專利名稱：脂肪酸去飽和酶在玉米中的表達的制作方法
背景技術(shù)：
本申請要求2004年4月16日申請的美國臨時專利申請第60/563,135號的優(yōu)先權(quán)，所述臨時申請的全部內(nèi)容通過引用具體結(jié)合到本文中。
1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明總的來講涉及調(diào)節(jié)長鏈多不飽和脂肪酸(LC-PUFA)的雙鍵數(shù)目和雙鍵位置的去飽和酶在玉米中的表達及由其獲得的組合物。
2.相關(guān)技術(shù)描述大多數(shù)生物中，脂肪酸生物合成的初級產(chǎn)物為16碳和18碳的化合物。這些脂肪酸的鏈長與不飽和度的相對比率在品種間變化很大。例如，哺乳動物主要是產(chǎn)生飽和脂肪酸和單不飽和脂肪酸，而大多數(shù)高等植物則產(chǎn)生具有一、二或三個雙鍵的脂肪酸，后兩種脂肪酸包括多不飽和脂肪酸(PUFA)。
兩個重要的PUFA家族為ω-3脂肪酸(也稱為“n-3”脂肪酸)，例如二十碳五烯酸(EPA，20:4，n-3)，和ω-6脂肪酸(也稱為“n-6”脂肪酸)，例如花生四烯酸(ARA，20:4，n-6)。PUFA是細胞質(zhì)膜和脂肪組織的重要成分，它們分別以諸如磷脂和甘油三酯的形式存在于在細胞質(zhì)膜和脂肪組織中。PUFA是哺乳動物正常發(fā)育，特別是嬰兒大腦發(fā)育及組織形成和修復(fù)所必需的。
一些疾病用脂肪酸治療后會有所起色。補充PUFA則顯示可減少血管成形術(shù)后再狹窄的比率。文件中還詳細記載了某些膳食ω-3脂肪酸對心血管疾病和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎健康有益(Simopoulos，1997；James等，2000)。此外，曾提出用PUFA治療哮喘和銀屑病。有證據(jù)表明PUFA可參與鈣代謝，這提示PUFA可用于治療或預(yù)防骨質(zhì)疏松癥和腎結(jié)石或尿道結(jié)石。多數(shù)對健康有益的證據(jù)涉及魚和魚油中的長鏈ω-3脂肪、EPA和二十二碳六烯酸(DHA，22:6)?；谶@一論據(jù)，有關(guān)國家的衛(wèi)生當局和營養(yǎng)學(xué)家推薦在膳食消耗中增加這些PUFA加拿大(科學(xué)評論委員會(Scientific Review Committee)，1990，營養(yǎng)推薦(Nutrition Recommendations)，國家衛(wèi)生福利部(Minister ofNational Health and Welfare)，Canada，Ottowa)、歐洲(de Deckerer等，1998)、英國(英國營養(yǎng)基金會(The British NutritionFoundation)，1992，不飽和脂肪酸——營養(yǎng)和生理學(xué)的意義英國營養(yǎng)基金會特別工作報告(Unsaturated fatty-acids-nutritional andphysiological significanceThe report of the British NutritionFoundation′s Task Force)，Chapman and Hall，London)和美國(Simopoulos等，1999)。
還可用PUFA治療糖尿病(美國專利第4,826,877號；Horrobin等，1993)。已經(jīng)證實在患糖尿病的動物中，脂肪酸代謝和脂肪酸組成發(fā)生改變。這些改變被認為與糖尿病引起的某些長期并發(fā)癥有關(guān)，包括視網(wǎng)膜病、神經(jīng)病、腎病和生殖系統(tǒng)損害。含有γ-亞麻酸(GLA，18:3，Δ6，9，12)的櫻草油，顯示出預(yù)防糖尿病性神經(jīng)損害并使之逆轉(zhuǎn)。
亞油酸(LA，18:2，Δ9，12)和α-亞麻酸(ALA，18:3，Δ9，12，15)等PUFA，被認為是膳食的必需脂肪酸，因為哺乳動物缺乏合成這些脂肪酸的能力。然而一旦攝入，哺乳動物便有能力使LA和ALA進行代謝形成n-6和n-3家族的長鏈多不飽和脂肪酸(LC-PUFA)。這些LC-PUFA是重要的細胞成分，使膜具有流動性，并作為有生物活性的類二十烷酸(例如前列腺素、前列環(huán)素和白三烯)的前體發(fā)揮作用，調(diào)節(jié)正常的生理機能?；ㄉ南┧崾呛铣深惗樗岬闹饕绑w，類二十烷酸包括白三烯、前列腺素和血栓烷，它還在炎癥過程中發(fā)揮作用。給予SDA等ω-3脂肪酸，顯示抑制白三烯的生物合成(美國專利第5,158,975號)。SDA的消耗顯示可引起促炎細胞因子TNF-α和IL-1β的血液水平降低(美國申請第20040039058號)。
哺乳動物中，LC-PUFA的形成受Δ6-去飽和步驟速度的限制，該步驟將LA轉(zhuǎn)化為γ-亞麻酸(GLA，18:3，Δ6，9，12)，將ALA轉(zhuǎn)化為SDA(18:4，Δ6，9，12，15)。許多生理和病理狀況顯示進一步抑制這一代謝步驟，從而抑制LC-PUFA的產(chǎn)生。為了克服限速步驟，提高EPA的組織水平，可消耗大量的ALA。然而，因為在提高人體組織的EPA水平方面，SDA比ALA的有效性高達約四倍，所以只消耗適量的SDA，就可以提供有效的EPA來源(美國申請第20040039058號)。在同一研究中，給予SDA還能夠提高二十二碳五烯酸(DPA)這一EPA延伸產(chǎn)物的組織水平。或者，通過膳食補充EPA或DHA，避開Δ6-去飽和作用，可有效減輕許多與低水平PUFA有關(guān)的病理疾病。然而，由于種種原因，現(xiàn)有PUFA的來源途徑不盡如人意，下面將加以詳述。對可靠且經(jīng)濟的PUFA源的需求，刺激了對選擇性PUFA源的興趣。
大多重要的長鏈PUFA包括主要存在于不同種類魚油的DHA和EPA，以及存在于被孢霉屬(Mortierella)等絲狀真菌的ARA。各種各樣的DHA來源，包括各種海洋生物、從冷水性海魚和蛋黃部分中獲得的油都用于商品中。SDA的商用來源包括毛束草屬(Trichodesma)，琉璃苣屬(Borago(borage))和藍薊屬(Echium)植物。然而，有關(guān)天然來源的PUFA商品有幾個缺點。天然來源的PUFA，例如動植物源，異質(zhì)油組成高。因此，從這類來源獲得的油可能需要進行大規(guī)模純化，才能分離出一種以上所需的PUFA，或生產(chǎn)出富含一種以上PUFA的油。
天然來源的PUFA在可得性方面還會遇到不受控制的波動。魚類資源會經(jīng)歷自然變化，或會因漁撈過度而耗盡。另外，即使其治療益處的證據(jù)比比皆是，但有關(guān)ω-3脂肪酸的膳食建議仍未得到重視。魚油具有令人不愉快的味道和氣味，這種味道和氣味又不能經(jīng)濟地從所需的產(chǎn)品中分離出，因此只能提供這種令人不滿意的產(chǎn)品作為食物補充劑。動物油，特別是魚油，可造成環(huán)境污染物堆積。食品可富含魚油，但同樣，由于成本和全球魚類資源減少，這類富含魚油的食品也是一個問題。這一問題還妨礙了整條魚的消費和食用。雖然如此，如果大眾接受了增加魚攝入的健康信息，滿足對魚的需求就可能出現(xiàn)問題。而且，過于依賴野生魚類資源的水產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)性發(fā)展也會出現(xiàn)問題(Naylor等，2000)。
其它的自然局限性支持新的生產(chǎn)ω-3脂肪酸的方法。氣候和疾病可引起魚資源和植物資源的產(chǎn)量發(fā)生波動。用于產(chǎn)油作物輪作生產(chǎn)的可耕地受到的競爭壓力來自人口的穩(wěn)定增長和隨之而來食物生產(chǎn)對剩余耕地需求的增加。琉璃苣等確實產(chǎn)生PUFA的作物，并不適宜商業(yè)化種植，單作情況也不理想。因此，如果可種植更有利可圖，更利于生長的作物時，則不具備種植該作物的經(jīng)濟競爭性。被孢霉屬等生物的大規(guī)模發(fā)酵也很昂貴。天然動物組織的ARA含量低，難以加工。紫球藻屬(Porphyridium)和被孢霉屬等微生物難以進行工業(yè)規(guī)模的培養(yǎng)。
許多酶參與PUFA的生物合成。油酸(OA，18:1，Δ9)通過Δ12去飽和酶形成LA(18:2，Δ9，12)，而LA則通過Δ15去飽和酶形成ALA(18:3，Δ9，12，15)。LA和ALA通過Δ6去飽和酶形成SDA(18:4，Δ6，9，12，15)和GLA(18:3，Δ6，9，12)。然而，如上所述，哺乳動物不能使Δ9以外的位置去飽和，因此不能使油酸轉(zhuǎn)變成LA。同樣，哺乳動物無法合成ALA。其它真核生物，包括真菌和植物，具有碳12和碳15位置去飽和的酶。因此，動物的大多數(shù)多不飽和脂肪酸都來自食物，通過膳食LA和ALA隨后的去飽和及鏈延伸得到。
已有各種去飽和酶編碼基因的記載。例如，美國專利第5,952,544號中描述了從油菜(Brassica napus)中分離和克隆的編碼脂肪酸去飽和酶的核酸片段?！?44專利中核酸片段的表達導(dǎo)致ALA的積累。然而，表達油菜Δ15去飽和酶的轉(zhuǎn)基因植物中，遺留了大量未被去飽和酶轉(zhuǎn)化的LA。已經(jīng)證實，某些真菌Δ15去飽和酶在植物中表達時，能夠?qū)A轉(zhuǎn)化成ALA。具體地講，粗糙脈孢菌(Neurospora crassa)和構(gòu)巢曲霉(Aspergillus(Emericella)nidulans)中的真菌Δ15去飽和酶是有效的(國際公布號WO 03/099216，其內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中)。ALA水平升高，使Δ6去飽和酶(當與編碼Δ15去飽和酶的核酸進行共表達時)作用于ALA，從而產(chǎn)生較高水平的SDA。由于SDA的有益用途眾多，因此有需要大幅提高SDA的產(chǎn)量。
人們一直在尋找來源于不同的資源用于增加SDA產(chǎn)量的核酸。已從真菌高山被孢霉(Mortierella alpina)(美國專利第6,075,183號)和植物櫻草屬(Primula)(國際公布號WO 05/021761，其內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文)中分離出編碼Δ6去飽和酶的基因。這表明在酵母和植物中，能夠?qū)LA轉(zhuǎn)化為SDA。
因此，有利的是獲取與PUFA生物合成有關(guān)的基因材料，在植物系統(tǒng)中，具體地講，是在基于土地的陸生作物植物系統(tǒng)中表達分離出來的材料，可對這一系統(tǒng)進行操作以提供一種以上商業(yè)用量的PUFA產(chǎn)品。人與動物也需要增加ω-3脂肪的攝取。因此，有需要提供大量富含ω-3的食物和食物補充劑，使人和動物可選擇符合其日常飲食習(xí)慣的飼料、飼料成分、食品和食品成分。特別有益的是增加了SDA的種子油和膳食。
目前可從植物油中獲得的只有一種ω-3脂肪酸，即ALA。然而，攝取ALA后不能很好地轉(zhuǎn)化為鏈更長的ω-3脂肪酸例如EPA和DHA。同時待審的美國申請第20040039058號“炎性疾病的治療和預(yù)防(Treatment And Prevention Of Inflammatory Disorders)”中已證實，利用亞麻籽油提高大眾ALA的攝入量達平均1g/天～14g/天，血漿磷脂EPA的水平僅適度提高。ALA攝入增加14倍導(dǎo)致血漿磷脂EPA增加2倍(Manzioris等，1994)。因此，最終需要利用脂肪酸去飽和酶、編碼脂肪酸去飽和酶的基因和產(chǎn)生脂肪酸去飽和酶的重組方法，生產(chǎn)有效的和商業(yè)上可行的PUFA產(chǎn)品。還需要含特定PUFA相對比例較高的油，及含這類油的食品和飼料組合物及補充劑。另還需要經(jīng)濟可行的生產(chǎn)特定PUFA的方法。
盡管如上所述，ω-3脂肪酸的生產(chǎn)效率低、產(chǎn)量低，但是通過陸生食物鏈生產(chǎn)ω-3脂肪酸，特別是生產(chǎn)SDA，是有利于公共衛(wèi)生事業(yè)的。正如以上所描述的，SDA之所以重要，是因為從ALA到EPA的轉(zhuǎn)化量低。這是因為人體內(nèi)轉(zhuǎn)化的起始酶，即Δ6-去飽和酶的活性低，是限速酶。研究證實，小鼠及大鼠中Δ6-去飽和酶底物ALA轉(zhuǎn)化為EPA，不如其產(chǎn)物SDA轉(zhuǎn)化為EPA有效，這一研究為Δ6-去飽和酶是限速酶提供了證據(jù)(Yamazaki等，1992；Huang，1991)。
玉米等某些種子油完全缺乏SDA或其它重要的ω-3脂肪酸，因此，本領(lǐng)域非常需要包含具有改進的PUFA分布型(profile)的種子油的植物?？衫盟鲇蜕a(chǎn)富含ω-3脂肪酸的食品和食物補充劑，消耗這些食品有效地提高了EPA的組織水平。所有用富含ω-3的油生產(chǎn)或配制的食品和食物，例如牛奶、人造奶油和香腸，都將有益于健康。還可以使用具有富含ω-3脂肪酸的提煉油或碾碎谷物或全脂谷物(full-fat grain)的動物飼料，有效地提高了EPA的組織水平，有益于牲畜的健康及產(chǎn)量。因此，為了生產(chǎn)富含PUFA的油，十分需要新的表達去飽和酶的植物。
發(fā)明概要一方面，本發(fā)明提供含有順-6，9，12，15-十八碳四烯酸(stearidonicacid)的內(nèi)源玉米種子油。在本發(fā)明的某些實施方案中，玉米種子油含有約0.1％至約33％的順-6，9，12，15-十八碳四烯酸，在另一些實施方案中可含約5％至約15％、約5％至約10％、約7.5％至約12％、約10％至約15％、約12％至約15％、約10％至約33％、約15％至約33％、約15％至約32％、約20％至約33％、約20％至約30％、約25％至約30％和約25％至約33％的順-6，9，12，15-十八碳四烯酸，包括全部中間值以及下表所示數(shù)值。本發(fā)明提供的內(nèi)源玉米種子油還含有γ-亞麻酸。本發(fā)明的某些實施方案中，油中γ-亞麻酸的含量可為約0.01％至約7.5％和約0.01％至約5％，包括低于約5％和低于約3％，尤其包括全部中間值和下表所示數(shù)值。本發(fā)明的某些實施方案中，α-亞麻酸的含量可低于約5％、10％、15％或20％。
本發(fā)明的另一些實施方案中，本發(fā)明的玉米種子油中順-6，9，12，15-十八碳四烯酸與γ-亞麻酸的比率可為約1∶1至約10∶1、約2∶1至約10∶1、約3∶1至約5∶1或至少約3∶1。本發(fā)明提供的玉米種子油另含有ω-3脂肪酸與ω-6脂肪酸的比率約0.5％∶1至約10∶1、約5∶1至約10∶1和至少約5∶1。
本發(fā)明的另一方面提供生產(chǎn)含有改進的PUFA分布型的玉米種子油的方法，該方法包括以下步驟(a)得到本發(fā)明的植物種子；(b)從所述種子中提取所述油。在本發(fā)明某些實施方案中，優(yōu)選的轉(zhuǎn)化這類植物細胞的方法包括使用土壤桿菌屬(Agrobacterium)的Ti和Ri質(zhì)粒、電穿孔和高速彈道轟擊(high-velocity ballistic bombardment)。
又一方面，本發(fā)明提供產(chǎn)生含有ω-3脂肪酸水平發(fā)生改變的種子油的玉米植物的方法，該方法包括將本發(fā)明的重組載體導(dǎo)入產(chǎn)油植物中。在該方法中，導(dǎo)入重組載體可以包括遺傳轉(zhuǎn)化。在一個實施方案中，轉(zhuǎn)化包括以下步驟(a)用本發(fā)明的重組載體轉(zhuǎn)化植物細胞；(b)用植物細胞再生植株，其中，相對于未用載體轉(zhuǎn)化的相同基因型的對應(yīng)植物，該植物的ω-3脂肪酸水平發(fā)生改變。該植物還被定義為用編碼具有去飽和酶活性的多肽的核酸序列轉(zhuǎn)化的植物，該多肽使脂肪酸分子在碳12和/或碳15去飽和。所述植物的SDA和GLA含量可以增加。該方法還包括將重組載體導(dǎo)入多種玉米植物中，從遺傳了重組載體的植物或其子代中，篩選出具有所需ω-3脂肪酸分布型的植物。
再有另一方面，本發(fā)明提供增加供人或動物消耗的食用產(chǎn)品的營養(yǎng)值的方法，所述方法包括在食用產(chǎn)品中加入本發(fā)明提供的玉米種子油。在某些實施方案中，該產(chǎn)品是人和/或動物的食物。食用產(chǎn)品還可為動物飼料和/或食品補充劑。本方法中，所述油可增加食用產(chǎn)品的SDA含量和/或可增加食用產(chǎn)品中ω-3脂肪酸與ω-6脂肪酸的比率。在加入所述油之前，該食用產(chǎn)品可能缺乏SDA。
再有另一方面，本發(fā)明提供制造食品或飼料的方法，所述方法包括在生產(chǎn)食品或飼料的食品或飼料的原料成分中，加入本發(fā)明提供的玉米種子油。在某些實施方案中，該方法還被稱為制造食品和/或飼料的方法。本發(fā)明還提供通過本發(fā)明方法生產(chǎn)的食品或飼料。
再有另一方面，本發(fā)明包括向人或動物提供SDA的方法，所述方法包括將本發(fā)明的種子油給予人或動物。本方法中，在食品或飼料等食用組合物中加入該種子油。食品的實例包括飲料、浸制食品、醬油、調(diào)味品、色拉調(diào)味料、果汁、糖漿、甜點心、掛糖霜(icings)和餡料(fillings)、軟質(zhì)冷凍產(chǎn)品、糖果或中間食品(intermediate food)。食用組合物基本上是液體或固體。食用組合物也可以是食品補充劑和/或營養(yǎng)制品。本方法中，可將種子油給予人和/或動物。可給予種子油的動物的實例包括牲畜或家禽。
另一方面，可從用分離的核酸轉(zhuǎn)化的植物中獲得本發(fā)明的玉米種子油，此核酸編碼能夠使脂肪酸分子在碳6去飽和的多肽(Δ6-去飽和酶)。在一個實施方案中，可采用從櫻草(Primula sp.)中分離出來的，具有獨特去飽和酶活性的分離的多核苷酸序列。在某些實施方案中，所述分離的多核苷酸是從例如櫻草(Primula juliae)中分離出來的。在本發(fā)明另外的某些實施方案中，所述多核苷酸編碼多肽，該多肽與SEQ ID NO3和/或SEQ ID NO4多肽序列有至少90％同源性，包括與這些多肽序列有至少約92％、95％、98％和99％的同源性。相對于亞油酸，這類序列對α亞麻酸可具有底物特異性。在某些實施方案中，相對于亞油酸，對α-亞麻酸的底物特異性至少為2∶1，包括約2∶1至約2.9∶1。
又一方面，玉米植物是用分離的多核苷酸轉(zhuǎn)化的，該多核苷酸編碼具有去飽和酶活性且使脂肪酸分子在碳6去飽和的多肽，并且包括選自以下的序列(a)編碼SEQ ID NO3或SEQ ID NO4多肽的多核苷酸；(b)含有SEQ ID NO1或SEQ ID NO2核酸序列的多核苷酸；(c)在5X SSC、50％甲酰胺和42℃的條件下，與SEQ ID NO1或SEQ ID NO2或其互補序列雜交的多核苷酸。
又一方面，本發(fā)明提供選自以下的分離的多核苷酸(a)含有SEQID NO8核酸序列的多核苷酸；(b)在5X SSC、50％甲酰胺和42℃的條件下，與SEQ ID NO8雜交的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼具有去飽和酶活性的多肽，該多肽使脂肪酸分子在碳6去飽和；(c)與SEQ ID NO8的核酸序列有至少90％序列同一性的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼具有去飽和酶活性的多肽，該多肽使脂肪酸分子在碳6去飽和；(d)序列(a)、序列(b)或序列(c)的互補序列。在一個實施方案中，該多核苷酸可含有SEQ ID NO9的核酸序列。本發(fā)明還提供含有該多核苷酸的重組構(gòu)建體和轉(zhuǎn)基因植物，以及由這種植物產(chǎn)生的種子油。
再有一方面，玉米植物是用含有本發(fā)明分離的多核苷酸的重組載體轉(zhuǎn)化的。本文所用術(shù)語“重組載體”，包括希望導(dǎo)入宿主細胞、組織和/或生物體的任何DNA重組區(qū)段，特別包括從起始多核苷酸分離的表達盒。重組載體可為線狀或環(huán)狀。從各個方面看，重組載體可包含選自以下的至少一種附加序列與多核苷酸操作性偶聯(lián)(operatively coupled)的調(diào)節(jié)序列；與多核苷酸操作性偶聯(lián)的選擇標記；與多核苷酸操作性偶聯(lián)的標記序列；與多核苷酸操作性偶聯(lián)的純化部分；和與多核苷酸操作性偶聯(lián)的引導(dǎo)序列(targeting sequence)。
再有一方面，本發(fā)明提供用本文所述的多核苷酸轉(zhuǎn)化的玉米細胞。在又一實施方案中，除多核苷酸外，還用含組成型和組織特異性啟動子的重組載體轉(zhuǎn)化細胞。在本發(fā)明的某些實施方案中，該細胞還可進一步定義為是用編碼具有去飽和酶活性的多肽的核酸序列轉(zhuǎn)化的，該多肽使脂肪酸分子在碳12和/或碳15去飽和。
附圖簡述以下附圖是本說明書的組成部分，用于進一步說明本發(fā)明的某些方面?？梢酝ㄟ^引用一幅或多幅附圖，結(jié)合本文具體實施方案的詳細描述，加深對本發(fā)明的理解?？蓮南率龈綀D的描述中，更充分地理解本發(fā)明

圖1表示載體pMON82812的圖譜。
圖2表示載體pMON78175的圖譜。
圖3表示載體pMON78171的圖譜。
發(fā)明詳述本發(fā)明通過提供PUFA含量增加的植物的培育方法和組合物及其所產(chǎn)生的種子油，克服了現(xiàn)有技術(shù)的局限性。本發(fā)明的一個實施方案中，申請人提供了轉(zhuǎn)基因玉米(Zea mays)植物，該種植物產(chǎn)生含順-6，9，12，15-十八碳四烯酸(SDA)的內(nèi)源玉米種子油，還可含有γ-亞麻酸(GLA)。這一點很重要，因為玉米種子油通常缺乏這些組分，而這些組分的每一種對健康都非常有益。玉米種子油是內(nèi)源的，因為無需從外部加入SDA等，就可以由玉米種子產(chǎn)生。這一內(nèi)源油可以是一種能用作食品和飼料成分的提取油組合物，所以有益于人或動物的健康。因此，植物等生物脂肪酸含量的變化提供改善營養(yǎng)及有利于健康等多種益處。根據(jù)本發(fā)明，可利用脂肪酸含量的變化，在玉米等植物、植物部分和植物產(chǎn)品(包括植物種子油)中使所需的PUFA達到有益水平或得到PUFA所需的分布型。例如，當植物的種子組織中產(chǎn)生所需的PUFA時，就可從這種通常導(dǎo)致油中所需PUFA含量高，或油中具有所需的脂肪酸含量或分布型的種子中分離出油，進而可用于食品和其它產(chǎn)品以提供有益的特性。本發(fā)明特別提供含SDA的內(nèi)源玉米種子油。
本發(fā)明的各方面包括使細胞PUFA含量發(fā)生改變的方法和組合物，例如使玉米植物細胞PUFA含量發(fā)生改變的方法和組合物。本發(fā)明涉及的組合物包括將新的分離的多核苷酸序列和多核苷酸構(gòu)建體引入植物和/或植物部分中。該分離的多核苷酸的實例為櫻草屬脂肪酸去飽和酶，例如櫻草屬Δ6-去飽和酶。按照本發(fā)明制備的玉米細胞，可包含其它脂肪酸去飽和酶，包括已知的Δ6去飽和酶，例如源自高山被孢霉的Δ6去飽和酶。發(fā)明人特別揭示了不同的Δ6和Δ15脂肪酸去飽和酶的表達產(chǎn)生含SDA的玉米種子油。因此，本發(fā)明的某些實施方案提供用Δ6和Δ15脂肪酸去飽和酶的編碼序列轉(zhuǎn)化的玉米植物和細胞。在本發(fā)明的一個實施方案中，Δ15-去飽和酶可得自粗糙脈孢菌和構(gòu)巢曲霉等真菌源。本發(fā)明多個實施方案中，可聯(lián)合使用去飽和酶多核苷酸和編碼多肽，這通常取決于宿主細胞、可利用的底物和所需的終產(chǎn)物?！叭ワ柡兔浮笔侵冈谝环N以上脂肪酸的相鄰碳原子間，能夠去飽和或催化形成雙鍵，產(chǎn)生單不飽和或多不飽和脂肪酸或其前體的多肽。特別重要的是能夠催化油酸轉(zhuǎn)化為LA、LA轉(zhuǎn)化為ALA或者ALA轉(zhuǎn)化為SDA的多肽，這包括在12、15或6位上催化去飽和作用的酶。術(shù)語“多肽”是指任何氨基酸鏈，不論長度或翻譯后修飾(例如糖基化或磷酸化)。選擇特定的具有去飽和酶活性的多肽所要考慮的方面包括但不限于多肽的最適pH、多肽是否為限速酶或其組分、所用去飽和酶是否是合成所需的PUFA所必需的和/或多肽是否需要輔因子等。表達多肽優(yōu)選具有與其所處宿主細胞位置的生化環(huán)境相容的特征。例如，多肽可能必須競爭才能得到底物。
可考慮對所研究多肽的Km和比活進行分析，確定指定多肽適用于改變指定宿主細胞PUFA的產(chǎn)量、水平或分布型的程度。在特定情況下使用的多肽，是一種能夠在所用宿主細胞現(xiàn)有條件下發(fā)揮特殊功能的多肽，但另一方面，還可以是任一種去飽和酶多肽，它具有所需的特征，或能夠改變所需PUFA的相對產(chǎn)量、水平或分布型或本文所述的任何其它所需的特征。表達酶的底物可以由宿主細胞產(chǎn)生，或者可以通過外源提供。為了實現(xiàn)表達，本發(fā)明的多肽是由下述多核苷酸編碼的。
本發(fā)明的另一方面，可以使用含有核酸或其片段的載體，該載體含有啟動子、去飽和酶編碼序列和終止區(qū)，用于轉(zhuǎn)移到該啟動子和終止區(qū)能起作用的生物體中。因此，本發(fā)明提供產(chǎn)生重組Δ6-去飽和酶的玉米植物。本發(fā)明所提供的該Δ6-去飽和酶編碼序列的實例是在玉米的表達達到最優(yōu)化的SEQ ID NO8和SEQ ID NO9。因此，本發(fā)明特別提供有該序列的核酸，以及與這些序列有至少90％序列同一性，包括至少93％、95％、98％和99％序列同一性的核酸。可用序列分析軟件，例如GCG Wisconsin Package序列分析軟件包(Accelrys，San Diego，CA)、MEGAlign(DNAStar，Inc.，1228 S.Park St.，Madison，Wis.53715)和MacVector(Oxford Molecular Group，2105 S.BascomAvenue，Suite 200，Campbell，Calif. 95008)等，進行多肽或多核苷酸比較，確定同一性。這類軟件通過比對相似性或同一性程度，從中找出相似的序列。
可以提供整合到宿主細胞基因組或在宿主細胞中自主復(fù)制(例如附加型復(fù)制)的核酸構(gòu)建體。為了產(chǎn)生ALA和/或SDA，通常使用的表達盒(即編碼蛋白質(zhì)的多核苷酸，它與指導(dǎo)多核苷酸表達的核酸序列操作性連接(operatively linked))包括提供使編碼Δ6-去飽和酶和/或Δ15-去飽和酶的多核苷酸表達的表達盒。在某些實施方案中，宿主細胞可以具有野生型油酸含量。
根據(jù)本文提供的方法，構(gòu)建用于去飽和酶表達的表達載體的方法和組合物，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言是顯而易見的。本文所述的表達載體是工程DNA或RNA分子，用于控制所需多核苷酸(例如編碼去飽和酶的多核苷酸)的表達。載體的實例包括質(zhì)粒、噬菌體、黏粒或病毒。本發(fā)明也包括穿梭載體(例如Wolk等，1984；Bustos等，1991)。載體及其制備和使用方法的綜述可參見Sambrook等(2001)；Goeddel(1990)；Perbal(1988)。能夠?qū)崿F(xiàn)多核苷酸表達的序列元件包括啟動子、增強子元件、上游激活序列、轉(zhuǎn)錄終止信號和聚腺苷酸化位點。
編碼去飽和酶的多核苷酸可處于強啟動子的轉(zhuǎn)錄控制之下。某些情況下，這將導(dǎo)致去飽和酶增加表達量，作為酶催化反應(yīng)的結(jié)果，伴隨而來的是所產(chǎn)生的脂肪酸增加。這類啟動子的實例包括35SCaMV(花椰菜花葉病毒)、34S FMV(玄參花葉病毒)(參見例如美國專利第5,378,619號，該專利的內(nèi)容全部結(jié)合到本文中)和Lec(來自玉米)。植物的啟動子序列多種多樣，可在轉(zhuǎn)基因植物中驅(qū)動編碼去飽和酶的多核苷酸進行組織特異性表達。事實上，在本發(fā)明的具體實施方案中，所用的啟動子為種子特異性啟動子。在這一方面可以使用的啟動子的實例包括例如下述基因的5′調(diào)節(jié)區(qū)在植物種子成熟過程中進行調(diào)節(jié)的油菜籽蛋白(napin)(Kridl等，Seed Sci.Res.1209219，1991)、菜豆蛋白(Bustos等，Plant Cell，1(9)839-853，1989)、大豆胰蛋白酶抑制劑(Riggs等，Plant Cell，1(6)609-621，1989)、ACP(Baerson等，Plant Mol.Biol.，22(2)255-267，1993)、硬酯酰-ACP去飽和酶(Slocombe等，Plant Physiol.104(4)167-176，1994)、大豆β-伴大豆球蛋白(conglycinin)的α亞基(P-Gm7S，參見例如Chen等，Proc.Natl.Acad.Sci.838560-8564，1986)、Vicia fabaUSP(P-Vf.Usp，參見例如SEQ ID NO1、2和3，美國專利申請10/429,516)、球蛋白啟動子(參見例如Belanger和Kriz，Genet.129863-872(1991)、大豆β-伴大豆球蛋白的α亞基(7Sα)(美國專利申請10/235,618，其內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中)、大麥種子peroxidinPER1啟動子(參見例如Stacey等，Plant Mol.Biol，311205-1216，1996)和玉米(Zea mays)L3油質(zhì)蛋白啟動子(P-Zm.L3，參見例如Hong等，Plant Mol.Biol，34(3)549-555，1997；另參見美國專利第6,433,252號，該文獻內(nèi)容通過引用具體結(jié)合在本文中)。
在胚乳中高度表達的啟動子的實例包括玉米醇溶蛋白編碼基因的啟動子，玉米醇溶蛋白是在玉米胚乳中發(fā)現(xiàn)的一類貯藏蛋白。已經(jīng)分離出玉米醇溶蛋白基因的基因組克隆(Pedersen等，Cell，291015-1026(1982)和Russell等，Transgenic Res.6(2)157-168)，本發(fā)明還可以使用源自這些克隆的啟動子，包括15kD、16kD、19kD、22kD和27kD的基因，在胚乳中表達(參見例如美國專利第6,326,527號，其內(nèi)容通過引用全部具體結(jié)合到本文中)。其它已知在玉米和其它植物中發(fā)揮作用的合適的啟動子包括下述基因的啟動子waxy(顆粒結(jié)合型淀粉合酶)、Brittle和Shrunken 2(ADP葡糖焦磷酸化酶)、Shrunken 1(蔗糖合酶)、分支酶I和II、淀粉合酶、脫支酶、油質(zhì)蛋白、谷蛋白、蔗糖合酶(Yang等，1990)、Betl1(基部胚乳轉(zhuǎn)移層(basalendosperm transfer layer))和球蛋白1。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的用于本發(fā)明實踐中的其它啟動子也包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。
普通技術(shù)人員能夠確定適用于在具體宿主細胞內(nèi)表達的載體和調(diào)節(jié)元件(包括操作性連接的啟動子和編碼區(qū))。本文中，“操作性連接(operatively linked)”是指啟動子序列和終止子序列有效地發(fā)揮調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的功能。另一實例中，適于在轉(zhuǎn)基因玉米植物中表達Δ6和/或Δ15去飽和酶的載體，可以含有種子特異性啟動子序列，所述啟動子序列與去飽和酶編碼區(qū)操作性連接，還與種子貯藏蛋白終止信號或胭脂堿合酶終止信號操作性連接。在又一實例中，用于植物中去飽和酶表達的載體可含組成型啟動子或組織特異性啟動子，所述啟動子與去飽和酶編碼區(qū)操作性連接，還與組成型或組織特異性終止子或胭脂堿合酶終止信號操作性連接。
本文所公開的核苷酸序列或調(diào)節(jié)元件的修飾也落入本文的范圍，核苷酸序列或調(diào)節(jié)元件經(jīng)修飾后仍保持本文所述的功能。這類修飾包括插入、取代和缺失，特別是引起遺傳密碼簡并的取代。
本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員熟知構(gòu)建這類重組載體的標準技術(shù)，例如可以參照Sambrook等(2001)或隨處可查的眾多有關(guān)重組DNA技術(shù)的任一種實驗室手冊。還有大量連接DNA片段的方法供查尋，選擇何種方法取決于DNA片段的末端性質(zhì)。本發(fā)明所考慮還包括核酸載體中有助于克隆、表達或加工的其它核苷酸序列元件，例如信號肽編碼序列、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中保持蛋白質(zhì)所必需的KDEL編碼序列或?qū)ⅵ?-去飽和酶引導(dǎo)至葉綠體上的轉(zhuǎn)運肽編碼序列。這類序列對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說是已知的。例如，Van den Broeck等(1985)描述了最優(yōu)化的轉(zhuǎn)運肽。Michaelis等(1982)揭示了原核信號序列和真核信號序列。
一旦分離出所需的基因組DNA或cDNA，就可用已知的方法進行測序。本領(lǐng)域中，一般認為這類方法易出現(xiàn)誤差，因此對同一區(qū)，尤其是對具有重復(fù)域、大量的二級結(jié)構(gòu)或異常堿基組成的區(qū)，例如GC堿基含量高的區(qū)，進行多重測序是一種常規(guī)做法，期望從所推導(dǎo)的序列中得出出錯率。當出現(xiàn)差異時，可以重新測序，并可采用特殊方法。特殊方法可以包括通過下述方法改變測序條件不同的溫度；不同的酶；能夠改變寡核苷酸形成高級結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)；修飾的核苷酸，例如ITP或甲基化dGTP等；不同的凝膠組成，例如加入甲酰胺；不同的引物或位于與問題區(qū)不同距離的引物；或不同的模板，例如單鏈DNA。也可采用對mRNA進行測序。
某些或所有具有去飽和酶活性的多肽的編碼序列可得自天然來源。然而在某些情況下，需要對所有或部分密碼子進行修飾，例如使用宿主偏好的密碼子增強表達。可從在特定宿主品種和/或目標組織中進行蛋白質(zhì)表達時，量最大且頻率最高的密碼子中，確定宿主偏好的密碼子。因此，可以全部或部分合成具有去飽和酶活性的多肽的編碼序列。也可合成全部或部分DNA，除去可能存在于轉(zhuǎn)錄mRNA二級結(jié)構(gòu)中的任何不穩(wěn)定序列或不穩(wěn)定區(qū)。還可合成全部或部分DNA，改變堿基組成成為所需宿主細胞中較偏好的堿基組成。文獻資料中大量記載了用于序列合成和序列連接的方法?？刹捎皿w外誘變和選擇、定點誘變或其它方法，使天然存在的去飽和酶基因發(fā)生突變，在體內(nèi)產(chǎn)生具有去飽和酶活性的多肽，這種多肽具有更適于在宿主細胞內(nèi)發(fā)揮作用的物理和動態(tài)參數(shù)，例如半壽期更長或所需多不飽和脂肪酸的產(chǎn)出率更高。
一旦得到編碼去飽和酶多肽的多核苷酸，就可將它放入能夠在宿主細胞中進行復(fù)制的載體中，或通過PCR或長PCR等技術(shù)進行體外增殖。復(fù)制型載體可以包括質(zhì)粒、噬菌體、病毒、黏粒等。合適的載體包括使目標基因發(fā)生突變或使目標基因在宿主細胞內(nèi)表達的載體。長PCR技術(shù)使得大型構(gòu)建體在體外增殖成為可能，從而無需采用復(fù)制型載體或宿主細胞，就完全能夠在體外進行目標基因的修飾(例如誘變或者加入表達信號)，并使所得構(gòu)建體進行增殖。
為了表達去飽和酶多肽，將功能性轉(zhuǎn)錄和翻譯的起始區(qū)和終止區(qū)與編碼去飽和酶多肽的多核苷酸操作性連接。多肽編碼區(qū)的表達可在體外或在宿主細胞內(nèi)發(fā)生。轉(zhuǎn)錄和翻譯的起始區(qū)和終止區(qū)得自各種非專有來源，包括待表達的多核苷酸、能夠在所需系統(tǒng)中表達的已知基因或疑似基因、表達載體、化學(xué)合成物或得自宿主細胞中的內(nèi)源基因座。
可以瞬時方式或穩(wěn)定方式在宿主細胞中實現(xiàn)表達。包含宿主細胞內(nèi)起作用的表達信號的導(dǎo)入構(gòu)建體可發(fā)生瞬時表達，但該構(gòu)建體不能復(fù)制，也很少整合到宿主細胞中，或宿主細胞不進行增殖。也可以通過誘導(dǎo)與目標基因操作性連接的可調(diào)節(jié)啟動子的活性，實現(xiàn)瞬時表達，雖然這類可誘導(dǎo)系統(tǒng)常常表現(xiàn)出低的基礎(chǔ)表達水平。可以通過導(dǎo)入可整合到宿主基因組或在宿主細胞內(nèi)自主復(fù)制的構(gòu)建體，達到穩(wěn)定表達?？梢酝ㄟ^使用位于表達構(gòu)建體的選擇標記或用表達構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的選擇標記，然后選擇表達標記的細胞，篩選出穩(wěn)定表達的目標基因。當整合產(chǎn)生穩(wěn)定表達時，可在宿主基因組內(nèi)隨機發(fā)生構(gòu)建體整合，或者可以通過使用構(gòu)建體，所述構(gòu)建體所包含的區(qū)與宿主基因組的同源性足于靶向與宿主基因座重組，從而靶向構(gòu)建體整合。當構(gòu)建體靶向內(nèi)源基因座時，可由內(nèi)源基因座提供所有或某些轉(zhuǎn)錄和翻譯的調(diào)節(jié)區(qū)。
如果需要增加源生物內(nèi)去飽和酶多肽的表達，則可采用幾種方法?？蓪⒕幋a去飽和酶多肽的附加基因?qū)胨拗魃?。通過同源重組也可增加天然去飽和酶基因座的表達，例如將較強啟動子插入宿主基因組來增加表達、刪除宿主基因組的信息而去掉mRNA或編碼蛋白質(zhì)中的不穩(wěn)定序列或者將穩(wěn)定序列加入到mRNA中(美國專利第4,910,141號)。
一般認為通過使用附加型或整合型表達載體，可在宿主細胞中導(dǎo)入和擴增不止一種編碼去飽和酶的多核苷酸或編碼不止一種去飽和酶的多核苷酸。如果獨立的復(fù)制型載體表達兩種以上的基因，則各載體具有不同的復(fù)制方式是適合的。各導(dǎo)入構(gòu)建體，不論整合與否，都應(yīng)有不同的選擇方式，都應(yīng)缺乏與其它構(gòu)建體的同源性以保持穩(wěn)定表達，防止構(gòu)建體間元件的重配(reassortment)?？梢酝ㄟ^實驗方法，謹慎地選擇導(dǎo)入構(gòu)建體的調(diào)節(jié)區(qū)、篩選手段和增殖方法，從而使所有導(dǎo)入的多核苷酸以必要的水平表達，合成所需產(chǎn)物。
如果轉(zhuǎn)化是必需的，則可將去飽和酶編碼序列插入到植物轉(zhuǎn)化載體中，例如雙元載體(binary vector)，參見Bevan(1984)。通過對根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)天然基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)進行修飾，可以獲得植物轉(zhuǎn)化載體。這一天然系統(tǒng)包括大的Ti(誘導(dǎo)根瘤的)質(zhì)粒，質(zhì)粒中含有一段大的稱為T-DNA的片段，可轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)化植物中。Ti質(zhì)粒的其它片段，即vir區(qū)，負責(zé)T-DNA轉(zhuǎn)移。T-DNA區(qū)與末端重復(fù)序列相鄰。在經(jīng)修飾的雙元載體中，根瘤誘導(dǎo)基因被去除，vir區(qū)的功能被用來轉(zhuǎn)移與T-DNA邊界序列(border sequence)相鄰的外來DNA。T-區(qū)還含有抗生素抗性選擇標記和插入轉(zhuǎn)移序列的多克隆位點。此工程株被認為是“繳械的(disarmed)”根癌土壤桿菌株，能使與T-區(qū)相鄰的序列有效地轉(zhuǎn)化進入植物的核基因組。
本發(fā)明有許多用途。基于本發(fā)明多核苷酸的探針也用于分離相關(guān)分子的方法或檢測表達去飽和酶生物的方法中。當用作探針時，多核苷酸或寡核苷酸必須是可檢測的。這通常是通過在內(nèi)部位點附加標記(例如通過摻入修飾殘基)，或在5′端或3′端附加標記實現(xiàn)的。這些標記可以直接進行檢測，可以與可檢測標記的第二分子結(jié)合，或者可以與未經(jīng)標記的第二分子及可檢測標記的第三分子結(jié)合；只要可獲得滿意的檢測信號，無不可接受的背景信號水平，這一過程便可一直延續(xù)下去。第二、第三或橋接系統(tǒng)可以包括應(yīng)用針對其它任何分子(包括標記或其它抗體)的抗體，或者可以包括任何彼此結(jié)合的分子，例如生物素-鏈霉抗生物素/抗生物素蛋白系統(tǒng)?？蓹z測標記通常包括放射性同位素、用化學(xué)法或用酶法等方法產(chǎn)生或改變光的分子、產(chǎn)生可檢測反應(yīng)產(chǎn)物的酶、磁性分子、熒光分子或與檢測標記結(jié)合時熒光特性或光發(fā)射特性發(fā)生改變的分子。標記方法的實例可參見美國專利號第5,011,770號?；蛘?，可以通過等溫滴定量熱法(isothermal titration calorimetry)，測量探針與靶結(jié)合時溶液熱量的變化，或者正如可用BIAcore系統(tǒng)所進行的那樣，分別通過包被表面的探針或靶并且檢測靶或探針結(jié)合所產(chǎn)生的表面光散射的變化，直接檢測靶分子的結(jié)合。
可用標準技術(shù)將含有目標基因的構(gòu)建體導(dǎo)入宿主細胞內(nèi)。為方便起見，本文中，用任何方法進行操作而攝取了DNA序列或構(gòu)建體的宿主細胞可稱為“轉(zhuǎn)化體”或“重組體”。例如，該宿主將具有至少一個拷貝的表達構(gòu)建體，也可具有兩個以上，這取決于基因是否整合到基因組內(nèi)、是否擴增或是否存在于具有多拷貝數(shù)目的染色體外元件中。
可以通過選擇導(dǎo)入構(gòu)建體所包含的標記來鑒定轉(zhuǎn)化的宿主細胞。或者，像許多轉(zhuǎn)化技術(shù)將許多DNA分子導(dǎo)入宿主細胞那樣，可用所需的構(gòu)建體導(dǎo)入不同的標記構(gòu)建體。通常，通過轉(zhuǎn)化宿主在選擇性培養(yǎng)基上的生長能力對轉(zhuǎn)化宿主進行選擇。選擇性培養(yǎng)基可摻入抗生素，或可缺乏未轉(zhuǎn)化宿主生長必需的因子，例如營養(yǎng)因子或生長因子。因此，導(dǎo)入的標記基因可以提供抗生素抗性，或者編碼必需的生長因子或酶，在轉(zhuǎn)化宿主內(nèi)表達時，使轉(zhuǎn)化宿主在選擇性培養(yǎng)基中生長。如果可直接或間接檢測出表達的標記蛋白，則也可對轉(zhuǎn)化宿主進行選擇。標記蛋白可獨立地表達，或可作為與另一蛋白的融合體表達?？梢酝ㄟ^標記蛋白的酶活性檢測標記蛋白；例如，β-半乳糖苷酶可將底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)轉(zhuǎn)化成有色產(chǎn)物，螢光素酶可將螢光素轉(zhuǎn)化成發(fā)光產(chǎn)物。可以通過標記蛋白產(chǎn)生光的特性或修飾特性檢測標記蛋白；例如，當使用藍色光照射時，維多利亞水母(Aequorea victoria)的綠色熒光蛋白會發(fā)出熒光?？梢允褂每贵w檢測標記蛋白或目標蛋白等分子標記?？梢酝ㄟ^目測或者FACS等技術(shù)或者用抗體淘選，選擇表達標記蛋白或標記的細胞。卡那霉素和氨基糖苷G418抗性以及在缺乏尿嘧啶、亮氨酸、賴氨酸或色氨酸培養(yǎng)基中的生長能力都是令人感興趣的。
本發(fā)明的另一方面提供含有本文所述的分離的DNA的轉(zhuǎn)基因植物或植物子代。可以通過任何植物轉(zhuǎn)化方法，用一種以上編碼Δ6-去飽和酶和Δ15-去飽和酶的分離的DNA轉(zhuǎn)化植物細胞。按照本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的方法，常常使轉(zhuǎn)化植物細胞在愈傷組織培養(yǎng)物或葉盤中，再生為完整的轉(zhuǎn)基因植株(例如Horsch等，1985)。由于轉(zhuǎn)化植物的子代遺傳了編碼去飽和酶的多核苷酸，因此可以使用轉(zhuǎn)化植物的種子或插條保持轉(zhuǎn)基因植物系。
本發(fā)明還提供一種使GLA和/或SDA含量增加的轉(zhuǎn)基因植物的方法。在本發(fā)明的某些實施方案中，可以將編碼Δ15-去飽和酶和/或Δ12-去飽和酶的DNA導(dǎo)入含有Δ6去飽和酶的植物細胞內(nèi)。該植物可包含或不包含內(nèi)源Δ12-去飽和酶和/或Δ15-去飽和酶的活性。本發(fā)明還提供一種提供含高水平PUFA(包括GLA和/或SDA)的轉(zhuǎn)基因玉米植物的方法，這類PUFA是天然玉米植物所缺乏的?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的重組技術(shù)的方法，構(gòu)建含有編碼Δ6-去飽和酶和/或Δ12-去飽和酶和/或Δ15-去飽和酶的DNA的表達載體(Sambrook等，2001)。
為了補充膳食起見，可將純化的PUFA、轉(zhuǎn)化的植物或植物部分或其衍生物摻入烹飪用油、脂或人造奶油中，因此在正常使用時，食用者可得到所需要的份量。PUFA還可摻入到嬰兒配方食品、營養(yǎng)補充劑或其它食品中，也可用作抗炎藥或降膽固醇藥。
本文所用的“食用組合物”是指哺乳動物可攝取的組合物，例如食物、營養(yǎng)物和藥用組合物。本文所用“食物”是指可以使用或制備的用作哺乳動物食品的物質(zhì)，包括可在食品(例如煎炸用油)或食品添加劑制造中使用的物質(zhì)。例如，食物包括供人消耗的動物或任何動物產(chǎn)品，如雞蛋等。典型的食物包括但不限于飲料(例如軟飲料、碳酸飲料、即可混合飲料)、浸制食品(例如水果和蔬菜)、醬油、調(diào)味品、色拉調(diào)味料、果汁、糖漿、甜點(例如布丁、果凍、掛糖霜和餡料、烘焙食品和冰淇淋和冰糕等冷凍甜點)、軟質(zhì)冷凍產(chǎn)品(例如軟質(zhì)冷凍奶油、軟質(zhì)冷凍冰淇淋和酸牛奶、奶制品或非奶制品人造稠黃油等軟質(zhì)冷凍點綴品(soft frozen toppings))、油和乳化產(chǎn)品(例如起酥油、人造奶油、蛋黃醬、黃油、烹飪用油和色拉調(diào)味料)和中等水分食品(例如大米和狗糧)。
本發(fā)明所提供食物的一個實例是為陪伴動物調(diào)配的食品。術(shù)語“陪伴動物”是指馴養(yǎng)動物。陪伴動物具體可以是哺乳動物，尤其包括但不限于狗、貓、兔、嚙齒動物和馬。正如所敘述的一樣，陪伴動物可以通過消耗含有本發(fā)明種子油一類的食物獲得健康。
動物食品的配制，包括為陪伴動物配制的食品為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。在貓糧和狗糧方面，濕的寵物食品、半濕的寵物食品、干的寵物食品和寵物犒賞食品(pet treats)和零食也是眾所周知的。還可得到寵物飲料，例如貓用牛奶飲料。例如，通常中等水分食品的水分含量超過20％，而濕食品的水分含量至少約65％。半濕食品的水分含量通常介于約20％至約65％之間，可含有丙二醇等濕潤劑、山梨酸鉀和防止微生物(即細菌和霉菌)生長的其它成分。干的寵物食品(粗磨)的水分含量一般低于約20％，它的生產(chǎn)方法可以包括擠出、加熱烘干和/或烘焙。寵物犒賞食品和零食常常是半濕易嚼的犒賞食品或零食；形狀式樣多種多樣的干的犒賞食品或零食；易嚼的骨頭；烘焙、擠出或模壓的犒賞食品；糖果類犒賞食品/零食；或其它類型的犒賞食品，正如本領(lǐng)域眾所周知的一樣。
中等水分寵物食品可以包括谷粒、肉類、脂肪、維生素、礦物質(zhì)、水及功能成分等成分，這些成分經(jīng)過混合、煮熟并被包裝起來。然而，可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知配方的任何半濕寵物食品。例如可在干物質(zhì)基礎(chǔ)上，加入約5～40％(重量)的蛋白質(zhì)、約5～45％(重量)的脂肪、約0.1～12％(重量)的纖維、約1～90％(重量)的碳水化合物和約0.1～2％(重量)的功能成分，制成寵物食品。本發(fā)明的油組合物中可加入任何所需用量，例如約1～50％(重量)，包括約1～30％和約3～15％。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的一樣，可在所需的終產(chǎn)物特征的基礎(chǔ)上作出變動。
而且，還可攝入本文所述的食用組合物作為食品和飲料中的添加劑或補充劑。這些組合物可與各種維生素和礦物質(zhì)等營養(yǎng)物一起調(diào)配，摻入營養(yǎng)飲料、豆奶和湯等基本為液體的組合物中；摻入基本為固體的組合物中；摻入明膠或以粉狀形式摻入各種食品中使用。這類功能食品或保健食品中有效成分的含量可與通常的藥物劑量相似。
純化的PUFA、轉(zhuǎn)化的植物或植物部分也可摻入動物(特別是牲畜)飼料中。因此，動物本身可從富含PUFA的食物中獲益，當人消耗產(chǎn)自這類牲畜的食品時也將受益?，F(xiàn)認為在某些實施方案中，SDA在動物體內(nèi)會轉(zhuǎn)化成EPA，這類動物可以通過消耗SDA使EPA增加而因此受益。
對于藥用(人用或獸用)而言，一般可口服給予該組合物，但可以通過任何吸收暢順的途徑給藥，例如胃腸外(即皮下、肌內(nèi)或靜脈內(nèi))、直腸、陰道或局部例如以皮膚軟膏劑或洗劑給予?？蓡为毥o予本發(fā)明的PUFA、轉(zhuǎn)化的植物或植物部分，或可與藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑聯(lián)用。如果可能的話，明膠膠囊劑是口服給藥的優(yōu)選劑型。上述膳食補充劑也可以提供一種口服的給藥途徑?？梢跃Y合物形式或作為脂肪酸的鹽、酯、酰胺或前藥給予本發(fā)明的不飽和酸。本發(fā)明包括任何藥學(xué)上可接受的鹽；特別優(yōu)選的是鈉鹽、鉀鹽或鋰鹽。還包括N-烷基多羥基胺鹽，例如N-甲基葡糖胺，參見PCT公布說明書WO 96/33155。優(yōu)選的酯為乙酯。作為固體鹽，PUFA也可以片劑劑型給予。對于靜脈給藥，PUFA或其衍生物可摻入商品制劑中，例如英脫利匹特(Intralipid)。
本發(fā)明的某些實施方案中，提供與異源啟動子操作性連接的編碼序列或編碼序列的片段，方向或是有義或是反義。還提供含有這些序列的表達構(gòu)建體，同時提供用這些序列轉(zhuǎn)化的植物和植物細胞。本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本說明書將了解，可協(xié)同應(yīng)用植物轉(zhuǎn)化技術(shù)，采用這些序列或本發(fā)明的其它序列，構(gòu)建構(gòu)建體(參見例如Sambrook等，2001；Gelvin等，1990)。因此，本發(fā)明的技術(shù)并不限于任何具體的核酸序列。
本發(fā)明所提供序列的一個用途是改變油組成。去飽和酶基因可與其它序列一起提供。不一定是標記編碼區(qū)的可表達編碼區(qū)如果與標記編碼區(qū)聯(lián)用時，就可以使用相同或不同DNA片段上的獨立的編碼區(qū)進行轉(zhuǎn)化。在后一種情況下，會將不同的載體同時傳遞到受體細胞中，使共轉(zhuǎn)化最大化。
對與去飽和酶編碼序列協(xié)同使用的任何附加元件的選擇，通常取決于轉(zhuǎn)化目的。作物植物轉(zhuǎn)化的一個主要目的是增加植物的商業(yè)化適宜的和重要的農(nóng)藝性狀。由于已知PUFA對健康發(fā)揮許多有益的作用，因此同時增加SDA產(chǎn)量也是有益的，并且可以通過櫻草屬Δ6-去飽和酶的表達予以實現(xiàn)。本發(fā)明的某些實施方案中，SDA的增加可能包括了Δ12去飽和酶和/或Δ15去飽和酶的表達。
用于植物轉(zhuǎn)化的載體可以包括例如質(zhì)粒、黏粒、YAC(酵母人工染色體)、BAC(細菌人工染色體)或任何其它合適的克隆系統(tǒng)以及其DNA片段。因此，如果使用術(shù)語“載體”或“表達載體”，則包括前述所有類型的載體和從載體中分離的核酸序列。一般認為利用具有大容量的插入片段的克隆系統(tǒng)，允許導(dǎo)入大的含不止一種選擇基因的DNA序列。根據(jù)本發(fā)明，這可用于導(dǎo)入多種去飽和酶編碼核酸?？梢允褂眉毦蚪湍溉斯と旧w(分別為BAC或YAC)，或者甚至是植物人工染色體，促進這些序列的導(dǎo)入。例如，Hamilton等(1996)公開了用于土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化中BAC的用途。
轉(zhuǎn)化中特別有用的是從這些載體中分離出的表達盒。當然，用于轉(zhuǎn)化植物細胞的DNA片段一般都含有希望導(dǎo)入宿主細胞并在宿主細胞內(nèi)表達的cDNA或基因。這些DNA片段還可以包括啟動子、增強子、多接頭或甚至調(diào)節(jié)基因等所需結(jié)構(gòu)。經(jīng)過選擇用于細胞導(dǎo)入的DNA片段或基因通常可編碼在所得重組細胞中表達的蛋白質(zhì)，產(chǎn)生可篩選或可選擇的性狀，和/或該DNA片段或基因通?？删幋a使所得的轉(zhuǎn)基因植物具有改良表型的蛋白質(zhì)。但是情況不一定總是這樣，本發(fā)明還包括摻入了非表達轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因植物。下面為本發(fā)明所用載體中可能包含的優(yōu)選的成分。
轉(zhuǎn)錄起始位點和編碼序列起點之間的DNA序列，也就是不翻譯的前導(dǎo)序列，也可以影響基因表達。因此，希望能使用本發(fā)明轉(zhuǎn)化構(gòu)建體的特殊的前導(dǎo)序列。一般認為優(yōu)選的前導(dǎo)序列包括預(yù)計可指導(dǎo)附著基因進行最大表達的序列，也就是說包括優(yōu)選的共有前導(dǎo)序列，該前導(dǎo)序列可增加或保持mRNA的穩(wěn)定性，防止不適當?shù)姆g起始。本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的說明書，將了解如何選擇這樣的序列。一般優(yōu)選源自植物高度表達基因的序列。
按照本發(fā)明制備的轉(zhuǎn)化構(gòu)建體通常包括3′端DNA序列，該序列作為使轉(zhuǎn)錄終止的信號，使通過與去飽和酶基因(例如cDNA)操作性連接的編碼序列所產(chǎn)生的mRNA發(fā)生多聚腺苷化。在本發(fā)明的一個實施方案中，使用了去飽和酶基因的天然終止子?；蛘?，異源3′端可增強去飽和酶編碼區(qū)的表達。相信有用的終止子的實例包括根癌土壤桿菌胭脂堿合酶基因的3′端(nos 3′端)(Bevan等，1983)、馬鈴薯或番茄蛋白酶抑制劑I或II基因的3′端和CaMV 35S終止子的3端。如果需要，還可以包括Adh內(nèi)含子(Callis等，1987)、蔗糖合酶內(nèi)含子(Vasil等，1989)或TMVΩ元件(Gallie等，1989)等調(diào)節(jié)元件。
相信本發(fā)明植物或其它細胞轉(zhuǎn)化所用的合適的方法實際上包括可將DNA導(dǎo)入細胞的任何方法，例如，直接傳遞DNA，例如，原生質(zhì)體PEG-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(Omirulleh等，1993)、干燥/抑制介導(dǎo)的DNA攝取(Potrykus等，1985)、電穿孔(美國專利第5,384,253號，有關(guān)內(nèi)容通過引用全文具體結(jié)合到本文中)、與碳化硅纖維一起攪拌(Kaeppler等，1990；美國專利第5,302,523號，其內(nèi)容通過引用全部具體結(jié)合到本文中；美國專利第5,464,765號，其內(nèi)容通過引用全部具體結(jié)合到本文中)、土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(美國專利第5,591，616號和美國專利第5,563,055號；兩者的內(nèi)容均通過引用具體結(jié)合到本文中)和使DNA包被的微粒加速(美國專利第5,550,318號；美國專利第5,538,877號和美國專利第5,538,880號；各專利的內(nèi)容均通過引用具體結(jié)合到本文中)等。事實上，通過應(yīng)用這些技術(shù)，任何植物種的細胞都可進行穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化，這些細胞都可發(fā)育成為轉(zhuǎn)基因植物。
將外源DNA傳遞給受體細胞后，后面的步驟一般涉及鑒定轉(zhuǎn)化細胞，以便進一步培育和再生植株。正如本領(lǐng)域眾所周知的一樣，為了改進鑒定轉(zhuǎn)化體的能力，需要使用根據(jù)本發(fā)明制備的轉(zhuǎn)化載體的選擇或篩選標記基因。因此在這種情況下，一般可以通過將細胞暴露在一種或多種選擇劑中，然后對可轉(zhuǎn)化的細胞群體進行試驗，或可對細胞進行選擇以得到所需的標記基因性狀。
除了用按照本發(fā)明制備的構(gòu)建體直接轉(zhuǎn)化具體的植物基因型外，還可以通過將具有本發(fā)明選定的DNA的植物與第二種缺乏該DNA的植物雜交，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物。也可用植物育種技術(shù)引入多種去飽和酶，例如將Δ6、Δ12和/或Δ15-去飽和酶導(dǎo)入一種植物中。按這種方式，可有效增加Δ6-去飽和酶的反應(yīng)產(chǎn)物。通過產(chǎn)生Δ6-去飽和酶基因和/或其它去飽和酶基因(例如Δ12-和/或Δ15-去飽和酶基因)純合的植物，可增加植物的有益代謝物。
如上所述，可以通過雜交將選定的去飽和酶基因?qū)刖唧w的植物品種，而不必總是直接轉(zhuǎn)化指定品種的植物。因此，本發(fā)明不僅包括直接轉(zhuǎn)化的植物或根據(jù)本發(fā)明從已轉(zhuǎn)化的細胞再生出的植物，而且包括這類植物的子代。本文所用術(shù)語“子代”是指根據(jù)本發(fā)明制備的親本植物的任一后代，其中子代含有根據(jù)本發(fā)明制備的選定DNA的構(gòu)建體。如本文所述，使植物“雜交”以提供具有一種以上與起始植物系有關(guān)的附加轉(zhuǎn)基因或等位基因的植物系，是指通過將起始系與含有本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因或等位基因的供體植物系雜交，使特定序列導(dǎo)入植物系的技術(shù)。例如，為此目的，可以實施下述步驟(a)第一系(起始系)親本植物的植物種子和第二系(含有所需的轉(zhuǎn)基因或等位基因的供體植物系)親本植物的植物種子；(b)使第一系親本植物和第二系親本植物的種子生長至開花期的植物；(c)用第二系親本植物的花粉給第一系親本植物的花授粉；(d)收獲花經(jīng)授粉的親本植物所結(jié)的種子。
本文中的回交是指包括以下步驟的方法(a)使含有所需基因、DNA序列或DNA元件的第一種基因型的植物與缺乏所述的所需基因、DNA序列或DNA元件的第二種基因型的植物進行雜交；(b)選出一種以上含有所需基因、DNA序列或DNA元件的子代植物；(c)使子代植物與第二種基因型的植物進行雜交；(d)重復(fù)步驟(b)和步驟(c)，目的是將來自第一種基因型植物中所需的DNA序列轉(zhuǎn)移到第二種基因型的植物中。
DNA元件漸滲入植物基因型是指回交轉(zhuǎn)化方法的結(jié)果。DNA序列漸滲的植物基因型被稱為回交轉(zhuǎn)化的基因型、品系、近交種或雜交種。同樣地，缺乏所需的DNA序列的植物基因型被稱為未轉(zhuǎn)化的基因型、品系、近交種或雜交種。
實施例下述實施例用來說明本發(fā)明的實施方案。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當了解實施例中所公開的技術(shù)，是依據(jù)發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的代表性技術(shù)，在實施本發(fā)明時應(yīng)用良好的技術(shù)。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當知道，根據(jù)本說明書，可在不偏離本發(fā)明的發(fā)明構(gòu)思、精神和范圍的情況下，對已公開的具體實施方案進行許多修改，但仍獲得相同或相似的結(jié)果。更具體地講，既在化學(xué)上相關(guān)，又在生理學(xué)上相關(guān)的某些試劑，可以替換本文所述的試劑而仍可獲得相同或相似的結(jié)果，這是顯而易見的。所有這些對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的類似的替換和修飾，被認為屬于所附權(quán)利要求書所限定的本發(fā)明的發(fā)明精神、范圍和構(gòu)思的范圍之內(nèi)。
實施例1在玉米中表達Δ15-去飽和酶和Δ6-去飽和酶的載體構(gòu)建在玉米胚組織和糊粉組織內(nèi)表達Δ15-去飽和酶和Δ6-去飽和酶的雙元載體。這一構(gòu)建體是用球蛋白啟動子制備的，該啟動子驅(qū)動經(jīng)誘變的粗糙脈孢菌Δ15-去飽和酶(SEQ ID NO5)的表達以增加在玉米等單子葉植物中的表達，也驅(qū)動高山被孢霉Δ6-去飽和酶(SEQID NO6，bp 71-1444)的表達(美國專利第6,075,183號)。將高山被孢霉(M.alpina)Δ6-去飽和酶克隆到含球蛋白啟動子的穿梭載體pMON67624中，產(chǎn)生pMON82809。將經(jīng)誘變的粗糙脈孢菌(N.crassa)Δ15去飽和酶克隆到含球蛋白啟動子的穿梭載體pMON67624中，產(chǎn)生pMON82810。
然后，將這兩種球蛋白去飽和酶表達盒克隆到含有草甘膦抗性的CP4標記基因的玉米雙元載體pMON30167中。將第一種含有高山被孢霉Δ6-去飽和酶的表達盒克隆到pMON30167中，產(chǎn)生pMON82811。將第二種含有經(jīng)誘變的粗糙脈孢菌Δ15去飽和酶的表達盒克隆到pMON82811中，產(chǎn)生玉米轉(zhuǎn)化構(gòu)建體pMON82812(圖1)。通過根癌土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化得到轉(zhuǎn)化的外植體。從轉(zhuǎn)化組織再生植株。然后，分析生長在溫室中各植株的油組成。
構(gòu)建另一個雙元載體pMON78175，以在玉米胚和糊粉組織內(nèi)表達Δ15-去飽和酶和Δ6-去飽和酶。為了產(chǎn)生這個雙元載體，用pMON82812作為模板，通過PCR擴增處于球蛋白啟動子控制之下的含有粗糙脈孢菌Δ15去飽和酶(SEQ ID NO5)的表達盒，然后將其克隆到穿梭載體中，對盒序列加以證實。通過PCR產(chǎn)生含有由球蛋白啟動子驅(qū)動的櫻草(P.juliae)Δ6-去飽和酶(SEQ ID NO7)的表達盒。在這一過程中，使緊接櫻草Δ6-去飽和酶的ATG起始密碼子之前的核苷酸變成CAGCC，產(chǎn)生基因表達在玉米等單子葉植物中最優(yōu)化的翻譯起始區(qū)。隨后，采用本領(lǐng)域已確立的標準限制和連接方法，將櫻草Δ6-去飽和酶和粗糙脈孢菌Δ15去飽和酶克隆到攜帶CP4表達盒作為選擇標記的雙元載體中，產(chǎn)生玉米轉(zhuǎn)化載體pMON78175(圖2)。通過根癌土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化得到轉(zhuǎn)化外植體。從轉(zhuǎn)化組織再生出植株。然后，分析生長在溫室中各植株的油組成。
實施例2在玉米中表達最優(yōu)化單子葉植物序列櫻草Δ6-去飽和酶的載體本實施例提供在單子葉植物中表達改進的櫻草Δ6-去飽和酶多核苷酸分子的設(shè)計和構(gòu)建。本領(lǐng)域中已十分明確，非內(nèi)源蛋白編碼序列在植物中的表達不好(美國專利第5,880,275號，有關(guān)內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中)。因此，用天然PjD6D多肽序列(SEQ ID NO3)，按以下方法設(shè)計和構(gòu)建人工PjD6D蛋白編碼多核苷酸序列1)用類似于高度表達的單子葉植物蛋白的密碼子使用偏好，2)用 in planta法去除已知影響mRNA穩(wěn)定性的前述RNA不穩(wěn)定元件(美國專利第5,880,275號)。所得經(jīng)修飾的PjD6D多核苷酸序列稱為PjD6Dnno(SEQ IDNO8)，編碼與天然PjD6D多肽序列相同的多肽(SEQ ID NO3)。
構(gòu)建雙元載體pMON78171，以在玉米胚和糊粉組織內(nèi)表達Δ15-去飽和酶和序列修飾的Δ6-去飽和酶。為了產(chǎn)生這個雙元載體，用pMON82812作為模板，通過PCR擴增處于球蛋白啟動子控制之下的含有粗糙脈孢菌Δ15去飽和酶(SEQ ID NO5)的表達盒，然后將其克隆到穿梭載體中，對盒序列加以證實。通過PCR產(chǎn)生含有由球蛋白啟動子驅(qū)動的櫻草Δ6-去飽和酶(SEQ ID NO9)的表達盒。在這一過程中，使緊接櫻草Δ6-去飽和酶的ATG起始密碼子之前的核苷酸變成CAGCC，產(chǎn)生基因表達在玉米等單子葉植物中最優(yōu)化的翻譯起始區(qū)。隨后，采用本領(lǐng)域已確立的標準限制和連接方法，將櫻草Δ6-去飽和酶和粗糙脈孢菌Δ15去飽和酶克隆到攜帶CP4表達盒作為選擇標記的雙元載體中，產(chǎn)生玉米轉(zhuǎn)化載體pMON78171(圖3)。通過根癌土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化得到轉(zhuǎn)化外植體。從轉(zhuǎn)化組織再生出植株。然后，分析生長在溫室中各植物的油組成。
實施例3脂肪酸分析將玉米粒磨碎，勻漿用庚烷抽提，測定表達pMON82812的成熟玉米粒的脂肪酸組成。用含有0.25mg/ml triheptadecanoin的甲苯溶液和甲醇鈉的甲醇溶液(0.6N)處理庚烷提取液。用氯化鈉水溶液(10％重量/體積)使反應(yīng)停止。室溫下進行分層后，用裝有分叉/不分叉毛細管入口的GLC(Hewlett Packard 6890型(120伏特)(250℃)和火焰離子化檢測器(270℃)，對有機相進行分析。柱子為Supelco 24077(0.25mm外徑×15m長)，裝有0.25μm鍵合聚乙二醇固定相。對照商品標準，根據(jù)保留時間確定脂肪酸甲酯。按照所確定的峰的面積百分比，計算定性的重量百分比組成。顯示出SDA和GLA的玉米粒的分析結(jié)果見表1。未發(fā)現(xiàn)僅含GLA的部分無效(partial null)玉米粒?？傊?jīng)過分析的玉米粒2/3以上含有GLA和SDA。用pMON82812轉(zhuǎn)化的ZM_103111@的成熟玉米粒的分析結(jié)果顯示含9.68％SDA。
表1表達SDA和/或GLA的單粒成熟玉米粒的脂肪酸分析
注釋Gen表示基因型。
用pMON78171轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的脂肪酸的分析結(jié)果見下表2。按上述方法，分析了10粒R1或F1成熟種子的脂肪酸組成，按種子數(shù)計算平均脂肪酸組成，零除外。用載體pMON78171得到的表現(xiàn)最好的結(jié)果平均含有28.6％SDA和2.2％GLA。表現(xiàn)最好的單粒玉米種子含有32.9％SDA和3.5％GLA。
表2成熟玉米粒的脂肪酸分析
用pMON78175轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的脂肪酸的分析結(jié)果見下表3。按上述方法，分析了10粒R1或F1成熟種子的脂肪酸組成。表現(xiàn)最好的單粒玉米種子含有12.4％SDA和0％GLA。
表3成熟玉米粒的脂肪酸分析
* ** * * *根據(jù)本說明書，無需過多實驗，就可制備或?qū)嵤┍疚乃_和要求保護的所有組合物和/或方法。雖然在優(yōu)選的實施方案中描述了本發(fā)明的組合物和方法，但是對本領(lǐng)域的技術(shù)人員顯而易見的是，可在不偏離本發(fā)明的構(gòu)思、精神和范圍的情況下，對本文所述的組合物和/或方法、方法的步驟或步驟的順序作出修改。更具體地講，顯而易見的是，既在化學(xué)上相關(guān)又在生理學(xué)上相關(guān)的某些試劑，可以替換本文所述的試劑而獲得相同或相似的結(jié)果。對本領(lǐng)域的技術(shù)人員是顯而易見的所有這些相似的替換和修改，被認為包括在所附權(quán)利要求書所限定的本發(fā)明的精神、范圍和構(gòu)思內(nèi)。
參考文獻下面列舉的參考文獻對本文所用的方法、技術(shù)和/或組合物進行補充、解釋、提供背景知識、或作出指導(dǎo)，因此通過引用將這些文獻的內(nèi)容結(jié)合到本文中
美國專利4,826,877美國專利4,910,141美國專利5,011,770美國專利5,158,975美國專利5,302,523美國專利5,378,619美國專利5,384,253美國專利5,464,765美國專利5,538,877美國專利5,538,880美國專利5,550,318美國專利5,563,055美國專利5,591,616美國專利5,952,544美國專利6,603,061Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology，GreenPublishing Assoc.，NY，1994。
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<213>粗糙脈孢菌(Neurospora crassa)<400>20atggcggtca ccacccgcag ccacaaggcc gcggccgcca ccgagcccga ggttgtcagc60accggcgttg acgccgtctc tgctgctgct ccctcctcct cctcctcctc ttccagccaa120aagtcggccg agcccatcga ataccccgac atcaagacca tccgcgacgc catccccgac180cactgcttcc gcccgcgcgt ctggatctcc atggcctact tcatccgcga cttcgccatg240gcctttggcc tcggctacct cgcctggcag tacatccccc tgatcgcctc caccccgctc300cgctacggcg cctgggctct gtacggctac ctccagggtc tcgtctgcac gggcatctgg360attctggcgc acgagtgcgg ccacggcgcc ttctcgaggc acacgtggtt caacaacgtc420atggggtgga ttggccactc cttcctcttg gtcccttact tcagctggaa gttcagccac480catcgccacc atcgcttcac cggccacatg gagaaggaca tggcgtttgt gcctgccacc540gaggctgatc gcaaccagag gaagctggcc aacttgtaca tggacaagga gacggccgag600atgtttgagg atgtgcccat tgtccagctc gtcaagctca tcgcccacca gctggccggc660tggcagatgt acctcctctt caacgtctcc gccggtaagg gcagcaagca gtgggagact720ggcaagggcg gcatgggctg gttgagggtt agccactttg agccttcctc tgctgtgttc780cgcaactccg aggccatcta cattgccctg tccgatcttg gtctcatgat catgggctac840atcctctacc aggccgcgca ggttgttggc tggcagatgg tgggtctgct gtacttccag900cagtacttct gggttcacca ttggttggtc gccatcactt acctccacca cacccacgag960gaagtccacc actttgacgc cgactcgtgg accttcgtca agggcgctct cgccaccgtc1020gaccgcgatt ttggcttcat tggcaagcac ctcttccaca acattatcga ccaccacgtc1080gtccaccact tgttccctcg catccccttc tactacgccg aagaagccac caactcgatc1140cgccccatgc tcggccccct ctaccaccgc gacgaccgct ccttcatggg ccagctgtgg1200tacaacttca cccactgcaa gtgggtcgtt ccggaccccc aggtccccgg cgcgcttatt1260tgggcgcaca ccgttcagag cacccagtaa 1290<210>21<211>2391<212>DNA<213>高山被孢霉(Mortierella alpina)<400>21caggatcggc ggcagcggtg gcaggagcca aggagcaggc tccagacgct gcttaggaac 60cggggacccg ggagtgcccg caccctgagc tctcagctcc ggaggcgtca tggcagagta 120cggaactctc cttcaggacc tgaccaacaa catcaccctt gaagatctgg aacagctcaa 180gtcagcctgc aaggaggaca tccccagtga gaagagtgag gagatcacca caggcagcgc 240ctggtttagc ttcctggaga gccacaacaa gctggacaaa gacaacctct cctacataga 300
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<211>522<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>修飾堿基<222>(200)...(511)<223>N＝A、C、G或T<220>
<223>人工序列的描述合成引物<400>22ttacagtaca gtcaatcacc tttattccag ggttagaaca aggccgtgca cactgcagac 60aggagcacag gatggggaca atctcacagc cgtacagggt gggagggcag gttagtcttt 120ttaggttatt tttgccttac agagagattt ctagactctg ctggaaatga ccctgtctcc 180cttctcccat ctcccccctc ctctcctcan agaaggctcc tattccttcc tcctcttccc 240cctctcgctc tcgctcgctc tcacgcacat tctcacatca cgtaatcctg accggaagga 300cagtcgtgct cagctccccc ctcccaattc tacaagtgcc tctcggtcct ggagggagaa 360gcagacaggg ctggggcatc tcggggaggt cctttaaggc aaaactgngg agtactccag 420gtgtccgtgt taaggcaggt gtccccanca ntggccaaaa gggacggctg ggctgggctg 480gctgggcgtg caaggttgtt ccnggcccgn nggtttcttc tt52權(quán)利要求
1.一種內(nèi)源玉米種子油，所述油中順-6，9，12，15-十八碳四烯酸(18:4n-3)含量為約0.1％至約33％。
2.權(quán)利要求1的玉米種子油，其中順-6，9，12，15-十八碳四烯酸含量選自約12％至約15％、約10％至約33％、約15％至約32％、約20％至約30％和約25％至約30％。
3.權(quán)利要求1的玉米種子油，其中所述玉米種子油定義為含有選自以下含量的γ-亞麻酸低于約7.5％、低于約5％和低于約3％。
4.權(quán)利要求1的玉米種子油，其中順-6，9，12，15-十八碳四烯酸與γ-亞麻酸的比率選自約1∶1至約10∶1、約2∶1至約10∶1、約3∶1至約5∶1和至少約3∶1。
5.權(quán)利要求1的玉米種子油，其中所述油中ω-3脂肪酸與ω-6脂肪酸的比率選自約0.5％∶1至約10∶1、約5∶1至約10∶1和至少約5∶1。
6.一種玉米種子，所述玉米種子含有權(quán)利要求1的種子油。
7.權(quán)利要求6的玉米種子，定義為近交種子。
8.權(quán)利要求6的玉米種子，定義為雜交種子。
9.一種玉米植物，所述玉米植物產(chǎn)生權(quán)利要求1的種子油。
10.權(quán)利要求6的玉米植物，定義為近交植物。
11.權(quán)利要求6的玉米植物，定義為雜交植物。
12.一種分離的多核苷酸，所述多核苷酸選自(a)含有SEQ ID NO8的核酸序列的多核苷酸；(b)在5X SSC、50％甲酰胺和42℃的條件下，與SEQ ID NO8雜交的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼具有去飽和酶活性的多肽，該多肽使脂肪酸分子在碳6去飽和；和(c)與SEQ ID NO8的核酸序列具有至少90％序列同一性的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼具有去飽和酶活性的多肽，該多肽使脂肪酸分子在碳6去飽和；和(d)序列(a)、序列(b)或序列(c)的互補序列。
13.權(quán)利要求12的多核苷酸，進一步定義為含有SEQ ID NO9的核酸序列。
14.一種重組構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包括權(quán)利要求12的分離的多核苷酸。
15.一種轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物是用權(quán)利要求14的重組構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的。
16.一種產(chǎn)生種子油的方法，所述方法包括在植物生長條件下，使權(quán)利要求9的植物生長直到植物產(chǎn)生所述的種子油。
17.一種增加用于人或非人類動物消耗的食用產(chǎn)品營養(yǎng)價值的方法，所述方法包括在食用產(chǎn)品中加入權(quán)利要求1的玉米種子油。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述食用產(chǎn)品選自人用食品、動物飼料和食品補充劑。
19.權(quán)利要求17的方法，其中所述玉米種子油使食用產(chǎn)品中的順-6，9，12，15-十八碳四烯酸含量增加。
20.權(quán)利要求17的方法，其中所述玉米種子油使食用產(chǎn)品中的ω-3脂肪酸與ω-6脂肪酸的比率增加。
21.權(quán)利要求17的方法，其中在加入所述玉米種子油之前，所述食用產(chǎn)品缺乏順-6，9，12，15-十八碳四烯酸。
22.一種生產(chǎn)食品和/或飼料的方法，所述方法包括向原料成分中加入權(quán)利要求1的玉米種子油以生產(chǎn)食品和/或飼料。
23.通過權(quán)利要求22的方法生產(chǎn)的食品或飼料。
24.一種向人或非人類動物提供順-6，9，12，15-十八碳四烯酸的方法，所述方法包括給予所述人或非人類動物權(quán)利要求1的玉米種子油。
25.權(quán)利要求24的方法，其中所述玉米種子油是以食用組合物給予的。
26.權(quán)利要求25的方法，其中所述食用組合物是食品或飼料。
27.權(quán)利要求26的方法，其中所述食品包括飲料、浸制食品、醬油、調(diào)味品、色拉調(diào)味料、果汁、糖漿、甜點心、掛糖霜和餡料、軟質(zhì)冷凍產(chǎn)品、糖果或中等水分食品。
28.權(quán)利要求26的方法，其中所述食用組合物是供陪伴動物用的食品或飼料。
29.權(quán)利要求25的方法，其中所述食用組合物基本上是液體或固體。
30.權(quán)利要求25的方法，其中所述食用組合物是食品補充劑和/或營養(yǎng)制品。
31.權(quán)利要求24的方法，其中所述玉米種子油是給予人的。
32.權(quán)利要求24的方法，其中所述玉米種子油是給予非人類動物的。
33.權(quán)利要求32的方法，其中所述玉米種子油是給予牲畜或家禽的。
全文摘要
本發(fā)明總的來講涉及去飽和酶在轉(zhuǎn)基因玉米植物中的表達及由其獲得的組合物。具體地講，本發(fā)明涉及玉米植物中含有改進的ω－3脂肪酸分布型的油的生產(chǎn)及由該玉米植物所產(chǎn)生的種子油。這樣的油可含有對健康產(chǎn)生有益作用但天然玉米植物中并不存在的順－6，9，12，15－十八碳四烯酸。
文檔編號C12N15/82GK1968688SQ200580019209
公開日2007年5月23日 申請日期2005年4月15日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月16日
發(fā)明者V·烏爾辛, B·弗羅曼, A·J·納瓦, J·貢扎萊斯 申請人:孟山都技術(shù)有限公司