專(zhuān)利名稱(chēng)：神經(jīng)再生的制作方法
背景技術(shù)：
1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及使用基于細(xì)胞的治療方法預(yù)防神經(jīng)退化及促進(jìn)神經(jīng)再生。
2.技術(shù)背景及現(xiàn)狀針對(duì)受損神經(jīng)的神經(jīng)再生已經(jīng)進(jìn)行了許多的研究工作。通常，針對(duì)外周神經(jīng)創(chuàng)傷的臨床外科治療包括一系列復(fù)雜的步驟，這涉及到首先清除創(chuàng)傷局部位置附近的受損組織以及提供有助于外周神經(jīng)再生的環(huán)境(Kline，J Neurosurg，1989，70166-174)。手術(shù)過(guò)程的方法通常涉及受傷區(qū)域頂端和末端的直接連接或融合(Kline和Judice，JNeurosurg，1983，58631-649)。其他的外科手術(shù)方法包括諸如外周神經(jīng)移植(Millesi，Clin Orthop，1988，23736-42)以及更傳統(tǒng)的諸如保持電刺激以產(chǎn)生在等待神經(jīng)自然再生過(guò)程中有助于抑制肌肉-神經(jīng)連結(jié)點(diǎn)退化的肌肉收縮的門(mén)診治療(Kim等，KoreanAcademy of Rehabilitation Medicine(韓國(guó))，1999，23893-898；al-Amood等，J Physiol(Lond)，1991，441243-256)。最后，大部分這樣的手術(shù)還包括廣泛的包括長(zhǎng)期受控的運(yùn)動(dòng)治療以防止肌肉弱化和收縮并促進(jìn)神經(jīng)的繼發(fā)性生長(zhǎng)的理療計(jì)劃(Pyun等，Korean Academy of Rehabilitation Medicine(韓國(guó))，1999，231063-1075)。
通常，使用機(jī)械矯正裝置以保護(hù)關(guān)節(jié)并防止受影響部位周邊肌肉和韌帶的損傷(Gravois，《物理治療及康復(fù)》(Physical Medicine and Rehabilitation)，馬薩諸塞州Blackwell Science，2000，pp432-433)。此外，用于神經(jīng)再生的各種實(shí)驗(yàn)技術(shù)還包括使用生物合成管連接神經(jīng)或與有助于共同降低神經(jīng)損傷并刺激神經(jīng)再生的藥物組合使用(al-Amood等，J Physiol(Lond)，1991，441243-256；Dumitru，Dumitru主編的《電反應(yīng)診斷醫(yī)學(xué)》(Electrodiagnostic medicine)第1版，PhiladelphiaHanley&Belfus，1995，pp341-384)；Ebara和Nakayama，《脊柱》(Spine)，2002，16SS10-S15；Horowitz，《肌肉神經(jīng)》(Muscle Nerve)，1989，12314-322；Matzuk等，Nature，1995，374360-363；Mengs，Arch Int Pharmacodyn Therp，1984，271(2)315-323)。
因此，在現(xiàn)有技術(shù)中對(duì)用于受損神經(jīng)(尤其是外周神經(jīng))的再生或防止其退化的分子治療方法存在需求。
發(fā)明概述本發(fā)明一方面是針對(duì)神經(jīng)再生的一種方法，該方法包括a)產(chǎn)生包含以可操作方式與啟動(dòng)子相連的編碼蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子超家族成員之一的DNA序列的重組病毒或質(zhì)粒載體；b)用所述重組載體體外轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的細(xì)胞群體，形成所述培養(yǎng)細(xì)胞的群體；以及c)將所述轉(zhuǎn)染細(xì)胞移植到受損神經(jīng)周?chē)鷧^(qū)域，使得受損神經(jīng)周?chē)鷧^(qū)域內(nèi)所述DNA序列的表達(dá)引起神經(jīng)再生。所述轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子可以是BMP。所述BMP可以是BMP-2或BMP-9。所述細(xì)胞可以是結(jié)締組織細(xì)胞。所述細(xì)胞優(yōu)選地可以是成纖維細(xì)胞或神經(jīng)細(xì)胞。此外，所述神經(jīng)可以是外周神經(jīng)。所述載體可以是病毒載體。所述載體可以是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺伴隨病毒載體、腺病毒載體或皰疹病毒載體。此外，所述細(xì)胞群體在移植前可以在液氮中保存在諸如10％DMSO中。
本發(fā)明也針對(duì)神經(jīng)再生的一種方法，該方法包括a)產(chǎn)生包含編碼髓鞘再生蛋白的DNA序列的重組病毒或質(zhì)粒載體；b)用所述重組載體體外轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的細(xì)胞群體，形成所述培養(yǎng)細(xì)胞的群體；以及c)將所述轉(zhuǎn)染細(xì)胞移植到受損神經(jīng)周?chē)鷧^(qū)域，使得受損神經(jīng)周?chē)鷧^(qū)域內(nèi)所述DNA序列的表達(dá)引起神經(jīng)再生。所述細(xì)胞可以是諸如成纖維細(xì)胞的結(jié)締組織細(xì)胞、或神經(jīng)細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞或施萬(wàn)細(xì)胞。在所述方法中，所述蛋白質(zhì)可以是神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白(neuregulin)-1。再生的神經(jīng)可以是外周神經(jīng)。


以下的詳細(xì)描述和附圖有助于對(duì)本發(fā)明更全面的理解。附圖只是出于說(shuō)明的目的，因此不是對(duì)本發(fā)明的限制，其中圖1A-1B顯示了BMP-9組損傷2周后大鼠坐骨神經(jīng)的顯微鏡檢測(cè)，圖中顯示了非常嚴(yán)重的神經(jīng)軸突和髓鞘退化，以及顯著的空泡化改變。圖1A-1B也顯示了神經(jīng)周軟組織中單核炎性細(xì)胞的明顯滲透。(AH&E染色；B改進(jìn)的三色染色200×)圖2A-2B顯示了BMP-9組損傷4周后大鼠坐骨神經(jīng)的顯微鏡檢測(cè)，圖中顯示約70％的受損區(qū)域伴隨有空泡化改變。有些顯著的髓鞘消化腔以及明顯的溫和的神經(jīng)內(nèi)纖維化。(AH&E染色；B改進(jìn)的三色染色200×)圖3A-3C顯示了BMP-9組損傷8周后大鼠坐骨神經(jīng)的顯微鏡檢測(cè)，圖中顯示了約50％神經(jīng)軸突中的空泡化改變。神經(jīng)外空間中單核炎性細(xì)胞的滲透嚴(yán)重。神經(jīng)束中也存在局灶出血(AH&E染色×200，B和C改進(jìn)的三色染色，分別為200×和100×)圖4A-4B顯示了BMP-9組損傷8周后大鼠坐骨神經(jīng)的顯微鏡檢測(cè)，圖中顯示了約33％神經(jīng)軸突中的空泡化改變。神經(jīng)外空間中殘留著一些單核炎性細(xì)胞。(A和B改進(jìn)的三色染色，200×)圖5A-5B顯示了BMP-2組損傷2周后大鼠坐骨神經(jīng)的顯微鏡檢測(cè)，圖中顯示了大部分神經(jīng)軸突中的空泡化改變。中心的軸突萎縮和脫髓鞘是顯著的。(A和B改進(jìn)的三色染色，分別為100×和200×)圖6A-6B顯示了BMP-2組損傷4周后大鼠坐骨神經(jīng)的顯微鏡檢測(cè)，圖中顯示了約半數(shù)神經(jīng)軸突中的空泡化改變。存在明顯的伴隨著溫和神經(jīng)內(nèi)纖維化的脫髓鞘作用。(A和B改進(jìn)的三色染色，分別為100×和200×)圖7A-7B顯示了BMP-2組損傷8周后大鼠坐骨神經(jīng)的顯微鏡檢測(cè)，圖中顯示了約半數(shù)神經(jīng)軸突中的空泡化改變。神經(jīng)外空間中殘留著一些單核炎性細(xì)胞。(A和B改進(jìn)的三色染色，分別為100×和200×)圖8A-8B顯示了陰性對(duì)照組損傷2周后大鼠坐骨神經(jīng)的顯微鏡檢測(cè)，圖中顯示了幾乎所有的神經(jīng)軸突發(fā)生了退化以及軸突外圍中單核炎性細(xì)胞的滲透。神經(jīng)外纖維化也是明顯的。(A和B改進(jìn)的三色染色，分別為100×和200×)圖9A-9B顯示了陰性對(duì)照組損傷4周后大鼠坐骨神經(jīng)的顯微鏡檢測(cè)，圖中顯示了約33％的神經(jīng)軸突發(fā)生退化以及明顯的空泡化改變。(A和B改進(jìn)的三色染色，分別為100×和200×)圖10A-10B顯示了陰性對(duì)照(sham)組損傷8周后大鼠坐骨神經(jīng)的顯微鏡檢測(cè)，圖中顯示了約10-20％的神經(jīng)軸突發(fā)生了退化以及顯著的空泡化改變。(A和B改進(jìn)的三色染色，分別為100×和200×)優(yōu)選實(shí)施方式的詳細(xì)描述在本申請(qǐng)中，“一個(gè)”和“一種”用于表示單個(gè)和多個(gè)對(duì)象。
如這里所使用的，術(shù)語(yǔ)“結(jié)締組織細(xì)胞”包括在結(jié)締組織中所發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞，諸如成纖維細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和骨細(xì)胞(成骨細(xì)胞/骨細(xì)胞)(它們分泌胞外膠原基質(zhì))，以及脂肪細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞。優(yōu)選地，所述結(jié)締組織細(xì)胞是成纖維細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和骨細(xì)胞。更優(yōu)選地，所述結(jié)締組織細(xì)胞是成纖維細(xì)胞。結(jié)締組織細(xì)胞也包括間葉細(xì)胞樣細(xì)胞(也被認(rèn)為是未成熟的成纖維細(xì)胞)。需要指出的是，本發(fā)明可采用結(jié)締組織細(xì)胞的混合培養(yǎng)物以及單一細(xì)胞類(lèi)型加以實(shí)施。
如這里所使用的，在受損神經(jīng)“附近”注射細(xì)胞是指注射部位與受損神經(jīng)之間足夠近從而在受損部位產(chǎn)生神經(jīng)再生的有效結(jié)果的區(qū)域。因此，在受損神經(jīng)附近注射細(xì)胞包括在受損位置或與所述注射細(xì)胞足夠近，從而使有效多肽表達(dá)并且所述多肽能直接或間接影響神經(jīng)再生結(jié)果的任何位置。
如這里所使用的，“啟動(dòng)子”可以是具有活性的并控制真核細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄的任何DNA序列。所述啟動(dòng)子可以是在真核和/或原核細(xì)胞中具有活性的。優(yōu)選地，所述啟動(dòng)子在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中具有活性。所述啟動(dòng)子可以是組成型或誘導(dǎo)型表達(dá)的。優(yōu)選地，所述啟動(dòng)子誘導(dǎo)型的。優(yōu)選地，所述啟動(dòng)子是由外界刺激所誘導(dǎo)的。更優(yōu)選地，所述啟動(dòng)子是由激素或金屬所誘導(dǎo)的。進(jìn)一步更優(yōu)選地，所述啟動(dòng)子是由重金屬誘導(dǎo)的。最優(yōu)選地，所述啟動(dòng)子是金屬硫因基因啟動(dòng)子。同樣地，可以將也控制轉(zhuǎn)錄的“增強(qiáng)子元件”插入所述DNA載體構(gòu)件并與本發(fā)明所述的構(gòu)件共同使用以增強(qiáng)感興趣的基因的表達(dá)。
如這里所使用的，“選擇標(biāo)記”包括由穩(wěn)定保持所導(dǎo)入基因的細(xì)胞所表達(dá)的并使得細(xì)胞表現(xiàn)出諸如形態(tài)轉(zhuǎn)化等不同表型或酶活性的基因產(chǎn)物。對(duì)表達(dá)轉(zhuǎn)染基因的細(xì)胞的分離是通過(guò)在相同的細(xì)胞中導(dǎo)入編碼選擇標(biāo)記(諸如具有產(chǎn)生針對(duì)抗生素或其他藥物抗性的酶活性)的第二條基因得以實(shí)現(xiàn)的。選擇標(biāo)記的實(shí)例包括但不限于胸苷激酶、二氫葉酸還原酶、氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶(它們產(chǎn)生對(duì)氨基糖苷類(lèi)抗生素(諸如卡那霉素、新霉素和遺傳霉素)的抗性)、潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶、黃嘌呤-鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶、CAD(具有尿苷全生物合成最初三種酶活性(氨基甲酰磷酸合成酶、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶和二氫乳清酸酶)的單一蛋白質(zhì)、腺苷脫氨酶以及天冬酰胺合成酶(Sambrook等，《分子克隆》(Molecular Cloning)，1989，第16章)，這些選擇標(biāo)記通過(guò)參考完整地組合在本申請(qǐng)中。
如這里所使用的，“轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)超家族”包括一組結(jié)構(gòu)上相關(guān)的蛋白質(zhì)，它們?cè)谂咛グl(fā)育過(guò)程中對(duì)廣泛的分化過(guò)程產(chǎn)生影響。該家族包括正常的男性性發(fā)育所需的副中腎管抑制物質(zhì)(MIS)(Behringer等，Nature，345167，1990)、背-腹軸形成及成蟲(chóng)盤(pán)形態(tài)發(fā)生所需的果蠅dpp基因(DPP)基因產(chǎn)物(Padgett等，Nature，32581-84，1987)、位于卵細(xì)胞植物極的爪蟾(Xenopus)Vg-1基因產(chǎn)物(Weeks等，Cell，51861-867，1987)、能夠誘導(dǎo)爪蟾胚胎中中胚層和前期結(jié)構(gòu)形成的活化素(Mason等，Biochem，Biophys.Res.Commun.，135957-964，1986)、以及能誘導(dǎo)軟骨和骨重新形成的骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP，諸如BMP-2、3、4、5、6和7，成骨素、OP-1)(Sampath等，J.Biol.Chem.，26513198，1990)。TGF-β基因產(chǎn)物能夠影響包括脂肪形成、肌肉發(fā)生、軟骨發(fā)生、血細(xì)胞生成以及上皮細(xì)胞分化在內(nèi)的多種分化過(guò)程(參見(jiàn)Massague，Cell 49437，1987，這通過(guò)參考完整地組合在本申請(qǐng)中)。
TGF-β家族的蛋白質(zhì)最初以大的前體蛋白質(zhì)的形式合成，其隨后在距C末端約110-140個(gè)氨基酸的堿性殘基簇的位置進(jìn)行蛋白酶解。所述蛋白質(zhì)的C末端區(qū)域都具有結(jié)構(gòu)上的相關(guān)性，并且在其同源度的基礎(chǔ)上可以將不同的家族成員劃歸不同的亞類(lèi)。雖然在具體的亞類(lèi)中同源度在70％到90％氨基酸序列一致之間，亞類(lèi)之間的同源度明顯較低，通常僅為20％到50％。在每種情況下，活性形式似乎是通過(guò)二硫鍵相連的C末端片段二聚體。對(duì)于已研究的大部分家族成員來(lái)說(shuō)，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)同源二聚體形式具有生物學(xué)活性，但對(duì)于其他家族成員而言，象抑制素(Ung等，Nature，321779，1986)和TGF-β(Cheifetz等，Cell，48409，1987)，也已觀察到其異源二聚體，并且與其相應(yīng)的同源二聚體相比可能具有不同的生物學(xué)性質(zhì)。
TGF-β基因超家族成員包括TGF-β3、TGF-β2、TGF-β4(雞)、TGF-β1、TGF-β5(爪蟾)、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6、OP-1/BMP-7、BMP-8、BMP-9、果蠅60A、果蠅DPP、Vgr1、GDF-1、爪蟾Vgf、抑制素-βA、抑制素-βB、抑制素-α和MIS。許多這樣的基因在Massague，Ann.Rev.Biochem.67753-791，1998中進(jìn)行了討論，該文獻(xiàn)通過(guò)參考完整地組合在本申請(qǐng)中。
優(yōu)選地，所述TGF-β基因超家族成員是TGF-β。更優(yōu)選地，所述成員是TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、BMP-8或BMP-9。
需要理解的是，在通過(guò)以上命名描述蛋白質(zhì)時(shí)，所述蛋白質(zhì)不限于野生型的確切序列。所述蛋白質(zhì)序列的變異是允許的，因此與所述蛋白質(zhì)在功能方面具有充分相同活性的另一條多肽序列是包括在內(nèi)的。
神經(jīng)組織神經(jīng)組織源于脊索影響下的胚胎外胚層。外胚層受誘導(dǎo)形成變厚的神經(jīng)板，其隨后分化并末端最終融合形成神經(jīng)管，由此產(chǎn)生完整的中樞神經(jīng)系統(tǒng)。中樞神經(jīng)系統(tǒng)由腦、顱神經(jīng)和脊髓構(gòu)成。外周神經(jīng)系統(tǒng)源于被稱(chēng)為神經(jīng)嵴的神經(jīng)溝旁細(xì)胞。
神經(jīng)組織以復(fù)雜的綜合溝通網(wǎng)絡(luò)的形式分布在全身。神經(jīng)細(xì)胞(神經(jīng)元)以回路形式與其他神經(jīng)元溝通，神經(jīng)回路可以是非常簡(jiǎn)單的，也可以是非常復(fù)雜的更高級(jí)別回路。神經(jīng)元行使實(shí)際的信息傳輸和綜合的功能，而被稱(chēng)為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的其他神經(jīng)組織細(xì)胞通過(guò)支持、保護(hù)、防衛(wèi)及營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)元幫助神經(jīng)元行使其功能。在腦部神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞比神經(jīng)元多約10倍以上。神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞創(chuàng)建了神經(jīng)元行使功能所需要的微環(huán)境并在有些情況下為神經(jīng)元的處理與活性提供協(xié)助。神經(jīng)元是可被激發(fā)的細(xì)胞。這意味著當(dāng)其被適當(dāng)刺激時(shí)，可以啟動(dòng)能沿細(xì)胞膜傳播從而將信息傳達(dá)給遠(yuǎn)處細(xì)胞的動(dòng)作電位。神經(jīng)元是負(fù)責(zé)對(duì)刺激進(jìn)行接收、傳輸和處理的獨(dú)立的功能單位。
通常，神經(jīng)元由三部分構(gòu)成其中定位有細(xì)胞核與細(xì)胞器的細(xì)胞體；樹(shù)突，它們是從環(huán)境或其他神經(jīng)元接收刺激的由細(xì)胞體延伸出的突起；以及軸突，它們是用于向其他神經(jīng)元傳輸神經(jīng)沖動(dòng)的由細(xì)胞體延伸出的長(zhǎng)的單一突起。軸突通常在其遠(yuǎn)端分叉，并且具有球狀末端的每個(gè)分枝在另一個(gè)細(xì)胞上終結(jié)。球狀末端與相鄰細(xì)胞的相互作用形成被稱(chēng)為突觸的結(jié)構(gòu)。突觸專(zhuān)門(mén)用以接收信號(hào)并將其轉(zhuǎn)化成電位。
人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的大部分神經(jīng)元是多極性的，這意味著它們具有兩個(gè)以上的細(xì)胞突起，其中只有一個(gè)是軸突，其他突起是樹(shù)突。視網(wǎng)膜或嗅黏膜的雙極性神經(jīng)元具有始于細(xì)胞體的一個(gè)樹(shù)突和一個(gè)軸突。在脊髓神經(jīng)節(jié)中發(fā)現(xiàn)的假單極性神經(jīng)元能將由樹(shù)突收集的感官?zèng)_動(dòng)不經(jīng)過(guò)細(xì)胞體直接傳輸給軸突。神經(jīng)元也可以按照功能加以分類(lèi)。感官神經(jīng)元參與感官刺激的接收和傳輸。運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元發(fā)送沖動(dòng)以控制肌肉和腺體。其他神經(jīng)元，中間神經(jīng)元，作為功能網(wǎng)絡(luò)的一部分以神經(jīng)元之間中間媒介的方式發(fā)揮作用。
突觸是傳播細(xì)胞信號(hào)的專(zhuān)門(mén)化的功能性細(xì)胞接點(diǎn)。大部分突觸是化學(xué)突觸，其中突觸前末端中的囊泡含有化學(xué)信使，當(dāng)突觸前膜受到刺激時(shí)，所述化學(xué)信使釋放到突觸間隙中?；瘜W(xué)信使擴(kuò)散通過(guò)突觸間隙與突觸后膜上的受體結(jié)合。這引起影響細(xì)胞作用的突觸后膜極化狀態(tài)的改變。神經(jīng)肌肉接點(diǎn)是一種特殊類(lèi)型的突觸。已知35種以上的神經(jīng)遞質(zhì)，其中大部分是小分子(氧化一氮、乙酰膽堿)、兒茶酚胺(去甲腎上腺素、血清素)、或神經(jīng)活性肽(內(nèi)啡肽、后葉加壓素)。神經(jīng)遞質(zhì)一旦使用，其通過(guò)酶降解、擴(kuò)散或突觸前細(xì)胞的內(nèi)吞作用得以快速清除。
有些神經(jīng)元被包裹在稱(chēng)為髓鞘的絕緣物質(zhì)中。這一富含脂類(lèi)的物質(zhì)是由神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞形成的(外周神經(jīng)系統(tǒng)中的施萬(wàn)細(xì)胞以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞)。通過(guò)減少必須去極化的膜表面積，這樣的絕緣有助于更快的神經(jīng)傳導(dǎo)。在有髓鞘的神經(jīng)元中，神經(jīng)沖動(dòng)沿著軸突的長(zhǎng)度從一個(gè)無(wú)髓鞘片段跳躍至另一個(gè)無(wú)髓鞘片段。正如在大的外周神經(jīng)和大腦白質(zhì)中的情況，髓鞘以及組織中神經(jīng)元細(xì)胞體的缺乏使得有些神經(jīng)組織顯白色。被稱(chēng)為星形細(xì)胞的另一種神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞參與結(jié)構(gòu)完整性、神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)以及維持神經(jīng)組織微環(huán)境。星形細(xì)胞相互之間通過(guò)縫隙連接直接溝通并能通過(guò)調(diào)節(jié)局部環(huán)境影響其所負(fù)責(zé)的神經(jīng)元的存活。室管膜細(xì)胞將脊髓和腦室排成一列并分泌腦脊髓液。另一種被稱(chēng)為小膠質(zhì)細(xì)胞的小膠質(zhì)細(xì)胞是參與成熟的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中炎癥反應(yīng)和修復(fù)的噬菌細(xì)胞。
神經(jīng)組織是能夠接收和傳輸電沖動(dòng)的可激發(fā)組織。其中心細(xì)胞類(lèi)型被稱(chēng)為神經(jīng)元。神經(jīng)元通常具有細(xì)胞體、接收輸入信號(hào)的樹(shù)突以及傳輸電位的軸突。
神經(jīng)元可以分成感官神經(jīng)元、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元、分泌神經(jīng)元或聯(lián)合神經(jīng)元。通常按照傳導(dǎo)速度、直徑以及是否存在稱(chēng)為髓鞘的專(zhuān)門(mén)化脂蛋白絕緣層對(duì)其進(jìn)行分類(lèi)。A類(lèi)纖維是具有髓鞘的并能以12-120米/秒的速度傳導(dǎo)沖動(dòng)。B類(lèi)也是具有髓鞘的纖維，但它們只能以3-5米/秒的速度傳輸沖動(dòng)。C類(lèi)纖維是無(wú)髓鞘的，其直徑小，并且傳輸速度很低(2.5米/秒)。A類(lèi)纖維的一個(gè)例子是支配腓腸肌活動(dòng)的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元。B類(lèi)纖維的一個(gè)例子是自主節(jié)前輸出神經(jīng)元，低速C類(lèi)神經(jīng)元的一個(gè)例子是攜帶彌散疼痛感信息的感官神經(jīng)元。
感官神經(jīng)元適應(yīng)于從環(huán)境中探測(cè)某些類(lèi)型的信息。這包括感知象壓力或拉力的機(jī)械性刺激感受器、溫度感受器、視網(wǎng)膜中的光感受器、以及諸如味蕾或用于嗅覺(jué)的化學(xué)感受器。聯(lián)合神經(jīng)元或中間神經(jīng)元通常存在于脊髓和大腦中，它們將感官傳入神經(jīng)元與傳出運(yùn)動(dòng)或分泌神經(jīng)元相連。
神經(jīng)元通過(guò)被稱(chēng)為突觸的結(jié)構(gòu)相互溝通。軸突末端是含有大量小囊泡的突觸小體。這些小囊泡中充滿了被稱(chēng)為神經(jīng)遞質(zhì)的化學(xué)物質(zhì)。乙酰膽堿是突觸處最常見(jiàn)的神經(jīng)遞質(zhì)，而取決于神經(jīng)元，可以使用如去甲腎上腺素、血清素和GABA等其他化學(xué)物質(zhì)。當(dāng)神經(jīng)沖動(dòng)沿軸突傳輸并到達(dá)突觸小體時(shí)，囊泡與神經(jīng)元細(xì)胞膜融合并釋放神經(jīng)遞質(zhì)。隨后所述化學(xué)物質(zhì)經(jīng)狹窄的突觸間隙擴(kuò)散到達(dá)接收神經(jīng)元突觸后膜上的該化學(xué)物質(zhì)特異的受體。
神經(jīng)遞質(zhì)與受體的相互作用引起膜電位的改變，這可以引發(fā)新的突觸后神經(jīng)元沖動(dòng)。存在于突觸中的乙酰膽堿酯酶降解乙酰膽堿并終止刺激。其他神經(jīng)遞質(zhì)或被降解或由突觸前神經(jīng)元回收以終止刺激。
在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，多個(gè)神經(jīng)元可能匯聚于單一的神經(jīng)元上。當(dāng)每個(gè)突觸前神經(jīng)元將神經(jīng)遞質(zhì)釋放到與突觸后神經(jīng)元組成的突觸中時(shí)，產(chǎn)生綜合并疊加的局部膜電位。這些傳入的信號(hào)可能是抑制性的或刺激性的。如果最終疊加的膜電位達(dá)到該神經(jīng)元的最小閥值，會(huì)引發(fā)運(yùn)動(dòng)電位。
運(yùn)動(dòng)電位通過(guò)跳躍式傳導(dǎo)沿一個(gè)方向離開(kāi)細(xì)胞體。最快的神經(jīng)元是包裹在髓鞘中的，髓鞘由被稱(chēng)為郎飛結(jié)的裸露的神經(jīng)元細(xì)胞膜節(jié)點(diǎn)分隔成不連續(xù)的片段。在跳躍式傳導(dǎo)中，電位在節(jié)點(diǎn)之間跳躍，從而降低了參與動(dòng)作電位傳導(dǎo)的膜面積并加快了傳導(dǎo)。
神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的非神經(jīng)元細(xì)胞被稱(chēng)為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。星形膠質(zhì)細(xì)胞是數(shù)量最多的膠質(zhì)細(xì)胞，它們?yōu)樯窠?jīng)元提供支持和營(yíng)養(yǎng)。小膠質(zhì)細(xì)胞是神經(jīng)組織特異的小噬菌細(xì)胞。將腦室與脊髓中央管排成一列并產(chǎn)生腦脊髓液的細(xì)胞被稱(chēng)為室管膜細(xì)胞。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞構(gòu)成多種神經(jīng)元髓鞘片段。在外周神經(jīng)系統(tǒng)中，髓鞘的每個(gè)片段是由單個(gè)施萬(wàn)細(xì)胞構(gòu)成的。
中樞神經(jīng)系統(tǒng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)由腦和脊髓組成。除了顱骨和椎骨所提供的保護(hù)之外，腦脊膜(硬腦脊膜、蛛網(wǎng)膜和軟腦膜)保護(hù)并滋養(yǎng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)。在蛛網(wǎng)膜下空間、脊柱中央管以及腦室中發(fā)現(xiàn)了腦脊液。軟腦膜是最內(nèi)部的層并與神經(jīng)組織粘連。蛛網(wǎng)膜層位于軟腦膜和硬腦脊膜之間。顱骨下就是強(qiáng)韌的纖維狀硬腦脊膜。
腦可以分為前腦、中腦和腦干三個(gè)基本區(qū)域。前腦包括丘腦、下丘腦、基底神經(jīng)節(jié)和大腦。大腦負(fù)責(zé)意識(shí)思維、感覺(jué)的詮釋、所有主動(dòng)的運(yùn)動(dòng)、智能以及情緒。
大腦組織可以分為結(jié)構(gòu)區(qū)和功能區(qū)。大腦表層盤(pán)繞成腦回(突起)和腦溝(凹槽)。皮層感官和運(yùn)動(dòng)區(qū)可以分別定位于中央后回和中央溝。感官區(qū)接收來(lái)自身體對(duì)側(cè)經(jīng)丘腦處理后投射的感官信息。身體上具有更多感官神經(jīng)末梢的部位對(duì)應(yīng)于更多的皮層感官區(qū)。運(yùn)動(dòng)區(qū)控制對(duì)側(cè)軀干的主動(dòng)肌肉運(yùn)動(dòng)，但聯(lián)合區(qū)對(duì)運(yùn)動(dòng)的啟動(dòng)具有重要作用。
大腦是腦的最大部分并被分為具有幾個(gè)腦葉的左右兩個(gè)半球。前葉包含運(yùn)動(dòng)區(qū)、Broca語(yǔ)言區(qū)、聯(lián)合區(qū)，并在智能和行為中發(fā)揮功能。頂葉包括感官區(qū)并在感覺(jué)和聽(tīng)覺(jué)中發(fā)揮功能。主要的視覺(jué)聯(lián)合區(qū)位于枕葉，而顳葉包含聽(tīng)覺(jué)聯(lián)合、嗅覺(jué)幾記憶存儲(chǔ)區(qū)。
丘腦位于大腦皮層和腦干之間。除嗅覺(jué)感知之外的所有感官輸入在投射到腦的其他部位之前都在此進(jìn)行處理。下丘腦位于丘腦下部并負(fù)責(zé)處理內(nèi)部刺激及維持內(nèi)環(huán)境。這里不斷進(jìn)行著對(duì)血壓、溫度、心率、呼吸、水代謝、滲透壓、饑餓以及神經(jīng)內(nèi)分泌活性的無(wú)意識(shí)控制。從垂體后葉釋放后葉催產(chǎn)素和ADH的神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞的核位于下丘腦中。
基底神經(jīng)節(jié)(尾狀核、蒼白球、黑質(zhì)、丘腦底核、紅核)是嵌入大腦每個(gè)半球內(nèi)的神經(jīng)元組。它們參與復(fù)雜的運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)、信息處理及無(wú)意識(shí)的全部意向性運(yùn)動(dòng)。
腦干包括延髓和腦橋。腦干包含對(duì)呼吸、心臟及血管收縮反射進(jìn)行調(diào)節(jié)的重要的功能區(qū)和中繼中樞。腦橋包含參與呼吸調(diào)控的呼吸調(diào)節(jié)中樞。
小腦位于腦干上方并使用在其他部位處理的關(guān)于身體位置、運(yùn)動(dòng)、姿勢(shì)和平衡的信息。運(yùn)動(dòng)不是在小腦中啟動(dòng)的，但其對(duì)于協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng)是必需的。
外周神經(jīng)系統(tǒng)外周神經(jīng)系統(tǒng)包括位于腦和脊髓之外的神經(jīng)、神經(jīng)結(jié)、脊神經(jīng)和顱神經(jīng)。12條顱神經(jīng)起始于位于腦干中的核并攜帶控制諸如嗅覺(jué)、視覺(jué)、唾液分泌、心率和膚覺(jué)等各種自主功能的沖動(dòng)通往特定位置。顱神經(jīng)經(jīng)常是混合型的，其包含感官和運(yùn)動(dòng)組分，但它們可以只具有運(yùn)動(dòng)或感官纖維。下表列舉了顱神經(jīng)及其功能。
表1 顱神經(jīng)

外周神經(jīng)系統(tǒng)的感官部分從各種感受器接收輸入信號(hào)，對(duì)其進(jìn)行處理并發(fā)送給中樞神經(jīng)系統(tǒng)。感官輸入可以如本體感受(感知關(guān)節(jié)和肌肉的位置)中來(lái)自內(nèi)部來(lái)源或如皮膚對(duì)壓力或熱的感受中來(lái)自外部來(lái)源。分布有特定脊神經(jīng)的皮膚區(qū)域被稱(chēng)為皮區(qū)。傳入纖維收集感官輸入信號(hào)并上傳給脊髓，在丘腦中匯聚，并最終結(jié)束于大腦的感官皮層。具有更多感官感受器的區(qū)域(例如指尖和嘴唇)對(duì)應(yīng)于腦部感官皮層上更大的區(qū)域。攜帶本體感受信息的纖維也散布于小腦。幾乎所有的感官系統(tǒng)向丘腦的各個(gè)部分傳輸沖動(dòng)。大腦皮層參與有意識(shí)的感知以及對(duì)感官刺激的詮釋。
經(jīng)自主的軀體傳出系統(tǒng)發(fā)生通往肌肉和腺體的運(yùn)動(dòng)輸入。中樞神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)關(guān)節(jié)、肌腱的神經(jīng)支配經(jīng)軀體傳出系統(tǒng)傳輸。有些肌肉反應(yīng)通過(guò)脊髓反射進(jìn)行。這樣的例子是當(dāng)手指接觸熱的爐子時(shí)所看到的抽回反應(yīng)。將手指移開(kāi)的動(dòng)作經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單的脊髓反射發(fā)生，這遠(yuǎn)在疼痛感到達(dá)腦部之前。顯而易見(jiàn)地，這是一種避免進(jìn)一步受傷的保護(hù)機(jī)制。通往腺體和平滑肌的運(yùn)動(dòng)輸入通常經(jīng)自主系統(tǒng)發(fā)生。
大部分器官?gòu)淖灾魃窠?jīng)系統(tǒng)的兩個(gè)分支上接收輸入。在某個(gè)器官或組織中，一個(gè)分支通常是刺激性的，而另一個(gè)分支是抑制性的。自主系統(tǒng)的交感神經(jīng)分支發(fā)揮作用以使軀體對(duì)生理應(yīng)激反應(yīng)有所準(zhǔn)備。交感神經(jīng)分支的刺激就象是踩油門(mén)，作為響應(yīng)，軀體做好了奔跑或戰(zhàn)斗的準(zhǔn)備。觀察到諸如心率加快、氣管擴(kuò)張以及調(diào)動(dòng)糖原儲(chǔ)備向葡萄糖轉(zhuǎn)化等作用。交感神起始于第1節(jié)胸椎到第4節(jié)腰椎之間。它們具有短的神經(jīng)節(jié)前神經(jīng)元，該神經(jīng)元結(jié)束于沿脊柱分布的側(cè)神經(jīng)節(jié)之一。乙酰膽堿是具有延伸至目標(biāo)組織的長(zhǎng)神經(jīng)節(jié)后神經(jīng)元的突觸處的神經(jīng)遞質(zhì)，在該組織中在大部分交感神經(jīng)末梢釋放去甲腎上腺素。有些交感神經(jīng)節(jié)后神經(jīng)元(如支配汗腺或骨骼肌脈管系統(tǒng)的)釋放乙酰膽堿。
副交感神經(jīng)分支經(jīng)起始于中樞神經(jīng)系統(tǒng)顱骨和骶骨區(qū)域的神經(jīng)元發(fā)揮作用以抵消交感分支的作用。例如，副交感神經(jīng)刺激引起氣管收縮及心率降低。它調(diào)節(jié)諸如消化、排尿及勃起等靜態(tài)活動(dòng)。長(zhǎng)的神經(jīng)節(jié)前神經(jīng)元在接近目標(biāo)器官的突觸處釋放乙酰膽堿。短的神經(jīng)節(jié)后神經(jīng)元在效應(yīng)組織上也釋放乙酰膽堿。
通過(guò)髓鞘生成細(xì)胞的受損神經(jīng)再生在本發(fā)明的一個(gè)方面，為了實(shí)現(xiàn)神經(jīng)再生，必須有兩個(gè)前提。首先，再生因子生成細(xì)胞以及從治療中獲益的神經(jīng)細(xì)胞必須是具有生存能力的。第二是必須發(fā)生神經(jīng)元的髓鞘形成。在這一點(diǎn)上，可以使用不同的細(xì)胞類(lèi)型以實(shí)現(xiàn)這一表型。例如，細(xì)胞生存促進(jìn)細(xì)胞和髓鞘生成細(xì)胞的混合物可以共同用于神經(jīng)再生。
本發(fā)明尤其預(yù)期神經(jīng)細(xì)胞的髓鞘形成特別適用于通過(guò)受損神經(jīng)再生治療脊髓損傷。在這一點(diǎn)上，可以使用諸如其表達(dá)促使髓鞘形成的軸突神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1(Nrg1)(Michailov等，Science，304，700-703，4/30/2004)等蛋白質(zhì)，并使其單獨(dú)在諸如但不限于施萬(wàn)細(xì)胞的神經(jīng)細(xì)胞中表達(dá)，或與諸如包括但不限于成纖維細(xì)胞等能表達(dá)Nrg1的結(jié)締組織細(xì)胞等另一種相同或不同類(lèi)型細(xì)胞共同使用。
BMP對(duì)神經(jīng)再生和防止神經(jīng)退化的作用本發(fā)明的一個(gè)具體并舉例說(shuō)明的方面是針對(duì)功能蛋白質(zhì)BMP-2和BMP-9對(duì)大鼠中神經(jīng)損傷后再生的作用的確定。使用了36只Sprague-Dawley大鼠(體重400±10克)，將其分為3組(對(duì)照組、BMP-2組和BMP-9組)。這里需要說(shuō)明的是，BMP-2組或BMP-9組是指在對(duì)未經(jīng)注射的Sprague-Dawley大鼠實(shí)施神經(jīng)損傷后對(duì)其注射表達(dá)BMP-2或BMP-9的細(xì)胞的動(dòng)物組。使用止血鉗在坐骨神經(jīng)上制造了碾壓傷。對(duì)照組僅注射含未改變的成纖維細(xì)胞的緩沖液。BMP-2和BMP-9組注射含基因改造的成纖維細(xì)胞的緩沖液(BMP-2BMP-2分泌型成纖維細(xì)胞；BMP-9BMP-9分泌型成纖維細(xì)胞)。注射完成后，通過(guò)以下方法評(píng)估再生效果1)腓腸肌-比目魚(yú)肌處所記錄的坐骨神經(jīng)運(yùn)動(dòng)原傳導(dǎo)研究，以及2)通過(guò)蘇木素-伊紅及改進(jìn)的三色染色對(duì)坐骨神經(jīng)的組織學(xué)研究。
神經(jīng)傳導(dǎo)研究表明，在一周時(shí)，BMP-2和BMP-9組中的潛伏期(latency)與對(duì)照組相比明顯縮短，并隨后在4和6周中BMP-9組與其他組相比表現(xiàn)出更大的振幅(p＜0.05)。在第8周，所有組之間沒(méi)有明顯的潛伏期差異，但BMP-9組中的振幅更大。
在組織學(xué)研究中，第2周之前所有組都表現(xiàn)出嚴(yán)重的退化(表現(xiàn)為具有炎性應(yīng)答、軸突丟失和空泡化改變)。對(duì)照組中的退化在第4和8周中得以延續(xù)，但在BMP-2組中，炎癥反應(yīng)和空泡化改變的程度明顯降低，其中只有半數(shù)表現(xiàn)出這些現(xiàn)象。BMP-9組中，這些改變進(jìn)一步降低，只有三分之一表現(xiàn)出軸突丟失和空泡化改變，并且炎癥反應(yīng)非常溫和。在這些大鼠中，這些功能蛋白質(zhì)對(duì)碾壓傷后的神經(jīng)再生具有顯著作用。這些結(jié)果顯示了包括外周神經(jīng)損傷在內(nèi)的神經(jīng)損傷后的神經(jīng)再生。
TGF-β、活化素和BMP是參與發(fā)育過(guò)程中細(xì)胞分化、生長(zhǎng)和器官形成的蛋白質(zhì)。BMP與生長(zhǎng)/分化因子(GDF)、成骨蛋白(OP)以及副中腎管抑制素/抗副中腎管激素(MIS/AMH)都是TGF-β超家族的成員(Ebara和Nakayama所著《脊柱》(Spine)，2002，16SS10-S15)。歷史上1965年Urist觀察到在嚙齒動(dòng)物和兔子的肌肉中插入去礦化的骨基質(zhì)后胚胎骨化和其他類(lèi)似于軟骨內(nèi)骨化的過(guò)程(Urist MR，《骨，通過(guò)自我誘導(dǎo)形成》(Bone，formation by autoinduction)，Science，1965，150(698)893-899)。植入后，間葉細(xì)胞通過(guò)化學(xué)趨化遷移到所插入的骨組織，然后發(fā)生有絲分裂和縮合。隨后，源于間葉細(xì)胞的成軟骨細(xì)胞分泌有助于軟骨模板形成的細(xì)胞外基質(zhì)。這一細(xì)胞外基質(zhì)通過(guò)造血細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞血管化。開(kāi)始局部出現(xiàn)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞并且被吸收的軟骨轉(zhuǎn)化成骨組織。21天后形成具有骨髓核的小骨(Wang等，Proc Nat Acad Sci USA，1988，859484-9488)。與從去礦化骨基質(zhì)開(kāi)始的變化過(guò)程相關(guān)的組分被描述為骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)。
1988年，Wang等(Wang等，Proc Nat Acad Sci USA，1988，859484-9488)從牛骨中分離出了分子量分別為16kDa、18kDa和30kDa的3種多肽。稍后，Wozney等(Woozney，Mol Rep Dev，1992，32160-167)使用這些多肽作為探針鑒定了人RNA和相應(yīng)的DNA。隨后的研究表明，存在著至少16種內(nèi)生的BMP(Wozney和Rosen，Clin Orthop，1998，34626-37)。
除了BMP-1(成骨膠原C-蛋白酶)，它們都是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β基因超家族的成員(Wozney和Rosen，Clin Orthop，1998，34626-37)。在結(jié)構(gòu)上，BMP以巨大的前體形式產(chǎn)生，該前體由15-25個(gè)氨基酸的信號(hào)肽、50-375個(gè)氨基酸的前域和100-125個(gè)氨基酸的成熟羧基末端構(gòu)成。后者具有相當(dāng)保守的7個(gè)半胱氨酸殘基，它們?cè)隰然┒藚^(qū)域通過(guò)蛋白水解處理與前體分離后使肽發(fā)生二聚化(Croteau等，1999；22686-695)。每個(gè)具有活性的成熟的BMP以由相同單體構(gòu)成的二硫鍵相連的同源二聚體形式或以由兩種不同類(lèi)型單體構(gòu)成的二硫鍵相連的異源二聚體形式存在(Sampath等，J Biol Chem，1990，26513198-13250)。有意思的是，該蛋白質(zhì)的二聚化與其活性相關(guān)，例如BMP2和BMP7的異源二聚體已經(jīng)證明是比相同單體所構(gòu)成的同源二聚體更強(qiáng)的成形素(Kawabata等，Cytokine Growth Factor Rev，1998，949-61；Sampath等，J Biol Chem，1990，26513198-13250)。
為了評(píng)估BMP的生物學(xué)活性，需要了解細(xì)胞內(nèi)BMP基因表達(dá)與BMP二聚化機(jī)制。雖然對(duì)BMP的基因表達(dá)所知不多，已知的是其可能受到堿性螺旋-環(huán)-螺旋(bHLH)蛋白的調(diào)控(Ebara等，Biochem Biophys Res Commun，1997，240136-141)。bHLH蛋白由3個(gè)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，兩端的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域起正向轉(zhuǎn)錄激活因子的作用，而中心結(jié)構(gòu)域發(fā)揮陰性調(diào)控子的作用。在這些結(jié)構(gòu)域中，E單元(E-box，介于246-265個(gè)堿基對(duì)的DNA序列)可以被USF轉(zhuǎn)錄因子識(shí)別并在調(diào)節(jié)小鼠中BMP表達(dá)中具有重要作用。BMP也可能參與細(xì)胞死亡途徑的調(diào)控。
不僅在轉(zhuǎn)錄水平上，BMP的生物學(xué)活性在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)上受到嚴(yán)格調(diào)控，甚至在細(xì)胞外受到調(diào)控。目前認(rèn)為在細(xì)胞外作為抑制性蛋白的BMP受體易與BMP作用并對(duì)提高的BMP活性產(chǎn)生應(yīng)答，這可以引起最終導(dǎo)致其調(diào)控的陰性反饋信號(hào)產(chǎn)生的增強(qiáng)(Ebara和Nakayama所著《脊柱》(Spine)，2002，16SS10-S15)。在細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞受到信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和抑制性Smad蛋白的調(diào)控，這意味著B(niǎo)MP能夠上調(diào)抑制性Smad蛋白的表達(dá)(Ebara和Nakayama所著《脊柱》(Spine)，2002，16SS10-S15)。
在細(xì)胞外水平上，細(xì)胞受抑制BMP與細(xì)胞受體結(jié)合的諸如頭蛋白和軟骨素的BMP結(jié)合蛋白調(diào)控。扭型原腸胚形成(Tsg)基因增強(qiáng)軟骨素的功能(Ebara和Nakayama所著《脊柱》(Spine)，2002，16SS10-S15)。促濾泡素抑制素(follisatin)與OP-1/BMP-7和BMP-4蛋白結(jié)合并抑制BMP(Matzuk等，Nature，1995，374360-363)。
BMP受體BMP與兩種不同類(lèi)型(I類(lèi)和II類(lèi))的絲氨酸-蘇氨酸激酶受體結(jié)合。在哺乳動(dòng)物中已經(jīng)確證了兩種I類(lèi)受體和一種II類(lèi)受體(Kawabata等，Cytokine Growth Factor Rev，1998，949-61)。在哺乳動(dòng)物中，I類(lèi)受體具有異構(gòu)體A和B，并且雖然其結(jié)構(gòu)類(lèi)似，它們表現(xiàn)出不同的激活Smad蛋白的行為(Imamura等，Nature，1997，389549-551)。為了進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，I類(lèi)和II類(lèi)受體需要形成復(fù)合物。I類(lèi)受體被II類(lèi)受體激活并且信號(hào)由I類(lèi)受體傳導(dǎo)入細(xì)胞。該信號(hào)在細(xì)胞內(nèi)由Smad蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)。Smad1、Smad5和Smad8具有相同結(jié)構(gòu)并從BMP傳導(dǎo)信號(hào)。Smad2和Smad3從TGF-β和活化素傳導(dǎo)信號(hào)。這些Smad蛋白形成異源復(fù)合物并轉(zhuǎn)移入細(xì)胞核以激活各種基因。Smad、Tob、Ski和Smurf1參與這些基因的負(fù)調(diào)控。其中，Smad6抑制BMP的轉(zhuǎn)錄并也在BMP信號(hào)途徑的負(fù)反饋中發(fā)揮作用(Bai等，J Biol Chem，2000，2758267-8270)。Tob是抗增殖蛋白家族成員并參與BMP/Smad信號(hào)負(fù)調(diào)控(Yoshida等，Cell，2000，1031085-1097)。致癌蛋白Ski抑制BMP信號(hào)傳導(dǎo)和BMP應(yīng)答基因的表達(dá)，并通過(guò)直接與Smad復(fù)合物反應(yīng)抑制BMP活化，這是BMP的特有性質(zhì)(Wang等，Proc Natl AcadSci USA，2000，9714394-14399)。Smurf1屬于泛素連接酶的Hect家族并通過(guò)選擇性結(jié)合受受體調(diào)控的Smad抑制BMP的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(Zuh等，Nature，1999，400687-693)。
對(duì)于BMP家族蛋白質(zhì)功能的進(jìn)一步研究正在進(jìn)行，看來(lái)其在胚胎發(fā)育階段中參與包括神經(jīng)系統(tǒng)(Farkas等，J Neurosci，1999，92227-235)、眼睛(Mohans等，InvestOphthalmol Vis Sci，1998，392626-2636)、肺、腎、前列腺、生殖器官和毛囊在內(nèi)的基本軀體形成的規(guī)劃。例如，已經(jīng)報(bào)道了手指以及手指間的空間的形成是由于由BMP引起的手指間細(xì)胞的凋亡(Zou和Niswander，Science，1996，272738)。
BMP參與胚胎發(fā)育過(guò)程中骨骼系統(tǒng)的形成、分化與復(fù)原。在出生后的骨骼系統(tǒng)中，BMP存在于腦基質(zhì)膠原、骨膜細(xì)胞和充滿血形成元件的基質(zhì)間葉細(xì)胞中。從骨肉瘤和軟骨肉瘤中也已分離到了BMP(Lianjia和Yan，Clin Orthop，1990，257249-256)。骨折后，BMP擴(kuò)散入所吸收的骨基質(zhì)，激活骨祖細(xì)胞并由此產(chǎn)生更多BMP。BMP的分布取決于治療時(shí)間和骨折部位并可能由于交互反應(yīng)而進(jìn)一步復(fù)雜化。在各種其他組織中也已進(jìn)行了BMP研究以研究其保護(hù)或再生作用，并已證明其對(duì)心肌缺血和再灌注中的心肌功能具有保護(hù)作用(Lefer等，J Mol Cell Cardiol，1992，24585-593)，在引起大腦缺血的實(shí)驗(yàn)中腹腔內(nèi)注射BMP后對(duì)延伸的神經(jīng)系統(tǒng)具有保護(hù)作用，并對(duì)受損腎臟具有再生作用(Ripamonti和Duneas，Plast Reconstr Surg，1998，101227-239)。
本申請(qǐng)說(shuō)明，參與外周神經(jīng)分化的BMP與未治療組的康復(fù)過(guò)程相比有利于受損神經(jīng)的復(fù)原。
體內(nèi)(in vivo)及先體外后體內(nèi)(ex vivo)方法本發(fā)明不限于使用先體外后體內(nèi)方法將基因運(yùn)送到所需部位。也設(shè)計(jì)了體內(nèi)方法。也需要說(shuō)明的是，可以使用任何載體，只要其能在注射部位內(nèi)表達(dá)所需基因。所述載體可以是質(zhì)粒或任何數(shù)量的病毒載體，只要其有效地應(yīng)用于表達(dá)所需基因。
本發(fā)明不限于這里所描述的具體實(shí)施方式
的范圍。實(shí)際上，除了這里所描述的之外，對(duì)本發(fā)明的各種改進(jìn)對(duì)于精通本領(lǐng)域的人員而言在先前的描述和附圖基礎(chǔ)上是顯而易見(jiàn)的。這樣的改進(jìn)沒(méi)有超越所附屬的權(quán)利要求書(shū)的范圍。以下所提供的實(shí)施例是為了對(duì)本發(fā)明進(jìn)行舉例說(shuō)明，而不是對(duì)本發(fā)明加以限制。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1-材料與方法材料本研究中使用了體重為400±10克的成熟的Sprague-Dawley大鼠(16-18周齡)。使用成熟大鼠是因?yàn)榕c處在生長(zhǎng)階段的大鼠相比更易于觀察到由于神經(jīng)再生和生理變化所引起的改變。
方法將功能性蛋白BMP注射入外周神經(jīng)在技術(shù)上是有難度的。因此，在本研究中將產(chǎn)生BMP2和BMP9的大鼠成纖維細(xì)胞直接轉(zhuǎn)染外周神經(jīng)使得BMP2和BMP9得以局部分泌。將總計(jì)36只大鼠分為3組。每組由12只具有受損神經(jīng)的大鼠組成。第一組是對(duì)照組，其中大鼠的受損神經(jīng)用沒(méi)有轉(zhuǎn)基因的未經(jīng)改造的成纖維細(xì)胞處理。第二組(BMP2組)由神經(jīng)損傷的大鼠構(gòu)成，其用BMP-2轉(zhuǎn)基因的經(jīng)過(guò)基因改造的成纖維細(xì)胞處理，第三組(BMP9組)由用BMP-9轉(zhuǎn)基因的經(jīng)過(guò)基因改造的成纖維細(xì)胞處理的具有神經(jīng)損傷的大鼠組成。經(jīng)處理2、4、8周后，每組宰殺2只大鼠并從兩肢收集坐骨神經(jīng)進(jìn)行組織的組織學(xué)檢測(cè)。通過(guò)設(shè)置實(shí)驗(yàn)前的初始基線值并在手術(shù)后8周內(nèi)隔周檢測(cè)神經(jīng)傳導(dǎo)對(duì)肢體的坐骨神經(jīng)也進(jìn)行了神經(jīng)運(yùn)動(dòng)原傳導(dǎo)研究。
神經(jīng)損傷通過(guò)以300毫克/千克體重的濃度腹腔注射4％的水合氯醛對(duì)大白鼠進(jìn)行麻醉。在將其以俯臥體位固定之前，去除尾端和右肢股骨區(qū)域的毛發(fā)。對(duì)股骨區(qū)用碘酒(potadine)和70％乙醇消毒后，在股骨區(qū)中央部位周?chē)s1-1.5厘米表皮垂直切開(kāi)并將股二頭肌外拉以暴露坐骨神經(jīng)。按照DeKoning等(De Koning等，J Neurol Sci，1986，74237-246)所述的方法，通過(guò)將股與全膝關(guān)節(jié)之間的表皮切開(kāi)長(zhǎng)度2-2.5厘米的切口并剝離臀部和全膝關(guān)節(jié)肌肉以暴露坐骨神經(jīng)，隨后通過(guò)用止血鉗(Crile，15厘米)碾壓30秒對(duì)坐股突出處暴露的神經(jīng)產(chǎn)生損傷從而造成神經(jīng)損傷。止血鉗可以設(shè)定3種不同水平的握力強(qiáng)度，并對(duì)固定區(qū)域的神經(jīng)損傷采用相同的握力水平，在距止血鉗末端5厘米處作黑線標(biāo)記以使得用最強(qiáng)握力水平在固定區(qū)域產(chǎn)生碾壓傷。取下止血鉗后，第一組對(duì)照組使用超細(xì)針頭(30規(guī)格)在距神經(jīng)損傷處2毫米內(nèi)注射含0.05毫升未經(jīng)改造的成纖維細(xì)胞(單位5×105細(xì)胞/50微升)的緩沖液。第2和第3個(gè)實(shí)驗(yàn)組在對(duì)受傷區(qū)域進(jìn)行縫合消毒之前通過(guò)相同的方法分別注射能分泌BMP2和BMP9的基因改造的成纖維細(xì)胞。
神經(jīng)傳導(dǎo)檢測(cè)對(duì)大鼠用4％水合氯醛麻醉后進(jìn)行神經(jīng)傳導(dǎo)檢測(cè)?；顒?dòng)記錄電極置于腓腸肌以刺激坐骨切跡，對(duì)照電極置于足部，接地電極置于刺激電極和記錄電極之間。塊狀電極用作記錄電極并通過(guò)使用針狀電極將接地電極置于皮下。使用KeyPoint(Dantec，丹麥)進(jìn)行神經(jīng)傳導(dǎo)檢測(cè)。研究中的頻率、記錄打印速度和記錄靈敏度分別設(shè)置為2-10000Hz、2毫秒/格、5毫伏/格。每?jī)芍苓M(jìn)行神經(jīng)傳導(dǎo)檢測(cè)。檢測(cè)在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)進(jìn)行，并隨后在2、4、6、8周后進(jìn)行。檢測(cè)過(guò)程中的潛伏期和振幅通過(guò)基線和負(fù)電極點(diǎn)之間的振幅測(cè)定。每組選取5只大鼠進(jìn)行神經(jīng)傳導(dǎo)研究并每只獲得10個(gè)測(cè)量數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)室與大鼠的溫度分別保持在25℃和30℃。
病理學(xué)/組織學(xué)組織檢測(cè)通過(guò)檢查實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)其受傷前的正常神經(jīng)對(duì)大鼠神經(jīng)組織進(jìn)行了檢測(cè)以觀察其受傷后的自然恢復(fù)。在未經(jīng)轉(zhuǎn)基因操作的細(xì)胞處理的情況下，使用了4只大鼠(8條神經(jīng))以觀察神經(jīng)再生。2、4、8周后從每組隨機(jī)選取2只大鼠(4條神經(jīng))并對(duì)其組織進(jìn)行檢測(cè)。為了進(jìn)行組織檢測(cè)，從經(jīng)麻醉大鼠的碾壓傷部位剝離約2厘米的坐骨神經(jīng)。經(jīng)甲醛緩沖溶液固定并隨后用蘇木素-伊紅(H&E)及改進(jìn)的三色(MT)染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察神經(jīng)組織的變化。
數(shù)據(jù)分析通過(guò)與參照組比較，對(duì)神經(jīng)損傷2、4、6、8周后來(lái)自每組的復(fù)合肌動(dòng)作電位最大振幅及潛伏期的變化進(jìn)行了分析，并采用SPSS-PC程序進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。每組間的比較通過(guò)ANOVA和t-校驗(yàn)進(jìn)行并將顯著度水平設(shè)為0.05。受傷及再生程度由病理學(xué)家對(duì)組織學(xué)數(shù)據(jù)的解讀加以確定。
實(shí)施例II-重量變化大鼠的最初體重位于400±10克的區(qū)間內(nèi)。表2中顯示了其隨后的重量變化。在第2周沒(méi)有觀察到每組之間的差異，但在第4和第6周時(shí)，BMP9組與其他組相比表現(xiàn)出一些差異(p＜0.05)。在第8周，組之間沒(méi)有具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異(p＞0.05)(表2)。
表2 實(shí)驗(yàn)組中的體重變化

實(shí)施例III-潛伏期變化實(shí)驗(yàn)前由每組隨機(jī)測(cè)量的基線數(shù)據(jù)顯示潛伏期為1.44±0.11毫秒。損傷后的潛伏期顯示，在第2和第4周，對(duì)照組、BMP2組和BMP9組之間具有差異，但該差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)。在第6周，BMP2和BMP9組的潛伏期與對(duì)照組相比明顯縮短(p＜0.05)。然而，在第8周，這三組之間的潛伏期沒(méi)有差異(表3)。
表3 組中的潛伏期變化

實(shí)施例IV-振幅變化實(shí)驗(yàn)前由每組隨機(jī)測(cè)量的基線數(shù)據(jù)顯示振幅為23.9±4.3毫伏。受傷后第2周和第4周，BMP9組的振幅與對(duì)照組相比顯著提高(p＜0.05)。在第6周，BMP2組及BMP9組與對(duì)照組相比顯示出明顯差異(p＜0.05)，并且在第8周表現(xiàn)出按照BMP9、BMP2和對(duì)照組順序排列的顯著差異(p＜0.05)(表4)。
表4 振幅變化

實(shí)施例V-組織學(xué)及病理學(xué)觀察從每組中隨機(jī)選取的大鼠的組織學(xué)神經(jīng)組織檢測(cè)表現(xiàn)出與圖1到圖10所示神經(jīng)生理學(xué)檢測(cè)結(jié)果相似的變化。由于神經(jīng)組織的軸突沒(méi)有再生以及留有炎癥反應(yīng)，對(duì)照組表現(xiàn)出最緩慢的恢復(fù)速度。用能夠分泌BMP2或BMP9的經(jīng)過(guò)基因改造的成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染的組與對(duì)照組相比在早期沒(méi)有表現(xiàn)出任何顯著的差異，所有組在第2周都表現(xiàn)出由神經(jīng)的碾壓傷所引起的嚴(yán)重病理學(xué)癥狀，諸如空泡化改變、炎癥單核細(xì)胞的滲透以及神經(jīng)外膜血管出血。對(duì)于對(duì)照組而言，這些癥狀在8周內(nèi)得以持續(xù)。然而對(duì)于BMP2組而言，在第4和第8周，炎癥反應(yīng)和空泡化改變程度明顯降低，并且只有半數(shù)表現(xiàn)出這些癥狀。對(duì)于BMP9組而言，在第4和第8周，這些效果更為明顯，只有三分之一表現(xiàn)出軸突丟失和空泡化改變，并進(jìn)一步表現(xiàn)出非常溫和的炎癥反應(yīng)。
這里所引用的參考文獻(xiàn)通過(guò)參考完整地組合在本申請(qǐng)書(shū)中。
精通本領(lǐng)域的人員通過(guò)使用常規(guī)的實(shí)驗(yàn)方法應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到或能夠確定這里所具體描述的本發(fā)明具體實(shí)施方式
的許多等價(jià)物。這樣的等價(jià)物確定地包含在權(quán)利要求書(shū)的范圍以內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種神經(jīng)再生的方法，其特征在于，所述方法包括a)產(chǎn)生包含以可操作方式與啟動(dòng)子相連的編碼蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子超家族成員之一的DNA序列的重組病毒或質(zhì)粒載體；b)用所述重組載體體外轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的細(xì)胞群體，形成所述培養(yǎng)細(xì)胞的群體；以及c)將所述轉(zhuǎn)染細(xì)胞移植到受損神經(jīng)周?chē)鷧^(qū)域，使得受損神經(jīng)周?chē)鷧^(qū)域內(nèi)所述DNA序列的表達(dá)引起神經(jīng)再生。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子是BMP。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述BMP是BMP-2和BMP-9。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞是結(jié)締組織細(xì)胞。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞是成纖維細(xì)胞。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞是神經(jīng)細(xì)胞。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述神經(jīng)是外周神經(jīng)。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述載體是病毒載體。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述載體是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺伴隨病毒載體、腺病毒載體、或皰疹病毒載體。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞群體是在移植前保存的。
11.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)染的細(xì)胞群體是在移植前在液氮中保存在10％DMSO中的。
12.一種神經(jīng)再生的方法，其特征在于，所述方法包括a)產(chǎn)生包含編碼髓鞘再生蛋白的DNA序列的重組病毒或質(zhì)粒載體；b)用所述重組載體體外轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的細(xì)胞群體，形成所述培養(yǎng)細(xì)胞的群體；以及c)將所述轉(zhuǎn)染細(xì)胞移植到受損神經(jīng)周?chē)鷧^(qū)域，使得受損神經(jīng)周?chē)鷧^(qū)域內(nèi)所述DNA序列的表達(dá)引起神經(jīng)再生。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞是結(jié)締組織細(xì)胞。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞是成纖維細(xì)胞。
15.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞是神經(jīng)細(xì)胞。
16.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞是神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。
17.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞是施萬(wàn)細(xì)胞。
18.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述蛋白是神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1。
19.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述神經(jīng)是外周神經(jīng)。
全文摘要
本申請(qǐng)描述了一種神經(jīng)再生的方法，其步驟包括產(chǎn)生包含以可操作方式與啟動(dòng)子相連的編碼蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子超家族成員之一的DNA序列的重組病毒或質(zhì)粒載體；用所述重組載體體外轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的細(xì)胞群體，形成所述培養(yǎng)細(xì)胞的群體；以及將所述轉(zhuǎn)染細(xì)胞移植到受損神經(jīng)周?chē)鷧^(qū)域，使得受損神經(jīng)周?chē)鷧^(qū)域內(nèi)所述DNA序列的表達(dá)引起神經(jīng)再生。
文檔編號(hào)C12N15/12GK101031645SQ200580026516
公開(kāi)日2007年9月5日 申請(qǐng)日期2005年6月23日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月23日
發(fā)明者金昌煥, 李寬熙 申請(qǐng)人:組織基因股份有限公司