專利名稱：前列腺癌相關的基因和多肽的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物科學領域，具體涉及癌癥的治療和診斷領域。具體地說，本發(fā)明涉及前列腺癌相關的新基因B3537(CCDC4)所編碼的新多肽。更進一步地，本發(fā)明涉及新基因CCDC4。例如，本發(fā)明之基因和多肽可用于前列腺癌的診斷，用作開發(fā)針對此疾病的藥物的靶分子，以及用于減緩前列腺癌的細胞生長。
背景技術：
前列腺癌是西方國家男性最常見的癌癥之一(Gronberg，Lancet 361859-64(2003))。在發(fā)達國家，由于西方的飲食習慣及人口的老年化，前列腺癌的發(fā)病率正穩(wěn)步增高。通過檢測血清中前列腺特異抗原(PSA)可早期診斷前列腺癌，從而取得進行治療性手術的機會，這已經(jīng)明顯改善了前列腺癌的預后。然而，可達30％的患者在接受根治性前列腺切除術后復發(fā)癌癥(Han et al.，J Urol 166416-9(2001))。多數(shù)復發(fā)的或晚期的癌癥對雄激素消融療法(androgen ablation therapy)有反應，因為前列腺癌的生長在初始階段依賴雄激素。但是，多數(shù)接受這種治療的患者最終進入雄激素非依賴期，這時他們對這種療法就不再有反應。前列腺癌最嚴重的臨床難題就是雄激素非依賴性前列腺癌對任何其它療法都沒有反應(Gronberg，Lancet 361859-64(2003))。因此，建立不同于雄激素消融療法的針對前列腺癌的新療法已經(jīng)成為前列腺癌處理中的一個急迫問題。
cDNA微陣技術提供了正常和惡性腫瘤細胞中基因表達的綜合信息，以及比較惡性腫瘤和相應正常細胞中基因表達的能力(Okabe et al.，Cancer Res612129-37(2001)；Kitahara et al.，Cancer Res 613544-9(2001)；Lin et al.，Oncogene 214120-8(2002)；Hasegawa et al.，Cancer Res 627012-7(2002))。這種方法使得人們能夠了解癌細胞的復雜本質，也有助于理解致癌機理。腫瘤中失調基因的鑒定有助于更加準確地和精確地診斷各種腫瘤，并尋找新的治療靶(Bienz and Clevers，Cell 103311-20(2002))。為了從全基因組的角度來揭示腫瘤機制，發(fā)現(xiàn)診斷的靶分子，并研制新的治療藥物，本發(fā)明人使用23040個基因的cDNA微陣，分析了腫瘤細胞的表達譜(Okabe et al.，Cancer Res 612129-37(2001)；Kitahara et al.，Cancer Res 613544-9(2001)；Lin et al.，Oncogene 214120-8(2002)；Hasegawa et al.，Cancer Res 627012-7(2002))。
研究致癌機理對鑒定抗腫瘤劑的分子靶很有幫助。例如，法尼基轉移酶(FTI)抑制劑最早用于抑制Ras相關生長信號傳導途徑，Ras的激活依賴翻譯后法尼基化，現(xiàn)用于治療動物模型的Ras依賴性腫瘤取得良好效果(He et al.，Cell 99335-45(1999))。在人體臨床試驗中采用了組合療法或抗癌藥物加抗HER2單克隆抗體trastuzumab來拮抗原癌基因受體HER2/neu；且已經(jīng)在乳癌患者中取得了有所改善的臨床反應和整體存活率(Lin et al.，Cancer Res 616345-9(2001))。由于bcr-abl酪氨酸激酶的組成性激活在白細胞的轉化中起重要作用，能選擇性滅活bcr-abl融合蛋白的一種酪氨酸激酶抑制劑STI-571已用于治療慢性髓細胞性白血病。這一類的藥物設計用于抑制特異基因產(chǎn)物的致癌作用(Fujita et al.，Cancer Res 617722-6(2001))。因此，癌細胞中常常上調的基因產(chǎn)物可作為研究新抗癌藥物的潛在靶。事實上，以能導致癌生長和發(fā)展的異常表達分子為靶的新藥已經(jīng)證實對某些類型的癌癥有效。此類藥物包括用于乳癌的Herceptin，用于慢性髓細胞性白血病的Glivec(STI571)，及用于非小細胞肺癌的Iressa(ZD1839)。
已知有幾種分子在前列腺癌中過度表達，因而鑒定為前列腺癌的治療靶或標志物(Xu et al.，Cancer Res 606568-72(2002)；Luo et a1.，Cancer Res622220-6(2002))。然而，這些分子多數(shù)在其它主要器官中同樣高表達。這樣，以這些分子為靶的藥物可能對癌細胞是有毒的，但同樣可能對其它器官的正常生長細胞造成損害。
研究顯示，CD8+細胞毒性T淋巴細胞(CTL)能識別MHC I型分子上呈遞的衍生自腫瘤相關抗原(TAA)的表位肽，并溶解腫瘤細胞。自第一個腫瘤相關抗原MAGE家族發(fā)現(xiàn)以來，使用免疫學方法發(fā)現(xiàn)了許多其它腫瘤相關抗原(Boon，Int J Cancer 54177-80(1993)；Boon and van der Bruggen，J Exp Med 183725-9(1996)；van der Bruggen et al.，Science 2541643-7(1991)；Brichard et al.，J Exp Med 178489-95(1993)；Kawakami et al.，J ExpMed 180347-52(1994))。有些已發(fā)現(xiàn)的腫瘤相關抗原成為了免疫療法的靶，現(xiàn)正在臨床試驗階段。至今發(fā)現(xiàn)的腫瘤相關抗原包括MAGE(van derBruggen et al.，Science 2541643-7(1991))，gp100(Kawakami et al.，J ExpMed 180347-52(1994))，SART(Shichijo et al.，J Exp Med 187277-88(1998))，及NY-ESO-1(Chen et al.，Proc Natl Acad Sci USA 941914-8(1997))。另一方面，以前證實在腫瘤細胞中特異性過度表達的基因產(chǎn)物已發(fā)現(xiàn)能被識別為靶，誘導細胞免疫反應。此類基因產(chǎn)物包括p53(Umano etal.，Brit J Cancer 841052-7(2001))，HER2/neu(Tanaka et al.，Brit J Cancer 8494-9(2001))，CEA(Nukaya et al.，Int J Cancer 8092-7(1999))，等等。
盡管腫瘤相關抗原的基礎和臨床研究取得了顯著進展(Rosenberg et al.，Nature Med 4321-7(1998)；Mukherji et al.，Proc Natl Acad Sci USA 928078-82(1995)；Hu et al.，Cancer Res 562479-83(1996))，用于治療包括結腸直腸癌在內的腺癌的候選腫瘤相關抗原只有為數(shù)不多的幾個。在癌細胞中大量表達同時僅在癌細胞中表達的腫瘤相關抗原有希望成為免疫療法的候選靶。此外，尋找新的能誘導有力的和特異的抗腫瘤免疫反應的腫瘤相關抗原將極大地激勵在各種癌癥中臨床運用肽免疫接種策略(Boon and vander Bruggen，J Exp Med 183725-9(1996)；van der Bruggen et al.，Science 2541643-7(1991)；Brichard et al.，J Exp Med 178489-95(1993)；Kawakami et al.，J Exp Med 180347-52(1994)；Shichijo et al.，J Exp Med 187277-88(1998)；Chen et al.，Proc Natl Acad Sci USA 941914-8(1997)；Harris，J Natl CancerInst 881442-5(1996)；Butterfield et al.，Cancer Res 593134-42(1999)；Vissers et al.，Cancer Res 595554-9(1999)；van der Burg et al.，J Immunol 1563308-14(1996)；Tanaka et al.，Cancer Res 574465-8(1997)；Fujie et al.，Int JCancer80169-72(1999)；Kikuchi et al.，Int J Cancer 81459-66(1999)；Osio etal.，Int J Cancer 81387-94(1999))。
有多次報道顯示，從某些健康供體獲得的受肽刺激的外周血單核細胞(PBMC)在受到肽刺激后產(chǎn)生相當高水平的IFN-γ，但在51Cr釋放測定法中幾乎不以HLA-A24或-A0201限制方式對腫瘤細胞產(chǎn)生細胞毒性作用(Kawano et al.，Cancer Res 603550-8(2000)；Nishizaka et al.，Cancer Res 604830-7(2000)；Tamura et al.，Jpn J Cancer Res 92762-7(2001))。然而，HLA-A24和-A0201都是日本人及高加索人中常見的HLA等位基因之一(Date et al.，Tissue Antigens 4793-101(1996)；Kondo et al.，J Immunol1554307-12(1995)；Kubo et al.，J Immunol 1523913-24(1994)；Imanishi et al.，Proceeding of the eleventh International Histocompatibility Workshop andConference Oxford University Press，Oxford，1065(1992)；Williams et al.，Tissue Antigens 49129(1997))。因此，由這些HLA呈遞的癌抗原肽對治療日本人及高加索人的癌癥可能尤為重要。此外，已知體外誘導低親和力的細胞毒性T淋巴細胞通常需要高濃度的肽，在抗原呈遞細胞(APC)上形成高水平的特異肽/MHC復合物，才能有效激活這些細胞毒性T淋巴細胞(Alexander-Miller et al.，Proc Natl Acad Sci USA 934102-7(1996))。
發(fā)明概述為了揭示前列腺癌的發(fā)病機理，鑒定新的診斷標志物和/或治療這些腫瘤的藥物靶，本發(fā)明人使用全基因組cDNA微陣結合激光微光束顯微切割技術，分析了前列腺癌的基因表達譜。在前述研究中，通過將激光顯微切割與全基因組cDNA微陣結合，獲得了前列腺癌細胞(PRC)和非侵入性前體細胞(PIN)的精確表達譜。將侵入性PRC的表達譜與正常前列腺上皮或非侵入性前體PIN相比較，本發(fā)明人鑒定了侵入性PRC和前體PIN所共有的88個上調基因和207個下調基因。在本發(fā)明中，本發(fā)明人著重于一個表達序列標簽(EST)，并鑒定了在前列腺癌細胞中過度表達的一個新基因，CCDC4。
結果，CCDC4鑒定為在前列腺癌細胞中特異性過度表達。本發(fā)明人顯示了通過siRNA獲得的CCDC4抑制效果減緩前列腺癌細胞的生長，而且這個分子可能成為前列腺癌新療法的藥物設計的潛在靶。
CCDC4編碼包含卷曲螺旋域、有530個氨基酸的蛋白質。根據(jù)Northern印跡分析，CCDC4的表達僅限于睪丸和前列腺。
許多抗癌藥物不僅對癌細胞有毒，對正常生長細胞同樣有毒。然而，基于CCDC4的正常表達僅限于睪丸和前列腺的事實，抑制CCDC4表達的藥物可能不會對其它器官有不良作用，因而可方便地用于治療或預防前列腺癌。因此，本發(fā)明提供了分離的基因，CCDC4，它可作為前列腺癌的候選診斷標志物，以及開發(fā)新診斷策略和有效抗癌藥物的有希望的潛在靶。此外，本發(fā)明提供了由該基因編碼的多肽，及其生產(chǎn)和使用。更具體地，本發(fā)明提供了新的人類多肽，CCDC4或其功能等同物，其表達在前列腺癌細胞中是增高的。
在一個優(yōu)選的實施方案中，CCDC4多肽包含由開放讀碼框SEQ ID NO1編碼的530個氨基酸的蛋白質，或是由開放讀碼框SEQ ID NO3編碼的437個氨基酸的蛋白質。CCDC4多肽優(yōu)選包含SEQ ID NO2(Gene Bank編號AB126828)或SEQ ID NO4(Gene Bank編號AB126829)所列氨基酸序列。本申請還提供了由至少部分CCDC4多核苷酸序列或是與SEQ IDNO1或3所列序列至少15％且更優(yōu)選至少25％互補的多核苷酸序列編碼的分離的蛋白質。
本發(fā)明進一步提供了新的人類基因，CCDC4，其表達在絕大多數(shù)前列腺癌中較相應的非癌前列腺管上皮明顯增高。分離的CCDC4基因包含SEQID NO1或3所述多核苷酸序列。尤其，CCDC4 cDNA包含8763個核苷酸，其中包含1593個核苷酸的開放讀碼框(SEQ ID NO1)，或是8692個核苷酸，其中包含1314個核苷酸的開放讀碼框(SEQ ID NO3)。本發(fā)明還涵蓋能與SEQ ID NO1或3所列多核苷酸序列雜交且至少15％且更優(yōu)選至少25％互補的多核苷酸，以至于它們編碼CCDC4蛋白質或其功能等同物。此類多核苷酸的例子是由序列SEQ ID NO1或3編碼的CCDC4的簡并或等位基因突變體。
如這里所用，分離的基因是指在結構上不同于任何自然存在的多核苷酸或者自然存在并跨越3個以上分開基因的基因組多核苷酸的任何片段的多核苷酸。因此，該術語包括，例如(a)DNA，其序列是自然存在的基因組DNA分子的一部分，該分子在它所自然存在的生物體的基因組中；(b)多核苷酸，摻入到載體或者原核生物或真核生物的基因組DNA中，以至于得到的分子不同于任何自然存在的載體或基因組DNA；(c)分開的分子諸如cDNA、基因組片段、聚合酶鏈反應(PCR)所產(chǎn)生的片段、或限制性片段；和(d)作為雜合基因即編碼融合多肽的基因一部分的重組核苷酸序列。
據(jù)此，在一方面，本發(fā)明提供了編碼本文所述多肽或其片段的分離的多核苷酸。優(yōu)選地，分離的多核苷酸包含與SEQ ID NO1或3所示核苷酸序列至少60％相同的核苷酸序列。更優(yōu)選地，分離的核酸分子與SEQ ID NO1或3所示核苷酸序列至少65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或以上相同。如果分離的多核苷酸在長度上比參考序列，如SEQ ID NO1或3更長或同樣長，用全長參考序列進行比較。當分離的多核苷酸比參考基因短，如比SEQ ID NO1或3短，用相同長度的一段參考序列進行比較(排除同源性計算要求的任何環(huán))。
本發(fā)明還提供了以編碼CCDC4蛋白質的多核苷酸序列轉染或轉化宿主細胞并表達該多核苷酸序列來生產(chǎn)蛋白質的方法。加之，本發(fā)明提供了包含編碼CCDC4蛋白質的多核苷酸序列的載體和包含編碼CCDC4蛋白質的多核苷酸的宿主細胞。此類載體和宿主細胞可用于生產(chǎn)CCDC4蛋白質。
本申請還提供了能特異識別CCDC4蛋白質的結合劑。例如，結合劑可以是針對CCDC4蛋白質誘導的抗體。或者，結合劑可以是對該蛋白質特異的配體，或是能與該蛋白質特異結合的人工合成多肽(參見如WO2004044011)。還提供了CCDC4基因的反義多核苷酸(如反義DNA)、核酶、和siRNA(小干擾RNA)。
本發(fā)明還提供了用于診斷前列腺癌的方法，它包括以下步驟測定受試者生物樣本中該基因的表達水平，與正常樣本比較CCDC4基因的表達水平，并確定樣本中CCDC4基因的高表達水平說明該受試者患有前列腺癌或者有發(fā)展為前列腺癌的危險。
此外，本發(fā)明還提供了篩選用于治療或預防前列腺癌的化合物的方法。該方法包括使CCDC4多肽與測試化合物接觸，并選擇與CCDC4多肽結合或改變CCDC4生物學活性的測試化合物。
本發(fā)明還提供了篩選用于治療或預防前列腺癌的化合物的方法，其中該方法包括使測試化合物與表達CCDC4多肽或者導入了下述載體的細胞接觸，所述載體在報道基因上游包含CCDC4的轉錄調控區(qū)，并選擇抑制CCDC4多肽的表達水平的測試化合物。
本申請還提供了用于治療或預防前列腺癌的藥用組合物。該藥用組合物可以是例如抗癌藥物。該藥用組合物可包含針對SEQ ID NO1和3各自所示和所述CCDC4多核苷酸序列的反義S-寡核苷酸、siRNA分子或核酶的至少一部分。適當?shù)膕iRNA以序列SEQ ID NO8為靶。因此，本發(fā)明之siRNA包含來自SEQ ID NO8的核苷酸序列。根據(jù)本發(fā)明，這可優(yōu)選地選作治療或預防前列腺癌的靶。所述藥用組合物還可以是包含通過本發(fā)明之篩選用于治療或預防細胞增殖性疾病諸如前列腺癌的化合物的方法選擇的化合物的藥用組合物。
所述藥用組合物的作用過程最好是抑制癌細胞諸如前列腺癌細胞的生長。所述藥用組合物可用于包括人類和已馴化哺乳動物在內的哺乳動物。
本發(fā)明還提供了用本發(fā)明所提供的藥用組合物治療或預防前列腺癌的方法。
此外，本發(fā)明還提供了用于治療或預防癌癥的方法，該方法包括的步驟有施用CCDC4多肽。期望通過施用CCDC4多肽能誘導抗腫瘤免疫。因此，本發(fā)明還提供了用于誘導抗腫瘤免疫的方法，該方法包括的步驟有施用CCDC4，以及包含CCDC4多肽的用于治療或預防癌癥的藥用組合物。
應該理解的是前述的發(fā)明概述及以下的詳細說明都是優(yōu)選的實施方案，并不限制本發(fā)明或本發(fā)明的其它可選實施方案。
附圖簡述

圖1(A)是描述半定量PCR結果的照片。CCDC4在從人前列腺癌組織顯微切割的前列腺癌細胞中過度表達。圖1(B)是描述顯示CCDC4在正常組織中表達譜的Northern印跡分析的照片。CCDC4的8.7kb轉錄本只限于在成人睪丸和前列腺中表達。
圖2顯示了通過siRNA抑制前列腺癌細胞系PRC3中內源性CCDC4的效果。圖2(A)是顯示RT-PCR結果的照片。該照片證實了轉染siRNA表達載體si#1抑制CCDC4 mRNA的效果。si#1是專為CCDC4 mRNA序列設計的，而siEGFP是為EGFP mRNA序列設計的。轉染后48小時收獲并分析RNA。ACTB用于使輸入cDNA標準化。圖2(B)是顯示集落形成實驗結果的照片。該照片顯示了經(jīng)RT-PCR證實能有效抑制CCDC4的si#1轉染后一周，PRC3細胞的集落數(shù)明顯減少。圖2(C)是顯示MTT實驗結果的條形圖。該實驗同樣顯示了轉染si#1后生長細胞數(shù)的顯著減少。
發(fā)明詳述這里所用的詞語“一個/種”和“這個/種”是指“至少一個/種”，除非另有說明。
為了揭示前列腺癌的機制及鑒定新的診斷標志物和/或用于治療和/或預防這些腫瘤的藥靶，本發(fā)明人使用全基因組cDNA微陣結合激光微光束顯微切割，分析了前列腺癌中的基因表達譜。結果表明，CCDC4特異地在前列腺癌細胞中過度表達。而且，用小干擾RNA(siRNA)抑制CCDC4基因表達導致明顯的癌細胞生長抑制。這些發(fā)現(xiàn)提示CCDC4致使癌細胞具有致瘤作用，而且抑制這些蛋白質的活性可作為治療和預防增殖性疾病諸如前列腺癌的有希望的策略。
CCDC4根據(jù)本發(fā)明，鑒定了具有相似序列的兩個基因，它們編碼CCDC4的變體。較長變體的cDNA由8763個核苷酸組成，含有1593個核苷酸的開放讀碼框(SEQ ID NO1)，而較短的變體由8692個核苷酸組成，含有1314個核苷酸的開放讀碼框(SEQ ID NO3)。這些開放讀碼框分別編碼530個氨基酸的蛋白質和437個氨基酸的蛋白質。
因此，本發(fā)明提供了基本上純的由這些基因編碼的多肽，包括包含氨基酸序列SEQ ID NO2或4的多肽及其功能等同物，只要它們編碼CCDC4蛋白質。在功能上與CCDC4等同的多肽的例子包括，例如其它生物體對應于人CCDC4蛋白質的同源蛋白，以及人CCDC4蛋白質的突變體。
在本發(fā)明中，術語“功能上等同的”是指目標多肽具有類似CCDC4蛋白質的促進細胞增殖和授予癌細胞致癌活性的作用。目標多肽是否具有細胞增殖活性可以通過將編碼目標多肽的DNA導入細胞，表達相應多肽并檢測其對細胞增殖的促進或集落形成活性的增高來判斷。此類細胞包括，例如，NIH3T3、COS7和HEK293。
用于制備功能上與指定蛋白質等同的多肽的方法為本領域技術人員所熟知，包括將突變引入蛋白質的已知方法。例如，本領域技術人員可通過定點突變將適當?shù)耐蛔円脒@些蛋白質的氨基酸序列來制備功能上與人CCDC4蛋白質等同的多肽(Hashimoto-Gotoh et al.，Gene 152271-5(1995)；Zoller and Smith，Methods Enzymol 100468-500(1983)；Kramer et al.，NucleicAcid Res 129441-9456(1984)；Kramer and Fritz，Methods Enzymol 154350-67(1987)；Kunkel，Proc Natl Acad Sci USA 82488-92(1985)；Kunkel，Methods Enzymol 852763-6(1988))。氨基酸突變也可能自然發(fā)生。本發(fā)明之多肽包括具有人CCDC4蛋白質的氨基酸序列但其中一個或多個氨基酸發(fā)生突變的蛋白質，只要得到的突變多肽在功能上等同于人CCDC4蛋白質。此類突變體中的突變氨基酸數(shù)目通常為10個氨基酸或更少，優(yōu)選6個氨基酸或更少，更優(yōu)選3個氨基酸或更少。
已知突變的或修飾的蛋白質，具有在某種氨基酸序列上通過替代、刪除、插入和/或添加一個或多個氨基酸殘基而修飾的氨基酸序列的蛋白質，能保留原有的生物學活性(Mark et al.，Proc Natl Acad Sci USA 815662-6(1984)；Zoller and Smith，Nucleic Acid Res 106487-500(1982)；Dalbadie-McFarland et al.，Proc Natl Acad Sci USA 796409-13(1982))。
突變氨基酸殘基優(yōu)選突變?yōu)椴煌被釟埢?，其中氨基酸側鏈的特性不?一個稱為保守氨基酸替代的過程)。氨基酸側鏈的特性的例子包括疏水性氨基酸(A，I，L，M，F(xiàn)，P，W，Y，V)，親水性氨基酸(R，D，N，C，E，Q，G，H，K，S，T)，和帶有以下共同官能基或特征的側鏈脂肪族側鏈(G，A，V，L，I，P)；含羥基側鏈(S，T，Y)；含硫原子側鏈(C，M)；含羧酸和酰胺側鏈(D，N，E，Q)；含堿基側鏈(R，K，H)；及含芳香族側鏈(H，F(xiàn)，Y，W)。注意，附帶說明的字母指的是氨基酸的單字母代碼。
將一個或多個氨基酸殘基加到人CCDC4蛋白質的氨基酸序列中所得到的多肽的一個例子是包含人CCDC4蛋白質的融合蛋白。融合蛋白，人CCDC4蛋白質與其它肽或蛋白質的融合體，包含在本發(fā)明中。融合蛋白可通過本領域技術人員所熟知的技術來制備，諸如將編碼本發(fā)明之人CCDC4蛋白質的DNA與編碼其它肽或蛋白質的DNA連接在一起，并保證讀碼框正確，將融合DNA插入表達載體并在宿主中表達。對與本發(fā)明之蛋白質融合的肽或蛋白質不作限制。
可用作與本發(fā)明之蛋白質融合的肽的已知肽包括，例如，F(xiàn)LAG(Hoppet al.，Biotechnology 61204-10(1988))，含6個His(組氨酸)殘基的6xHis，10xHis，流感凝集素(HA)，人c-myc片段，VSP-GP片段，p18 HIV片段，T7標簽，HSV標簽，E標簽，SV40 T抗原片段，lck標簽，α-微管蛋白片段，B標簽，蛋白質C片段等等。可與本發(fā)明之蛋白質融合的蛋白質的例子包括GST(谷胱苷肽-S-轉移酶)，流感凝集素(HA)，免疫球蛋白恒定區(qū)，β-半乳糖苷酶，MBP(麥芽糖結合蛋白)等等。
融合蛋白可通過將編碼上述融合肽或蛋白質的市售DNA與編碼本發(fā)明之多肽的DNA融合并表達所得融合DNA來制備。
在本領域已知的可供選擇的分離功能等同多肽的方法是，例如，運用雜交技術的方法(Sambrook et al.，Molecular Cloning 2nd ed。9.47-9.58，ColdSpring Harbor Lab.Press(1989))。本領域技術人員能輕易地分離出與編碼人CCDC4蛋白質的整個或部分DNA序列(即SEQ ID NO1或3)具有高度同源性的DNA，并由分離的DNA分離人CCDC4蛋白質的功能等同多肽。本發(fā)明之多肽包括由能與編碼人CCDC4蛋白質的整個或部分DNA序列雜交的DNA編碼且在功能上等同于人CCDC4蛋白質的多肽。這些多肽包括對應于衍生自人類的蛋白質的哺乳動物同系物(例如由猴、大鼠、兔和?；蚓幋a的多肽)。在從動物分離與編碼人CCDC4蛋白質的DNA高度同源的cDNA時，使用來自睪丸或前列腺的組織是特別優(yōu)選的。
用于分離編碼在功能上與人CCDC4蛋白質等同的多肽的DNA的雜交條件可由本領域技術人員按常規(guī)作出選擇。例如，雜交可如下進行用“快速雜交緩沖液”(Amersham LIFE SCIENCE)于68℃預雜交30分鐘或更長，加入已標記探針，并于68℃保溫1小時或更長。以下清洗步驟可在例如低嚴格性條件下進行。低嚴格性條件是例如42℃，2X SSC，0.1％SDS，或是優(yōu)選50℃，2X SSC，0.1％SDS。更優(yōu)選使用高嚴格性條件。高嚴格性條件是例如于室溫在2X SSC，0.01％SDS中洗三次，20分鐘；然后于37℃在1X SSC，0.1％SDS中洗三次，20分鐘；再然后于50℃，在1X SSC，0.1％SDS中洗兩次，20分鐘。然而，有些因素，諸如溫度和鹽濃度，能影響雜交的嚴格度，而本領域技術人員能選擇合適的條件以達到所需的嚴格度。
可采用基因擴增的方法，例如聚合酶鏈反應(PCR)方法代替雜交用于分離編碼在功能上與人CCDC4蛋白質等同的多肽的DNA，所用引物是根據(jù)編碼該蛋白質的DNA(SEQ ID NO1或3)的序列信息合成的。
由前述的雜交技術或基因擴增技術分離的DNA所編碼的在功能上與人CCDC4蛋白質等同的多肽通常與人CCDC4蛋白質的氨基酸序列具有高度同源性?！案叨韧葱浴币话闶侵敢环N多肽序列或一種多核苷酸序列與參考序列之間40％或更高同源性，優(yōu)選60％或更高，更優(yōu)選80％或更高，甚至更優(yōu)選85％，90％，93％，95％，98％，99％或更高。同源性百分比(也稱為同一性百分比)通常在兩個最佳比對的序列之間進行。為比較而進行的序列比對方法在本領域是眾所周知的。序列的最佳比對和比較可按照例如“Wilbur and Lipman，Proc Natl Acad Sci USA 80726-30(1983)”中的算法進行。
根據(jù)用于生成本發(fā)明之多肽的細胞或宿主或是所采用的純化方法，其氨基酸序列、分子量、等電點、是否有糖鏈、或者型方面有差異。無論怎樣，只要它具有與本發(fā)明之人CCDC4蛋白質等同的功能，它就包含在本發(fā)明的范圍內。
本發(fā)明之多肽可通過本領域技術人員熟知的方法以重組蛋白或天然蛋白的形式制備。重組蛋白的制備可通過將編碼本發(fā)明之多肽的DNA(例如包含核苷酸序列SEQ ID NO1或3的DNA)插入適當?shù)谋磉_載體，將載體導入適當?shù)乃拗骷毎?，收獲提取物，并通過將提取物層析來純化多肽，層析例如離子交換層析、反相層析、凝膠過濾或親和層析，即利用固定有針對本發(fā)明之蛋白質的抗體的柱子進行的層析，或者結合一種以上上述柱子的層析。
同樣，當本發(fā)明之多肽在宿主細胞(例如動物細胞和大腸桿菌)中作為與谷胱甘肽-S-轉移酶蛋白質的融合蛋白或補充了多個組氨酸的重組蛋白的形式表達時，表達的重組蛋白可用谷胱甘肽柱或鎳柱進行純化?；蛘?，當本發(fā)明之多肽以標有c-myc、多個組氨酸或FLAG的蛋白質的形式表達時，可用針對c-myc、His或FLAG的相應抗體檢測和純化該蛋白質。
融合蛋白質純化以后，還可能根據(jù)需要用凝血酶或Xa因子切除目標多肽以外的區(qū)域。
天然蛋白的分離可通過本領域技術人員熟知的方法進行，例如讓表達本發(fā)明之多肽的組織或細胞的提取物經(jīng)過附著有如下所述的能與CCDC4蛋白質結合的抗體的親和柱。該抗體可以是多克隆抗體或單克隆抗體。
本發(fā)明還涵蓋本發(fā)明之多肽的部分肽段。部分肽段具有本發(fā)明之多肽的特異氨基酸序列并由至少7個氨基酸組成，優(yōu)選8個氨基酸或更多，更優(yōu)選9個氨基酸或更多。部分肽段可用于例如制備針對本發(fā)明之多肽的抗體，篩選能與本發(fā)明之多肽結合的化合物，及篩選本發(fā)明之多肽的抑制劑。
本發(fā)明之部分肽段可通過基因工程，通過已知的肽合成或通過用適當?shù)碾拿赶景l(fā)明之多肽來生成。對于肽合成，例如，可用固相合成或液相合成。
本發(fā)明進一步提供了編碼上述CCDC4多肽的多核苷酸。本發(fā)明之多核苷酸可用于在體內或體外生成如上所述的本發(fā)明之多肽，或者可用于可歸因于編碼本發(fā)明之蛋白質的基因中遺傳異常的疾病的基因療法。本發(fā)明之多核苷酸的任何形式都可使用，只要它編碼本發(fā)明之多肽，包括mRNA、RNA、cDNA、基因組DNA、及化學合成的多核苷酸。本發(fā)明之多核苷酸包括包含指定核苷酸序列及其簡并序列的DNA，只要所得DNA編碼本發(fā)明之多肽。
本發(fā)明之多核苷酸可通過本領域技術人員知道的方法來制備。例如，本發(fā)明之多核苷酸可如下制備從表達本發(fā)明之多肽的細胞制備cDNA文庫，并以本發(fā)明之DNA(例如SEQ ID NO1或3)的部分序列作為探針進行雜交。cDNA文庫的制備可采用，例如，Sambrook等編寫的《分子克隆》，冷泉港實驗室出版社(1989)中所描述的方法；或者，可采用市售cDNA文庫。cDNA文庫還可如下制備從表達本發(fā)明之多肽的細胞提取RNA，根據(jù)本發(fā)明之DNA的序列(例如SEQ ID NO1或3)合成寡DNA，以所述寡DNA為引物進行PCR，并擴增編碼本發(fā)明之蛋白質的cDNA。
另外，通過對所得cDNA的核苷酸測序，可常規(guī)確定由所述cDNA編碼的翻譯區(qū)，且能容易地得到本發(fā)明之多肽的氨基酸序列。還有，以得到的cDNA或其部分作為探針，篩選基因組DNA文庫，就能分離得到基因組DNA。
更具體地說，首先可從表達本發(fā)明之多肽的細胞、組織或器官(如睪丸或前列腺)制備mRNA。可使用已知方法來分離mRNA；例如通過胍超速離心(Chirgwin et al.，Biochemistry 185294-9(1979))或AGPC法(Chomczynski and Sacchi，Anal Biochem 162156-9(1987))制備總RNA。此外，可用mRNA純化試劑盒(Pharmacia)和類似的試劑盒從總RNA純化mRNA?；蛘?，可以用QuickPrep mRNA純化試劑盒(Pharmacia)直接純化mRNA。
使用逆轉錄酶從所得mRNA合成cDNA。cDNA的合成可采用市售試劑盒，諸如AMV逆轉錄酶cDNA第一鏈合成試劑盒(Seikagaku Kogyo)。或者，cDNA可遵循5′-RACE法用這里所描述的引物和類似的引物、5′-AmpliFINDER RACE試劑盒(Clontech)、及聚合酶鏈反應(PCR)合成和擴增(Frohman et al.，Proc Natl Acad Sci USA 858998-9002(1998)；Belyavsky etal.，Nucleic Acid Res 172919-32(1989))。
從PCR產(chǎn)物中制備所需DNA片段并與載體DNA連接。將重組載體用于轉染大腸桿菌之類，并從選出的菌落制備所需重組載體。所需DNA的核苷酸序列可經(jīng)常規(guī)方法鑒定，諸如雙脫氧核糖核酸鏈終止法。
本發(fā)明之多核苷酸的核苷酸序列可在設計時考慮表達所用宿主細胞的密碼子使用頻率以提高表達效率(Grantham et al.，Nucleic Acid Res 943-74(1981))。本發(fā)明之多核苷酸的序列可用市售試劑盒或常規(guī)方法來改變。例如，為改變序列，可用限制酶消化序列，插入合成的寡核苷酸或適當?shù)亩嗪塑账崞?，摻入接頭，或插入起始密碼子(ATG)和/或終止密碼子(TAA，TGA或TAG)。
具體而言，本發(fā)明之多核苷酸涵蓋包含核苷酸序列SEQ ID NO1或3的DNA。
而且，本發(fā)明提供了能在高嚴格度條件下與具有核苷酸序列SEQ ID NO1或3的多核苷酸雜交并編碼在功能上與如前所述本發(fā)明之CCDC4蛋白質等同的多肽的多核苷酸。本領域技術人員可選擇適宜的嚴格度條件。例如，可使用低嚴格度條件。更優(yōu)選地，可使用高嚴格度條件。這些條件與前述的相同。上述雜交DNA優(yōu)選cDNA或染色體DNA。
本發(fā)明還提供了與編碼人CCDC4蛋白質的多核苷酸(SEQ ID NO1或3)或其互補鏈互補且包含至少15個核苷酸的多核苷酸。本發(fā)明之多核苷酸優(yōu)選能與編碼本發(fā)明之CCDC4多肽的DNA特異雜交的多核苷酸。這里所用的術語“特異雜交”是指在通常雜交條件下，優(yōu)選在高嚴格度雜交條件下，與編碼其他蛋白質的DNA無明顯交叉雜交發(fā)生。此類多核苷酸包括能與編碼本發(fā)明之多肽的DNA或其互補鏈特異雜交的探針、引物、核苷酸及核苷酸衍生物(例如反義寡核苷酸和核酶)。此外，此類多核苷酸可用于制備DNA芯片。
載體和宿主細胞本發(fā)明還提供了導入了本發(fā)明之多核苷酸的載體和宿主細胞。本發(fā)明之載體可用于在宿主細胞中保存本發(fā)明之多核苷酸，尤其是DNA，表達本發(fā)明之多肽，或在基因療法中施用本發(fā)明之多核苷酸。
當宿主細胞是大腸桿菌且載體在大腸桿菌(如JM109，DH5α，HB101，或XL1 Blue)中大量擴增和生成時，載體須具有在大腸桿菌中擴增的“起點”及標志基因以便篩選受到轉化的大腸桿菌(如能由諸如氨芐青霉素、四環(huán)素、卡那霉素、氯霉素等藥物篩選的抗藥基因)。例如，可使用M13系列載體，pUC系列載體，pBR322，pBluescript，pCR-Script等。此外，pGEM-T、pDIRECT和pT7及上述載體可用于亞克隆和提取cDNA。當載體是用于生產(chǎn)本發(fā)明之蛋白質時，表達載體尤其有用。例如，在大腸桿菌中表達的表達載體須具備上述在大腸桿菌中擴增的特征。當使用大腸桿菌，諸如JM109，DH5α，HB101或XL1 Blue作為宿主細胞時，載體必包含能在大腸桿菌中高效表達所需基因的啟動子，例如lacZ啟動子(Ward et al.，Nature 341544-6(1989)；FASEB J 62422-7(1992))，araB啟動子(Better etal.，Science 2401041-3(1988))，T7啟動子等等。從這一點出發(fā)，可使用例如pGEX-5X-1(Pharmacia)，“QIAexpress系統(tǒng)”(Qiagen)，pEGFP和pET(在這種情況中，宿主優(yōu)選表達T7 RNA聚合酶的BL21)替代上述載體。此外，載體還可包含多肽分泌所需的信號序列。引導多肽分泌到大腸桿菌周質的例示性信號序列是pelB信號序列(Lei et al.，J Bacteriol 1694379(1987))。用于將載體導入靶宿主細胞的手段包括，例如氯化鈣法和電穿孔法。
除大腸桿菌以外，例如，可使用衍生自哺乳動物的表達載體(例如pcDNA3(Invitrogen)和pEGF-BOS(Nucleic Acid Res 18(17)5322(1990))，pEF，pCDM8)，衍生自昆蟲細胞的表達載體(例如“Bac-to-BAC桿狀病毒表達系統(tǒng)”(GIBCO BRL)，pBacPAK8)，衍生自植物的表達載體(如pMH1，pMH2)，衍生自動物病毒的表達載體(如pHSV，pMV，pAdexLcw)，衍生自逆轉錄病毒的表達載體(如pZIpneo)，衍生自酵母的表達載體(如“畢赤酵母表達試劑盒”(Invitrogen)，pNV11，SP-Q01)，及衍生自枯草芽孢桿菌的表達載體(如pPL608，pKTH50)來生產(chǎn)本發(fā)明之多肽。
為了在哺乳動物細胞，諸如CHO、COS和NIH3T3細胞中表達載體，載體須含有在此類細胞中表達所必需的啟動子，例如SV40啟動子(Mulliganet al.，Nature 277108(1979))，MMLV-LTR啟動子，EFlα啟動子(Mizushimaet al.，Nucleic Acid Res 185322(1990))，CMV啟動子等等，并且優(yōu)選含有用于篩選轉化子的標志基因(例如可由藥物(如新霉素，G418)篩選的抗藥基因)。具備這些特征的已知載體的例子包括例如pMAM，pDR2，pBK-RSV，pBK-CMV，pOPRSV和pOP13。
生產(chǎn)多肽此外，本發(fā)明還提供了用于生產(chǎn)本發(fā)明之多肽的方法。為了制備多肽，可培養(yǎng)含有下述表達載體的宿主細胞，所述表達載體包含編碼所述多肽的基因。根據(jù)需要，這些方法可用于穩(wěn)定地表達基因，同時在細胞中增加其拷貝數(shù)。例如，可將包含互補DHFR基因的載體(如pCHOI)導入核酸合成途徑遭到刪除的CHO細胞，并用氨甲蝶呤(MTX)擴增。而且，在短暫表達基因的情況中，可運用將含有SV40復制起點的載體(pcD等)轉化到染色體中包含SV40 T抗原表達基因的COS細胞中的方法。
按上述方法所獲得的本發(fā)明之多肽可從宿主細胞內或細胞外(諸如培養(yǎng)基)分離，并純化成基本上純的均質多肽。這里所用關系到指定多肽的術語“基本上純的”是指該多肽基本上不含其他生物學大分子?；旧霞兊亩嚯脑诟芍刂羞_到至少75％(如至少80，85，95或99％)的純度。純度可用適當?shù)臉藴史椒▉頊y量，例如柱層析，聚丙烯酰胺凝膠電泳，或HPLC分析。多肽分離和純化的方法不限于任何特定的方法；事實上，可采用任何標準方法。
例如，柱層析，過濾，超濾，鹽沉淀，溶劑沉淀，溶劑提取，蒸餾，免疫沉淀，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，等電點電泳，透析，和重結晶，均可恰當選擇并結合起來以分離和純化多肽。
層析的例子包括，例如親和層析，離子交換層析，疏水層析，凝膠過濾，反相層析，吸收層析，等等(Strategies for Protein Purification andCharacterizationA Laboratory Course Manual.Ed.Daniel R.Marshak et al.，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1996))。這些層析可用液相層析來進行，諸如HPLC和FPLC。這樣，本發(fā)明提供了通過以上方法制備的高度純化的多肽。
本發(fā)明之多肽可任選在純化前或純化后通過用適當?shù)牡鞍踪|修飾酶進行處理來修飾或者部分刪除。有用的蛋白質修飾酶包括，但不限于，胰蛋白酶，糜蛋白酶，賴氨酰內肽酶，蛋白激酶，葡萄糖苷酶等等。
抗體本發(fā)明提供了能與本發(fā)明之多肽結合的抗體。本發(fā)明之抗體可以任何形式使用，諸如單克隆或多克隆抗體，并包括通過用本發(fā)明之多肽免疫動物，諸如兔所獲得的抗血清，所有類別的多克隆和單克隆抗體，人源抗體和通過基因重組生成的人源化抗體。
作為抗原用于獲得抗體的本發(fā)明之多肽可以是衍生自任何動物物種，但優(yōu)選衍生自哺乳動物，諸如人、小鼠或大鼠，更優(yōu)選衍生自人。衍生自人的多肽可通過本發(fā)明所公開的核苷酸或氨基酸序列獲得。根據(jù)本發(fā)明，用作免疫抗原的多肽可以是完整的蛋白質或蛋白質的部分肽段。部分肽段可包含，例如本發(fā)明之多肽的氨基末端(N端)或羧基末端(C端)片段。
在這里，抗體定義為能與本發(fā)明之多肽的全長或片段發(fā)生反應的蛋白質。
可將編碼本發(fā)明之多肽或其片段的基因插入已知的表達載體，然后用于轉化本文所述的宿主細胞。所需多肽或其片段可通過任何標準方法從宿主細胞內或細胞外回收，然后可用作抗原?；蛘?，可使用表達多肽的整個細胞或其裂解物，或是化學合成的多肽作為抗原。
任何哺乳動物都可用該抗原免疫，但優(yōu)選考慮其與細胞融合所用親本細胞的相容性。通常選用嚙齒目(Rodentia)、兔形目(Lagomorpha)或靈長目(Primate)的動物。嚙齒目動物包括例如小鼠，大鼠和倉鼠。兔形目動物包括例如兔。靈長目動物包括例如狹鼻類的猴(舊世紀猴)，諸如食蟹猴(Macaca fascicularis)，獼猴，狒狒和黑猩猩。
用抗原免疫動物的方法是本領域已知的。腹膜內注射或皮下注射抗原是免疫哺乳動物的標準方法。更詳細地說，將抗原用適量的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)、生理鹽水等稀釋和懸浮。如需要，抗原懸浮液可與適量的標準佐劑混和，諸如弗氏完全佐劑，形成乳狀液，然后施用于哺乳動物。優(yōu)選地，隨后每4到21天施用抗原與適量弗氏不完全佐劑的混合物，重復多次。適當?shù)妮d體也可用于免疫。如上所述免疫后，通過標準方法檢驗血清中所需抗體水平的增加。
針對本發(fā)明之多肽的多克隆抗體可通過從血清中所需抗體水平檢驗到增高的被免疫哺乳動物采集血液，并運用任何常規(guī)方法從血液分離血清來制備。多克隆抗體包括含有多克隆抗體的血清，以及從血清中分離出來的含多克隆抗體的級分。免疫球蛋白G或M可從只識別本發(fā)明之多肽的級分制備，例如使用偶聯(lián)了本發(fā)明之多肽的親和柱，并進一步用蛋白質A或蛋白質G柱純化這一級分。
為了制備單克隆抗體，從用抗原免疫的哺乳動物收集免疫細胞，如上所述檢查血清中所需抗體水平的增高，再進行細胞融合。用于細胞融合的免疫細胞優(yōu)選從脾獲得。其它優(yōu)選的與上述免疫細胞融合的親本細胞包括例如哺乳動物的骨髓瘤細胞，更優(yōu)選具有用藥物篩選融合細胞的獲得性特征的骨髓瘤細胞。
上述免疫細胞和骨髓瘤細胞可通過已知方法融合，例如Milstein等的方法(Galfre and Milstein，Methods Enzymol 733-46(1981))。
通過細胞融合所獲得的雜交瘤可通過在標準篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)來篩選，諸如HAT培養(yǎng)基(含次黃嘌呤，氨基喋呤和胸腺嘧啶的培養(yǎng)基)。通常細胞在HAT培養(yǎng)基中培養(yǎng)數(shù)天至數(shù)周，時間長到足以使除所需雜交瘤以外的所有其它細胞(非融合細胞)死亡。然后，進行標準有限稀釋以篩選并克隆產(chǎn)生所需抗體的雜交瘤細胞。
除上述方法，即用抗原免疫非人動物以制備雜交瘤，人淋巴細胞諸如感染了EB病毒的細胞，亦可用多肽，表達多肽的細胞或其體外裂解物進行免疫。接著，將免疫的淋巴細胞與衍生自人的能夠無限分裂的骨髓瘤細胞，諸如U266融合，得到產(chǎn)生能與多肽結合的所需人源抗體的雜交瘤細胞(未經(jīng)審查、已公開的日本專利申請?zhí)?JP-A)Sho 63-17688)。
隨后將所獲得的雜交瘤植入小鼠腹腔，然后抽取腹水。所獲得的單克隆抗體可通過例如硫酸銨沉淀，蛋白質A或蛋白質G柱，DEAE離子交換柱或偶聯(lián)了本發(fā)明之多肽的親和柱來純化。本發(fā)明之抗體不僅可用于本發(fā)明之多肽的純化和檢測，還可作為本發(fā)明之多肽的激動劑和拮抗劑的候選物。另外，這一抗體可用于與本發(fā)明之多肽相關的疾病的抗體治療。在將所得到的抗體注射到人體中時(抗體治療)，優(yōu)選人源抗體或人源化抗體以降低免疫原性。
例如，可用選自多肽，表達多肽的細胞或其裂解物的抗原免疫具有人抗體基因全集的轉基因動物。隨后從動物收集產(chǎn)生抗體的細胞并與骨髓瘤細胞融合形成雜交瘤，可從后者制備針對所述多肽的人源抗體(參見WO92-03918，WO93-2227，WO94-02602，WO94-25585，WO96-33735和WO96-34096)。
或者，可用癌基因使產(chǎn)生抗體的免疫細胞，諸如經(jīng)免疫淋巴細胞永生化，并用于制備單克隆抗體。
這樣獲得的單克隆抗體也可通過基因工程技術重組制備(參見例如Borrebaeck and Larrick，Therapeutic Monoclonal Antibodies，published in theUnited Kingdom by MacMillan Publishers LTD(1990))。例如，可從產(chǎn)生抗體的免疫細胞，諸如雜交瘤或經(jīng)免疫淋巴細胞克隆得到編碼抗體的DNA，插入適當?shù)妮d體，并導入宿主細胞以制備重組抗體。本發(fā)明還提供了用上述方法制備的重組抗體。
另外，本發(fā)明之抗體可以是抗體的片段或經(jīng)修飾的抗體，只要它能與本發(fā)明之一種或多種多肽結合。例如，抗體片段可以是Fab，F(xiàn)(ab’)2，F(xiàn)v或單鏈Fv(scFv)，其中來自H和L鏈的Fv片段通過適當?shù)慕宇^相連(Hustonet al.，Proc Natl Acad Sci USA 855879-83(1988))。更詳細地說，抗體片段可通過用酶處理抗體來制備，諸如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶?；蛘?，可以構建編碼抗體片段的基因，插入表達載體并在適當?shù)乃拗骷毎斜磉_(參見例如Co et al.，J Immunol 1522968-76(1994)；Better and Horwitz，MothedsEnzymol 178476-96(1989)；Pluckthun and Skerra，Methods Enzymol 178497-515(1989)；Lamoyi，Methods Enzymol 121652-63(1986)；Rousseaux etal.，Methods Enzymol 121663-9(1986)；Bird and Walker，Trends Biotechnol9132-7(1991))。
抗體可通過綴合各種分子，諸如聚乙二醇(PEG)來修飾。本發(fā)明提供了此類修飾抗體。修飾抗體可通過化學修飾抗體來獲得。這些修飾方法在本領域是常規(guī)的。
或者，本發(fā)明之抗體可以衍生自非人抗體的可變區(qū)與衍生自人源抗體的恒定區(qū)之間的嵌合抗體，或是包含衍生自非人抗體的互補決定區(qū)(CDR)、衍生自人源抗體的框架區(qū)(FR)和恒定區(qū)的人源化抗體的形式來獲得。此類抗體可根據(jù)已知技術制備。人源化可通過用嚙齒類CDR或CDR序列替代人源抗體的相應序列來進行(參見如Verhoeyen et al.，Science 2391534-1536(1988))。相應地，此類人源化抗體是嵌合抗體，其中基本上少于完整人源可變區(qū)用來源于非人物種的相應序列所替代。
還可采用在人源框架區(qū)和恒定區(qū)之外包含人源可變區(qū)的完全人源抗體。此類抗體的生產(chǎn)可運用本領域已知的多種技術。例如，體外的方法涉及使用展示于噬菌體上的人源抗體片段的重組文庫(例如Hoogenboom&Winter，J.Mol.Biol.227381(1991))。類似的，生產(chǎn)人源抗體還可通過將人免疫球蛋白基因座導入轉基因動物，如小鼠，其本身的內源性免疫球蛋白基因已經(jīng)部分或全部滅活了。這一方法在美國專利號6,150,584；5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016中進行了描述。
可將如上所述得到的抗體純化至均質。例如，抗體的分離和純化可采用普通蛋白質的分離和純化方法。例如，通過恰當?shù)倪x擇并結合使用柱層析，諸如親和層析、過濾、超濾、鹽析、透析、SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳和等電聚焦的方法分離抗體(AntibodiesA Laboratory Manual.Ed Harlowand David Lane，Cold Spring Harbor Laboratory(1988))，但并不限于這些方法。蛋白質A柱和蛋白質G柱可用作親和柱。使用的例示性蛋白質A柱包含例如Hyper D，POROS和Sepharose F.F.(Pharmacia)。
除親和層析以外的例示性層析包括例如離子交換層析，疏水層析，凝膠過濾，反相層析，吸附層析等(Strategies for Protein Purification andCharacterizationA Laboratory Course Manual.Ed Daniel R.Marshak et al.，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1996))。層析流程可通過液相層析進行，諸如HPLC和FPLC。
例如，吸光率測量，酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)，酶免疫測定法(EIA)，放射免疫測定法(RIA)和/或免疫熒光技術可用于測量本發(fā)明之抗體的抗原結合活性。在ELISA中，將本發(fā)明之抗體固定在平板上，將本發(fā)明之多肽加到平板中，隨后加入含目標抗體的樣品，諸如產(chǎn)生抗體的細胞的培養(yǎng)物上清液或純化的抗體。然后加入能識別一抗并標記有酶諸如堿性磷酸酶的二抗，并將平板保溫。接著，清洗之后向平板中加入酶底物，諸如對硝基苯磷酸，并測量吸光度以評估樣品的抗原結合活性。多肽片段，諸如C端或N端片段，可用作抗原來評估抗體的結合活性。BIAcore(Pharmacia)可用于評估依照本發(fā)明之抗體的活性。
上述方法使本發(fā)明之多肽的檢測或測量成為可能，即將本發(fā)明之抗體暴露于假設含有本發(fā)明之多肽的樣品，并檢測或測量抗體與多肽所形成的免疫復合物。
由于依照本發(fā)明之多肽的檢測或測量方法能特異地檢測或測量多肽，因此這種方法可用于使用該多肽的許多實驗。
反義多核苷酸，小干擾RNA和核酶本發(fā)明包括能與核苷酸序列SEQ ID NO1或3中任何位點雜交的反義寡核苷酸。這種反義寡核苷酸優(yōu)選針對核苷酸序列SEQ ID NO1或3的至少約15個連續(xù)核苷酸。甚至更優(yōu)選在上述至少15個連續(xù)核苷酸中包含起始密碼子的上述反義寡核苷酸。
反義寡核苷酸的衍生物或修飾產(chǎn)物也可用作反義寡核苷酸。此類修飾產(chǎn)物的例子包括低級烷基磷酸酯修飾諸如磷酸甲酯型或磷酸乙酯型，硫代磷酸酯修飾和磷酰胺酯(phosphoroamidate)修飾。
這里所用術語“反義寡核苷酸”不僅是指與構成DNA或mRNA特定區(qū)域的核苷酸對應的核苷酸完全互補的寡核苷酸，還指有一個或多個核苷酸錯配的寡核苷酸，只要所述DNA或mRNA和反義寡核苷酸能與核苷酸序列SEQ ID NO1或3特異雜交。
本發(fā)明包括此類多核苷酸，即在“至少約15個連續(xù)核苷酸序列區(qū)域”中具有至少70％或更高，優(yōu)選80％或更高，更優(yōu)選約90％或更高，甚至更優(yōu)選約95％或更高同源性的多核苷酸。可使用這里闡述的算法來確定同源性?？墒褂帽绢I域已知的算法來確定同源性。而且，反義寡核苷酸的衍生物或修飾產(chǎn)物在本發(fā)明中也可用作反義寡核苷酸。此類修飾產(chǎn)物的例子包括低級烷基磷酸酯修飾諸如磷酸甲酯型或磷酸乙酯型，硫代磷酸酯修飾和磷酰胺酯修飾。
此類反義多核苷酸可作為探針用于分離或檢測編碼本發(fā)明之多肽的DNA，或是作為引物用于擴增。
本發(fā)明之反義寡核苷酸衍生物作用于產(chǎn)生本發(fā)明之多肽的細胞是通過結合編碼所述多肽的DNA或mRNA，抑制其轉錄或翻譯，促進mRNA的降解，和抑制本發(fā)明之多肽的表達，從而導致所述多肽功能的抑制。
本發(fā)明還包括包含核苷酸序列SEQ ID NO1或3的有義鏈核酸和反義鏈核酸的組合的小干擾RNA(siRNA)。更詳細地說，用于抑制CCDC4表達的此類siRNA包括以核苷酸序列SEQ ID NO8為靶的siRNA。
術語“siRNA”是指能阻止靶mRNA翻譯的雙鏈RNA分子。運用標準技術將siRNA導入細胞，包括以DNA為模板轉錄RNA的細胞。siRNA包含編碼人CCDC4蛋白質的多核苷酸(SEQ ID NO1或3)的有義核酸序列和反義核酸序列。siRNA構建成具有靶基因的有義和互補反義序列的單一轉錄本(雙鏈RNA)，如發(fā)卡結構。
靶細胞中siRNA與對應于CCDC4的轉錄本的結合導致細胞的蛋白質產(chǎn)量下降。寡核苷酸的長度為至少10個核苷酸，也可像天然存在轉錄本一樣長。優(yōu)選寡核苷酸的長度為約19個至約25個核苷酸。更優(yōu)選寡核苷酸的長度少于約75個，約50個，約25個核苷酸。抑制癌細胞生長的CCDC4siRNA寡核苷酸的例子包括含有SEQ ID NO8的靶序列。另外，為了增強siRNA的抑制作用，可在靶序列反義鏈的3′端添加核苷酸“u”。所加核苷酸“u”的數(shù)目至少是約2個，通常是約2個至約10個，優(yōu)選約2個至約5個。所加“u”在siRNA反義鏈的3’端形成單鏈。
將CCDC4 siRNA以能夠與mRNA轉錄本結合的形式直接導入細胞。在這些實施方案中，本發(fā)明之siRNA分子通常按上文關于反義分子所述進行修飾。其它修飾也是可能的，例如綴合有膽固醇的siRNA已證明具有改良的藥理性質(Song et al.，Nature Med.9347-351(2003))。或者，編碼CCDC4 siRNA的DNA在載體中。
載體的構建，例如，通過將CCDC4靶序列克隆到表達載體中，CCDC4序列的側翼都操作連接調控序列，從而允許兩條鏈的表達(通過DNA分子的轉錄)(Lee，N.S.，Dohjima，T.，Bauer，G，Li，M.-J.，Ehsani，A.，Salvaterra，P.，and Rossi，J.(2002)Expression of small interfering RNAs targeted againstHIV-1 rev transcripts in human cells.Nature Biotechnology 20500-505)。CCDC4 mRNA的反義RNA分子由第一個啟動子轉錄(如克隆DNA 3′端的啟動子序列)，而CCDC4 mRNA的有義鏈則由第二個啟動子轉錄(如克隆DNA 5′端的啟動子序列)。有義鏈與反義鏈在體內雜交形成CCDC4基因沉默的siRNA產(chǎn)物。或者，可用兩個構建物產(chǎn)生siRNA構建物的有義鏈和反義鏈?？寺〉腃CDC4可編碼具有二級結構(如發(fā)卡結構)的構建物，其中一個轉錄本同時具有靶基因的有義序列和互補反義序列。
而且，為了形成發(fā)卡環(huán)狀結構，可在有義序列與反義序列之間插入包含任意核苷酸序列的環(huán)狀序列。這樣，本發(fā)明還提供了具有通式5′-[A]-[B]-[A′]-3′的siRNA，其中[A]代表對應于與CCDC4的mRNA或cDNA特異雜交的序列的核糖核苷酸序列。在優(yōu)選的實施方案中，[A]是對應于與SEQ ID NO1或3的核苷酸1666-1684(SEQ ID NO8)的核糖核苷酸序列，[B]是由約3個至約23個核苷酸組成的核糖核苷酸序列，[A’]是由[A]的互補序列組成的核糖核苷酸序列。環(huán)狀序列可由長度優(yōu)選為3個至23個核苷酸的任意序列組成。環(huán)狀序列，例如，可選自下列序列(http://www.ambion.com/techlib/tb/tb_506.html)。在本發(fā)明之siRNA中，可將核苷酸“u”加到[A′]的3′端，以增強siRNA的抑制作用。所加核苷酸“u”的數(shù)目至少是約2個，通常是約2個至約10個，優(yōu)選約2個至約5個。此外，由23個核苷酸組成的環(huán)狀序列也提供有活性的siRNA(Jacque，J.-M.，Triques，K.，and Stevenson，M.(2002)Modulation ofHIV-1 replication by RNA interference.Nature 418435-438)。
CCC，CCACC或CCACACCJacque，J.M.，Triques，K.，and Stevenson，M.“Modulation of HIV-1 replication by RNA interference.”Nature，Vol.418435-438(2002)；UUCGLee，N.S.，Dohjima，T.，Bauer，G，Li，H.，Li，M.-J.，Ehsani，A.，Salvaterra，P，and Rossi，J.(2002)Expression of small interfering RNAs targetedagainst HIV-1 rev transcripts in human cells.Nature Biotechnology 20500-505；Fruscoloni，P.，Zamboni，M.，and Tocchini-Valentini，GP.“Exonucleolyticdegradation of double-stranded RNA by an activity in Xenopus laevis germinalvesicles.”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100(4)1639-1644(2003)；及UUCAAGAGADykxhoorn，D.M.，Novina，C.D.，and Sharp P.A.“Killingthe messengerShort RNAs that silence gene expression.”Nature ReviewsMolecular Cell Biology 4457-467(2002)。
例如，本發(fā)明之具有發(fā)卡結構的優(yōu)選siRNA如下所示。在下面的結構中，環(huán)狀序列可選自CCC，UUCG，CCACC，CCACACC，和UUCAAGAGA。優(yōu)選的環(huán)狀序列是UUCAAGAGA(在DNA中為“ttcaagaga”)。gaugguucugcagcaccac-[B]-guggugcugcagaaccauc(SEQ ID NO8的靶序列)CCDC4序列側翼的調控序列可以是相同的或不同的，這樣可以獨立的，或以時間的或空間的方式調節(jié)它們的表達。通過將CCDC4基因模板克隆到包含如來自小核RNA(snRNA)U6的RNA聚合酶III轉錄單位或人H1 RNA啟動子的載體中，從而在細胞內轉錄siRNA。為了將載體導入細胞，可采用轉染增強劑。FuGENE(Rochediagnostics)，Lipofectamine2000(Invitrogen)，Oligofectamine(Invitrogen)，和Nucleofector(Wako Pure Chenical)是有用的轉染增強劑。
siRNA的核苷酸序列可通過Ambion網(wǎng)站提供的siRNA設計計算機程序來設計(http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html)。siRNA的核苷酸序列是按以下方案由計算機程序挑選的siRNA靶位點的選定1.從目標轉錄本的AUG起始密碼子開始，向下游搜索AA雙核苷酸序列。記錄每個AA的出現(xiàn)及其3′相鄰的19個核苷酸作為可能的siRNA靶位點。Tuschl，et al.Targeted mRNA degradation by double-stranded RNA in vitro.Genes Dev 13(24)3191-7(1999)，不推薦針對5′和3′非翻譯區(qū)(UTR)和起始密碼子鄰近區(qū)域(75個堿基以內)設計siRNA，因為這些區(qū)域可能更加富含調控蛋白結合位點。UTR結合蛋白和/或翻譯起始復合體可能干擾siRNA內切核酸酶復合物的結合。
2.將可能的靶位點與人類基因組數(shù)據(jù)庫進行比較，去除與其它編碼序列具有明顯同源性的任何靶序列。同源性搜索可通過BLAST進行，該程序可在NCBI的服務器上找到www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/。
3.選擇合乎標準的靶序列并合成。在Ambion，優(yōu)選地順著評估基因的全長選擇數(shù)個靶序列。
按照標準方法，在體外對與CCDC4 mRNA各個部分互補的寡核苷酸和寡核苷酸測試它們在腫瘤細胞中降低CCDC4產(chǎn)量的能力(如采用PC3或DU145前列腺癌細胞系)。接觸候選siRNA組合物的細胞中與缺乏候選組合物條件下培養(yǎng)的細胞中相比CCDC4基因產(chǎn)物的減少用CCDC4特異抗體或其它檢測策略來檢測。在基于細胞的或非細胞的體外測定法中能降低CCDC4產(chǎn)量的序列隨后測試其抑制細胞生長的效果。在基于細胞的體外測定法中抑制細胞生長的序列再在大鼠或小鼠中進行體內測試，以驗證在具有惡性贅生物的動物中CCDC4產(chǎn)量的降低和腫瘤細胞生長的降低。
本發(fā)明還包括包含靶序列的核酸序列，例如SEQ ID NO1或3的核苷酸1666-1684(SEQ ID NO8)的雙鏈分子。在本發(fā)明中，該雙鏈分子包含一條有義鏈和一條反義鏈，其中有義鏈包含對應于SEQ ID NO8的核糖核苷酸序列，而反義鏈包含與所述有義鏈互補的核糖核苷酸序列，其中所述有義鏈與所述反義鏈彼此雜交形成所述雙鏈分子，且所述雙鏈分子在導入表達CCDC4基因的細胞后抑制所述基因的表達。在本發(fā)明中，當分離的核酸是RNA或其衍生物時，核苷酸序列中的堿基“t”應用“u”替代。如本文所用術語“互補”是指核酸分子的核苷酸單元之間的Watson-Crick或Hoogsteen堿基配對，而術語“結合”是指兩種核酸或化合物或相關核酸或化合物或其組合之間的物理或化學相互作用。
互補核酸序列在適宜條件下雜交形成含少數(shù)錯配或不含錯配的穩(wěn)定雙鏈體。而且，本發(fā)明之分離核苷酸的有義鏈和反義鏈能通過雜交形成雙鏈核苷酸或發(fā)卡環(huán)狀結構。在一個優(yōu)選的實施方案中，此類雙鏈體每10個配對中包含不多于1個錯配。在一個尤其優(yōu)選的實施方案中，當雙鏈體的兩條鏈完全互補時，此類雙鏈體不含錯配。核酸分子的長度小于8763個核苷酸(對于SEQ ID NO1)或8692個核苷酸(對于SEQ ID NO3)。例如，核酸分子的長度小于500個，200個，或75個核苷酸。本發(fā)明還包括包含這里所描述的一種或多種核酸的載體，及含有這些載體的細胞。本發(fā)明之分離核酸對針對CCDC4的siRNA或編碼該siRNA的DNA是有用的。當核酸用于siRNA或編碼它的DNA時，有義鏈優(yōu)選長于約19個核苷酸，更優(yōu)選長于約21個核苷酸。
本發(fā)明之反義寡核苷酸或siRNA抑制本發(fā)明之多肽的表達，因而可用于抑制本發(fā)明之多肽的生物學活性。而且，包含本發(fā)明之反義寡核苷酸或siRNA的表達抑制劑，由于它們能抑制本發(fā)明之多肽的生物學活性而有用。因此，包含本發(fā)明之反義寡核苷酸或siRNA的組合物可用于治療前列腺癌。抑制哺乳動物細胞中表達的CCDC4 siRNA寡核苷酸的例子包括包含SEQID NO8的靶序列。此外，為了增強siRNA的抑制活性，可在靶序列反義鏈的3′端加上核苷酸“u”。添加“u”的數(shù)目至少是約2個，通常約2個至約10個，優(yōu)選約2個至約5個。所加的“u”在siRNA反義鏈的3′端形成單鏈。
同樣，包含本發(fā)明之反義寡核苷酸或siRNA的表達抑制劑，由于它們能抑制本發(fā)明之多肽的生物學活性而是有用的。因此，包含本發(fā)明之反義寡核苷酸或siRNA的組合物可用于治療細胞增殖性疾病諸如前列腺癌。
而且，本發(fā)明提供了能抑制本發(fā)明之CCDC4多肽表達的核酶。
通常，核酶可分為大核酶和小核酶。大核酶已知是切割核酸磷酸脂鍵的一種酶。經(jīng)與大核酶反應后，反應位點由5′-磷酸和3′-羥基組成。大核酶可進一步分為(1)通過鳥苷酸在5′剪接位點催化酯交換的I組內含子RNA；(2)通過套索結構介導的兩步反應催化自身剪接的II組內含子RNA；和(3)通過水解在5′位點切割tRNA前體的核糖核酸酶P的RNA成分。另一方面，小核酶較之大核酶更小(約40個堿基對)，它切割RNA產(chǎn)生5′-羥基和2′-3′環(huán)磷酸。小核酶包括錘頭型核酶(Koizumi et al.，F(xiàn)EBS LErr 228225(1988))和發(fā)夾型核酶(Buzayan，Nature 323349(1986)；Kikuchi and Sasaki，Nucleic Acid Res 196751(1992))。用于設計和構建核酶的方法是本領域已知的(參見Koizumi et al.，F(xiàn)EBS Lett 228225(1988)；Koizumi et al.，NucleicAcids Res 177059(1989)；Kikuchi and Sasaki，Nucleic Acids Res 196751(1992))。因此，抑制本發(fā)明之多肽表達的核酶也可根據(jù)它們的序列信息(SEQ ID NO1或3)和這些常規(guī)方法構建。
針對CCDC4基因的核酶抑制過度表達的CCDC4蛋白質的表達，因而可用于抑制該蛋白質的生物學活性。因此，這些核酶可用于治療或預防前列腺癌。
診斷前列腺癌另外，本發(fā)明提供了以本發(fā)明之基因的表達水平為診斷標志物的診斷細胞增殖性疾病，諸如前列腺癌的方法。
這一診斷方法包含以下步驟(a)檢測本發(fā)明之CCDC4基因的表達水平；并(b)將所述表達水平的增高與前列腺癌聯(lián)系起來。
生物樣本中CCDC4基因的表達水平可通過測定對應于CCDC4基因的mRNA或由CCDC4基因編碼的蛋白質來評估。mRNA的定量方法為本領域技術人員所知道。例如，對應于CCDC4基因的mRNA水平可通過Northern印跡或RT-PCR來評估估算。由于CCDC4基因的全長核苷酸序列已顯示于SEQ ID NO1或3，任何本領域技術人員都能設計測定CCDC4基因所需探針或引物的核苷酸序列。
CCDC4基因的表達水平還可通過根據(jù)該基因所編碼的蛋白質的活性或數(shù)量來分析。下文描述了用于測定CCDC4蛋白質數(shù)量的方法。例如，免疫測定法可用于測定生物材料中的蛋白質。任何生物材料都可作為測定蛋白質或其活性的生物樣本，只要標志基因(CCDC4基因)在前列腺癌患者的樣本中表達。例如，前列腺管上皮可作為此類生物樣本。另外，體液諸如血液和尿液也可用于分析。另一方面，應根據(jù)待分析蛋白質的活性選擇適當?shù)姆椒y定CCDC4基因所編碼的蛋白質的活性。
估算生物樣本中CCDC4基因的表達水平并與正常樣本(如衍生自未患病受試者的樣本)比較。當此類比較顯示靶基因的表達高于正常樣本時，即判定該受試者患有前列腺癌。來自正常受試者和待診斷受試者的生物樣本中CCDC4基因的表達水平可同時測定?；蛘?，可根據(jù)以往從對照組收集的樣本中基因表達水平的分析結果，用統(tǒng)計學方法確定表達水平的正常范圍。將受試者樣本所獲得的結果與正常范圍相比較；當結果不在正常范圍內時，即判定該受試者患有或有可能發(fā)展成前列腺癌。
本發(fā)明還提供了用于診斷細胞增殖性疾病，諸如前列腺癌的診斷劑。本發(fā)明之診斷劑包含能與本發(fā)明之多核苷酸或多肽結合的化合物。優(yōu)選地，可使用能與本發(fā)明之多核苷酸雜交的寡核苷酸或者能與本發(fā)明之多肽結合的抗體作為此類化合物。
這一診斷前列腺癌的方法可用于評估治療受試者中前列腺癌的效果。根據(jù)該方法，從接受前列腺癌治療的受試者獲取生物樣本，諸如測試細胞群。評估的方法可按照診斷前列腺癌的常規(guī)方法進行。
如果需要，在治療前、治療中或治療后的不同時間點從受試者取得生物樣本。隨后測定生物樣本中CCDC4基因的表達水平，并與衍生自例如參考細胞群，包括前列腺癌狀況已知的細胞(即癌細胞或非癌細胞)的對照水平進行比較。對照水平是在未經(jīng)治療的生物樣本中測定的。
如果對照水平衍生自不含癌細胞的生物樣本，衍生自受試者的生物樣本的表達水平與對照水平之間的相似性表明治療有效。而衍生自受試者的生物樣本中CCDC4基因的表達水平與對照水平之間的差異表明不太有利的臨床效果或預后。
術語“有效”指的是治療導致病理性上調基因(CCDC4基因)的表達降低，或受試者中前列腺癌細胞在尺寸、分布或增殖潛力的下降。在出于預防目的進行治療時，“有效”指的是治療延緩或防止前列腺癌的發(fā)生。對前列腺癌的評估可以是通過標準臨床方案進行的。而且，治療效果的測定可與診斷或治療前列腺癌的任何已知方法聯(lián)系起來。
此外，本發(fā)明之前列腺癌診斷方法還可通過比較衍生自患者的生物樣本諸如測試細胞群中CCDC4基因的表達水平和對照水平，來評估患有前列腺癌的受試者的預后。或者，衍生自患者的生物樣本中CCDC4基因的表達水平可在疾病階段的一定范圍測量以評估患者的預后。
CCDC4基因的表達水平較正常對照的增高表明不太有利的預后。CCDC4基因的表達水平下降表明患者的預后更為有利。
篩選化合物運用CCDC4基因、該基因編碼的蛋白質或該基因的轉錄調控區(qū)，可篩選能改變基因表達或基因編碼的多肽的生物活性的化合物。此類化合物可作為治療或預防前列腺癌的藥物。
因此，本發(fā)明提供了用本發(fā)明之多肽篩選用于治療或預防前列腺癌的化合物的方法。這一篩選方法的實施方案包括以下步驟(a)使測試化合物與本發(fā)明之多肽接觸；(b)檢測本發(fā)明之多肽與測試化合物之間的結合活性；并(c)選擇與本發(fā)明之多肽結合的化合物。
用來進行篩選的本發(fā)明之多肽可以是重組多肽或來源于自然界的蛋白質及其部分肽段。與測試化合物接觸的本發(fā)明之多肽可以是例如純化的多肽、可溶性蛋白質、與載體結合的形式、或與其它多肽融合的融合蛋白。
作為利用本發(fā)明之多肽篩選蛋白質例如與本發(fā)明之多肽結合的蛋白質的方法，可以使用為本領域技術人員所熟知的許多方法。此類篩選可通過例如免疫沉淀法來完成，特別是按以下方式來進行。將編碼本發(fā)明之多肽的基因插入表達外源基因的表達載體中，諸如pSV2neo、pcDNAI、pcDNA3.1、pCAGGS和pCD8，并在宿主(如動物)細胞等中表達該基因。用來表達的啟動子可以是任何常用的啟動子，包括例如SV40早期啟動子(Rigby in Williamson(ed.)，Genetic Engineering，vol.3.Academic Press，London，83-141(1982))，EF-α啟動子(Kim et al.，Gene 91217-23(1990))，CAG啟動子(Niwa et al.，Gene 108193-200 (1991))，RSV LTR啟動子(Cullen，Methods in Enzymology 152684-704(1987))，SRα啟動子(Takebe et al.，MolCell Biol 8466(1988))，CMV立即早期啟動子(Seed and Aruffo，Proc NatlAcad Sci USA 843365-9(1987))，SV40晚期啟動子(Gheysen and Fiers，J MolAppl Genet 1385-94(1982))，腺病毒晚期啟動子(Kaufman et al.，Mol CellBiol 9946(1989))，HSV TK啟動子等。將基因導入宿主細胞以表達外源基因可采用任何方法，例如電穿孔法(Chu et al.，Nucleic Acids Res 151311-26(1987))，磷酸鈣法(Chen and Okayama，Mol Cell Biol 72745-52(1987))，DEAE右旋糖苷法(Lopata et al.，Nucleic Acids Res 125707-17(1984)；Sussman and Milman，Mol Cell Biol 41642-3(1985))，脂轉染法(Derijard，BCell 71025-37(1994)；Lamb et al.，Nature Genetics 522-30(1993)；Rabindranet al.，Science 259230-4(1993))，等等。本發(fā)明之多肽可以以包含單克隆抗體的識別位點(表位)的融合蛋白的形式表達，通過將特異性經(jīng)過驗證的單克隆抗體的表位導入本發(fā)明之多肽的N端或C端?？墒褂檬惺鄣谋砦?抗體系統(tǒng)(Experimental Medicine 1385-90(1995))。能利用其多克隆位點表達與例如β-半乳糖苷酶、麥芽糖結合蛋白、谷胱苷肽-S-轉移酶、綠色熒光蛋白(GFP)等融合的融合蛋白的載體可從商業(yè)途徑購買。
還報道了只導入小表位制備的融合蛋白，所述小表位由幾個至十幾個氨基酸組成，因而不會在融合后改變本發(fā)明之多肽的特性。可使用諸如多組氨酸(His標簽)，流感聚集物HA，人c-myc，F(xiàn)LAG，水泡性口炎病毒糖蛋白(VSV-GP)，T7基因10蛋白(T7標簽)，人類單純泡疹病毒糖蛋白(HSV標簽)，E標簽(單克隆噬菌體上的一種表位)等表位及識別它們的單克隆抗體作為表位-抗體系統(tǒng)用于篩選與本發(fā)明之多肽結合的蛋白質(Experimental Medicine 1385-90(1995))。
在免疫沉淀中，通過向使用適當去污劑制備的細胞裂解物中加入這些抗體形成免疫復合物。免疫復合物由本發(fā)明之多肽，具有與該多肽結合的能力的多肽，及抗體組成。除了可如上所述所制備的針對以上表位的抗體以外，免疫沉淀也可用針對本發(fā)明之多肽的抗體來進行。
當抗體是小鼠IgG抗體時，例如可使用蛋白質A sepharose或蛋白質Gsepharose沉淀免疫復合物。如果本發(fā)明之多肽是以具有表位諸如GST的融合蛋白的形式制備的，可以與采用針對本發(fā)明之多肽的抗體相同的方法形成免疫復合物，使用能與該表位特異結合的物質，諸如谷胱苷肽-Sepharose4B。
免疫沉淀可以遵循或依據(jù)例如文獻(Harlow and Lane，Antibodies，511-52，Cold Spring Laboratory publication，New York(1988))中的方法來進行。
SDS-PAGE常用于分析免疫沉淀的蛋白質，且可使用適當濃度的凝膠對所結合的蛋白質分析分子量。因為用常規(guī)的染色方法，諸如考馬斯染色或銀染難以檢測本發(fā)明之多肽所結合的蛋白質，可通過在含有放射性同位素(35S-甲硫氨酸或35S-半胱氨酸)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞，標記細胞中的蛋白質并檢測蛋白質，從而提高檢測該蛋白質的靈敏度。在揭示了蛋白質的分子量后，可以從SDS-聚丙烯酰胺凝膠中直接純化靶蛋白質并測定其序列。
作為使用多肽篩選與本發(fā)明之多肽結合的蛋白質的方法，可用例如West-Western印跡分析法(Skolnik et al.，Cell 6583-90(1991))。尤其可通過以下方法得到與本發(fā)明之多肽結合的蛋白質，利用噬菌體載體(如ZAP)由期望表達與本發(fā)明之多肽結合的蛋白質的細胞、組織、器官(例如諸如睪丸和前列腺之組織)、或培養(yǎng)細胞(如PC3，DUl45)制備cDNA文庫，在LB-瓊脂糖上表達蛋白質，將表達的蛋白質固定在濾膜上，使經(jīng)純化和標記的本發(fā)明之多肽與上述濾膜反應，并通過標記物檢測表達本發(fā)明之多肽所結合的蛋白質的噬菌斑?？梢岳蒙锼睾陀H合素之間的結合來標記本發(fā)明之多肽，或是利用能特異結合本發(fā)明之多肽的抗體，或是與本發(fā)明之多肽融合的肽或多肽(例如GST)。也可使用利用放射性同位素或熒光等等的方法。
或者，在本發(fā)明之篩選方法的另一個實施方案中，可以使用基于細胞的雙雜交系統(tǒng)(“MATCHMAKER雙雜交系統(tǒng)”，“哺乳動物MATCHMARKER雙雜交測定試劑盒”、“MATCHMAKER單雜交系統(tǒng)”(Clontech)；“HybriZAP雙雜交載體系統(tǒng)”(Stratagene)；參考文獻“Daltonand Treisman，Cell 68597-612(1992)”，“Fields and Sternglanz，Trends Genet10286-92(1994)”)。
在雙雜交系統(tǒng)中，將本發(fā)明之多肽與SRF結合區(qū)或GAL4結合區(qū)融合并在酵母細胞中表達。由期望表達能與本發(fā)明之多肽結合的蛋白質的細胞制備cDNA文庫，使得該文庫在表達時，與VP16或GAL4的轉錄激活區(qū)融合。然后將cDNA文庫導入上述酵母細胞，并從檢測到的陽性克隆分離由文庫衍生的cDNA(當?shù)鞍踪|與酵母細胞中表達的本發(fā)明之多肽結合時，兩者的結合激活報道基因，使得陽性克隆能夠被檢測到)。通過將如上分離的cDNA導入大腸桿菌并表達蛋白質來制備由該cDNA編碼的蛋白質。
作為報道基因，除HIS3基因外，可以使用例如Ade2基因、lacZ基因、CAT基因、螢光素酶基因等。
也可利用親和層析來篩選與本發(fā)明之多肽結合的化合物。例如，可將本發(fā)明之多肽固定在親和柱的載體上，并將含有能與本發(fā)明之多肽結合的蛋白質的測試化合物加載到柱子上。這里的測試化合物可以是例如細胞提取物、細胞裂解物等。在加載測試化合物后，洗柱，并制備與本發(fā)明之多肽結合的化合物。
當測試化合物是蛋白質時，分析得到的蛋白質的氨基酸序列，據(jù)此序列合成寡DNA，并以該寡DNA為探針篩選cDNA文庫，從而得到編碼該蛋白質的DNA。
在本發(fā)明中，可以基于表面激元共振現(xiàn)象的生物傳感器作為手段來檢測或測量所結合的化合物。在使用此類生物傳感器時，只使用少量未標記的多肽就能通過表面激元共振信號實時觀察本發(fā)明之多肽與測試化合物之間的相互作用(例如BIAcore，Pharmacia)。因此，有可能利用生物傳感器諸如BIAcore來評價本發(fā)明之多肽與測試化合物之間的結合。
用于篩選將固定好的本發(fā)明之多肽暴露于合成的化學化合物、天然物質庫或隨機噬菌體肽展示庫后發(fā)生結合的分子的方法，及基于組合化學技術的高通量篩選方法(Wrighton et al.，Science 273458-64(1996)；Verdine，Nature 38411-13(1996)；Hogan，Nature 38417-9(1996))，不僅用于分離與本發(fā)明之蛋白質結合的蛋白質，還有化學化合物(包括激動劑和拮抗劑)，是本領域技術人員所熟知。
另外，本發(fā)明提供了利用本發(fā)明之多肽來篩選用于治療或預防前列腺癌的化合物的方法，包括以下步驟(a)使測試化合物與本發(fā)明之多肽接觸；(b)檢測步驟(a)中多肽的生物學活性；并(c)選擇與所述測試化合物缺失情況下檢測到的生物學活性相比能抑制所述多肽生物學活性的化合物。
因為本發(fā)明之CCDC4蛋白質具有促進前列腺癌細胞的細胞增殖的活性，可以這一活性為指標，篩選能抑制本發(fā)明這種蛋白質的活性的化合物。
具有CCDC4蛋白質的活性的任何多肽均可用于篩選。此類生物學活性包括人類CCDC4蛋白質的細胞增殖活性。例如，可使用人類CCDC4蛋白質及在功能上與這些蛋白質等同的多肽。此類多肽可以由細胞內源性或外源性表達。
通過這種篩選分離的化合物即為本發(fā)明之多肽的激動劑或拮抗劑。術語“促效劑”指的是通過結合本發(fā)明之多肽來激活其功能的分子。類似的，術語“拮抗劑”指的是通過結合本發(fā)明之多肽來抑制其功能的分子。再者，通過這種篩選分離的化合物即為能在體內抑制本發(fā)明之多肽與分子(包括DNA和蛋白質)之間相互作用的候選化合物。
當本方法中檢測的生物學活性是細胞增殖時，可以例如如下檢測，制備表達本發(fā)明之多肽的細胞，在測試化合物存在的情況下培養(yǎng)細胞，并如實施例中所述測定細胞增殖的速度，測量細胞周期等，及測量集落形成活性。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了篩選用于治療或預防前列腺癌的化合物的方法。如以上詳細討論的一樣，通過控制CCDC4的表達水平，可以控制前列腺癌的發(fā)生和發(fā)展。這樣，可通過利用CCDC4的表達水平作為指標的篩選方法來鑒定可用于治療或預防前列腺癌的化合物。在本發(fā)明的內容中，此類篩選可包括例如以下步驟a)使表達CCDC4的細胞與測試化合物接觸；并b)選擇與測試化合物缺失的情況下的表達水平相比能降低CCDC4表達水平的化合物。
表達至少一種CCDC4的細胞包括例如由前列腺癌建立的細胞系；這些細胞可用于本發(fā)明的上述篩選方法(如PC3，DU145)。表達水平可通過本領域技術人員熟知的方法來評估。在篩選方法中，可選擇能降低CCDC4表達水平的化合物作為用于治療或預防前列腺癌的候選藥物。
或者，本發(fā)明的篩選方法可包括以下步驟a)使測試化合物與導入了下述載體的細胞接觸，所述載體包含一種或多種標志基因的轉錄調控區(qū)及在該轉錄調控區(qū)控制下表達的報道基因，其中所說的一種或多種標志基因是CCDC4，b)測量所說報道基因的表達水平；并c)選擇與對照相比能降低所說報道基因表達水平或活性的化合物。
合適的報道基因和宿主細胞為本領域所熟知。篩選所需的報道基因構建物可以用標志基因的轉錄調控區(qū)來構建。當標志基因的轉錄調控區(qū)為本領域技術人員所知時，可以用已知的序列信息來構建報道基因構建物。當標志基因的轉錄調控區(qū)尚未鑒定時，可以依據(jù)標志基因的核苷酸序列信息從基因組文庫中分離含轉錄調控區(qū)的核苷酸區(qū)段。
可用于結合蛋白質的支持物的例子包括不溶性多糖，諸如瓊脂糖、纖維素和右旋糖苷；合成樹脂，諸如聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、和硅；優(yōu)選使用由以上材料制備的市售珠子和平板(如多孔板、生物傳感器芯片等)。在使用珠子時，可將它們填到柱子中。
蛋白質與支持物的結合可按常規(guī)方法進行，諸如化學鍵合和物理吸附?；蛘?，可通過特異識別蛋白質的抗體將該蛋白質結合到支持物上。再者，蛋白質與支持物的結合還可通過生物素和親合素的手段來進行。
只要緩沖液不抑制蛋白質之間的結合，蛋白質之間的結合可以在緩沖液中進行，例如但不限于磷酸鹽緩沖液和Tris緩沖液。
在本發(fā)明中，基于表面激元共振現(xiàn)象的生物傳感器可用作檢測或測量所結合蛋白質的方法。在使用此類生物傳感器時，只使用少量未標記的多肽，就可通過表面激元共振信號實時觀察蛋白質之間的相互作用(例如BIAcore，Pharmacia)。
或者，CCDC4多肽可進行標記，而所結合蛋白質的標記物可用于檢測或測量所結合的蛋白質。具體而言，在預先標記一種蛋白質后，在測試化合物存在的情況下將已標記蛋白質與其它蛋白質接觸，然后在清洗后根據(jù)標記物檢測或測量所結合的蛋白質。
標記物質諸如放射性同位素(如3H，14C，32P，33P，35S，125I，131I)，酶(如堿性磷酸酶，辣根過氧化物酶，β-半乳糖苷酶，β-葡萄糖苷酶)，熒光物質(如異硫氰酸熒光素(FITC)，羅丹明)，及生物素和親合素，可用來標記本方法之蛋白質。在用放射性同位素標記蛋白質時，可通過液閃來進行檢測或測量。或者，用酶標記的蛋白質的檢測或測量可通過加入該酶的底物并檢測底物在酶促條件下的變化來進行，諸如用吸收比色計檢測顏色的產(chǎn)生。再者，在使用熒光物質作為標記物時，可用熒光光度計檢測或測量所結合的蛋白質。
在使用抗體進行本篩選時，抗體優(yōu)選用上述標記物之一進行標記，并根據(jù)標記物質進行檢測或測量。或者，針對CCDC4多肽或肌動蛋白的抗體可作為一抗，利用用標記物質標記的二抗進行檢測。再者，可以利用蛋白質G或蛋白質A柱檢測或測量在本發(fā)明之篩選中與蛋白質結合的抗體。
或者，在本發(fā)明篩選方法的另一個實施方案中，可以使用基于細胞的雙雜交系統(tǒng)(“MATCHMAKER雙雜交系統(tǒng)”，“哺乳動物MATCHMARKER雙雜交測定試劑盒”，“MATCHMAKER單雜交系統(tǒng)”(Clontech)；“HybriZAP雙雜交載體系統(tǒng)”(Stratagene)；參考文獻“Dalton and Treisman，Cell 68597-612(1992)”，“Fields and Sternglanz，Trends Genet 10286-92(1994)”)。
在雙雜交系統(tǒng)中，將本發(fā)明之CCDC4多肽與SRF結合區(qū)或GAL4結合區(qū)融合，并在酵母細胞中表達。
作為報道基因，除HIS3基因外，可使用例如Ade2基因、lacZ基因、CAT基因、螢光素酶基因等。
任何測試化合物，例如細胞提取物，細胞培養(yǎng)物上清液，發(fā)酵微生物產(chǎn)物，海洋生物提取物，植物提取物，純化的或粗制的蛋白質，肽，非肽化合物，合成微分子(micromolecular)化合物，及天然化合物均可用于本發(fā)明之篩選方法。本發(fā)明之測試化合物也可利用本領域所知的多種組合文庫方法中的任何一種來得到，包括(1)生物文庫，(2)空間可尋址的平行固相或液相文庫，(3)需要解卷積(deconvolution)的合成文庫法，(4)“一珠一化合物”文庫法，和(5)利用親和層析選擇的合成文庫法。利用親和層析選擇的生物文庫法僅限于肽庫，而其它四種方法可用于肽，非肽寡聚物，或小分子化合物文庫(Lam(1997)Anticancer Drug Des.12145)。在本領域中可以找到合成小分子文庫的方法的例子(DeWitt et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 906909；Erb et al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9111422；Zuckermann et al.(1994)J.Med.Chem.372678；Cho et al.(1993)Science 2611303；Carell et al.(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.332059；Carell et al.(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.332061；Gallop et al.(1994)J.Med.Chem.371233)?；衔镂膸炜梢源嬖谟谌芤褐?參見Houghten(1992)Bio/Techniques 13412)，或是在珠子上(Lam(1991)Nature 35482)，芯片上(Fodor(1993) Nature 364555)，細菌上(US Pat.No.5,223,409)，孢子上(US Pat.No.5,571,698；5,403,484；和5,223,409)，質粒上(Cull et al.(1992)Proc.Natl.Acac.Sci.USA 891865)，或噬菌體上(Scott and Smith (1990)Science 249386；Delvin(1990)science 249404；Cwirla et al.(1990)Proc.Natl.Acac.Sci.USA 876378；Felici(1991)J.Mol.Biol.222301；US Pat.Application 2002103360)。
通過本發(fā)明之篩選方法分離的化合物是能抑制本發(fā)明之多肽活性的候選藥物，用于治療或預防例如由細胞增殖疾病而導致的疾病，諸如前列腺癌。通過本發(fā)明之篩選方法得到的化合物包括對通過本發(fā)明之本篩選方法得到的，其中部分結構通過添加、刪除和/或替換而進行轉變的化合物。
用于治療或預防前列腺癌的藥物組合物本發(fā)明提供了用于治療或預防前列腺癌的組合物，其中包含通過本發(fā)明之篩選方法選出的任何化合物。
在將通過本發(fā)明之篩選方法分離的化合物作為藥物施用于人或其它哺乳動物諸如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、貓、犬、綿羊、豬、牛、猴、狒狒、黑猩猩以治療細胞增殖性疾病(如前列腺癌)時，分離的化合物可直接施用或者可利用已知的藥物制備方法配制成劑量形式。例如，根據(jù)需要，藥物可以口服，制成糖衣片、膠囊、酏劑和微膠囊；或非口服，注射水或任何其它制藥學可接受液體的無菌溶劑或懸浮液的形式。例如，化合物可與制藥學可接受載體或介質混合成普遍可接受的藥物執(zhí)行中的單位劑量形式，具體有滅菌水，生理鹽水，植物油，乳化劑，懸浮劑，表面活性劑，穩(wěn)定劑，芳香劑，賦形劑，媒介劑，防腐劑，粘結劑等。這些制劑中活性成分的數(shù)量處于所示所需范圍內的合適劑量。
可制成片劑或膠囊所用添加劑的例子是，粘結劑諸如明膠，玉米淀粉，黃蓍膠和阿拉伯膠；賦形劑諸如結晶纖維素；膨脹劑諸如玉米淀粉，明膠和褐藻酸；潤滑劑諸如硬脂酸鎂；甜味劑諸如蔗糖，乳糖或糖精；芳香劑諸如胡椒薄荷，玉山白株樹(Gaultheria adenothrix)油和櫻桃。當單位劑量形式為微膠囊時，上述成分中還可包括液相載體，諸如油。注射用無菌組合物(composite)可遵循常規(guī)的藥物執(zhí)行用媒介劑諸如注射用蒸餾水配制。
生理鹽水，葡萄糖，和其它等滲液體包括佐劑，諸如D-山梨糖醇，D-甘露糖，D-甘露醇和氯化鈉，可用作注射用水溶液。這些可以與適當?shù)脑鋈軇┙Y合使用，諸如醇類，具體如乙醇，多元醇類諸如丙二醇和聚乙二醇，非離子表面活性劑諸如聚山梨醇酯80(TM)和HCO-50。
芝麻油或大豆油可用作油性液體，并可與作為增溶劑的苯甲酸芐酯，苯甲醇結合使用，且可與緩沖液諸如磷酸鹽緩沖液，乙酸納緩沖液；止痛劑，諸如鹽酸普魯卡因；穩(wěn)定劑，諸如苯甲醇，酚；和抗氧化劑一起配制。制備的注射液可裝入合適的安瓿中。
可使用本領域技術人員熟知的方法將本發(fā)明的藥用化合物施用于患者，例如動脈內，靜脈內，經(jīng)皮注射，以及鼻內，經(jīng)支氣管，肌肉內或口服施用。劑量和施用方法根據(jù)患者的體重和年齡及施用方法而變化；而本領域技術人員可按常規(guī)進行選擇。如果所說的化合物可由DNA編碼的話，可將該DNA插入用于基因療法的載體并施用該載體以進行治療。劑量和施用方法因患者的體重、年齡、和癥狀而異，但可由本領域技術人員進行適當?shù)倪x擇。
例如，雖然根據(jù)癥狀會有所差異，當口服施用于普通成人(體重60公斤)時，與本發(fā)明之多肽結合并調節(jié)其活性的化合物的劑量為每天約0.1毫克至約100毫克，優(yōu)選每天約1.0毫克至約50毫克，而更優(yōu)選每天約1.0毫克至約20毫克。
當以注射形式腸胃外施用于普通成人(體重60公斤)時，雖然根據(jù)患者、靶器官、癥狀和施用方法而有所差別，方便的是每天靜脈內注射約0.01毫克至約30毫克的劑量，優(yōu)選每天約0.1至約20毫克，更優(yōu)選每天約0.1至約10毫克。同樣，在其它動物的情況中也是如此，有可能施用轉變成60公斤體重的數(shù)量。
再者，本發(fā)明提供了用于治療或預防前列腺癌的藥用組合物，它包含能抑制CCDC4基因表達的活性成分。此類活性成分包括針對CCDC4基因的反義多核苷酸、siRNA或核酶或其衍生物，諸如反義多核苷酸、siRNA或核酶的表達載體。
這些活性成分可與對衍生物不具活性的適當基礎物質混合制成外用制劑，諸如搽劑和敷劑。同樣，如果需要，它們也可通過添加賦形劑、等滲劑、增溶劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、止痛劑等配制成片劑、粉劑、顆粒、膠囊、脂質體膠囊、注射劑、溶液、滴鼻劑和凍干劑。這些可通過常規(guī)方法制備。
活性成分可以直接施用于患處或注射到血管中使其到達患處而給予患者。還可用封固介質來提高持久性和膜通透性。封固介質的例子包括脂質體、多L-賴氨酸、脂質、膽固醇、脂轉染試劑或其衍生物。
本發(fā)明這些組合物的劑量可根據(jù)患者的狀況進行適當?shù)恼{整，以期望的數(shù)量使用。例如，可施用每公斤體重0.1至100毫克，優(yōu)選每公斤體重0.1至50毫克的劑量范圍。
本發(fā)明的另一個實施方案是用于治療或預防前列腺癌的組合物，它包含針對CCDC4基因編碼的蛋白質的抗體或該抗體之結合該蛋白質的片段。
雖然根據(jù)癥狀會有所不同，當口服施用于普通成人(體重60公斤)時，用于治療或預防前列腺癌的抗體或其片段的劑量是每天約0.1毫克至約100毫克，優(yōu)選每天約1.0毫克至約50毫克，更優(yōu)選每天約1.0毫克至約20毫克。
當以注射形式腸胃外施用于普通成人(體重60公斤)時，雖然根據(jù)患者的狀況、疾病的癥狀和施用方法有所差別，方便的是每天靜脈內注射約0.01毫克至約30毫克，優(yōu)選每天約0.1至約20毫克，更優(yōu)選每天約0.1至約10毫克的劑量。同樣，在其它動物的情況中也是如此，有可能施用轉變成60公斤體重的數(shù)量。
用于治療或預防前列腺癌的方法本發(fā)明提供了用于在受試者中治療或預防前列腺癌的方法。為了預防或治療目的將治療性化合物施用于患有或有風險(或易于)發(fā)展成前列腺癌的受試者。此類受試者是通過標準臨床方法或通過檢測CCDC4的異常表達水平或活性得到鑒定的。預防性施用發(fā)生在疾病的明顯臨床癥狀出現(xiàn)以前，從而預防疾病或紊亂，或延緩其進程。
治療性方法包括降低CCDC4基因的表達或功能。在這些方法中，受試者接受有效量化合物的治療，以降低受試者中過度表達的基因(CCDC4基因)。施藥可以是全身的或局部的。治療性化合物包括能降低在前列腺癌細胞中內源性存在的此類基因的表達水平的化合物(即下調過度表達基因的表達的化合物)。施用此類治療性化合物抵消受試者細胞中異常過度表達基因的效果，并期望能改善受試者的臨床狀況。此類化合物可通過上文所述本發(fā)明之篩選方法得到。
CCDC4基因的表達還可通過本領域已知的數(shù)種方式進行抑制，包括對受試者施用能抑制或拮抗基因表達的核酸。能破壞基因表達的反義寡核苷酸、小干擾RNA或核酶可用于抑制基因的表達。
如前所述，對應于CCDC4基因核酸序列的反義寡核苷酸可用于降低CCDC4基因的表達水平。具體地，本發(fā)明之反義寡核苷酸可通過結合CCDC4基因編碼的任何多肽或與其對應的mRNA，從而抑制基因的轉錄或翻譯，促進mRNA的降解，和/或抑制由基因編碼的蛋白質的表達，及最終抑制CCDC4蛋白質的功能來起作用。
通過與對衍生物無活性的適當基礎材料混合，反義寡核苷酸及其衍生物可制成外用制劑，諸如搽劑或敷劑，用于本發(fā)明中治療或預防前列腺癌的方法。
抑制過度表達基因的一種或多種基因產(chǎn)物的核酸還包括小干擾RNA(siRNA)，它包含編碼CCDC4基因的核苷酸序列的有義鏈核酸和反義鏈核酸的組合體。將siRNA導入細胞的標準技術可用于本發(fā)明中的治療和預防，包括以DNA為模板轉錄得到RNA的方法。siRNA構建成包含來自靶基因的有義序列和互補反義序列的單一轉錄本，如發(fā)夾結構。
本方法用于抑制CCDC4基因表達上調的細胞中的基因表達。siRNA與靶細胞中CCDC4基因轉錄本的結合導致該細胞中CCDC4蛋白質產(chǎn)量下降。
抑制過度表達基因的一種或多種基因產(chǎn)物的核酸還包括針對過度表達基因(CCDC4基因)的核酶。
此外，本發(fā)明提供了使用針對本發(fā)明之多肽的抗體來治療或預防細胞增殖性疾病，諸如前列腺癌的方法。依據(jù)此方法，施用制藥學有效量的針對本發(fā)明之多肽的抗體。因為CCDC4蛋白質的表達在前列腺癌細胞中上調，并且抑制這些蛋白質的表達會導致細胞增殖活性降低，預期可通過抗體與這些蛋白質的結合來治療或預防細胞增殖性疾病。這樣，以足以降低本發(fā)明之多肽的活性的劑量施用針對本發(fā)明之多肽的抗體，其范圍是每天0.1至約250毫克/公斤體重。成人的劑量范圍通常為每天約5毫克至約17.5克，優(yōu)選每天約5毫克至約10克，最優(yōu)選每天約100毫克至約3克。
或者，使用能與腫瘤細胞特異的細胞表面標記物結合的抗體作為藥物投遞的工具。例如，以足以傷害腫瘤細胞的劑量與胞毒劑偶聯(lián)的抗體。
本發(fā)明還涉及誘導抗腫瘤免疫的方法，包括的步驟有施用CCDC4蛋白質或其免疫學活性片段，或者編碼該蛋白質或其片段的多核苷酸。因而CCDC4蛋白質或其免疫學活性片段可用作針對細胞增殖性疾病諸如前列腺癌的疫苗。在有些情況中，蛋白質或其片段可以與T細胞受體(TCR)結合或由抗原呈遞細胞(APC)諸如巨噬細胞、樹突狀細胞(DC)、或B細胞呈遞的形式施用。鑒于樹突狀細胞的強抗原呈遞能力，樹突狀細胞是最優(yōu)選使用的抗原呈遞細胞。
在本發(fā)明中，針對細胞增殖性疾病的疫苗是指具有在接種動物后誘導抗腫瘤免疫的功能的物質。一般來說，抗腫瘤免疫包括諸如以下之免疫反應-誘導針對腫瘤的細胞毒性淋巴細胞，-誘導識別腫瘤的抗體，和-誘導抗腫瘤細胞因子產(chǎn)生。
因而，當某種蛋白質在接種動物后誘導這些免疫反應中的任何一種時，就認為該蛋白質具有誘導抗腫瘤免疫反應的效果。通過在體內或在體外觀察宿主中免疫系統(tǒng)針對該蛋白質的反應就能檢測由蛋白質對抗腫瘤免疫的誘導。
例如，用來檢測細胞毒性T淋巴細胞誘導的方法是眾所周知的。進入活體的外源物質通過抗原呈遞細胞(APC)的作用呈遞給T細胞或B細胞。由于抗原的刺激，T細胞對由抗原呈遞細胞呈遞的抗原發(fā)生反應，以抗原特異的方式分化成細胞毒性T細胞(或細胞毒性T淋巴細胞，CTL)，并隨后擴增(這個過程稱為T細胞活化)。于是，將肽經(jīng)抗原呈遞細胞呈遞給T細胞并檢測CTL的誘導就可對該肽的CTL誘導進行評價。更進一步，抗原呈遞細胞還有激活CD4+T細胞、CD8+T細胞、巨噬細胞、噬曙紅細胞和NK細胞的作用。因為CD4+T細胞和CD8+T細胞在抗腫瘤免疫中也是重要的，肽對抗腫瘤免疫的誘導作用也可用這些細胞的激活作用作為指標來評價。
本領域眾所周知利用樹突狀細胞(DC)作為APC來評價CTL的誘導作用的方法。DC是在APC中具有最強CTL誘導作用的代表性APC。在這種方法中，首先使測試多肽與DC接觸，然后使該DC接觸T細胞。在接觸DC后檢測到T細胞具有針對目的細胞的細胞毒性效應就說明所述測試多肽具有誘導細胞毒性T細胞的活性。針對腫瘤的CTL活性可使用例如51Cr標記的腫瘤細胞的裂解作為指標來檢測?；蛘撸褂?H-胸苷攝入活性或LHD(乳糖脫氫酶)釋放作為指標來評估腫瘤細胞損傷程度的方法也是眾所周知的。
除DC以外，外周血單核細胞(PBMC)也可用作抗原呈遞細胞。據(jù)報道，CTL的誘導可通過在GM-CSF和IL-4存在的情況下培養(yǎng)PBMC而加強。類似的，已證明CTL通過在匙孔血藍蛋白(KLH)和IL-7存在的情況下培養(yǎng)PBMC而誘導。
經(jīng)這些方法證實具有CTL誘導活性的測試多肽即具有DC激活效果及后續(xù)CTL誘導活性的多肽。因此，能誘導針對腫瘤細胞的CTL的多肽可用作針對腫瘤的疫苗。此外，通過與多肽接觸而獲得誘導針對腫瘤的CTL能力的APC可用作針對腫瘤的疫苗。再者，由于APC呈遞的多肽抗原而獲得細胞毒性的CTL也可用作針對腫瘤的疫苗。利用源于APC和CTL的抗腫瘤免疫的此類腫瘤治療方法稱為細胞免疫療法。
通常，在將多肽用于細胞免疫療法時，已知聯(lián)合多種結構不同的多肽并使它們與DC接觸能加強CTL誘導的效率。所以，在用蛋白質片段刺激DC時，使用多種類型片段的混合物是有利的。
或者，可以通過觀察針對腫瘤的抗體生成的誘導來證實多肽對抗腫瘤免疫的誘導。例如，在經(jīng)多肽免疫的實驗動物中誘導產(chǎn)生針對該多肽的抗體時，及腫瘤細胞的生長受到那些抗體的抑制時，就確定該多肽具有誘導抗腫瘤免疫的能力。
施用本發(fā)明之疫苗能誘導抗腫瘤免疫，而抗腫瘤免疫的誘導能治療或預防細胞增殖性疾病，諸如前列腺癌。針對癌癥的療法或癌癥發(fā)生的預防包括任何步驟，諸如抑制癌細胞的生長，腫瘤的消退及抑制癌癥的發(fā)生。治療或預防癌癥的效果還包括降低癌癥患者的死亡率，降低血液中的腫瘤標志物，減輕癌癥伴隨的可檢測癥狀等等。此類治療和預防效果優(yōu)選具有統(tǒng)計學顯著性。例如，與沒有施用疫苗的對照相比，觀察到針對細胞增殖性疾病的疫苗的治療或預防效果的顯著性水平為5％或更低。例如，Student氏t檢驗，Mann-Whitney U檢驗或ANOVA均可用于統(tǒng)計學分析。
上述具有免疫學活性的蛋白質或編碼該蛋白質的載體可與佐劑聯(lián)合。佐劑指的是在與具有免疫學活性的蛋白質一起(或相繼)施用時能增強針對該蛋白質的免疫反應的化合物。佐劑的例子包括但不限于霍亂毒素、沙門氏菌毒素、明礬等。另外，本發(fā)明之疫苗可適當聯(lián)合制藥學可接受載體。此類載體包括滅菌水、生理鹽水、磷酸鹽緩沖液、培養(yǎng)液等。另外，如果需要，疫苗可含有穩(wěn)定劑、懸浮液、防腐劑、表面活性劑等。疫苗可系統(tǒng)或局部施用。疫苗施用可通過單次施用來進行，或通過多次施用來增強。
在以APC或CTL作為本發(fā)明之疫苗時，可通過例如回體(ex vivo)方法來治療或預防腫瘤。更具體地，收集接受治療或預防處理的受試者的PBMC，使這些細胞以回體方式與多肽接觸，并在誘導APC或TCL后，可將這些細胞施用于受試者。還可在體外通過將編碼多肽的載體導入PBMC來誘導APC?？稍谑┯们翱寺≡隗w外誘導的APC或TCL。通過克隆和培養(yǎng)對靶細胞具有高殺傷活性的細胞，能增強細胞免疫療法的效果。而且，以這種方式分離的APC和CTL可用于細胞免疫療法，不僅針對細胞來源的個體，而且針對來自不同個體的相似類型腫瘤。
再者，本發(fā)明提供了用于治療或預防細胞增殖性疾病諸如前列腺癌的藥用組合物，它包含制藥學有效量的CCDC4多肽。該藥用組合物可用來引發(fā)抗腫瘤免疫。CCDC4的正常表達局限于睪丸和前列腺。所以，抑制這種基因的表達可能不會對其它器官起負面作用。這樣，CCDC4多肽優(yōu)選用于治療細胞增殖性疾病，尤其是前列腺癌。另外，因為已表明在癌細胞中特異表達的蛋白質的肽片段能誘導針對癌的免疫反應，所以CCDC4的肽片段也可用在用于治療或預防細胞增殖性疾病諸如前列腺癌的藥用組合物。在本發(fā)明中，多肽或其片段以足以誘導抗腫瘤免疫的劑量施用，所述劑量在0.1毫克至10毫克，優(yōu)選0.3毫克至5毫克，更優(yōu)選0.8毫克至1.5毫克的范圍內?？芍貜褪┯谩＠?，1mg的肽或其片段可每兩周施用4次以誘導抗腫瘤免疫。
另外，編碼CCDC4或其片段的多核苷酸可用于引發(fā)抗腫瘤免疫。此類多核苷酸可摻入表達載體中從而在待治療的受試者中表達CCDC4或其片段。這樣，本發(fā)明涵蓋誘導抗腫瘤免疫的方法，其中將編碼CCDC4或其片段的多核苷酸施用于患有或有風險發(fā)展成細胞增殖性疾病諸如前列腺癌的受試者。
提供下面的實施例是用來說明本發(fā)明并幫助本領域普通技術人員制造和使用本發(fā)明。這些實施例不應以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
除非另外定義，這里使用的所有技術和科學術語具有本發(fā)明所屬領域普通技術人員的通常理解相同的含義。雖然與這里所描述的方法和材料相同或等同的方法和材料可用來實施或測試本發(fā)明，下文描述了合適的方法和材料。收錄這里引用的任何專利、專利申請和出版物作為參考。
實現(xiàn)本發(fā)明的最優(yōu)模式下面的實施例詳細例示了本發(fā)明，但本發(fā)明不限于這些實施例。
(1)cDNA微陣和激光微光束顯微切割cDNA微陣玻片的制造已有描述(Ono et al.，Cancer Res，605007-5011，2000)。為了降低實驗波動，本發(fā)明人為每一個表達譜的分析準備了兩套一樣的cDNA微陣玻片，各包含23,040個cDNA點。簡而言之，對20個前列腺癌組織進行激光微光束顯微切割，得到前列腺癌細胞、PIN細胞和正常前列腺管上皮細胞并純化總RNA。進行基于T7的RNA擴增以得到足夠的RNA進行微陣實驗。將從前列腺癌細胞和正常導管上皮細胞擴增得到的一份RNA通過逆轉錄分別用Cy5-dCTP和Cy3-dCTP進行標記(AmershamBiosciences，Buckinghamshire，UK)。如前所述進行雜交、清洗和檢測(Ono etal.，2000)。
(2)新基因CCDC4的鑒定(含卷曲螺旋結構域4，coiled-coil domaincontaining 4)根據(jù)我們的全基因組cDNA微陣，本發(fā)明人鑒定了一個上調的點，內部編號(housing name)為B3537，它代表一個EST(人類cDNA FLJ35632)。綜合其它EST信息及由前列腺癌cDNA的RACE得到的序列，我們鑒跫了一個新基因CCDC4。
(3)Northern印跡分析將人多組織Northern印跡(Clontech，Palo Alto，CA)與[α-32P]dCTP標記的B3537 PCR產(chǎn)物進行雜交。利用引物(5′-GTGACAAATCCATTGATCCTGA-3′，SEQ ID NO5和5′-GAACACGTGGCATTCTAGAGGTA-3′，SEQ ID NO6)通過PCR制備361bp的PCR產(chǎn)物。根據(jù)供應商的建議進行預雜交、雜交和洗膜。將印跡在-80℃用增強屏自顯影7天。
通過RT-PCR分析驗證了CCDC4在前列腺癌細胞中的過度表達(圖1A)。Northern印跡分析(圖1B)顯示該轉錄本長約8.7kb，由6個外顯子組成，編碼530個氨基酸、具有卷曲螺旋域的蛋白質(Gene Bank編號AB126828)(SEQ ID NO2)。還鑒定了一個可選剪接形式，它預期產(chǎn)生缺失長型C端區(qū)的437個氨基酸的短型同種型(Gene Bank編號AB126829)(SEQ ID NO4)。如Northern印跡分析所示，該基因的表達限制于正常睪丸和前列腺(圖1B)，表明針對此分子對正常人體器官預期產(chǎn)生很小的毒性。
(4)siRNA表達構建物和集落形成/MTT測定法本發(fā)明人利用siRNA表達載體(psiU6BX)分析靶基因的RNA干擾作用。將U6啟動子克隆到基因特異序列的上游(來自靶轉錄本的19個核苷酸序列，以一個短間隔序列TTCAAGAGA(SEQ ID NO7)與其自身的反向互補序列分開)，并以5個胸苷作為終止信號；此外，整合neo盒，使其對遺傳霉素(Sigma)產(chǎn)生抗性。CCDC4基因的靶序列為5′-GATGGTTCTGCAGCACCAC-3′(SEQ ID NO8)(Si#1)，而陰性對照為5′-GAAGCAGCACGACTTCTTC-3′(SEQ ID NO9)(siEGFP)。
用于CCDC4 siRNA的寡核苷酸如下所示。通過將下述雙鏈寡核苷酸克隆到psiU6BX載體的BbsI位點來構建si#1。相對于CCDC4核酸序列SEQ IDNO1或3的對應核苷酸位置如下所示。寡核苷酸是CCDC4靶序列的有義核苷酸序列和反義核苷酸序列的組合體。si#1的發(fā)夾環(huán)結構的核苷酸序列如SEQ ID NO10所示(內切核酸酶識別位點已從每個發(fā)夾環(huán)結構序列中除去)。
si#1(SEQ ID NO1或3的核苷酸1666-1684/SEQ ID NO8)5′-caccgatggt tctgcagcac cacttcaaga gagtggtgct gcagaaccat c-3′(SEQ ID NO11)
5′-aaaagatggt tctgcagcac cactctcttg aagtggtgct gcagaaccat c-3′(SEQ ID NO12)將前列腺癌細胞系PC3和DU145接種到10cm培養(yǎng)皿中(5x105細胞/盤)，并用Lipofectamine 2000(Invitrogen)根據(jù)制造商的指示用含有EGFP靶序列(EGFP)的psiU6BX和含有CCDC4靶序列的psiU6BX轉染細胞。細胞用500mg/mL遺傳霉素篩選一周，轉染后48小時收集初級細胞并通過RT-PCT驗證CCDC4的抑制效果。RT-PCT的引物如前所述。用吉姆薩溶液染色并進行MTT反應，分別評估集落形成和細胞數(shù)。
RT-PCT驗證了CCDC4 mRNA能被轉染的siRNA表達載體si#1所抑制，但不能被siEGFP抑制。集落形成測定法表明在經(jīng)RT-PCR驗證有效抑制CCDC4的si#1轉染細胞中，集落數(shù)目顯著減少。MTT測定法也表明用si#1轉染的培養(yǎng)細胞的數(shù)目顯著減少。這些發(fā)現(xiàn)強烈支持CCDC4對PRC細胞生長是必需的，且CCDC4的分子靶向是開發(fā)PRC新療法的有希望的途徑。
psiU6BX3.0載體的構建在以下質粒序列中(SEQ ID NO13)，編碼siRNA的DNA片段插入位于核苷酸485-490的缺口中，以(-)表示。
GACGGATCGGGAGATCTCCCGATCCCCTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGGATCCACTAGTAACGGCCGCCAGTGTGCTGGAATTCGGCTTGGGGATCAGCGTTTGAGTAAGAGCCCGCGTCTGAACCCTCCGCGCCGCCCCGGCCCCAGTGGAAAGACGCGCAGGCAAAACGCACCACGTGACGGAGCGTGACCGCGCGCCGAGCGCGCGCCAAGGTCGGGCAGGAAGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTAGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACC------TTTTTACATCAGGTTGTTTTTCTGTTTGGTTTTTTTTTTACACCACGTTTATACGCCGGTGCACGGTTTACCACTGAAAACACCTTTCATCTACAGGTGATATCTTTTAACACAAATAAAATGTAGTAGTCCTAGGAGACGGAATAGAAGGAGGTGGGGCCTAAAGCCGAATTCTGCAGATATCCATCACACTGGCGGCCGCTCGAGTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGGGGCTCTAGGGGGTATCCCCACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTAATTCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCT
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工業(yè)應用性與非癌性前列腺管上皮細胞相比，人CCDC4基因在前列腺癌中的表達顯著升高。據(jù)此，該基因可作為前列腺癌的診斷標志，而其編碼的蛋白質可用于前列腺癌的診斷分析。
本發(fā)明人還顯示了新蛋白質CCDC4的表達促進細胞生長，而所述細胞生長可被對應于CCDC4基因的小干擾RNA抑制。這些發(fā)現(xiàn)表明CCDC4蛋白質刺激致癌活性。因而，這些新的致癌蛋白質中的每一種都可作為研發(fā)抗癌藥物的靶。例如，阻斷CCDC4表達或阻止其活性的試劑在治療上可作為抗癌藥物，特別是用于治療前列腺癌的抗癌藥物。此類試劑的實例包括針對CCDC4基因的反義寡核苷酸、小干擾RNA、和核酶，及識別CCDC4的抗體。
盡管已經(jīng)參照具體實施方案詳細地說明了本發(fā)明，對本領域技術人員來說，顯而易見的是可在不偏離本發(fā)明的精神和范圍的前題下對本發(fā)明進行多種改變和修改。
序列表<110>腫瘤療法科學股份有限公司<120>前列腺癌相關的基因和多肽<130>ONC-A0404P<150>US60/555,810<151>2004-03-23<160>21<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>8763<212>DNA<213>人類(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(593)..(2185)<223>
<400>1gcgatgctcg gggaaagcag gaccccaaag ccccgtaaac accgcgcgac cacccgggcc 60aagatcttca agaggttctt ttcagaagga tcggagagca attcccgatt ggtagaagaa120cttgctgtaa tacacacgta ctctgacgac cccgccccaa cgactagccc ctcctctgtg180caaccccgag agtttggggt catgcagggg gcgccacgag ctcgtttcgg aagccggacc240ccgcccgcag ccgcagaagc ctcgagtcca catctgggtc tctaaagtct cgccgtagcc300agatcccgga tccccacctt cttcaccagt tcccgggcgt cctccaggca ttggcgaggc360agcctgtcaa tcaggagctc gggcggcagc cccccgcgcg ggggctcggc gatgccagcc420tcagcgacag gcggcggcgg cggcggccac ggcacagaca cacaccctcc cacacgcgcg480caccagggca gacccggcgg gcaggcggcg gaggcaccct cggagcccgg cgcccggcgg540
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<223>siRNA表達載體的人工構建質粒序列<400>13gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtgcactct cagtacaatc tgctctggat 60ccactagtaa cggccgccag tgtgctggaa ttcggcttgg ggatcagcgt ttgagtaaga120
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<223>人工合成的引物序列<400>14ggggatcagc gtttgagtaa 20<210>15<211>20<212>DNA
<213>人工的<220>
<223>人工合成的引物序列<400>15taggccccac ctccttctat20<210>16<211>30<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的引物序列<400>16tgcggatcca gagcagattg tactgagagt 30<210>17<211>29<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的引物序列<400>17ctctatctcg agtgaggcgg aaagaacca 29<210>18<211>40<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的引物序列<400>18tttaagcttg aagactattt ttacatcagg ttgtttttct 40
<210>19<211>37<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的引物序列<400>19tttaagcttg aagacacggt gtttcgtcct ttccaca37<210>20<211>51<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于siRNA的人工合成序列<400>20caccgaagca gcacgacttc ttcttcaaga gagaagaagt cgtgctgctt c51<210>21<211>51<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于siRNA的人工合成序列<400>21aaaagaagca gcacgacttc ttctctcttg aagaagaagt cgtgctgctt c5權利要求
1.選自下組的基本上純的多肽(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO2或4的多肽；(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO2或4或包含與SEQ ID NO2或4具有至少約80％同源性的序列的多肽；和(c)由能與由核苷酸序列SEQ ID NO1或3組成的多核苷酸在嚴格條件下雜交的多核苷酸編碼的多肽，其中該多肽具有與由SEQ ID NO2或4任一的氨基酸序列組成的多肽等同的生物學活性。
2.編碼權利要求1中所述多肽的分離的多核苷酸。
3.包含權利要求2中所述多核苷酸的載體。
4.包含權利要求2中所述多核苷酸或權利要求3中所述載體的宿主細胞。
5.用于生產(chǎn)權利要求1中所述多肽的方法，所說的方法包括以下步驟(a)培養(yǎng)權利要求4中所述的宿主細胞；(b)使所述宿主細胞表達所述多肽；并(c)收集表達的多肽。
6.能與權利要求1中所述多肽結合的抗體。
7.與編碼權利要求1中所述多肽的多核苷酸或其互補鏈互補且包含至少15個核苷酸的多核苷酸。
8.針對編碼權利要求1中所述多肽的多核苷酸的反義多核苷酸或小干擾RNA。
9.權利要求8中所述的小干擾RNA，其中它的有義鏈包含核苷酸序列SEQ ID NO8作為靶序列且在長度上小于75個核苷酸。
10.用于診斷前列腺癌的方法，所說的方法包括以下步驟(a)檢測生物樣本中編碼氨基酸序列SEQ ID NO2或4的基因的表達水平；并(b)把所述表達水平的增高與所述疾病聯(lián)系起來。
11.權利要求10中所述的方法，其中所述表達水平是通過選自下組的任一方法檢測的(a)檢測編碼氨基酸序列SEQ ID NO2或4的mRNA，(b)檢測包含氨基酸序列SEQ ID NO2或4的蛋白質，和(c)檢測包含氨基酸序列SEQ ID NO2或4的蛋白質的生物學活性。
12.篩選用于治療或預防前列腺癌的化合物的方法，所說的方法包括以下步驟(a)使測試化合物與選自下組的多肽接觸(1)包含氨基酸序列SEQ ID NO2或4的多肽；(2)包含氨基酸序列SEQ ID NO2或4或包含與SEQ ID NO2或4具有至少約80％同源性的序列的多肽；和(3)由能與由核苷酸序列SEQ ID NO1或3組成的多核苷酸在嚴格條件下雜交的多核苷酸編碼的多肽，其中該多肽具有與由氨基酸序列SEQ ID NO2或4組成的多肽等同的生物學活性；(b)檢測所述多肽與所述測試化合物之間的結合活性；并(c)選擇與所述多肽結合的化合物。
13.篩選用于治療或預防前列腺癌的化合物的方法，所說的方法包括以下步驟(a)使測試化合物與選自下組的多肽接觸(1)包含氨基酸序列SEQ ID NO2或4的多肽；(2)包含氨基酸序列SEQ ID NO2或4或包含與SEQ ID NO2或4具有至少約80％同源性的序列的多肽；和(3)由能與由核苷酸序列SEQ ID NO1或3組成的多核苷酸在嚴格條件下雜交的多核苷酸編碼的多肽，其中該多肽具有與由氨基酸序列SEQ ID NO2或4組成的多肽等同的生物學活性；(b)檢測步驟(a)中所述多肽的生物學活性；并(c)選擇與所述測試化合物缺失情況下檢測到的生物學活性相比抑制所述多肽生物學活性的化合物。
14.權利要求13中所述的方法，其中所述生物學活性是細胞增殖活性。
15.篩選用于治療或預防前列腺癌的化合物的方法，所說的方法包括以下步驟(a)使測試化合物與表達包含核苷酸序列SEQ ID NO1或3的一種或多種多核苷酸的細胞接觸；并(b)選擇與所述測試化合物缺失情況下檢測到的表達水平相比降低所述包含核苷酸序列SEQ ID NO1或3的一種或多種多核苷酸的表達水平的化合物。
16.權利要求15中所述的方法，其中所述細胞是前列腺癌細胞。
17.篩選用于治療或預防前列腺癌的化合物的方法，所說的方法包括以下步驟(a)使測試化合物與導入了下述載體的細胞接觸，該載體包含一種或多種標志基因的轉錄調控區(qū)及在該轉錄調控區(qū)控制下表達的報道基因，其中所述一種或多種標志基因包含選自SEQ ID NO1或3的任一核苷酸序列，(b)測量所述報道基因的表達水平或活性；并(c)選擇與對照相比降低所述報道基因的表達水平或活性的化合物。
18.用于治療或預防前列腺癌的組合物，所說的組合物包含制藥學有效量的針對下述多核苷酸的反義多核苷酸或小干擾RNA作為活性成分及制藥學可接受載體，其中所述多核苷酸編碼選自下組的多肽(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO2或4的多肽；(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO2或4，其中一個或多個氨基酸被替代、刪除、插入和/或添加且具有與由氨基酸序列SEQ ID NO2或4組成的蛋白質等同的生物學活性的多肽；和(c)由能與由核苷酸序列SEQ ID NO1或3組成的多核苷酸在嚴格條件下雜交的多核苷酸編碼的多肽，其中該多肽具有與由氨基酸序列SEQ IDNO2或4組成的多肽等同的生物學活性，及制藥學可接受載體。
19.權利要求18中所述的組合物，其中所說的小干擾RNA包含核苷酸序列SEQ ID NO8作為靶序列。
20.權利要求19中所述的組合物，所說的小干擾RNA的通式為5’-[A]-[B]-[A’]-3’，其中[A]是對應于核苷酸序列SEQ ID NO8的核糖核苷酸序列，[B]是由3至23個核苷酸組成的核糖核苷酸序列，且[A’]是由[A]的互補序列組成的核糖核苷酸序列。
21.權利要求18中所述的組合物，其中所說的組合物包含轉染增強劑。
22.用于治療或預防前列腺癌的組合物，所說的組合物包含制藥學有效量的針對選自下組的多肽的抗體作為活性成分及制藥學可接受載體(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO2或4的多肽；(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO2或4，其中一個或多個氨基酸被替代、刪除、插入和/或添加且具有與由氨基酸序列SEQ ID NO2或4組成的蛋白質等同的生物學活性的多肽；和(c)由能與由核苷酸序列SEQ ID NO1或3組成的多核苷酸在嚴格條件下雜交的多核苷酸編碼的多肽，其中該多肽具有與由氨基酸序列SEQ IDNO2或4組成的多肽等同的生物學活性。
23.用于治療或預防前列腺癌的組合物，所說的組合物包含制藥學有效量的通過權利要求12至17任一項的方法選擇的化合物作為活性成分及制藥學可接受載體。
24.用于治療或預防前列腺癌的方法，所說的方法包括的步驟有施用制藥學有效量的針對下述多核苷酸的反義多核苷酸或小干擾RNA，其中所述多核苷酸編碼選自下組的多肽(1)包含氨基酸序列SEQ ID NO2或4的多肽；(2)包含氨基酸序列SEQ ID NO2或4，其中一個或多個氨基酸被替代、缺失、插入和/或添加且具有與由氨基酸序列SEQ ID NO2或4組成的蛋白質等同的生物學活性的多肽；和(3)由能與由核苷酸序列SEQ ID NO1或3組成的多核苷酸在嚴格條件下雜交的多核苷酸編碼的多肽，其中該多肽具有與由氨基酸序列SEQ IDNO2或4組成的多肽等同的生物學活性。
25.權利要求24中所述的方法，其中所說的小干擾RNA包含核苷酸序列SEQID NO8作為靶序列。
26.權利要求25中所述的方法，所說的小干擾RNA的通式為5’-[A]-[B]-[A’]-3’，其中[A]是對應于核苷酸序列SEQ ID NO8的核糖核苷酸序列，[B]是由3至23個核苷酸組成的核糖核苷酸列，且[A’]是由[A]的互補序列組成的核糖核苷酸序列。
27.權利要求24中所述的方法，其中所說的組合物包含轉染增強劑。
28.用于治療或預防前列腺癌的方法，所說的方法包括的步驟有施用制藥學有效量的針對選自下組的多肽的抗體(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO2或4的多肽；(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO2或4，其中一個或多個氨基酸被替代、刪除、插入和/或添加且具有與由氨基酸序列SEQ ID NO2或4組成的蛋白質等同的生物學活性的多肽；和(c)由能與由核苷酸序列SEQ ID NO1或3組成的多核苷酸在嚴格條件下雜交的多核苷酸編碼的多肽，其中該多肽具有與由氨基酸序列SEQ IDNO2或4組成的多肽等同的生物學活性。
29.用于治療或預防前列腺癌的方法，所說的方法包括的步驟有施用制藥學有效量的通過權利要求12至17任一項的方法選擇的化合物。
30.用于治療或預防前列腺癌的方法，所說的方法包括的步驟有施用制藥學有效量的選自(a)-(c)的多肽或是編碼該多肽的多核苷酸(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO2或4的多肽或其片段；(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO2或4，其中一個或多個氨基酸被替代、刪除、插入和/或添加且具有與由氨基酸序列SEQ ID NO2或4組成其中一個或多個氨基酸被替代、缺失、插入和/或添加且具有與由氨基酸序列SEQ ID NO2或4組成的蛋白質等同的生物學活性的蛋白質等同的生物學活性的多肽；(c)由能與由核苷酸序列SEQ ID NO1或3組成的多核苷酸在嚴格條件下雜交的多核苷酸編碼的多肽或其片段，其中該多肽具有與由氨基酸序列SEQ ID NO2或4組成的多肽等同的生物學活性。
31.用于誘導抗腫瘤免疫的方法，所說的方法包括的步驟有使選自(a)-(c)的多肽與抗原呈遞細胞接觸，或是將編碼該多肽的多核苷酸或包含該多核苷酸的載體導入抗原呈遞細胞(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO2或4的多肽或其片段；(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO2或4，其中一個或多個氨基酸被替代、刪除、插入和/或添加且具有與由氨基酸序列SEQ ID NO2或4組成的蛋白質等同的生物學活性的多肽；(c)由能與由核苷酸序列SEQ ID NO1或3組成的多核苷酸在嚴格條件下雜交的多核苷酸編碼的多肽或其片段，其中該多肽具有與由氨基酸序列SEQ ID NO2或4組成的多肽等同的生物學活性。
32.權利要求31中所述誘導抗腫瘤免疫的方法，其中所述方法進一步包括的步驟有對受試者施用所述抗原呈遞細胞。
33.用于治療或預防前列腺癌的藥物組合物，所說的組合物包含制藥學有效量的選自(a)-(c)的多肽或是編碼該多肽的多核苷酸作為活性成分及制藥學可接受載體(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO2或4的多肽或其片段；(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO2或4，其中一個或多個氨基酸被替代、刪除、插入和/或添加且具有與由氨基酸序列SEQ ID NO2或4組成的蛋白質等同的生物學活性的多肽；(c)由能與由核苷酸序列SEQ ID NO1或3組成的多核苷酸在嚴格條件下雜交的多核苷酸編碼的多肽或其片段，其中該多肽具有與由氨基酸序列SEQ ID NO2或4組成的多肽等同的生物學活性。
34.權利要求33中所述的藥用組合物，其中所述多核苷酸摻入到表達載體中。
35.診斷劑，它包含能與編碼權利要求1中所述多肽的多核苷酸雜交的寡核苷酸，或包含能與權利要求1中所述多肽結合的抗體。
36.包含有義鏈和反義鏈的雙鏈分子，其中所述有義鏈包含對應于SEQID NO8的核糖核苷酸序列，且其中所述反義鏈包含與所說的有義鏈互補的核糖核苷酸序列，其中所說的有義鏈與所說的反義鏈彼此雜交形成所說的雙鏈分子，且其中所說的雙鏈分子在導入表達CCDC4基因的細胞后能抑制所述基因的表達。
37.權利要求36中所述的雙鏈分子，其中所說的有義鏈包含來自SEQID NO1的約19個至約25個連續(xù)核苷酸。
38.權利要求36中所述的雙鏈分子，其中所說的有義鏈由對應于SEQID NO8的核糖核苷酸序列組成。
39.權利要求36中所述的雙鏈分子，其中一條核糖核苷酸轉錄本包含有義鏈和反義鏈，所說的雙鏈分子進一步包含連接所說的有義鏈和所說的反義鏈的單鏈核糖核苷酸序列。
40.編碼權利要求36中所述雙鏈分子的載體。
41.權利要求40中所述的載體，其中所述載體編碼具有二級結構的轉錄本，其中所述轉錄本包含所述有義鏈和反義鏈。
42.權利要求40中所述的載體，其中所述轉錄本進一步包含連接所說的有義鏈和所說的反義鏈的單鏈核糖核苷酸序列。
全文摘要
本申請?zhí)峁┝诵碌娜祟惢駽CDC4，其表達在前列腺癌中顯著增高。例如，該基因及其編碼的多肽可用于前列腺癌的診斷，用作研制針對這種疾病的藥物的靶分子，以及用于減緩前列腺癌的細胞生長。
文檔編號C12N15/63GK1984925SQ20058001655
公開日2007年6月20日 申請日期2005年3月11日 優(yōu)先權日2004年3月23日
發(fā)明者中村佑輔, 中川英刀, 中鶴修一 申請人:腫瘤療法科學股份有限公司