專利名稱：Atⅲ在全血及血漿中的直接激活的制作方法
相關(guān)申請(qǐng)本申請(qǐng)要求于2004年7月7日申請(qǐng)的臨時(shí)申請(qǐng)U.S.S.N.60/586,043的優(yōu)先權(quán)，該申請(qǐng)的內(nèi)容全文并入本文作為參考。
背景技術(shù)：
盡管疫苗可以預(yù)防多種病毒感染，但并不是所有的病毒都能夠通過疫苗預(yù)防，而且即使存在疫苗，也并不是所有的可能的易感者都能夠接受疫苗接種。例如，不存在針對(duì)逆轉(zhuǎn)錄人類免疫缺陷病毒(HIV)引起的、不能治愈的獲得性免疫缺陷綜合癥(AIDS)的疫苗，患該病的患者身體免疫系統(tǒng)崩潰，使患者易受到機(jī)會(huì)感染，例如肺炎，和某些癌癥，例如卡波西肉瘤。許多HIV患者都會(huì)共同感染丙型肝炎病毒(HCV)，乙型肝炎病毒(HBV)，或其他病毒。盡管存在針對(duì)某些病毒例如HBV的疫苗，但許多風(fēng)險(xiǎn)人群并沒有接種疫苗或沒有機(jī)會(huì)接種。另外，有些數(shù)據(jù)顯示HBV疫苗對(duì)于已經(jīng)感染了HIV的人群并非那么有效。
一旦發(fā)生了病毒感染，通常是不可治愈的。但是存在多種抗病毒藥物，能夠防止病毒復(fù)制和破壞身體免疫系統(tǒng)，即，能夠減緩感染進(jìn)程，延長(zhǎng)患者的生命。但是這種治療通常只能部分有效，還不確定需要怎樣的病毒抑制率才能夠獲得持續(xù)的病毒學(xué)、免疫學(xué)和臨床有效性?？共《舅幬锿ǔ６拘院芨撸軌蛞饑?yán)重的副作用，包括心臟損傷，腎衰竭和骨質(zhì)疏松癥。
例如，高效的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物療法(HAART)是一種廣泛使用的抗-HIV治療，其需要包括多種藥物蛋白酶抑制劑的治療方案來徹底抑制病毒的復(fù)制。肝的損傷是抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法(HAART)引起的一個(gè)重要關(guān)注點(diǎn)，已經(jīng)表明各類抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法都會(huì)引起肝損傷。目前抗HIV療法的效率進(jìn)一步被治療方案的復(fù)雜性、藥丸容量和藥-藥相互作用所限制。逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物的毒副作用使得組合治療的使用期限很難長(zhǎng)久，許多患者不能承受長(zhǎng)期的HAART治療。此外，組合治療方式的低粘附性(adherence)導(dǎo)致出現(xiàn)HIV的耐藥菌株。
顯而易見需要一種新的抗病毒藥劑及其他治療病毒感染的新方法。
發(fā)明概述本發(fā)明基于以下意外發(fā)現(xiàn)可以使用如肝素等糖類在血，血漿，血清白蛋白，重組血漿等血液制品中直接原位活化ATIII，再施用于患者。例如，一個(gè)患者的血液制品可以與肝素或其它糖類孵育，透析并再施用到該患者中?；蛘?，來自另外來源(例如商品來源)的血液制品可以與肝素或其它糖類孵育，透析并施用到某個(gè)患者中。如此處理的血液制品含有治療病毒感染有效劑量的活化的ATIII。這種新的療法除去了對(duì)預(yù)先制備ATIII制劑的需要。如此處理的血液制品作為一種療法是有益的，例如用于治療病毒感染患者或由凝血酶活化作用所引起或促進(jìn)的疾病或病癥。本發(fā)明提供的該療法可縮短前-臨床以及臨床試驗(yàn)時(shí)間。此外，這些療法為現(xiàn)有使用純化的活化ATIII藥物制劑治療病毒感染的方法提供了一種替代方案或補(bǔ)充。
由下述的詳細(xì)說明以及權(quán)利要求可以明顯看出本發(fā)明的其它特點(diǎn)以及優(yōu)越性。


圖1表明在用LMW肝素處理的血液中HIV-I活性被抑制(如以下實(shí)施例4所述)。
圖2表明活化的肝素的作用機(jī)理。來自Aventis(人來源)以及來自GTC(重組)的純ATIII是無活性的。寡糖和ATIII孵育/或加熱孵育會(huì)加速這些分子的相互作用以形成復(fù)合體，該復(fù)合體經(jīng)歷了構(gòu)象變化產(chǎn)生活性形式。
發(fā)明的詳細(xì)說明1.定義為了方便起見，本文集中了本說明書，實(shí)施例和附加權(quán)利要求中使用的某些術(shù)語(yǔ)。除非另有說明，否則，本文使用的所有專業(yè)和科學(xué)名詞都具有本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域?qū)I(yè)人員通常認(rèn)為的含義。
本文所用量詞″a″和″an″是指一個(gè)或一個(gè)以上(即，至少一個(gè))語(yǔ)法上的物品對(duì)象。舉例來說，“一個(gè)元件”意味著一個(gè)元件或多于一個(gè)元件。
術(shù)語(yǔ)“活化ATIII”或“以活化ATIII”指在適宜條件下處理ATIII，從而使ATIII變成高分子量ATIII并能夠減少病毒負(fù)荷。
術(shù)語(yǔ)“施用”包括將藥物組合物或治療劑運(yùn)送到患者系統(tǒng)之內(nèi)或運(yùn)送到患者體表或體內(nèi)的特定區(qū)域的任何方法。本文所用短語(yǔ)“全身施用”“全身性施用”“外周施用”和“外圍地施用”，不同于施用化合物、藥物或其他材料使其直接進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，是指進(jìn)入患者全身并因此經(jīng)受新陳代謝等過程，例如皮下給藥?！澳c道外施用”和“腸道外地施用”是指不同于腸內(nèi)和局部給藥的施用模式，通常通過注射，其包括但不限于靜脈內(nèi)的，肌內(nèi)的，動(dòng)脈內(nèi)的，鞘內(nèi)的，囊內(nèi)的，眶內(nèi)的，心內(nèi)的，皮內(nèi)的，腹膜內(nèi)的，經(jīng)氣管的，皮下的，表皮下的，關(guān)節(jié)內(nèi)的，包囊下的，蛛網(wǎng)膜下的，脊柱內(nèi)的和胸骨內(nèi)的注射和輸注。
術(shù)語(yǔ)“ATIII”指抗凝血酶III。
術(shù)語(yǔ)“血液制品”指任何血液的制品或物質(zhì)，或來源于血液的制品或物質(zhì)。例如，血液制品包括但不限于，全血，血漿，血清，血清白蛋白制劑，及其人工制劑，比如重組血漿。
術(shù)語(yǔ)“哺乳動(dòng)物”是本領(lǐng)域已知的，示例性的哺乳動(dòng)物包括人，靈長(zhǎng)類動(dòng)物，?？苿?dòng)物，豬科動(dòng)物，犬科動(dòng)物，貓科動(dòng)物以及嚙齒動(dòng)物(例如小鼠和大鼠)。
術(shù)語(yǔ)“高分子量ATIII”是指相對(duì)于野生型ATIII分子、經(jīng)處理分子量增大了的ATIII，例如從58kDa增大到約60kDa到約240kDa。
將要通過本方法處理的“患者”“受試者”或“宿主”是指人或者非人動(dòng)物。
短語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的”指組份及其劑量在合理的臨床判斷范圍內(nèi)，適用于與人類和動(dòng)物組織接觸，無過度毒性，刺激，過敏反應(yīng)，或其它問題或并發(fā)癥，以及合理的利益/風(fēng)險(xiǎn)比率。
短語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的載體”是指藥學(xué)上可接受的材料，組合物或載體，例如液相或固相填充劑，稀釋劑，賦形劑，溶劑或封閉材料，涉及從一個(gè)器官或身體的部分?jǐn)y帶或傳送任何添加物或組合物，或其組份到另一器官或身體部分。
術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的載體”指載體的“可接受”性，即，與組合物中的其它組分相適應(yīng)，且不會(huì)對(duì)接受者有害。可充當(dāng)藥學(xué)上可接受的載體的一些實(shí)例包括(1)糖，比如乳糖，葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，比如玉米淀粉和馬鈴薯淀粉；(3)纖維素，和其衍生物，比如羧甲基纖維素鈉鹽，乙基纖維素和醋酸纖維素；(4)粉末黃芪膠；(5)麥芽；(6)白明膠；(7)滑石粉；(8)賦形劑，比如可可脂和栓劑蠟；(9)油，比如花生油，棉籽油，紅花油，芝麻油，橄欖油，玉米油和豆油；(10)二醇類，比如丙二醇；(11)多元醇，比如甘油，山梨糖醇，甘露糖醇和聚乙二醇；(12)酯類，比如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)瓊脂；(14)緩沖劑，比如氫氧化鎂和氫氧化鋁；(15)藻酸；(16)無熱原的水；(17)等滲鹽水；(18)林格溶液；(19)乙醇；(20)磷酸鹽緩沖液；和(21)其它用于藥物制劑的無毒配伍物質(zhì)。
術(shù)語(yǔ)“糖類”包括單糖和多糖。
術(shù)語(yǔ)“能夠活化ATIII的糖類”指任何能將野生型ATIII轉(zhuǎn)化為能夠減少病毒負(fù)荷的活化和/或高分子量ATIII的糖類。
術(shù)語(yǔ)“治療有效量”指活化的ATIII，藥物或其它分子的含量，當(dāng)給需要這種治療的受試者施用時(shí)該含量足以實(shí)現(xiàn)有效治療。治療有效量隨所述待治療患者和疾病病癥、患者的體重和年齡、疾病病癥的嚴(yán)重度、給藥方式等等的不同而有所變化，該有效量可由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易地測(cè)定。
本文所用術(shù)語(yǔ)“治療”含義是包括治愈以及改善任一病癥或疾病的至少一個(gè)癥狀，或疾病的進(jìn)展被降低或杜絕。治療可以在病態(tài)開始的預(yù)前或隨后進(jìn)行。
術(shù)語(yǔ)“病毒負(fù)荷”指病毒(例如HIV)在血液中的濃度。
除非另有陳述，說明書和權(quán)利要求所用的所有表示組分，反應(yīng)條件等的數(shù)字，在任何情況下應(yīng)被理解為被術(shù)語(yǔ)“約”修飾。
因此，除非標(biāo)明與此相反，在說明書和附加權(quán)利要求中所述的數(shù)字參數(shù)均為近似值，可根據(jù)有待通過本發(fā)明來獲得的性質(zhì)的不同而發(fā)生變化。
2.ATIII的血液原位活化作用抗凝血酶III(ATIII)是存在于血漿中的一種糖蛋白，具有明確的血液凝固作用。具體地，ATIII是一種有效的凝結(jié)級(jí)聯(lián)反應(yīng)的抑制劑，具有54kDa到65kDa之間的表觀分子量(Rosenberg和Damus，J.Biol.Chem.2486490-505(1973)；Nordenman等，Eur.J.Biochem.，78195-204(1977)；Kurachi等，Biochemistry 15373-7(1976))，其中百分之十是由四個(gè)葡糖胺-堿碳水化合物鏈所貢獻(xiàn)(Kurachi等，Biochemistry 15373-7(1976)；Petersen等，The PhysiologicalInhibitors of Coagulation and Fibrinolysis(Collen等，eds)Elsevier，Amsterdam，48頁(yè)(1979))。
盡管從其名稱含義來看是ATIII僅僅對(duì)凝血酶起作用，實(shí)際上ATIII能對(duì)幾乎所有凝結(jié)酶起到至少一定程度的抑制作用。它抑制的主要的酶是Xa因子，IXa因子和凝血酶(IIa因子)。它還對(duì)因子XIIa，因子Xia和VIla因子與組織因子的復(fù)合體具有抑制作用，但對(duì)VIIa因子和活化的蛋白質(zhì)C沒有作用。ATIII還抑制胰蛋白酶，纖維蛋白溶酶和激肽釋放酶(Charlotte和Church，Seminars in Hematology 283-9(1995))。其通過多種相互作用發(fā)揮限制凝結(jié)的功能，這使其成為一種主要的天然抗凝結(jié)蛋白質(zhì)。
ATIII對(duì)其自身具有相對(duì)低效的抑制作用。但是，ATIII能通過一種簡(jiǎn)單的模板機(jī)理活化，或通過與肝素結(jié)合由變構(gòu)構(gòu)象變化活化(Skinner等，J.Mol.Biol.2839-14(1998)；Huntington等，J.Mol.Biol.，293449-55(1999)；Belar等，J.Mol.Biol.Chem.，2758733-41(2000))。當(dāng)ATIII結(jié)合肝素時(shí)，導(dǎo)致抑制發(fā)生的那些反應(yīng)的速度大大加快。這種相互作用是基于肝素的抗凝作用治療基礎(chǔ)。
純血漿來源或重組的ATIII對(duì)降低HIV病毒負(fù)荷無活性。但是，我們已經(jīng)在U.S.S.N.10/436,872中表明已經(jīng)處理過的、具有更高分子量的，或“活化的”ATIII能在感染細(xì)胞中有效地減少HIV病毒負(fù)荷。該申請(qǐng)?zhí)卣魇前委熌孓D(zhuǎn)錄病毒感染的、有效量的高分子量抗凝血酶III(ATIII)的藥物組合物，該申請(qǐng)全文并入本文作為參考。ATIII與肝素以各種組合方式孵育和/或加熱均顯示可活化ATIII并抑制逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的增殖。
本發(fā)明基于以下意外發(fā)現(xiàn)，即可以使用肝素等糖類在血，血漿，血清白蛋白，重組血漿等血液制品中直接原位活化ATIII，再將其施用于患者。如此處理的血液制品含有活化的或高分子量ATIII。這種新的療法不必預(yù)先制備ATIII，例如將其制備、純化并制劑為藥物組合物。如此處理的血液制品作為一種療法是有益的，例如用于治療病毒病患者或由凝血酶活化作用所引起或促進(jìn)的疾病或病癥。
例如，可以在適當(dāng)條件下(約37到約40℃)將該患者自身的血液或血漿或血清白蛋白與肝素共同孵育，(不必使糖類濃度大大低于經(jīng)處理的血液中的ATIII等摩爾濃度)，然后將活化的血制品注射回到該患者中。這種概念背后的基本原理是大部分的患者每公升血液具有約100到約150mg ATIII，而其僅僅需要很少量的肝素進(jìn)行活化。
因此，在血液制品中原位制備活化的ATIII方法可包括(a)向含有ATIII的血液制品中加入能夠活化ATIII的糖類，所述糖類的數(shù)量足以活化所述ATIII；以及(b)在足以活化所述ATIII的條件下孵育血液制品和糖類的混合物。在某些具體實(shí)施方式
中，所述的糖類的加入量可以多于血液制品中的ATIII數(shù)量，例如，血液制品中ATIII數(shù)量的約0.1到約1.0等摩爾的數(shù)量。
某些
具體實(shí)施例方式
中足以活化ATIII的條件是，約37℃到約40℃，約24到約72小時(shí)。某些具體實(shí)施方式
中該溫度約為37℃到約38℃，約38℃到約39℃或約39℃到約40℃。某些具體實(shí)施方式
中，孵育時(shí)間為約24到約36小時(shí)，約36到約48小時(shí)，約48到約60小時(shí)，或約60到約72小時(shí)。
該血液制品可以是血液或來源于血液的任何制品或物質(zhì)。例如，血液制品包括但不限于，全血，血漿，血清，血清白蛋白制劑，及其人工制劑，比如重組血漿。
所述的糖類可以是例如寡糖，如任何形式的肝素，包括低分子量肝素(約2到約4kDa)，高分子量肝素(至少12kDa)，和標(biāo)準(zhǔn)的未被分級(jí)的肝素。在某些具體實(shí)施方式
中，所述的糖類是五糖。此外，該糖可以是由糖苷酶或其它限制酶處理的寡糖。在某些具體實(shí)施方式
中，該糖可以以該血液制品中ATIII的量的約0.1到約0.2，約0.2到約0.3，約0.3到約0.4，約0.4到約0.5，約0.5到約0.6，約0.6到約0.7，約0.7到約0.8，0.8到約0.9，或約0.9到約1.0等摩爾的量加入?？捎糜诒景l(fā)明方法的糖包括但不限于，單糖，二糖和多糖(包括五，七和六糖)，糖醇，和氨基糖。單糖的實(shí)例包括葡萄糖，果糖，半乳糖，甘露糖，阿拉伯糖和肌醇。二糖的實(shí)例包括蔗糖，乳糖，麥芽糖，果膠。糖醇的實(shí)例包括甘露糖醇，山梨糖醇，和木糖醇。氨基糖的實(shí)例包括葡糖胺，半乳糖胺，N-乙酰-D-葡糖胺和N-乙酰半乳糖胺，能形成氨基糖苷類和肝素等更復(fù)雜寡糖的構(gòu)筑單元。在某些具體實(shí)施方式
中，所述的寡糖可以是低分子量(2-4kDa)肝素，高分子量(至少12kDa)肝素，標(biāo)準(zhǔn)的未被分級(jí)的肝素，果膠，五糖和氨基糖苷類。在某些具體實(shí)施方式
中，所述的寡糖對(duì)ATIII有親和性。本文所用的糖可與附加的小分子，如生物素，抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白衍生。在某些具體實(shí)施方式
中糖類可以是硫酸化寡糖或糖苷酶及通過其他限制酶反應(yīng)鑒定的寡糖。
含有已被原位活化了的ATIII的血液制品也在本發(fā)明范圍內(nèi)。這種血液制品可以在例如無菌i.v.或孵育袋中包裝。
3.處理的方法上述處理血液制品以原位活化ATIII的方法及從而產(chǎn)生的活化的血液制品可以并入受試者疾病治療方法中。因此，這種在需要治療的受試者中治療疾病的方法可包含(a)向含有ATIII的血液制品中加入能夠活化ATIII的糖類，糖類的數(shù)量足以活化所述ATIII；(b)在足以活化所述ATIII的條件下孵育血液制品和糖類的混合物；以及(c)將所述混合物施用到所述受試者以治療疾病。在某些具體實(shí)施方式
中，這種方法可進(jìn)一步包含在注入步驟之前用透析等方法純化所述混合物，以去除未反應(yīng)的糖類。本發(fā)明的方法可用于人及動(dòng)物受試者，如牛、馬、犬、貓等。
在某些
具體實(shí)施例方式
中，疾病由細(xì)菌或病毒造成?？梢允褂帽景l(fā)明原位活化ATIII的方法或血液制品治療的病毒實(shí)例包括甲型肝炎病毒(HAV)感染，乙型肝炎病毒(HBV)感染，丙型肝炎病毒(HCV)感染，人免疫缺陷病毒(HIV)感染，冠狀病毒感染，巨細(xì)胞病毒感染(CMV)及重癥急性呼吸性綜合癥(SARS)。在某些具體實(shí)施方式
中，該病毒是逆轉(zhuǎn)錄病毒，比如人免疫缺陷病毒。在其它具體實(shí)施方式
中，該疾病可以是由凝血酶活化作用所引起或促進(jìn)的疾病或病癥。
患者中與凝血酶活化作用相關(guān)的疾病包括敗血病，損傷，急性呼吸窘迫綜合征，血栓癥，中風(fēng)及再狹窄。該方法還可以用來治療具有高風(fēng)險(xiǎn)患凝血酶相關(guān)的病理性疾病的患者，如再閉塞(reocclusion)及在經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈成形術(shù)中再狹窄；外科手術(shù)相關(guān)的血栓癥，局部缺血/再灌注傷害；及在癌癥或外科患者中的凝結(jié)異常。在該方法中施用的處理的血液制品可作為抗凝劑在下述治療中發(fā)揮作用，例如，導(dǎo)致靜脈及動(dòng)脈的血栓癥風(fēng)險(xiǎn)增大的先天性抗凝血酶III缺陷；或?qū)е聫浡匝軆?nèi)凝血的獲得性抗凝血酶III缺陷；內(nèi)皮損傷所導(dǎo)致的微血管病性溶血性貧血(即溶血-尿毒癥綜合癥)及靜脈閉塞的疾病(VOD)。所述方法及血液制品還可用來治療半慢性疾病，如動(dòng)脈的血栓及深靜脈血栓形成。
單劑量給藥、長(zhǎng)期慢性多劑量治療這兩種治療方法均包含在本發(fā)明范圍內(nèi)。
在某些
具體實(shí)施例方式
中，該治療方法可進(jìn)一步包含向所述受試者施用其它藥物組合物，比如抗病毒藥物。例如，在某些具體實(shí)施方式
中，抗病毒藥物可以與該血液制品同時(shí)施用。在其它具體實(shí)施方式
中，抗病毒藥物可以在施用該混合物之后施用。在其它具體實(shí)施方式
中，抗病毒藥物既可以與該血液制品同時(shí)也可以隨其后施用?？梢韵蛟摶旌衔镏屑尤肟共《舅幬铮蜃鳛閱为?dú)的組合物施用。
抗病毒藥物的示例性實(shí)例包括逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑，比如齊多夫定、扎西他賓，去羥肌苷，司他夫定，拉米夫定，阿巴卡韋，替諾福韋，奈韋拉平，依法韋侖，地位韋啶；蛋白酶抑制劑，比如沙奎那韋，利托那韋，茚地那韋，奈非那韋，氨普奈韋，洛匹那韋，并及其他試劑，比如阿拉伯糖苷，阿拉伯糖苷5′單磷酸鹽，無環(huán)鳥苷，鳥嘌呤，泛昔洛韋，拉米夫定，克來夫定，afedovir dipivoxil，恩替卡韋，IFN a-2b，IFN-a-2a，類淋巴母細(xì)胞IFN，共有序列-IFN，IFN-b，IFN-g，加入聚乙二醇的IFN-a-2a，糖皮質(zhì)甾類，或胸腺素al，IL-2，IL-12，病毒唑，環(huán)孢菌素或粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子，融合抑制劑，比如T-20(恩夫韋地(enfuvirtide))，鋅指抑制劑，及病毒唑。
推薦用高活性抗反轉(zhuǎn)錄病毒治療(HAART)治療HIV及其他病毒感染。在每日的服法中結(jié)合HAART與兩個(gè)或更多抗病毒藥療法，亦稱“雞尾酒法”。雞尾酒抗病毒藥物為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知。例如，公知的抗HIV雞尾酒組合包括但不限于，AZT，3TC及依法韋侖；奈韋拉平，司他夫定及拉米夫定；恩曲他濱(emtricitabine)及替諾福韋酯(tenofovir disoproxil fumarate)；茚地那韋，齊多夫定及拉米夫定(3TC)；和齊多夫定及3TC。一種有效的抗HCV雞尾酒是病毒唑和干擾素。
本發(fā)明血液制品及其他抗病毒的結(jié)合可減少任一單一組分的所需劑量，這是因?yàn)椴煌M分作用的引發(fā)和持續(xù)可以是互補(bǔ)的(complimentary)。在這種結(jié)合療法中，不同活性試劑可以同時(shí)或獨(dú)立地施用，以及在一天內(nèi)同時(shí)或在不同的時(shí)間施用。
可以同時(shí)，隨后，或既同時(shí)又隨后地施用的其它藥物組合物包括ATIII以及干擾素或者干擾素來源的藥物。例如，該血液制品可以是在加入寡糖以活化ATIII之前補(bǔ)充有額外的ATIII。在另一具體實(shí)施方式
中，可以在本發(fā)明的血液制品用于治療方法之前，單獨(dú)或與肝素或五糖等糖類共同使用抗凝劑來處理本發(fā)明的血液制品，以便提高它們的效果。
此外，如待審的U.S.專利申請(qǐng)10/436,872所述的高分子量ATIII藥物組合物可通過例如與所述處理的血液制品給藥的同時(shí)，隨后或既同時(shí)又隨后地施用用于補(bǔ)充該療法。
本發(fā)明的血液制品可以直接，或可以使用一個(gè)或多個(gè)生理學(xué)可接受的載體或賦形劑配制成常規(guī)的方式施用于受試者。對(duì)于這種療法，本發(fā)明的化合物可配制成各種給藥負(fù)荷，包括全身的和局部的或定位的給藥。通常可以在Remmington′s Pharmaceutical Sciences，MeadePublishing Co.，Easton，PA獲得技術(shù)和制劑。針對(duì)全身地施用，優(yōu)選注射，包括肌內(nèi)，靜脈內(nèi)，腹膜內(nèi)，和皮下注射?？梢耘渲圃撗褐破烦梢杂糜谕ㄟ^注射的腸道外方式施用，例如，通過快速濃注或連續(xù)輸注。對(duì)于注射，本發(fā)明的血液制品可配置成液體溶液，優(yōu)選生理學(xué)配伍的緩沖液，諸如Hank溶液或林格溶液。另外，該血液制品可以配制成固態(tài)并在即將使用之前再溶解或懸浮。還包括血液制品的凍干形式。
用于注射的制劑可以與加入的防腐劑一起以單位劑型存在，例如在安瓿或在多劑量容器中。該制劑可以是混懸液，在油性或液態(tài)載體中的溶液或乳劑，并可含有制劑用試劑，諸如懸浮劑，穩(wěn)定劑和/或分散劑。或者，該活性成分可以在使用之前以粉末形式與適當(dāng)?shù)妮d體組合，例如，無菌的無熱原水。
此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，用于本發(fā)明方法的任一血液制品，試劑，化合物，藥物等等的劑量可以因患者的癥狀，年齡及體重，待治療或預(yù)防的病癥的性質(zhì)及嚴(yán)重度，給藥途徑，和補(bǔ)充手段的形式而不同。該制劑的任一形式都可以以任何適當(dāng)?shù)膭┝渴┯?，諸如以單個(gè)劑量或以等分劑量施用。根據(jù)本說明書的內(nèi)容及其教導(dǎo)，本發(fā)明血液制品的劑量，無論是單獨(dú)或與本發(fā)明的任何其它化合物一起，或與對(duì)特定紊亂，疾病或病癥有用的任何化合物一起，均可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知技術(shù)容易地測(cè)定。本發(fā)明還提供一種或以上的受試化合物以及其它治療劑的混合物。
已經(jīng)證明當(dāng)以約100U/kg/天的劑量施用時(shí)，ATIII耐藥性很好(Warren等，JAMA 2861869-78(2001))并顯示完全被排出的半衰期為18.6h(Ilias等，Intensive Care Medicine 267104-7115(2000))。當(dāng)根據(jù)癥狀，體重，性別，動(dòng)物物種等等適當(dāng)?shù)卮_定劑量時(shí)，其用于成人通常為1-1,000單位/kg體重/天的ATIII(本發(fā)明處理的血液制品中所含的)，優(yōu)選10-500單位/kg體重/天，該劑量是在一天內(nèi)一次或多次施用。如果是靜脈內(nèi)給藥，該劑量?jī)?yōu)選10-100單位/kg體重/天。
在指定患者中產(chǎn)生最有效治療的任一特定制品或化合物的精確的給藥時(shí)間及劑量將取決于特定化合物的活性，藥物動(dòng)力學(xué)，和生物利用率，該患者的生理情況(包括年齡，性別，疾病類型和階段，全身的身體條件，對(duì)給藥劑量的敏感度，和藥物治療類型)，給藥途徑，等等。本文的指導(dǎo)原則可以用于優(yōu)化該治療，例如，測(cè)定給藥的最優(yōu)化時(shí)間和/或劑量，其僅僅是包括監(jiān)測(cè)該患者和調(diào)整劑量和/或時(shí)間等的常規(guī)實(shí)驗(yàn)。在某些具體實(shí)施方式
中，例如當(dāng)該血液制品是患者的血液時(shí)，施用方案還可能取決于ATIII在血液制品中的相對(duì)劑量。
對(duì)于正在進(jìn)行治療的患者，可以通過在24小時(shí)時(shí)間內(nèi)在預(yù)定時(shí)間測(cè)量一個(gè)或多個(gè)相關(guān)指數(shù)來監(jiān)測(cè)患者的健康。治療，包括補(bǔ)充手段，劑量，給藥時(shí)間和劑型在內(nèi)，可以根據(jù)這種監(jiān)測(cè)的結(jié)果最優(yōu)化。可以通過測(cè)量相同的參數(shù)來周期性地重新評(píng)價(jià)該患者以測(cè)定改善程度，第一次的重新評(píng)價(jià)通常出現(xiàn)在治療開始后四個(gè)星期末，隨后的重新評(píng)價(jià)在治療過程中每四到八周進(jìn)行，此后每隔二個(gè)月進(jìn)行。治療可以持續(xù)數(shù)月乃至幾年，人的常規(guī)治療長(zhǎng)度最少是一個(gè)月?？梢愿鶕?jù)這些重新評(píng)價(jià)調(diào)整施用的試劑劑量和給藥時(shí)間。在與HAART方式一起施用該血液制品的具體實(shí)施方式
中，可以在HAART間歇期間施用該血液制品。
可以以小于該制品或化合物的最優(yōu)化劑量的較小劑量開始治療。此后，可以小幅增加該劑量，直至達(dá)到最優(yōu)化的治療效果。
4.試劑盒本發(fā)明還提供含有本發(fā)明組合物的試劑盒，以及任選地使用說明書。例如，用于實(shí)踐本發(fā)明某些治療方法的試劑盒可以包含一種能夠活化ATIII的糖類以及使用說明書。用于實(shí)踐本發(fā)明某些治療方法的其它試劑盒可以包括含有已經(jīng)原位活化的ATIII的血液制品。此外，本發(fā)明提供試劑盒，該試劑盒可在在血液制品中制備原位活化的ATIII的方法中使用。例如，這種試劑盒可含有能夠活化ATIII的寡糖和使用說明書。
試劑盒組分可以包裝成用于手動(dòng)、或者部分或全部自動(dòng)地實(shí)施上述方法。在涉及試劑盒的其它具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明設(shè)想的試劑盒包括本發(fā)明的組合物，以及任選地使用說明書。在其它具體實(shí)施方式
中，試劑盒可進(jìn)一步包括對(duì)照，試劑，緩沖液，和/或使用說明書。這種試劑盒可能具有各種應(yīng)用，包括例如成像，診斷，治療及其他應(yīng)用。
實(shí)施例上面對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了概括性的描述，參考下列實(shí)施例可更容易理解本發(fā)明，所述實(shí)施例僅僅為了說明本發(fā)明的某些方面和具體實(shí)施方式
，并非限制本發(fā)明。
實(shí)施例1使用標(biāo)準(zhǔn)的、未被分級(jí)的肝素在體外進(jìn)行ATIII活化的方案在無菌的孵育袋中將用于人的標(biāo)準(zhǔn)的、未被分級(jí)的肝素(1,000-10,000單位，或約2到約40mg)加入到500mL市場(chǎng)上可買到的人血漿樣品中(含平均約120到約150mg的ATIII)。加入到袋中的肝素?cái)?shù)量取決于患者的病毒負(fù)荷和期望的治療方式。在室溫下，37℃或40℃孵育所獲混合物24-72小時(shí)。在孵育期需要輕微的混合。孵育的混合物可以進(jìn)一步純化以去除未反應(yīng)的肝素，也可以不經(jīng)純化即注入到患者中。在本方法中，所述肝素劑量與血漿中的ATIII水平相比要低得多，這樣就避免了產(chǎn)物混合物中的游離肝素，因此降低流血的風(fēng)險(xiǎn)。
實(shí)施例2使用標(biāo)準(zhǔn)的，未被分級(jí)的肝素在體外血液中進(jìn)行ATIII活化的方案在無菌的孵育袋中將用于人的標(biāo)準(zhǔn)的、未被分級(jí)的肝素(1,000-20,000單位，或約2到約40mg)加入到1,000mL取自HIV或HCV患者的血液樣品中(含平均約70到約150mg的ATIII)。在室溫下，37℃或40℃孵育所獲混合物24-72小時(shí)。在孵育期需要輕微的混合。孵育的混合物可以進(jìn)一步純化以去除未反應(yīng)的肝素，也可以不經(jīng)純化即注入到患者中。在本方法中，所述肝素劑量與血漿中的ATIII水平相比要低得多，這樣就避免了產(chǎn)物混合物中的游離肝素，因此降低流血的風(fēng)險(xiǎn)。
實(shí)施例3使用低分子量肝素在體外血漿中進(jìn)行ATIII活化的方案在無菌的孵育袋中將用于人的低分子量(LMW)肝素(1,000-10,000單位，或約2-約20mg)加入到500mL市場(chǎng)上可買到的人血漿樣品中(含平均約70到約150mg的ATIII)。在室溫下，37℃或40℃孵育所獲混合物24-72小時(shí)。在孵育期需要輕微的混合。孵育的混合物可以進(jìn)一步純化以去除未反應(yīng)的肝素，也可以不經(jīng)純化即注入到患者中。在本方法中，所述肝素劑量與血漿中的ATIII水平相比要低得多，這樣就避免了產(chǎn)物混合物中的游離肝素，因此降低流血的風(fēng)險(xiǎn)。
實(shí)施例4使用低分子量肝素在體外血液中制備活化ATIII的方法在無菌的孵育袋中將用于人的低分子量(LMW)肝素(1,000-20,000單位，或約2-約20mg)加入到1,000mL取自HIV或HCV患者的血液樣品中(含平均約70到約150mg的ATIII)。在室溫下，37℃或40℃孵育所獲混合物24-72小時(shí)。在孵育期需要輕微的混合。孵育的混合物可以進(jìn)一步純化以去除未反應(yīng)的肝素，也可以不經(jīng)純化即注入到患者中。在本方法中，所述肝素劑量與血漿中的ATIII水平相比要低得多，這樣就避免了產(chǎn)物混合物中的游離肝素，因此降低流血的風(fēng)險(xiǎn)。
實(shí)施例5使用肝素，肝素衍生物，或其它能夠活化ATIII的寡糖在血液或血漿中活化ATIII還可以使用0.1到1.0等摩爾量的任何肝素衍生的五糖或其它能夠活化ATIII的寡糖，利用在以上實(shí)施例1-4中所述方法在血液或血漿中活化ATIII。這種實(shí)施例在上述詳細(xì)說明中提供。
實(shí)施例6以改良形式測(cè)定蛋白質(zhì)結(jié)合肝素和游離肝素為評(píng)估所述游離肝素和蛋白質(zhì)結(jié)合肝素，按下述結(jié)合使用UV和折射率(RI)。
為校正所述通過UV和RI檢測(cè)器進(jìn)行的吸收檢測(cè)中的差異建立了校正系數(shù)，其是根據(jù)下列公式利用兩種檢測(cè)器進(jìn)行的純蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定建立的K＝UV蛋白/RI蛋白或RI蛋白＝UV蛋白/K總的RI整合可以按照下面表示為RI總數(shù)＝RI蛋白+RI肝素因此，結(jié)合的肝素(B肝素)為％B肝素＝[(RI總數(shù)-UV蛋白/K)/RI總數(shù)]×100游離肝素(F肝素)根據(jù)下式計(jì)算％F肝素＝[F肝素/(F肝素+B肝素)]×100實(shí)施例7抑制HIV-I復(fù)制的試驗(yàn)X4 HTLV-IIIB(在下文中寫為X4 HIV；Chang等，NATURE，363466-9(1993))，一種原型的T-向性(prototypical T-tropic)的HIV菌株(American Type Tissue Collection，Monassass，VA，USA；ATCC No.CRL-8543)，被用于評(píng)價(jià)ATIII活化方法對(duì)T-向性的HIV感染的效果。能感染細(xì)胞培養(yǎng)微量板上50％的孔、或試管的指定混懸液體積(例如0.1ml)中的病毒的數(shù)量被稱為組織培養(yǎng)感染劑量50[TCID50]。TCID50用作一種通過噬菌斑(該方法給出PFU或噬菌斑形成單位的數(shù)值)測(cè)定病毒滴定度的替代手段。以1×10-2TCID50每毫升的MOI、用X4 HIV急性地感染表達(dá)人類白細(xì)胞抗原蛋白質(zhì)(HLA)B6，Bw62和Cw3的人T淋巴樣干細(xì)胞(H9細(xì)胞)。所述感染的H9細(xì)胞被重懸到5×105細(xì)胞/ml的R20細(xì)胞培養(yǎng)基中。用滴管吸取2毫升該混懸液到24孔微量滴定板的各孔中。然后在存在或不存在已經(jīng)活化了的ATIII樣品的條件下培養(yǎng)細(xì)胞直至12天。每隔兩天(3，6，9和12天)，將1ml細(xì)胞上清液從試驗(yàn)孔去除并替換為等量的R20細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)基。同樣處理對(duì)照孔，但接受的含樣品培養(yǎng)基未被處理。
分別測(cè)量在0，3，6，9和12天獲得的各樣品中HIV病毒核心蛋白質(zhì)p24(gag)的濃度(AllianceHIV-I p24 ELISA試劑盒，NENLife Science，Boston MA，USA)。
該結(jié)果列于圖1，顯示在用低分子量肝素處理的血液中HIV-I抑制活性。
等價(jià)物本發(fā)明已經(jīng)論述了特定的具體實(shí)施方式
，以上說明書是說明性的而非限制性的。本領(lǐng)域技術(shù)人員依據(jù)說明書和下述權(quán)利要求的綜述可顯而易見的對(duì)本發(fā)明進(jìn)行許多變動(dòng)。例如，以上實(shí)施例中舉出的反應(yīng)物數(shù)量的變化，以及孵育時(shí)間的變化均屬于本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明的充分范圍應(yīng)該參考以下而定權(quán)利要求，屬于本發(fā)明范圍內(nèi)的等價(jià)物，說明書，并要考慮到這種變動(dòng)。
本文提及的所有出版物和專利，包括下列的那些，均并全文入本文作為參考。在發(fā)生矛盾時(shí)，依照本申請(qǐng)，包括任何本文中的定義。Wright，BIOASSAY，18453-64(1996)；Skinner et al.，J.MoI.Biol.2839-14(1998)；Huntington et al.，J.MoI.Biol.293449-55(1999)；Deeks，JAMA，286224-6(2001)；Stephenson，JAMA，277614-6(1997)；Carret al，Lancet，3511881-3(1998)。
權(quán)利要求
1.對(duì)需要治療的受試者進(jìn)行治療的方法，包括(a)向含有ATIII的血液制品中加入能夠活化ATIII的糖類，所述糖類的數(shù)量足以活化所述ATIII；(b)在足以活化所述ATIII的條件下孵育血液制品和糖類的混合物；以及(c)將所述混合物施用到所述患者。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述糖類是寡糖。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述寡糖是肝素，并且所述肝素選自低分子量肝素，高分子量肝素，和標(biāo)準(zhǔn)的、未被分級(jí)的肝素。
4.權(quán)利要求2的方法，其中所述寡糖加入的數(shù)量多于所述血液制品中ATIII的數(shù)量。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述足以活化ATIII的條件為約37℃到約40℃、約24到約72小時(shí)的孵育。
6.權(quán)利要求2的方法，其中加入的所述寡糖的量是0.1-1.0等摩爾量的所述血液制品中ATIII的量。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述血液制品是血漿或人血清白蛋白。
8.權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括在施用步驟之前純化所述混合物以去除未反應(yīng)的糖類。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述疾病是選自下述的病毒感染甲型肝炎病毒HAV感染，乙型肝炎病毒HBV感染，丙型肝炎病毒HCV感染，人免疫缺陷病毒HIV感染，和冠狀病毒感染。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述疾病是人類免疫缺陷性病毒HIV感染。
11.權(quán)利要求1的方法，其中所述疾病是由選自下述的由凝血酶活化所引起或促進(jìn)的疾病或病癥敗血病，損傷，急性呼吸窘迫綜合征，血栓癥，中風(fēng)，再狹窄，再閉塞和經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈成形術(shù)中的再狹窄；與外科手術(shù)相關(guān)的血栓癥，局部缺血/再灌注損傷；和癌癥或外科患者中的凝血異常，抗凝血酶III缺陷，靜脈的或動(dòng)脈的血栓癥，彌漫性血管內(nèi)凝血，微血管病性溶血性貧血和靜脈閉塞疾病VOD。
12.權(quán)利要求9的方法，進(jìn)一步包括給所述患者施用一種抗病毒藥物。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述抗病毒藥物的施用是與所述混合物的施用同時(shí)進(jìn)行。
14.權(quán)利要求12的方法，其中所述抗病毒藥物的施用是在所述混合物的施用之后。
15.權(quán)利要求12的方法，其中還在給藥之前向所述產(chǎn)物混合物中加入抗病毒藥物。
16.權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括在加入所述糖類之前向所述血液制品中補(bǔ)充額外的ATIII。
17.權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括給所述患者施用一種干擾素或干擾素來源藥物。
18.權(quán)利要求9的方法，其中所述混合物的施用使得病毒負(fù)荷降低。
19.一種在血液制品中原位制備活化的ATIII的方法，可包含(a)向含有ATIII的血液制品中加入能夠活化ATIII的糖類，所述糖類的數(shù)量足以活化所述ATIII；以及(b)在足以活化所述ATIII的條件下孵育血液制品和糖類的混合物。
20.一種用于在血液制品中原位制備活化的ATIII的試劑盒，包括一種能夠活化ATIII的寡糖和使用說明書。
全文摘要
公開了在血液中原位激活A(yù)TⅢ的方法，以及該方法和血制品在治療感染性疾病，炎癥疾病和由凝血酶激活作用介導(dǎo)的疾病和病癥中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12Q1/00GK101014717SQ200580029945
公開日2007年8月8日 申請(qǐng)日期2005年7月7日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月7日
發(fā)明者D·R·埃爾馬勒 申請(qǐng)人:綜合醫(yī)院公司