專利名稱：用于定量微rna和小干擾rna的新方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于檢測(cè)、定量以及監(jiān)控成熟微RNA(microRNA)和小干擾RNA(siRNA)的表達(dá)的核酸、探針和方法。本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于監(jiān)控其它非編碼RNA、mRNA剪接變體的表達(dá)，以及檢測(cè)和定量RNA編輯、單一轉(zhuǎn)錄物的等位基因變體、轉(zhuǎn)錄物中特定外顯子的突變、缺失或重復(fù)，例如與人疾病(如癌)相關(guān)的改變的方法。本發(fā)明此外還涉及用于檢測(cè)和定量靶標(biāo)DNA序列的方法。
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及在多種核酸樣品中定量靶標(biāo)核苷酸序列并且更具體地涉及采用設(shè)計(jì)和使用寡核苷酸探針的方法，所述的探針可用于檢測(cè)和定量感興趣的靶標(biāo)核苷酸序列，特別是RNA靶標(biāo)序列，例如微RNA和siRNA靶標(biāo)序列以及可用于檢測(cè)核酸樣品(例如來自癌患者和健康患者)之間的不同。
微RNA不斷擴(kuò)大的國際序列數(shù)據(jù)庫以及伴隨的代表全部三個(gè)生命領(lǐng)域(細(xì)菌、古細(xì)菌、真核生物)的近200個(gè)基因組的測(cè)序已經(jīng)成為解析生物有機(jī)體為基因、轉(zhuǎn)錄物和蛋白質(zhì)的復(fù)雜分子目錄的過程中的主要驅(qū)動(dòng)力。單個(gè)物種中的遺傳變異的重要性已經(jīng)變得明顯，數(shù)個(gè)重要基因組的遺傳藍(lán)圖的完成后，最終導(dǎo)致在2001年人基因序列的工作草圖的發(fā)表(Lander，Linton，Birren等，2001 Nature 409860-921；Venter，Adams，Myers等，2001 Science 2911304-1351；Sachidanandam，Weissman，Schmidt等，2001 Nature 409928-933)。另一方面，對(duì)源于人和小鼠基因組的轉(zhuǎn)錄物的增加數(shù)量的詳細(xì)的、大規(guī)模的分子分析，以及新近的數(shù)種類型的非蛋白質(zhì)編碼RNA，例如小核RNA、siRNA、微RNA和反義RNA的鑒定，表明更高等真核生物的轉(zhuǎn)錄組(transcriptome)比最先預(yù)計(jì)的要更為復(fù)雜(Wong等，2001，Genome Research 111975-1977；Kampa等，2004，Genome Research14331-342)。
作為中心法則的一個(gè)結(jié)論‘DNA產(chǎn)生RNA，RNA產(chǎn)生蛋白質(zhì)’，RNA僅被認(rèn)為是將基因信息翻譯成蛋白質(zhì)的簡(jiǎn)單分子。最近，據(jù)估計(jì)雖然大部分基因組都發(fā)生了轉(zhuǎn)錄，但高等真核生物中幾乎97％的基因組不編碼蛋白質(zhì)，而推斷是非編碼RNA(Wong等2001，Genome Research111975-1977)。非編碼RNA(ncRNA)看起來特別適于需要高度特異性核酸識(shí)別的調(diào)控作用。因此，對(duì)RNA的認(rèn)識(shí)，快速地從僅為信息分子轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞中的包括多種多樣的結(jié)構(gòu)、信息和催化功能的分子。
最近，大量小的非編碼RNA基因已經(jīng)得以鑒定并稱為微RNA(miRNA)(對(duì)于綜述，參見Ke等，2003，Curr.Opin.Chem.Biol.7516-523)。發(fā)現(xiàn)的第一種miRNA是lin-4和let-7，其為線蟲(C.elegans)中對(duì)不同發(fā)育事件的正常的時(shí)序控制必需的異時(shí)性開關(guān)基因(heterochronic switching gene)。miRNA在廣闊范圍的物種中在進(jìn)化上是保守的并在表達(dá)譜(expression profile)中表現(xiàn)出多樣性，暗示它們具有多種多樣的調(diào)控功能并對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和發(fā)育施加顯著影響(Ke等，2003，Curr.Opin.Chem.Biol.7516-523)。最近研究表明miRNA可以在許多水平上調(diào)節(jié)基因表達(dá)，表現(xiàn)出新的基因調(diào)控機(jī)制并支持這樣的想法，即RNA能夠行使與蛋白質(zhì)相似的調(diào)控作用。理解這種基于RNA的調(diào)控作用將有助于我們理解高等真核生物中基因組的復(fù)雜性以及理解復(fù)雜的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。
miRNA是21-25個(gè)核苷酸(nt)的RNA，從更長(zhǎng)的內(nèi)源性發(fā)夾結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄物加工而來(Ambros等，2003，RNA 9277-279)。根據(jù)由SangerInstitute，UK管理的微RNA登記數(shù)據(jù)庫，迄今為止在人、蠕蟲、果蠅和植物中已經(jīng)鑒定出多于719種微RNA，并且許多對(duì)應(yīng)推定基因(putative gene)的微RNA也已經(jīng)得以鑒定。一些miRNA在基因組中具有多個(gè)基因座(Reinhart等，2002，Genes Dev.161616-1626)并且偶爾地，幾個(gè)miRNA基因排列于串聯(lián)的簇中(Lagos-Quintana等，2001，Science 294853-858)。事實(shí)上，許多到此為止報(bào)道的miRNA僅被分離一次，這暗示許多新miRNA將會(huì)在未來發(fā)現(xiàn)。最近的一項(xiàng)對(duì)人21和22號(hào)染色體的轉(zhuǎn)錄物的深入分析發(fā)現(xiàn)，49％的觀測(cè)到的轉(zhuǎn)錄物已經(jīng)超出了任何已知的注解，并且進(jìn)一步來說，這些新的轉(zhuǎn)錄物既有編碼RNA又有非編碼RNA(Kampa等，2004，Genome Research 14331-342)。迄今鑒定的miRNA可能僅僅代表冰山一角，并且miRNA的數(shù)目可能證明是十分巨大的。
迄今得以表征的微RNA的綜合特征(Ke等，2003，Curr.Opin.Chem.Biol.7516-523；Lee等，1993，Cell 75843-854；Reinhart等，2000，Nature 403901-906)可以總結(jié)如下1.miRNA是約21-25nt的單鏈RNA。
2.它們通過Dicer酶從更長(zhǎng)的內(nèi)源性雙鏈-發(fā)夾結(jié)構(gòu)前體切割而來。
3.miRNA精確地匹配可以潛在地編碼雙鏈發(fā)夾結(jié)構(gòu)形式的前體RNA的基因區(qū)。
4.miRNA及它們預(yù)測(cè)的前體二級(jí)結(jié)構(gòu)在系統(tǒng)進(jìn)化上是保守的。
數(shù)條證據(jù)表明Dicer酶及Argonaute酶在miRNA的生物合成、成熟和功能中是關(guān)鍵的參與者(Grishok等，2001，Cell 10623-24)。miRNA生物合成需要的基因的突變導(dǎo)致遺傳性的發(fā)育缺陷，這種缺陷(至少部分)源于產(chǎn)生miRNA的作用。目前的觀點(diǎn)是，miRNA由Dicer從雙鏈體形式的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的前體切割而來，最初在3’末端具有2或3nt的突出，稱為前-miRNA。輔助因子結(jié)合前-miRNP并解鏈前-miRNA為單鏈miRNA，則前-miRNP然后轉(zhuǎn)化為miRNP。作為miRNP復(fù)合體的一部分的miRNA可以識(shí)別調(diào)控靶標(biāo)。在miRNP和RNA-誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RISC)之間有數(shù)種相似性，包括相似的大小以及兩者都含有RNA解旋酶和PPD蛋白。因此據(jù)報(bào)道m(xù)iRNP和RISC是具有多功能的相同RNP(Ke等，2003，Curr.Opin.Chem.Biol.7516-523)。不同的效應(yīng)物引導(dǎo)miRNA進(jìn)入不同的通路。前-miRNA的結(jié)構(gòu)與這樣的觀測(cè)結(jié)果相一致，即在3’末端具有2或3nt的22nt突出端的RNA雙鏈體有利于蛋白復(fù)合物的重構(gòu)并且可能是短RNA雙鏈體高度特異性結(jié)合至蛋白質(zhì)組分所需要的(對(duì)于綜述，參見Ke等，2003，Curr.Opin.Chem.Biol.7516-523)。
增加的證據(jù)表明miRNA在真核基因調(diào)控中起關(guān)鍵作用。首先發(fā)現(xiàn)的miRNA即lin-4和let-7，與其它異時(shí)性基因的3’非翻譯區(qū)(UTR)中重復(fù)的元件進(jìn)行不完全地堿基配對(duì)，并且通過反義RNA-RNA相互作用直接地和負(fù)調(diào)控性質(zhì)地調(diào)控轉(zhuǎn)錄(Lee等，1993，Cell 75843-854；Reinhart等2000，Nature 403901-906)。其它miRNA據(jù)認(rèn)為通過有限的匹配與靶標(biāo)mRNA相互作用并且也抑制翻譯(Lagos-Quintana等，2001，Science 294853-858；Lee和Ambros 2001，Science 294858-862)。然而，許多研究表明，假如miRNA與它們的靶標(biāo)RNA之間有著完全的互補(bǔ)性，則可導(dǎo)致靶標(biāo)RNA降解而不是抑制翻譯(Hutvanger和Zamore 2002，Science 2972056-2060)，暗示著互補(bǔ)性的程度決定它們的功能。通過鑒定具有相近互補(bǔ)性的序列，數(shù)種靶標(biāo)基因得以預(yù)測(cè)，它們的大部分可能是潛在的細(xì)胞生長(zhǎng)和發(fā)育中關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子。高比例的預(yù)測(cè)的miRNA靶標(biāo)作為發(fā)育調(diào)節(jié)物起作用并且靶標(biāo)位點(diǎn)的保守性暗示miRNA涉及廣范圍的生物體發(fā)育和行為以及細(xì)胞命運(yùn)的決定(綜述參見Ke等，2003，Curr.Opin.Chem.Biol.7516-523)。
微RNA和人疾病miRNA的基因組定位分析表明它們?cè)谌税l(fā)育和疾病中起重要作用。已經(jīng)查明數(shù)種人疾病中miRNA或它們的加工機(jī)制可能牽涉其中。其中一種是脊髓性肌萎縮(SMA)，其為由運(yùn)動(dòng)元神經(jīng)存活(SMN)基因的減少的蛋白質(zhì)水平或喪失功能的突變引起的兒童神經(jīng)變性疾病(Paushkin等人，2002，Curr.Opin.Cell Biol.14305-312)。作為SMN復(fù)合物一部分的兩種蛋白質(zhì)(Gemin3和Gemin4)也是miRNP的組分，然而在SMA中miRNA生物合成或功能是否是失調(diào)以及這對(duì)發(fā)病機(jī)理有什么影響仍然有待研究。另一種與mi/siRNA相關(guān)聯(lián)的神經(jīng)疾病是由脆性X綜合征蛋白(FMRP)的缺失或突變引起的脆性X綜合征(fragile Xmental retardation)(FXMR)(Nelson等，2003，TIBS28534-540)，并且有另外的線索表明miRNA可能在其它神經(jīng)疾病中起作用。然而另一有趣的發(fā)現(xiàn)是miR-224基因座位于兩種不同的神經(jīng)疾病早發(fā)性帕金森綜合征和X-連鎖智力障礙的最小候選區(qū)域內(nèi)(Dostie等，2003，RNA9180-186)。癌和miRNA之間的關(guān)聯(lián)最近也已經(jīng)有描述。在慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)中最頻繁的單基因異常是位于染色體13q14的缺失(50％的病例)。最近的研究確定，兩種不同的miRNA(miR15和miR16)基因形成簇并位于LEU2的內(nèi)含子內(nèi)，該內(nèi)含子位于B-細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞性白血病(B-CLL)腫瘤抑制基因座位的刪除的最小區(qū)域內(nèi)，并且在大部分CLL病例中兩種基因都缺失或受到下調(diào)(Calin等，2002，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.9915524-15529)。據(jù)預(yù)測(cè)miRNA和人疾病之間的聯(lián)系只有伴隨對(duì)miRNA及它們控制的基因網(wǎng)絡(luò)的了解才將會(huì)得以加強(qiáng)。而且，對(duì)RNA-介導(dǎo)的基因表達(dá)的調(diào)控的理解正引起新的治療方法的開發(fā)，這將有可能引起醫(yī)學(xué)實(shí)踐的革命性變化(Nelson等，2003，TIBS 28534-54。)。
小干擾RNA和RNAi最近一些對(duì)大小范圍在21-25nt的小RNA的關(guān)注是由于RNA干擾(RNAi)現(xiàn)象，其中雙鏈RNA導(dǎo)致任何同源RNA的降解(Fire等，1998，Nature 391806-811)。RNAi依賴一種復(fù)合物以及遠(yuǎn)古的細(xì)胞機(jī)制，這種細(xì)胞機(jī)制可能是進(jìn)化用來保護(hù)免受病毒攻擊和移動(dòng)性基因元件的影響。RNAi機(jī)制中的關(guān)鍵步驟是短的干擾RNA(siRNA)的產(chǎn)生，其為每條鏈約22nt長(zhǎng)的雙鏈RNA。siRNA導(dǎo)致同源靶標(biāo)RNA的降解并產(chǎn)生更多對(duì)抗相同靶標(biāo)RNA的siRNA(Lipardi等，2001，Cell 107297-307)。目前對(duì)RNAi的mRNA降解途徑的觀點(diǎn)是，反向平行的Dicer二聚體以ATP-依賴的方式切割長(zhǎng)的雙鏈dsRNA形成siRNA。然后siRNA整合進(jìn)RNA-誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RISC)并且ATP-依賴的siRNA的解鏈激活了RISC(Zhang等，2002，EMBO J.215875-5885；Nyknen等，2001，Cell 107309-321)?；钚訰ISC復(fù)合物因而經(jīng)引導(dǎo)降解了特定的靶標(biāo)mRNA。
微RNA和siRNA的檢測(cè)和分析當(dāng)前的觀點(diǎn)認(rèn)為，miRNA可以代表一種新發(fā)現(xiàn)的、深層隱藏的基因調(diào)控，這已經(jīng)在全世界研究人員中引起了高度的興趣去發(fā)現(xiàn)miRNA、它們的靶標(biāo)和作用機(jī)制。然而，這些小RNA的檢測(cè)和分析并不是沒有價(jià)值的。因此，至今多于700種miRNA的發(fā)現(xiàn)要求人們?nèi)ダ盟鼈兲貏e的特征。首先，研究小組已經(jīng)將miRNA的小的大小用作分離和檢測(cè)的首要標(biāo)準(zhǔn)。主要是因?yàn)樵赾DNA文庫構(gòu)建過程中通過大小選擇通常排除了小的基因，因此，標(biāo)準(zhǔn)的cDNA文庫缺少miRNA。來自果蠅胚、蠕蟲或Hela細(xì)胞的總RNA已經(jīng)按大小分級(jí)，這樣僅25個(gè)核苷酸或更小的分子將得以捕獲(Moss 2002，Curr.Biology 12R138-R140)。使用T4RNA連接酶將合成的寡聚物直接連接至RNA庫。然后將該序列反轉(zhuǎn)錄、通過PCR擴(kuò)增、克隆并測(cè)序(Moss 2002，Curr.Biology 12R138-R140)。隨后用該序列查詢基因組數(shù)據(jù)庫，確認(rèn)來自這些生物體的miRNA的來源，同時(shí)將這些miRNA基因在物理上放入基因組中的其它基因的背景內(nèi)。大量的克隆序列已經(jīng)定位于內(nèi)含子區(qū)域或在偶爾在成簇的基因之間，暗示著串聯(lián)排列的miRNA從單個(gè)轉(zhuǎn)錄物加工而來使得能協(xié)同調(diào)節(jié)。而且，基因組序列已經(jīng)揭示，miRNA前體的回折結(jié)構(gòu)(fold-back structure)(Moss 2002，Curr.Biology 12R138-R140)。
不同miRNA的大小以及有時(shí)候低水平表達(dá)需要使用靈敏的和定量的分析工具。由于它們21-25nt這么小的大小，排除了使用定量實(shí)時(shí)RCR來監(jiān)控成熟miRNA的表達(dá)。因此，大多數(shù)miRNA研究人員目前使用RNA印跡分析結(jié)合聚丙烯酰胺凝膠電泳來檢查成熟的以及前-miRNA兩者的表達(dá)(Reinhart等，2000，Nature 403901-906；Lagos-Quintana等，2001，Science 294853-858；Lee和Ambros 2001，Science 294862-864)。引物延伸也已經(jīng)用來檢測(cè)成熟miRNA(Zeng和Cullen 2003，RNA 9112-123)。作為用于監(jiān)控miRNA表達(dá)工具的所有基于凝膠的測(cè)定法的缺點(diǎn)包括低的處理量和不好的靈敏性。因?yàn)槲㈥嚵芯哂辛己玫奶幚砹?，所以DNA微陣列看起來是用于定量miRNA的RNA印跡分析的好的備選方法。然而，微陣列的缺點(diǎn)是其需要高濃度的輸入靶標(biāo)基因以便進(jìn)行有效的雜交和信號(hào)產(chǎn)生、對(duì)稀少的靶標(biāo)基因敏感性低以及必須使用更靈敏的測(cè)定法如實(shí)時(shí)定量PCR來進(jìn)行微陣列處理后的確認(rèn)，這是不可行的。最近報(bào)道了用cDNA微陣列來監(jiān)控神經(jīng)發(fā)育中miRNA的表達(dá)，該方法使用5-10μg一份的輸入總RNA作為靶標(biāo)基因，但成熟的miRNA必須在微陣列雜交前使用微量濃縮器從miRNA前體分離(Krichevsky等，2003，RNA 91274-1281)。一種PCR方法也已經(jīng)用于測(cè)定成熟miRNA的表達(dá)水平(Grad等，2003，Mol.Cell 111253-1263)。這種方法可用于克隆miRNA，但是對(duì)用于常規(guī)的miRNA表達(dá)分析是十分不切實(shí)際的，因?yàn)樵摲椒ㄉ婕澳z分離小RNA并連接至連接寡核苷酸上。Schmittgen等，(2004，Nucleic Acids Res.32e43)描述了RNA印跡分析的備選方法，其中他們使用實(shí)時(shí)PCR測(cè)定法來定量miRNA前體的表達(dá)。該方法的不利之處是其僅容許定量前體miRNA，而前體miRNA不一定反映成熟miRNA的表達(dá)水平。為了全面描述大量miRNA的表達(dá)，有必要定量成熟miRNA，例如那些在人疾病中表達(dá)的成熟miRNA，其中miRNA生物合成的改變引起了與前體miRNA的那些水平十分不同的成熟miRNA的水平。例如，26種miRNA的前體在來自患者的非-癌性和癌性結(jié)腸直腸組織中同水平表達(dá)，而成熟的人miR143和miR145的表達(dá)在癌組織中較于非癌組織極大地減少，暗示在人疾病中特定miRNA的加工的改變(Michael等，2003，Mol.CancerRes.1882-891)。另一方面，在擬南芥(Arabidopsis thaliana)的miR165和玉米中miR166的最近發(fā)現(xiàn)表明，微RNA作為信號(hào)在植物中確定葉的極性并甚至可以形成可以移動(dòng)的信號(hào)從初生葉下的信號(hào)中心發(fā)散(Juarez等，2004，Nature 42884-88；Kidner and Martienssen2004，Nature 42881-84)。
總而言之，使用實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)量成熟miRNA以及siRNA的最大的挑戰(zhàn)是它們21-25nt這樣小的大小。本發(fā)明描述的方法解決了在檢測(cè)和定量小RNA分子即miRNA及siRNA中前述實(shí)踐的問題，并且目標(biāo)在于確保發(fā)展靈活、方便并且便宜的測(cè)定法來精確地并且特異地定量miRNA和siRNA轉(zhuǎn)錄物。
RNA編輯和選擇剪接
RNA編輯用于描述在RNA分子的一級(jí)序列中的任何特定的改變，不包括其它在機(jī)理上確定了的加工例如選擇性剪接或多腺苷酸化。RNA由于編輯引起的改變分為兩大類，這取決于改變是在堿基水平還是核苷酸水平(Gott 2003，C.R.Biologies 326 901-908)。RNA編輯是十分廣泛的，發(fā)生于哺乳動(dòng)物、病毒、有袋類動(dòng)物、植物、蠅類、青蛙、蠕蟲、烏賊、真菌、粘菌、腰鞭毛蟲、動(dòng)質(zhì)體原生動(dòng)物(kinetoplastid protozoa)及其它單細(xì)胞真核生物?，F(xiàn)在列出的極可能僅代表冰山一角；基于已知的編輯酶的同系物的分布，RNA編輯幾乎無疑發(fā)生在許多其它物種，包括全部的后生動(dòng)物。既然RNA編輯可以以發(fā)育或組織-特異性的方式受到調(diào)節(jié)，其有可能在人疾病的病原學(xué)中起重要作用(Gott 2003，C.R.Biologies 326 901-908)。
真核基因的共同特征是它們由蛋白質(zhì)編碼性外顯子和內(nèi)含子組成。內(nèi)含子的特征是在RNA剪接中從前-mRNA分子切離，內(nèi)含子兩邊的序列剪接在一起。RNA剪接不僅提供功能性的mRNA，而且也負(fù)責(zé)產(chǎn)生另外的多樣性。這種現(xiàn)象稱為選擇性剪接，其導(dǎo)致產(chǎn)生來自相同基因的不同mRNA。代表來自單個(gè)基因的亞型的mRNA可以通過利用備選外顯子或保留打斷兩個(gè)外顯子的內(nèi)含子而不同。該過程常常導(dǎo)致不同的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，這些蛋白質(zhì)產(chǎn)物可能相對(duì)不同或完全不同，甚至具有相反的細(xì)胞功能。不斷有證據(jù)表明，選擇性剪接是十分廣泛的(Croft等，Nature Genetics，2000)。最近的研究已經(jīng)揭示，人基因組中大約35,000種基因的至少80％經(jīng)選擇性剪接(Kampa等，2004，GenomeResearch 14331-342)。顯然，通過組合不同類型的修飾并因而產(chǎn)生不同基因轉(zhuǎn)錄物的不同的可能組合，選擇性剪接與RNA編輯一起是產(chǎn)生蛋白質(zhì)多樣性的有效機(jī)制。對(duì)選擇性剪接變體和RNA編輯的分析，反過來，代表了功能基因組學(xué)、疾病診斷學(xué)和藥物基因組學(xué)的新方法。
作為人疾病致病因子的選擇性剪接的錯(cuò)位控制轉(zhuǎn)錄物的詳細(xì)結(jié)構(gòu)的檢測(cè)是細(xì)胞或組織的分子描述的一個(gè)重要目標(biāo)。沒有檢測(cè)和定量存在于一種組織中的剪接變體的能力，就不能準(zhǔn)確地描述轉(zhuǎn)錄物的含量或蛋白質(zhì)的含量。分子醫(yī)學(xué)研究顯示，許多癌導(dǎo)致剪接變體水平的改變，所以需要檢測(cè)和定量這些轉(zhuǎn)錄物的精確方法。產(chǎn)生異常剪接形式的突變也可以是這種嚴(yán)重疾病如脊髓性肌萎縮和囊性纖維化的首要原因。
多數(shù)對(duì)人疾病的研究，以及多數(shù)遺傳學(xué)研究是基于對(duì)少數(shù)幾種模式生物體的研究。選擇性剪接模式的進(jìn)化穩(wěn)定性以及剪接根據(jù)突變和環(huán)境及細(xì)胞狀況而改變的程度影響著這些模式體系的實(shí)用性。目前，對(duì)選擇性剪接模式或RNA編輯改變的速率(rate)以及影響這些速率的因素知之甚少。
之前，進(jìn)行了其它分析方法來在酵母本身中檢測(cè)RNA轉(zhuǎn)錄物的剪接，或在大鼠組織中檢測(cè)假定的外顯子跳躍剪接(exon skippingsplicing)事件，但這些方法中沒有一種具有足夠的分辨率來估計(jì)剪接變體的量，而剪接變體的量可能是理解細(xì)胞生活周期和疾病中的改變所必需的。因而，需要改良的方法來用于核酸擴(kuò)增、雜交和定量。本發(fā)明目前的方法能夠區(qū)分mRNA剪接變體以及RNA-編輯的轉(zhuǎn)錄物，并能定量核酸樣品，例如源于患者的樣品中的每種變體的量。
真核生物中的反義轉(zhuǎn)錄RNA-介導(dǎo)的基因調(diào)控在高等真核生物中是廣泛存在的，并且復(fù)雜的基因現(xiàn)象如RNA干擾、共抑制、轉(zhuǎn)基因沉默、印記、甲基化，以及可能的位置-效應(yīng)斑駁和轉(zhuǎn)位，全部涉及基于RNA信號(hào)或與RNA信號(hào)關(guān)聯(lián)的交叉途徑(Mattick 2001；EMBO reports 2，11986-991)。最近研究表明反義轉(zhuǎn)錄是小鼠和人基因組中十分普通的現(xiàn)象(Okazaki等，2002；Nature 420563-573；Yelin等，2003，Nature Biotechnol)。因而，真核細(xì)胞，例如人細(xì)胞中基因表達(dá)的反義調(diào)控看起來是普通的調(diào)控機(jī)制。鑒于此，本發(fā)明提供了用于定量非編碼反義RNA的方法，以及用于有義-反義轉(zhuǎn)錄單元之間交疊區(qū)的高精度基因定位的方法。
發(fā)明概述確定基因組功能和理解隱藏在高等真核生物的復(fù)雜轉(zhuǎn)錄組中的信息層面的挑戰(zhàn)要求有新的、改良的技術(shù)來檢測(cè)、分析和定量復(fù)雜核酸樣品中的RNA分子。因而，在同源測(cè)定體系(homogeneous assaysystem)中使用基于特異性的和靈敏的寡核苷酸檢測(cè)探針的方法能夠在真核生物的轉(zhuǎn)錄組中檢測(cè)和定量成熟的微RNA、siRNA、RNA-編輯的轉(zhuǎn)錄物以及高度同源的剪接變體將是十分期望的。
本發(fā)明解決了當(dāng)前上面列舉的同源測(cè)定法的常規(guī)方法面臨的問題，本發(fā)通過提供一種方法用于設(shè)計(jì)、合成并組合使用新的寡核苷酸標(biāo)簽探針和檢測(cè)探針，所述的探針對(duì)短的核酸靶標(biāo)(例如RNA靶標(biāo)序列)具有足夠的序列特異性和高度親和性，這樣它們不太可能檢測(cè)隨機(jī)RNA靶標(biāo)分子并且也不太可能檢測(cè)前-成熟RNA分子。這種標(biāo)簽探針含有一種序列，其錨定于標(biāo)簽探針上，該序列是作為隨后在實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定法中通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的核酸擴(kuò)增的引發(fā)位點(diǎn)所必需的。本發(fā)明方法利用兩種錨定標(biāo)簽探針，每種探針設(shè)計(jì)用來組合檢測(cè)互補(bǔ)的靶標(biāo)序列(例如短的RNA序列)，其中第一種標(biāo)簽探針雜交至靶標(biāo)序列內(nèi)的第一個(gè)區(qū)域以及第二種標(biāo)簽探針雜交至同一互補(bǔ)靶標(biāo)序列內(nèi)的第二個(gè)區(qū)域(例如與第一個(gè)區(qū)域鄰接的短RNA靶標(biāo)序列)。在優(yōu)選的模式中，其中一種標(biāo)簽探針經(jīng)5’磷酸化，使得雜交至互補(bǔ)靶標(biāo)序列的兩種鄰近的標(biāo)簽寡核苷酸探針通過連接酶共價(jià)偶聯(lián)形成單一的寡核苷酸序列。與復(fù)雜的核酸樣品中的靶標(biāo)RNA序列雜交的背景通過使用兩種標(biāo)簽探針除去，其中兩種探針雜交至互補(bǔ)的靶標(biāo)序列(例如短的RNA靶標(biāo)序列)上是共價(jià)偶聯(lián)兩種探針?biāo)枰摹１痉椒ㄟM(jìn)一步利用高度親和性的核酸類似物(例如LNA)代替識(shí)別序列用以靈敏地以及特異性地雜交至短的靶標(biāo)序列(例如miRNA或siRNA)上。連接反應(yīng)后進(jìn)行靶標(biāo)序列的定量實(shí)時(shí)PCR，例如，用核糖核酸即共價(jià)連接的寡核苷酸分子作為模板，用連接于標(biāo)簽探針上的錨定序列作為PCR引物的引發(fā)位點(diǎn)，以及使用具有足夠雙鏈穩(wěn)定性的短的檢測(cè)探針來使得能結(jié)合擴(kuò)增子，并采用同源測(cè)定法中使用的多種檢測(cè)原理中的任意一種進(jìn)行檢測(cè)。在優(yōu)選的模式中，將檢測(cè)探針用雙鏈穩(wěn)定性的、高度親和性的核苷酸類似物(例如LNA，并優(yōu)選氧-LNA)取代，以使得能將短的檢測(cè)探針用于實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定法。
在另一方法中，雜交至核酸樣品中的靶標(biāo)核糖核酸的標(biāo)簽探針的共價(jià)連接用熱穩(wěn)定性連接酶進(jìn)行，這使得能在靶標(biāo)序列標(biāo)記反應(yīng)(tagging reaction)中在高溫下進(jìn)行變性、退火和連接的重復(fù)循環(huán)，因而產(chǎn)生許多共價(jià)連接的模板分子用于隨后的實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定法。在優(yōu)選的模式中調(diào)節(jié)退火溫度而使得能在復(fù)雜核酸分子樣品中區(qū)分高度同源的靶標(biāo)核糖核酸。在另一方面調(diào)節(jié)退火溫度而使得能區(qū)分在高度同源的靶標(biāo)序列間的單個(gè)錯(cuò)配。
然而，在另一方法中，第一種標(biāo)簽探針的識(shí)別序列互補(bǔ)于靶標(biāo)核糖核酸序列中的序列，例如互補(bǔ)于成熟微RNA或siRNA的3’-末端或互補(bǔ)于位于靶標(biāo)核糖核酸序列中的RNA編輯核苷酸、剪接點(diǎn)、單核苷酸多態(tài)性或點(diǎn)突變的3’的序列。所述的第一標(biāo)簽探針(稱為RT標(biāo)簽探針)在使用逆轉(zhuǎn)錄酶的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中用作錨定引物來產(chǎn)生互補(bǔ)于靶標(biāo)RNA序列的引物延伸產(chǎn)物。設(shè)計(jì)第二標(biāo)簽探針(稱為2nd鏈標(biāo)簽探針)而使得其識(shí)別序列互補(bǔ)于逆轉(zhuǎn)錄酶-延伸的核苷酸序列，所述的逆轉(zhuǎn)錄酶-延伸的核苷酸序列對(duì)應(yīng)于成熟微RNA或siRNA的5’-末端或位于核糖核酸靶標(biāo)序列中的RNA編輯的核苷酸、剪接點(diǎn)、單核苷酸多態(tài)性或點(diǎn)突變的5’的序列。2nd鏈標(biāo)簽探針用作錨定引物來產(chǎn)生互補(bǔ)于引物延伸產(chǎn)物的第二條鏈。反應(yīng)的特異性是基于依次使用兩種錨定標(biāo)簽探針，其分別雜交至靶標(biāo)RNA和互補(bǔ)的DNA序列的3’-末端和5’-末端區(qū)域。在優(yōu)選的模式中，用雙鏈穩(wěn)定性的、高度親和性的核苷酸類似物(例如LNA，并優(yōu)選氧-LNA)修飾RT標(biāo)簽探針使得能使用高度嚴(yán)格的引物退火條件。然而，在另一優(yōu)選的模式中，兩種標(biāo)簽探針的識(shí)別序列都用雙鏈穩(wěn)定性的、高度親和性的核苷酸類似物(例如LNA，并優(yōu)選氧-LNA)修飾使得能分別在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和第二鏈合成反應(yīng)中都能使用高度嚴(yán)格的引物退火條件。第二鏈反應(yīng)后將得到的雙鏈靶標(biāo)序列進(jìn)行定量實(shí)時(shí)PCR，所述的雙鏈靶標(biāo)序列對(duì)應(yīng)于錨定的靶標(biāo)核糖核酸序列(例如微RNA序列)，所述的PCR用連接在標(biāo)簽探針上的錨定序列作為PCR引物的引發(fā)位點(diǎn)，并使用具有足夠雙鏈穩(wěn)定性的短檢測(cè)探針來使得能結(jié)合擴(kuò)增子，并采用同源測(cè)定法中使用的多種檢測(cè)原理中的任意一種。在優(yōu)選的模式中，將檢測(cè)探針用雙鏈穩(wěn)定性的、高度親和性的核苷酸類似物(例如LNA，并優(yōu)選氧-LNA)取代，以使得能將短的檢測(cè)探針用于實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定法。在另一優(yōu)選的模式中，檢測(cè)探針進(jìn)一步用雙鏈穩(wěn)定性LNA二氨基嘌呤或LNA 2-硫-T高度親和性類似物以及LNA單體取代。
當(dāng)組合miRNA或siRNA靶標(biāo)特異性標(biāo)簽探針集和miRNA或siRNA檢測(cè)探針時(shí)，本發(fā)明當(dāng)前的方法對(duì)檢測(cè)和定量由幾十萬種不同核酸組成的復(fù)雜混合物中單個(gè)的小RNA分子(例如測(cè)定成熟miRNA或siRNA)是非常有用和適用的。標(biāo)簽探針集以及檢測(cè)探針中的識(shí)別序列通過用高度親和性的核苷酸類似物(例如LNA，以及優(yōu)選氧-LNA)代替來合成，使得能在高溫下發(fā)生高度靈敏和特異性的雜交和連接。通過使用用高度親和性的核苷酸類似物(例如LNA、LNA二氨基嘌呤和LNA 2-硫-胸腺嘧啶脫氧核苷)代替的本發(fā)明的短檢測(cè)探針，對(duì)應(yīng)成熟miRNA或siRNA的短的擴(kuò)增子，包括標(biāo)簽探針集的錨定引物位點(diǎn)，可以直接在標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定法中監(jiān)控。本發(fā)明方法此外在檢測(cè)和定量復(fù)雜核酸樣品中的miRNA或siRNA外的非編碼RNA、反義RNA轉(zhuǎn)錄物、RNA-編輯的轉(zhuǎn)錄物或高度同源的、選擇性剪接轉(zhuǎn)錄物中非常有用，所述的核酸樣品是例如人、小鼠、大鼠、美麗線蟲(C.elegans)、果蠅(Drosophila melanogaster)、擬南芥(Arabidopsis thaliana)、稻和玉米轉(zhuǎn)錄組，在它們各自的轉(zhuǎn)錄組中由幾十萬種不同核糖核酸組成。本方法也直接可應(yīng)用于檢測(cè)、測(cè)試、診斷或定量在復(fù)雜的人核酸樣品(例如來自癌患者的樣品)中涉及或與人疾病關(guān)聯(lián)的miRNA、siRNA、其它非編碼RNA、RNA-編輯的轉(zhuǎn)錄物或選擇性mRNA剪接變體。
附圖
簡(jiǎn)述Fig.1是本發(fā)明用于通過序列-特異性實(shí)時(shí)定量RT-PCT定量微RNA的一種方法的圖示。
Fig.2A顯示用于人miR-15a微RNA靶標(biāo)序列的實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增曲線。將序列特異性LNA-修飾的微RNA標(biāo)簽探針退火并連接，然后使用實(shí)時(shí)PCR、錨定PCR引物和LNA-修飾的miR-15a微RNA的雙-標(biāo)記檢測(cè)探針測(cè)定連接的標(biāo)簽探針(實(shí)心正方形)，用負(fù)模板作為陰性對(duì)照(十字)。反應(yīng)的特異性用沒有連接酶的反應(yīng)測(cè)試(空心正方形)。使用miR-15a微RNA模板的連接了的微RNA探針的閾值循環(huán)數(shù)(Ct)是35.0，而陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)(負(fù)模板和負(fù)連接酶)沒有檢測(cè)到Ct值。ΔRn是基線校正的標(biāo)準(zhǔn)化報(bào)告信號(hào)(Rn)并表示在開始的幾個(gè)PCR循環(huán)中確定的Rn減去基線信號(hào)。Fig.2B顯示在用Gelstar(1∶10000稀釋，Cambrex Bio Science，USA)染色的2％瓊脂糖凝膠電泳上的實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)的終末點(diǎn)分析。連接了的miR-15a標(biāo)簽探針模板顯示了在泳道1中的PCR片段(～65bp)。陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)(負(fù)模板(泳道2))和負(fù)連接酶(泳道3)顯示了比連接了的mir-15a標(biāo)簽探針模板短的具有低分子量的片段。在實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)中無模板的對(duì)照(NTC)在瓊脂糖凝膠電泳沒有任何片段(不顯示)。
Fig.3顯示用于人miR-15a微RNA靶標(biāo)序列和相應(yīng)的DNA 3’-封閉靶標(biāo)序列的實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增曲線。RNA模板(實(shí)心正方形)替換為在3’-末端用磷酸化學(xué)封閉的DNA模板(實(shí)心三角形)。沒有連接酶(空心三角形)，封閉的DNA模板在LNA序列-特異性實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)法中不能檢測(cè)到。RNA模板和DNA模板的Ct值分別是35.0和33.3。
Fig.4顯示人miR-15a和人miR-16微RNA靶標(biāo)序列的實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增曲線。本發(fā)明方法的序列-特異性微RNA靶標(biāo)序列識(shí)別通過使用miR-15a微RNA靶標(biāo)序列(實(shí)心正方形)相對(duì)于使用與miR-15a靶標(biāo)序列具有72％序列一致性的miR-16靶標(biāo)序列(空心圓形)來評(píng)估。在實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)中負(fù)模板對(duì)照(十字)和NTC(黑的垂直線)都沒顯示產(chǎn)生任何信號(hào)。用于將LNA-修飾的miR-15a靶標(biāo)序列-特異性的標(biāo)簽探針退火至miR-15a靶標(biāo)序列的雜交條件得到36.2的Ct值，而將相同標(biāo)簽探針用于高度同源的miR-16得到39.9的Ct值，對(duì)應(yīng)13-倍的辨別差異。
Fig.5顯示了使用兩種不同的LNA-修飾的、雙標(biāo)記的檢測(cè)探針的用于人miR-15a微RNA的實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增曲線。設(shè)計(jì)兩種不同的LNA-修飾的實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)探針用于人miR-15a微RNA靶標(biāo)序列，其使用了由Quick T4 DNA連接試劑盒連接的相同的LNA-修飾的標(biāo)簽探針。在實(shí)時(shí)PCR測(cè)定法中LNA-修飾的檢測(cè)探針EQ15866(實(shí)心正方形)和EQ15867(實(shí)心三角形)的使用分別得到38.2和32.2的Ct值。從負(fù)連接酶對(duì)照(EQ15866，空心正方形；EQ15867，空心三角形)中沒有檢測(cè)到信號(hào)。
Fig.6顯示了使用不同摩爾比的靶標(biāo)序列和miR-15a標(biāo)簽探針的用于人miR-15a靶標(biāo)序列的實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增曲線。靶標(biāo)序列和標(biāo)簽探針之間的摩爾比是1∶1(實(shí)心正方形)時(shí)得到最高的終末點(diǎn)熒光信號(hào)(ΔRn值)，而1∶5的摩爾比(空心菱形)得到最低的終末點(diǎn)信號(hào)(ΔRn值)。摩爾過量的miR-15a標(biāo)簽探針(1∶5的摩爾比(實(shí)心菱形))也導(dǎo)致特異性的終末點(diǎn)信號(hào)，盡管在PCR反應(yīng)中從NTC中沒有檢測(cè)到熒光信號(hào)。
Fig.7顯示了使用miR-15a標(biāo)簽探針和最好模式的LNA-修飾的檢測(cè)探針的實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增曲線，所述的PCR用于摻入進(jìn)復(fù)雜的Torulla酵母總RNA背景的人miR-15a靶標(biāo)序列。miR-15a微RNA分別以2.4μM(空心正方形)和1μM(空心圓)濃度摻入至10μg的酵母總RNA，以等摩爾濃度與miR-15a標(biāo)簽探針退火，然后連接并通過定量實(shí)時(shí)PCR進(jìn)行miR-15a檢測(cè)。從miR-15a靶標(biāo)序列對(duì)照(無復(fù)雜酵母總RNA背景)(實(shí)心正方形)觀測(cè)到最高的熒光信號(hào)，而從酵母總RNA樣品沒有檢測(cè)到信號(hào)(垂直線)。如NTC(十字)表明的，沒有觀測(cè)到實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)的污染。
Fig.8顯示用于人miR-15a微RNA靶標(biāo)序列的實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增曲線。將序列-特異性LNA-修飾的微RNA標(biāo)簽探針退火，連接，并然后用實(shí)時(shí)PCR、錨定PCR引物和SYBR綠檢測(cè)(實(shí)心正方形)檢測(cè)連接了的模板，用負(fù)模板作為陰性對(duì)照(十字)。反應(yīng)的特異性用沒有連接酶的反應(yīng)測(cè)試(空心菱形)。
Fig.9是本發(fā)明用于通過序列-特異性實(shí)時(shí)定量RT-PCT定量微RNA的一種方法的圖示。
Fig.10顯示了DNA、LNA和RNA核苷的結(jié)構(gòu)。
Fig.11是本發(fā)明用于通過序列-特異性實(shí)時(shí)定量RT-PCT定量微RNA的一種方法的圖示。
Fig.12顯示了LNA 2，6-二氨基嘌呤和LNA 2-硫代胸腺嘧啶脫氧核苷的結(jié)構(gòu)。
Fig.13顯示了用于人miR-15a微RNA的實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增曲線，所述的PCR使用三種不同miR-15a標(biāo)簽探針對(duì)以微RNA為模板進(jìn)行連接(I；EQ16311/EQ16452，II；EQ16453/EQ16307，和III；EQ16447/EQ16307)。對(duì)ImiR-15a模板(實(shí)心正方形)、無模板(空心正方形)和無T4DNA連接酶(空心菱形)，對(duì)IImiR-15a模板(實(shí)心三角形)、無模板(空心三角形)和無T4DNA連接酶(虛線)，對(duì)IIImiR-15a模板(實(shí)心圓)、無模板(空心圓)和無T4DNA連接酶(黑線)。
Fig.14顯示了實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增曲線，顯示了改良的對(duì)人miR-15a微RNA檢測(cè)，該P(yáng)CR通過以微RNA為模板進(jìn)行連接并使用LNA2，6-二氨基嘌呤-增強(qiáng)的miR-15a檢測(cè)探針。檢測(cè)探針EQ16580對(duì)應(yīng)實(shí)心正方形，EQ16581對(duì)應(yīng)實(shí)心三角形，EQ16582對(duì)應(yīng)實(shí)心圓以及EQ16583對(duì)應(yīng)十字，以及相應(yīng)的無模板對(duì)照；EQ16580對(duì)應(yīng)空心正方形、EQ16581對(duì)應(yīng)空心三角形、EQ16582對(duì)應(yīng)空心圓以及EQ16583對(duì)應(yīng)黑線。
Fig.15是人miR-15a的實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定法的標(biāo)準(zhǔn)曲線。LNA-修飾的人miR-15a微RNA標(biāo)簽探針EQ16311/EQ16452(對(duì)I)用于以miR-15a為模板的連接反應(yīng)，其中人miR-15a模板濃度分別是50、5、0.5、0.05或0.005nM。連接了的模板然后用實(shí)時(shí)PCR進(jìn)行檢測(cè)，所述的PCR使用錨定PCR引物和miR-15a微RNA的LNA-修飾的雙標(biāo)記檢測(cè)探針EQ15866，負(fù)模板用作陰性對(duì)照。循環(huán)閾值對(duì)模板拷貝數(shù)的log值的曲線用來產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線。
Fig.16顯示了實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增曲線來說明對(duì)人mir-15a微RNA的檢測(cè)，所述的PCR擴(kuò)增使用miR-15a微RNA為模板的RT-PCR反應(yīng)和不同的LNA-修飾的錨定標(biāo)簽探針和LNA-修飾的雙標(biāo)記檢測(cè)探針。選取了三種不同的微RNA RT-PCR標(biāo)簽探針對(duì)，對(duì)IVEQ16591/EQ16311，miR-15模板(實(shí)心正方形)，無模板(黑mark)；對(duì)VEQ16591/EQ16314，miR-15模板(實(shí)心菱形)，無模板(空心三角形)；以及對(duì)VIEQ16589/EQ16314，miR-15模板(實(shí)心圓)，無模板(黑線)?？招膱A表示無RT-PCR酶的混合對(duì)照。
Fig.17顯示了通過微RNA為模板的RT-PCR說明改良的對(duì)人miR-15a微檢測(cè)的實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增曲線，所述的實(shí)時(shí)定量PCR使用LNA 2，6-二氨基嘌呤增強(qiáng)的miR-15a檢測(cè)探針。不同的雙標(biāo)記檢測(cè)探針顯示如下EQ16580(實(shí)心三角形)、EQ16581(實(shí)心正方形)、EQ16582(實(shí)心正方形)檢測(cè)探針和無模板陰性對(duì)照(實(shí)線)。
Fig.18是人miR-15a的實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定法的標(biāo)準(zhǔn)曲線。人miR-15a的LNA-修飾的微RNA標(biāo)簽探針EQ16624/EQ16620(對(duì)VII)用作反轉(zhuǎn)錄引物(RT標(biāo)簽探針)和2nd鏈標(biāo)簽探針。RT-PCR反應(yīng)分別用50、5、0.5、0.05或0.005nM濃度的miR-15a模板進(jìn)行。然后通過使用錨定PCR引物和miR-15a微RNA的LNA-修飾的雙標(biāo)記檢測(cè)探針(EQ16582)用實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)miR-15a。循環(huán)閾值對(duì)模板拷貝數(shù)的log值的曲線用來產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線。
Fig.19顯示了通過微RNA為模板的RT-PCR反應(yīng)的實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增曲線，該曲線說明了對(duì)人miR-15a的檢測(cè)，所述的實(shí)時(shí)定量PCR使用60℃(實(shí)心三角形)、55℃(實(shí)心正方形)和50℃(實(shí)心菱形)不同的退火溫度。無RT-PCR酶的混合對(duì)照和無模板負(fù)對(duì)照沒有檢測(cè)到信號(hào)。
Fig.20顯示了實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增曲線，說明了對(duì)人mir-15a微RNA的檢測(cè)，所述的PCR擴(kuò)增使用了miR-15a微RNA為模板的RT-PCR反應(yīng)和不同LNA-修飾的雙標(biāo)記檢測(cè)探針。不同的雙標(biāo)記檢測(cè)探針顯示如下miR-15a為模板的實(shí)時(shí)PCR和檢測(cè)探針EQ16582(實(shí)心三角形)，混雜的miR-16為模板的實(shí)時(shí)PCR和檢測(cè)探針EQ16582(空心三角形)，miR-15a為模板的實(shí)時(shí)PCR和檢測(cè)探針EQ16679(實(shí)心圓)，混雜的miR-16為模板的實(shí)時(shí)PCR和檢測(cè)探針EQ16679(空心圓)，并且無RT-PCR酶的混合對(duì)照和無模板負(fù)對(duì)照沒有檢測(cè)到信號(hào)。
Fig.21顯示了實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增曲線，說明了對(duì)人mir-15a微RNA的檢測(cè)，所述的PCR擴(kuò)增使用miR-15a微RNA為模板的RT-PCR反應(yīng)和LNA-修飾的錨定標(biāo)簽探針和LNA-修飾的雙標(biāo)記檢測(cè)探針。樣品顯示如下miR-15a為模板的實(shí)時(shí)PCR(實(shí)心三角形)、混雜的miR-16為模板的實(shí)時(shí)PCR(實(shí)心正方形)、無Superscript III的陰性對(duì)照(空心正方形)和無模板陰性對(duì)照(空心三角形)。
Fig.22是本發(fā)明用于通過序列-特異性實(shí)時(shí)定量RT-PCT定量微RNA的一種方法的圖示。
Fig.23顯示了使用微RNA為模板的RT-PCR反應(yīng)的實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增曲線，證明了改良的對(duì)人miR-15a的檢測(cè)，所述的實(shí)時(shí)定量PCR使用LNA 2，6-二氨基嘌呤增強(qiáng)的miR-15a檢測(cè)探針。該圖形說明了miR-15a微RNA靶標(biāo)序列(空心圓)與miR-16靶標(biāo)序列(實(shí)心三角形)的比較，后者與miR-15a靶標(biāo)序列有72％的序列一致性。陰性對(duì)照是沒有微RNA的封閉標(biāo)簽探針(空心三角形)、沒有第二鏈LNA標(biāo)簽探針(實(shí)心正方形)和無Klenow片段(3’→5’外切-)酶(空心正方形)，但是在實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)中，無hsa-miR-15a反向引物2對(duì)照(線形)或無Qiagen OneStep RT-PCR酶混合物對(duì)照(線)中沒有觀測(cè)到信號(hào)。
Fig.24是人miR-15a的實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)的擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線(小圖)。將LNA-修飾的人miR-15a微RNA標(biāo)簽探針EQ1695和EQ16624(對(duì)IX)用于miR-15a為模板的RT-PCR反應(yīng)，3’-封閉的LNA-修飾的標(biāo)簽探針用作捕獲序列，其中在各個(gè)試驗(yàn)中成熟人miR-15a模板分別是500、50、5、0.5或0.05fmol。然后用實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)該模板的miR-15a微RNA，所述PCR通過使用錨定PCR引物和LNA-修飾的雙標(biāo)記檢測(cè)探針EQ15866來進(jìn)行，負(fù)模板用作陰性對(duì)照。循環(huán)閾值對(duì)模板拷貝數(shù)的log值的曲線用來產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線。
Fig.25顯示了證明對(duì)人U6 snRNA為模板的RT-PCR反應(yīng)的檢測(cè)的實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增曲線，所述的PCR使用LNA檢測(cè)探針和1μL cDNA模板(實(shí)心正方形)、5μL cDNA模板(空心正方形)和無模板陰性對(duì)照(空心三角形)。
Fig.26顯示了實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增曲線，該曲線說明了對(duì)hsamiR-7a為模板的TR-PCR的檢測(cè)，所述的PCR產(chǎn)生了足夠量信號(hào)的S形的擴(kuò)增曲線，Ct值為18.5。
Fig.27是本發(fā)明用于通過序列-特異性實(shí)時(shí)定量RT-PCT定量微RNA的一種方法的圖示。
Fig.28是本發(fā)明用于通過序列-特異性實(shí)時(shí)定量RT-PCT定量微RNA的一種方法的圖示。
Fig.29顯示了部分的Hsa miR-15a前體序列、成熟的Hsa miR-15a序列以及本發(fā)明的一種方法的圖示，所述的方法通過序列-特異性實(shí)時(shí)定量RT-PCR用于定量微RNA。
Fig.30顯示了部分的Hsa miR-143前體序列、成熟的Hsa miR-143序列以及本發(fā)明的一種方法的圖示，所述的方法通過序列-特異性實(shí)時(shí)定量RT-PCR用于定量微RNA。
Fig.31是本發(fā)明用于通過序列-特異性實(shí)時(shí)定量RT-PCT定量微RNA的一種方法的圖示。
Fig.32顯示用于人miR-143微RNA靶標(biāo)序列的實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增曲線。本檢測(cè)法根據(jù)Fig.31中的圖示進(jìn)行并如實(shí)施例30中描述?？招恼叫伪硎驹趯?shí)施例30步驟2中純化了的反應(yīng)，實(shí)心正方形表示在實(shí)施例30的第2步中沒有純化的反應(yīng)。沒有從基線上升的曲線表示對(duì)應(yīng)的“無miR”-對(duì)照。
Fig.33是本發(fā)明的一種方法的圖示，所述的方法用于通過序列-特異性實(shí)時(shí)定量RT-PCT定量微RNA。
Fig.34顯示了部分的Hsa miR-143前體序列、成熟的Hsa miR-143序列以及本發(fā)明的-種方法的圖示，所述的方法通過序列-特異性實(shí)時(shí)定量RT-PCR用于定量微RNA。
Fig.35顯示了實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增曲線，其證明了RNA接頭與成熟微RNA的連接和隨后的逆轉(zhuǎn)錄，并且實(shí)時(shí)PCR使用具有淬滅基團(tuán)Q2的LNA-修飾的檢測(cè)探針。bsa-let-7a對(duì)應(yīng)空心正方形、hsa-let-7g對(duì)應(yīng)實(shí)心正方形、無miRNA對(duì)應(yīng)空心三角形，以及無PCR模板對(duì)照對(duì)應(yīng)實(shí)心三角形。
Fig.36是本發(fā)明的一種方法的圖示，所述的方法用于通過序列-特異性實(shí)時(shí)定量RT-PCT定量微RNA。
Fig.37是本發(fā)明的一種方法的圖示，所述的方法用于通過序列-特異性實(shí)時(shí)定量RT-PCT定量微RNA。
定義為了后面詳細(xì)描述本發(fā)明這個(gè)目的，為特定術(shù)語提供以下的定義，所述的術(shù)語用于本發(fā)明的公開內(nèi)容。
在下文中，“封閉探針”指一種探針，其含有與靶標(biāo)序列(例如短的RNA靶標(biāo)序列、寡核苷酸、引物)互補(bǔ)的識(shí)別序列。所述的封閉序列用于防止序列相同的分子與互補(bǔ)的靶標(biāo)序列雜交。一般而言，封閉序列含有一個(gè)、兩個(gè)或更多LNA單體并且封閉探針的3’-末端經(jīng)修飾以抑制封閉探針整合進(jìn)引物延伸產(chǎn)物內(nèi)。這種“封閉”可以通過使用非互補(bǔ)的堿基或通過加入化學(xué)部分如生物素或磷酸基團(tuán)至最后的核苷酸的3’-羥基基團(tuán)而達(dá)到。
在下文中，“dNTP”表示2′-脫氧腺苷-5’-三磷酸、2′-脫氧胞苷-5’-三磷酸，2′-脫氧鳥苷-5’-三磷酸和2′-脫氧胸苷-5’-三磷酸的混合物。
“RT-引物”指一種引物，其含有與靶標(biāo)脫氧核糖核酸和/或核糖核酸序列中的序列互補(bǔ)的識(shí)別序列，例如與成熟的微RNA或siRNA的3’-末端或與RNA-DNA嵌合體，或與位于靶標(biāo)核糖核酸序列中的RNA-編輯的核苷酸、剪接點(diǎn)、單核苷酸多態(tài)性或點(diǎn)突變的3’的序列互補(bǔ)的識(shí)別序列，并含有隨后的捕獲或PCR擴(kuò)增所必需的錨定序列。所述的RT-引物在使用逆轉(zhuǎn)錄酶的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中用作錨定引物來產(chǎn)生互補(bǔ)于靶標(biāo)RNA序列的引物延伸產(chǎn)物。
術(shù)語“捕獲探針”指一種探針，其含有互補(bǔ)于靶標(biāo)序列(如短的RNA靶標(biāo)序列)的識(shí)別序列和隨后的捕獲、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)或PCR擴(kuò)增所必需的錨定序列。錨定序列用作隨后的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)、實(shí)時(shí)PCR的RT-或PCR引物的引發(fā)位點(diǎn)，或作為捕獲檢測(cè)法的標(biāo)簽。
在本文中，術(shù)語“連接物”表示在熱化學(xué)上和光化學(xué)上無活性的產(chǎn)生間隔(distance-making)的基團(tuán)，其用于連接兩個(gè)或多個(gè)不同的上面定義的類型的核苷酸部分。連接序列是基于不同的性質(zhì)而選擇的，這些性質(zhì)包括疏水性、親水性、分子柔性和長(zhǎng)度(例如，參見Hermanson等，″Immobilized Affinity Ligand Techniques″，Academic Press，San Diego，California(1992)，p.137-ff)。一般而言，連接序列的長(zhǎng)度少于或約400埃，在一些應(yīng)用中優(yōu)選少于100埃。因而，連接序列含有一條任選由一個(gè)或多個(gè)雜原子(例如氧原子、氮原子，和/或硫原子)打斷或以它們結(jié)尾的碳原子鏈。因而，連接序列可以含有一個(gè)或多個(gè)酰胺、酯、氨基、醚和/或硫醚官能團(tuán)，并任選為芳香的或單/多不飽和烴、聚氧乙烯(如聚乙二醇)、寡/聚酰胺(例如多聚-(3-丙氨酸)、多聚甘氨酸、多聚賴氨酸)和肽，一般是低聚糖、寡/多聚磷酸酯。而且連接序列可以由它們的組合單位組成。連接序列的長(zhǎng)度可以不同，這要考慮關(guān)于5-或6-元環(huán)的涉及基團(tuán)的“活性/官能性”部分的理想的或必需的定位和空間取向。在特別感興趣的實(shí)施方案中，連接序列包括可化學(xué)裂解的基團(tuán)。這種可化學(xué)裂解基團(tuán)的實(shí)例包括在還原條件下可裂解的二硫化物基團(tuán)、可由肽酶裂解的肽片段等。
在本文中，“固體支持物”可以選自廣泛圍的聚合物材料，例如CPG(可控多孔玻璃)、聚丙烯、聚苯乙烯、聚碳酸酯或聚乙烯，并且可以采用不同的形式，例如管、微量滴定孔板、棒、珠、粒子、慮器等。寡核苷酸可以經(jīng)由其5’-或3’-末端(或經(jīng)由連接至5’-或3’-末端的連接物的末端)固定于固體支持物上，這可通過多種通常在寡核苷酸的固定中采用的化學(xué)或光化學(xué)方法或通過非-共價(jià)偶聯(lián)(例如通過將生物素化的寡核苷酸與固定化的鏈霉親和素結(jié)合)來進(jìn)行。
“環(huán)狀引物”指一種探針，其含有與靶標(biāo)脫氧核糖核酸序列中的序列互補(bǔ)的識(shí)別序列，所述的識(shí)別序列與對(duì)應(yīng)于成熟微RNA或siRNA的5’-末端或位于最初的核糖核酸靶標(biāo)序列中的RNA編輯的核苷酸、剪接點(diǎn)、單核苷酸多態(tài)性或點(diǎn)突變的5’的逆轉(zhuǎn)錄酶-延伸的核苷酸序列互補(bǔ)，還含有對(duì)于隨后的捕獲或PCR擴(kuò)增所必需的錨定序列，所述的環(huán)狀引物用作錨定引物來產(chǎn)生與引物延伸產(chǎn)物互補(bǔ)的第二核酸鏈。環(huán)狀引物的另一方面是，錨定序列在選定的測(cè)定溫度下形成一個(gè)分子內(nèi)的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)的形成由在該寡核苷酸的5’-和3’-末端的互補(bǔ)序列介導(dǎo)。反應(yīng)的特異性是基于依次使用具有不交疊的識(shí)別序列的兩種錨定標(biāo)簽探針，其分別雜交至靶標(biāo)RNA和互補(bǔ)DNA序列的3’-末端和5’-末端區(qū)域。
“發(fā)夾結(jié)構(gòu)”指在選定的檢測(cè)溫度下的寡核苷酸的分子內(nèi)結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)由該寡核苷酸的5’-和3’-末端的互補(bǔ)序列的雜交介導(dǎo)。
“U”指酶單位，其定義為在給定時(shí)間和溫度下轉(zhuǎn)化給定量的反應(yīng)物為產(chǎn)物所需的酶的量。
在本文中，“配體”指能結(jié)合的一些物質(zhì)。配體包括生物素和官能基團(tuán)，例如芳香基團(tuán)(例如苯、吡啶、萘、蒽和菲)、雜芳基團(tuán)(例如噻吩、呋喃、四氫呋喃、吡啶、二噁烷和嘧啶)、羧酸、羧酸酯、碳酰鹵、碳酰疊氮化物、碳酰肼、磺酸、磺酸酯、磺酰鹵、氨基脲、氨基硫脲、醛、酮、伯醇、仲醇、叔醇、酚、烷基鹵、硫醇、二硫化物、伯胺、仲胺、叔胺、肼、環(huán)氧化物、馬來酰亞胺、任選由一個(gè)或多個(gè)雜原子(例如氧原子、氮原子和/或硫原子)打斷或以它們結(jié)尾的C1-C20烷基，其任選含有芳香的或單/多不飽和烴、聚氧乙烯(如聚乙二醇)、寡/聚酰胺(例如多聚β-丙氨酸、多聚甘氨酸、多聚賴氨酸)、肽、寡/多聚糖、寡/多聚磷酸酯、毒素、抗生素、細(xì)胞毒素和類固醇，以及還有″親合性配體″，即對(duì)特定蛋白質(zhì)、抗體、多-和寡糖及其它生物分子上的位點(diǎn)具有特異親合性的官能團(tuán)或生物分子。
單數(shù)形式“a”、“an”和“the”包括復(fù)數(shù)指代，除非文中清楚地另外指出。例如，術(shù)語“細(xì)胞”包括多個(gè)細(xì)胞，包括它們的混合物。術(shù)語“核酸分子”包括多個(gè)核酸分子。
“轉(zhuǎn)錄組”指任何物種的基因組的轉(zhuǎn)錄單位的全部總和。除了編碼蛋白質(zhì)的mRNA，其也代表非編碼RNA，例如小的核仁RNA、siRNA、微RNA和反義RNA，其在細(xì)胞中包含重要的結(jié)構(gòu)和調(diào)節(jié)功能。
術(shù)語“擴(kuò)增子”指小的、復(fù)制的DNA片段。
“樣品”指細(xì)胞或從生物體分離的組織或液體樣品，包括(但不限于)，例如皮膚、血漿、血清、脊髓液、淋巴液、滑液、尿、淚液、血細(xì)胞、器官、腫瘤，并且也指體外細(xì)胞培養(yǎng)成分的樣品(包括但限于細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)基中生長(zhǎng)產(chǎn)生的條件培養(yǎng)基、重組細(xì)胞及細(xì)胞組分)。
“生物”指生活實(shí)體，包括但不限于，例如，人、小鼠、大鼠、果蠅、美麗線蟲、酵母、擬南芥、玉米、稻、斑馬魚、靈長(zhǎng)類、家畜等。
“標(biāo)簽探針”指探針，其含有與靶標(biāo)序列(例如短的RNA靶標(biāo)序列)互補(bǔ)的識(shí)別序列和隨后捕獲或PCR擴(kuò)增所需的錨定序列?！皟煞N標(biāo)簽探針”或“標(biāo)簽探針對(duì)”指兩種錨定標(biāo)簽探針，每種設(shè)計(jì)來組合檢測(cè)短的互補(bǔ)靶標(biāo)序列(例如短的RNA序列)，其中第一種標(biāo)簽探針的識(shí)別序列雜交至靶標(biāo)序列內(nèi)的第一個(gè)區(qū)域并且第二個(gè)標(biāo)簽探針的識(shí)別序列雜交至相同互補(bǔ)靶標(biāo)序列內(nèi)的第二個(gè)區(qū)域(例如鄰接第一個(gè)區(qū)域的短的RNA靶標(biāo)序列)。在本發(fā)明方法中，其中一種標(biāo)簽探針經(jīng)5’磷酸化，使得雜交至互補(bǔ)的靶標(biāo)序列的兩種鄰近的、非交疊的標(biāo)簽寡核苷酸探針通過連接酶共價(jià)偶聯(lián)形成單條寡核苷酸序列。連接至標(biāo)簽探針的錨定序列經(jīng)設(shè)計(jì)而使得它們?cè)诒景l(fā)明方法中使用的雜交條件下不與給定轉(zhuǎn)錄組中的任何靶標(biāo)核酸或相互之間發(fā)生交叉-雜交。錨定序列用作隨后實(shí)時(shí)定量PCR的PCR引發(fā)位點(diǎn)，或作為捕獲檢測(cè)法的標(biāo)簽。
“RT標(biāo)簽探針”指一種探針，其含有與靶標(biāo)核糖核酸序列中的序列互補(bǔ)的識(shí)別序列，例如與成熟的微RNA或siRNA的3’-末端或與位于靶標(biāo)核糖核酸序列中的RNA-編輯的核苷酸、剪接點(diǎn)、單核苷酸多態(tài)性或點(diǎn)突變的3’的序列互補(bǔ)的識(shí)別序列，并含有隨后的捕獲或PCR擴(kuò)增所必需的錨定序列。所述的RT標(biāo)簽探針在使用逆轉(zhuǎn)錄酶的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中用作錨定引物來產(chǎn)生互補(bǔ)于靶標(biāo)RNA序列的引物延伸產(chǎn)物?！?nd鏈標(biāo)簽探針”指錨定的標(biāo)簽探針，其識(shí)別序列與對(duì)應(yīng)于成熟微RNA或siRNA的5’-末端或位于初始核糖核酸靶標(biāo)序列中的RNA編輯核苷酸、剪接點(diǎn)、單核苷酸多態(tài)性或點(diǎn)突變的5’的序列的逆轉(zhuǎn)錄酶-延伸的核苷酸序列互補(bǔ)。2nd鏈標(biāo)簽探針用作錨定引物來產(chǎn)生與引物延伸產(chǎn)物互補(bǔ)的第二條核酸鏈。反應(yīng)的特異性是基于依次使用具有不交疊的識(shí)別序列的兩種錨定標(biāo)記探針，分別雜交至靶標(biāo)RNA和互補(bǔ)DNA序列的3’-末端和5’-末端區(qū)域。
“兩種標(biāo)簽探針”或“標(biāo)簽探針對(duì)”指兩種錨定標(biāo)簽探針，每種經(jīng)設(shè)計(jì)來組合探測(cè)短的互補(bǔ)靶標(biāo)序列(例如短的RNA序列)，其中第一種標(biāo)簽探針的識(shí)別序列雜交至靶標(biāo)序列內(nèi)的第一個(gè)區(qū)域并且識(shí)別序列的2nd鏈標(biāo)簽探針識(shí)別與逆轉(zhuǎn)錄酶-延伸的核苷酸序列互補(bǔ)的序列，逆轉(zhuǎn)錄酶-延伸的核苷酸序列對(duì)應(yīng)成熟微RNA或siRNA的5’-末端或位于最初的核糖核酸靶標(biāo)序列中的RNA編輯的核苷酸、剪接點(diǎn)、單核苷酸多態(tài)性或點(diǎn)突變的5’。2nd鏈標(biāo)簽探針用作錨定引物來產(chǎn)生與引物延伸產(chǎn)物互補(bǔ)的第二條核酸鏈。
連接至這兩種標(biāo)簽探針的每種的錨定序列經(jīng)設(shè)計(jì)而使得它們?cè)诒景l(fā)明方法中使用的雜交條件下不與給定轉(zhuǎn)錄組中的任何靶標(biāo)核酸或相互之間發(fā)生交叉雜交。錨定序列用作隨后實(shí)時(shí)定量PCR的PCR引物引發(fā)位點(diǎn)，或作為捕獲檢測(cè)法的標(biāo)簽。
術(shù)語“引物”可以指多于一種引物并指寡核苷酸，不論是天然產(chǎn)生的(如經(jīng)純化的限制酶切消化物中的)還是合成產(chǎn)生，當(dāng)置于其中與核酸鏈互補(bǔ)的引物延伸產(chǎn)物的合成得以催化的條件下時(shí)，其能作為沿互補(bǔ)鏈的合成的起始點(diǎn)。這種條件包括在合適的緩沖系(“緩沖系”包括為輔助因子或影響pH、離子強(qiáng)度等的物質(zhì))并在合適溫度下四種不同的脫氧核糖核苷三磷酸和聚合作用誘導(dǎo)劑如DNA聚合酶或逆轉(zhuǎn)錄酶的存在。引物優(yōu)選在合適的緩沖系(“緩沖系”包括為輔助因子或影響pH、離子強(qiáng)度等的物質(zhì))中以及在適合溫度下是單鏈的以最大效率地由聚合酶或逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行擴(kuò)增。引物優(yōu)選是單鏈用以最大效率的擴(kuò)增。
術(shù)語“檢測(cè)探針”指經(jīng)標(biāo)記的寡核苷酸，其由于該探針與靶標(biāo)區(qū)域的互補(bǔ)性而與擴(kuò)增的靶標(biāo)核酸(例如短的RNA靶標(biāo)序列)內(nèi)的序列形成雙鏈結(jié)構(gòu)。檢測(cè)探針優(yōu)選不含有與用來引發(fā)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的序列互補(bǔ)的序列。一般而言，探針的3’末端將受到“封閉”以抑制該探針整合進(jìn)引物延伸產(chǎn)物?！胺忾]”可以通過使用非互補(bǔ)性堿基或通過加入化學(xué)部分如生物素或磷酸基團(tuán)至最后的核苷酸的3’羥基而獲得，這取決于選擇的部分，其可以起雙重目的，即也可以作為標(biāo)記。
術(shù)語“miRNA”和“微RNA”指源于內(nèi)源基因的21-25nt的非編碼RNA。它們從更長(zhǎng)(約75nt)的稱為前-miRNA的發(fā)夾狀的前體加工而來。微RNA裝配進(jìn)稱為miRNP的復(fù)合體中并通過反義互補(bǔ)性識(shí)別它們的靶標(biāo)。如果微RNA與它們的靶標(biāo)100％匹配，即完全互補(bǔ)，則靶標(biāo)mRNA被切割，并且miRNA如同siRNA起作用。如果不完全匹配，即部分互補(bǔ)，那么靶標(biāo)mRNA的翻譯受到阻斷。
術(shù)語“小干擾RNA”或“siRNA”指21-25nt的RNA，其源于對(duì)線形雙鏈RNA的加工。siRNA組裝進(jìn)稱為RISC(RNA-誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體)的復(fù)合物中，并且針對(duì)同源的RNA序列進(jìn)行內(nèi)切核苷酸的切割。合成的siRNA也組裝成RISC并能切割同源RNA序列。
術(shù)語“RNA干擾”(RNAi)指其中與靶標(biāo)mRNA同源的雙鏈RNA導(dǎo)致該靶標(biāo)mRNA的降解的現(xiàn)象。更廣義地定義為通過同源siRNA對(duì)靶標(biāo)mRNA的降解。
術(shù)語“識(shí)別序列”指與靶標(biāo)核苷酸序列內(nèi)的區(qū)域互補(bǔ)的核苷酸序列，所述的區(qū)域是靶標(biāo)核苷酸序列和識(shí)別序列之間的序列特異性雜交所必需的。本發(fā)明的標(biāo)簽探針以及檢測(cè)探針含有靶標(biāo)序列特異性的識(shí)別序列。
術(shù)語“錨定序列”指連續(xù)地連接至標(biāo)簽探針對(duì)的兩個(gè)核苷酸序列，所述的錨定序列經(jīng)設(shè)計(jì)以使得它們相互之間或與靶標(biāo)核苷酸序列或含有靶標(biāo)核苷酸序列的核酸樣品中的任意核苷酸序列不發(fā)生交叉雜交。
如此處使用的術(shù)語“標(biāo)簽”指可用于提供可檢測(cè)(優(yōu)選可定量)的信號(hào)的任何原子或分子，并且其可以連接至核酸或蛋白質(zhì)上。標(biāo)簽可以提供通過熒光、放射性、比色法、X-射線衍射或吸收、磁性、酶促活性等等而可以檢測(cè)的信號(hào)。
標(biāo)簽是報(bào)告基團(tuán)，其可以通過其本身檢測(cè)或可作為檢測(cè)系列的一部分檢測(cè)。報(bào)告基團(tuán)的官能性部分的實(shí)例是生物素、地高辛、熒光基團(tuán)(能夠吸收某種波長(zhǎng)的電磁輻射(例如光或X-射線)的基團(tuán)，并且其隨后再發(fā)射吸收的能量為更長(zhǎng)波長(zhǎng)的輻射；說明性的實(shí)例是DANSYL(5-二甲基氨基)-1-萘磺酰基)、DOXYL(N-氧-4，4-二甲基噁唑烷)、PROXYL(N-氧-2，2，5，5-四甲基吡咯烷)、TEMPO(N-氧-2，2，6，6-四甲基哌啶)、二硝基苯基、吖啶類、香豆素類、Cy3和Cy5(Biological Detection Systems公司的商標(biāo))、赤蘚紅、香豆酸、傘形酮、德克薩斯紅、羅丹明、四甲基羅丹明、Rox、7-硝基苯-2-氧雜-1-二唑(NBD)、芘、熒光素、銪、釕、釤及其它稀有堿土金屬)、放射性同位素標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記(在化學(xué)反應(yīng)時(shí)通過光的發(fā)射而可檢測(cè)的標(biāo)記)、自旋標(biāo)記(通過使用電子自旋共振光譜可以檢測(cè)的結(jié)合至生物分子上的自由基(例如，經(jīng)取代的有機(jī)硝基氧化物)或其它順磁探針(例如Cu2+、Mg2+))。特別重要的實(shí)例是生物素、熒光素、德克薩斯紅、羅丹明、二硝基苯基、地高辛、釕、銪、Cy5、Cy3等。
“連接”或“共價(jià)偶聯(lián)”指共價(jià)偶聯(lián)兩種鄰接的核苷酸序列(例如本發(fā)明的標(biāo)簽寡核苷酸探針序列)而形成單條核苷酸序列。本反應(yīng)通過連接酶催化，在一條核苷酸序列的5’-末端和鄰近的核苷酸序列的3’-末端之間(例如在退火至它們的互補(bǔ)靶標(biāo)核酸序列上的本發(fā)明的兩個(gè)鄰接的標(biāo)簽探針之間)形成磷酸二酯鍵。
“RNA為模板的寡核苷酸連接”指共價(jià)偶聯(lián)退火至互補(bǔ)RNA靶標(biāo)序列上的兩個(gè)鄰近的寡核苷酸探針序列而形成單條核苷酸序列。本反應(yīng)通過連接酶催化，其在一條核苷酸序列的5’-末端和鄰近的核苷酸序列的3’-末端之間(例如在本發(fā)明的兩個(gè)鄰接的標(biāo)簽探針之間)形成磷酸二酯鍵。
術(shù)語“PCR反應(yīng)”、“PCR擴(kuò)增”、“PCR”、“預(yù)-PCR”和“實(shí)時(shí)定量PCR”是可互換的術(shù)語，其用于表示使用擴(kuò)增要檢測(cè)的靶標(biāo)核酸的核酸擴(kuò)增體系。這種體系的實(shí)例包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)體系和連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)體系。最近描述的以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它方法是基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBATM，Cangene，Mississauga，Ontario)和Q Beta復(fù)制酶體系。通過所述的擴(kuò)增反應(yīng)形成的產(chǎn)物可以或不可以進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控或僅在反應(yīng)后作為終末點(diǎn)測(cè)量。
如此處使用的，術(shù)語“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”指用于檢測(cè)的引物、探針、寡聚體片段、寡聚體對(duì)照和未標(biāo)記的封閉寡聚體，并應(yīng)該是聚脫氧核糖核苷酸(含有2-脫氧-D-核糖)、多核糖核苷酸(含有D-核糖)，以及多核苷酸的任意其它類型的上位概念，所述的其它類型是嘌呤或嘧啶堿基或經(jīng)修飾的嘌呤或嘧啶堿基的N糖苷。在術(shù)語“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”之間在長(zhǎng)度上沒有作有意的區(qū)別，并且這些術(shù)語將可以互換使用。這些術(shù)語僅指分子的一級(jí)結(jié)構(gòu)。因而，這些術(shù)語包括雙-和單-鏈DNA以及雙-和單-鏈RNA。寡核苷酸包括對(duì)應(yīng)指定靶標(biāo)核苷酸序列的區(qū)域的約至少3個(gè)核苷酸、優(yōu)選至少約6個(gè)核苷酸，并且更優(yōu)選至少8-30個(gè)核苷酸的序列?！皩?duì)應(yīng)”表示與指定序列相同或互補(bǔ)。寡核苷酸不一定在物理上源于任何存在的或天然的序列，而是可以以任何方式(包括化學(xué)合成、DNA復(fù)制、逆轉(zhuǎn)錄或它們的組合)產(chǎn)生。
術(shù)語“寡核苷酸”或“核酸”指基因組DNA或RNA、cDNA(半合成的多核苷酸或合成的來源)的多核苷酸，其由于它的來源或操作(1)與其天然結(jié)合的多核苷酸的全部或部分不結(jié)合；和/或(2)連接至不同于其天然連接的多核苷酸的多核苷酸；并(3)天然中沒發(fā)現(xiàn)。由于單核苷酸以某種方式反應(yīng)而形成寡核苷酸，使得一個(gè)單核苷酸戊糖環(huán)的5’-磷酸經(jīng)磷酸二酯鍵連接至其在一個(gè)方向上鄰近的單核苷酸的3’-氧上，寡核苷酸的一個(gè)末端如果其5’磷酸沒有連接至單核苷酸戊糖環(huán)的3’氧上則稱為“5’末端”，而如果其3’氧沒有連接至隨后的單核苷酸戊糖環(huán)的5’磷酸上則稱為“3’末端”。如此處使用的，核苷酸序列，即使處于更大的寡核苷酸內(nèi)部，也可以說是具有5’和3’末端。當(dāng)兩種不同的、非交疊的寡核苷酸退火至相同的線形互補(bǔ)核酸序列的不同區(qū)域上，一條寡核苷酸的3’末端指向另一條的5’末端；前者可以稱為“上游”寡核苷酸而后者稱為“下游”寡核苷酸。
術(shù)語“SBC核堿基(nucleobase)”指“選擇性結(jié)合互補(bǔ)的”核堿基，即可以與它們的互補(bǔ)核堿基形成穩(wěn)定氫鍵，但不能與其它SBC核堿基形成穩(wěn)定氫鍵的經(jīng)修飾的核堿基。舉個(gè)例子，SBC核堿基A’，它可以與其互補(bǔ)的未修飾的核堿基T形成穩(wěn)定氫鍵對(duì)。類似地，SBC核堿基T’可以與其互補(bǔ)的未經(jīng)修飾的核堿基A形成穩(wěn)定的氫鍵對(duì)。然而，與堿基對(duì)A’-T和A-T’相比，SBC核堿基A’和T’將形成不穩(wěn)定的氫鍵對(duì)。類似地，C的SBC核堿基稱為C’并可以與其互補(bǔ)的未經(jīng)修飾的G形成穩(wěn)定的氫鍵對(duì)，而G的SBC核堿基稱為G’并可以與其互補(bǔ)的未經(jīng)修飾的核堿基C形成穩(wěn)定的氫鍵對(duì)，仍然，與堿基對(duì)C’-G和C-G’相比，C’和G’將形成不穩(wěn)定的氫鍵對(duì)。當(dāng)形成了2個(gè)或多個(gè)氫鍵時(shí)可獲得穩(wěn)定的氫鍵對(duì)，例如A’和T、A和T’、C和G’以及C’和G之間的對(duì)。當(dāng)形成1個(gè)或沒有氫鍵時(shí)獲得不穩(wěn)定的氫鍵對(duì)，例如A’和T’以及C’和G’之間的對(duì)。特別重要的SBC核堿基是2，6-二氨基嘌呤(A’，也稱為D)以及2-硫-尿嘧啶(U’，也稱為2SU)(2-硫-4-氧-嘧啶)和2-硫-胸腺嘧啶(T’，也稱為2ST)(2-硫-4-氧-5-甲基-嘧啶)。Fig.4說明了A-2ST和D-T對(duì)具有2個(gè)或多于2個(gè)氫鍵，而D-2ST對(duì)形成單個(gè)(不穩(wěn)定的)氫鍵。類似地，SBC核堿基吡咯并-[2，3-d]嘧啶-2(3H)-酮(C’，也稱為Pyrrolopyr)和次黃嘌呤(G’，也稱為I)(6-氧-嘌呤)顯示于Fig.9中，其中PyrroloPyr-G對(duì)和C-I對(duì)每對(duì)具有2個(gè)氫鍵，而PyrroloPyr-I對(duì)形成單個(gè)氫鍵。
“SBC LNA寡聚物”指含有至少一個(gè)LNA單體的“LNA寡聚物”，其中核堿基是“SBC核堿基”?！熬哂蠸BC核堿基的LNA單體”表示“SBC LNA單體”。一般而言，SBC LNA寡聚物包括除了SBC LNA單體還含有其它經(jīng)修飾的或天然出現(xiàn)的核苷酸或核苷的寡聚物。“SBC單體”表示具有SBC核堿基的非LNA單體?！爱愋蛄泄押塑账帷北硎驹赪atson-Crick意義上具有與相應(yīng)的經(jīng)修飾的寡核苷酸相同序列的一條寡核苷酸，例如序列agTtcATg等價(jià)于agTscD2SUg，其中s等價(jià)于SBC DNA單體2-硫-t或2-硫-u，D等價(jià)于SBC LNA單體LNA-D以及2SU等價(jià)于SBC LNA單體LNA2SU。
如此處使用的核酸序列的互補(bǔ)序列指一條寡核苷酸，其當(dāng)與該核酸序列比對(duì)而使得一條序列的5′末端與另一條的3’末端配對(duì)時(shí)，是“反向平行結(jié)合”。一般在天然核酸中沒發(fā)現(xiàn)的堿基可以包含在本發(fā)明的核酸內(nèi)，例如，肌苷和7-脫氮鳥嘌呤。互補(bǔ)性可以不是完全的；穩(wěn)定的雙鏈可以含有錯(cuò)配堿基對(duì)或不匹配堿基。在核酸技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員考慮許多變量(包括例如，寡核苷酸的長(zhǎng)度、寡核苷酸中胞嘧啶和鳥嘌呤的百分比含量、離子強(qiáng)度和錯(cuò)配堿基對(duì)的發(fā)生率)根據(jù)經(jīng)驗(yàn)可以確定雙鏈穩(wěn)定性。
解鏈溫度或“Tm”用以度量核酸雙鏈的穩(wěn)定性。在特定條件下特定核酸雙鏈的Tm是一半的雙鏈已經(jīng)解聚時(shí)的溫度。
如此處定義的，“5′→3′核酸酶活性”或“5′至3’核酸酶活性”指模板-特異性核酸聚合酶的活性，其包括5′→3′核酸外切酶活性，該外切酶活性通常與一些DNA聚合酶相關(guān)聯(lián)，藉此核苷酸相繼從寡核苷酸的5’末端被除去(即大腸桿菌DNA聚合酶I具有該活性而Klenow片段沒有)，或包括5′→3′核酸內(nèi)切酶活性，其中在5’末端多于一個(gè)核苷酸發(fā)生了切割，或包括這兩種活性。
“熱穩(wěn)定性核酸聚合酶”指當(dāng)比較時(shí)，例如與來自大腸桿菌聚合酶比較時(shí)對(duì)熱相對(duì)穩(wěn)定，并催化核苷的聚合作用的酶。一般而言，該酶將在退火至靶標(biāo)序列的引物的3’-末端起始合成，并沿模板向5’-方向進(jìn)行，并且如果具有5’至3’核酸酶活性，則水解或取代插入的、退火的探針而釋放標(biāo)記的和未標(biāo)記的探針片段或完整的探針，直至合成終止。一種代表性熱穩(wěn)定性酶從棲熱水生菌(Taq)中分離，其描述于美國專利號(hào)4,889,818，并且在常規(guī)PCR中使用它的方法描述于Saiki等，(1988)，Science 239487。
“熱穩(wěn)定性逆轉(zhuǎn)錄酶”指一種逆轉(zhuǎn)錄酶，其與例如禽骨髓瘤病毒(AMV)逆轉(zhuǎn)錄酶或莫洛尼氏猴白血病毒(MMLV)逆轉(zhuǎn)錄酶相比更具有熱穩(wěn)定性。
術(shù)語“核堿基”涵蓋了天然出現(xiàn)的核堿基腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)以及非天然出現(xiàn)的核堿基例如黃嘌呤、二氨基嘌呤、8-氧-N6-甲基腺嘌呤、7-脫氮黃嘌呤、7-脫氮鳥嘌呤、N4，N4-橋亞乙基胞嘧啶、N6，N6-橋亞乙基-2，6-二氨基嘌呤、5-甲基胞嘧啶、5-(C3-C6)-炔基-胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、假異胞嘧啶、2-羥基-5-甲基-4-三唑并吡啶、異胞嘧啶、異鳥嘌呤、肌苷，并且描述于Benner等，U.S.Patent No.5,432,272和Susan M.Freier和Karl-Heinz Altmann，Nucleic AcidResearch，254429-4443，1997中的“非天然出現(xiàn)”核堿基。術(shù)語“核堿基”因而不僅包括已知的嘌呤和嘧啶雜環(huán)，而且還包括其雜環(huán)類似物和互變異構(gòu)體。其它天然出現(xiàn)的和非天然出現(xiàn)的核堿基包括在美國專利No.3,687,808中；在Sanghvi的Antisense Research andApplication，S.T.Crooke和B.Lebleu編輯，CRC Press，1993的第15章中；在Englisch等，Angewandte Chemie，InternationalEdition，30613-722，1991中(特別參見622-623頁，以及在ConciseEncyclopedia of Polymer Science and Engineering，J.I.Kroschwitz編輯，John Wiley & Sons，pages 858-859，1990、Cook，Anti-Cancer DrugDesign 6585-607，1991中)描述的那些核堿基。
術(shù)語“核苷堿基”或“核堿基類似物”另外旨在包括可以作為類似核苷堿基的雜環(huán)化合物，包括某些在最經(jīng)典意義上不是核苷堿基但作為核苷堿基的“通用堿基”。特別提到的通用堿基是3-硝基吡咯或5-硝基吲哚。其它優(yōu)選的化合物包括芘和吡啶基噁唑衍生物、芘基、芘基甲基丙三醇衍生物等等。其它優(yōu)選的通用堿基包括吡咯、二唑或三唑衍生物，包括那些本領(lǐng)域已知的通用堿基。
“通用堿基”指天然出現(xiàn)的或理想地非天然出現(xiàn)的化合物或部分，其可以與至少-種或優(yōu)選地與全部天然堿基(例如腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶和/或胸腺嘧啶)配對(duì)，并且其具有此處描述的15、12、10、8、6、4或2℃或更小的Tm差別。
“寡核苷酸”、“寡聚體”或“寡”表示通過核苷酸間鍵合連接的單體(例如雜環(huán)堿基的糖苷)的連續(xù)的鏈。在寡核苷酸中的兩個(gè)連續(xù)的單體之間的鍵由2-4個(gè)(優(yōu)選3個(gè))基團(tuán)/原子組成，所述的基團(tuán)/原子選自-CH2-、-O-、-S-、-NRH-、＞C＝O、＞C＝NRH、＞C＝S、-Si(R″)2-、-SO-、-S(O)2-、-P(O)2-、-PO(BH3)-、-P(O，S)-、-P(S)2-、-PO(R″)-、-PO(OCH3)-和-PO(NHRH)-，其中RH選自氫和C1-4-烷基，以及R″選自C1-6-烷基和苯基。這種鍵的說明性實(shí)例是-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CO-CH2-、-CH2-CHOH-CH2-、-O-CH2-O-、-O-CH2-CH2-、-O-CH2-CH＝(當(dāng)用作連接隨后的單體的鍵時(shí)包括R5)、-CH2-CH2-O-、-NRH-CH2-CH2-、-CH2-CH2-NRH-、-CH2-NRH-CH2-、-O-CH2-CH2-NRH-、-NRH-CO-O-、-NRH-CO-NRH-、-NRH-CS-NRH-、-NRH-C(＝NRH)-NRH-、-NRH-CO-CH2-NRH-、-O-CO-O-、-O-CO-CH2-O-、-O-CH2-CO-O-、-CH2-CO-NRH-、-O-CO-NRH-、-NRH-CO-CH2-、-O-CH2-CO-NRH-、-O-CH2-CHCH2-NRH-、-CH＝N-O-、-CH2-NRH-O-、-CH2-O-N＝(當(dāng)用作連接隨后的單體的鍵時(shí)包括R5)、-CH2-O-NRH-、-CO-NRH-CH2-、-CH2-NRH-O-、-CH2-NRH-CO-、-O-NRH-CH2-、-O-NRH-、-O-CH2-S-、-S-CH2-O-、-CH2-CH2-S-、-O-CH2-CH2-S-、-S-CH2-CH＝(當(dāng)用作連接隨后的單體的鍵時(shí)包括R5)、-S-CH2-CH2-、-S-CH2-CH2-O-、-S-CH2-CH2-S-、-CH2-S-CH2-、-CH2-SO-CH2-、-CH2-SO2-CH2-、-O-SO-O-、-O-S(O)2-O-、-O-S(O)2-CH2-、-O-S(O)2-NRH-、-NRH-S(O)2-CH2-、-O-S(O)2-CH2-、-O-P(O)2-O-、-O-P(O，S)-O-、-O-P(S)2-O-、-S-P(O)2-O-、-S-P(O，S)-O-、-S-P(S)2-O-、-O-P(O)2-S-、-O-P(O，S)-S-、-O-P(S)2-S-、-S-P(O)2-S-、-S-P(O，S)-S-、-S-P(S)2-S-、-O-PO(R″)-O-、-O-PO(OCH3)-O-、-O-PO(OCH2CH3)-O-、-O-PO(OCH2CH2S-R)-O-、-O-PO(BH3)-O-、-O-PO(NHRN)-O-，-O-P(O)2-NRH-、-NRH-P(O)2-O-、-O-P(O，NRH)-O-、-CH2-P(O)2-O-、-O-P(O)2-CH2-和-O-Si(R″)2-O-；其中-CH2-CO-NRH-、-CH2-NRH-O-、-S-CH2-O-、-O-P(O)2-O-、-O-P(O，S)-O-、-O-P(S)2-O-、-NRH-P(O)2-O-、-O-P(O，NRH)-O-、-O-PO(R″)-O-、-O-PO(CH3)-O-和-O-PO(NHRN)-O-(其中RH選自氫和C1-4-烷基，以及R″選自C1-6-烷基和苯基)是特別理想的。另外的說明性實(shí)例在Mesmaeker等，Current Opinion inStructural Biology 1995，5，343-355和Susan M.Freier和Karl-Heinz Altmann，Nucleic Acids Research，1997，vol 25，pp4429-4443中給出。
核苷間鍵合的左手邊結(jié)合至3’-位置的P*取代基的5-元環(huán)，而右手邊結(jié)合至前面的單體的5’-位置。
“LNA”或“LNA單體”(例如LNA核苷或LNA核苷酸)或LNA寡聚物(例如寡核苷酸或核酸)表示包括至少一個(gè)LNA單體的核苷或核苷酸類似物。公開于PCT出版物WO 99/14226中的LNA單體通常是最理想的經(jīng)修飾的用來整合進(jìn)本發(fā)明的寡核苷酸的核酸。而且，核酸可以通過本領(lǐng)域已知的任何類型的修飾在3’和/或5’末端修飾。例如，任一端或兩端可以蓋有保護(hù)基團(tuán)、連接至柔性連接基團(tuán)、連接至反應(yīng)基團(tuán)以助于連接至底物表面等等。理想的LNA單體和它們的合成方法也公開于US 6,043,060、US 6,268,490、PCT出版物WO 01/07455、WO 01/00641、WO 98/39352、WO 00/56746、WO 00/56748和WO 00/66604以及公開于以下文獻(xiàn)Morita等，Bioorg.Med.Chem.Lett.12(1)73-76，2002；Hakansson等，Bioorg.Med.Chem.Lett.11(7)935-938，2001；Koshkin等，J.Org.Chem.66(25)8504-8512，2001；Kvaerno等，J.Org.Chem.66(16)5498-5503，2001；Hakansson等，J.Org.Chem.65(17)5161-5166，2000；Kvaerno等，J.Org.Chem.65(17)5167-5176，2000；Pfundheller等，Nucleosides Nucleotides18(9)2017-2030，1999；以及Kumar等，Bioorg.Med.Chem.Lett.8(16)2219-2222，1998。
優(yōu)選的LNA單體，也稱為“氧-LNA”是包括如公開于PCT出版物WO 03/020739的雙環(huán)化合物的LNA單體，其中如下式(I)顯示的R4’和R2’一起指-CH2-O-或-CH2-CH2-O-?！癓NA修飾的寡核苷酸”或“LNA取代的寡核苷酸”表示含有至少一個(gè)下面描述的式(I)的LNA單體的寡核苷酸，其具有下面描述的說明性修飾實(shí)例。
其中X選自-O-、-S-、-N(RN)-、-C(R6R6*)-、-O-C(R7R7*)-、-C(R6R6*)-O-、-S-C(R7R7*)-、-C(R6R6*)-S-、-N(RN*)-C(R7R7*)-、-C(R6R6*)-N(RN*)-和-C(R6R6*)-C(R7R7*)。
B選自如上面討論的經(jīng)修飾的堿基，例如任選取代的碳環(huán)芳基(例如任選取代的芘或任選取代的芘基甲基丙三醇)或任選取代雜脂環(huán)或任選取代的雜芳香環(huán)(例如任選取代的吡啶基噁唑、任選取代的吡咯、任選取代的二唑或任選取代的三唑部分)；氫、羥基、任選取代的C1-4-烷氧基、任選取代的C1-4烷基、任選取代的C1-4-酰氧基、核堿基、DNA插入劑、光化學(xué)活性基團(tuán)、熱化學(xué)活性基團(tuán)、螯合基團(tuán)、報(bào)告基團(tuán)和配體。
P指用于核苷間鍵合至隨后的單體的自由基位置，或指5’-末端基團(tuán)，這種核苷間鍵或5’-末端基團(tuán)任選包括取代基R5。取代基R2、R2*、R3和R3*之一是指核苷間鍵合至隨后的單體的基團(tuán)P*或2’/3’-末端基團(tuán)。取代基R1*、R4*、R5、R5*、R6、R6*、R7、R7*、RN，以及不表示P*的取代基R2、R2*、R3和R3*每種指含有約1-8基團(tuán)/原子的雙自由基，其選自-C(RaRb)-、-C(Ra)＝C(Ra)-、-C(Ra)＝N-、-C(Ra)-O-、-O-、-Si(Ra)2-、-C(Ra)-S、-S-、-SO2-、-C(Ra)-N(Rb)-、-N(Ra)-和＞C＝Q，其中Q選自-O-、-S-和-N(Ra)-，以及Ra和Rb每個(gè)獨(dú)立地選自氫、任選取代的C1-12-烷基、任選取代的C2-12-鏈烯基、任選取代的C2-12-炔基、羥基、C1-12-烷氧基、C2-12-鏈烯氧基、羧基、C1-2-烷氧基羰基、C1-12-烷基羰基、甲?；⒎蓟?、芳氧基-羰基、芳氧基、芳基羰基、雜芳基、雜芳氧基-羰基、雜芳氧基、雜芳基羰基、氨基、單-和雙(C1-6-烷基)氨基、氨甲酰基、單-和雙(C1-6烷基)-氨基-羰基、氨基-C1-6-烷基-氨基羰基、單-和二(C1-6-烷基)氨基-C1-6-烷基-氨基羰基、C1-6-烷基-羰基氨基、脲基、C1-6-烷?；趸?、sulphono、C1-6-烷基磺酰氧基、硝基、疊氮基、磺酰基、C1-6-烷硫基、鹵素、DNA插入劑、光化學(xué)活性基、熱化學(xué)活性基、螯合基團(tuán)、報(bào)告基團(tuán)、及配體，其中芳基和雜芳基可以經(jīng)任選取代，以及其中兩個(gè)成對(duì)的取代基Ra和Rb一起可以指任選取代的亞甲基(＝CH2)，以及其中選自Ra、Rb的兩個(gè)非成對(duì)的或成對(duì)的取代基以及存在的且不涉及P、P*或雙自由基的任意取代基R1*、R2、R2*、R3、R3*、R4*、R5、R5*、R6和R6*、R7和R7*一起可以形成選自如前面定義的相同類型的雙自由基的連接的雙自由基；非成對(duì)的取代基的對(duì)因此與(i)所述的非成對(duì)取代基連接的原子以及(ii)任何間插原子一起形成單-或雙環(huán)實(shí)體。
存在的但不涉及P、P*或雙自由基的取代基R1*、R2、R2*、R3、R4*、R5、R5*、R6和R6*、R7以及R7*的每種獨(dú)立地選自氫、任選取代的C1-12-烷基、任選取代的C2-12-鏈烯基、任選取代的C2-12-炔基、羥基、C1-12-烷氧基、C2-12-鏈烯氧基、羧基、C1-12-烷氧基羰基、C1-12-烷基羰基、甲?；?、芳基、芳氧基-羰基、芳氧基、芳基羰基、雜芳基、雜芳氧基-羰基、雜芳氧基、雜芳基羰基、氨基、單-和二(C1-6-烷基)氨基、氨甲酰基、單-和二(C1-6-烷基)-氨基-羰基、氨基-C1-6-烷基-氨基羰基、單-和二(C1-6-烷基)氨基-C1-6-烷基-氨基羰基、C1-6-烷基-羰基氨基、脲基、C1-6-烷酰基氧基、sulphono、C1-6-烷基磺酰氧基、硝基、疊氮基、磺酰基、C1-6-烷基硫、鹵素、DNA插入劑、光化學(xué)活性基、熱化學(xué)活性基、螯合基團(tuán)、報(bào)告基團(tuán)和配體，其中芳基和雜芳基可經(jīng)任選取代，以及其中兩種成對(duì)取代基一起可以指氧、硫氧、亞氨基或經(jīng)任選取代的亞甲基，或一起可以形成具有1-5個(gè)碳原子烯基鏈的螺雙自由基，其任選被一個(gè)或多個(gè)選自-O-、-S-和-(NRN)-(其中RN選自氫和C1-4-烷基)的雜原子/基團(tuán)打斷和/或終止，并且其中兩個(gè)鄰接的(非成對(duì))取代基可以指產(chǎn)生雙鍵的另一個(gè)鍵；以及RN*當(dāng)存在并不涉及雙自由基時(shí)，選自氫和C1-4-烷基；以及其堿鹽和酸加成鹽。
示范性的5′、3′和/或2′末端基團(tuán)包括-H、-OH、鹵素(例如氯、氟、碘或溴)、任選取代的芳基(例如苯基或芐基)、烷基(例如，甲基或乙基)、烷氧基(例如甲氧基)、酰基(例如乙?；虮郊柞；?、芳?；?、芳烷基、羥基、羥基烷基、烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、硝基、氰基、羧基、烷氧基羰基、芳氧基羰基、芳烷氧基羰基、酰氨基、芳酰基氨基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、雜芳基磺?；?、烷基亞磺?；?、芳基亞磺酰基、雜芳基亞磺?；⑼榱蚧?、芳硫基、雜芳硫基、芳烷基硫基、雜芳烷基硫基、脒基、氨基、氨甲?；?、氨磺?；?、鏈烯、炔、保護(hù)基(例如甲硅烷基、4，4′-二甲氧基三苯甲基、單甲氧基三苯甲基或三苯甲基(三苯基甲基))、連接物(例如，含有氨、乙二醇、醌如蒽醌的連接物)、可檢測(cè)標(biāo)記(例如，放射性標(biāo)記或熒光標(biāo)記)和生物素。
可以理解，這里對(duì)核酸單位、核酸殘基、LNA單體的提及或相似的術(shù)語是既包括獨(dú)立的核苷單位和核苷酸單位也包括在寡核苷酸內(nèi)的核苷單位和核苷酸單位。
“經(jīng)修飾的堿基”或其它相似的術(shù)語指可以與天然堿基(例如腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶和/或胸腺嘧啶)配對(duì)和/或與非天然出現(xiàn)的核堿基或核苷堿基配對(duì)的物質(zhì)(例如，非天然出現(xiàn)的核堿基或核苷堿基)。理想地，經(jīng)修飾的堿基產(chǎn)生在此描述的15、12、10、8、6、4或2℃或更少的Tm差異。示例性的經(jīng)修飾的堿基描述于EP 1 072679和WO 97/12896中。
術(shù)語“化學(xué)部分”指分子的一部分?！坝没瘜W(xué)部分修飾”因而指通過包含不一般的化學(xué)結(jié)構(gòu)而修飾標(biāo)準(zhǔn)的分子結(jié)構(gòu)。所述的結(jié)構(gòu)的連接可以是共價(jià)或非共價(jià)連接。
術(shù)語在寡核苷酸探針中“包括化學(xué)部分”因而指連接分子結(jié)構(gòu)。這種化學(xué)部分包括但不限于選自不對(duì)稱花青染料、DAPI、SYBR Green I、SYBR Green II、SYBR Gold、PicoGreen、噻唑橙、Hoechst 33342、溴化乙錠、1-O-(1-芘基甲基)丙三醇和Hoechst 33258的共價(jià)和/或非共價(jià)結(jié)合的小溝結(jié)合劑(MGB)和/或插入性核酸(INA)。
其它化學(xué)部分包括經(jīng)修飾的核堿基、核苷堿基或LNA修飾的寡核苷酸。術(shù)語“雙標(biāo)記探針”指具有兩個(gè)連接的標(biāo)記的寡核苷酸。在一方面，一個(gè)標(biāo)記連接至探針分子的5’末端，而另一標(biāo)記連接至該分子的3’末端。本發(fā)明的一個(gè)特別方面包括連接至一端的熒光分子以及連接至另一端的能通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)淬滅該熒光團(tuán)的分子。5’核酸酶測(cè)定探針和一些分子信標(biāo)是雙標(biāo)記探針的實(shí)例。
“5’核酸酶檢測(cè)探針”指可以通過DNA聚合酶的5’-3’核酸外切酶活性水解的雙標(biāo)記探針。5’核酸酶檢測(cè)探針不一定在特定PCR測(cè)定法下采用的條件下被DNA聚合酶的5’-3’核酸外切酶活性水解。名稱“5’核酸酶檢測(cè)”的使用不考慮觀測(cè)到的水解程度并且不代表實(shí)驗(yàn)者的任何期望。術(shù)語“5’核酸酶檢測(cè)探針”和“5’核酸酶檢測(cè)”僅指其中沒有采取特別的手段來避免探針的水解的測(cè)定法?！?’核酸酶檢測(cè)探針”常常指“TaqMan檢測(cè)探針”，“5’核酸酶檢測(cè)”稱為“TaqMan檢測(cè)”。在該申請(qǐng)案中這些名稱可以互換使用。
“寡核苷酸類似物”指能識(shí)別特定靶標(biāo)核苷酸序列的核酸結(jié)合分子。特別的寡核苷酸類似物是肽核酸(PNA)，其中寡核苷酸的糖磷酸主鏈由蛋白質(zhì)樣主鏈代替。在PNA中，核堿基連接于不帶電的聚酰胺主鏈產(chǎn)生一個(gè)嵌合的假肽-核酸結(jié)構(gòu)，其與核酸形式是同形的。
“分子信標(biāo)”指單或雙標(biāo)記探針，所述的標(biāo)記不太可能受DNA-聚合酶的5’-3’核酸外切酶活性影響。對(duì)探針、聚合酶或測(cè)定條件進(jìn)行特殊的修飾以避免通過DNA-聚合酶的5’-3’核酸外切酶活性分開標(biāo)記或組分核苷酸。因此檢測(cè)原理依賴于分子信標(biāo)結(jié)合至其靶標(biāo)序列時(shí)標(biāo)記引發(fā)的信號(hào)的可檢測(cè)的差別。在本發(fā)明的一個(gè)方面，該寡核苷酸探針在選定的測(cè)定溫度下形成一個(gè)分子內(nèi)的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)的形成由在該寡核苷酸的5’-和3’-末端的互補(bǔ)序列介導(dǎo)。該寡核苷酸可以具有連接至一端的熒光分子和連接至另一端的一個(gè)分子，當(dāng)在發(fā)夾結(jié)構(gòu)中相互十分靠近時(shí)該分子能淬滅熒光團(tuán)。在本發(fā)明的另一方面，發(fā)夾結(jié)構(gòu)沒有基于在探針序列末端的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，結(jié)合時(shí)檢測(cè)到的信號(hào)改變可以由一個(gè)或兩個(gè)標(biāo)記與形成的雙鏈結(jié)構(gòu)之間相互作用或由結(jié)合時(shí)探針的空間構(gòu)象的一般變化-或由結(jié)合后標(biāo)記之間減少的相互作用而引起。分子信標(biāo)的一個(gè)特別方面含有一些LNA殘基以抑制DNA聚合酶的5’-3’核酸外切酶活性引起的水解。
“高度親合性核苷酸類似物”指當(dāng)用至少一個(gè)這種高度-親合性核苷酸類似物取代時(shí)，增加寡核苷酸探針與其互補(bǔ)的識(shí)別序列的“結(jié)合親合性”的非天然出現(xiàn)的核苷酸類似物。
如此處使用的，與包含相同序列但不包含穩(wěn)定性核苷酸的探針比較對(duì)識(shí)別序列具有增加的“結(jié)合親合性”的探針指這樣一種探針，即它的探針識(shí)別片段結(jié)合常數(shù)(Ka)高于雙鏈分子的互補(bǔ)序列的結(jié)合常數(shù)。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，探針識(shí)別片段的結(jié)合常數(shù)高于雙鏈分子中靶標(biāo)序列中的識(shí)別序列的互補(bǔ)鏈的解離常數(shù)(Kd)。
如果它們含有能根據(jù)Watson-Crick堿基-配對(duì)原則(例如，G與C，A與T或A與U)可以形成氫鍵的核苷堿基或其它氫鍵基序(例如二氨基嘌呤與T，S-甲基C與G，2-硫胸腺嘧啶與A，肌苷與C，假異胞嘧啶與G等等)時(shí)，將這些單體稱為是“互補(bǔ)的”。
術(shù)語“隨后的單體”指在5’-末端方向的鄰近單體而“前面的單體”指在3’-末端方向的鄰近單體。
術(shù)語“靶標(biāo)核酸”或“靶標(biāo)核糖核酸”指具有單條特異性序列的任何相關(guān)核酸，例如生物核酸，如源于患者、動(dòng)物(人或非人動(dòng)物)、植物、細(xì)菌、真菌、古細(xì)菌、細(xì)胞、組織、器官等。例如，如果靶標(biāo)核糖核酸或核酸源于細(xì)菌、古細(xì)菌、植物、非-人動(dòng)物、細(xì)胞、真菌或非人生物體時(shí)，本方法任選進(jìn)一步包括基于對(duì)靶標(biāo)核酸的檢測(cè)而選取細(xì)菌、古細(xì)菌、植物、非人動(dòng)物、細(xì)胞、真菌或非人生物體。在一個(gè)實(shí)施方案中，靶標(biāo)核酸源于患者，例如人患者。在這些實(shí)施方案中，本發(fā)明任選進(jìn)一步包括基于對(duì)靶標(biāo)核酸的檢測(cè)而選擇治療、診斷疾病，或診斷對(duì)疾病的遺傳傾向。
“靶標(biāo)序列”指任何靶標(biāo)核酸內(nèi)的特異性核酸序列。
如此處使用的術(shù)語“嚴(yán)格條件”是在約Tm-5℃(低于解鏈溫度(Tm)5℃)至低于Tm約20℃到25℃的范圍內(nèi)發(fā)生的“嚴(yán)格性”。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，雜交的嚴(yán)格性可以改變以便鑒定或檢測(cè)相同的或相關(guān)的多核苷酸序列。Nucleic Acid Hybridization，A PracticalApproach，Ed.Hames，B.D.和Higgins，S.J.，IRL Press，1985；Gall和Pardue，Proc.Natl.Acad Sci.，USA 63378-383，1969；和John等，Nature 223582-587，1969中對(duì)雜交技術(shù)進(jìn)行了一般性描述。
本發(fā)明也提供用于分離、純化、擴(kuò)增、檢測(cè)、鑒定、定量或捕獲天然的或合成的核酸的試劑盒，其中該試劑盒包括反應(yīng)體和如上定義的一種或多種LNA修飾的寡核苷酸(寡聚體)。LNA修飾的寡核苷酸優(yōu)選固定在所述的反應(yīng)體上。
對(duì)于根據(jù)本發(fā)明的試劑盒，反應(yīng)體優(yōu)選是固體支持材料，例如其選自硼硅玻璃、鈉鈣玻璃、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚丙烯、聚乙烯、聚乙二醇對(duì)苯二酸酯、聚醋酸乙烯酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚甲基丙烯酸甲酯和聚氯乙烯，優(yōu)選聚苯乙烯和聚碳酸酯。反應(yīng)體可以是標(biāo)本管、管形瓶、載玻片、片、薄膜、珠、小丸、盤、板、環(huán)、桿、網(wǎng)、濾墊、碟(tray)、微量滴定板、棒或多葉片棒的形式。
試劑盒通常帶有書面的說明書，說明使用該試劑盒的最佳條件。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及使用寡核苷酸用于分離、純化、擴(kuò)增、檢測(cè)、鑒定、定量或捕獲微RNA或小干擾RNA，其特征是該寡核苷酸含有一些核苷類似物。
更特別地，本發(fā)明提供具有高度靈敏性或好的選擇性的用于檢測(cè)和定量微RNA或小干擾RNA的方法。根據(jù)本發(fā)明，在對(duì)應(yīng)從100pM-10fM或更少(10aM)RNA靶標(biāo)濃度的樣品中，微RNA和小干擾RNA的定量在從10fmol-10amol RNA靶標(biāo)序列或更少(10zmol)的水平上是可檢測(cè)的。
在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明包括如Fig.1和Fig.9中顯示的以下步驟1)設(shè)計(jì)并合成兩個(gè)標(biāo)簽探針使得每種由互補(bǔ)于靶標(biāo)序列(例如成熟miRNA)的10-12nt的高度親和性的核苷酸序列和與靶標(biāo)序列或相互沒有任何互補(bǔ)性的錨定DNA序列組成。與在溶液中復(fù)雜核酸樣品中的靶標(biāo)序列合并，含有識(shí)別元件的兩個(gè)標(biāo)簽探針在嚴(yán)格條件下雜交，因而由靶標(biāo)序列確定使得兩個(gè)標(biāo)簽探針靠近相鄰，其中一個(gè)標(biāo)簽探針的5’-末端與一個(gè)標(biāo)簽探針的3’-末端鄰近。
2)由于其中一個(gè)探針的5’-末端經(jīng)磷酸化，使用DNA連接酶以及將靶標(biāo)序列(例如miRNA)作為模板，該靶標(biāo)-特異性標(biāo)簽探針由連接作用得以連接。該連接反應(yīng)可以使用熱穩(wěn)定性連接酶在高溫下進(jìn)行，并因而循環(huán)而增加用于隨后的PCR擴(kuò)增的模板分子的拷貝數(shù)。
3)高度親和性標(biāo)簽探針的以靶標(biāo)序列為模板的連接反應(yīng)后，將連接的探針分子用作定量實(shí)時(shí)PCR的模板，使用具有足夠雙鏈穩(wěn)定性的短檢測(cè)探針使得能結(jié)合至擴(kuò)增子，并采用同源測(cè)定法中使用的多種檢測(cè)原理的任何一種。
根據(jù)另一優(yōu)選的本發(fā)明實(shí)施方案，檢測(cè)和定量包括Fig.27中顯示的以下步驟a)將靶標(biāo)核糖核酸序列與寡核苷酸捕獲探針接觸，其中識(shí)別核苷酸序列與靶標(biāo)序列中的序列互補(bǔ)；b)使用DNA聚合酶和靶標(biāo)核糖核酸序列作為引物，合成捕獲序列探針中的錨定核苷酸序列的互補(bǔ)鏈。
c)固定形成的雙鏈于固體支持物上并使靶標(biāo)序列樣品富集，隨后將靶標(biāo)序列從固體支持物上釋放；d)使用逆轉(zhuǎn)錄酶以及將標(biāo)簽探針中的錨定核苷酸序列作為引物結(jié)合位點(diǎn)，通過逆轉(zhuǎn)錄合成靶標(biāo)核糖核酸的互補(bǔ)DNA鏈。
e)通過使用DNA聚合酶和第二標(biāo)簽探針作為引物合成第二鏈，置換雜雙鏈體中的核糖核酸序列，其中所述的第二標(biāo)簽探針由錨定核苷酸序列和識(shí)別核苷酸序列組成，其中所述的識(shí)別核苷酸序列互補(bǔ)于逆轉(zhuǎn)錄酶-延伸的核酸序列中的序列。
f)使用對(duì)應(yīng)連接在寡核苷酸標(biāo)簽探針上的錨定核苷酸序列的引物和包括靶標(biāo)識(shí)別序列和檢測(cè)部分的標(biāo)記的檢測(cè)探針通過實(shí)時(shí)PCR定量得到的核酸。
在另一優(yōu)選的本發(fā)明實(shí)施方案中，檢測(cè)和定量包括Fig.28中顯示的以下步驟a)將靶標(biāo)核糖核酸序列與寡核苷酸捕獲探針接觸，其中識(shí)別核苷酸序列與靶標(biāo)序列中的序列互補(bǔ)；b)使用DNA聚合酶以及將靶標(biāo)核糖核酸序列作為引物，合成捕獲探針中的錨定核苷酸序列的互補(bǔ)鏈；c)固定形成的雙鏈于固體支持物上并使靶標(biāo)樣品富集。
d)使用逆轉(zhuǎn)錄酶以及將捕獲探針作為引物，通過逆轉(zhuǎn)錄合成靶標(biāo)核糖核酸的互補(bǔ)DNA鏈；e)通過使用DNA聚合酶和第二標(biāo)簽探針作為引物合成第二鏈，置換雜雙鏈體中的核糖核酸序列，其中所述的第二標(biāo)簽探針由錨定核苷酸序列和識(shí)別核苷酸序列組成，并且其中所述的識(shí)別核苷酸序列互補(bǔ)于逆轉(zhuǎn)錄酶-延伸的核酸序列中的序列；f)隨后使用DNA聚合酶和引物對(duì)進(jìn)行靶標(biāo)序列為模板的PCR擴(kuò)增；e)使用對(duì)應(yīng)于連接在寡核苷酸標(biāo)簽探針上的錨定核苷酸序列的引物和包括靶標(biāo)識(shí)別序列和檢測(cè)部分的標(biāo)記的檢測(cè)探針通過實(shí)時(shí)PCR定量得到的核酸。
對(duì)于該固定的捕獲探針方法的一個(gè)優(yōu)勢(shì)是，不必進(jìn)行總RNA樣品的非蛋白質(zhì)編碼性RNA(例如小核仁RNA、siRNA、微RNA和反義RNA)的初始濃縮。優(yōu)選地，捕獲探針將雜交至溶液中的特異性靶標(biāo)上。其次，當(dāng)捕獲探針固定于固體支持物上時(shí)，可以除去未結(jié)合的物質(zhì)并因而進(jìn)行了特異性靶標(biāo)的濃縮。
在另一優(yōu)選的本發(fā)明實(shí)施方案，包括Fig.11中顯示的以下步驟1)設(shè)計(jì)并合成兩個(gè)標(biāo)簽探針即RT標(biāo)簽探針和2nd鏈標(biāo)簽探針，使得每種由對(duì)應(yīng)6-12nt的靶標(biāo)核糖核酸序列(例如成熟miRNA)的核苷酸識(shí)別序列和與靶標(biāo)序列或相互沒有任何互補(bǔ)性的錨定序列組成。RT標(biāo)簽探針的識(shí)別序列或RT和2nd鏈標(biāo)簽探針兩者通過高度親和性的核苷酸類似物(例如LNA)修飾。RT標(biāo)簽探針中的識(shí)別序列互補(bǔ)于靶標(biāo)核糖核酸序列中的序列，例如互補(bǔ)于成熟微RNA或siRNA的3’-末端或互補(bǔ)于位于靶標(biāo)核糖核酸序列中的RNA-編輯核苷酸、剪接點(diǎn)、單核苷酸多態(tài)性或點(diǎn)突變的3’的序列。RT標(biāo)簽探針在嚴(yán)格條件下雜交至復(fù)雜核酸樣品中的靶標(biāo)RNA序列并在使用逆轉(zhuǎn)錄酶的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中用作錨定引物來產(chǎn)生互補(bǔ)于靶標(biāo)RNA序列的錨定引物延伸產(chǎn)物。
2)2nd鏈標(biāo)簽探針包含識(shí)別序列，該識(shí)別序列互補(bǔ)于逆轉(zhuǎn)錄酶-延伸的核苷酸序列，所述的逆轉(zhuǎn)錄酶-延伸的核苷酸序列對(duì)應(yīng)成熟微RNA或siRNA的5’-末端或?qū)?yīng)位于初始的核糖核酸靶標(biāo)序列中的RNA-編輯核苷酸、剪接點(diǎn)、單核苷酸多態(tài)性或點(diǎn)突變的5’的序列。在嚴(yán)格雜交條件下2nd鏈標(biāo)簽探針雜交至RT反應(yīng)產(chǎn)物上并隨后作為錨定引物通過DNA聚合酶(例如熱穩(wěn)定性DNA聚合酶)來產(chǎn)生互補(bǔ)于引物延伸產(chǎn)物的第二條鏈。該反應(yīng)的特異性是基于依次使用錨定RT和2nd鏈標(biāo)簽探針，所述的兩種探針具有非交疊的識(shí)別序列，分別雜交至靶標(biāo)RNA和互補(bǔ)DNA序列的3’-末端和5’-末端區(qū)域。設(shè)計(jì)連接至標(biāo)簽探針的錨定序列使得它們?cè)诒景l(fā)明方法中使用的雜交條件下與給定轉(zhuǎn)錄組中的任何靶標(biāo)核酸或相互之間不發(fā)生交叉雜交。錨定序列在隨后的實(shí)時(shí)定量PCR中作為PCR引物的引發(fā)位點(diǎn)或作為捕獲測(cè)定法的標(biāo)簽。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)以及第二鏈反應(yīng)由于在識(shí)別序列中使用了高度親和性的核苷酸類似物(這是本發(fā)明的一個(gè)新的組分)可以使用熱穩(wěn)定性逆轉(zhuǎn)錄酶和熱穩(wěn)定性DNA聚合酶在高溫下進(jìn)行，因而增加了產(chǎn)生用于隨后PCR擴(kuò)增的模板分子的特異性。本發(fā)明另一新的組成是，發(fā)現(xiàn)所述的高度親和性識(shí)別序列(通過例如LNA修飾)可以用作逆轉(zhuǎn)錄酶或DNA聚合酶的引物，并且這種所述的高度親和性識(shí)別序列可以用作模板以通過DNA聚合酶來合成互補(bǔ)鏈。
3)靶標(biāo)RNA序列-特異性的逆轉(zhuǎn)錄和2nd鏈合成反應(yīng)后，將雙鏈分子用作定量實(shí)時(shí)PCR的模板，使用具有足夠雙鏈穩(wěn)定性的短檢測(cè)探針使得能結(jié)合至擴(kuò)增子，并采用同源測(cè)定法中使用的多種檢測(cè)原理的任何一種。
結(jié)合的檢測(cè)可以直接通過結(jié)合至靶標(biāo)序列后一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記的特性的可檢測(cè)的變化(例如具有或不具有莖結(jié)構(gòu)的分子信標(biāo)型檢測(cè)法)或間接通過結(jié)合后接著的反應(yīng)，例如在5’核酸酶檢測(cè)中通過DNA聚合酶的5’核酸酶活性的切割來進(jìn)行。檢測(cè)探針也是本發(fā)明的另一新的組成。其包括短的寡核苷酸部分，該序列經(jīng)選擇而使得能特異性檢測(cè)對(duì)應(yīng)核心片段中的靶標(biāo)序列和用作PCR引物的退火位點(diǎn)的錨定序列的短的擴(kuò)增的DNA分子。
設(shè)計(jì)用來檢測(cè)靶標(biāo)序列(例如不同的成熟miRNA靶標(biāo)分子)的新的、短的檢測(cè)探針使得能發(fā)現(xiàn)，十分短的8-12-mer LNA-DNA嵌合的、mix-mer探針與基于實(shí)時(shí)PCR的測(cè)定法相兼容。在本發(fā)明的一方面，將修飾的或核堿基類似物、核苷堿基或核苷酸整合進(jìn)標(biāo)簽探針以及檢測(cè)探針，有可能還有小溝結(jié)合劑和其它修飾，它們?nèi)坑糜诜€(wěn)定在探針和靶標(biāo)分子之間形成的雙鏈以使得最短的可能序列可用于雜交并檢測(cè)靶標(biāo)分子。在本發(fā)明優(yōu)選的方面，該修飾是整合LNA殘基而減少檢測(cè)探針的長(zhǎng)度至8或9或10或11或12至14個(gè)核苷酸而保持形成的雙鏈的足夠穩(wěn)定性使得在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)時(shí)PCR測(cè)定法條件下可以檢測(cè)。在本發(fā)明的另一優(yōu)選方面，用于連接反應(yīng)的一個(gè)或兩個(gè)標(biāo)簽探針中的靶標(biāo)識(shí)別序列或RT標(biāo)簽探針中的識(shí)別序列或用于RT-PCR反應(yīng)的RT標(biāo)簽探針和2nd鏈標(biāo)簽探針兩者中的識(shí)別序列在每?jī)蓚€(gè)、每三個(gè)或每四個(gè)核苷酸位置用LNA單體代替，同時(shí)分別在兩個(gè)探針的3’-末端具有至少一個(gè)DNA核苷酸，使得由于LNA修飾的寡核苷酸探針對(duì)它們互補(bǔ)靶標(biāo)分子，尤其是靶標(biāo)RNA分子具有增加的雙鏈穩(wěn)定性而能在高溫下進(jìn)行高度特異性和靈敏性的雜交事件。
在另一優(yōu)選的本發(fā)明實(shí)施方案，檢測(cè)和定量包括Fig.22中顯示的以下步驟a)將靶標(biāo)核糖核酸序列與權(quán)利要求1-3的寡核苷酸標(biāo)簽探針接觸，其中識(shí)別核苷酸序列與靶標(biāo)序列中的序列互補(bǔ)；b)用DNA聚合酶和靶標(biāo)核糖核酸序列作為引物合成標(biāo)簽探針中的錨定核苷酸序列的互補(bǔ)鏈；c)用逆轉(zhuǎn)錄酶和標(biāo)簽探針中的錨定核苷酸序列作為引物結(jié)合位點(diǎn)通過逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成靶標(biāo)核糖核酸的互補(bǔ)DNA鏈；d)用DNA聚合酶和第二標(biāo)簽探針作為引物通過合成第二鏈而代替雜雙鏈中核糖核酸序列，其中所述的第二標(biāo)簽探針由錨定核苷酸序列和識(shí)別核苷酸序列組成，其中所述的識(shí)別核苷酸序列與逆轉(zhuǎn)錄酶延伸的核酸序列中的序列互補(bǔ)；e)使用對(duì)應(yīng)連接在寡核苷酸標(biāo)簽探針上的錨定核苷酸序列的引物和含有識(shí)別序列及檢測(cè)部分的標(biāo)記的檢測(cè)探針通過實(shí)時(shí)PCR定量得到的核酸。
在另外的優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明包括如Fig.29中顯示的步驟。
在另外的優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明包括如Fig.30中顯示的步驟。
一個(gè)另外的實(shí)施方案包括使用含有“封閉探針”的LNA來防止RT-引物結(jié)合至超出成熟miRNA轉(zhuǎn)錄物長(zhǎng)度的模板。該封閉探針設(shè)計(jì)為結(jié)合與成熟miRNA序列3’區(qū)域側(cè)翼的pri-/前體miRNA序列內(nèi)的非成熟miRNA區(qū)互補(bǔ)的序列。另外該封閉探針設(shè)計(jì)為部分與成熟序列交疊，因而防止RT-引物(如在實(shí)施例12-16中描述的，并在Fig 11的步驟1中敘述)結(jié)合至pri-/前體序列并使得RT標(biāo)簽探針僅退火至成熟miRNA序列上。反應(yīng)步驟在Fig.33的步驟I和Fig.22.2-22.4中敘述。
在另一采用的實(shí)施方案中，成熟的miRNA序列(類似于HsamiRNA-15a序列，F(xiàn)ig 29)利用RT-引物而得以檢測(cè)，所述的RT-引物設(shè)計(jì)來抑制與超出某長(zhǎng)度的即例如pri-和pre-成熟miRNA的長(zhǎng)度的模板結(jié)合。這種封閉通過例如整合大的分子結(jié)構(gòu)進(jìn)RT-引物，或通過將短的含有LNA的探針(封閉探針)退火至引物而導(dǎo)入雙鏈結(jié)構(gòu)，定位來防止引物結(jié)合至超過成熟miRNA的長(zhǎng)度的模板上而獲得。設(shè)計(jì)的封閉引物使得僅允許成熟的miRNA序列退火，而更長(zhǎng)的模板不退火。反應(yīng)步驟在Fig.29中敘述。
在另外的實(shí)施方案中，前述實(shí)施方案中的RT-引物也包括在反應(yīng)中的一種PCR引物。任選地，其它PCR引物也可以設(shè)計(jì)為抑制結(jié)合至超過某長(zhǎng)度的模板。反應(yīng)步驟在Fig.29b中敘述。
另一實(shí)施方案采用將人工的寡核苷酸模板加入至反應(yīng)中。在其中miRNA從前體分子的遠(yuǎn)離3’-末端表達(dá)的情況中(類似于Has miR-143，序列Fig.30)，成熟的以及前體miRNA模板含有適于通過聚合酶(例如Klenow片段)延伸的3’-末端。通過采用如Fig.31中敘述的RT-引物(該引物隨后通過RNA-指導(dǎo)的DNA聚合酶(例如逆轉(zhuǎn)錄酶)延伸)，得到的模板取決于成熟的還是前體miRNA轉(zhuǎn)錄物用作模板將在長(zhǎng)度上不同。在實(shí)施例12-16以及如在Fig 11步驟2中敘述的2nd鏈標(biāo)簽探針已經(jīng)交換為在Fig.31中敘述的3’-封閉的人工寡核苷酸模板，而僅允許源于成熟miRNA的RT轉(zhuǎn)錄物的延伸。3’-封閉的人工寡核苷酸隨后用作模板來產(chǎn)生隨后PCR擴(kuò)增的引物位點(diǎn)。
在另一實(shí)施方案中，其中miRNA從前體分子的遠(yuǎn)離3’-末端表達(dá)(類似于Hsa miR-143序列，F(xiàn)ig.30)，成熟的miRNA利用雜交至逆轉(zhuǎn)錄的miRNA的3’-末端(最初的成熟miRNA的5’-末端)的PCR引物而得以檢測(cè)，并且該引物設(shè)計(jì)為抑制結(jié)合超出某長(zhǎng)度即例如逆轉(zhuǎn)錄的pri-/前體miRNA的長(zhǎng)度的模板。該封閉通過例如整合大的分子結(jié)構(gòu)進(jìn)這種PCR引物(例如，為環(huán)狀引物，其保留錨定序列并在給定的試驗(yàn)溫度下通過該寡核苷酸的5’-和3’-末端的互補(bǔ)序列介導(dǎo)形成分子內(nèi)發(fā)夾結(jié)構(gòu))或通過退火短的含有LNA的探針(封閉探針)至引物上而引入雙鏈結(jié)構(gòu)，定位以防止引物結(jié)合至超過成熟miRNA長(zhǎng)度的模板上。特定地設(shè)計(jì)該引物使得僅允許成熟的經(jīng)加工的miRNA序列退火，而更長(zhǎng)的模板不退火。反應(yīng)步驟在Fig.34中敘述。
在細(xì)胞中，微RNA分子既作為更長(zhǎng)的(超過70個(gè)核苷酸)pricursor和前體分子存在以及以活性形式的成熟miRNA(17-25個(gè)核苷酸)的形式存在。檢測(cè)微RNA分子中的一個(gè)挑戰(zhàn)是僅檢測(cè)成熟形式的分子，其為一個(gè)17-25bp長(zhǎng)的單鏈RNA分子。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，成熟miRNA作為引物，即miRNA雜交至模板上并通過能進(jìn)行RNA-引發(fā)的DNA-指導(dǎo)的DNA合成的酶延伸。其次，檢測(cè)依賴于該延伸的發(fā)生并且此外延伸的發(fā)生依賴在離退火至模板的位點(diǎn)期望距離處在miRNA的3’末端具有-OH終點(diǎn)，其用于確保僅檢測(cè)經(jīng)加工的成熟miRNA分子。在檢測(cè)反應(yīng)中使用靶標(biāo)(在該情況中為miRNA)作為引物的原理可以應(yīng)用于使用其它靶標(biāo)(既可以是DNA又可以是RNA)的其它檢測(cè)形式上。
本發(fā)明的一般方面許多非編碼RNA分子，例如微RNA分子十分短并不能容納用于逆轉(zhuǎn)錄酶、PCR擴(kuò)增兩者的引物以及任選地用于通過PCR的擴(kuò)增和檢測(cè)的經(jīng)標(biāo)記檢測(cè)探針。根據(jù)本發(fā)明，容納這個(gè)的一種解決方案是，將額外的序列附加至微RNA上，優(yōu)選通過使得能進(jìn)行成熟-特異性測(cè)定法的設(shè)計(jì)的方法進(jìn)行。
如描述的(參見實(shí)施例)，這種序列可以通過提供(通過序列特異性雜交)用于聚合酶反應(yīng)的模板給微RNA，并提供聚合酶(例如Klenow聚合酶)和核苷酸使得能進(jìn)行延伸，導(dǎo)致與提供的模板部分相似的序列附加在成熟的微RNA上。這種附加的序列可以單獨(dú)地或與微RNA的核酸序列一起部分容納用于逆轉(zhuǎn)錄酶、用于PCR擴(kuò)增或用于經(jīng)標(biāo)記的檢測(cè)探針的引物。
附加額外序列的另外的方法可以是連接反應(yīng)方法。在這樣一種反應(yīng)中，可將接頭核酸序列通過連接反應(yīng)連接至微RNA分子的3’-末端、5’-末端或兩個(gè)末端。這種連接反應(yīng)可以通過提供“橋連”核酸序列來幫助，所述的“橋連”核酸序列包含特異于成熟靶標(biāo)RNA序列的末端部分的核苷酸序列和特異于所述接頭分子的末端部分的核苷酸序列，這樣該成熟RNA靶標(biāo)和所述接頭分子在序列特異性雜交時(shí)得以相互緊密地靠近放置。這種通過連接反應(yīng)附加的序列可以單獨(dú)地或與微RNA的核酸序列一起部分容納用于逆轉(zhuǎn)錄酶、用于PCR擴(kuò)增或用于經(jīng)標(biāo)記的檢測(cè)探針的引物。
將額外序列附加至靶標(biāo)小RNA分子的另外的方法可以是非模板依賴的聚合酶反應(yīng)的方法。在這樣的一個(gè)實(shí)施方案中，將小靶標(biāo)RNA分子的樣品接受聚合酶反應(yīng)，提供polyA尾巴給樣品中存在的所有微RNA。這可以例如通過使用polyA聚合酶進(jìn)行。在另一個(gè)這種實(shí)施方案中，將小靶標(biāo)RNA分子的樣品接受末端轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)，當(dāng)分別加入dATP、dCTP、dGTP或dTTP時(shí)其能提供A、C、G或T多聚核苷酸尾給樣品中存在的所有微RNA?？蓪⑦@種提供了相似核苷酸的核苷酸尾巴的微RNA樣品通過在逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)中使用包含互補(bǔ)的相似核苷酸的引物轉(zhuǎn)化為cDNA，因而提供了具有附加的相似核苷酸的多聚核苷酸尾的微RNA的cDNA樣品。通過與微RNA序列的部分交疊，RT-引物也可以對(duì)特定的微RNA或一組微RNA或微RNA家族有特異性。這種cDNA樣品隨后用作使用對(duì)特定微RNA序列有特異性的引物的PCR擴(kuò)增的模板，所述的引物處于成熟微RNA序列內(nèi)或與通過不依賴模板的聚合酶反應(yīng)附加上的序列部分交疊。
一個(gè)這種實(shí)例描述于Fig.37中，其中總RNA樣品或僅含有大小在200個(gè)核苷酸以下的RNA的樣品級(jí)分接受polyA聚合酶而將polyA核苷酸尾附加在了所有的微RNA靶標(biāo)分子上。隨后，將polyT引物在逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)中用作引物將RNA樣品轉(zhuǎn)化為cDNA。所述的RT反應(yīng)可以進(jìn)一步通過讓RT-引物序列與對(duì)特定微RNA或一組微RNA或微RNA家族特異性的微RNA序列部分交疊而賦予序列特異性。隨后，將所述的cDNA樣品接受PCR擴(kuò)增，所述的PCR擴(kuò)增使用對(duì)特定微RNA靶標(biāo)有特異性的PCR引物以及任選地使用經(jīng)標(biāo)記的檢測(cè)探針。這種PCR引物可以整個(gè)或部分與附加的序列交疊。
本發(fā)明的一個(gè)廣泛的方面因而涉及用于定量測(cè)定具有最多100個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的短的RNA(其可以是這里描述的任何小RNA類型)的方法，所述的方法包括a)從含有所述短RNA的樣品制備模板多核苷酸，該模板多核苷酸由下列組成1)由所述短RNA序列、其對(duì)應(yīng)的DNA序列或與所述短RNA序列互補(bǔ)的核苷酸序列組成的單鏈靶標(biāo)序列以及2)5’或3’鄰接的核苷酸序列，b)在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)或核苷酸聚合作用中使用所述的模板多核苷酸來獲得cDNA鏈，并且c)進(jìn)行定量實(shí)時(shí)PCR(qPCR)，所述的cDNA用作模板并且任選地將模板多核苷酸用作模板。
本發(fā)明的這方面反映了本發(fā)明的最根本的概念，即短RNA的特定檢測(cè)可以通過在全部的步驟a-c中確保相對(duì)高程度的特異性以及每個(gè)步驟中的特異性增加了本方法的總體的特異性。一個(gè)主要的特征是在步驟a中的模板多核苷酸的提供，其中所述的模板包括在隨后的步驟中可用引物的“柄”的附加的序列，因而為所有必需的引物和使用的檢測(cè)探針提供了空間。正如這里的描述要表現(xiàn)的，這些“柄”對(duì)期望定量的短RNA既可以有特異性又可以無特異性，在特異性序列的情況下，在將這些特異性序列優(yōu)選地或特異性地加至短的RNA而不是包括短RNA的序列上的反應(yīng)中，這些特異性序列得以附加上短RNA上。
當(dāng)在內(nèi)容中使用術(shù)語“對(duì)應(yīng)于”時(shí)表示，對(duì)應(yīng)于參照核苷酸序列的核苷酸序列或者與參照序列相同或構(gòu)成了嚴(yán)格雜交于參照核苷酸序列的互補(bǔ)序列的序列。通常，這表示如果DNA序列的互補(bǔ)序列可以轉(zhuǎn)錄為討論的RNA序列，那么所述RNA序列相當(dāng)于所述DNA序列。
在本文中術(shù)語“cDNA”表示DNA片段，其可以或者通過模板多核苷酸的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)或者通過基于模板核苷酸的核苷酸聚合作用(例如DNA聚合作用)獲得。
如前面提到的短的RNA最多100個(gè)核苷酸，但通過本方法的手段可以測(cè)定更短的RNA。具有最多90、最多80、最多70、最多60、最多50、最多40、最多30以及最多25個(gè)核苷酸殘基的RNA可以通過本方法和試劑盒方便地測(cè)定，以及甚至更短的RNA，例如具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24和25個(gè)核苷酸殘基的那些RNA。優(yōu)選地，短的RNA具有16-25個(gè)核苷酸殘基之間的長(zhǎng)度。
用于步驟c中的qPCR的引物在一個(gè)實(shí)施方案中選自-至少2種寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的至少一種對(duì)應(yīng)于或互補(bǔ)于5’或3’鄰接的核苷酸序列中的序列-一個(gè)實(shí)施方案，其特別是如果兩個(gè)引物涉及鄰接的序列，受益于在步驟a和b中存在附加在5’和/或3’序列的特異性(對(duì)短RNA或源于其的序列特異性)序列和/或步驟b利用了對(duì)短RNA特異性的方法；-至少2種寡核苷酸，其中至少一種所述的寡核苷酸對(duì)應(yīng)于或互補(bǔ)于模板多核苷酸中的連續(xù)的序列，該模板多核苷酸由部分單鏈靶標(biāo)序列和部分鄰接的5’或3’核苷酸序列構(gòu)成-一個(gè)實(shí)施方案，其中由于部分短的RNA(或源于其的序列)的特異性識(shí)別而在步驟c中存在相對(duì)高程度的特異性，并且其中基于序列特異性方法而附加5’或3’核苷酸序列和/或步驟b利用對(duì)短RNA特異性的方法可能是有利的；以及-至少2種寡核苷酸，其中一種對(duì)應(yīng)于單鏈靶標(biāo)中的第一個(gè)核苷酸序列而另一種互補(bǔ)于該單鏈靶標(biāo)序列中的第二個(gè)核苷酸序列-一個(gè)實(shí)施方案，其中由于短RNA(或源于其的序列)的特異性識(shí)別而在步驟c中存在高度的特異性。
用于qPCR的所述的引物可以各自獨(dú)立地包括可檢測(cè)標(biāo)記。
在另外的實(shí)施方案中，在步驟(b)的反應(yīng)中利用逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)引物或DNA聚合作用引物，所述的引物對(duì)應(yīng)于或互補(bǔ)于單鏈靶標(biāo)序列或其對(duì)應(yīng)于或互補(bǔ)于由部分單鏈靶標(biāo)序列或部分鄰接的5’或3’核苷酸序列構(gòu)成的模板多核苷酸中的連續(xù)序列。優(yōu)選逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)引物或核苷酸聚合作用引物特異于至少一種短RNA；這反映的事實(shí)是在一些短RNA屬于具有高度序列一致性的某些家族。
附加上的5’和/或3’鄰接核苷酸序列在一些實(shí)施方案中是由相同的核苷酸組成的多核苷酸(可以通過利用用于附加序列的末端轉(zhuǎn)移酶或通過利用加入相同核苷酸殘基的聚合酶而獲得)。
無論如何，單鏈靶標(biāo)序列和5’和/或3′鄰接核苷酸序列可以通過共價(jià)作用也可通過非共價(jià)連接-重要的問題是該模板序列是否在步驟b中可以接受逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)或核苷酸聚合作用。
在一些實(shí)施方案中5’和/或3’鄰接的核苷酸序列包括可檢測(cè)的標(biāo)記，因而有助于后面的檢測(cè)。
在大多數(shù)實(shí)施方案中，5’和/或3’鄰接核苷酸序列通過酶促反應(yīng)連接至單鏈靶標(biāo)序列上，但也考慮通過非酶促反應(yīng)。
可用于加入相同核苷酸的酶包括以下(使用IUBMB酶命名法)轉(zhuǎn)移酶EC 2.7.7.19(多核苷酸腺苷酰基轉(zhuǎn)移酶)、EC 2.7.7.52(RNA尿苷酰轉(zhuǎn)移酶)和EC 2.7.7.31(DNA核苷酸外轉(zhuǎn)移酶)。
連接酶EC 6.5.1.1(DNA連接酶(ATP))、EC 6.5.1.2(DNA連接酶(NAD+))和EC 6.5.1.3(RNA連接酶(ATP))。
在某些實(shí)施方案中，5’和/或3’鄰接的核苷酸序列在樣品RNA所來源的有機(jī)體中天然不存在。據(jù)信這減少在樣品中檢測(cè)到不相關(guān)序列的風(fēng)險(xiǎn)。優(yōu)選5’和/或3’鄰接的核苷酸序列是非哺乳動(dòng)物的。
在另外的實(shí)施方案中，步驟(a)包括通過連接反應(yīng)將5’和/或3’鄰接核苷酸序列連接至短RNA而制備模板多核苷酸，或步驟(a)包括通過在末端轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)中，優(yōu)選在poly-A轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)中將5’和/或3’鄰接核苷酸序列連接至短RNA而制備模板多核苷酸。連接反應(yīng)既可以是序列特異性的(例如突出端連接反應(yīng))和平末端連接反應(yīng)，但優(yōu)選利用突出端連接反應(yīng)。在優(yōu)選的突出端連接反應(yīng)方案中，該方法涉及將部分互補(bǔ)于5’或3’鄰接核苷酸序列的連接酶-活性末端和部分互補(bǔ)于短RNA分子的連接酶-活性末端的寡核苷酸退火至短RNA，這樣使5’或3’鄰接核苷酸序列的連接酶活性末端直接鄰接小RNA分子的連接酶-活性末端而使得能進(jìn)行突出端連接。
使用連接反應(yīng)或末端轉(zhuǎn)移酶的一個(gè)主要優(yōu)勢(shì)是樣品中的所有RNA使得能用于隨后的步驟(其然后在另一方面，應(yīng)該是高度特異性的)。這使得產(chǎn)生了例如一個(gè)非特異性的cDNA文庫，該文庫后面在b和c中可用于更特異性的步驟。
通常，連接反應(yīng)或末端轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)僅在靶標(biāo)序列的3’末端進(jìn)行，但通過在進(jìn)行連接反應(yīng)前將靶標(biāo)序列的5’末端磷酸化可進(jìn)行對(duì)靶標(biāo)序列5’末端的連接反應(yīng)。無論如何，為了避免鄰接核苷酸序列的“自我-連接”，優(yōu)選封閉一個(gè)末端(因?yàn)檫B接酶需要分子中的3’-羥基和5’-磷酸來連接，這對(duì)技術(shù)人員來說是相當(dāng)容易的)。因而，在進(jìn)行連接反應(yīng)前將5’鄰接核苷酸序列在其5’末端封閉而將3’鄰接核苷酸序列在其3’末端封閉，并且因?yàn)檫@兩種核苷酸序列通常在分開的步驟加入，這避免了它們的自我-連接。
在步驟(a)中5′和/或3’鄰接核苷酸序列優(yōu)選地或?qū)Ｒ坏剡B接至規(guī)定加工狀態(tài)的所述的短RNA上。這意味著用于附加鄰接核苷酸序列的方法利用了取決于在短RNA中游離3’或5’末端的存在的序列偶聯(lián)步驟(藉此，引入了對(duì)例如成熟前RNA的辨別，所述的成熟前RNA包括相同的序列，但在其相應(yīng)的末端不相同)。優(yōu)選規(guī)定加工狀態(tài)的所述的RNA是成熟狀態(tài)。
在許多實(shí)施方案中步驟(b)包括模板多核苷酸的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)以獲得cDNA(參見例如Fig.27)。然而，如上面提到的，步驟b也可以包括步驟b中的核苷酸聚合作用而獲得cDNA(參見，例如Fig.31的實(shí)施方案)。
除了利用連接反應(yīng)或末端轉(zhuǎn)移酶，步驟(a)可以包括核苷酸聚合作用的步驟來連接鄰接的核苷酸序列。用于這個(gè)目的的聚合酶既可以是非模板依賴的也可以是模板依賴的聚合酶。通常采用的聚合酶是DNA聚合酶。
盡管優(yōu)選的實(shí)施方案利用模板特異性的聚合作用，該聚合作用也可以包括加入poly-A，poly-G、poly-T或poly-C尾至靶標(biāo)序列的3’-末端。
然而，如已經(jīng)提到的，目前優(yōu)選的實(shí)施方案要求使用模板特異性方法。在檢測(cè)微RNA的情況中，本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)是能區(qū)分成熟的和成熟前的微RNA，并且在該方面考慮兩種不同的情形是重要的其中微RNA位于其成熟前前體的3’末端的情形和其中微RNA位于成熟前前體的5’末端的情形。為了把成熟形式與這些前體的每種區(qū)分開來，使用了不同的方法。
下面的實(shí)施方案說明了獲得這種區(qū)分的多種方法，但不以任何方式限制對(duì)微RNA的定量，因?yàn)楫?dāng)定量或檢測(cè)任意短RNA時(shí)這些實(shí)施方案是可以使用的一個(gè)實(shí)施方案(參見Fig.27)要求步驟(a)包括通過以下步驟制備模板多核苷酸-將短RNA的3’末端退火至寡核苷酸捕獲探針上(它的5’末端與該短RNA的3’末端互補(bǔ))，以及-用寡核苷酸捕獲探針作為模板通過核苷酸聚合作用延伸短RNA以便獲得構(gòu)成模板多核苷酸的延伸了的短RNA分子。通常，核苷酸聚合作用包括DNA聚合作用以獲得RNA-DNA雜合物，其構(gòu)成了模板多核苷酸。
在該實(shí)施方案中，步驟(b)優(yōu)選包括逆轉(zhuǎn)錄RNA-DNA雜合鏈獲得cDNA，任選在除去了沒有退火至寡核苷酸捕獲探針上的物質(zhì)后進(jìn)行(如果該捕獲探針包括使得能實(shí)現(xiàn)固定的標(biāo)簽的話，這可以獲得)。在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中，使用的引物可以是寡核苷酸捕獲探針本身或，是單獨(dú)的逆轉(zhuǎn)錄引物(當(dāng)捕獲探針可以固定時(shí)，通常是這種情況-在那個(gè)情況中，將雙鏈變性并將模板轉(zhuǎn)移至另外的容器中，在其中加入新的引物和其它試劑)。
另一個(gè)實(shí)施方案(參見Fig.31)要求步驟(a)包括通過以下步驟制備模板多核苷酸-將短RNA的5’末端退火至寡核苷酸捕獲探針上，所述的捕獲探針的3’末端互補(bǔ)于短RNA的5’并且其5’末端包括5’鄰接核苷酸序列，以及-使用短RNA作為模板通過逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)延伸該捕獲探針獲得延伸了的捕獲探針，其構(gòu)成了模板多核苷酸。在該情況中，模板多核苷酸不包括任何起始的短RNA。
這個(gè)實(shí)施方案可以進(jìn)一步要求步驟(b)包括將短RNA從延伸了的捕獲探針上除去(例如通過升高溫度)，讓捕獲探針以其3’末端退火至輔助寡核苷酸上，所述的輔助寡核苷酸包括與3’鄰接核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列，并且用輔助寡核苷酸作為模板通過DNA聚合作用的方式進(jìn)一步在5’→3’方向延長(zhǎng)該捕獲探針而獲得cDNA。因而，在這個(gè)實(shí)施方案中，有5’和3’鄰接核苷酸序列兩者的加入，這都通過靶標(biāo)序列特異性方法加入。
如提到的，如果捕獲寡核苷酸含有能使其固定于固相支持物上的部分則可以有益于這兩個(gè)實(shí)施方案。在這樣的實(shí)施方案中，退火后通常將捕獲探針固定以便能除去未退火的物質(zhì)。
這里描述的所有實(shí)施方案可通過在步驟(a)中富集樣品的短的RNA而得以優(yōu)化-這可以通過多種技術(shù)人員已知的方法(大小排阻色譜法、電泳法等)完成。這降低了在測(cè)定步驟中獲得來源于mRNA中的序列和其它長(zhǎng)RNA片段的假陽性采樣的風(fēng)險(xiǎn)。
根據(jù)本發(fā)明的原理，步驟c可以需要任何在此描述的檢測(cè)方法。然而優(yōu)選步驟(c)包括使用包含經(jīng)修飾的核苷酸(例如LNA核苷酸)的檢測(cè)探針。在多數(shù)這些實(shí)施方案中，該檢測(cè)探針對(duì)應(yīng)于或互補(bǔ)于短RNA中的序列，但是如果早先的步驟a和b足夠特異性，這不是必須的-在那些情況中，該檢測(cè)探針可以對(duì)來自步驟b的反應(yīng)產(chǎn)物的其它部分是特異性的。
而且用于逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)或DNA聚合作用或一般來說步驟a-c中的多種引物(和/或捕獲探針和/或輔助寡核苷酸)可以包括經(jīng)修飾的核苷酸。主要的優(yōu)勢(shì)是，引物和其它寡核苷酸的全長(zhǎng)可以減少，因?yàn)槔鏛NA表現(xiàn)出與DNA高度雜交，所以使用短的寡核苷酸可以獲得序列特異性結(jié)合。
在步驟c中的檢測(cè)中利用與步驟b中使用的相同引物作為引物(即由在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中或步驟(b)的核苷酸聚合作用中使用的引物構(gòu)成的引物)也是可能的。此外，如果步驟中的特異性程度在整體上足夠高使得能進(jìn)行短RNA的“無噪聲”檢測(cè)，則在步驟c中使用這種“再循環(huán)的”引物將不會(huì)明顯地影響該方法。
根據(jù)本發(fā)明的這種一般方面的描述，本發(fā)明也涉及用于定量測(cè)定具有最多100個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的成熟的短RNA的試劑盒，所述的試劑盒包含-可用于這里描述的方法最小數(shù)目的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)引物和/或核苷酸聚合作用引物和/或用于qPCR的引物和/或寡核苷酸捕獲探針和/或輔助寡核苷酸探針和/或寡核苷酸探針，其中逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)引物、核苷酸聚合反應(yīng)引物、用于qPCR的引物、寡核苷酸捕獲探針、輔助寡核苷酸和寡核苷酸具有上面所描述的性質(zhì)；和-關(guān)于使用逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和/或核苷酸聚合作用引物和/用于qPCR的引物和/或寡核苷酸捕獲探針和/或輔助寡核苷酸和/或寡核苷酸探針來定量測(cè)定短RNA的說明書。
涉及試劑盒的條款的所有公開內(nèi)容作了必要地細(xì)節(jié)上的改動(dòng)來生產(chǎn)該試劑盒。該試劑盒可進(jìn)一步包括如這里描述的一種或多種酶和其它試劑。
作為這種“最小試劑盒”的一個(gè)實(shí)例，提供了以下物質(zhì)用于進(jìn)行在Fig.27中列出的方法(參考引物和探針是可選的)miR-特異性測(cè)定法●Biotinyleret LNA捕獲探針●miR-特異性反向引物●miR-特異性正向引物和反向引物●miR-特異性雙-標(biāo)記探針●RNA對(duì)照寡核苷酸●DNA對(duì)照寡核苷酸參照的U6 snoRNA測(cè)定法●參照U6 snoRNA RT引物/隨機(jī)六聚體引物●參照U6 snoRNA引物和雙-標(biāo)記探針
本發(fā)明的另外方面一旦選取了合適的靶標(biāo)序列，LNA取代的標(biāo)簽探針和檢測(cè)探針優(yōu)選使用如本領(lǐng)域描述的商業(yè)提供的方法和設(shè)備(Tetrahedron 543607-30，1998)用化學(xué)方法合成。例如，固相亞磷酰胺方法可以用于產(chǎn)生短的LNA探針(Caruthers等，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.47411-418，1982；Adams等，J.Am.Chem.Soc.105661(1983))。
含有LNA的探針通常在合成時(shí)標(biāo)記。亞磷酰胺合成方法的靈活性此外有助于容易產(chǎn)生攜帶有全部商業(yè)可得的連接物、熒光團(tuán)以及用于該標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)的標(biāo)記分子的LNA。LNA也可以通過酶促反應(yīng)(例如通過激酶反應(yīng))標(biāo)記。
根據(jù)本發(fā)明的檢測(cè)探針可以包括單個(gè)標(biāo)記或多個(gè)標(biāo)記。在一方面，多個(gè)標(biāo)記包括一對(duì)標(biāo)記，當(dāng)發(fā)生檢測(cè)探針雜交至靶標(biāo)序列時(shí)，其相互作用或者產(chǎn)生信號(hào)或產(chǎn)生信號(hào)變化。
在另一方面，該檢測(cè)探針包括熒光團(tuán)部分和淬滅物部分，定位方式使得探針的雜交狀態(tài)可以通過該核苷酸的熒光信號(hào)的增加與該探針的未雜交狀態(tài)區(qū)分出來。在一方面，除了識(shí)別元件外，檢測(cè)探針還包括第一和第二互補(bǔ)序列，當(dāng)該探針未雜交至靶標(biāo)分子中的識(shí)別序列時(shí)，其相互特異性雜交，使得淬滅物分子足夠鄰近所述的報(bào)告分子來淬滅報(bào)告分子的熒光。與靶標(biāo)分子雜交隔開了淬滅物與報(bào)告分子并產(chǎn)生信號(hào)，該信號(hào)與雜交的量成比例。
在另一方面，核酸分子的鏈的聚合可以用具有5’核酸酶活性的聚合酶檢測(cè)。熒光團(tuán)和淬滅物分子足夠鄰近地整合進(jìn)探針中，這樣當(dāng)探針雜交至其識(shí)別序列時(shí)淬滅物淬滅了熒光團(tuán)分子的信號(hào)。通過具有5’核酸酶活性的聚合酶對(duì)探針的切割導(dǎo)致了淬滅物和熒光團(tuán)分子的分離，并按核酸序列的增加導(dǎo)致增加量的信號(hào)。
靶標(biāo)核酸分子的合適樣品可以包括廣范圍的真核和原核細(xì)胞，包括原生質(zhì)體；或可能包含靶標(biāo)核酸的其它生物材料。該方法因而可以應(yīng)用于組織培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞(例如血液、血清、血漿、網(wǎng)狀細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、尿、骨髓組織、腦脊液或從血液或淋巴制備的任何產(chǎn)品)或任何類型的組織的活檢樣品(例如肌肉活檢樣品、肝臟活檢樣品、腎臟活檢樣品、膀胱活檢樣品、骨活檢樣品、軟骨活檢樣品、皮膚活檢樣品、胰腺活檢樣品、腸道活檢樣品、胸腺活檢樣品、乳房活檢樣品、子宮活檢樣品、睪丸活檢樣品、眼活檢樣品或腦活檢樣品，例如，在溶解緩沖液中勻漿)、archival tissue核酸、植物細(xì)胞或?qū)B壓休克敏感的其它細(xì)胞以及細(xì)菌、酵母、病毒、支原體、原生動(dòng)物、立克次體、真菌的細(xì)胞和其它小的微生物細(xì)胞等等。
多種擴(kuò)增反應(yīng)是本領(lǐng)域一般技術(shù)人員所周知的，并包括(但不限于)PCR、RT-PCR、LCR、體外轉(zhuǎn)錄、滾環(huán)PCR和OLA等等。多種引物也可用于多重PCR用于檢測(cè)一組特定的靶標(biāo)分子。
優(yōu)選地，本發(fā)明的標(biāo)簽探針以及檢測(cè)探針經(jīng)修飾以便在相同的雜交條件下或嚴(yán)格雜交條件下使探針對(duì)靶標(biāo)序列的結(jié)合親和性與沒有修飾的相同探針相比增加至少兩倍。優(yōu)選的修飾包括(但不限于)將已經(jīng)通過化學(xué)部分修飾或通過類似物代替的核堿基、核苷堿基或核苷酸包括在內(nèi)以增加結(jié)合親和性。優(yōu)選的修飾也可以包括連接雙鏈-穩(wěn)定劑，例如小溝結(jié)合劑(MGB)或插入核酸(INA)。而且，優(yōu)選的修飾也可以包括加入非辨別性堿基(例如5-硝基吲哚)，其能穩(wěn)定雙鏈形成而不考慮靶標(biāo)鏈上的相對(duì)位置處的核堿基。最后，包括非糖-磷酸骨架(例如PNA，其能讓序列特異性結(jié)合至靶標(biāo)序列)的多探針也認(rèn)為是修飾。所有上述不同的增加結(jié)合親和性的修飾將在下文中稱為“穩(wěn)定化修飾”，以及標(biāo)簽探針和檢測(cè)探針將在下面也稱為“經(jīng)修飾的寡核苷酸”。更優(yōu)選地，經(jīng)修飾的寡核苷酸的結(jié)合親和性比相同序列但沒有穩(wěn)定化修飾的探針的結(jié)合高至少約3倍、4倍、5倍或20倍。
更優(yōu)選地，穩(wěn)定化修飾是將一個(gè)或多個(gè)LNA核苷酸類似物包括在內(nèi)。根據(jù)本發(fā)明的6-30個(gè)核苷酸的探針可以包括1-8個(gè)穩(wěn)定化核苷酸，例如LNA核苷酸。當(dāng)包括至少兩個(gè)LNA核苷酸時(shí)，這些核苷酸可以是連續(xù)的或由一個(gè)或多個(gè)非LNA核苷酸隔開。在一個(gè)方面，LNA核苷酸是α和/或木糖型LNA核苷酸。
本發(fā)明也提供包括具有如上定義的穩(wěn)定化修飾的標(biāo)簽探針和檢測(cè)探針的探針文庫。優(yōu)選地，檢測(cè)探針長(zhǎng)度是少于約20個(gè)核苷酸并更優(yōu)選少于15個(gè)核苷酸，并最優(yōu)選約7或8或9或10或11個(gè)核苷酸。而且，優(yōu)選地，標(biāo)簽探針長(zhǎng)度少于約40個(gè)核苷酸并更優(yōu)選少于35個(gè)核苷酸，并最優(yōu)選約20或30個(gè)核苷酸。而且，優(yōu)選地，標(biāo)簽探針連接反應(yīng)和用于RT-PCR反應(yīng)的RT標(biāo)簽探針以及2nd鏈標(biāo)簽探針包括長(zhǎng)度少于約15個(gè)核苷酸的高度親和性的標(biāo)簽識(shí)別序列，所述標(biāo)簽識(shí)別序列更優(yōu)選少于14個(gè)核苷酸，并且最優(yōu)選在6-13個(gè)核苷酸之間，并且另外包括作為PCR引物的引發(fā)位點(diǎn)的錨定序列，其長(zhǎng)為少于約30個(gè)核苷酸并更優(yōu)選少于25個(gè)核苷酸，并且最優(yōu)選在15-20個(gè)核苷酸之間。含有標(biāo)記的檢測(cè)探針的探針文庫取決于連接在識(shí)別元件上的檢測(cè)元件的類型可用于多種應(yīng)用。這些應(yīng)用包括(但不限于)雙或單標(biāo)記測(cè)定法(例如5’核酸酶測(cè)定法)、分子信標(biāo)應(yīng)用(見例如Tyagi and Kramer Nat.Biotechnol.14303-308，1996)和其它基于FRET的測(cè)定法。
現(xiàn)存的用于如上列出的微RNA、siRNA、RNA-編輯的轉(zhuǎn)錄物、選擇性剪接變體和反義非編碼RNA的定量檢測(cè)法的問題通過使用本發(fā)明的探針，結(jié)合本發(fā)明的任何方法得以解決，這包括一組RNA標(biāo)簽探針和檢測(cè)探針或組合2nd鏈標(biāo)簽探針和檢測(cè)探針的RNA RT標(biāo)簽探針的探針組，選擇這些探針以識(shí)別或檢測(cè)在給定生物體的給定細(xì)胞類型中的多數(shù)全部發(fā)現(xiàn)的和檢測(cè)的miRNA、RNA-編輯的轉(zhuǎn)錄物、siRNA、選擇性剪接變體和反義非編碼RNA。在一方面，探針文庫包括標(biāo)記和檢測(cè)哺乳動(dòng)物成熟miRNA，例如小鼠、大鼠、兔、猴或人miRNA的探針。通過提供合算的可用于成熟miRNA、RNA-編輯的轉(zhuǎn)錄物、siRNA、選擇性剪接變體和反義非編碼RNA的定量實(shí)時(shí)的和終末-點(diǎn)PCR測(cè)定法的方法，本發(fā)明克服了上面討論的特別是常規(guī)miRNA測(cè)定法和siRNA測(cè)定法的局限性。根據(jù)本發(fā)明的檢測(cè)探針的檢測(cè)元件可以是單或雙標(biāo)記的(例如通過在探針的每端包括一個(gè)標(biāo)記或在內(nèi)部位置包括標(biāo)記)。因而，根據(jù)本發(fā)明的探針可以適用于5’核酸酶測(cè)定法、分子信標(biāo)測(cè)定法、FRET測(cè)定法以及其它類似的測(cè)定法。在一方面，測(cè)定探針包括兩個(gè)標(biāo)記，其能相互作用而產(chǎn)生信號(hào)或改變信號(hào)，這樣當(dāng)探針雜交至靶標(biāo)序列時(shí)信號(hào)或信號(hào)的改變可以得以檢測(cè)。一個(gè)特別的方面是當(dāng)有兩個(gè)標(biāo)記時(shí)包括淬滅物和報(bào)告分子。
在另一方面，探針包括靶標(biāo)-特異性識(shí)別片段，該片段能特異性雜交至包括互補(bǔ)識(shí)別序列的靶標(biāo)分子。稱為“具有莖桿區(qū)域的分子信標(biāo)”的本發(fā)明的一個(gè)特別的檢測(cè)方面是，當(dāng)識(shí)別序列的側(cè)翼是第一和第二個(gè)互補(bǔ)的能形成發(fā)夾的序列時(shí)，其能退火形成發(fā)夾。將一個(gè)報(bào)告標(biāo)記連接至一個(gè)互補(bǔ)序列的末端并將淬滅部分連接至另一互補(bǔ)序列的末端。當(dāng)?shù)谝缓偷诙パa(bǔ)序列雜交時(shí)(即，當(dāng)探針識(shí)別序列與其靶標(biāo)不雜交時(shí))形成的莖桿部分使得這兩個(gè)標(biāo)記相互靠近鄰接而引起信號(hào)，該信號(hào)由報(bào)告分子產(chǎn)生，通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)而淬滅。當(dāng)探針雜交至靶標(biāo)序列時(shí)減少了這兩種標(biāo)記的距離并且這種距離的減少產(chǎn)生了標(biāo)記之間相互作用的改變。因而探針的雜交導(dǎo)致了報(bào)告分子產(chǎn)生信號(hào)(例如熒光)，該信號(hào)可以檢測(cè)和/或定量。
然而在另一方面，靶標(biāo)檢測(cè)探針在短的靶標(biāo)識(shí)別序列的相對(duì)的末端包含報(bào)告分子和淬滅分子，這樣這些部分相互足夠接近，因而淬滅分子相當(dāng)?shù)販p少了報(bào)告分子產(chǎn)生的信號(hào)。當(dāng)探針游離于溶液中以及當(dāng)其結(jié)合至靶標(biāo)核酸上時(shí)就是這種情況。稱為“5’核酸酶測(cè)定法”的本發(fā)明的一個(gè)特別的檢測(cè)方面是檢測(cè)探針易于受DNA聚合酶的5’核酸酶活性的切割。該反應(yīng)可能引起淬滅分子與報(bào)告分子分離并產(chǎn)生可檢測(cè)的信號(hào)。因而，這種探針可用于基于擴(kuò)增的測(cè)定法來檢測(cè)和/或定量靶標(biāo)核酸的擴(kuò)增過程。
本發(fā)明也提供方法、體系和存于計(jì)算機(jī)可讀取的介質(zhì)中的計(jì)算機(jī)程序(“計(jì)算機(jī)程序產(chǎn)品”)來設(shè)計(jì)包含至少一個(gè)穩(wěn)定化核堿基的標(biāo)簽探針和檢測(cè)探針。本方法包括查詢靶標(biāo)序列的數(shù)據(jù)庫(例如登記于http//www.sanger.ac.uk/Software/Rfam/mirna/index.shtml的miRNA)并設(shè)計(jì)探針，該探針i)在嚴(yán)格雜交條件下具有足夠的結(jié)合穩(wěn)定性來結(jié)合它們各自的靶標(biāo)序列，ii)具有有限的傾向與自身形成雙鏈結(jié)構(gòu)，以及iii)能結(jié)合并檢測(cè)/定量給定數(shù)據(jù)庫中的至少約60％、至少約70％，至少約80％、至少約90％或至少約95％的全部靶標(biāo)序列。
捕獲探針設(shè)計(jì)程序。
本發(fā)明也提供方法、體系和存于計(jì)算機(jī)可讀取的介質(zhì)中的計(jì)算機(jī)程序(“計(jì)算機(jī)程序產(chǎn)品”)來設(shè)計(jì)核苷酸序列來實(shí)現(xiàn)捕獲探針。
本方法包括以下步驟
a)最初猜測(cè)一個(gè)或多個(gè)核苷酸序列來實(shí)現(xiàn)捕獲探針；b)基于條件和目標(biāo)的實(shí)現(xiàn)重復(fù)改良最初的猜測(cè)；c)當(dāng)足夠滿足該條件和目標(biāo)(也包括用于本方法的計(jì)算時(shí)間)時(shí)終止該算法。
解鏈穩(wěn)度稱為“Tm”這三個(gè)步驟的詳細(xì)描述A)初始的猜測(cè)是基于miRNA序列去匹配一系列合適的通過使用引物發(fā)現(xiàn)軟件找到的反向引物(引物3)。產(chǎn)生隨機(jī)序列來補(bǔ)足該捕獲探針的非初始猜測(cè)部分。隨機(jī)產(chǎn)生通過使用雙核苷酸Tm表來引導(dǎo)以確保序列具有在目標(biāo)Tm值附近的Tm。
B)重復(fù)改良通過打分函數(shù)引導(dǎo)，該打分函數(shù)基于目標(biāo)和條件以及雙核苷酸Tm表。做隨機(jī)改變以避免最適度以下的重復(fù)。
C)當(dāng)基于目標(biāo)、條件和計(jì)算時(shí)間的打分函數(shù)得到滿足時(shí)終止該算法。
獲得引物和探針條件的目標(biāo)列于以下1.捕獲探針與miRNA雜交的解鏈溫度條件捕獲探針和miRNA形成的雙鏈的解鏈溫度擴(kuò)展為適于DNA聚合酶延伸反應(yīng)。該雙鏈內(nèi)的寡核苷酸長(zhǎng)度應(yīng)該滿足上述的DNA聚合酶延伸反應(yīng)的Tm條件。miRNA雜交至捕獲探針的3’-末端。
2.捕獲探針和DNA聚合酶延伸的miRNA形成的雙鏈的解鏈溫度條件捕獲探針和DNA聚合酶延伸的miRNA靶標(biāo)形成的雙鏈的Tm不允許超過能變性該雜雙鏈而不破壞RNA-DNA靶標(biāo)的溫度。
3.捕獲探針和逆轉(zhuǎn)錄(RT)引物之間的關(guān)系RT引物與捕獲探針的5’-末端序列相同并雜交至DNA聚合酶-延伸的miRNA的3’-末端。RT引物和DNA聚合酶-延伸的miRNA形成的這種雙鏈的Tm必須適于使用逆轉(zhuǎn)錄酶的第一鏈合成。
4.成熟的和前體miRNA之間的區(qū)別前體miRNA的3’-末端不允許在給定的捕獲反應(yīng)的雜交條件下以顯著量的寡核苷酸雜交至捕獲探針上。同樣，在前體miRNA序列內(nèi)在成熟miRNA基序后的前面的單體不允許雜交至非miRNA-相關(guān)的捕獲探針序列。
每個(gè)設(shè)計(jì)的探針和引物的一般條件是要求低的自身-退火和低的自身-雜交。
雙標(biāo)記的探針設(shè)計(jì)程序。
本發(fā)明也提供方法、體系和存于計(jì)算機(jī)可讀取的介質(zhì)中的計(jì)算機(jī)程序(“計(jì)算機(jī)程序產(chǎn)品”)來設(shè)計(jì)核苷酸序列來實(shí)現(xiàn)雙標(biāo)記探針。雙標(biāo)記探針用于最大特異性地檢測(cè)特定的miRNA或特定的miRNA家族。
雙標(biāo)記探針必需滿足以下條件a)要求低的自身-退火和低的自身-雜交。
b)必須退火至靶標(biāo)而具有合適的Tm來在PCR反應(yīng)中起作用。
c)在PCR反應(yīng)中必須不退火至引物。
本方法包括以下步驟A)設(shè)計(jì)對(duì)miRNA或miRNA家族具有最大特異性的探針。滿足條件(稱為雙標(biāo)記探針匹配)的優(yōu)選探針通過該雙標(biāo)記探針結(jié)合至其它miRNA的能力來研究。然后根據(jù)打分函數(shù)給雙標(biāo)記探針匹配賦予特異性分值。序列匹配、序列長(zhǎng)度以及序列中LNA-修飾的核苷酸的使用決定雙標(biāo)記探針匹配。
B)雙標(biāo)記探針通過它們滿足上述條件的程度來打分。根據(jù)打分函數(shù)雙標(biāo)記探針通過它們滿足上述條件的程度來打分。特異性分?jǐn)?shù)和滿足條件的分?jǐn)?shù)然后用于確定最好的雙標(biāo)記探針的核苷酸序列。
淬滅分子優(yōu)選選自如EP申請(qǐng)案No.2004078170.0中公開的暗淬滅分子(dark quencher)，特別是選自1，4-雙-(3-羥基-丙基氨基)-蒽醌、1-(3-(4，4’-二甲氧基-三苯甲氧基)丙基氨基)-4-(3-羥基丙基氨基)-蒽醌、1-(3-(2-氰基乙氧基(二異丙基氨基)膦氧基)丙基氨基)-4-(3-(4，4’-二甲氧基-三苯甲氧基)丙基氨基)-蒽醌(#Q1)、1，5-雙-(3-羥基-丙基氨基)-蒽醌、1-(3-羥基丙基氨基)-5-(3-(4，4’-二甲氧基-三苯甲氧基)丙基氨基)-蒽醌、1-(3-(氰基乙氧基(二異丙基氨基)膦氧基)丙基氨基)-5-(3-(4，4’-二甲氧基-三苯甲氧基)丙基氨基)-蒽醌(#Q2)、1，4-雙-(4-(2-羥基乙基)苯基氨基)-蒽醌、1-(4-(2-(4，4’-二甲氧基-三苯甲氧基)乙基)苯基氨基)-4-(4-(2-羥基乙基)苯基氨基)-蒽醌、1-(4-(2-(2-氰基乙氧基(二異丙基氨基)膦氧基)乙基)苯基氨)-4-(4-(2-(4，4’-二甲氧基-三苯甲氧基)乙基)苯基氨基)-蒽醌以及1，8-雙-(3-羥基-丙基氨基)-蒽醌；或備選地選自6-甲基-醌茜、1，4-雙(3-羥基丙基氨基)-6-甲基蒽醌、1-(3-(4，4’-二甲氧基-三苯甲氧基)丙基氨基)-4-(3-羥基丙基氨基)-6(7)-甲基-蒽醌、1-(3-(2-氰基乙氧基(二異丙基氨基)膦氧基)丙基氨基)-4-(3-(4，4’-二甲氧基-三苯甲氧基)丙基氨基)-6(7)-甲基-蒽醌、1，4-雙(4-(2-羥乙基)苯基氨基)-6-甲基-蒽醌、1，4-二羥基-2，3-二氫-6-羧基-蒽醌、1，4-雙(4-甲基-苯基氨基)-6-羧基-蒽醌、1，4-雙(4-甲基-苯基氨基)-6-(N-(6，7-二羥基-4-氧-庚烷-1-基))甲酰胺基-蒽醌、1，4-雙(4-甲基-苯基氨基)-6-(N-(7-二甲氧基三苯甲氧基-6-羥基-4-氧-庚烷-1-基))甲酰胺基-蒽醌、1，4-雙(4-甲基-苯基氨基)-6-(N-(7-(2-氰基乙氧基(二異丙基氨基)膦氧基)-6-羥基-4-氧-庚烷-1-基))甲酰胺基-蒽醌、1，4-雙(丙基氨基)-6-羧基-蒽醌、1，4-雙(丙基氨基)-6-(N-(6，7-二羥基-4-氧-庚烷-1-基))甲酰胺基-蒽醌、1，4-雙(丙基氨基)-6-(N-(7-二甲氧基三苯甲氧基-6-羥基-4-氧-庚烷-1-基))甲酰胺基-蒽醌、1，5-雙(4-(2-羥乙基)苯基氨基)-蒽醌、1-(4-(2-羥乙基)苯基氨基)-5-(4-(2-(4，4’-二甲氧基-三苯甲氧基)乙基)苯基氨基)-蒽醌、1-(4-(2-氰基乙氧基(二異丙基氨基)膦氧基)乙基)苯基氨基)-5-(4-(2--(4，4’-二甲氧基-三苯甲氧基)乙基)苯基氨基)-蒽醌、1，8-雙(3-羥基丙基氨基)-蒽醌、1-(3-羥基丙基氨基)-8-(3-(4，4’-二甲氧基-三苯甲氧基)丙基氨基)-蒽醌、1，8-雙(4-(2-羥乙基)苯基氨基)-蒽醌以及1-(4-(2-羥乙基)苯基氨基)-8-(4-(2-(4，4’-二甲氧基-三苯甲氧基)乙基)苯基氨基)-蒽醌。
共價(jià)偶聯(lián)寡核苷酸至不同的固體支持物上的一種優(yōu)選方法是如WO 96/31557或WO 99/14226中描述的使用連接至寡核苷酸5’-或3’-末端的光化學(xué)活性蒽醌的光化學(xué)固定法。
在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，高度親和性和特異性的LNA修飾的寡核苷酸用于天然的或合成的核酸的序列特異性捕獲和純化。在一方面，將天然的或合成的核酸與固定在固體表面上的LNA修飾的寡核苷酸接觸。在本情況中雜交和捕獲同時(shí)發(fā)生。捕獲的核酸可以例如在表面上通過多種本領(lǐng)域已知的方法直接檢測(cè)、鑒定、定量或擴(kuò)增，或在進(jìn)行這種鑒定或擴(kuò)增前將其從表面上釋放，這通過將固定的、經(jīng)修飾的寡核苷酸和捕獲的核酸接受去雜交條件，例如加熱或通過使用低離子強(qiáng)度的緩沖液而達(dá)到。
在另一方面，LNA修飾的寡核苷酸攜帶有共價(jià)連接至5’或3’末端上的配體。在本情況中，在溶液中將LNA修飾的寡核苷酸與天然的或合成的核酸接觸，隨后形成的雜交產(chǎn)物捕獲于攜帶有能特異性結(jié)合該配體的分子的固體支持物上。
在一優(yōu)選的方面，靶標(biāo)序列數(shù)據(jù)庫包括對(duì)應(yīng)人、小鼠、大鼠、Drosophila melanogaster、美麗線蟲、擬南芥、玉米、河豚、斑馬魚、原雞(Gallus Gallus)、vira或稻miRNA的核酸序列。
在另一方面，本方法進(jìn)一步包括基于這種假設(shè)即識(shí)別序列包括至少一種穩(wěn)定化核苷酸(例如LNA分子)來計(jì)算穩(wěn)定性。在一優(yōu)選的方面，計(jì)算得到的穩(wěn)定性用于在最初查詢靶標(biāo)序列數(shù)據(jù)庫來初始確定最優(yōu)的探針識(shí)別序列前，將具有不足穩(wěn)定性的探針從虛擬的候選探針數(shù)據(jù)庫中除去。
在另一方面，本方法另外包括計(jì)算給定探針序列與其自身形成雙鏈結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，這種穩(wěn)定性的計(jì)算基于這種假設(shè)即該序列包括至少一個(gè)穩(wěn)定化核苷酸，例如LNA分子。在一優(yōu)選的方面，計(jì)算得到的傾向用于將可能形成探針雙鏈的探針序列從虛擬候選探針的數(shù)據(jù)庫中除去。
本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案是用于檢測(cè)或定量靶標(biāo)miRNA、siRNA、RNA-編輯的轉(zhuǎn)錄物、非編碼反義轉(zhuǎn)錄物或選擇性剪接變體的試劑盒，其包括標(biāo)簽探針和靶標(biāo)檢測(cè)探針的文庫。在一方面，試劑盒包括關(guān)于它們使用的in silico方法。在另一方面，試劑盒包括關(guān)于獲得廉價(jià)DNA引物的建議的信息。包括于這些試劑盒中的探針可能具有任意或全部上述性質(zhì)。在一優(yōu)選的方面，多種探針包括至少一個(gè)穩(wěn)定化核苷酸，例如LNA核苷酸。在另一方面，多個(gè)探針包括偶聯(lián)至至少一個(gè)化學(xué)部分或與其穩(wěn)定連接的核苷酸以增加該探針的結(jié)合穩(wěn)定性。根據(jù)本發(fā)明的試劑盒使得用戶能快速并有效地發(fā)展一種用于不同miRNA靶標(biāo)、siRNA靶標(biāo)、RNA-編輯的轉(zhuǎn)錄物、非編碼反義轉(zhuǎn)錄物或選擇性剪接變體的檢測(cè)法。
一般而言，本發(fā)明描述了對(duì)高度親和性的具有雙鏈穩(wěn)定性特性的寡核苷酸探針的設(shè)計(jì)以及十分有用的用于多種靶標(biāo)核酸檢測(cè)、擴(kuò)增以及定量(例如通過實(shí)時(shí)定量PCR來監(jiān)控微RNA或siRNA的表達(dá))的方法。這些寡核苷酸探針的一些含有通過組合特異化的具有LNA主鏈的核堿基產(chǎn)生的新的核苷酸，因而產(chǎn)生了具有特異性性質(zhì)(例如減少的與互補(bǔ)鏈的序列差別或減少的形成分子內(nèi)雙鏈結(jié)構(gòu)的能力)的高度親和性的寡核苷酸。本發(fā)明也提供用于在復(fù)雜的核酸樣品中檢測(cè)和定量核酸的改良方法。其它理想的經(jīng)修飾的堿基具有減少的自我-退火或與含有一個(gè)或多個(gè)經(jīng)修飾的寡核苷酸探針形成雙鏈的能力。
實(shí)施例現(xiàn)在將進(jìn)一步通過參考以下實(shí)施例說明本發(fā)明。應(yīng)該理解，以下是僅通過實(shí)例的方式并且可以對(duì)細(xì)節(jié)進(jìn)行修飾而仍然在本發(fā)明的內(nèi)容之內(nèi)。
在下面的實(shí)施例中，探針參考號(hào)指在下面的合成實(shí)施例中顯示的LNA-寡核苷酸序列。
人miR-15a微RNA靶標(biāo)序列的實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定的靈敏性和特異性的評(píng)估。
材料和方法1.用于微RNA檢測(cè)和定量的寡核苷酸標(biāo)簽探針和檢測(cè)探針的設(shè)計(jì)和合成。
RNA寡核苷酸(EQ15885和EQ15886)購自DNA Technology(Aarhus，丹麥)并通過反相色譜(RP-HPLC)純化。將RNA寡核苷酸溶解于焦碳酸二乙酯(DEPC)處理過的H2O中并在NanoDrop ND-1000(NanoDroptechnologies，USA)上確定濃度?；蛘?，合成寡核苷酸或在DNAtechnology購買標(biāo)準(zhǔn)的DNA寡核苷酸。
表I微RNA標(biāo)簽探針、合成的轉(zhuǎn)錄模板和檢測(cè)探針的設(shè)計(jì)。
aLNA(大寫字母)、DNA(小寫字母)、RNA(斜體和小寫字母)、5-甲基C(mC)；熒光素(6-FITC(Glenn Research，Prod.Id.No.10-1964))、#Q1(如實(shí)施例8a中描述的制備)、z(5-硝基吲哚(GlennResearch，Prod.Id.No.10-1044))以及磷酸(P)。
用10U T4多核苷酸激酶(New England Biolabs(NEB)USA)、400pmol hsa-miR-15a微RNA探針1(EQ15848)和1×T4DNA連接酶緩沖液(NEB，USA)，將具有3’-末端識(shí)別序列的人miR-15a微RNA標(biāo)簽探針在50μL反應(yīng)物中經(jīng)酶促反應(yīng)5’-磷酸化。將反應(yīng)在37℃下孵育30分鐘并在70℃下加熱滅活10分鐘。通過加入50μL DECP-處理的H2O并通過YM-30Microcon離心柱(Millipore，USA)3分鐘14000×g過濾反應(yīng)物除去激酶。
在NanoDrop ND-1000(NanoDrop technologies，USA)上測(cè)定磷酸化標(biāo)簽探針的濃度2.以微RNA為模板的連接反應(yīng)連接反應(yīng)在20μL反應(yīng)物中進(jìn)行，所述的反應(yīng)物的組成為120nMmiR-15a RNA模板(EQ15885)、120nM的每種微RNA標(biāo)簽探針(磷酸化的EQ15848(見上面)和EQ15849)、10mM Tris-HCl pH7.0(Ambion，USA)、10mM MgCl2(PE Biosystems，USA)、0.05×T4DNA連接酶緩沖液[2.5mM TRIS-HCl、0.5mM MgCl2、0.5mM DTT、50μM ATP、1.25μg/mL BSA、pH7.5@25；(NEB，USA)]。在37℃下將反應(yīng)預(yù)孵育15分鐘并加入800U T4DNA連接酶并在37℃孵育另外的2小時(shí)。最后在65℃熱滅活反應(yīng)20分鐘。使用miR-15a DNA(EQ15852)、miR-16RNA(EQ15886)作為靶標(biāo)或不用模板而使用miR-15a RNA靶標(biāo)重復(fù)該連接反應(yīng)。除了1∶1摩爾比的靶標(biāo)微RNA標(biāo)簽探針，在獨(dú)立的連接反應(yīng)中還使用5∶1和1∶5的比率。
用Quick連接試劑盒(NEB，USA)進(jìn)行的連接反應(yīng)根據(jù)供應(yīng)商的說明書進(jìn)行。簡(jiǎn)而言之，寡核苷酸與上面描述的一樣，在20μL的反應(yīng)混合物中，在25℃下孵育寡核苷酸和1×快速連接緩沖液(NEB，USA)孵育15分鐘并加入1μL Quick T4 DNA連接酶(NEB，USA)并且延長(zhǎng)孵育另外30分鐘。在65℃下熱滅活酶20分鐘。
3.實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)測(cè)定3.1.使用SYBR綠檢測(cè)的微RNA實(shí)時(shí)PCR測(cè)定反應(yīng)包括(50μL)1×SYBR Green PCR Master Mix(AppliedBiosystems，USA)、200nM M13正向引物(EQ7396)、200nM M13反向引物(EQ7655)和2.5μL連接反應(yīng)物(如上描述的)。循環(huán)程序在ABI Prism 7000 Sequence Detection System中95℃10分鐘、50個(gè)循環(huán)(95℃15秒)、45℃1分鐘、60℃1分鐘，以及最后從60℃-95℃解離20分鐘。
3.2.使用LNA-修飾的檢測(cè)探針的微RNA實(shí)時(shí)PCR測(cè)定反應(yīng)物(50μL)是1×Quanti Tect Probe PCR mastermix(Qiagen，Germany)、200nM hsa miR-15a M13正向引物(EQ15887)、200nMhsa miR-15a M13反向引物(EQ15888)、100nM LNA序列特異性探針(EQ15866或EQ15867)、2.5μL連接反應(yīng)物(如上描述)。循環(huán)程序在ABI Prism 7000 Sequence Detection System中95℃15分鐘、95℃20秒(50個(gè)循環(huán))、60℃1分鐘。
在以下，dUTP表示2′-脫氧尿苷-5’-三磷酸。
實(shí)施例1用于人miR-15a微RNA靶標(biāo)序列的實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定法將序列-特異性的LNA-修飾的微RNA標(biāo)簽探針退火并連接。隨后用實(shí)時(shí)PCR、用于miR-15a微RNA的錨定PCR引物和LNA-修飾的雙標(biāo)記檢測(cè)探針檢測(cè)連接的模板，負(fù)模板用作陰性對(duì)照。使用沒有連接酶的反應(yīng)測(cè)驗(yàn)該反應(yīng)的特異性。循環(huán)閾值(Ct)，其代表報(bào)告熒光增加高于基線信號(hào)可以第一次檢測(cè)時(shí)的PCR循環(huán)，對(duì)于連接了的微RNA探針，使用miR-15a微RNA模板時(shí)是35.0(Fig.2A)，而對(duì)于陰性對(duì)照試驗(yàn)(分別是負(fù)模板和負(fù)連接酶)觀測(cè)不到Ct。在PCR反應(yīng)過程中測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)化的報(bào)告信號(hào)(Rn)，其表示報(bào)告染料的熒光信號(hào)除以無源(passive)參照染料的熒光信號(hào)。在PCR過程中，當(dāng)擴(kuò)增子拷貝數(shù)增加時(shí)Rn增加，直到反應(yīng)到達(dá)平臺(tái)期。基線校正的Rn(ΔRn)表示Rn減去在起初幾個(gè)PCR循環(huán)確定的基線信號(hào)。對(duì)于終末點(diǎn)分析(Fig 2B)，將實(shí)時(shí)PCR樣本(4μL)施加在用110000 Gelstar染色的2％的瓊脂糖凝膠上并在1×TBE緩沖液(90mM Tris-硼酸鹽，2mM EDTA，pH8.3)中8V/cm下電泳2小時(shí)。泳道1顯示了在實(shí)時(shí)PCR中作為模板的連接的miR-15a標(biāo)簽探針。陰性對(duì)照為泳道2負(fù)模板，以及泳道3無連接酶。
實(shí)施例2用于人miR-15a微RNA靶標(biāo)序列和相應(yīng)的DNA 3’-封閉靶標(biāo)的實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定法用DNA模板代替RNA模板，該DNA模板經(jīng)化學(xué)封閉在3’-末端具有磷酸。在連接反應(yīng)中不加入連接酶，則不能在LNA序列-特異性實(shí)時(shí)PCR測(cè)定中檢測(cè)到封閉的DNA模板。RNA模板和DNA模板的Ct值分別是35.0和33.3(Fig.3)。
實(shí)施例3用于人miR-15a和人miR-16微RNA靶標(biāo)序列的實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定法的特異性本發(fā)明的序列-特異性微RNA靶標(biāo)序列識(shí)別通過使用miR-15a微RNA靶標(biāo)與人miR-16靶標(biāo)相比較來評(píng)估，miR-16靶標(biāo)與miR-15a靶標(biāo)序列具有72％的序列一致性。在實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)中負(fù)模板對(duì)照和無模板對(duì)照(NTC)都沒有顯示產(chǎn)生任何信號(hào)。使用用于將如上描述的LNA-修飾的miR-15a靶標(biāo)序列-特異性標(biāo)簽探針退火至miR-15a靶標(biāo)的雜交條件得到了36.2的Ct值，而使用相同的標(biāo)簽探針用于高度同源性的miR-16得到39.9的Ct值，相當(dāng)于13倍的辨別差異(Fig.4)。
實(shí)施例4用于人miR-15a微RNA靶標(biāo)序列的實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定法，該P(yáng)CR使用兩種不同的LNA-修飾的、雙標(biāo)記檢測(cè)探針。
使用相同的由Quick T4 DNA連接試劑盒連接的LNA-修飾的標(biāo)簽探針，設(shè)計(jì)用于人miR-15a微RNA序列的兩種不同的LNA-修飾的實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)探針。在實(shí)時(shí)PCR測(cè)定法中使用LNA-修飾的檢測(cè)探針EQ15866和EQ15867分別得到38.2和32.2的Ct值(Fig.5)。負(fù)連接酶對(duì)照(EQ15866，空心圓；EQ15867，空心三角形)兩者都沒有檢測(cè)到信號(hào)。
實(shí)施例5用于人miR-15a靶標(biāo)序列的實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定法，該P(yáng)CR使用靶標(biāo)和miR-15a標(biāo)簽探針之間不同的摩爾比。
靶標(biāo)和標(biāo)簽探針之間的摩爾比是1∶1時(shí)得到最高的終末點(diǎn)熒光信號(hào)(Fig.6)(ΔRn值)，而1∶5的摩爾比得到最低的終末點(diǎn)信號(hào)(ΔRn值)。摩爾過量的miR-15a標(biāo)簽探針(1∶5摩爾比)也導(dǎo)致了特異性的終末點(diǎn)信號(hào)(Fig.6)，而PCR反應(yīng)中無模板對(duì)照(NTC)沒有顯示任何顯著的熒光信號(hào)。
實(shí)施例6用于摻入進(jìn)Torulla酵母RNA復(fù)雜背景的人miR-15a靶標(biāo)序列的實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定法，該P(yáng)CR使用miR-15a標(biāo)簽探針和最佳模式的LNA-修飾的檢測(cè)探針。
將miR-15a微RNA以2.4μM和1μM的濃度分別摻入10μg Torulla酵母RNA中，與等摩爾濃度的miR-15a標(biāo)簽探針退火，隨后連接并通過定量實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)miR-15a。在miR-15a靶標(biāo)序列對(duì)照(無復(fù)雜的酵母總RNA背景)中觀測(cè)到最高的熒光信號(hào)，而從酵母總RNA樣品(Fig.7)沒有觀測(cè)到熒光信號(hào)。如負(fù)模板對(duì)照顯示的，沒有觀測(cè)到實(shí)時(shí)PCR測(cè)定法的污染。
實(shí)施例7用于人miR-15a微RNA靶標(biāo)序列的實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定法，該P(yáng)CR使用SYBR檢測(cè)。
將序列-特異性的LNA-修飾的微RNA標(biāo)簽探針退火并連接。使用實(shí)時(shí)PCR、錨定PCR引物和SYBR綠檢測(cè)容易地測(cè)定連接了的模板(Fig.8)，而從負(fù)模板或負(fù)連接酶對(duì)照沒有檢測(cè)到信號(hào)。
實(shí)施例8a1-(3-(2-氰基乙氧基(二異丙基氨基)膦氧基)丙基氨基)-4-(3-(4，4’-二甲氧基-三苯甲氧基)丙基氨基)-蒽醌(3)淬滅分子“Q1”的制備
1，4-雙(3-羥基丙基氨基)-蒽醌(1)將leucoquinizarin(9.9g；0.04mol)與3-氨基-1-丙醇(10mL)和乙醇(200mL)混合并加熱至回流6小時(shí)。冷卻該混合物至室溫并在大氣條件下攪拌過夜。將混合物傾注于水(500mL)中，過濾沉淀物，用水(200mL)洗滌并干燥。將該固體在乙酸乙酯(300mL)中沸騰，冷卻至室溫并通過過濾收集固體。
收率8.2g(56％)1-(3-(4，4’-二甲氧基-三苯甲氧基)丙基氨基)-4-(3-羥基丙基氨基)-蒽醌(2)將1，4-雙(3-羥基丙基氨基)-蒽醌(7.08g；0.02mol)溶解于干N，N-二甲基甲酰胺(150mL)和干吡啶(50mL)的混合物中。加入二甲氧基三苯甲基氯(3.4g；0.01mol)并攪拌混合物2小時(shí)。加入額外的二甲氧基三苯甲基氯(3.4g；0.01mol)并攪拌混合物3小時(shí)。在真空下濃縮混合物并將殘余物再溶解于二氯甲烷(400mL)中并且用水(2×200ml)洗滌并干燥(Na2SO4)。通過硅膠濾墊(10cm；h 10cm)過濾該溶液并用二氯甲烷洗脫直至單-DMT-蒽醌產(chǎn)物開始洗脫，其后溶劑改變?yōu)槎燃淄橹械?％的甲醇。合并純化的級(jí)分并濃縮得到綠色泡沫。
收率7.1g(54％)
1H-NMR(CDCl3)10.8(2H，2xt，J＝5.3Hz，NH)，8.31(2H，m，AqH)，7.67(2H，dt，J＝3.8和9.4，AqH)，7.4-7.1(9H，m，ArH+AqH)，6.76(4H，m，ArH)3.86(2H，q，J＝5.5Hz，CH2OH)，3.71(6H，s，CH3)，3.54(4H，m，NCH2)，3.26(2H，t，J＝5.7Hz，CH2ODMT)，2.05(4H，m，CCH2C)，1.74(1H，t，J＝5Hz，OH)。
1-(3-(2-氰基乙氧基(二異丙基氨基)膦氧基)丙基氨基)-4-(3-(4，4’-二甲氧基-三苯甲氧基)丙基氨基)-蒽醌(3)將1-(3-(4，4’-二甲氧基-三苯甲氧基)丙基氨基)-4-(3-羥基丙基氨基)-蒽醌(0.66g；1.0mmol)溶解于干二氯甲烷(100mL)中并加入3的分子篩。攪拌混合物3小時(shí)并然后加入2-氰基乙基-N，N，N’，N’-四異丙基磷二脒(335mg；1.1mmol)和4，5-二氰基咪唑(105mg；0.9mmol)。攪拌混合物5小時(shí)并然后加入飽和NaHCO3(50mL)并攪拌10分鐘。分離相并用飽和的NaHCO3(50mL)、鹽水(50mL)洗滌有機(jī)相并干燥(Na2SO4)。濃縮后，獲得亞磷酰胺的綠色泡沫并用于寡核苷酸合成而無需進(jìn)一步純化。
收率705mg(82％)31P-NMR(CDCl3)150.01H-NMR(CDCl3)10.8(2H，2xt，J＝5.3Hz，NH)，8.32(2H，m，AqH)，7.67(2H，m，AqH)，7.5-7.1(9H，m，Ar H+AqH)，6.77(4H，m，ArH)3.9-3.75(4H，m)，3.71(6H，s，OCH3)，3.64-3.52(3.54(6H，m)，3.26(2H，t，J＝5.8Hz，CH2ODMT)，2.63(2H，t，J＝6.4Hz，CH2CN)2.05(4H，m，CCH2C)，1.18(12H，dd，J＝3.1Hz，CCH3)。
實(shí)施例8b1-(3-(氰基乙氧基(二異丙基氨基)膦氧基)丙基氨基)-5-(3-(4，4’-二甲氧基-三苯甲氧基)丙基氨基)-蒽醌(6)淬滅分子“Q2”的制備
1，5-雙(3-羥基丙基氨基)-蒽醌(4)將1，5-二氯蒽醌(2.8g；10mmol)與3-氨基-1-丙醇(10mL)和DMSO(50mL)混合并加熱至130℃4小時(shí)。將混合物冷卻至～80°并加入水(150mL)。當(dāng)混合物達(dá)到RT，通過過濾分離形成的沉淀，用水(2×50mL)洗滌，在甲苯(200mL)中沸騰并通過過濾分離不溶解的產(chǎn)物并干燥。收率3.2g(90％)1-(3-羥基丙基氨基)-5-(3-(4，4’-二甲氧基-三苯甲氧基)丙基氨基)-蒽醌(5)將1，5-雙(3-羥基丙基氨基)-蒽醌(1.4g；4mmol)與吡啶(50mL)共蒸發(fā)并然后再懸浮于吡啶(50mL)中，加入二甲氧基三苯甲基氯(1.4g；4.1mmol)并攪拌過夜。濃縮混合物并將殘余物再溶解于二氯甲烷(150mL)中，用飽和的NaHCO3(2×50mL)、鹽水(50mL)洗滌，干燥(Na2SO4)并濃縮。在硅膠柱(MeOH/二氯甲烷為2/98)上純化。濃縮合適的級(jí)分后，獲得單-DMT化合物的紅色泡沫。收率0.9g(34％)1H-NMR(CDCl3)9.7(2H，2xt，NH)，7.6-6.7(19H，m，ArH)，3.86(2H，q，J＝5.5Hz，CH2)，3.74(6H，s，CH3)，3.48(4H，m，NCH2)，3.26(2H，t，J＝5，9Hz)，2.05(4H，m，CH2)，1.45(1H，t，J＝5Hz)。
1-(3-氰基乙氧基(二異丙基氨基)膦氧基)丙基氨基)-5-(3-(4，4’-二甲氧基-三苯甲氧基)丙基氨基)-蒽醌(6)
將1-(3-羥基丙基氨基)-5-(3-(4，4’-二甲氧基-三苯甲氧基)丙基氨基)-蒽醌(0.4g；0.61mmol)溶解于干二氯甲烷(50mL)中并加入3的分子篩。攪拌混合物3小時(shí)并然后加入2-氰基乙基-N，N，N’，N’-四異丙基磷二脒(tetraisopropylphosphordiamidite)(200mg；0.66mmol)和4，5-二氰基咪唑(71mg；0.6mmol)。攪拌混合物2小時(shí)并然后加入飽和NaHCO3(50mL)并攪拌10分鐘。分離相并用飽和的NaHCO3(50mL)、鹽水(50mL)洗滌有機(jī)相并干燥(Na2SO4)。濃縮后獲得亞磷酰胺的紅色泡沫并用于寡核苷酸合成無需進(jìn)-步純化。收率490mg(93％)31P-NMR(CDCl3)148.3.用于實(shí)施例9-11的材料和方法。
1.使用海藻糖的以微RNA-為模板的連接反應(yīng)連接反應(yīng)在20μL反應(yīng)物中進(jìn)行，反應(yīng)物的組成為50nM miR-15aRNA模板(EQ15885，表I)、500nM的每種微RNA標(biāo)簽探針、10mMTris-HCl pH7.0(Ambion，USA)、10mM MgCl2(Ambion，USA)、0.05×T4DNA連接酶緩沖液[2.5mM Tris-HCl、0.5mM MgCl2、0.5mMDTT、50μM ATP、1.25μg/mL BSA、pH7.5，25℃下；(NEB，USA)]、24g/100mL海藻糖(Sigma-Aldrich，USA)、0.05μg/μL Torulla酵母RNA(Ambion，USA)。反應(yīng)在熱循環(huán)儀DYADTM(MJ Research DNAengine，USA)中42℃下預(yù)孵育15分鐘并加入800U T4DNA連接酶(NEB，USA)，并且在42℃下孵育1小時(shí)。最后在95℃下將反應(yīng)物熱滅活20分鐘。在沒有模板而有miR-15a RNA靶標(biāo)時(shí)重復(fù)該連接反應(yīng)。
2.使用LNA-修飾的檢測(cè)探針的微RNA實(shí)時(shí)PCR測(cè)定法反應(yīng)物(50μL)是1×PCR緩沖液[含有Tris-HCl、KCl、(NH4)2SO4、1.5mM MgCl2；pH8.7(20℃)](Qiagen，Germany)、終濃度4mM的MgCl2、200nM的每種dATP、dCTP、dGTP和600nM dUTP(Applied Biosystems，USA)；200nM hsa-miR-15a正向引物2(EQ16444，表II)、200nM hsa-miR-15a反向引物2(EQ16445，表II)、250nM LNA序列-特異性miR-15a檢測(cè)探針(EQ15866，表I)、0.1×ROX參照染料(Invitrogen，USA)、5μL連接反應(yīng)物(如上描述)和2.5U HotStarTaq DNA聚合酶(Qiagen，Germany)。循環(huán)程序在Applied Biosystems 7500實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)中95℃10分鐘、50個(gè)循環(huán)的95℃20秒、60℃1分鐘。
表II用于實(shí)施例9-16的不同的微RNA標(biāo)簽探針、檢測(cè)探針和實(shí)時(shí)PCR引物的設(shè)計(jì)。
aLNA(大寫字母)、DNA(小寫字母)、5-甲基C(mC)；熒光素(6-FITC(Glenn Research，Prod.Id.No.10-1964))、#Q1(如實(shí)施例8a中描述的制備)、z(5-硝基吲哚(Glenn Research，Prod.Id.No.10-1044))，磷酸(P)、X指LNA-2，6-二氨基嘌呤以及Z指LNA-2-硫代胸苷。
實(shí)施例9用于人miR-15a微RNA的實(shí)時(shí)定量PCR，該P(yáng)CR使用三組不同的miR-15a標(biāo)簽探針對(duì)的微RNA為模板進(jìn)行連接。
將序列-特異性LNA-修飾的微RNA標(biāo)簽探針退火并連接。選取三對(duì)不同的人miR-15a微RNA標(biāo)簽探針(表II)對(duì)I.EQ16311/EQ16452、II.EQ16453/EQ16307和III.EQ16447/EQ16307)并且如上描述的進(jìn)行連接反應(yīng)。隨后用如上描述的實(shí)時(shí)PCR、通過用于miR-15a微RNA的錨定PCR引物和LNA-修飾的雙-標(biāo)記檢測(cè)探針檢測(cè)連接了的模板，負(fù)模板用作陰性對(duì)照。使用沒有加入T4DNA連接酶的反應(yīng)測(cè)試該連接反應(yīng)的特異性。循環(huán)閾值(Ct)表示可以第一次檢測(cè)到報(bào)告熒光大于基線信號(hào)的PCR循環(huán)數(shù)，miR-15a微RNA模板的Ct值對(duì)于微RNA標(biāo)簽探針對(duì)I、II和III分別是17.2、30.5和28.7(Fig.13)。對(duì)于用對(duì)II和III進(jìn)行的陰性對(duì)照(分別是負(fù)模板和負(fù)連接酶)沒有檢測(cè)到Ct值，用對(duì)I進(jìn)行的陰性對(duì)照的Ct值分別在第37和第39個(gè)循環(huán)后可檢測(cè)到，當(dāng)與17.2的相應(yīng)Ct值相比時(shí)該值仍然是可以接受的(Fig.13)。在PCR反應(yīng)過程中測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)化的報(bào)告信號(hào)(Rn)，其表示報(bào)告染料的熒光信號(hào)除以無源(passive)參照染料的熒光信號(hào)。在PCR過程中，當(dāng)擴(kuò)增子拷貝數(shù)增加時(shí)Rn增加，直到反應(yīng)到達(dá)平臺(tái)期。基線校正的Rn(ΔRn)表示Rn減去在起初幾個(gè)PCR循環(huán)確定的基線信號(hào)。
實(shí)施例10用于人miR-15a微RNA的改良的實(shí)時(shí)定量PCR，該P(yáng)CR使用微RNA為模板的連接和LNA-2，6-二氨基嘌呤-增強(qiáng)的檢測(cè)探針。
在如上描述的人miR-15a為模板的連接反應(yīng)中，使用LNA-修飾的序列-特異性微RNA標(biāo)簽探針EQ16311/EQ16452(實(shí)施例9中的對(duì)I)重復(fù)實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)。隨后通過錨定PCR引物和LNA-修飾的雙-標(biāo)記檢測(cè)探針(EQ16580、EQ16581、EQ16582或EQ16583，表II)，使用如上描述的實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)連接了的模板，負(fù)模板用作陰性對(duì)照。使用沒有加入T4DNA連接酶的反應(yīng)測(cè)試該連接反應(yīng)的特異性。使用摻入Torulla酵母RNA的復(fù)雜背景的人miR-15a微RNA模板的Ct值是十分相當(dāng)?shù)?，即?duì)于LNA-修飾的雙-標(biāo)記檢測(cè)探針EQ16580、EQ16581、EQ16582和EQ16583，Ct值分別是30.4、30.0、29.9和30.6(Fig.14、表II)。相反，對(duì)于陰性對(duì)照試驗(yàn)(負(fù)模板和負(fù)連接酶，F(xiàn)ig.14)沒有觀測(cè)到Ct值。通過用LNA-2，6-二氨基嘌呤單體取代一個(gè)或兩個(gè)LNAA核苷酸，明顯增強(qiáng)了在微RNA測(cè)定法中檢測(cè)到的基線校正的熒光信號(hào)ΔRn，而用第三個(gè)LNA 2，6-二氨基嘌呤單體取代(EQ16583，表II)，沒有更進(jìn)一步增加熒光信號(hào)，顯示了與雙LNA 2，6-二氨基嘌呤-取代的miR-15a檢測(cè)探針(EQ16582，表II、Fig.14)相當(dāng)?shù)慕Y(jié)果。
實(shí)施例11用微RNA為模板的連接反應(yīng)產(chǎn)物作為模板產(chǎn)生的人miR-15a微RNA的實(shí)時(shí)定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線。
將LNA-修飾的人miR-15a微RNA標(biāo)簽探針對(duì)EQ16311/EQ16452(實(shí)施例9中的對(duì)I)用于如上描述的miR-15a為模板的連接反應(yīng)，其中人miR-15a模板濃度分別是50、5、0.5、0.05或0.005nM。隨后通過用于miR-15a微RNA的錨定PCR引物和LNA-修飾的雙-標(biāo)記檢測(cè)探針(EQ15866，表I)，使用如上描述的實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)連接的模板，負(fù)模板用作陰性對(duì)照。使用沒有連接酶的反應(yīng)檢驗(yàn)該連接的特異性。使用miR-15a微RNA模板對(duì)于50、5、0.5、0.05和0.005nM的miR-15a微RNA濃度的Ct值分別是17.6、22.0、25.9、29.6和35.6，而陰性對(duì)照試驗(yàn)(負(fù)模板和負(fù)連接酶)沒有觀測(cè)到Ct值。Ct值與最初的模板拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)成反比例。因而，通過畫出Ct值相對(duì)拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)的曲線得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，如Fig.15描繪的。通過線形回歸分析確定其斜率和截距。滴定曲線的斜率為-4.31以及截距為30.9。
實(shí)施例12用于人miR-15a微RNA的實(shí)時(shí)定量PCR，該P(yáng)CR反應(yīng)使用具有LNA-修飾的標(biāo)簽探針和LNA-修飾的雙-標(biāo)記檢測(cè)探針的微RNA為模板的RT-PCR反應(yīng)物。
1.用LNA-修飾的標(biāo)簽探針的微RNA逆轉(zhuǎn)錄和第二鏈反應(yīng)。
逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和PCR(RT-PCR)反應(yīng)在50μL反應(yīng)物中進(jìn)行，所述的反應(yīng)物的組成為2nM miR-15a RNA模板(EQ15885，表I)、600nM每種微RNA標(biāo)簽探針、1×OneStep RT-PCR緩沖液[含有Tris-HCl、KCl、(NH4)2SO4、1.5mM MgCl2、DTT、pH8.7(20℃)](Qiagen，Germany)、400μM的每種dNTP(Qiagen，Germany)、20U SUPERase-In(Ambion，USA)、0.05μg/μL Torulla酵母RNA以及2μL Qiagen OneStep RT-PCREnzyme mix(Qiagen，Germany)。將熱循環(huán)儀DYADTM(MJ Research DNAengine，USA)預(yù)熱至起始溫度。溫度曲線是50℃30分鐘、95℃15分鐘、50℃1分鐘、72℃3分鐘，并最后冷卻至4℃。無模板時(shí)作為陰性對(duì)照，重復(fù)該RT-PCR反應(yīng)。
2.使用LNA-修飾的檢測(cè)探針的微RNA實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定法PCR反應(yīng)物(50μL)是1×PCR緩沖液[含有Tris-HCl、KCl、(NH4)2SO4、pH8.7(20℃)](Qiagen，Germany)、終濃度為4mM的MgCl2、200nM的每種dATP、dCTP、dGTP和600nM dUTP(Applied Biosystems，USA)”)；200nM hsa-miR-15a正向引物2(EQl6444，表II)、200nM hsa-miR-15a反向引物2(EQ16445，表II)、250nM LNA序列特異性檢測(cè)探針(EQ15866，表I)、0.1×ROX參照染料(Invitrogen，USA)、5μL的RT-PCR反應(yīng)產(chǎn)物作為模板(如上描述)和2.5UHotStarTaq DNA聚合酶(Qiagen，Germany)。循環(huán)程序在AppliedBiosystems 7500實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems，USA)中95℃10分鐘、50個(gè)循環(huán)的95℃20秒、60℃1分鐘。
將用于人miR-15a的LNA-修飾的微RNA標(biāo)簽探針退火并作為逆轉(zhuǎn)錄引物(RT標(biāo)簽探針)和2nd鏈標(biāo)簽探針延伸。選取三對(duì)不同的微RNA標(biāo)簽探針(表I I)對(duì)IV.EQ16591/EQ16311、V.EQ16591/EQ16314和VI.EQ16589/EQ16314。如上描述的進(jìn)行miR-15a RT-PCR反應(yīng)。隨后使用miR-15a微RNA的錨定PCR引物和LNA-修飾的雙-標(biāo)記檢測(cè)探針(EQ15866，表I)，使用如上描述的實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)模板，負(fù)模板用作陰性對(duì)照。用沒有加入OneStep RT-PCR Enzyme mix的反應(yīng)評(píng)估微RNA RT-PCR測(cè)定法的特異性。使用miR-15a微RNA模板，對(duì)于微RNA探針對(duì)IV、V和VI，Ct值(其表示可以首先檢測(cè)到報(bào)告熒光增長(zhǎng)至高于基線信號(hào)時(shí)的PCR循環(huán)數(shù))分別是19.2、28.2和22.0(Fig.16)。而用對(duì)V和VI進(jìn)行的陰性對(duì)照試驗(yàn)(分別是負(fù)模板和負(fù)連接酶)沒有檢測(cè)到Ct值，來自使用對(duì)V的陰性對(duì)照的相應(yīng)Ct值，對(duì)于無模板和無RT-PCR Enzyme mix分別是39.0和39.9，這還是可以接受的值。在整個(gè)實(shí)時(shí)PCR程序過程中測(cè)量Rn信號(hào)，其表示報(bào)告染料的熒光信號(hào)除以無源(passive)參照染料的熒光信號(hào)。在PCR過程中，當(dāng)擴(kuò)增子拷貝數(shù)增加時(shí)Rn增加，直到反應(yīng)到達(dá)平臺(tái)期。ΔRn表示Rn減去在起初幾個(gè)PCR循環(huán)中確定的基線信號(hào)。
實(shí)施例13用于人miR-15a微RNA的改進(jìn)的實(shí)時(shí)定量PCR，該P(yáng)CR使用具有LNA-修飾的標(biāo)簽探針和LNA 2，6-二氨基嘌呤-增強(qiáng)的檢測(cè)探針的微RNA為模板的RT-PCR反應(yīng)物。
1.用LNA-修飾的標(biāo)簽探針的微RNA逆轉(zhuǎn)錄和第二鏈反應(yīng)。
RT-PCR反應(yīng)在25μL反應(yīng)物中進(jìn)行，所述的反應(yīng)物組成為2nMmiR-15a RNA模板(EQ 15885，表I)、60nM每種微RNA標(biāo)簽探針、1×OneStep RT-PCR緩沖液[含有Tris-HCl、KCl、(NH4)2SO4、1.5mMMgCl2、DTT、pH8.7(20℃)](Qiagen，Germany)、400μM的每種dNTP(Qiagen，Germany)、10U SUPERase-In(Ambion，USA)、0.05μg/μLKTorulla酵母RNA以及1μL Qiagen OneStep RT-PCR Enzymemix(Qiagen，Germany)。將熱循環(huán)儀DYADTM(MJ Research DNA engine，USA)加熱至反應(yīng)起始溫度。溫度曲線是50℃30分鐘、95℃15分鐘、50℃1分鐘、72℃3分鐘，并最后冷卻至4℃。在沒有模板作為陰性對(duì)照而有miR-15a RNA靶標(biāo)時(shí)重復(fù)該連接反應(yīng)。
2.使用LNA-修飾的檢測(cè)探針的微RNA實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定法反應(yīng)物(25μL)是1×PCR緩沖液[含有Tris-HCl、KCl、(NH4)2SO4、pH8.7(20℃)](Qiagen，Germany)、終濃度為4mM的MgCl2、200nM的每種dATP、dCTP、dGTP和600nM dUTP(Applied Biosystems，USA)；200nM hsa-miR-15a正向引物2(EQ16444，表II)、200nMhsa-miR-15a反向引物2(EQ16445，表II)、250nM LNA檢測(cè)探針(EQ15866，表I)、0.1×ROX參照染料(Invitrogen，USA)、5μL的RT-PCR反應(yīng)產(chǎn)物(如上描述)和1.25U HotStarTaq DNA聚合酶(Qiagen，Germany)。循環(huán)程序在Applied Biosystems 7500實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems，USA)中95℃10分鐘、50個(gè)循環(huán)的95℃20秒、60℃1分鐘。
將用于人miR-15a微RNA的LNA-修飾的微RNA標(biāo)簽探針EQ16591/EQ16314(實(shí)施例12中的對(duì)V)退火并作為如上描述的逆轉(zhuǎn)錄引物(RT標(biāo)簽探針)和2nd鏈標(biāo)簽探針延伸。隨后通過錨定PCR引物和LNA-修飾的雙-標(biāo)記檢測(cè)探針(EQ16580、EQ16581和EQ16582，表II)，使用如上描述的實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)miR-15RT-PCR反應(yīng)，負(fù)模板用作陰性對(duì)照。使用miR-15a微RNA模板的Ct值對(duì)于LNA-修飾的雙-標(biāo)記檢測(cè)探針EQ16580、EQ16581和EQ16582分別是33.0、33.2和33.7(Fig.17)，而陰性對(duì)照試驗(yàn)(負(fù)模板和負(fù)OneStep RT-PCR Enzymemix)沒有檢測(cè)到Ct值。通過用LNA 2，6-二氨基嘌呤單體取代一個(gè)或兩個(gè)LNA A核苷酸明顯增強(qiáng)了在微RNA測(cè)定法中檢測(cè)的基線較正的熒光信號(hào)ΔRn(Fig.17)。
實(shí)施例14用微RNA為模板的RT-PCR反應(yīng)產(chǎn)物作為模板產(chǎn)生的人miR-15a微RNA的實(shí)時(shí)定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線。
將用于人miR-15a微RNA的LNA-修飾的微RNA標(biāo)簽探針EQ16624/EQ16620(對(duì)VII)退火并作為逆轉(zhuǎn)錄引物(RT標(biāo)簽探針)和2nd鏈標(biāo)簽探針延伸。如上描述的進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，其中人miR-15a微RNA模板濃度分別是50、5、0.5、0.05或0.005nM。隨后通過用于miR-15a微RNA的錨定PCR引物和LNA-修飾的雙-標(biāo)記檢測(cè)探針(EQ16582)，使用如上描述的實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)miR-15a RT-PCR反應(yīng)，負(fù)模板用作陰性對(duì)照。用沒有加入OneStep RT-PCR Enzyme mix的反應(yīng)評(píng)估微RNA RT-PCR反應(yīng)的特異性。使用miR-15a微RNA模板的Ct值對(duì)于50、5、0.5、0.05和0.005nM濃度的miR-15a微RNA分別是22.2、26.5、30.6、33.6和37.8，而陰性對(duì)照試驗(yàn)(負(fù)模板和負(fù)OneStep RT-PCR Enzyme mix)沒有觀測(cè)到Ct值。Ct值與最初的模板拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)成反比例。因而，通過畫出Ct值相對(duì)拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)的曲線得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，如Fig.18描繪的。通過線形回歸分析確定其斜率和截距。滴定曲線的斜率為-3.81以及截距為34.0。
實(shí)施例15用于人miR-15a微RNA的實(shí)時(shí)定量PCR，該P(yáng)CR使用微RNA為模板的RT-PCR反應(yīng)產(chǎn)物作為模板和升高的退火溫度。
將用于人miR-15a微RNA的LNA-修飾的微RNA標(biāo)簽探針EQ16624/EQ16620(對(duì)VII)退火并作為逆轉(zhuǎn)錄引物(RT標(biāo)簽探針)和2nd鏈標(biāo)簽探針延伸。對(duì)于逆轉(zhuǎn)錄引物和2nd鏈標(biāo)簽探針兩者，退火溫度從50℃變至55℃或60℃。如上描述的進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。隨后通過用于miR-15a微RNA的錨定PCR引物和LNA-修飾的雙-標(biāo)記檢測(cè)探針(EQ16582)，使用如上描述的實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)miR-15a RT-PCR反應(yīng)，負(fù)模板用作陰性對(duì)照。用沒有加入OneStep RT-PCR Enzyme mix的反應(yīng)評(píng)估微RNA RT-PCR反應(yīng)的特異性。使用miR-15a微RNA模板的Ct值對(duì)于50、55和60℃退火溫度分別是28.6、29.3和31.0(Fig.19)，而陰性對(duì)照試驗(yàn)(負(fù)模板和負(fù)OneStep RT-PCR Enzyme mix)沒有檢測(cè)到Ct值。
實(shí)施例16用于人miR-15a微RNA的改良的實(shí)時(shí)定量PCR，該P(yáng)CR使用具有LNA-修飾的標(biāo)簽探針的微RNA為模板的RT-PCR反應(yīng)物和LNA 2，6二氨基嘌呤/LNA 2-硫代胸苷-增強(qiáng)的檢測(cè)探針。
1.用LNA-修飾的標(biāo)簽探針的微RNA逆轉(zhuǎn)錄和第二鏈反應(yīng)。
RT-PCR反應(yīng)在50μL反應(yīng)物中進(jìn)行，所述的反應(yīng)物組成為2nMmiR-15a RNA模板(EQ15885，表I)、60nM每種微RNA標(biāo)簽探針、1×OneStep RT-PCR緩沖液[含有Tris-HCl、KCl、(NH4)2SO4、1.5mMMgCl2、DTT、pH8.7(20℃)](Qiagen，Germany)，400μM的每種dNTP(Qiagen，Germany)、20U SUPERase-In(Ambion，USA)、0.05μg/μL Torulla酵母RNA(Ambion，USA)以及2μL Qiagen OneStepRT-PCR Enzyme mix(Qiagen，Germany)。將熱循環(huán)儀DYADTM(MJResearch DNA engine，USA)加熱至反應(yīng)起始溫度。溫度曲線是50℃30分鐘、95℃15分鐘，50℃1分鐘、72℃3分鐘，并最后冷卻至4℃。在沒有模板而有miR-15a RNA靶標(biāo)時(shí)作為陰性對(duì)照重復(fù)該RT-PCR反應(yīng)。
2.使用LNA-修飾的檢測(cè)探針的微RNA實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定法反應(yīng)物(25μL)是1×PCR緩沖液[含有Tris-HCl、KCl、(NH4)2SO4、pH8.7(20℃)](Qiagen，Germany)、終濃度為4mM的MgCl2、200nM的每種dATP、dCTP、dGTP和600nM dUTP(AppliedBiosystems，)”)；200nM hsa-miR-15a正向引物2(EQ16444，表II)、200nM hsa-miR-15a反向引物2(EQ16445，表II)、250nMLNA檢測(cè)探針(EQ15866，表I)、0.1×ROX參照染料(Invitrogen，USA)、5μL的RT-PCR反應(yīng)產(chǎn)物(如上描述)和1.25U HotStarTaqDNA聚合酶(Qiagen，Germany)。循環(huán)程序在Applied Biosystems7500實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems，USA)中95℃10分鐘、50個(gè)循環(huán)的95℃20秒、60℃1分鐘。
將用于人miR-15a微RNA的微RNA標(biāo)簽探針EQ16623/EQ16618(對(duì)VIII)退火并作為如上面描述的逆轉(zhuǎn)錄引物(RT標(biāo)簽探針)和2nd鏈標(biāo)簽探針延伸。隨后通過錨定PCR引物和LNA-修飾的雙-標(biāo)記檢測(cè)探針(EQ16852和EQ16679，表II)，使用如上描述的實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)miR-15RT-PCR反應(yīng)，并將混雜的對(duì)照miR-16微RNA(EQ15886，表I)和負(fù)模板用作陰性對(duì)照。使用miR-15a微RNA模板的Ct值對(duì)于LNA-修飾的雙-標(biāo)記檢測(cè)探針EQ16582和EQ16679分別是25.6和30.1(Fig.19)。混雜的miR-16微RNA對(duì)照的Ct值，對(duì)于LNA-修飾的雙-標(biāo)記探針EQ16582和EQ16679分別是33.3和不可檢測(cè)，而對(duì)于陰性試驗(yàn)(負(fù)模板和負(fù)OneStep RT-PCR Enzyme mix)Ct值是不可檢測(cè)的。通過用2，6二氨基嘌呤和LNA 2-硫代胸苷單體代替LNA A和LNA T核苷酸顯著增強(qiáng)了在微RNA測(cè)定法中檢測(cè)到的完全匹配和混雜的微RNA模板間的區(qū)別(Fig.20)。
表III用于實(shí)施例17中的封閉的微RNA標(biāo)簽探針的設(shè)計(jì)
aLNA(大寫字母)、DNA(小寫字母)、5-甲基C(mC)；和磷酸(P)。
實(shí)施例17用于人miR-15a微RNA的實(shí)時(shí)定量PCR，該P(yáng)CR使用具有3′-封閉的LNA-修飾的標(biāo)簽探針的微RNA為模板的RT-PCR反應(yīng)物和LNA-修飾的檢測(cè)探針。
1.使用封閉的LNA-修飾的標(biāo)簽探針的微RNA 1鏈轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。
逆轉(zhuǎn)錄(RT)反應(yīng)在20μL反應(yīng)物中進(jìn)行，該反應(yīng)物的組成為25nM miR-15a RNA模板(EQ15885，表I)、50nM微RNA封閉標(biāo)簽探針(EQ16695)、200nM hsa-miR-15a反向引物2(EQ16445，表1)、1×第一鏈緩沖液(50mM Tris-HCl、75mM KCl、3mM MgCl2、pH8.320℃)(Invitrogen，USA)、5mM DTT(Invitrogen，USA)、500μM的每種dNTP(Applied Biosystems，USA)、10U SUPERase-In(Ambion，USA)、0.05μg/μL Torulla酵母RNA和1U SuperscriptIII逆轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen，USA)。混合mir-15a模板、微RNA封閉標(biāo)簽探針和逆轉(zhuǎn)錄引物并在70℃下加熱10分鐘并在冰上淬滅。將熱循環(huán)儀DYADTM(MJ Research DNA engine，USA)加熱至反應(yīng)起始溫度。溫度曲線是55℃60分鐘、70℃15分鐘并最后冷卻至4℃。不用模板或Superscript III時(shí)作為陰性對(duì)照代替miR-15a RNA靶標(biāo)重復(fù)第一鏈合成。使用miR-16RNA(EQ 15886)作為靶標(biāo)代替miR-15a RNA靶標(biāo)也重復(fù)第一鏈反應(yīng)。
2.用LNA-修飾的標(biāo)簽探針的微RNA第二鏈定時(shí)釋放PCR擴(kuò)增。
反應(yīng)物(50μL)是1×AmpliTaq Gold緩沖液(AppliedBiosystems，USA)、1.5mM MgCl2、200nM第二鏈LNA標(biāo)簽探針(EQ16624，表II)、20μL的RT反應(yīng)產(chǎn)物(如上描述)和1.25U AmpliTaq GoldDNA聚合酶(Applied Biosystems，USA)。循環(huán)程序在DYADTM熱循環(huán)儀(MJ Research DNA engine，USA)中95℃1分鐘和55℃1分鐘10個(gè)循環(huán)。
3.使用LNA-修飾的檢測(cè)探針的微RNA實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定法。
反應(yīng)物(25μL)是1×PCR緩沖液[含有Tris-HCl、KCl、(NH4)2SO4、pH8.7(20℃)](Qiagen，Germany)、終濃度為4mM的MgCl2、200nM的每種dATP、dCTP、dGTP和600nM dUTP(Applied Biosystems，USA)；200nM hsa-miR-15a正向引物2(EQ16444，表II)、終濃度200nM的hsa-miR-15a反向引物2(EQ16445，表II)、250nM LNA檢測(cè)探針(EQ15866，表I)、0.1×ROX參照染料(Invitrogen，USA)、5μL的1st和2nd鏈反應(yīng)產(chǎn)物(如上描述)和1.25U HotStarTaq DNA聚合酶(Qiagen，Germany)。循環(huán)程序在Applied Biosystems 7500實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems，USA)中95℃10分鐘、45個(gè)循環(huán)的95℃20秒、60℃1分鐘。
將用于人miR-15a微RNA的LNA-修飾的微RNA標(biāo)簽探針EQ16695(RT標(biāo)簽探針)和hsa-miR-15a反向引物退火并作為逆轉(zhuǎn)錄引物延伸。第一鏈反應(yīng)后退火2nd鏈標(biāo)簽探針并如上描述延伸。隨后通過用于miR-15a微RNA的錨定PCR引物和LNA-修飾的雙-標(biāo)記檢測(cè)探針(EQ16582，表II)，使用如上描述的實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)miR-15RT和PCR反應(yīng)，負(fù)模板用作陰性對(duì)照。使用miR-15a微RNA模板的Ct值對(duì)于LNA-修飾的雙-標(biāo)記檢測(cè)探針EQ16582是37.1(Fig.21)，而對(duì)于miR-16微RNA模板和陰性對(duì)照試驗(yàn)(負(fù)模板和負(fù)Superscript III)沒有檢測(cè)到Ct值。
實(shí)施例18用于成熟人miR-15a微RNA的實(shí)時(shí)定量PCR，該P(yáng)CR使用具有3′-封閉的LNA-修飾的標(biāo)簽探針的微RNA為模板的RT-PCR反應(yīng)物和LNA-修飾的檢測(cè)探針。
1.使用能進(jìn)行RNA-引發(fā)的DNA-指導(dǎo)的DNA合成的酶以及封閉的LNA-修飾的miRNA標(biāo)簽探針進(jìn)行微RNA引物延伸。
miRNA引物延伸反應(yīng)在20μL反應(yīng)物中進(jìn)行。首先混合500nmolmiR-15a RNA模板(EQ15885，表I)、1μg Torulla酵母RNA(Ambion，USA)和25nM微RNA封閉標(biāo)簽探針(EQ16695，表II)，在70℃下加熱10分鐘并在冰上淬滅。加入1×EcoPol緩沖液(NEB，USA)、500μM的每種dNTP(Applied Biosystems，USA)、10U SUPERase-In(Ambion，USA)、5U Klenow片段(3’→5’外切)酶(NEB，USA)和DEPC-處理過的H2O至總體積20μL。將熱循環(huán)儀DYADTM(MJ ResearchDNA engine，USA)加熱至37℃并用以下退火溫度曲線循環(huán)37℃30分鐘、75℃20分鐘，隨后冷卻至4℃。
2.通過RT-PCR的成熟miRNA的擴(kuò)增，該P(yáng)CR使用LNA-修飾的標(biāo)簽探針和能進(jìn)行DNA-引發(fā)的RNA/DNA-指導(dǎo)的DNA合成的酶。
來自步驟nr1的引物延伸反應(yīng)產(chǎn)物稀釋至50μL的反應(yīng)混合物，所述的反應(yīng)混合物含有以下60nM第二鏈LNA標(biāo)簽探針(EQ16624，表II)、200nM hsa-miR-15a反向引物2(EQ16445，表I)、400μM的每種dNTP、1×Qiagen OneStep RT-PCR緩沖液(Qiagen，USA)、2μL Qiagen OneStep RT-PCR Enzyme mix(含有OmniscriptTM逆轉(zhuǎn)錄酶、SensiScriptTM逆轉(zhuǎn)錄酶和HotStarTaqDNA聚合酶；dNTPs、緩沖液和酶購自Qiagen，USA)以及加入DEPC-處理過的H2O至終體積50μL。將熱循環(huán)儀DYADTM(MJ Research DNA engine，USA)加熱至50℃，并使用以下溫度曲線進(jìn)行循環(huán)50℃30分鐘、95℃15分鐘和10個(gè)循環(huán)的95℃1分鐘、55℃1分鐘、72℃2分鐘，隨后冷卻至4℃。
用miR-16RNA(EQ15886，表I)作為靶標(biāo)代替miR-15a RNA靶標(biāo)也重復(fù)該反應(yīng)。作為陰性對(duì)照，在各個(gè)反應(yīng)混合物中省去微RNA封閉標(biāo)簽探針、第二鏈LNA標(biāo)簽探針、hsa-miR-15a反向引物2、Klenow片段(3’→5’外切)酶或Qiagen One Step RT-PCR酶。
3.使用LNA-修飾的檢測(cè)探針的miRNA實(shí)時(shí)定量PCR。
該實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)混合物(25μL)含有1×PCR緩沖液[含有Tris-HCl、KCl、(NH4)2SO4、pH8.7(20℃)](Qiagen，Germany)、終濃度為4mM的MgCl2、200nM的每種dATP、dCTP、dGTP和600nMdUTP(Applied Biosystems，USA)；200nM hsa-miR-15a正向引物2(EQ16444，表II)、終濃度300nM的hsa-miR-15a反向引物2(EQ16445，表II)、250nM LNA檢測(cè)探針(EQ15866，表I)、0.1×ROX參照染料(Invitrogen，USA)、5μL的1st和2nd鏈反應(yīng)產(chǎn)物(如上描述)和1.25U HotStarTaq DNA聚合酶(Qiagen，Germany)。循環(huán)程序在Applied Biosystems 7500實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)(AppliedBiosystems，USA)中95℃10分鐘、40個(gè)循環(huán)的95℃20秒、60℃1分鐘。
將在其3’末端受到封閉的用于人miR-15a的LNA-修飾的微RNA標(biāo)簽探針EQ16695(1st鏈標(biāo)簽探針)用于標(biāo)記成熟的miR-15a并通過使用miR-15a作為引物采用RNA-引發(fā)的DNA-指導(dǎo)的DNA聚合酶延伸。通過退火RT-引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)并通過RNA/DNA-指導(dǎo)的DNA聚合酶反應(yīng)延伸。最后，退火2nd鏈標(biāo)簽探針并通過DNA-指導(dǎo)的DNA聚合酶反應(yīng)延伸。隨后通過miR-15a微RNA的錨定PCR引物和LNA-修飾的雙-標(biāo)記檢測(cè)探針(EQ16582，表II)，使用如上描述的實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)分別通過miR-15a引物延伸反應(yīng)、逆轉(zhuǎn)錄和PCR產(chǎn)生的標(biāo)記的人miRNA模板，用無模板作陰性對(duì)照。使用miR-15a微RNA模板的Ct值對(duì)于LNA-修飾的雙-標(biāo)記檢測(cè)探針EQ16582是14.9(Fig.23)，而對(duì)于miR-16微RNA模板的Ct值是23.4，同時(shí)陰性對(duì)照試驗(yàn)的Ct值對(duì)于無微RNA封閉標(biāo)簽探針、無第二鏈LNA標(biāo)簽探針和無Klenow片段(3’→5’外切-)酶反應(yīng)分別是32.3、27.7和29.9。陰性對(duì)照試驗(yàn)(無hsa-miR-15a反向引物2或無Qiagen OneStep RT-PCR Enzyme mix)沒有獲得可檢測(cè)的Ct值。
實(shí)施例19使用具有3′-封閉LNA-修飾的標(biāo)簽探針的微RNA為模板的RT-PCR反應(yīng)物產(chǎn)生的成熟人miR-15a微RNA的實(shí)時(shí)定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線。
將LNA-修飾的人miR-15a微RNA標(biāo)簽探針對(duì)EQ1695/EQ16624(實(shí)施例18中的對(duì)IX)用于如上描述的具有3’-封閉的LNA-修飾的標(biāo)簽探針的miR-15a為模板的RT-PCR(實(shí)施例18)，其中人miR-15a模板濃度分別是500、50、5、0.5或0.05fmol。隨后通過用于miR-15a微RNA的錨定PCR引物和LNA-修飾的雙-標(biāo)記檢測(cè)探針(EQ15866，表I)，使用如上描述的實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)miRNA-15a模板，負(fù)模板用作陰性對(duì)照。對(duì)于500、50、5、0.5和0.05fmol的miR-15a微RNA模板，Ct值分別是18.4、21.1、24.7、28.5和32.0，而對(duì)于無模板的陰性對(duì)照試驗(yàn)，Ct值是36.8。Ct值與最初的模板拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)成反比例。因而，通過畫出Ct值相對(duì)拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)的曲線得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，如Fig.24描繪的。通過線形回歸分析確定其斜率和截距。滴定曲線的斜率為-3.45以及截距為27.4。
表IV微RNA 3′-封閉標(biāo)簽探針的設(shè)計(jì)。
aLNA(大寫字母)、DNA(小寫字母)、5-甲基C(mC)和磷酸(P)。計(jì)。
表V.用于實(shí)施例20中的U6 snRNA檢測(cè)探針和實(shí)時(shí)PCR引物的設(shè)
aLNA(大寫字母)、DNA(小寫字母)、5-甲基C(mC)；熒光素(6-FITC(Glenn Research，Prod.Id.No.10-1964))、#Q1(如實(shí)施例8a中描述的制備)、z(5-硝酸吲哚(Glenn Research，Prod.Id.No.10-1044))、磷酸(P)。
實(shí)施例20用于智人(Homo sapien)U6 snRNA的實(shí)時(shí)PCR。
1.U6 snRNA逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄(RT)反應(yīng)在20μL反應(yīng)物中進(jìn)行，其含有1μg定量PCR人參考總RNA模板(Stratagene，USA)、5μg pd(N)6隨機(jī)六聚體(Amersham Biosciences，Sweden)、1×第一鏈緩沖液(50mMTris-HCl、75mM KCl、3mM MgCl2、pH8.3，20℃下)(Invitrogen，USA)、10mM DTT(Invitrogen，USA)、1mM的每種dNTP(AppliedBiosystems，USA)、10U SUPERase-In(Ambion，USA)和200Usuperscript II逆轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen，USA)?；旌蠀⒖伎俁NA模板和隨機(jī)六聚體并在70℃加熱5分鐘并且在冰上淬滅。在熱循環(huán)儀DYADTM(MJ Research DNA engine，USA)上的溫度曲線是37℃下30分鐘、42℃下90分鐘并然后在4℃下保持。在Microcon YM-30Centrtfugal Filter Unit(Millipore，USA)上根據(jù)廠商說明書純化第一鏈合成物。將離心后回收的樣品稀釋至5倍初始RT起始體積(總共100μL)。
2.使用LNA-修飾的檢測(cè)探針的U6 snRNA實(shí)時(shí)PCR測(cè)定法。
反應(yīng)物(50μL)是1×PCR緩沖液[Tris-HCl、KCl、(NH4)2SO4、pH8.7(20℃)](Qiagen，Germany)、終濃度為4mM的MgCl2、200nM的每種dATP、dCTP、dGTP和600nM dUTP(Applied Biosystems，USA)；900nM U6 snRNA正向引物(EQ17160，表V)、900nM U6 snRNART引物(EQ17159，表V)、250nM LNA檢測(cè)探針(EQ17167，表V)、0.1×ROX參照染料(Invitrogen，USA)、1或5μL的第一鏈合成(RT)反應(yīng)產(chǎn)物(如上描述)和2.5U HotStarTaq DNA聚合酶(Qiagen，Germany)。循環(huán)程序在Applied Biosystems 7500實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems，USA)中95℃下10分鐘、40個(gè)循環(huán)的95℃下15秒、60℃下1分鐘。
隨后使用如上描述的實(shí)時(shí)PCR、人U6s nRNA的PCR引物和LNA-修飾的雙-標(biāo)記檢測(cè)探針來檢測(cè)U6 snRNA(目錄號(hào)X59362，GenBank)RT反應(yīng)物，負(fù)模板用作陰性對(duì)照。使用1或5μL U6 snRNA cDNA模板的Ct值對(duì)于LNA-修飾的雙-標(biāo)記的檢測(cè)探針(EQ17167，表V)分別是28.0和25.6(Fig.25)，而對(duì)于陰性對(duì)照試驗(yàn)(無模板)沒有獲得可檢測(cè)的Ct值。
實(shí)施例21用于人miR-15a的實(shí)時(shí)RT-PCT，其使用在3’-封閉的和5’-生物素-標(biāo)記的LNA-修飾的捕獲探針上進(jìn)行微RNA-引發(fā)的延伸反應(yīng)，在鏈霉抗生物素管中固定延伸產(chǎn)物，在溶液中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)，并使用LNA-修飾的檢測(cè)探針進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR。
1.在3’-封閉的、5’-生物素-標(biāo)記的LNA-修飾的捕獲探針上進(jìn)行微RNA-引發(fā)的延伸反應(yīng)。
將Hsa miR-15a RNA(1fmol；EQ15885，表I)與1μg Torulla酵母RNA(Ambion，USA)和100fmol miR-15a捕獲探針(EQ16879，表VI)混合于6μL的總體積中，在65℃下加熱5分鐘并在冰上淬滅，加入1μL 10×NEBuffer 2(New England Biolabs，USA)、1μL dNTPmix(1mM的每種dNTP；Applied Biosystems，USA)、20U SUPERase-In(Ambion，USA)和5U Klenow外切-(New England Biolabs，USA)。在37℃下繼續(xù)孵育30分鐘。
2.在鏈霉抗生物素管中固定將1體積2×結(jié)合緩沖液(200mM Tris-HCl pH7.5(20℃)、800mM LiCl、40mM EDTA)加入至Klenow exo-反應(yīng)物并將上清液轉(zhuǎn)移至鏈霉抗生物素包被的PCR管(Roche，Germany)。在37℃下孵育3分鐘使得生物素-鏈霉抗生物素結(jié)合得以形成。通過在室溫下五倍體積的洗滌緩沖液(10mM Tris-HCl pH7.5(20℃)、20mM LiCl)中洗滌三次除去未結(jié)合的材料?！傲⒓催M(jìn)行RT反應(yīng)”。
3.在溶液中的RT反應(yīng)將RT-引物(100fmol，EQ16994，表VI)和10nmol的每種dNTP(Applied Biosystems，USA)混合于12μL總體積中并加入至含有固定了的捕獲探針和嵌合的RNA-DNA鏈的鏈霉抗生物素PCR管。在70℃下加熱該管5分鐘并將上清液移至冰上的新的管中。加入5×第一鏈緩沖液à(50mM Tris-HCl pH8.3(20℃)、75mM KCl、3mM MgCl2；Invitrogen，USA)、10x DTT(1x＝10mM，Invitrogen，USA)、20U SUPERase-In(Ambion，USA)和200U Superscript II逆轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen，USA)并在42℃下繼續(xù)孵育1小時(shí)。70℃下加熱15分鐘來終止反應(yīng)。
4.使用LNA-修飾的檢測(cè)探針的實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)物(50μL)是1×PCR緩沖液(Qiagen，Germany)、終濃度為4mM的MgCl2、0.2mM的每種dATP、dCTP、dGTP和0.6mM dUTP(Applied Biosystems，USA)、900nM miR-15a正向引物(EQ16990，表VI)、900nM miR反向引物(EQ16989，表VI)、250nM miR-15aLNA檢測(cè)探針(EQ16992，表VI)、0.1×ROX參照染料(Invitrogen，USA)、1μL的第一鏈合成(RT)反應(yīng)物(如上描述)、0.5U脲嘧啶DNA糖基化酶(Invitrogen，USA)和2.5U HotStarTaq DNA聚合酶(Qiagen，Germany)。溫度循環(huán)程序是37℃下10分鐘、95℃下10分鐘、45℃下1分鐘、60℃下1分鐘，隨后40個(gè)循環(huán)的95℃下20秒和60℃下1分鐘。實(shí)時(shí)RT-PCR分析在ABI 7500實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems，USA)上進(jìn)行。
所述的反應(yīng)的結(jié)果的Ct值是33.1。沒有Torulla酵母RNA的反應(yīng)產(chǎn)生的Ct值是33.3，而在步驟1中沒有SUPERase-In的反應(yīng)得到的Ct為32.1。沒有hsa miR-15a RNA(EQ15885，表I)或沒有miR-15a捕獲探針(EQ16879，表VI)或沒有Klenow外切-的陰性對(duì)照試驗(yàn)全部都沒有得到Ct值。無模板對(duì)照(NTC)qPCR也沒有得到Ct值。通過在瓊脂糖凝膠上讓實(shí)時(shí)RT-PCR反應(yīng)的樣品跑膠的終末點(diǎn)分析確證了該結(jié)果，即無Ct值對(duì)應(yīng)于凝膠上缺少PCR擴(kuò)增子。
表VI用于實(shí)施例21-23的寡核苷酸
aLNA(大寫字母)、DNA(小寫字母)、熒光素(6-FITC(Glenn Research，Prod.Id.No.10-1964))、生物素(Bio(Glenn Research))、兩個(gè)部分的六乙烯基乙二醇(HEG2(Glenn Research)、#Q1(如實(shí)施例8a中描述的制備)、z(5-硝基吲哚(Glenn Research，Prod.Id.No.10-1044))、磷酸(P)。
實(shí)施例22用于系列稀釋的人miR-15a的實(shí)時(shí)RT-PCT，其使用在3’-封閉的和5’-生物素-標(biāo)記的LNA-修飾的捕獲探針上進(jìn)行微RNA-引發(fā)的延伸反應(yīng)，在鏈霉抗生物素管中固定延伸產(chǎn)物，在溶液中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)反應(yīng)，并使用LNA-修飾的檢測(cè)探針進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR。
1.在3’-封閉的、5’-生物素-標(biāo)記的LNA-修飾的捕獲探針上進(jìn)行微RNA-引發(fā)的延伸反應(yīng)。
在7μL的總體積中將Hsa miR-15a RNA(100fmol，10 fmol，1fmol，100amol或10amol；EQ15885，表I)與1μg Torulla酵母RNA(Ambion，USA)與100fmol miR-15a捕獲探針(EQ16879，表VI)混合，在65℃下加熱5分鐘并在冰上冷卻。加入1μL 10×NEBuffer2(New England Biolabs，USA)、1μL dNTP mix(1mM的每種dNTP；Applied Biosystems，USA)和5U Klenow外切-(New England Biolabs，USA)。在37℃下繼續(xù)孵育30分鐘。
2.在鏈霉抗生物素管中固定將1體積2×結(jié)合緩沖液(200mM Tris-HCl pH7.5(20℃)、800mM LiCl、40mM EDTA)加入至Klenow exo-反應(yīng)物并將上清液轉(zhuǎn)移至鏈霉抗生物素包被的PCR管(Roche，Germany)。在37℃下孵育3分鐘使得生物素-鏈霉抗生物素結(jié)合得以形成。通過在室溫下五倍體積的洗滌緩沖液(10mM Tris-HCl pH7.5(20℃)、20mM LiCl)中洗滌三次除去未結(jié)合的材料。
3.在溶液中的RT反應(yīng)將RT-引物(100fmol，EQ 16994，表VI)和10nmol的每種dNTP(Applied Biosystems，USA)混合于12μL總體積中并加入至含有固定了的捕獲探針和嵌合的RNA-DNA鏈的鏈霉抗生物素PCR管。在70℃下加熱5分鐘并將上清液移至冰上的新的管中。加入5×第一鏈緩沖液à(50mM Tris-HCl pH8.3(20℃)、75mM KCl、3mM MgCl2；Invitrogen，USA)、10x DTT(1x＝10mM，Invitrogen，USA)、20U SUPERase-In(Ambion，USA)和200U Superscript II逆轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen，UsA)并在42℃下繼續(xù)孵育1小時(shí)。70℃下加熱15分鐘來終止反應(yīng)。
4.使用LNA-修飾的檢測(cè)探針的實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)物(50μL)是1×PCR緩沖液(Qiagen，Germany)、終濃度為4mM的MgCl2、0.2mM的每種dATP、dCTP、dGTP和0.6mM dUTP(Applied Biosystems，USA)、900nM miR-15a正向引物(EQ16990，表VI)、900nM miR反向引物(EQ16989，表VI)、250nM miR-15aLNA檢測(cè)探針(EQ16992，表VI)、0.1×ROX參照染料(Invitrogen，USA)、1μL的第一鏈合成(RT)反應(yīng)物(如上描述)、0.5U尿嘧啶DNA糖基化酶(Invitrogen，USA)和2.5U HotStarTaq DNA聚合酶(Qiagen，Germany)。溫度循環(huán)程序是37℃下10分鐘、95℃下10分鐘、45℃下1分鐘、60℃下1分鐘，隨后40個(gè)循環(huán)的95℃下20秒和60℃下1分鐘。實(shí)時(shí)RT-PCR分析在ABI 7500實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems，USA)上進(jìn)行。
所述反應(yīng)的結(jié)果是對(duì)于100fmol、10fmol、1fmol、100amol和10amol hsa miR-15a RNA(EQ15885，表I)加入物Ct值分別是24.0、27.6、31.1、34.8和37.0。沒有hsa miR-15a RNA(EQ15885，表I)的陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)無Ct值。無模板對(duì)照(NTC)qPCR也沒有得到Ct值。10amol hsa miR-15a RNA(EQ15885，表I)的加入物對(duì)應(yīng)50μL實(shí)時(shí)RT-PCR混合物中的10fM或更低濃度。通過在瓊脂糖凝膠上讓實(shí)時(shí)RT-PCR反應(yīng)的樣品跑膠的終末點(diǎn)分析確證了該結(jié)果，即無Ct值對(duì)應(yīng)于凝膠上缺少PCR擴(kuò)增子。
實(shí)施例23人miR-15a的實(shí)時(shí)RT-PCT，其使用在3’-封閉和5’-生物素-標(biāo)記的LNA-修飾的捕獲探針上進(jìn)行微RNA-引發(fā)的延伸反應(yīng)，在鏈霉抗生物素珠上固定延伸產(chǎn)物，在溶液中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)反應(yīng)，并使用LNA-修飾的檢測(cè)探針進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR。
1.在3’-封閉的、5’-生物素-標(biāo)記的LNA-修飾的捕獲探針上進(jìn)行微RNA-引發(fā)的延伸反應(yīng)。
在7μL的總體積中將Hsa miR-15a RNA(1fmol；EQ15885，表I)與1μg Torulla酵母RNA(Ambion，USA)與100fmol miR-15a捕獲探針(EQ16879，表VI)混合，在65℃下加熱5分鐘并在冰上冷卻。加入1μL 10×NEBuffer 2(New England Biolabs，USA)、1μL dNTPmix(每種1mM；Applied Biosystems，USA)和5U Klenow外切-(New England Biolabs，USA)。在37℃下繼續(xù)孵育30分鐘。
2.固定于鏈霉抗生物素珠上加入1體積(10μL)含有10μg Dynabeads M-270鏈霉抗生物素的2×結(jié)合緩沖液(10mM Tris-HCl pH7.5(20℃)、2M NaCl、1mM EDTA(Dynal Biotech，Norway)至Klenow外切-反應(yīng)物并在20℃下伴隨旋轉(zhuǎn)孵育10分鐘以使得生物素-鏈霉抗生物素結(jié)合得以形成。將管置于磁性粒子濃縮器(Dynal MPC-9600；Dynal Biotech，Norway)中。除去上清液并在100μL洗滌緩沖液(10mM Tris-HCl pH7.5(20℃)、20mM NaCl)中將珠洗滌三次。“立即進(jìn)行RT反應(yīng)”。
3.在溶液中的RT反應(yīng)將RT-引物(100fmol，EQ16994，表VI)和10nmol的每種dNTP(Applied Biosystems，USA)混合于12μL總體積中并加入至含有固定了的捕獲探針和嵌合的RNA-DNA鏈的管中。在70℃下加熱5分鐘；轉(zhuǎn)移至磁性粒子濃縮器并將上清液移至冰上的新的管中。加入5×第一鏈緩沖液à(50mM Tris-HCl pH8.3(20℃)、75mM KCl、3mMMgCl2；Invitrogen，USA)、10x DTT(1x＝10mM，Invitrogen，USA)、20U SUPERase-In(Ambion，USA)和200U Superscript II逆轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen，USA)并在42℃下繼續(xù)孵育1小時(shí)。70℃下加熱15分鐘來終止反應(yīng)。
4.使用LNA-修飾的檢測(cè)探針的實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)物(50μL)是1×PCR緩沖液(Qiagen，Germany)、終濃度為4mM的MgCl2、0.2mM的每種dATP、dCTP、dGTP和0.6mM dUTP(Applied Biosystems，USA)、900nM miR-15a正向引物(EQ16990，表VI)、900nM miR反向引物(EQ16989，表VI)、250nM miR-15aLNA檢測(cè)探針(EQ16992，表VI)、0.1×ROX參照染料(Invitrogen，USA)、5μL的第一鏈合成(RT)反應(yīng)物(如上描述)、0.5U尿嘧啶DNA糖基化酶(Invitrogen，USA)和2.5U HotStarTaq DNA聚合酶(Qiagen，Germany)。溫度循環(huán)程序是37℃下10分鐘、95℃下10分鐘、45℃下1分鐘、60℃下1分鐘，隨后40個(gè)循環(huán)的95℃下20秒和60℃下1分鐘。實(shí)時(shí)RT-PCR分析在ABI 7500實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems，USA)上進(jìn)行。
所述的反應(yīng)的結(jié)果的Ct值是28.0。無模板對(duì)照(NTC)qPCR沒有得到Ct值。
實(shí)施例24
用于人miR-7a的實(shí)時(shí)定量PCR，其使用由含有5’-生物素的LNA-修飾的捕獲探針引發(fā)的固體支持物上的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，該逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后是使用LNA-修飾的檢測(cè)探針的實(shí)時(shí)PCR。
1.在5’-生物素標(biāo)記的LNA-修飾的捕獲探針上進(jìn)行微RNA-引發(fā)的延伸反應(yīng)。
在10μL的總體中混合以下物質(zhì)Hsa miR-7a RNA(10fmol；EQ16898，表VII)、1μg Torulla酵母RNA(Ambion，USA)和100fmolmiR-7a捕獲探針(EQ 17367，表VII)、1μL 10×NEBuffer 2(NewEngland Biolabs，USA)、1μL dNTP mix(1mM的每種dNTP；AppliedBiosystems，USA)和5U Klenow外切-(New England Biolabs，USA)。在37℃下孵育混合物30分鐘。
2.在鏈霉抗生物素管中固定將2.5μL 5×結(jié)合緩沖液(500mM Tris-HCl pH7.5(20℃)、2M LiCl、100mM EDTA)加入至Klenow exo-反應(yīng)物并將上清液轉(zhuǎn)移至鏈霉抗生物素包被的PCR管(Roche，Germany)。在37℃下孵育3分鐘使得生物素-鏈霉抗生物素結(jié)合得以形成。通過在室溫下100μL的洗滌緩沖液(10mM Tris-HCl pH7.5(20℃)、20mM LiCl)中洗滌5次除去未結(jié)合的材料。
3.RT反應(yīng)將20μL的以下RT反應(yīng)混合物加入至含有固定了的捕獲探針和嵌合RNA-DNA鏈的鏈霉抗生物素包被的PCR管中1×第一鏈緩沖液(50mM Tris-HCl pH8.3(20℃)、75mM KCl、3mM MgCl2；Invitrogen，USA)、10mM DTT(Invitrogen，USA)、1.25mM的每種dNTP(AppliedBiosystems，USA)、20U SUPERase-In(Ambion，USA)和200USuperscript II逆轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen，USA)，42℃下孵育1小時(shí)。
4.預(yù)-PCR移出RT-混合物并用20μL的PCR主混合物替換，該P(yáng)CR主混合物含有各0.4μM的1×Quantitect Probe PCR Master Mix(Qiagen，USA)正向和反向引物(EQ17372 & EQ17374，表VII)、1U尿嘧啶-DNA糖基化酶(UNG，Roche，Germany)。讓預(yù)-PCR接受以下條件95℃下15分鐘、30℃下1分鐘、40℃下1分鐘、60℃下1分鐘和10個(gè)循環(huán)的94℃下20秒和60℃下1分鐘。將反應(yīng)物保持在4℃直到進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR。然后，在用于實(shí)時(shí)PCR前將80μL DEPC-H2O加入至預(yù)-PCR反應(yīng)物中。
5.使用LNA-修飾的檢測(cè)探針的實(shí)時(shí)PCR50μL實(shí)時(shí)PCR mix含有每種0.4μM的1x Quantitect Probe PCRMaster Mix(Qiagen)正向和反向引物(EQ17372 & EQ17374，表VII)、0.2μM miR-7a LNA檢測(cè)探針(EQ17377，表VII)、1U UNG(Roche，Germany)以及5μL的稀釋的第一鏈合成(RT)-預(yù)-PCR反應(yīng)產(chǎn)物(如上描述的)。溫度循環(huán)程序是95℃下15分鐘和40個(gè)循環(huán)的94℃下20秒& 60℃下1分鐘。實(shí)時(shí)PCR在Opticon實(shí)時(shí)PCR儀(MJResearch，USA)上進(jìn)行。
結(jié)果。
該實(shí)時(shí)PCR產(chǎn)生具有足夠量的信號(hào)的S型擴(kuò)增曲線(Fig.26)，Ct值是18.5。獲得的Ct值對(duì)于用于當(dāng)前試驗(yàn)的Hsa-miR-7a的量是現(xiàn)實(shí)的并表明本測(cè)定法的完全功能性。
表VII用于實(shí)施例24中的寡核苷酸
aLNA(大寫字母)、DNA(小寫字母)、RNA(斜體和小寫字母)、5-甲基C(mC)；熒光素(6-FITC(Glenn Research，Prod.Id.No.10-1964))、生物素(Bio(Glenn Research))、#Q1(如實(shí)施例8a中描述的制備)、#Q2(如實(shí)施例8b中描述的制備)、z(5-硝基吲哚(Glenn Research，Prod.Id.No.10-1044))、磷酸(P)。
實(shí)施例25雙標(biāo)記的寡核苷酸探針的合成、去保護(hù)和純化表I、II和V-VII的雙標(biāo)記寡核苷酸探針即EQ15866、EQ15867、EQ16580-16583、EQ16679、EQ17167、EQ16879、EQ16992、EQ17367和EQ17377在自動(dòng)化DNA合成儀(Expedite 8909 DNA合成儀，PerSeptiveBiosystems，0.2μmol量級(jí))上使用亞磷酰胺方法(Beaucage和Caruthers，Tetrahedron Lett.221859-1862，1981)用2-氰基乙基保護(hù)的LNA和DNA亞磷酰胺(Sinha等，Tetrahedron Lett.245843-5846，1983)制備。與DNA亞磷酰胺相比，對(duì)LNA亞磷酰胺修改合成循環(huán)(250s偶聯(lián)時(shí)間)。在偶聯(lián)步驟中將1H-四唑或4，5-二氰基咪唑(Proligo，Hamburg，Germany)用作活化劑。
用32％的氨水將寡核苷酸去保護(hù)(室溫下1小時(shí)，然后60℃下2小時(shí))并通過HPLC純化(Shimadzu-SpectraChrom系列；XterraTMRP18柱，10m 7.8×150mm(Waters)。緩沖液A0.05M三乙基醋酸銨pH7.4。B.水中50％的乙腈。洗脫0-25分鐘10-80％B；25-30分鐘80％B)。寡核苷酸的組成和純度通過MALDI-MS(PerSeptiveBiosystem，Voyager DE-PRO)分析檢驗(yàn)。
實(shí)施例26人hsa-Let-7a的實(shí)時(shí)RT-PCT，其使用在3’-封閉的和5’-生物素-標(biāo)記的LNA-修飾的捕獲探針上進(jìn)行微RNA-引發(fā)的延伸反應(yīng)，在鏈霉抗生物素管中固定延伸產(chǎn)物，在溶液中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)，并使用具有淬滅基團(tuán)Q2的LNA-修飾的檢測(cè)探針進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR。
1.在3’-封閉的、5’-生物素-標(biāo)記的LNA-修飾的捕獲探針上進(jìn)行微RNA-引發(fā)的延伸反應(yīng)。
將Hsa Let-7a RNA(10fmol；EQ16898，表VII)與1μg Torulla酵母RNA(Ambion，USA)和100fmol cP5_hsa-let-7a捕獲探針(EQ17367，表VII)、1μL 10×NEBuffer 2(New England Biolabs，USA)、1μL dNTP mix(1mM的每種dNTP；Applied Biosystems，USA)和5U Klenow外切-(New England Biolabs，USA)混合，總體積為10μL。在37℃下進(jìn)行孵育30分鐘。
2.在鏈霉抗生物素管中固定將2.5μL 5×結(jié)合緩沖液(500mM Tris-HCl pH7.5(20℃)、2M LiCl、100mM EDTA)加入至Klenow exo-反應(yīng)物并將混合物轉(zhuǎn)移至鏈霉抗生物素包被的PCR管(Roche，Germany)底部。在37℃下孵育3分鐘使得生物素-鏈霉抗生物素結(jié)合得以形成。通過在室溫下100μL的洗滌緩沖液(10mM Tris-HCl pH7.5(20℃)、20mM LiCl)中洗滌5次除去未結(jié)合的材料。將洗滌過的管立即接受逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。
3.在溶液中的RT反應(yīng)將RT-引物(1μl 100fmol/μl，EQ17374，表VII)和2.5dNTP(10mM的每種dNTP，Applied Biosystems，USA)混合于12μL總體積中并加入至含有固定了的捕獲探針和嵌合的RNA-DNA鏈的鏈霉抗生物素PCR管。在70℃下加熱5分鐘并將上清液移至冰上的新的管中。加入4μl的5×第一鏈緩沖液(250mM Tris-HCl pH8.3(20℃)、375mM KCl、15mM MgCl2；Invitrogen，USA)、2μl 100mM的DTT(Invitrogen，USA)、1μl 20U/μl SUPERase-In(Ambion，USA)和1μl 200U/μl的Superscript II逆轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen，USA)并在42℃下繼續(xù)孵育1小時(shí)。70℃下加熱15分鐘來終止反應(yīng)。通過加入80μL的DEPC H2O將總體積調(diào)節(jié)至100μL。
4.使用LNA-修飾的檢測(cè)探針的實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)物(50μL)是1×QuantiTect Probe PCR Master Mix(Qiagen，Ge rmany)、400nM hsa-let-7a_qPcR-F-引物3(EQ17372，表VII)、400nM hsa-let-7a qPcR-R-引物2(EQ17375，表VII)、200nMhsa-let-7a_qPcR-Probe2_Q2檢測(cè)探針(EQ18089，表VII)、5μL的第一鏈合成(RT)反應(yīng)物(如上描述)和0.5U尿嘧啶DNA糖基化酶(Invitrogen，USA)。溫度循環(huán)程序是37℃下10分鐘、95℃下15分鐘、30℃下1分鐘、40℃下1分鐘，60℃下1分鐘，隨后40個(gè)循環(huán)的95℃下20秒和60℃下1分鐘。實(shí)時(shí)RT-PCR分析在Opticon實(shí)時(shí)PCR儀(MJ Research，USA)上進(jìn)行。
5.結(jié)果。
重復(fù)試驗(yàn)3次，獲得的平均Ct值是19.0，CV為0.01。沒有加入hsa Let-7a miRNA的試驗(yàn)重復(fù)三次都沒有產(chǎn)生信號(hào)，并沒獲得Ct值。
實(shí)施例27前體pre-miRNA hsa Let-7a的制備1.體外轉(zhuǎn)錄a.將T7啟動(dòng)子/前導(dǎo)寡核苷酸(EQ18219，見表VIII)與hsa-let-7a-1前體longmer DNA寡核苷酸(EQ18213，見表VIII)混合，每種寡核苷酸的終濃度是20μM。
b.將樣品在95℃下加熱5分鐘并讓該溶液在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上冷卻至室溫。
c.將8μL上面的溶液在普通的20-μL MegaScript反應(yīng)物(Ambion，USA)中用作模板，所述的反應(yīng)物含有ATP、GTP、CTP、UTP、反應(yīng)緩沖液和酶mix。
d.將反應(yīng)物在37℃下過夜孵育。
e.加入1μL DNA酶并在37℃下將反應(yīng)物孵育15分鐘。
f.在RNeasy min Elute Cleanup離心柱上使用經(jīng)修改的用于miRNA清除的方法純化體外轉(zhuǎn)錄的前體pre-miRNA。
表VIII用于實(shí)施例27中的寡核苷酸
2經(jīng)修改的用于前體miRNA清除的方法1.加入350μl緩沖液RLT至樣品中，并通過渦旋振蕩完全混合。
2.加入1體積的80％乙醇(350μl)，并通過渦旋振蕩完全混合。不離心。立即進(jìn)行步驟3。
3.吸移樣品(包括可能形成了的任何沉淀)至置于2ml收集管中的RNeasy Mini離心柱中。輕輕蓋上蓋子，在8000×g下離心15秒。
4.棄去RNeasy Mini離心柱5.吸移來自步驟3的流質(zhì)(含有miRNA)至2ml反應(yīng)管中。
6.加入1.4體積的100％乙醇(980μl)，并通過渦旋振蕩完全混合。不離心。立即進(jìn)行步驟7。
7.將700μl的樣品吸移至置于2ml收集管中的RNeasyMinElute離心柱中。輕輕蓋上蓋子，在8000×g下離心15秒。棄去流質(zhì)。重復(fù)步驟7直至已經(jīng)將全部樣品吸移進(jìn)離心柱中。每次棄去流質(zhì)。
8.將500l緩沖液RPE吸移至RNeasy MinElute離心柱中。輕輕蓋上蓋子，在8000×g下離心15秒。棄去流質(zhì)。
9.將500μl 80％的乙醇吸移至RNeasy MinElute離心柱中。輕輕蓋上蓋子，在8000×g下離心15秒。棄去流質(zhì)和收集管。
10.將RNeasy MinElute離心柱置于2ml收集管中。打開蓋子，并在8000×g下離心1分鐘。
11.將RNeasy MinElute離心柱置于1.5ml收集管中，并將14μl無RNA酶的水吸移至離心柱膜上。輕輕蓋上蓋子，在8000×g下離心1分鐘來洗脫miRNA。
在OD260下測(cè)量miRNA洗脫物的濃度，隨后通過將其稀釋于DEPC H2O水中達(dá)到10nM的終濃度(10fmol/μL)。
實(shí)施例28用于相對(duì)于人hsa-Let-7a前體而選擇性檢測(cè)成熟的人hsa-Let-7a的實(shí)時(shí)RT-PCT，其使用在3’-封閉的和5’-生物素-標(biāo)記的LNA-修飾的捕獲探針上進(jìn)行微RNA-引發(fā)的延伸反應(yīng)，在鏈霉抗生物素管中固定延伸產(chǎn)物，在溶液中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)，并使用具有淬滅基團(tuán)Q2的LNA-修飾的檢測(cè)探針進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR。
1.在3’-封閉的、5’-生物素-標(biāo)記的LNA-修飾的捕獲探針上進(jìn)行微RNA-引發(fā)的延伸反應(yīng)。
將miRNA hsa Let-7a(10fmol；EQ16898，表VII)和/或前體pre-miRNA hsa Let-7a(10fmol；如實(shí)施例27中描述的產(chǎn)生)與1μgTorulla酵母RNA(Ambion，USA)和100fmol cP5_hsa-let-7a捕獲探針(EQ17367，表VII)、1μL 10×NEBuffer 2(New England Biolabs，USA)、1μL dNTP mix(1mM的每種dNTP；Applied Biosystems，USA)和5U Klenow外切-(New England Biolabs，USA)混合，總體積為10μL。在37℃下進(jìn)行孵育30分鐘。
2.在鏈霉抗生物素管中固定將2.5μL 5×結(jié)合緩沖液(500mM Tris-HCl pH7.5(20℃)、2M LiCl、100mM EDTA)加入至Klenow exo-反應(yīng)物并將混合物轉(zhuǎn)移至鏈霉抗生物素包被的PCR管(Roche，Germany)底部。在37℃下孵育3分鐘使得生物素-鏈霉抗生物素結(jié)合得以形成。通過在室溫下100μL的洗滌緩沖液(10mM Tris-HCl pH7.5(20℃)、20mM LiCl)中洗滌5次除去未結(jié)合的材料。將洗滌過的管立即接受逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。
3.在溶液中的RT反應(yīng)將RT-引物(1μl 100fmol/μl，EQ17374，表VII)和2.5μl dNTP(10mM的每種dNTP，Applied Biosystems，USA)混合于12μL總體積中并加入至含有固定了的捕獲探針和嵌合的RNA-DNA鏈的鏈霉抗生物素PCR管。在70℃下加熱5分鐘并將上清液移至冰上的新的管中。加入4μl的5×第一鏈緩沖液(250mM Tris-HCl pH8.3(20℃)、375mM KCl、15mM MgCl2；Invitrogen，USA)、2μl 100mM的DTT(Invitrogen，USA)、1μl 20U/μl SUPERase-In(Ambion，USA)和1μl 200U/μl的Superscript II逆轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen，USA)并在42℃下繼續(xù)孵育1小時(shí)。70℃下加熱15分鐘來終止反應(yīng)。通過加入80μL的DEPC H2O將總體積調(diào)節(jié)至100μL。
4.使用LNA-修飾的檢測(cè)探針的實(shí)時(shí)PCR
反應(yīng)物(50μL)是1×QuantiTect Probe PCR Master Mix(Qiagen，Germany)、400nM hsa-let-7a_qPcR-F-引物3(EQ17372，表VII)、400nM hsa-let-7a qPcR-R-引物2(EQ17375，表VII)、200nMhsa-let-7a_qPcR-Probe2_Q2檢測(cè)探針(EQ18089，表VII)、5μL的第一鏈合成(RT)反應(yīng)物(如上描述)和0.5U尿嘧啶DNA糖基化酶(Invitrogen，USA)。溫度循環(huán)程序是37℃下10分鐘、95℃下15分鐘、30℃下1分鐘、40℃下1分鐘，60℃下1分鐘，隨后40個(gè)循環(huán)的94℃下20秒和60℃下1分鐘。實(shí)時(shí)RT-PCR分析在Opticon實(shí)時(shí)PCR儀(MJ Research，USA)上進(jìn)行。
5.結(jié)果。
通過對(duì)成熟miRNA hsa Let-7a和/或pre-miRNA hsa Let-7a進(jìn)行如上描述的測(cè)定法獲得以下Ct值(表IX)。
表IX
在成熟的和前體hsa-let-7a miRNA之間的Ct值有11.8的差異(ΔCt)。11.8的ΔCt對(duì)應(yīng)于該測(cè)定法對(duì)成熟hsa-let-7a miRNA的靈敏性相對(duì)于前體要高1000-10,000倍，這表明了該測(cè)定法區(qū)分這兩種miRNA的能力。因此，當(dāng)僅檢測(cè)成熟hsa-let-7a miRNA或檢測(cè)以等摩爾濃度存在的成熟的hsa-let-7a miRNA加上前體hsa-let-7a miRNA時(shí)獲得十分相似的Ct值。當(dāng)沒有加入miRNA而進(jìn)行該測(cè)定法時(shí)沒有獲得信號(hào)和Ct值。當(dāng)沒有加入RT反應(yīng)物或當(dāng)模板由用于hsa-let-7amiRNA的前體體外轉(zhuǎn)錄的寡核苷酸-模板組成時(shí)在qPCR中獲得很少的或沒有獲得信號(hào)(結(jié)果沒有顯示)。同樣，當(dāng)加入至qPCR的模板由RT(如上面描述的進(jìn)行但使用前體hsa-let-7a miRNA作為模板)組成時(shí)，即忽略微RNA-引發(fā)的延伸反應(yīng)步驟(結(jié)果沒有顯示)時(shí)獲得很少或沒有獲得信號(hào)。
實(shí)施例29用于相對(duì)于十分相關(guān)的miRNAs hsa-Let-7f和hsa-Let-7g而選擇性檢測(cè)hsa-let-7a的實(shí)時(shí)RT-PCT，其使用在3’-封閉的和5’-生物素-標(biāo)記的LNA-修飾的捕獲探針上進(jìn)行微RNA-引發(fā)的延伸反應(yīng)，在鏈霉抗生物素管中固定延伸產(chǎn)物，在溶液中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)，并使用具有淬滅基團(tuán)Q2的LNA-修飾的檢測(cè)探針進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR。
1.在3’-封閉的、5’-生物素-標(biāo)記的LNA-修飾的捕獲探針上進(jìn)行微RNA-引發(fā)的延伸反應(yīng)。
將10fmol hsa Let-7a miRNA、hsa Let-7f miRNA或hsa Let-7gmiRNA(分別是EQ16898、EQ16899和EQ16917-表VII)與1μg Torulla酵母RNA(Ambion，USA)、100fmol cP5_hsa-let-7a捕獲探針(EQ17367，表VII)、1μL 10×NEBuffer 2(New Engl and Biolabs，USA)、1μL dNTP mix(1mM的每種dNTP；Applied Biosystems，USA)和5U Klenow外切-(New England Biolabs，USA)混合，總體積為10μL。在37℃下進(jìn)行孵育30分鐘。
2.在鏈霉抗生物素管中固定將2.5μL 5×結(jié)合緩沖液(500mM Tris-HCl pH7.5(20℃)、2M LiCl、100mM EDTA)加入至Klenow exo-反應(yīng)物并將混合物轉(zhuǎn)移至鏈霉抗生物素包被的PCR管(Roche，Germany)底部。在37℃下孵育3分鐘使得生物素-鏈霉抗生物素結(jié)合得以形成。通過在室溫下100μL的洗滌緩沖液(10mM Tris-HCl pH7.5(20℃)、20mM LiCl)中洗滌5次除去未結(jié)合的材料。將洗滌過的管立即接受逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。
3.在溶液中的RT反應(yīng)將RT-引物(1μl 100fmol/μl，EQ17374，表VII)和2.5μ1dNTP(10mM的每種dNTP，Applied Biosystems，USA)混合于12μL總體積中并加入至含有固定了的捕獲探針和嵌合的RNA-DNA鏈的鏈霉抗生物素PCR管。在70℃下加熱5分鐘并將上清液移至冰上的新的管中。加入4μl的5×第一鏈緩沖液(250mM Tris-HCl pH8.3(20℃)、375mM KCl、15mM MgCl2；Invitrogen，USA)、2μl 100mM的DTT(Invitrogen，USA)、1μl 20U/μl SUPERase-In(Ambion，USA)和1μl 200U/μl的Superscript II逆轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen，USA)并在42℃下繼續(xù)孵育1小時(shí)。70℃下加熱15分鐘來終止反應(yīng)。通過加入80μL的DEPC H2O將總體積調(diào)節(jié)至100μL。
4.使用LNA-修飾的檢測(cè)探針的實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)物(50μL)是1×QuantiTectProbe PCR Master Mix(Qiagen，Germany)、400nM hsa-let-7a_qPcR-F-引物3(EQ17372，表VII)、400nM hsa-let-7a qPcR-R-引物2(EQ17375，表VII)、200nMhsa-let-7a_qPcR-Probe2_Q2檢測(cè)探針(EQ18089，表VII)、5μL的第一鏈合成(RT)反應(yīng)物(如上描述)和0.5U尿嘧啶DNA糖基化酶(Invitrogen，USA)。溫度循環(huán)程序是37℃下10分鐘、95℃下15分鐘、30℃下1分鐘、40℃下1分鐘，60℃下1分鐘，隨后40個(gè)循環(huán)的94℃下20秒和60℃下1分鐘。實(shí)時(shí)RT-PCR分析在Opticon實(shí)時(shí)PCR儀(MJ Research，USA)上進(jìn)行。
5.結(jié)果。
用hsa Let-7a miRNA作為模板在hsa Let-7a miRNA測(cè)定法中獲得20.4的Ct值。在其中將hsa Let-7f miRNA和hsa Let-7g miRNA用作模板的測(cè)定法中沒有信號(hào)產(chǎn)生以及沒有獲得Ct值。同樣，從其中沒有加入miRNA的測(cè)定法或從其中沒有加入RT作為模板的測(cè)定法中沒有獲得信號(hào)和沒有獲得Ct值。這表明，該測(cè)定法能有區(qū)別性地檢測(cè)hsa-let-7a miRNA而不是十分同源的miRNA hsa Let-7f miRNA和hsaLet-7g miRNA，其中l(wèi)et-7a和hsa Let-7f miRNA之間的唯一不同是從G到A的單個(gè)核苷酸改變。
實(shí)施例30hsa-mir-143的實(shí)時(shí)RT-PCR定量，其使用捕獲/RT-探針的兩步延伸，要研究的微RNA作為第一模板以及人造輔助寡核苷酸作為第二模板，隨后使用LNA修飾的雙-標(biāo)記檢測(cè)探針通過擴(kuò)增完全延伸的捕獲/RT-探針進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR定量。
當(dāng)miRNA位于莖-環(huán)分子的下面的鏈時(shí)，通過Dicer酶加工產(chǎn)生成熟miR的獨(dú)特5’-末端，而pre-miR和成熟miR的3’-末端是相同的。
該實(shí)施例按照Fig.31設(shè)計(jì)的測(cè)定法進(jìn)行。
兩種捕獲/RT-探針延伸反應(yīng)在使用“One Step RT/PCR mix”的相同反應(yīng)混合物中進(jìn)行。該反應(yīng)混合物因而含有微RNA、捕獲/RT-探針、逆轉(zhuǎn)錄酶、3’-磷酸化的和5’-生物素化的人造輔助模板(helpertemplate)以及Taq-聚合酶。
在2-步捕獲/RT-探針延伸后，然后將一等分的該反應(yīng)混合物用作實(shí)時(shí)PCR定量反應(yīng)中的加入物。
1.2-步捕獲/RT-探針延伸反應(yīng)混合物。
在具有25μL總體積的反應(yīng)混合物中，將以下物質(zhì)混合hsa-mir-143微RNA(1fmol；EQ16900，表X)、1μg Torulla酵母RNA(Ambion，USA)、hsa-Rim-143_CP5_NoBio(125fmol；EQ18080，表X)、hsa-Rim-143_AT_Bio(6.25pmol；EQ18079，表X)、dNTP mix(終濃度0.2mM的每種dNTP；Applied Biosystems，USA)、1×QiagenOneStep RT-PCR緩沖液(Qiagen，Germany)、1×Qiagen OneStep RT-PCREnzyme Mix和DEPC處理的水(Ambion，USA)。
進(jìn)行“無-miR”對(duì)照，該對(duì)照省去了微RNA(hsa-mir-143，表X)。
使用DNA Engine Dyad熱循環(huán)儀(MJ Research，USA)讓反應(yīng)混合物接受以下的溫度循環(huán)程序逆轉(zhuǎn)錄 60℃30分鐘Taq的活化 95℃15分鐘捕獲探針延伸 10個(gè)循環(huán)的(95℃下20秒+60℃下30秒)冷卻 4℃.
在進(jìn)一步處理前將反應(yīng)混合物立即用75μL DEPC處理的水(Ambion，USA)稀釋。
2.通過結(jié)合至鏈霉抗生物素將人造輔助寡核苷酸從反應(yīng)混合物中除去。
將一等份20μL的每種從上面步驟1獲得的反應(yīng)混合物與1μLImmunoPure固定的鏈霉抗生物素(Pierce)混合，渦旋振蕩并在37℃下孵育5分鐘并通過離心柱(Harvard Apparatus)離心。
3.使用LNA修飾的雙-標(biāo)記檢測(cè)探針的實(shí)時(shí)PCR定量在具有25μL總體積的反應(yīng)混合物中，將以下混合hsa-Rim-143_引物2(0.5μM終濃度，EQ17724，表X)，hsa-miR-143_引物143_C2(0.5μM終濃度，EQ17574，表X)、hsa-Rim-143_P4(0.25μM終濃度，EQ18057，表X)、1×TaqManUniversalPCRMaster Mix(Applied Biosystems，USA)、2.5μL來自上面步驟1或步驟2的經(jīng)稀釋的反應(yīng)混合物和DEPC處理的水。
使用ABI 7500實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems，USA)讓反應(yīng)混合物接受以下的溫度循環(huán)程序Taq的活化95℃15分鐘PCR擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)的(95℃下20秒+60℃下30秒)對(duì)于沒有在步驟2中純化的含有微RNA的樣品上述反應(yīng)的結(jié)果是Ct值為37，以及對(duì)于相應(yīng)的包括了在步驟2中的純化的樣品Ct值是36。兩個(gè)相應(yīng)的“無miR”-對(duì)照都沒有得到任何在40個(gè)循環(huán)內(nèi)的Ct值。見Fig.32。
表X用于實(shí)施例Rim中的寡核苷酸
aLNA(大寫字母)、DNA(小寫字母)、熒光素(6-FITC(Glenn Research，Prod.Id.No.10-1964))、生物素(Bio(Glenn Research))、兩個(gè)部分的六乙二醇(HEG2(Glenn Research))、#Q2(如實(shí)施例8b中描述的制備)、z(5-硝基吲哚(G1enn Research，Prod.Id.No.10-1044))、磷酸(P)。
實(shí)施例31用于相對(duì)密切相關(guān)的hsa-Let-7g而選擇性檢測(cè)hsa-let-7a的實(shí)時(shí)RT-PCR，其使用將RNA接頭連接至成熟的微RNA，隨后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，并使用具有淬滅基團(tuán)Q2的LNA-修飾的檢測(cè)探針進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR。
在該實(shí)施例中采用的方法一般是如Fig.36中描述。
1.將RNA接頭連接至成熟的微RNA。
將10fmol hsa Let-7a miRNA或hsa Let-7g miRNA(分別是EQ16898和EQ16917-表VII)與20fmol RNA接頭(EQ18557；表XI)和40U的T4RNA連接酶(New England Biolabs，USA)混合于20μL的總體積中，其還包括1×T4RNA連接酶緩沖液(50mM Tris-HCl pH7.8(25℃)、10mM MgCl2、1mM ATP和10mM二硫蘇糖醇)。在37℃下進(jìn)行連接反應(yīng)15分鐘。65℃下加熱15分鐘來終止反應(yīng)。
2.RT反應(yīng)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)在50μL反應(yīng)物中進(jìn)行，反應(yīng)物組成為2μMRT-引物(EQ17374，表VII)和500μM的每種dNTP(Applied Biosystems，USA)、1×第一鏈緩沖液(50mM Tris-HCl pH8.3(20℃)、75mMKCl、3mM MgCl2；Invitrogen，USA)、10mM DTT(Invitrogen，USA)、60U SUPERase-In(Ambion，USA)、500U Superscript II逆轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen，USA)和20μL的如上描述的連接混合物。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)在42℃下進(jìn)行1小時(shí)。70℃下加熱15分鐘來終止反應(yīng)。
4.使用LNA-修飾的檢測(cè)探針的實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)物(50μL)是1×PCR緩沖液(Qiagen，Germany)、終濃度為4mM的MgCl2、0.2mM的每種dATP、dCTP、dGTP和0.6mM dUTP(Applied Biosystems，USA)、900nM hsa-let-7a_qPcR-F-引物3(EQ17372，表VII)、900nM hsa-let-7a qPcR-R-引物2(EQ17375，表VII)、250nM hsa-let-7a_qPcR-Probe2_Q2檢測(cè)探針(EQ18089，表VII)、0.1×ROX參照染料(Invitrogen，USA)、2.5μL的第一鏈合成(RT)反應(yīng)物(如上描述)、0.5U尿嘧啶DNA糖基化酶(Invitrogen，USA)和2.5U HotStarTaq DNA聚合酶(Qiagen，Germany)。溫度循環(huán)程序是37℃下10分鐘、95℃下10分鐘、隨后40個(gè)循環(huán)的95℃下20秒和60℃下1分鐘。實(shí)時(shí)RT-PCR分析在ABI 7500實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems，USA)上進(jìn)行。
5.結(jié)果。
用hsa Let-7a miRNA作為模板在hsa Let-7a miRNA測(cè)定法中獲得27.1的Ct值(Fig.35)。在其中將hsa Let-7g miRNA用作模板的測(cè)定法中沒有信號(hào)產(chǎn)生并且沒有獲得Ct值。同樣，從其中沒有加入miRNA的測(cè)定法或從其中沒有加入RT作為模板的qPCR中沒有獲得信號(hào)也沒有獲得Ct值。表明該檢測(cè)法有能力區(qū)分檢測(cè)hsa-let-7a miRNA而不是相近的miRNA類似物hsa Let-7g。
表XI用于連接的寡核苷酸。
RNA(斜體字和小寫字母)和磷酸(P)。
實(shí)施例32用于相對(duì)于密切相關(guān)的miRNA hsa-Let-7g而選擇性檢測(cè)hsa-let-7a的實(shí)時(shí)RT-PCR，其使用使用“橋連”核酸序列(連接輔助寡核苷酸)將RNA寡核苷酸連接至成熟的微RNA，隨后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，并使用具有淬滅基團(tuán)Q2的LNA-修飾的檢測(cè)探針進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR。
以下是如何進(jìn)行連接-輔助-寡核苷酸輔助的連接反應(yīng)和隨后的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)以及qPCR來檢測(cè)成熟的微RNA hsa-let-7a的實(shí)施例。
1.將RNA連接寡核苷酸接至成熟的微RNA。
將10fmol hsa Let-7a miRNA或hsa Let-7g miRNA(分別是EQ16898和EQ16917-表VII)與100fmol連接寡核苷酸和100fmol連接輔助寡核苷酸(分別是EQ18557和EQ18565-表XII)和400U的T4DNA連接酶(New England Biolabs，USA)混合于20μL的總體積中，其還包括1×T4DNA連接酶緩沖液(50mM Tris-HCl pH7.5(25℃)、10mM MgCl2、1mM ATP和10mM二硫蘇糖醇、25μg/ml BSA)。通過在室溫下孵育30分鐘進(jìn)行連接反應(yīng)。65℃下加熱10分鐘來終止反應(yīng)。
2.RT反應(yīng)將1μL RT-引物(100fmol/μL，EQ17374，表VII)和2μL dNTP(10mM的每種dNTP-Applied Biosystems，USA)與1μL 5×第一鏈緩沖液(250mM Tris-HCl pH8.3(20℃)、375mM KCl、15mMMgCl2；Invitrogen，USA)、1μL 20U/μL SUPERase-In(Ambion，USA)和1μL 200U/μL Superscript II逆轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen，USA)混合。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)在42℃下進(jìn)行1小時(shí)。70℃下加熱15分鐘來終止反應(yīng)。通過加入74μL的DEPC H2O將總體積調(diào)節(jié)至100μL。
3.使用LNA-修飾的檢測(cè)探針的實(shí)時(shí)PCR用1×QuantiTect Probe PCR Master Mix(Qiagen，Germany)、400nM hsa-let-7a_qPcR-F-引物3(EQ17372，表VII)、400nMhsa-let-7a qPcR-R-引物2(EQ17375，表VII)、200nMhsa-let-7a_qPcR-Probe2_Q2檢測(cè)探針(EQ18089，表VII)、5μL的第一鏈合成(RT)反應(yīng)物(如上描述)和0.5U尿嘧啶DNA糖基化酶(Invitrogen，USA)構(gòu)建實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)物(50μL)。使用以下溫度循環(huán)程序37℃下10分鐘、95℃下15分鐘、30℃下1分鐘、40℃下1分鐘，60℃下1分鐘，隨后40個(gè)循環(huán)的94℃下20秒和60℃下1分鐘。實(shí)時(shí)RT-PCR分析可以在Opticon實(shí)時(shí)PCR儀(MJResearch，USA)上進(jìn)行。
表XII用于連接的寡核苷酸。
實(shí)施方案本發(fā)明可以通過以下實(shí)施方案定義，其中術(shù)語“條款”指有所述編號(hào)的前面的條款。
1.定量核酸樣品中的靶標(biāo)核苷酸序列的方法，所述的方法包括a)將靶標(biāo)核苷酸序列與兩種寡核苷酸標(biāo)簽探針接觸，每種探針由錨定核苷酸序列和識(shí)別核苷酸序列組成，其中所述的識(shí)別核苷酸序列與靶標(biāo)序列互補(bǔ)，并且其中第一個(gè)標(biāo)簽探針的識(shí)別序列雜交至靶標(biāo)序列的第一個(gè)區(qū)域而第二個(gè)標(biāo)簽探針的第二個(gè)識(shí)別序列雜交至與靶標(biāo)序列的第一個(gè)區(qū)域鄰接的第二個(gè)靶標(biāo)序列區(qū)域；b)通過連接反應(yīng)將兩個(gè)雜交的標(biāo)簽探針的鄰接識(shí)別序列共價(jià)連接而形成連續(xù)的核苷酸序列，該連續(xù)的核苷酸序列包括與靶標(biāo)核苷酸序列互補(bǔ)的序列和兩個(gè)錨定核苷酸序列，并且c)通過使用對(duì)應(yīng)錨定核苷酸序列的引物和包括靶標(biāo)識(shí)別序列和檢測(cè)部分的標(biāo)記的檢測(cè)探針的實(shí)時(shí)PCR定量連接的寡核苷酸分子。
2.如條款1的方法，其中標(biāo)簽探針和檢測(cè)探針中的識(shí)別核苷酸序列用高度親和性的核苷酸類似物修飾。
3.如條款1-2的方法，其中高度親和性的核苷酸類似物是LNA。
4.條款1-3的方法，其中5’-磷酸化的標(biāo)簽探針中的識(shí)別核苷酸序列從接著5’-核苷酸位置的核苷酸位置以LNA開始在每第二個(gè)、第三個(gè)或第四個(gè)位置用LNA修飾，并且其中在第二個(gè)標(biāo)簽探針中的識(shí)別核苷酸序列在每第二個(gè)、第三個(gè)或第四個(gè)位置用LNA取代，在3’-核苷酸位置前的核苷酸位置終止。
5.條款4的方法，其中5’-磷酸化的標(biāo)簽探針中的識(shí)別序列從接著5’-核苷酸位置的核苷酸位置以LNA開始在每第三個(gè)位置用LNA修飾，并且其中在第二個(gè)標(biāo)簽探針中的識(shí)別核苷酸序列在每第三個(gè)位置用LNA取代，在3’-核苷酸位置前的核苷酸位置終止。
6.條款1-5的方法，其中標(biāo)簽探針中的錨定核苷酸序列是DNA序列。
7.條款1-5的方法，其中標(biāo)簽探針中的錨定核苷酸序列用高度親和性的核苷酸類似物修飾。
8.條款7的方法，其中標(biāo)簽探針中的錨定核苷酸序列用LNA修飾。
9.條款1-8的方法，其中標(biāo)簽探針中的識(shí)別核苷酸序列長(zhǎng)度少于約20個(gè)核苷酸并且更優(yōu)選少于15個(gè)核苷酸，并且最優(yōu)選在10和14個(gè)核苷酸之間。
10.條款1-9的方法，其中標(biāo)簽探針中的錨定核苷酸序列長(zhǎng)度少于約30個(gè)核苷酸并且更優(yōu)選少于27個(gè)核苷酸，并且最優(yōu)選在15和25個(gè)核苷酸之間。
11.條款1-10的方法，其中檢測(cè)探針中的識(shí)別序列用高度親和性的核苷酸類似物修飾。
12.如條款11的方法，其中高度親和性的核苷酸類似物是LNA。
13.條款12的方法，其中檢測(cè)探針的長(zhǎng)度是少于約20個(gè)核苷酸并且更優(yōu)選少于15個(gè)核苷酸，并且最優(yōu)選在8和12個(gè)核苷酸之間。
14.條款13的方法，其中檢測(cè)探針包含LNA序列，其在5’-末端含有DNA核苷酸以及在3’-末端含有磷酸基團(tuán)。
15.條款14的方法，其中檢測(cè)探針用至少一個(gè)化學(xué)部分取代。
16.條款15的方法，其中檢測(cè)探針含有熒光團(tuán)-淬滅基團(tuán)對(duì)。
17.條款1-16的方法，其中檢測(cè)探針通過5’核酸酶測(cè)定原理使用雙標(biāo)記而得以檢測(cè)。
18.條款1-16的方法，其中檢測(cè)探針通過分子信標(biāo)原理得以檢測(cè)。
19.條款1-18的任意之一的方法，其中標(biāo)簽探針用T4 DNA連接酶連接。
20.條款1-18的任意之一的方法，其中標(biāo)簽探針用熱穩(wěn)定性DNA連接酶連接。
21.條款1-18的任意之一的方法，其中標(biāo)簽探針用RNA連接酶連接。
22.條款1-18的任意之一的方法，其中標(biāo)簽探針用熱穩(wěn)定性RNA連接酶連接。
23.條款20或22的方法，其中連接反應(yīng)在變性和標(biāo)簽探針退火和連接之間重復(fù)進(jìn)行循環(huán)，產(chǎn)生許多連接了的寡核苷酸分子。
24.條款1-23任意之一的方法，其中標(biāo)簽探針之一用配體標(biāo)記。
25.條款24的方法，其中連接了的分子利用配體-捕獲分子相互作用來純化。
26.條款24-25的方法，其中配體是生物素，并且其中配體-捕獲分子相互作用是生物素-抗生物素蛋白或生物素-鏈霉抗生物素。
27.條款1-26任意之一的方法，其中靶標(biāo)核苷酸序列是RNA序列。
28.條款1-26任意之一的方法，其中靶標(biāo)核苷酸序列是微RNA序列。
29.條款28的方法，其中靶標(biāo)核苷酸序列是成熟微RNA序列。
30.條款1-26任意之一的方法，其中靶標(biāo)核苷酸序列是siRNA序列或RNA-編輯的序列。
31.條款1-26任意之一的方法，其中靶標(biāo)核苷酸序列是選擇性剪接變體序列。
32.條款1-26任意之一的方法，其中靶標(biāo)序列是非編碼或反義RNA序列或含有單核苷酸多態(tài)性或點(diǎn)突變的RNA序列。
33.條款1-26任意之一的方法，其中靶標(biāo)核苷酸序列是DNA序列。
34.條款1-26任意之一的方法，其中靶標(biāo)核苷酸序列是含有單核苷酸多態(tài)性或點(diǎn)突變的DNA序列。
35.條款1-34的方法，其中靶標(biāo)核苷酸序列是人的序列。
36.條款35的方法，其中靶標(biāo)核苷酸序列涉及疾病或可用于診斷疾病例如癌。
37.條款1-36任意之一的標(biāo)簽探針和檢測(cè)探針的文庫，其用于檢測(cè)或定量微RNA。
38.條款37的探針的文庫，其用于檢測(cè)和定量植物或哺乳動(dòng)物微RNA。
39.條款37的探針的文庫，其用于檢測(cè)和定量人或動(dòng)物微RNA。
40.條款1-36任意之一的標(biāo)簽探針和檢測(cè)探針的文庫，其用于檢測(cè)或定量反義RNA、非編碼RNA或siRNA。
41.條款1-36任意之一的標(biāo)簽探針和檢測(cè)探針的文庫，其用于檢測(cè)或定量RNA-編輯的轉(zhuǎn)錄物。
42.條款1-36任意之一的標(biāo)簽探針和檢測(cè)探針的文庫，其用于檢測(cè)或定量選擇性剪接變體。
43.條款37-42任意之一的試劑盒。
44.定量核酸樣品中的靶標(biāo)核糖核酸序列的方法，所述的方法包括a)將靶標(biāo)核糖核酸序列與寡核苷酸標(biāo)簽探針接觸，所述的標(biāo)簽探針由錨定核苷酸序列和識(shí)別核苷酸序列組成，其中所述的識(shí)別核苷酸序列與靶標(biāo)核糖核酸序列中的序列互補(bǔ)；b)使用逆轉(zhuǎn)錄酶和將寡核苷酸標(biāo)簽探針作為引物，通過逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成靶標(biāo)核糖核酸的互補(bǔ)鏈；c)通過使用DNA聚合酶和將第二標(biāo)簽探針作為引物合成第二鏈，置換雜雙鏈中的核糖核酸序列，其中所述的第二標(biāo)簽探針由錨定核苷酸序列和識(shí)別核苷酸序列組成，其中所述的識(shí)別核苷酸序列互補(bǔ)于逆轉(zhuǎn)錄酶延伸的核酸序列中的序列；d)使用對(duì)應(yīng)于連接在寡核苷酸標(biāo)簽探針上的錨定核苷酸序列的引物和包括靶標(biāo)識(shí)別序列和檢測(cè)部分的標(biāo)記的檢測(cè)探針通過實(shí)時(shí)PCR定量得到的核酸。
45.如條款44的方法，其中標(biāo)簽探針和檢測(cè)探針中的識(shí)別核苷酸序列用高度親和性的核苷酸類似物修飾。
46.條款44的方法，其中在第一標(biāo)簽探針和檢測(cè)探針中與靶標(biāo)核糖核酸中的序列互補(bǔ)的識(shí)別核苷酸序列用高度親和性的核苷酸類似物修飾，并且在第二標(biāo)簽探針中的識(shí)別序列不進(jìn)行修飾。
47.如條款44的方法，其中標(biāo)簽探針中的識(shí)別序列未經(jīng)修飾而檢測(cè)探針用高度親和性的核苷酸類似物修飾。
48.如條款44-47的方法，其中高度親和性的核苷酸類似物是LNA。
48.條款44-48的方法，其中標(biāo)簽探針中的識(shí)別序列在每第二個(gè)、第三個(gè)或第四個(gè)位置用LNA修飾，在識(shí)別序列的3’-末端中有至少一個(gè)DNA核苷酸。
49.條款48的方法，其中標(biāo)簽探針中的識(shí)別序列在每第三個(gè)位置用LNA修飾，在識(shí)別序列的3’-末端中有至少一個(gè)DNA核苷酸結(jié)尾。
50.條款44-49的方法，其中標(biāo)簽探針中的錨定核苷酸序列是DNA序列。
51.條款44-50的方法，其中標(biāo)簽探針中的錨定核苷酸序列用高度親和性的核苷酸類似物修飾。
52.條款51的方法，其中標(biāo)簽探針中的錨定核苷酸序列用LNA修飾。
53.條款44-52的方法，其中標(biāo)簽探針中的識(shí)別序列長(zhǎng)度少于約20個(gè)核苷酸并且更優(yōu)選少于15個(gè)核苷酸，并且最優(yōu)選在6和14個(gè)核苷酸之間。
54.條款44-53的方法，其中標(biāo)簽探針中的錨定核苷酸序列長(zhǎng)度少于約30個(gè)核苷酸并且更優(yōu)選少于27個(gè)核苷酸，并且最優(yōu)選在15和25個(gè)核苷酸之間。
55.條款44-54的方法，其中檢測(cè)探針中的識(shí)別序列用高度親和性的核苷酸類似物修飾。
56.如條款55的方法，其中高度親和性的核苷酸類似物是LNA。
57.條款56的方法，其中LNA任選用SBC核堿基、2’-O-甲基、2，6-二氨基嘌呤、2-硫尿嘧啶、2-硫代胸苷、5-硝基吲哚、通用或簡(jiǎn)并堿基、嵌入核苷酸或小溝結(jié)合物。
58.條款57的方法，其中識(shí)別序列中至少一個(gè)LNA腺苷單體用LNA 2’6-二氨基嘌呤代替。
59.條款58的方法，其中至少一個(gè)LNA單體用LNA 2-硫代胸苷代替。
60.條款59的方法，其中檢測(cè)探針的長(zhǎng)度少于約20個(gè)核苷酸并且更優(yōu)選少于15個(gè)核苷酸，并且最優(yōu)選在7和12個(gè)核苷酸之間。
61.條款59的方法，其中檢測(cè)探針包括LNA序列，其在5’-末端含有DNA核苷酸以及在3’-末端含有磷酸基團(tuán)。
62.條款61的方法，其中檢測(cè)探針用至少一個(gè)化學(xué)部分取代。
63.條款62的方法，其中檢測(cè)探針含有熒光團(tuán)-淬滅基團(tuán)對(duì)。
64.條款44-63的方法，其中檢測(cè)探針通過5’核酸酶測(cè)定原理使用雙標(biāo)記而得以檢測(cè)。
65.條款44-63的方法，其中檢測(cè)探針通過分子信標(biāo)原理得以檢測(cè)。
66.條款44-65任意之一的方法，其中靶標(biāo)核糖核酸的互補(bǔ)鏈用熱穩(wěn)定性逆轉(zhuǎn)錄酶合成。
67.條款44-66任意之一的方法，其中代替雜雙鏈中的靶標(biāo)核糖核酸序列的第二鏈用熱穩(wěn)定性DNA聚合酶合成。
68.條款44-67任意之一的方法，其中第二鏈標(biāo)簽探針用配體標(biāo)記。
69.條款68的方法，其中第二鏈分子利用配體-捕獲分子相互作用來純化。
70.條款68-69的方法，其中配體是生物素，并且其中配體-捕獲分子相互作用是生物素-抗生物素蛋白或生物素-鏈霉抗生物素。
71.條款44-70任意之一的方法，其中靶標(biāo)核糖核酸序列是微RNA序列。
72.條款71的方法，其中靶標(biāo)核糖核酸序列是成熟微RNA序列。
73.條款72的方法，其中第一標(biāo)簽探針的識(shí)別序列與成熟微RNA的3’-末端互補(bǔ)，而第二標(biāo)簽探針的識(shí)別序列與逆轉(zhuǎn)錄酶延伸的核苷酸序列的3’-末端(對(duì)應(yīng)于成熟微RNA的5’-末端)互補(bǔ)。
74.條款44-70任意之一的方法，其中靶標(biāo)核糖核酸序列是siRNA序列或RNA-編輯的序列。
75.條款44-70任意之一的方法，其中靶標(biāo)核糖核酸序列是選擇性剪接變體序列。
76.條款44-70任意之一的方法，其中靶標(biāo)核糖核酸序列是非編碼或反義RNA序列或含有單核苷酸多態(tài)性或點(diǎn)突變的RNA序列。
77.條款74-76任意之一的方法，其中第一標(biāo)簽探針的識(shí)別序列互補(bǔ)于成熟siRNA的3’-末端或互補(bǔ)于位于RNA編輯核苷酸、剪接位點(diǎn)、單核苷酸多態(tài)性或點(diǎn)突變的3’的序列，并且第二個(gè)標(biāo)簽探針的識(shí)別序列互補(bǔ)于逆轉(zhuǎn)錄酶延伸的核苷酸序列，所述的逆轉(zhuǎn)錄酶延伸的核苷酸序列對(duì)應(yīng)于siRNA的5’-末端或?qū)?yīng)于位于核糖核酸靶標(biāo)序列中的RNA編輯核苷酸、剪接位點(diǎn)、單核苷酸多態(tài)性或點(diǎn)突變的’5的序列。
78.條款44-77的方法，其中靶標(biāo)核糖核酸序列是人的序列。
79.條款78的方法，其中靶標(biāo)核糖核酸序列涉及疾病或可用于診斷疾病例如癌。
80.條款44-79任意之一的標(biāo)簽探針和檢測(cè)探針的文庫，其用于檢測(cè)或定量微RNA。
81.條款80的探針的文庫，其用于檢測(cè)和定量植物或哺乳動(dòng)物微RNA。
82.條款80的探針的文庫，其用于檢測(cè)和定量人或動(dòng)物微RNA。
83.條款44-79任意之一的標(biāo)簽探針和檢測(cè)探針的文庫，其用于檢測(cè)或定量反義RNA、非編碼RNA、siRNA、RNA-編輯的轉(zhuǎn)錄物或選擇性剪接變體。
84.條款80-83任意之一的試劑盒。
權(quán)利要求
1.一種方法，所述的方法用于分離、純化、擴(kuò)增、檢測(cè)、鑒定、定量或捕獲非編碼RNA，例如微RNA或小干擾RNA(siRNA)，該方法的特征是使用含有一些核苷類似物的寡核苷酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，所述的方法包括以下步驟a)將非編碼核糖核酸序列與寡核苷酸捕獲探針接觸，其中識(shí)別核苷酸序列與非編碼RNA中的序列互補(bǔ)；b)用DNA聚合酶以及將靶標(biāo)核糖核酸序列作為引物，合成捕獲探針中剩余的核苷酸序列(錨定核苷酸序列)的互補(bǔ)鏈；c)固定形成的雙鏈于固體支持物上并使靶標(biāo)樣品富集，隨后將靶標(biāo)序列從固體支持物上釋放；d)使用逆轉(zhuǎn)錄酶并將捕獲探針中的錨定核苷酸序列作為引物結(jié)合位點(diǎn)，通過逆轉(zhuǎn)錄合成非編碼核糖核酸的互補(bǔ)DNA鏈；e)通過使用DNA聚合酶和將第二標(biāo)簽探針作為引物合成第二鏈，置換雜雙鏈中的核糖核酸序列，其中所述的第二標(biāo)簽探針由錨定核苷酸序列和識(shí)別核苷酸序列組成，其中所述的識(shí)別核苷酸序列互補(bǔ)于逆轉(zhuǎn)錄酶延伸的核酸序列中的序列；f)使用對(duì)應(yīng)連接在寡核苷酸標(biāo)簽探針上的錨定核苷酸序列的引物和包括靶標(biāo)識(shí)別序列和檢測(cè)部分的標(biāo)記的檢測(cè)探針，通過實(shí)時(shí)PCR定量得到的核酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，所述的方法包括以下步驟a)將靶標(biāo)核糖核酸序列與寡核苷酸捕獲探針接觸，其中識(shí)別核苷酸序列與靶標(biāo)序列中的序列互補(bǔ)；b)使用DNA聚合酶并將靶標(biāo)核糖核酸序列作為引物，合成捕獲探針中的錨定核苷酸序列的互補(bǔ)鏈；c)固定形成的雙鏈于固體支持物上并使靶標(biāo)樣品富集；d)使用逆轉(zhuǎn)錄酶并將捕獲探針作為引物，通過逆轉(zhuǎn)錄合成靶標(biāo)核糖核酸的互補(bǔ)DNA鏈；e)通過使用DNA聚合酶和將第二標(biāo)簽探針作為引物合成第二鏈，置換雜雙鏈中的核糖核酸序列，其中所述的第二標(biāo)簽探針由錨定核苷酸序列和識(shí)別核苷酸序列組成，并且其中所述的識(shí)別核苷酸序列互補(bǔ)于逆轉(zhuǎn)錄酶延伸的核酸序列中的序列；f)使用DNA聚合酶和引物對(duì)進(jìn)行以靶標(biāo)序列為模板的PCR擴(kuò)增；e)使用對(duì)應(yīng)連接在寡核苷酸標(biāo)簽探針上的錨定核苷酸序列的引物和含有靶標(biāo)識(shí)別序列及檢測(cè)部分的標(biāo)記的檢測(cè)探針，通過實(shí)時(shí)PCR定量由此得到的核酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，所述的方法包括通過以下手段定量核酸樣品中的靶標(biāo)核苷酸序列a)將靶標(biāo)核苷酸序列與各由錨定核苷酸序列和識(shí)別核苷酸序列組成的兩種寡核苷酸標(biāo)簽探針接觸，其中所述的識(shí)別核苷酸序列與靶標(biāo)序列互補(bǔ)，并且其中第一種標(biāo)簽探針的識(shí)別序列雜交至靶標(biāo)序列的第一個(gè)區(qū)域而第二種標(biāo)簽探針的第二個(gè)識(shí)別序列雜交至鄰近靶標(biāo)序列的第一個(gè)區(qū)域的靶標(biāo)序列的第二個(gè)區(qū)域；b)通過連接反應(yīng)將雜交的標(biāo)簽探針的兩個(gè)鄰接的識(shí)別序列共價(jià)連接而形成連續(xù)的核苷酸序列，該連續(xù)的核苷酸序列包括與靶標(biāo)核苷酸序列互補(bǔ)的序列和兩個(gè)錨定核苷酸序列，并且c)通過使用對(duì)應(yīng)錨定核苷酸序列的引物和包含靶標(biāo)識(shí)別序列和檢測(cè)部分的標(biāo)記的檢測(cè)探針的實(shí)時(shí)PCR定量連接了的寡核苷酸分子。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，所述的方法包括通過以下手段定量核酸樣品中的小的非編碼RNA序列a)將靶標(biāo)核糖核酸序列與寡核苷酸標(biāo)簽探針接觸，其中識(shí)別核苷酸序列與靶標(biāo)序列中的序列互補(bǔ)；b)使用DNA聚合酶和將靶標(biāo)核糖核酸序列作為引物，合成標(biāo)簽探針中的錨定核苷酸序列的互補(bǔ)鏈；c)使用逆轉(zhuǎn)錄酶并將標(biāo)簽探針中的錨定核苷酸序列作為引物結(jié)合位點(diǎn)，通過逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成靶標(biāo)核糖核酸的互補(bǔ)DNA鏈；d)使用DNA聚合酶并將第二標(biāo)簽探針作為引物，通過合成第二鏈而置換雜雙鏈中的核糖核酸序列，其中所述的第二標(biāo)簽探針由錨定核苷酸序列和識(shí)別核苷酸序列組成，其中所述的識(shí)別核苷酸序列與逆轉(zhuǎn)錄酶延伸的核酸序列中的序列互補(bǔ)；e)使用對(duì)應(yīng)連接至寡核苷酸標(biāo)簽探針上的錨定核苷酸序列的引物和含有靶標(biāo)識(shí)別序列及檢測(cè)部分的標(biāo)記的檢測(cè)探針通過實(shí)時(shí)PCR定量得到的核酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的方法，其中核苷類似物是LNA。
7.一種試劑盒，所述的試劑盒用于分離、純化、擴(kuò)增、檢測(cè)、鑒定、定量或捕獲非編碼RNA，例如微RNA或小干擾RNA(siRNA)，其中該試劑盒包含反應(yīng)體和一種或多種經(jīng)修飾的寡核苷酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的試劑盒，其中經(jīng)修飾的寡核苷酸含有一些寡核苷類似物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的試劑盒，其中核苷類似物是LNA。
10.用于定量測(cè)定具有最多100個(gè)核苷酸的短RNA的方法，所述的方法包括a)從含有所述短RNA的樣品制備模板多核苷酸，該模板多核苷酸由下列組成1)由所述短RNA序列、其對(duì)應(yīng)的DNA序列或與所述短RNA序列互補(bǔ)的核苷酸序列組成的單鏈靶標(biāo)序列以及2)5’和/或3’鄰接的核苷酸序列，b)在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)或核苷酸聚合作用中使用所述的模板多核苷酸來獲得cDNA鏈，并且c)進(jìn)行定量實(shí)時(shí)PCR(qPCR)，所述的cDNA用作模板和任選地將模板多核苷酸用作模板。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中用于步驟c的qPCR的引物選自-至少2種寡核苷酸，其中至少一種所述的寡核苷酸對(duì)應(yīng)或互補(bǔ)于5’或3’鄰接核苷酸序列中的序列，-至少2種寡核苷酸，其中至少一種所述的寡核苷酸對(duì)應(yīng)于或互補(bǔ)于由部分單鏈靶標(biāo)序列和部分鄰接的5’或3’核苷酸序列構(gòu)成的模板多核苷酸中的連續(xù)序列，-至少2種寡核苷酸，其中一種對(duì)應(yīng)于單鏈靶標(biāo)序列中的第一個(gè)核苷酸序列而另外一種互補(bǔ)于該單鏈靶標(biāo)序列中的第二個(gè)核苷酸序列，其中所述的用于qPCR的引物可以各自獨(dú)立地包含可檢測(cè)標(biāo)記。
12.根據(jù)權(quán)利要求10或11的方法，其中在步驟(b)的反應(yīng)中利用逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)引物或DNA聚合反應(yīng)引物，所述的引物對(duì)應(yīng)于或互補(bǔ)于單鏈靶標(biāo)序列，或?qū)?yīng)于或互補(bǔ)于由部分單鏈靶標(biāo)序列和部分鄰接的5’或3’核苷酸序列構(gòu)成的模板多核苷酸中的連續(xù)序列。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中所述的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)引物或核苷酸聚合反應(yīng)引物特異于至少一種短RNA。
14.根據(jù)權(quán)利要求10-13任一項(xiàng)的方法，其中5’和/或3’鄰接核苷酸序列是由相同核苷酸組成的多核苷酸。
15.根據(jù)權(quán)利要求10-14任一項(xiàng)的方法，其中單鏈靶標(biāo)序列和5’和/或3’鄰接核苷酸序列通過共價(jià)連接。
16.根據(jù)權(quán)利要求10-15任一項(xiàng)的方法，其中單鏈靶標(biāo)序列和5’和/或3’鄰接核苷酸序列通過非共價(jià)連接。
17.根據(jù)權(quán)利要求10-16任一項(xiàng)的方法，其中5’和/或3’鄰接核苷酸序列包含可檢測(cè)標(biāo)記。
18.根據(jù)權(quán)利要求10-17任一項(xiàng)的方法，其中5’和/或3’鄰接核苷酸序列通過酶促反應(yīng)連接至單鏈靶標(biāo)序列。
19.根據(jù)權(quán)利要求10-17任一項(xiàng)的方法，其中5’和/或3’鄰接核苷酸序列通過非酶促反應(yīng)連接至單鏈靶標(biāo)序列。
20.根據(jù)權(quán)利要求10-19任一項(xiàng)的方法，其中5’和/或3’鄰接核苷酸序列在該樣品RNA所源自的生物體中不是天然出現(xiàn)的。
21.根據(jù)權(quán)利要求10-20任一項(xiàng)的方法，其中5’和/或3’鄰接核苷酸序列是非哺乳動(dòng)物的。
22.根據(jù)權(quán)利要求10-21任一項(xiàng)的方法，其中在末端轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)中，優(yōu)選在poly-A轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)中，步驟(a)包括通過將5’和/或3’鄰接核苷酸序列連接至短RNA而制備模板多核苷酸，或其中步驟(a)包括通過將5’和/或3’鄰接核苷酸序列聯(lián)結(jié)至短RNA而制備模板多核苷酸。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中連接作用選自突出端連接和平末端連接，優(yōu)選突出端連接。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，所述的方法包括將部分互補(bǔ)于5’或3’鄰接核苷酸序列的連接酶活性末端和部分互補(bǔ)于短RNA分子的連接酶活性末端的寡核苷酸退火至短RNA，這樣使5’或3’鄰接核苷酸序列的連接酶活性末端直接鄰接小RNA分子的連接酶活性末端而使得能進(jìn)行突出端連接。
25.根據(jù)權(quán)利要求22-24任一項(xiàng)的方法，其中讓樣品中的全部RNA接受連接作用或末端轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)。
26.根據(jù)權(quán)利要求22-25任一項(xiàng)的方法，其中連接反應(yīng)或末端轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)僅在靶標(biāo)序列的3’末端進(jìn)行。
27.根據(jù)權(quán)利要求22-25任一項(xiàng)的方法，其中連接至靶標(biāo)序列的5’-末端是通過在連接反應(yīng)前磷酸化靶標(biāo)序列的5’末端來進(jìn)行。
28.根據(jù)權(quán)利要求22-27任一項(xiàng)的方法，其中在連接反應(yīng)前5’鄰接核苷酸序列在其5’末端被封閉而3’鄰接核苷酸序列在其3’末端被封閉。
29.根據(jù)權(quán)利要求10-28任一項(xiàng)的方法，其中在步驟(a)中5’和/或3’鄰接核苷酸序列優(yōu)先地或?qū)Ｒ坏剡B接至所述的短RNA的特定的加工狀態(tài)。
30.根據(jù)權(quán)利要求29的方法，其中所述RNA的特定加工狀態(tài)是成熟狀態(tài)。
31.根據(jù)權(quán)利要求22-30任一項(xiàng)的方法，其中步驟(b)包括從模板多核苷酸逆轉(zhuǎn)錄而獲得cDNA。
32.根據(jù)權(quán)利要求10-18任一項(xiàng)的方法，其中步驟(a)包括核苷酸聚合作用的步驟以連接鄰接的核苷酸序列。
33.根據(jù)權(quán)利要求32的方法，其中聚合作用是通過聚合酶進(jìn)行，所述的聚合酶選自非模板依賴性和模板依賴性聚合酶。
34.根據(jù)權(quán)利要求33的方法，其中聚合酶是DNA聚合酶。
35.根據(jù)任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中聚合作用在于加入poly-A，poly-G、poly-T或poly-C尾巴至靶標(biāo)序列的3’-末端。
36.根據(jù)權(quán)利要求32-35的方法，其中步驟(a)包括通過以下步驟制備模板多核苷酸-將短RNA的3’末端退火至寡核苷酸捕獲探針上，所述捕獲探針的5’末端互補(bǔ)于該短RNA的3’末端，以及-用寡核苷酸捕獲探針作為模板通過核苷酸聚合作用延伸短RNA以便獲得延伸了的短RNA分子，該延伸了的短RNA分子構(gòu)成了模板多核苷酸。
37.根據(jù)權(quán)利要求36的方法，其中核苷酸聚合作用包括DNA聚合作用以便獲得RNA-DNA雜合物，該RNA-DNA雜合物構(gòu)成了模板聚核苷酸。
38.根據(jù)權(quán)利要求36或37的方法，其中步驟(b)包括(I)逆轉(zhuǎn)錄RNA-DNA雜合鏈而獲得cDNA，任選在除去了未退火至寡核苷酸捕獲探針的材料后。
39.根據(jù)權(quán)利要求38的方法，其中逆轉(zhuǎn)錄作用中的引物是寡核苷酸捕獲探針或單獨(dú)的逆轉(zhuǎn)錄引物。
40.根據(jù)權(quán)利要求32-35的方法，其中步驟(a)包括通過以下步驟制備模板多核苷酸-將短RNA的5’末端退火至寡核苷酸捕獲探針上，所述捕獲探針的3’末端互補(bǔ)于該短RNA的5’末端，并且其5’末端包含5’鄰接核苷酸序列，以及-用短RNA作為模板通過逆轉(zhuǎn)錄作用延伸捕獲探針而獲得延伸了的捕獲探針，該延伸了的捕獲探針構(gòu)成了模板多核苷酸。
41.根據(jù)權(quán)利要求40的方法，其中步驟(b)包括將短RNA從延伸了的捕獲探針除去，讓捕獲探針在其3’末端退火至輔助寡核苷酸上，所述的輔助寡核苷酸包含與3’鄰接核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列，并且用輔助寡核苷酸作為模板通過DNA聚合作用的方式進(jìn)一步以5’→3’方向延長(zhǎng)該捕獲探針而獲得cDNA。
42.根據(jù)權(quán)利要求36-41任一項(xiàng)的方法，其中捕獲寡核苷酸含有使得能固定于固體支持物上的部分。
43.根據(jù)權(quán)利要求42的方法，其中捕獲探針在退火后固定以使得能除去未退火的材料。
44.根據(jù)權(quán)利要求10-43任一項(xiàng)的方法，其中步驟(a)中的樣品的短RNA得以富集。
45.根據(jù)權(quán)利要求10-44任一項(xiàng)的方法，其中步驟(c)包括使用含有經(jīng)修飾的核苷酸的檢測(cè)探針。
46.根據(jù)權(quán)利要求45的方法，其中經(jīng)修飾的核苷酸是LNA核苷酸。
47.根據(jù)權(quán)利要求45或46的方法，其中檢測(cè)探針對(duì)應(yīng)于或互補(bǔ)于短RNA中的序列。
48.根據(jù)權(quán)利要求10-47任一項(xiàng)的方法，其中用于逆轉(zhuǎn)錄作用中或DNA聚合作用中的引物包含經(jīng)修飾的核苷酸。
49.根據(jù)權(quán)利要求48的方法，其中經(jīng)修飾的核苷酸是LNA核苷酸。
50.根據(jù)權(quán)利要求10-49任一項(xiàng)的方法，其中用于步驟(c)中的qPCR的至少一種引物由用于步驟(b)的逆轉(zhuǎn)錄作用或核苷酸聚合作用的引物構(gòu)成。
51.用于定量測(cè)定具有最多100個(gè)核苷酸的短RNA的試劑盒，所述的試劑盒包含-最小數(shù)目的用于根據(jù)權(quán)利要求10-50任一項(xiàng)的方法的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)引物和/或核苷酸聚合反應(yīng)引物和/或用于qPCR的引物和/或寡核苷酸捕獲探針和/或輔助寡核苷酸和/或寡核苷酸探針，其中逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)引物、核苷酸聚合反應(yīng)引物、用于qPCR的引物、寡核苷酸捕獲探針、輔助寡核苷酸和寡核苷酸探針是如權(quán)利要求11-50任一項(xiàng)定義的，以及-關(guān)于使用逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)引物和/或核苷酸聚合反應(yīng)引物和/或用于qPCR的引物和/或寡核苷酸捕獲探針和/或輔助寡核苷酸和/或寡核苷酸探針來定量測(cè)定短RNA的說明書。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于檢測(cè)、定量以及監(jiān)控成熟微RNA和小干擾RNA(siRNA)的表達(dá)的核糖核酸、探針和方法。本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于監(jiān)控其它非編碼RNA、mRNA剪接變體的表達(dá)，以及檢測(cè)和定量RNA編輯、單一轉(zhuǎn)錄物的等位基因變體、轉(zhuǎn)錄物中特定外顯子的突變、缺失或重復(fù)，例如與人疾病(如癌)相關(guān)的改變的方法。本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于檢測(cè)、定量以及監(jiān)控脫氧核酸的表達(dá)的方法。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1961081SQ200580017688
公開日2007年5月9日 申請(qǐng)日期2005年4月7日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月7日
發(fā)明者N·雅各布森, L·孔斯巴克, S·考皮南, S·M·?？送郀柕? P·莫里森, P·S·尼爾森, M·諾霍爾姆 申請(qǐng)人:埃克斯魁恩公司