專利名稱：與質(zhì)量分析結(jié)合的甲基化特異性擴增產(chǎn)物的堿基特異性切割的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了用于評估核酸甲基化狀態(tài)的方法和產(chǎn)品。

背景技術(shù)：
遺傳信息不僅存儲于四個核苷酸堿的序列構(gòu)型中，還存儲于選定堿基的共價修飾中(參見例如Robertson et al.Nature Rev.Genet.111-19(2000))。這些共價修飾的其中之一是胞嘧啶核苷酸的甲基化，尤其是“CpG”二核苷酸中鳥嘌呤核苷酸鄰近的胞嘧啶。CpG二核苷酸內(nèi)將甲基共價加成給胞嘧啶的反應(yīng)由來自DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)家族的蛋白催化(Amir et al.Nature Genet.23185-88(1999)；Okano et al.Cell 99247-57(1999))。在人類基因組中，CpG二核苷酸通常描述不足，并且多數(shù)CpG二核苷酸存在于稱為CpG島的獨特區(qū)域。這些CpG島中的大部分可以在基因啟動子區(qū)發(fā)現(xiàn)。在啟動子相關(guān)的CpG島中胞嘧啶轉(zhuǎn)化成5’-甲基胞嘧啶已表明與染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化有關(guān)，而且經(jīng)常引起相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄性剪切。由DNA甲基化引起的轉(zhuǎn)錄性剪切與哺乳動物發(fā)育、遺傳印記和X染色體的失活以及寄生DNA和多種癌癥類型的抑制相關(guān)(參見例如Li et al.Cell 69915-26(1992)；Okano et al.Cell 99247-57(1999))。檢測到DNA甲基化狀態(tài)的變化可以作為瘤形成事件早期檢測中的標記物(Costello et al.Nature Genet.24132-38(2000))。
例證DNA甲基化在臨床環(huán)境中實際應(yīng)用的研究比較缺乏，這一點至少部分是由于DNA甲基化研究面臨的技術(shù)局限性。已經(jīng)有幾個DNA甲基化分析技術(shù)被人們采用，但每個方法均有其局限性。一些方法易于得到假陽性結(jié)果，因此限制了每次分析時將甲基化評估精確到單一的胞嘧啶位點。其他方法則需要大量的高質(zhì)量基因組DNA、消耗勞力且易于得到假陽性結(jié)果。
由于DNA甲基化具有診斷以及其他用途，因此需要可靠且成本有效的高通量DNA甲基化分析工具和方法，以評估可能的甲基化位點、聯(lián)系甲基化位點與疾病、并且用來開發(fā)預(yù)后性甲基化標記物。因此在本文所述的目的中，提供甲基化核苷酸鑒定方法及用于該方法的產(chǎn)品是本文的一個目的。


發(fā)明內(nèi)容
概述 本發(fā)明提供了鑒定靶核酸分子甲基化狀態(tài)的方法、組合物以及試劑盒。所述方法可以包括用修飾作為靶核酸分子甲基化狀態(tài)的函數(shù)的靶核酸分子的核苷酸的試劑處理靶核酸分子；擴增處理過的靶核酸分子；斷裂擴增的靶核酸分子；檢測一個或多個擴增的靶核酸分子片段，以及根據(jù)所述片段例如其大小和(或)其數(shù)量來鑒定靶核酸分子或核酸分子中核苷酸基因座的甲基化狀態(tài)，或者鑒定核酸分子或其中的核苷酸基因座為甲基化或未甲基化。
斷裂可通過在諸如堿基特異性切割條件下處理擴增產(chǎn)物而完成。這些片段的檢測可以通過諸如像MALDI-TOF質(zhì)譜分析法測定或檢測一個或多個擴增的靶核酸分子片段而實現(xiàn)。檢測還可以通過諸如比較所述一個或多個靶核酸分子片段的測定質(zhì)量與一個或多個參考核酸像未處理核酸分子片段的測定質(zhì)量而實現(xiàn)。在一個示例性的方法中，所述試劑修飾未甲基化核苷酸，并且隨后修飾特異性擴增所得到的修飾靶核酸。
本發(fā)明還提供了鑒定核酸中一個或多個甲基化或未甲基化核苷酸的方法、組合物以及試劑盒，方法為用修飾作為選定核苷酸甲基化狀態(tài)的函數(shù)的選定的核苷酸生成不同核苷酸的試劑處理靶核酸分子；用引物接觸處理過的靶核酸分子，而該引物含有一個或多個與選定核苷酸互補的核苷酸，或者含有一個或多個與不同核苷酸互補的核苷酸；在核酸合成條件下處理接觸過的靶核酸分子，據(jù)此核苷酸在雜交到靶核酸分子的引物上合成；在堿基特異性切割條件下處理合成的產(chǎn)物；以及檢測切割處理的產(chǎn)物，其中根據(jù)切割產(chǎn)物的數(shù)量或者一個或多個切割產(chǎn)物與一個或多個參照物之間的比較，確定含有一個或多個甲基化或未甲基化核苷酸的靶核酸分子。
同樣地，本發(fā)明提供了鑒定核酸中一個或多個甲基化或未甲基化核苷酸的方法、組合物以及試劑盒，方法為用可修飾作為選定核苷酸甲基化狀態(tài)的函數(shù)的選定的核苷酸生成不同核苷酸的試劑，處理靶核酸分子；擴增處理過的核酸分子，以形成擴增產(chǎn)物；用引物接觸處理過的靶核酸分子，所述引物含有與選定核苷酸互補的核苷酸相互補的一個或多個核苷酸，或者含有與不同核苷酸互補的核苷酸相互補的一個或多個核苷酸；在核酸合成條件下處理接觸過的靶核酸分子，據(jù)此核苷酸在雜交到靶核酸分子的引物上合成；在堿基特異性切割條件下處理合成的產(chǎn)物；以及檢測切割處理的產(chǎn)物，其中根據(jù)切割產(chǎn)物的數(shù)量或者一個或多個切割產(chǎn)物與一個或多個參照物之間的比較，確定含有一個或多個甲基化或未甲基化核苷酸的靶核酸分子。
例如，本發(fā)明提供的方法、組合物以及試劑盒包括鑒定核酸中一個或多個甲基化或未甲基化核苷酸的方法、組合物以及試劑盒，方法為用試劑處理靶核酸分子，試劑選自修飾未甲基化的選定核苷酸生成不同核苷酸的試劑以及修飾甲基化的選定核苷酸生成不同核苷酸的試劑；特異性擴增處理過的靶核酸分子，方法選自(i)用引物接觸處理過的靶核酸分子，而該引物與含有一個或多個選定核苷酸或者一個或多個不同核苷酸的靶核酸區(qū)特異性雜交，并且在核酸合成條件下處理接觸過的靶核酸分子；以及(ii)擴增處理過的核酸分子，以形成擴增產(chǎn)物，用引物接觸擴增產(chǎn)物，而該引物與含有一個或多個選定核苷酸或者一個或多個不同核苷酸的靶核酸區(qū)特異性雜交；在核酸合成條件下處理接觸過的靶核酸分子；用堿基特異性切割條件處理擴增產(chǎn)物；以及檢測切割處理的產(chǎn)物，其中含有一個或多個甲基化或未甲基化核苷酸的靶核酸分子由下列觀察結(jié)果表示，選自于存在兩個或多個切割產(chǎn)物、僅存在一個單個切割產(chǎn)物、存在比參考核酸分子數(shù)量多一個或多個的切割產(chǎn)物、存在比參考核酸分子數(shù)量少一個或多個的切割產(chǎn)物、存在與參考核酸分子數(shù)量相同的切割產(chǎn)物、與參考核酸分子質(zhì)量相比一個或多個切割產(chǎn)物質(zhì)量的變化以及一個或多個切割產(chǎn)物與參考核酸分子質(zhì)量相同。
本發(fā)明還提供了用于鑒定甲基化核苷酸分子的方法、組合物以及試劑盒的實例，方法為處理靶核酸分子，以確定未甲基化的胞嘧啶核苷酸；用包含一個和多個鳥嘌呤核苷酸特異性的擴增處理過的靶核酸分子；堿基特異性的切割擴增產(chǎn)物；以及檢測切割產(chǎn)物，其中存在兩個和多個片段表示靶核酸分子包含一個和多個甲基化的胞嘧啶。其他實例包括包括鑒定非甲基化核酸分子的方法，方法為用修飾未甲基化的胞嘧啶的試劑處理靶核酸分子以產(chǎn)生尿嘧啶；用包含一個或多個腺嘌呤核苷酸的引物特異性的擴增處理過的靶核酸分子；以及檢測切割產(chǎn)物，其中存在兩個或多個片段表示包含一個或多個未甲基化的胞嘧啶的靶核酸分子。
本文所提供的其他示例性的方法、組合物和試劑盒包括用于鑒定核酸中甲基化的核苷酸的核苷酸基因座的方法、組合物和試劑盒，方法為用修飾未甲基化的胞嘧啶的試劑處理靶核酸分子以產(chǎn)生尿嘧啶；用包含一個或多個腺嘌呤核苷酸的引物特異性的擴增處理過的靶核酸分子；以及檢測切割產(chǎn)物的質(zhì)量，其中與參考質(zhì)量相比，一個或多個切斷產(chǎn)物的質(zhì)量變化表示靶內(nèi)的核苷酸基因座被甲基化。類似的示例性方法包括用于鑒定靶核酸內(nèi)未甲基化核苷酸的核苷酸基因座的方法，方法為用修飾未甲基化的胞嘧啶的試劑處理靶核酸分子以產(chǎn)生尿嘧啶；用包含一個或多個腺嘌呤核苷酸的引物特異性的擴增處理過的靶核酸分子；堿基特異性的切割擴增產(chǎn)物；以及檢測切割產(chǎn)物的質(zhì)量，其中與參考質(zhì)量相比，一個或多個切斷產(chǎn)物的質(zhì)量變化表示靶內(nèi)的核苷酸基因座被甲基化。
本發(fā)明還提供了用于鑒定甲基化核酸中甲基化狀態(tài)的核苷酸基因座的方法、組合物以及試劑盒，方法為處理靶核酸分子，以確定未甲基化的胞嘧啶核苷酸；特異性擴增處理過的靶核酸分子，采用的引物與靶核酸分子的第一預(yù)定區(qū)特異性雜交，其中預(yù)定區(qū)含有一個或多個胞嘧啶核苷酸。堿基特異性的切割擴增產(chǎn)物；以及檢測切割產(chǎn)物的質(zhì)量，其中相對于參考質(zhì)量，一個或多個切割產(chǎn)物的質(zhì)量變化表示靶核酸中第二個區(qū)域內(nèi)的核苷酸基因座是甲基化的，其中第一個區(qū)域和第二個區(qū)域互相不交迭。
本發(fā)明提供的方法、組合物以及試劑盒可以與多個其它流程中任何一個聯(lián)合實施或應(yīng)用，這些流程包括但不限于根據(jù)靶核酸分子的甲基化狀態(tài)修飾靶核酸分子的流程、任何用于擴增靶核酸分子的流程、任何用于斷裂靶核酸分子的流程、任何用于檢測靶核酸分子片段的流程。
例如，本發(fā)明提供了用于鑒定核酸中甲基化核苷酸的核苷酸基因座的方法、組合物以及試劑盒，方法為用可將未甲基化的胞嘧啶修飾生成尿嘧啶的試劑處理靶核酸分子；用含有一個或多個鳥嘌呤核苷酸的引物特異性擴增處理過的靶核酸分子；堿基特異性的切割擴增產(chǎn)物；用相同的切割試劑(s)切割或模擬切割參考核酸；檢測切割產(chǎn)物的質(zhì)量；確定靶核酸分子片段和參考片段之間質(zhì)量信號的差異；以及從質(zhì)量信號的差異確定一組數(shù)量減少的序列變異候選物，從而確定與參考核酸相比靶核酸中的序列變異，其中核苷酸基因座的甲基化通過序列變異的核苷酸基因座表示。本發(fā)明提供的方法、組合物以及試劑盒另一個實例是用于鑒定核酸中甲基化核苷酸的核苷酸基因座的方法、組合物以及試劑盒，方法為用可將未甲基化的胞嘧啶修飾生成尿嘧啶的試劑處理靶核酸分子；擴增處理過的靶核酸分子以形成第一擴增產(chǎn)物；用含有一個或多個胞嘧啶的核苷酸的引物特異性擴增第一擴增產(chǎn)物，以形成第二擴增產(chǎn)物；堿基特異性的切割所述第二擴增產(chǎn)物；用相同的切割試劑(s)切割或模擬切割參考核酸；檢測切割產(chǎn)物的質(zhì)量；確定靶核酸分子片段和參考片段之間質(zhì)量信號的差異；以及從質(zhì)量信號的差異確定一組數(shù)量減少的序列變異候選物，從而確定與參考核酸相比靶核酸中的序列變異，其中所述核苷酸基因座的甲基化通過序列變異的核苷酸基因座表示。
本發(fā)明還提供了在兩個或多個核酸中用于鑒定一個或多個甲基化或未甲基化核苷酸的方法、組合物以及試劑盒，方法為用可修飾作為選定核苷酸的甲基化狀態(tài)的函數(shù)的選定的核苷酸生成不同核苷酸的試劑而處理兩個或多個不同的靶核酸分子；用引物接觸所述處理過的靶核酸分子，所述引物含有一個或多個與選定核苷酸互補的核苷酸，或者含有一個或多個與不同核苷酸互補的核苷酸；在核酸合成條件下處理所述接觸過的靶核酸分子，據(jù)此，核苷酸在與靶核酸分子雜交的引物上合成；在堿基特異性切割條件下處理所述合成產(chǎn)物；以及檢測所述切割處理的產(chǎn)物，其中含有一個或多個甲基化或未甲基化的選定核苷酸的靶核酸分子根據(jù)一個或多個切割產(chǎn)物與一個或多個參照物之間的比較來確定。
本發(fā)明還提供了用于鑒定核酸中一個或多個甲基化或未甲基化核苷酸的方法、組合物以及試劑盒，方法為用可修飾作為選定核苷酸甲基化狀態(tài)的函數(shù)的選定的核苷酸生成不同核苷酸的試劑處理靶核酸分子；用引物接觸所述處理過的靶核酸分子，所述引物含有一個或多個與選定核苷酸互補的核苷酸或含有一個或多個與不同核苷酸互補的核苷酸；在核酸合成條件下處理接觸過的靶核酸分子，據(jù)此，核苷酸在與靶核酸分子雜交的引物上合成；在斷裂條件下處理合成的產(chǎn)物；以及通過質(zhì)譜分析法檢測所述斷裂處理的產(chǎn)物，其中含有一個或多個甲基化或未甲基化的選定核苷酸的靶核酸分子，根據(jù)斷裂產(chǎn)物的數(shù)量或根據(jù)一個或多個斷裂產(chǎn)物與一個或多個參照物之間的比較來確定。類似的，提供了用于鑒定核酸中一個或多個甲基化或未甲基化核苷酸的方法，方法為用可修飾作為選定核苷酸甲基化狀態(tài)的函數(shù)的選定的核苷酸生成不同核苷酸的試劑，處理靶核酸分子；用封閉性寡核苷酸接觸所述處理過的靶核酸分子，所述封閉性寡核苷酸含有一個或多個與選定核苷酸互補的核苷酸，或者含有一個或多個與不同核苷酸互補的核苷酸；在核酸合成條件下處理所述接觸過的靶核酸分子，其中，當封閉性寡核苷酸與靶核酸分子雜交時，核苷酸合成被抑制；在堿基特異性切割條件下處理所述合成產(chǎn)物；以及檢測切割處理的產(chǎn)物，其中含有一個或多個甲基化或未甲基化的選定核苷酸的靶核酸分子根據(jù)切割產(chǎn)物的數(shù)量或者根據(jù)一個或多個切割產(chǎn)物與一個或多個參照物之間的比較來確定。
本發(fā)明還提供了用于鑒定核酸中一個或多個甲基化或未甲基化核苷酸的方法、組合物或試劑盒，方法為用可修飾作為選定核苷酸的甲基化狀態(tài)的函數(shù)的選定核苷酸生成不同核苷酸的試劑，處理靶核酸分子；用切割試劑接觸所述靶核酸分子，所述切割試劑在含有一個或多個甲基化的選定核苷酸或者一個或多個未甲基化的選定核苷酸的位點選擇性切割靶核酸，或者切割試劑在含有一個或多個選定核苷酸或者一個或多個不同核苷酸的位點選擇性切割處理過的靶核酸；在核酸合成條件下處理接觸過的靶核酸分子，其中未被切割的靶核酸分子被擴增；在堿基特異性切割條件下處理述擴增產(chǎn)物；以及檢測切割處理的產(chǎn)物，其中含有一個或多個甲基化或未甲基化的選定核苷酸的靶核酸分子根據(jù)切割產(chǎn)物的數(shù)量或者根據(jù)一個或多個切割產(chǎn)物與一個或多個參照物之間的比較來確定。
本發(fā)明還提供了用于鑒定核酸中一個或多個甲基化或未甲基化核苷酸的方法、組合物或試劑盒，方法為用引物接觸靶核酸分子并在核酸合成條件下處理接觸過的靶核酸分子，其中與靶核酸分子互補的鏈被合成；用甲基轉(zhuǎn)移酶試劑接觸所述靶核酸合成的產(chǎn)物雙鏈，據(jù)此靶核酸CpG序列中的甲基化也存在于合成產(chǎn)物的互補CpG序列中；重復引物和甲基轉(zhuǎn)移酶試劑接觸步驟，以形成第二合成產(chǎn)物，其具有與靶核酸分子中相同的核苷酸序列以及CpG核苷酸的甲基化狀態(tài)；用可修飾作為選定核苷酸的甲基化狀態(tài)的函數(shù)的選定核苷酸生成不同核苷酸的試劑處理合成產(chǎn)物；在堿基特異性切割條件下處理試劑處理過的產(chǎn)物；以及檢測切割處理的產(chǎn)物，其中含有一個或多個甲基化或未甲基化的選定核苷酸的靶核酸分子根據(jù)切割產(chǎn)物的數(shù)量或者根據(jù)一個或多個切割產(chǎn)物與一個或多個參照物之間的比較來確定。
本發(fā)明還提供了用于鑒定核酸中一個或多個甲基化或未甲基化核苷酸的方法、組合物或試劑盒，其中擴增產(chǎn)物通過堿基特異性切割條件被切割，而堿基特異性條件選自由化學條件、物理條件、酶堿基特異性切割條件以及其組合所組成的組。例如，擴增產(chǎn)物可以用RNase、DNase、堿性化合物、甲酸哌啶、哌啶、硫酸二甲酯、肼、氯化鈉以及其組合進行切割。
本發(fā)明還提供了用于鑒定核酸中一個或多個甲基化或未甲基化核苷酸的方法、組合物或試劑盒，其中擴增步驟包括轉(zhuǎn)錄。在這些方法中，整合入轉(zhuǎn)錄本的三磷酸核苷可以包括三個rNTP和一個dNTP。例如，一個dNTP選自dCTP、dTTP、dATP以及dGTP。在另一個實施中，一個dNTP選自dCTP和dTTP，并且轉(zhuǎn)錄本可以用RNaseA進行切割。
本發(fā)明還提供了用于鑒定核酸中一個或多個甲基化或未甲基化核苷酸的方法、組合物或試劑盒，其中一個或多個樣品測定的質(zhì)量強度與一個或多個參考質(zhì)量強度進行比較。同樣地，本發(fā)明還提供了用于鑒定核酸中一個或多個甲基化或未甲基化核苷酸的方法，其中收集兩個或多個核酸樣品，并且一個或多個樣品測定的質(zhì)量強度與一個或多個參考質(zhì)量強度進行比較。在這些方法中，將不完全轉(zhuǎn)化的靶核酸分子與甲基化的靶核酸分子區(qū)分開。
本發(fā)明提供的方法、組合物和試劑盒可以用于各種不同的應(yīng)用，包括確證甲基化或未甲基化靶核酸分子的特異性擴增、確定疾病診斷、可能的疾病結(jié)果或疾病治療方案以及鑒定甲基化相關(guān)的等位基因。
本發(fā)明的方法、組合物和試劑盒可以用于區(qū)分假陽性甲基化特異性擴增和真陽性甲基化特異性擴增，通過例如用可修飾未甲基化的選定核苷酸生成不同核苷酸的試劑處理靶核酸分子；用甲基化狀態(tài)特異性引物接觸處理過的靶核酸分子，所述甲基化狀態(tài)特異性引物與含有一個或多個選定核苷酸的第一個靶核酸區(qū)互補；在核酸合成條件下處理接觸過的靶核酸分子；在堿基特異性切割條件下處理合成產(chǎn)物；以及檢測切割產(chǎn)物的質(zhì)量，其中與參考質(zhì)量相比，一個或多個切割產(chǎn)物質(zhì)量的變化表示靶核酸第二區(qū)域中的核苷酸基因座是甲基化的，其中所述第二區(qū)域與第一區(qū)域相互不交迭，據(jù)此，在第二區(qū)域內(nèi)存在一個或多個甲基化基因座確證真陽性甲基化特異性擴增。
本發(fā)明的方法、組合物和試劑盒可以用于鑒定甲基化，從而鑒定與疾病、疾病結(jié)果或者治療方案結(jié)果相關(guān)的甲基化模式，通過例如根據(jù)本發(fā)明提供的任何方法，鑒定來自于一個或多個樣品的一個或多個核酸分子的甲基化或未甲基化核苷酸，所述樣品從一個或多個已知疾病、疾病結(jié)果或者治療方案的受試者收集；根據(jù)本發(fā)明提供的任何方法，鑒定來自于一個或多個樣品的一個或多個核酸分子的甲基化或未甲基化核苷酸，所述樣品從一個或多個正常受試者收集；鑒定在步驟(a)的一個或多個核酸分子與步驟(b)的一個或多個核酸分子之間差異的甲基化或未甲基化核苷酸；據(jù)此，根據(jù)差異的甲基化或未甲基化核苷酸鑒定與疾病、疾病結(jié)果或治療方案結(jié)果相關(guān)的甲基化。
在另一個實施中，本發(fā)明提供的方法、組合物和試劑盒可以用于診斷疾病、決定治療方案、或確定受試者疾病結(jié)果，通過例如鑒定來自于一個或多個樣品(從一個受試者收集)的一個或多個核酸分子中的一個或多個甲基化或未甲基化核苷酸；與同已知疾病、疾病結(jié)果或者治療方案結(jié)果相關(guān)的一個或多個參考核酸分子用于比較一個或多個核酸分子中的甲基化或未甲基化核苷酸；據(jù)此，與參考核酸分子相同的甲基化或未甲基化核苷酸可以鑒定受試者的疾病、疾病結(jié)果或者治療方案結(jié)果。本發(fā)明提供的方法、組合物和試劑盒也可以用于決定治療方案或確定受試者疾病結(jié)果的方法，通過例如鑒定來自于一個或多個樣品的一個或多個核酸分子的甲基化或未甲基化核苷酸，所述樣品從一個受試者收集；與同已知疾病、疾病結(jié)果或者治療方案結(jié)果相關(guān)的一個或多個參考核酸分子用于比較所述一個或多個核酸分子中的甲基化或未甲基化核苷酸；據(jù)此，不同于參考核酸分子的甲基化或未甲基化核苷酸可以鑒定受試者的疾病、疾病結(jié)果或者治療方案結(jié)果。
本發(fā)明提供的方法、組合物和試劑盒可以用于確定與等位基因相關(guān)的一個或多個核苷酸基因座上的甲基化狀態(tài)，通過例如收集含有已知等位基因的核酸分子；鑒定含有已知等位基因的核酸分子中的一個或多個甲基化或未甲基化核苷酸基因點；鑒定不含有等位基因的核酸分子中的相應(yīng)核苷酸基因點的甲基化狀態(tài)；以及比較含等位基因的核酸分子中核苷酸基因點的甲基化狀態(tài)與缺乏等位基因的核酸分子中核苷酸基因座的甲基化狀態(tài)，據(jù)此，一個或多個基因點甲基化狀態(tài)頻率的差異可鑒定與等位基因相關(guān)的不同基因點。類似的，本發(fā)明提供的方法、組合物和試劑盒可以用于確定與一個或多個核酸基因座的甲基化狀態(tài)相關(guān)的等位基因，通過形成含有一個或多個已知甲基化或未甲基化核苷酸基因座的核酸分子的第一集合，基因座根據(jù)本文提供的方法加以鑒定；鑒定集合的核酸樣品中存在的一個或多個等位基因的頻率；鑒定核酸分子的第二集合中存在的一個或多個等位基因的等位基因頻率，核酸分子的第二集合相對于第一集合的核酸分子，含有甲基化狀態(tài)不同的核苷酸基因座；以及比較核酸分子第一集合中的等位基因頻率與核酸分子第二集合中的等位基因頻率，據(jù)此，根據(jù)等位基因頻率的差異可鑒定與等位基因相關(guān)的一個或多個基因座。
本發(fā)明提供的方法、組合物以及試劑盒也可用于檢測一個或多個等位基因可能的同一性，通過例如鑒定核酸分子中一個或多個甲基化或未甲基化核苷酸的核酸分子；以及確定一個或多個等位基因與一個或多個甲基化或未甲基化核苷酸一起存在的頻率，其中可以確定等位基因可能的同一性。
本發(fā)明還提供用于鑒定靶核酸分子甲基化狀態(tài)的組合物和試劑盒。試劑盒可以包括試劑，其可作為靶核酸分子甲基化狀態(tài)的函數(shù)而修飾靶核酸分子的一個或多個核苷酸；一個或多個甲基化特異性引物能特異性雜交到處理過的靶核酸分子上；以及一個或多個化合物能斷裂擴增的靶核酸分子。一個或多個能斷裂擴增的靶核酸產(chǎn)物可以包括RNase、DNase、堿性化合物、甲酸哌啶、哌啶、硫酸二甲酯、肼、氯化鈉及其組合，例如本發(fā)明提供的試劑盒可以包括一種或多種RNase。
詳細描述 A.定義 B.用于確定靶核酸分子甲基化的方法 1.樣品 a.來源 b.制備 2.靶核酸分子 a.核酸的類型 b.靶核酸分子的結(jié)構(gòu)或生物學作用 c.靶核酸分子的大小和組成 C.甲基狀態(tài)特異性序列修飾 1.用于序列修飾的試劑 2.含有重亞硫酸鹽胞嘧啶的修飾 3.所得的核酸分子 D.擴增處理過的靶核酸分子 1.甲基化特異性引物 a.甲基特異性引物的設(shè)計 b.引物組成 c.引物結(jié)合區(qū) d.含有C或G核苷酸的引物 2.核酸合成方法 a.預(yù)擴增 b.互補鏈的合成 c.將首次擴增步驟與后面的步驟分開 d.反應(yīng)參數(shù) e.修飾的三磷酸核苷 f.處理過的靶核酸分子的兩條鏈 g.擴增后步驟 h.擴增產(chǎn)物的多個等份 i.多重擴增 3.核苷酸合成阻滯劑 a.核苷酸合成阻滯劑的組成和性質(zhì) b.核苷酸合成阻滯劑的應(yīng)用 c.多個核苷酸合成阻滯劑的應(yīng)用 4.斷裂與核苷酸合成聯(lián)合應(yīng)用 5.轉(zhuǎn)錄 6.擴增靶核酸分子，同時保持甲基化序列 E.核酸分子的斷裂 1.核酸分子的酶斷裂 a.堿基特異性斷裂 b.核酸分子的內(nèi)切核酸酶斷裂 c.核酸酶斷裂 d.核酸酶斷裂 2.核酸分子的物理性斷裂 3.核酸分子的化學性斷裂 4.斷裂方法的組合 a.堿基特異性斷裂 i.無片段 ii.存在片段 iii.與參照物的比較 b.多個堿基特異性切斷反應(yīng) c.序列信息和甲基化狀態(tài)的鑒定 F.靶核酸分子片段的檢測 1.質(zhì)譜分析 a.質(zhì)譜分析樣品 i.測定的核酸分子的特征 ii.調(diào)節(jié) iii.多重和質(zhì)量修飾 2.其他質(zhì)量測定方法 3.確定質(zhì)量峰值特征 4.基于雜交的檢測方法 G.片段測定分析 1.甲基化狀態(tài)鑒定 a.無需參照物的鑒定方法 b.使用參照物的鑒定方法 i.核酸分子序列已知 ii.核酸分子序列未知 c.質(zhì)量峰值特征的應(yīng)用 2.來自片段測定分析的可用信息 a.小量甲基化或未甲基化核酸的檢測 b.區(qū)分甲基化狀態(tài)與不完全轉(zhuǎn)化 c.確定兩個或多個基因座的甲基化狀態(tài) d.特異性擴增的確證 i.與錯配雜交區(qū)分 ii.與不完全轉(zhuǎn)化區(qū)分 3.兩條靶核酸分子鏈的分析 4.切割模式的信息 H.應(yīng)用 1.甲基化的發(fā)現(xiàn) a.疾病相關(guān)的發(fā)現(xiàn) b.多重分析 c.靶核酸分子片段作為標記物 2.甲基化分析 a.疾病相關(guān)分析 b.生物體鑒定 c.病原體鑒定和分型 d.單模標本 e.確定甲基化頻率 f.鑒定等位基因 3.組成和試劑盒 A.定義 除非另有指明，本文所用的所有技術(shù)和科學術(shù)語具有相同的含義，并且為本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員所理解。本文的全部披露過程提到的所有專利、專利申請、公開的申請和出版物、GENEBANK序列、網(wǎng)站以及其他公開材料，除非另有指明，其全部內(nèi)容結(jié)合于此供參考。假如本文中術(shù)語存在多個定義，本部分所用的定義優(yōu)先。無論參考文獻連接URL或者其他這種標識符或地址，應(yīng)該理解，這種標識符會有變化而且因特網(wǎng)上的特定信息也會轉(zhuǎn)換，但同等信息是已知的并且可以很容易獲取，例如通過搜索因特網(wǎng)和/或恰當?shù)臄?shù)據(jù)庫。此外，參考文獻證明了這種信息的可用性和公共傳播性。
如本文所使用的“靶核酸分子”是利用本文披露的方法進行研究的核酸分子。靶核酸分子包括基因組DNA片段、線粒體DNA或RNA片段以及RNA片段，例如可以研究靶核酸分子中一個或多個甲基化核苷酸的存在或缺乏。在甲基化鑒定方法的上下文中，例如鑒定靶核酸分子的甲基化狀態(tài)或核苷酸基因座的甲基化狀態(tài)，靶核酸分子也可以指靶核酸分子的擴增產(chǎn)物，包括處理過的靶核酸分子的擴增產(chǎn)物，其中這種擴增產(chǎn)物的核苷酸序列反映靶核酸分子的甲基化狀態(tài)。期望的目的從上下文將會變得清晰或者將特別指出。
如本文所使用的靶核酸分子的“甲基化狀態(tài)”指靶核酸分子中一個或多個甲基化核苷酸堿基的存在或缺乏。例如含有甲基化胞嘧啶的靶核酸分子認為是甲基化的(即靶核酸分子的甲基化狀態(tài)是甲基化的)。不含有任何甲基化核苷酸的靶核酸分子被認為是未甲基化的。類似的，靶核酸分子中核苷酸基因座的甲基化狀態(tài)指在靶核酸分子中特定基因座上甲基化核苷酸的存在或缺乏。例如當存在于靶核酸分子中第七位核苷酸的核苷酸是5-甲基胞嘧啶時，則靶核酸分子中第七位核苷酸上的胞嘧啶的甲基化狀態(tài)是甲基化的。類似的，當存在于靶核酸分子中的第七位核苷酸的核苷酸是胞嘧啶(并且不是5-甲基胞嘧啶)時，則靶核酸分子中得第七位核苷酸上的胞嘧啶甲基化裝提是未甲基化的。
如本文所使用的“甲基化狀態(tài)頻率”指相對于分子或基因座為未甲基化的情形的數(shù)量，分子或基因座為甲基化的情形的數(shù)量。甲基化狀態(tài)頻率可用來描述一群個體或來自單一個體的樣品。例如，具有50％甲基化狀態(tài)頻率的核苷酸基因座是50％情形為甲基化而50％情形為未甲基化。這種頻率可以用來，例如，描述一群個體中核苷酸基因座或核酸區(qū)域甲基化的程度。因此，當在第一人群或核酸分子集合中的甲基化不同于在第二人群或核酸分子集合中的甲基化時，則第一人群或集合的甲基化狀態(tài)的頻率將不同于所述第二人群或集合的甲基化裝提頻率。這種頻率也可以用來，例如，描述在單一個體中核苷酸基因座或核酸區(qū)域甲基化的程度。例如這種頻率可以用來描述來自組織樣品的一群細胞在核苷酸基因座或核酸區(qū)域的甲基化或未甲基化程度。
如本文所使用的“甲基化核苷酸”或“甲基化核苷酸堿基”指的是核苷酸堿基上存在的甲基部分，其中甲基部分通常在識別的核苷酸堿基上不存在。例如，胞嘧啶的嘧啶環(huán)上不含有甲基，但5-甲基胞嘧啶的嘧啶環(huán)上含有甲基部分。因此，胞嘧啶不是甲基化核苷酸而5-甲基胞嘧啶是甲基化核苷酸。在另一個實施例中，胸腺嘧啶在其嘧啶環(huán)的第5位含有甲基部分；然而，為了本發(fā)明的目的，由于胸腺嘧啶通常是DNA核苷酸堿基，所以當胸腺嘧啶存在于DNA中時，不認為其是甲基化核苷酸。用于DNA典型的核苷堿基是胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶和鳥嘌呤。用于RNA典型的核苷堿基是尿嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶和鳥嘌呤。
如本文所使用的“甲基化核酸分子”指的是含有一個或多個非特有甲基化的甲基化核苷酸的核酸分子。
如本文所使用的“核苷酸基因座”指的是核酸分子中的核苷酸的位置。甲基化核苷酸的核苷酸基因座指的是核酸分子中甲基化核苷酸的位置。
如本文所使用的“CpG島”指的是相對于全基因組DNA，含有的CpG二核苷酸數(shù)量增多的基因組DNA的G:C富集區(qū)。CpG島長度至少為200bp，其中所述區(qū)域的G:C含量為至少50％，并且觀察到的CpG頻率與預(yù)期頻率比為0.6；典型的CpG島長度至少為500bp，其中所述區(qū)域的G:C含量為至少55％，并且觀察到的CpG頻率與預(yù)期頻率比為0.65。觀察到的CpG頻率/預(yù)期頻率的比值可以根據(jù)Gardiner-Garden et al.J.Mol.Biol.196261-281(1987)中提供的方法進行計算。例如，觀察到的CpG頻率/預(yù)期頻率的比值可以根據(jù)下面的公式來計算 R＝(AxB)/(CxD) 其中，R是CpG頻率/預(yù)期頻率的比值，A是分析序列中CpG二核苷酸的數(shù)量，B是分析序列的核苷酸總數(shù)，C是分析序列中C核苷酸的總數(shù)，以及D是分析序列中G核苷酸的總數(shù)。
如本文所使用的，修飾作為靶核酸分子甲基化狀態(tài)的函數(shù)的靶核酸分子的核苷酸的試劑或者甲基化特異性試劑，指的是可以改變靶核酸分子的核苷酸序列的化合物或混合物或其他試劑，使得其能反映靶核酸分子的甲基化狀態(tài)。用這種試劑處理靶核酸分子的方法可以包括用試劑接觸靶核酸分子，如果需要可以聯(lián)合加成步驟，以便實現(xiàn)核苷酸序列的預(yù)期改變。靶核酸分子的核苷酸序列的這種變化可以得到一種靶核酸分子，其中每個甲基化核苷酸均被修飾成不同核苷酸。靶核酸核苷酸序列的這種變化可以得到一種靶核酸分子，其中每個未甲基化核苷酸均被修飾成不同核苷酸。靶核酸核苷酸序列的這種變化可以得到一種靶核酸分子，其中每個未甲基化的選定核苷酸(例如每個未甲基化的胞嘧啶)均被修飾成不同核苷酸。改變靶核酸核苷酸序列的這種試劑的使用，可以得到一種靶核酸分子，其中每個甲基化核苷酸的選定核苷酸(例如每個甲基化的胞嘧啶)均被修飾成不同核苷酸。
如本文所使用的，利用能修飾選定核苷酸的試劑指的是能修飾核酸分子中的4個典型存在的核苷酸其中之一(DNA為C、G、T、A；RNA為C、G、U、A)的試劑，以便該試劑修飾一個核苷酸而不修飾其他三個核苷酸。在一個示例性的具體實施方式
中，這種試劑修飾未甲基化的選定核苷酸以生成不同核苷酸。在另一個示例性的具體實施方式
中，這種試劑可使未甲基化的胞嘧啶核苷酸脫去氨基。示例性的試劑是重亞硫酸鹽。
如本文所使用的“選定的核苷酸”指的是核酸分子中通常存在4個核苷酸其中之一(DNA為C、G、T、A；RNA為C、G、U、A)，并且可以包括核苷酸典型存在的甲基化衍生物(例如，當C是選定核苷酸時，甲基化和未甲基化C均包含在選定核苷酸的含義內(nèi))，然而甲基化的選定核苷酸特指典型存在甲基化的核苷酸，以及未甲基化的選定核苷酸特指典型存在未甲基化的核苷酸。
如本文所使用的“不同核苷酸”指的是化學上不同于選定核苷酸的核苷酸，典型的，使得不同核苷酸具有的Watson-Crick堿基配對性質(zhì)不同于選定核苷酸，由此，與選定核苷酸互補的典型存在的核苷酸不同于與不同核苷酸互補的典型核苷酸。例如，當C是選定核苷酸時，U或T可以為不同核苷酸，其通過C對G的互補性以及U或T對A的互補性來例證。
如本文所使用的，與選定核苷酸互補的核苷酸或者與不同核苷酸互補的核苷酸指的是一種可在高嚴謹性條件下與選定核苷酸或不同核苷酸形成堿基配對，親和力高于互補性核苷酸與4個典型核苷酸中的三個的堿基配對的核苷酸。互補性的一個實例是DNA(例如A-T和C-G)和RNA(例如A-U和C-G)中的Watson-Crick堿基配對。因此，例如在高嚴謹性條件下，G與C堿基配對的親和力高于G與G、A或T堿基配對，且因此當C為選定核苷酸時，G是與選定核苷酸互補的核苷酸。具有類似堿基配對性質(zhì)的非天然或不典型核苷酸也包括在內(nèi)，例如與C互補的非天然或不典型核苷酸是與G類似的非天然或不典型核苷酸，因為其與C堿基配對的親和力高于其與G、A或T堿基配對。
如本文所使用的，決定錯配百分比的雜交嚴謹性如下 1)高嚴謹性0.1xSSPE，0.1％SDS，65℃ 2)中嚴謹性0.2xSSPE，0.1％SDS，50℃ 3)低嚴謹性1.0xSSPE，0.1％SDS，50℃ 本領(lǐng)域的技術(shù)人員通曉適合穩(wěn)定雜交物的洗滌步驟，并且也通曉SSPE的成分(參見，例如Sambrook，E.F.Fritsch，T.Maniatis，inMolecular Cloning，ALaboratorv Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)，vol.3，p.B.13，，也可以參見多個描述常用實驗室溶液的目錄)。SSPE是pH值為7.4磷酸鹽緩沖的0.18M NaCl。另外，本領(lǐng)域的技術(shù)人員認識到雜交物的穩(wěn)定性由Tm決定，Tm是鈉離子濃度和溫度的函數(shù)(Tm＝81.5℃-16.6(log10[Na+])+0.41(％G+C)-600/1))，所以，洗滌條件中對雜交物穩(wěn)定性關(guān)鍵的參數(shù)只有SSPE(或SSC)中的鈉離子濃度和溫度。特異性雜交通常發(fā)生在高嚴謹性條件下。
如本文所使用的，與選定核苷酸的互補物相互補的核苷酸或者與不同核苷酸的互補物相互補的核苷酸指的是在高嚴謹性條件下與選定核苷酸互補的核苷酸或與不同核苷酸互補的核苷酸形成堿基配對的核苷酸，其親和力高于互補核苷酸與4個典型核苷酸中其余3個的堿基配對。例如，當C為選定核苷酸時，G可以是選定核苷酸的互補物，以及C或C的類似核苷酸可以是與選定核苷酸的互補物相互補的核苷酸。在另一個實例中，U可以是不同核苷酸，A可以是不同核苷酸的互補物，以及T可以是與不同核苷酸的互補物相互補的核苷酸。
如本文所使用的，含有預(yù)先確定區(qū)域的靶核酸分子或者含有預(yù)先確定區(qū)域的經(jīng)處理的靶核酸分子及其變異體，指用試劑處理過的靶核酸分子的特定區(qū)域，所述試劑作為靶核酸分子甲基化狀態(tài)的函數(shù)而修飾靶核酸分子的一個或多個核苷酸，其中所得的區(qū)域的核苷酸序列是已知的或預(yù)期的核苷酸序列。例如，與靶核酸分子中預(yù)先確定區(qū)域雜交的引物可以是其核苷酸序列與已知核苷酸序列的靶核酸分子區(qū)域互補的引物。當引物與經(jīng)試劑處理的靶核酸分子互補時，雜交是特異性的。如在這種引物的上下文中所使用的“預(yù)先確定”可以指在靶核酸的至少一部分中已知的核苷酸序列。預(yù)先確定還指當用甲基化特異性試劑處理引起核苷酸序列改變時，經(jīng)處理的靶核酸的至少一部分預(yù)期的核苷酸序列，且這種區(qū)域的核苷酸序列改變可以推算，從而可設(shè)計與核苷酸序列改變的區(qū)域互補的引物。
如本文中所使用的“處理”指使被分析物(通常為核酸分子)暴露于某些條件的工藝，在所述條件下，分析物可以發(fā)生物理性或化學性修飾或者其他化學反應(yīng)(包括酶反應(yīng))。例如，用可修飾靶核酸的試劑，作為靶核酸甲基化狀態(tài)的函數(shù)處理靶核酸，可以包括將諸如重亞硫酸鹽的試劑加入到含有靶核酸分子的溶液中，其中存在于靶核酸分子中的任何未甲基化的選定核苷酸，例如任何未甲基化的C核苷酸，可被化學性修飾例如脫氨；然而，如果靶核酸分子不含有未甲基化的選定核苷酸例如不含有未甲基化的C核苷酸，那么用這種試劑處理的靶核酸分子根本不可以被化學性修飾。在另一個實例中，在斷裂或切割條件下處理靶核酸分子，可以包括在選定的靶核酸分子例如含有可以發(fā)生切割G核苷酸的靶核酸分子中，加入諸如RNaseT1的切割試劑。然而，切割不一定發(fā)生，例如當靶核酸分子不含有G核苷酸時，通過RNaseT1的切割可能不會發(fā)生。在另一個實施中，在核酸合成條件下處理靶核酸分子可包括加入DNA或RNA聚合酶和NTPs，以便如果例如引物被雜交到靶核酸分子上，則核酸合成可以發(fā)生；然而，如果例如引物未被雜交到靶核酸分子上，核酸合成則不是必要的。
如本文所使用的，混合樣品或者其他含被分析物的組合物“處理前”樣品指的是首先將樣品混合成單一混合物，并且隨后實施一種或多種處理步驟例如核酸合成或斷裂或重亞硫酸鹽處理。相反，當兩個或多個樣品或組合物“單獨處理”時，在一個或多個處理步驟后，再將樣品或組合物互相加入。
如本文所使用的“等份”是少于總量的一部分樣品或其他含被分析物的組合物。多個等份的大小或數(shù)量不必彼此相等。
如本文所使用的處理過的靶核酸分子“形成于”或“源自”未處理的靶核酸分子指處理過的靶核酸分子具有與未處理的靶核酸分子的核苷酸序列相關(guān)的核苷酸序列，其反映未處理過的靶核酸分子的甲基化狀態(tài)。
如本文所使用的“甲基轉(zhuǎn)移酶試劑”指的是將甲基部分轉(zhuǎn)移或者催化轉(zhuǎn)移到諸如核苷酸或核酸分子的化合物上的試劑。典型的，甲基轉(zhuǎn)移酶試劑可以堿基特異性的轉(zhuǎn)移甲基部分。示例性的甲基轉(zhuǎn)移酶試劑是本領(lǐng)域中已知的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶試劑。
如本文所使用的習語“雜交”或其語法變異形式指在低、中或高嚴謹性條件下或在核酸合成條件下第一核酸分子結(jié)合到第二核酸分子上。雜交可以包括一些情形，其中第一核酸分子結(jié)合到第二核酸分子上，在那里第一和第二核酸分子互補。
如本文所使用的“特異性雜交”指在核酸合成條件下，和與不含有互補序列的核酸分子雜交相比，探針或引物優(yōu)先雜交到含有與探針或引物互補序列的核酸分子上。例如，特異性雜交包括探針雜交到與和探針互補的靶序列上。
如本文所使用的，在引物雜交的上下文中，核苷酸合成條件指引物退火到待擴增的核酸分子上的條件。示例性的核苷酸合成條件是10mM TrisHCl pH＝8.3、1.5mM MgCl2、50mM NaCl，62℃。其他示例性的核苷酸合成條件是16.6mM硫酸銨、67mM Tris pH＝8.8、6.7mM MgCl2、10mM 2-巰基乙醇，60℃。本領(lǐng)域的技術(shù)人員通曉影響雜交的參數(shù)，例如溫度、探針或引物長度和組成、緩沖液組成和pH、以及鹽濃度，可以很容易調(diào)整這些參數(shù)以實現(xiàn)核酸與靶序列的特異性雜交。
如本文所使用的互補性堿基配對指Watson-Crick堿基配對(例如DNA中的G-C和A-T，和RNA中的G-C和A-U)，或者當使用非天然或不典型核苷酸時其等同物。兩條互補的核酸鏈含有互補的堿基配對。在一些具體實施方式
中，探針可含有通用或半通用堿基或者其他組分，其可以通過堿基配對或其他方式與一個或多個核苷酸堿基相互作用；在這種情況下，盡管含有一些非典型的G-C或A-T的堿基配對，探針仍然可以是互補的。當探針或引物與靶核酸分子雜交時，如果出現(xiàn)錯配例如G-T、G-A、C-T或C-A，則探針不是互補性的。
如本文所使用的，“基本上”互補的指引物是充分互補的，以與含有需要的序列的靶核酸分子在核酸合成條件下雜交。引物應(yīng)該具有充分的互補性，以與需要的靶核酸分子雜交，并使靶核酸分子擴增。例如，在本文披露的方法中所用的引物可與需要的待擴增靶核酸分子100％互補。在另一個實例中，只要引物可用來擴增至少一個待擴增的靶核酸分子，則引物可以有1、2、3或更多個錯配。例如，靶核酸分子可在引物雜交區(qū)含有3個胞嘧啶核苷酸；當3個C核苷酸中僅有一個被甲基化時，用重亞硫酸鹽處理可以將2個未甲基化C核苷酸轉(zhuǎn)化為U核苷酸，而與含有3個C核苷酸的靶核酸分子100％互補的引物仍然可以雜交到僅含有一個C核苷酸的靶核酸分子上，從而僅含有一個C核苷酸的靶核酸分子仍然可以被擴增。
如本文所使用的“核酸”指的是多聚核苷酸例如脫氧核糖核酸(DNA)以及核糖核酸(RNA)。術(shù)語還包括作為等同物的從核苷酸類似物制得的RNA或DNA的衍生物、變異體和類似物以及單鏈(正義或反義)和雙鏈多聚核苷酸，包括PNA(肽核酸)。脫氧核糖核苷酸包括脫氧腺苷、脫氧胞苷、脫氧鳥苷以及脫氧胸苷。對于RNA，尿核苷的堿基部分是尿嘧啶。
如本文所使用的“檢測”核酸分子或其片段指的是確定存在核酸分子，典型的當核酸分子或其片段已經(jīng)從樣品或混合物的其他組分中完全或部分分離時，并且還可以包括確定核酸分子或其片段的荷質(zhì)比、質(zhì)量、數(shù)量、吸光度、熒光或其他性質(zhì)。
如本文所使用的“質(zhì)譜分析法”包括任何本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的合適的質(zhì)譜分析形式。這些形式包括但不限于基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF)、電噴霧(ES)、IR-MALDI(參見，例如99/57318號國際PCT公開申請和美國專利5,118,937)、離子回旋共振質(zhì)譜儀(ICR)、傅立葉變換及其組合。MALDI，特別是UV和IR，屬于本領(lǐng)域中的已知形式。
如本文所使用的習語“質(zhì)譜分析”指原子、分子或分子片段荷質(zhì)比的確定。
如本文所使用的質(zhì)譜指利用質(zhì)譜分析生物多聚體或其片段，得到的數(shù)據(jù)以圖解或數(shù)字編碼或其他方式演示出來。
如本文所使用的，與光譜或光譜分析的相關(guān)的圖案指信號、峰值或其數(shù)字圖表的特征性分布及數(shù)量。
如本文所使用的，在質(zhì)譜及其分析的上下文中的信號、峰值或者測定指的是輸出數(shù)據(jù)，其可以反映原子、分子或分子片段的荷質(zhì)比，并且還可以反映存在的原子、分子或其片段的數(shù)量。荷質(zhì)比可以用來確定原子、分子或分子片段的質(zhì)量，并且數(shù)量可用于定量或半定量方法。例如，在一些具體實施方式
中，信號峰值或測定可以反映具有特定荷質(zhì)比的分子的數(shù)量或相對數(shù)量。信號或峰值包括輸出數(shù)據(jù)的視覺、圖表和數(shù)字表示。
如本文所使用的強度，當涉及測定的質(zhì)量時，指的是與其他樣品或混合物組分相比，存在于樣品或混合物中的被分析物的相對量的反映。例如，第一質(zhì)譜峰值或信號的強度可以相對于質(zhì)譜的第二峰值而報道，或者相對于所有峰值強度之和而報道。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以認識用來報道峰值相對強度的多種方式。強度可以表示為峰高、半峰高時的峰寬、峰下面積、信噪比或者其他本領(lǐng)域中已知的表示法。
如本文所使用的“比較測定的質(zhì)量或質(zhì)量峰值“指的是相對于一個或多個樣品或參考質(zhì)量峰值分析一個或多個測定的樣品質(zhì)量峰值。例如，測定的樣品質(zhì)量峰值可以通過與推算出的質(zhì)量峰值模式進行比較，并且可確定測定的質(zhì)量峰值與推算出的質(zhì)量峰值之間的任何交迭，以鑒定樣品質(zhì)量或分子。參考質(zhì)量峰值是參考原子、分子或分子片段質(zhì)量的圖解。
如本文所使用的參考質(zhì)量是測定的樣品質(zhì)量可與之比較的質(zhì)量。樣品質(zhì)量與參考質(zhì)量之間的比較可以鑒定樣品質(zhì)量與參考質(zhì)量相同還是不同。這種參考質(zhì)量可以推算得出，可以存在于數(shù)據(jù)庫中，或可以通過實驗確定。推算出的參考質(zhì)量可以基于核酸的預(yù)測質(zhì)量。例如，推算出的參考質(zhì)量可以基于已知或預(yù)測序列或者已知或預(yù)測甲基化狀態(tài)的靶核酸分子的預(yù)測斷裂模式。實驗來源的參考質(zhì)量可以源自任何核酸樣品的測定質(zhì)量。例如，實驗來源的質(zhì)量可以是在用甲基化特異性的試劑處理的靶核酸分子、擴增處理后的靶核酸分子以及堿基特異性切割擴增產(chǎn)物后的質(zhì)量。參考質(zhì)量的數(shù)據(jù)庫可以包括一個或多個參考質(zhì)量，其中參考質(zhì)量可以推算出或?qū)嶒灤_定；數(shù)據(jù)庫可以包含相應(yīng)于推算出或?qū)嶒灤_定的靶核酸分子的斷裂模式的參考質(zhì)量；數(shù)據(jù)庫可以包含相應(yīng)于推算出或?qū)嶒灤_定的兩個或多個靶核酸分子的斷裂模式的參考質(zhì)量。
如本文所使用的“參考核酸分子“指已知為甲基化或未甲基化的核酸分子，或者核酸分子的一個或多個核苷酸基因座的甲基化狀態(tài)已知的核酸分子。參考核酸分子可以用來推算或者實驗推導參考質(zhì)量。用來推算參考質(zhì)量的參考核酸分子通常是序列已知且含有已知甲基化核苷酸基因座的核酸。用來實驗推導參考質(zhì)量的參考核酸分子可以含有但不必須含有已知序列或已知甲基化核苷酸基因座；即使當參考核酸不含有已知序列時，諸如本文所披露的方法或者本領(lǐng)域已知的其他方式可以用來鑒定參考核酸分子為甲基化的。
如本文所使用的，在一個或多個樣品質(zhì)量(或一個或多個樣品質(zhì)量峰值特征)和一個或多個參考質(zhì)量(或一個或多個參考質(zhì)量峰值特征)以及其語法變體之間的“相關(guān)”指在一個或多個樣品質(zhì)量(或一個或多個樣品質(zhì)量峰值特征)和一個或多個參考質(zhì)量(或一個或多個參考質(zhì)量峰值特征)之間的比較，其中質(zhì)量相似性的提高表示樣品靶核酸分子的質(zhì)量性質(zhì)，例如樣品靶核酸分子的甲基化與參考核酸的質(zhì)量性質(zhì)例如甲基化相同的可能性提高。這種相關(guān)可以用來鑒定靶核酸分子，例如鑒定其為甲基化的、鑒定靶核酸分子中甲基化核苷酸的數(shù)量、鑒定一個或多個核苷酸基因座的甲基化狀態(tài)、或者鑒定一個或多個核苷酸基因座是甲基化的。
如本文所使用的靶核酸分子與參考物之間的相關(guān)性，包括靶核酸分子中的核苷酸基因座和參考物中核苷酸基因座之間的相關(guān)性，其指靶核酸分子或參考物的核苷酸基因座與的相似性或同一性，以便預(yù)期靶核酸分子和參考物含有甲基化狀態(tài)相同的至少一個未確定基因座。例如，當靶核酸分子少于所有核苷酸基因座的甲基化狀態(tài)已經(jīng)鑒定時，并且當在參考核酸和靶核酸之間存在相關(guān)性時，則可以預(yù)期靶核酸分子的一個或多個未鑒定基因座具有與參考物中相應(yīng)的核苷酸基因座相同的甲基化狀態(tài)。在另一個實例中，當在參考核酸與靶核酸之間存在相關(guān)性時，位于引物雜交區(qū)的靶核酸分子的一個或多個基因座可以預(yù)期具有與參考物中相應(yīng)的核苷酸基因座的相同的甲基化狀態(tài)。缺乏這種相關(guān)性可以指相關(guān)性不足以用來提供靶核酸分子中未確定甲基化狀態(tài)的期望值，或者可以指反相關(guān)，其中靶核酸分子中的甲基化狀態(tài)預(yù)期與參考物中的甲基化狀態(tài)相反(即未甲基化或甲基化)。
如本文所使用的“分析”指確定單個寡核苷酸或寡核苷酸混合物的具體性質(zhì)。這些性質(zhì)包括但不限于寡核苷酸或寡核苷酸混合物的核苷酸組成以及完整序列、寡核苷酸中存在的一個或多個甲基化核苷酸、寡核苷酸的質(zhì)量和長度以及存在樣品分子內(nèi)的分子或序列。
如本文所使用的“多重”、“多重反應(yīng)”或其語法變異體指在單一反應(yīng)中或在單一質(zhì)譜分析或其他質(zhì)量測定(例如單一質(zhì)譜)中，同時評估或分析一個以上的分子，例如生物分子(如寡核苷酸分子)。
如本文所使用的“收集”指從兩個或多個來源混合樣品。這種收集可以是，例如混合來自相同生物體的細胞的核酸樣品、混合來自同一物種不同生物體的核酸樣品或者混合來自不同物種的核酸樣品。
如本文所使用的“核酸合成”指化學或生物化學反應(yīng)，其中在一個核苷酸和另一個核苷酸或寡核苷酸之間形成磷酸二酯鍵。核酸合成可以包括酶反應(yīng)例如DNA復制反應(yīng)如PCR或轉(zhuǎn)錄或者化學反應(yīng)例如固相合成。核酸合成條件指含核酸分子溶液的條件，其中可能形成核苷酸磷酸二酯鍵。例如，靶核酸分子可以與引物接觸，并且可以在核酸合成反應(yīng)下處理，其可以包括例如PCR或轉(zhuǎn)錄條件，以及當引物雜交到靶核酸分子上時，核苷酸可以在引物上合成，即核苷酸可以通過磷酸二酯鍵連接到引物3′末端而實現(xiàn)酶促加成；然而，當引物不雜交到靶核酸分子上，可能沒有核苷酸在引物上合成。
如本文所使用的“擴增”指增加生物聚合物尤其是核酸的量。擴增包括形成附加的生物聚合物的一個或多個步驟，例如，1個或多個PCR循環(huán)。根據(jù)選擇的5’和3’引物，擴增還可以用來限制并確定進行分析的核酸的區(qū)域?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的任何途徑進行擴增，包括使用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、轉(zhuǎn)錄以及其他這種方法。例如當要確定甲基化核苷酸的頻率時，例如PCR的擴增可以定量實施。
如本文所使用的“特異性擴增”指根據(jù)生物聚合物的一種或多種性質(zhì)來增加具體生物聚合物的量。例如，根據(jù)核酸的核苷酸序列或者根據(jù)核酸一部分的核苷酸序列，核酸可以特異性擴增。根據(jù)核酸序列的一部分的核酸特異性擴增的實例是利用諸如PCR的核酸擴增，其中利用一個或兩個引物特異性雜交到核酸的一個或兩個區(qū)域。典型的，特異性擴增包括靶核酸分子的核酸合成，其中引物完全互補的與靶核酸分子中的核酸序列雜交。在特異性擴增反應(yīng)中，一些引物可以非計劃的雜交到核苷酸序列上，所述引物與該序列部分錯配，導致非計劃或假陽性擴增產(chǎn)物。本文提供的方法可以用來區(qū)分真正特異性擴增產(chǎn)物和假陽性產(chǎn)物。
如本文所使用的“引物”是多聚核苷酸例如含有3’羥基的DNA或RNA。引物可以用作例如在3’羥基上形成磷酸酯鍵或磷酸二酯鍵的前體，通過如核苷酸合成反應(yīng)諸如轉(zhuǎn)錄或DNA復制。引物可雜交到模板核酸上，于是酶可以催化一個或多個核苷酸加成到引物3’末端。
如本文所使用的“甲基化特異性引物”或“甲基化狀態(tài)特異性引物”指根據(jù)靶核酸分子的甲基化狀態(tài)，可與靶核酸分子或經(jīng)甲基化特異性試劑處理的靶核酸分子特異性雜交的引物。例如，靶核酸分子可以用作為靶核酸分子甲基化狀態(tài)的函數(shù)的甲基化特異性試劑處理，導致靶核酸分子核苷酸序列的改變；并且甲基化狀態(tài)特異性引物可以特異性雜交到處理過的甲基化靶核酸分子上，而不與處理過的未甲基化靶核酸分子雜交，或不與處理過的、差異的甲基化靶核酸分子雜交。在另一個實例中，靶核酸分子可以用甲基化特異性試劑作為靶核酸分子甲基化狀態(tài)的函數(shù)處理，引起所述靶核酸分子核苷酸序列的改變；并且甲基化狀態(tài)特異性引物可以特異性雜交到處理過的未甲基化靶核酸分子上，而不與處理過的甲基化靶核酸分子雜交，或不與處理過的、差異的未甲基化靶核酸分子雜交。在其他實例中，甲基化特異性引物不但始終僅與完全互補序列雜交，而且非計劃的結(jié)合到至少部分與甲基化狀態(tài)特異性引物錯配的核苷酸序列上。盡管這種低效錯配雜交可以引起未甲基化特異性擴增，本文提供的方法可以用來區(qū)分來自于完全互補雜交的擴增產(chǎn)物和來自錯配雜交的擴增產(chǎn)物。雜交到靶核酸分子上的甲基化特異性引物然后可作為用于隨后核苷酸合成反應(yīng)例如PCR的引物。
如本文所使用的“擴增阻滯劑”或“核苷酸合成阻滯劑”指化合物特別是寡核苷酸，能結(jié)合核酸分子上的核苷酸序列并降低或抑制酶催化核苷酸合成的能力，例如DNA或RNA聚合酶。在一個實例中，擴增阻滯劑結(jié)合到核苷酸序列上，同時酶喪失催化核苷酸合成的能力。在另一個實例中，擴增阻滯劑可以與引物競爭，結(jié)合到核酸分子上核苷酸合成起始的核苷酸序列上。典型的，擴增阻滯劑是寡核苷酸，其中這種封閉性寡核苷酸不含有3’羥基，因此在核酸合成期間，附加的核苷酸不能加入到擴增阻滯劑上。
如本文所使用的“抑制核苷酸合成”指的是降低合成的核酸分子的量，而該核酸分子由來自于樣品或混合物中的全部或選定亞群的核酸分子而生成。核苷酸合成可以通過例如降低引物與核苷酸序列雜交的能力或者通過物理性阻斷核酸聚合酶的持續(xù)途徑而被抑制。典型的，對于不含有所需要的序列的核酸分子，例如盡管與甲基化特異性引物部分錯配但可能以其他方式擴增的某些核酸分子，其核酸合成被抑制。
如本文所使用的，核酸分子的檢測區(qū)指的是待分析核苷酸序列的核酸分子區(qū)域。核酸分子的引物檢測區(qū)指的是核酸分子的某些區(qū)域，其核苷酸序列待分析以確定引物是否雜交到核酸分子的該區(qū)域。例如，在核酸合成條件下，當引物檢測區(qū)與引物互補時，甲基化特異性引物可以在引物檢測區(qū)特異性雜交到靶核酸分子上。類似的，靶核酸分子的非引物檢測區(qū)是核酸分子中甲基化特異性引物不與其特異性雜交的區(qū)域。典型的，靶核酸分子的非引物檢測區(qū)是不與引物檢測區(qū)互相交迭的核苷酸區(qū)域，例如，位于兩個引物雜交位點之間的區(qū)域，包括位于靶核酸分子的兩個引物檢測區(qū)之間的核苷酸區(qū)域。靶核酸分子的未甲基化特異性引物檢測區(qū)通常是不與甲基化特異性引物檢測區(qū)相互交迭的核苷酸區(qū)域，盡管當引物不是甲基化特異性引物時，其可以與引物雜交區(qū)交迭。
如本文所使用的，預(yù)先確定區(qū)指含有確定核苷酸序列的核酸分子的區(qū)域。例如，可以生成具有已知的具體核苷酸序列的引物。與這種引物完全互補性雜交的靶核酸分子區(qū)域可以根據(jù)引物已知的特定核苷酸序列來確定。因此，預(yù)先確定區(qū)可以是與這樣的引物完全互補性雜交的核酸分子的區(qū)域。
如本文所使用的，第一區(qū)域與第二區(qū)域不相互交迭指的是不包含任何相同核苷酸基因座的核酸分子的一部分。例如，不與引物雜交區(qū)交迭的第一區(qū)域是不含有任何與引物雜交的核苷酸基因座的第一區(qū)域。
如本文所使用的，擴增產(chǎn)物是利用靶核酸分子作為模板的核苷酸合成反應(yīng)的任何產(chǎn)物。因此，與處理過的靶核酸分子互補并在第一擴增步驟中形成的單鏈核酸分子是擴增產(chǎn)物。另外，隨后核苷酸合成反應(yīng)的產(chǎn)物為擴增產(chǎn)物，其含有與處理過的靶核酸分子或其互補物相同序列，。擴增產(chǎn)物可以是單鏈核酸分子或雙鏈核酸分子。
如本文所使用的“斷裂”或“切割”指核酸分子例如靶核酸分子或其擴增產(chǎn)物斷裂成兩個或多個較小核酸分子的步驟或條件。這種斷裂或切割可以是序列特異性、堿基特異性或者非特異性，且可以通過各種方法、試劑或條件包括例如化學斷裂、酶促斷裂、物理斷裂來完成。
如本文所使用的，斷裂條件指化學、酶促或物理條件，在所述條件下，可以但不是必需實現(xiàn)核酸分子的斷裂或切割。切割條件或切割反應(yīng)條件可以包括一個或多個用于實施實際或模擬切割反應(yīng)的切割試劑；并且反應(yīng)的其他參數(shù)包括但不限于時間、溫度、pH值、或者緩沖液或粒子的選擇。例如，斷裂條件可以指含有序列特異性內(nèi)切核酸酶的緩沖液，其中含有可識別序列的核酸分子被切割，而不含有識別序列的核酸分子則不被切割。
如本文所使用的，切割試劑是任何可以引起核酸分子切割的試劑，包括，例如核酸酶和可切割核酸分子的化學試劑如強堿。
如本文所使用的，“片段”、“切割產(chǎn)物”、“被切割的產(chǎn)物”或其語法變異體，指的是來自于靶核酸分子或其擴增產(chǎn)物的斷裂或切割的核酸分子產(chǎn)物。盡管這種片段或被切割的產(chǎn)物可以指所有來自切割反應(yīng)的核酸分子，典型的這種片段或被切割的產(chǎn)物僅指來自于靶核酸分子的片段或切斷或其擴增產(chǎn)物中含有靶核酸分子相應(yīng)核苷酸序列的一部分的核酸分子產(chǎn)物。例如，在本發(fā)明方法的范圍內(nèi)，擴增產(chǎn)物的化合物和混合物可以比靶核酸分子序列的被擴增核苷酸區(qū)域多含有一個或多個核苷酸(例如除了含有與靶核酸分子互補的核苷酸之外，引物可以含有“額外的”核苷酸例如轉(zhuǎn)錄起始序列，得到的擴增產(chǎn)物含有“額外的”核苷酸或者與靶核酸分子的被擴增核苷酸區(qū)域不相對應(yīng)的核苷酸)。在這種實例中，對應(yīng)于非源自靶核酸分子的核苷酸的片段或被切割的產(chǎn)物，典型的將不能提供有個靶核酸分子中甲基化的任何信息。因此，本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理解，在本文提供的方法中，用來提供甲基化信息的被擴增產(chǎn)物的片段是含有一個或多個起源靶核酸分子的核苷酸的片段，而非含有僅起源于不同于靶核酸分子中的序列的核苷酸的片段。因此，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解，起源于本文中提供的方法、化合物和混合物的片段包括來源于被擴增核酸分子的一部分的片段，其至少部分含有來自于靶核酸分子或基本的或代表性的靶核酸分子的核苷酸序列信息。
如本文所使用的，堿基特異性切割指的是在具體堿基位點上(例如RNA中A、C、U或G或DNA中A、C、T或G)的核酸選擇性切割或者具體堿基類型(例如嘌呤或嘧啶)的選擇性切割。例如，C特異性切割指核酸中每個C核苷酸位置的核酸的切割。
如本文所使用的，在核酸切割的上下文中，習語“非特異性切割”指的是在任意位置靶核酸分子的切割，從而可以隨機產(chǎn)生大小和核苷酸序列不同的多種被切割產(chǎn)物。如本文所使用的，在任意位置的切割，不要求絕對的算術(shù)隨機化，而是僅替代在切割中缺乏基于序列的優(yōu)先性。例如，通過發(fā)光或剪切方式的切割可以在幾乎任何位置切割DNA；然而，這種方法可以導致在某些位置的切割頻率稍高于其他位置。然而，對于本發(fā)明的目的，在僅有輕微序列優(yōu)先性的幾乎所有位置的切割仍然是隨機的。利用本文描述的方法非特異性切割可以導致相互交迭的核苷酸片段的產(chǎn)生。
如本文所使用的術(shù)語“完全切割”或“全部切割”指的是在一個切割反應(yīng)中，通過具體切割試劑識別的所有切割位點均被切割完全。
如本文所使用的術(shù)語“部分切割”、“部分斷裂”或“不完全切割”或其語法變異體，指的是在一個反應(yīng)中，用于具體切割試劑的相關(guān)切割位點僅有一部分真正被切割試劑切割。部分切割可以指具體基因座全部切割，但在相同靶核酸分子的一個或多個其它基因座未達到完全切割；或者部分切割可以指在一個或多個基因座上的部分而不是全部靶核酸分子的切割。切割試劑可以是但不限于，酶、化學切割試劑或者機械或物理力量。如在本文闡明的，用于實現(xiàn)部分切割的示例性方法是產(chǎn)生生物分子，并且在其產(chǎn)生期間包括可切割或不可切割的核苷酸或氨基酸，從而即使當切割反應(yīng)進行完全時，具體切割位點含有非可切割的核苷酸或氨基酸。這使得所得的靶生物分子部分的被切割。例如，如果未切割的靶生物分子含有4個可能的切割位點，那么由部分切割所得的產(chǎn)物混合物可以含有靶生物分子片段的任何組合在第一、第二、第三、第四個切割位點的單一切割；2個切割位點的任何一個或多個組合上的雙重切割；或3個切割位點的任何一個或多個組合的三重切割； 如本文所使用的，未切割的切割位點指用于切割試劑的已知識別位點，但在反應(yīng)條件下未被切割試劑切割的切割位點，所述條件例如時間、溫度或者在切割識別位點上修飾堿基以避免被試劑切割。
如本文所使用的，互補性切割反應(yīng)指的是利用不同切割試劑或通過改變所述同一切割試劑的切割特異性在同一個靶或參考核酸或蛋白上實施或模擬的切割反應(yīng)，從而即可產(chǎn)生相同靶或參考核酸或蛋白的交替的切割模式。
如本文所使用的習語“相互交迭的片段”指的是具有一個或多個來自天然靶核酸分子的共有核苷酸基因座的片段。
如本文所使用的習語“大小的統(tǒng)計學范圍”指的是利用本領(lǐng)域中已知的或本文披露的切割方法用于產(chǎn)生的多數(shù)片段的尺寸范圍，以便某些片段可能顯著小于或大于具體尺寸范圍內(nèi)的大多數(shù)其他片段。這種片段尺寸的統(tǒng)計學范圍的實例是泊松分布。例如，12～30個堿基的統(tǒng)計學尺寸范圍還可以包括一些小至1個核苷酸或大至300個或更多個核苷酸的寡核苷酸，但是這些具體尺寸在統(tǒng)計上出現(xiàn)相對罕見。在一些具體實施方式
中，不存在片段統(tǒng)計學范圍的限制。在其他具體實施方式
中，片段的統(tǒng)計學范圍可以指定一個范圍，使得10％的片段在指定的尺寸范圍內(nèi)、其中20％的片段在指定的尺寸范圍內(nèi)、30％的片段在指定的尺寸范圍內(nèi)、40％的片段在指定的尺寸范圍內(nèi)、50％的片段在指定的尺寸范圍內(nèi)、60％的片段在指定的尺寸范圍內(nèi)、70％的片段在指定的尺寸范圍內(nèi)、80％的片段在指定的尺寸范圍內(nèi)、90％的片段在指定的尺寸范圍內(nèi)、95％的片段在指定的尺寸范圍內(nèi)。
如本文所使用的基質(zhì)或支持粒子指的是以分散粒子形式存在的支持物質(zhì)。粒子具有任何形狀和尺寸，但典型的具有的尺寸至少為100mm或更小、50mm或更小、10mm或更小、1mm或更小、100μm或更小、50μm或更小、10μm或更小、5μm或更小、1μm或更小、0.5μm或更小，并且且典型的體積為100mm3或更小、50mm3或更小、10mm3或更小、1mm3或更小、100μm3或更小以及立方毫米的等級；典型的粒子的直徑為大于約1.5微米并且小于約15微米，例如約4～6微米。這種微粒統(tǒng)稱為“珠子(beads)”。
如本文所使用的“底物”指的是不溶性支持物，可以提供一個表面，在表面上面或其上方可以進行反應(yīng)，和/或可以在可鑒定基因座上保持反應(yīng)產(chǎn)物。支持物可以從幾乎任何不溶性或固態(tài)物質(zhì)制作，例如硅膠、玻璃(如可控孔徑玻璃(CPG))、尼龍、王水樹脂、Merrifield樹脂、葡聚糖凝膠、瓊脂糖、纖維素、金屬表面(例如鋼、金、銀、鋁、硅和銅)、塑性材料(例如聚乙烯、聚丙二醇、聚酰胺、聚酯、聚偏氟乙烯(PVDF))。示例性的底物包括但不限于平面支持物例如玻璃纖維過濾器、玻璃表面、金屬表面(鋼、金、銀、鋁、銅和硅)以及塑性材料。固態(tài)支持物可以是任何適于爬在cartridge base上的形狀，包括但不限于板、膜、晶圓片、帶有凹陷的晶圓片、多孔三維底物以及為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他幾何形狀和構(gòu)型。示例性的支持物是設(shè)計用來在分散的基因座上接收或連接樣品的平面支持物，例如帶有疏水區(qū)環(huán)繞的親水區(qū)的平面支持物，用于接收、容納或結(jié)合樣品。
如本文所使用的“非特異性RNase”指的是無需考慮切割位點上存在的核苷酸序列而切割RNA分子的酶。示例性的非特異性RNase是RNaseI。
如本文所使用的“非特異性DNase”指的是無需考慮切割位點上存在的核苷酸序列而切割DNA分子的酶，示例性的非特異性DNase是DNaseI。
如本文所使用的術(shù)語“單堿基切割酶”指的是可以識別并切割具體堿基(例如DNA的A、C、T或G；RNA的A、C、U或G)或者具體類型的堿基(例如嘌呤或嘧啶)的限制性酶。
如本文所使用的術(shù)語“1-1/4-切割酶”指的是可以識別并切割核酸中2堿基鏈的限制性酶，其中一個堿基位置的身份(identity)固定而另一個堿基位置的身份是四個典型出現(xiàn)堿基中任何三個。
如本文所使用的術(shù)語“1-1/2-切割酶”指的是可以識別并切割核酸中2堿基鏈的限制性酶，其中一個堿基位置的身份固定而另一個堿基位置的身份是四個典型堿基中任何兩個。
如本文所使用的術(shù)語“雙堿基切割酶”或“2切割酶”指的是可以識別并切割長度為2堿基的具體核酸位點。
如本文所使用的術(shù)語“一組質(zhì)量信號”或“質(zhì)量峰值模式”指的是適合核酸分子中兩個或多個核酸片段的每一個的兩個或多個質(zhì)量測定值?！百|(zhì)量模式”指的是對應(yīng)于核酸分子的兩個或多個核酸片段的兩個或多個質(zhì)量。
如本文所使用的評分或分數(shù)指的是推算具體甲基化核苷酸或序列候選物真正存在于靶核酸分子或蛋白序列中的概率。分數(shù)的值用來確定對應(yīng)于實際靶序列的甲基化核苷酸或序列候選物。通常，在一組靶序列樣品中，最高分數(shù)代表在靶分子中最可能的甲基化核苷酸或序列，但是可以使用其他篩選原則，例如當存在單個靶序列時，檢測陽性分數(shù)。
如本文所使用的，模擬指的是根據(jù)核酸中甲基化核苷酸的核苷酸序列和定位以及核酸中用于特定的特異性切割試劑的預(yù)測切割位點的推算。斷裂模式可以模擬為數(shù)字表格(例如，對應(yīng)于參考生物分子片段質(zhì)量的質(zhì)量列表)、質(zhì)譜、凝膠上的條帶模式、或任何測定質(zhì)量分布的技術(shù)的圖解。在大多數(shù)情況下，模擬可以通過推算機程序進行。
如本文所使用的，模擬切割指的是一個虛擬過程，其中靶分子或參考分子實際上被切割。
如本文所使用的，虛擬指的是利用計算機進行的研究和實驗。虛擬方法包括但不限于分子模型研究、生物分子對接實驗、以及分子結(jié)構(gòu)和/或過程的實際演示例如分子的相互作用。
如本文所使用的受試者包括但不限于動物、植物、細菌、病毒、寄生蟲以及任何其他具有核酸的生物體或?qū)嶓w。哺乳動物屬于受試者，包括靈長類比如人類。
如本文所使用的，疾病治療方案指的是處理疾病采取的步驟，包括例如行為矯正、手術(shù)或藥物。治療包括改善或消除疾病癥狀或疾病的方案。
如本文所使用的，當涉及核酸分子或樣品來源時例如個體或一組個體，正常值指的是不按照任何具體標準篩選的核酸分子或樣品來源，并且典型的指核酸分子的一般核苷酸序列或者樣品來源(例如一個或多個健康受試者或一個或多個未診斷疾病的受試者)的健康狀況。例如，具體核苷酸基因座的正常甲基化狀態(tài)可以是核苷酸基因座的野生型甲基化狀態(tài)。在另一個實例中，一組正常受試者可以是一組不具有具體表現(xiàn)型(例如疾病)的受試者。
如本文所使用的，表現(xiàn)型指的是包括任何可區(qū)分的生物體特征的一組參數(shù)。表現(xiàn)型可以為體部特征，并且在受試者是動物的情況下，表現(xiàn)型可以為心理特征例如情緒特征。
如本文所使用的，與疾病、疾病結(jié)果或治療方案結(jié)果相關(guān)的甲基化或甲基化狀態(tài)指的是相對于正常受試者的核酸區(qū)域或核苷酸基因座的甲基化狀態(tài)，在已知疾病、疾病結(jié)果或治療方案結(jié)果的受試者的核酸區(qū)域或核苷酸基因座的甲基化狀態(tài)存在更頻繁或缺失更頻繁。
如本文所使用的，等位基因指的是發(fā)生于基因基因座上的兩個或多個核苷酸變異中的任何一個的特定變異。例如，等位基因可以為一個或多個核苷酸的缺失、SNP或者多個核苷酸的突變、多個微衛(wèi)星中大量重復中的任何一個或者雜合性缺失。已知的等位基因是已經(jīng)按照本領(lǐng)域技術(shù)人員所應(yīng)用的方法進行表征的等位基因。
如本文所使用的，等位基因缺乏的核酸分子或基因座是不含有具體等位基因(例如具體數(shù)量的微衛(wèi)星重復)的核酸分子或基因座，但是在該基因座可以含有任何其他等位基因變異。
如本文所使用的，等位基因頻率是人群中含有具體等位基因的基因座的分數(shù)或百分比，其中人群可以為任何組別包括例如正?；蚬灿孟嗨票憩F(xiàn)型的多個個體。
如本文所使用的，與等位基因相關(guān)的甲基化狀態(tài)是一種甲基化狀態(tài)，其中在同一個核酸分子中觀察到甲基化的存在或缺失和等位基因的存在比不相關(guān)甲基化狀態(tài)/等位基因配對時其他預(yù)期狀態(tài)要更加頻繁。
如本文所使用的，與疾病、疾病結(jié)果或治療方案結(jié)果相關(guān)的甲基化狀態(tài)是一種甲基化狀態(tài)，其中在同一個體中核酸分子中觀察到甲基化的存在或缺失和疾病、疾病結(jié)果或治療方案結(jié)果比在一群較大個體(例如，所有個體的人群)中存在的其他方式要更加頻繁。
如本文所使用的，“分配”指的是確定核酸片段的位置表示具體分子量以及具體末端核苷酸。
如本文所使用的，“一個”指的是一個或多個。
如本文所使用的，“多個”指的是兩個或多個核苷酸，其中每個均具有不同序列或甲基化狀態(tài)。這種差異可能是由于多聚核苷酸中天然存在的變異例如多聚核苷酸中的差異甲基化，或者可能由于引入不同多聚核苷酸的特定修飾，例如用甲基化特異性試劑處理后形成的特定核苷酸差異整合入每個多聚核苷酸中。
如本文所使用的，“模糊分配”指的是對應(yīng)于靶核酸分子中的特定序列變異或甲基化狀態(tài)的峰值或信號的獨特分配，以及如果分子數(shù)量被復合，特定序列變異或甲基化狀態(tài)代表的峰值可以獨特地分配給每個分子。
如本文所使用的，數(shù)據(jù)處理程序指的是一個過程，可以在軟件中具體實施，并確定所獲得數(shù)據(jù)(即，分析的最終結(jié)果)的生物學顯著性。例如，數(shù)據(jù)處理程序可以根據(jù)收集的數(shù)據(jù)確定基因型。在本文的系統(tǒng)和方法中，數(shù)據(jù)處理程序還可以控制儀器和/或基于結(jié)果確定的數(shù)據(jù)收集程序。數(shù)據(jù)處理程序和數(shù)據(jù)收集程序可以合并，并通過儀器提供反饋以處理獲得數(shù)據(jù)，從而提供基于分析的判斷方法。
如本文所使用的，多個基因或多個靶核酸分子包括至少2、5、10、25、50、100、250、500、1000、2,500、5,000、10,000、100,000、1,000,000個或更多個基因或靶核酸分子。多個基因或靶核酸分子可以包括一個生物體或甚至多個生物體的完整或部分基因組。選擇生物體類型就確定了基因或靶核酸分子所選自的基因組。用于選擇基因或靶核酸分子的示例性生物體包括動物如哺乳動物，后者包括人類和嚙齒類如小鼠、昆蟲、酵母、細菌、寄生蟲和植物。
如本文所使用的“樣品”指的是含有待檢測物質(zhì)的混合物。樣品包括“生物樣品”，其指獲自有生命的來源的任何物質(zhì)，例如，動物諸如人類或其他哺乳動物、植物、細菌、真菌、原生生物或病毒或者處理過的形式例如被擴增或被提取的物質(zhì)。生物樣品可以為任何形式，包括固態(tài)物質(zhì)例如組織、細胞、細胞團、細胞提取物或活檢，或者生物流體例如尿液、血液、組織間液、腹膜液、血漿、淋巴液、腹水、汗液、唾液、濾泡液、乳汁、非乳汁乳腺分泌物、血清、腦脊液、糞便、精液、肺部痰液、羊膜液、感染或炎癥區(qū)的滲出物、含有頰細胞的漱口液、滑膜液或者由受試者產(chǎn)生的任何其他液態(tài)樣品。另外，樣品可以為組織或器官的固態(tài)樣品，例如采集的組織包括骨髓、上皮、胃、前列腺、腎、膀胱、乳腺、結(jié)腸、肺、胰腺、子宮內(nèi)膜、神經(jīng)元、肌肉以及其他組織。樣品可以包括器官以及病理樣品例如福爾馬林固定石蠟包埋的樣品。如需要，固態(tài)物質(zhì)可以與液體混合或純化或擴增或以其他方式處理。采用本文描述的方法進行分析的樣品可以在一個或多個純化步驟中處理，以提高樣品中所需細胞或核酸的純度，樣品也可以無需任何提高所需細胞或核酸純度的純化步驟，而采用本文中描述的方法進行分析。尤其是，本文的樣品包括用于質(zhì)譜分析的基質(zhì)混合物以及生物聚合物例如核酸。
如本文所用的，衍生于另一個樣品的樣品指的是已經(jīng)被加工過的樣品，例如核酸分子的純化或提取和/或擴增。
如本文所用的混合物指的是任何混合物，其可以為溶液、懸浮液、流體、粉末、糊劑、水相、非水相或其組合。
如本文所用的組合物指的是兩個成分之間或多個成分之間的任何聯(lián)合。
如本文所用的術(shù)語“假陽性”指的是高于背景噪聲的結(jié)果，但并非由于預(yù)期事件或序列或甲基化狀態(tài)而產(chǎn)生。例如，當出現(xiàn)錯配雜交時、或通過除了核酸的特異性切割過程而形成的片段時或當甲基化特異性試劑的處理不完全(即，并非所有可以被試劑轉(zhuǎn)化的核苷酸實際上均被轉(zhuǎn)化了)時，可以出現(xiàn)假陽性。
如本文所用的術(shù)語“真陽性”指的是高于背景噪聲的結(jié)果，并且由預(yù)期的事件或序列或甲基化狀態(tài)產(chǎn)生。例如，當發(fā)生完全互補雜交時，或當通過核酸的特異性切斷而形成斷裂時，或當甲基化特異性試劑的處理不完全(即，所有可以被試劑轉(zhuǎn)化的核苷酸實際上均被轉(zhuǎn)化了)時，可以出現(xiàn)假陽性。
如本文所用的術(shù)語“假陰性”指的是在實際測定中缺失、但另外被預(yù)期的真實信號。例如，當實際質(zhì)譜中不存在但在相應(yīng)的模擬質(zhì)譜中經(jīng)推算出現(xiàn)質(zhì)量信號時，可以出現(xiàn)假陰性。
如本文所用的“不完全轉(zhuǎn)化”及其語法變異體指的是作為核酸分子甲基化狀態(tài)的函數(shù)而修飾核酸分子序列的步驟，其中實際被修飾的核苷酸少于全部核苷酸。在處理步驟之后，本文提供的質(zhì)量測定方法可以用來區(qū)分來自于不完全轉(zhuǎn)化的片段以及來自于實際的甲基化核苷酸的片段。
如本文所用的，流體指的是任何可以流動的混合物。因此，包含混合物的流體可以包括半固態(tài)、糊劑、溶液、水相混合物、凝膠、洗液、膏劑以及其他這種混合物。
如本文所用的，細胞提取物指的是由裂解或破裂細胞制造的制品或成分。
如本文所用的，試劑盒是一個組合物，其中包裝有各種組分，可能帶有使用說明書以及與組合物一起使用的試劑和/或設(shè)備。
如本文所用的，系統(tǒng)指的是具有用于控制和指導方法的軟件和/或任何其他的元件的元件組合。
如本文所用的，軟件指的是計算機可讀的程序指令，當由計算機執(zhí)行時，可以實施計算機操作。典型的，軟件在程序產(chǎn)品上提供，其含有的程序指令記錄在計算機可讀的媒介上，例如但不限于磁性媒介包括軟盤、硬盤和磁帶；以及光媒介包括CD-ROM盤、DVD盤、磁光盤以及其他這種記錄程序指令的媒介。
如本文所用的“陣列”指的是成分例如核酸的集合。典型的，陣列包含兩種或多種成分?？蓪ぶ返年嚵惺且环N陣列成分可鑒別的陣列，典型的通過固相支持物上的位置。因此，通常陣列的成分將固定于固相表面上分散的可鑒別基因座。陣列包括單一固相表面上的成分的組合，例如芯片上的核苷酸集合。
B.用于確定靶核酸分子甲基化的方法 本文提供的是用于確定靶核酸分子甲基化狀態(tài)的方法。甲基化的核酸分子例如DNA包括甲基化的核苷酸。甲基化的核苷酸有多種作用。例如在基因表達中發(fā)揮作用，而且與包括癌癥在內(nèi)的疾病相關(guān)。本文提供的方法可以用來確定核酸分子是否是甲基化的(即，含有甲基化的核苷酸)。本文提供的方法可以用來確定核酸分子中甲基化或未甲基化核苷酸的基因座。本文提供的方法可以用來確定核酸分子中的核苷酸基因座是否是甲基化的。本文還提供了另外的方法以及用于實施所述方法的組合物、試劑盒及系統(tǒng)。
在一種方法中，核酸分子的甲基化狀態(tài)可以通過用修飾靶核酸分子核苷酸序列的試劑作為靶核酸分子甲基化狀態(tài)的函數(shù)處理靶核酸分子、使用一個或多個引物擴增處理過的靶核酸分子、切割擴增產(chǎn)物、以及檢測一個或多個被切割的產(chǎn)物來鑒定。在一個具體實施方式
中，擴增方法包括甲基化特異性擴增例如甲基化特異性PCR。在另一個具體實施方式
中，檢測被切割產(chǎn)物的步驟是通過測定靶核酸分子片段的質(zhì)量而實施的，例如通過質(zhì)譜。在又一個具體實施方式
中，一個或多個被切割產(chǎn)物的質(zhì)量與參考核酸分子的一個或多個質(zhì)量進行比較。
在另一個方法中，核酸分子中甲基化或未甲基化核苷酸的基因座可以通過用修飾靶核酸分子核苷酸序列的試劑作為靶核酸分子甲基化狀態(tài)的函數(shù)處理靶核酸分子、使用一個或多個引物擴增處理過的靶核酸分子、切割擴增產(chǎn)物、以及檢測一個或多個被切割的產(chǎn)物來鑒定。在一個具體實施方式
中，擴增方法包括甲基化特異性擴增例如甲基化特異性PCR。在另一個具體實施方式
中，檢測被切割產(chǎn)物的步驟是通過測定靶核酸分子片段的質(zhì)量而實施的，例如通過質(zhì)譜。在又一個具體實施方式
中，一個或多個被切割產(chǎn)物的質(zhì)量與參考核酸分子的一個或多個質(zhì)量進行比較。
在另一個方法中，核酸分子中核苷酸基因座的甲基化狀態(tài)可以通過用修飾靶核酸分子核苷酸序列的試劑作為靶核酸分子甲基化狀態(tài)的函數(shù)處理靶核酸分子、使用一個或多個引物擴增處理過的靶核酸分子、切割擴增產(chǎn)物、以及檢測一個或多個被切割的產(chǎn)物來確定。在一個具體實施方式
中，擴增方法包括甲基化特異性擴增例如甲基化特異性PCR。在另一個具體實施方式
中，檢測被切割產(chǎn)物的步驟是通過測定靶核酸分子片段的質(zhì)量而實施的，例如通過質(zhì)譜。在又一個具體實施方式
中，一個或多個被切割產(chǎn)物的質(zhì)量與參考核酸分子的一個或多個質(zhì)量進行比較。
鑒定甲基化或未甲基化核酸分子或核酸分子中甲基化或未甲基化核苷酸基因座的方法可以用于各種應(yīng)用例如本文將進一步闡述的甲基化發(fā)現(xiàn)、疾病診斷、決定治療模式以及生物體鑒定。
與疾病相關(guān)的甲基化核苷酸是甲基化胞嘧啶，例如5-甲基胞嘧啶。在某些情況下，存在甲基化胞嘧啶與疾病相關(guān)。在其他情況下，缺乏甲基化胞嘧啶或者存在未甲基化胞嘧啶與疾病相關(guān)。本文中提供的所述方法可以用來確定核酸分子是否含有甲基化或未甲基化胞嘧啶。本文中提供的方法也可以用來確定核酸分子甲基化或未甲基化胞嘧啶的基因座。本文中提供的方法還可以用來確定核酸分子中具體核苷酸基因座上的胞嘧啶是否是甲基化的。
1.樣品 本文中描述的所述方法可以應(yīng)用于多種來源的任何樣品，用于多種目的中的任何一種。典型的，本文使用的方法可以用來確定受試者相關(guān)的信息或者確定核酸甲基化與疾病之間的聯(lián)系。本文所描述的方法中使用的樣品將根據(jù)應(yīng)用的方法的目的而選擇。例如，當將生物體的表現(xiàn)型與甲基化核酸分子或核苷酸基因座進行聯(lián)系時，樣品可以含有來自多種不同生物體的核酸。在另一個實施例中，樣品可以含有一個個體的核酸，其中分析樣品以確定疾病狀態(tài)或個體的疾病趨勢。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以利用本文描述的方法確定所需待分析樣品。
a.來源 樣品可以來自任何受試者，包括動物、植物、細菌、病毒、寄生蟲、鳥類、爬行動物、兩棲動物、真菌、魚類以及其他植物和動物。哺乳動物包括在受試者中，典型的是人類。
來自于受試者的樣品可以是任何形式，包括固態(tài)材料例如組織、細胞、細胞團、細胞提取物或活檢，或者生物生物體液例如尿液、血液、組織間液、腹膜液、血漿、淋巴液、腹水、汗液、唾液、濾泡液、乳汁、非乳汁乳腺分泌物、血清、腦脊液、糞便、精液、肺部痰液、羊膜液、感染或炎癥區(qū)的滲出物、含有頰細胞的漱口液、滑膜液或者由受試者產(chǎn)生的任何其他液態(tài)樣品。另外，樣品可以是收集的組織，包括骨髓、上皮、胃、前列腺、腎、膀胱、乳腺、結(jié)腸、肺、胰腺、子宮內(nèi)膜、神經(jīng)元以及肌肉。樣品可以包括組織、器官以及病理樣品諸如福爾馬林固定石蠟包埋的樣品。
b.制備 本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認識到，某些樣品可以直接用于本文所提供的方法中。例如，無需任何提高所需細胞或核酸分子純度的純化或處理步驟，樣品即可利用本文描述的方法進行分析。
如需要，樣品可以利用已知的技術(shù)進行制備，如Maniatis，et al.(Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，N.Y.pp.280-281(1982))所描述的技術(shù)。例如，利用本文所描述的方法分析的樣品可以在一個或多個純化步驟中進行處理，以提高樣品中所需要的細胞或核酸的純度。如需要，固態(tài)物質(zhì)可以與流體混合。
用于分離來自體內(nèi)幾乎任何生物體或組織或器官的樣品以及來自培養(yǎng)細胞的樣品中核酸的方法是眾所周知的。例如，樣品可以加以處理以均化器官、組織或細胞樣品，并且細胞可以利用已知的溶解緩沖液、超聲波降解法、電穿孔以及其方法和組合進行溶解。如需要本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解到，可以進行進一步的純化。另外，樣品制備可以包括多種試劑，其可以包括在隨后步驟中。這些試劑包括例如鹽類、緩沖液、中性蛋白(如白蛋白)、去垢劑以及這種可以用來促進優(yōu)化雜交或酶促反應(yīng)和/或降低非特異性或本底相互作用的試劑。另外，以其他方式提高分析效率的試劑，例如蛋白酶抑制劑、核酸酶抑制劑以及抗微生物制劑，可以根據(jù)樣品制備方法以及靶核酸分子的純度而采用。
2.靶核酸分子 本文提供的方法用來確定甲基化狀態(tài)，包括靶核酸分子是含有甲基化還是含有未甲基化核苷酸、靶核酸分子中的核苷酸基因座是否是甲基化的以及靶核酸中甲基化或未甲基化核苷酸的核苷酸基因座。因此，在本文提供的方法中使用的靶核酸分子包括任何核酸分子?？梢詫嵤┍疚奶峁┑囊环N或多種方法，以提供靶核酸分子中有關(guān)甲基化核苷酸的信息。
a.核酸類型 本文提供的方法允許采用純化或非純化形式的任何含核酸的樣品或標本。因此，過程可以采用如DNA或RNA包括信使RNA，其中DNA或RNA可以是單鏈或雙鏈。另外，可以分析各含有一條鏈的DNA-RNA雜交體。還可以采用核酸混合物，例如含有核苷酸類似物的核酸以及核糖核苷酸和脫氧核糖核苷酸的混合物。待分析的特異性核酸分子序列，即，靶核酸分子可以是較大分子的一部分或者初始作為分散的分子而存在，以便特異性靶核酸分子組成樣品的全部核酸成分。待分析靶核酸分子初始不必以純化的形式存在，它可以是復雜混合物的較小部分，例如可以包含在生物體全DNA中。將要確定其甲基化狀態(tài)的靶核酸分子可以是獨立的分子或者核酸分子混合物的一部分。待分析的靶核酸分子可以僅代表核酸分子復合物的一個較小部分。另外，靶核酸分子可以組成樣品中多聚核苷酸的一部分或幾乎全部。
b.靶核酸分子的結(jié)構(gòu)或生物學作用 待分析的靶核酸分子可以包括基因組DNA或其一部分的一個或多個蛋白編碼區(qū)。靶核酸分子可以含有一個或多個基因啟動子區(qū)、一個或多個CpG島、與染色質(zhì)結(jié)構(gòu)相關(guān)的一個或多個序列、或者細胞核酸的其他區(qū)域。靶核酸分子可以是甲基化或未甲基化的，可在單一核苷酸如胞嘧啶、或者小的核苷酸群如胞嘧啶富集序列、或者一個或多個CpG島。
c.靶核酸分子的大小和組成 在本文方法中使用的靶核酸分子的長度可以根據(jù)靶核酸分子的序列、用于甲基化鑒定的具體方法以及所需要的具體甲基化狀態(tài)的鑒定而變化，但典型的，其長度將限制于一個長度，本文披露的斷裂以及檢測方法可以用來鑒定靶核酸分子的一個或多個核苷酸基因座的甲基化狀態(tài)。例如，靶核酸分子的長度可以限制在其中靶核酸分子的至少約1％、至少約3％、至少約5％、至少約10％、至少約20％、至少約30％、至少約40％、至少約50％、至少約60％、至少約70％、至少約80％、至少約85％、至少約90％、至少約95％、至少約98％、至少約99％或其全部的甲基化狀態(tài)，其可以利用本文披露的斷裂和檢測方法進行測定。
在一個具體實施方式
中，靶核酸分子的長度為其中兩個或多個核苷酸基因座的甲基化狀態(tài)可以進行鑒定，例如靶核酸分子的長度可以限制為這樣的長度，其中正被分析的核苷酸基因座的至少約1％、至少約3％、至少約5％、至少約10％、至少約20％、至少約30％、至少約40％、至少約50％、至少約60％、至少約70％、至少約80％、至少約85％、至少約90％、至少約95％、至少約98％、至少約99％或其全部的甲基化狀態(tài)均可以利用本文披露的斷裂以及檢測方法進行鑒定。例如，靶核酸分子的長度可以為至少約20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、225、250、275、300、350、400、450、500、550、600、700、800、900、1000、1200、1400、1600、1800、2000、2500或3000個堿基。典型的，靶核酸分子的長度將不長于約10,000、5000、4000、3000、2500、2000、1500、1000、900、800、700、600、500、450、400、350、280、260、240、220、200、190、180、170、160、150、140、130、120、110或100個堿基。
利用本文披露的方法分析的靶核酸分子可以包括一個或多個甲基化的核苷酸，但不是必需含有任何甲基化的核苷酸。本文披露的方法可以用來鑒定靶核酸分子是否含有甲基化或未甲基化的核苷酸、并且還可以用來鑒定靶核酸分子中甲基化或未甲基化核苷酸的核苷酸基因座。
靶核酸分子或者靶核酸分子中核苷酸基因座的甲基化狀態(tài)可以利用本文中提供的方法進行鑒定。甲基化的核苷酸可以成簇存在，從而一個核酸區(qū)域包含多個甲基化的核苷酸。另外，甲基化的核苷酸可以以單一、非成簇的基因座存在。靶核酸分子可以包括甲基化核苷酸簇可能存在的核酸區(qū)域的全部或一部分。靶核酸分子還可以包括其中僅一個核苷酸基因座能被甲基化的核酸區(qū)域。
基因組DNA中已經(jīng)鑒定為甲基化的核苷酸是胞嘧啶。甲基化的胞嘧啶可以存在于基因組DNA多個區(qū)域中任何一個。本文提供的方法可以用來確定多個基因組DNA區(qū)域的任何一個中胞嘧啶的甲基化狀態(tài)。例如，甲基胞嘧啶通常存在于命名為胞嘧啶-鳥嘌呤二核苷酸中。在一個具體實施方式
中，對靶核酸分子中一個或多個CpG二核苷酸內(nèi)的胞嘧啶核苷酸的甲基化狀態(tài)進行鑒定，這種二核苷酸在基因組中某些區(qū)域被富集，其中這些富集區(qū)命名為CpG島。CpG島可以在某些基因的啟動子區(qū)附近發(fā)現(xiàn)，包括用于腫瘤抑制基因、癌基因、發(fā)育調(diào)節(jié)基因以及管家基因的啟動子區(qū)。因此，本文披露的方法可以用來鑒定靶核酸分子中CpG二核苷酸內(nèi)的胞嘧啶核苷酸的甲基化狀態(tài)，其中CpG核苷酸被定位于基因啟動子區(qū)，例如腫瘤抑制基因、癌基因、發(fā)育調(diào)節(jié)基因以及管家基因的啟動子區(qū)。本文披露的方法還可以用來鑒定靶核酸分子中CpG島內(nèi)的一個或多個胞嘧啶的甲基化狀態(tài) 本文提供的方法可以用來鑒定多個核苷酸基因座的甲基化狀態(tài)。因此，較大的靶核酸的一個或多個甚至全部核苷酸基因座的甲基化狀態(tài)可以利用本文提供的方法進行鑒定。例如，整個CpG島的多個核苷酸基因座甚至全部核苷酸基因座的甲基化狀態(tài)可以利用本文提供的方法進行鑒定。
C.甲基化狀態(tài)特異性序列修飾 核酸分子可以含有帶有修飾的核苷酸，例如甲基化而不改變核酸分子的核苷酸序列。擴增含有這樣修飾的核苷酸的核酸分子可以得到與非修飾的核苷酸互補的擴增產(chǎn)物，使得擴增產(chǎn)物不包含有關(guān)核苷酸修飾的信息。例如，含有甲基化胞嘧啶的核酸分子的擴增產(chǎn)物將導致擴增產(chǎn)物在甲基化胞嘧啶的位置上含有未修飾的鳥嘌呤(對互補鏈而言)或者未修飾的胞嘧啶。可以根據(jù)一個或多個核苷酸中修飾的存在或缺乏而修飾靶核酸分子的核苷酸序列的試劑是已知的，其中修飾本身不改變核苷酸序列。例如，重亞硫酸鹽可以用于將未甲基化胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶的過程中，因此使得可以根據(jù)核酸分子中修飾的存在或缺乏而修飾靶核酸分子的核苷酸序列。
在實施本文所披露的方法中，用修飾靶核酸分子作為靶核酸分子甲基化狀態(tài)的函數(shù)的試劑處理靶核酸分子。處理過的靶核酸分子序列可以具有反映未處理靶核酸分子的甲基化狀態(tài)的所得序列。在一個具體實施方式
中，試劑可以用來修飾未甲基化的選定的核苷酸以生成不同核苷酸。例如，試劑可以用來修飾未甲基化的胞嘧啶以生成尿嘧啶。在某些具體實施方式
中，在一個反應(yīng)容器(例如反應(yīng)管)中，用一種或多種修飾試劑接觸核苷酸，其中在反應(yīng)容器中完成一個或多個擴增、切割和/或檢測步驟。在這些具體實施方式
中，修飾或未修飾核酸可以用一個反應(yīng)容器進行檢測。在某些具體實施方式
中，核酸樣品分到兩個或多個反應(yīng)容器中，其中反應(yīng)容器中的一個用修飾試劑進行接觸，而反應(yīng)容器中的另一個不用修飾試劑進行接觸。
1.用于序列修飾的試劑 用于修飾核酸分子的核苷酸序列的各種試劑在本領(lǐng)域是已知的，而且可以與本文提供的方法聯(lián)合使用。試劑和條件例如已知的誘變劑或致突變制劑可以選自多種化合物或其他程序(procudure)。誘變性化學試劑包括甲磺酸甲酯(methylmethane sulfonate)、甲磺酸乙酯(ethylmethane sulfonate)、硫酸二乙酯、亞硝基胍(N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍)、亞硝酸、二(2-氯乙基)硫醚、二(2-氯乙基)甲胺、2-氨基嘌呤、t-溴尿嘧啶、羥胺、亞硫酸氫鈉、肼、甲酸以及亞硝酸鈉?？梢愿淖兒怂岱肿拥暮塑账嵝蛄械拿敢部梢杂糜诒疚奶峁┑姆椒òɡ?-甲基胞嘧啶DNA糖苷酶。另外，某些條件例如高溫、紫外照射、X輻射可以誘發(fā)核酸分子序列的變化。
用于確定核酸分子或核苷酸基因座甲基化狀態(tài)的方法包括用可修飾靶核酸分子核苷酸序列的試劑，作為靶核酸分子甲基化狀態(tài)的函數(shù)接觸含有靶核酸分子的樣品。例如，可以用修飾甲基化堿基如甲基化胞嘧啶的試劑接觸靶核酸分子，從而可以在甲基化堿基例如甲基化胞嘧啶的位置上修飾靶核酸分子的核苷酸序列?？梢圆捎眯揎棄A基的任何試劑。修飾甲基化堿基的示例性的試劑是5-甲基胞嘧啶DNA糖苷酶。還可以利用加熱將甲基化胞嘧啶修飾成胸腺嘧啶。
在另一個實施例中，靶核酸分子可以用修飾未甲基化堿基而不是甲基化堿基的試劑進行接觸，例如未甲基化胞嘧啶而不是甲基化胞嘧啶，于是靶核酸分子的核苷酸序列在未甲基化堿基的位置而不是甲基化堿基的位置被修飾，例如在未甲基化胞嘧啶的位置而不是甲基化胞嘧啶的位置。修飾未甲基化堿基而不是甲基化堿基的示例性試劑是重亞硫酸鈉，其可以修飾未甲基化胞嘧啶而不是甲基化胞嘧啶。
用于修飾靶核酸分子在某種意義上反映靶核酸分子的甲基化模式的方法在本領(lǐng)域中是已知的，如在美國專利5,786,146號以及美國專利公開20030180779號和20030082600號中所例證的。
2.用重亞硫酸鹽修飾胞嘧啶 在一個具體實施方式
中，試劑可以用來將未甲基化胞嘧啶修飾成尿嘧啶。用于將未甲基化胞嘧啶修飾成尿嘧啶的示例性試劑是重亞硫酸鈉。重亞硫酸鈉(NaHSO3)與胞嘧啶的5，6-雙鍵反應(yīng)，以形成易于脫氨的磺化胞嘧啶反應(yīng)的中間產(chǎn)物，以生成磺化尿嘧啶?；腔蜞奏さ幕腔鶊F在堿性條件下可以去除，導致尿嘧啶的形成。尿嘧啶是作為胸腺嘧啶被DNA聚合酶例如Taq聚合酶識別，因此，用諸如PCR的方法擴增靶核酸分子時，得到的被擴增的靶核酸分子在起始模板靶核酸分子中未甲基化胞嘧啶存在的位置上含有胸腺嘧啶，而互補鏈在與起始靶核酸分子中未甲基化胞嘧啶存在的位置相互補的位置上含有胞嘧啶。另外，諸如PCR的擴增方法可以產(chǎn)生含有胞嘧啶的被擴增的靶核酸分子，其中起始靶核酸分子含有5-甲基胞嘧啶，而互補鏈在與起始靶核酸分子中甲基化胞嘧啶存在的位置相互補的位置上含有鳥嘌呤。因此，在諸如PCR的擴增方法中，擴增產(chǎn)物中的胞嘧啶可以標記5-甲基胞嘧啶的位置，而擴增產(chǎn)物中的胸腺嘧啶可以標記未甲基化胞嘧啶的位置。類似的，在與被處理的靶核酸分子互補的擴增產(chǎn)物鏈中，鳥嘌呤可以標記5-甲基胞嘧啶的位置而腺嘌呤可以標記未甲基化胞嘧啶的位置。
用重亞硫酸鹽處理靶DNA的示例性方法可以包括用還可以含有尿素和對苯二酚的重亞硫酸鹽溶液的接觸變性的DNA，以及孵育混合物20個循環(huán)，每個循環(huán)為95℃、30秒以及55℃、15min。另一個可替換的方法中，重亞硫酸鹽處理可以在瓊脂糖中實施，并且沉淀步驟可以用透析步驟取代(6,214,556號美國專利以及Olek et al.Nucl.Acids Res.245064-66(1996))。重亞硫酸鹽處理靶核酸分子的變異在本領(lǐng)域是已知的，如在美國專利5,786,146和6,214,556號、美國專利公開20030082600號、Tost et al.Nucl.Acids.Res.31e50(2003)、Olek et al.Nucl.Acids Res.245064-66(1996)以及Grunau et al.Nucl.Acids Res.29e65(2001)中所例證的。
3.所得的核酸分子 在本文提供的方法中，與處理前靶核酸分子的核苷酸序列相比，經(jīng)甲基化特異性試劑處理的靶核酸分子可以具有不同的核苷酸序列。因為甲基化特異性試劑作為靶核酸分子的甲基化狀態(tài)的函數(shù)而修飾靶核酸分子的核苷酸序列，處理過的核酸分子將含有與未處理的靶核酸分子相關(guān)的核苷酸序列，其能反映未處理的靶核酸分子的甲基化狀態(tài)。
D.擴增處理過的靶核酸分子 本文提供的方法還可以包括利用一個或多個引物擴增處理過的靶核酸分子的步驟。在一個具體實施方式
中，至少一個引物是甲基化特異性引物。在另一個具體實施方式
中，引物含有與利用甲基化特異性試劑處理的核苷酸互補的一個或多個核苷酸。例如，重亞硫酸鹽是胞嘧啶特異性的；當使用重亞硫酸鹽時，在鑒定甲基化核苷酸的方法中使用的引物可以含有一個或多個鳥嘌呤核苷酸。擴增方法可以用來選擇性擴增與引物互補的靶核酸分子，而不擴增核酸樣品中的一個或多個其它核酸分子。
1.甲基化特異性引物 甲基化特異性引物，本文中還可稱為甲基化狀態(tài)特異性引物，設(shè)計用來根據(jù)未處理的靶核酸分子中的一個或多個核苷酸的甲基化狀態(tài)區(qū)分處理過的靶核酸分子的核苷酸序列。例如，甲基化特異性引物可以被設(shè)計為與來自含有甲基化核苷酸的靶核酸分子的經(jīng)試劑處理的靶核酸分子的核苷酸序列雜交，優(yōu)于與來自含有未甲基化核苷酸的靶核酸分子的經(jīng)試劑處理的靶核酸分子的核苷酸序列雜交。在另一個實施例中，甲基化特異性引物可以被設(shè)計為與來自含有未甲基化核苷酸的靶核酸分子的經(jīng)試劑處理的靶核酸分子的核苷酸序列雜交，優(yōu)于與來自含有甲基化核苷酸的靶核酸分子的經(jīng)試劑處理的靶核酸分子的核苷酸序列雜交。
在核苷酸合成反應(yīng)可以發(fā)生的條件下，用于擴增樣品中處理過的靶核酸分子的引物可以與處理過的靶核酸分子雜交。典型的，可以實施兩個或多個核苷酸合成反應(yīng)循環(huán)以生成足夠量的用于后續(xù)步驟包括斷裂和檢測的靶核酸分子。在利用甲基化特異性引物選擇性擴增靶核酸分子的方法中，在擴增方法中使用的至少一種引物將是甲基化特異性的。在一些具體實施方式
中，在擴增方法中使用的兩種引物將均是甲基化特異性的。
在一個具體實施方式
中，由甲基化的未處理靶核酸分子形成的經(jīng)處理靶核酸分子的擴增優(yōu)于由未甲基化的未處理靶核酸分子形成的經(jīng)處理靶核酸分子。例如，甲基化特異性引物可以特異性雜交到由甲基化靶核酸分子形成的經(jīng)處理的靶核酸分子上，而甲基化特異性引物并不選擇性雜交到由未甲基化靶核酸分子形成的經(jīng)處理的靶核酸分子上。在另一個具體實施方式
中，由未甲基化未處理的靶核酸分子形成的經(jīng)處理靶核酸分子的擴增優(yōu)先于由甲基化未處理的靶核酸形成的經(jīng)處理靶核酸分子。例如，甲基化特異性引物可以特異性雜交到由未甲基化靶核酸分子形成的經(jīng)處理靶核酸分子上，而甲基化特異性引物并不選擇性雜交到由甲基化靶核酸分子形成的經(jīng)處理靶核酸分子上。
在另一個具體實施方式
中，形成自在一個或多個選定的核苷酸基因座上含有甲基化核苷酸的未處理靶核酸分子的經(jīng)處理靶核酸分子的擴增優(yōu)于形成自在一個或多個選定的核苷酸基因座上含有未甲基化核苷酸的未處理靶核酸分子的經(jīng)處理靶核酸分子。例如，甲基化特異性引物可以特異性雜交到形成自在一個或多個選定的核苷酸基因座上含有甲基化核苷酸的靶核酸分子的經(jīng)處理靶核酸分子上，而甲基化特異性引物并不選擇性雜交到形成自在一個或多個選定的靶核苷酸基因座上不含有甲基化核苷酸的經(jīng)處理靶核酸分子上。在另一個具體實施方式
中，形成自在一個或多個選定的核苷酸基因座上含有未甲基化核苷酸的未處理靶核酸分子的經(jīng)處理靶核酸分子的擴增優(yōu)于形成自在一個或多個選定的核苷酸基因座上含有甲基化核苷酸的未處理靶核酸分子的經(jīng)處理靶核酸分子。例如，甲基化特異性引物可以特異性雜交到形成自在一個或多個選定的核苷酸基因座上含有未甲基化核苷酸的經(jīng)靶核酸分子的經(jīng)處理靶核酸分子上，而甲基化特異性引物并不選擇性雜交到形成自在一個或多個選定的靶核苷酸基因座上不含有未甲基化核苷酸的靶核酸分子的經(jīng)處理靶核酸分子上。
a.甲基化特異性引物的設(shè)計 設(shè)計甲基化特異性引物以用來根據(jù)未處理的靶核酸分子中的一個或多個核苷酸的甲基化狀態(tài)區(qū)分處理過的靶核酸分子的核苷酸序列。例如，甲基化特異性引物可以設(shè)計為與來自未甲基化核苷酸的處理過的靶核酸分子進行選擇性雜交。甲基化特異性引物也可以設(shè)計為與來自甲基化靶核酸分子的處理過的靶核酸分子進行選擇性雜交。甲基化特異性引物還可以設(shè)計為結(jié)合到處理過的靶核酸分子的預(yù)先確定的核苷酸序列上，其中預(yù)先確定的核苷酸序列可以源自甲基化或未甲基化的靶核酸分子。
甲基化特異性引物的設(shè)計將受到期望選擇性擴增的靶核酸分子的核苷酸甲基化狀態(tài)的影響(例如，選擇擴增含有甲基化核苷酸基因座的靶核酸分子，而不擴增含有未甲基化核苷酸基因座的靶核酸分子)，還受到作為靶核酸分子甲基化狀態(tài)的函數(shù)修飾靶核酸分子的核苷酸序列的試劑的影響(例如重亞硫酸鹽，其可以用來將未甲基化胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶)。例如，設(shè)計用來擴增經(jīng)重亞硫酸鹽處理的含有甲基化胞嘧啶的靶核酸分子的引物通常含有一個或多個鳥嘌呤核苷酸。甲基化特異性引物的設(shè)計還受到對靶核酸分子上引物雜交區(qū)的核苷酸序列的任何了解的影響。例如，當已知靶核酸分子的全部核苷酸序列時，引物雜交位點可以通過設(shè)計含有與預(yù)定義位點互補的核苷酸序列的引物而選擇。
在一個實施例中，甲基化特異性引物設(shè)計用來選擇性結(jié)合靶核酸分子，其預(yù)定義位點未被甲基化狀態(tài)特異性試劑修飾，有利于具有被甲基化狀態(tài)特異性試劑修飾的預(yù)定義位點的靶核酸分子。在另一個實施例中，一個或多個甲基化特異性引物可以選擇性結(jié)合靶核酸分子，其未被甲基化狀態(tài)特異性試劑修飾的預(yù)定位點，優(yōu)于具有被甲基化狀態(tài)特異性試劑修飾的預(yù)定義位點的靶核酸分子。
b.引物組成 本文披露的方法中使用的引物具有足夠的長度以及適當?shù)男蛄校栽试S利用靶核酸分子模板進行特異性引物延伸。典型的，引物被設(shè)計為與待擴增的靶核酸分子的每一條鏈互補。引物可以為寡脫氧核糖核苷酸、寡核糖核苷酸、或既含有脫氧核糖核苷酸又含有核糖核苷酸的寡核苷酸；在某些具體實施方式
中，引物可以含有一個或多個核苷酸類似物。引物的長度可以根據(jù)多個因素中的任何一個而變化，所述因素包括溫度、緩沖液、所需要的選擇性以及核苷酸組成。引物可以含有至少約5、8、10、15、20、25、30、40、50、60、70或80個核苷酸，并且典型的含有不多于約120、110、100、90、70、60、50、40、30、20或10個核苷酸。
在一個具體實施方式
中，在核酸合成方法中使用的引物還可以包含不與靶核酸分子雜交的成分(moiety)。這種成分可以包括多種化合物或混合物中的任何一個，而且可以發(fā)揮多種功能中的任何一個。例如，這種成分可以是不與靶核酸分子雜交的另外的核苷酸例如轉(zhuǎn)錄起始序列。成分還可以是利于引物或引物所整合入的核酸的鑒定或分離的成分。這種成份可以是，例如可結(jié)合成分例如生物素、多組氨酸、磁性珠子或其他用于特異性結(jié)合的混合物或化合物。這種成份還可以是熒光化合物、含有放射性核素的化合物、膠體金屬、量子點或其他用于檢測的混合物或化合物。
本文使用的寡核苷酸引物可以利用任何合適的方法制備，例如傳統(tǒng)的磷酸二酯和磷酸三酯法或者其自動化的具體實施方式
。在一個這樣的自動化具體實施方式
中，二乙基亞磷酰胺用作起始物質(zhì)，并且可以如通過Beaucage，et al.Tetrahedron Letters 221859-1862(1981)所描述的進行合成。在固態(tài)支持物上用于合成寡核苷酸的方法在本領(lǐng)域中是已知，如美國專利4,458,066號中所例證的。
c.引物結(jié)合區(qū) 按照所披露的擴增和核酸合成法而使用的引物可以特異性雜交到靶核酸分子上。典型的，甲基特異性引物可以特異性雜交到具有預(yù)定義或預(yù)先確定序列的靶核酸分子上。靶核酸分子上甲基化特異性引物特異性雜交的部分可以命名為引物檢測區(qū)(query region)。
在本文提供的方法中，靶核酸分子的核苷酸序列可以作為靶核酸分子的甲基化狀態(tài)的函數(shù)而被修飾。因此，相應(yīng)于未處理靶核酸分子區(qū)域的甲基化狀態(tài)，經(jīng)甲基化特異性試劑處理的靶核酸分子的引物檢測區(qū)可以是其核苷酸序列反映未處理靶核酸分子中該區(qū)域甲基化狀態(tài)的引物檢測區(qū)。例如，在第4位核苷酸含有甲基胞嘧啶而第7位核苷酸含有未甲基化胞嘧啶的未處理靶核酸分子的區(qū)域可以用重亞硫酸鹽處理，可以將第7位核苷酸的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶而不改變第4位核苷酸的甲基胞嘧啶，因此，相應(yīng)于在第4位核苷酸含有甲基胞嘧啶而第7位核苷酸含有未甲基化胞嘧啶的未處理靶核酸分子的區(qū)域的處理過的靶核酸分子的引物檢測區(qū)以及與這個引物檢測區(qū)互補的引物，將在與第4位核苷酸互補的基因座上含有腺嘌呤而與第7位核苷酸互補的基因座上含有鳥嘌呤。
在本文披露的甲基化特異性擴增方法的一個具體實施方式
中，當引物檢測區(qū)含有與甲基化特異性引物互補的序列時，甲基化特異性引物可以特異性雜交到靶核酸分子的引物檢測區(qū)上。另外，與此具體實施方式
相一致，當引物檢測區(qū)不含有與甲基化特異性引物互補的序列時，甲基化特異性引物則不可以特異性雜交到靶核酸分子的引物檢測區(qū)上。例如，含有一個或多個甲基化基因座的靶核酸分子可以用重亞硫酸鹽處理，且處理過的靶核酸分子的引物檢測區(qū)可以含有一個或多個胞嘧啶核苷酸；甲基化特異性引物可以設(shè)計為與處理過的靶核酸分子的引物檢測區(qū)中存在的一個或多個胞嘧啶核苷酸特異性雜交，而引物因此可以與處理過的甲基化靶核酸分子的引物檢測區(qū)特異性雜交。類似的，在另一個實施例中，含有一個或多個未甲基化基因座的靶核酸分子可以用重亞硫酸鹽處理，且處理過的靶核酸分子的引物檢測區(qū)可以不含有胞嘧啶核苷酸；甲基化特異性引物可以設(shè)計為與處理過的靶核酸分子的引物檢測區(qū)中存在的一個或多個胞嘧啶核苷酸特異性雜交，而引物因此可以不與處理過的未甲基化靶核酸分子特異性雜交。
在另一個實施例中，含有一個或多個未甲基化基因座的靶核酸分子可以用重亞硫酸鹽處理，且處理過的靶核酸分子的引物檢測區(qū)可以包含一個或多個尿嘧啶核苷酸；甲基化特異性引物可以設(shè)計為與處理過的靶核酸分子的引物檢測區(qū)中存在的一個或多個尿嘧啶核苷酸特異性雜交，而引物因此可以與處理過的未甲基化靶核酸分子的引物檢測區(qū)特異性雜交。類似的，在另一個實施例中，含有一個或多個甲基化基因座的靶核酸分子可以用重亞硫酸鹽處理，且處理過的靶核酸分子的引物檢測區(qū)可以不含有尿嘧啶核苷酸；甲基化特異性引物可以設(shè)計為與處理過的靶核酸分子的引物檢測區(qū)中存在的一個或多個尿嘧啶核苷酸特異性雜交，而引物因此可以不與處理過的甲基化靶核酸分子特異性雜交。本文提供的方法可以用來確定靶核酸分子的非引物檢測區(qū)的甲基化狀態(tài)。本文提供的方法也可以用來確定靶核酸分子的非引物檢測區(qū)中一個或多個核苷酸基因座的甲基化狀態(tài)。本文提供的方法可以用來確定靶核酸分子中非引物檢測區(qū)中甲基化或未甲基化核苷酸的基因座。在一個實施例中，靶核酸分子的非引物檢測區(qū)可以含有一個或多個胞嘧啶核苷酸；鑒定處理過的靶核酸分子的非引物檢測區(qū)含有一個或多個胞嘧啶核苷酸可以用來鑒定靶核酸分子的非引物檢測區(qū)含有一個或多個甲基化核苷酸。在另一個實施例中，處理過的靶核酸分子的非引物檢測區(qū)中一個或多個核苷酸基因座可以鑒定為含有胞嘧啶核苷酸；在這種鑒定中，靶核酸分子的非引物檢測區(qū)中的一個或多個核苷酸基因座可以鑒定為甲基化。本文提供的方法還可以用來確定甲基化胞嘧啶核苷酸的基因座。
在另一個實施例中，靶核酸分子的非引物檢測區(qū)可以含有一個或多個尿嘧啶核苷酸；鑒定處理過的靶核酸分子的非引物檢測區(qū)含有一個或多個尿嘧啶核苷酸可以用來鑒定靶核酸分子的非引物檢測區(qū)含有一個或多個未甲基化核苷酸。在另一個實施例中，處理過的靶核酸分子的非引物檢測區(qū)中一個或多個核苷酸基因座可以鑒定為含有尿嘧啶核苷酸；在這種鑒定中，處理過的靶核酸分子的非引物檢測區(qū)中的一個或多個核苷酸基因座可以鑒定為未甲基化。本文提供的方法還可以用來確定未甲基化胞嘧啶核苷酸的基因座。
因此，本文提供的方法可以用來鑒定靶核酸分子非引物檢測區(qū)的甲基化狀態(tài)，可以用來鑒定靶核酸分子非引物檢測區(qū)中一個或多個核苷酸基因座的甲基化狀態(tài)，以及還可以用來確定甲基化或未甲基化核苷酸的基因座。
在一個具體實施方式
中，靶核酸分子的引物檢測區(qū)可以含有一個或多個胞嘧啶核苷酸。典型的，當甲基化靶核酸分子用甲基化特異性試劑例如重亞硫酸鹽進行處理時，未甲基化胞嘧啶核苷酸可以被轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而甲基化胞嘧啶核苷酸則不然。因此，用重亞硫酸鹽處理的甲基化靶核酸分子可以含有一個或多個胞嘧啶核苷酸，其中胞嘧啶核苷酸與未處理的靶核酸分子中的甲基化胞嘧啶核苷酸相對應(yīng)。在一個具體實施方式
中，一個或多個胞嘧啶核苷酸定位于靶核酸分子的引物檢測區(qū)5’末端附近。例如，引物檢測區(qū)的5’一半可以含有一個或多個胞嘧啶核苷酸，其中5’一半指的是包括引物檢測區(qū)5’末端和引物檢測區(qū)的中點并介于二者之間的核苷酸。在另一個具體實施方式
中，靶核酸分子的引物檢測區(qū)在其5’末端含有胞嘧啶核苷酸。
類似的，與處理過的靶核酸分子互補的擴增產(chǎn)物的引物檢測區(qū)可以含有一個或多個鳥嘌呤核苷酸。在一個具體實施方式
中，一個或多個鳥嘌呤核苷酸定位于互補性擴增產(chǎn)物的引物檢測區(qū)5’末端附近。例如，引物檢測區(qū)的5’一半可以含有一個或多個鳥嘌呤核苷酸，其中5’一半指的是包括引物檢測區(qū)5’末端和引物檢測區(qū)的中點并介于二者之間的核苷酸。在另一個具體實施方式
中，互補性擴增產(chǎn)物的引物檢測區(qū)在其5’末端含有鳥嘌呤核苷酸。
在另一個具體實施方式
中，靶核酸分子的引物檢測區(qū)可以含有一個或多個尿嘧啶核苷酸。經(jīng)重亞硫酸鹽處理的含有一個或多個未甲基化胞嘧啶的靶核酸分子可以含有一個或多個尿嘧啶核苷酸，其中至少某些尿嘧啶核苷酸可以對應(yīng)于未處理靶核酸分子中的未甲基化胞嘧啶核苷酸。在一個具體實施方式
中，一個或多個尿嘧啶核苷酸定位于靶核酸分子的引物檢測區(qū)5’末端附近。例如，引物檢測區(qū)的5’一半可以含有一個或多個尿嘧啶核苷酸。在另一個具體實施方式
中，靶核酸分子的引物檢測區(qū)在其5’末端含有尿嘧啶核苷酸。
類似的，與處理過的靶核酸分子互補的擴增產(chǎn)物的引物檢測區(qū)中可以含有一個或多個腺嘌呤核苷酸。在一個具體實施方式
中，一個或多個腺嘌呤核苷酸定位于互補性擴增產(chǎn)物的引物檢測區(qū)5’末端附近。例如，引物檢測區(qū)的5’一半可以含有一個或多個腺嘌呤核苷酸。在另一個具體實施方式
中，互補性擴增產(chǎn)物的引物檢測區(qū)在其5’末端含有腺嘌呤核苷酸。
靶核酸分子包含與甲基化特異性引物特異性雜交的一個或多個引物檢測區(qū)，還可以包含一個或多個非引物檢測區(qū)。非引物檢測區(qū)是不能發(fā)揮甲基化特異性擴增作用的靶核酸分子的一部分。例如，非引物檢測區(qū)可以是不能與甲基化特異性引物特異性雜交靶核酸分子的區(qū)域。靶核酸分子的非引物檢測區(qū)可以包含位于兩個引物檢測區(qū)之間，但引物檢測區(qū)不包括在內(nèi)的靶核酸分子的一部分；例如，非引物檢測區(qū)還可以位于引物雜交區(qū)之間，但該引物雜交區(qū)不包括在內(nèi)，以及還可以位于甲基化特異性引物雜交區(qū)之間，并且不甲基化特異性引物雜交區(qū)。本文還有一些預(yù)期的方法，其中第一引物是甲基化特異性引物，而第二引物則不是(即第二引物不與處理過的靶核酸分子選擇性雜交，作為未處理靶核酸分子甲基化狀態(tài)的函數(shù))。在這些方法中，未甲基化特異性引物檢測區(qū)包括位于引物雜交區(qū)之間的區(qū)域，還包括第二(未甲基化特異性)引物雜交的區(qū)域。
d.含有C或G核苷酸的引物 根據(jù)引物的預(yù)期用途，甲基化特異性引物可以包含核苷酸的任何組合。如本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解，引物可以包含多個區(qū)域，其包括一個或多個不與靶核酸分子雜交的區(qū)域(例如，轉(zhuǎn)錄起始序列)。因此，除非另有指明，論及有關(guān)引物的核苷酸組成指的是與靶核酸分子雜交的區(qū)域的核苷酸組成，而不指不與核酸分子雜交的引物區(qū)域的核苷酸組成。在一個實施例中，甲基化特異性引物可以含有一個或多個鳥嘌呤核苷酸(即靶核酸分子結(jié)合區(qū)含有一個或多個鳥嘌呤核苷酸)。甲基化特異性引物可以含有一個或多個胞嘧啶核苷酸(即靶核酸分子結(jié)合區(qū)含有一個或多個胞嘧啶核苷酸)。處理過的靶核酸分子或其具有相同核苷酸序列的擴增產(chǎn)物，可以含有一個或多個胞嘧啶核苷酸。與這種處理過的靶核酸分子或其擴增產(chǎn)物互補的甲基化特異性引物可以含有一個或多個鳥嘌呤核苷酸。與處理過的靶核酸分子互補的擴增產(chǎn)物可以含有一個或多個鳥嘌呤核苷酸。與這種擴增產(chǎn)物互補的甲基化特異性引物可以含有一個或多個胞嘧啶核苷酸。
在另一個實施例中，甲基化特異性引物可以含有一個或多個胸腺嘧啶或尿嘧啶核苷酸(即靶核酸分子結(jié)合區(qū)含有一個或多個胸腺嘧啶或尿嘧啶核苷酸)。甲基化特異性引物可以含有一個或多個腺嘌呤核苷酸(即靶核酸分子結(jié)合區(qū)含有一個或多個腺嘌呤核苷酸)。處理過的靶核酸分子或其具有相同核苷酸序列的擴增產(chǎn)物，可以含有一個或多個胸腺嘧啶或尿嘧啶核苷酸。與這種處理過的靶核酸分子或其擴增產(chǎn)物互補的甲基化特異性引物可以含有一個或多個腺嘌呤核苷酸。與處理過的靶核酸分子互補的擴增產(chǎn)物可以含有一個或多個腺嘌呤核苷酸。與這種擴增產(chǎn)物互補的甲基化特異性引物可以含有一個或多個胸腺嘧啶或尿嘧啶核苷酸。
在一個具體實施方式
中，其中重亞硫酸鹽用作處理靶核酸分子的試劑，該靶核酸分子可以含有很少的甲基化胞嘧啶，由于一條鏈的引物中大多數(shù)缺乏C，而互補鏈的引物中大多數(shù)缺乏G，因而甲基化特異性引物的序列中含有相對較少的C或G，由于未甲基化C被修飾成U(尿嘧啶)，在擴增產(chǎn)物中作為T(胸腺嘧啶)擴增，因此被擴增的互補鏈將在對應(yīng)于擴增C的每個位點上用A取代G。
在其他具體實施方式
中，靶核酸分子可以包含多個未甲基化的胞嘧啶。在這些具體實施方式
中，甲基化特異性引物的序列中可以包含相當少、相當多、或任何相對之間的數(shù)量的C或G。
在一個具體實施方式
中，引物可以設(shè)計為減少來自非特異性雜交的擴增可能性。一個或多個鳥嘌呤核苷酸可以定位于引物3’末端附近。例如，引物3’一半可以含有一個或多個鳥嘌呤核苷酸，其中3’一半指的是包括引物3’末端和引物中點并介于二者之間的核苷酸。靶核酸分子或其擴增產(chǎn)物可以含有這種引物與其特異性雜交的一個或多個胞嘧啶核苷酸。在某些條件下，引物可以非特異性雜交到不含有一個或多個胞嘧啶核苷酸的核酸分子上。然而，3’一半含有一個或多個鳥嘌呤核苷酸的引物將在其3’一半具有一個或多個錯配的堿基對。由于引物延伸發(fā)生在3’末端，因此相對于在5’末端同等程度的錯配，在3’末端或其附近(即，在3’一半之上)的錯配堿基對可以降低引物延伸的可能性。因此，使用在引物3’一半內(nèi)含有一個或多個鳥嘌呤核苷酸的引物將增加特異性雜交的引物而非錯配的引物延伸的可能性。在另一個具體實施方式
中，當與處理過的靶核酸分子互補的擴增產(chǎn)物被雜交到引物上時，一個或多個胞嘧啶核苷酸可以位于引物3’末端附近。例如，引物的3’一半可以含有一個或多個胞嘧啶核苷酸。
在另一個具體實施方式
中，當甲基化特異性引物用來選擇性擴增未甲基化靶核酸時，一個或多個腺嘌呤核苷酸可以位于引物3’末端附近。例如，引物的3’一半可以含有一個或多個腺嘌呤核苷酸。類似的，當與處理過的靶核酸互補的擴增產(chǎn)物被雜交到引物時，一個或多個胸腺嘧啶或尿嘧啶核苷酸可以位于引物3’末端附近。例如，引物的3’一半可以含有一個或多個胸腺嘧啶或尿嘧啶核苷酸。
在另一個具體實施方式
中，甲基化特異性引物的3’核苷酸可以特異性區(qū)分在一個基因座上為甲基化的處理過的靶核酸分子以及在該基因座上為未甲基化的處理過的靶核酸分子，通過在引物3’末端選擇性雜交來自甲基化核苷酸的核苷酸。例如，甲基化特異性引物在其3’末端可以含有鳥嘌呤(G)，而且一旦與靶核酸分子雜交，在與引物3’G核苷酸基因座相應(yīng)的位置上存在C核苷酸，引起靶核酸分子的擴增，然而在與引物3’G核苷酸基因座相應(yīng)的位置上存在U或T核苷酸，則不能導致靶核酸分子的擴增。在另一個實施例中，甲基化特異性引物在其3’端可以含有C，而且一旦與靶核酸分子雜交，在與引物3’C核苷酸基因座相應(yīng)的位置上存在G核苷酸，可以引起靶核酸分子的擴增，然而在與引物3’G核苷酸基因座相應(yīng)的位置上存在A核苷酸則不能導致靶核酸分子的擴增。
在另一個具體實施方式
中，在引物3’末端，引物可以用來與來自未甲基化核苷酸的核苷酸選擇性雜交。例如，甲基化特異性引物在其3’末端可以含有腺嘌呤(A)，而且一旦與靶核酸分子雜交，在與引物3’G核苷酸基因座相應(yīng)的位置存在T或U核苷酸可以引起靶核酸分子的擴增，然而在與引物3’G核苷酸基因座相應(yīng)的位置存在C核苷酸則不能導致靶核酸分子的擴增。在另一個實施例中，甲基化特異性引物在其3’末端可以含有T或U，而且一旦與靶核酸分子雜交，在與引物3’C核苷酸基因座相應(yīng)的位置存在A核苷酸可以引起靶核酸分子的擴增，然而在與引物3’G核苷酸基因座相應(yīng)的位置存在G核苷酸則不能導致靶核酸分子的擴增。
2.核酸合成方法 本文描述的或本領(lǐng)域已知的甲基化特異性引物，可以用于根據(jù)靶核酸分子的甲基化狀態(tài)特異性擴增靶核酸分子的方法中，因此，用來選擇性增加樣品中靶核酸分子的量。甲基化狀態(tài)特異性引物的擴增產(chǎn)物可以按照本文提供的斷裂及片段檢測方法分析其進一步的甲基化信息。利用一個或多個甲基化特異性引物，甲基化狀態(tài)特異性擴增方法包括一個或多個核酸合成步驟。在一個具體實施方式
中，利用一個甲基化特異性引物和一個不根據(jù)靶核酸分子甲基化狀態(tài)而特異性結(jié)合的引物，可以實施甲基化特異性擴增。在另一個具體實施方式
中，利用兩個甲基化特異性引物實施甲基化特異性擴增。在另一個具體實施方式
中，可以在進行甲基化特異性擴增之前實施預(yù)擴增步驟。
根據(jù)本文所披露的方法，靶核酸序列可以用作一步或多步核酸合成的模板。核酸合成步驟可以包括引物延伸、DNA復制、聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)、逆轉(zhuǎn)錄、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)、滾環(huán)擴增、全基因組擴增、鏈置換擴增(SDA)以及基于轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)。
a.預(yù)擴增 在一個具體實施方式
中，在利用甲基化特異性引物進行核酸合成步驟之前，可以實施一個擴增步驟，該步驟可以擴增一個或多個核酸分子而不區(qū)分甲基化和未甲基化核酸分子或基因座。例如，當樣品中的核酸量很低時可以實施這種擴增步驟；通過不區(qū)分樣品中甲基化靶核酸分子和未甲基化靶核酸分子或其他核酸的預(yù)擴增步驟，可以改善甲基化靶核酸分子的檢測。典型的，在用試劑處理核酸樣品之后，可以實施這種擴增步驟，而試劑可以作為核酸分子的甲基化狀態(tài)的函數(shù)而修飾核酸分子的核苷酸序列。盡管這種方法不根據(jù)甲基化狀態(tài)區(qū)分，然而，在這種預(yù)擴增步驟中使用的引物可以用來增加樣品中待分析的特定靶核酸區(qū)域核酸分子相對于核酸總量的量。例如，引物可以設(shè)計為與靶核酸分子的預(yù)先確定區(qū)雜交，以便增加樣品中靶核酸分子的相對量，而不根據(jù)靶核酸分子的甲基化狀態(tài)擴增靶核酸分子。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根據(jù)多個已知因素確定在這種預(yù)擴增步驟中使用的引物，并且包括預(yù)擴增步驟的預(yù)期選擇性以及任何已知的核苷酸序列信息。
b.互補鏈的合成 在利用雙鏈核酸分子的核酸合成方法中，在任何核酸合成步驟之前首先分離鏈。在鏈分離之后，一個或多個引物可以雜交到一個或多個處理過的待擴增的單鏈核酸分子上，并實施核苷酸合成以向每條引物添加核苷酸，以形成與靶核酸分子的鏈互補的鏈。在一個具體實施方式
中，可以進行核酸合成以選擇性擴增處理過的核酸分子兩條鏈中的一條。在另一個具體實施方式
中，合成與處理過的雙鏈靶核酸分子的每條鏈互補的鏈的步驟可以在兩條或多條引物存在時實施，以便至少一條引物可以雜交到每一條鏈，從而引導加合性核苷酸合成。
在利用單鏈核酸分子進行核酸合成的方法中，引物可以雜交到待擴增的單鏈核酸分子上，并可以實施核苷酸合成以向引物上添加核苷酸，以形成與單鏈核酸分子互補的鏈。在一個具體實施方式
中，合成與單鏈核酸分子互補的鏈的步驟在存在兩條或多條引物時實施，以便一條引物可以雜交到靶核酸分子鏈的核苷酸序列上，并且一條引物可以雜交到合成的互補鏈上并引導加成性核苷酸合成。例如，在合成互補鏈后，可以立即進行核酸分子的PCR擴增而無需進一步處理樣品。
c.將首次擴增步驟與后期步驟分離 在另一個具體實施方式
中，合成與單鏈核酸分子互補的鏈的步驟可以單獨實施，通過加成性核苷酸合成反應(yīng)。例如，可以合成互補鏈以形成雙鏈核酸分子，而在擴增雙鏈核酸分子之前，樣品可以經(jīng)歷一個或多個中間步驟。中間步驟可以包括多個處理核酸樣品的方法中任何一個，包括增加核酸分子的純度、去除多余引物、改變反應(yīng)條件(例如緩沖液條件、樣品中存在的酶或反應(yīng)物)以及其他參數(shù)。在一個實施例中，樣品可以經(jīng)歷核酸分子的一個或多個純化步驟。例如，用來生成與核酸分子互補的鏈的引物在其5’末端可以含有一個基團(moiety)，該基團允許鑒定或分離引物或?qū)⒁镆牒怂醿?nèi)。這種基團可以為，例如，可結(jié)合成分(moiety)例如生物素、多組氨酸、磁性珠子或其他合適的底物，由此用可結(jié)合成分的結(jié)合性配偶體接觸樣品可以得到引物已引入的核酸分子內(nèi)的選擇性結(jié)合。這種選擇性結(jié)合可以用來從樣品雜質(zhì)中分離核酸分子，從而增加核酸分子的純度。在實施一個或多個中間步驟例如增強純度的步驟之后，核酸分子可以根據(jù)本文提供的方法以及本領(lǐng)域已知的方法進行擴增。
在這種具體實施方式
的一個變通例中，在合成互補鏈之后，一個或多個第二甲基化特異性引物可以雜交到在前述步驟中合成的互補鏈上，并進行核酸合成。例如，當?shù)谝患谆禺愋砸锾禺愋噪s交到靶核酸分子上時，而靶核酸分子在第一甲基化特異性引物不與其雜交的區(qū)域含有不同核苷酸序列，可以適使用這種具體實施方式
。通過利用不同的第二甲基化特異性引物，可以分離含有不同核苷酸序列的靶核酸分子。例如，根據(jù)核酸分子中第二位置上的序列，可以利用可結(jié)合基團與第二引物的粘附而分離核酸分子。在另一個變通例中，第一擴增步驟的產(chǎn)物可以分成兩份或更多份，并且可以將不同的第二引物加入到每一份中，其中第二引物的部分或全部可以是甲基化特異性引物。利用兩個或多個為甲基化特異性引物的第二引物的具體實施方式
，可以用來在多個不同的第二引物檢測區(qū)上甲基化特異性擴增靶核酸。
d.反應(yīng)參數(shù) 在形成與單鏈靶核酸分子互補的鏈后，可以實施隨后的靶核酸分子擴增步驟，其中互補鏈被分離，引物被雜交到鏈上，并且引物添加到核苷酸上以形成新的互補鏈。鏈分離可以作為獨立的步驟實現(xiàn)，或者與引物延伸產(chǎn)物的合成同時進行。這種鏈分離可以利用多種合適的變性條件完成，包括物理、化學或酶促途徑，所述“變性”包括所有這種途徑。分離核酸鏈的一種物理方法涉及加熱靶核酸分子直到其變性。典型的熱變性可以涉及溫度在約80℃～105℃的范圍內(nèi)，時間在約1～10的范圍內(nèi)。鏈分離還可以通過化學途徑實現(xiàn)，包括高鹽條件或者強堿條件。鏈分離還可以通過來自已知為解旋酶的一類酶的酶誘導，或被RecA酶誘導，其中RecA酶具有解旋酶活性，已知在存在riboATP時可使DNA變性。適合于通過解旋酶的核酸鏈分離的反應(yīng)條件通過Kuhn Hoffmann-Berling，CSH-Quantitative Biology，4363(1978)描述，應(yīng)用RecA的技術(shù)在Ann.Rev.Genetics 16405-437(1982)進行綜述。
在每種擴增步驟后，擴增產(chǎn)物將是雙鏈，其中一條鏈與另一條鏈互補?；パa的鏈可以分離，而且兩條分離的鏈均可以用作合成加成性核酸鏈的模板。這種合成可以在允許引物雜交到模板的條件下進行。通常合成在緩沖的水相溶液中進行，典型的在pH值約為7～9例如pH值約為8。典型的，可以將過量摩爾數(shù)的兩種寡核苷酸引物加入到含有分離的模板鏈的緩沖液中。在某些具體實施方式
中，靶核酸的量是未知的(例如，當本文披露的方法用于診斷性應(yīng)用時)，因此不能肯定地確定引物的量相對于互補鏈的量。
在一個示例性的方法中，三磷酸脫氧核糖核苷酸dATP、dCTP、dGTP和dTTP可以獨立或與引物一起加入到合成混合物中，并且所得的溶液可以加熱到約90℃～100℃，持續(xù)約1～10min，典型的為1～4min。在這種加熱階段后，溶液可以冷卻到約室溫。冷卻的混合物可以加入用于實現(xiàn)引物延伸反應(yīng)的適當?shù)拿?本文稱為“用于聚合作用的酶”)，并且反應(yīng)可以在本領(lǐng)域已知的條件下進行。這種合成(或擴增)反應(yīng)可以在室溫直到一個高于該溫度則聚合作用不能發(fā)生的溫度下進行。例如，如果酶是熱穩(wěn)定的，則用于聚合作用的酶還可以在高于室溫的溫度下使用。在一個具體實施方式
中，擴增方法是利用如在本文描述的以及本領(lǐng)域技術(shù)人員通常使用的PCR?？商鎿Q的擴增方法已經(jīng)被描述且可以應(yīng)用。用于此目的多種合適的酶在本領(lǐng)域中是已知的，包括例如E.coli DNA聚合酶I、E.coli DNA聚合酶I的Klenow片段、T4 DNA聚合酶以及其他可用的DNA聚合酶、聚合酶突變蛋白質(zhì)、逆轉(zhuǎn)錄酶、以及其他酶包括熱穩(wěn)定酶(即，在溫度升高時可以進行引物延伸的酶，典型的，升高的溫度可以引起待擴增的核酸變性)。
e.修飾的三磷酸核苷 在一個具體實施方式
中，根據(jù)本文披露的方法或本領(lǐng)域已知的方法進行的核酸合成反應(yīng)可以利用一種或多種三磷酸核苷。修飾可以例如賦予或者改變通過各自切割方法的靶核酸分子的切割特異性，或者可以改變被切割的靶核酸分子的檢測。例如，三磷酸核苷中的一個或多個可以被類似物取代，該類似物在核苷酸之間生成選擇性的非水解鍵。例如，核苷可以被α-硫代-酶作用物取代，核苷間的磷硫酰鍵隨后可以通過利用試劑諸如鹵代烷(例如，碘乙酰胺、碘乙醇)或2，3-環(huán)氧-1-丙醇的烷化而修飾。其他可以為選擇性非水解性的示例性核苷包括2’氟代核苷、2’脫氧核苷以及2’氨基核苷。
其它示例性修飾的三磷酸核苷包括質(zhì)量修飾的三磷酸核苷，可以使用例如質(zhì)量修飾的三磷酸脫氧核苷、質(zhì)量修飾的三磷酸二脫氧核苷以及質(zhì)量修飾的三磷酸核糖核苷。質(zhì)量修飾的三磷酸核苷可以在堿基、糖和/或磷酸基團(moiety)上進行修飾，并且通過酶促步驟、化學性或二者的組合而引入。在一個方面，修飾可以包括除了羥基以外的2’取代基。在另一個方面，核苷酸之間的鍵可以被修飾，例如，磷硫酰鍵或進一步與烷化劑反應(yīng)的磷硫酰鍵。在又一個方面，修飾的三磷酸核苷可以用甲基進行修飾，例如5-甲基胞嘧啶或5-甲基尿苷。
在另一個具體實施方式
中，靶核酸分子利用天然存在但不是靶核酸分子正常前體的三磷酸核苷進行擴增。例如，正常不存在于DNA中的三磷酸尿苷，可以通過在存在正常DNA前體核苷酸(例如dCTP、dATP和dGTP)及dUTP時擴增DNA，而將其引入到擴增的DNA分子中。這種將尿苷引入到DNA可以促進DNA的堿基特異性切割。例如，當擴增的含有尿苷的DNA是用尿嘧啶-DNA轉(zhuǎn)葡糖基酶(UDG)處理時，尿嘧啶殘基被切割。隨后化學性處理來自UDG反應(yīng)的產(chǎn)物，引起磷酸骨架的切割并產(chǎn)生堿基特異性切割產(chǎn)物。
f.處理過的靶核酸分子的兩條鏈 在一個具體實施方式
中，用可修飾靶核酸分子作為靶核酸分子甲基化狀態(tài)的函數(shù)的試劑處理后，處理過的雙鏈靶核酸分子的兩條鏈將不能保持完全互補。例如，當雙鏈靶核酸分子用重亞硫酸鹽處理時，靶核酸分子兩條鏈上的未甲基化C核苷酸可以被轉(zhuǎn)化為U核苷酸。兩條鏈的互補性G核苷酸未被修飾。因此，每個基于甲基化的靶核酸分子序列修飾可以在靶核酸分子互補鏈之間引起錯配。
基于甲基化的序列修飾處理后，處理靶核酸分子的方法例如擴增和斷裂，可以僅利用處理過的核酸分子的一條鏈或者利用處理過的核酸分子的兩條鏈而進行。例如，用于擴增步驟的引物可以僅與處理過的核酸分子的一條鏈互補，或者可以與處理過的核酸分子的兩條鏈互補。因此，可以實施擴增步驟以生成至少兩種不同的擴增的雙鏈產(chǎn)物，其中處理過的靶核酸分子的兩條鏈被擴增成獨立的雙鏈產(chǎn)物。
可替換的，可以進行擴增，以便處理過的靶核酸分子的兩條鏈中僅一條鏈被擴增。例如，當利用至少一種對兩條鏈中的一條具有選擇性的引物進行擴增時，與引物雜交的鏈可以被選擇性擴增。例如，由于在試劑處理后兩條鏈不再是完全互補物，甲基化特異性引物可以設(shè)計為與第一處理過的鏈的核苷酸序列特異性雜交，而不與第二處理過的鏈的互補物對應(yīng)的核苷酸序列特異性雜交。因此，至少一種引物將選擇性雜交到來源于兩條處理過的靶核酸分子鏈的唯一其中一條的核苷酸序列上。類似的，第二引物也可以設(shè)計為與兩條處理過的靶核酸分子鏈中的僅一條選擇性雜交?？商鎿Q的，第二引物另一條鏈可以設(shè)計為與兩條鏈之一均可雜交，但是，當與第一鏈選擇性引物聯(lián)合應(yīng)用時，將仍引起兩條處理過的靶核酸分子鏈中僅一條的選擇性擴增。
g.擴增后步驟 在一步或多步擴增后，在加成性擴增步驟之前或切割步驟之前，擴增產(chǎn)物可以經(jīng)歷一個或多個處理步驟。例如，在加成性擴增之前或切割之前，擴增產(chǎn)物可以經(jīng)歷一個或多個純化步驟。擴增的產(chǎn)物也可以經(jīng)歷一個或多個修飾擴增產(chǎn)物的步驟。
用于純化核酸分子的方法在本領(lǐng)域中是已知的，包括沉淀、透析或其他溶劑交換、凝膠電泳、雜質(zhì)的酶促降解(例如蛋白酶處理或RNase處理DNA靶核酸分子樣品)、液相層析包括離子交換層析和親和層析以及其他特異性結(jié)合靶核酸分子以將其與雜質(zhì)分離的方法(例如，雜交、生物素結(jié)合)。純化步驟還可以包括分離擴增產(chǎn)物的互補鏈。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認識到，根據(jù)用于隨后擴增、修飾或切割步驟所需要的純度水平和/或樣品組成來選擇使用哪種純化步驟。
修飾被擴增的產(chǎn)物的步驟可以包括任何改變產(chǎn)物組成的方法。這些步驟可以包括分離雙鏈產(chǎn)物的兩條鏈、將核酸雜交到產(chǎn)物的單鏈上、從擴增產(chǎn)物的5’或3’末端添加或去除基團(例如熒光染料、生物素、信號序列以及其他本文披露的或在本領(lǐng)域中已知的成分)、修飾核苷酸堿基、修飾磷酸二酯鍵或者修飾糖基。
h.擴增產(chǎn)物的多個等份 用于確定靶核酸中甲基化的方法可以包括一些方法，其中單一樣品在一個或多個步驟中加以處理，然后單一樣品可以分成兩份或多份用于隨后步驟中的平行處理。平行處理樣品等份可以提供有關(guān)靶核酸分子中甲基化的互補性信息。例如，單一樣品可以在用接觸樣品的步驟中用試劑進行處理，而該試劑根據(jù)靶核酸分子的甲基化狀態(tài)修飾靶核酸分子的序列；然后單一樣品可以被擴增；并且在斷裂之前，將單一樣品分成兩分或多份，使得每一不同的等份可以在不同的斷裂條件下處理。來自每一等份的不同斷裂模式可以提供與其他等份的質(zhì)譜提供信息的補充信息。因此，通過將單一樣品分成兩份或多份，可以獲得關(guān)于靶核酸分子中甲基化的補充信息。
擴增后，擴增產(chǎn)物可以分成兩份或多份。例如，在擴增后但在切割擴增產(chǎn)物之前，可以將擴增產(chǎn)物分成兩份或多份；在擴增后可以將擴增產(chǎn)物分成兩份或多份，并且經(jīng)歷進一步的步驟例如一個或多個擴增產(chǎn)物純化步驟或擴增產(chǎn)物修飾步驟。。
當在切割前將擴增產(chǎn)物分成兩份或多份時，對所述兩份或多份中的每一份可以應(yīng)用不同的切割方法。例如，第一靶核酸分子等份可以用RNaseA特異性斷裂，同時第二靶核酸分子等份可以用RNaseT1特異性斷裂。在另一個實施例中，擴增的靶核酸分子可以分成4份，并且每份可以用不同的堿基特異性試劑處理以生成4組不同的堿基特異性切割的靶核酸分子片段。分成兩份或多份可以實現(xiàn)對同一個擴增產(chǎn)物實施不同的切割反應(yīng)。對同一個擴增產(chǎn)物使用不同的切割反應(yīng)在本文提供的切割方法中將進一步描述。
在另一個具體實施方式
中，處理過的靶核酸分子或其擴增產(chǎn)物可以分成兩份或多份，可以實施兩個或多個不同的擴增步驟以從相同的處理過的核酸產(chǎn)生兩種或多種不同的擴增產(chǎn)物。例如，可以對處理過的靶核酸的PCR產(chǎn)物實施兩個或多個不同的轉(zhuǎn)錄步驟。兩種不同轉(zhuǎn)錄步驟的實例是其中第一轉(zhuǎn)錄反應(yīng)將rATP、rGTP、rCTP和dTTP引入到轉(zhuǎn)錄物，而第二轉(zhuǎn)錄反應(yīng)則將rATP、rGTP、rTTP和dCTP引入到轉(zhuǎn)錄物，從而兩個合成的轉(zhuǎn)錄物引入其中的脫氧核苷酸不同。
不同的擴增步驟可以包括在不同等份中使用不同的酶、在不同等份中使用不同的反應(yīng)條件、在不同等份中使用不同的核苷或核苷類似物，而且可以設(shè)計為擴增處理過的靶核酸分子或擴增處理過的靶核酸分子的一條鏈的擴增產(chǎn)物的一條特異性鏈。例如，不同的擴增反應(yīng)可以含有質(zhì)量、化學組成典型事件(typical occurrence)(典型vs.非典型核苷)不同的核苷酸，如本文披露以及本領(lǐng)域中已知的。不同的擴增步驟可以用來在不同核苷酸基因座切割、具有不同的切割產(chǎn)物質(zhì)量或者可以通過不同的方法檢測的擴增產(chǎn)物。
典型的，兩種或多種不同的擴增步驟將產(chǎn)生不同的擴增產(chǎn)物，典型的，不同的擴增產(chǎn)物將具有不同的斷裂性質(zhì)。不同的擴增產(chǎn)物一般將為至少一個原子不同的靶核酸分子。例如，第一擴增產(chǎn)物可以含有脫氧胞嘧啶核苷酸，而第二擴增產(chǎn)物可以含有核糖ribonucleic胞嘧啶核苷酸，其中兩個擴增產(chǎn)物之間的區(qū)別是存在鍵合到核苷酸糖基2’碳的氧原子。典型的，具有不同斷裂性質(zhì)的擴增產(chǎn)物，即當在相同切割條件下處理時能夠產(chǎn)生不同組切割產(chǎn)物的擴增產(chǎn)物。例如，含有一個或多個脫氧胞嘧啶核苷酸的轉(zhuǎn)錄物將具有與含有一個或多個脫氧胸腺嘧啶的轉(zhuǎn)錄物不同的RNAseA切割模式。
樣品可以分成兩份或多份，不同的份中特異性擴增靶核酸分子的不同鏈。例如，處理過的靶核酸分子可以含有非互補鏈，可以在不同的份中采用諸如甲基化狀態(tài)特異性引物的不同引物擴增不同的鏈。在另一個具體實施方式
中，根據(jù)每一份中所使用的引物，擴增靶核酸分子的互補鏈可以在不同份中分別擴增。例如，擴增的靶核酸分子樣品可以分成兩份或多份，其中正向鏈在第一組等份中轉(zhuǎn)錄，反向鏈在第二組等份中轉(zhuǎn)錄。如本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解到，樣品可以分為任何多個等份，其中可以實施本文描述的平行反應(yīng)的任何組合。
i.多重擴增 擴增方法可以同時在兩個或多個靶核酸分子上進行實施，例如可通過多重PCR方法。在這種具體實施方式
中，引物可以作為一個或多個靶核酸分子的甲基化特異性引物。典型的，每個靶核酸分子可以用不同甲基化特異性引物雜交，以擴增多個不同的靶區(qū)域。多個靶核酸或其擴增子可以經(jīng)受斷裂條件包括例如堿基特異性切割。
多重擴增還可以在靶核酸分子上實施，檢測從一個或多個斷裂反應(yīng)產(chǎn)生的片段。在一個檢測片段的具體實施方式
中，當待檢測以及在甲基化鑒定中使用的質(zhì)量(masses)相互不交迭時，可以實施多重擴增。當兩個或多個靶核酸的質(zhì)量mass斷裂以及測定的質(zhì)量masses為已知或可以推算時，則可以測定或推測得到質(zhì)量masses的交迭。在該上下文中，交迭指的是足以分別決定兩個或多個片段存在的兩個或多個片段的質(zhì)量或測定質(zhì)量的差異。當質(zhì)量mass片段相互不交迭時，可以實施多重擴增，而且在甲基化鑒定的方法中，所得到的質(zhì)量mass可以與適當?shù)陌泻怂岱肿勇?lián)系起來。例如，根據(jù)靶核酸分子核苷酸序列和引物設(shè)計的知識，可以推測來自兩個或多個擴增產(chǎn)物的斷裂模式，以生成不具有相同質(zhì)量的片段；這些片段的質(zhì)量測定可以在一個質(zhì)譜測定中實施，并且根據(jù)推算的斷裂模式，可以將得到的測定質(zhì)量與適當?shù)陌泻怂崧?lián)系起來。
當靶核酸分子的核苷酸序列已知時，可以設(shè)計引物和斷裂方法以減少片段交迭，通過例如增加推測片段的核苷酸組成差異。減少交迭的引物和斷裂方法將是靶核酸核苷酸序列的函數(shù)，且可以很容易被本領(lǐng)域技術(shù)人員確定。
在另一個多重擴增的具體實施方式
中，某些片段mass可以交迭，但仍然可以利用非交迭峰實施甲基化鑒定方法。在這種具體實施方式
中，斷裂模式的一部分對于靶核酸分子可以是非交迭的，來自該非交迭部分的質(zhì)量masses可以用于本文提供的甲基化鑒定方法中。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以確定非交迭片段質(zhì)量masses是否適合于甲基化鑒定方法，通過確定質(zhì)量移位、新片段質(zhì)量或缺失片段的質(zhì)量可否被檢測以及可否與靶核酸分子的甲基化狀態(tài)聯(lián)系起來。
在其他具體實施方式
中，兩個或多個含有甲基化狀態(tài)信息的靶核酸分子片段的質(zhì)量可以相互交迭。在這些具體實施方式
中，來自兩個或多個靶核酸分子的片段仍然可以通過利用多種方法中的一種或多種而用于多重擴增方法。例如，交迭片段可以通過修飾靶核酸分子的一個或多個的片段質(zhì)量而使其不再相互交迭。本文描述了用于核酸分子質(zhì)量修飾的方法。例如，來自兩個靶核酸分子的交迭片段質(zhì)量的分離可以通過RNA整合，即將rCTP、rGTP、rUTP和rATP引入到第一轉(zhuǎn)錄物而將rCTP、rGTP、dTTP和rATP引入到另第二轉(zhuǎn)錄物。
在多重測定中使用的核酸分子可以來自多種來源中的任何一種。例如，多重核酸分子可以是來自相同個體的不同染色體或不同基因組區(qū)域的核酸分子、處理過的靶核酸分子的正向和反向鏈(其中，對靶核酸分子的處理已經(jīng)使得兩條鏈非互補)、核酸分子的正向和反向互補鏈、不同個體的不同基因組或染色體區(qū)域、或在本文描述的方法中可以分別測定的任何其他不同的序列。
在多重測定中使用的核酸分子還可以包括具有相同核苷酸序列的核酸分子。典型的，這種多重測定可以用來確定樣品中存在的甲基化和未甲基化核苷酸或核苷酸基因座的相對量。例如，樣品可以含有來自多個個體的相同基因組區(qū)域的核酸分子。這種多重測定可以用于確定一群個體中的甲基化頻率。在另一個實施例中，多重可以包含來自單一個體的二倍體DNA的兩個拷貝，其中二倍體DNA的兩個拷貝的甲基化狀態(tài)將被確定。
3.核苷酸合成阻滯劑 靶核酸分子的甲基化特異性擴增可以利用處理過的靶核酸分子的一個區(qū)域的特異引物而實施，該區(qū)域含有預(yù)期核苷酸序列，例如反映未處理的靶核酸分子中一個或多個甲基化或未甲基化核苷酸的核苷酸序列。另外，靶核酸分子的甲基化特異性擴增可以利用寡核苷酸實施，該寡核苷酸不作為引物而是用來抑制其雜交的靶核酸分子的擴增。這種寡核苷酸，本文命名為核苷酸合成阻滯劑或擴增阻滯劑，可以結(jié)合到含有非預(yù)期序列的靶核酸分子上，例如在未處理的靶核酸分子中僅反映未甲基化核苷酸或選定的甲基化核苷酸的核苷酸序列。例如，當用重亞硫酸鹽處理靶核酸分子時，可以使用擴增阻滯劑與處理過的靶核酸區(qū)域雜交，其中一個或多個胞嘧啶核苷酸已經(jīng)轉(zhuǎn)化為尿嘧啶。在另一個具體實施方式
中，當用重亞硫酸鹽處理靶核酸分子時，可以使用擴增阻滯劑與處理過的含有一個或多個胞嘧啶核苷酸的靶核酸區(qū)域雜交。因此，本文提供的用于本文描述的核苷酸合成的方法還可以向其中添加一種或多種核苷酸合成阻滯劑。擴增阻滯劑的其他應(yīng)用在本領(lǐng)域是已知的，例如美國專利20030082600號中所提供的。
a.核苷酸合成阻滯劑的組成和性質(zhì) 核苷酸合成阻滯劑或擴增阻滯劑是雜交到不被擴增的樣品中的一個或多個核酸的寡核苷酸。典型的，擴增阻滯劑不含有3’-羥基基團，以便在核苷酸合成反應(yīng)期間其他的核苷酸不能加成到擴增阻滯劑上。在一個具體實施方式
中，擴增阻滯劑結(jié)合到核酸的至少一個核苷酸基因座上，其中核苷酸基因座的甲基化狀態(tài)待分析。例如，當樣品用重亞硫酸鹽處理時，擴增阻滯劑可以結(jié)合到核酸中的U(或T)核苷酸上，其中U/T核苷酸從C核苷酸到U核苷酸的基于重亞硫酸鹽的轉(zhuǎn)化結(jié)果而產(chǎn)生。在另一個實施例中，當樣品用重亞硫酸鹽處理時，擴增阻滯劑可以結(jié)合到核酸中的C核苷酸上，其中C核苷酸未因為重亞硫酸鹽處理而轉(zhuǎn)化為U(或T)核苷酸。
在用甲基化特異性試劑例如重亞硫酸鹽處理之前，可以根據(jù)核酸是甲基化或未甲基化而加入擴增阻滯劑，其特異性結(jié)合到核酸區(qū)域上，包括靶核酸分子或擴增產(chǎn)物的區(qū)域。在擴增阻滯劑的一種應(yīng)用中，當一種或多種擴增阻滯劑結(jié)合與其靶核酸分子不如結(jié)合背景DNA或不具有預(yù)期序列的核酸分子那么有效時，具有預(yù)期序列的處理過的靶核酸分子被擴增。即，擴增阻滯劑可以選擇性阻滯背景DNA和不具有預(yù)期序列的核酸分子的擴增。例如，擴增阻滯劑可以結(jié)合到具有反映未甲基化核苷酸的核苷酸序列的核酸分子上(例如，當使用重亞硫酸鹽時，結(jié)合含有U/T的序列，如果U/T產(chǎn)生于從未甲基化胞嘧啶向尿嘧啶的重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化)。在另一個實施例中，擴增阻滯劑可以結(jié)合到具有反映甲基化核苷酸的核苷酸序列的核酸分子上(例如，當使用重亞硫酸鹽時，結(jié)合含有C的序列，其中C未被重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化為U)。
在使用擴增阻滯劑的上下文中，具有預(yù)期的序列的靶核酸分子或擴增產(chǎn)物指的是含有反映未處理的靶核酸分子中一個或多個甲基化或未甲基化核苷酸的核苷酸序列的核酸分子。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)實驗設(shè)計確定核苷酸序列的滿意度。例如，當靶核酸分子中一個或多個未甲基化胞嘧啶基因座待確定時，預(yù)期的重亞硫酸鹽處理的序列在一個或多個C核苷酸的位置含有一個或多個U/T核苷酸，且待擴增的預(yù)期的核酸分子含有這些U/T核苷酸。在另一個實施例中，當靶核酸中一個或多個甲基化胞嘧啶基因座待確定時，預(yù)期的重亞硫酸鹽處理的序列含有的一個或多個C核苷酸未被重亞硫酸鹽處理而轉(zhuǎn)化，且待擴增的預(yù)期的核酸分子含有這些C核苷酸。典型的，相對于結(jié)合到含有預(yù)期序列的核酸分子上，擴增阻滯劑將更易于結(jié)合到具有非預(yù)期序列的核酸分子上。
擴增阻滯劑可以短至兩個核苷酸，例如CG、TG或CA二核苷酸，或者擴增阻滯劑可以長于兩個核苷酸。例如，擴增阻滯劑可以含有3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個核苷酸，且可以結(jié)合到特異性序列上以抑制擴增阻滯劑雜交的序列的擴增。擴增阻滯劑的核苷酸組成可以根據(jù)待確定的甲基化狀態(tài)以及用來處理靶核酸分子的甲基化特異性試劑而選擇。例如，當使用重亞硫酸鹽且甲基化胞嘧啶待確定時，設(shè)計用來直接結(jié)合到處理過的靶核酸分子上的擴增阻滯劑可以含有A、C和T/U核苷酸，但不含有G核苷酸。設(shè)計用來結(jié)合到與重亞硫酸鹽處理的靶核酸分子互補的核酸上的擴增阻滯劑可以含有A、G和T/U核苷酸，但不含有C核苷酸。在另一個實施例中，當使用重亞硫酸鹽且未甲基化胞嘧啶待確定時，設(shè)計用來直接結(jié)合到處理過的靶核酸分子上的擴增阻滯劑可以含有G、C和T/U核苷酸，但不含有A核苷酸。設(shè)計用來結(jié)合到與重亞硫酸鹽處理的靶核酸分子互補的核酸上的擴增阻滯劑可以含有A、G和C核苷酸，但不含有T/U核苷酸。
在一個具體實施方式
中，擴增阻滯劑可以設(shè)計為特異性結(jié)合到具有非預(yù)期序列的核酸分子上(即，在擴增阻滯劑雜交位點，重亞硫酸鹽處理的靶核酸分子序列含有一個或多個尿嘧啶)，而結(jié)合到具有預(yù)期序列(即，重亞硫酸鹽處理的具有胞嘧啶的靶核酸分子序列)的靶核酸分子上則特異性或親和性低得多。在一個實施例中，擴增阻滯劑可以特異性雜交到僅含有A、T和G的靶核酸分子序列上，而不能特異性雜交到含有一個或多個C核苷酸的靶核酸分子序列上。這些擴增阻滯劑一般將不含有G核苷酸。類似的，當擴增阻滯劑結(jié)合到與處理過的靶核酸分子互補的序列上時，擴增阻滯劑可以特異性結(jié)合到僅含有A、T和C核苷酸的核苷酸序列上，而不能特異性雜交到含有一個或多個G核苷酸的靶核酸分子序列上。這些擴增阻滯劑一般將不含有C核苷酸。
某些示例性的擴增阻滯劑可以特異性雜交到核酸分子中含有TG或CA二核苷酸序列的區(qū)域。這種核酸分子含有的核苷酸序列反映重亞硫酸鹽處理的未甲基化CpG二核苷酸序列或與其互補的序列。因此，擴增阻滯劑可以含有TG或CA二核苷酸序列。在一個具體實施方式
中，擴增阻滯劑含有兩個或多個TG或CA二核苷酸序列，其可以結(jié)合例如重亞硫酸鹽處理的未甲基化CpG島或與其互補的序列。
其它示例性的擴增阻滯劑可以特異性的雜交到核酸分子中含有GC或CG二核苷酸序列的區(qū)域。這種核酸分子含有的核苷酸序列反映重亞硫酸鹽處理的未甲基化CpG二核苷酸序列或與其互補的序列。因此，擴增阻滯劑可以含有GC或CG二核苷酸序列。在一個具體實施方式
中，擴增阻滯劑含有兩個或多個GC或CG二核苷酸序列，其可以結(jié)合例如重亞硫酸鹽處理的未甲基化CpG島或與其互補的序列。
擴增阻滯劑可以具有這樣的性質(zhì)，即其不能被核苷酸合成反應(yīng)中使用的酶延伸。這一點可以通過利用在3’位置具有其他功能的3’-脫氧寡核苷酸或寡核苷酸而實現(xiàn)，例如，3’-O-乙?；押塑账?。另外，擴增阻滯劑一般不易于通過在擴增反應(yīng)中使用的酶而水解。這一點可以通過利用不具有核酸酶活性的酶或利用修飾的非水解寡核苷酸而實現(xiàn)，其中非水解寡核苷酸可以具有例如5’末端的硫代硫酸橋賦予水解抗性。
b.核酸合成阻滯劑的應(yīng)用 甲基化特異性擴增阻滯劑以及甲基化特異性引物或未甲基化特異性引物同時存在時，可以實施甲基化特異性擴增。因此，擴增阻滯劑的應(yīng)用可以允許在甲基化特異性擴增反應(yīng)中使用各種各樣的引物。在一個具體實施方式
中，擴增阻滯劑與甲基化特異性引物聯(lián)合應(yīng)用。在這種具體實施方式
中，擴增阻滯劑可以抑制背景DNA以及具有非預(yù)期序列的核酸分子的擴增，而甲基化特異性引物可以優(yōu)先擴增具有預(yù)期序列的核酸分子。在這種方法中，在靶核酸分子樣品中可能存在非常高的相對量的背景DNA以及具有非預(yù)期序列的核酸分子，然而僅具有預(yù)期序列的核酸分子被擴增。
在一個具體實施方式
中，擴增阻滯劑可以指向未甲基化核酸分子的引物檢測區(qū)，其中所述引物檢測區(qū)是甲基化核酸分子中甲基化特異性引物結(jié)合的位點。在這種具體實施方式
中，甲基化特異性引物可以用于最初的核酸合成反應(yīng)步驟中，并且隨后可以加入擴增阻滯劑以抑制由于非目的性雜交導致的擴增(例如，防止擴增與甲基化特異性引物雜交但為錯配的核酸)。利用甲基化特異性引物，起始的兩個核酸合成反應(yīng)步驟可以選擇性生成與具有預(yù)期序列的處理過的單鏈靶核酸分子互補的核酸，并用來選擇性復制處理過的單鏈靶核酸分子。某些擴增可以來自于在引物雜交區(qū)具有非預(yù)期序列的核酸分子的非目的性雜交(典型的，來自于一個或多個錯配的堿基對的序列)，在幾個擴增循環(huán)后，由于引物整合入擴增產(chǎn)物中，所以甲基化特異性引物不能防止選擇這些序列。在起始的幾個擴增步驟中，引物整合的擴增產(chǎn)物的量相對小于多個步驟之后的量。因此，通過在一個或兩個核苷酸合成步驟后應(yīng)用擴增阻滯劑，所述阻滯劑將雜交到具有非預(yù)期序列的核酸中非引物整合區(qū)，以抑制其擴增。因此，擴增阻滯劑可以用來降低甲基化特異性引物與具有非預(yù)期序列的核酸的非目的性雜交的量，從而減少來自非預(yù)期序列的擴增產(chǎn)物。
在另一個具體實施方式
中，擴增阻滯劑可以對核酸或其他核酸分子的一個區(qū)域特異，該區(qū)域不同于甲基化特異性引物雜交的區(qū)域。在這種具體實施方式
中，擴增阻滯劑可以用來抑制具有非預(yù)期序列的核酸在每一個擴增步驟期間的擴增。因此，在核酸合成的起始步驟中，甲基化特異性引物可以用來選擇性擴增核酸，典型的具有預(yù)期序列的靶核酸分子，而擴增阻滯劑可以進一步用來在每一個擴增步驟選擇性抑制具有非預(yù)期序列的核酸擴增。
在另一個具體實施方式
中，當靶核酸分子含有兩個用于甲基化特異性擴增的選擇性的區(qū)域，并且待分析其甲基化狀態(tài)的預(yù)期全長靶核酸分子大于含有兩個用于甲基化特異性擴增的選擇區(qū)并介于二者之間的核酸部分時，可以使用甲基化特異性引物與擴增阻滯劑的組合物。例如，相對于待分析的靶核酸分子的全長，當用于甲基化特異性擴增的兩個區(qū)域接近于在一起時，可以采用這種組合。例如，待分析的靶核酸分子長度為200個核苷酸，但是可以含有兩個由20個核苷酸分開的特定區(qū)域，其將用于靶核酸分子的選擇性擴增。在這種情況下，選擇性區(qū)域的其中之一可以由甲基化特異性引物處理/定向(targeted)，而另一個選擇性區(qū)域擇由擴增阻滯區(qū)處理/定向targeted。例如，一個引物可以是甲基化特異性引物、另一個引物可以是甲基化非特異性引物，且其他的甲基化特異性可以通過使用一種或多種擴增阻滯劑而賦予。
c.多個核酸合成阻滯劑的應(yīng)用 在一個具體實施方式
中，可以采用兩個或多個擴增阻滯劑。典型的，采用不多于兩條甲基化特異性引物來選擇特定的靶核酸分子，與之對比的是，可以采用的擴增阻滯劑的數(shù)量不加以限定。例如，可以利用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個擴增阻滯劑賦予甲基化特異性。每個擴增阻滯劑可以含有不同的核苷酸數(shù)量，而且使用多個擴增阻滯劑可以包括使用含有共用序列的擴增阻滯劑(例如，使用具有TTA序列的擴增阻滯劑三核苷酸或具有TTAA序列的擴增阻滯劑四核苷酸)。在一個實施例中，至少一個擴增阻滯劑結(jié)合到核酸序列上，以便抑制甲基化特異性引物與核酸的非目的性雜交。在另一個實施例中，至少一個擴增阻滯劑結(jié)合到除甲基化特異性引物可以非目的性雜交的序列以外的核酸序列上。在另一個實施例中，僅僅利用擴增阻滯劑賦予甲基化特異性(例如，利用甲基化特異性擴增阻滯劑以及甲基化非特異性引物進行甲基化特異性擴增)。在另一個實施例中，靶核酸分子的兩個或多個區(qū)域可以用擴增阻滯劑處理。當在應(yīng)用中使用的少于兩個引物是甲基化特異性引物時，擴增可以利用一個或多個甲基化非特異性引物。當甲基化特異性僅通過使用一個或多個擴增阻滯劑來決定時，兩個擴增引物均可以為甲基化非特異性引物。
在一個具體實施方式
中，擴增阻滯劑不用于首次甲基化特異性核酸合成反應(yīng)。例如，當用甲基化特異性引物接觸處理過的單鏈靶核酸分子，且核酸合成將核苷酸添加到引物上以形成與處理過的靶核酸分子互補的鏈時，可以省略擴增阻滯劑。擴增阻滯劑在互補鏈合成之后的步驟中也可以省略。因此，在第一個、第二個或者第一個以及第二個核酸合成反應(yīng)中，可以免用擴增阻滯劑。在無需擴增阻滯劑的核酸合成反應(yīng)之后，在核酸擴增反應(yīng)期間可以加入擴增阻滯劑。例如，甲基化特異性引物可以用于具有預(yù)期序列的靶核酸分子的初始甲基化特異性合成，然后在隨后的擴增步驟期間，擴增阻滯劑可以用來防止除具有預(yù)期序列的靶核酸分子以外的核酸的擴增。
4.斷裂與核苷酸合成的聯(lián)合 選擇性核苷酸合成還可以與斷裂聯(lián)合實施。通過多個核酸合成循環(huán)擴增的靶核酸將利用引物雜交到靶核酸分子的兩個獨立區(qū)域上。靶核酸分子在兩個引物雜交位點之間內(nèi)的中心區(qū)的斷裂，將防止靶核酸分子的擴增。因此，即使在核酸合成中使用的引物不是選擇性的引物時，核酸分子中心區(qū)的選擇性斷裂可以導致靶核酸分子的選擇性擴增。
在一個實施例中，在用核酸合成條件處理之前，以及在用修飾所述靶核酸分子序列的試劑作為核酸甲基化狀態(tài)的函數(shù)處理之前，可以用斷裂條件處理樣品。在這個實施例中，斷裂條件可以對甲基化或未甲基化核苷酸具有選擇性。例如，樣品中可以加入甲基化敏感性內(nèi)切核酸酶例如HPA II，該酶可以在未甲基化識別位點而不是甲基化識別位點切割，這就導致樣品當識別位點為甲基化時含有完整的靶核酸分子，而識別位點為未甲基化時含有切割的靶核酸分子。樣品然后可以通過核酸合成條件處理，采用的引物經(jīng)設(shè)計使得僅未切割的靶核酸分子被擴增。作為切割的結(jié)果，擴增將對識別位點為甲基化的靶核酸分子具有選擇性。
在另一個實施例中，在用核酸合成條件處理之前，但在用修飾靶核酸分子序列作為靶核酸甲基化狀態(tài)的函數(shù)的試劑處理之后，可以用斷裂條件處理樣品。例如，樣品中可以加入內(nèi)切核酸酶，該酶在具體基因座包含C核苷酸的識別位點切割，但在具體基因座包含T或U核苷酸的識別位點則不切割。反之，樣品可以樣品中可以加入內(nèi)切核酸酶，該酶在具體基因座包含T或U核苷酸的識別位點切割，但在具體基因座包含C核苷酸的識別位點則不切割。樣品可以首先用修飾靶核酸分子序列作為靶核酸分子甲基化狀態(tài)的函數(shù)的試劑進行處理，然后用這種內(nèi)切核酸酶處理。所得的樣品將含有在識別位點具有預(yù)期甲基化狀態(tài)的完整靶核酸分子，并含有在識別位點具有非預(yù)期甲基化狀態(tài)的切割的靶核酸分子。樣品隨后可以用利用設(shè)計的引物的核酸合成條件處理，以便僅為切割的靶核酸分子被擴增。作為切割的結(jié)果，擴增將對識別位點為甲基化的靶核酸分子具有選擇性。
可以在這種方法中使用的斷裂條件包括任何可以選擇性切割甲基化核酸分子或未甲基化核酸分子的斷裂條件，包括可以選擇性切割甲基化核酸分子或未甲基化核酸分子的內(nèi)切核酸酶?？梢允褂玫牧硗獾臄嗔褩l件包括任何可以通過序列特異性切割的斷裂條件，例如，選擇性切割在特定基因座含有C核苷酸的核苷酸序列的內(nèi)切核酸酶，或者選擇性切割在特定基因座含有U或T核苷酸的核苷酸序列的內(nèi)切核酸酶。
與核酸合成聯(lián)合使用的斷裂還可以與其他甲基化特異性方法聯(lián)合使用，包括那些本文提供的方法。例如，與核酸合成聯(lián)用的斷裂可以利用甲基化特異性引物實施，且與核酸合成聯(lián)用的斷裂可以利用擴增阻滯劑實施。如本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，本文提供的方法的任何組合均可以聯(lián)用。
5.轉(zhuǎn)錄 轉(zhuǎn)錄方法利用模板DNA分子以形成RNA分子，其可以用來擴增靶核酸分子以及將靶核酸分子從DNA形式修飾成RNA形式。示例性的模板DNA包括擴增的產(chǎn)物靶核酸分子以及處理過的未擴增的靶核酸分子。
如本文所描述的，處理過的靶核酸分子經(jīng)歷一個或多個核酸合成反應(yīng)。核酸合成反應(yīng)可以用來擴增處理過的靶核酸分子和/或修飾核酸分子的形式。在一個具體實施方式
中，處理過的靶核酸分子或PCR產(chǎn)物被轉(zhuǎn)錄。
模板DNA例如靶核酸分子或其擴增產(chǎn)物的轉(zhuǎn)錄，或其擴增的產(chǎn)物可以對模板DNA的一條鏈或兩條鏈而實施。在一個具體實施方式
中，待轉(zhuǎn)錄的核酸分子含有能實施轉(zhuǎn)錄的酶結(jié)合的基團(moiety)，這種基團可以為例如轉(zhuǎn)錄啟動子序列。
轉(zhuǎn)錄反應(yīng)可以利用本領(lǐng)域已知的多種方法中的任何一種并利用本領(lǐng)域已知的多種酶中的任何一種來實施。例如，具有整合dNTP和rNTP能力的突變體T7RNA聚合酶(T7R&DNA聚合酶；Epicentre，Madison，WI)可以用于轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中。轉(zhuǎn)錄反應(yīng)可以在本領(lǐng)域已知的標準反應(yīng)條件下進行，例如40mM Tris-Ac(pH＝7.5)、10mM NaCl、6mM MgCl2、2mM亞精胺、10mM二硫蘇糖醇、1mM每種rNTP、5mM dNTP(當使用時)、40nM DNA模板、以及5U/μL T7R&DNA聚合酶，在37℃孵育2小時。轉(zhuǎn)錄后，可以將蝦堿性磷酸酶加入切割反應(yīng)中以減少環(huán)磷酸副產(chǎn)品的量。T7R&DNA聚合酶的使用在本領(lǐng)域中是已知的，如美國專利5,849,546，6,107,037號以及Sousa et al.EMBO J.144609-4621(1995)，Padilla et al.Nucl.Acid Res.271561-1563(1999)，Huang et al.Biochemistry 368231-8242(1997)，and Stanssens et al.GenomeRes.14126-133(2004)所例證的。
除了用四種常規(guī)的核糖核苷酸底物(rCTP、rATP、rGTP以及rUTP)進行轉(zhuǎn)錄外，還可以用核苷類似物取代一種或多種三磷酸核糖核苷而實施轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，例如那些本文提供的以及本領(lǐng)域已知的或者具有相應(yīng)的三磷酸脫氧核糖核苷的核苷類似物(例如，用dCTP取代rCTP、或用dUTP或dTTP取代rUTP)。在一個具體實施方式
中，一個或多個rNTP用核苷或核苷類似物取代，整合入轉(zhuǎn)錄的核酸后，在應(yīng)用于轉(zhuǎn)錄的核酸的斷裂條件下，核苷或核苷類似物不是可切割的。
在一個具體實施方式
中，轉(zhuǎn)錄的實施在一個或多個核酸合成反應(yīng)之后，包括一個或多個利用甲基化特異性引物的核酸合成反應(yīng)。例如，擴增產(chǎn)物的轉(zhuǎn)錄可以在靶核酸分子擴增之后進行，包括靶核酸分子的甲基化特異性擴增。在另一個具體實施方式
中，處理過的靶核酸分子無須經(jīng)過任何前序核酸合成步驟而進行轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄可以在缺乏本文描述的擴增阻滯劑時進行，或者可以在存在擴增阻滯劑時進行。例如，擴增可以在存在一種或多種甲基化特異性擴增阻滯劑時進行。
6.擴增靶核酸分子同時保持甲基化序列 本文還提供了能保持任何甲基化殘基甲基化的擴增甲基化靶核酸分子的方法。在這種實施例中，甲基化的靶核酸分子可以在核酸合成步驟中作為模板鏈，例如本文描述的或本領(lǐng)域已知的核酸合成方法。雙鏈產(chǎn)物將含有一個甲基化鏈以及一個未甲基化鏈。然后，雙鏈靶核酸分子的新合成的未甲基化鏈可以選擇性甲基化。甲基化反應(yīng)可以參照核酸模板鏈的甲基化狀態(tài)，而在新合成鏈的特定胞嘧啶堿基上進行。例如，當模板鏈上的CpG二核苷酸為甲基化時，新合成鏈上可雜交到甲基化二核苷酸中鳥嘌呤的胞嘧啶，可以在5’位置被甲基化。在一個具體實施方式
中，在合成鏈的甲基化傳導(conductive to)條件下，可以通過雙鏈核酸與甲基轉(zhuǎn)移酶接觸而實施這種方法。酶的甲基酶活性可以是合成的鏈內(nèi)CpG二核苷酸可以被甲基化以反映模板鏈上相應(yīng)CpG二核苷酸的甲基化，因此，保持模板鏈的基因組甲基化模式。
甲基化反應(yīng)完成后，兩條甲基化的鏈可以被分離，并且分離的鏈可以進行進一步的核酸合成反應(yīng)步驟。核酸合成完成后，每個雙鏈核酸將含有一條甲基化鏈和一條未甲基化鏈。未甲基化鏈然后可以進行本文描述的或者本領(lǐng)域已知的甲基化步驟。作為第二輪核酸合成和甲基化的結(jié)果，可以生成模板靶核酸鏈的復制物，能精確保持初始模板靶核酸鏈中CpG二核苷酸的甲基化狀態(tài)。
可以用于甲基化步驟中的甲基化酶包括那些能根據(jù)模板鏈上相應(yīng)的CpG二核苷酸內(nèi)胞嘧啶的甲基化狀態(tài)而在5’位置將胞嘧啶甲基化的酶。當模板鏈CpG內(nèi)的胞嘧啶為甲基化時，與其雜交的合成鏈的相應(yīng)CpG可以通過甲基酶的作用而在胞嘧啶核苷酸的5’位置被甲基化。如果模板鏈CpG內(nèi)的胞嘧啶為未甲基化時，合成鏈上相應(yīng)的CpG將保持未甲基化。反應(yīng)可以利用適當?shù)木彌_液和其他試劑以及所選酶的供應(yīng)商所建議的反應(yīng)條件而實施，這些條件可以包括甲基供體分子例如腺苷甲硫氨酸。在一個具體實施方式
中，加成到合成鏈的甲基攜帶可檢測標記物，包括質(zhì)量標記物，可以根據(jù)本文描述的以及本領(lǐng)域已知的方法將其引入到合成的核酸鏈的胞嘧啶內(nèi)。
酶可以來自多種來源中的任何一種，例如人類、小鼠、重組體、以及其他來源的酶。在一個具體實施方式
中，甲基轉(zhuǎn)移酶是DNA(胞嘧啶-5)甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT1)。幾種甲基轉(zhuǎn)移酶是已知的，例如，能傳播未甲基化鏈內(nèi)半甲基化DNA的甲基化模式的甲基轉(zhuǎn)移酶家族，例如重組的人類DNMT1(參見Pradhan，S.Bacolla，A.Wells，R.D.Roberts，R.J.“重組人類DNA(胞嘧啶-5)甲基轉(zhuǎn)移酶I.表達、純化以及重新甲基化和維持甲基化的比較”J.Biol.Chem.27433002-33010和Bacolla，A.Pradhan，S.Roberts，R.J.Wells，R.D.“重組人類DNA(胞嘧啶-5)甲基轉(zhuǎn)移酶.II.穩(wěn)態(tài)動力學揭示甲基化DNA的變構(gòu)激活”J.Biol.Chem.27433011-33019)。在一個具體實施方式
中，甲基化轉(zhuǎn)移酶是維持甲基化轉(zhuǎn)移酶。本文描述的擴增/甲基化方法以及用于實施這些方法的試劑在本領(lǐng)域中是已知的，如在US20030180779和WO02/101353公開的申請所例證的。
甲基化的擴增產(chǎn)物可以用于本文所披露的方法中。例如，可以用修飾甲基化擴增產(chǎn)物序列作為甲基化擴增產(chǎn)物的甲基化的函數(shù)的試劑處理甲基化的擴增產(chǎn)物。處理過的甲基化擴增產(chǎn)物隨后可以進一步被擴增，接下來進一步擴增的產(chǎn)物可以斷裂，并可以測量片段的質(zhì)量?？商鎿Q的，處理過的甲基化擴增產(chǎn)物無需進一步擴增即可斷裂，并可以測量片段的質(zhì)量。
E.核酸分子的斷裂 本文提供的方法還包括靶核酸分子或擴增產(chǎn)物的斷裂和/或切割步驟。任何用于將核酸分子切割成合適大小分布的片段的方法可以用來生成核酸片段。核酸分子分斷裂在本領(lǐng)域是已知的，并且可以通過多種方式完成。例如，由DNA、RNA、DNA和RNA類似物或其組合構(gòu)成的核酸分子，可以物理的、化學的或酶促切割。在一個具體實施方式
中，在一個或多個特異性酶切位點的酶促切割可以用來產(chǎn)生本文所利用的核酸分子片段。典型的，切割可以在擴增后實現(xiàn)，從而為一旦利用本文提供的方法產(chǎn)生了足夠量的擴增產(chǎn)物，擴增產(chǎn)物即可以被切割成兩個或多個片段。
在使用限制酶的具體實施方式
中，根據(jù)所使用的限制酶的數(shù)量和類型以及所選擇的具體反應(yīng)條件，產(chǎn)生片段的平均長度可以被控制在一個具體范圍內(nèi)。在具體具體實施方式
中，制備用于本發(fā)明的核酸分子片段大小可以在一組范圍內(nèi)，包括1～50個堿基、2～40個堿基、3～35個堿基、以及5～30個堿基。然而，其他計劃用于本發(fā)明的大小范圍包括在約50～150個堿基之間、在約25～75個堿基之間、以及在約12～30個堿基之間。在一個特定的具體實施方式
中，使用了約3～35個堿基的片段。通常，片段大小范圍將被選擇，以使得片段的質(zhì)量可以利用本文描述的以及本領(lǐng)域已知的質(zhì)量測量方法來準確確定，另外，在某些具體實施方式
中，選擇大小范圍，以促進MALDI-TOF MS的預(yù)期解吸效率。
1.核酸分子的酶促斷裂 核酸分子片段可以由單鏈或多鏈核酸分子的酶促切割而產(chǎn)生。多鏈核酸分子包括含有多于一條鏈的核酸分子(包括例如雙鏈和三鏈核酸分子)的核酸分子復合體。根據(jù)所使用的酶，核酸分子被非特異性切割或在特異性核苷酸序列切割?？梢允褂萌魏文軌蚯懈詈怂岱肿拥拿?，包括但不限于，內(nèi)切核酸酶、外切核酸酶、單鏈特異性核酸酶、雙鏈特異性核酸酶、核酶、以及DNA酶。多個用于斷裂核酸分子的酶在本領(lǐng)域是已知的并有市售，例如核酸酶BAL-31、綠豆核酸酶、外切核酸酶I、外切核酸酶III、外切核酸酶VIII、λ外切核酸酶、T7外切核酸酶、外切核酸酶T、RecJ、RNaseA、RNaseU2、RNaseT1、RNaseH、ShortCutRNaseIII、AccI、BasAI、BtgZI、MfeI、SacI、N.BbvCIA、N.BbvC IB、N.BstNBI、I-Ceu1、I-SceI、PI-PspI、PI-SceI、McrBC、以及其他已知酶(參見，例如New England Biolabs，Inc.Catalog；Sambrook，J.Russell，D.W.Molecular CloningA Laboratory Manual，3rd ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，2001)。酶還可以用來將大核酸分子降解為較小片段。
本文還預(yù)期的是兩個或多個“雙堿基切割酶”的使用或者優(yōu)先切割內(nèi)切核酸酶(例如RNase PHyM)的使用，通過使用非可切割核苷酸(同時增加平均片段大小)使其更特異。在另一個具體實施方式
中，利用單堿基和/或雙堿基切割酶可以進行切割。一旦產(chǎn)生片段，片段可選擇性的進行凝膠電泳以分離具有具體尺寸范圍的片段。
a.堿基特異性斷裂 靶核酸分子可以利用在特定堿基(例如對于DNA為A、C、T或G；對于RNA為A、C、U或G)或堿基類型(即嘧啶或嘌呤)選擇性切割的核酸酶進行斷裂。在一個具體實施方式
中，特異性切割3種RNA核苷酸(例如U、G和A)、2種RNA核苷酸(例如C和U)、或1種RNA核苷酸(例如A)的RNase可以用來堿基特異性的切割靶核酸分子的轉(zhuǎn)錄物。例如，RNaseT1在G核糖核苷酸上切割ssRNA(單鏈RNA)、RNaseU2在A核糖核苷酸上切割ssRNA、RNaseCL3在C核糖核苷酸上切割ssRNA、PHyM在U和A核糖核苷酸上切割ssRNA、以及RNaseA在嘧啶核糖核苷酸(C和U)上切割ssRNA。單特異性RNase例如RNaseT1(G特異性)和RNaseU2(A特異性)的使用在本領(lǐng)域是已知的(Donis-Keller et al.Nucleic Acids Res.42527-2537(1977)；Gupta and Randerath，Nucleic Acids Res.41957-1978(1977)；Kuchino andNishimura，Methods Enzymol.180154-163(1989)；and Hahner et al.Nucl.Acids Res.25(10)1957-1964(1997))。另一種酶，已經(jīng)報道雞肝核糖核酸酶(RNaseCL3)優(yōu)先在胞嘧啶上切割，但據(jù)報道酶對這種堿基的傾向性受反應(yīng)條件的影響(Boguski et al.J.Biol.Chem.2552160-2163(1980))。報道還宣稱了另一種核糖核酸酶的胞嘧啶特異性，即cusativin，分離自Cucumis sativusL的干種子(Rojo et al.Planta 194328-338(1994))?？商鎿Q的，已經(jīng)證明可利用RNase PHyM(A和U特異)(Donis-Keller，H.Nucleic Acids Res.83133-3142(1980))和RNaseA(C和U特異)(Simoncsits et al.Nature 269833-836(1977)；Gupta and Randerath，Nucleic Acids Res.41957-1978(1977))鑒定嘧啶殘基。這種切割模式的實例在Stanssens et al.WO 00/66771中給出。
另外，堿基可以被定向(targeted)，例如可以通過將修飾的核苷酸整合入核酸內(nèi)并切除核苷酸的堿基，隨后在適當?shù)臈l件下或用酶處理核酸，可以引起核酸在被切除堿基位點的斷裂。例如，dUTP可以整合入DNA內(nèi)，堿基特異性斷裂可以通過利用UDG去除尿嘧啶堿基來完成、并且隨后在已知的切割條件下切割DNA。在另一個實施例中，甲基胞嘧啶可以整合入DNA中，堿基特異性可以通過利用甲基胞嘧啶去糖基酶去除甲基胞嘧啶來完成、隨后在已知條件下處理而導致DNA斷裂。堿基特異性斷裂可以用于部分切割反應(yīng)(包括當靶核酸分子含有整合入其中的非可切割核苷酸時，進行徹底的部分切割反應(yīng))以及全切割反應(yīng)。
利用RNase的堿基特異性切割反應(yīng)條件在本領(lǐng)域是已知的，可以包含例如4mM Tris-Ac(pH 8.0)，4mM KAc，1mM spermidine，0.5mM dithiothreitol以及1.5mM的MgCl2。
在一個具體實施方式
中，擴增產(chǎn)物可以轉(zhuǎn)錄成單鏈RNA分子，然后利用內(nèi)切核糖核酸酶堿基特異性切割。利用例如可將未甲基化胞嘧啶轉(zhuǎn)化成尿嘧啶而不修飾甲基化胞嘧啶的重亞硫酸鹽處理靶核酸分子，其可用來產(chǎn)生堿基特異性切割模式的差異，可以利用諸如質(zhì)譜分析的質(zhì)量分析方法進行分析，還可以用于鑒定甲基化位點。在一個具體實施方式
中，靶核酸分子的轉(zhuǎn)錄可以產(chǎn)生RNA分子，所述RNA分子可以利用特異性RNA內(nèi)切核酸酶進行切割。例如，RNA分子的堿基特異性切割可以利用兩種不同的內(nèi)切核糖核酸酶來實施，例如RNaseT1和RNaseA。RNaseT1特異性切割G核苷酸，而RNaseA特異性切割嘧啶核糖核苷酸(即，胞嘧啶和尿嘧啶堿殘基)。在一個具體實施方式
中，當可切割一個以上核苷酸的酶例如RNaseA用于切割時，在靶核酸分子或擴增產(chǎn)物的轉(zhuǎn)錄期間可以引入非可切割的核苷例如dNTP。例如，在擴增產(chǎn)物的轉(zhuǎn)錄期間，可以引入dCTP，并且得到的被轉(zhuǎn)錄的核酸可以通過在U核糖核苷酸上的RNaseA進行切割，但對在C脫氧核糖核苷酸上的RNaseA的切割有抗性。在另一個實施例中，在靶核酸分子的轉(zhuǎn)錄期間，可以引入dTTP，并且得到的被轉(zhuǎn)錄的核酸可以通過在C核糖核苷酸上的RNaseA進行切割，但對在T脫氧核糖核苷酸上的RNaseA的切割有抗性。通過選擇性使用非可切割核苷例如dNTP以及通過利用RNase例如RNaseA和RNaseT1實施堿基特異性切割，可以在同一靶核酸序列的不同轉(zhuǎn)錄物上實施三種不同核苷酸堿基的特異性的堿基切割。例如，特定靶核酸分子的轉(zhuǎn)錄物可以利用RNaseT1進行G特異性切割；在轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中，轉(zhuǎn)錄物可以利用dTTP進行C特異性切割，隨后用RNaseA消化；在轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中，轉(zhuǎn)錄物可以利用dTTP進行T特異性切割，隨后用RNaseA消化。
在另一個具體實施方式
中，利用dNTP、不同RNase以及靶核酸分子的兩個取向，可以允許6種不同的切割圖譜。例如，雙鏈靶核酸分子可以產(chǎn)生兩種不同的單鏈轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，其可以稱為靶核酸分子正向鏈的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物和靶核酸分子反向鏈的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。兩種不同轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中的每一種可以進行三種獨立的堿基特異性切割反應(yīng)，例如本文所描述的G特異性切割、C特異性切割以及T特異性切割，以引起6種不同的堿基特異性切割。6個可能的切割圖譜列于表1中。使用4種不同的堿基特異性切割反應(yīng)可以產(chǎn)生靶核酸分子一條鏈中所有4種核苷酸堿基的信息。也就是說，考慮到正向鏈的切割可以通過切割反向鏈上的互補堿基而模擬，正向鏈4個核苷酸的堿基特異性切割可以通過參照反向鏈的切割而完成。例如，三個堿基特異性切割反應(yīng)可以在靶核酸分子正向鏈的轉(zhuǎn)錄物上進行，以產(chǎn)生靶核酸分子正向鏈的G-、C-以及T-特異性切割；第四個堿基特異性切割反應(yīng)可以是靶核酸分子反向鏈轉(zhuǎn)錄物的T-特異性切割，其結(jié)果將相當于靶核酸分子正向鏈轉(zhuǎn)錄物的A-特異性切割。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將通曉，產(chǎn)生靶核酸分子一條鏈所有4個核苷酸堿基信息的堿基特異性切割可以利用可能的堿基特異性切割反應(yīng)的多種不同組合完成，包括表1中提供的用于RNaseT1和RNaseA的切割反應(yīng)和用于正向鏈或負向鏈的其他切割反應(yīng)，和/或利用非水解性核苷酸，可用本領(lǐng)域已知的或者本文披露的其他堿基特異性RNase實施的切割反應(yīng)。
表1 在一個實施例中，RNaseU2可以用來堿基特異性切割靶核酸分子轉(zhuǎn)錄物。RNaseU2可以在A核苷酸上堿基特異性切割RNA。因此，通過利用RNaseT1、U2和A以及通過利用適當?shù)膁NTP(與RNaseA聯(lián)合使用)，通過堿基特異性切割靶核酸分子僅一條鏈的轉(zhuǎn)錄物，可以分析靶核酸分子的所有4種堿基位置。在某些具體實施方式
中，當利用僅堿基特異性切割4種核糖核苷酸中一種的RNaseA實施堿基特異性切割時，非可切割的三磷酸核苷不是必需的。例如，RNaseT1、RNaseCL3、cusativin或者RNaseU2用于堿基特異性切割時，不需要在靶核酸分子轉(zhuǎn)錄物中存在非可切割的核苷酸。使用諸如RNaseT1和RNaseU2的RNase可以產(chǎn)生靶核酸分子中所有4種核苷酸堿基的信息。例如，可以合成靶核酸分子或擴增產(chǎn)物的正向鏈和反向鏈的轉(zhuǎn)錄物，且每個轉(zhuǎn)錄物均可以利用RNaseT1和RNaseU2進行堿基特異性切割。所得的4種切割反應(yīng)的切割模式將產(chǎn)生靶核酸分子一條鏈中所有4種核苷酸堿基的信息。在這種具體實施方式
中，可以進行兩個轉(zhuǎn)錄反應(yīng)正向靶核酸分子的第一轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和反向靶核酸分子鏈的第二轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。
還計期望用于方法的是多種不同的堿基特異性切割方法。多種不同的堿基特異性切割方法在本領(lǐng)域是已知的和本文所描述的，包括酶促堿基特異性RNA切割、酶促堿基特異性DNA切割以及化學性堿基特異性DNA切割。例如，酶促堿基特異性切割如利用尿嘧啶-脫糖基酶(UDG)或甲基胞嘧啶脫糖基酶(MCDG)的切割在本領(lǐng)域是已知的和本文所描述的，并可以與本文描述的酶促RNase介導的堿基特異性切割反應(yīng)聯(lián)合實施。
b.核酸分子的內(nèi)切核酸酶斷裂 內(nèi)切核酸酶是對斷裂核酸分子非常有用的一類示例性酶。內(nèi)切核酸酶切割核酸分子鏈內(nèi)的鍵(bonds)。內(nèi)切核酸酶可以對雙鏈或單鏈核酸分子特異。切割可以在核酸分子內(nèi)或在特異性序列上隨機發(fā)生。隨機切割雙鏈核酸分子的內(nèi)切核酸酶經(jīng)常與核酸分子的骨架相互作用。核酸分子的特異性斷裂可以在連續(xù)反應(yīng)中或同時利用一種或多種酶而實現(xiàn)。均質(zhì)或異質(zhì)核酸分子可以被切割。
限制內(nèi)切核酸酶是內(nèi)切核酸酶的一個亞類，其能識別雙鏈核酸分子內(nèi)的特異序列，并且通常切割識別序列內(nèi)或與其接近的兩條鏈。一個在DNA分析中常用的酶是HaeIII，其在5’-GGCC-3’序列上切斷DNA。其它示例性限制內(nèi)切核酸酶包括AccI、AflIII、Alu IAlw44I，ApaI，AsnI，AvaI，AvaII，BamHI，BanII，BclI，BglI.BglII，BlnI，BsmI，BssHII，BstEII，CfoI，ClaI，DdeI，DpnI，DraI，EclXI，EcoRI，EcoRI，EcoRII，EcoRV，HaeII，HaeIII，HindII，HindIII，HpaI，HpaII，KpnI，KspI，MluI，MluNI，MspI，NciI，NcoI，NdeI，NdeII，NheI，NotI，NruI，NsiI，PstI，PvuI，PvuII，RsaI，SacI，SalI，Sau3AI，ScaI，ScrFI，，SfiI，SmaI，SpeI，SphI，SspI，StuI，StyI，SwaI，TaqI，XbaI，XhoI這些酶的切割位點在本領(lǐng)域是已知的。另外期望的是TypeII S限制內(nèi)切核酸酶，從其識別位點的下游切割。
根據(jù)所使用的酶，在核酸分子中的切割可以得到一條鏈的突出末端、另一條鏈也稱為“粘”末端。例如，BamHI產(chǎn)生黏附性5’突出末端，而KpnI產(chǎn)生黏附性3’突出末端?？商鎿Q的，切割可以得到不具有突出末端的“平”末端。例如，DraI切割產(chǎn)生平末端。限制性酶可以切割含有一個或多個甲基化核苷酸的序列而不切割未甲基化同等序列、可以特異性切割不含甲基化核苷酸的序列而不切割含有一個或多個甲基化核苷酸的同等序列、或者可以切割一個序列而不管序列中一個或多個核苷酸的甲基化狀態(tài)。在一個實施例中，切割識別位點可以被甲基化掩蓋。
限制性內(nèi)切核酸酶可以用來產(chǎn)生多種核酸分子片段的大小。例如，CviJI是一種在兩堿基和三堿基DNA序列之間識別的限制性內(nèi)切核酸酶。通過CviJI的徹底消化可以得到平均長度為16～64個核苷酸的DNA片段。因此，通過CviJI的部分消化可以以一種類似于剪切或聲波降解法的“準”隨機方式斷裂DNA。CviJI通常在G和C之間切割RGCY，得到易于克隆的平末端，其中R是任何一種嘌呤而Y是任何一種嘧啶。在存在1mM ATP和20％二甲基亞砜時，切割的特異性變松散，并且CviJI還切割RGCN和YGCY位點。在這些“星”的條件下，CviJI切割產(chǎn)生準隨機消化，此時消化的或切割的DNA可以為選定大小的。
在另一個具體實施方式
中，CviJI可以用來特異性切割具有甲基化CpG重復的核酸序列。在這種具體實施方式
中，CviJI在所述“星”的條件下應(yīng)用，使得大多數(shù)NGCY和RGCN序列被CviJI切割。例如，當靶核酸分子或擴增產(chǎn)物用重亞硫酸鹽處理時，靶核酸分子或擴增產(chǎn)物中存在GC二核苷酸可以意味甲基化C核苷酸的存在；因此，在NGCY或RGCN上切割則可以表示在切割位點上存在甲基化C。
用于利用限制性內(nèi)切核酸酶斷裂核酸分子的方法在本領(lǐng)域是廣為人知的。在一個示例性方案中，制備20～50μl的反應(yīng)混合物，含有DNA 1～3μg；限制酶緩沖液1X；以及限制性內(nèi)切核酸酶(2單位/1μgDNA)。合適的緩沖液在本領(lǐng)域也是已知的，包括合適的離子強度、輔助因子、以及可選的pH緩沖液，為酶促活性提供最優(yōu)條件。特異性酶需要的特異性緩沖液，其通?？蓮乃雒傅墓?yīng)商處得到。一個示例性的緩沖液是谷氨酸鉀緩沖液(KGB)。Hannish，J.and M.McClelland，″Activity of DNA modification and restrictionenzymes in KGB，a potassium glutamate buffer，″Gene Anal.Tech 5105(1988)；McClelland，M.et al.″A single buffer for all restriction endonucleases，″Nucl.Acids Res.16364(1988)反應(yīng)混合物在37℃下孵育1小時或者任何產(chǎn)生預(yù)期大小或尺寸范圍的片段所需要的時間段。反應(yīng)可以通過在65℃或80℃(根據(jù)需要)加熱混合物而終止。可替換的，反應(yīng)可以通過用例如EDTA螯合二價陽離子如Mg2+而終止。
在特殊的具體實施方式
中，可以使用多于一種酶來斷裂核酸分子。如果酶在相似條件(例如離子強度、溫度或pH)下均有活性，則多種酶可以用于同一個反應(yīng)中；或者多種酶可以用于序列反應(yīng)中。典型的，多種酶均可以用于標準緩沖液例如KGB。當使用限制酶時，所述核酸分子可以被部分或徹底消化。
DNAse也可以用來產(chǎn)生核酸分子片段。Anderson，S.”ShotgumDNA sequencing using cloned DNase I-generated fragments，″Nucl.Acids Res.93015-3027(1981).DNaseI(脫氧核糖核酸酶I)是一種將雙鏈和單鏈DNA非特異性消化成多核苷酸和單核苷酸的內(nèi)切核酸酶。酶能夠?qū)捂満碗p鏈DNA以及染色質(zhì)起作用。
II型脫氧核糖核酸酶用于核酸研究中的多種應(yīng)用包括在酸性pH下的DNA測序和消化。來自于豬脾臟的脫氧核糖核酸酶II的分子量為38,000道爾頓。酶是具有二聚體結(jié)構(gòu)的糖蛋白內(nèi)切核酸酶。離子強度為0.15M時，最優(yōu)的pH范圍是4.5～5.0。脫氧核糖核酸酶II水解天然和變性DNA中的脫氧核糖核苷酸linkage，產(chǎn)生具有3’-磷酸的產(chǎn)物。在pH值為5.6～5.9時，還可以作用于p-硝基苯基磷酸二酯。Ehrlich，S.D.et al.″Studies on acid deoxyribonuclease.IX.5′-Hydroxy-terminal and penultimate nucleotides of oligonucleotides obtained from calf thymusdeoxyribonucleic acid，″Biochemistry 10(11)2000-2009(1971). 內(nèi)切核酸酶可以對具體類型的核酸分子特異。例如，內(nèi)切核酸酶可以對DNA或RNA特異性，或?qū)捂溁螂p鏈核酸分子特異。內(nèi)切核酸酶可以為序列特異或非序列特異。例如，核糖核酸酶H是一種特異性降解RNA-DNA雜交體中的RNA鏈的內(nèi)切核酸酶。核糖核酸酶A是一種在C和U殘基上特異性攻擊單鏈RNA鏈的內(nèi)切核酸酶。核糖核酸酶A催化切割位于核苷酸的5’核糖和連接于鄰近嘧啶核苷酸3’核糖的磷酸基團之間的磷酸二酯鍵。所得到的2’，3’-環(huán)磷酸可以水解為相應(yīng)的3’-磷酸核苷。RNaseT1僅在G核糖核苷酸上消化RNA，在鳥苷酸殘基的3’-羥基和側(cè)翼核苷酸的5’-羥基之間切割。RNaseU2僅在A核糖核苷酸上消化RNA。堿基特異性消化的實例可以在Stanssens等人.WO 00/66771公開申請中查到。
BenzonaseTM、核酸酶P1以及磷酸二酯酶I是適于產(chǎn)生200個堿基對或小于200個堿基的核酸分子片段的非特異性內(nèi)切核酸酶。BenzonaseTM(Novagen，Madison，WI)是一種基因工程內(nèi)切核酸酶，其降解所有形式的DNA和RNA(單鏈、雙鏈、線性和環(huán)狀)，且可以用于寬范圍的操作條件。酶將核酸徹底消化成長度為終止為2～5堿基寡核苷酸的5’-一磷酸，。美國專利第5,173,418號中提供了用于BenzonaseTM的核苷酸和氨基酸序列，用于如本文提供的方法的核酸斷裂可以通過二核苷酸(“2切割酶”)或松散型二核苷酸(“1-1/2切割酶”或“1-1/4切割酶”)切割特異性而實現(xiàn)。二核苷酸特異性切割試劑為本領(lǐng)域技術(shù)人員所通曉(參見，例如WO 94/21663；Cannistraro et al.Eur.J.Biochem.181363-370(1989)；Stevens etal.J.Bacteriol.16457-62(1985)；Marotta et al.Biochemistry 122901-2904(1973). 核苷酸特異性切割可以通過靶核酸分子或擴增產(chǎn)物的酶促和/或化學修飾而加以控制。例如，感興趣的靶核酸分子轉(zhuǎn)錄物可以用常規(guī)底物和α-硫代底物(α-thio-substrate)的混合物來合成，隨后磷硫酰核苷酸間linkage可以通過使用諸如烷基鹵(例如碘乙酰胺、碘乙醇)或2，3-環(huán)氧-1-丙醇的試劑烷化而加以修飾。預(yù)計通過這種修飾形成的磷硫酰鍵不是RNase的底物。其他不被RNase切割的示例性核苷酸包括2’氟代核苷酸、2’脫氧核苷酸和2’氨基核苷酸。在利用這種步驟的一個實施例中，根據(jù)所需要的切割特異性，通過整合非可水解的核苷酸可將RNaseA的切割特異性限制于CpN或UpN二核苷酸。因此，在一個RNaseA對CpG核苷酸特異的實例中，轉(zhuǎn)錄物(靶分子)可以通過將αS-dUTP、αS-ATP、αS-CTP和GTP核苷酸整合入轉(zhuǎn)錄物而制備。有用的二核苷酸特異性切割試劑的集合可以通過利用其他RNase而進一步擴充，例如RNase-U2和RNase-T1。在單特異性RNase例如RNase-T1情況下，根據(jù)選擇哪種核苷酸為非可切割，利用非可切割核苷酸可以將CpN鍵的切割限制于四種可能的CpN鍵中的任何三個、兩個或一個。這些選擇性修飾策略還可以用來防止在同聚物束上每一個堿基的切割，通過選擇性修飾同聚物束內(nèi)某些核苷酸以使得修飾核苷酸對切割抗性較弱或較強。
c.核酸酶斷裂 利用核酸酶從核酸分子末端去除多種不同長度的堿基，可將大單鏈核酸分子斷裂成小核酸分子。用于去除單鏈核酸分子末端的示例性核酸酶包括但不限于S1、Bal31以及綠豆核酸酶。例如，綠豆核酸酶將單鏈DNA降解成5’末端帶有磷酸基團的單或多核苷酸。雙鏈核酸如果暴露于非常大量的這種酶，也可以被徹底消化。
內(nèi)切核酸酶是還可以從核酸分子例如DNA分子末端切割核苷酸的蛋白質(zhì)。已知存在5’內(nèi)切核酸酶(從DNA鏈的5’末端切割DNA)和3’內(nèi)切核酸酶(從鏈的3’末端切割DNA)。例如，內(nèi)切核酸酶III是3’至5’內(nèi)切核酸酶，其從DNA鏈的3’末端釋放5’單核苷酸；酶是水解3’-末端的磷酸一酯的DNA3’-磷酸酶；而且酶是AP內(nèi)切核酸酶，其在無嘌呤或無嘧啶位點切割磷酸二酯鍵，以生成無堿基的5’磷酸脫氧核糖殘基的5’末端。另外，酶具有RNase H活性；它將優(yōu)先降解DNA-RNA雜交雙鏈中的RNA，其可能是通過外切核酸裂解。在哺乳動物細胞中，主要的DNA 3’-外切核酸酶是DNaseIII(也稱TREX-1)。因此，通過利用外切核酸酶降解核酸分子的末端可以形成片段。
d.核酸的酶斷裂 催化性DNA和RNA在本領(lǐng)域是已知的，并且可以用來切割核酸分子以產(chǎn)生核酸分子片段。Santoro，S.W.and Joyce，G.F.″A general purpose RNA-cleaving DNA enzyme，″Proc.Natl.Acad.Sci.USA 944262-4266(1997).作為單鏈分子的DNA可以折疊成類似于RNA的三維結(jié)構(gòu)，而且2’-羥基對于催化作用是非必需的。如同核糖核酸酶，通過選擇也可以使DNAzyme依賴輔助因子。在用于RNA水解的組氨酸依賴的DNAzyme，已經(jīng)證明這一點。美國專利第6,326,174號和第6,194,180號披露了脫氧核糖核酸酶、催化性和酶促性DNA分子，其能夠切割核酸序列或分子，尤其是RNA。
核糖核酸酶用于切割核酸分子在本領(lǐng)域是已知的，而核糖核酸酶是催化化學反應(yīng)例如切割共價鍵的RNA。Uhlenbeck揭示了一種小的活性核酶“錘頭狀核酶”，其中所述催化鏈和底物鏈是分開的(Uhlenbeck，Nature 328596-600(1987))。這種核酶通過堿基配對相互作用結(jié)合底物RNA、切割被結(jié)合的靶RNA、釋放切割產(chǎn)物并再循環(huán)，因此核酶可以多次重復這個過程。Haseloff和Gerlach列舉了能夠反向作用的小錘頭狀核酶的設(shè)計原則(Haseloff et al.Nature，334585-591(1988))。研究人員已經(jīng)開發(fā)了多種具有高切割特異性的不同錘頭狀核酶，而設(shè)計具有預(yù)期底物特異性的錘頭狀核酶的一般途徑在本領(lǐng)域是已知的，如美國專利5,646,020號和6,096,020號所示例的。具有反向切割活性的核酶的另一種類型是起源于δ肝炎病毒基因組的δ核酶。Ananvoranich和Perrault闡述了δ核酶切割底物特異性的因素(Ananvoranich et al.J.Biol.Chem.27313812-13188(1998))。發(fā)夾型核酶也可用于反向切割，且發(fā)夾型核酶的底物特異性原則也是已知的(參見，例如Perez-Ruiz et al.J.Biol.Chem.27429376-29380(1999))。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以利用已知的底物特異性原則來選擇核酶，并設(shè)計可獲得預(yù)期核酸分子切割特異性的核酶序列。
DNA切割酶或DNase可以用來識別并切割DNA雙鏈中的一條。多種切割酶是已知的。其中，例如具有下列酶切位點的NY2A NY2A5′...R AG...3′ 3′...YTC...5′where R＝A or Gand Y＝C or T NYS15′...CC[A/G/T]...3′ 切割酶和NYS 1切割酶3′...GG[T/C/A]...5′. 隨后對來自切割酶反應(yīng)的產(chǎn)物進行化學處理，引起磷酸骨架的切割并產(chǎn)生片段。
Fen-1斷裂方法涉及Fen-1酶，該酶是位點特異性核酸酶，已知為“側(cè)翼”內(nèi)切核酸酶(美國專利5,843,669、5,874,283和6,090,606號)。這種酶識別并切割由雜交到靶核酸DNA鏈的兩個寡核苷酸交迭產(chǎn)生的DNA“側(cè)翼”。這種切割是高度特異的，并且可以識別單堿基變異，可檢測感興趣核苷酸基因座的單個甲基化堿基。Fen-1酶可以是諸如核酸酶的Fen-1例如人類、鼠類和Xenopus XPG酶和酵母RAD2核酸酶，或者諸如內(nèi)切核酸酶的Fen-1，來自于例如M.jannschii，P.furiosus和P.woesei。
另一個可用的技術(shù)是DNA嵌合體的切割，三重(tripartite)DNA-RNA-DNA探針被雜交到靶核酸分子上，例如M肺結(jié)核特異性序列。一旦加入RNAseH，三聯(lián)探針的RNA部分被降解，釋放出DNA部分(Yule，Bio/Technology 121335(1994))。
2.核酸分子的物理性斷裂 核酸分子斷裂可以利用物理或機械力而實現(xiàn)，包括機械剪切力和聲波降解法。例如，核酸分子的物理性斷裂可以利用流體動力實現(xiàn)。典型的，通過反復推動含有核酸分子的溶液使其進出配有針頭的注射器，可剪切溶液中的核酸分子。Thorstenson，Y.R.et al.″An Automated Hydrodynamic Process forControlled，Unbiased DNA Shearing，″Genome Research 8848-855(1998)；Davison，P.F.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 451560-1568(1959)；Davison，P.F.Nature 185918-920(1960)；Schriefer，L.A.et al.″Low pressure DNA shearinga method for random DNA sequence analysis，″Nucl.Acids Res.187455-7456(1990)典型的，用皮下針頭剪切DNA產(chǎn)生的多數(shù)片段在1～2kb的范圍內(nèi)，盡管少數(shù)片段可以短至300bp。
用于剪切核酸分子包括基因組DNA的設(shè)備已有市售。示例性設(shè)備利用注射器抽吸，通過推動DNA樣品經(jīng)過突然縮小的小平面而產(chǎn)生流體動力性剪切力。Thorstenson，Y.R.et al.″An AutomatedHydrodynamic Process for Controlled，Unbiased DNA Shearing，″Genome Research 8848-855(1998)剪切體積通常為100～250μl，且處理時間小于15min。樣品的剪切可以通過計算機控制而完全自動化。
Oefner等人開發(fā)的流體動力點滲透剪切法是一種利用流體動力剪切核酸分子的方法。Oefner，P.J.et al.″Efficient randomsubcloning of DNA sheared in a recirculating point-sink flow system，″Nucl.Acids Res.24(20)3879-3886(1996).“點滲透”指的是流體動力在這種系統(tǒng)中流動的理論模型。應(yīng)變速率張量描述施加于分子上的動力及因此導致的分子破裂。DNA斷裂歸因于這種張量的“剪切”力，這類斷裂的方法稱為剪切。斷裂既可以由剪切力引起(當流體在細孔或針孔內(nèi)時)，也可以由伸張應(yīng)變力引起(當流體接近針孔時)。點滲透剪切可利用諸如HPLC泵的泵施加壓力而強迫核酸分子(例如DNA)穿過非常小的直徑管而實現(xiàn)。所得到的片段具有嚴格的尺寸范圍，其中最大片段約為最小片段的兩倍。片段的大小與流動速率成反比。
核酸分子片段還可以通過振蕩溶液中的大核酸分子而獲得，例如通過混合、摻雜(blending)、攪動或渦旋溶液。Hershey，A.D.and Burgi，E.J.Mol.Biol.2143-152(1960)；Rosenberg，H.S.and Bendich，A.J.Am.Chem.Soc.823198-3201(1960).溶液可以用不同長度的時間進行振蕩，直到獲得預(yù)期大小或大小范圍的片段。向溶液中加入珠子或粒子有助于斷裂核酸分子。
一種物理性斷裂核酸分子的合適方法是基于聲波裂解所述核酸分子。Deininger，P.L.″Approaches to rapid DNA sequence analysis，″Anal.Biochem.129216-223(1983).典型的，利用聲波裂解法產(chǎn)生核酸分子片段如下實施將含有緩沖的核酸分子的微離心管置于超聲波儀(例如，杯型破碎頭超聲波儀)內(nèi)的冰水浴中，并用最大輸出和連續(xù)功率以短脈沖超聲不同的次數(shù)。短脈沖可以持續(xù)約10秒。參見例如Bankier，A.T.et al.″Random cloning and sequencing by theM13/dideoxynucleotide chain termination method，″Meth.Enzymol.15551-93(1987).在一個示例性的聲波裂解方案中，根據(jù)聲波裂解的條件如持續(xù)時間和聲波裂解強度，聲波裂解大核酸分子得到的片段范圍為300～500bp或2～10kb。Kawata，Y.et al.″Preparation of a Genomic Library Using TA Vector，″Prep.Biochem & Biotechnol.29(1)91-100(1999). 在聲波裂解期間，增加溫度可以得到不均勻的片段分布模式，為此，水浴的溫度可以小心監(jiān)測，必要時可以加入新鮮的冰水。一個確定超聲裂解法的特異條件的示例性方案包括將溶于350μl合適緩沖液中的約100μg核酸分子樣品，分成10份，每份35μl，其中5份進行較多次10秒脈沖超聲。在每一次10秒脈沖之間，將所述管置于冰水浴中至少約1min，以冷卻核酸分子樣品。如需要，在每個樣品之間，可以重置超聲波儀內(nèi)的冰水浴。將樣品離心以回收濃縮物，并將其中一份在瓊脂糖凝膠上電泳，與分子量標記物(sizemarker)作比較。根據(jù)從瓊脂糖凝膠電泳檢測的片段分子量范圍，剩余的5個管可以相應(yīng)的聲波裂解以獲得預(yù)期片段大小。
還可以利用噴霧器實現(xiàn)核酸分子的斷裂。Bodenteich，A.Chissoe，S.Wang，Y.-F.and Roe，B.A.(1994)In Adams，M.D.Fields，C.and Venter，J.C.(eds)Automated DNA Sequencing and Analysis.Academic Press，San Diego，CA.噴霧器在本領(lǐng)域是已知的，且已有市售。一個利用噴霧器斷裂核酸分子的示例性方案包括將2毫升含有25～50％甘油的緩沖的核酸分子溶液(約50μg)置于冰水浴中，然后溶液暴露于壓力8～10psi的氣體蒸汽例如氮氣，達2.5分鐘。應(yīng)該理解，可以使用任何氣體尤其是惰性氣體。氣體壓力是片段大小的首要決定因素。變化壓力可以產(chǎn)生不同的片段大小。冰水浴用于噴霧法，可以用來生成分布均勻的片段。類似的，可以利用高壓霧化噴射器而生成片段。Cavalieri，L.F.and Rosenberg，B.H.J.Am.Chem.Soc.815136-5139(1959). 另一種用于斷裂核酸分子的方法利用緩沖的核酸分子溶液的反復冷凍和融化。核酸分子樣品可以按照需要冷凍和融化，產(chǎn)生預(yù)期大小或大小范圍的片段。另外，可以用離子或粒子轟擊核酸樣品，以產(chǎn)生多種大小的片段。例如，核酸分子可以在真空下暴露于萃取離子束。在7kV*q下，離子從電子束離子陷阱萃取，并指到靶核酸分子上。核酸分子可以照射任何時間長度，典型的為幾小時，直到例如獲得100個離子/μm2的總流量。
還可以通過照射核酸分子而實現(xiàn)核酸分子斷裂。典型的，諸如γ射線或x射線的照射將足夠用來斷裂核酸分子。通過調(diào)整暴露于照射的強度和持續(xù)時間可以調(diào)整片段大小。也可以利用紫外線照射。還可以調(diào)整暴露的強度和持續(xù)時間而將對核酸分子的非預(yù)期效應(yīng)降到最低。
煮沸核酸分子也可以產(chǎn)生片段。典型的，在恒定振蕩下將核酸分子溶液煮沸達幾小時，可以獲得約500bp的片段。片段的大小可以隨著煮沸的持續(xù)時間而變化。
3.核酸分子的化學性斷裂 化學性斷裂可用來斷裂核酸分子，以堿基特異性或無需堿基特異性。核酸分子可以通過化學反應(yīng)而斷裂，包括例如水解反應(yīng)包括堿水解和酸水解。因為RNA(或非配對堿基)在堿性條件下不穩(wěn)定，所以堿性條件可以用來斷裂含有切割酶或RNA的核酸分子。見Nordhoff et al.″Ion stability of nucleic acids in infrared matrix-assistedlaser desorption/ionization mass spectrometry，″Nucl.Acids Res.21(15)3347-3357(1993).DNA在酸存在下尤其是強酸例如6M HCl存在時可以被水解。溫度可以升高到室溫以上，以促進水解。根據(jù)反應(yīng)條件和反應(yīng)時間的長度，核酸分子可以被斷裂成多種大小包括單堿基片段。在精密條件下，水解可以打斷脫氧核苷與嘌呤和嘧啶堿基之間的磷酸酯鍵以及N-糖苷鍵。
一個用于產(chǎn)生核酸分子片段的示例性的酸/堿水解的方案是已知的(參見例如Sargent et al.Meth.Enz 152432(1988))。簡單而言，1克DNA溶于50毫升0.1N NaOH中；加入1.5毫升濃鹽酸，并迅速混合溶液。DNA將立刻沉淀，攪動不應(yīng)該超過幾秒以防止形成大的聚集體。樣品在室溫下孵育20min以部分脫嘌呤(depurinate)DNA。隨后，加入2毫升10N NaOH(0.1N的OH-濃度)，并攪動樣品直到DNA完全重溶；然后將樣品在65℃下孵育30分鐘以水解DNA。典型尺寸范圍可以在250～1000個核苷酸之間，但根據(jù)水解條件可以變動到更低或更高范圍。
化學性切割也可為特異性的。例如，選定的核酸分子可以通過烷化而切割，尤其是磷硫酰修飾的核酸分子(參見，例如K.A.Browne，″Metal ion-catalyzed nucleic Acid alkylation and fragmentation，″J.Am.Chem.Soc.124(27)7950-7962(2002))。磷硫酰修飾的烷化使得核酸分子易于在修飾位點被切割。I.G.Gut和S.Beck描述了將DNA烷化用于質(zhì)譜分析的方法。I.G.Gut and S.Beck，″A procedure for selective DNA alkylation and detectionby mass spectrometry，″Nucl.Acids Res.23(8)1367-1373(1995). 多種用于堿基特異性和堿基非特異性化學切割寡核苷酸的其他化合物和方法在本領(lǐng)域是已知的，并預(yù)期用于本文提供的斷裂方法中。例如，堿基特異性切割可以利用化合物而實現(xiàn)，例如甲酸哌啶、哌啶、二甲基硫酸鹽、肼和氯化鈉、肼。例如，利用二甲基硫酸鹽和哌啶可以在G核苷酸堿基特異性切割DNA；利用二甲基硫酸鹽、哌啶和酸可以在A和G核苷酸堿基特異性切割DNA；利用肼和哌啶可以在C和T核苷酸堿基特異性切割DNA；利用肼、哌啶和氯化鈉可以在C核苷酸堿基特異性切割DNA；利用強堿可以在A核苷酸堿基特異性切割DNA，在C核苷酸切割特異性較低。
4.斷裂方法的組合 片段可以利用本文描述的斷裂方法的任何組合而形成，例如利用堿基特異性切割方法的組合、酶或剪切與序列特異性酶的組合。用于產(chǎn)生特異性片段的方法可以與用于產(chǎn)生隨機片段的方法組合。另外，用于產(chǎn)生隨機片段的不同方法可以組合，并且用于產(chǎn)生特異性片段的不同方法可以組合。例如，一種或多種在特異位點切割核酸分子的酶可以與一種或多種在不同位點特異性切割核酸分子的酶聯(lián)合應(yīng)用。在另一個實施例中，切割特定種類核酸分子的酶可以聯(lián)合應(yīng)用，例如，RNase與DNase或單鏈特異核酸酶的組合可以與雙鏈特異核酸酶聯(lián)合應(yīng)用，或者外切核酸酶可以與內(nèi)切核酸酶聯(lián)合應(yīng)用。在另一個實施例中，隨機切割核酸分子的酶可以與特異性切割核酸分子的酶聯(lián)合應(yīng)用。斷裂法的聯(lián)合應(yīng)用指的是在核酸分子上一種接一種或同時實施一種和多種方法。
如本文所預(yù)期的，聯(lián)合應(yīng)用可以包括在核酸分子樣品的第一部分應(yīng)用第二斷裂法，而在核酸分子樣品的第二部分應(yīng)用第二斷裂法。兩個樣品在隨后的檢測和質(zhì)量測定方法中可以分別分析，或者可以集中到一起，在隨后的檢測和質(zhì)量測定方法中可以同時分析。斷裂法的組合可以包括2種或多種斷裂法、3種或多種斷裂法、或者4種或多種斷裂法。
a.堿基特異性斷裂 作為靶核酸分子甲基化狀態(tài)的函數(shù)，靶核酸分子或擴增產(chǎn)物的序列修飾可以得到反映靶核酸分子甲基化狀態(tài)的堿基特異性切割模式。因此，具有相同核苷酸序列的兩種核酸分子甲基化狀態(tài)的差異，可以導致兩種核酸分子的堿基特異性切割模式的差異。反映靶核酸分子甲基化狀態(tài)改變的堿基特異性切割模式的類型改變包括核苷酸的甲基化或缺乏甲基化，其可以在核酸分子中引入新的可切割位點，并且得到兩個較短片段而非一個較大片段；核苷酸的甲基化或缺乏甲基化，其可以將不可切割位點引入到靶核酸分子中，并且得到一個較大片段而非兩個較短片段；甲基化或缺乏甲基化，可導致片段核苷酸組成的變化，造成質(zhì)量位移。這三種在堿基特異性切割模式中的變化，在表2中加以例證，該表是形成自重亞硫酸鹽處理的核酸分子的轉(zhuǎn)錄物的堿基特異性切割。這些堿基特異性切割模式變化中的每一種可以包含可以用于DNA甲基化分析的信息，如本文所描述的。
表2 未甲基化 變化類型甲基化 TAAATGTAT TAAACGTAT 特定的核苷酸序列TAAACGCAT的理論切割片段，該片段如果在第5位胞嘧啶為甲基化，則通過重亞硫酸鹽處理轉(zhuǎn)化成TAAACGTAT，如果不是甲基化的則將轉(zhuǎn)化成TAAATGTAT。
可用于甲基化狀態(tài)鑒定中的片段質(zhì)量模式包括存在片段、缺乏片段以及相對于參照物的片段質(zhì)量。利用片段質(zhì)量鑒定甲基化狀態(tài)可以通過將片段質(zhì)量與參考核酸序列、參考片段質(zhì)量或推算出的片段質(zhì)量進行比較。利用片段質(zhì)量鑒定甲基化狀態(tài)可以與確定全部或部分靶核酸分子核苷酸序列聯(lián)合實施。利用片段質(zhì)量鑒定甲基化狀態(tài)還可以僅通過測定片段質(zhì)量而進行，無需與參照物或核酸序列進行比較。
i.缺乏片段 缺乏片段可以鑒定核酸為甲基化或未甲基化，或者鑒定其含有一個或多個甲基化或未甲基化核苷酸，以及還可以用來鑒定靶核酸分子中甲基化或未甲基化核苷酸的數(shù)量。缺乏片段可以鑒定甲基化或未甲基化核苷酸的基因座，或者可以鑒定核苷酸基因座的甲基化狀態(tài)。
可以進行單個堿基特異性切割反應(yīng)以確定靶核酸分子中任何核苷酸堿基是否為甲基化或未甲基化。在一個具體實施方式
中，在U核糖核苷酸(對于轉(zhuǎn)錄物或其反向鏈，為A核糖核苷酸)上特異性切割的單個堿基特異性切割反應(yīng)，當靶核酸分子含有一個或多個未甲基化C核苷酸并用重亞硫酸鹽進行處理時，可以得到N個靶核酸分子片段(其中N＝兩個或多個)。在這種實施例中，存在最大數(shù)量的可能片段(即N＝M+Q+1，其中M是核酸分子中存在的C核苷酸總數(shù)，而Q是核酸分子中存在的U核苷酸總數(shù))可以表示靶核酸分子的每一個C核苷酸均為未甲基化的。存在小于最大數(shù)量的片段(即N＜M+Q+1)可以表示一個或多個C核苷酸是甲基化的(例如，甲基化C核苷酸的數(shù)量＝(M+Q+1)-N)。
還可能鑒定缺乏的片段，且利用片段的identity(特性)來鑒定甲基化或未甲基化核苷酸的基因座，并因此確定一個或多個核苷酸基因座的甲基化狀態(tài)。在這種方法中，一個或多個缺乏的片段可以與參考片段質(zhì)量、參考核苷酸序列例如靶核酸序列、或者片段質(zhì)量和/或序列的數(shù)據(jù)庫進行比較，而且通過比較，可以鑒定靶核酸分子序列中一個或多個缺乏片段的位置。例如，重亞硫酸鹽處理的靶核酸分子的U特異性切割可以得到的切割模式，相對于參照物，缺乏一個或多個片段。缺乏參照物片段可以表示在缺乏一個片段序列的5’和(/或3’末端存在一個或兩個甲基化的胞嘧啶基因座。鑒定靶核酸序列中缺乏片段的位置以及甲基化核苷酸片段內(nèi)基因座可以鑒定靶核酸中的甲基化核苷酸基因座。另外，某些觀察到的片段可以作為缺乏切割的結(jié)果而產(chǎn)生，并因此代替兩個或多個缺乏片段而存在。觀察到的片段和缺乏片段與參考片段的比較可以用來確定缺乏片段的數(shù)量和位置，并從而確定觀察到的片段代表的甲基化核苷酸基因座的數(shù)量(例如，當觀察到的片段代替兩個缺乏片段而存在時，一個核苷酸可以是甲基化的；當觀察到的片段代替三個缺乏片段而存在時，兩個核苷酸可以是甲基化的)。因此，鑒定靶核酸序列中缺乏片段的位置以及甲基化的核苷酸片段內(nèi)的基因座可以鑒定靶核酸序列中甲基化的核苷酸基因座，且可以用來確定基因座是甲基化的。
缺乏第一片段可以造成第二片段的缺乏以及第三片段的存在(例如，當在第一和第二片段之間無切割時，產(chǎn)生第三片段)。利用諸如本文所描述的那些方法，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以將這種來自于片段缺乏的信息中的任何一種或全部，用于鑒定一個或多個缺乏片段的位置、鑒定新片段的定位，從而鑒定靶核酸分子為甲基化的或未甲基化的或含有一個或多個甲基化或未甲基化核苷酸；靶核酸分子中甲基化或未甲基化核苷酸的數(shù)量；甲基化或未甲基化核苷酸的基因座；或核苷酸基因座的甲基化狀態(tài)。
在另一個實施例中，缺乏一個或多個片段可以表示靶核酸分子中存在一個或多個未甲基化核苷酸。當靶核酸分子用重亞硫酸鹽處理并隨后進行C特異性切割時，峰值的數(shù)量將比靶核酸中存在的甲基化胞嘧啶的數(shù)量多一個。當存在的片段小于最大數(shù)量時，缺乏片段的數(shù)量可以等于未甲基化胞嘧啶的數(shù)量。另外，C特異性切割的缺乏片段和存在片段與參照物的比較可以用來鑒定未甲基化胞嘧啶的基因座。
缺乏片段還可以用來鑒定具體核苷酸基因座的甲基化狀態(tài)，甚至無需鑒定參考核酸分子中由片段代表的核苷酸序列部分。例如，當用重亞硫酸鹽處理在已知核苷酸基因座具有單個C核苷酸的靶核酸分子時，在C特異性切割后缺乏一個片段(即僅存在一個“片段”而非兩個片段)可以鑒定核苷基因座為未甲基化的。在另一個實施例中，當靶核酸分子不含T核苷酸而僅含一個C核苷酸時，在U特異性切割后缺乏片段(即僅存在一個“片段”而非兩個片段)可以鑒定核苷基因座為甲基化的。
ii.存在片段 存在片段質(zhì)量可以鑒定所述靶核酸為甲基化的或未甲基化的、或者含有甲基化或未甲基化核苷酸，還可以用來鑒定靶核酸分子中甲基化或未甲基化核苷酸的數(shù)量。存在片段質(zhì)量還可以鑒定甲基化或未甲基化核苷酸基因座，或可以鑒定核苷酸基因座的甲基化狀態(tài)。
在一個實施例中，當重亞硫酸鹽處理的含有一個或多個甲基化C核苷酸的靶核酸分子在特異性切割C核苷酸(或在反向轉(zhuǎn)錄物的G核糖核苷酸)的反應(yīng)中被堿基特異性切割時，可以得到兩個或多個核酸分子片段。在這種實施例中，存在片段的數(shù)量可以表示靶核酸分子中為甲基化的不同C核苷酸的數(shù)量(典型的，N-1個甲基化的C核苷酸，其中N是不同核酸分子片段的數(shù)量)。例如，當進行C特異性切割反應(yīng)時，完全非甲基化的靶核酸分子得到的核酸分子不具有任何切割位點，不產(chǎn)生任何切割產(chǎn)物，并且因此僅得到一個“片段”(即全長核酸分子)。當使用含有一個甲基化胞嘧啶的靶核酸分子時，核酸分子被切割一次，以產(chǎn)生兩個切割片段。因此，核酸分子的單個堿基特異性切割反應(yīng)，隨后檢測切割片段，可以用來鑒定靶核酸分子為甲基化的、或含有甲基化核苷酸，并且還可以用來鑒定靶核酸分子中甲基化核苷酸的數(shù)量。進行這種甲基化狀態(tài)鑒定，需要或無需將片段質(zhì)量與來自于參考核酸的參考核酸序列或者片段測定值或推算值進行比較；或者需要或無需確定靶核酸分子的核苷酸序列。
存在片段還可以用來鑒定未甲基化核苷酸，并且還可以鑒定未甲基化核苷酸的數(shù)量。例如，當進行重亞硫酸鹽處理的靶核酸分子的U特異性切割時，任何未甲基化C核苷酸將被轉(zhuǎn)化成U/T，而且將在U特異性切割中被切割。比靶核酸中存在的U核苷酸的數(shù)量多兩個或多個片段時，可以表示靶核酸分子中存在一個或多個未甲基化的胞嘧啶(即M＝N-(Q+1)個片段，其中M是核酸分子中存在的未甲基化C核苷酸的數(shù)量，N是片段的數(shù)量，而Q是核酸分子中存在的U核苷酸的總數(shù))。因此，存在的片段可以表示靶核酸分子含有未甲基化的胞嘧啶，還可以表示靶核酸分子中未甲基化的胞嘧啶的數(shù)量。
還可能鑒定存在的片段，且利用片段的特性來鑒定甲基化或未甲基化核苷酸的基因座，并因此確定核苷酸基因座的甲基化狀態(tài)。在這種方法中，一個或多個存在的片段可以與參考片段質(zhì)量、參考核苷酸序列例如靶核酸序列、或者片段質(zhì)量和/或序列的數(shù)據(jù)庫進行比較，而且通過這種比較，可以鑒定靶核酸分子序列中一個或多個存在片段的位置。例如，在觀察到的樣品片段中存在參考片段可以表示在缺乏片段序列的5’和/或3’末端存在一個或兩個甲基化或未甲基化的胞嘧啶基因座。某些觀察到的片段可以作為缺乏切割的結(jié)果而產(chǎn)生，并因此代替兩個或多個缺乏片段而存在。觀察到的片段和缺乏片段與參考片段的比較可以用來確定由觀察到的片段代表的甲基化或未甲基化的核苷酸基因座的數(shù)量。因此，鑒定靶核酸序列中觀察到的片段的位置以及甲基化或未甲基化的核苷酸片段內(nèi)的基因座可以用來確定基因座是甲基化或未甲基化的，且可以用來鑒定一個或多個核苷酸基因座的甲基化狀態(tài)。
存在第一片段可以造成第二片段的存在以及第三片段的缺乏(例如，當存在第三片段的切割時，則產(chǎn)生第一和第二片段)。利用諸如本文所描述的方法，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以將這種來自于片段存在的信息中的任何一種或全部用于鑒定一個或多個其他片段的位置、鑒定缺乏片段的位置，從而鑒定靶核酸分子為甲基化的或未甲基化的或含有一個或多個甲基化或未甲基化核苷酸；靶核酸分子中甲基化或未甲基化核苷酸的數(shù)量；甲基化或未甲基化核苷酸的基因座；或者核苷酸基因座的甲基化狀態(tài)。
存在一個片段還可以用來鑒定具體核苷酸基因座的甲基化狀態(tài)，甚至無需鑒定參考核酸分子中由片段代表的核苷酸序列部分。例如，當用重亞硫酸鹽處理在已知核苷酸基因座具有單個C核苷酸的靶核酸分子時，在C特異性切割后存在兩個或多個片段可以鑒定核苷基因座為甲基化的。在另一個實施例中，當靶核酸分子不含T核苷酸而僅含一個C核苷酸時，在U特異性切割后存在兩個或多個片段可以鑒定核苷基因座為未甲基化的。
iii.與參照物的比較 片段的質(zhì)量或相對質(zhì)量可以通過與參考質(zhì)量進行比較而確定，其中參考質(zhì)量可以是參考核酸分子或參考核酸分子一個片段的分子量表示(representation)。相對于參考質(zhì)量的片段質(zhì)量位移、或與參考質(zhì)量相同的片段質(zhì)量可以鑒定靶核酸為甲基化或未甲基化的、或含有甲基化或未甲基化的核苷酸，或可以用來鑒定靶核酸分子中甲基化或未甲基化核苷酸的數(shù)量。在另一個具體實施方式
中，相對于參考質(zhì)量的片段質(zhì)量位移或與參考質(zhì)量相同的片段質(zhì)量可以鑒定甲基化或未甲基化核苷酸的基因座，或可以鑒定核苷酸基因座的甲基化狀態(tài)。
在一個實施例中，在G核糖核苷酸(或?qū)τ诜聪蜴湹霓D(zhuǎn)錄物，為C核糖核苷酸)上特異性切割的堿基特異性切割可以得到含有C核苷酸基因座的片段。當靶核酸分子中一個或多個C核苷酸基因座為未甲基化時，片段在那些基因座上將含有U或T核苷酸。當靶核酸分子中一個或多個C核苷酸基因座為甲基化時，片段在那些基因座上將含有C核苷酸。C和U核苷酸之間的質(zhì)量差異是1Da(當兩者均為脫氧核糖核苷酸或者兩者均為核糖核苷酸時)，而在C和T核苷酸之間的質(zhì)量差異是15Da(當兩者均為脫氧核糖核苷酸或者兩者均為核糖核苷酸時)。因此，用一個U或T取代C時，將分別引起1Da和15Da片段的質(zhì)量位移。當片段含有多個C核苷酸基因座時，由一個或多個U或T核苷酸取代C核苷酸產(chǎn)生的質(zhì)量位移可以確定靶核酸分子中甲基化和未甲基化C核苷酸基因座的數(shù)量。例如，對于靶核酸分子內(nèi)含有5個C核苷酸基因座的RNA片段，如果其中三個C核苷酸基因座為未甲基化的，相對于代表5個甲基化的C核苷酸基因座的參照物，將觀察到3Da的質(zhì)量位移，而相對于代表5個未甲基化的C核苷酸基因座的參照物，將觀察到2Da的質(zhì)量位移。
盡管C和U的質(zhì)量僅相差1Da，多種本文披露或本領(lǐng)域已知的方法中的任何一種可以用來增加代表C的核苷酸與代表U的核苷酸之間的差異，使得質(zhì)量位移更易于測定?？商鎿Q的，T可以用于取代U以增加相對于C的質(zhì)量位移。
利用參考序列或片段或數(shù)據(jù)庫可以用來表示測定的片段具有與參考序列/片段相同或不同的組成。例如，參考片段與測定的片段質(zhì)量相同時可以鑒定測定的片段具有與參考片段相同的核苷酸組成。在另一個實施例中，參考片段與測定的片段質(zhì)量不同時可以鑒定相對于參考片段測定的片段具有與之不同的核苷酸組成。另外，參考片段與測定的片段之間的質(zhì)量差異可以用來鑒定測定的片段的核苷酸組成。例如，相對于測定的片段，參考片段的質(zhì)量增加2Da可以表示相對于測定的片段，參考片段含有2個其他的U核苷酸，以及相對于參考片段測定的片段含有兩個其他的胞嘧啶。因此，測定的片段具有與參考片段相同的質(zhì)量可以用來鑒定靶核酸為甲基化或未甲基化的、或含有甲基化或未甲基化核苷酸，用來鑒定靶核酸分子中甲基化或未甲基化核苷酸的數(shù)量，用來鑒定甲基化或未甲基化核苷酸的基因座，或用來鑒定核苷酸基因座的甲基化狀態(tài)。另外，相對于參考片段，測定的片段具有質(zhì)量位移可以用來鑒定靶核酸為甲基化或未甲基化的、或含有甲基化或未甲基化核苷酸，鑒定靶核酸分子中甲基化或未甲基化核苷酸的數(shù)量，鑒定甲基化或未甲基化核苷酸的基因座，或鑒定核苷酸基因座的甲基化狀態(tài)。
可以實施堿基特異性切割反應(yīng)以鑒定靶核酸分子中一個或多個甲基化或未甲基化核苷酸的基因座。堿基特異性切割并將片段與參照物比較可以用來鑒定所有甲基化或未甲基化基因座，或鑒定靶核酸分子中所有基因座的甲基化狀態(tài)。例如，可以進行單個堿基特異性切割反應(yīng)，并將得到的片段與來自參考核酸的片段進行比較。測定的核酸分子片段與參考核酸片段的比較可以用來鑒定所述靶核酸分子中甲基化或未甲基化核苷酸的基因座。在另一個實施例中，當靶核酸分子的斷裂模式與已知胞嘧啶核苷酸基因座甲基化狀態(tài)的參考核酸匹配時，參考核酸可以用來鑒定靶核酸分子中胞嘧啶基因座的甲基化狀態(tài)。在另一個實施例中，可以進行單個堿基特異性切割反應(yīng)，并將得到的片段與兩個或多個參考核酸的序列或切割模式進行比較。在這種實施例中，如果參考核酸分子的切割模式與測定的片段質(zhì)量匹配，則其序列可以鑒定為與靶核酸分子序列相同。參考核酸片段和斷裂模式可以通過實驗確定或可以利用本領(lǐng)域已知的或本文描述的方法進行推測。
在一個具體實施方式
中，來自同一次測定的兩個測定片段(例如，來自同一個質(zhì)譜的兩個質(zhì)量峰值)可以用作彼此的參考片段。例如，當核酸樣品含有異質(zhì)核酸時(例如，當樣品含有來自多個生物體的基因組DNA時)，可以使用這種方法。在這種具體實施方式
中，可以實施一個或多個堿基特異性切割反應(yīng)以形成核酸分子片段，其中一個或多個片段的質(zhì)量位移可以表示存在或缺乏一個或多個甲基化核苷酸，例如甲基化胞嘧啶。例如，擴增產(chǎn)物可以利用RNaseT1進行G特異性切割，當靶核酸分子在特定的C核苷酸均為甲基化時，含有該特定核苷酸基因座的片段可以具有相同的第一質(zhì)量(first mass)。當所有靶核酸分子在該特定C核苷酸均為未甲基化時，含有該核苷酸基因座的片段可以具有相同的第二質(zhì)量(second mass)。當樣品含有在特定C核苷酸基因座為甲基化的核酸分子以及在該C核苷酸基因座為未甲基化的核酸分子的混合物時，斷裂可以得到具有第一質(zhì)量和第二質(zhì)量的片段。這些片段可以互相作為參考片段進行比較，以確定在特定核苷酸基因座甲基化核苷酸相對于未甲基化核苷酸的量。例如，確定第一質(zhì)量和第二質(zhì)量峰值大小的比值可以確定在該C核苷酸為甲基化的核酸分子數(shù)量相對于在該C核苷酸為未甲基化的核酸分子數(shù)量。半甲基化DNA樣品(例如，來自二倍體細胞的DNA，其中兩個相關(guān)核酸區(qū)域中的一個區(qū)域含有甲基化的核苷酸而另一個區(qū)域含有未甲基化的核苷酸)可以得到數(shù)量相當?shù)募谆臀醇谆怂岱肿悠?即比約為50/50)。
在另一個具體實施方式
中，來自于不同質(zhì)量測定的片段(例如，來自于不同質(zhì)譜的兩個質(zhì)量峰值)可以作為彼此的參考片段。例如，這種方法可以用來比較兩個或多個樣品例如兩個或多個異質(zhì)樣品中甲基化核酸分子的相對量?？商鎿Q的，來自不同質(zhì)量測定的片段可以進行比較，其中一個片段對應(yīng)于未知或檢測樣品，而另一個片段對應(yīng)于已知參照物。在這些具體實施方式
中，可以實施一個或多個堿基特異性切割反應(yīng)以形成核酸分子片段，其中一個或多個片段中的質(zhì)量位移可以表示存在或缺乏一個或多個甲基化核苷酸例如甲基化胞嘧啶。例如，擴增產(chǎn)物可以利用RNaseT1進行G特異性切割。當靶核酸分子在特定的C核苷酸均為甲基化時，含有該特定核苷酸基因座的片段可以具有相同的第一質(zhì)量。當所有靶核酸分子在該特定C核苷酸均為未甲基化時，含有該核苷酸基因座的片段可以具有相同的第二質(zhì)量。當樣品含有在特定C核苷酸基因座為甲基化的核酸分子以及在該C核酸基因座為未甲基化的核酸分子的混合物時，斷裂可以得到第一質(zhì)量和第二質(zhì)量的片段。在這種實施例中，一個或兩個片段可以與另一個樣品的片段或參考物進行比較，以確定在特定核苷酸基因座甲基化核苷酸相對于未甲基化核苷酸的量。例如，確定第一樣品中片段、第二樣品的第二片段或者參照物的峰值大小的比，可以確定相對于第二樣品或參照物，其甲基化程度為增加或減少；或確定在該C核苷酸為甲基化的核酸分子數(shù)量相對于在該C核苷酸為未甲基化的核酸分子數(shù)量。在一個實施例中，將進行比較的片段的強度加以標準化。例如，兩個樣品或一個樣品和一個參照物，可以往其中加入已知量的標記核酸或者可以以在特定樣品中相對恒定的標記核酸分子進行標準化，例如組成性表達的管家基因。在這種實施例中，待比較片段的強度首先用標記核酸分子進行標準化，片段相對于標記的量可以互相比較，確定兩個樣品中或樣品相對于參照物的甲基化的量，或者確定在該C核苷酸為甲基化的核酸分子數(shù)量相對于在該C核苷酸為未甲基化的核酸分子數(shù)量。
在另一個具體實施方式
中，相對量可以通過比較三個片段而測定。當甲基化核苷酸的存在引起切割而甲基化缺乏不引起切割時，將得到兩個較小的甲基化核酸分子片段和一個較大的未甲基化核酸分子片段。在這種情況下，兩個片段的測定量可以與一個片段的測定量進行比較，以推算甲基化核苷酸與未甲基化核苷酸的比。在另一個具體實施方式
中，當核苷酸為甲基化時產(chǎn)生一個較大片段，而當核苷酸為未甲基化時形成兩個較小片段；在這種情況下，將一個片段的測定值與兩個片段的測定值進行比較，以推算甲基化核苷酸與未甲基化核苷酸的比。
b.多個堿基特異性切割反應(yīng) 在其他具體實施方式
中，兩個或多個堿基特異性切割反應(yīng)可以用來提供靶核酸分子中特定核苷酸基因座的甲基化狀態(tài)信息。例如，第一堿基特異性切割反應(yīng)可以用來鑒定特定核苷酸基因座的甲基化狀態(tài)(即任何靶核酸分子在該核苷酸基因座是否是甲基化的)，而第二堿基特異性切割反應(yīng)可以用來鑒定在該核苷酸基因座甲基化核苷酸相對于未甲基化核苷酸的量。
兩個或多個堿基特異性切割反應(yīng)還可以用來提供冗余信息，用來確證對核苷酸基因座是甲基化或未甲基化的鑒定，還可以用來提供定量測定的其他信息，例如存在于靶核酸分子特定核苷酸基因座的甲基化與未甲基化核苷酸的比。兩個或多個堿基特異性切割反應(yīng)還可以用來確定大的靶核酸分子的甲基化狀態(tài)。例如，靶核酸分子可能太大，而不能在單個堿基特異性切割反應(yīng)中測定所有的核酸分子片段的準確質(zhì)量，因此靶核酸分子中某些核苷酸的甲基化狀態(tài)可能是不可測定的。當兩個或多個另外的堿基特異性切割反應(yīng)用來產(chǎn)生另外的一組或多組核酸分子片段時，可以測定每個覆蓋靶核酸分子不同區(qū)域的堿基特異性切割反應(yīng)的核酸分子片段，而且可以比單個堿基特異性切割反應(yīng)提供關(guān)于較大數(shù)量的靶核酸分子核苷酸基因座甲基化狀態(tài)的信息。在一個具體實施方式
中，當進行兩個或多個堿基特異性切割反應(yīng)時，可以確定所有待討論的核苷酸基因座的甲基化狀態(tài)。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以決定達到預(yù)期的甲基化狀態(tài)鑒定完整性和冗余度水平所必需的切割反應(yīng)的數(shù)量，利用如根據(jù)核酸分子的斷裂和質(zhì)量測定來確定核苷酸序列的方法。本文描述了利用切割和質(zhì)量測定來確定核苷酸序列的示例性方法，并且可以在2003年4月25日提交的另案在審的的美國臨時申請序列號60/466/006(代理人案號P2070)以及于2002年11月27日提交的60/429/895(代理人案號P2073)中查到，而且在本領(lǐng)域是已知的，如在Stanssens等人.Genome Res.14126-133(2004)中所例證的。
c.序列信息和甲基化狀態(tài)鑒定 靶核酸分子中一個或多個甲基化或未甲基化的核苷酸基因座可以在鑒定靶核酸分子的核苷酸序列之后或同時進行鑒定。當甲基化或未甲基化核苷酸基因座在核苷酸序列鑒定之后進行鑒定時，核苷酸序列可以通過已知的測序方法獲得，或者通過查閱包含靶核酸分子序列的數(shù)據(jù)庫例如公共數(shù)據(jù)庫而獲得。
核苷酸序列確定方法還可以基于本文提供的斷裂和質(zhì)量測定方法，因此，甲基化狀態(tài)鑒定和核苷酸序列確定可以同時進行。當使用甲基化特異性試劑例如重亞硫酸鹽，作為靶核酸分子甲基化狀態(tài)的函數(shù)而修飾所述序列時，靶核酸分子的序列確定可以與第二靶核酸分子的序列確定一起進行。這種第二核酸分子可以包括處理過的靶核酸分子或未處理的靶核酸分子的反向鏈。這樣，預(yù)處理核苷酸序列(其可以在確定處理過的核苷酸序列之后進行確定)可以用來區(qū)分未修飾的核苷酸和來自于甲基化核苷酸的修飾的核苷酸(例如，可以區(qū)分來自于野生型靶核酸分子核苷酸序列的T核苷酸和來自于重亞硫酸鹽處理的未甲基化C核苷酸的T核苷酸)。
示例性的核苷酸序列確定方法包括構(gòu)建并仔細研究測序圖；對候選序列評分并確定序列變異；以及其他本領(lǐng)域已知的方法。例如，當進行部分或隨機斷裂時，用于確定靶核酸分子序列的方法可以包括的步驟例如斷裂靶核酸分子，確定至少兩個片段的分子量，確定至少兩個片段的可能組成，根據(jù)每個片段中未被切割的切割位點的數(shù)量將至少兩個片段的可能組成進行排序，構(gòu)建至少一個理論上能表示至少兩個片段的規(guī)則(ordered)組成的測序圖，對一個或多個潛在的候選序列進行評分并確定擬合度的秩次，以及仔細研究traverse至少一個測序圖以重建靶生物分子的一個或多個潛在的候選序列。利用部分或隨機切割確定核苷酸序列的示例性方法可以在2003年4月25日提交的另案在審的美國臨時申請序列號60/466/006(代理人案號P2070)中查到。
在另一個實施例中，當進行完全斷裂時，用于確定靶核酸分組序列的方法可以包括的步驟例如通過用一種或多種特異性切割試劑接觸分子將靶核酸分子切割成片段，使用同樣的切割試劑將一個或多個參考核酸分子切割或模擬切割成片段，確定靶核酸分子和參考核酸片段的質(zhì)量信號，鑒定靶核酸分子與一個或多個參考核酸分子之間差異的片段，確定相應(yīng)于為復合體(compomer)witnesses的差異片段的復合體，其中復合體為片段的核苷酸堿基組成，確定候選序列相對于每一復合體witnesses的序列變異，對候選序列進行評分，以及確定多個靶核酸分子中的序列變異。利用完全斷裂確定核苷酸序列的示例性方法可以在2002年11月27日提交的另案在審美國臨時申請序列號60/429/895(代理人案號P2073)中查到。
F.靶核酸分子片段的檢測 如本文列出的，用于甲基化狀態(tài)鑒定的方法可以包括核酸分子檢測方法。這些檢測方法包括本領(lǐng)域中已知的方法。核酸分子檢測方法包括凝膠電泳、毛細管電泳、雜交方法例如Southern或Northern印跡分析、核酸陣列雜交、質(zhì)譜分析以及其他這種方法。在一個具體實施方式
中，核酸分子可以通過確定一個或多個靶核酸分子片段的分子質(zhì)量而檢測，其中所述靶核酸分子片段利用本文披露的或本領(lǐng)域已知的方法而形成。例如，一個或多個靶核酸分子的質(zhì)量可以利用質(zhì)譜分析而確定，包括MALDI-TOF質(zhì)譜分析。
1.質(zhì)譜分析 在本文提供的方法中，可以進行質(zhì)譜分析以確定原子、分子或分子片段的荷質(zhì)比。典型的，可以利用質(zhì)譜儀檢測原子、分子或分子片段的質(zhì)量。多種質(zhì)譜分析形式中的任何一種可以被利用，包括任何離子源、配置和檢測器。這些形式包括但不限于基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF)、電噴霧電離(ESi)、IR-MALDI(參見，例如公開的國際PCT申請99/57318號以及美國專利5,118,937號)、離子回旋共振質(zhì)譜儀Ion CyclotronResonance(ICR)、傅里葉變換線性/反射儀(RETOF)以及其組合(參見，例如Aebersold and Mann，March 13，2003，Nature，422198-207(例如，在圖2中)，為適合應(yīng)用于本文提供的方法的示例性質(zhì)譜分析方法的綜述)。典型的，MALDI方法包括UV-MALDI或IR-MALDI。核酸可以通過本領(lǐng)域已知的依賴質(zhì)譜分析的檢測方法和方案而進行分析(參見，例如美國專利5,605,798號、6,043,031號、6,197,498號、6,428,955號、6,268,131號以及國際專利申請WO96/29431號、國際PCT申請WO98/20019號以及美國專利公開20030129589號)。這些方法可以通過本領(lǐng)域已知的方法和設(shè)備而自動化(參見例如美國專利公開20020009394，其中描述了一種自動化加工線)。
中等分辨率儀器，包括但不限于彎曲場反射或延遲引出飛行時間MS儀器，也可以改善DNA檢測用于測序或診斷。兩種方法中的任何一個均能夠檢測≥30mer的鏈中9Da(Δm(A-T))的位移。
a.質(zhì)譜分析樣品 當使用諸如MALDI的質(zhì)譜分析法進行分析時，可將納升體積的樣品裝載于芯片上，應(yīng)用這樣的體積可得到定量或半定量的質(zhì)譜分析結(jié)果。例如，在所得的質(zhì)譜中的峰下面積與樣品成分的相對濃度成比例。用于制備和使用這種芯片的方法在本領(lǐng)域是已知的，如在美國專利6,024,925號、美國公開申請20010008615以及PCT申請PCT/US97/20195(WO 98/20020)號中所例證的；用于制備和使用這種芯片的方法還在共同另案在審的美國申請序列號08/786,988、09/364/774以及09/297,575中提供。用于進行這些分析的芯片和試劑盒商購自SEQUNOM，商標為MassARRAYTM。MassARRAYTM系統(tǒng)包含小型化陣列例如

對于MALDI-TOF(基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜)質(zhì)譜分析迅速傳送結(jié)果很有用。可以準確區(qū)分不帶標簽的遺傳變異體相關(guān)的DNA片段大小中單個堿基的變化。
i.被測定的核酸分子的特征 在一個具體實施方式
中，測定在斷裂步驟中形成的所有核酸分子片段的質(zhì)量。靶核酸分子片段或擴增產(chǎn)物片段的測定質(zhì)量還可以稱為“樣品”測定質(zhì)量，與來自參考核酸片段的“參考”質(zhì)量形成對比。
在另一個具體實施方式
中，用質(zhì)譜法測定其質(zhì)量的核酸分子片段的長度為不長于75個核苷酸、不長于60個核苷酸、不長于50個核苷酸、不長于40個核苷酸、不長于35個核苷酸、不長于30個核苷酸、不長于27個核苷酸、不長于25個核苷酸、不長于23個核苷酸、不長于22個核苷酸、不長于21個核苷酸、不長于20個核苷酸、不長于19個核苷酸、或不長于18個核苷酸。
在另一個具體實施方式
中，用質(zhì)譜法測定其質(zhì)量的核酸分子片段的長度為不少于3個核苷酸、不少于4個核苷酸、不少于5個核苷酸、不少于6個核苷酸、不少于7個核苷酸、不少于8個核苷酸、不少于9個核苷酸、不少于10個核苷酸、不少于12個核苷酸、不少于15個核苷酸、不少于18個核苷酸、不少于20個核苷酸、不少于25個核苷酸、不少于30個核苷酸或不少于35個核苷酸。
在一個具體實施方式
中，進行質(zhì)量測定的核酸分子片段是RNA。在另一個具體實施方式
中，進行質(zhì)量測定的靶核酸分子片段是DNA。在另外一個具體實施方式
中，進行質(zhì)量測定的靶核酸分子片段包含一個修飾的或非典型核苷酸(即在DNA中除了脫氧C、T、G或A以外的核苷酸，或在RNA中除了C、G或A以外的核苷酸)。例如，轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的核酸分子產(chǎn)物可以含有核糖核苷酸和脫氧核糖核苷酸的組合物。在另一個實施例中，核酸分子可以含有典型存在的核苷酸以及質(zhì)量修飾的核苷酸，或者可以含有典型存在的核苷酸以及非天然存在的核苷酸。
ii.調(diào)節(jié) 在進行質(zhì)譜分析之前，可以處理核酸分子以提高分辨率。這些過程稱為分子的調(diào)節(jié)。例如，分子可以加以“調(diào)節(jié)”以降低揮發(fā)所需的激光能量，和/或者將斷裂最小化。多種用于核酸分子調(diào)節(jié)的方法在本領(lǐng)域是已知的。調(diào)節(jié)的一個實例是修飾核酸分子的磷酸二酯骨架(例如，通過陽離子交換)，對于消除由于每個核苷酸單位結(jié)合的陽離子的異質(zhì)性引起的峰加寬可以是有用的。在另一個實施例中，用烷化劑例如碘化烷、碘乙酰胺、β-碘乙醇、或2，3-環(huán)氧-1-丙醇接觸核酸分子，可以將核酸分子的單硫代磷酸二酯鍵轉(zhuǎn)化成磷酸三酯鍵。類似的，使用例如三烷基甲硅烷基氯化物(trialkylsilylchlorides)可以將磷酸二酯鍵轉(zhuǎn)化成不帶電的衍生物。進一步調(diào)節(jié)可以包括整合可降低脫嘌呤(MS期間的斷裂)敏感性的核苷酸，例如嘌呤類似物如N7-或N9-deazapurine核苷酸，或RNA構(gòu)建單元或利用寡核苷酸三酯或整合烷化的磷硫酰官能團、或采用寡核苷酸模擬物例如PNA。
iii.多重以及質(zhì)量修飾 為了某些應(yīng)用，可以同時檢測多于一個核酸分子片段。在其他應(yīng)用中，例如可以利用不同固相支持物上的寡核苷酸或寡核苷酸模擬陣列進行平行處理?！岸嘀亍笨梢酝ㄟ^幾種不同的方法學而實現(xiàn)。例如，來自幾個不同核酸分子的片段可以同時進行質(zhì)量測定法。典型的，在多重質(zhì)量測定中，核酸分子片段應(yīng)該是足夠可區(qū)分的，使得可能同時檢測多種核酸分子。通過利用將使用的質(zhì)量測定方法確保片段的質(zhì)量為可區(qū)分的，而實現(xiàn)核酸分子片段的可區(qū)分性。這一點可以通過序列本身(組成或長度)或者通過將質(zhì)量修飾官能團引入一個或多個核酸分子而實現(xiàn)。
在一個具體實施方式
中，待進行質(zhì)量測定的核酸分子含有連接到該分子上的一個或多個質(zhì)量修飾基團。質(zhì)量修飾基團在本領(lǐng)域是已知的，且可以連接到核酸分子片段的3’末端或5’末端，可以連接到核酸堿基或者核苷酸的糖基上，或者可以連接到核苷酸之間磷酸二酯鍵的取代物上。一種簡單的質(zhì)量修飾可以通過將H用鹵素如F、Cl、Br和(或)I或擬鹵素例如SCN、NCS取代而實現(xiàn)，或者通過利用不同的烷基、芳基、芳烷基基團例如甲基、乙基、丙基、異丙基、t-丁基、己基、苯基、或官能團例如N3、CH2F、CHF2、CF3、Si(CH3)3、Si(CH3)2C2H5、Si(CH3)2(C2H5)2、Si(CH3)(C2H5)2、Si(C2H5)3。另外一種質(zhì)量修飾可以通過核酸分子(例如，檢測器(D))或三磷酸核苷連接同肽(homo-)或異肽(heteropeptides)而實現(xiàn)。一個在產(chǎn)生質(zhì)量修飾的種類(質(zhì)量增加57)中非常有用的實例是連接寡甘氨酸，例如可以實現(xiàn)質(zhì)量修飾74、131、188、245。還可以使用簡單的寡酰胺，例如可以獲得質(zhì)量修飾74、88、102、116等。
質(zhì)量修飾還可以包括寡/聚乙烯乙二醇衍生物。寡/聚乙烯乙二醇還可以通過較低的烷基例如甲基、乙基、丙基、異丙基、t-丁基和其他合適的取代基而單烷化。其他化學物質(zhì)也可以用于質(zhì)量修飾的化合物中(參見，例如那些在Oligonucleotides and Analogues，，A Practical Approach，F(xiàn).Eckstein，editor，IRL Press，Oxford，1991中描述的)。
質(zhì)量修飾基團可以連接到例如寡核苷酸的5’末端、核酸堿基、磷酸骨架、核苷2’位置和/或末端3’位置上。質(zhì)量修飾基團的實例包括例如鹵素、疊氮基、或類型XR，其中X是連接基團而R是質(zhì)量修飾官能團。例如，質(zhì)量修飾官能團可以用來將確定的質(zhì)量增加值引入到寡核苷酸分子，如本文所描述的。在磷酸二酯鍵引入的修飾例如通過α-硫代三磷酸核苷，其優(yōu)點在于這些修飾不干擾精確的Watson-Crick堿基配對并且還可進行完整的核酸分子的一步合成后位點特異性修飾，例如通過烷化反應(yīng)(參見，例如Nakamaye et al.Nucl.Acids Res.169947-9959(1988))。示例性的質(zhì)量修飾官能團是硼修飾的核酸，通過聚合酶可以有效地將其整合入核酸中(參見例如Porter et al.Biochemistry 3411963-11969(1995)；Hasan et al.Nucl.Acids Res.242150-2157(1996)；Li et al.Nucl.Acids Res.234495-4501(1995))。
此外，可以加入質(zhì)量修飾官能團，以影響鏈終止，例如通過將其連接到三磷酸核苷中糖環(huán)的3’位。對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員，多種組合顯而易見的可以用于本文提供的方法中。這樣，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認識到，通過官能團和連接位置的多種變異和組合，鏈延長的三磷酸核苷也可以以相似的方式進行質(zhì)量修飾。
不同的質(zhì)量修飾的核苷酸可以用來同時模擬檢測多種不同的核酸片段。在一個具體實施方式
中，質(zhì)量修飾可以在擴增期間被整合。在另一個具體實施方式
中，不同靶核酸分子的多重可以通過質(zhì)量修飾一種或多種靶核酸分子而實現(xiàn)，如需要，其中每種不同的靶核酸分子可以進行不同的質(zhì)量修飾。
2.其他質(zhì)量測定方法 本領(lǐng)域中已知的其他質(zhì)量測定方法可以用于質(zhì)量測定的方法中，包括電泳方法例如凝膠電泳和毛細管電泳，以及層析方法包括分子篩層析和反相層析。
3.確定質(zhì)量峰的特征 利用諸如本文描述的質(zhì)量分析方法，可以獲得靶核酸分子片段相關(guān)的信息。可從質(zhì)量測定獲得的其他質(zhì)量峰的信息包括峰的信噪比、峰面積(例如可由峰下面積或半高峰寬來代表)、峰高、峰寬、相對于一個或多個其他質(zhì)量峰的峰面積、相對于一個或多個其他質(zhì)量峰的峰高以及相對于一個或多個其他質(zhì)量峰的峰寬。這些質(zhì)量峰特征可以用于現(xiàn)有的甲基化鑒定方法中，例如通過擴增片段的至少一個質(zhì)量峰特征與一個或多個參考核酸的一個或多個質(zhì)量峰特征的比較，而鑒定靶核酸分子核苷酸基因座甲基化狀態(tài)的方法。
4.基于雜交的檢測方法 在本文的方法中可以采用基于雜交的檢測方法。通常，這種方法檢測具有特定核苷酸序列的核酸的存在，通過檢測探針寡核苷酸與樣品核酸之間的雜交而實現(xiàn)，例如靶核酸分子、靶核酸分子片段，其中探針寡核苷酸可以用可檢測的或可結(jié)合的基團標記，或者可以連接到底物或固相支持物上。大量基于雜交的核酸檢測方法在本領(lǐng)域是已知的，包括但不限于Southern印跡分析、Nouthern印跡分析、基于芯片的雜交方法和原位雜交。探針寡核苷酸可以連接到底物或固相支持物上例如珠子、膜或板；可以含有可檢測的成分例如熒光化合物、化學發(fā)光化合物、放射性核素、可切割質(zhì)量標記物；或者可以含有可結(jié)合成分例如生物素、磁珠或多組氨酸。
在一個具體實施方式
中，待用雜交檢測的核酸分子或核酸分子片段的序列是已知序列。因此，探針寡核苷酸可以設(shè)計為與核酸分子或核酸分子片段的特定序列雜交。探針寡核苷酸與核酸分子或核酸分子片段的雜交可以用來鑒定靶核酸分子含有一個或多個甲基化核苷酸，鑒定靶核酸分子上一個或多個甲基化核苷酸基因座，或鑒定靶核酸分子中一個或多個核苷酸基因座的甲基化狀態(tài)。探針寡核苷酸與核酸分子或核酸分子片段的雜交還可以用來鑒定靶核酸分子不含有任何甲基化的核苷酸或鑒定靶核酸分子上一個或多個未甲基化的核苷酸基因座。
G.片段測定分析 靶核酸分子可以根據(jù)靶核酸分子的甲基化狀態(tài)擴增，然后根據(jù)本文提供的方法進行斷裂，并且片段的存在可以根據(jù)本文提供的方法進行測定例如通過質(zhì)譜分析。片段的測定例如片段質(zhì)量的測定可以提供大量關(guān)于靶核酸分子中甲基化的信息。例如，片段質(zhì)量可以告知靶核酸分子是否含有甲基化核苷酸、核苷酸基因座是否為甲基化的、以及甲基化或未甲基化核苷酸基因座的位置。片段測定可以與參照物(可以包括參考質(zhì)量)進行比較，或者僅片段數(shù)量即可提供關(guān)于靶核酸分子中甲基化的信息。同一個靶核酸分子的不同斷裂模式可以提供關(guān)于靶核酸分子中甲基化的其他和/或交迭信息。
1.甲基化狀態(tài)鑒定 片段測定可用來鑒定靶核酸分子的甲基化狀態(tài)或鑒定靶核酸分子特定核苷酸基因座的甲基化狀態(tài)。片段測定可用來鑒定靶核酸分子是否含有一個或多個甲基化或未甲基化的核苷酸，例如分別為甲基胞嘧啶或胞嘧啶；確定靶核酸分子中存在的甲基化或未甲基化核苷酸的數(shù)量，例如分別為甲基胞嘧啶或胞嘧啶；鑒定核苷酸基因座在靶核酸分子中例如胞嘧啶基因座是甲基化或未甲基化的；鑒定甲基化或未甲基化核苷酸在靶核酸分子中的核苷酸基因座，例如分別為甲基胞嘧啶或胞嘧啶；確定樣品中甲基化的靶核酸分子相對于未甲基化的靶核酸分子的比；確定在靶核酸分子上特定核苷酸基因座的甲基化核苷酸相對于該基因座未甲基化核苷酸的比；以及提供冗余信息以進一步確證本文提供的任何一個確定。
片段測定可用來鑒定靶核酸分子是否含有甲基化或未甲基化的核苷酸，或者用來鑒定靶核酸分子中存在的甲基化或未甲基化核苷酸的數(shù)量，其中靶核酸分子或擴增產(chǎn)物在單個堿基特異性切割反應(yīng)中斷裂。片段測定可用來鑒定兩個或多個靶核酸分子是否含有甲基化或未甲基化的核苷酸，或者用來鑒定兩個或多個靶核酸分子中存在的甲基化或未甲基化核苷酸的數(shù)量，其中靶核酸分子或擴增產(chǎn)物在單個堿基特異性切割反應(yīng)中斷裂。片段測定可用來鑒定靶核酸分子是否含有甲基化或未甲基化的核苷酸，或者用來鑒定靶核酸分子中存在的甲基化或未甲基化核苷酸的數(shù)量，其中靶核酸分子或擴增產(chǎn)物在兩個或多個堿基特異性切割反應(yīng)中斷裂。片段測定可用來鑒定兩個或多個靶核酸分子是否含有甲基化或未甲基化的核苷酸，或者用來鑒定兩個或多個靶核酸分子中存在的甲基化或未甲基化核苷酸的數(shù)量，其中靶核酸分子或擴增產(chǎn)物在兩個或多個堿基特異性切割反應(yīng)中斷裂。
a.無需參照物的鑒定方法 片段測定可用來鑒定靶核酸分子是否含有甲基化或未甲基化的核苷酸，或者用來鑒定靶核酸分子中存在的甲基化或未甲基化核苷酸的數(shù)量，需要或無需將片段測定與一個或多個參考分子、序列、片段或質(zhì)量進行比較。例如，當靶核酸分子用重亞硫酸鹽進行處理、然后進行C特異性切割反應(yīng)時，兩個或多個不同片段質(zhì)量的存在可以無需參照任何其他核苷酸分子或序列或片段或質(zhì)量(例如，不與參考核核苷酸質(zhì)量或參考核苷酸序列進行比較)，即可表示靶核酸分子中一個或多個C核苷酸是甲基化的。在另一個實施例中，當靶核酸分子用重亞硫酸鹽進行處理、然后進行C特異性切割反應(yīng)時，兩個或多個不同片段質(zhì)量的存在可以無需參照任何其他核苷酸分子或序列或片段或質(zhì)量，即可表示靶核酸分子中甲基化的C核苷酸的數(shù)量。
b.利用參照物的鑒定方法 在其他具體實施方式
中，一個或多個參照物可以用于甲基化鑒定方法。在某些情況下，對于靶核酸分子所在的區(qū)域，可能存在之前已知的序列(例如，公共數(shù)據(jù)庫序列)。在這些情況下，參考核酸可以通過試驗獲得，而片段質(zhì)量可以利用本領(lǐng)域已知的方法或本文披露的方法通過實驗來測定。在這些情況下，對于特定的參考核酸組成、甲基化特異性試劑以及斷裂方法，還可以推算參考核酸分子片段序列和質(zhì)量，。
在其他情況下，即使靶核酸分子的序列未知，但由靶核酸分子包含的區(qū)域的核酸片段質(zhì)量模式可以是已知的。例如，已知的核酸片段質(zhì)量模式可以為來自于特定核酸分子的堿基特異性切割的質(zhì)量模式，所述特定核酸分子具有已知的甲基化狀態(tài)，和/或含有已知數(shù)量的甲基化或未甲基化核苷酸。在一個實施例中，一個個體染色體的一部分可能具有已知的甲基化狀態(tài)或已知數(shù)量的甲基化或未甲基化核苷酸以及一組已知的片段質(zhì)量，但該部分的核苷酸序列部分或全部未知。在這種情況下，甲基化鑒定方法可以比較靶核酸分子或擴增產(chǎn)物片段的測定質(zhì)量與一種或多種試驗確定的參考質(zhì)量模式，以確定靶核酸的甲基化狀態(tài)或者靶核酸中甲基化或未甲基化核苷酸的數(shù)量。
i.核酸分子序列已知 當靶核酸分子的序列已知時，推算或?qū)嶒灥姆椒梢澡b定一種或多種可以用于甲基化鑒定方法中的片段測定。實驗的方法可以在已知含有甲基化的核苷酸的參考核酸分子上、已知不含有甲基化核苷酸或已知在特定基因座含有甲基化或未甲基化核苷酸的參考核酸上來實施，這種參考核酸分子可以用甲基化特異性試劑處理、切割，且可以測定質(zhì)量片段。利用含有確定的甲基化或未甲基化核苷酸基因座的參考核酸分子序列可以產(chǎn)生推算，并預(yù)測作為甲基化特異性試劑處理和切割的結(jié)果而產(chǎn)生的質(zhì)量片段。例如，在已知核苷酸基因座具有甲基化胞嘧啶的參考核酸分子可以用重亞硫酸鹽處理、轉(zhuǎn)錄、用RNaseT1堿基特異性切割所述轉(zhuǎn)錄物并測定所述切割片段的質(zhì)量。利用已知核苷酸序列信息或與未甲基化參考核酸分子的切割進行比較，可以鑒定表示所述甲基化胞嘧啶的片段質(zhì)量。來自于用重亞硫酸鹽和RNaseT1處理的靶核酸分子的片段質(zhì)量可以與參考片段質(zhì)量進行比較，以表示甲基化胞嘧啶的存在或缺乏。
在實驗確定或推算的情況下，試劑、核苷酸組成(例如RNA、DNA、質(zhì)量修飾的核苷酸)、以及所使用的堿基特異性切割將與那些用于靶核酸分子的相同。例如，參考核酸分子和靶核酸分子均用重亞硫酸鹽處理、轉(zhuǎn)錄并用RNaseT1進行堿基特異性切割。
本文提供的方法還包括在甲基化鑒定方法中利用一種或多種但少于全部的片段質(zhì)量。例如，一個參考核酸片段質(zhì)量可以用來鑒定靶核酸分子含有至少一個甲基化或未甲基化核苷酸、一個參考核酸片段可以用來鑒定靶核酸分子核苷酸基因座的甲基化狀態(tài)、一個參考核酸片段可以用來鑒定核苷酸基因座為甲基化或未甲基化的。
推算可以用來預(yù)測斷裂模式，以鑒定與靶核酸分子或擴增的產(chǎn)物片段的一個或多個測定質(zhì)量峰值特征相同或不同的質(zhì)量。這種推算方法可以產(chǎn)生所有質(zhì)量峰值特征中的任何一個或全部，包括質(zhì)量、峰面積以及質(zhì)量峰值的信噪比。靶核酸分子或擴增的產(chǎn)物片段的一個或多個測定質(zhì)量峰值特征區(qū)別于來自未甲基化參考核苷酸序列片段的推算的質(zhì)量峰值特征，可以鑒定靶核酸分子為甲基化的，且可以提供一個或多個甲基化核苷酸的基因座。靶核酸分子或擴增的產(chǎn)物片段的一個或多個測定質(zhì)量峰值特征區(qū)別于來自甲基化參考核苷酸序列片段的推算的質(zhì)量峰值特征，可以鑒定靶核酸分子為未甲基化的，且可以提供一個或多個未甲基化核苷酸的基因座。靶核酸分子或擴增的產(chǎn)物片段的一個或多個測定質(zhì)量峰值特征與來自未甲基化參考核苷酸序列片段的推算的質(zhì)量峰值特征相同，可以鑒定靶核酸分子為未甲基化的，且可以提供一個或多個未甲基化核苷酸的基因座。靶核酸分子或擴增的產(chǎn)物片段的一個或多個測定質(zhì)量峰值特征與來自未甲基化參考核苷酸序列片段的推算的質(zhì)量峰值特征相同，可以鑒定靶核酸分子為甲基化的，且可以提供一個或多個甲基化核苷酸的基因座。
通過重復推算這些不同的甲基化參考核酸分子，可能產(chǎn)生幾種互相區(qū)別(且相互排斥)的片段質(zhì)量模式以及可以用來鑒定靶核酸分子為甲基化或未甲基化的一種或多種質(zhì)量峰值特征的幾種不同組合，且可以提供一個或多個甲基化或未甲基化核苷酸的基因座。樣品核酸分子片段的測定可以產(chǎn)生樣品片段質(zhì)量，其中所有片段質(zhì)量或含有一個或多個樣品片段質(zhì)量的一部分可以與推算的表示甲基化狀態(tài)的片段質(zhì)量的一個或多個組合進行比較，而且推算的表示甲基化狀態(tài)的片段質(zhì)量的一個或多個組合可以與試驗的片段質(zhì)量峰值進行聯(lián)系。然后，樣品核酸分子的甲基化狀態(tài)可以鑒定為推算的片段質(zhì)量總和與試驗的質(zhì)量峰值最密切相關(guān)的參考核酸的甲基化狀態(tài)，可選的，假如相關(guān)性高于用戶定義的閾值量。
樣品質(zhì)量(或峰值特征)與參考質(zhì)量(或峰值特征)的相關(guān)性可以用本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的多種方式中的任何一種來實施。例如，具有特定的觀察或推算的質(zhì)量和強度(例如，峰面積或信噪比)的參考質(zhì)量可以僅存在于多種參考質(zhì)量模式中的一種。檢測具有基本相同的質(zhì)量和強度(例如，在實驗誤差以內(nèi)相同的質(zhì)量和強度)的樣品質(zhì)量，可以用來鑒定同一個靶核酸分子內(nèi)的核苷酸基因座具有與參考核酸的核苷酸基因座相同的甲基化狀態(tài)。樣品質(zhì)量和參考質(zhì)量之間的相關(guān)性可以利用統(tǒng)計學方法包括回歸方法例如線性或非線性回歸以及其他已知用于數(shù)據(jù)相關(guān)性的方法來實施。
在一個具體實施方式
中，用戶可以定義一個閾值，設(shè)定了參考核酸以足夠可能性來鑒定靶核酸分子中甲基化或缺乏甲基化所必需的最小相關(guān)性。當不存在高于閾值的相關(guān)性時，則沒有一個靶核酸能以足夠可能性來鑒定靶核酸分子中甲基化或缺乏甲基化。當在一個或多個參考質(zhì)量與樣品靶核酸分子質(zhì)量之間存在高于閾值的相關(guān)性時，具有最高相關(guān)性的參考核酸可以鑒定靶核酸分子中的甲基化或缺乏甲基化。
通過實驗確定的質(zhì)量和質(zhì)量峰值特征可以與本文描述的推算的質(zhì)量和質(zhì)量峰值特征在靶核酸甲基化鑒定方法中的應(yīng)用相同的方式來應(yīng)用。另外，可以從參考核酸分子的實驗性確定、推算或二者的組合而得到參考質(zhì)量和/或質(zhì)量峰值的數(shù)據(jù)庫，所述數(shù)據(jù)庫可以與本文描述的推算的質(zhì)量和質(zhì)量峰值特征在靶核酸甲基化鑒定方法中的應(yīng)用相同的方式來應(yīng)用。
ii.核酸分子序列未知 在一個具體實施方式
中，靶核酸分子中存在甲基化或未甲基化的核苷酸可以利用核酸分子片段的質(zhì)量模式來鑒定，而無需了解靶核酸分子的序列。例如，核酸分子片段的測定質(zhì)量可以與一個或多個參考核酸分子片段進行比較，包括參考質(zhì)量模式例如含有多個質(zhì)量峰值的質(zhì)譜，其中參考核酸分子中甲基化或未甲基化核苷酸的存在或缺乏是已知的，其中參考質(zhì)量或參考質(zhì)量模式與測定的質(zhì)量或測定的質(zhì)量模式相同則鑒定靶核酸分子具有與參考核酸分子相同的甲基化或未甲基化核苷酸，而參考質(zhì)量或參考質(zhì)量模式與測定的質(zhì)量或測定的質(zhì)量模式不同時則鑒定靶核酸分子具有不同于參考核酸分子的核苷酸甲基化狀態(tài)。在這些方法中，對于鑒定靶核酸分子中存在甲基化或未甲基化核苷酸來說，靶核酸或參考核酸的核苷酸序列都是不必要。
實驗性方法可以在核苷酸序列未知但已知含有甲基化核苷酸或已知含有未甲基化核苷酸的參考核酸分子上進行。這種參考核酸分子可以用甲基化特異性試劑處理、切割，且可以測定質(zhì)量片段。這些參考核酸片段質(zhì)量可以用來確定靶核酸分子中是否含有甲基化或未甲基化核苷酸以及確定靶核酸分子中存在的甲基化或未甲基化核苷酸的量。這種確定可以通過比較靶核酸分子片段的一種或多種質(zhì)量(或質(zhì)量峰值特征)與來自一種或多種參考核酸分子片段的一種或多種質(zhì)量(或質(zhì)量峰值特征)而實現(xiàn)。
在一種示例性的方法中，從樣品靶核酸分子片段測定的一種或多種質(zhì)量峰值特征，可以與從來自一種或多種參考核酸分子的一個或多個片段測定的一種或多種質(zhì)量峰值特征進行比較，而且一種或多種參考核酸分子質(zhì)量峰值可以與樣品靶核酸質(zhì)量峰值進行聯(lián)系。然后，樣品靶核酸分子的甲基化狀態(tài)可以鑒定為和其所具有的一種或多種質(zhì)量峰值與樣品靶核酸分子的質(zhì)量峰值最密切相關(guān)的參考核酸的甲基化狀態(tài)相當，并且可選的，假設(shè)相關(guān)性高于用戶定義的閾值量。因此，當含有靶核酸分子的區(qū)域的核苷酸序列未知時，即使待討論的序列或部分的定位均不是已知的，靶核酸分子甲基化狀態(tài)的鑒定可以通過鑒定特定的參考核酸具有相同的甲基化狀態(tài)而實現(xiàn)。
c.質(zhì)量峰值特征的應(yīng)用 測定的質(zhì)量可以具有三個或更多的鑒定特征，包括測定的質(zhì)量、峰面積(例如，質(zhì)量峰值下的面積)、以及質(zhì)量信號的信噪比。本文預(yù)期少至1個或少至2個質(zhì)量峰值特征可以用于本文披露的靶核酸分子甲基化鑒定方法中。當靶核酸分子的核苷酸序列已知時，一個或多個質(zhì)量峰值的組合可以用來鑒定靶核酸分子中核苷酸的甲基化狀態(tài)，其中所述組合表示一種或多種預(yù)測的質(zhì)量峰值特征作為核苷酸序列和預(yù)測的靶核酸分子甲基化狀態(tài)的結(jié)果。
在一個具體實施方式
中，兩個或多個質(zhì)量峰值的特征用來鑒定靶核酸分子的甲基化狀態(tài)。在這個方法中，兩種或多種質(zhì)量峰值特征的組合稱為“模式”。例如，模式可以是兩個或多個核酸分子片段的質(zhì)量。在另一個實施例中，模式可以是兩個或多個核酸分子片段的質(zhì)量和強度?？梢愿鶕?jù)本文披露的甲基化鑒定方法使用靶核酸分子片段的質(zhì)量峰值特征的模式。例如，來自樣品靶核酸分子的模式可以與一個或多個參考核酸分子片段模式進行比較，與樣品靶核酸分子片段模式最密切相關(guān)的參考片段模式表示樣品核酸分子中的甲基化與匹配的參考核酸分子的甲基化相當。
2.獲自片段測定分析的信息 本文提供的方法可以用來提供多種有關(guān)樣品的不同類型信息中的任何一種。例如，方法可以用來檢測樣品中少量甲基化或未甲基化靶核酸分子，檢測不完全胞嘧啶轉(zhuǎn)化，以及鑒定靶核酸分子中多個核苷酸基因座的甲基化狀態(tài)。
a.檢測小量甲基化或未甲基化核酸 在一個具體實施方式
中，本文提供的方法可以用來檢測樣品中小量甲基化或未甲基化靶核酸分子。作為多種因素中任何一種的結(jié)果，甲基化或未甲基化靶核酸分子可以小量存在于多種樣品中的任何一種。例如，因為所述樣品本身非常小或者因為甲基化或未甲基化靶核酸分子相對于樣品中核酸總量非常小，甲基化或未甲基化靶核酸分子可以小量存在，。因此，現(xiàn)有方法可以用來檢測小樣品中的甲基化或未甲基化靶核酸分子，以及可以用來檢測含有相對大量背景核酸的樣品中的甲基化或未甲基化靶核酸分子。
在另一個實施例中，甲基化靶核酸分子可以小量存在于含有小量新生物細胞的組織樣品中，其中甲基化靶核酸分子僅存在于新生物細胞中。因此，相對于樣品中存在的DNA總量或核酸分子總量，甲基化靶核酸分子可以小量存在。當甲基化靶核酸分子以相對小量存在時，利用未甲基化特異性的方法擴增靶核酸分子，可以得到擴增的核酸分子的集合，其中來自于甲基化靶核酸分子的擴增的靶核酸分子以相對小量存在，以至于擴增的靶核酸分子不能被檢測，或者擴增的甲基化靶核酸分子的檢測不大于確證存在甲基化靶核酸分子必需的信噪比。
甲基化靶核酸分子可以小量存在于樣品中，因為例如樣品含有異質(zhì)DNA。異質(zhì)DNA可以來自于含有兩種或多種生物體DNA的DNA樣品。異質(zhì)DNA還可以來自于含有單一生物體兩種或多種細胞的DNA樣品，其中兩種或多種細胞的表遺傳學狀態(tài)不同。
根據(jù)具體實施方式
，其中小量甲基化靶核酸分子存在于樣品中，本文提供的方法可以用來檢測甲基化靶核酸分子。例如，本文提供的甲基化特異性擴增方法可以用來增加甲基化或未甲基化靶核酸分子的相對量或者既增加來自于用試劑處理甲基化靶核酸分子的核酸分子的總量又增加其相對量，其中所述試劑根據(jù)其甲基化狀態(tài)而修飾靶核酸分子(在這種具體實施方式
中，靶核酸分子和來自于處理的靶核酸分子的核酸分子可以替代使用)，即甲基化或未甲基化靶核酸分子的擴增可以用來增加樣品中存在的甲基化或未甲基化靶核酸分子的總量，并且由此增加可利用本文提供的質(zhì)量測定方法進行檢測的甲基化或未甲基化靶核酸分子片段的量。另外，甲基化或未甲基化靶核酸分子的甲基化特異性擴增可以用來選擇性增加樣品中存在的甲基化或未甲基化靶核酸分子的量，而無需增加背景或非需要核酸分子或樣品中存在的其他核酸的量，因此增加可利用本文提供的質(zhì)量測定方法進行檢測的甲基化或未甲基化靶核酸分子片段的相對量。因此，利用本文提供的方法，即使其以小量存在時，甲基化或未甲基化靶核酸分子可以被檢測。本文提供的方法可以用來檢測樣品中存在的甲基化或未甲基化靶核酸分子，其量可以小至1pg、5pg、10pg、50pg、100pg、500pg或1ng。本文提供的方法可以用來檢測樣品中存在的甲基化或未甲基化靶核酸分子，其相對量可以小至0.001％、0.005％、0.01％、0.05％或0.1％。
b.區(qū)分甲基化狀態(tài)和不完全轉(zhuǎn)化 在另一個具體實施方式
中，本文提供的方法可以用來區(qū)分來自含有甲基化核苷酸的靶核酸分子的片段與來自靶核酸分子中未甲基化核苷酸不完全轉(zhuǎn)化的片段。作為靶核酸分子甲基化狀態(tài)的函數(shù)而修飾核酸分子序列的方法可能是不完全的，得到處理過的未甲基化核酸分子的異質(zhì)性混合物，其中處理過的未甲基化核酸分子的一部分具有與處理過的甲基化核酸分子相同的核苷酸序列，或者其中處理過的靶核酸分子上的未甲基化基因座的一部分具有與處理過的核酸分子上的甲基化基因座相同的序列，結(jié)果也可以稱為不完全轉(zhuǎn)化。在處理步驟之后，可以利用本文提供的質(zhì)量測定方法區(qū)分來自不完全轉(zhuǎn)化的片段和來自真正甲基化核苷酸的片段。
核酸分子均質(zhì)混合物的不完全轉(zhuǎn)化得到處理過的核酸分子的異質(zhì)混合物。如果不完全轉(zhuǎn)化的位點不位于擴增引物雜交位點，不完全轉(zhuǎn)化的位點在隨后的任何擴增步驟中將保持異質(zhì)，而且將得到由質(zhì)量測定檢測的核酸分子片段的異質(zhì)混合物。異質(zhì)核酸分子片段將包含一些核酸片段可表示特定核苷酸的甲基化盡管核苷酸為未甲基化的(即含有未被轉(zhuǎn)化核苷酸的片段)，以及核酸片段可表示在該核苷酸的未甲基化(即含有被轉(zhuǎn)化核苷酸的片段)。異質(zhì)核酸分子片段還可能含有一些核酸片段，其中特定核苷酸始終鑒定為甲基化。
質(zhì)量測定方法可以用來區(qū)分部分轉(zhuǎn)化和真正的甲基化核苷酸，通過檢測表示在特定核苷酸表示的未甲基化的核酸分子片段。既存在表示未甲基化的核酸分子片段又存在表示在同一核苷酸甲基化的核酸分子片段，可以表示核苷酸在該基因座的轉(zhuǎn)化不完全，而且在該基因座的核苷酸在樣品核酸分子中不是甲基化的。相反，存在適中表示在核苷酸基因座甲基化的靶核酸分子片段可以表示核苷酸基因座在樣品核酸分子中是甲基化的。
在一個具體實施方式
中，來自于甲基化核苷酸或甲基化基因座的片段不必須是均質(zhì)的。即在一個斷裂模式中的某些片段可以反映在一個基因座的甲基化核苷酸而其他片段反映在該基因座的未甲基化核苷酸，即使基因座始終是甲基化的。這可以來源于均質(zhì)樣品，例如當斷裂不完全時；還可以來源于非完全均質(zhì)的樣品。本文提供的方法可以用來鑒定基因座為甲基化的，即使存在異質(zhì)片段。在一個實施例中，當反映甲基化基因座的片段數(shù)量大于反映未甲基化基因座的片段數(shù)量時，在靶核酸中基因座是甲基化的；而當反映甲基化基因座的片段數(shù)量小于反映未甲基化基因座的片段數(shù)量時，在靶核酸中基因座是未甲基化的。因此，反映甲基化的片段相對于反映未甲基化的片段的比可以用來確定在特定基因座的甲基化。在一個實施例中，如果甲基化片段與未甲基化片段的比值大于1，則基因座是甲基化的，反之亦然。在另一個實施例中，如果甲基化片段與未甲基化片段的比值大于2、3或4，則基因座是甲基化的；而如果甲基化片段與未甲基化片段的比值小于1/2、1/3或1/4，則基因座是未甲基化的。在后者的實施例中，比值約為1可以得到不確定的結(jié)果，其中無法鑒定特定基因座的甲基化狀態(tài)。
在另一個具體實施方式
中，靶核酸分子的片段與參考核酸分子進行比較。例如，靶核酸分子可以用重亞硫酸鹽進行處理、擴增并斷裂，且片段可以反映一個或多個胞嘧啶基因座的不完全重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化。靶核酸分子的斷裂可以與甲基化狀態(tài)已知的參考核酸分子進行比較，且所述參考核酸分子也已經(jīng)重亞硫酸鹽進行處理、擴增并斷裂。例如，當參考核酸僅含有未甲基化胞嘧啶時，斷裂模式可以反映在一個或多個基因座不完全轉(zhuǎn)化的基線量。在這些方法的范圍之內(nèi)，每個核苷酸基因座可以以不同的量轉(zhuǎn)化，因此在斷裂模式中反映的不完全轉(zhuǎn)化的基線量，對于每一個核苷酸基因座可以變動。將參考核酸分子斷裂模式與靶核酸分子進行比較時，當靶核酸分子的一個或多個片段大于或小于基線量時，則一個或多個基因座可以鑒定為至少部分甲基化。建立不完全轉(zhuǎn)化基線的參考核酸，可以用于例如一些方法中，其中靶核酸分子在異質(zhì)核酸樣品中例如含有正常細胞和腫瘤細胞的組織樣品、來自多個個體的集合樣品、或者來自單個生物體或單個細胞的異質(zhì)二倍體DNA。在這種情況下，對一個量來說，如果一個或多個片段大于或小于由參考核酸建立的基線量，則該量反映在一個或多個基因座為甲基化的核苷酸相對量。這種方法還可以用于均質(zhì)核酸樣品中以類似的校正不完全轉(zhuǎn)化。
c.確定在兩個或多個基因座的甲基化狀態(tài) 在另一個具體實施方式
中，本文提供的方法可以用來鑒定靶核酸分子中兩個或多個核苷酸基因座的甲基化狀態(tài)?？梢杂糜诒疚奶峁┑姆椒ǖ陌泻怂岱肿涌梢院袃蓚€或多個其甲基化狀態(tài)待定的核苷酸基因座。例如，靶核酸分子可以含有一個或多個核苷酸基因座，其甲基化狀態(tài)待定且位于靶核酸分子的引物雜交區(qū)(或擴增阻滯劑雜交區(qū))。且這種靶核酸分子還可以含有一個或多個核苷酸基因座，其甲基化狀態(tài)待定且不位于與引物(或擴增阻滯劑)雜交的區(qū)域。本文披露的方法提供了通過兩種方法來鑒定核苷酸基因座的甲基化狀態(tài)擴增和片段檢測。例如，位于雜交區(qū)的基因座的甲基化狀態(tài)可以通過擴增靶核酸來確定，而位于不與引物(或擴增阻滯劑)雜交的區(qū)域中基因座的甲基化狀態(tài)可以通過本文提供的斷裂和檢測方法來確定。而且，擴增方法和片段檢測方法均可以用來鑒定兩個或多個核苷酸基因座的甲基化狀態(tài)，得到大量靶核酸分子的核苷酸基因座，其甲基化狀態(tài)可以利用本文提供的方法進行鑒定。
在一個具體實施方式
中，位于不與引物(或擴增阻滯劑)雜交的區(qū)域中的核苷酸基因座不用于本文提供的甲基化特異性擴增步驟中，因此，本文提供的方法可以用來鑒定一個或多個核苷酸基因座的甲基化狀態(tài)，其中這種鑒定是通過質(zhì)量峰值分析而非通過雜交或擴增方法來實施?？梢岳觅|(zhì)量峰值分析而非通過雜交或擴增方法來鑒定其甲基化狀態(tài)的核苷酸基因座的數(shù)量可以為2個或更多、3個或更多、5個或更多、7個或更多、9個或更多、11個或更多、13個或更多、15個或更多、17個或更多、20個或更多、25個或更多、30個或更多、35個或更多、40個或更多、45個或更多、50個或更多、60個或更多、70個或更多、或者80個或更多。
d.特異性擴增的確證 在另一個具體實施方式
中，本文提供的方法可用來確證與甲基化狀態(tài)特異性擴增引物互補的靶核酸分子的特異性擴增。本文提供的方法還可用來區(qū)分與甲基化狀態(tài)特異性擴增引物互補的靶核酸分子的特異性擴增以及來自于靶核酸分子和甲基化狀態(tài)特異性擴增引物之間錯配的擴增。本文提供的方法還可用來確定靶核酸分子中可與一個或多個甲基化特異性引物雜交的區(qū)域內(nèi)一個或多個核苷酸的甲基化狀態(tài)。例如，本文提供的方法可用來測定通過甲基化狀態(tài)特異性擴增引物而擴增形成的擴增產(chǎn)物或其片段的質(zhì)量，所述測定的質(zhì)量可以用來確證是否發(fā)生甲基化特異性擴增，是否在甲基化狀態(tài)特異性引物和靶核酸分子之間的發(fā)生錯配，或者靶核酸分子中甲基化特異性引物結(jié)合區(qū)內(nèi)一個或多個核苷酸是否為甲基化的。在另一個實施例中，本文提供的方法可以用來確定由擴增產(chǎn)物的斷裂形成的斷裂產(chǎn)物的數(shù)量，而擴增產(chǎn)物通過用甲基化狀態(tài)特異性擴增引物擴增而產(chǎn)生，而斷裂產(chǎn)物的數(shù)量可以用來確證是否發(fā)生甲基化狀態(tài)特異性擴增，或是否在甲基化狀態(tài)特異性引物和靶核酸分子之間發(fā)生錯配，或者靶核酸分子中甲基化特異性引物結(jié)合區(qū)內(nèi)一個或多個核苷酸是否為甲基化的。
i.區(qū)別錯配雜交 因為某些現(xiàn)象例如錯配雜交或不完全胞嘧啶轉(zhuǎn)化可以引起靶核酸分子的擴增而不能準確反映靶核酸分子的甲基化狀態(tài)，因而傳統(tǒng)的甲基化特異性PCR方法傾向于假陽性結(jié)果。例如，當擴增作為錯配雜交的結(jié)果而發(fā)生時，甲基化特異性PCR的每個擴增產(chǎn)物不再含有關(guān)于引物雜交區(qū)內(nèi)靶核酸分子的序列信息。在幾輪擴增之后，擴增產(chǎn)物的數(shù)量遠大于靶核酸分子的數(shù)量，并且關(guān)于引物雜交區(qū)內(nèi)靶核酸分子核苷酸序列的信息基本上被丟失。結(jié)果，可以產(chǎn)生不能準確反映靶核酸分子甲基化狀態(tài)的擴增產(chǎn)物，這種結(jié)果通常命名為假陽性結(jié)果。
現(xiàn)有方法可以用來區(qū)分假陽性結(jié)果和真陽性結(jié)果，后者的擴增產(chǎn)物結(jié)果確實準確地反映靶核酸分子的甲基化狀態(tài)。當甲基化發(fā)生于核酸區(qū)域時(例如，CpG島)，經(jīng)常發(fā)生于區(qū)域內(nèi)一個以上核苷酸。例如，含有一個甲基化CpG的CpG島通常將含有一個或多個其它的甲基化CpG。本文提供的方法可以用來確定在甲基化特異性擴增時不與一個或多個甲基化特異性引物雜交的靶核酸分子區(qū)域內(nèi)的核苷酸甲基化狀態(tài)。通過評估不被甲基化特異性引物結(jié)合的靶核酸分子區(qū)域中核苷酸的甲基化狀態(tài)，有可能確定引物結(jié)合的靶核酸分子區(qū)域中一個或多個核苷酸的甲基化狀態(tài)。
例如，在靶核酸分子較大比例的核苷酸中或在靶核酸分子幾乎沒有一個核苷酸中，CpG島可以含有甲基化的胞嘧啶核苷酸。在這種實例中，通過鑒定靶核酸分子中甲基化特異性引物不與其雜交的一部分內(nèi)一個或多個核苷酸基因座的甲基化狀態(tài)，用甲基化特異性引物(或擴增阻滯劑)進行的靶核酸擴增可以鑒定為假陽性擴增或真陽性擴增。
例如，當甲基化狀態(tài)特異性引物通過雜交到含有一個或多個C核苷酸的靶核酸分子核苷酸序列而用來擴增經(jīng)重亞硫酸鹽處理的靶核酸分子時，如果靶核酸區(qū)域內(nèi)不被甲基化狀態(tài)特異性引物雜交的C核苷酸中沒有一個是甲基化的，甲基化狀態(tài)特異性擴增反應(yīng)可以確定為假陽性。即當甲基化狀態(tài)特異性擴增反應(yīng)產(chǎn)生一個結(jié)果，其中唯一的甲基化C核苷酸位于甲基化狀態(tài)特異性引物雜交區(qū)；來自這種甲基化狀態(tài)特異性擴增的結(jié)果可用來推斷沒有發(fā)生甲基化特異性擴增、而是在甲基化狀態(tài)特異性引物和靶核酸分子之間發(fā)生了錯配，并且靶核酸分子中甲基化特異性引物結(jié)合區(qū)內(nèi)的一個或多個C核苷酸不是甲基化的。
在另一個實施例中，當甲基化狀態(tài)特異性引物通過雜交到含有一個或多個U或T核苷酸而取代一個或多個C核苷酸(即重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化的未甲基化C核苷酸)的靶核酸分子核苷酸序列而用來擴增經(jīng)重亞硫酸鹽處理的靶核酸分子時，如果不被甲基化狀態(tài)特異性引物雜交的靶核酸分子區(qū)域內(nèi)的多個C核苷酸是甲基化的，則甲基化狀態(tài)特異性擴增反應(yīng)可以確定為假陽性。即當甲基化狀態(tài)特異性擴增反應(yīng)產(chǎn)生一個結(jié)果，其中唯一的甲基化C核苷酸位于甲基化狀態(tài)特異性引物雜交區(qū)；來自這種甲基化狀態(tài)特異性擴增的結(jié)果可用來推斷沒有發(fā)生甲基化狀態(tài)特異性擴增、而是在甲基化狀態(tài)特異性引物和靶核酸分子之間發(fā)生了錯配，并且靶核酸分子中甲基化特異性引物結(jié)合區(qū)內(nèi)的一個或多個C核苷酸不是甲基化的。
在另一個實施例中，例如，當甲基化狀態(tài)特異性引物通過雜交到含有一個或多個C核苷酸的靶核酸分子核苷酸序列而用來擴增經(jīng)重亞硫酸鹽處理的靶核酸分子時，如果靶核酸區(qū)域內(nèi)不被甲基化狀態(tài)特異性引物雜交的C核苷酸中沒有一個是甲基化的，甲基化狀態(tài)特異性擴增反應(yīng)可以確定為真陽性。即當甲基化狀態(tài)特異性擴增反應(yīng)產(chǎn)生一個結(jié)果，其中多個甲基化C核苷酸位于甲基化狀態(tài)特異性引物雜交區(qū)之外；來自這種甲基化狀態(tài)特異性擴增的結(jié)果可用來推斷發(fā)生了甲基化特異性擴增、而沒有在甲基化狀態(tài)特異性引物和靶核酸分子之間發(fā)生錯配，并且靶核酸分子中甲基化特異性引物結(jié)合區(qū)內(nèi)的一個或多個C核苷酸是甲基化的。
在另一個實施例中，當甲基化狀態(tài)特異性引物通過雜交到含有一個或多個U或T核苷酸而取代一個或多個C核苷酸(即重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化的未甲基化C核苷酸)的靶核酸分子核苷酸序列而用來擴增經(jīng)重亞硫酸鹽處理的靶核酸分子時，如果不被甲基化狀態(tài)特異性引物雜交的靶核酸區(qū)域內(nèi)的C核苷酸中沒有一個是甲基化的，則甲基化狀態(tài)特異性擴增反應(yīng)可以確定為真陽性。即當甲基化狀態(tài)特異性擴增反應(yīng)產(chǎn)生一個結(jié)果，其中多個未甲基化C核苷酸位于甲基化狀態(tài)特異性引物雜交區(qū)之外；來自這種甲基化狀態(tài)特異性擴增的結(jié)果可用來推斷發(fā)生甲基化特異性擴增、而沒有在甲基化狀態(tài)特異性引物和靶核酸分子之間發(fā)生錯配，并且靶核酸分子中甲基化特異性引物結(jié)合區(qū)內(nèi)的一個或多個C核苷酸是未甲基化的。
上述實例中的一些指的是一些情況，其中未被甲基化特異性引物結(jié)合的區(qū)域內(nèi)的核苷酸沒有一個是甲基化或未甲基化的，而且當這種核苷酸中沒有一個是甲基化或未甲基化的時，甲基化狀態(tài)特異性引物結(jié)合區(qū)內(nèi)的核苷酸甲基化狀態(tài)可以確定為同樣狀態(tài)。如應(yīng)用于上述實例，本文還預(yù)期了一些情況，其中在靶核酸分子的較大比率核苷酸中或在靶核酸分子幾乎沒有一個核苷酸中，核苷酸的甲基化狀態(tài)是相同的。例如，當靶核酸分子中100個核苷酸長的非雜交區(qū)內(nèi)僅有一個胞嘧啶被確定為甲基化時，可以推算非雜交區(qū)中幾乎沒有一個核苷酸是甲基化的，而且因此，在甲基化狀態(tài)特異性引物雜交區(qū)內(nèi)的核苷酸也是未甲基化的。典型的，對于某些情況其中幾乎沒有一個核苷酸是甲基化或未甲基化的，少于約20％的核苷酸(例如，少于20％的胞嘧啶)是甲基化或未甲基化的。通常，當幾乎沒有一個核苷酸是甲基化或未甲基化時，少于約10％或少于約5％的核苷酸是甲基化或未甲基化的。典型的，對于某些情況其中大多數(shù)核苷酸是甲基化或未甲基化的，至少50％的核苷酸(例如，至少約50％胞嘧啶)是甲基化或未甲基化的。通常，當大多數(shù)核苷酸是甲基化或未甲基化的時，多于約70％或多于約85％的核苷酸是甲基化或未甲基化的。
在另一個實施例中，當存在含有兩個或多個已知甲基化狀態(tài)的基因座參考核酸序列時，本文提供的方法可以用來確證是否發(fā)生甲基化狀態(tài)特異性擴增、是否在甲基化狀態(tài)特異性引物和靶核酸分子之間發(fā)生錯配，或者靶核酸分子中甲基化特異性引物結(jié)合區(qū)內(nèi)一個或多個核苷酸是否為甲基化的。尤其是，當兩個或多個基因座的甲基化狀態(tài)相相關(guān)性時，本文提供的方法可以用來確證是否發(fā)生甲基化特異性擴增，是否在甲基化狀態(tài)特異性引物和靶核酸分子之間發(fā)生錯配，或者靶核酸分子中甲基化特異性引物結(jié)合區(qū)內(nèi)一個或多個核苷酸是否為甲基化的。例如，當?shù)谝患谆奏ず偷诙谆奏ぶg存在相關(guān)性時，鑒定第一胞嘧啶為甲基化也可以用來鑒定第二胞嘧啶為甲基化的。因此，當靶核酸分子區(qū)域內(nèi)未被甲基化特異性引物雜交的胞嘧啶鑒定為甲基化時，靶核酸分子區(qū)域內(nèi)被甲基化特異性引物雜交的胞嘧啶也可鑒定為甲基化的。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根據(jù)胞嘧啶基因座的甲基化狀態(tài)以及所使用的甲基化狀態(tài)特異性引物，推斷是否發(fā)生了甲基化特異性擴增以及是否發(fā)生了錯配雜交。類似的，當甲基化胞嘧啶與未甲基化胞嘧啶相相關(guān)性時，鑒定兩個基因座之一則可以鑒定兩者；根據(jù)胞嘧啶基因座的甲基化狀態(tài)以及所使用的甲基化狀態(tài)特異性引物，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以推斷是否發(fā)生了甲基化特異性擴增以及是否發(fā)生了錯配雜交。類似的，當一個未甲基化胞嘧啶與另一個未甲基化胞嘧啶相相關(guān)性時，鑒定兩個基因座之一則可以鑒定兩者；根據(jù)胞嘧啶基因座的甲基化狀態(tài)以及所使用的甲基化狀態(tài)特異性引物，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以推斷是否發(fā)生了甲基化特異性擴增以及是否發(fā)生了錯配雜交。
用于區(qū)分假陽性和真陽性的方法可以利用本文提供的任何一種方法而實施。例如，將片段質(zhì)量與參考質(zhì)量進行比較，所述片段質(zhì)量相對于參考質(zhì)量的位移可以表示靶核酸分子中不與甲基化狀態(tài)特異性引物雜交的靶核酸分子區(qū)域內(nèi)核苷酸的甲基化狀態(tài)，而且因此可以根據(jù)實驗設(shè)計以及待確定的甲基化狀態(tài)推斷發(fā)生了假陽性擴增或真陽性擴增。在另一個實施例中，將片段質(zhì)量與參考質(zhì)量進行比較，在片段質(zhì)量與參考質(zhì)量之間的相同質(zhì)量可以表示靶核酸分子中不與甲基化狀態(tài)特異性引物雜交的靶核酸分子區(qū)域內(nèi)核苷酸的甲基化狀態(tài)，而且因此可以根據(jù)實驗設(shè)計推斷發(fā)生了假陽性擴增或真陽性擴增。在另一個實施例中，將樣品片段的數(shù)量與參考質(zhì)量的數(shù)量進行比較，在片段數(shù)量相對于參考數(shù)量之間的差異可以表示靶核酸分子中不與甲基化狀態(tài)特異性引物雜交的靶核酸分子區(qū)域內(nèi)核苷酸的甲基化狀態(tài)，而且因此可以根據(jù)實驗設(shè)計推斷發(fā)生了假陽性擴增或真陽性擴增。在另一個實施例中，將樣品片段的數(shù)量與參考質(zhì)量的數(shù)量進行比較，所述片段數(shù)量相對于參考數(shù)量相同時，可以表示靶核酸分子中不與甲基化狀態(tài)特異性引物雜交的靶核酸分子區(qū)域內(nèi)核苷酸的甲基化狀態(tài)，而且因此可以根據(jù)實驗設(shè)計推斷發(fā)生了假陽性擴增或真陽性擴增。在另一個實施例中，確定樣品片段的數(shù)量，當觀察到三個或多個片段時，可以表示靶核酸分子中不與甲基化狀態(tài)特異性引物雜交的靶核酸分子區(qū)域內(nèi)核苷酸的甲基化狀態(tài)和靶核酸分子中與甲基化狀態(tài)特異性引物雜交的靶核酸分子區(qū)域內(nèi)核苷酸的甲基化狀態(tài)相同，并且因此可以用來推斷發(fā)生了真陽性擴增。在另一個實施例中，確定樣品片段的數(shù)量，當觀察到三個或較少片段時，可以表示靶核酸分子中不與甲基化狀態(tài)特異性引物雜交的靶核酸分子區(qū)域內(nèi)核苷酸的甲基化狀態(tài)不同于靶核酸分子中與甲基化狀態(tài)特異性引物雜交的靶核酸分子區(qū)域內(nèi)核苷酸的甲基化狀態(tài)，并且因此可以用來推斷發(fā)生了假陽性擴增。
ii.區(qū)別不完全轉(zhuǎn)化 假陽性擴增還可以來自于不完全轉(zhuǎn)化。當發(fā)生不完全轉(zhuǎn)化時，例如，通過重亞硫酸鹽將未甲基化胞嘧啶不完全轉(zhuǎn)化成尿嘧啶，甲基化狀態(tài)特異性引物可以雜交到未轉(zhuǎn)化的核苷酸上，產(chǎn)生的擴增產(chǎn)物不能準確反映靶核酸的甲基化狀態(tài)。本文提供的方法可以用來確定當發(fā)生不完全轉(zhuǎn)化時，可以用來區(qū)分不完全轉(zhuǎn)化的核苷酸與甲基化或未甲基化核苷酸，且可以用來確定不完全轉(zhuǎn)化發(fā)生的程度。在確定已經(jīng)發(fā)生不完全轉(zhuǎn)化的情況下，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以確定不完全轉(zhuǎn)化的程度并推斷甲基化特異性擴增作為不完全轉(zhuǎn)化結(jié)果發(fā)生的可能性，引起假陽性擴增。例如，當多于約5％、多于約10％或多于約20％的核苷酸為不完全轉(zhuǎn)化時，甲基化特異性擴增可被確定為假陽性擴增。因此，本文還提供了一些方法，用于確定利用甲基化狀態(tài)特異性擴增引物，是否由于不完全轉(zhuǎn)化而發(fā)生靶核酸分子的假陽性擴增。本文提供的方法還可以用來區(qū)分完全轉(zhuǎn)化的與甲基化狀態(tài)特異性擴增引物互補的靶核酸分子擴增和來自不完全轉(zhuǎn)化的靶核酸分子與甲基化狀態(tài)特異性引物雜交的擴增；這種方法包括確定是否發(fā)生不完全轉(zhuǎn)化，如果發(fā)生不完全轉(zhuǎn)化，則可推斷擴增來自不完全轉(zhuǎn)化的靶核酸分子與甲基化狀態(tài)特異性引物的雜交。
本文提供的方法還可以用來確定靶核酸分子中與一個或多個甲基化特異性引物雜交的區(qū)域內(nèi)一個或多個核苷酸的甲基化狀態(tài)。例如，本文提供的方法可以用來確定位于甲基化狀態(tài)特異性引物不與其雜交的靶核酸分子部分內(nèi)的核苷酸是否為真實的甲基化還是僅僅為不完全轉(zhuǎn)化，如在本文其他部分更充分描述的。如果位于甲基化狀態(tài)特異性引物不與其雜交的靶核酸分子部分內(nèi)的核苷酸確定為甲基化的，則本文提供的方法可以用來確定甲基化狀態(tài)特異性引物雜交區(qū)內(nèi)的核苷酸也為甲基化的，且盡管發(fā)生了不完全轉(zhuǎn)化，但還是發(fā)生了真甲基化特異性擴增。
在另一個實施例中，本文提供的方法可以用來確定位于甲基化狀態(tài)特異性引物不與其雜交的靶核酸分子部分內(nèi)的核苷酸是否為真實的未甲基化還是僅僅為不完全轉(zhuǎn)化。如果位于甲基化狀態(tài)特異性引物不與其雜交的靶核酸分子部分內(nèi)的核苷酸確定為未甲基化的，則本文提供的方法可以用來確定甲基化狀態(tài)特異性引物雜交區(qū)內(nèi)的核苷酸也為未甲基化的，且盡管發(fā)生了不完全轉(zhuǎn)化，但還是發(fā)生了真甲基化特異性擴增。
在另一個實施例中，本文提供的方法可以用來確定位于甲基化狀態(tài)特異性引物不與其雜交的靶核酸分子部分內(nèi)的核苷酸是否為真實的甲基化還是僅僅為不完全轉(zhuǎn)化。如果位于甲基化狀態(tài)特異性引物不與其雜交的靶核酸分子部分內(nèi)的少數(shù)或沒有核苷酸確定為甲基化的，則本文提供的方法可以用來確定甲基化狀態(tài)特異性引物雜交區(qū)內(nèi)的核苷酸為未甲基化的，且發(fā)生了假甲基化特異性擴增。
在另一個實施例中，本文提供的方法可以用來確定位于甲基化狀態(tài)特異性引物不與其雜交的靶核酸分子部分內(nèi)的核苷酸是否為真實的未甲基化還是僅僅為不完全轉(zhuǎn)化。如果位于甲基化狀態(tài)特異性引物不與其雜交的靶核酸分子部分內(nèi)的少數(shù)或沒有核苷酸確定為未甲基化的，則本文提供的方法可以用來確定甲基化狀態(tài)特異性引物雜交區(qū)內(nèi)的核苷酸為甲基化的，且發(fā)生了假甲基化特異性擴增。
如在本文披露的，相對于參考片段的片段數(shù)量或相對于相對質(zhì)量的片段質(zhì)量測定片段數(shù)量可以用來確定假陽性擴增是否作為不完全轉(zhuǎn)化的結(jié)果而發(fā)生，所用方式與本文描述的關(guān)于假擴增是否作為錯配雜交的結(jié)果而發(fā)生的方式相同。
2.分析兩條靶核酸分子鏈 當靶核酸分子上至少一個核苷酸為甲基化或未甲基化的時，用可以修飾靶核酸分子序列作為靶核酸分子甲基化狀態(tài)函數(shù)的試劑處理靶核酸分子，可以得到處理過的靶核酸分子的兩條不再完全互補的鏈(即含有至少一個錯配)。例如，用重亞硫酸鹽處理的含有至少一個未甲基化胞嘧啶的靶核酸將在未甲基化胞嘧啶的位點含有錯配的U-G堿基對。處理后、擴增前靶核酸分子的兩條鏈將不會與處理后、擴增后靶核酸分子的兩條鏈相混淆，因為前一組兩條鏈是不互補的，而后一組兩條鏈是互補的。
在一個具體實施方式
中，處理后、擴增前的兩條非互補鏈可用來鑒定靶核酸分子的甲基化狀態(tài)。例如，靶核酸分子的兩條鏈可以含有甲基化和/或未甲基化胞嘧啶，且用重亞硫酸鹽處理雙鏈靶核酸分子可以根據(jù)每條鏈各自的甲基化狀態(tài)而不根據(jù)互補鏈的甲基化狀態(tài)，而引起序列修飾。因此，為了鑒定每條鏈的甲基化狀態(tài)，將每條鏈根據(jù)本文提供的方法分別進行分析。因此，本文還提供了用于鑒定靶核酸分子甲基化狀態(tài)的方法，通過用可以修飾靶核酸分子一個或多個核苷酸作為靶核酸分子甲基化狀態(tài)的函數(shù)的試劑處理靶核酸分子，然后分離處理過的靶核酸分子的兩條鏈，并利用如本文提供的擴增、斷裂和質(zhì)量測定方法鑒定兩條鏈中每一條的甲基化狀態(tài)。
在另一個具體實施方式
中，使用兩條鏈可以發(fā)揮使用參考核酸類似的作用。例如，當用重亞硫酸鹽處理靶核酸分子時，未甲基化的C核苷酸將被轉(zhuǎn)化成U(在DNA中，為T)核苷酸，但是互補鏈的相應(yīng)G核苷酸以及甲基化的C核苷酸將不會被轉(zhuǎn)化。匹配的C-G堿基對基因座可以表示存在甲基化的胞嘧啶，而錯配的U-G(T-G)堿基對基因座可以表示存在未甲基化的胞嘧啶。在另一個實施例中，當用重亞硫酸鹽處理靶核酸分子時，第一條鏈的C特異性斷裂可以表示在該鏈上甲基化C核苷酸的數(shù)量和基因座，而第二條鏈的G特異性斷裂可以表示在所述第一條鏈上甲基化和未甲基化C核苷酸的全部數(shù)量和基因座。結(jié)合來自兩條鏈的切割信息可以確定第一條鏈內(nèi)甲基化和未甲基化C核苷酸的數(shù)量和基因座。
4.切割模式中的信息 來源于本文提供的斷裂和測定方法的片段測定，例如堿基特異性切割，可以提供關(guān)于靶核酸分子甲基化狀態(tài)以及靶核酸分子上甲基化核苷酸位置的信息。
在一個具體實施方式
中，全部或幾乎全部靶核酸分子片段質(zhì)量提供關(guān)于甲基化或未甲基化核苷酸基因座存在的冗余信息。例如，通過堿基特異性切割的核酸分子斷裂，可以產(chǎn)生多個核酸片段，且可以測定片段質(zhì)量。核酸分子片段將含有5’末端和3’末端，其中每個末端可以作為斷裂的結(jié)果而產(chǎn)生，或者為原始未切割的核酸分子的5’末端或3’末端。當兩個末端均作為斷裂的結(jié)果而產(chǎn)生時，則每個末端均含有斷裂信息。例如，當重亞硫酸鹽處理的核酸片段的兩個末端均來源于利用RNaseA的C特異性切割時，所述3’末端將含有對應(yīng)于核酸分子中第一甲基化C的C核苷酸，而所述5’末端將含有與對應(yīng)于核酸分子中第二甲基化C的C核苷酸緊鄰的核苷酸。因此，存在這樣一個片段可以鑒定靶核酸分子含有至少兩個甲基化的C核苷酸。另外，如果已知這樣一個核酸分子片段在核酸分子序列中的位置，片段可以表示兩個核酸分子序列在核酸分子中的存在和基因座。檢測相鄰的靶核酸分子片段可以提供交迭信息，而且因此可以用來提供甲基化核苷酸鑒定中的冗余度。例如，如果兩個相鄰片段中的一個不能利用質(zhì)量測定方法進行檢測，則這種冗余度可能非常有用。例如，當一個片段太小或太大而不能利用質(zhì)譜分析精確測定時，相鄰片段的測定還可以允許確定靶核酸分子的甲基化狀態(tài)以及靶核酸分子上甲基化核苷酸的基因座。
擴增的靶核酸分子樣品可以分成兩個或多個部分，且可對每一部份實施不同的擴增步驟。例如，當對靶核酸分子樣品的兩個不同部分實施兩種堿基特異性切割反應(yīng)時，從第一部分的質(zhì)量峰值獲得的信息可以與從第二部分的質(zhì)量峰值獲得的信息部分或完全冗余，作為所述交迭信息的結(jié)果得到增強的冗余度，并作為所述非交迭信息的結(jié)果得到增加的覆蓋(如在該上下文中使用的覆蓋指的是待定的靶核酸基因座甲基化信息的完整性)。例如，可以對兩個分離的靶核酸分子樣品部分實施兩種不同的堿基特異性切割反應(yīng)(每個樣品一種堿基特異性切割)，而且當合并來自兩個切割反應(yīng)的片段測定時，則可以提供關(guān)于待分析核苷酸基因座的甲基化狀態(tài)的信息，也可以提供待分析的一個或多個核苷酸基因座的冗余度。在另一個具體實施方式
中，對四種靶核酸分子樣品進行四種堿基特異性切割反應(yīng)，可以提供關(guān)于所有待分析核苷酸基因座的甲基化狀態(tài)的信息，還可以提供所有待分析核苷酸基因座中90％或更多的冗余信息。
H.應(yīng)用 本文提供的方法可以用于多個應(yīng)用中，包括上述討論的那些應(yīng)用、鑒定新的甲基化位點、鑒定受試者DNA的甲基化狀態(tài)、確定全部甲基化DNA的一部分、以及平行確定兩種或多種靶核酸分子的甲基化狀態(tài)。
1.甲基化的發(fā)現(xiàn) 基因組DNA中甲基化或未甲基化核苷酸可以影響DNA的結(jié)構(gòu)包括染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，還可以影響基因表達。DNA中的胞嘧啶可以為甲基化的。大多數(shù)甲基胞嘧啶位于轉(zhuǎn)位子內(nèi)，甲基胞嘧啶還經(jīng)常在鳥嘌呤形成“CpG”基序時觀察到。CpG基序在基因組中不常見，但是經(jīng)常與其他CpG基序成簇出現(xiàn)，以形成“CpG島”。CpG島通常為500個堿基或更長，且含有至少55％G和C，并觀察到高于預(yù)期CpG頻率至少0.65。CpG島已經(jīng)在啟動子區(qū)域發(fā)現(xiàn)，且認為這些CpG島影響基因表達并在多種疾病包括多種癌癥中發(fā)揮作用。甲基化核苷酸例如CpG島中的甲基化胞嘧啶仍然正在被發(fā)現(xiàn)?，F(xiàn)有的方法提供迅速而靈敏的途徑以發(fā)現(xiàn)其他甲基化的核苷酸，尤其是甲基化胞嘧啶例如在CpG基序和CpG島中的那些甲基化胞嘧啶。缺乏甲基化有可能在DNA結(jié)構(gòu)和/或基因表達中發(fā)揮作用。因此，現(xiàn)有方法還用于發(fā)現(xiàn)未甲基化核苷酸，尤其是未甲基化胞嘧啶例如CpG基序和CpG島中的那些未甲基化胞嘧啶。
可以利用本文提供的方法發(fā)現(xiàn)之前未表征化的甲基化核苷酸，其中擴增中使用的引物可以具有計劃的、預(yù)定義序列或具有隨機序列。為了本具體實施方式
的目的，計劃的或預(yù)定義序列指的是用于一個或多個已知DNA區(qū)域雜交的序列(例如，染色體上的已知位置、已知的啟動子區(qū)域、已知的轉(zhuǎn)位子或反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)位子)。為了本具體實施方式
的目的，隨機序列指的是不計劃用于任何特定DNA區(qū)域雜交的序列。在一個實施例中，具有計劃序列或隨機序列的引物對中的一條引物可以含有一個或多個G核苷酸，其中所述G核苷酸與樣品DNA的C核苷酸雜交。當樣品DNA在引物雜交前用重亞硫酸鹽進行處理時，含有G核苷酸的引物可以選擇性雜交到含有甲基化C核苷酸的DNA序列上。甲基化DNA的擴增、斷裂以及質(zhì)量測定可以利用本文提供的方法而實施。可選的，甲基化擴增的DNA可以利用已知方法或本文提供的方法進行測序?？商鎿Q的，當樣品DNA在引物雜交前用重亞硫酸鹽進行處理且所述重亞硫酸鹽處理的DNA用至少一個步驟擴增時，引物序列可以含有一個或多個C核苷酸，其中C核苷酸與新合成鏈中的G核苷酸雜交，而所述新合成鏈與重亞硫酸鹽處理的鏈互補。
在另一個實施例中，具有計劃序列或隨機序列的引物對中的一條引物可以含有一個或多個A核苷酸，其中所述A核苷酸與樣品DNA的U核苷酸雜交。當樣品DNA在引物雜交前用重亞硫酸鹽進行處理時，含有A核苷酸的引物可以選擇性雜交到含有未甲基化C核苷酸的DNA序列上。未甲基化含胞嘧啶的DNA的擴增、斷裂以及質(zhì)量測定可以利用本文提供的方法而實施?？蛇x的，擴增的DNA可以利用已知方法或本文提供的方法進行測序?？商鎿Q的，當樣品DNA在引物雜交前用重亞硫酸鹽進行處理且重亞硫酸鹽處理的DNA用至少一個步驟擴增時，引物序列可以含有一個或多個T或U核苷酸，其中T或U核苷酸與新合成鏈中的A核苷酸雜交，而所述新合成鏈與重亞硫酸鹽處理的鏈互補。
在一個具體實施方式
中，存在一個或多個甲基化核苷酸可以鑒定為異?；虿煌谶@種生物體內(nèi)那些核苷酸基因座的典型核苷酸。在一個具體實施方式
中，存在一個或多個甲基化核苷酸可以鑒定為正常或與這種生物體內(nèi)那些核苷酸基因座的典型核苷酸相同。在另一個具體實施方式
中，存在一個或多個未甲基化核苷酸可以鑒定為異常或不同于這種生物體內(nèi)在那些核苷酸基因座的典型核苷酸。在一個具體實施方式
中，存在一個或多個未甲基化核苷酸可以鑒定為正?；蚺c這種生物體內(nèi)在那些核苷酸基因座的典型核苷酸相同。
a.疾病相關(guān)的發(fā)現(xiàn) 在一個具體實施方式
中，存在或缺乏一個或多個甲基化或未甲基化核苷酸可以鑒定為表示與甲基化或未甲基化DNA相關(guān)的疾病狀態(tài)，例如腫瘤性疾病。在另一個具體實施方式
中，存在或缺乏一個或多個甲基化或未甲基化核苷酸可以鑒定為表示正常、健康或無疾病狀態(tài)。在另一個具體實施方式
中，樣品中甲基化靶核酸分子相對于未甲基化靶核酸分子的異常率，可以表示與甲基化或未甲基化DNA相關(guān)的疾病狀態(tài)，例如腫瘤性疾病。例如，與正常個體中的相對量比較，相對多量或相對少量的甲基化靶核酸分子可以表示與甲基化或未甲基化DNA相關(guān)的疾病狀態(tài)，例如腫瘤性疾病。在另一個具體實施方式
中，在靶核酸分子中一個核苷酸基因座的甲基化核苷酸相對于在該基因座的未甲基化核苷酸的異常率，可以表示與甲基化或未甲基化DNA相關(guān)的疾病狀態(tài)，例如腫瘤性疾病。例如，與正常個體中的相對量比較，相對多量或相對少量的甲基化核苷酸基因座可以表示與甲基化或未甲基化DNA相關(guān)的疾病狀態(tài)，例如腫瘤性疾病。
與一個或多個核苷酸的甲基化修飾相關(guān)的疾病包括，例如白血病(Aoki E et al.″Methylation status of the p15INK4B gene in hematopoieticprogenitors and peripheral blood cells in myelodysplastic syndromes″Leukemia 14(4)586-593(2000)；Nosaka，K.et al.″Increasing methylation of the CDKN2A gene is associated with the progression ofadult T-cell leukemia″Cancer Res 60(4)1043-1048(2000)；Asimakopoulos FA et al.″ABL1methylation is a distinct molecular event associated with clonal evolution of chronic myeloid leukemia″Blood 94(7)2452-2460(1999)；Fajkusova L.et al.″Detailed Mapping of Methylcytosine Positions atthe CpG lsland Surrounding the Pa Promoter at the bcr-abl Locus in CML Patients and in Two CellLines，K562 and BV173″Blood Cells Mol Dis 26(3)193-204(2000)；Litz C E et al.″Methylation statusof the major breakpoint cluster region in Philadelphia chromosome negative leukemias″Leukemia6(1)35-41(1992))、頭頸癌(Sanchez-Cespedes M.et al.″Gene promoter hypermethylationin tumors and serum of head and neck cancer patients″Cancer Res 60(4)892-895(2000))，Hodgkin′sdisease(Garcia J.F.et al.″Loss of p16 protein expression associated with methylation of the p16INK4Agene is a frequcnt finding in Hodgkin′s disease″Lab Invest 79(12)1453-1459(1999))、胃癌(Yanagisawa Y.et al.″Methylation of the hMLH1 promoter in familial gastric cancer withmicrosatellite instability″ Int J Cancer 85(1)50-53(2000))、前列腺癌(Rennie P.S.et al.″Epigenetic mechanisms for progression of prostate cancer″Cancer Metastasis Rev 17(4)401-409(1998-99)、腎癌(Clifford，S.C.et al.″Inactivation of the von Hippel-Lindau(VHL)tumorsuppressor gene and allelic losses at chromosome arm 3p in primary renal cell carcinomaevidence for aVHL-independent pathway in clear cell renal tumourigenesis″Genes Chromosomes Cancer 22(3)200-209(1998))，膀胱癌(Sardi，I.et al.″Molecular genetic alterations of c-myc oncogene insuperficial and locally advanced bladder cancer″Eur Urol 33(4)424-430(1998))、乳腺癌(Mancini，D.N.et al.″CpG methylation within the 5′regulatory region of the BRCA1 gene is tumorspecific and includes a putative CREB binding site″Oncogene 16(9)1161-1169(1998)；Zrihan-Licht S.et al.″DNA methyIation status ofthe MUC1 gene coding for a breast-cancer-associated protein″IntJ.Cancer 62(3)245-251(1995)；Kass，D.H.et al.″Examination of DNA methylation of chromosomalhot spots associated with breast cancer″Anticancer Res 13(5A)1245-1251(1993))Burlitt’s 淋巴瘤(Tao，Q.et al.″Epstein-Barr virus(EBV)in endemic Burkitt′s lymphomamolecular analysis of primarytumor tissue″Blood 91(4)1373-1381(1998))、Wilms瘤(Kleymenova，E.V.et al.″Identification ofa tumor-specific methylation site in the Wilms tumor suppressor gene″Oncogene 16(6)713-720(1998))，Prader-Willi/Angelman綜合征(Zeschnigh et al.″Imprinted segments in the human genomedifferentDNA methylation patterns in the Prader-Willi/Angelman syndrome region as determined by the genomicsequencing method″Human Mol.Genetics(6)3387-395(1997)；Fang P et al.″The spectrum ofmutations in UBE3A causing Angelman syndrome″Hum Mol Genet 8(1)129-135(1999))，ICF綜合征(Tuck-Muller et al.″CMDNA hypomethylation and unusual chromosome instability in celllines from ICF syndrome patients″Cytogenet Cell Genet 89(1-2)121-128(2000))，皮膚纖維瘤(Chen，T.C.et al.″Dermatofibroma is a clonal proliferative disease″J Cutan Pathol 27(1)36-39(2000))，高血壓(Lee，S.D.et al.″Monoclonal endothelial cell proliferation is present in primarybut not secondary pulmonary hypertension″J Clin Invest 101(5)927-934(1998))，小兒神經(jīng)性疾病(Campos-Castello，J.et al.″The phenomenon of genomic″imprinting″and its implications inclinical neuropediatrics″Rev Neurol 28(1)69-73(1999))，孤獨癥(Klauck，S.M.et al.″Moleculargenetic analysis of the FMR-1 gene in a large collection of autistic patients″Hum Genet 100(2)224-229(1997))，潰瘍性結(jié)腸炎(Gloria，L.et al.″DNA hypomethylation and proliferative activity areincreased in the rectal mucosa of patients with long-standing ulcerative colitis″Cancer 78(11)2300-2306(1996))，脆弱X綜合征(Hornstra，I.K.et al.″High resolution methylation analysis of theFMR1 gene trinucleotide repeat region in fragile X syndrome″Hum Mol Genet 2(10)1659-1665(1993))，以及Huntington’s 病(FerIuga，J.et al.″Possible organ and age-related epigenetic factors inHuntington′s disease and colorectal carcinoma″Med Hypotheses 29(1)51-54(1998)).與DNA的表遺傳學狀態(tài)相關(guān)的其他疾病包括低級星型細胞瘤、間變性星型細胞瘤、膠質(zhì)母細胞瘤、髓母細胞瘤、結(jié)腸癌、肺癌、胰腺癌、子宮內(nèi)膜癌、神經(jīng)母細胞瘤、頭痛、性交不適、原發(fā)性粘液水腫、惡性貧血、Addison’s病、重癥肌無力、青少年性糖尿病、血小板減少性紫癜、多發(fā)性硬化、風濕性關(guān)節(jié)炎、硬化??；以及其他疾病例如CNS功能不良、損傷或疾病；攻擊或行為障礙的癥狀；腦損傷的臨床、心理和社會后果；精神障礙和人格疾病；功能不良；胃腸道的損傷和疾病；呼吸系統(tǒng)功能不良、損傷或疾??；病變、炎癥、感染、免疫性和/或相關(guān)的恢復；機體功能不良、損傷或疾病，作為發(fā)育過程中的異常；皮膚、肌肉、結(jié)締組織或骨骼的功能不良、損傷或疾??；內(nèi)分泌和代謝功能不良、損傷或疾病；且還可以與非預(yù)期藥物相互作用相聯(lián)系。
b.多重分析 用于高通量鑒定來自多個靶核酸分子的核酸甲基化狀態(tài)的方法，也是本文所預(yù)期的。多重指的是同時鑒定一個以上靶核酸分子的甲基化狀態(tài)。用于實施多重反應(yīng)的方法，尤其是與質(zhì)譜分析聯(lián)用是已知的(參見，例如美國專利6,043,031號以及國際PCT申請WO 97/37041號)。
多重提供的優(yōu)點即與必須對每個單個靶核酸分子必須實施獨立的質(zhì)譜分析相比，多個靶核酸分子可以在幾個甚至單一質(zhì)譜中分析其甲基化信息。本文提供的方法可以應(yīng)用于高通量、高度自動化過程，用于高速準確地闡述核酸甲基化。
多重可以用來鑒定兩個或多個核酸分子的甲基化狀態(tài)，或鑒定兩個或多個核酸分子中一個或多個核苷酸基因座的甲基化狀態(tài)。在一個具體實施方式
中，本文披露的方法可以用來鑒定靶核酸分子的甲基化狀態(tài)，而所述靶核酸分子來自于多種不同的樣品包括不同的細胞類型、不同的組織類型、不同生物體、不同菌株、不同種屬、或者新細胞、新組織、新生物體、新菌株或新種屬。這種來自一個以上來源的多重樣品還可以稱為集合。鑒定來自不同樣品的靶核酸分子的甲基化狀態(tài)可以用于，例如確定細胞的腫瘤性或轉(zhuǎn)移性狀態(tài)、診斷受試者包括例如患有遺傳、感染、自身免疫或腫瘤性疾病的患者；區(qū)分細胞類型、組織類型、菌株類型或生物體類型；確定兩種或多種基因之間表達的相關(guān)性以及基因表達與細胞形態(tài)學(例如細胞的有絲分裂或減數(shù)分裂狀態(tài))之間的相關(guān)性。
來自于兩種或多種來源的生物樣片的混合物可以合并成一個單一的混合物用于本文的分析。例如，本文提供的方法可以用于鑒定不同來源的多拷貝靶核酸分子的甲基化狀態(tài)，并因此鑒定生物樣品的核酸混合物中靶核酸分子甲基化狀態(tài)的變異。生物樣品的混合物還可以包括但不限于來自個體集合的核酸、來自一個或多個個體的核酸的不同區(qū)域、起源于單一組織或細胞類型的均質(zhì)腫瘤樣品、或含有一種以上組織或細胞類型的異質(zhì)腫瘤樣品、或起源于原發(fā)瘤的細胞系。還有一些預(yù)期的方法例如單倍體型方法，其中可以檢測同一區(qū)域內(nèi)每個單倍體的甲基化狀態(tài)。
在另一個具體實施方式
中，根據(jù)本文提供的方法可以實施的多重方法包括鑒定來自單一受試者的兩種或多種靶核酸分子的甲基化狀態(tài)。例如，受試者兩個或多個標記物的甲基化狀態(tài)可以表示受試者的疾病狀態(tài)(例如腫瘤狀態(tài))或者可表示受試者的疾病或腫瘤傾向。兩個或多個標記物的甲基化狀態(tài)還可以用來表示患病細胞的起源。例如，某些基因(例如p15、E-鈣粘蛋白和降鈣素)附近的CpG島內(nèi)的甲基化可以表示急性骨髓白血病而非前列腺癌，而谷光甘肽-S轉(zhuǎn)移酶蛋白-1基因附近的CpG島內(nèi)的甲基化可以表示前列腺癌而非急性骨髓白血病。因此，鑒定個體內(nèi)兩個或多個靶核酸甲基化狀態(tài)的多重方法，可以用來確定個體內(nèi)的疾病狀態(tài)或其傾向，還可以用來確定個體內(nèi)可能存在或可能發(fā)生的疾病類型。這種多重方法可以包括一組靶核酸標記物，其中一個或多個靶核酸標記物內(nèi)存在或缺乏甲基化可以表示受試者的疾病狀態(tài)(例如腫瘤狀態(tài))，或可以表示受試者的疾病或腫瘤傾向，或可用來表示患病細胞的起源。
c.靶核酸分子片段作為標記物 在其他具體實施方式
中，反映靶核酸分子甲基化狀態(tài)的靶核酸分子片段可以用作大靶核酸分子序列或部分的標記物或指示劑。這種具體實施方式
不需要確定靶核酸分子的序列，但可以包括確定靶核酸分子的序列或部分，或簡單確定靶核酸分子片段的質(zhì)量峰值模式。這種方法可以包括，例如基因定位、指紋法和指紋法相關(guān)方法以及其他方法包括利用靶核酸分子片段作為靶核酸分子甲基化狀態(tài)的指示劑。例如，含有甲基化胞嘧啶的特定序列可以在生物體全基因組中僅發(fā)生幾次，故在基因組圖譜或DNA指紋中，含有甲基化胞嘧啶的特定序列可以用作為唯一標識符。指紋法利用擴增步驟例如擴增的核糖體DNA限制性分析(ARDRA)、隨機擴增的多態(tài)性DNA分析(RAPD)、限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)以及擴增的片段長度多態(tài)性(AFLP)，可以與本文披露的甲基化檢測方法聯(lián)合應(yīng)用。
在一個具體實施方式
中，可以用修飾靶核酸分子序列作為靶核酸分子甲基化狀態(tài)的函數(shù)的試劑來處理靶核酸分子，可以形成靶核酸分子的片段，并確定片段的質(zhì)量，以生成質(zhì)量峰值的模式，其特征在于一個、兩個、三個或多個特征例如質(zhì)量、峰面積以及質(zhì)量峰值的信噪比。這種質(zhì)量峰值的模式可以用作靶核酸分子甲基化狀態(tài)的指示劑。
在一個具體實施方式
中，靶核酸分子片段可以來自于非相鄰的核苷酸序列。擴增和切割方法可以用來形成來自染色體或基因組廣大區(qū)域的靶核酸分子片段。這些片段中的一部分可以進一步擴增并用作甲基化指紋法標記物。作為進一步擴增的可替換方法，一部分選定的片段通過結(jié)合或雜交的方法例如將選定的片段雜交到捕獲寡核苷酸探針上可以與所述片段的剩余部分分開。這種具體實施方式
可以使用下列物質(zhì)作為靶核酸分子來自一個或多個不同生物體例如一個種群或菌株群的基因、染色體片段、YAC、BAC、全染色體、全基因組，多個基因、染色體片段、YAC、BAC、全染色體、全基因組。用于擴增部分核酸片段的方法在本領(lǐng)域是已知的，例如美國專利6,045,994號披露的AFLP。
3.甲基化分析 確定特定靶核酸分子中存在或缺乏甲基化，可以用來提供關(guān)于生物樣品的大量信息。例如，特定核酸區(qū)域的甲基化分析可以提供關(guān)于受試者疾病的信息，可以鑒定生物體或病原體，可以推算核酸區(qū)域或核苷酸基因座的甲基化頻率，并且可以鑒定甲基化相關(guān)的等位基因。
a.疾病相關(guān)分析 甲基化水平升高或降低已經(jīng)與多種疾病相相關(guān)性。在確定位點的甲基化或缺乏甲基化可以與疾病狀態(tài)或無疾病狀態(tài)相相關(guān)性。本文披露的方法可以用于確定受試者的疾病傾向、診斷疾病以及確定患病受試者的治療方案的方法中。
多個核苷酸基因座和/或核酸區(qū)域的甲基化狀態(tài)已知可與疾病、疾病結(jié)果以及成功治療疾病相相關(guān)性，而且還可以用來區(qū)分根據(jù)癥狀、組織樣品或者血液或血清樣品難于區(qū)分的疾病類型。例如，CpG島甲基化指示劑表現(xiàn)型(CIMP)存在于卵巢癌的某些類型，而不存在于其他類型中(Strathdee，et al.Am.J.Pathol.1581121-1127(2001))。在另一個實施例中，甲基化可以用來區(qū)分類癌瘤和胰腺內(nèi)分泌腫瘤，二者具有不同的預(yù)期結(jié)果以及疾病治療方案(Chan et al.Oncogene22924-934(2003))。在另一個實施例中，H.pylori依賴的胃粘膜相關(guān)淋巴組織(MALT)淋巴瘤其特征在于含有幾個甲基化核酸區(qū)域，而在非H.pylori依賴的MALT淋巴瘤中那些核酸區(qū)域不是甲基化的(Kaneko et al.Gut 52641-646(2003))。在另一個實施例中，存在于結(jié)直腸癌的CIMP通常不包含異常的p53表達，而且可用5-氟尿嘧啶有效治療，而這種治療對于CIMP-結(jié)直腸癌不是同等有效(Van Rijnsoever et al.Clin.Cancer Res.92898-2903(2003))。類似的與疾病、疾病結(jié)果和疾病治療的關(guān)系已經(jīng)與低甲基化或未甲基化核酸區(qū)域或者未甲基化核苷酸基因座相相關(guān)性。
與受試者疾病狀態(tài)相關(guān)的方法可以如下實施從受試者收集樣品，用修飾靶核酸分子序列的作為靶核酸分子甲基化狀態(tài)的函數(shù)的試劑處理樣品，將所述樣品進行甲基化特異性擴增，然后檢測一個或多個與疾病或無疾病狀態(tài)相關(guān)的片段。在一個具體實施方式
中，利用本領(lǐng)域已知的或本文披露的方法，斷裂擴增的靶核酸分子。在另一個具體實施方式
中，通過測定靶核酸分子或靶核酸分子片段的質(zhì)量來檢測所述片段。靶核酸分子或靶核酸分子片段還可以利用本領(lǐng)域已知的或本文披露的基于雜交的檢測方法進行檢測。靶核酸分子或靶核酸分子片段的檢測可以鑒定靶核酸分子的甲基化狀態(tài)或靶核酸分子一個或多個核苷酸基因座的甲基化狀態(tài)。靶核酸分子的甲基化狀態(tài)或靶核酸分子一個或多個核苷酸基因座的甲基化狀態(tài)的鑒定，可以表示受試者對一種或多種疾病的傾向、受試者的疾病狀態(tài)、或者對于受試者來說為適當或不適當?shù)募膊≈委熯^程。
來自受試者的樣品可以為任何形式，包括固態(tài)物質(zhì)例如組織、細胞、細胞團、細胞提取物或活檢，或者生物流體例如尿液、血液、組織間液、腹膜液、血漿、淋巴液、腹水、汗液、唾液、濾泡液、乳汁、非乳汁乳腺分泌物、血清、腦脊液、糞便、精液、肺部痰液、羊膜液、感染或炎癥區(qū)的滲出物、含有頰細胞的漱口液、滑膜液或者由受試者產(chǎn)生的任何其他液態(tài)樣品。另外，所述樣品可以為從組織收集的樣品，包括但不限于骨髓、上皮、胃、前列腺、腎、膀胱、乳腺、結(jié)腸、肺、胰腺、子宮內(nèi)膜、神經(jīng)元和肌肉。樣品可以包括器官以及病理樣品例如福爾馬林固定石蠟包埋的樣品。如需要，固態(tài)物質(zhì)可以與液體混合或純化或擴增或以其他方式處理。采用本文描述的方法進行分析的樣品可以在一個或多個純化步驟中處理，以提高樣品中所需細胞或核酸的純度，樣品也可以無需任何提高所需細胞或核酸純度的純化步驟，而采用本文描述的方法進行分析。
在一個具體實施方式
中，檢測甲基化靶核酸分子或靶核酸分子中一個或多個甲基化核苷酸基因座可以表示對與一種或多種甲基化DNA相關(guān)的疾病的傾向增強。在另一個具體實施方式
中，檢測甲基化靶核酸分子或靶核酸分子中一個或多個甲基化核苷酸基因座可以表示對與一種或多種甲基化DNA相關(guān)的疾病的傾向減弱。在另一個具體實施方式
中，檢測未甲基化靶核酸分子或靶核酸分子中一個或多個未甲基化核苷酸基因座可以表示對與一種或多種甲基化DNA相關(guān)的疾病的傾向減弱。在另一個具體實施方式
中，檢測未甲基化靶核酸分子或靶核酸分子中一個或多個未甲基化核苷酸基因座可以表示對與一種或多種甲基化DNA相關(guān)的疾病的傾向增強。
檢測甲基化靶核酸分子或靶核酸分子中一個或多個甲基化核苷酸基因座可以表示受試者中存在甲基化狀態(tài)相關(guān)的疾病。在另一個具體實施方式
中，檢測甲基化靶核酸分子或靶核酸分子中一個或多個甲基化核苷酸基因座可以表示受試者中缺乏甲基化狀態(tài)相關(guān)的疾病。在另一個具體實施方式
中，檢測未甲基化靶核酸分子或靶核酸分子中一個或多個未甲基化核苷酸基因座可以表示受試者中缺乏甲基化狀態(tài)相關(guān)的疾病。在另一個具體實施方式
中，檢測未甲基化靶核酸分子或靶核酸分子中一個或多個未甲基化核苷酸基因座可以表示受試者中存在甲基化狀態(tài)相關(guān)的疾病。
檢測甲基化靶核酸分子或靶核酸分子中一個或多個甲基化核苷酸基因座可以表示疾病治療方案的效果增強。在另一個具體實施方式
中，檢測甲基化靶核酸分子或靶核酸分子中一個或多個甲基化核苷酸基因座可以表示疾病治療方案的效果減弱。在另一個具體實施方式
中，檢測未甲基化靶核酸分子或靶核酸分子中一個或多個未甲基化核苷酸基因座可以表示疾病治療方案的效果增強。在另外一個具體實施方式
中，檢測未甲基化靶核酸分子或靶核酸分子中一個或多個未甲基化核苷酸基因座可以表示疾病治療方案的效果減弱。治療方案可以包括給予藥物化合物或組合物包括化學治療化合物或組合物、外科手術(shù)或其他醫(yī)學手術(shù)、物理治療、職業(yè)治療、飲食改良以及行為矯正。
b.生物體鑒定 本文提供的方法可以用來鑒定生物體或區(qū)別一個生物體與其它生物體不同。在一個具體實施方式
中，可以鑒定人類樣品。甲基化區(qū)域可以作為有用的標記物，用于人類鑒定、父子關(guān)系和母子關(guān)系檢測、基因定位、遷移和遺傳糾紛、孿生子配型檢測、人類生育檢測、培養(yǎng)的人類細胞的質(zhì)量控制、鑒定人類遺骨、以及法醫(yī)中檢測精液樣品、血斑和其他物質(zhì)。這種甲基化區(qū)域還可以作為有用的標記物，用于商業(yè)化的動物育種和系譜分析以及商業(yè)化的植物育種。農(nóng)作物和動物的經(jīng)濟重要性特征可以通過鑒定甲基化區(qū)域來鑒定。靶核酸分子(如基因組DNA)可以獲自一個長的靶核酸分子區(qū)域和/或多個短的靶核酸分子區(qū)域。在其他具體實施方式
中，方法可以用于鑒定非人類生物體例如非人類動物、鳥類、植物、真菌和細菌。
c.病原體鑒定和分型 利用本文提供的甲基化鑒定方法來鑒定微生物菌株的過程或方法也是本文所預(yù)期的。微生物選自多種生物體包括但不限于細菌、真菌、原生生物、纖毛蟲以及病毒。微生物不限于具體屬、種、菌株或血清型。微生物可以通過確定甲基化狀態(tài)和/或靶微生物核酸相對于一個或多個參考核酸的甲基化狀態(tài)變異來鑒定。參考核酸可以獲自例如來自相同屬或不同屬、種株或血清型的其他微生物，或者獲自宿主原核或真核生物。
細菌病原體的鑒定和分型在感染性疾病的臨床處理中很關(guān)鍵。微生物的精確鑒定不僅用來區(qū)分疾病狀態(tài)和健康狀態(tài)，還用來確定是否以及哪種抗生素或其他抗微生物治療是適于治療的。病原體分型的傳統(tǒng)方法已經(jīng)利用了多種表型特征包括生長特征、顏色、細胞或克隆形態(tài)、抗生素敏感性、染色、氣味以及與特異性抗體的反應(yīng)性來鑒定細菌。所有這些方法需要培養(yǎng)病原體，而因此具有多種嚴重不足包括高額材料和人力消耗、操作者暴露危險、由于錯配導致的假陽性以及由于存貨細胞數(shù)量少或由于多種病原體的苛刻培養(yǎng)條件而導致的假陰性。另外，培養(yǎng)方法需要相對長時間以實現(xiàn)診斷，而且因為這種感染可能危害生命的性質(zhì)，抗生物治療通常在可以獲得結(jié)果之前才啟動。
在許多情況下，病原體與構(gòu)成正常菌叢的生物體類似，而且可能利用本文引用的所述表型方法不能區(qū)分無毒株。在這些情況下，確定致病菌株的存在可能需要由本文提供的甲基化檢測方法提供較高的分辨率。例如，基于甲基化狀態(tài)的靶核酸分子序列修飾，隨后是斷裂以及利用MALDI/TOF質(zhì)譜分析法檢測片段，然后篩查甲基化狀態(tài)變異，能夠可靠的區(qū)分僅有一個甲基化核苷酸不同的靶核酸分子，并且可將甲基化特異性擴增的區(qū)分能力與通過MALDI-TOF MS提供的速度和信息相結(jié)合。類似的，通過比較一個或多個質(zhì)量峰值或質(zhì)量峰值模式而鑒定靶核酸分子中核苷酸甲基化狀態(tài)的方法，可以用來檢測這種序列變異。
d.單體型分析 本文提供的方法可以用來檢測單體型。在任何二倍體細胞中，在含有一個或多個有區(qū)別的甲基化變異的任何基因或其他染色體區(qū)段可以存在兩種單體型。確定單體型對于理解多種表型的遺傳基礎(chǔ)非常有價值，包括疾病誘因或易感性、對治療性干預(yù)的反應(yīng)以及其他醫(yī)學、畜牧業(yè)和農(nóng)業(yè)感興趣的表型。
單體型分析程序允許選擇來自一個個體兩條同源染色體中一條的DNA部分以及鑒定該DNA部分上可能的甲基化位點。通過分別鑒定靶核酸分子的甲基化狀態(tài)或?qū)?yīng)于DNA兩個單體拷貝中每一個的靶核酸分子的核苷酸基因座的甲基化狀態(tài)，可以實施單體型分析的程序。還可以通過收集DNA兩個單體拷貝，同時鑒定靶核酸分子的甲基化狀態(tài)或?qū)?yīng)于DNA兩個單體拷貝的靶核酸分子的核苷酸基因座的甲基化狀態(tài)，來實施單體型分析。典型的，同時鑒定的方法產(chǎn)生的結(jié)果表示兩個單體型拷貝均為未甲基化的、兩個單體型拷貝均為甲基化的、或者一個單體型拷貝是未甲基化的而另一個單體型拷貝是甲基化的。這些結(jié)果可以通過例如鑒定與甲基化的靶核酸分子相關(guān)的質(zhì)量峰值和/或鑒定與未甲基化的靶核酸分子相關(guān)的質(zhì)量峰值而確定。僅存在與甲基化的靶核酸分子相關(guān)的質(zhì)量峰值，可以表示兩個單體型拷貝均為甲基化的。僅存在與未甲基化的靶核酸分子相關(guān)的質(zhì)量峰值，可以表示兩個單體型拷貝均為未甲基化的。既存在與甲基化的靶核酸分子相關(guān)的質(zhì)量峰值又存在與未甲基化的靶核酸分子相關(guān)的質(zhì)量峰值，可以表示一個單體型拷貝是甲基化的而另一個單體型拷貝是未甲基化的。當既存在與甲基化的靶核酸分子相關(guān)的質(zhì)量峰值又存在與未甲基化的靶核酸分子相關(guān)的質(zhì)量峰值時，產(chǎn)生峰值的核酸片段的相對量可以利用本文提供的方法確定；典型的，當一個單體型是甲基化的而另一個單體型不是甲基化的時，則單體型分析將提供約50/50的比。
單體型的直接分辨率可以產(chǎn)生的信息含量增加，從而改善任何相關(guān)疾病的診斷或鑒定與那些疾病相關(guān)的相關(guān)性。
e.確定甲基化頻率 本文描述的方法對于鑒定一個或多個核酸區(qū)域或核苷酸非常有用，其甲基化狀態(tài)與通過年齡、種族、性別、其他疾病、對環(huán)境條件的相似暴露、相似攝入(例如食物、酒精、煙草)或其他標準分組的人群相關(guān)。本文披露的用于比較來自樣品的靶核酸分子甲基化相對量的方法可以用來確定一個人群中核酸區(qū)域或核苷酸為甲基化的可能性。例如，樣品可以含有來自一個人群兩個或多個成員的DNA，而本文披露的甲基化狀態(tài)鑒定方法可以用來確定甲基化的核酸區(qū)域或核苷酸的量相對于未甲基化的核酸區(qū)域或核苷酸的量。已知在某些水平與疾病相關(guān)的核酸區(qū)域或核苷酸甲基化狀態(tài)也可以用來確定人群中的成員被甲基化相關(guān)疾病影響的易感性。確定人群中甲基化狀態(tài)的變化也可以鑒定之前未知的甲基化位置并最終鑒定疾病發(fā)生和進展涉及的基因或通路。
f.鑒定等位基因 本文提供的甲基化狀態(tài)鑒定方法可以用來鑒定或提供一個或多個其它等位基因存在的可能性。例如，鑒定具體基因座的甲基化狀態(tài)可以用來鑒定或提供一個SNP在同一基因座、遠端基因座或近端基因座發(fā)生的可能性。已知等位基因是連鎖的，且以高于等位基因隨機遺傳預(yù)期的的比率而遺傳。等位基因比隨機遺傳預(yù)期的更經(jīng)常同時發(fā)生，稱為連鎖不平衡。
如本領(lǐng)域已知的，核酸區(qū)域(例如CpG島)或核苷酸基因座的甲基化狀態(tài)可以與多個不同的等位基因連鎖。已知與甲基化連鎖的等位基因類型包括SNP、微衛(wèi)星(如，微衛(wèi)星不穩(wěn)定性)、缺失、純合性缺失、印記或者印記缺失以及其他甲基化或未甲基化的區(qū)域。本文所使用的等位基因指的是核苷酸基因座或感興趣的核苷酸基因座，包括常見或“野生型”基因座，也包括變異的基因座(變異的等位基因)。例如，p14甲基化與微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的存在以及結(jié)腸癌中p53突變的缺乏相關(guān)(Shen et al.Gastroenterology 124626-633(2003))。在另一個實施例中，hMLH1基因啟動子的超甲基化與微衛(wèi)星不穩(wěn)定性相關(guān)(Kim et al.J.Pathol.20023-31(2003))。在另一個實施例中，BRAF基因的突變與hMLH1基因啟動子甲基化相關(guān)(Deng et al.Clin.Cancer Res.10191-195(2004))。在另一個實施例中，幾個基因的超甲基化與微衛(wèi)星不穩(wěn)定性、GA轉(zhuǎn)換以及DNA中雙鏈斷裂相關(guān)(Esteller，Eur.J.Cancer 362294-2300(2000))。在另一個實施例中，超甲基化與純合性缺失的增加相關(guān)(Eden et al.Science 300455(2003))。在另一個實施例中，母源等位基因特異性KvDMR1的缺失與DMR0的T382GSNP相關(guān)(Murrell et al.Hum.Mol.Genet.13247-255(2004)。在另一個實施例中，SNP的存在于甲基化基因座的存在相關(guān)(Ober et al.Am.J.Hum.Genet.721425-1435(2003))。
通過鑒定一個或多個核酸區(qū)域(例如，一個或多個CpG島)甲基化狀態(tài)而鑒定或確定等位基因存在或缺乏的可能性增加的方法，包括在本文提供的方法中。連鎖不平衡可以表示第一遺傳或表遺傳特征(例如甲基化)與第二遺傳或表遺傳特征(例如DNP等位基因)同時觀察到的頻率。因此，根據(jù)連鎖不平衡的程度，鑒定一個或多個核酸區(qū)域或者一個或多個核苷酸基因座的甲基化狀態(tài)可以用來鑒定等位基因存在或缺乏的可能性。本文提供的方法還可以用來鑒定在一個或多個甲基化或未甲基化核酸區(qū)域或一個或多個核苷酸基因座的甲基化狀態(tài)與特定等位基因之間的連鎖不平衡程度。這種方法可以包括選擇特定等位基因、收集含有等位基因的兩種或多種核酸樣品以及確定等位基因與一個或多個甲基化或未甲基化核酸區(qū)域或一個或多個核苷酸基因座的甲基化狀態(tài)同時觀察到的頻率。用于確定連鎖的等位基因存在的方法在本領(lǐng)域是已知的，如在US20030190644中所例證的，而且可以與本文提供的甲基化狀態(tài)鑒定方法聯(lián)合使用。
4.組合物和試劑盒 在另一個具體實施方式
中，存在提供的診斷系統(tǒng)，典型的為組合物或試劑盒的形式，其合適的包裝材料中含有至少一種引物和一種試劑，用于實施本文描述的一種或多種斷裂方法。例如，在一個具體實施方式
中，診斷系統(tǒng)、組合物或試劑盒，含有一種或多種甲基化特異性引物，以及用于實施一種或多種堿基特異性切割反應(yīng)的試劑例如甲基化特異性引物以及一種或多種RNase、DNase或者本文提供的方法中描述的其他化學試劑。診斷系統(tǒng)、組合物或試劑盒對于鑒定靶核酸分子的甲基化狀態(tài)或靶核酸分子核苷酸基因座的甲基化狀態(tài)非常有用。
診斷系統(tǒng)、組合物或試劑盒可以包括至少一種引物，典型的包括至少一種甲基化特異性引物的兩種或多種引物；以及蛋白例如用于實施擴增、轉(zhuǎn)錄和/或斷裂步驟的酶；以及獨立包裝的化學試劑，其量足夠用于至少一次分析。診斷系統(tǒng)、組合物或試劑盒還可以包括一種或多種擴增阻滯劑、一種或多種dNTPs、一種或多種rdNTPs、dNTPs和rdNTPs的組合、一種或多種用于在質(zhì)譜測定前調(diào)節(jié)靶核酸分子片段的混合物、一種或多種MALDI基質(zhì)化合物、一種或多種質(zhì)譜分析底物，如在本領(lǐng)域已知的和在本文描述的方法中提供的。
一種示例性的組合物可以包含作為靶核酸分子甲基化狀態(tài)修飾靶核酸分子一個或多個核苷酸的試劑，例如重亞硫酸鹽；一種或多種用于特異性雜交到經(jīng)試劑處理的靶核酸分子上的甲基化特異性引物，例如，一種或多種甲基化特異性PCR引物；以及一種或多種用于斷裂擴增的靶核酸分子的化合物，例如包括RNaseA或RNaseT1的RNases。
本文還提供了組合物，包括本文提供的試劑盒以及一種或多種設(shè)備例如質(zhì)譜儀、熱循環(huán)控制裝置、用于制備樣品的裝置例如組織勻漿器，如本領(lǐng)域已知或本文提供的。試劑盒還可以包括用于實施本文描述的甲基化鑒定方法的合適的緩沖液和溶液。
在試劑盒中應(yīng)用的包裝材料可以為一種或多種用來保存試劑盒內(nèi)含物的物理性結(jié)構(gòu)，而且可以用眾所周知的方法構(gòu)建，典型的，提供無菌、無污染的環(huán)境。包裝材料可以帶有一個標簽表示試劑盒的內(nèi)含物。另外，所述包裝材料含有說明書，表明如何采用試劑盒內(nèi)的物質(zhì)來鑒定靶核酸分子的甲基化狀態(tài)或靶核酸分子核苷酸基因座的甲基化狀態(tài)。典型的，說明書包括切實的表達，描述試劑濃度或至少一種分析方法的參數(shù)例如待混合試劑和樣品的相對量、試劑/樣品混合物保持的時間長度、溫度、緩沖液條件以及其他參數(shù)。所述試劑盒可以包括一種或多種容器，其能夠容納固定極限內(nèi)用于甲基化鑒定方法中的引物、酶或其他反應(yīng)物或者緩沖溶液。試劑盒還可以包括底物、支持物或用于實施甲基化鑒定方法的容器包括小瓶或試管、或者質(zhì)譜分析底物例如Sequenom SpectroCHIP

底物。

具體實施例方式 包括以下實施例是為了說明本發(fā)明，而不是限制本發(fā)明的范圍。
實施例I 以下實施例說明了一種用于鑒定靶核酸分子分子甲基化狀態(tài)的方法。
方法 重亞硫酸鹽處理 根據(jù)Paulin et al.Nucl.Acids Res.265009-5011(1998)中提供的方法來實施重亞硫酸鹽處理。用限制性內(nèi)切核酸酶消化基因組DNA(2μg)，然后通過加入3M氫氧化鈉將其變性并在37℃下孵育15min。將6.24M尿素/2M間位重亞硫酸鈉(4M重亞硫酸鹽)溶液以及10mM對苯二酚鈉溶液加入到變性的DNA中以達到最終濃度為5.36M尿素、3.44M重亞硫酸鹽、0.5mM對苯二酚。將DNA溶液置于0.5ml管中并用礦物油覆蓋，在PCR機器中進行20個循環(huán)，所述管反復加熱到95℃達30秒并在55℃下孵育15min。除了采用BresacleanDNA純化步驟(Geneworks，Adelaide，Australia)來使所述DNA脫鹽外，重亞硫酸鹽處理的DNA 進一步處理，如在Clark et al.Nucl.Acids Res.222990-2997(1994)描述的。
PCR和體外轉(zhuǎn)錄 感興趣的靶核酸分子MGMT從經(jīng)重亞硫酸鹽處理的人基因組DNA中擴增，采用的引物合并了T7啟動子序列[5′-CAG TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA GA]。PCR產(chǎn)物可選的克隆進pGEM-T載體系統(tǒng)(Promega)中，并從克隆的DNA再次擴增。
對于特異性未甲基化DNA的擴增，我們采用了下列基因特異性引物序列 MGMT_U_T7_REVcagtaatacgactcactatagggagaaggctttttcctatcacaaaaataatccac MGMT_U_10MER_FORaggaagagaggggatttttattaagtgggtgttg. 對于甲基特異性擴增，我們采用了下列引物序列 MGMT_M_T7_REVcagtaatacgactcactatagggagaaggctcttttcctatcacaaaaataatccg MGMT_M_10MER_FORaggaagagaggatttttattaagcgggcgtc. 所述PCR反應(yīng)在5μl的總體積中進行，采用1pmol每種引物、40μM dNTP、0.1Uμl Hot Star Taq DNA聚合酶(Qiagen)、1.5mM MgCl2以及隨酶提供的緩沖液。這種反應(yīng)混合物在95℃下預(yù)激活15min，反應(yīng)混合物共擴增45個循環(huán)95℃，20秒；62℃，30秒以及72℃，30秒，循環(huán)完成后，反應(yīng)混合物在72℃下孵育3min。通過加入1.7μl水和0.3μl蝦堿性磷酸酶，使未使用的dNTP脫磷酸，并在37℃下孵育20min。
一份2μl的PCR混合物(25～250ng擴增子)直接用作4μl轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的模板。采用突變的聚合酶(20單位T7R&DNA聚合酶；Epicentre，Madison，WI)將dCTP或dUTP/dTTP整合入轉(zhuǎn)錄物中。核糖核苷酸以1mM使用，而(可選的)dNTP底物以5mM使用。反應(yīng)中的其他組分如由酶的供應(yīng)商建議的。轉(zhuǎn)錄后，加入RNase切割體外轉(zhuǎn)錄物，然后混合物進一步用水稀釋至27μl的最終體積。
所述方案在本領(lǐng)域是已知的，如Stanssens et al.Genome Res.14126-133(2004)中所例證的。
樣品調(diào)節(jié)以及質(zhì)譜測定 通過往所述轉(zhuǎn)錄樣品中加入6mgCLEAN Resin(Sequenom Inc.San Diego，CA)實現(xiàn)磷酸骨架的調(diào)節(jié)。將一份15nl的切割反應(yīng)混合物機械性分配到用基質(zhì)預(yù)負荷(SpectroCHIP；Sequenom Inc.San Diego，CA)的硅膠芯片上。質(zhì)譜利用MassARRAY質(zhì)譜儀(BRUKER-SEQUENOM)來收集。
基因組甲基化輪廓的發(fā)現(xiàn) 檢測擴增子可以為包括25～30個CpG位點的400～500個堿基對的靶核酸分子。這種區(qū)域的上鏈和下鏈可以分別被分析。為了將其分成甲基化和未甲基化模板，可以擴增重亞硫酸鹽處理的基因組DNA，并克隆擴增產(chǎn)物。在正向鏈C特異性切割而在反向鏈G特異性切割的反應(yīng)中，可觀察到質(zhì)量信號模式的差異。單個切割反應(yīng)產(chǎn)生的質(zhì)量信號模式可以區(qū)分甲基化和未甲基化模板DNA。在那些由于甲基化保護使得胞嘧啶不能轉(zhuǎn)化成尿嘧啶的鏈，將在擴增產(chǎn)物中攜帶切割位點。這些切割位點引起轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的斷裂，片段長度由相鄰甲基化CpG位點的距離而決定。未甲基化模板不含有胞嘧啶，因此不攜帶切割位點。所得到的全長轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物不能通過MALDI-TOF檢測。這些反應(yīng)提供對于發(fā)現(xiàn)甲基化以及區(qū)分甲基化和未甲基化樣品非常有用的質(zhì)量模式，因為來源于未甲基化和甲基化DNA的片段差異容易測定。另外，這些模式適合鑒定在選擇性PCR擴增后僅含有5％甲基化DNA的混合物中的甲基化。
甲基化比率分析 另一個堿基特異性切割反應(yīng)適于鑒定甲基化比率。甲基化誘導的正向鏈上的C/T轉(zhuǎn)換用反向鏈上的G/A轉(zhuǎn)換來代表。當一個切割產(chǎn)物上包含多個CpG時，這些轉(zhuǎn)換引起16道爾頓(G/A質(zhì)量位移)的質(zhì)量位移或其倍數(shù)。在甲基化引起信號的質(zhì)量位移的反應(yīng)中，一個信號代表甲基化的模板而另一個信號代表未甲基化模板。這些信號的強度可以進行比較以確定甲基化vs.未甲基化模板的比。而且，測定片段的堿基組成僅有一個或幾個核苷酸不同，保證在MALDI-TOF測定過程中相等的解析和離子化性能。用于估計信號強度的方法例如“峰下面積”和“信噪比”可以產(chǎn)生相似的結(jié)果。根據(jù)靶核酸分子的序列，多個信號對可以用于確定信號強度之間的比。這種信息可以用來獨立評估每個CpG位點的甲基化程度，或者如果全部CpG位點均為大約同等程度的甲基化，可以用來將甲基化含量在完整靶區(qū)域上進行平均。信號強度比值與所采用DNA之間的直接相關(guān)性可以確定模板甲基化范圍為10％～90％。如果甲基化和未甲基化模板之間的比值低于10％或超過90％，代表較低量模板的信號仍然可以檢測，但定量可能發(fā)生更高的誤差。
甲基化模式分析 堿基特異性切割可以確定給定靶核酸分子內(nèi)每個CpG的甲基化狀態(tài)。C-特異性正向反應(yīng)在擴增子內(nèi)每個甲基化CpG產(chǎn)生一個切割位點。因此，理論上，每個甲基化CpG產(chǎn)生一個特異性片段，得到質(zhì)譜內(nèi)至少一個指示性信號。這些信號中的一些可能不是可檢測的，因為其質(zhì)量落在高或低質(zhì)量截斷值之外?，F(xiàn)有的MALDI-TOF設(shè)備可以檢測質(zhì)量在約1000～11000Da之間的切割產(chǎn)物，等同于長度為約3～35個核苷酸的片段。僅一個反應(yīng)的分析可以用于確定靶核酸分子內(nèi)全部CpG位點中75％左右(根據(jù)靶核酸分子的大小、序列以及甲基化程度，可能會較大或較小)的甲基化狀態(tài)。為了獲得關(guān)于全部CpG位點的信息，兩個反應(yīng)已足夠。使用4個反應(yīng)有利于提供冗余信息。例如，當進行4個反應(yīng)時，全部CpG位點中的90％以上可以用一個以上的信號代表。這意味著大多數(shù)或全部甲基化事件可以通過一個以上觀察結(jié)果獨立進行確證。這種冗余度在診斷性應(yīng)用中非常有用。
結(jié)果 以下提供一個方法的實施例，其用來分析來自于PCR反應(yīng)的堿基切割片段，其中計劃PCR反應(yīng)對于甲基化vs.未甲基化模板DNA的擴增是特異性的。所述方法允許消除當利用甲基化特異性引物的PCR反應(yīng)引起未甲基化DNA的擴增時所產(chǎn)生的假陽性結(jié)果。簡單而言，記錄質(zhì)量信號模式并與虛擬推算的斷裂模式進行比較。通過比較獲得的質(zhì)量信號模式與虛擬推算的質(zhì)量信號，甲基化狀態(tài)確定為甲基化或未甲基化模板DNA。



圖1和圖2示出了兩個質(zhì)譜的重疊上面的波譜來源于“U”反應(yīng)，用于特異性擴增未甲基化DNA(其中“U”相當于未甲基化，unmethylated)，下面的波譜來源于“M”反應(yīng)，用于特異性擴增甲基化DNA(其中“M”相當于甲基化，methylated)。在圖1和圖2中，點線分別表示來源于未甲基化模板(圖1)和甲基化模板(圖2)的切割產(chǎn)物的參考質(zhì)量信號。圖1表示來源于未甲基化模板的切割產(chǎn)物在其預(yù)期質(zhì)量中發(fā)現(xiàn)。上面波譜的全部信號在其預(yù)期質(zhì)量中發(fā)現(xiàn)，如通過虛擬模擬推算的，因此表示未甲基化模板DNA的特異性擴增是成功的。相反，圖2示出了來源于對甲基化模板DNA特異的擴增反應(yīng)的切割產(chǎn)物不與預(yù)期質(zhì)量相匹配。在3913道爾頓和2878道爾頓的信號不受甲基化影響而保持匹配，然而，在2525道爾頓和3473道爾頓的信號對應(yīng)于未甲基化參照物中2509道爾頓和3457道爾頓。通過比較圖1和圖2，顯而易見，來自甲基化特異性反應(yīng)的切割產(chǎn)物在對未甲基化模板DNA特異的質(zhì)量處進行檢測。這表明所述甲基化特異性擴增反應(yīng)實際上擴增未甲基化DNA并產(chǎn)生凝膠電泳上的假陽性結(jié)果，其可以通過質(zhì)譜分析進行校正。
* ** 本文參考的每個專利、專利申請、出版物以及文件結(jié)合于此供參考。引用上述專利、專利申請、出版物以及文件既不認可上述任何一個是恰當?shù)那捌诩夹g(shù)，也不形成對這些出版物或文件的內(nèi)容或日期的認可。單獨而言，這些文件和并于此供參考，不應(yīng)該認為是可斷言或承認任何文件內(nèi)容的任何部分對于滿足任何國家或地區(qū)法定專利申請的披露要求而言是必要材料。盡管如此，保留在合適的時候依靠這些文件中的任何一個來提供檢查機構(gòu)或法庭認為對所聲明的主題必要的材料的權(quán)利。
在不偏離本發(fā)明的基本方面時，可對上述內(nèi)容進行修改。盡管本發(fā)明已經(jīng)對一個或多個特異性具體實施方式
以大量的細節(jié)進行描述，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認識到可以對本發(fā)明中明確披露的具體實施方式
進行更改，然而這些修改和改進應(yīng)在本發(fā)明的范圍和精神之內(nèi)。本發(fā)明本文恰當示例性進行描述，可以在缺乏本文非明確披露的要素時而實施。因此，例如在本文的每個情況下，術(shù)語“包括”“主要由、、、構(gòu)成”以及“由、、、構(gòu)成”中的任何一個可以用其他兩個術(shù)語之一代替。因此，所采用的術(shù)語和表達法用作描述而非限制術(shù)語，不排除所示出和描述的特征的同等物或其部分，而且應(yīng)認識到在本發(fā)明的范圍內(nèi)可能進行多種修改。本發(fā)明的具體實施方式
在以下權(quán)利要求中列出。
權(quán)利要求
1.一種鑒定甲基化的核酸分子的方法，包括
(a)用可將未甲基化的胞嘧啶修飾生成尿嘧啶的試劑處理靶核酸分子；
(b)用靶核酸結(jié)合區(qū)含有一個或多個鳥嘌呤核苷酸的引物特異性擴增處理過的靶核酸分子；
(c)堿基特異性地切割擴增產(chǎn)物；以及
(d)檢測切割產(chǎn)物，其中兩個或多個片段的存在表示靶核酸分子含有一個或多個甲基化的胞嘧啶。
2.一種鑒定甲基化的核酸分子的方法，包括
(a)用可將未甲基化的胞嘧啶修飾生成尿嘧啶的試劑處理靶核酸分子；
(b)擴增處理過的靶核酸分子以形成第一擴增產(chǎn)物；
(c)用靶核酸結(jié)合區(qū)含有一個或多個胞嘧啶核苷酸的引物特異性擴增所述第一擴增產(chǎn)物以形成第二擴增產(chǎn)物；
(d)堿基特異性地切割第二擴增產(chǎn)物；以及
(e)檢測切割產(chǎn)物，其中兩個或多個片段的存在表示靶核酸分子含有一個或多個甲基化的胞嘧啶。
3.一種鑒定甲基化的核酸分子的方法，包括
(a)用可將未甲基化的胞嘧啶修飾生成尿嘧啶的試劑處理靶核酸分子；
(b)用靶核酸結(jié)合區(qū)含有一個或多個鳥嘌呤核苷酸的引物特異性擴增處理過的靶核酸分子；
(c)堿基特異性地切割擴增產(chǎn)物；以及
(d)檢測切割產(chǎn)物的質(zhì)量，其中與參考質(zhì)量相比較，
一個或多個切割產(chǎn)物的質(zhì)量變化表示所述靶分子含有一個或多個甲基化的胞嘧啶。
4.一種鑒定甲基化的核酸分子的方法，包括
(a)用可將未甲基化的胞嘧啶修飾生成尿嘧啶的試劑處理靶核酸分子；
(b)擴增處理過的靶核酸分子以形成第一擴增產(chǎn)物；
(c)用靶核酸結(jié)合區(qū)含有一個或多個胞嘧啶核苷酸的引物特異性擴增所述第一擴增產(chǎn)物以形成第二擴增產(chǎn)物；
(d)堿基特異性地切割所述第二擴增產(chǎn)物；以及
(e)檢測切割產(chǎn)物的質(zhì)量，其中與參考質(zhì)量相比較，
一個或多個切割產(chǎn)物的質(zhì)量變化表示所述靶分子含有一個或多個甲基化的胞嘧啶。
5.一種鑒定甲基化的核酸分子的方法，包括
(a)用可將未甲基化的胞嘧啶修飾生成尿嘧啶的試劑處理靶核酸分子；
(b)用靶核酸結(jié)合區(qū)含有一個或多個鳥嘌呤核苷酸的引物特異性擴增處理過的靶核酸分子；
(c)堿基特異性地切割所述擴增產(chǎn)物；以及
(d)檢測所述切割產(chǎn)物的質(zhì)量，其中一個或多個與參考質(zhì)量相同的切割產(chǎn)物的質(zhì)量表示所述靶分子含有一個或多個甲基化的胞嘧啶。
6.一種鑒定甲基化的核酸分子的方法，包括
(a)用可將未甲基化的胞嘧啶修飾生成尿嘧啶的試劑處理靶核酸分子；
(b)擴增處理過的靶核酸分子以形成第一擴增產(chǎn)物；
(c)用靶核酸結(jié)合區(qū)含有一個或多個胞嘧啶核苷酸的引物特異性擴增所述第一擴增產(chǎn)物以形成第二擴增產(chǎn)物；
(d)堿基特異性地切割所述第二擴增產(chǎn)物；以及
(e)檢測切割產(chǎn)物的質(zhì)量，其中一個或多個與參考質(zhì)量相同的切割產(chǎn)物的質(zhì)量表示所述靶分子含有一個或多個甲基化的胞嘧啶。
7.一種用于鑒定核酸中甲基化的核苷酸的核苷酸基因座的方法，包括
(a)用可將未甲基化的胞嘧啶修飾生成尿嘧啶的試劑處理靶核酸分子；
(b)用靶核酸結(jié)合區(qū)含有一個或多個鳥嘌呤核苷酸的引物特異性擴增處理過的靶核酸分子；
(c)堿基特異性地切割擴增產(chǎn)物；以及
(d)檢測切割產(chǎn)物的質(zhì)量，其中與參考質(zhì)量相比較，
一個或多個切割產(chǎn)物的質(zhì)量變化表示靶分子中的核苷酸基因座是甲基化的。
8.一種用于鑒定核酸中甲基化的核苷酸的核苷酸基因座的方法，包括
(a)用可將未甲基化的胞嘧啶修飾生成尿嘧啶的試劑處理靶核酸分子；
(b)擴增處理過的靶核酸分子以形成第一擴增產(chǎn)物；
(c)用靶核酸結(jié)合區(qū)含有一個或多個胞嘧啶核苷酸的引物特異性擴增所述第一擴增產(chǎn)物，形成第二擴增產(chǎn)物；
(d)堿基特異性的切割所述第二擴增產(chǎn)物；以及
(e)檢測切割產(chǎn)物的質(zhì)量，其中與參考質(zhì)量相比較，一個或多個切割產(chǎn)物的質(zhì)量變化表示靶分子中的核苷酸基因座是甲基化的。
9.一種用于鑒定核酸中甲基化的核苷酸的核苷酸基因座的方法，包括
(a)用可將未甲基化的胞嘧啶修飾生成尿嘧啶的試劑處理靶核酸分子；
(b)用靶核酸結(jié)合區(qū)含有一個或多個鳥嘌呤核苷酸的引物特異性擴增處理過的靶核酸分子；
(c)堿基特異性地切割擴增產(chǎn)物；以及
(e)檢測切割產(chǎn)物的質(zhì)量，其中一個或多個與參考質(zhì)量相同的切割產(chǎn)物的質(zhì)量，表示靶分子中的核苷酸基因座是甲基化的。
10.一種用于鑒定核酸中甲基化的核苷酸的核苷酸基因座的方法，包括
(a)用可將未甲基化的胞嘧啶修飾生成尿嘧啶的試劑處理靶核酸分子；
(b)擴增處理過的靶核酸分子以形成第一擴增產(chǎn)物；
(c)用靶核酸結(jié)合區(qū)含有一個或多個胞嘧啶核苷酸的引物特異性擴增所述第一擴增產(chǎn)物以形成第二擴增產(chǎn)物；
(d)堿基特異性地切割所述第二擴增產(chǎn)物；以及
(e)檢測切割產(chǎn)物的質(zhì)量，其中一個或多個與參考質(zhì)量相同的切割產(chǎn)物的質(zhì)量表示靶分子中的核苷酸基因座是甲基化的。
11.一種用于鑒定核酸中甲基化核苷酸的核苷酸基因座的方法，包括
(a)用可將未甲基化的胞嘧啶修飾生成尿嘧啶的試劑處理靶核酸分子；
(b)用靶核酸結(jié)合區(qū)含有一個或多個鳥嘌呤核苷酸的引物特異性擴增處理過的靶核酸分子；
(c)堿基特異性地切割擴增產(chǎn)物；以及
(d)用相同的切割試劑切割或模擬切割參考核酸；
(e)檢測(c)和(d)中生成的切割產(chǎn)物的質(zhì)量；
(f)確定(c)中生成的片段和(d)中生成的片段之間的質(zhì)量信號的差異；以及
(g)從質(zhì)量信號的差異中確定一組減少的序列變異候選物，從而確定與參考核酸相比所述靶分子中的序列變異，其中核苷酸基因座的甲基化通過序列變異的核苷酸基因座來表示。
12.一種用于鑒定核酸中甲基化核苷酸的核苷酸基因座的方法，包括
(a)用可將未甲基化的胞嘧啶修飾生成尿嘧啶的試劑處理靶核酸分子；
(b)擴增處理過的靶核酸分子以形成第一擴增產(chǎn)物；
(c)用靶核酸結(jié)合區(qū)含有一個或多個胞嘧啶核苷酸的引物特異性擴增所述第一擴增產(chǎn)物以形成第二擴增產(chǎn)物；
(d)堿基特異性的切割所述第二擴增產(chǎn)物；
(e)用相同的切割試劑切割或模擬切割參考核酸；
(f)檢測(d)和(e)中生成的切割產(chǎn)物的質(zhì)量；
(g)確定(d)中生成的片段和(e)中生成的片段之間的質(zhì)量信號的差異；以及
(h)從質(zhì)量信號的差異中確定一組減少的序列變異候選物，從而確定與參考核酸相比靶核酸中的序列變異，其中核苷酸基因座的甲基化通過序列變異的核苷酸基因座來表示。
13.一種鑒定甲基化核酸分子的方法，包括
(a)處理靶核酸分子，以確定未甲基化的胞嘧啶核苷酸；
(b)用引物特異性擴增處理過的靶核酸分子，所述引物與含有一個或多個胞嘧啶核苷酸的靶核酸分子中的預(yù)先確定區(qū)特異性雜交；
(c)堿基特異性地切割所述擴增產(chǎn)物；以及
(d)檢測切割產(chǎn)物的質(zhì)量，其中與參考質(zhì)量相比較，一個或多個切割產(chǎn)物的質(zhì)量變化表示所述靶分子含有一個或多個甲基化的胞嘧啶。
14.一種用于鑒定核酸中甲基化核苷酸的核苷酸基因座的方法，包括
(a)處理靶核酸分子，以確定未甲基化的胞嘧啶核苷酸；
(b)用引物特異性擴增處理過的所述靶核酸分子，所述引物與含有一個或多個胞嘧啶核苷酸的靶核酸分子中的預(yù)先確定區(qū)特異性雜交；
(c)堿基特異性的切割所述擴增產(chǎn)物；以及
(d)檢測切割產(chǎn)物的質(zhì)量，其中與參考質(zhì)量相比較，一個或多個切割產(chǎn)物的質(zhì)量變化表示靶分子中的核苷酸基因座是甲基化的。
15.一種用于鑒定甲基化的核酸中核苷酸基因座的甲基化狀態(tài)的方法，包括
(a)處理靶核酸分子，以確定未甲基化的胞嘧啶核苷酸；
(b)用引物特異性擴增處理過的靶核酸分子，所述引物與含有一個或多個胞嘧啶核苷酸的靶核酸分子的預(yù)先確定的第一個區(qū)域特異性雜交；
(c)堿基特異性地切割所述擴增產(chǎn)物；以及
(d)檢測所述切割產(chǎn)物的質(zhì)量，其中與參考質(zhì)量相比較，一個或多個切割產(chǎn)物的質(zhì)量變化表示靶分子中的第二個區(qū)域的核苷酸基因座是甲基化的，其中所述第一個區(qū)域和所述第二個區(qū)域相互不交迭。
16.一種用于鑒定核酸中甲基化核苷酸的核苷酸基因座的方法，包括
(a)處理靶核酸分子，以確定未甲基化的胞嘧啶核苷酸；
(b)用引物特異性擴增處理過的靶核酸分子，所述引物與靶核酸分子中的預(yù)先確定區(qū)或者預(yù)先確定區(qū)的互補序列特異性雜交，其中預(yù)先確定區(qū)含有一個或多個胞嘧啶核苷酸；
(c)堿基特異性地切割所述擴增產(chǎn)物；以及
(d)檢測所述切割產(chǎn)物的質(zhì)量，其中與參考質(zhì)量相比較，一個或多個切割產(chǎn)物的質(zhì)量變化表示靶分子中的核苷酸基因座是甲基化的。
17.一種鑒定甲基化核酸分子的方法，包括
(a)用可修飾未甲基化的選定的核苷酸生成不同的核苷酸的試劑處理靶核酸分子；
(b)用引物特異性擴增處理過的靶核酸分子，所述引物的靶核酸結(jié)合區(qū)含有一個或多個與選定核苷酸互補的核苷酸；
(c)堿基特異性地切割所述擴增產(chǎn)物；以及
(d)檢測所述切割產(chǎn)物，其中兩個或多個片段的存在表示所述靶核酸分子含有一個或多個甲基化的選定核苷酸。
18.一種鑒定甲基化核酸的方法，包括
(a)用可修飾未甲基化的選定的核苷酸生成不同的核苷酸的試劑處理靶核酸分子；
(b)擴增處理過的靶核酸分子以形成第一擴增產(chǎn)物；
(c)用靶核酸結(jié)合區(qū)含有一個或多個所選核苷酸的引物特異性擴增所述第一擴增產(chǎn)物以形成第二擴增產(chǎn)物；
(d)堿基特異性地切割所述第二擴增產(chǎn)物；以及
(e)檢測切割產(chǎn)物，其中兩個或多個片段的存在表示靶核酸分子含有一個或多個甲基化的選定核苷酸。
19.一種鑒定核酸中甲基化或未甲基化的核苷酸的方法，包括
(a)用從由可修飾未甲基化的選定的核苷酸生成不同核苷酸的試劑和可修飾甲基化的選定的核苷酸生成不同核苷酸的試劑組成的組中選擇的試劑處理靶核酸分子；
(b)用引物特異性擴增處理過的靶核酸分子，所述引物選自由靶核酸結(jié)合區(qū)包含一個或多個與選定核苷酸互補的核苷酸的引物、靶核酸結(jié)合區(qū)包含一個或多個與選定核苷酸互補物相互補的核苷酸的引物、靶核酸結(jié)合區(qū)包含一個或多個與不同核苷酸互補的核苷酸的引物、靶核酸結(jié)合區(qū)包含一個或多個與不同核苷酸互補物相互補的核苷酸的引物組成的組；
(c)在堿基特異性切割條件下，處理所述擴增的核酸分子；以及
(d)檢測切割處理的產(chǎn)物，其中鑒定靶核酸分子含有一個或多個甲基化或未甲基化的選定核苷酸可通過觀察結(jié)果表示，而所述觀察結(jié)果選自由存在兩個或多個產(chǎn)物、僅存在單個產(chǎn)物、存在比參考產(chǎn)物數(shù)量多一個或多個的產(chǎn)物、存在比參考產(chǎn)物數(shù)量少一個或多個的產(chǎn)物、存在與參考產(chǎn)物數(shù)量相同的產(chǎn)物、與參考產(chǎn)物質(zhì)量相比一個或多個產(chǎn)物質(zhì)量的變化以及與參考產(chǎn)物質(zhì)量相同的一個或多個產(chǎn)物所組成的組。
20.一種鑒定核酸中一個或多個甲基化核苷酸的方法，包括
(a)用修飾作為選定核苷酸甲基化狀態(tài)的函數(shù)的選定的核苷酸以生成不同核苷酸的試劑處理靶核酸分子；
(b)用引物接觸處理過的靶核酸分子，而所述引物與含有一個或多個選定核苷酸或者一個或多個不同核苷酸的靶核酸區(qū)域特異性雜交；
(c)在核酸合成條件下處理接觸過的所述靶核酸分子；
(d)在堿基特異性切割條件下處理合成的產(chǎn)物；以及
(e)檢測切割處理的產(chǎn)物，根據(jù)檢測的切割產(chǎn)物的數(shù)量，可以鑒定靶核酸中一個或多個甲基化的核苷酸。
21.一種鑒定核酸中一個或多個甲基化核苷酸的方法，包括
(a)用可修飾作為選定核苷酸甲基化狀態(tài)的函數(shù)的選定的核苷酸生成不同核苷酸的試劑處理靶核酸分子；
(b)用引物接觸處理過的靶核酸分子，所述引物與含有一個或多個選定核苷酸或者一個或多個不同核苷酸的靶核酸區(qū)域特異性雜交；
(c)在核酸合成條件下處理接觸過的所述靶核酸分子；
(d)在堿基特異性切割條件下處理合成的產(chǎn)物；
(e)檢測切割處理的產(chǎn)物；以及
(f)與一個或多個參照比較一個或多個切割產(chǎn)物，據(jù)此鑒定靶核酸中一個或多個甲基化的核苷酸。
22.一種鑒定核酸中一個或多個未甲基化的核苷酸的方法，包括
(a)用可修飾作為選定核苷酸甲基化狀態(tài)的函數(shù)的選定的核苷酸以生成不同核苷酸的試劑處理靶核酸分子；
(b)用引物接觸處理過的靶核酸分子，所述引物與含有一個或多個選定核苷酸或者一個或多個不同核苷酸的靶核酸區(qū)域特異性雜交；
(c)在核酸合成條件下處理接觸過的所述靶核酸分子；
(d)在堿基特異性切割條件下處理合成的產(chǎn)物；以及
(e)檢測切割處理的產(chǎn)物，根據(jù)檢測的切割產(chǎn)物的數(shù)量，可以鑒定靶核酸中一個或多個未甲基化的核苷酸。
23.一種鑒定核酸中一個或多個未甲基化的核苷酸的方法，包括
(a)用可修飾作為選定核苷酸甲基化狀態(tài)的函數(shù)的選定的核苷酸以生成不同核苷酸的試劑處理靶核酸分子；
(b)用引物接觸處理過的靶核酸分子，所述引物與含有一個或多個選定核苷酸或者一個或多個不同核苷酸的靶核酸區(qū)域特異性雜交；
(c)在核酸合成條件下處理接觸過的所述靶核酸分子；
(d)在堿基特異性切割條件下處理合成的產(chǎn)物；
(e)檢測切割處理的產(chǎn)物；以及
(f)與一個或多個參照比較一個或多個切割產(chǎn)物，據(jù)此鑒定靶核酸中一個或多個未甲基化的核苷酸。
24.一種鑒定核酸中一個或多個甲基化的核苷酸的方法，包括
(a)用可修飾作為選定核苷酸甲基化狀態(tài)的函數(shù)的選定的核苷酸以生成不同核苷酸的試劑處理靶核酸分子；
(b)擴增處理過的靶核酸分子以形成擴增產(chǎn)物；
(c)用引物接觸處理過的靶核酸分子，所述引物與含有一個或多個選定核苷酸或者一個或多個不同核苷酸的靶核酸區(qū)域特異性雜交；
(d)在核酸合成條件下處理接觸過的擴增產(chǎn)物；
(e)在堿基特異性切割條件下處理合成的產(chǎn)物；以及
(f)檢測切割處理的產(chǎn)物，根據(jù)檢測的切割產(chǎn)物的數(shù)量，可以鑒定靶核酸中一個或多個未甲基化的核苷酸。
25.一種鑒定核酸中一個或多個甲基化的核苷酸的方法，包括
(a)用可修飾作為選定核苷酸甲基化狀態(tài)的函數(shù)的選定的核苷酸生成不同核苷酸的試劑處理靶核酸分子；
(b)擴增處理過的靶核酸分子以形成擴增產(chǎn)物；
(c)用引物接觸處理過的靶核酸分子，所述引物與含有一個或多個選定核苷酸或者一個或多個不同核苷酸的靶核酸區(qū)域特異性雜交；
(d)在核酸合成條件下處理接觸過的擴增產(chǎn)物；
(e)在堿基特異性切割條件下處理合成的產(chǎn)物；
(f)檢測切割處理的產(chǎn)物；以及
(g)與一個或多個參照比較一個或多個切割產(chǎn)物，據(jù)此鑒定靶核酸中一個或多個甲基化的核苷酸。
26.一種鑒定核酸中一個或多個未甲基化的核苷酸的方法，包括
(a)用可修飾作為選定核苷酸甲基化狀態(tài)的函數(shù)的選定的核苷酸生成不同核苷酸的試劑處理靶核酸分子；
(b)擴增處理過的靶核酸分子以形成擴增產(chǎn)物；
(c)用引物接觸處理過的靶核酸分子，所述引物與含有一個或多個選定核苷酸或者一個或多個不同核苷酸的靶核酸區(qū)域特異性雜交；
(d)在核酸合成條件下處理接觸過的擴增產(chǎn)物；
(e)在堿基特異性切割條件下處理合成的產(chǎn)物；以及
(f)檢測切割處理的產(chǎn)物，根據(jù)檢測的切割產(chǎn)物的數(shù)量，可以鑒定靶核酸中一個或多個未甲基化的核苷酸。
27.一種鑒定核酸中一個或多個未甲基化的核苷酸的方法，包括
(a)用可修飾作為選定核苷酸甲基化狀態(tài)的函數(shù)的選定的核苷酸生成不同核苷酸的試劑處理靶核酸分子；
(b)擴增處理過的靶核酸分子以形成擴增產(chǎn)物；
(c)用引物接觸處理過的靶核酸分子，所述引物與含有一個或多個選定核苷酸或者一個或多個不同核苷酸的靶核酸區(qū)域特異性雜交；
(d)在核酸合成條件下處理接觸過的擴增產(chǎn)物；
(e)在堿基特異性切割條件下處理合成的產(chǎn)物；
(f)檢測切割處理的產(chǎn)物；以及
(g)與一個或多個參照比較一個或多個切割產(chǎn)物，據(jù)此鑒定靶核酸中一個或多個未甲基化的核苷酸。
28.一種鑒定核酸中甲基化或未甲基化的核苷酸的方法，包括
(a)用從由可修飾未甲基化的選定的核苷酸生成不同核苷酸的試劑和可修飾甲基化的選定的核苷酸生成不同核苷酸的試劑組成的組中選擇的試劑，處理靶核酸分子；
(b)特異性擴增處理過的靶核酸分子，通過選自由以下方法組成的組中的方法
(i)用引物接觸處理過的靶核酸分子，所述引物與含有一個或多個選定核苷酸或者一個或多個不同核苷酸的靶核酸區(qū)域特異性雜交；并在核酸合成條件下處理接觸過的靶核酸分子；
(ii)擴增處理過的靶核酸分子以形成擴增產(chǎn)物；用引物接觸擴增產(chǎn)物，所述引物與含有一個或多個選定核苷酸或者一個或多個不同核苷酸的靶核酸區(qū)域特異性雜交；并在核酸合成條件下處理接觸過的擴增產(chǎn)物；
(c)用堿基特異性切割條件處理擴增產(chǎn)物；以及
(d)檢測切割處理的產(chǎn)物，其中含有一個或多個甲基化或未甲基化的選定核苷酸的靶核酸分子可通過觀察結(jié)果表示，而所述觀察結(jié)果選自由存在兩個或多個切割產(chǎn)物、僅存在單個切割產(chǎn)物、存在比參考核酸分子數(shù)量多的一個或多個的切割產(chǎn)物、存在比參考核酸分子數(shù)量少的一個或多個的切割產(chǎn)物、存在與參考核酸分子數(shù)量相同的切割產(chǎn)物、與參考核酸分子質(zhì)量相比一個或多個產(chǎn)物質(zhì)量的變化、以及一個或多個與參考核酸分子質(zhì)量相同的切割產(chǎn)物所組成的組。
29.一種鑒定核酸中一個或多個甲基化或未甲基化的核苷酸的方法，包括
(a)用可修飾作為選定核苷酸甲基化狀態(tài)的函數(shù)的選定的核苷酸生成不同核苷酸的試劑處理靶核酸分子；
(b)用引物接觸所述處理過的靶核酸分子，所述引物含有與選定核苷酸互補的一個或多個核苷酸或含有與不同核苷酸互補的一個或多個核苷酸；
(c)在核酸合成條件下處理所述接觸過的靶核酸分子，據(jù)此核苷酸在雜交到靶核酸分子的引物上合成；
(d)在堿基特異性切割條件下處理所述合成產(chǎn)物；以及
(e)檢測所述切割處理的產(chǎn)物，其中含有一個或多個甲基化或未甲基化的選定核苷酸的靶核酸分子根據(jù)切割產(chǎn)物的數(shù)量或者根據(jù)一個或多個切割產(chǎn)物與一個或多個參照物之間的比較來確定。
30.一種鑒定核酸中一個或多個甲基化或未甲基化的核苷酸的方法，包括
(a)用可修飾作為選定核苷酸甲基化狀態(tài)的函數(shù)的選定的核苷酸生成不同核苷酸的試劑處理靶核酸分子；
(b)擴增所述處理過的靶核酸分子以形成擴增產(chǎn)物；
(c)用引物接觸所述處理過的靶核酸分子，所述引物含有與所述選定核苷酸互補的核苷酸互補的一個或多個核苷酸或含有與所述不同核苷酸互補的核苷酸互補的一個或多個核苷酸；
(d)在核酸合成條件下處理所述接觸過的靶核酸分子，據(jù)此核苷酸在雜交到靶核酸分子的引物上合成；
(e)在堿基特異性切割條件下處理所述合成產(chǎn)物；以及
(f)檢測所述切割處理的產(chǎn)物，其中含有一個或多個甲基化或未甲基化的選定核苷酸的靶核酸分子根據(jù)切割產(chǎn)物的數(shù)量或者根據(jù)一個或多個切割產(chǎn)物與一個或多個參照物之間的比較來確定。
31.一種區(qū)分假陽性甲基化特異性擴增和真甲基化特異性擴增的方法，包括以下步驟
(a)用可修飾未甲基化的選定核苷酸生成不同核苷酸的試劑處理靶核酸分子；
(b)用與含有一個或多個選定核苷酸的第一個靶核酸區(qū)互補的甲基化狀態(tài)特異性引物接觸所述處理過的靶核酸分子；
(c)在核酸合成條件下處理所述接觸過的靶核酸分子；
(d)在堿基特異性切割條件下處理所述合成產(chǎn)物；以及
(e)檢測切割產(chǎn)物的質(zhì)量，其中與參考質(zhì)量相比，一個或多個切割產(chǎn)物質(zhì)量的變化表示靶核酸第二個區(qū)域中的核苷酸基因座是甲基化的，其中所述第二個區(qū)域與第一個區(qū)域不交迭，據(jù)此，第二個區(qū)域中存在一個或多個甲基化基因座確證真甲基化特異性擴增。
32.一種區(qū)分假陽性甲基化特異性擴增和真甲基化特異性擴增的方法，包括以下步驟
(a)用可修飾未甲基化的選定核苷酸生成不同核苷酸的試劑處理靶核酸分子；
(b)用與含有一個或多個選定核苷酸的第一個靶核酸區(qū)互補的甲基化狀態(tài)特異性引物接觸所述處理過的靶核酸分子；
(c)在核酸合成條件下處理所述接觸過的靶核酸分子；
(d)在堿基特異性切割條件下處理所述合成產(chǎn)物；以及
(e)檢測切割產(chǎn)物的質(zhì)量，其中與參考質(zhì)量相比，一個或多個切割產(chǎn)物質(zhì)量的變化表示靶分子第二個區(qū)域中的核苷酸基因座是甲基化的，其中所述第二個區(qū)域與第一個區(qū)域不交迭，據(jù)此，一個或多個基因座的甲基化狀態(tài)與參考核酸分子中相應(yīng)基因座的甲基化狀態(tài)進行比較，并且甲基化基因座與參考核酸分子的相關(guān)性確證了真甲基化特異性擴增。
33.一種在兩個或多個核酸中鑒定一個或多個甲基化或未甲基化的核苷酸的方法，包括
(a)用可修飾作為選定核苷酸的甲基化狀態(tài)的函數(shù)的選定核苷酸生成不同核苷酸的試劑處理兩個或多個不同的靶核酸分子；
(b)用引物接觸所述處理過的靶核酸分子，所述引物含有一個或多個與選定核苷酸互補的核苷酸，或者含有一個或多個與不同核苷酸互補的核苷酸；
(c)在核酸合成條件下處理接觸過的所述靶核酸分子，由此核苷酸被合成到雜交到靶核酸分子的引物上；
(d)在堿基特異性切割條件下處理所述合成產(chǎn)物；以及
(e)檢測所述切割處理的產(chǎn)物，其中含有一個或多個甲基化或未甲基化的選定核苷酸的靶核酸分子根據(jù)一個或多個切割產(chǎn)物與一個或多個參照物之間的比較來確定。
34.一種在兩個或多個核酸中鑒定一個或多個甲基化或未甲基化的核苷酸的方法，包括
(a)用可修飾作為的選定核苷酸的甲基化狀態(tài)的函數(shù)的選定核苷酸生成不同核苷酸的試劑處理兩個或多個靶核酸分子；
(b)擴增所述處理過的靶核酸分子以形成擴增產(chǎn)物；
(c)用引物接觸所述處理過的靶核酸分子，所述引物含有與選定核苷酸互補的核苷酸相互補的一個或多個核苷酸，或者含有與不同核苷酸互補的核苷酸相互補的一個或多個核苷酸；
(d)在核酸合成條件下處理所述接觸過的靶核酸分子，據(jù)此，核苷酸在雜交到靶核酸分子的引物上合成；
(e)在堿基特異性切割條件下處理所述合成產(chǎn)物；以及
(f)檢測所述切割處理的產(chǎn)物，其中含有一個或多個甲基化或未甲基化的選定核苷酸的靶核酸分子根據(jù)一個或多個切割產(chǎn)物與一個或多個參照物之間的比較來確定。
35.一種鑒定核酸中一個或多個甲基化或未甲基化的核苷酸的方法，包括
(a)用可修飾作為的選定核苷酸的甲基化狀態(tài)的函數(shù)的選定核苷酸生成不同核苷酸的試劑處理靶核酸分子；
(b)用引物接觸所述處理過的靶核酸分子，所述引物含有一個或多個與選定核苷酸互補的核苷酸，或者含有一個或多個與不同核苷酸互補的核苷酸；
(c)在核酸合成條件下處理所述接觸過的靶核酸分子，據(jù)此，核苷酸在雜交到所述靶核酸分子的引物上合成；
(d)在斷裂條件下處理所述合成產(chǎn)物；以及
(e)通過質(zhì)譜分析法檢測斷裂處理的產(chǎn)物，其中含有一個或多個甲基化或未甲基化的選定核苷酸的靶核酸分子根據(jù)斷裂產(chǎn)物的數(shù)量或者根據(jù)一個或多個斷裂產(chǎn)物與一個或多個參照物之間的比較來確定。
36.一種鑒定核酸中一個或多個甲基化或未甲基化的核苷酸的方法，包括
(a)用可修飾作為選定核苷酸的甲基化狀態(tài)的函數(shù)的選定的核苷酸生成不同核苷酸的試劑處理靶核酸分子；
(b)擴增所述處理過的靶核酸分子以形成擴增產(chǎn)物；
(c)用引物接觸所述處理過的靶核酸分子，所述引物含有與選定核苷酸互補的核苷酸相互補的一個或多個核苷酸，或者含有與不同核苷酸互補的核苷酸相互補的一個或多個核苷酸；
(d)在核酸合成條件下處理所述接觸過的靶核酸分子，據(jù)此，核苷酸在雜交到靶核酸分子雜交的引物上合成；
(e)在斷裂條件下處理所述合成產(chǎn)物；以及
(f)通過質(zhì)譜分析法檢測斷裂處理的產(chǎn)物，其中含有一個或多個甲基化或未甲基化的選定核苷酸的靶核酸分子根據(jù)斷裂產(chǎn)物的數(shù)量或者根據(jù)一個或多個斷裂產(chǎn)物與一個或多個參照物之間的比較來確定。
37.一種鑒定核酸中一個或多個甲基化或未甲基化的核苷酸的方法，包括
(a)用可修飾作為選定核苷酸的甲基化狀態(tài)的函數(shù)的選定的核苷酸生成不同核苷酸的試劑處理靶核酸分子；
(b)用封閉性寡核苷酸接觸所述處理過的靶核酸分子，所述封閉性寡核苷酸含有一個或多個與選定核苷酸互補的核苷酸，或者含有一個或多個與不同核苷酸互補的核苷酸；
(c)在核酸合成條件下處理所述接觸過的靶核酸分子，據(jù)此，當封閉性寡核苷酸與靶核酸分子雜交時，核苷酸合成被抑制；
(d)在堿基特異性切割條件下處理所述合成產(chǎn)物；以及
(e)檢測所述切割處理的產(chǎn)物，其中含有一個或多個甲基化或未甲基化的選定核苷酸的靶核酸分子根據(jù)切割產(chǎn)物的數(shù)量或者根據(jù)一個或多個切割產(chǎn)物與一個或多個參照物之間的比較來確定。
38.一種鑒定核酸中一個或多個甲基化或未甲基化的核苷酸的方法，包括
(a)用可修飾作為選定核苷酸的甲基化狀態(tài)的函數(shù)的選定的核苷酸生成不同核苷酸的試劑處理靶核酸分子；
(b)擴增所述處理過的靶核酸分子以形成擴增產(chǎn)物；
(c)用封閉性寡核苷酸接觸所述處理過的靶核酸分子，
所述封閉性寡核苷酸含有一個或多個與選定核苷酸互補的核苷酸，或者含有一個或多個與不同核苷酸互補的核苷酸；
(d)在核酸合成條件下處理所述接觸過的靶核酸分子，其中當封閉性寡核苷酸與靶核酸分子雜交時，核苷酸合成被抑制；
(e)在堿基特異性切割條件下處理所述合成產(chǎn)物；以及
(f)檢測所述切割處理的產(chǎn)物，其中含有一個或多個甲基化或未甲基化的選定核苷酸的靶核酸分子根據(jù)切割產(chǎn)物的數(shù)量或者根據(jù)一個或多個切割產(chǎn)物與一個或多個參照物之間的比較來確定。
39.一種鑒定核酸中一個或多個甲基化或未甲基化的核苷酸的方法，包括
(a)用可修飾作為選定核苷酸的甲基化狀態(tài)的函數(shù)的選定的核苷酸生成不同核苷酸的試劑處理靶核酸分子；
(b)用封閉性寡核苷酸接觸所述處理過的靶核酸分子，所述封閉性寡核苷酸含有一個或多個與選定核苷酸互補的核苷酸，或者含有一個或多個與不同核苷酸互補的核苷酸；
(c)在核酸合成條件下處理所述接觸過的靶核酸分子，其中當封閉性寡核苷酸與靶核酸分子雜交時，核苷酸合成被抑制；
(d)在斷裂條件下處理所述合成產(chǎn)物；以及
(e)通過質(zhì)譜分析法檢測斷裂處理的產(chǎn)物，其中含有一個或多個甲基化或未甲基化的選定核苷酸的靶核酸分子根據(jù)斷裂產(chǎn)物的數(shù)量或者根據(jù)一個或多個斷裂產(chǎn)物與一個或多個參照物之間的比較來確定。
40.一種鑒定核酸中一個或多個甲基化或未甲基化的核苷酸的方法，包括
(a)用可修飾作為選定核苷酸的甲基化狀態(tài)的函數(shù)的選定的核苷酸生成不同核苷酸的試劑處理靶核酸分子；
(b)擴增所述處理過的靶核酸分子以形成擴增產(chǎn)物；
(c)用封閉性寡核苷酸接觸所述處理過的靶核酸分子，所述封閉性寡核苷酸含有一個或多個與選定核苷酸互補的核苷酸，或者含有一個或多個與不同核苷酸互補的核苷酸；
(d)在核酸合成條件下處理所述接觸過的靶核酸分子，其中當封閉性寡核苷酸與靶核酸分子雜交時，核苷酸合成被抑制；
(e)在斷裂條件下處理所述合成產(chǎn)物；以及
(f)通過質(zhì)譜分析法檢測斷裂處理的產(chǎn)物，其中含有一個或多個甲基化或未甲基化的選定核苷酸的靶核酸分子根據(jù)斷裂產(chǎn)物的數(shù)量或者根據(jù)一個或多個斷裂產(chǎn)物與一個或多個參照物之間的比較來確定。
41.一種鑒定核酸中一個或多個甲基化或未甲基化的核苷酸的方法，包括
(a)用可修飾作為選定核苷酸的甲基化狀態(tài)的函數(shù)的選定的核苷酸生成不同核苷酸的試劑處理靶核酸分子；
(b)用切割試劑接觸所述靶核酸分子，采用的切割試劑在含有一個或多個甲基化的選定核苷酸或者一個或多個未甲基化的選定核苷酸的位點選擇性切割所述靶核酸，或者采用的切割試劑在含有一個或多個選定核苷酸或者一個或多個不同核苷酸的位點選擇性切割所述處理過的靶核酸；
(c)在核酸合成條件下處理所述接觸過的靶核酸分子，其中在步驟(b)中未被切割的靶核酸分子被擴增；
(d)在堿基特異性切割條件下處理所述擴增產(chǎn)物；以及
(e)檢測所述切割處理的產(chǎn)物，其中含有一個或多個甲基化或未甲基化的選定核苷酸的靶核酸分子根據(jù)切割產(chǎn)物的數(shù)量或者根據(jù)一個或多個切割產(chǎn)物與一個或多個參照物之間的比較來確定。
42.一種鑒定核酸中一個或多個甲基化或未甲基化核苷酸的方法，包括
(a)用可修飾作為選定核苷酸的甲基化狀態(tài)的函數(shù)的選定的核苷酸生成不同核苷酸的試劑處理靶核酸分子；
(b)擴增所述處理過的靶核酸分子以形成擴增產(chǎn)物；
(c)用切割試劑接觸所述靶核酸分子，采用的切割試劑在含有一個或多個甲基化的選定核苷酸或者一個或多個未甲基化的選定核苷酸的位點選擇性切割所述靶核酸，或者采用的切割試劑在含有一個或多個選定核苷酸或者一個或多個不同核苷酸的位點選擇性切割所述處理過的靶核酸；
(d)在核酸合成條件下處理所述接觸過的靶核酸分子，其中在步驟(b)中未被切割的靶核酸分子被擴增；
(e)在堿基特異性切割條件下處理所述擴增產(chǎn)物；以及
(f)檢測所述切割處理的產(chǎn)物，其中含有一個或多個甲基化或未甲基化的選定核苷酸的靶核酸分子根據(jù)切割產(chǎn)物的數(shù)量或根據(jù)一個或多個切割產(chǎn)物與一個或多個參照物之間的比較來確定。
43.一種鑒定核酸中一個或多個甲基化或未甲基化的核苷酸的方法，包括
(a)用可修飾作為選定核苷酸的甲基化狀態(tài)的函數(shù)的選定的核苷酸生成不同核苷酸的試劑處理靶核酸分子；
(b)用切割試劑接觸所述靶核酸分子，采用的切割試劑在含有一個或多個甲基化的選定核苷酸或者一個或多個未甲基化的選定核苷酸的位點選擇性切割所述靶核酸，或者采用的切割試劑在含有一個或多個選定核苷酸或者一個或多個不同核苷酸的位點選擇性切割所述處理過的靶核酸；
(c)在核酸合成條件下處理所述接觸過的靶核酸分子，其中在步驟(b)中未被切割的靶核酸分子被擴增；
(d)在斷裂條件下處理所述擴增產(chǎn)物；以及
(e)通過質(zhì)譜分析法檢測斷裂處理的產(chǎn)物，其中含有一個或多個甲基化或未甲基化的選定核苷酸的靶核酸分子根據(jù)斷裂產(chǎn)物的數(shù)量或者根據(jù)一個或多個斷裂產(chǎn)物與一個或多個參照物之間的比較來確定。
44.一種鑒定核酸中一個或多個甲基化或未甲基化的核苷酸的方法，包括
(a)用可修飾作為選定核苷酸的甲基化狀態(tài)的函數(shù)的選定的核苷酸生成不同核苷酸的試劑處理靶核酸分子；
(b)擴增所述處理過的靶核酸分子以形成擴增產(chǎn)物；
(c)用切割試劑接觸所述靶核酸分子，采用的切割試劑在含有一個或多個甲基化的選定核苷酸或者一個或多個未甲基化的選定核苷酸的位點選擇性切割所述靶核酸，或者采用的切割試劑在含有一個或多個選定核苷酸或者一個或多個不同核苷酸的位點選擇性切割所述處理過的靶核酸；
(d)在核酸合成條件下處理所述接觸過的靶核酸分子，其中在步驟(b)中未被切割的靶核酸分子被擴增；
(e)在斷裂條件下處理所述擴增產(chǎn)物；以及
(f)通過質(zhì)譜分析法檢測斷裂處理的產(chǎn)物，其中含有一個或多個甲基化或未甲基化的選定核苷酸的靶核酸分子根據(jù)斷裂產(chǎn)物的數(shù)量或者根據(jù)一個或多個斷裂產(chǎn)物與一個或多個參照物之間的比較來確定。
45.一種鑒定核酸中一個或多個甲基化或未甲基化的核苷酸的方法，包括
(a)用引物接觸所述靶核酸分子并在核酸合成條件下處理所述接觸過的靶核酸分子，其中與靶核酸分子互補的鏈被合成；
(b)用甲基轉(zhuǎn)移酶試劑接觸所述靶核酸合成的產(chǎn)物雙鏈，據(jù)此靶核酸的CpG序列中的甲基化存在于合成產(chǎn)物的互補CpG序列中；
(c)重復步驟(a)和(b)以形成第二個合成產(chǎn)物，所述第二個合成產(chǎn)物具有與靶核酸分子相同的核苷酸序列以及CpG核苷酸的甲基化狀態(tài)；
(d)用可修飾作為選定核苷酸的甲基化狀態(tài)的函數(shù)選定的核苷酸生成不同核苷酸的試劑處理合成產(chǎn)物；
(e)在堿基特異性切割條件下處理所述試劑處理過的產(chǎn)物；以及
(f)檢測所述切割處理的產(chǎn)物，其中含有一個或多個甲基化或未甲基化的選定核苷酸的靶核酸分子根據(jù)切割產(chǎn)物的數(shù)量或者根據(jù)一個或多個切割產(chǎn)物與一個或多個參照物之間的比較來確定。
46.一種鑒定核酸中一個或多個甲基化或未甲基化的核苷酸的方法，包括
(a)用引物接觸所述靶核酸分子并在核酸合成條件下處理所述接觸過的靶核酸分子，其中與所述靶核酸分子互補的鏈被合成；
(b)用甲基轉(zhuǎn)移酶試劑接觸所述靶核酸合成的產(chǎn)物雙鏈，據(jù)此靶核酸的CpG序列中的甲基化也存在于合成產(chǎn)物的互補CpG序列中；
(c)重復步驟(b)和(c)，形成第二個合成產(chǎn)物，所述第二個合成產(chǎn)物具有與靶核酸分子相同的核苷酸序列以及CpG核苷酸的甲基化狀態(tài)；
(d)用可修飾選定的作為選定核苷酸的甲基化狀態(tài)的函數(shù)的核苷酸生成不同核苷酸的試劑處理合成產(chǎn)物；
(e)在斷裂條件下處理所述試劑處理過的產(chǎn)物；以及
(f)通過質(zhì)譜分析法檢測所述斷裂處理的產(chǎn)物，其中含有一個或多個甲基化或未甲基化的選定核苷酸的靶核酸分子根據(jù)斷裂產(chǎn)物的數(shù)量或者根據(jù)一個或多個斷裂產(chǎn)物與一個或多個參照物之間的比較來確定。
47.一種區(qū)分假陽性甲基化特異性擴增和真甲基化特異性擴增的方法，包括以下步驟
(a)根據(jù)權(quán)利要求1～30或33～46中任何一個所述的方法，確定一個或多個核苷酸基因座的甲基化狀態(tài)；以及
(b)確定任何一個甲基化核苷酸基因座是否定位于靶核酸分子中不與所述引物雜交的區(qū)域；據(jù)此，靶核酸分子中不與引物雜交的區(qū)域中一個或多個甲基化基因座的存在確證靶核酸的真甲基化特異性擴增。
48.一種區(qū)分假陽性甲基化特異性擴增和真甲基化特異性擴增的方法，包括以下步驟
(a)根據(jù)權(quán)利要求1～30或33～46中任何一個所述的方法，確定一個或多個核苷酸基因座的甲基化狀態(tài)；以及
(b)確定任何未甲基化的核苷酸基因座是否定位于靶核酸分子中不與引物雜交的區(qū)域；據(jù)此，靶核酸分子中不與引物雜交的區(qū)域存在一個或多個未甲基化基因座確證靶核酸的真甲基化特異性擴增。
49.一種區(qū)分假陽性甲基化特異性擴增和真甲基化特異性擴增的方法，包括以下步驟
(a)根據(jù)權(quán)利要求1～30或33～46中任何一個所述的方法，確定一個或多個核苷酸基因座的甲基化狀態(tài)；以及
(b)將定位于靶核酸分子中不與引物雜交的區(qū)域的一個或多個核苷酸基因座的甲基化狀態(tài)與一個或多個參照物相比；據(jù)此，所述一個或多個核苷酸基因座與所述一個或多個參照物之間的相關(guān)性確證靶核酸的真甲基化特異性擴增。
50.一種區(qū)分假陽性甲基化特異性擴增和真甲基化特異性擴增的方法，包括以下步驟
(a)根據(jù)權(quán)利要求1～30或33～46中任何一個所述的方法，確定一個或多個核苷酸基因座的甲基化狀態(tài)；以及
(b)將定位于靶核酸分子中不與引物雜交的區(qū)域的一個或多個核苷酸基因座的甲基化狀態(tài)與一個或多個參照物比較；據(jù)此，所述一個或多個核苷酸基因座與所述一個或多個參照物之間缺乏相關(guān)性確證了靶核酸的真甲基化特異性擴增。
51.一種區(qū)分假陽性甲基化特異性擴增和真甲基化特異性擴增的方法，包括以下步驟
(a)根據(jù)權(quán)利要求1～30或33～46中任何一個所述的方法，確定一個或多個核苷酸基因座的甲基化狀態(tài)；以及
(b)將定位于靶核酸分子中不與引物雜交的區(qū)域的一個或多個核苷酸基因座的甲基化狀態(tài)與一個或多個參照物相比；
據(jù)此，所述一個或多個核苷酸基因座與所述一個或多個參照物之間的相關(guān)性確證了靶核酸的假陽性甲基化特異性擴增。
52.一種區(qū)分假陽性甲基化特異性擴增和真甲基化特異性擴增的方法，包括以下步驟
(a)根據(jù)權(quán)利要求1～30或33～46中任何一個所述的方法，確定一個或多個核苷酸基因座的甲基化狀態(tài)；以及
(b)將定位于靶核酸分子中不與引物雜交的區(qū)域的一個或多個核苷酸基因座的甲基化狀態(tài)與一個或多個參照物相比；據(jù)此，所述一個或多個核苷酸基因座與所述一個或多個參照物之間缺乏相關(guān)性確證了靶核酸的假陽性甲基化特異性擴增。
53.根據(jù)權(quán)利要求1～52中任何一個所述的方法，其中所述一個或多個選定核苷酸基因座的甲基化狀態(tài)加以鑒定。
54.根據(jù)權(quán)利要求1～53中任何一個所述的方法，其中一個或多個選定核苷酸基因座鑒定為甲基化的。
55.根據(jù)權(quán)利要求1～53中任何一個所述的方法，其中一個或多個選定核苷酸基因座鑒定為未甲基化的。
56.根據(jù)權(quán)利要求17～55中任何一個所述的方法，其中所述試劑修飾未甲基化的選定核苷酸生成不同核苷酸。
57.根據(jù)權(quán)利要求17～55中任何一個所述的方法，其中所述試劑修飾甲基化的選定核苷酸生成不同核苷酸。
58.根據(jù)權(quán)利要求17～57中任何一個所述的方法，其中所述引物含有一個或多個與選定核苷酸互補的核苷酸。
59.根據(jù)權(quán)利要求17～57中任何一個所述的方法，其中所述引物含有一個或多個與不同核苷酸互補的核苷酸。
60.根據(jù)權(quán)利要求17～57中任何一個所述的方法，其中所述引物含有一個或多個與選定核苷酸互補的核苷酸，還含有一個或多個與不同核苷酸互補的核苷酸。
61.根據(jù)權(quán)利要求1～60中任何一個所述的方法，其中兩個或多個產(chǎn)物的存在表示所述靶核酸分子含有一個或多個甲基化核苷酸。
62.根據(jù)權(quán)利要求1～60中任何一個所述的方法，其中兩個或多個產(chǎn)物的存在表示所述靶核酸分子含有一個或多個未甲基化核苷酸。
63.根據(jù)權(quán)利要求1～60中任何一個所述的方法，其中兩個或多個產(chǎn)物的存在可以鑒定一個或多個核苷酸基因座的甲基化狀態(tài)。
64.根據(jù)權(quán)利要求1～60中任何一個所述的方法，其中兩個或多個產(chǎn)物的存在表示一個或多個甲基化核苷酸的基因座。
65.根據(jù)權(quán)利要求1～60中任何一個所述的方法，其中兩個或多個產(chǎn)物的存在表示一個或多個未甲基化核苷酸的基因座。
66.根據(jù)權(quán)利要求1～60中任何一個所述的方法，其中僅單一產(chǎn)物的存在表示靶核酸分子含有一個或多個甲基化核苷酸。
67.根據(jù)權(quán)利要求1～60中任何一個所述的方法，其中僅單一產(chǎn)物的存在表示靶核酸分子含有一個或多個未甲基化核苷酸。
68.根據(jù)權(quán)利要求1～60中任何一個所述的方法，其中僅單一產(chǎn)物的存在可以鑒定一個或多個核苷酸基因座的甲基化狀態(tài)。
69.根據(jù)權(quán)利要求1～60中任何一個所述的方法，其中僅單一產(chǎn)物的存在表示一個或多個甲基化核苷酸的基因座。
70.根據(jù)權(quán)利要求1～60中任何一個所述的方法，其中僅單一產(chǎn)物的存在表示一個或多個未甲基化核苷酸的基因座。
71.根據(jù)權(quán)利要求1～60中任何一個所述的方法，其中比參考產(chǎn)物數(shù)量多一個或多個產(chǎn)物的存在表示靶核酸分子含有一個或多個甲基化的核苷酸。
72.根據(jù)權(quán)利要求1～60中任何一個所述的方法，其中比參考產(chǎn)物數(shù)量多一個或多個產(chǎn)物的存在表示所述靶核酸分子含有一個或多個未甲基化的核苷酸。
73.根據(jù)權(quán)利要求1～60中任何一個所述的方法，其中比參考產(chǎn)物數(shù)量多的一個或多個產(chǎn)物的存在可以鑒定一個或多個核苷酸基因座的甲基化狀態(tài)。
74.根據(jù)權(quán)利要求1～60中任何一個所述的方法，其中比參考產(chǎn)物數(shù)量多的一個或多個產(chǎn)物的存在表示一個或多個甲基化核苷酸的基因座。
75.根據(jù)權(quán)利要求1～60中任何一個所述的方法，其中比參考產(chǎn)物數(shù)量多的一個或多個產(chǎn)物的存在表示一個或多個未甲基化的核苷酸的基因座。
76.根據(jù)權(quán)利要求1～60中任何一個所述的方法，其中比參考產(chǎn)物數(shù)量少的一個或多個產(chǎn)物的存在表示靶核酸分子含有一個或多個甲基化的核苷酸。
77.根據(jù)權(quán)利要求1～60中任何一個所述的方法，其中比參考產(chǎn)物數(shù)量少的一個或多個產(chǎn)物的存在表示靶核酸分子含有一個或多個未甲基化的核苷酸。
78.根據(jù)權(quán)利要求1～60中任何一個所述的方法，其中比參考產(chǎn)物數(shù)量少的一個或多個產(chǎn)物的存在可以鑒定一個或多個核苷酸基因座的甲基化狀態(tài)。
79.根據(jù)權(quán)利要求1～60中任何一個所述的方法，其中比參考產(chǎn)物數(shù)量少的一個或多個產(chǎn)物的存在表示一個或多個甲基化核苷酸的基因座。
80.根據(jù)權(quán)利要求1～60中任何一個所述的方法，其中比參考產(chǎn)物數(shù)量少的一個或多個產(chǎn)物的存在表示一個或多個甲基化核苷酸的基因座。
81.根據(jù)權(quán)利要求1～60中任何一個所述的方法，其中與參考產(chǎn)物數(shù)量相同的產(chǎn)物的存在表示靶核酸分子含有一個或多個甲基化的核苷酸。
82.根據(jù)權(quán)利要求1～60中任何一個所述的方法，其中與參考產(chǎn)物數(shù)量相同的產(chǎn)物的存在表示靶核酸分子含有一個或多個未甲基化的核苷酸。
83.根據(jù)權(quán)利要求1～60中任何一個所述的方法，其中與參考產(chǎn)物相同數(shù)量的產(chǎn)物的存在允許鑒定一個或多個核苷酸基因座的甲基化狀態(tài)。
84.根據(jù)權(quán)利要求1～60中任何一個所述的方法，其中與參考產(chǎn)物相同數(shù)量的產(chǎn)物的存在表示一個或多個甲基化的核苷酸的基因座。
85.根據(jù)權(quán)利要求1～60中任何一個所述的方法，其中與參考產(chǎn)物相同數(shù)量的產(chǎn)物的存在表示一個或多個未甲基化的核苷酸的基因座。
86.根據(jù)權(quán)利要求1～60中任何一個所述的方法，其中與參考產(chǎn)物質(zhì)量相比，一個或多個產(chǎn)物質(zhì)量的變化表示靶核酸分子含有一個或多個甲基化的核苷酸。
87.根據(jù)權(quán)利要求1～60中任何一個所述的方法，其中與參考產(chǎn)物質(zhì)量相比，一個或多個產(chǎn)物質(zhì)量的變化表示靶核酸分子含有一個或多個未甲基化的核苷酸。
88.根據(jù)權(quán)利要求1～60中任何一個所述的方法，其中與參考產(chǎn)物質(zhì)量相比，一個或多個產(chǎn)物質(zhì)量的變化可以鑒定一個或多個核苷酸基因座的甲基化狀態(tài)。
89.根據(jù)權(quán)利要求1～60中任何一個所述的方法，其中與參考產(chǎn)物質(zhì)量相比，一個或多個產(chǎn)物質(zhì)量的變化表示一個或多個甲基化核苷酸的基因座。
90.根據(jù)權(quán)利要求1～60中任何一個所述的方法，其中與參考產(chǎn)物質(zhì)量相比，一個或多個產(chǎn)物質(zhì)量的變化表示一個或多個未甲基化的核苷酸的基因座。
91.根據(jù)權(quán)利要求1～60中任何一個所述的方法，其中所述質(zhì)量與參考產(chǎn)物質(zhì)量相同的一個或多個產(chǎn)物的存在，表示靶核酸分子含有一個或多個甲基化的核苷酸。
92.根據(jù)權(quán)利要求1～60中任何一個所述的方法，其中所述質(zhì)量與參考產(chǎn)物質(zhì)量相同的一個或多個產(chǎn)物的存在，表示靶核酸分子含有一個或多個未甲基化的核苷酸。
93.根據(jù)權(quán)利要求1～60中任何一個所述的方法，其中所述質(zhì)量與參考產(chǎn)物質(zhì)量相同的一個或多個產(chǎn)物的存在，允許鑒定一個或多個核苷酸基因座的甲基化狀態(tài)。
94.根據(jù)權(quán)利要求1～60中任何一個所述的方法，其中所述質(zhì)量與參考產(chǎn)物質(zhì)量相同的一個或多個產(chǎn)物的存在，表示一個或多個甲基化的核苷酸的基因座。
95.根據(jù)權(quán)利要求1～60中任何一個所述的方法，其中所述質(zhì)量與參考產(chǎn)物質(zhì)量相同的一個或多個產(chǎn)物的存在，表示一個或多個未甲基化的核苷酸的基因座。
96.一種揭示與疾病、疾病結(jié)果或者治療方案結(jié)果相關(guān)的甲基化的方法，包括以下步驟
(a)根據(jù)權(quán)利要求1～95中任何一個所述的方法，鑒定來自于一個或多個樣品的一個或多個核酸分子中甲基化或未甲基化的核苷酸，所述樣品從一個或多個具有已知疾病、疾病結(jié)果或者治療方案的結(jié)果的受試者收集；
(b)根據(jù)權(quán)利要求1～95中任何一個所述的方法，鑒定來自于一個或多個樣品的一個或多個核酸分子中甲基化或未甲基化的核苷酸，所述樣品從一個或多個正常受試者收集；
(c)鑒定步驟(a)中所述一個或多個核酸分子與步驟(b)中所述一個或多個核酸分子之間差異的甲基化或未甲基化核苷酸；據(jù)此，根據(jù)差異的甲基化或未甲基化核苷酸鑒定與疾病、疾病結(jié)果或者治療方案結(jié)果相關(guān)的甲基化。
97.一種診斷疾病、決定治療方案或者確定受試者疾病結(jié)果的方法，包括以下步驟
(a)根據(jù)權(quán)利要求1～95中任何一個所述的方法，鑒定來自于從受試者收集的一個或多個樣品的一個或多個核酸分子中一個或多個甲基化或未甲基化的核苷酸；
(b)與同已知疾病、疾病結(jié)果或者治療方案結(jié)果相關(guān)的一個或多個參考核酸分子比較所述一個或多個核酸分子中的甲基化或未甲基化核苷酸；據(jù)此，與參考核酸分子相同的甲基化或未甲基化核苷酸可以鑒定受試者的疾病、疾病結(jié)果或者治療方案結(jié)果。
98.一種診斷疾病、決定治療方案或者確定受試者疾病結(jié)果的方法，包括以下步驟
(a)根據(jù)權(quán)利要求1～95中任何一個所述的方法，鑒定來自于從受試者收集的一個或多個樣品的一個或多個核酸分子中一個或多個甲基化或未甲基化的核苷酸；
(b)與同與已知疾病、疾病結(jié)果或者治療方案結(jié)果相關(guān)的一個或多個參考核酸分子比較所述一個或多個核酸分子中的甲基化或未甲基化核苷酸；據(jù)此，不同于參考核酸分子的甲基化或未甲基化核苷酸可以鑒定受試者的疾病、疾病結(jié)果或者治療方案結(jié)果。
99.一種確定與等位基因相關(guān)的一個或多個核苷酸基因座的甲基化狀態(tài)的方法，包括以下步驟
(a)收集含有已知等位基因的核酸分子；
(b)根據(jù)權(quán)利要求1～95中任何一個所述的方法，鑒定含有所述已知等位基因的核酸分子中的一個或多個甲基化或未甲基化核苷酸基因座。
(c)鑒定不含有等位基因的核酸分子中的相應(yīng)核苷酸基因座的甲基化狀態(tài)；
(d)比較含有等位基因的核酸分子中核苷酸基因座的甲基化狀態(tài)與缺乏等位基因的核酸分子中核苷酸基因座的甲基化狀態(tài)，據(jù)此，一個或多個基因座甲基化狀態(tài)頻率的差異可鑒定與等位基因相關(guān)的不同基因座。
100.一種確定與一個或多個核苷酸基因座的甲基化狀態(tài)相關(guān)的等位基因的方法，包括以下步驟
(a)形成第一個含有一個或多個已知甲基化或未甲基化核苷酸基因座的核酸分子集合，所述基因座根據(jù)權(quán)利要求1～95中任何一個所述的方法加以鑒定；
(b)鑒定所述集合的核酸樣品中的一個或多個等位基因存在的頻率；
(c)鑒定第二個核酸分子集合中的一個或多個等位基因的等位基因存在的頻率，所述第二個核酸分子集合相對于第一個集合的核酸分子含有甲基化狀態(tài)不同的核苷酸基因座；以及
(d)比較第一個核酸分子集合中的等位基因頻率與第二個核酸分子集合中的等位基因頻率，據(jù)此，根據(jù)等位基因頻率的差異可鑒定與等位基因相關(guān)的一個或多個基因座。
101.一種確定與等位基因相關(guān)的一個或多個核酸基因座的甲基化狀態(tài)的方法，包括下列步驟
(a)收集含有一個或多個已知甲基化或未甲基化核酸基因座的核酸分子，所述基因座按照權(quán)利要求1～95中任何一個所述的方法加以鑒定；
(b)鑒定一個或多個相對于正常核酸樣品以較高或較低頻率存在的等位基因；以及
(c)鑒定正常核酸樣品中核酸基因座的甲基化狀態(tài)，據(jù)此，根據(jù)一個或多個基因座甲基化狀態(tài)頻率的差異可鑒定與等位基因相關(guān)的不同基因座。
102.一種確定與一個或多個核酸基因座的甲基化狀態(tài)相關(guān)的等位基因的方法，包括下列步驟
(a)收集含有一個或多個已知等位基因的核酸分子；
(b)根據(jù)權(quán)利要求1～95中任何一個所述的方法，鑒定一個或多個相對于正常核酸樣品以較高或較低頻率存在的甲基化或未甲基化核酸基因座；
(c)鑒定正常核酸樣品中所述等位基因的頻率，據(jù)此，根據(jù)等位基因頻率的差異可鑒定與一個或多個甲基化或未甲基化基因座相關(guān)的等位基因。
103.一種確定一個或多個等位基因可能的同一性的方法，包括下列步驟
(a)鑒定核酸分子中一個或多個甲基化或未甲基化核苷酸；以及
(b)根據(jù)權(quán)利要求99～102，確定具有一個或多個甲基化或未甲基化核苷酸的一個或多個等位基因存在的頻率，據(jù)此確定所述等位基因的可能的同一性。
104.根據(jù)權(quán)利要求1～103中任何一個所述的方法，其中所述檢測步驟包括檢測與兩個或多個不同靶核酸分子相應(yīng)的切割產(chǎn)物。
105.根據(jù)權(quán)利要求104所述的方法，其中所述兩個或多個不同的靶核酸分子分別用修飾作為選定核苷酸甲基化狀態(tài)的函數(shù)的選定的核苷酸以生成不同核苷酸的試劑進行處理。
106.根據(jù)權(quán)利要求104所述的方法，其中所述兩個或多個不同的靶核酸分子在用修飾作為選定核苷酸甲基化狀態(tài)的函數(shù)的選定的核苷酸以生成不同核苷酸的試劑處理前進行混合。
107.根據(jù)權(quán)利要求104～105所述的方法，其中所述兩個或多個不同的靶核酸分子分別用引物進行接觸。
108.根據(jù)權(quán)利要求104～106所述的方法，其中所述兩個或多個不同的靶核酸分子在用引物接觸所述靶核酸分子前進行混合。
109.根據(jù)權(quán)利要求104～105或107中任何一個所述的方法，其中所述兩個或多個不同的靶核酸分子在核酸合成條件下分別進行處理。
110.根據(jù)權(quán)利要求104～108的任何一個所述的方法，其中所述兩個或多個不同的靶核酸分子在核酸合成條件下處理前進行混合。
111.根據(jù)權(quán)利要求104～105、107或109中任何一個所述的方法，其中所述兩個或多個不同的靶核酸分子在堿基特異性切割條件下分別進行處理。
112.根據(jù)權(quán)利要求104～110中任何一個所述的方法，其中所述兩個或多個不同的靶核酸分子在堿基特異性切割條件下處理前進行混合。
113.根據(jù)權(quán)利要求1～112中任何一個所述的方法，其中所述堿基特異性切割反應(yīng)是鳥嘌呤特異性切割反應(yīng)。
114.根據(jù)權(quán)利要求1～112中任何一個所述的方法，其中所述堿基特異性切割反應(yīng)是胞嘧啶特異性切割反應(yīng)。
115.根據(jù)權(quán)利要求1～112中任何一個所述的方法，其中所述切割產(chǎn)物的數(shù)量大于引物的靶核酸結(jié)合區(qū)中鳥嘌呤的數(shù)量。
116.根據(jù)權(quán)利要求1～112中任何一個所述的方法，其中所述切割產(chǎn)物的數(shù)量大于引物的靶核酸結(jié)合區(qū)中胞嘧啶的數(shù)量。
117.根據(jù)權(quán)利要求1～116中任何一個所述的方法，其中所述一個或多個甲基化核苷酸基因座定位于核酸分子中引物不與其雜交的區(qū)域。
118.根據(jù)權(quán)利要求1～117中任何一個所述的方法，其中所述質(zhì)量通過質(zhì)譜分析法進行檢測。
119.根據(jù)權(quán)利要求1～117中任何一個所述的方法，其中所述檢測步驟包括檢測所述切割產(chǎn)物的質(zhì)量。
120.根據(jù)權(quán)利要求119所述的方法，其中所述質(zhì)量通過質(zhì)譜分析法進行檢測。
121.根據(jù)權(quán)利要求1～120中任何一個所述的方法，其中所述質(zhì)量通過MALDI-TOF質(zhì)譜分析法進行檢測。
122.根據(jù)權(quán)利要求1～121中任何一個所述的方法，其中所述擴增產(chǎn)物在堿基特異性切割條件下進行切割，而堿基特異性條件選自由化學條件、物理條件、酶性堿基特異性切割條件及其組合所組成的組。
123.根據(jù)權(quán)利要求1～122中任何一個所述的方法，其中所述擴增產(chǎn)物用化合物進行切割，而所述化合物選自由RNase、DNase、堿性化合物、甲酸哌啶、哌啶、硫酸二甲酯、肼、氯化鈉及其組合所組成的組。
124.根據(jù)權(quán)利要求123所述的方法，其中所述RNase選自由RNaseA、RNase T1和RNase U2組成的組。
125.根據(jù)權(quán)利要求1～124中任何一個所述的方法，其中所述擴增產(chǎn)物分成兩等分，并且對第一等分應(yīng)用的堿基特異性切割步驟不同于對第二等分應(yīng)用的堿基特異性切割步驟。
126.根據(jù)權(quán)利要求125所述的方法，其中所述第一等分用RNase A進行處理，所述第二等分用RNase T1進行處理。
127.根據(jù)權(quán)利要求1～126中任何一個所述的方法，其中所述擴增步驟包括轉(zhuǎn)錄。
128.根據(jù)權(quán)利要求127所述的方法，其中所述整合入轉(zhuǎn)錄物的三磷酸核苷包括三個rNTP和一個dNTP。
129.根據(jù)權(quán)利要求128所述的方法，其中所述一個dNTP選自由dCTP、dTTP、dATP和dGTP組成的組。
130.根據(jù)權(quán)利要求128所述的方法，其中所述一個dNTP選自由dCTP、和dTTP組成的組，所述轉(zhuǎn)錄物用RNase A進行切割。
131.根據(jù)權(quán)利要求1～130中任何一個所述的方法，其中所述擴增步驟還包括兩個轉(zhuǎn)錄步驟，其中所述第一個轉(zhuǎn)錄步驟將rATP、rGTP、rCTP和dTTP整合入所述轉(zhuǎn)錄物，所述第二個轉(zhuǎn)錄步驟將rATP、rGTP、rUTP和dCTP整合入所述轉(zhuǎn)錄物。
132.根據(jù)權(quán)利要求131所述的方法，其中所述處理過的靶核酸分子分成兩份，第一個轉(zhuǎn)錄步驟僅應(yīng)用于第一等份，第二個轉(zhuǎn)錄步驟僅應(yīng)用于第二等份。
133.根據(jù)權(quán)利要求1～132中任何一個所述的方法，其中所述擴增步驟包括PCR和轉(zhuǎn)錄，其中PCR產(chǎn)物是雙鏈的，所述轉(zhuǎn)錄步驟包括兩個轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，其中第一個轉(zhuǎn)錄反應(yīng)包括轉(zhuǎn)錄PCR產(chǎn)物第一條鏈，第二個轉(zhuǎn)錄反應(yīng)包括轉(zhuǎn)錄PCR產(chǎn)物第二條鏈。
134.根據(jù)權(quán)利要求133所述的方法，其中所述PCR產(chǎn)物分成兩份，第一份含有PCR產(chǎn)物第一條鏈，第二份含有PCR產(chǎn)物第二條鏈。
135.根據(jù)權(quán)利要求1～134中任何一個所述的方法，其中所述靶核酸分子中一個或多個CpG二核苷酸的胞嘧啶核苷酸的甲基化狀態(tài)加以鑒定。
136.根據(jù)權(quán)利要求135所述的方法，其中所述一個或多個CpG核苷酸定位于基因啟動子區(qū)。
137.根據(jù)權(quán)利要求136所述的方法，其中所述基因啟動子區(qū)是腫瘤抑制啟動子區(qū)。
138.根據(jù)權(quán)利要求1～37中任何一個所述的方法，其中所述靶核酸分子CpG島中一個或多個胞嘧啶核苷酸的甲基化狀態(tài)加以鑒定。
139.根據(jù)權(quán)利要求1～138中任何一個所述的方法，據(jù)此確定未甲基化胞嘧啶。
140.根據(jù)權(quán)利要求17～139中任何一個所述的方法，據(jù)此將未甲基化胞嘧啶修飾以生成尿嘧啶。
141.根據(jù)權(quán)利要求1～140中任何一個所述的方法，其中所述試劑包括亞硫酸氫鹽。
142.根據(jù)權(quán)利要求1～141中任何一個所述的方法，其中所述擴增步驟還包括將第二引物特異性雜交到含有一個或多個胞嘧啶核苷酸的靶核酸分子中預(yù)定第三區(qū)的互補物上，其中第二和第三區(qū)相互不交迭。
143.根據(jù)權(quán)利要求1～142中任何一個所述的方法，其中所述引物的3’一半含有一個或多個鳥嘌呤核苷酸。
144.根據(jù)權(quán)利要求1～143中任何一個所述的方法，其中所述引物的3’末端基本上由鳥嘌呤核苷酸組成。
145.根據(jù)權(quán)利要求1～142中任何一個所述的方法，其中所述引物的3’一半含有一個或多個胞嘧啶核苷酸。
146.根據(jù)權(quán)利要求1～142或145中任何一個所述的方法，其中所述引物的3’末端基本上由胞嘧啶核苷酸組成。
147.根據(jù)權(quán)利要求1～146中任何一個所述的方法，據(jù)此處理過的靶核酸分子含有一個或多個胞嘧啶核苷酸。
148.根據(jù)權(quán)利要求1～147中任何一個所述的方法，其中所述一個或多個樣品測定的質(zhì)量的強度與一個或多個參考物質(zhì)量的強度進行比較。
149.根據(jù)權(quán)利要求1～147中任何一個所述的方法，其中收集兩個或多個核酸樣品，所述一個或多個樣品測定的質(zhì)量的強度與一個或多個參考質(zhì)量的強度進行比較。
150.根據(jù)權(quán)利要求148或149所述的方法，據(jù)此區(qū)分不完全轉(zhuǎn)化的靶核酸分子和甲基化的靶核酸分子。
151.根據(jù)權(quán)利要求1～146中任何一個所述的方法，其中所述第一次測定的質(zhì)量的強度與第二次測定的質(zhì)量的強度進行比較。
152.根據(jù)權(quán)利要求1～146中任何一個所述的方法，其中收集兩個或多個核酸樣品，第一次測定的質(zhì)量的強度與第二次測定的質(zhì)量的強度進行比較。
153.根據(jù)權(quán)利要求151或權(quán)利要求152所述的方法，其中所述第一次和第二次測定的質(zhì)量來自于同一個樣品。
154.根據(jù)權(quán)利要求151或權(quán)利要求152所述的方法，其中所述第一次和第二次測定的質(zhì)量來自于不同樣品。
155.根據(jù)權(quán)利要求151或權(quán)利要求152所述的方法，據(jù)此計算核苷酸基因座的甲基化核苷酸與該核苷酸基因座的未甲基化的核苷酸的比值。
156.一種用于根據(jù)權(quán)利要求1～155中任何一個所述方法鑒定甲基化核酸的組合物。
157.一種用于根據(jù)權(quán)利要求1～155中任何一個所述方法鑒定核酸中甲基化核苷酸的核苷酸基因座的組合物。
158.一種用于鑒定甲基化核酸的組合物，包括
(a)試劑，修飾未甲基化胞嘧啶生成尿嘧啶；
(b)引物，其靶核酸分子結(jié)合區(qū)包含一個或多個鳥嘌呤核苷酸；以及
(c)試劑，用于堿基特異性斷裂擴增的核酸產(chǎn)物。
159.權(quán)利要求158中所述的組合物，還包括第二引物。
160.一種用于鑒定甲基化核酸的組合物，包括
(a)試劑，用于修飾未甲基化胞嘧啶生成尿嘧啶；
(b)引物，其靶核酸分子結(jié)合區(qū)不包含鳥嘌呤核苷酸；以及
(c)試劑，用于堿基特異性斷裂擴增的核酸產(chǎn)物。
161.一種用于鑒定甲基化核酸的組合物，包括
(a)試劑，用于修飾未甲基化胞嘧啶生成尿嘧啶；
(b)引物，其靶核酸分子結(jié)合區(qū)包含一個或多個鳥嘌呤核苷酸；
(c)第二引物，其靶核酸分子結(jié)合區(qū)包含一個或多個胞嘧啶核苷酸；以及
(d)試劑，用于堿基特異性斷裂擴增的核酸產(chǎn)物。
162.根據(jù)權(quán)利要求161中所述的組合物，還包括第二引物。
163.一種用于鑒定甲基化核酸的組合物，包括
(a)試劑，用于修飾未甲基化胞嘧啶生成尿嘧啶；
(b)第一引物，其靶核酸分子結(jié)合區(qū)不包含鳥嘌呤核苷酸；
(c)第二引物，其靶核酸分子結(jié)合區(qū)不包含胞嘧啶核苷酸；以及
(d)試劑，用于堿基特異性斷裂擴增的核酸產(chǎn)物。
164.一種用于鑒定甲基化核酸的組合物，包括
(a)試劑，用于修飾作為選定核苷酸甲基化狀態(tài)的函數(shù)的選定核苷酸以生成不同核苷酸；
(b)引物，含有一個或多個與選定核苷酸互補的核苷酸或者含有一個或多個與不同核苷酸互補的核苷酸；以及
(c)試劑，用于堿基特異性斷裂擴增的核酸產(chǎn)物。
165.根據(jù)權(quán)利要求158～164中任何一個所述的組合物，其中所述用于斷裂擴增的核酸產(chǎn)物的試劑選自由RNase、DNase、堿性化合物、甲酸哌啶、哌啶、硫酸二甲酯、肼、氯化鈉及其組合所組成的組。
166.根據(jù)權(quán)利要求158～165中任何一個所述的組合物，其中所述用于斷裂擴增的核酸產(chǎn)物的試劑選自由RNase A、RNase T1和RNase U2所組成的組。
167.根據(jù)權(quán)利要求158～166中任何一個所述的組合物，其中所述用于修飾選定核苷酸的試劑選自由甲磺酸甲酯(methylmethane sulfonate)、甲磺酸乙酯(ethylmethanesulfonate)、硫酸二乙酯、亞硝基胍(N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍)、亞硝酸、二(2-氯乙基)硫醚、2-氨基嘌呤、t-溴尿嘧啶、羥胺、亞硫酸氫鈉、肼、甲酸、亞硝酸鈉和5-甲基胞嘧啶DNA糖苷酶組成的組。
168.根據(jù)權(quán)利要求158～167中任何一個所述的組合物，其中所述用于修飾核苷酸的試劑是亞硫酸氫鈉。
169.根據(jù)權(quán)利要求158～168中任何一個所述的組合物，還包括第二試劑，用于堿基特異性的斷裂擴增的核酸產(chǎn)物。
170.根據(jù)權(quán)利要求169所述的組合物，其中所述斷裂擴增的核酸產(chǎn)物第二試劑選自由RNase、DNase、堿性化合物、甲酸哌啶、哌啶、硫酸二甲酯、肼、氯化鈉及其組合所組成的組。
171.根據(jù)權(quán)利要求158～170中任何一個所述的組合物，其中所述用于斷裂擴增的核酸產(chǎn)物第二試劑選自由RNase A、RNase T1和RNase U2所組成的組。
172.根據(jù)權(quán)利要求158～171中任何一個所述的組合物，其中所述組合物包括RNase A和RNase T1。
173.根據(jù)權(quán)利要求158～172中任何一個所述的組合物，其中所述組合物還包括一個或多個三磷酸核糖核苷酸。
174.根據(jù)權(quán)利要求158～173中任何一個所述的組合物，其中所述組合物還包括一個或多個三磷酸脫氧核糖核苷酸。
175.根據(jù)權(quán)利要求158～174中任何一個所述的組合物，其中所述組合物還包括一個或多個與一個或多個三磷酸脫氧核糖核苷酸混合的三磷酸核糖核苷酸。
176.根據(jù)權(quán)利要求158～175中任何一個所述的組合物，其中所述組合物還包括核酸合成酶。
177.根據(jù)權(quán)利要求158～176中任何一個所述的組合物，其中所述組合物還包括RNA聚合酶。
178.根據(jù)權(quán)利要求158～177中任何一個所述的組合物，其中所述組合物還包括DNA聚合酶。
179.根據(jù)權(quán)利要求158～178中任何一個所述的組合物，其中所述組合物還包括MALDI基質(zhì)化合物。
180.根據(jù)權(quán)利要求158～179中任何一個所述的組合物，其中所述組合物還包括MALDI底物。
181.一種試劑盒，含有權(quán)利要求158～180中任何一項所述的組合物，可選地包裝有一個或多個用法說明書、試劑、用于使用所述組合物的裝置。
182.根據(jù)權(quán)利要求181所述的試劑盒，其中所述用于使用所述組合物的裝置選自由熱循環(huán)器和質(zhì)譜儀組成的組。
全文摘要
本發(fā)明提供了方法、組合物和試劑盒，該方法、組合物和試劑盒用于鑒定靶核酸分子的甲基化狀態(tài)、靶核酸分子中核苷酸基因座的甲基化狀態(tài)，或者用于鑒定靶核酸分子中一個或多個甲基化或未甲基化核苷酸的基因座。甲基化狀態(tài)通過以下方式進行用可修飾靶核酸分子中一個或多個核苷酸作為靶核酸分子甲基化狀態(tài)的函數(shù)的試劑處理甲基化的靶核酸分子，甲基化特異性擴增靶核酸分子、斷裂擴增產(chǎn)物并且檢測一個或多個片段，從而鑒定靶核酸分子的甲基化狀態(tài)、靶核酸分子中核苷酸基因座的甲基化狀態(tài)、或者靶核酸分子中一個或多個甲基化或未甲基化的核苷酸的基因座。
文檔編號C12Q1/68GK101233240SQ200580017164
公開日2008年7月30日 申請日期2005年3月24日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月26日
發(fā)明者馬蒂亞斯·埃里希, 迪克爾·約翰內(nèi)斯·范德博姆 申請人:斯昆諾有限公司