專利名稱：將核酸遞送到外周神經(jīng)元的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明通常涉及將核酸遞送到外周神經(jīng)元的組合物和方法。
背景技術(shù)：
神經(jīng)再生是一種復(fù)雜的生物學(xué)過程。中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)損傷后的變性過程在某些方面是相類似的，但在另外一些方面卻不同。最大的區(qū)別之一在于在神經(jīng)損傷后，外周神經(jīng)具有明顯更強(qiáng)的再生軸突能力(Fenrich，K.等.2004，Can J Neurol Sci.31(2)142)。
Schmidt和Leach最近綜述了治療神經(jīng)損傷的許多方法(2003，Annu.Rev.Biomed.Eng.5293)。目前治療損傷導(dǎo)致神經(jīng)缺陷的方法通常依靠來自病人的供體組織。這帶來了下列問題供體位置的功能損失、潛在疼痛神經(jīng)瘤的形成、供體和受體神經(jīng)結(jié)構(gòu)的不同以及大范圍修復(fù)時(shí)移植物短缺。為了克服這些問題，已經(jīng)開發(fā)出了合成神經(jīng)導(dǎo)管(NGCs)，其通過將切斷神經(jīng)殘端鎖定在該管的兩端來對(duì)神經(jīng)間隙進(jìn)行橋連(US5,0190,87)。許多裝置，例如，Integra Neurosciences I型拼接(collage)管和SaluMedica的SaluBridgeTM神經(jīng)封套已獲美國食品與藥物管理局批準(zhǔn)。然而，這些裝置是用于治療相對(duì)較短的神經(jīng)缺損，并且在大多數(shù)情況下，合成管并不具有神經(jīng)自體移植物的功能(Schmidt & Leach2003，Annu.Rev.Biomed.Eng.5293)。
提出了一些組織-構(gòu)建方法來提高NGCs的功能，其包括在中空管內(nèi)遞送神經(jīng)營養(yǎng)因子。相對(duì)于充滿了磷酸緩沖鹽類的NGCs而言，用透析血漿填充的硅酮NGCs使得功能性復(fù)原在8周內(nèi)增加了3-5倍(Williams等.1987，J.Comparative Neurology 264284)。作為替代的，在管內(nèi)傳導(dǎo)神經(jīng)營養(yǎng)因子如神經(jīng)生長因子(NGF)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)、神經(jīng)膠質(zhì)生長因子(GFG)以及睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)會(huì)顯著的加速斷裂及被修補(bǔ)神經(jīng)的形態(tài)和/或功能恢復(fù)。
NGF是第一個(gè)并且是研究最為透徹的神經(jīng)-來源的因子，其作用的神經(jīng)元群的種類相對(duì)有限，包括外周神經(jīng)系統(tǒng)感覺神經(jīng)元的交感亞群，和腦內(nèi)的紋狀體(striatial)及膽堿能神經(jīng)元(Terenghi，G.1999，J.Anat1941-14)。在正常情況下，NGF呈現(xiàn)出非常低的濃度，但是在實(shí)驗(yàn)性神經(jīng)損傷動(dòng)物模型中快速升高。NCF主要是由在損傷神經(jīng)遠(yuǎn)殘端的目標(biāo)組織和施沃恩細(xì)胞來產(chǎn)生的，然后在作用神經(jīng)元受體產(chǎn)生神經(jīng)營養(yǎng)功效前以逆向方式運(yùn)輸入細(xì)胞體內(nèi)。外周神經(jīng)病中，在病態(tài)神經(jīng)內(nèi)的此類運(yùn)輸會(huì)受影響、減少或被完全阻斷。盡管在早期NGF的遞送能促進(jìn)管內(nèi)的神經(jīng)再生，但是這種促進(jìn)不會(huì)持續(xù)到1個(gè)月后，這可能是由于管內(nèi)NGF濃度的快速降低，造成這種降低的原因在于NGF在37℃含水介質(zhì)中降解、滲漏出管和/或由于液體進(jìn)入而被稀釋。此外，將神經(jīng)營養(yǎng)因子導(dǎo)入NGCs的時(shí)間對(duì)于愈合或再生過程有著重要的影響引入各種試劑太早或太晚都會(huì)抑制再生過程(US5584885)。
感覺神經(jīng)元的細(xì)胞體位于背根神經(jīng)節(jié)，小結(jié)節(jié)(nodule)位于每個(gè)脊神經(jīng)的背根遠(yuǎn)端。背神經(jīng)根和腹神經(jīng)根位于硬膜鞘內(nèi)并被腦脊液(CSF)包圍，其穿過椎間孔，在其中背根形成了背根神經(jīng)節(jié)，隨后與腹根合在一起形成背神經(jīng)根。從形態(tài)上看，DRG的體感神經(jīng)元具有一個(gè)單極結(jié)構(gòu)，并通過一個(gè)脊髓中的長的向上軸突而連接到中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)上，并通過第二軸突分支下行通過脊神經(jīng)根而連接到外周神經(jīng)系統(tǒng)(PNS)上，并且進(jìn)一步突出進(jìn)入到外周神經(jīng)中。從功能上說，DRG神經(jīng)元負(fù)責(zé)從觸覺、溫度、痛感到本體感受的不同感覺通道的受體-傳導(dǎo)刺激的信號(hào)傳導(dǎo)。
發(fā)明簡述本發(fā)明的一個(gè)方面在于提供了一種將核酸遞送到宿主外周神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元細(xì)胞中的方法，其包括下述步驟辨識(shí)背根神經(jīng)節(jié)中的目標(biāo)神經(jīng)元細(xì)胞，然后將包含核酸的載體施用到宿主腦脊液中足夠接近背根神經(jīng)節(jié)的位置，以將核酸遞送到目標(biāo)神經(jīng)元細(xì)胞的細(xì)胞體中。
本發(fā)明的另一個(gè)方面在于提供了一種治療宿主外周神經(jīng)病的方法，該方法包括辨識(shí)受神經(jīng)病影響的背根神經(jīng)節(jié)中的目標(biāo)神經(jīng)元細(xì)胞，然后將包含治療用核酸的載體施用到宿主腦脊液中足夠接近背根神經(jīng)節(jié)的位置，以將核酸遞送到目標(biāo)神經(jīng)元細(xì)胞的細(xì)胞體中。
本發(fā)明的又一個(gè)方面在于提供了一種治療宿主的斷裂的外圍神經(jīng)的方法，該外圍神經(jīng)具有近端和遠(yuǎn)端殘端，該方法包括將包含治療用核酸的載體鞘內(nèi)施用至背根神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)細(xì)胞中，其中遠(yuǎn)端和近端殘端被鎖定到神經(jīng)導(dǎo)管上。
本發(fā)明的再一個(gè)方面在于提供了一種含核酸載體在用于將核酸遞送到背根神經(jīng)節(jié)中目標(biāo)神經(jīng)元細(xì)胞中的用途，其中所述遞送依靠載體在腦脊液中的施用位置發(fā)揮作用，該位置足夠接近背根神經(jīng)節(jié)以將核酸遞送到目標(biāo)神經(jīng)元細(xì)胞的細(xì)胞體中。
而本發(fā)明的一個(gè)方面在于提供一種含治療用核酸的載體在用于治療宿主外周神經(jīng)病中的用途，其中所述核酸被從腦脊液中的施用位置遞送到受到神經(jīng)病影響的背根神經(jīng)節(jié)中的目標(biāo)神經(jīng)元細(xì)胞中，該位置足夠接近背根神經(jīng)節(jié)以將核酸遞送到目標(biāo)神經(jīng)元細(xì)胞的細(xì)胞體中。
仍然是本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種含治療用核酸的載體在用于治療斷裂的外周神經(jīng)中的用途，該外周神經(jīng)具有遠(yuǎn)端和近端殘端，其中所述遠(yuǎn)端和近端殘端被鎖定到神經(jīng)導(dǎo)管上，所述核酸被從腦脊液中的施用位置遞送到背根神經(jīng)節(jié)中的目標(biāo)神經(jīng)元細(xì)胞中。
結(jié)合附圖閱讀本發(fā)明下列具體實(shí)施方案時(shí)，本發(fā)明的其他方面和特征對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言是顯而易見的。
附圖簡述在圖中，其僅以本發(fā)明實(shí)施例、實(shí)施方式進(jìn)行了說明

圖1為在注射后兩天大鼠DRG中被Cy3標(biāo)記了的桿狀病毒或PEI/DNA復(fù)合物的共焦掃描顯微鏡圖片。用FITC標(biāo)記的NeuN對(duì)DRG進(jìn)行了染色(綠色)。主要在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)現(xiàn)了被Cy3標(biāo)記的桿狀病毒和PEI復(fù)合物(紅色)，同時(shí)還用NeuN信號(hào)(箭頭)進(jìn)行了很好的共同定位。
圖2圖示的是鞘內(nèi)注射后一天(上半部分)或三天(下半部分)時(shí)，用編碼螢火蟲熒光素酶基因的PEI/DNA或桿狀病毒載體轉(zhuǎn)染DRG細(xì)胞的情況。540bp的PCR片段相應(yīng)于火螢熒光素酶基因的一部分。
圖3是來自DRG中用帶有CMV E/P啟動(dòng)子的四種不同載體表達(dá)熒光素酶的情況。在后注射2天時(shí)測定了熒光素酶的活性，并且以相對(duì)亮度單元(RLU)/毫克蛋白質(zhì)(圖3A)或/毫克組織(圖3B)的形式對(duì)該活性進(jìn)行了表達(dá)。圖3C描繪了在PEI/DNA復(fù)合物的鞘內(nèi)注射后的DRG中，以RLU/毫克蛋白質(zhì)表達(dá)的熒光素酶活性隨時(shí)間的變化。
圖4是脊髓和DRG中用帶有CMVE/PDGF啟動(dòng)子的四種不同載體表達(dá)熒光素酶的情況。在注射后2天時(shí)測定了熒光素酶的活性，并且以相對(duì)亮度單元(RLU)/組織(圖4A)或/毫克蛋白質(zhì)(圖4B)的形式對(duì)該活性進(jìn)行了表達(dá)。
圖5圖示的是在DRG的神經(jīng)元中熒光素酶表達(dá)的共焦掃描顯微鏡圖片。將注射PEI/DNA復(fù)合物后2天收集的大鼠DRG冷凍切片用于雙重免疫染色，即以抗熒光素酶表示轉(zhuǎn)染細(xì)胞和以抗NeuN表示神經(jīng)元。大部分的細(xì)胞可以用沒被NeuN(箭頭)標(biāo)記的熒光素酶陽性細(xì)胞進(jìn)行共定位。
圖6體外(A，B)和體內(nèi)(C)基因轉(zhuǎn)染后的NGF濃度。在COS7細(xì)胞培養(yǎng)物中的NGF濃度是用/毫升培養(yǎng)基(圖6A)或/毫克細(xì)胞溶菌液蛋白質(zhì)(圖6B)來表示的。在體外轉(zhuǎn)染后24小時(shí)收集細(xì)胞。在鞘內(nèi)注射含pcDNA3-NGF的PEI復(fù)合物或?qū)φ战M質(zhì)粒pcDNA-luc后的第3和第7天，收集了DRG(圖6C)。
圖7圖示的是鞘內(nèi)注射四周后NGC內(nèi)神經(jīng)再生形態(tài)特征分析。來自PEI/pcDNA-NGF轉(zhuǎn)染組的樣本，與對(duì)照組相比(p＜0.01)，該樣本顯示了具有較大直徑的纖維并且具有較低的G比率。在纖維群和密度方面，兩個(gè)組之間沒有顯著的差異。
圖8是來自NGF轉(zhuǎn)染組(B)和對(duì)照組(A)的再生神經(jīng)纖維的電子顯微鏡形態(tài)圖。運(yùn)行4周后收集了樣本。MA有髓軸突。在NGF組中用較濃的髓磷脂標(biāo)記較大的軸突。原始放大倍率×10000。
詳細(xì)描述本發(fā)明者令人驚奇的發(fā)現(xiàn)將核酸載體施用入脊髓周圍的腦脊液中是將外生核酸遞送到背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)質(zhì)中的有效方法。更具體地說，編碼NGF的核酸載體被鞘內(nèi)注射到腦脊液中后顯示了對(duì)于神經(jīng)導(dǎo)管內(nèi)斷裂坐骨神經(jīng)再生的積極作用。
本申請(qǐng)所用術(shù)語“神經(jīng)元細(xì)胞”和“神經(jīng)元”采用本領(lǐng)域的通常含義可以交互使用，是指神經(jīng)系統(tǒng)的任何傳導(dǎo)細(xì)胞，其通常包括細(xì)胞體或細(xì)胞質(zhì)，一些樹突和一個(gè)軸突。該術(shù)語既包括單個(gè)細(xì)胞也包括多個(gè)細(xì)胞群，另有清晰說明的除外。
將重組載體鞘內(nèi)施用入接近背根神經(jīng)節(jié)的腦脊液使得背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞可以一定方式進(jìn)行轉(zhuǎn)染，該方式不依賴于軸突傳遞并且以相對(duì)最小侵入技術(shù)來完成。在外周神經(jīng)損傷之后，包圍著損傷點(diǎn)的細(xì)胞和組織，包括施沃恩細(xì)胞，通常分泌因子，該因子被損傷或損壞的神經(jīng)元軸突吸收。這些因子通常通過軸突傳遞被遞送到損傷神經(jīng)的細(xì)胞質(zhì)中，其中它們與受體相互作用并且發(fā)揮生物學(xué)作用。許多病毒類基因治療系統(tǒng)，包括利用皰疹和脊髓灰質(zhì)炎病毒的治療，都使用了這種軸突傳遞以將治療用基因遞送到其它方法不可到達(dá)的神經(jīng)元中，包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)元。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，這些方法在某些情況下提供的不是最優(yōu)基因遞送，在這些情況中，軸突遞送是被損害的，例如，在特定的神經(jīng)病中，如糖尿病類神經(jīng)病和外傷、壓力或橫切所引起的外周神經(jīng)損傷中。
在外周軸突傳遞被損害或消失的情況下，可以通過使用對(duì)目標(biāo)DRG神經(jīng)元的鞘內(nèi)注射，將置于適當(dāng)啟動(dòng)子調(diào)控下編碼外源基因的核酸載體遞送到DRG的細(xì)胞。因此，可以通過將含核酸載體施用到腦脊液中，從而將所述核酸遞送至外周神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)細(xì)胞體中?？梢岳斫獾?，腦脊液中的注射位置取決于特定的目標(biāo)神經(jīng)元細(xì)胞，該細(xì)胞是核酸遞送所需進(jìn)入的背根神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)細(xì)胞。更特別的，所挑選的施用位置足夠接近目標(biāo)DRG神經(jīng)元細(xì)胞從而將核酸遞送到目標(biāo)細(xì)胞的細(xì)胞體中，即，遞送可以被調(diào)節(jié)或被影響而與軸突傳遞無關(guān)。因此，核酸被遞送到目標(biāo)細(xì)胞可以不受軸突傳遞的影響。從外周神經(jīng)系統(tǒng)的節(jié)段結(jié)構(gòu)(segmental architecture)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解到施用的位置取決于目的在于轉(zhuǎn)染的DRG神經(jīng)細(xì)胞。例如，為了將轉(zhuǎn)基因基因產(chǎn)品遞送到擴(kuò)展至受試者食指的外周神經(jīng)中，優(yōu)選將載體鞘內(nèi)施用入到環(huán)繞或靠近受試者的脊椎的CSF中其。可以參考普通解剖學(xué)文章來確定適宜的注射位置，例如，Introduction to HumanAnatomy 6th edition，F(xiàn)rancis，CV.Mosby Company，1973。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，通過腰椎注射來施用載體。腰椎注射被認(rèn)為是安全的，并且對(duì)受損的脊髓和神經(jīng)根基本不產(chǎn)生影響，這是由于位于馬尾水平上相對(duì)較寬的蛛網(wǎng)膜下隙中的腦脊液(CSF)在使得神經(jīng)根對(duì)針頭穿刺反應(yīng)時(shí)可以具有一定程度的移動(dòng)。因此，該方法確保了將基因遞送到腰椎DRG中的安全多重施用。腰椎穿刺在臨床中用作脊椎麻醉的可行方法，并且用于引入治療用的或診斷用的試劑。
因此，鞘內(nèi)施用的含核酸序列的載體可以用于指導(dǎo)任何外源核酸在背根神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)元細(xì)胞中的表達(dá)，從而將治療用產(chǎn)品提供到外傷或疾病后的外周神經(jīng)元或用于研究外周神經(jīng)元中的基因表達(dá)。
在不同的實(shí)施方式中，載體是病毒載體，“病毒載體”指的是為將外源核酸引入細(xì)胞而構(gòu)建的重組病毒。病毒載體包括，例如，反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺伴隨病毒(AAV)、桿狀病毒、牛痘病毒、皰疹病毒、甲病毒類載體、甲病毒類復(fù)制和慢病毒載體。
通過病毒載體將核酸遞送到細(xì)胞中需要病毒囊膜的外表面上的分子和將被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞上的分子之間的特異性相互作用，例如，糖蛋白D與細(xì)胞表面受體，皰疹病毒進(jìn)入介質(zhì)A或nectin-1，之間的相互作用，(Krummenacher等.2003，Journal of Virology 77(16)8985)。作為替代的，病毒基因遞送系統(tǒng)可以涉及非特異性相互作用，例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞的桿狀病毒轉(zhuǎn)染。桿狀病毒對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞顯示了廣泛向性并且可以用非細(xì)胞-特異性的靜電相互作用來調(diào)節(jié)病毒的進(jìn)入(Sarkis等.2000，Proc.Nat Acad.Sci.9714638)。取決于被轉(zhuǎn)染的目標(biāo)細(xì)胞的特性，本領(lǐng)域技術(shù)人員能很容易的確定最適宜的病毒基因遞送系統(tǒng)。
在特定的實(shí)施方式中，病毒載體可以是桿狀病毒載體或AAV載體。最近，桿狀病毒載體被認(rèn)為是新一代基因治療載體，原因在于其既對(duì)增殖性又對(duì)非增值性靜態(tài)哺乳動(dòng)物細(xì)胞具有廣泛向性，并且其在脊椎細(xì)胞中缺乏復(fù)制，并且?guī)缀鯖]有顯微鏡下能觀察到的細(xì)胞毒性(Ghosh等，2002，MolTher 65；Kost & Condreay，2002，Trends Biotechnol 20173)。桿狀病毒，例如源自苜蓿銀紋夜蛾多(核殼體)核型多角體病毒的桿狀病毒，特別適用于非-分裂細(xì)胞的基因治療，原因在于它們是游離的并且它們的啟動(dòng)子在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中是無活性的，這就使得它們?cè)谌梭w細(xì)胞中不會(huì)復(fù)制(Sarkis等.2000，Proc.Nat.Acad.Sci.9714638)。當(dāng)桿狀病毒載體被直接體內(nèi)注入時(shí)，其顯示可以轉(zhuǎn)染腦細(xì)胞(Sarkis等.2000，Proc.Nat.Acad.Sci 9714638；Tani等2003，Journal of Virology77(18)9799)。進(jìn)一步，相對(duì)于腺病毒，桿狀病毒載體可以消除更少的小神經(jīng)膠質(zhì)反應(yīng)(Lehtolainen等2002，Gene Therapy 91693)。
利用桿狀病毒載體來進(jìn)行神經(jīng)系統(tǒng)基因轉(zhuǎn)染的可能性已經(jīng)進(jìn)行了兩項(xiàng)研究。最初的報(bào)告描述了體外和體內(nèi)神經(jīng)元細(xì)胞的足量轉(zhuǎn)導(dǎo)(Sarkis等，2000，Proc.Nat.Acad.Sci 9714638)。在人類胚胎的腦原代細(xì)胞培養(yǎng)物中，神經(jīng)上皮、成神經(jīng)細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞可以被轉(zhuǎn)染，盡管使用成年裸鼠的體內(nèi)試驗(yàn)表明主要是星形膠質(zhì)細(xì)胞以及僅一些神經(jīng)元被轉(zhuǎn)導(dǎo)了。第二項(xiàng)研究檢查了腦中桿狀病毒-介導(dǎo)基因表達(dá)的細(xì)胞類型且鑒定脈絡(luò)叢的立方上皮細(xì)胞是主要目標(biāo)，內(nèi)表皮細(xì)胞中有適度的基因表達(dá)，而其他類型的腦細(xì)胞僅有非常有限或沒有表達(dá)，包括神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞(Lehtolainen等，2002，Gene Therapy91693)。
本發(fā)明者首次發(fā)現(xiàn)了通過鞘內(nèi)注射，桿狀病毒能轉(zhuǎn)染感覺神經(jīng)元。
本領(lǐng)域技術(shù)人員易于理解怎樣構(gòu)建用在本發(fā)明中的桿狀病毒載體。重組桿狀病毒載體可以根據(jù)商品化桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)所附的說明書進(jìn)行構(gòu)建，例如，Bac-to-Bac表達(dá)系統(tǒng)(Invitrogen)?？梢杂梅肿由锓椒▉砀倪M(jìn)重組桿狀病毒載體，包括PCR方法和其他克隆方法，正如技術(shù)人員熟知的或已經(jīng)被描述的，例如在Sambrook等，《分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》(第三版)，Cold Spring Harbour出版社。
病毒載體可以被構(gòu)建使之含有增高量的病毒囊膜糖蛋白gp64。雖然病毒上的gp64進(jìn)入到哺乳動(dòng)物細(xì)胞的作用機(jī)理還不知道，但是具有增高量gp64的病毒載體可以提高轉(zhuǎn)導(dǎo)水平(Tani等2001，Virology 279343)。還通過將外來膜蛋白合并入病毒顆粒的囊膜中來改進(jìn)重組病毒載體。例如，神經(jīng)系統(tǒng)感染效率的提高是可以通過將假假型(Sarkis等.2000，Proc.Nat.Acad.Sci.9714638)狂犬病病毒糖蛋白(RVG)或水皰性口膜炎病毒G蛋白(VSVG)(Tani等.2003，Journal of Virology 77(18)9799)，皰疹囊膜糖蛋白或源自α-或彈狀病毒的囊膜蛋白(Ghosh等2002，Molecular Therapy 6(1)5)并入到病毒性病毒體的囊膜中來實(shí)現(xiàn)。對(duì)于病毒進(jìn)入，已知RVG來利用煙堿乙酰膽堿受體和低親和神經(jīng)生長因子受體，并且相對(duì)于未改進(jìn)的桿狀病毒而言，RVG改進(jìn)的桿狀病毒顯示了10-5000倍高的神經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率(Tani等2003，Journal of Virology77(18)9799)?？梢蕴鎿Q的，可以通過將抗細(xì)胞特異性蛋白受體的抗體并入病毒囊膜囊膜中來提高病毒感染的細(xì)胞特異性，該。
為了最小化或避免被血清補(bǔ)體滅活的任何可能性(Tani等2003，Journal of Virology 77(18)9799)，要改進(jìn)重組病毒來增加它們對(duì)補(bǔ)體系統(tǒng)的抗性，包括，例如通過將人類衰變-加速因子合并入病毒囊膜中(Huser等，2001，Nature Biotechnology19451).
在另外的實(shí)施方式中，載體是非病毒載體?！胺遣《据d體”指的是除病毒載體之外用于將外源核酸，例如質(zhì)粒引入細(xì)胞的系統(tǒng)。非病毒載體包括，但不限于聚合物類、多肽類和脂類載體。許多非病毒載體是可以商業(yè)獲得的，例如PEI 25K(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)、LipofectamineTM2000(Invitrogen，Carlsbad CA)?？梢愿鶕?jù)商品說明書或通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法，例如Boussif等(1995，Proc.Nat.Acad.Sci.927297)來制備這些載體和和核酸的復(fù)合物.
通常，非病毒的基因遞送系統(tǒng)依靠目標(biāo)核酸的直接遞送或依靠非特異性內(nèi)化方法。非病毒基因遞送系統(tǒng)及其轉(zhuǎn)染方法已經(jīng)被本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，包括，例如，裸露質(zhì)粒、DEAE-葡聚糖、磷酸鈣共沉淀、微注射、脂質(zhì)體-介導(dǎo)轉(zhuǎn)染、陽離子脂類、和聚陽離子聚合物?？梢员槐绢I(lǐng)域技術(shù)人員進(jìn)一步理解的，其中的一些方法，例如微注射、脂質(zhì)體-介導(dǎo)轉(zhuǎn)染、聚陽離子聚合物都可以在體內(nèi)和體外轉(zhuǎn)染細(xì)胞。可以改進(jìn)這些非病毒載體以提高神經(jīng)-特異性轉(zhuǎn)染，例如通過將載體與一種或多種配體相連的方法，該配體特異性地或優(yōu)先與神經(jīng)細(xì)胞結(jié)合。例如，可以通過將破傷風(fēng)毒素的非毒性片段C與聚賴氨酸通過共價(jià)相連實(shí)現(xiàn)聚賴氨酸/DNA復(fù)合物的神經(jīng)-特異性轉(zhuǎn)染。
相對(duì)于真核細(xì)胞而言，含有細(xì)菌序列DNA的非病毒載體通常具有增高了的回文CpG序列，并且這些外來CpG序列在脊椎中可以作為強(qiáng)免疫刺激劑。因此，降低CpG含量是有利的，并且可以提高蛋白質(zhì)表達(dá)，由于CpG序列在真核細(xì)胞宿主中被甲基化后會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄沉默(Chevalier-Mariette等.2003，Genome Biology 4R53)。在一些實(shí)施方式中，非基于病毒DNA載體的DNA中的CpG含量降低。已發(fā)現(xiàn)第一代腺病毒的CMV增強(qiáng)子啟動(dòng)子-增強(qiáng)子內(nèi)的胞嘧啶殘基甲基化，包括CpG位置上的胞嘧啶殘基甲基化，是轉(zhuǎn)基因表達(dá)降低的主要機(jī)理(Brooks等2004，J.Gene Med.6395)。本領(lǐng)域技術(shù)人員易于理解，可以利用常規(guī)生物學(xué)方法，如Chevalier-Mariette等2003，Genome Biology4R53中所描述的寡核苷酸或PCR為基礎(chǔ)的誘變，降低載體中的CpG二核苷酸含量。
在一些實(shí)施方式中，非病毒載體是一種聚乙烯基亞胺/DNA復(fù)合物(PEI/DNA)。聚陽離子PEI體外和體內(nèi)中都具有較高的轉(zhuǎn)染效率(Boussif等.1995，Proc.Nat.Acad.Sci.927297)。優(yōu)選地，PEI/DNA中的DNA是質(zhì)粒DNA。在PEI/DNA復(fù)合物中，PEI氮含量與DNA磷酸含量之比優(yōu)選為6-30，更優(yōu)選是6-20，最優(yōu)選是6-15(Boussif等.1995，Proc.Nat.Acad.Sci.927297)。本領(lǐng)域技術(shù)人員易于制備PEI/DNA，例如，用已有的商業(yè)化方法。一旦進(jìn)入神經(jīng)系統(tǒng)中，PEI就可以介導(dǎo)DNA轉(zhuǎn)染終末分化的非-分裂神經(jīng)元(Boussif等.1995，Proc.Nat.Acad.Sci.927297)。直接腦注射后，PEI/DNA復(fù)合物可以提供的轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平高于HIV-衍生載體獲得的轉(zhuǎn)基因表達(dá)高，并且其與用腺病毒載體所取得的轉(zhuǎn)基因表達(dá)含量在相同的范圍內(nèi)。PEI/DNA復(fù)合物中的PEI具有的平均分子量為800kD，50kD，或更優(yōu)選為25kD(Abdallah等1996，Hum Gene Ther.7(16)1947)?？梢杂闷渌酆衔飳?duì)PEI進(jìn)行共價(jià)修飾，例如使用聚乙二醇來降低PEI/DNA復(fù)合物的細(xì)胞毒性。(Shi等2003，Gene Therapy 10，1179)。
在不同的實(shí)施方式中，所述載體包括與編碼核酸序列可操作連接的啟動(dòng)子。該啟動(dòng)子可以是強(qiáng)病毒啟動(dòng)子，例如CMV或神經(jīng)-特異性啟動(dòng)子?？梢岳眉?xì)胞特異性啟動(dòng)子來獲得所選細(xì)胞類型中的特異性基因表達(dá)。
神經(jīng)元特異性啟動(dòng)子可以是，能活化神經(jīng)元或神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)且基本不活化其他細(xì)胞類型內(nèi)可操作連接的序列的轉(zhuǎn)錄的任一核苷酸序列并。如果那些細(xì)胞類型任一種中可操作連接序列的轉(zhuǎn)錄水平足夠低以至于不會(huì)影響該細(xì)胞的生理功能，那么所述啟動(dòng)子基本不會(huì)活化轉(zhuǎn)錄。
神經(jīng)元特異性啟動(dòng)子包括用于神經(jīng)元基因，如SynapsinI、神經(jīng)元特異性烯醇酶、神經(jīng)絲-L和神經(jīng)肽Y的啟動(dòng)子，以及特異性針對(duì)特定神經(jīng)元細(xì)胞類型的啟動(dòng)子。例如，酪氨酸羥化酶基因啟動(dòng)子(4.8kb 5’UTR)對(duì)兒茶酚胺能神經(jīng)元和CNS神經(jīng)元具有特異性，多巴胺-b-羥化酶基因啟動(dòng)子對(duì)腎上腺素和去腎上腺素神經(jīng)元具有特異性以及L7浦肯雅細(xì)胞蛋白質(zhì)啟動(dòng)子對(duì)視網(wǎng)膜桿體雙極神經(jīng)元具有特異性。這些以及其他的神經(jīng)元特異性啟動(dòng)子包括，D1A多巴胺受體基因啟動(dòng)子、人類次黃嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶啟動(dòng)子、SCG10啟動(dòng)子、Tα1-α微管蛋白啟動(dòng)子、醛縮酶C啟動(dòng)子、β-微管蛋白啟動(dòng)子、GnRH基因增強(qiáng)子和啟動(dòng)子、谷氨酸脫羧酶65基因啟動(dòng)子、β-半乳糖苷α1，2-墨角藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因啟動(dòng)子、神經(jīng)煙堿乙酰膽堿受體β3基因啟動(dòng)子、GABA(A)受體δ亞單元基因啟動(dòng)子、神經(jīng)元特異性FE65基因啟動(dòng)子、N-型鈣通道α1B亞單元基因啟動(dòng)子和微管伴隨蛋白1B基因啟動(dòng)子，參見，Harrington CA，Lewis EJ，Krzemien D，Chikaraishi DM.Identification and cell type specificity of thetyrosine hydroxylase gene promoter.Nucleic Acids Res 1987，152363-2384；Coker GT 3rd，Vinnedge L，O′Malley KL；Characterization of rat and human tyrosine hydroxylase genesfunctional expression of both promoters in neuronal 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神經(jīng)元特異性啟動(dòng)子包括至少一段能活化可操作連接序列的神經(jīng)元細(xì)胞特異性表達(dá)的核苷酸序列，在一些實(shí)施方式中，所述核苷酸序列保留了作為啟動(dòng)子所需的最小的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。在一些實(shí)施方式中，載體包括同一序列的多個(gè)拷貝，或者兩種或多種不同核苷酸序列，其中的每一序列都可以有效的活化轉(zhuǎn)錄活性。對(duì)于所用的不同啟動(dòng)子而言，普通技術(shù)人員利用上述本領(lǐng)域熟知的方法可以知道或辨識(shí)出轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)。
血小板-衍生生長因子β-鏈(PDGFβ)啟動(dòng)子(Sasahara M，F(xiàn)ries JW，Raines EW，Gown AM，Westrum LE，F(xiàn)rosch MP，Bonthron DT，Ross R，Collins T.PDGF[beta]-chain in neurons of the central nervoussystem，posterior pituitary，and in a transgenic model.Cell 1991；64217-227)已經(jīng)顯示了對(duì)于包括多巴胺能神經(jīng)元在內(nèi)的神經(jīng)元細(xì)胞的特異性。在一個(gè)實(shí)施方式中，神經(jīng)元特異性啟動(dòng)子是PDGFβ啟動(dòng)子。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述神經(jīng)元特異性啟動(dòng)子是人類PDGFβ啟動(dòng)子。
例如，啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性可以較弱，提供低于理想水平的治療用基因序列表達(dá)。在不同的實(shí)施方式中，所述啟動(dòng)子可以與增強(qiáng)子子可操作地連接。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，“增強(qiáng)子”是能提高可操作連接啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的任何核苷酸序列，在神經(jīng)元特異性啟動(dòng)子情況下，其能提高神經(jīng)元細(xì)胞中啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性。許多增強(qiáng)子已被大家所熟知，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員也知道如何來篩選新的增強(qiáng)子序列，例如，通過篩選能提高報(bào)道基因轉(zhuǎn)錄的核苷酸序列，例如通過功能圖譜(functional mapping)。
當(dāng)?shù)谝缓怂嵝蛄信c第二核酸序列置于功能連接時(shí)，那么就說所述序列是可操作地連接。例如，如果啟動(dòng)子活化了編碼序列的轉(zhuǎn)錄，那么該編碼序列與該啟動(dòng)子是可操作連接。類似的，當(dāng)增強(qiáng)子增加了可操作連接序列的轉(zhuǎn)錄，那么啟動(dòng)子與增強(qiáng)子就是可操作連接。當(dāng)與啟動(dòng)子分隔開時(shí)增強(qiáng)子仍能發(fā)揮作用，因此，那么所述增強(qiáng)子與所述啟動(dòng)子是可操作連接，即使該增強(qiáng)子與該啟動(dòng)子不相鄰接。
在不同的實(shí)施方式中，增強(qiáng)子可以是一種異源增強(qiáng)子，即是天然狀態(tài)下不與啟動(dòng)子相連的核苷酸序列，但一旦可操作連接后，則能提高啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性。提高可操作連接序列的轉(zhuǎn)錄水平指的是，相對(duì)于只是啟動(dòng)子時(shí)所觀察到的轉(zhuǎn)錄水平而言，可操作連接序列轉(zhuǎn)錄水平的可測增加，這可以用常規(guī)轉(zhuǎn)錄試驗(yàn)來測量，包括使用報(bào)道基因構(gòu)建體。
所述增強(qiáng)子可以是已知的強(qiáng)病毒增強(qiáng)子元件，如勞氏肉瘤病毒(RSV)啟動(dòng)子(Gorman等1982.Proc.Nat.Acad.Sci.796777-6781)，SV40啟動(dòng)子(Ghosh等1981.Proc.Nat.Acad.Sci.78100)，CMV啟動(dòng)子或包括CMV即時(shí)早期(IE)基因增強(qiáng)子(CMVIE增強(qiáng)子)的啟動(dòng)子(Boshart等1985(細(xì)胞)41521；Niwa等，1991，Gene 108193；參見美國專利5849522和5168062)。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，CMV增強(qiáng)子可操作地連接于PDGFβ啟動(dòng)子的上游。在另一個(gè)的實(shí)施方式中，CMV增強(qiáng)子可操作連接于PDGFβ啟動(dòng)子的上游并且這兩個(gè)序列是相接觸的。在另外的實(shí)施方式中，CMV增強(qiáng)子與CMV啟動(dòng)子可操作連接(CMVE/P)。
與增強(qiáng)子可操作連接的神經(jīng)元特異性啟動(dòng)子的其他實(shí)例包括等位基因變體以及已知啟動(dòng)子和增強(qiáng)子序列的衍生物，描述見美國申請(qǐng)10/407009。
在不同的實(shí)施方式中，此類變體和衍生物基本上是同源性的，因此在溫和或嚴(yán)格條件下它們能與已知增強(qiáng)子和啟動(dòng)子序列雜交。在中度嚴(yán)格條件下與濾膜-結(jié)合序列進(jìn)行雜交，條件可以是，例如，0.5MNaHPO4、7％十二烷基硫酸鈉(SDS)、1mMEDTA在65℃下進(jìn)行操作，在42℃在0.2×SSC/0.1％SDS中洗滌(參見Ausubel，et al.(eds)，1989，CurrentProtocols in Molecular Biology，Vol.1，Green Publishing Associates，Inc.，and John Wiley & Sons，Inc.，New York，at p.2.10.3)。可替代地，可以與濾膜-結(jié)合序列在嚴(yán)格條件下進(jìn)行雜交，條件可以是，例如，0.5MNaHPO4、7％SDS、1mMEDTA在65℃下進(jìn)行操作，在68℃在0.1×SSC/0.1％SDS中洗滌(參見Ausubel等(編著)，1989，如前所述)?？梢愿鶕?jù)目的序列在已知方法基礎(chǔ)上來改進(jìn)雜交條件(參見Tijssen，1993，Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes，Part I，Chapter 2″Overviewof principles of hybridization and the strategy of nucleic acidprobe assays″，Elsevier，New York)。通常，所選擇的嚴(yán)格條件大約比特定序列在特定離子強(qiáng)度和pH值條件下的解鏈溫度低約5℃。嚴(yán)格雜交，例如是42℃下在5×SSC和50％甲酰胺中進(jìn)行，然后在65℃下用0.1×SSC洗滌緩沖液進(jìn)行洗滌。嚴(yán)格雜交的洗滌可以是，例如至少15分鐘、30分鐘、45分鐘、60分鐘、75分鐘、90分鐘、105分鐘或120分鐘。
當(dāng)序列最佳對(duì)齊時(shí)，序列間的同源程度用同一性百分比來表示，即序列間準(zhǔn)確匹配的發(fā)生率?？梢岳枚喾N算法來實(shí)現(xiàn)進(jìn)行同一性比較序列的最佳對(duì)齊，例如運(yùn)用Smith和Waterman的局部同源性算法，1981，Adv.Apple.Math 2482，Needleman和Wunsch的同源對(duì)齊算法，1970，J.Mol.Biol.48443，Pearson和Lipman的相似性搜索方法，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.美國852444，和這些算法的計(jì)算機(jī)化應(yīng)用(如Wisconsin Genetics軟件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，GeneticsComputer Group，Madison，WI，U.S.A.)。另外還可以使用BLAST算法進(jìn)行序列對(duì)齊，描述見Altschul等1990，J.Mol.Biol.215403-10(利用已發(fā)表的缺省設(shè)置)。用于運(yùn)行BLAST分析的軟件可以從國家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information)獲得(通過網(wǎng)址http//www.ncbi.nlm.nih.gov)。在不同的實(shí)施方式中，變體和衍生物具有利用此類算法所確定的至少50％，至少80％、至少90％或至少95％的同一性。
在不同的實(shí)施方式中，載體包括一種編碼標(biāo)志蛋白質(zhì)的基因，該蛋白質(zhì)的表達(dá)及細(xì)胞或亞細(xì)胞定位易于測定。“標(biāo)志蛋白質(zhì)”指的是其存在或亞細(xì)胞定位易于測定的蛋白質(zhì)，如綠色熒光蛋白質(zhì)(GFP)或其任一增強(qiáng)衍生物。其他的標(biāo)志蛋白質(zhì)已為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知。在不同的實(shí)施方式中，所述基因可以編碼其表達(dá)通過下述方式易于測定的酶提供特異性底物，然后檢測酶促反轉(zhuǎn)產(chǎn)物，例如向含有熒光素酶的細(xì)胞或細(xì)胞裂解物提供熒光素。在另外的實(shí)施方式中，所述標(biāo)志蛋白質(zhì)可以是任何可用免疫學(xué)方法測定其表達(dá)的蛋白質(zhì)，例如通過提供可特異性識(shí)別該標(biāo)志蛋白質(zhì)的標(biāo)記抗體。該抗體優(yōu)選是單克隆抗體，并且根據(jù)本領(lǐng)域熟知方法對(duì)其進(jìn)行直接或間接的標(biāo)記，例如用熒光顏料進(jìn)行標(biāo)記并通過熒光顯微法檢測蛋白質(zhì)表達(dá)。其他的免疫學(xué)檢測方法也已為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，包括但不限于，免疫金染色法、同位素標(biāo)記法、比色酶促沉淀法。
優(yōu)選地，所述核酸載體包含治療用基因或治療用轉(zhuǎn)基因，其表達(dá)可以產(chǎn)生治療用產(chǎn)物。術(shù)語“基因”是根據(jù)其通常定義來使用的，即核酸序列的可操作連接群。在此所用的“治療用產(chǎn)物”是指能實(shí)現(xiàn)預(yù)期結(jié)果的任何產(chǎn)品，例如，疾病的治療、預(yù)防或改善。治療用產(chǎn)物可以是治療用蛋白質(zhì)、治療用肽或治療用RNA，如小干擾RNA(siRNA)或反義RNA。
在一些實(shí)施方式中，治療用產(chǎn)物是神經(jīng)營養(yǎng)因子，例如神經(jīng)生長因子。在此所用的“神經(jīng)生長因子”指的是任何能促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞生長和/或神經(jīng)再生的因子，例如神經(jīng)營養(yǎng)蛋白、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白受體和神經(jīng)營養(yǎng)因子?！吧窠?jīng)營養(yǎng)蛋白”指的是能支持神經(jīng)存活和/或神經(jīng)再生的蛋白質(zhì)家族。神經(jīng)營養(yǎng)蛋白包括，例如，神經(jīng)生長因子(NGF)、腦-源神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)，神經(jīng)營養(yǎng)蛋白3(NT-3)、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白4/5(NT-4/5)以及神經(jīng)營養(yǎng)蛋白的變體?！白凅w”是指具有下列特征的蛋白質(zhì)由于一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代、添加或缺失，其序列與自然存在的蛋白質(zhì)序列不同，但保留了自然存在蛋白質(zhì)的一些生物活性。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，變體與自然存在蛋白具有約60％、70％、80％，優(yōu)選90％、或更優(yōu)選高于90％的同源性。在具體實(shí)施方案中，所述治療用產(chǎn)物是NGF。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述載體包含與CMVE/P可操作連接的編碼NGF的基因。
“神經(jīng)營養(yǎng)蛋白受體”指的是能與神經(jīng)營養(yǎng)蛋白結(jié)合的蛋白質(zhì)。神經(jīng)營養(yǎng)蛋白受體包括，例如，低親和力的p75受體和高親和力的受體，例如trkA、trkB、和trkC及其變體?！吧窠?jīng)營養(yǎng)因子”包括，例如睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)、海馬-衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(HDNF)、白血病抑制因子(LIF)(Yamamori等1989，Science 2461412)、酸性和堿性成纖維細(xì)胞生長因子(aFGF，bFGF)及其變體。
“神經(jīng)營養(yǎng)因子”還包括具有下列特性的其他因子能在體外和/或體內(nèi)促進(jìn)神經(jīng)突外生的其他因子，保證軸突再生的其它因子，或發(fā)揮作用對(duì)抗慢性軸索顯微外科術(shù)(chronic axotomy)給抗軸突再生帶來副作用的其他因子，例如，親免疫素配體FK506(Lee等2000，Muscle Nerve23633)及其變體。
在其他的實(shí)施方式中，所述治療用產(chǎn)物是一種抗-凋亡因子，例如bcl-2或bcl-XL。對(duì)成人而言，外周神經(jīng)損害后DRG中會(huì)有20-40％的細(xì)胞損失，這與凋亡很相似(Terenghi 1999，J.Anat.1941)。并不限于任何特別的理論，認(rèn)為將抗凋亡的蛋白質(zhì)遞送到DRG中的神經(jīng)元細(xì)胞中可以減少或防止這種細(xì)胞損失。
制備重組載體的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知，例如，下列文獻(xiàn)中描述的方法，Sambrook等《分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(第三版)Cold SpringHarbour Laboratory出版社(2001)和其他的一些實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，以及商品說明書中描述的方法。
為了有助于施用，可以將載體配制成藥物組合物中的一種成分。所述組合物通常含有藥用可接受濃度的鹽、緩沖試劑、防腐劑和各種可兼容的載體或稀釋劑。對(duì)于所有形式的遞送，載體都可以配制在生理鹽溶液中。
藥用可接受稀釋劑的比例和同一性可以根據(jù)選擇的施用途徑、與載體的相容性和常規(guī)藥物試驗(yàn)來確定。通常，所述藥物組合物用不會(huì)顯著損害載體生物學(xué)活性的成分配制。適宜的載體和稀釋劑的描述見，例如，Remington′s Pharmaceutical Sciences(Remington′s PharmaceuticalSciences，Mack Publishing Company，Easton，Pa.，USA 1985)。
可以用生理學(xué)適宜的緩沖液制備載體溶液。在常規(guī)儲(chǔ)藏和使用條件下，這些制劑中含有能防止微生物增長但不會(huì)使載體失活的防腐劑。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道怎樣制備適宜的制劑。用于選擇和制備適宜的制劑的常規(guī)步驟和成分的描述見，例如，Remington′s Pharmaceutical Sciences and inThe United States PharmacopeiaThe National Formulary(USP 24NF19)，1999年出版。
在一些實(shí)施方式中，載體被施用到脊椎動(dòng)物宿主。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，載體被施用到人類宿主。
在一些外周神經(jīng)病類型中，DRG被認(rèn)為是早期且重要的目標(biāo)，這些外周神經(jīng)病包括糖尿病神經(jīng)病，最常見的外周神經(jīng)病(Kishi等2002，Diabetes51819；England & Asbury，2004 Lancet 3632151)。糖尿病神經(jīng)患者者顯示了廣泛的感覺和植物性神經(jīng)癥狀但是沒有明顯的運(yùn)動(dòng)失調(diào)。人類和實(shí)驗(yàn)糖尿病神經(jīng)病的病理學(xué)研究證明了在DRG中具有細(xì)胞損失，這可能是因可見的mylenated纖維損失和軸突萎縮導(dǎo)致的。DRG中的神經(jīng)元還直接參與因物理外傷、壓力或橫切所引起的外周神經(jīng)損傷的病理生理過程。外周神經(jīng)斷裂還會(huì)引發(fā)受影響DRG中存活神經(jīng)元的核周體中神經(jīng)肽、細(xì)胞質(zhì)和轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的生物化學(xué)改變，及導(dǎo)致近端神經(jīng)殘端的萎縮(Stoll &Muller 1999，Brain Pathol.9(2)313)。這些病理變化必定會(huì)干擾感覺信號(hào)從身體部分例如皮膚、肌肉和內(nèi)臟的向CNS的傳遞。結(jié)果，身體的某些部分會(huì)功能異?；蚋緹o功能。
在DRG中，治療用基因的表達(dá)，特別是那些編碼神經(jīng)營養(yǎng)蛋白的基因的表達(dá)能阻止實(shí)驗(yàn)性神經(jīng)病中的神經(jīng)變性(Glorioso等2003，Curr OpinMol Ther.5483)。然而，將基因轉(zhuǎn)移到DRG還是充滿了挑戰(zhàn)，原因在于基因的解剖特性。在先前的研究中，通過將病毒載體，主要是單純皰疹病毒(HSV)肌肉注射或皮下注射來實(shí)現(xiàn)所述轉(zhuǎn)移，所述病毒載體被神經(jīng)末端吸收，然后在軸質(zhì)中被運(yùn)輸?shù)紻RG的神經(jīng)元的質(zhì)體中(Haase等1998，J.Neurol Sci.160 Suppl.；Jacksondeng 2003，Virology 31445；Goss等2001，Gene Therapy 8551)。盡管有效，但是該方法依賴于包括神經(jīng)末端內(nèi)吞作用和軸突逆行傳導(dǎo)的功能性細(xì)胞機(jī)理，而這些機(jī)理在外周神經(jīng)病條件下已經(jīng)被破壞了。
在另一種不依賴神經(jīng)末端內(nèi)吞作用和軸突逆行傳導(dǎo)的方法中，Glatzel等(2000，Proc.Nat.Acad.Sci 97442)和Xu等(2003，Biomaterials242405)最近使用顯微神經(jīng)外科技術(shù)將基因轉(zhuǎn)移載體直接注射入到DRG中，獲得沿感覺神經(jīng)通道的報(bào)道基因強(qiáng)表達(dá)。這種注射方法需要移去一片脊椎以獲得進(jìn)入DRG的通道。此外對(duì)DRG組織也是侵入性的，并且當(dāng)需要重復(fù)注射時(shí)如慢性病癥的長期治療中，其也不可行的。
因此根據(jù)本發(fā)明，將含編碼治療產(chǎn)物的基因的載體最小侵入程度地遞送到背根神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)元細(xì)胞體，有利于治療外周神經(jīng)病，促進(jìn)受損外周神經(jīng)的生長和/或再生?！巴庵苌窠?jīng)病”，正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，指的是伴有或無明顯運(yùn)動(dòng)失調(diào)的外周神經(jīng)元細(xì)胞或其功能的損失。因此此類細(xì)胞是受外周神經(jīng)病影響的目標(biāo)細(xì)胞，可以通過細(xì)胞內(nèi)治療用基因的表達(dá)來治療。外周神經(jīng)病是疾病或病癥或全身性疾病所導(dǎo)致的。許多神經(jīng)病的病因已經(jīng)很清楚，例如，糖尿病、尿毒癥、AIDS、萊姆疾病或營養(yǎng)不良。外周神經(jīng)病的其他病因包括機(jī)械壓力例如壓緊或擠壓、直接外傷、穿透損傷、挫傷、骨折或骨脫臼；作用表面神經(jīng)的壓力、神經(jīng)內(nèi)出血；暴露在寒冷或輻射中或，很少見，某些藥物或有毒物質(zhì)；和血管或膠原蛋白病癥，例如，動(dòng)脈硬化癥、系統(tǒng)紅斑狼瘡、硬皮病、肉狀瘤病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多動(dòng)脈神經(jīng)炎。雖然外周神經(jīng)病的病因是多樣的，但是他們通常產(chǎn)生共同的癥狀，包括胳膊、手、腿和/或腳的虛弱、麻木、感覺異常(不正常的感覺例如灼熱、撓癢、刺痛感或發(fā)麻)和疼痛。大量病例的病因不明。
優(yōu)選通過鞘內(nèi)注射來施用載體，所注射的量足以取得所需的效果，例如，在目標(biāo)細(xì)胞中具有有效量的治療用基因表達(dá)。
在一些實(shí)施方式中，可以通過腰椎穿刺來施用載體。腰椎穿刺是相對(duì)常規(guī)并且沒有創(chuàng)傷的臨床步驟，其對(duì)脊髓的危害極小。通常，用與注射器或微注射器相連的窄針頭例如，26號(hào)針頭將含載體的溶液施用入腦脊液。對(duì)于大鼠而言，針頭的適宜鞘內(nèi)位置可以通過輕微尾部運(yùn)動(dòng)來確證，這表明是進(jìn)入到蛛網(wǎng)膜下空間的適宜注射。在注射后，針頭在鞘內(nèi)空間內(nèi)保持一段時(shí)間，例如2分鐘后再移去。
可以重復(fù)給予有效量的載體，這取決于初始治療方案的效果。通常周期性地施用，同時(shí)監(jiān)視任何反應(yīng)。根據(jù)所選定的施用計(jì)劃和程序，本領(lǐng)域技術(shù)人員知道應(yīng)給出的較低或較高劑量。
例如，當(dāng)載體被施用到人類患者時(shí)，載體以有效的劑量并保持足夠的時(shí)間來被施用以獲得所需的效果。例如，載體以所需的量和劑量被施用以遞送治療用基因，該基因產(chǎn)物的功能在于減緩、改進(jìn)、調(diào)節(jié)、改善、穩(wěn)定、防止擴(kuò)散、減慢或延遲外周神經(jīng)病的病程或治愈外周神經(jīng)病。
被施用到患者的有效量可以改變，這取決于很多因素，例如，治療用基因產(chǎn)品的藥物動(dòng)力學(xué)特性、施用模式、受試者的年齡、健康狀況和體重，病癥或病態(tài)的特性以及程度，治療的頻率以及如果有，共同治療的類型。在使用病毒載體的實(shí)施方式中，所述有效量還取決于病毒的毒力和滴度。
基于上述因素，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定出適宜用量。在最初載體可以適宜量被施用，其可以根據(jù)需要進(jìn)行調(diào)整，這取決于患者的臨床反應(yīng)?？梢愿鶕?jù)經(jīng)驗(yàn)確定載體有效量，這取決于該載體可以被安全施用的最大量。在一些實(shí)施方式中，載體對(duì)脊椎動(dòng)物幾乎沒有細(xì)胞毒性，因而可以大量施用。然而，被施用的載體量應(yīng)該是能產(chǎn)生所需效果的最小量。
在不同的實(shí)施方式中，大約109用量的重組桿狀病毒顆粒被施用到人類患者中。在其他的實(shí)施方式中，約102-約109的重組桿狀病毒顆粒、約106-約109的重組桿狀病毒顆粒、約102-約107的重組桿狀病毒顆粒、約103-約106的重組桿狀病毒顆粒、約104-約105的重組桿狀病毒顆粒以單一劑量被施用。在一些實(shí)施方式中，載體可以被施用超過一次，例如，通過重復(fù)注射。在其他實(shí)施方式中，通過一個(gè)與含有載體組合物的儲(chǔ)液囊相連的鞘內(nèi)導(dǎo)管將病毒載體重復(fù)施用，描述見Jackson等2001，Human GeneTherapy 121827。
在其他實(shí)施方式中，將含有約4μg DNA的非病毒載體以單一劑量的方式施用到宿主中。非病毒載體僅瞬時(shí)表達(dá)一次性轉(zhuǎn)染入靶細(xì)胞的治療用基因，效果不及最優(yōu)轉(zhuǎn)基因表達(dá)。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，通過一個(gè)與含有載體組合物的儲(chǔ)液囊相連的鞘內(nèi)導(dǎo)管，將病毒載體重復(fù)施用，描述見Jackson等2001，Human Gene Therapy 121827。
對(duì)已斷裂的外周神經(jīng)最好按照下述進(jìn)行治療。將編碼治療用基因產(chǎn)物的載體，例如NGF等神經(jīng)生長因子，鞘內(nèi)施用到宿主DRG的神經(jīng)元細(xì)胞中，該宿主的斷裂的近端和遠(yuǎn)端神經(jīng)殘端被固定在神經(jīng)導(dǎo)管中。載體被施用入背根神經(jīng)節(jié)周圍的腦脊液中，從而將所述核酸遞送到已切斷神經(jīng)的細(xì)胞體中。例如，如果是坐骨神經(jīng)斷裂，可以通過腰部注射的方式將載體鞘內(nèi)注射到L4和L5脊椎間脊內(nèi)空間內(nèi)的腦脊液中。
本申請(qǐng)所述的“神經(jīng)導(dǎo)管”也被稱為“神經(jīng)導(dǎo)向通道”或簡單稱為“神經(jīng)導(dǎo)向”，其指的是一種具有通過一個(gè)內(nèi)在通道連接的第一和第二開口末端的裝置，其中管內(nèi)徑足夠大因而能在兩端接受切割。神經(jīng)導(dǎo)管可用于引導(dǎo)近端神經(jīng)末端的軸突芽生，為受損神經(jīng)末端分泌的生長因子的擴(kuò)散提供通道，以及減少疤痕組織的滲透(schmidt等2003，Annu Rev BiomedEng5293)。正如本領(lǐng)域所熟知的，神經(jīng)導(dǎo)管可以來自生物材料，例如細(xì)胞外基質(zhì)蛋白、例如膠原蛋白(US50190987)、層粘連蛋白、纖連蛋白、纖維蛋白/纖維蛋白原、透明質(zhì)酸類物質(zhì)或來自如硅膠、泡沫聚(四氟乙烯)。此外，合成神經(jīng)導(dǎo)管還可以由生物可吸收或生物可降解物質(zhì)制備而得，例如，聚(乳酸)(PLA)、聚(羥基乙酸)(PLG)、乳酸羥基乙酸共聚體(PLGA)、聚(己內(nèi)酯)、聚(氨酯)、聚(寡)膦嗪、聚(3-羥基丁酸酯)和異丁烯酸酯類水凝膠。(參見Schmidt&Leach和本申請(qǐng)中的參考文獻(xiàn))。神經(jīng)導(dǎo)管可以是不通透、通透或半通透性的，其可以引入神經(jīng)元載體細(xì)胞、例如施沃恩細(xì)胞，其還可具有導(dǎo)向神經(jīng)基底，以及其還可以有一個(gè)或多個(gè)腔內(nèi)通道(Hudson等1999，Clin Plast Surg26617)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉如何將已斷裂的神經(jīng)固定到神經(jīng)導(dǎo)管中，例如按照Schmidt等2003，Annu Rev Biomed Eng 293。通常，通過例如9-0或10-0縫合將切斷裂外周神經(jīng)的近端和遠(yuǎn)端殘端固定在神經(jīng)導(dǎo)管的內(nèi)通道內(nèi)。優(yōu)選地，神經(jīng)導(dǎo)管內(nèi)通道充滿了溶液、懸浮液或軸突生長凝膠支持物。
在正常情況下，NGF呈現(xiàn)出非常低的濃度，但是在動(dòng)物模型神經(jīng)損傷處快速升高。切割時(shí)，NCF主要由損傷神經(jīng)遠(yuǎn)殘端的目標(biāo)組織和施沃恩細(xì)胞產(chǎn)生，然后被逆向運(yùn)輸入神經(jīng)細(xì)胞體內(nèi)。背根神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)元細(xì)胞體內(nèi)的NGF外源表達(dá)可以被逆行傳輸而遞送的NGF補(bǔ)充或取代。并不限于任何特殊的理論，NGF的外源表達(dá)會(huì)促進(jìn)神經(jīng)營養(yǎng)因子的順行傳輸?shù)揭褦嗔焉窠?jīng)的近端殘端，并且這些因子會(huì)通過神經(jīng)導(dǎo)管擴(kuò)散并在導(dǎo)管內(nèi)促進(jìn)神經(jīng)的再生。
正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，可以在神經(jīng)殘端被固定在導(dǎo)管之前完成載體的施用，或更優(yōu)選是在其之后。本領(lǐng)域技術(shù)人員易于確定有效促進(jìn)宿主外周神經(jīng)再生的載體施用時(shí)間。
在此列出的所有文獻(xiàn)都全部引入以作參考。
雖然在此公開了本發(fā)明的不同實(shí)施方式，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員用普通知識(shí)作出的適應(yīng)和改進(jìn)在本發(fā)明的范圍內(nèi)。此類改進(jìn)包括用于本發(fā)明任一方面的已知等效物的替代以基本相同的方式取得相同的結(jié)果。在此所用的所有方法和科技術(shù)語與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員普通理解的意思相同，另有定義的除外。
本申請(qǐng)中所用的詞語“包含”是開放式詞語，基本等同于詞語“包括，但不限于”。本申請(qǐng)中的單數(shù)詞“一個(gè)”和“所述”指的都是單數(shù)和復(fù)數(shù)，在本文中另有說明的除外。
下列實(shí)施例是為了說明本發(fā)明的各個(gè)方面，而決不對(duì)本申請(qǐng)公開的眾多方面構(gòu)成陷制。
實(shí)施例原料和方法基因遞送載體在此測試了三種非-病毒基因遞送系統(tǒng)，聚乙烯氨(PEI)/質(zhì)粒DNA復(fù)合物、lipofectamineTM2000/DNA復(fù)合物和肽系統(tǒng)，以及兩種病毒載體，重組桿狀病毒和2型腺伴隨病毒(AAV-2)。
為了制備PEI/DNA復(fù)合物，將質(zhì)粒DNA pCMV E/P-luc(Liu等，2004，Gene Ther.1152)或pcDNA3.1/NCF與PEI(25kDa；Sigma-Aldrich，SanDiego，CA)通過下述方式在5％葡萄糖溶液中進(jìn)行混合將適量的PEI溶液添加到DNA溶液中，通過渦旋方式簡單混合，然后在室溫下靜置30分鐘。通過將來自鼠腦cDNA文庫的全長DNA片段插入經(jīng)EcoR1消化后的pcDNA3中，構(gòu)建得到pcDNA3.1/NGF。用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的PEI與DNA之比分別是每當(dāng)量DNA磷對(duì)10和14當(dāng)量的PEI氮。在一些實(shí)驗(yàn)中，在PEI與DNA混合前，用羰花青染料Cy3(Amersham、烏普薩拉市、瑞典)對(duì)PEI進(jìn)行了標(biāo)記。考慮1μgDNA含有3nmol的磷來計(jì)算所需質(zhì)粒的量。為了制備lipofectamineTM2000/DNA復(fù)合物，將pCMV E/P-luc與lipofectamineTM2000/(Invitrogen，新加坡)通過下述方式在5％葡萄糖溶液中進(jìn)行混合將適量的lipofectamineTM2000添加到經(jīng)稀釋的DNA溶液中，通過渦旋方式簡單混合，然后在室溫下孵育20分鐘。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中的DNA(μg)與lipofectamineTM2000(μl)之比為1-3。
為了制備肽基因遞送系統(tǒng)，使用肽NL4-10K和PEI600。所述肽含有來自NGF的含環(huán)4區(qū)域的29-氨基酸片段(aa80-108)，該片段與作為DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的10-賴氨酸連接(Zeng等，J Gene Medicine，2004，出版中)。首先將DNA與PEI600以氮/磷比為5的比例進(jìn)行第一次復(fù)合，然后以肽/DNA(nmol/g)為1.5的比例加入肽。
根據(jù)Bac-To-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)手冊(cè)(Gibco BRL，LifeTechnologies，USA)來構(gòu)建重組桿狀病毒載體。人類CMV E/P啟動(dòng)子或CMV E/PDGF啟動(dòng)子調(diào)控下的熒光素酶DNA來自Liu等所構(gòu)建的載體(《基因治療》，2004，1152)。將啟動(dòng)子插入pFastBacl的NotI和XbaI位點(diǎn)之間，熒光素酶cDNA在啟動(dòng)子下游的XhoI和HindIII之間。在Sf9昆蟲細(xì)胞內(nèi)增殖重組桿狀病毒。將來自昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基的芽生(budded)病毒用0.2μm孔徑的濾膜過濾，并以25000g超離60分鐘進(jìn)行濃縮。對(duì)于吸收試驗(yàn)而言，根據(jù)供應(yīng)商提供的手冊(cè)(Amersham、Uppsala，Sweden)用羰花青染料Cy3對(duì)PEI進(jìn)行了標(biāo)記。通過下述方式構(gòu)建了重組AAV-2載體將來自pCMV E/P載體的CMV E/P啟動(dòng)子或來自pCMV E/PDGF載體的CMVE/PDGF啟動(dòng)子亞克隆入側(cè)連ITR序列的經(jīng)修飾的pAAV質(zhì)粒。這種pAAV質(zhì)粒名為pAAV-MCS-luc，是通過用多重克隆點(diǎn)(MCS)-熒光素酶-聚A表達(dá)框取代質(zhì)粒pAAV-MCS(Strtagen，La Jolla，CA)上兩個(gè)NotI位點(diǎn)之間的原始序列構(gòu)建得到的。該表達(dá)框從pGL3-為基礎(chǔ)的質(zhì)粒(Promega，美國)PCR擴(kuò)增得到的，使用正向引物，5-ATTGCGCCCGCGGTACCGAG(SEQ IDNO1)和反向引物，5-ATTGCGCCCGCTTATCGATTTTACCACATTTG(SEQ ID NO2)。將啟動(dòng)子插入pAAV-MCS-luc中的KpnI和Hind III位點(diǎn)之間。使用該質(zhì)粒與AAV-2包裝質(zhì)粒pAAV-RC及腺病毒輔助質(zhì)粒pHelper(Stratagen，La Jolla，加拿大)一起轉(zhuǎn)染HEK293(人胚胎腎)細(xì)胞。通過兩輪的冷凍/解凍循環(huán)將包裝入轉(zhuǎn)染后HEK293細(xì)胞中的AAV-2載體從被收集細(xì)胞中釋放出來，然后用一步重力-流(gravity-flow)肝素親合柱對(duì)其進(jìn)行了純化。
動(dòng)物與操作整個(gè)試驗(yàn)中使用了成年雄性Wistar大鼠，重量為250-320g，由新加坡國立大學(xué)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。使用了50只大鼠來進(jìn)行熒光素酶活性化驗(yàn)，其中30只大鼠用于時(shí)程研究(每個(gè)時(shí)間間隔5只)，PEI、lipofectamineTM2000、AAV和桿狀病毒載體試驗(yàn)各使用了5只。免疫組化試驗(yàn)使用了12只大鼠，其中的6只為假操作組，另6只為實(shí)驗(yàn)組。使用了12只大鼠來進(jìn)行PCR分析，其中的6只在假操作組而6只在實(shí)驗(yàn)組。在注射后的不同時(shí)間，隨機(jī)將大鼠分配到每個(gè)組中。將大鼠每籠放4只在恒溫22℃和60％濕度下經(jīng)過一個(gè)白天-黑夜循環(huán)(12h/12h)內(nèi)，并用常規(guī)實(shí)驗(yàn)鼠糧進(jìn)行喂養(yǎng)。所有動(dòng)物的處理和飼養(yǎng)均按照，由國際衛(wèi)生組織制定的且被新加坡國立大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心采用的國際試驗(yàn)動(dòng)物指導(dǎo)手冊(cè)(International Guiding Principles)(1985)。
對(duì)于鞘內(nèi)注射來說，通過腹膜內(nèi)注射戊巴比妥鈉來麻醉大鼠(60mg/60kg體重)。將大鼠的后背皮膚切開暴露脊柱。選擇第4和5腰椎(L4-5)之間的脊柱內(nèi)空間作為注射位置。一個(gè)與26號(hào)針頭相連的10μl微注射器用來進(jìn)行注射。鼠尾的輕微運(yùn)動(dòng)表明了正確注射進(jìn)了蛛網(wǎng)膜下空間。每次注射使用4μg質(zhì)粒DNA與1×108AAV-2顆?；?×107桿狀病毒顆粒的復(fù)合物20μl。2-5分鐘的緩慢施用之后，針頭被移出前在原處停留2分鐘。注射后用手術(shù)夾閉合皮膚。
為了制備神經(jīng)損傷和再生的鼠模型(Xu等2003，Biomate[eta]als 242504)，通過2厘米長的皮膚切口來暴露被麻醉鼠的右坐骨神經(jīng)。在去除7mm的一段神經(jīng)后，接著將近端和遠(yuǎn)端神經(jīng)殘端拔入硅膠神經(jīng)導(dǎo)管的每端開口內(nèi)2mm(NGC，TygonID0.05英寸，OD0.09英寸，長1.4厘米)，并留有10mm的殘端間隙。在近端殘端被拔入管開口端前，將25微升的鹽水填充到管內(nèi)。用單根10/0神經(jīng)束膜縫合線(Ethilon)將兩個(gè)殘端固定到管內(nèi)。在NGC植入后，立即將含4μg pcDNA/NGF的PEI復(fù)合物20μl鞘內(nèi)注射入L4和L5脊柱的脊內(nèi)空間，對(duì)照大鼠注射PEI/pcDNA3/luc復(fù)合物。在該實(shí)驗(yàn)中使用了30只大鼠，其中15只注射了PEI/pcDNA3.1/NGF復(fù)合物，另外15只作為對(duì)照。
報(bào)道基因檢測進(jìn)行了PCR擴(kuò)增以檢測DRG中運(yùn)輸?shù)膱?bào)道基因。在腰部鞘內(nèi)注射PEI/DNA復(fù)合物或桿狀病毒載體后2天，深度麻醉后用0.1MPBS(pH7.4)進(jìn)行心臟內(nèi)灌注使大鼠致死，并在注射位置收集了三對(duì)成對(duì)DRG(腰椎L4至L6)。用刀片進(jìn)行切碎使得組織均質(zhì)化，然后按照Dneasy Tissue試劑盒(Qiagen，Hilden，德國)常規(guī)方法提取DNA。根據(jù)熒光酶素基因序列設(shè)計(jì)了用于PCR的寡核苷酸引物，序列如下所示5’引物，5’-AT TGC TCAACA GTA TGG GCA-3’(SEQ ID NO3)))))))))))，3’引物5’-CGA AGA AGGAGA ATA GGG TTG-3’(SEQ ID NO4)。擴(kuò)增產(chǎn)物的預(yù)期大小是540bp。擴(kuò)增循環(huán)為94℃5分鐘，1循環(huán)；94℃，45秒，55℃30秒，72℃30秒，35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7分鐘。為了排除整個(gè)過程中的污染，對(duì)取自假操作大鼠的樣本進(jìn)行平行操作。
用熒光素酶活性試驗(yàn)來檢驗(yàn)熒光素酶報(bào)道基因的表達(dá)。大鼠在深度麻醉后用0.1MPBS(pH7.4)進(jìn)行心臟內(nèi)灌注而使大鼠致死。在注射位置周圍收集了六對(duì)成對(duì)DRG并在-80℃下保存至進(jìn)行操作。加入PBS緩沖液后(100μlPBS/50mg組織)，每份樣本都在冰上用超聲波均質(zhì)化10秒鐘，接著4℃下在微離心器中以13000rpm進(jìn)行離心。使用10毫升上清液室溫下進(jìn)行熒光素酶活性試驗(yàn)，使用購自Promega(Madison，WI，美國)的試驗(yàn)試劑盒。使用單-孔光度計(jì)(Berthold Lumat LB9501)測量10秒鐘。用組織提取物的總蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)化RLU，用蛋白質(zhì)試驗(yàn)試劑盒(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)進(jìn)行測量。
對(duì)于免疫染色，注射后2天殺死大鼠。在深度麻醉后，首先用格氏溶液，接著用含2％多聚甲醛的0.1MPBS(pH7.4)灌注大鼠。灌注后，取出3對(duì)成對(duì)DRG(L4至L6)，用相同的固定液后-固定(post-fixed)2-4個(gè)小時(shí)后轉(zhuǎn)移到含15％蔗糖的0.1M PBS中。切出30μm厚的冷凍切片，然后封裝(mount)于在包被后的載片上。該切片在0.1M PBS中洗滌20分鐘，該P(yáng)BS的pH為7.4，其中含有0.2％Triton X-100，接著用含5％正常山羊血清的PBS封閉1小時(shí)。然后用抗-熒光素酶多克隆一抗(Promega；1∶150稀釋)和抗神經(jīng)特異性核蛋白單克隆抗體(ChemiconInternational，美國；1∶500稀釋)孵育切片過夜。在0.1M的PBS中洗滌該切片，然后用抗-兔IgG Fitc偶聯(lián)物(Sigma-Aldrich公司，美國；1∶100稀釋)和抗-小鼠IgG Fitc偶聯(lián)物(Sigma-Aldrich公司，美國；1∶100稀釋)再孵育1小時(shí)。在孵育后，在PBS中洗滌三次該切片，用DAKO熒光素酶固定介質(zhì)固定，用蓋玻片覆蓋。對(duì)照切片沒有用一抗孵育。用Olympus 500共焦激光掃描顯微鏡對(duì)切片進(jìn)行檢測。每個(gè)切片先用488nm激光線(laser line)和發(fā)射濾光器(emission filter)BP510-525掃描以檢測Fitc熒光素；然后用543nm激光線和發(fā)射濾光器LP570來檢測Tritc熒光素。
NGF試驗(yàn)使用Cos7細(xì)胞進(jìn)行體外轉(zhuǎn)染，檢驗(yàn)質(zhì)粒pcDNA3.1/NGF的基因表達(dá)。將培養(yǎng)物細(xì)胞種植在60-70％融合的6-孔平板。過夜孵育后，用OptiMEM替換培養(yǎng)基，向每孔中加入25μl等份的含4μgpcDNA3.1/NGF的PEI/DNA復(fù)合物。在37℃下，用DNA/PEI復(fù)合物孵育細(xì)胞3個(gè)小時(shí)。接著用新鮮完全培養(yǎng)基替換上述培養(yǎng)基。繼續(xù)孵育24小時(shí)后，收集細(xì)胞和培養(yǎng)基用于NGF試驗(yàn)，使用靈敏的NGF ELISA試劑盒(Boehringer Mannheim)。對(duì)于對(duì)照組，用pcDNA3-Luc代替pcDNA3.1/NGF。在體內(nèi)NGF表達(dá)試驗(yàn)中，使用了15只大鼠，，其中10只用于實(shí)驗(yàn)組，第3天和第7天的時(shí)間間隔各5只。讓4μg的pcDNA3.1/NGF或pcDNA3/NGF與20μl的PEI復(fù)合，然后如同上文所述注射入到每只大鼠中。收集DGR并進(jìn)行均質(zhì)化。上清液用于NGF ELISA。
神經(jīng)再生評(píng)估操作后四周，再次麻醉大鼠，將坐骨神經(jīng)與NGC一起暴露，并將其小心地從周圍組織中剝離出來。用鑷子夾持住遠(yuǎn)離管的神經(jīng)片段以確定神經(jīng)再生的成功。后背肌肉的收縮或腿部的收回表明在被夾持片段中存在再生的感覺纖維，而如果沒有反應(yīng)則表示不存在此類纖維。
對(duì)于組織學(xué)檢測，收集NGC中的再生神經(jīng)鏈(nerve cable)，并將其在2.5％戊二醛的PBS緩沖液(pH＝7.4)中固定過夜。隨后進(jìn)行的固定、包埋、切片和染色步驟都如前所述(Xu等。2003《生物材料》242504)。接著用半薄(semi-thin)切片操作再生神經(jīng)的末梢片段，并用TolubineBlue進(jìn)行染色以進(jìn)行形態(tài)分析。對(duì)取自10mm間隙(gap)中部的17個(gè)橫向半薄切片進(jìn)行分析，以確定再生軸突數(shù)量、纖維群和纖維直徑。用MicroImage LiteTM(Olympus，圖像分析軟件)來進(jìn)行定量測量和評(píng)估。選擇感興趣區(qū)域用于超薄切片。用檸檬酸鉛對(duì)超薄切片(100nm)進(jìn)行染色，在銅編織網(wǎng)上進(jìn)行收集并用80-100kV的Philips EM 208s電子顯微鏡進(jìn)行檢測。評(píng)估樣本的神經(jīng)組織再生和抗聚合物的異體反應(yīng)。
實(shí)施例1通過腰部鞘內(nèi)注射將基因轉(zhuǎn)移到DRG中首先，鞘內(nèi)施用Cy3共價(jià)標(biāo)記的桿狀病毒載體或PEI/DNA復(fù)合物后，我們從評(píng)估DRG對(duì)基因載體的吸收開始。注射后2天，在注射位置附近收集DRG，并用抗-NeuN對(duì)其切片進(jìn)行染色。在DRG中檢測到了紅色Cy3信號(hào)，主要位于高倍下的NeuN-陽性細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中(圖1)。對(duì)注射后第1和第3天收集到的DRG樣本進(jìn)行PCR分析，結(jié)果表明CNS注射后在這些PNS區(qū)域中存在被運(yùn)輸?shù)膱?bào)道基因(圖2)。
對(duì)帶有熒光素酶報(bào)道基因的四種不同的基因遞送系統(tǒng)，PEI/DNA復(fù)合物、lipofectamin/DNA復(fù)合物、桿狀病毒載體和AAV-2載體，檢測了它們?cè)诮閷?dǎo)轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)移進(jìn)入DRG細(xì)胞的效果。腰椎鞘內(nèi)注射2天后，很容易的檢測了上述各種類型載體在DRG細(xì)胞中的熒光素酶活性(圖3)。在研究來自PEI/DNA復(fù)合物的轉(zhuǎn)基因熒光素酶表達(dá)的時(shí)程實(shí)驗(yàn)中，早在注射后第1天就檢測到了酶活性，在第3天時(shí)達(dá)到峰值，然后在接下來的幾周中逐漸降低，在注射后4周仍能檢測到較低的活性(圖3)。熒光素酶的免疫染色表明DRG中所檢測到的蛋白質(zhì)并不限于上皮組織，而且還存在于神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中。對(duì)熒光素酶和神經(jīng)元特異性NeuN蛋白質(zhì)的雙重免疫染色表明DRG中的熒光素酶陽性細(xì)胞其中的大部分也是NeuN-陽性的，只有很少的熒光素酶陽性細(xì)胞是非神經(jīng)元細(xì)胞(圖5)。
實(shí)施例2通過神經(jīng)導(dǎo)管的NGF cDNA轉(zhuǎn)染和神經(jīng)再生NGF是一種主要作用于感覺和交感神經(jīng)元的神經(jīng)營養(yǎng)因子(Thorne，R.G.，and Frey，W.H.II 2001，Clin Pharmocokinet 40907)，選擇NGF，通過神經(jīng)導(dǎo)管(NGC)檢測其在DRG中表達(dá)對(duì)外周神經(jīng)再生的影響，神經(jīng)導(dǎo)管是一種廣泛用在前-臨床試驗(yàn)中修復(fù)神經(jīng)缺陷的裝置(Schmidt等2003，Ann.Rev.Biomed.Eng.293)。我們對(duì)來自PEI-介導(dǎo)的基因遞送的NGF cDNA表達(dá)進(jìn)行了檢測。在轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞后，培養(yǎng)基中的NGF濃度升高，正如在敏感ELISA中所檢測的一樣，水平為約1ng/ml，比對(duì)照組高6倍(圖6A)。類似的升高還發(fā)現(xiàn)于對(duì)細(xì)胞裂解物進(jìn)行分析的時(shí)候(圖6B)。在腰椎鞘內(nèi)注射PEI/NGF cDNA復(fù)合物后，DRG中的NGF表達(dá)比對(duì)照組高3倍并且持續(xù)了至少7天。
實(shí)施例3NGF表達(dá)對(duì)神經(jīng)再生的影響夾持實(shí)驗(yàn)顯示通過NGCs獲得的神經(jīng)再生成功率，NGF組在操作后4周時(shí)是87％，而對(duì)照組為67％。在從夾持實(shí)驗(yàn)陽性大鼠收集的管內(nèi)發(fā)現(xiàn)了將兩個(gè)神經(jīng)殘端10mm間隙橋連的再生組織鏈(tissue cable)。從NGF組的NGC中所收集到的組織鏈顯示了比對(duì)照組更具改善的再生品質(zhì)，神經(jīng)纖維的直徑顯著增大，G-比率減小(Friende等1982，Brain Research235335)，G-比率為軸突直徑與有髓纖維之比(圖7)。所檢測的另兩個(gè)參數(shù)即纖維群和密度，盡管可以看出在NGF組中其有所增加，但是并沒有發(fā)現(xiàn)顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這可能是因?yàn)檩^大的標(biāo)準(zhǔn)差(圖7)。
通過透射電子顯微鏡還可以檢測到神經(jīng)再生的形態(tài)標(biāo)志。再生的神經(jīng)鏈位于管內(nèi)中心，四周包裹著精致的神經(jīng)外膜。在NGF組和對(duì)照組中，所述鏈內(nèi)均含有大量再生的有髓和無髓軸突的肌束。相對(duì)于對(duì)照組來說，NGF組中的有髓軸突分別具有更大和更高的數(shù)量、直徑和密度(圖8)。NGF組中的髓鞘也比對(duì)照組中的厚得多。
因此本研究證明了治療用NGF基因?qū)嗔炎巧窠?jīng)的再生具有的積極的作用，為外周神經(jīng)再生的基因治療提供了一個(gè)實(shí)例。NGF是第一個(gè)并且是研究最為透徹的神經(jīng)-來源的因子，其作用的神經(jīng)元群的種類相對(duì)有限，包括外周神經(jīng)系統(tǒng)感覺神經(jīng)元的交感亞群，和腦內(nèi)的紋狀體(striatial)及膽堿能神經(jīng)元(Terenghi，G.1999，J.Anat.1841)。在正常情況下，NGF呈現(xiàn)出非常低的濃度，但是在實(shí)驗(yàn)性神經(jīng)損傷動(dòng)物模型中快速升高。該蛋白主要由損傷神經(jīng)遠(yuǎn)殘端的目標(biāo)組織和施沃恩細(xì)胞產(chǎn)生，然后在作用神經(jīng)元受體及產(chǎn)生神經(jīng)營養(yǎng)功效前以逆向方式運(yùn)輸入細(xì)胞體內(nèi)。外周神經(jīng)病中，病態(tài)神經(jīng)內(nèi)的此類運(yùn)輸負(fù)性減少或深圳被完全阻斷。保持運(yùn)輸機(jī)制從而維持受影響神經(jīng)元正常功能的替代方式對(duì)于外周神經(jīng)病的治療來說是十分重要的。通過鞘內(nèi)注射被遞送基因載體到DRG神經(jīng)元中不需要軸突傳輸就可到達(dá)細(xì)胞質(zhì)中，其能有利地用于支持DRG中的神經(jīng)元功能，從而減慢或終止相關(guān)軸突的變性過程。
形態(tài)分析和TEM分析都表明DRG中的NGF轉(zhuǎn)染、神經(jīng)再生、特別是新軸突的直徑都有所改善。軸突中神經(jīng)絲的數(shù)量被認(rèn)為是控制軸突直徑的關(guān)鍵因素，其在感覺神經(jīng)元中可能受到NGF的調(diào)節(jié)。
在外周神經(jīng)斷裂后，感覺神經(jīng)元中的神經(jīng)體大小、軸突直徑、神經(jīng)絲合成和神經(jīng)絲的軸突傳遞均減小。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，NGF cDNA的轉(zhuǎn)染會(huì)上調(diào)NGF蛋白質(zhì)的表達(dá)、有助于提高神經(jīng)絲合成并且顯著的增大纖維直徑。
正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，在此描述的實(shí)施方式可以有很多改進(jìn)。而本發(fā)明旨在包括落于權(quán)利要求限定范圍內(nèi)的所有這樣的改進(jìn)。
序列表<110>王朔王旭<120>將核酸遞送到外周神經(jīng)元的方法<130>93231-66<160>4<170>專利文本3.3<210>1<211>28<212>DNA<213>合成的引物<400>1attgcggccg cggtaccgag ctcttacg 28<210>2<211>32<212>DNA<213>合成的引物<400>2attgcggccg cttatcgatt ttaccacatt tg 32<210>3<211>20<212>DNA<213>合成的引物<400>3attgctcaac agtatgggca 20<210>4<211>21<212>DNA<213>合成的引物<400>4cgaagaagga gaatagggtt g 2權(quán)利要求
1.一種將核酸遞送到宿主外周神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元細(xì)胞中的方法，其包括下述步驟辨識(shí)背根神經(jīng)節(jié)中的目標(biāo)神經(jīng)元細(xì)胞，然后將包含核酸的載體施用到宿主腦脊液中的位置，其中所述位置足夠接近背根神經(jīng)節(jié)的位置，以將核酸遞送到目標(biāo)神經(jīng)元細(xì)胞的細(xì)胞體中。
2.一種治療宿主外周神經(jīng)病的方法，該方法包括辨識(shí)受神經(jīng)病影響的背根神經(jīng)節(jié)中的目標(biāo)神經(jīng)元細(xì)胞，然后將包含治療用核酸的載體施用到宿主腦脊液中的位置，其中所述位置足夠接近背根神經(jīng)節(jié)的位置，以將核酸遞送到目標(biāo)神經(jīng)元細(xì)胞的細(xì)胞體中。
3.一種治療宿主的斷裂外圍神經(jīng)的方法，該外圍神經(jīng)具有近端和遠(yuǎn)端殘端，該方法包括將包含治療用核酸的載體施用到背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞中，其中所述的遠(yuǎn)端和近端殘端被鎖定到神經(jīng)導(dǎo)管上。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其中所述的將載體施用到背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞包括在腦脊液中足夠接近背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞的位置施用載體，以將所述核酸遞送到背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞的細(xì)胞體中。
5.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述的外周神經(jīng)病是糖尿病神經(jīng)病、神經(jīng)擠壓或神經(jīng)斷裂。
6.如權(quán)利要求1-5任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述的核酸包含一種可操作連接到啟動(dòng)子上的編碼序列。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述的啟動(dòng)子是病毒啟動(dòng)子。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述的病毒啟動(dòng)子是CMV啟動(dòng)子。
9.如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述的啟動(dòng)子是神經(jīng)元特異性啟動(dòng)子。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述的神經(jīng)元特異性啟動(dòng)子是PDGF β啟動(dòng)子。
11.如權(quán)利要求6-10任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述的啟動(dòng)子與增強(qiáng)子可操作連接。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述的增強(qiáng)子是CMV增強(qiáng)子。
13.如權(quán)利要求1-12任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述的核酸編碼一種神經(jīng)營養(yǎng)因子。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述的神經(jīng)營養(yǎng)因子是一種神經(jīng)生長因子。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述的神經(jīng)生長因子是NGF。
16.如權(quán)利要求1-12任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述的核酸編碼一種抗凋亡因子。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述的抗凋亡因子是bc1-2。
18.如權(quán)利要求1-17任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述的載體是病毒載體。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述的病毒載體是桿狀病毒載體或AAV載體。
20.如權(quán)利要求1-17任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述的載體是非病毒載體。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其中所述的非病毒載體是聚合物類載體、多肽類載體或脂類載體。
22.如權(quán)利要求21所述的方法，其中所述的聚合物類載體是聚乙烯亞胺。
23.如權(quán)利要求1-22任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述的載體是通過注射施用的。
24.如權(quán)利要求23所述的方法，其中所述的載體是通過腰椎注射施用的。
25.一種包含核酸的載體在將所述核酸遞送到背根神經(jīng)節(jié)的目標(biāo)神經(jīng)元細(xì)胞中的用途，其中所述的遞送依靠載體在腦脊液中的施用位置發(fā)揮作用，該位置足夠接近背根神經(jīng)節(jié)以將核酸遞送到目標(biāo)神經(jīng)元細(xì)胞的細(xì)胞體中。
26.一種包含治療用核酸的載體在用于治療宿主外周神經(jīng)病中的用途，其中所述核酸被從腦脊液中的載體施用位置遞送到受到神經(jīng)病影響的背根神經(jīng)節(jié)的目標(biāo)神經(jīng)元細(xì)胞中，該位置足夠接近背根神經(jīng)節(jié)以將核酸遞送到目標(biāo)神經(jīng)元細(xì)胞的細(xì)胞體中。
27.一種含治療用核酸的載體在用于治療斷裂的外周神經(jīng)中的用途，該外周神經(jīng)具有遠(yuǎn)端和近端殘端，其中所述遠(yuǎn)端和近端殘端被鎖定到神經(jīng)導(dǎo)管上，所述核酸被從腦脊液中的施用位置遞送到背根神經(jīng)節(jié)中的神經(jīng)元細(xì)胞中。
28.如權(quán)利要求27所述的用途，其中所述的施用位置在腦脊液中，該位置足夠接近背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞以將載體遞送到背根神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)元細(xì)胞的細(xì)胞體中。
29.如權(quán)利要求25所述的用途，其中所述的外周神經(jīng)病是糖尿病神經(jīng)病、神經(jīng)擠壓或神經(jīng)斷裂。
30.如權(quán)利要求25-29任意一項(xiàng)所述的用途，其中核酸包括一種可操作連接到啟動(dòng)子上的編碼序列。
31.如權(quán)利要求30所述的用途，其中所述的啟動(dòng)子是病毒啟動(dòng)子。
32.如權(quán)利要求31所述的用途，其中所述的病毒啟動(dòng)子是CMV啟動(dòng)子。
33.如權(quán)利要求30所述的用途，其中所述的啟動(dòng)子是神經(jīng)元特異性啟動(dòng)子。
34.如權(quán)利要求33所述的用途，其中所述的神經(jīng)元特異性啟動(dòng)子是PDGF β啟動(dòng)子。
35.如權(quán)利要求30-34任意一項(xiàng)所述的用途，其中所述的啟動(dòng)子與增強(qiáng)子是可操作連接。
36.如權(quán)利要求35所述的用途，其中所述的增強(qiáng)子是CMV增強(qiáng)子。
37.如權(quán)利要求25-36任意一項(xiàng)所述的用途，其中所述的核酸編碼一種神經(jīng)營養(yǎng)因子。
38.如權(quán)利要求37所述的用途，其中所述的神經(jīng)營養(yǎng)因子是一種神經(jīng)生長因子。
39.如權(quán)利要求38所述的用途，其中所述的神經(jīng)生長因子是NGF。
40.如權(quán)利要求25-36任意一項(xiàng)所述的用途，其中所述的核酸編碼一種抗凋亡因子。
41.如權(quán)利要求40所述的用途，其中所述的抗凋亡因子是bc1-2。
42.如權(quán)利要求25-41任意一項(xiàng)所述的用途，其中所述的載體是病毒載體。
43.如權(quán)利要求42所述的用途，其中所述的病毒載體是桿狀病毒載體或AAV載體。
44.如權(quán)利要求25-41任意一項(xiàng)所述的用途，其中所述的載體是非病毒載體。
45.如權(quán)利要求44所述的用途其中所述的非病毒載體是聚合物類載體、多肽類載體或脂類載體。
46.如權(quán)利要求45所述的用途，其中所述的聚合物類載體是聚乙烯亞胺。
47.如權(quán)利要求25-36中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述的施用位置為腰部區(qū)域。
全文摘要
本發(fā)明提供了將核酸遞送到外周神經(jīng)元的方法，其通過辨識(shí)背根神經(jīng)節(jié)中的目標(biāo)神經(jīng)元，然后將包含核酸的載體鞘內(nèi)遞送到背根神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)元中。該核酸編碼可用于治療外周神經(jīng)病的神經(jīng)營養(yǎng)因子，該神經(jīng)營養(yǎng)因子可與神經(jīng)導(dǎo)管一起用于治療斷裂的外周神經(jīng)。
文檔編號(hào)C12N15/87GK101065488SQ200580021356
公開日2007年10月31日 申請(qǐng)日期2005年1月20日 優(yōu)先權(quán)日2005年1月20日
發(fā)明者王朔, 王旭 申請(qǐng)人:新加坡科技研究局