專利名稱：胚胎干細胞的培養(yǎng)基和培養(yǎng)的制作方法
相關申請的交叉參考本申請要求2004年9月8日提交的美國臨時專利申請序列號60/608,040的優(yōu)先權。
關于聯(lián)邦政府資助研究或開發(fā)的聲明本發(fā)明是利用下述機構授予的美國政府資助下完成的NIH RR17721。美國政府對本發(fā)明享有一定權利。
背景技術：
干細胞被定義為能夠分化成許多其它分化細胞類型的細胞。胚胎干細胞是來自胚胎的干細胞，能夠分化成大多數(shù)，如果不是全部，成熟機體的分化細胞類型。干細胞被稱為是多能的，這是指它能夠分化成許多細胞類型。一類受到研究機構高度關注的多能干細胞是人胚胎干細胞，這里簡稱為人ES細胞，這是一種來自人胚胎來源的胚胎干細胞。人胚胎干細胞由于能夠在培養(yǎng)基中無限增殖并由此而能夠(至少原則上能夠)提供細胞和組織以替代缺陷或受損的人組織而受到極大科學關注。人胚胎干細胞培養(yǎng)物的存在有可能提供無限量的人細胞和組織以用于各種有助于人體健康的治療方案和研究計劃?？梢韵胂?，在未來，將能夠增殖人胚胎干細胞并使其定向分化成特定譜系以產生出于治療目的可移植入人體的分化的細胞或組織。人胚胎干細胞和可由它們衍生的分化細胞也是用于研究人類細胞和發(fā)育系統(tǒng)的有力科學工具。
已經(jīng)描述了產生和培養(yǎng)人胚胎干細胞的基礎技術?，F(xiàn)有技術的確有效，但一些目前用來培養(yǎng)人胚胎干細胞的方法有限制和缺點。一種限制意義特別重大。大多數(shù)現(xiàn)有人胚胎干細胞系在一定程度上或在其它程度上已經(jīng)直接暴露于小鼠細胞或暴露于其中已經(jīng)培養(yǎng)過小鼠細胞的培養(yǎng)基。發(fā)現(xiàn)來自現(xiàn)有細胞系的一些人ES細胞展示出人類細胞通常不產生的唾液酸殘基Neu5Gc，這一事實倍受關注。最初的產生和培養(yǎng)人胚胎干細胞的技術要使用小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)飼養(yǎng)細胞作為飼養(yǎng)層，在該飼養(yǎng)層上可培養(yǎng)人胚胎干細胞。成纖維細胞飼養(yǎng)層通過一些仍不十分清除的機制使得干細胞能夠保持在未分化狀態(tài)。隨后發(fā)現(xiàn)，如果使干細胞接觸“調理培養(yǎng)基(conditionedmedium)”也能獲得相同的現(xiàn)象。調理培養(yǎng)基是已經(jīng)培養(yǎng)過飼養(yǎng)細胞(如MEF)的干細胞培養(yǎng)基。無論飼養(yǎng)細胞是能賦予培養(yǎng)基某些因子還是能從培養(yǎng)基中除去某些因子，其結果都是調理培養(yǎng)基可用來培養(yǎng)干細胞使其不發(fā)生分化。任何一種培養(yǎng)條件，即人ES細胞直接在鼠飼養(yǎng)細胞上生長或使用調理培養(yǎng)基都涉及這樣的問題，即一種或多種試劑如病毒能從小鼠細胞傳遞到人ES細胞。如果培養(yǎng)人胚胎干細胞的一個目的是產生最終可植入人體的組織，就高度需要干細胞從未暴露于其它物種的細胞或者暴露于曾用來培養(yǎng)其它物種的細胞的培養(yǎng)基。因此，在長期培養(yǎng)人胚胎干細胞技術的持續(xù)發(fā)展中最感興趣的是找到能增殖和培養(yǎng)人胚胎干細胞但不含成纖維細胞飼養(yǎng)層的培養(yǎng)條件。
培養(yǎng)中的人胚胎干細胞的一個特有性狀是，如果條件不夠理想，這種細胞則有分化趨勢。當在培養(yǎng)時過分要求維持人ES細胞處于未分化狀態(tài)時則容易誘導人ES細胞分化。大多數(shù)培養(yǎng)條件將導致一定水平不希望的分化，尤其是在正在生長的ES細胞集落邊緣周圍。盡管培養(yǎng)ES細胞時可以有一定程度不希望的分化，但目的是定義能夠盡可能使培養(yǎng)物維持未分化即得到盡可能少的分化細胞的培養(yǎng)條件。我們認為，我們已經(jīng)采用特別嚴格的標準來定義將支持無限培養(yǎng)未分化的ES細胞培養(yǎng)物的條件。
一些培養(yǎng)基配方能夠在一段時間內使人ES細胞維持未分化狀態(tài)，但長期培養(yǎng)時將不能維持這種狀態(tài)。具體地說，我們定義來自最初的種子培養(yǎng)物的人ES細胞在培養(yǎng)容器上生長至細胞鋪滿該相同的培養(yǎng)容器為一個“傳代”。我們發(fā)現(xiàn)一些培養(yǎng)基配方允許培養(yǎng)人ES細胞一或兩個傳代不發(fā)生嚴重分化，但在隨后的傳代中細胞迅速分化。我們已經(jīng)開始相信，為得到確實能夠支持人ES細胞無限增殖而不分化且不含飼養(yǎng)細胞或調理培養(yǎng)基的培養(yǎng)基，培養(yǎng)基必需支持培養(yǎng)人ES細胞處于基本均勻且未分化狀態(tài)至少5代。培養(yǎng)物在培養(yǎng)期間維持相對同質和未分化并保留人ES細胞所有重要特征也是重要的。
可通過形態(tài)學特征非常容易地評價干細胞培養(yǎng)物的分化狀態(tài)。未分化的干細胞具有一個特征形態(tài)，即具有清晰細胞邊界的小且致密的細胞，通過在顯微鏡下檢測干細胞培養(yǎng)物可容易觀察到這種形態(tài)。相反，已經(jīng)分化的細胞看上去較大且更加散開，并具有不明顯的邊界。盡管一些分化的細胞可能會在未分化細胞集落邊緣出現(xiàn)(通常是這樣)，但最理想的干細胞培養(yǎng)物是這樣一種細胞培養(yǎng)物，它在培養(yǎng)容器中增殖，在似乎分化的培養(yǎng)物周圍僅具有最少量的細胞。根據(jù)經(jīng)驗可以在視覺上準確判斷人ES細胞培養(yǎng)物的分化狀況和健康狀況。用來追蹤ES細胞未分化狀態(tài)的生化標記是轉錄因子Oct4，它被認為是ES細胞未分化狀態(tài)最可靠的標記，并且是當未分化的細胞開始分化時最先失去的標記之一。
發(fā)明概述本發(fā)明可概述為一種不需要飼養(yǎng)細胞或調理培養(yǎng)基的培養(yǎng)人胚胎干細胞的方法，該方法包括在含有鹽、維生素、氨基酸、葡萄糖、成纖維細胞生長因子、γ氨基丁酸、2-哌啶酸(pipecholic acid)、鋰和轉化生長因子β的培養(yǎng)基中培養(yǎng)人胚胎干細胞的步驟，所述物質的含量都足以在多次傳代培養(yǎng)中維持干細胞處于未分化狀態(tài)。
本發(fā)明還涉及一種人胚胎干細胞的體外細胞培養(yǎng)物，該人胚胎干細胞在含有高水平成纖維細胞生長因子、γ氨基丁酸、2-哌啶酸、鋰和轉化生長因子β的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，因此干細胞在不需要成纖維細胞飼養(yǎng)細胞或調理培養(yǎng)基的情況下便可以未分化狀態(tài)無限期地培養(yǎng)。
本發(fā)明的一個目的是定義人胚胎干細胞的長期培養(yǎng)條件，該培養(yǎng)條件避免使用或暴露于動物細胞和動物蛋白，不論是飼養(yǎng)細胞還是用于調理要培養(yǎng)干細胞的培養(yǎng)基的其它動物細胞和動物蛋白。
本發(fā)明的另一個目的是定義用于人胚胎干細胞的培養(yǎng)條件，該培養(yǎng)條件盡可能地確定，同時盡可能維持培養(yǎng)中最大比例的細胞處于未分化狀態(tài)。
通過以下描述將了解本發(fā)明的其它目的、特征和優(yōu)點。
附圖簡述

圖1展示了由以下說明書描述的試驗工作獲得的數(shù)據(jù)，顯示了培養(yǎng)基組分減少了生長于其中的人ES細胞培養(yǎng)物中分化細胞的比例。
圖2是顯示了含有人基質蛋白的培養(yǎng)基使培養(yǎng)的人ES細胞不展示非人源唾液酸殘基的數(shù)據(jù)的圖示。
圖3是顯示了人干細胞培養(yǎng)物中高水平未分化細胞的數(shù)據(jù)的圖示。
圖4是顯示了這里所述的培養(yǎng)基使干細胞培養(yǎng)物健壯生長的數(shù)據(jù)的圖示。
發(fā)明詳述我們已經(jīng)鑒定了許多能夠使人胚胎干細胞以未分化狀態(tài)無限期地培養(yǎng)和強壯增殖且同時完全不需要飼養(yǎng)細胞和調理培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基。開發(fā)這些培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件能夠無需直接或間接接觸任何種類的動物細胞而在確定的和受控的條件下衍生和維持人ES細胞系。這些培養(yǎng)基已被證實能支持未分化的ES細胞增殖多代，至少5代，這是這些培養(yǎng)基將支持這種無限期地培養(yǎng)的有力證據(jù)。
用來培養(yǎng)和增殖人ES細胞的確定的(defined)人源化培養(yǎng)基通常包含鹽、維生素、葡萄糖源、礦物質和氨基酸。為補充培養(yǎng)基和提供支持細胞生長的條件，最初的干細胞培養(yǎng)基含有來自一種來源或另一種來源的血清。之前還報道加入成纖維細胞生長因子和替代血清添加物可在不需要血清的情況下培養(yǎng)人ES細胞。可通過商業(yè)獲得用于此目的的替代血清，或者替代血清可以是用蛋白質如血清白蛋白、維生素、礦物質、運鐵蛋白或運鐵蛋白替代品、以及胰島素或胰島素替代品配制的混合物。也可在這種替代血清組分中添加硒。這里優(yōu)選用確定的替代血清來代替培養(yǎng)人ES細胞的任何來源的血清，以便避免血清組成變化的問題以及使用盡可能確定的培養(yǎng)基。我們已經(jīng)定義了充分的培養(yǎng)基，這里提到的培養(yǎng)基的所有組分列于下面的表1，該表列出了被稱為TeSR1的我們的培養(yǎng)基的所有組分以及各成分的濃度。TeSR1培養(yǎng)基由添加了人血清白蛋白、維生素、抗氧化劑、痕量礦物質、特定脂類和克隆生長因子的DMEM/DF12基礎培養(yǎng)基構成。
為避免對之前認為是維持人ES細胞處于未分化狀態(tài)所必需的成纖維細胞飼養(yǎng)層的需要，這里報道將較高濃度的FGF(10-1000ng/ml)和GABA(γ氨基丁酸)、2-哌啶酸(PA)、鋰(LiCl)和轉化生長因子β(TGFβ)組合使用將能夠使培養(yǎng)基支持未分化的干細胞生長。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這些添加物的組合足以維持人ES細胞培養(yǎng)物無限期地處于未分化狀態(tài)而不需接觸飼養(yǎng)細胞或調理培養(yǎng)基。這些添加物被證實是足夠的。然而并不是每一種培養(yǎng)基配方都需要它們中的全部。通過選擇性刪除這些添加劑，可刪除這些組分中的一種或多種，產生仍將生長但培養(yǎng)物中未分化狀態(tài)的純度有損失的人ES細胞培養(yǎng)物。這種培養(yǎng)物可在許多代中保持或不保持穩(wěn)定。然而，顯然這種組合足以使各種培養(yǎng)基能支持在不含飼養(yǎng)細胞或調理培養(yǎng)基的情況下在無限次數(shù)的傳代中長期培養(yǎng)和增殖未分化的人ES細胞。
我們最初對這些生長因子進行主觀篩選，根據(jù)人ES細胞表達的受體進行選擇，鑒定了一些對未分化細胞的增殖有正面效果的因子。這些因子中有bFGF、LiCl、γ-氨基丁酸(GABA)、2-哌啶酸和TGFβ最終含在TeSR1中。對所測試的四種細胞系中的每一種而言，TeSR1中持續(xù)表達人ES細胞特征標記的細胞的增殖率和百分比高于培養(yǎng)在成纖維細胞調理的培養(yǎng)基內的對照細胞，并且，除去這5種因子中的任何一種減低了培養(yǎng)的效果。這些數(shù)據(jù)中的一些示于圖1，該圖顯示，生長在省略了這些成分中任何一種的培養(yǎng)基中的培養(yǎng)物顯示出的未分化細胞的比例低于含有所有這4種培養(yǎng)基成分的培養(yǎng)物。注意，Oct4、SSEA-1、SSEA-4、Tral-60和Tral-80都是用來追蹤干細胞分化狀態(tài)的細胞表面標記或轉錄因子(Oct4)。圖4顯示了類似的試驗，該試驗證實，當培養(yǎng)基中含有所有這些組分時，在多次傳代中培養(yǎng)物的生長速率最高。
對人ES細胞的培養(yǎng)條件而言，在培養(yǎng)容器中含有生物基質也是有益的。之前使用的一種此類材料是MatrigelTM，這是來自小鼠細胞的人造基底膜，它以不含小鼠細胞的市售產品提供。現(xiàn)在已知的用于類似目的的另一種人源材料是纖連蛋白，它是一種人糖蛋白，以不溶形式使用以形成也用作ES細胞培養(yǎng)的基底膜的纖維基質。就我們掌握的情況，僅纖連蛋白基質是不夠的。然而，現(xiàn)在還發(fā)現(xiàn)，人基質材料可由人基質蛋白膠原IV、纖連蛋白、層粘連蛋白和玻連蛋白的組合制成，這種基質足以支持人ES細胞在TeSR1培養(yǎng)基中永遠處于未分化狀態(tài)。
在系統(tǒng)地測試了超過80種生長因子之后得到了上面列出的培養(yǎng)基添加物。雖然這些添加物中的一些在至少幾次傳代中支持培養(yǎng)中的人ES細胞生長，但許多在隨后的傳代中無法維持ES細胞處于未分化狀態(tài)。我們未鑒定產生了下面的實施例中描述的培養(yǎng)基添加物的結果的這些因子的其它組合。這并不是說不能對這些成分進行改變。例如，由于LiCl能刺激wnt途徑而將其用于該培養(yǎng)基。Wnt自身或該途徑的其它刺激物如活化素可作為LiCl的等效物，用于代替LiCl，雖然LiCl可能是用于此目的的最經(jīng)濟的試劑。類似地，GABA被認為與GABA受體反應，科學文獻中鑒定了一些作為該相同受體的激動劑的分子，這些分子也可作為等效物，用于代替培養(yǎng)基中的GABA。還認為PA也與GABA受體反應。雖然發(fā)現(xiàn)PA和GABA在這里所用濃度下都對培養(yǎng)基有幫助，但也可以想像，可以顯著升高這些成分中的一種成分或其它成分的濃度而避免對其它成分的需要。
較高濃度(40-100ng/ml)的成纖維細胞生長因子似乎可以排除對飼養(yǎng)細胞的需要。優(yōu)選的FGF是堿性FGF，也稱為bFGF和FGF2，但至少包括FGF4、FGF9、FGF17和FGF18的其它FGF也足以滿足該目的。其它FGF即便是在更高濃度可能也是有效的。
之前只有在存在成纖維細胞飼養(yǎng)細胞時或在調理培養(yǎng)基中培養(yǎng)人胚胎干(ES)細胞培養(yǎng)物時才能使其維持在未分化狀態(tài)的這一觀察結果導致人們推測成纖維細胞將某種能抑制ES細胞分化的因子釋放到培養(yǎng)基中。然而，無論由成纖維細胞飼養(yǎng)細胞介導的對培養(yǎng)基的效應如何，現(xiàn)在將清楚下面描述的培養(yǎng)基將代替這種效應。下面描述的三種培養(yǎng)基是確定的，不含動物細胞，并能長期培養(yǎng)未分化的人ES細胞處于未分化狀態(tài)。提供了一個培養(yǎng)基例子，其中培養(yǎng)基中的蛋白質都是人蛋白質，具有“人源化”培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，從而避免任何可能的涉及動物來源的亞細胞產品的問題。
實施例除非另有說明，用于這里描述的所有培養(yǎng)的TeSR1培養(yǎng)基的組成列于下面的表1。我們預備試驗提示，未分化的人ES細胞在pH 7.2、同滲容摩(osmolality)350mOsMol和10％CO2/5％O2大氣下最適宜增殖。這些條件被用于這里所述的所有隨后的培養(yǎng)。
人ES細胞系H1、H7、H9和H14的細胞在TeSR1中分別強壯增殖11、7、25和17代(2-6個月)。證實細胞系H14在7代之后、H9在8代和21代之后核型正常。證實H1和H9在11和20代后形成畸胎瘤。
已知之前的ES細胞培養(yǎng)物由于存在不是由人制造的唾液酸Neu5Gc而不是最佳的。由于人基質組分膠原、纖連蛋白、層粘連蛋白和玻連蛋白將最終的動物產品排除出入ES細胞的TeSR1培養(yǎng)條件，我們檢測了當在這種培養(yǎng)基中培養(yǎng)時現(xiàn)有人ES細胞系是否消除了Neu5Gc。我們證實了培養(yǎng)在成纖維細胞調理培養(yǎng)基中的人ES細胞上存在Neu5Gc，培養(yǎng)在Matrigel上的TeSR1的細胞上檢測到減少的但可檢測的Neu5Gc，培養(yǎng)在使用四種人基質組分的TeSR1中的ES細胞上檢測不到任何Neu5Gc。這些數(shù)據(jù)示于圖2。因此，培養(yǎng)在TeSR1和人蛋白質基質上的人ES細胞不展示培養(yǎng)在鼠科飼養(yǎng)細胞上的細胞中發(fā)現(xiàn)的非人唾液酸殘基。
為檢測ES細胞集落的條件和長期維持人ES細胞培養(yǎng)物的培養(yǎng)適用性，將TeSR1培養(yǎng)基與之前最好的培養(yǎng)條件(就我們掌握的情況是使用調理培養(yǎng)基)進行比較。發(fā)現(xiàn)TeSR1培養(yǎng)基能夠維持人ES細胞處于這樣一種未分化狀態(tài)，即超過90％的細胞即使在長期培養(yǎng)后仍繼續(xù)呈Oct4陽性。該檢測結果示于圖3。這首次說明，不含任何飼養(yǎng)細胞且不含調理培養(yǎng)基的培養(yǎng)基能維持人ES細胞的未分化生長水平至培養(yǎng)中90％以上的細胞在所有階段維持未分化的程度。
在TeSR1培養(yǎng)基和TeSR培養(yǎng)基中測試了培養(yǎng)了3代的H1細胞的生長曲線和FACS分析，TeSR培養(yǎng)基省略了以下各組分TGFβ、PA、LiCl、GABA和bFGF。開始培養(yǎng)時，在第1代的第0天將3×105各細胞系的細胞鋪板。計算三個復孔的細胞數(shù)以評價貼壁情況(第2-3天)和傳代時的最終細胞數(shù)(第6-7天)。重復最初的鋪板密度和取樣時間，可能的話進行5代。在第3代的第6天通過FACS分析細胞的細胞表面標記SSEA1、SSEA4、Tra1-60和Tra1-81和轉錄因子Oct4。該數(shù)據(jù)示于圖1。這些數(shù)據(jù)顯示，人ES細胞可培養(yǎng)在缺乏這些組分中的每一種的培養(yǎng)基中，但代價是培養(yǎng)時細胞會出現(xiàn)一些不希望的分化，且只有使用所有這些組分才能獲得未分化水平最高的培養(yǎng)物。用其它細胞系也獲得了類似結果。
測試了維持在TeSR1培養(yǎng)基中的人ES細胞系的多能性。將分別培養(yǎng)在Matrigel基質上TeSR1培養(yǎng)基中11代和20代的新出現(xiàn)的細胞系WA01和WA09的細胞分別注射入SCID-米色小鼠。接種6-8后在小鼠中出現(xiàn)了展示復雜分化的畸胎瘤。
表1TeSR1培養(yǎng)基的完整配方
權利要求
1.一種不需要飼養(yǎng)細胞或調理培養(yǎng)基的在基質上培養(yǎng)未分化狀態(tài)的人干細胞的方法，所述方法包括以下步驟在含有含量足以將人干細胞歷經(jīng)多次連續(xù)培養(yǎng)傳代而維持未分化狀態(tài)的鹽、維生素、氨基酸、葡萄糖、成纖維細胞生長因子、γ氨基丁酸、2-哌啶酸、鋰和轉化生長因子β的培養(yǎng)基中培養(yǎng)人干細胞。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基含有濃度至少為40ng/ml的成纖維細胞生長因子。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基還含有運鐵蛋白和胰島素。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述人干細胞是胚胎干細胞。
5.一種在基質上和含有鹽、維生素、氨基酸和成纖維細胞生長因子的培養(yǎng)基中培養(yǎng)人胚胎干細胞的方法，該方法的改進之處包括，在培養(yǎng)基中加入含量足以將所述細胞歷經(jīng)多次連續(xù)培養(yǎng)傳代而維持未分化狀態(tài)的γ氨基丁酸、2-哌啶酸、鋰和轉化生長因子β。
6.一種體外細胞培養(yǎng)物，包含處于培養(yǎng)容器中的人干細胞；干細胞能夠生長于其上的基質；和培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基含有鹽、維生素、氨基酸、葡萄糖、成纖維細胞生長因子、γ氨基丁酸、2-哌啶酸、鋰和轉化生長因子β，它們的含量足以將所述人干細胞歷經(jīng)多次培養(yǎng)傳代而維持未分化狀態(tài)，培養(yǎng)基不含飼養(yǎng)細胞且從未接觸飼養(yǎng)細胞。
7.如權利要求6所述的細胞培養(yǎng)物，其特征在于，所述培養(yǎng)基含有濃度至少為40ng/ml的成纖維細胞生長因子。
8.如權利要求6所述的細胞培養(yǎng)物，其特征在于，所述培養(yǎng)基含有濃度至少為100ng/ml的成纖維細胞生長因子。
9.如權利要求6所述的細胞培養(yǎng)物，其特征在于，所述培養(yǎng)基還含有選自白蛋白、胰島素和運鐵蛋白的蛋白質。
10.如權利要求6所述的細胞培養(yǎng)物，其特征在于，所述蛋白是人蛋白。
11.如權利要求10所述的細胞培養(yǎng)物，其特征在于，所述胰島素和運鐵蛋白是重組蛋白。
12.如權利要求6所述的細胞培養(yǎng)物，其特征在于，所述干細胞是人胚胎干細胞。
13.一種含有未分化的人干細胞、基質和培養(yǎng)基的人胚胎干細胞培養(yǎng)物，所述培養(yǎng)物不含飼養(yǎng)細胞或接觸過飼養(yǎng)細胞的培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基也不含非人動物產品，所述人胚胎干細胞在未分化狀態(tài)下增殖，并且，所述人胚胎干細胞經(jīng)長期培養(yǎng)后有至少90％為轉錄因子Oct4陽性。
14.如權利要求13所述的人胚胎干細胞培養(yǎng)物，其特征在于，所述細胞不展示唾液酸殘基Neu5Gc。
15.一種培養(yǎng)干細胞的培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基含有鹽、維生素、氨基酸、葡萄糖、成纖維細胞生長因子、γ氨基丁酸、2-哌啶酸、鋰和轉化生長因子β，它們的含量足以將所述干細胞歷經(jīng)多次培養(yǎng)傳代而維持未分化狀態(tài)。
16.如權利要求15所述的培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基還含有選自白蛋白、胰島素和運鐵蛋白的蛋白質。
全文摘要
以前培養(yǎng)人胚胎干細胞的方法需要成纖維細胞飼養(yǎng)細胞或曾經(jīng)接觸成纖維細胞飼養(yǎng)細胞的培養(yǎng)基以將干細胞維持在未分化狀態(tài)?，F(xiàn)在發(fā)現(xiàn)，如果在培養(yǎng)干細胞的培養(yǎng)基中加入高水平的成纖維細胞生長因子、γ氨基丁酸、2－哌啶酸、鋰和轉化生長因子β，即便沒有飼養(yǎng)細胞或調理培養(yǎng)基，干細胞也將在多次傳代中無限期地維持未分化。
文檔編號C12N5/02GK101044235SQ200580029936
公開日2007年9月26日 申請日期2005年9月8日 優(yōu)先權日2004年9月8日
發(fā)明者J·A·湯姆森, T·路德維格 申請人:威斯康星校友研究基金會