專利名稱：溶菌酶－脫乙酰殼多糖膜的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明公開了特定用于保護(hù)食品的抗微生物膜。
背景技術(shù)：
在固體或半固體食品中，微生物生長主要發(fā)生在表面上。加熱處理和化學(xué)防腐劑是用于維持微生物學(xué)安全和食物質(zhì)量的最廣泛使用的方法。微生物抗性增強(qiáng)的包裹膜通過抗微生物物質(zhì)從承載膜結(jié)構(gòu)至食物表面的緩釋而具有用于確保食物表面微生物學(xué)安全性的巨大潛力。此外，消費(fèi)者對于合成化學(xué)食品防腐劑的擔(dān)憂已引起對替代的更“有利于消費(fèi)者”的可食用保護(hù)膜更廣泛的興趣。
溶菌酶為在許多天然系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的經(jīng)過充分研究的水解酶。其為具有充分研究的空間結(jié)構(gòu)和序列的小并且穩(wěn)定的酶。溶菌酶由于其在寬范圍的pH和溫度條件下的穩(wěn)定性而具有用于食品保藏中的潛力。然而，其對革蘭氏陰性細(xì)菌有限的抗菌效力限制了其在食品工業(yè)中的應(yīng)用。脫乙酰殼多糖為已知的成膜生物聚合物，其也表現(xiàn)出抗微生物活性。
如今，對具有增強(qiáng)的微生物抗性并且機(jī)械性能沒有顯著削弱的膜具有持續(xù)的需求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明公開的一個(gè)方面涉及包括整合在脫乙酰殼多糖聚合物基質(zhì)內(nèi)的溶菌酶的復(fù)合膜。另一個(gè)方面中，本發(fā)明公開了包括脫乙酰殼多糖，以及基于脫乙酰殼多糖重量的約10至約200重量百分比的溶菌酶的膜。
本發(fā)明還公開了用于制備膜的方法，包括將脫乙酰殼多糖和溶菌酶溶解或分散于水介質(zhì)中而產(chǎn)生成膜溶液或分散體；向基質(zhì)表面施加該成膜溶液或分散體；并且將成膜溶液或分散體轉(zhuǎn)化為膜。
在尤其有效的應(yīng)用中，該膜為用于食品的抗微生物保護(hù)劑。


圖1圖示了作為時(shí)間的函數(shù)的溶菌酶從溶菌酶脫乙酰殼多糖復(fù)合膜基質(zhì)向0.15M磷酸鹽緩沖液的釋放模式圖。N＝6；L0＝0％溶菌酶(w/w脫乙酰殼多糖)；L20＝20％溶菌酶(w/w脫乙酰殼多糖)；L60＝60％溶菌酶(w/w脫乙酰殼多糖)；L100＝100％溶菌酶(w/w脫乙酰殼多糖)。膜厚度為72.6±8.2μm。
圖2A和2B圖示了溶菌酶-脫乙酰殼多糖復(fù)合膜對BHI肉湯培養(yǎng)基中E.coli(2A)和MRS肉湯培養(yǎng)基中糞鏈球菌(2B)的作用效果的圖。N＝6；對照＝無膜；L0＝0％溶菌酶(w/w脫乙酰殼多糖)；L20＝20％溶菌酶(w/w脫乙酰殼多糖)；L60＝60％溶菌酶(w/w脫乙酰殼多糖)；L100＝100％溶菌酶(w/w脫乙酰殼多糖)。
圖3A-3D為在1,000X放大倍數(shù)時(shí)溶菌酶脫乙酰殼多糖復(fù)合膜表面的掃描電子顯微鏡照片；L0(3A)、L20(3B)、L60(3C)、L100(3D)。L0＝0％溶菌酶(w/w脫乙酰殼多糖)；L20＝20％溶菌酶(w/w脫乙酰殼多糖)；L60＝60％溶菌酶(w/w脫乙酰殼多糖)；L100＝100％溶菌酶(w/w脫乙酰殼多糖)。
圖4A-4D為在1,000X放大倍數(shù)時(shí)溶菌酶-脫乙酰殼多糖復(fù)合膜橫截面的掃描電子顯微鏡照片；L0(4A)、L20(4B)、L60(4C)、L100(4D)。L0＝0％溶菌酶(w/w脫乙酰殼多糖)；L20＝20％溶菌酶(w/w脫乙酰殼多糖)；L60＝60％溶菌酶(w/w脫乙酰殼多糖)；L100＝100％溶菌酶(w/w脫乙酰殼多糖)。
發(fā)明詳述為了便于理解，以下更詳細(xì)描述了此處所用的下列術(shù)語“環(huán)境室內(nèi)條件”指約10℃至約40℃，通常約20℃至約25℃的室溫，大約1個(gè)大氣壓的壓力，以及包含一定量濕氣的氣氛。
“類似物”為化學(xué)結(jié)構(gòu)不同于親本化合物的分子，例如同系物(因化學(xué)結(jié)構(gòu)的增加而不同，如烷基鏈長度的不同)、分子片段，一個(gè)或多個(gè)官能團(tuán)不同，或電離改變的結(jié)構(gòu)。
“抗微生物有效量”為相比缺乏抗微生物組分的對照樣品，足以抑制樣品中至少一種微生物的生長達(dá)到統(tǒng)計(jì)上顯著的程度，優(yōu)選至少約25％，更優(yōu)選至少約50％，且最優(yōu)選完全抑制該微生物的生長的抗微生物組分或組分混合物的量。
如下文更詳細(xì)描述的“脫乙酰殼多糖”(還稱為聚-(1→4)-β-D-葡糖胺)包括去乙酰化的殼多糖(殼多糖也稱為β-(1→4)-聚-N-乙?；?D-葡糖胺)及其鹽。甲殼類水生物和甲殼綱動物的殼為脫乙酰殼多糖所來源的殼多糖的常見來源。
“膜”包括涂層，并且該膜在其施用的食品表面或在其形成的食品表面可以是間斷的或基本上連續(xù)的。例如，“膜”包括可覆蓋于食品上的獨(dú)立膜以及通過噴涂、浸涂、點(diǎn)涂或類似的技術(shù)在食品上形成的涂層。
“抑制”指此處公開的膜減緩或終止某些微生物在某時(shí)段的生長或增殖。
“溶菌酶”表示催化某些細(xì)菌細(xì)胞壁粘多糖水解，具體地為N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡糖胺之間的β(1-4)糖苷鍵，并引起細(xì)菌溶解的酶家族?？捎糜诖颂幍娜芫赴ㄌ烊?存在的溶菌酶、合成的溶菌酶以及下文更詳細(xì)描述的重組溶菌酶。
“微生物”或“微生物的”用于指顯微鏡可見的生物體或物質(zhì)，包括能感染人或動物和/或引起食物腐敗或其他不合需要的食物降解或改變的真菌和細(xì)菌生物體。因此，術(shù)語“抗-微生物的”此處用于指殺死或抑制真菌和/或細(xì)菌生物體生長的材料或試劑。
以上術(shù)語描述僅用以幫助讀者而提供，而不應(yīng)該視為具有小于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所理解的范圍或限制所附權(quán)利要求的范圍。
除非上下文另有明確表明，單數(shù)術(shù)語“一”、“一個(gè)”和“這個(gè)”包括復(fù)數(shù)對象。類似地，除非上下文另有明確表明，單詞“或者”包括“和”。單詞“包含”指“包括”。除非另有陳述，化學(xué)命名法中組分的描述指在添加至說明書中任何指定組合時(shí)的組分，但不一定預(yù)先排除一旦混合后混合物組分中的化學(xué)相互作用。
此處公開的膜包括至少一種脫乙酰殼多糖和至少一種溶菌酶，其中兩者都為可大量獲得的可更新材料。已發(fā)現(xiàn)基于脫乙酰殼多糖的膜基質(zhì)可有效攜帶產(chǎn)生溶菌酶-脫乙酰殼多糖復(fù)合膜的高濃度的溶菌酶。溶菌酶可以緩釋的方式從聚合脫乙酰殼多糖膜基質(zhì)釋放并且保留其對細(xì)菌細(xì)胞壁基質(zhì)的溶解活性。例如，抗微生物組分溶菌酶(以及某些情況中的脫乙酰殼多糖)可從膜釋放并且遷移入食品結(jié)構(gòu)中。與單獨(dú)的脫乙酰殼多糖或單獨(dú)的溶菌酶相比，這種復(fù)合膜具有對革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細(xì)菌的增強(qiáng)、協(xié)同的抗微生物活性，而不削弱該膜的防潮層特性。在膜的某些例子中，所有組分為對人或動物消耗而言都是可安全食用的并且可從可更新的來源得到。此外，膜為可生物降解的。
溶菌酶基本上均勻分布于脫乙酰殼多糖分子形成的聚合網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中。溶菌酶可以分布于脫乙酰殼多糖網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)內(nèi)的微顆粒形式存在，其中溶菌酶分子與脫乙酰殼多糖分子氫鍵鍵合和/或通過范德華力互相作用。
脫乙酰殼多糖為來源豐富、可更新的并且無毒的聚合物，與許多其他物質(zhì)可以生物相容?？刹捎萌魏涡问交虻燃?例如食物或醫(yī)用)的脫乙酰殼多糖制備膜。例如，脫乙酰殼多糖的粘度平均分子量可在約20至約2,000kD的范圍，并且脫乙酰作用的程度在約70至約90％的范圍。根據(jù)一種用于產(chǎn)生膜的示例性方法，脫乙酰殼多糖組分(或不同脫乙酰殼多糖的混合物)最初溶于引起脫乙酰殼多糖鹽形成的酸水溶液中。產(chǎn)生存在于膜中的脫乙酰殼多糖鹽的例子包括脫乙酰殼多糖乙酸鹽、脫乙酰殼多糖山梨酸鹽、脫乙酰殼多糖丙酸鹽、脫乙酰殼多糖乳酸鹽、脫乙酰殼多糖谷氨酸鹽、脫乙酰殼多糖苯甲酸鹽、脫乙酰殼多糖檸檬酸鹽、脫乙酰殼多糖馬來酸鹽、脫乙酰殼多糖甘醇酸鹽、脫乙酰殼多糖丙烯酸鹽、脫乙酰殼多糖琥珀酸鹽、脫乙酰殼多糖草酸鹽、脫乙酰殼多糖抗壞血酸鹽、脫乙酰殼多糖酒石酸鹽和其混合物。膜中脫乙酰殼多糖的量可根據(jù)所需的膜性質(zhì)而改變。例如，基于膜的總固體重量，膜可包含約25至約90，更尤其約35至約65重量百分比的脫乙酰殼多糖。
溶菌酶為存在于各種生物體，包括病毒、禽類、哺乳動物和植物中的天然抗微生物多肽。人體內(nèi)，溶菌酶可見于脾臟、肺、腎、白血球、血漿、唾液、乳汁、眼淚和軟骨中。因此，溶菌酶可從人的乳汁、淚液、唾液和鼻涕中分離。在牛的乳汁和初乳中也得以發(fā)現(xiàn)。還可能從花椰菜汁分離溶菌酶。然而，允許溶菌酶以工業(yè)規(guī)模提取的最重要的來源為雞的清蛋白。溶菌酶亦稱為胞壁酸酶或N-乙?；邗Ｋ饷?。人形式還可以重組產(chǎn)生。在此處公開的膜中，溶菌酶的有效量可根據(jù)溶菌酶的來源而改變。一些溶菌酶比其它的更有效，雞的溶菌酶比人的溶菌酶活性要低。膜中溶菌酶的抗微生物有效量還可根據(jù)所需的膜性質(zhì)而改變。尤其是，溶菌酶的最低量應(yīng)足以提供抗微生物活性。溶菌酶的最大量不應(yīng)大至明顯降低膜的機(jī)械或水蒸氣滲透率性質(zhì)。例如，以脫乙酰殼多糖的重量計(jì)，溶菌酶可以約10至約200重量百分比的量，更尤其約10至約100重量百分比，并且最尤其約30至約90重量百分比存在于膜中。換言之，膜可包括上至兩倍脫乙酰殼多糖量的溶菌酶的量。如果溶菌酶的量超過以脫乙酰殼多糖的重量計(jì)的百分之200，膜可能變得非常易碎并且機(jī)械強(qiáng)度較弱。
膜的任選組分為至少一種增塑劑，其可以是或不是可更新的材料。增塑劑降低膜的脆性，并且提高膜的撓性和沖擊抗性。示例性的增塑劑包括甘油、山梨糖醇、丙二醇、乙二醇、二甘醇、三甘醇、聚乙二醇(例如，PEG300和PEG400)、酒石酸二丁酯、丙二醇、丁二醇、乙酰單酸甘油乙酯和其混合物。膜中增塑劑的量可根據(jù)所需的膜性質(zhì)而改變。尤其是，由于溶菌酶較弱的成膜性質(zhì)，增塑劑的量應(yīng)隨著溶菌酶濃度的增加而提高。例如，以脫乙酰殼多糖的重量計(jì)，膜可包含約1至約50，更尤其約20至約30重量百分比的增塑劑。
膜的另一種任選組分為至少一種交聯(lián)劑，其可以是或不是可更新的材料。交聯(lián)劑可改進(jìn)膜的防水汽特性并降低膜的水溶性。示例性的交聯(lián)劑包括戊二醛、甲醛、乙二醛、雙醛淀粉、包含多價(jià)離子(例如鈣和鎂陽離子)的物質(zhì)和其混合物。膜中交聯(lián)劑的量可根據(jù)所需的膜性質(zhì)而改變。例如，基于脫乙酰殼多糖的重量，膜可包含約1至約20，更尤其約5至約10重量百分比的交聯(lián)劑。
此外任選的組分包括抗氧化劑、另外的抗菌劑、調(diào)味劑/著色劑、疏水劑、營養(yǎng)藥品和類似的添加劑。為了改進(jìn)防水性質(zhì)，疏水添加劑，如脂肪酸(即油酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸和硬脂酸)、乙?；视王ァ⑾?即巴西棕櫚蠟、蜂蠟和石蠟)以及油劑(即，礦物油和植物油)可以脫乙酰殼多糖重量計(jì)的約20至約100％的濃度范圍整合到膜組合物中。營養(yǎng)劑，如礦物質(zhì)和維生素可整合到膜基質(zhì)中以增強(qiáng)包裝或涂層產(chǎn)品的營養(yǎng)價(jià)值。例如，可摻入鈣、鋅和維生素E以增強(qiáng)包裝或涂層產(chǎn)品的健康益處(參見Park，S.-I.和Zhao，Y.2004.Incorporationof High Concentration of Mineral or Vitamin into Chitosan-Based Films.Journal of Agricultural and Food Chemistry.2004，vol.52，PP.1933-1939)。
膜可通過任何成膜技術(shù)包括澆鑄(即獨(dú)立成膜)、浸涂、噴涂、刷涂、降-膜和類似的方法制備。根據(jù)一種變化，膜的所有組分混合于液體混合物中(即，膜-形成混合物)，其隨后形成膜。例如，液體混合物可基本上均勻分布于基質(zhì)表面并且隨后干燥而形成膜。在具體的例子中，膜的組分為水溶性的或可分散的或經(jīng)修飾而變成水溶性的或可分散的(即溶解的)。組分一起混合于水溶液中(即，水為載體溶劑或介質(zhì))，其隨后在環(huán)境室溫和濕度下風(fēng)干而形成膜。或者，膜組分在有機(jī)溶劑載體中為可溶的。膜組分可以任何順序一起混合。
膜-形成混合物應(yīng)該相對便于制造和使用。膜-形成混合物的粘度應(yīng)該足夠低以允許混合物施加和涂布于基質(zhì)上而無需任何高-強(qiáng)度涂布技術(shù)或設(shè)備。例如，膜-形成混合物的粘度可在約10cps至約200cps的范圍。
脫乙酰殼多糖在水相有機(jī)或無機(jī)酸中為可溶的。合適的水相有機(jī)酸包括乙酸、山梨酸、丙酸、乳酸、谷氨酸、苯甲酸、檸檬酸、馬來酸、羥基乙酸、丙烯酸、琥珀酸、草酸、抗壞血酸、酒石酸和其混合物。通常，有機(jī)酸為非常淡的例如，根據(jù)特定類型酸，約0.5至約5，更尤其約1至約2的重量百分比的濃度。
通常，脫乙酰殼多糖預(yù)先確定的量在環(huán)境室溫下溶解于水相有機(jī)酸中以產(chǎn)生脫乙酰殼多糖鹽溶液?；旌衔锏膒H可以為約2.5至約6.3，更尤其約5.0至約6.0。溶于酸水溶液中的脫乙酰殼多糖量，根據(jù)水的重量以及取決于膜終產(chǎn)品中所需的脫乙酰殼多糖量，可以為約1至約5，更尤其約2的重量百分比。脫乙酰殼多糖鹽溶液還可包括任何以上-所述的任選組分如增塑劑。
溶菌酶隨后可添加至脫乙酰殼多糖鹽溶液中。溶菌酶可以純凈、工業(yè)級、食物級或藥物級的溶液形式添加，其可從不同商品供應(yīng)商處獲得?；蛘?，溶菌酶原液可通過將預(yù)定量的溶菌酶溶解于蒸餾水中而制備。溶于水中的溶菌酶的量，根據(jù)水的重量以及取決于膜終產(chǎn)品中所需的溶菌酶濃度，可以為約1至約20，更尤其約10至約15的重量百分比。如果溶菌酶的量太大，膜-形成溶液可能變得不能接受的淡，將不利地影響膜的性質(zhì)。溶菌酶原液還可包括任何以上-所述的任選組分如增塑劑。
脫乙酰殼多糖鹽溶液和溶菌酶原液在環(huán)境室內(nèi)條件下一起混合而產(chǎn)生成膜溶液?；蛘?，成膜溶液可在約50℃的溫度加熱或加熱至約50℃的溫度以增強(qiáng)溶解。相對于溶菌酶原液的量，選擇脫乙酰殼多糖鹽溶液的量以提供所需濃度的溶菌酶。產(chǎn)生的水相成膜溶液的pH可調(diào)節(jié)至在約5至約6的范圍內(nèi)以通過提供低酸性環(huán)境而保護(hù)食物。
膜可通過任何方法用于食物。膜通過將成膜溶液涂至基質(zhì)而從成膜溶液形成。例如，成膜溶液可噴涂或刷涂在表面上以形成防護(hù)涂層，或食品可浸入該成膜溶液中。或者，澆鑄膜可通過包裝或類似的方法而用于食品表面。涂布溶液的基質(zhì)可在約25℃至約65℃的溫度加熱約2小時(shí)至約48小時(shí)以形成膜。在涉及直接涂布食品的改變中，干燥時(shí)間通常較短(例如，帶有加壓氣流約5至約60分鐘)。
膜抗微生物活性的持續(xù)時(shí)間取決于環(huán)境條件。在高水分環(huán)境中，涂層組分進(jìn)入食品的遷移率將提高，因此降低抗微生物活性的有效持續(xù)時(shí)間。某些例子中，在環(huán)境室內(nèi)條件中，膜可保持完好(即，膜保持其顏色、大小和機(jī)械強(qiáng)度)高達(dá)約四個(gè)月。另外的例子中，抗微生物活性可保持高達(dá)約三周。
施加于食品表面的涂層量應(yīng)足以在表面上形成基本上連續(xù)的膜。所述量隨各種因素的變化而變化，包括食品類型、施加方法和所需性質(zhì)，但其可在約2至約30，更尤其約5至約10mg/cm2基質(zhì)表面積的范圍。根據(jù)某些例子，獨(dú)立膜應(yīng)具有至少約20μm，更尤其約30至約80μm的厚度。小于20μM的厚度對于直接在食物表面上形成的涂層(例如通過浸涂)為示例性的。
此處公開的膜設(shè)計(jì)為尤其針對抑制食物表面上的致病和腐敗細(xì)菌以及真菌。示例性的細(xì)菌包括胚牙乳桿菌(Lactobacilus plantarum)、單核細(xì)胞增多性李氏桿菌(Listeria monocytogenes)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肉毒桿菌(Clostridiumbotulinum)、沙門氏菌(Salmonella spp)和假單胞菌(Pseudomonas spp)。示例性的真菌包括黑曲霉(Aspergillus niger)、Monoilinia fructicola、灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)和根霉(Rhizopus spp)。
如此處所述保護(hù)的食品通常為易受由微生物生長、脫水(失水)和/或因呼吸作用的成熟所引起的質(zhì)量變質(zhì)影響的食品。通常，乳酪(切片的或塊的)和加工的肉制品(火腿、熱狗、香腸等等)可利用開發(fā)的膜包裝或用成膜溶液涂層。易壞的水果和蔬菜商品，如漿果、櫻桃、葡萄、蘋果、梨、油桃、李子和杏可被涂層而增強(qiáng)微生物安全性并延長產(chǎn)品的貯存期限。
膜呈現(xiàn)所希望的透水汽特性。例如，膜的水蒸氣滲透率可在約1至約300，更尤其約10至約100g mm/m2dkPa的范圍。膜的水蒸氣滲透率和機(jī)械性質(zhì)取決于成膜期間的相對濕度(RH)，因?yàn)樗捎米髅撘阴ざ嗵悄ぶ械脑鏊軇?。在低RH環(huán)境中(例如，低于40％)，膜為具有改進(jìn)的防水特性的相對較好的防氣材料。50％RH中，膜可以顯示出比得上商業(yè)-可得的低密度聚乙烯(LDPE)膜的中等機(jī)械性質(zhì)(例如，10至100MPa的張力強(qiáng)度以及10至50％的斷裂伸長率)。膜的防水性質(zhì)可通過添加脂類材料而得以改進(jìn)。
實(shí)施例如下所述具體的實(shí)施例為用于說明性目的的并且不應(yīng)認(rèn)為限制附加權(quán)利要求的范圍。
實(shí)施例1材料使用來自Vanson Inc.(Redmond，WA)的蝦脫乙酰殼多糖而無需進(jìn)一步純化。蝦脫乙酰殼多糖通過25℃時(shí)1％w/w乙酸水溶液的11cps粘度以及89.9％的脫乙酰作用得以表征。蛋清溶菌酶獲自EiprodukteGmbH und Co.(Germany)。USP(United States Pharmacopeia)級甘油獲自EM Science(Darmstadt，Germany)。試劑級冰醋酸獲自J.T.Baker(Phillipsburg，NJ)。
革蘭氏陽性糞鏈球菌(Streptococcus faecalis)ATCC 14508和革蘭氏陰性大腸桿菌B型用作檢驗(yàn)生物體。獲自Sigma Chem.Co.(St.Louis，MO)的凍干溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)用于溶菌酶釋放模式的測量。腦心浸液培養(yǎng)液(brain heat infusion)(BHI)、MRS肉湯培養(yǎng)基和瓊脂購自Difcoof Becton，Dickinson and Company(Sparks，MD)。
成膜溶液的制備通過將脫乙酰殼多糖溶液與溶菌酶溶液混合而制備成膜溶液(FFS)。通過將2wt％脫乙酰殼多糖溶解于添加25％甘油(w/w脫乙酰殼多糖)的1wt％乙酸溶液中而制備脫乙酰殼多糖溶液。通過將10wt％溶菌酶溶解于添加25％甘油(w/w溶菌酶)的蒸餾水中而制備溶菌酶溶液。然后將溶菌酶溶液以0、20、60或100％的濃度(每脫乙酰殼多糖的溶菌酶干重百分比)混合入脫乙酰殼多糖溶液中。將得到的混合物于Model PT10-35(Kinematica AG，Switzerland)中以3,000rpm勻化60秒。用5N的氫氧化鈉將FFS的pH調(diào)節(jié)至5.2。所有樣品溶液過濾通過尼龍網(wǎng)以除去不溶殘?jiān)⒃谡婵障旅摎?Model 0211-P204，GastMfg.Corp.，Benton Harbor，MI)。
成膜將計(jì)算量的每份脫氣的FFS以260×260mm的面積澆鑄于水平的Teflon-涂布的玻璃板上以獲得約70μm的均勻膜厚度。室內(nèi)環(huán)境下(24±2℃和40±5％的相對濕度)干燥2天后，從板上剝離干燥的膜并且切成片用于分析。尺寸25×25mm的膜片段用于密度和水分含量的評估。尺寸25×86mm的膜片段用于機(jī)械測試。尺寸70×70mm的膜片段用于水蒸氣滲透率的測試。所有測量之前，膜片在設(shè)置為25℃和50％相對濕度的環(huán)境室(Model T10RS，Tenney Environmental，Williamsport，PA)中調(diào)節(jié)至少2天。
膜厚度/密度和含水量的測量在25℃和50％調(diào)節(jié)2天后，利用卡尺測微計(jì)Model No.293-766-30(Mytutoyo Manufacturing Co.Ltd.，Japan)在每個(gè)膜樣本的五個(gè)隨機(jī)位置測量膜厚度。膜密度通過將膜重量除以膜體積進(jìn)行計(jì)算。膜的含水量通過在鼓風(fēng)干燥箱(Precision Scientific Inc.，Chicago，IL)中105℃干燥膜樣本18小時(shí)的重量分析進(jìn)行。含水量的百分比計(jì)算為濕重(wet base)。
溶菌酶釋放的測定約0.03g的溶菌酶-脫乙酰殼多糖膜樣本的樣品浸入小瓶中20ml的0.15M磷酸鹽緩沖液(pH6.2)中，并利用振蕩器(New BrunswickScientific Co.Inc.，New Brunswick，NJ)室溫下在50rpm振蕩。凍干溶壁微球菌的底物儲液制備于0.15M磷酸鹽緩沖液中(450nm處0.65的吸光度)。以0、0.25、1、4、12、24和48小時(shí)的時(shí)間間隔取1μl的混合物樣品。這些樣品與2.5ml溶壁微球菌底物在比色杯中混合并且隨后立即在25℃用Shimadzu UV-Vis 2100分光光度計(jì)(ShimadzuCo.，Japan)讀數(shù)40秒。溶菌酶的比活(activity rate)通過測量450nm處溶液吸光度的降低而確定，其反映了細(xì)胞壁底物的水解。光密度的降低表示為每分鐘Mille-吸光度單位的變化(Mabs/min)?；钚詥挝桓鶕?jù)0.15M磷酸鹽緩沖液中標(biāo)準(zhǔn)化溶菌酶濃度的回歸線轉(zhuǎn)換成mg/l溶菌酶，并且隨后轉(zhuǎn)換成每克干膜釋放的溶菌酶克數(shù)。
抗微生物活性大腸桿菌和糞鏈球菌分別在腦心浸液培養(yǎng)液(BHI)和MRS肉湯培養(yǎng)液中37℃過夜培養(yǎng)。1ml的這些微生物樣品用99ml相同的培養(yǎng)液稀釋以獲得大約107CFU/ml的接種物。約0.03g的每個(gè)膜樣本置于培養(yǎng)皿(petri dish)(85mm直徑)中，隨后向其中倒入10ml接種物。未暴露于膜的接種物用作對照。
培養(yǎng)皿在室溫下50RPM振蕩。在0、6、12和24小時(shí)時(shí)取樣，用稀釋小瓶(Dilu-Lock IITMButterfield′s緩沖液，Hardy Diagnostics，Santa Maria，CA)稀釋，并且一式兩份接種平皿。對于接種平皿而言，BHI和MRS瓊脂分別用于大腸桿菌和糞鏈球菌。每個(gè)平皿在菌落計(jì)數(shù)前在37℃溫育48小時(shí)。
水蒸氣滲透率的測量利用25℃和100/50％RH梯度的杯碟法(cup method)按照ASTME 96(ASTM 2000a)確定水蒸氣滲透率(WVP)。11ml蒸餾水置于有機(jī)玻璃(Plexiglas)制成的57mm內(nèi)徑以及15mm內(nèi)部深度的每個(gè)檢驗(yàn)杯中。水和膜間的距離為10.7mm并且有效膜面積為25.5cm2。檢驗(yàn)杯組件置于控溫并控濕的室中(25℃以及50％RH)。每個(gè)杯組件利用電子天平(0.0001g精度)在6小時(shí)中每小時(shí)進(jìn)行稱重記錄隨時(shí)間水分的損失。隨后利用WVP校正法(Gennadios及其它人1994)校正WVP在膜和水表面之間滯流的空氣間隙的阻力。
機(jī)械性能膜的機(jī)械性能利用紋理分析器(TA.XT2i，Texture TechnologiesCorp.，Scarsdale，NY)測定。所有性能測量在從室取出膜樣本后立即進(jìn)行，從而把水分差異減到最低。ASTM D882法(ASTM 2000b)用于測量斷裂時(shí)的張力強(qiáng)度(TS)和伸長率(EL)。每個(gè)膜樣本安放在紋理分析器的柄間(TA96)并且用50mm的初始柄間距和1mm/s的十字頭速度進(jìn)行檢驗(yàn)。TS值以測量的最大負(fù)載(N)除以膜橫截面積(mm2)得到的MPa單位報(bào)告。EL值通過記錄的斷裂伸長率除以樣本的初始長度并且乘以100而獲得。
微觀結(jié)構(gòu)膜的表面和內(nèi)部結(jié)構(gòu)利用掃描電子顯微鏡術(shù)(AmRay 3300FE場發(fā)射SEM，AmRay，Bedford，MA)進(jìn)行評估。膜片安放于鋁短棒上并利用濺射涂料器(Edwards model S150B Sputter Coater；BOC EdwardsVacuum，Ltd，UK)涂布金-鈀合金。每個(gè)涂布的樣品利用直接垂直于樣品的電子束的5kV電壓檢驗(yàn)。
統(tǒng)計(jì)分析所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。每次重復(fù)中，兩個(gè)膜樣本用于溶菌酶釋放和抗微生物活性測量；五個(gè)膜樣品用于密度、含水量和WVP測量；10個(gè)膜樣品用于機(jī)械性能測量。利用SAS(Statistical Analysis SystemInstitute Inc.，Cary，NC)，一般線性模型(GLM)方法用于檢驗(yàn)不同膜間的差異。對所有的處理進(jìn)行用于方差分析(ANOVA)的PROCGLM。進(jìn)行PROC REG以找到用于所測量應(yīng)答的合適的回歸模式。Duncan′s多-范圍檢驗(yàn)用于多種方法的比較。差異顯著性確定為p＜0.05。
結(jié)果-成膜和基本的物理性能當(dāng)將溶菌酶摻入脫乙酰殼多糖溶液中時(shí)，任何FFS中均未觀察到沉淀。此表明乙酸-溶解的脫乙酰殼多糖溶液具有與水溶性溶菌酶良好的相容性。所有干膜很容易從澆鑄板剝離。所有類型的膜的厚度通過澆鑄計(jì)算量的FFS而小心控制在72±11μm的范圍內(nèi)。此確保膜厚度中觀察到無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05)。
下表1顯示每個(gè)經(jīng)檢驗(yàn)的膜的密度和含水量(n＝15)。純脫乙酰殼多糖膜(L0)具有密度和含水量的最高值。所有膜當(dāng)中密度無統(tǒng)計(jì)學(xué)水平的差異。隨著溶菌酶濃度的提高含水量趨于降低。雖然不受任何理論的束縛，此可能是因脫乙酰殼多糖和溶菌酶包含大量-OH和-NH2基團(tuán)而發(fā)生。這些基團(tuán)中氫鍵鍵合是主要的引力。溶菌酶分子添加入脫乙酰殼多糖鏈可通過提高脫乙酰殼多糖和溶菌酶分子間的相互作用，如氫鍵鍵合和范德華力相互作用而改變脫乙酰殼多糖分子的結(jié)構(gòu)構(gòu)型。溶菌酶含有親水和疏水的氨基酸。成膜期間，隨著親水氨基酸側(cè)鏈通過在折疊溶菌酶中起重要作用的相同的疏水相互作用而向水相FFS伸出而形成溶菌酶疏水核(Proctor and Cunningham 1988)。膜基質(zhì)中的這些疏水側(cè)鏈可影響溶菌酶-脫乙酰殼多糖復(fù)合膜的含水量。
表1溶菌酶-脫乙酰殼多糖復(fù)合膜的組成和物理性能

1膜厚度＝72.64±8.2μm；L0＝0％溶菌酶(w/w脫乙酰殼多糖)；L20＝20％溶菌酶(w/w脫乙酰殼多糖)；L60＝60％溶菌酶(w/w脫乙酰殼多糖)；L100＝100％溶菌酶(w/w脫乙酰殼多糖)2基于FFS中脫乙酰殼多糖和溶菌酶的總重量和的甘油重量百分比結(jié)果-溶菌酶的釋放從膜基質(zhì)釋放的溶菌酶的量顯示在圖1中。無溶菌酶(L0)的脫乙酰殼多糖膜不顯示對凍干溶壁微球菌的任何溶解活性，而這些活性隨著摻入膜基質(zhì)中的溶菌酶濃度的提高而成比例提高。當(dāng)溶菌酶-脫乙酰殼多糖復(fù)合膜置于磷酸鹽緩沖液中時(shí)，膜因水分子擴(kuò)散進(jìn)入聚合膜結(jié)構(gòu)中而膨脹，引起摻入的溶菌酶從膜基質(zhì)釋放進(jìn)入水相環(huán)境。溶菌酶隨時(shí)間從膜基質(zhì)對數(shù)釋放。溶菌酶從膜基質(zhì)的釋放與聚合基質(zhì)中初始溶菌酶濃度線性相關(guān)。48小時(shí)后來自每個(gè)膜樣本的溶菌酶釋放量的百分比對L20、L60和L100膜而言分別為大約65％、79％和76％。24小時(shí)后，來自每個(gè)膜樣本的溶菌酶釋放量百分比對L20、L60和L100膜而言分別為大約48％、75％和71％。12小時(shí)后，來自每個(gè)膜樣本的溶菌酶釋放量百分比對L20、L60和L100膜而言分別為大約43％、60％和56％。1小時(shí)后，來自每個(gè)膜樣本的溶菌酶釋放量百分比對L20、L60和L100膜而言分別為大約14％、26％和25％。
在半-濕食物中，微生物生長主要發(fā)生在食物表面上。因此，通過控制和延緩擴(kuò)散維持食物表面上所需要水平的抗微生物劑對延長食物的貯存期限有利。這些結(jié)果表明摻入脫乙酰殼多糖膜的溶菌酶可以控制的方式從膜基質(zhì)釋放并保持對細(xì)菌細(xì)胞壁基質(zhì)的溶解活性。例如，約24小時(shí)后高達(dá)約30％的溶菌酶未從膜釋放。約48小時(shí)后，高達(dá)約20％的溶菌酶未從膜釋放。
結(jié)果-抗微生物活性圖2A和2B顯示了大腸桿菌和糞鏈球菌在用溶菌酶-脫乙酰殼多糖膜處理的肉湯培養(yǎng)基中的存活。除了用L100膜，溶菌酶-脫乙酰殼多糖復(fù)合膜對大腸桿菌的抗微生物效力隨著溶菌酶濃度的提高而提高。溫育24小時(shí)后，在具有L0、L20或L60膜的BHI肉湯培養(yǎng)液中細(xì)胞數(shù)量分別降低約1.8、2.3和2.7log(循環(huán))。同時(shí)，L100膜和對照使細(xì)胞數(shù)量分別提高約0.1和2.3log(循環(huán))。在回收細(xì)胞群后，L100膜抑制生長高達(dá)6小時(shí)。
糞鏈球菌的生長沒有受到含有低濃度溶菌酶的溶菌酶-脫乙酰殼多糖復(fù)合膜(L0和L20膜)的有效抑制。對于L0和L20膜而言，糞鏈球菌群在暴露24小時(shí)期間稍有提高。相比之下，在含有L60和L100膜的肉湯培養(yǎng)基中分別觀察到糞鏈球菌對數(shù)(log)水平減少3.3和3.8。對照樣品中24小時(shí)后出現(xiàn)約1.1對數(shù)(log)(循環(huán))的提高。隨著溶菌酶濃度的提高，對革蘭氏陽性糞鏈球菌的抗微生物活性的提高可以表明溶菌酶主要負(fù)責(zé)該作用。
脫乙酰殼多糖對大腸桿菌的抗微生物活性已由Shahidi(1999)綜述。純脫乙酰殼多糖膜(L0)呈現(xiàn)對革蘭氏陰性大腸桿菌的殺菌作用，但對革蘭氏陽性糞鏈球菌的生長幾乎沒有抑制作用。在L60膜中觀察到對兩種細(xì)菌最穩(wěn)定的抑制傾向。用L100膜回收大腸桿菌群值得懷疑，并且可由溶菌酶-脫乙酰殼多糖相互作用的增強(qiáng)進(jìn)行解釋。從膜基質(zhì)釋放的脫乙酰殼多糖分子可堆積在細(xì)胞表面或與溶菌酶相互作用而形成溶菌酶-脫乙酰殼多糖復(fù)合物。當(dāng)過量溶菌酶暴露于細(xì)胞懸液時(shí)，可提高溶菌酶-脫乙酰殼多糖相互作用的可能性。這些相互作用的提高可干擾脫乙酰殼多糖和細(xì)胞表面間的反應(yīng)。
在含有最高溶菌酶濃度(L100)的脫乙酰殼多糖膜中呈現(xiàn)出對糞鏈球菌最強(qiáng)的抗微生物活性，而對于大腸桿菌是在具有60％溶菌酶濃度(w/w脫乙酰殼多糖)的膜中。這些結(jié)果表明脫乙酰殼多糖的抗微生物活性可通過將溶菌酶摻入脫乙酰殼多糖膜基質(zhì)中而得以提高。此外，溶菌酶與脫乙酰殼多糖分子的比率為影響溶菌酶-脫乙酰殼多糖復(fù)合膜抗微生物性能的重要因素。
結(jié)果-水蒸氣滲透率膜的水蒸氣滲透率(WVP)在測試的濃度水平?jīng)]有受溶菌酶摻入的顯著影響(p＜0.05)(參見下表2)。雖然不受任何理論的束縛，該結(jié)果可通過兩個(gè)對立因素的作用而解釋。脫乙酰殼多糖膜，如許多其他的蛋白質(zhì)或多糖可食用膜一樣，由于其親水性而呈現(xiàn)相對低的防水特性。脫乙酰殼多糖膜的防水性能可通過添加疏水材料如脂肪酸而得以改善。由于溶菌酶包含疏水氨基酸側(cè)鏈，溶菌酶-脫乙酰殼多糖復(fù)合膜的親水性可隨著溶菌酶的添加而降低。然而，脫乙酰殼多糖的致密結(jié)構(gòu)，尤其其結(jié)晶部分可由溶菌酶分子破壞，引起通過膜基質(zhì)的WVP的提高。這兩個(gè)對立因素可隨著溶菌酶濃度的改變而抵消或把溶菌酶-脫乙酰殼多糖復(fù)合膜的WVP特性的改變降到最低。
表2溶菌酶-脫乙酰殼多糖復(fù)合膜的水蒸氣滲透率

1L0＝0％溶菌酶(w/w脫乙酰殼多糖)；L20＝20％溶菌酶(w/w脫乙酰殼多糖)；L60＝60％溶菌酶(w/w脫乙酰殼多糖)；L100＝100％溶菌酶(w/w脫乙酰殼多糖)結(jié)果-機(jī)械性能膜的張力強(qiáng)度(TS)和斷裂時(shí)的伸長率(EL)隨著溶菌酶的添加而顯著降低(p＞0.05)(參見下表3)。TS和EL隨著溶菌酶濃度提高的降低可描述為由下列線性方程組TS＝-0.10CI+16.70，R2＝0.96EL＝-0.32CI+59.89，R2＝0.99其中CI為溶菌酶-脫乙酰殼多糖膜基質(zhì)中溶菌酶的百分比濃度(％，w/w脫乙酰殼多糖)。此外，發(fā)現(xiàn)EL和TS間存在線性關(guān)系EL＝3.07TS+8.30，R2＝0.98。
在1∶1脫乙酰殼多糖和溶菌酶的比率(L100)時(shí)，TS和EL值分別有43％和48％的降低。然而，所述降低對于防止使用膜食物保護(hù)劑的應(yīng)用并不十分顯著。
脫乙酰殼多糖為具有剛性主鏈結(jié)構(gòu)的優(yōu)良的成膜線型聚合物，而溶菌酶為具有較低成膜能力的帶正電荷的酶。TS和EL的降低表明溶菌酶的摻入削弱了膜的結(jié)構(gòu)和完整性。溶菌酶分子引入脫乙酰殼多糖膜基質(zhì)中可能破壞晶體結(jié)構(gòu)的形成并且削弱脫乙酰殼多糖分子間的分子間氫鍵。膜基質(zhì)中脫乙酰殼多糖和溶菌酶分子間增強(qiáng)的相互作用可能是溶菌酶-脫乙酰殼多糖復(fù)合膜中TS和EL變化的原因。降低的TS和EL值還歸因于溶菌酶對脫乙酰殼多糖分子的降解，所述溶菌酶為幾丁質(zhì)分解酶。由溶菌酶降解脫乙酰殼多糖分子可通過利用高度去乙?；拿撘阴ざ嗵?例如至少約95％的脫乙酰程度)而減少。此外，溶菌酶-脫乙酰殼多糖復(fù)合膜的機(jī)械性能和防水性能可通過利用膜基質(zhì)中的交聯(lián)劑，如戊二醛而得以改善。
表3溶菌酶-脫乙酰殼多糖復(fù)合膜的機(jī)械性能

1L0＝0％溶菌酶(w/w脫乙酰殼多糖)；L20＝20％溶菌酶(w/w脫乙酰殼多糖)；L60＝60％溶菌酶(w/w脫乙酰殼多糖)；L100＝100％溶菌酶(w/w脫乙酰殼多糖)。
結(jié)果-微觀結(jié)構(gòu)脫乙酰殼多糖和溶菌酶間優(yōu)良的生物相容性以及溶菌酶在整個(gè)脫乙酰殼多糖基質(zhì)中的均勻分布通過SEM顯微照片得以證實(shí)。圖3A-3D顯示了1000X放大倍數(shù)下成膜期間暴露于空氣的溶菌酶-脫乙酰殼多糖復(fù)合膜的外表面。如SEM顯微照片所示，膜的表面結(jié)構(gòu)致密并且均勻。所有膜具有顯示連續(xù)結(jié)構(gòu)而在基質(zhì)中無任何孔或裂縫的均勻外觀。L60(3C)和L100(3D)膜的顯微照片顯示膜表面上明亮的大理石狀紋。這種大理石狀紋為均勻分布的并且隨著溶菌酶濃度的提高而增加。白色區(qū)域代表脫乙酰殼多糖基質(zhì)中溶菌酶微-顆粒的沉積。
圖4A-4D顯示溶菌酶-脫乙酰殼多糖復(fù)合膜中橫截面的顯微照片。通過用液氮冷凍膜并隨后將它們斷裂而獲得鋒利的邊緣。如圖4A-4D所示，脫乙酰殼多糖和溶菌酶間沒有垂直裂縫或相分離。除了一些平行于表面的斷裂外截面結(jié)構(gòu)為致密并連續(xù)的，可能在膜斷裂時(shí)已經(jīng)形成。溶菌酶在整個(gè)膜基質(zhì)中的均勻分布通過具有高溶菌酶濃度的膜的均勻外觀顯示(4C和4D)。L20膜的顯微照片(4B)顯示雜質(zhì)可能在干燥期間落于膜上。這類污染可能是溶劑蒸發(fā)成膜方法的缺點(diǎn)，尤其是如果膜在露天環(huán)境中澆鑄和干燥的話。
預(yù)實(shí)施例2選擇性的FFS可通過在65℃將2wt％脫乙酰殼多糖溶解于添加了50wt％十二烷酸，25wt％甘油和100wt％溶菌酶(w/w脫乙酰殼多糖)的1wt％乙酸溶液中而進(jìn)行制備。然后如實(shí)施例1所述制備膜。向成膜溶液中添加脂肪酸(即，十二烷酸)可改善膜的防水性能，并且不明顯影響其抗微生物活性。
實(shí)施例3通過將脫乙酰殼多糖溶液與溶菌酶溶液混合而制備涂布溶液。通過將3％脫乙酰殼多糖溶解于添加了25％甘油(w/w脫乙酰殼多糖)的1％乙酸溶液中而制備脫乙酰殼多糖溶液。通過將10％的溶菌酶溶解于添加25％甘油(w/w溶菌酶)的蒸餾水中制備溶菌酶溶液。溶菌酶溶液混合到脫乙酰殼多糖溶液中至60％的濃度(每干重脫乙酰殼多糖的溶菌酶的干重百分比)。產(chǎn)生的混合物利用均質(zhì)器(PT 10-35，Kinematica，Switzerland)在3,000rpm勻化60秒。單核細(xì)胞增多性李氏菌ATCC 15313和植物乳桿菌用作測試微生物來評估食物表面上涂布處理的抗微生物效力。單核細(xì)胞增多性李氏菌和植物乳桿菌分別在腦心浸液培養(yǎng)液(BHI)和MRS肉湯培養(yǎng)基中37℃過夜培養(yǎng)。
獲得商業(yè)生產(chǎn)的牛柳(beef franks)(Bun-Length，Oscar MayerFoods Corp.，Madison，WI)并且在無菌條件下切成26mm長度(～10g)。將牛柳片浸入涂布溶液30秒并且在垂直層狀氣流工作臺(100-plus，Envirco Corp.，Albuquerque，New Mexieo)中干燥30分鐘。未-涂布的對照和涂布的樣品用100μl單核細(xì)胞增多性李氏菌或植物乳桿菌(～2×103CFU/ml)接種，置于200mm×150mm真空塑料袋中(FoodSaver Rolls，Tilia，Inc.，San Francisco，CA)，并用熱封機(jī)(FoodSaver Vac 1075，Tilia，Inc.，SanFrancisco，CA)真空包裝。
在22.5±1℃貯藏4天后，將每一牛柳樣品置于無菌兜包袋中。真空塑料袋用90ml的0.1％的蛋白胨水漂洗并且轉(zhuǎn)入同樣的兜包袋中。樣品用兜包型粉碎機(jī)(Stomacher 400 Circulator，Seward，London，UK)在230 RPM maccrate2分鐘。一式兩份對懸浮液的微生物群計(jì)數(shù)。BHI和MRS瓊脂分別用于單核細(xì)胞增多性李氏菌和植物乳桿菌。含有微生物介質(zhì)的塑料平皿在微生物菌落計(jì)數(shù)前在37℃溫育48小時(shí)。
涂布處理對接種于涂布的和未-涂布的牛柳表面上單核細(xì)胞增多性李氏菌或植物乳桿菌生長的影響顯示在表4中。溶菌酶-脫乙酰殼多糖復(fù)合涂布處理導(dǎo)致牛柳表面上單核細(xì)胞增多性李氏菌的生長抑制。然而同樣的條件下觀察到植物乳桿菌細(xì)胞數(shù)量的少量提高。
表4涂布對用單核細(xì)胞增多性李氏菌或植物乳桿菌接種的牛柳的微生物生長的影響

實(shí)施例4商業(yè)生產(chǎn)的培養(yǎng)基切達(dá)干酪(cheddar cheese)(Tillamook CountyCreamery Association，Tillamook，OR)用作用于證實(shí)溶菌酶-脫乙酰殼多糖復(fù)合物涂布應(yīng)用的抗微生物性能的另一種食物系統(tǒng)。干酪塊無菌切至60mm×26mm×5mm大小(～10g)，并用實(shí)施例3中所述的涂布溶液涂布。所有方法與實(shí)施例3的相同。如表5所示，干酪切片表面上的單核細(xì)胞增多性李氏菌和植物乳桿菌的生長均受到抑制。
表5.涂布對用單核細(xì)胞增多性李氏菌或植物乳桿菌接種的切達(dá)干酪片的微生物生長的影響

實(shí)施例5根據(jù)實(shí)施例1中所述的方法制備溶菌酶脫乙酰殼多糖溶液，除了用2％的脫乙酰殼多糖代替3％的脫乙酰殼多糖。成膜溶液在具有260mm×260mm面積的水平Teflon-涂布的玻璃板上澆鑄并在環(huán)境條件下干燥(22.5±1℃和40±5％相對濕度{RH})2天。從板上取下干膜并且切成65×30mm大小的切片。產(chǎn)生的膜的厚度為85±9μm。膜切片保存在設(shè)置為25℃以及50％RH的環(huán)境室中(TIORS，Tenney Environmental，Williamsport，PA)2天。
切達(dá)干酪(Tillamook County Creamery Association，Tillamook，OR)無菌切成60mm×26mm×5mm的矩形大小并用100μl單核細(xì)胞增多性李氏菌或植物乳桿菌(～2×103CFU/ml)接種。接種的每片干酪夾在兩個(gè)同等處理的膜切片間。獲得商業(yè)生產(chǎn)的牛柳(Bun-Length，OscarMayer Foods corp.，Madison，WI)并在無菌條件下切成26mm長(～10g)且真空包裝于200mm×150mm的真空塑料袋中(FoodSaver Rolls，Tilia，Inc.，San Francisco，CA)。貯存條件和微生物計(jì)數(shù)與實(shí)施例3所述方法相同。
如表6所示，溶菌酶-脫乙酰殼多糖復(fù)合膜降低了干酪表面上微生物的生長。植物乳桿菌比單核細(xì)胞增多性李氏菌對膜更敏感。與干酪表面處理的例子相比，膜處理呈現(xiàn)比涂布處理更強(qiáng)的抗微生物活性。
表6.膜施用對用單核細(xì)胞增多性李氏菌或植物乳桿菌接種的切達(dá)干酪片的微生物生長的影響

根據(jù)一些實(shí)施例舉例說明和描述了本發(fā)明所公開的方法、膜和食品的原理，很顯然，這些方法、膜和食品可在不背離所述原理的條件下進(jìn)行詳細(xì)的改進(jìn)。
權(quán)利要求
1.包含溶菌酶的復(fù)合膜，所述溶菌酶被摻入脫乙酰殼多糖聚合物基質(zhì)中。
2.權(quán)利要求1的膜，其中膜的所有組分是可食用并可更新的。
3.權(quán)利要求1的膜，其中脫乙酰殼多糖具有至少約70％的脫乙酰程度。
4.權(quán)利要求1的膜，進(jìn)一步包含至少一種選自增塑劑或交聯(lián)劑的其他組分。
5.權(quán)利要求4的膜，進(jìn)一步包含至少一種增塑劑和至少一種交聯(lián)劑。
6.權(quán)利要求3的膜，進(jìn)一步包含至少一種交聯(lián)劑。
7.權(quán)利要求1的膜，其中所述脫乙酰殼多糖包含脫乙酰殼多糖乙酸鹽、脫乙酰殼多糖山梨酸鹽、脫乙酰殼多糖丙酸鹽、脫乙酰殼多糖乳酸鹽、脫乙酰殼多糖谷氨酸鹽、脫乙酰殼多糖苯甲酸鹽、脫乙酰殼多糖檸檬酸鹽、脫乙酰殼多糖馬來酸鹽、脫乙酰殼多糖甘醇酸鹽、脫乙酰殼多糖丙烯酸鹽、脫乙酰殼多糖琥珀酸鹽、脫乙酰殼多糖草酸鹽、脫乙酰殼多糖抗壞血酸鹽、脫乙酰殼多糖酒石酸鹽或其混合物。
8.權(quán)利要求1的膜，其中所述溶菌酶以抗微生物的有效量存在。
9.權(quán)利要求1的膜，其中膜具有約1至約300gmm/m2dkPa的水蒸氣滲透率。
10.權(quán)利要求1的膜，其中溶菌酶的量足以使所述膜施加至基質(zhì)約24小時(shí)后高達(dá)約30％的溶菌酶并未從所述膜釋放，并且約48小時(shí)后高達(dá)約20％的所述溶菌酶并未從所述膜釋放。
11.膜，包含(a)脫乙酰殼多糖；和(b)基于所述脫乙酰殼多糖的重量計(jì)約10至約200重量百分比的溶菌酶。
12.權(quán)利要求11的膜，包含約10至約100重量百分比的溶菌酶。
13.權(quán)利要求11的膜，進(jìn)一步包含至少一種選自增塑劑或交聯(lián)劑的其它組分。
14.權(quán)利要求13的膜，其中所述增塑劑以基于脫乙酰殼多糖重量計(jì)約1至約50重量百分比的量存在。
15.用于制備膜的方法，包括將脫乙酰殼多糖和溶菌酶溶解或分散于水相介質(zhì)中產(chǎn)生成膜溶液或分散體；將成膜溶液或分散體施加至基質(zhì)表面；以及將所述成膜溶液或分散體轉(zhuǎn)化為膜。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述脫乙酰殼多糖溶于水相有機(jī)酸中。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述水相有機(jī)酸選自乙酸、山梨酸、丙酸、乳酸、谷氨酸、苯甲酸、檸檬酸、馬來酸、甘醇酸、丙烯酸、琥珀酸、草酸、抗壞血酸、酒石酸或其混合物。
18.權(quán)利要求16的方法，其中所述溶菌酶溶于水中產(chǎn)生溶菌酶溶液，然后將所述溶菌酶溶液與所述脫乙酰殼多糖溶液混合。
19.權(quán)利要求18的方法，其中在環(huán)境室內(nèi)條件下發(fā)生所述溶菌酶溶液和所述脫乙酰殼多糖溶液的混合。
20.權(quán)利要求18的方法，其中所述溶菌酶溶液包括約5至約20重量百分比的溶菌酶。
21.權(quán)利要求15的方法，其中經(jīng)干燥所述成膜溶液或分散體轉(zhuǎn)化為膜。
22.權(quán)利要求15的方法，其中所述基質(zhì)表面包括食品表面。
23.權(quán)利要求22的方法，其中所述膜包括抗微生物有效量的溶菌酶，并且所述膜的所述抗-微生物活性持續(xù)至少三周。
24.權(quán)利要求15的方法，進(jìn)一步包括將至少一種其它的添加劑溶解或分散在水介質(zhì)中。
25.權(quán)利要求15的方法，進(jìn)一步包括將膜置于食品表面上。
26.權(quán)利要求22的方法，其中成膜溶液或分散體通過噴涂、刷涂、滴涂或浸涂施加于食品表面。
27.通過權(quán)利要求15的方法產(chǎn)生的膜。
28.權(quán)利要求27的膜，其中所述溶菌酶以抗微生物有效量存在于膜中。
29.在食品至少一部分表面上包括抗微生物膜的食品，其中所述抗微生物膜包含摻入聚合物基質(zhì)內(nèi)的溶菌酶。
30.權(quán)利要求29的食品，其中所述溶菌酶以基于脫乙酰殼多糖重量計(jì)約10至約200重量百分比的量存在于膜中。
31.權(quán)利要求29的食品，其中膜具有約1至約300gmm/m2dkPa的水蒸氣滲透率。
32.權(quán)利要求29的食品，其中膜通過以下方法制備，包括將脫乙酰殼多糖和溶菌酶溶解或分散于水介質(zhì)中產(chǎn)生成膜溶液或分散體；將所述成膜溶液或分散體施加至基質(zhì)表面；以及將所述成膜溶液或分散體轉(zhuǎn)化為膜。
全文摘要
本發(fā)明公開的一個(gè)方面涉及包括摻入脫乙酰殼多糖聚合物基質(zhì)內(nèi)的溶菌酶的復(fù)合膜。另一個(gè)方面中，本發(fā)明公開了包括脫乙酰殼多糖，以及基于脫乙酰殼多糖重量計(jì)約10至約200重量百分比的溶菌酶的膜。還公開了制備膜的方法，所述方法包括將脫乙酰殼多糖和溶菌酶溶解或分散于水相介質(zhì)中產(chǎn)生成膜溶液或分散體；將成膜溶液或分散體施加至基質(zhì)表面；以及將所述成膜溶液或分散體轉(zhuǎn)化為膜。在尤其有用的應(yīng)用中，所述膜為用于食品的抗微生物保護(hù)劑。
文檔編號A23C19/06GK1972602SQ200580015976
公開日2007年5月30日 申請日期2005年3月17日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月18日
發(fā)明者趙艷云, 樸首一, 馬克·A·達(dá)埃舍爾 申請人:俄勒岡州，由高等教育州委員會代表俄勒岡州立大學(xué)