-AHxA)，又被稱作ε-氨基己酸(εACA)；7-氨基庚酸(7-AHpA)；和反-4-氨甲基環(huán)己烷-1-羧酸(t-AMCHA)。
所提到的“與三環(huán)域4同源”的三環(huán)域是以與上文所提到的術(shù)語“與三環(huán)域1同源”類似的方式定義的。就是說，如上文所討論的，它們表現(xiàn)出與天然人纖溶酶原的三環(huán)域1類似的功能特征。這些多肽還如上所述能結(jié)合固定化的賴氨酸。
本發(fā)明的多肽結(jié)合固定化的賴氨酸。在本文中使用的短語“結(jié)合固定化的賴氨酸”表示如此表征的多肽與小-纖溶酶原相比，在使用賴氨酸-SEPHAROSE作為層析介質(zhì)進(jìn)行柱層析時，其前進(jìn)延遲。通常，本發(fā)明的多肽可以使用含有特異性配體例如εACA的溶液作為洗脫劑從所述層析介質(zhì)(賴氨酸親和樹脂)中洗脫。
另外，除了上面提到的Chang等的文獻(xiàn)之外，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以查閱其他參考文獻(xiàn)，以確定哪些殘基可以通過保守性或非-保守性置換，缺失或添加加以改變，以便得到本發(fā)明范圍內(nèi)的缺失突變體。例如，以下參考文獻(xiàn)提供了有關(guān)可能對ω氨基羧酸的結(jié)合起著重要作用的天然三環(huán)域中的特定殘基的信息授予Ji等的美國專利號6,538,103；授予Suzuki的美國專利號6,218,517；Douglas，J.T.，et al.，Biochemistry 41(10)3302-10(2002)；Zajicek，J.，et al.，J.Mol.Biol.，301(2)333-47(2000)；Lee，H.，et al.，Arch BiochemBiophys.，375(2)359-63(2000)；Castellino，F(xiàn).和S.McCance，Ciba Found Symp.21246-60(1997)；McCance，S.，et al.，J.Biol.Chem.，26932405-32410(1994)；Rejante，M.R.和M.Llinas，Eur.J.Biochem.，221(3)939-49(1994)；Wu，T.P.，et al.，Blood Coagul.Fibrinolysis，5(2)157-66(1994)；Hoover，C.J.，et al.，Biochemistry，32(41)10936-43(1993)；Menhart，N.，et al.，Biochemistry，328799-8806(1993)；Thewes，T.，et al.，J.Biol.Chem.，265(7)3906-3915(1990)；Novokhatny，V.，et al.，ThrombRes.，53(3)243-52(1989)；Motta，A.，et al.，Biochemistry，26(13)3827-36(1987)；Novokhatny，V.，et al.，J.Mol.Biol.，179215-232(1984)；Lerch，P.G.，et al.，Eur.J.Biochem.，107(1)7-13(1980)；Sottrup-Jensen，L.，et al.，Prog.Chem.Fibrinol.Thrombol.，3191-209(1978)；和Wiman，B.和D.Collen，Nature 272，549-545(1978)，所有文獻(xiàn)都以全文形式收作本文參考。
由于本發(fā)明人業(yè)已認(rèn)識到可以制備有價值的簡化的纖溶酶(原)分子，它具有N-末端三環(huán)域，具有有利的功能性特征(可以通過檢測本文所述的對固定化的賴氨酸的結(jié)合而部分地進(jìn)行評價)，本發(fā)明可以包括位于激活位點(diǎn)N-末端的其他血纖蛋白-結(jié)合結(jié)構(gòu)域或區(qū)。例如，本發(fā)明可以包括這樣的多肽，其中，纖溶酶的絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域連到選自下列一組的血纖蛋白-結(jié)合三環(huán)域包括但不局限于人纖溶酶原的三環(huán)域4，tPA的三環(huán)域2，或載脂蛋白(a)的三環(huán)域。另外，本發(fā)明可以包括這樣的多肽，其中，纖溶酶的絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域連接到任何其他已知的血纖蛋白-結(jié)合分子上，例如，tPA或纖連蛋白的“指狀”結(jié)構(gòu)域，或血纖蛋白-特異性IgG的FAB片段。
在特定實(shí)施方案中，位于Δ-纖溶酶原的N-末端三環(huán)域的某些位置上的殘基相對天然人纖溶酶原的三環(huán)域1來說是保守的。這些可以是處在與賴氨酸結(jié)合相關(guān)的位置上的殘基，并且包括Pro136-Pro140，Pro143-Tyr146，以及Arg153-Tyr156(位置編號如圖3所示)。本發(fā)明的Δ-纖溶酶原的某些實(shí)施方案在153位上可以具有Arg。在其他實(shí)施方案中，所述殘基的具體位置可以略有改變，而仍然出現(xiàn)在所述多肽的結(jié)構(gòu)和功能類似的位置上(即相對N-末端結(jié)構(gòu)域的三環(huán)域結(jié)構(gòu)；參見Chang，Y.，et al.正如上文所討論的)。在某些實(shí)施方案中，Δ-纖溶酶(原)多肽的N-末端三環(huán)域區(qū)與天然人纖溶酶原的三環(huán)域1或三環(huán)域4的百分同一性，比與天然人纖溶酶原的三環(huán)域5的百分同一性大至少一個殘基。
另外，本發(fā)明的具體實(shí)施方案可以通過與具有類似結(jié)構(gòu)域組成(即，三環(huán)域-絲氨酸蛋白酶(K-SP))的小-纖溶酶(原)相比進(jìn)行功能性表征(參見Sottrup-Jensen，L.，et al.，Progress in ChemicalFibrinolysis and Thrombolysis，Vol.3，(EdsJ.F.Davidson，et al.)Raven Press，New York(1978))。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的Δ-纖溶酶表現(xiàn)出被α2-抗纖溶酶抑制的速度增加，例如，比對小-纖溶酶的抑制速度快大約一或兩個數(shù)量級那么多。另外，在特定實(shí)施方案中，Δ-纖溶酶能結(jié)合固定化的賴氨酸(例如，賴氨酸-SEPHAROSE)。
Δ-纖溶酶原的三環(huán)域被表征為“N-末端”僅表示該結(jié)構(gòu)域存在于激活位點(diǎn)的N-末端，而不表示不存在位于所述結(jié)構(gòu)域本身的N-末端的額外氨基酸殘基。另外，介于與三環(huán)域1同源的結(jié)構(gòu)域和纖溶酶原的激活位點(diǎn)之間的殘基的數(shù)量和身份可以改變，而又不超出本發(fā)明的范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠確定能獲得本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)(ω氨基羧酸的三環(huán)域1-樣結(jié)合，而又不會顯著增加缺失突變體的大小或?qū)霛撛谟袉栴}的糖基化位點(diǎn))的這些變體，在本文公開內(nèi)容和本文引用的文獻(xiàn)有關(guān)三環(huán)域1功能和結(jié)構(gòu)的指南的基礎(chǔ)上無需進(jìn)行過多實(shí)驗(yàn)。
因此，本發(fā)明涉及多核苷酸，多肽，生產(chǎn)所述多肽的重組方法，包含所述多核苷酸的載體，用于生產(chǎn)所述多肽的表達(dá)系統(tǒng)，以及包含所述表達(dá)系統(tǒng)的培養(yǎng)的宿主細(xì)胞。
正如所指出的，一方面本發(fā)明涉及編碼本文所披露的多肽或具有其保守性氨基酸置換的多肽的多核苷酸。下面將更詳細(xì)地提供有關(guān)選擇“保守性”氨基酸置換的指南。在一種實(shí)施方案中，所述多核苷酸是DNA。
另一方面，本發(fā)明涉及制備載體的方法，包括將本發(fā)明的多核苷酸插入載體。另一方面，本發(fā)明涉及通過本發(fā)明方法生產(chǎn)的載體。
另一方面，本發(fā)明涉及制備培養(yǎng)的宿主細(xì)胞的方法，包括將本發(fā)明的載體導(dǎo)入培養(yǎng)的宿主細(xì)胞。另一方面，本發(fā)明涉及通過本發(fā)明方法生產(chǎn)的培養(yǎng)的宿主細(xì)胞。
另一方面，本發(fā)明涉及通過包括以下步驟的方法生產(chǎn)的本發(fā)明的分離的多肽(a)將包含編碼所述多肽的多核苷酸的載體導(dǎo)入培養(yǎng)的宿主細(xì)胞；(b)培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞；和(c)回收所述多肽。另一方面，本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)多肽的方法，包括(a)在表達(dá)所述載體的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細(xì)胞；和(b)回收多肽。
另一方面，本發(fā)明涉及包含至少一種本發(fā)明的多核苷酸的細(xì)胞。
在一種實(shí)施方案中，所述多核苷酸包含SEQ ID NO1所示出的核苷酸序列。在另一種實(shí)施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO2所示出的氨基酸序列。
多核苷酸本發(fā)明的多核苷酸包括具有可能涉及一個或多個核苷酸的置換，缺失和/或添加的變體。所述變體可以在編碼區(qū)，非編碼區(qū)，或這兩個區(qū)改變。編碼區(qū)的改變可以產(chǎn)生保守性或非保守性氨基酸置換，缺失或添加。其中特別優(yōu)選的是沉默置換，添加和缺失，這種變化不會改變Δ-纖溶酶(原)蛋白或其部分的特性和活性。在這一方面同樣特別優(yōu)選的是保守性置換(參見下文)。
本發(fā)明的其他實(shí)施方案包括核酸分子，包含具有與以下序列至少90％，更優(yōu)選至少95％，96％，97％，98％或99％相同的核苷酸序列的多核苷酸(a)編碼具有SEQ ID NO2所示出的完整氨基酸序列的Δ-纖溶酶原多肽的核苷酸序列；(b)編碼具有SEQ ID NO2所示出的氨基酸序列的Δ-纖溶酶原多肽的核苷酸序列；和(c)與上面的(a)或(b)中的任意核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。
在說到多核苷酸的核苷酸序列與編碼Δ-纖溶酶原多肽的參考核苷酸序列至少例如95％“相同”時，表示所述多核苷酸的核苷酸序列與所述參考序列相同，所不同的是，所述多核苷酸序列在編碼Δ-纖溶酶原多肽的參考核苷酸序列的每100個核苷酸中可包括多至5個點(diǎn)突變。換句話說，為了獲得核苷酸序列與參考核苷酸序列至少95％相同的多核苷酸，參考序列中多至5％的核苷酸可以缺失或用其他核苷酸置換，或可以將數(shù)目高至參考序列總核苷酸5％的核苷酸插入所述參考序列。所述參考序列的這些突變可以發(fā)生在參考核苷酸序列的5’或3’末端位置，或位于兩個末端位置之間的任何位置，單獨(dú)分散在參考序列的核苷酸之中或者在參考序列內(nèi)的一個或多個連續(xù)的組中。
正如上文所指出的，可以通過確定它們的百分同一性比較兩個或多個多核苷酸序列。同樣可以通過確定它們的百分同一性比較兩個或多個氨基酸序列。無論是核酸或肽序列，兩個序列的百分同一性一般被描述為兩個比對序列之間的完全匹配的數(shù)目除以較短序列的長度并且乘以100。核酸序列的近似比對是通過Smith和Waterman的局部同源性算法提供的，見Advances in Applied Mathematics 2482-489(1981)。該算法可以擴(kuò)展到用于肽序列，采用由Dayhoff開發(fā)的評分矩陣，見Atlas of Protein Sequences and Structure，M.O.Dayhoff ed.，5 suppl.3353-358，National Biomedical ResearchFoundation，Washington，D.C.，USA，并且由Gribskov統(tǒng)一化，見Nucl.Acids Res.14(6)6745-6763(1986)。這種算法對于核酸和肽序列的一種實(shí)施是由Genetics Computer Group(Madison，Wis.)在他們的BESTFIT應(yīng)用程序中提供的。該方法的預(yù)設(shè)參數(shù)披露于以下文獻(xiàn)中Wisconsin Sequence Analysis Package Program Manual，Version 8(1995)(可以從Genetics Computer Group，Madison，Wis.獲得)。
當(dāng)然，由于遺傳密碼的簡并性，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員很容易意識到與SEQ ID NO1所示出的核酸序列具有至少90％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的大量的核酸分子都能夠編碼Δ-纖溶酶原多肽。實(shí)際上，由于所述核苷酸序列的簡并變體都編碼相同的多肽，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，甚至不需要進(jìn)行本文所披露的任何功能分析或測定。本領(lǐng)域還可以理解的是，對于不是簡并變體的這類核酸分子來說，也會有合理數(shù)量的核酸分子編碼具有Δ-纖溶酶原多肽活性的多肽。這是因?yàn)榧夹g(shù)人員完全了解不太可能或不可能顯著影響蛋白功能的氨基酸置換(例如，將一種脂肪族氨基酸置換為另一種脂肪族氨基酸)。
最近，在較長的多核苷酸序列的合成生產(chǎn)方面的進(jìn)展業(yè)已能夠合成生產(chǎn)編碼顯著更長的多肽的核酸，而不使用傳統(tǒng)克隆技術(shù)。這些服務(wù)的商業(yè)提供者包括Blue Heron有限公司，Bothell，WA(http//www.blueheronbio.com)。由Blue Heron有限公司所采用的技術(shù)披露于美國專利6,664,112；6,623,928；6,613,508；6,444,422；6,312,893；4,652,639；美國公開專利申請?zhí)?0020119456A1；20020077471A1；和公開的國際專利申請(
發(fā)明者J·A·亨特, V·諾沃哈特尼 申請人:泰勒克里斯生物治療學(xué)公司