專利名稱：含有蛋白酶反應(yīng)促進(jìn)劑和/或色素穩(wěn)定劑的試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種蛋白酶反應(yīng)促進(jìn)劑以及一種促進(jìn)蛋白酶反應(yīng)的方法。而且，本發(fā)明涉及一種應(yīng)用蛋白酶反應(yīng)促進(jìn)劑的試劑和測(cè)定方法。進(jìn)一步具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及的應(yīng)用蛋白酶反應(yīng)促進(jìn)劑的試劑和測(cè)定方法用于測(cè)定血紅蛋白、糖化蛋白質(zhì)或糖化蛋白質(zhì)比率，本發(fā)明涉及準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、迅速地對(duì)血紅蛋白、血紅蛋白A1c和糖化白蛋白進(jìn)行定量測(cè)定的試劑及測(cè)定方法，該試劑和測(cè)定方法在臨床檢查中是有用的。
而且，本發(fā)明還涉及一種色素穩(wěn)定劑、一種試劑和一種色素穩(wěn)定化方法，所述色素穩(wěn)定劑是用于酶反應(yīng)檢出的色素穩(wěn)定劑且以含有環(huán)糊精為特征，所述試劑含有環(huán)糊精和用于酶反應(yīng)檢出的色素，所述色素穩(wěn)定化方法在酶反應(yīng)的檢出中使用。此外，本發(fā)明還涉及一種用于測(cè)定糖化蛋白質(zhì)或糖化蛋白質(zhì)比率的試劑及方法，所述試劑和方法使用由環(huán)糊精穩(wěn)定化的色素。
此外，本發(fā)明還涉及一種利用蛋白酶反應(yīng)促進(jìn)劑和色素來(lái)測(cè)定糖化蛋白質(zhì)或糖化蛋白質(zhì)比率的試劑及方法，所述色素用于酶反應(yīng)的檢出，且該色素由環(huán)糊精穩(wěn)定化。本發(fā)明還涉及準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、迅速地對(duì)糖化血紅蛋白、血紅蛋白A1c和糖化白蛋白進(jìn)行定量的試劑及測(cè)定方法，該試劑和測(cè)定方法在臨床檢查中是有用的。
本申請(qǐng)求特愿2004-229498號(hào)和特愿2004-281226號(hào)的優(yōu)先權(quán)，并將上述申請(qǐng)的內(nèi)容以引用方式包含于本申請(qǐng)中。
背景技術(shù)：
在糖尿病的診斷和控制上，糖化蛋白質(zhì)的測(cè)定非常重要，其中，糖化白蛋白和血紅蛋白A1c在臨床上經(jīng)常作為不可缺少的指標(biāo)來(lái)使用。對(duì)于糖化白蛋白和血紅蛋白A1c的定量，一直使用電泳法、離子交換色譜法、親和色譜法和免疫法來(lái)進(jìn)行測(cè)定，不過(guò)，最近正在開(kāi)發(fā)研究能夠更簡(jiǎn)單地對(duì)大量試樣進(jìn)行大規(guī)模處理的酶法(非專利文獻(xiàn)1和2)。
酶法中最為熟知的方法是利用蛋白酶分解試樣中的糖化蛋白質(zhì)而對(duì)產(chǎn)生的糖化氨基酸或糖化肽進(jìn)行測(cè)定的方法，可是蛋白酶反應(yīng)一般較慢，即使使用大量的蛋白酶，也很難在短時(shí)間內(nèi)使蛋白質(zhì)100％地分解。而且，對(duì)于所產(chǎn)生的過(guò)氧化氫可以通過(guò)利用過(guò)氧化酶使色素顯色來(lái)進(jìn)行定量，但此時(shí)存在的問(wèn)題是，色素、尤其是無(wú)色型色素的穩(wěn)定性較差。
有些已知的方法是使用四唑鹽(非專利文獻(xiàn)2和專利文獻(xiàn)1～7)、磺酸化合物和/或硝基化合物(專利文獻(xiàn)8和9)作為測(cè)定糖化蛋白質(zhì)時(shí)使作為測(cè)定對(duì)象的蛋白質(zhì)變性而促進(jìn)蛋白酶反應(yīng)的添加物。但是，四唑鹽與諸如糖化蛋白質(zhì)或抗壞血酸等具有還原性的化合物強(qiáng)烈反應(yīng)而顯色，由此導(dǎo)致在糖化蛋白質(zhì)濃度高的試樣或含有抗壞血酸的試樣中出現(xiàn)異常值。而且磺酸化合物多為酶的抑制劑，特別是經(jīng)常使用的十二烷基硫酸鈉、十二烷基苯磺酸鈉、十二烷基硫酸鋰等是強(qiáng)效的抑制劑，以致于它們成為作用于糖化氨基酸和/或糖化肽的酶的反應(yīng)終止劑。另外，硝基化合物本身顯色，導(dǎo)致試劑空白值升高，測(cè)定準(zhǔn)確度下降。
如上所述，現(xiàn)在所使用的“使作為測(cè)定對(duì)象的蛋白質(zhì)變性而促進(jìn)酶反應(yīng)的添加物”不能令人滿意。
此外，作為使用無(wú)色型色素進(jìn)行測(cè)定的例子，已知有添加N-(羧甲基氨基羰基)-4，4-雙(二甲基氨基)聯(lián)苯胺(下文中有時(shí)記為DA64)來(lái)測(cè)定血紅蛋白A1c的文獻(xiàn)(非專利文獻(xiàn)2)，但該文獻(xiàn)中沒(méi)有關(guān)于試劑的穩(wěn)定性和保存方面的描述。迄今為止對(duì)于一種形態(tài)為液態(tài)、長(zhǎng)期穩(wěn)定且含有無(wú)色型色素的試劑尚未見(jiàn)公開(kāi)。
專利文獻(xiàn)1WO 02/27012號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)2WO 02/27330號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)3WO 2002/027331號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)4特開(kāi)2000-93199號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)5特開(kāi)2001-292795號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)6特開(kāi)2003-232789號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)7WO 2000/210100號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)8WO 2004/007760號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)9WO 03/107011號(hào)公報(bào)非專利文獻(xiàn)1Kouzuma et.al.，“An enzymatic method for themeasurement of glycated albumin in biological sample”，Clinica ChimicaActa，2002，324，p.61-71.
非專利文獻(xiàn)2Ikunosuke Sakurabayashi et.al.，“New enzymatic assayfor glycated hemoglobin”，Clinical Chemistry，2003，49，2，p.269-274.

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種蛋白酶反應(yīng)促進(jìn)劑，該蛋白酶反應(yīng)促進(jìn)劑比現(xiàn)有已知的蛋白酶反應(yīng)促進(jìn)劑更有用。而且，本發(fā)明的目的在于提供一種用于酶反應(yīng)檢出的色素穩(wěn)定劑。
此外，本發(fā)明的目的還在于提供一種試劑，所述試劑利用上述蛋白酶反應(yīng)促進(jìn)劑和/或上述穩(wěn)定劑，在臨床生化檢查、特別是血紅蛋白A1c和糖化白蛋白的測(cè)定中所述試劑是有用的，而且，本發(fā)明也提供應(yīng)用了上述試劑的測(cè)定方法。
為了解決上述課題，本發(fā)明人對(duì)四唑鹽以外的、不與還原性物質(zhì)反應(yīng)的、難以對(duì)酶活性產(chǎn)生影響的且不顯色的蛋白酶反應(yīng)促進(jìn)劑進(jìn)行了研究。并且，通過(guò)使用含DA64的無(wú)色型色素，對(duì)具有與文獻(xiàn)(IkunosukeSakurabayashi et.al.，“New enzymatic assay for glycated hemoglobin”，Clinical Chemistry，2003年，第49卷，第2期，p.269-274.)公開(kāi)的相同組成的試劑的保存穩(wěn)定性進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，于37℃保存3天后，色素明顯顯色，導(dǎo)致測(cè)定困難。于是，本發(fā)明人對(duì)于仍是未知化合物的、作為用于酶反應(yīng)檢出的色素穩(wěn)定劑進(jìn)行了研究。
本發(fā)明人還對(duì)用于測(cè)定血紅蛋白、糖化蛋白質(zhì)和糖化蛋白質(zhì)比率的試劑及使用了該試劑的測(cè)定方法進(jìn)行了研究，所述試劑的特征是使用上述酶反應(yīng)促進(jìn)劑和/或上述色素穩(wěn)定劑。進(jìn)而，還對(duì)一種在臨床生化檢查、特別是血紅蛋白A1c和糖化白蛋白的測(cè)定中有用的測(cè)定用試劑及應(yīng)用了該試劑的測(cè)定方法進(jìn)行了研究。
本發(fā)明人著眼于選擇一種化合物，該化合物能夠使血紅蛋白或糖化蛋白質(zhì)變性，從而改變血紅蛋白的顏色并且促進(jìn)蛋白酶反應(yīng)，并且本發(fā)明人用心選擇出不受還原性物質(zhì)的影響、不抑制酶的作用以及不會(huì)導(dǎo)致空白值升高的化合物并進(jìn)行了專心的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，含有乙酸基的化合物、N-?；；撬猁}或聚氧乙烯烷基醚硫酸鹽具有蛋白酶反應(yīng)促進(jìn)作用，此外還發(fā)現(xiàn)，使用這些化合物可以準(zhǔn)確地測(cè)定出血紅蛋白、糖化蛋白質(zhì)或糖化蛋白質(zhì)比率。
此外，本發(fā)明人對(duì)篩選用于酶反應(yīng)的檢出的色素穩(wěn)定劑進(jìn)行了專心研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通常所知道的作為穩(wěn)定劑有用的很多的糖類和表面活性劑的穩(wěn)定效果較小，或者即使能夠穩(wěn)定色素，也會(huì)抑制顯色。在這些化合物中，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了環(huán)糊精，其對(duì)用于酶反應(yīng)的檢出的色素具有較強(qiáng)的穩(wěn)定效果，且不抑制該色素的顯色反應(yīng)。然而，眾所周知，環(huán)糊精是通過(guò)將化合物包起來(lái)的包合作用來(lái)使化合物保持穩(wěn)定的。然而，還眾所周知，在很多情況下，化合物一旦被包合就一直保持被包在環(huán)糊精內(nèi)的狀態(tài)。在本發(fā)明中，在化合物被包在環(huán)糊精內(nèi)的情況下，雖然也曾擔(dān)心不會(huì)發(fā)生顯色反應(yīng)，但卻發(fā)現(xiàn)，色素、尤其是通過(guò)過(guò)氧化酶的作用而顯色的無(wú)色型色素意外地得到穩(wěn)定，并且發(fā)現(xiàn)顯色反應(yīng)也充分得到了保持。此外還發(fā)現(xiàn)，通過(guò)使過(guò)氧化氫酶共存且降低緩沖劑的濃度，會(huì)使在酶反應(yīng)的檢出中使用的色素更穩(wěn)定；而且，使用本發(fā)明的色素穩(wěn)定化方法和試劑能夠更靈敏更準(zhǔn)確地測(cè)定糖化蛋白質(zhì)。
另外，本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)了使用上述蛋白酶反應(yīng)促進(jìn)劑和/或上述色素穩(wěn)定劑的并且在臨床生化檢查、特別是在血紅蛋白A1c和糖化白蛋白的測(cè)定中有用的試劑及使用該試劑的測(cè)定方法，進(jìn)而完成了本發(fā)明。
即，本發(fā)明涉及下述內(nèi)容1)一種蛋白酶反應(yīng)促進(jìn)劑，該蛋白酶反應(yīng)促進(jìn)劑包含下述物質(zhì)中的至少一種含有乙酸基的化合物或其鹽、N-酰基牛磺酸或其鹽、或者聚氧乙烯烷基醚硫酸或其鹽；2)如上述1)所述的蛋白酶反應(yīng)促進(jìn)劑，其中，所述含有乙酸基的化合物或其鹽為N-?；被峄蚱潲}，或是烷基醚羧酸或其鹽；3)如上述2)所述的蛋白酶反應(yīng)促進(jìn)劑，其中，所述N-?；被峄蚱潲}為如下通式(1)所示的化合物或其鹽；R1-CO-R2(1)通式(1)中，R1表示烷基或烯基，R2表示從氨基酸或氨基酸衍生物的氨基上除去氫原子后得到的一價(jià)基團(tuán)；4)如上述3)所述的蛋白酶反應(yīng)促進(jìn)劑，其中，所述N-?；被峄蚱潲}滿足下述I)和/或II)I)R1為CH3(CH2)n-或十七碳-8-烯基，其中，n為10～14的整數(shù)；II)氨基酸或氨基酸衍生物為N-甲基丙氨酸或肌氨酸；5)如上述2)所述的蛋白酶反應(yīng)促進(jìn)劑，其中，所述烷基醚羧酸或其鹽為如下通式(2)所示的化合物，R3-O-(CH2-CH2-O)m-CH2COOM(2)通式(2)中，R3表示烷基，m表示3～10的整數(shù)，M表示氫原子或與羧酸形成鹽的金屬；6)如上述5)所述的蛋白酶反應(yīng)促進(jìn)劑，其中，R3為CH3(CH2)Q-，此處，Q為10或11；7)一種蛋白酶反應(yīng)促進(jìn)劑，其特征是，在對(duì)由蛋白酶反應(yīng)生成的產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)定的方法中，所述蛋白酶反應(yīng)促進(jìn)劑將蛋白酶反應(yīng)速率加快1.5倍以上，在所述蛋白酶反應(yīng)中，蛋白酶至少與蛋白酶反應(yīng)促進(jìn)劑共存，以使反應(yīng)得到促進(jìn)；8)一種試劑，其特征是，該試劑含有上述1)～7)任意一項(xiàng)所述的蛋白酶反應(yīng)促進(jìn)劑；9)一種試劑，其特征是，該試劑含有下述i)～iii)i)如上述1)～8)任意一項(xiàng)所述的蛋白酶反應(yīng)促進(jìn)劑；ii)蛋白酶；和iii)作用于糖化氨基酸和/或糖化肽的酶；10)如上述8)或9)所述的試劑，其特征是，所述試劑還含有蛋白酶穩(wěn)定劑、和/或作用于糖化氨基酸和/或糖化肽的酶的穩(wěn)定劑；
11)如上述8)～10)任意一項(xiàng)所述的試劑，其特征是，所述試劑為液態(tài)，在冷藏下能保持6個(gè)月以上的穩(wěn)定狀態(tài)；12)如上述9)～11)任意一項(xiàng)所述的試劑，其中，所述蛋白酶從糖化血紅蛋白或其片段的糖化后的β鏈N末端切掉糖化氨基酸和/或糖化肽，而不是實(shí)質(zhì)性地從糖化血紅蛋白或其片段的糖化后的α鏈N末端切掉糖化氨基酸和/或糖化肽；13)如上述9)～12)任意一項(xiàng)所述的試劑，其特征是，所述作用于糖化氨基酸和/或糖化肽的酶對(duì)糖化纈氨酰-組氨酸的作用高于對(duì)糖化纈氨酰-亮氨酸的作用；14)如上述8)～13)任意一項(xiàng)所述的試劑，其特征是，所述試劑還含有無(wú)色型色素和色素穩(wěn)定劑；15)如上述14)所述的試劑，其中，所述色素穩(wěn)定劑為環(huán)糊精；16)如上述8)～15)任意一項(xiàng)所述的試劑，其特征是，所述試劑還含有第一試劑和第二試劑；所述第一試劑含有蛋白酶；和作用于糖化氨基酸和/或糖化肽、能夠?qū)⒉挥裳t蛋白的β鏈N末端產(chǎn)生的糖化氨基酸和/或糖化肽消除的酶；所述第二試劑含有作用于糖化氨基酸和/或糖化肽、能夠?qū)⒂裳t蛋白的β鏈N末端產(chǎn)生的糖化氨基酸和/或糖化肽檢出的酶；17)如上述8)～15)任意一項(xiàng)所述的試劑，其特征是，所述試劑含有第一試劑和第二試劑所述第一試劑含有作用于糖化氨基酸和/或糖化肽的酶；所述第二試劑含有蛋白酶；18)如上述16)或17)所述的試劑，其特征是，所述第一試劑還含有過(guò)氧化氫酶和/或過(guò)氧化酶；19)如上述8)～18)任意一項(xiàng)所述的試劑，其特征是，在由第一試劑和第二試劑構(gòu)成的試劑盒中，在同一試劑中含有蛋白酶和過(guò)氧化氫酶，且在不含有過(guò)氧化氫酶的試劑中含有疊氮化鈉；20)一種促進(jìn)蛋白酶反應(yīng)的方法，所述方法利用上述1)～7)任意一項(xiàng)所述的蛋白酶反應(yīng)促進(jìn)劑來(lái)促進(jìn)蛋白酶反應(yīng)；
21)如上述20)所述的促進(jìn)蛋白酶反應(yīng)的方法，其特征是，利用上述7)所述的蛋白酶反應(yīng)促進(jìn)劑，將蛋白酶反應(yīng)速率加快1.5倍以上；22)一種測(cè)定血紅蛋白、血紅蛋白A1c或糖化白蛋白的方法，所述方法利用上述8)～19)任意一項(xiàng)所述的試劑來(lái)進(jìn)行測(cè)定；23)如上述22)所述的方法，其特征是，在同一反應(yīng)槽中連續(xù)進(jìn)行血紅蛋白的測(cè)定和血紅蛋白A1c的測(cè)定；24)如上述23)所述的方法，其特征是，在同一波長(zhǎng)下進(jìn)行血紅蛋白的測(cè)定和血紅蛋白A1c的測(cè)定；25)如上述24)所述的方法，其特征是，設(shè)定副波長(zhǎng)以測(cè)定出一個(gè)值，然后從測(cè)定值中減去該值；26)如上述22)～25)任意一項(xiàng)所述的方法，其特征是，特異性地測(cè)定血紅蛋白A1c的β鏈N末端的糖化肽；27)如上述22)～26)任意一項(xiàng)所述的方法，其特征是，以溶血液、血紅蛋白溶液或血紅蛋白的β鏈N末端的糖化肽為校正物質(zhì)來(lái)測(cè)定血紅蛋白A1c，然后由校準(zhǔn)曲線計(jì)算出定量值；28)如上述22)所述的方法，其特征是，在同一反應(yīng)槽中連續(xù)進(jìn)行白蛋白的測(cè)定和糖化白蛋白的測(cè)定；29)如上述28)所述的方法，其特征是，在同一波長(zhǎng)下進(jìn)行白蛋白的測(cè)定和糖化白蛋白的測(cè)定。
本發(fā)明還涉及一種計(jì)算血紅蛋白A1c值(％)的方法，其特征是，以選自糖化纈氨酰-組氨酸、糖化纈氨酰-組氨酰-亮氨酸、糖化纈氨酰-組氨酰-亮氨酰-蘇氨酸、糖化纈氨酰-組氨酰-亮氨酰-蘇氨酰-脯氨酸中的任意一個(gè)已知濃度的合成肽為校正物質(zhì)，基于以上述校正物質(zhì)所得到的測(cè)定值，求出試樣中的血紅蛋白A1c濃度，然后除以同時(shí)/或另外測(cè)定的總的血紅蛋白濃度，由此求出血紅蛋白A1c值(％)。
另外作為本發(fā)明的其他方式，本發(fā)明涉及蛋白酶反應(yīng)促進(jìn)劑、促進(jìn)蛋白酶反應(yīng)的方法、含有該蛋白酶反應(yīng)促進(jìn)劑的試劑、以及測(cè)定血紅蛋白、糖化蛋白質(zhì)或糖化蛋白質(zhì)比率的方法，這些試劑和方法在使用酶來(lái)對(duì)尤其是血液試樣中的血紅蛋白、糖化蛋白質(zhì)和糖化蛋白質(zhì)比率準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、迅速、廉價(jià)地進(jìn)行定量的方面是有用的。具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及一種試劑及應(yīng)用該試劑的測(cè)定方法，所述試劑是通過(guò)以下方法得到的將上述1)所述的蛋白酶反應(yīng)促進(jìn)劑添加到在同一反應(yīng)槽中連續(xù)測(cè)定糖化蛋白質(zhì)的方法中所使用的試劑中，從而得到所述試劑。更詳細(xì)地說(shuō)，通常通過(guò)分別進(jìn)行蛋白質(zhì)的測(cè)定和糖化蛋白質(zhì)的測(cè)定來(lái)?yè)Q算糖化蛋白質(zhì)比率。然而，本發(fā)明人另外開(kāi)發(fā)出在同一反應(yīng)槽中連續(xù)進(jìn)行這些測(cè)定的方法(參見(jiàn)特開(kāi)2001-204495號(hào)公報(bào)等)。只要將該方法與本發(fā)明的蛋白酶反應(yīng)促進(jìn)劑相組合，則能夠更快更準(zhǔn)確地進(jìn)行測(cè)定，本發(fā)明也包括這種組合等。
另外，本發(fā)明還涉及如下內(nèi)容30)一種色素穩(wěn)定劑，該色素用于酶反應(yīng)的檢出，所述色素穩(wěn)定劑的特征在于含有環(huán)糊精；31)如上述30)所述的穩(wěn)定劑，其特征是，所述環(huán)糊精為β-環(huán)糊精類；32)如上述31)所述的穩(wěn)定劑，其特征是，所述β-環(huán)糊精類為甲基-β-環(huán)糊精或2-羥丙基-β-環(huán)糊精；33)如上述30)～32)任意一項(xiàng)所述的穩(wěn)定劑，其特征是，在酶反應(yīng)的檢出中使用的色素是通過(guò)過(guò)氧化酶的作用而顯色的色素；34)如上述33)所述的穩(wěn)定劑，其特征是，通過(guò)過(guò)氧化酶的作用而顯色的色素是無(wú)色型色素；35)一種試劑，所述試劑含有上述30)～34)任意一項(xiàng)所述的穩(wěn)定劑和在酶反應(yīng)的檢測(cè)中使用的色素；36)如上述35)所述的試劑，其特征是，所述試劑含有過(guò)氧化氫酶；37)如上述35)或36)所述的試劑，其特征是，所述試劑還含有測(cè)定時(shí)濃度為80mM以下的緩沖劑；38)如上述35)～37)任意一項(xiàng)所述的試劑，其特征是，所述試劑還含有蛋白酶；39)如上述38)所述的試劑，其特征是，所述試劑還含有蛋白酶反應(yīng)促進(jìn)劑；
40)如上述35)～39)任意一項(xiàng)所述的試劑，其特征是，在測(cè)定時(shí)，環(huán)糊精的濃度為0.5重量％以上；41)如上述35)～40)任意一項(xiàng)所述的試劑，其特征是，所述試劑為液態(tài)，并且在冷藏下能保持6個(gè)月以上的穩(wěn)定狀態(tài)；42)一種色素的穩(wěn)定化方法，所述色素用于酶反應(yīng)的檢出，所述穩(wěn)定化方法的特征是，利用上述30)～34)任意一項(xiàng)所述的穩(wěn)定劑；43)一種糖化蛋白質(zhì)或糖化蛋白質(zhì)比率的測(cè)定方法，其特征是，所述方法利用上述35)～41)任意一項(xiàng)所述的試劑；44)如上述43)所述的方法，其特征是，所述糖化蛋白質(zhì)是糖化白蛋白、糖化血紅蛋白、或血紅蛋白A1c，所述糖化蛋白質(zhì)比率是糖化白蛋白值、糖化血紅蛋白值、或血紅蛋白A1c值；45)環(huán)糊精的一種用途，其用途為穩(wěn)定在酶反應(yīng)的檢出中使用的色素；46)環(huán)糊精的一種用途，其用途為制造上述35)～41)任意一項(xiàng)所述的試劑。
此外，本發(fā)明涉及用于酶反應(yīng)檢出的色素的穩(wěn)定化方法和使該色素穩(wěn)定化的試劑，本發(fā)明還涉及使用上述試劑和方法來(lái)對(duì)尤其是血液試樣中的糖化蛋白質(zhì)和糖化蛋白質(zhì)比率準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、迅速、廉價(jià)地進(jìn)行定量的試劑及測(cè)定方法。
本發(fā)明的含有酶反應(yīng)促進(jìn)劑的試劑，通過(guò)將其添加至用于測(cè)定糖化蛋白質(zhì)和糖化蛋白質(zhì)比率的試劑中，由此具有能夠準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、迅速地進(jìn)行上述測(cè)定的效果，利用該效果，具有能夠大量、廉價(jià)地提供測(cè)定用試劑的效果。
而且，通過(guò)提供用于酶反應(yīng)的檢出的色素穩(wěn)定劑，由此能夠提供該色素的穩(wěn)定化方法；含有該色素的試劑，其流通時(shí)的保存穩(wěn)定性優(yōu)異；以及使用上述試劑測(cè)定糖化蛋白質(zhì)及糖化蛋白質(zhì)比率的方法及測(cè)定用試劑。
本發(fā)明的試劑含有蛋白酶反應(yīng)促進(jìn)劑以及用于酶反應(yīng)檢出的色素穩(wěn)定劑，由此所能夠提供的試劑可以準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、迅速地對(duì)臨床檢查中有用的血紅蛋白、血紅蛋白A1c和糖化白蛋白進(jìn)行定量測(cè)定，并且該試劑在流通時(shí)的保存穩(wěn)定性優(yōu)異。


圖1是基于本發(fā)明的實(shí)施例9的血紅蛋白的測(cè)定結(jié)果。
圖2是基于本發(fā)明的實(shí)施例10的血紅蛋白A1c的測(cè)定結(jié)果。
圖3是基于本發(fā)明的實(shí)施例10的血紅蛋白的測(cè)定結(jié)果。
圖4是基于本發(fā)明的實(shí)施例12的糖化白蛋白的測(cè)定結(jié)果。
圖5是基于本發(fā)明的實(shí)施例18的血紅蛋白A1c的校準(zhǔn)曲線。
圖6是基于本發(fā)明的實(shí)施例18的血紅蛋白的校準(zhǔn)曲線。
圖7是基于本發(fā)明的實(shí)施例19的糖化白蛋白的測(cè)定結(jié)果。圖中，實(shí)心□表示白蛋白濃度，實(shí)心菱形表示糖化白蛋白濃度，實(shí)心△表示糖化白蛋白值。
具體實(shí)施例方式
下面對(duì)本發(fā)明的構(gòu)成及優(yōu)選方式進(jìn)行更詳細(xì)的說(shuō)明。
作為能夠在本發(fā)明中使用的蛋白酶反應(yīng)促進(jìn)劑，只要其能夠促進(jìn)蛋白酶反應(yīng)、且不受還原性物質(zhì)的影響、對(duì)同時(shí)使用的酶活性沒(méi)有抑制以及不會(huì)影響空白吸光率，就可以使用任意蛋白酶促進(jìn)劑，例如優(yōu)選陰離子型表面活性劑，其中更優(yōu)選含有乙酸基的化合物或其鹽、N-?；；撬峄蚱潲}、聚氧乙烯烷基醚硫酸或其鹽。作為蛋白酶反應(yīng)促進(jìn)用試劑可以使用組合物，所述組合物含有至少一種能夠用于本發(fā)明的蛋白酶反應(yīng)促進(jìn)劑。
作為含有乙酸基的化合物或其鹽，優(yōu)選N-酰基氨基酸或其鹽、烷基醚羧酸或其鹽、醋酸甜菜堿型兩性表面活性劑、咪唑啉型兩性表面活性劑，更優(yōu)選N-酰基氨基酸或其鹽、烷基醚羧酸或其鹽，特別優(yōu)選N-?；被峄蚱潲}。而且，作為本發(fā)明的其他方式，有時(shí)更加優(yōu)選烷基醚羧酸或其鹽。另外，含有乙酸基的化合物不包括乙酸，其鹽可以是任何鹽，只要該鹽具有可與羧酸形成鹽的金屬離子即可。
作為能夠在本發(fā)明中使用的N-?；被峄蚱潲}，優(yōu)選如下通式(1)所示的化合物或其鹽，R1-CO-R2(1)通式(1)中，R1表示烷基或烯基，R2表示從氨基酸或氨基酸衍生物中的氨基上除去氫原子后得到的一價(jià)基團(tuán)。
R1表示烷基或烯基。作為R1表示的烷基，優(yōu)選直鏈狀或分支狀的碳原子數(shù)為11～15的烷基，特別優(yōu)選直鏈狀的碳原子數(shù)為11～15的烷基，即CH3(CH2)n-(其中，n為10～14的整數(shù))，其中最優(yōu)選直鏈狀的碳原子數(shù)為11的烷基(CH3(CH2)10-，十一烷基)(或以CH3(CH2)10-CO-表示的月桂?；?。作為R1表示的烯基，優(yōu)選直鏈狀或分支狀的碳原子數(shù)為11～15的烯基，更優(yōu)選直鏈狀的碳原子數(shù)為17或19的烯基，特別優(yōu)選直鏈狀的碳原子數(shù)為17的烯基。作為雙鍵的數(shù)量，優(yōu)選2或1，特別優(yōu)選1。即，優(yōu)選C17H31-或C17H33-，特別優(yōu)選C17H33-。作為雙鍵的位置，優(yōu)選至少在第8位碳上具有雙鍵。作為R1表示的烯基的具體例子，可以舉出從油酸中除去羧酸的基團(tuán)(CH3(CH2)7CH＝CH(CH2)7-、十七碳-8-烯基)、從亞油酸中除去羧酸的基團(tuán)(CH3(CH2)4CH＝CH(CH2)CH＝CH(CH2)7-、十七碳-8，11-二烯基)等。
作為R1，優(yōu)選CH3(CH2)n-(其中，n為10～14的整數(shù))或十七碳-8-烯基，特別優(yōu)選十七碳-8-烯基。而且作為本發(fā)明的其他方式，有時(shí)優(yōu)選CH3(CH2)n-(其中，n為10～14的整數(shù))，其中特別優(yōu)選CH3(CH2)10-。
R2表示從氨基酸或氨基酸衍生物中的氨基上除去氫原子后得到的一價(jià)基團(tuán)。從所述氨基上除去氫原子后得到的一價(jià)基團(tuán)部分與通式(1)中的-CO-形成肽鍵。作為氨基酸或氨基酸衍生物，可以為任意化合物，只要是具有氨基和羧酸基的化合物即可，優(yōu)選標(biāo)準(zhǔn)氨基酸或其衍生物。作為標(biāo)準(zhǔn)氨基酸，優(yōu)選非極性側(cè)鏈氨基酸。具體地說(shuō)，優(yōu)選甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸，更優(yōu)選甘氨酸、丙氨酸或纈氨酸，最優(yōu)選甘氨酸或丙氨酸。
作為標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的衍生物，優(yōu)選標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的N-烷基取代物，具體地說(shuō)，優(yōu)選N-甲基取代物。而且，作為標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的衍生物，優(yōu)選N-甲基丙氨酸或肌氨酸，特別優(yōu)選肌氨酸。另外，作為本發(fā)明的其他方式，有時(shí)也優(yōu)選N-甲基丙氨酸。
作為通式(1)所示的化合物，優(yōu)選其游離體(free body)或其鹽。作為形成鹽的金屬，可以是任何金屬，只要該金屬能夠與羧酸形成鹽即可，可以舉出例如鋰、鈉、鉀、鎂、鈣、鋇或銫。作為形成鹽的金屬，優(yōu)選鋰、鈉、鉀、鎂或鈣，更優(yōu)選鈉或鉀，特別優(yōu)選鈉。而且，作為本發(fā)明的其他方式，有時(shí)也優(yōu)選鉀。作為以通式(1)表示的化合物優(yōu)選游離體。
作為以通式(1)表示的化合物，作為優(yōu)選例，可以具體地舉出椰油酰肌氨酸鈉、月桂酰肌氨酸、月桂酰肌氨酸鈉、月桂酰肌氨酸鉀、肉豆蔻酰肌氨酸鈉、棕櫚酰肌氨酸鈉、油酰肌氨酸、或月桂酰甲基丙氨酸鈉等；作為更優(yōu)選的例子，可以舉出椰油酰肌氨酸鈉、肉豆蔻酰肌氨酸鈉、棕櫚酰肌氨酸鈉、或月桂酰甲基丙氨酸鈉；作為最優(yōu)選的例子，可以舉出月桂酰甲基丙氨酸鈉。
以通式(1)表示的化合物可以通過(guò)公知的方法合成，例如，可以在公知的肽化條件下使下述兩種物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)來(lái)得到能夠通過(guò)市售得到的長(zhǎng)鏈脂肪酸R1-COOH(R1與上述意義相同)和能夠通過(guò)市售得到的氨基酸R2-H(R2與上述意義相同)。而且，以通式(1)表示的化合物也可以使用市售品，例如，可以從Nikko Chemicals Co.，Ltd.獲得后使用。也可以根據(jù)需要將這些化合物進(jìn)行脫羧酸化后使用，或是使這些化合物與金屬鹽化之后使用。
而且，作為烷基醚羧酸或其鹽，優(yōu)選如下通式(2)所示的化合物，R3-O-(CH2-CH2-O)m-CH2COOM(2)通式(2)中，R3表示烷基，m表示3～10的整數(shù)，M表示氫原子或與羧酸形成鹽的金屬。
R3為烷基。作為R3表示的烷基，優(yōu)選直鏈狀或分支狀的碳原子數(shù)為11～12的烷基，特別優(yōu)選直鏈狀的碳原子數(shù)為11～12的烷基，即CH3(CH2)Q-(其中，Q為10或11)。
作為R3，優(yōu)選CH3(CH2)10-。另外，作為本發(fā)明的其他方式，有時(shí)也優(yōu)選CH3(CH2)11-。
m表示3～10的整數(shù)。作為m，優(yōu)選3～10的整數(shù)，優(yōu)選3、6、10，更優(yōu)選6、10，特別優(yōu)選6。另外，作為本發(fā)明的其他方式，有時(shí)優(yōu)選m為10。
M表示氫原子或與羧酸形成鹽的金屬。作為形成鹽的金屬，可以是是任何金屬，只要該金屬能夠與羧酸形成鹽即可，可以舉出例如鋰、鈉、鉀、鎂、鈣、鋇或銫。作為M，優(yōu)選氫原子、鋰、鈉、鉀、鎂或鈣，更優(yōu)選氫原子、鈉或鉀，特別優(yōu)選鈉。另外，有時(shí)也優(yōu)選氫原子。作為本發(fā)明的其他方式，有時(shí)也優(yōu)選鉀。
作為以通式(2)表示的化合物，作為優(yōu)選例，具體地可以舉出聚氧乙烯(3)十三烷基醚乙酸鈉、聚氧乙烯(6)十三烷基醚乙酸鈉、聚氧乙烯(3)十三烷基醚乙酸、聚氧乙烯(7)十三烷基醚乙酸、聚氧乙烯(4.5)月桂基醚乙酸鈉、聚氧乙烯(4.5)月桂基醚乙酸、聚氧乙烯(10)月桂基醚乙酸鈉、或聚氧乙烯(10)月桂基醚乙酸等，作為特別優(yōu)選的例子，可以舉出聚氧乙烯(3)十三烷基醚乙酸鈉、聚氧乙烯(6)十三烷基醚乙酸鈉、或聚氧乙烯(10)月桂基醚乙酸。
以通式(2)表示的化合物可以通過(guò)公知的方法合成，例如，可以在公知的醚化條件下使下述兩種物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)來(lái)得到能夠通過(guò)市售得到的R3-O-(CH2-CH2-O)m-1-CH2-CH2-OH(R3和m與上述意義相同)和能夠通過(guò)市售得到的鹵代乙酸衍生物X-CH2COOM(M與上述意義相同，X表示溴原子或氯原子)。而且，以通式(2)表示的化合物也可以使用市售品，例如，可以從Nikko Chemicals Co.，Ltd.獲得后使用。也可以根據(jù)需要將這些化合物進(jìn)行脫羧酸化后使用，或是使這些化合物與金屬鹽化之后使用。
作為能夠在本發(fā)明中使用的N-?；；撬峄蚱潲}，可以舉出N-椰油酰甲基?；撬徕c、N-月桂酰甲基?；撬徕c、N-肉豆蔻酰甲基?；撬徕c、N-棕櫚酰甲基?；撬徕c或N-硬脂酰甲基?；撬徕c等；作為特別優(yōu)選的例子，可以舉出N-月桂酰甲基?；撬徕c或N-硬脂酰甲基牛磺酸鈉，但是可以使用任意化合物，只要是N-?；；撬峄蚱潲}就可以，也可以使用游離N-酰基?；撬帷?br> 能夠用于本發(fā)明的N-?；；撬峄蚱潲}可以通過(guò)公知的方法合成，例如，可以通過(guò)使下述兩種物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)來(lái)得到能夠通過(guò)市售得到的?；撬岷湍軌蛲ㄟ^(guò)市售得到的?；瘎?。而且，能夠用于本發(fā)明的N-?；；撬峄蚱潲}也可以使用市售品，例如，可以從Nikko Chemicals Co.，Ltd.獲得后使用。也可以根據(jù)需要將這些化合物進(jìn)行脫羧酸化后使用，或是使這些化合物與金屬鹽化之后使用。
另外，作為能夠在本發(fā)明中使用的聚氧乙烯烷基醚硫酸或其鹽，可以舉出聚氧乙烯(2)月桂基醚硫酸鈉、聚氧乙烯(3)月桂基醚硫酸鈉、聚氧乙烯(4)月桂基醚硫酸鈉、聚氧乙烯(2)月桂基醚硫酸三乙醇胺、聚氧乙烯(4)月桂基醚硫酸三乙醇胺、聚氧乙烯(3)烷基醚硫酸三乙醇胺、聚氧乙烯(3)烷基醚硫酸鈉、或聚氧乙烯(4)壬基苯基醚硫酸鈉等；作為特別優(yōu)選的例子，可以舉出聚氧乙烯(2)月桂基醚硫酸三乙醇胺、聚氧乙烯(4)月桂基醚硫酸三乙醇胺、或聚氧乙烯(3)烷基醚硫酸三乙醇胺。但是，可以使用任意化合物，只要是聚氧乙烯烷基醚硫酸或其鹽就可以，也可以使用游離聚氧乙烯烷基醚硫酸。
能夠在本發(fā)明中使用的聚氧乙烯烷基醚硫酸或其鹽可以使用市售品，例如，可以從Nikko Chemicals Co.，Ltd.獲得后使用。
結(jié)果，作為本發(fā)明的蛋白酶反應(yīng)促進(jìn)劑，具體地說(shuō)，優(yōu)選椰油酰肌氨酸鈉、肉豆蔻酰肌氨酸鈉、棕櫚酰肌氨酸鈉、月桂酰甲基丙氨酸鈉、聚氧乙烯(3)十三烷基醚乙酸鈉、聚氧乙烯(6)十三烷基醚乙酸鈉、聚氧乙烯(10)月桂基醚乙酸、N-月桂酰甲基?；撬徕c、N-硬脂酰甲基?；撬徕c、聚氧乙烯(2)月桂基醚硫酸三乙醇胺、聚氧乙烯(4)月桂基醚硫酸三乙醇胺、或聚氧乙烯(3)烷基醚硫酸三乙醇胺。更優(yōu)選月桂酰甲基丙氨酸鈉、聚氧乙烯(3)十三烷基醚乙酸鈉、聚氧乙烯(6)十三烷基醚乙酸鈉、聚氧乙烯(10)月桂基醚乙酸、N-月桂酰甲基?；撬徕c、N-硬脂酰甲基?；撬徕c、聚氧乙烯(2)月桂基醚硫酸三乙醇胺、聚氧乙烯(4)月桂基醚硫酸三乙醇胺、或聚氧乙烯(3)烷基醚硫酸三乙醇胺，最優(yōu)選月桂酰甲基丙氨酸鈉。
這些蛋白酶反應(yīng)促進(jìn)劑的使用濃度，可以使用任意濃度，只要該濃度能夠使蛋白酶對(duì)蛋白質(zhì)的作用變大即可，例如，該濃度下限通常為0.01％以上，優(yōu)選為0.05％以上，最優(yōu)選為0.1％以上；該濃度上限為50％以下，優(yōu)選為40％以下，最優(yōu)選為30％以下。
另外，作為本發(fā)明的蛋白酶反應(yīng)促進(jìn)劑，只要該促進(jìn)劑能將蛋白酶反應(yīng)速率加快1.25倍以上即可。但所述蛋白酶反應(yīng)促進(jìn)劑用于血紅蛋白A1c的測(cè)定時(shí)，優(yōu)選所述蛋白酶反應(yīng)速率加快1.5倍以上，更優(yōu)選加快2倍以上，最優(yōu)選加快2.5倍以上。在所述蛋白酶反應(yīng)促進(jìn)劑用于糖化白蛋白的測(cè)定時(shí)，由于蛋白酶容易發(fā)揮作用，所以只要能得到1.5倍以上的蛋白酶反應(yīng)速率即可。
對(duì)于蛋白酶反應(yīng)的促進(jìn)程度可以通過(guò)使用實(shí)施例1的方法來(lái)判斷求出血紅蛋白A1c值高的試樣和血紅蛋白A1c值低的試樣的吸光度之差，計(jì)算所述吸光度之差是未添加反應(yīng)促進(jìn)劑時(shí)(對(duì)照)的倍數(shù)。順便提及，在對(duì)照中，可以使用未添加反應(yīng)促進(jìn)劑的試驗(yàn)溶液，或是使用添加了未確認(rèn)是否具有反應(yīng)促進(jìn)效果的糖類例如山梨糖醇等以代替反應(yīng)促進(jìn)劑的試驗(yàn)溶液。在對(duì)白蛋白進(jìn)行蛋白酶反應(yīng)促進(jìn)劑的篩選中，可以將試樣替換為糖化白蛋白值高的試樣和糖化白蛋白值低的試樣。
并且，在本發(fā)明中，至少使蛋白酶和蛋白酶反應(yīng)促進(jìn)劑共存從而使蛋白酶反應(yīng)得到促進(jìn)，由該蛋白酶反應(yīng)產(chǎn)生的物質(zhì)包括糖化氨基酸、糖化肽、氨基酸和肽等，其中優(yōu)選糖化氨基酸或糖化肽。作為測(cè)定上述由蛋白酶反應(yīng)產(chǎn)生的物質(zhì)的方法，可以舉出例如測(cè)定血紅蛋白A1c和糖化白蛋白的方法，但是，所述測(cè)定上述由蛋白酶反應(yīng)產(chǎn)生的物質(zhì)的方法也可以應(yīng)用于其他物質(zhì)的測(cè)定方法。
作為能夠在本發(fā)明中使用的蛋白酶，可以使用任意蛋白酶，只要該蛋白酶能夠有效作用于糖化蛋白質(zhì)且有效生成衍生自該蛋白質(zhì)的糖化氨基酸和/或糖化肽即可。作為優(yōu)選例，可以舉出例如衍生自動(dòng)物、植物的蛋白酶；衍生自芽孢桿菌(Bacillus)屬、曲霉(Aspergillus)屬、根霉(Rhizopus)屬、青霉(Penicillium)屬、鏈霉(Streptomyces)屬、葡萄球菌(Staphylococcus)屬、芽孢梭菌(Clostridium)屬、溶桿菌(Lysobacter)屬、奇果菌(Grifola)屬、酵母(Yeast)、麥軸梗霉(Tritirachium)屬、棲熱菌(Thermus)屬、假單胞菌(Pseudomonus)屬、或無(wú)色桿菌(Achromobacter)屬等微生物的蛋白酶等。作為衍生自芽孢桿菌屬微生物的蛋白酶，例如可優(yōu)選舉出枯草桿菌蛋白酶(subtilisin)和金屬蛋白酶等。
并且，作為測(cè)定對(duì)象的糖化蛋白質(zhì)為糖化白蛋白的情況下，更優(yōu)選衍生自芽孢桿菌屬和鏈霉屬微生物的蛋白酶，因?yàn)檫@些蛋白酶對(duì)人體白蛋白的作用較大。特別優(yōu)選衍生自芽孢桿菌屬的蛋白酶，例如枯草桿菌蛋白酶(Subtilisin)、蛋白酶型-VIII、蛋白酶型-IX、蛋白酶型-X、蛋白酶型-XV、蛋白酶型-XXIV、蛋白酶型-XXVII、蛋白酶型-XXXI(以上蛋白酶為Sigma Aldrich Japan K.K.制造)；嗜熱菌蛋白酶(Thermolysin)和枯草菌蛋白酶(Nagarse)(以上蛋白酶為Wako Pure Chemical Industries，Inc.制造)；Olientase-90N、Olientase-10NL、Olientase-22BF、Olientase-Y和Olientase-5BL、以及Nuclerisin(以上蛋白酶為HBI Enzymes Inc.制造)；枯草桿菌堿性蛋白酶(Proleather)、蛋白酶-N、蛋白酶-NL和蛋白酶-S″Amano″(以上蛋白酶為Amano Enzymes Inc.制造)；GODO-BNP和GODO-BAP(以上蛋白酶為GODO SHUSEI CO.，LTD.制造)；Protin-A、Protin-P、Deskin、Depireisu、Biosoak和高溫蛋白酶(以上蛋白酶為DaiwaKasei K.K.制造)；Toyozyme NEP(Toyobo Co.，Ltd.制造)；中性蛋白酶(Neutrase)、Esperase、Savinase、Durazyme、Biofeed Pro、Alcalase、NUE、Pyrase、Clear Lens Pro、Everlase、Novozyme-FM和Novolan(以上蛋白酶為Novozymes制造)；Enzylon-NBS和Enzylon-SA(以上蛋白酶為RakutoKasei Industrial Co.，Ltd.制造)；堿性蛋白酶GL440、OptiClean-M375 plus、OptiClean-L1000和OptiClean-ALP440(以上蛋白酶為Kyowa Hakko Co.，Ltd.制造)；Bioprase ALP-30、Sp-4FG、XL-416F和AL-15FG(以上蛋白酶為Nagase ChemteX Co.制造)；Aloase AP-10和蛋白酶YB(以上蛋白酶為Yakult Pharmaceutical Inc.Co.，Ltd.制造)；Corolase-N、Corolase-7089和Veron W(以上蛋白酶為Higuchi Shokai Co.，Ltd.制造)；和脂肪酶(Chirazyme)P-1(Roche Diagnostics K.K.制造)等。最優(yōu)選枯草桿菌蛋白酶(subtilisin)、枯草菌蛋白酶(Nagarse)、蛋白酶型-XXVII、和脂肪酶P-1。
另外，作為測(cè)定對(duì)象的糖化蛋白質(zhì)為血紅蛋白A1c的情況下，優(yōu)選衍生自芽孢桿菌屬、曲霉屬、鏈霉屬、麥軸梗霉屬和溶桿菌屬(Lysobacter)的蛋白酶，因?yàn)檫@些蛋白酶對(duì)人體血紅蛋白的作用較大。更優(yōu)選衍生自芽孢桿菌屬、曲霉屬、鏈霉屬和麥軸梗霉屬的蛋白酶，在本發(fā)明的一些方式中更優(yōu)選衍生自溶桿菌屬的蛋白酶。進(jìn)一步優(yōu)選衍生自芽孢桿菌屬或溶桿菌屬的蛋白酶，所述蛋白酶從糖化血紅蛋白或其片段的糖化后的β鏈N末端切掉糖化氨基酸和/或糖化肽，而不是實(shí)質(zhì)性地從糖化血紅蛋白或其片段的糖化后的α鏈N末端切掉糖化氨基酸和/或糖化肽。最優(yōu)選衍生自芽孢桿菌(Bacillus sp.)、嗜熱解朊芽孢桿菌(Bacillusthermoproteolyticus Rokko)、或溶桿菌屬(Lysobacter enzymogenes)的蛋白酶。另外，作為蛋白酶的優(yōu)選具體例，可以舉出例如衍生自嗜熱解朊芽孢桿菌(Bacillus thermoproteolyticus Rokko)的嗜熱菌蛋白酶和高溫蛋白酶(thermoase)(Daiwa Kasei K.K.制造)；Toyozyme NEP(Toyobo Co.，Ltd.制造)；衍生自芽孢桿菌(Bacillus sp.)的蛋白酶(芽孢桿菌ASP-842 FERMBP-08641)、和衍生自溶桿菌屬(Lysobacter enzymogenes)的蛋白酶(Lysobacter enzymogenes YK366 FERM BP-10010)等。優(yōu)選嗜熱菌蛋白酶和衍生自溶桿菌屬(Lysobacter enzymogenes)的蛋白酶，特別優(yōu)選嗜熱菌蛋白酶。另外，在本發(fā)明的其他方式中也特別優(yōu)選衍生自溶桿菌屬(Lysobacter enzymogenes)的蛋白酶。
對(duì)于能夠用于本發(fā)明的蛋白酶的活性，是通過(guò)采用酪蛋白-Folin法來(lái)進(jìn)行測(cè)定的。而且，可以利用WO 2004/104203號(hào)公報(bào)或特開(kāi)2003-344052號(hào)公報(bào)記載的方法確認(rèn)如下的酶基質(zhì)的特異性從糖化血紅蛋白或其片段的糖化后的β鏈N末端切掉糖化氨基酸和/或糖化肽，而不是實(shí)質(zhì)性地從糖化血紅蛋白或其片段的糖化后的α鏈N末端切掉糖化氨基酸和/或糖化肽。例如，WO 2004/104203號(hào)公報(bào)中記載的確認(rèn)方法是使用例如在血紅蛋白的α鏈N末端和β鏈N末端具有5個(gè)殘基的糖化肽，若只能夠生成諸如糖化纈氨酰-組氨酸、糖化纈氨酰-組氨酰-亮氨酸或糖化纈氨酰-組氨酰-亮氨酰-蘇氨酸等β鏈N末端的糖化肽，而不產(chǎn)生糖化纈氨酰-亮氨酸、糖化纈氨酰-亮氨酰-絲氨酸或糖化纈氨酰-亮氨酰-絲氨酰-脯氨酸，則該蛋白酶可以利用。此外，特開(kāi)2003-344052號(hào)公報(bào)記載的確認(rèn)方法是，使用糖化纈氨酰-組氨酰-對(duì)硝基苯胺和糖化纈氨酰-亮氨酰-對(duì)硝基苯胺，若只能夠從糖化纈氨酰-組氨酰-對(duì)硝基苯胺中分解出對(duì)硝基苯胺，則該蛋白酶可以利用。
作為能夠用于本發(fā)明的作用于糖化氨基酸和/或糖化肽的酶，可以使用任意酶，只要該酶能夠?qū)σ蛏鲜龅鞍酌傅淖饔枚商腔鞍踪|(zhì)生成的糖化氨基酸和/或糖化肽產(chǎn)生有效作用、并且能夠?qū)嵸|(zhì)性地測(cè)定糖化蛋白質(zhì)即可。作為作用于糖化氨基酸和/或糖化肽的酶的優(yōu)選例，可以舉出良好地作用于具有糖化α氨基的氨基酸和/或具有糖化α氨基的肽的酶；和良好地作用于具有糖化ε氨基的氨基酸和/或具有糖化ε氨基的肽的酶等。酶的種類有脫氫酶、氧化酶和激酶等，其中優(yōu)選被廣泛研究的氧化酶。
作用于糖化氨基酸和/或糖化肽的酶中，作為良好地作用于具有糖化ε氨基的氨基酸和/或具有糖化ε氨基的肽的酶的例子，可以舉出衍生自赤霉(Gibberella)屬、曲霉(Aspergillus)屬、念珠菌(Candida)屬、青霉(Penicillium)屬、鐮刀菌(Fusarium)屬、枝頂孢(Acremonium)屬、或德巴利酵母(Debaryomyces)屬的氧化酶。
此外，作為即使在與蛋白酶共存的狀態(tài)下也具有充分的活性、且能夠廉價(jià)地制造的酶的例子，可以舉出基因重組型酮胺氧化酶(KAOD，Asahi Kasei Pharma Co.制造；記載于Clinica Chimica Acta，2002，324，p.61-71)和變異型KAOD(KAOD-V，Asahi Kasei Pharma Co.制造，WO02/27330號(hào)公報(bào)中記載的含有FOD基因的轉(zhuǎn)化體微生物JM109·pcmFOD5(FERM BP-7848)所產(chǎn)生的KAOD)，所述變異型KAOD使糖化纈氨酸的反應(yīng)性顯著降低。另外，按照文獻(xiàn)(Clinia Chimica Acta，2002，324，p.61-71.)記載的方法測(cè)定作用于糖化氨基酸和/或糖化肽的酶的活性。
此外，作用于糖化氨基酸和/或糖化肽的酶中，作為良好地作用于具有糖化α氨基的氨基酸和/或具有糖化α氨基的肽的酶的例子，可以舉出衍生自棒狀桿菌(Corynebacterium)的氧化酶、上述基因重組型酮胺氧化酶(KAOD，Asahi Kasei Pharma Co.制造；記載于Clinica Chimica Acta，2002，324，p.61-71)、以及在測(cè)定血紅蛋白A1c時(shí)有用的、對(duì)糖化纈氨酰-組氨酸的作用高于對(duì)糖化纈氨酰-亮氨酸的酶，所述對(duì)糖化纈氨酰-組氨酸的作用高于對(duì)糖化纈氨酰-亮氨酸的酶衍生自Stephylium屬、新赤殼屬(Neoeosmospora)、Achaetomium屬、毛殼菌屬(Chaetomium)、錐毛殼屬(Coniochaeta)、Coniochaetidium屬、節(jié)菱孢屬(Arthrinium)、棘殼孢屬(Pyrenochaeta)、Leptospheria屬(Leptospira鉤端螺旋體屬)、格孢腔菌屬(Pleospora)、蛇孢腔菌屬(Ophiobolus)、彎孢霉菌屬(Curvularia)、和莖點(diǎn)霉屬(Phoma)。
此外，作用于糖化氨基酸和/或糖化肽的酶中，作為在測(cè)定血紅蛋白A1c時(shí)有用的、對(duì)糖化纈氨酰-組氨酸的作用高于對(duì)糖化纈氨酰-亮氨酸的酶的更優(yōu)選的例子，可以舉出衍生自下述菌株的酶Stephylium sp.菌株、侵管新赤殼(Neocosmospora vasinfecta)IFO7590菌株、WO 2004/104203號(hào)公報(bào)中記載的侵管新赤殼(Neocosmospora vasinfecta)474菌株、Achaetomium sp.菌株、毛殼菌屬菌株、錐毛殼屬菌株或Coniochaetidiumsavoryi ATCC菌株、節(jié)菱孢屬TO6、暗孢節(jié)菱孢NBRC31950、暗孢節(jié)菱孢NBRC6620、Arthrinium japonicum NBRC31098、棘殼孢屬YH807、Pyrenochaeta gentianicola MAFF425531、Pyrenochaeta terrestrisNBRC3 0929、Leptospheria nodorum(分生孢子名為Phomahennebergii)NBRC7480、Leptospheria doriolum JCM2742、Leptospheriamaculans(分生孢子名為Phoma lingum)MAFF726528、枯葉格孢腔菌NBRC32012、甜菜格孢腔(分生孢子名為甜菜莖點(diǎn)霉)NBRC5918、Ophiobolus herpotricus NBRC6158和棒彎孢(Curvulalia clavata)YH923(FERM BP-10009)等。特別優(yōu)選舉出衍生自侵管新赤殼IFO7590菌株、WO 2004/104203號(hào)公報(bào)中記載的侵管新赤殼(Neocosmospora vasinfecta)474菌株和棒彎孢(Curvulalia clavata)YH923(FERM BP-10009)的酶，最優(yōu)選衍生自侵管新赤殼IFO7590菌株的酶。另外，在本發(fā)明的其他方式中，有時(shí)也最優(yōu)選衍生自棒彎孢(Curvulalia clavata)YH923(FERM BP-10009)的酶。另外，對(duì)于基質(zhì)特異性的確認(rèn)，可以通過(guò)確認(rèn)上述酶對(duì)作為基質(zhì)的糖化纈氨酰-組氨酸和糖化纈氨酰-亮氨酸的作用來(lái)進(jìn)行。
作為可以用于本發(fā)明的蛋白酶的穩(wěn)定劑，可以使用任意穩(wěn)定劑，只要是能夠在試劑的保存中抑制蛋白酶活性降低的物質(zhì)即可，特別優(yōu)選能夠在以液體狀態(tài)保存試劑時(shí)抑制蛋白酶活性降低的物質(zhì)。
作為蛋白酶穩(wěn)定劑的優(yōu)選例，可以舉出二甲亞砜、醇、鈣、食鹽、季銨鹽和季銨鹽型陽(yáng)離子表面活性劑。作為醇的例子，可以舉出乙醇、丙醇、乙二醇和甘油等，作為季銨鹽型陽(yáng)離子表面活性劑的例子，可以舉出月桂基硫酸三乙醇胺和十二烷基三甲基氯化銨等。
另外，作為這些蛋白酶穩(wěn)定劑的使用濃度，可以以任意的濃度來(lái)使用，只要該濃度能夠在試劑的保存中抑制蛋白酶的活性降低即可，特別優(yōu)選能夠在以液體狀態(tài)保存試劑時(shí)抑制蛋白酶活性降低的濃度。作為優(yōu)選濃度，添加例如DMSO作穩(wěn)定劑時(shí)，下限濃度為5％以上，優(yōu)選為10％以上；上限濃度為50％以下，優(yōu)選為40％以下。
作為可以用于本發(fā)明、作用于糖化氨基酸和/或糖化肽的酶的穩(wěn)定劑，可以使用任意穩(wěn)定劑，只要是能夠在試劑的保存中至少抑制作用于糖化氨基酸和/或糖化肽的酶的活性降低的物質(zhì)即可，特別優(yōu)選能夠在以液體狀態(tài)保存試劑時(shí)至少抑制作用于糖化氨基酸和/或糖化肽的酶的活性降低的物質(zhì)。
作為作用于糖化氨基酸和/或糖化肽的酶的穩(wěn)定劑的優(yōu)選例，可以舉出糖醇、蔗糖、鎂、鈣、硫酸銨、氨基酸和肌氨酸。作為糖醇的例子，可以舉出山梨糖醇、甘露醇、海藻糖和甘油等。此外，作為氨基酸，雖然所有的氨基酸都具有較強(qiáng)的穩(wěn)定效果，但特別優(yōu)選標(biāo)準(zhǔn)氨基酸，其中更優(yōu)選脯氨酸、谷氨酸、丙氨酸、纈氨酸、甘氨酸和賴氨酸等。
而且，作為這些作用于糖化氨基酸和/或糖化肽的酶的穩(wěn)定劑的使用濃度，可以以任意的濃度來(lái)使用，只要該濃度能夠在試劑的保存中抑制作用于糖化氨基酸和/或糖化肽的酶的活性降低即可，特別優(yōu)選能夠在以液體狀態(tài)保存試劑時(shí)抑制作用于糖化氨基酸和/或糖化肽的酶的活性降低的濃度。作為優(yōu)選濃度，在添加例如山梨糖醇作穩(wěn)定劑時(shí)，下限濃度為0.1％以上，優(yōu)選為0.2％以上；上限濃度為30％以下，優(yōu)選為20％以下。
可以以如下方式判斷本發(fā)明的試劑的穩(wěn)定性。將液體試劑在冷藏(2℃～10℃)下保存，優(yōu)選在4℃保存6個(gè)月(或者以37℃下保存4天的條件來(lái)代替)。用保存后的試劑和保存前的試劑來(lái)進(jìn)行測(cè)定，作為校正物質(zhì)，測(cè)定濃度已知的糖化白蛋白或血紅蛋白A1c(或糖化血紅蛋白)，作為試樣，測(cè)定血清或溶血液(經(jīng)溶血處理的血液)，比較保存前的試劑和保存后的試劑的濃度。優(yōu)選濃度差異小的情況，特別優(yōu)選沒(méi)有濃度差異的情況。
本發(fā)明的通過(guò)使用蛋白酶反應(yīng)促進(jìn)劑來(lái)促進(jìn)蛋白酶反應(yīng)的方法是非常有用的。
作為可以用于本發(fā)明的在酶反應(yīng)的檢出中使用的色素，可以舉出輔酶、四唑鹽、Trinder型試劑和無(wú)色型試劑等，優(yōu)選輔酶、Trinder型試劑和無(wú)色型試劑，更優(yōu)選Trinder型試劑和無(wú)色型試劑等通過(guò)氧化酶的作用而顯色的色素，特別優(yōu)選無(wú)色型試劑。
例如，當(dāng)使用脫氫酶測(cè)定糖化氨基酸和/或糖化肽時(shí)，可以使用NAD(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸)等輔酶或以下述化合物為代表的各種四唑鹽氮藍(lán)四唑、四唑藍(lán)、2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺基苯基)-2H-四唑WST-1、2-(4-碘苯基)-3-(2，4-二硝基苯基)-5-(2，4-二磺基苯基)-2H-四唑WST-3、2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺基苯基)-2H-四唑WST-8(以上化合物為Dojindo Laboratories制造)。
此外，當(dāng)使用氧化酶測(cè)定糖化氨基酸和/或糖化肽時(shí)，可以使用Trinder型試劑或無(wú)色型試劑，這兩種試劑能夠在過(guò)氧化酶的存在下，通過(guò)過(guò)氧化氫、成色劑(coupler)和發(fā)色團(tuán)的氧化縮合而生成色素，所述過(guò)氧化氫由氧化酶的作用產(chǎn)生，所述成色劑為4-氨基安替比林(4-AA)或3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙(MBTH)等，所述發(fā)色團(tuán)為苯酚等。
作為Trinder型試劑的氫供體，可以使用苯酚衍生物、苯胺衍生物和甲苯胺衍生物等，作為具體例，可以舉出N-(3-磺丙基)苯胺鈉一氫化物(HALPS)、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺鈉一氫化物(TOPS)、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺鈉一氫化物(MAOS)、N-(3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺鈉一氫化物(HDAPS)、N-(2-羥基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺鈉(HDAOS)、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺鈉一氫化物(DAPS)、N-乙基N-(2-羥基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺鈉(DAOS)、N-乙基-N-(3-磺丙基)苯胺鈉(ALPS)、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺鈉一氫化物(ADPS)、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺鈉二氫化物(ADOS)、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)間甲苯胺(TOOS)和N，N-雙(4-磺丁基)-3-甲基苯胺二鈉(TODB)(以上化合物為Dojindo Laboratories制造)等。
作為可以用于本發(fā)明的無(wú)色型色素，可以使用任意色素，例如，可以舉出容易獲得的N-(羧甲基氨基羰基)-4，4-雙(二甲氨基)聯(lián)苯胺(DA64)、10-(羧甲基氨基羰基)-3，7-雙(二甲氨基)吩噻嗪(DA67)(上述色素為WakoPure Chemical Industries，Inc.制造)；2，2′-氨基雙(3-乙基苯并噻唑啉)-6-磺酸(ABTS)、雙-(4-二乙氨基苯基)-2-磺基甲苯(BSPM)、雙[3-雙(4-氯苯基)甲基-4-二甲氨基苯基]胺(BCMA)、10-N-甲基氨基甲酰-3，7-二甲氨基-10H-吩噻嗪(MCDP)(上述色素為Wako Pure Chemical Industries，Inc.制造等)；鄰聯(lián)甲苯胺、3，3′-二氨基聯(lián)苯胺·4HCl(DAB)、3-(4-羥苯基)丙酸(HPPA)、N，N′-雙(2-羥基-3-磺苯基)聯(lián)甲苯胺·2Na·4H2O(SAT-3)、3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMBZ)、N-(3-磺丙基)-3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺·Na(TMBZ-PS)、和N，N′，N′，N″，N″-六(3-磺丙基)-4，4′，4″-三氨基三苯甲烷·6Na(TPM-PS)(以上色素為Dojindo Laboratories制造)等。
作為可以用于本發(fā)明的色素穩(wěn)定劑，可以使用任意物質(zhì)，只要該物質(zhì)能提高色素的穩(wěn)定性即可，但優(yōu)選環(huán)糊精。可以使用任意的環(huán)糊精，只要能夠取得用于酶反應(yīng)的檢出的色素的穩(wěn)定效果即可?？梢耘e出例如α-環(huán)糊精類、β-環(huán)糊精類和γ-環(huán)糊精類，優(yōu)選β-環(huán)糊精類和γ-環(huán)糊精類，特別優(yōu)選β-環(huán)糊精類。作為α-環(huán)糊精類，可以舉出α-環(huán)糊精。作為γ-環(huán)糊精類，可以舉出γ-環(huán)糊精和羧甲基-γ-環(huán)糊精，優(yōu)選γ-環(huán)糊精，但有時(shí)也優(yōu)選羧甲基-γ-環(huán)糊精。作為β-環(huán)糊精類，可以舉出β-環(huán)糊精、羧甲基-β-環(huán)糊精、二甲基-β-環(huán)糊精、單氨基-β-環(huán)糊精、2-羥丙基-β-環(huán)糊精和甲基-β-環(huán)糊精，優(yōu)選2-羥丙基-β-環(huán)糊精和甲基-β-環(huán)糊精，特別優(yōu)選2-羥丙基-β-環(huán)糊精。另外，有時(shí)也非常優(yōu)選甲基-β-環(huán)糊精。
其結(jié)果，作為環(huán)糊精，優(yōu)選α-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精、γ-環(huán)糊精、羧甲基-γ-環(huán)糊精、羧甲基-β-環(huán)糊精、二甲基-β-環(huán)糊精和單氨基-β-環(huán)糊精(以上環(huán)糊精可以從Sigma Aldrich Japan K.K.等獲得)；2-羥丙基-β-環(huán)糊精和甲基-β-環(huán)糊精(以上環(huán)糊精可以從日本食品加工株式會(huì)社等獲得)，更優(yōu)選2-羥丙基-β-環(huán)糊精和甲基-β-環(huán)糊精，特別優(yōu)選2-羥丙基-β-環(huán)糊精。另外，有時(shí)也非常優(yōu)選甲基-β-環(huán)糊精。
作為用于酶反應(yīng)的檢出的色素穩(wěn)定劑可以使用上述環(huán)糊精。而且，也可以使用環(huán)糊精以使用于酶反應(yīng)的檢出的色素穩(wěn)定。此外，還可以使用環(huán)糊精以制造出用于酶反應(yīng)檢出的色素的穩(wěn)定化試劑。
作為用于酶反應(yīng)的檢出的色素的使用濃度，可以使用任意濃度，只要是能夠在試劑保存過(guò)程中保證充分顯色的濃度即可，特別優(yōu)選能夠在以液體狀態(tài)冷藏保存試劑時(shí)保證充分顯色的濃度。作為優(yōu)選濃度的例子，例如在使用DA67的情況下，下限濃度為1μM以上，優(yōu)選為2μM以上；上限濃度為100mM以下，優(yōu)選為50mM以下。
作為環(huán)糊精的使用濃度，可以使用任意濃度，只要是能夠在試劑保存過(guò)程中抑制用于酶反應(yīng)檢出的色素劣化的濃度即可，特別優(yōu)選能夠在以液體狀態(tài)保存試劑時(shí)抑制色素劣化的濃度。作為優(yōu)選濃度的例子，例如在添加甲基-β-環(huán)糊精作為穩(wěn)定劑的情況下，下限濃度為0.5％以上，優(yōu)選為1.0％以上；上限濃度為50％以下，優(yōu)選為40％以下。此外，對(duì)于色素和環(huán)糊精的重量比的優(yōu)選例，色素∶環(huán)糊精的重量比下限為1∶0.01以上，優(yōu)選為1∶0.04以上；色素∶環(huán)糊精的重量比上限為1∶500萬(wàn)以下，優(yōu)選為1∶3300000以下。
作為可以用于本發(fā)明的緩沖劑的優(yōu)選例，優(yōu)選Good緩沖劑，可以舉出例如，使用3-[4-(2-羥乙基)-1-哌嗪基]丙磺酸(EPPS)、2-[4-(2-羥乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸(HEPES)、2-羥基-3-[4-(2-羥乙基)-1-哌嗪基]丙磺酸(HEPPSO)、N-(2-乙酰胺)-2-氨基乙磺酸(ACES)、N-(2-乙酰胺)亞氨基二乙酸(ADA)、N，N-雙(2-羥乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)、N，N-雙(2-羥乙基)甘氨酸(Bicine)、雙(2-羥乙基)亞氨基三(羥甲基)甲烷(Bis-Tris)、N-環(huán)己基-3-氨基丙磺酸(CAPS)、N-環(huán)己基-2-羥基-3-氨基丙磺酸(CAPSO)、N-環(huán)己基-2-氨基乙磺酸(CHES)、3-[N，N-雙(2-羥乙基)氨基]-2-羥基丙磺酸(DIPSO)、2-嗎啉基乙磺酸(MES)、3-嗎啉基丙磺酸(MOPS)、2-羥基-3-嗎啉基丙磺酸(MOPSO)、哌嗪-1，4-雙(2-乙磺酸)(PIPES)、哌嗪-1，4-雙(2-羥基-3-丙磺酸)(POPSO)、N-三(羥甲基)甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)、2-羥基-N-三(羥甲基)甲基-3-氨基丙磺酸(TAPSO)、N-三(羥甲基)甲基-2-氨基丙磺酸(TES)、N-[三(羥甲基)甲基]甘氨酸(Tricine)和三羥甲基氨基甲烷(Tris)、N-(2-乙酰胺)-2-氨基乙磺酸(ACES)和N-(2-乙酰胺)亞氨基二乙酸(ADA)等化合物的緩沖劑；或硼酸、氨、甘氨酸、碳酸、乙酸、磷酸、二乙醇胺、對(duì)苯酚磺酸、2-氨基-2-甲基丙烷-1，3-二醇、二甲次胂酸、檸檬酸、馬來(lái)酸、巴比妥和3，3-二甲基戊二酸等。
此外，作為緩沖劑，更優(yōu)選在中性pH附近具有緩沖作用的緩沖劑，例如EPPS、HEPES、HEPPSO、ACES、ADA、BES、Bicine、Bis-Tris、CHES、DIPSO、MES、MOPS、MOPSO、PIPES、POPSO、TAPS、TAPSO、TES、Tricine、Tris、ACES、ADA、硼酸、氨、甘氨酸、磷酸、二乙醇胺、對(duì)苯酚磺酸、2-氨基-2-甲基丙烷-1，3-二醇、二甲次胂酸、檸檬酸、馬來(lái)酸、巴比妥和3，3-二甲基戊二酸等，其中最優(yōu)選3，3-二甲基戊二酸。
作為以穩(wěn)定的狀態(tài)含有本發(fā)明的用于酶反應(yīng)檢出的色素的試劑，沒(méi)有任何限定，只要該試劑至少含有本發(fā)明的用于酶反應(yīng)檢出的色素穩(wěn)定劑和用于酶反應(yīng)檢出的色素即可。
而且，對(duì)于上述本發(fā)明的試劑，特別優(yōu)選還含有過(guò)氧化氫酶。含有過(guò)氧化氫酶是為了除掉在保存過(guò)程中產(chǎn)生的過(guò)氧化氫，從而盡量抑制保存中的色素顯色。作為可以用于本發(fā)明的過(guò)氧化氫酶，可以使用任意的酶，只要其具有過(guò)氧化氫酶活性即可，優(yōu)選例如衍生自黑曲霉的酶和衍生自牛肝的酶，特別優(yōu)選衍生自黑曲霉的酶。此外，有時(shí)也特別優(yōu)選衍生自牛肝的酶。另外，衍生自黑曲霉的酶和衍生自牛肝的酶可以從SigmaAldrich Japan K.K.等獲得。
作為可以用于本發(fā)明的血紅蛋白測(cè)定用試劑和測(cè)定方法，可以使用任意的試劑和測(cè)定方法，只要是利用本發(fā)明的蛋白酶反應(yīng)促進(jìn)劑來(lái)測(cè)定血紅蛋白的試劑和測(cè)定方法即可。優(yōu)選含有如下化合物的試劑和應(yīng)用了該試劑的測(cè)定方法上述含有乙酸基的化合物或其鹽、N-?；；撬峄蚱潲}、或者聚氧乙烯烷基醚硫酸或其鹽。特別優(yōu)選含有如下化合物的試劑和應(yīng)用了該試劑的測(cè)定方法上述N-?；；撬峄蚱潲}、或者聚氧乙烯烷基醚硫酸或其鹽，并且所述化合物作為所述含有乙酸基的化合物或其鹽。作為這些蛋白酶反應(yīng)促進(jìn)劑的使用濃度，可以使用任意濃度，只要是能夠測(cè)定血紅蛋白的濃度即可。例如，通常，所述濃度的下限為0.01％以上，優(yōu)選為0.05％以上，最優(yōu)選為0.1％以上；所述濃度的上限為50％以下，優(yōu)選為40％以下，最優(yōu)選為30％以下。
對(duì)于可以用于本發(fā)明的血紅蛋白測(cè)定的操作，可以以如下方式進(jìn)行向上述血紅蛋白定量試劑中加入0.001ml～0.5ml的被測(cè)溶液，使其在37℃的溫度下反應(yīng)，在反應(yīng)開(kāi)始的一定時(shí)間后測(cè)定血紅蛋白的色調(diào)(吸光度)。對(duì)于血紅蛋白的色調(diào)，例如可以測(cè)定200nm～1000nm下的吸光度，優(yōu)選測(cè)定280nm～800nm下的吸光度。此時(shí)，若利用濃度已知的血紅蛋白進(jìn)行測(cè)定并比較吸光度的變化，則可以求出被測(cè)溶液中的血紅蛋白的量。
作為可以用于本發(fā)明的糖化蛋白質(zhì)測(cè)定用試劑，可以使用任意試劑，只要是利用本發(fā)明的蛋白酶反應(yīng)促進(jìn)劑和/或本發(fā)明的用于酶反應(yīng)檢出的色素穩(wěn)定劑來(lái)測(cè)定糖化蛋白質(zhì)的試劑即可，所述本發(fā)明的用于酶反應(yīng)檢出的色素穩(wěn)定劑以環(huán)糊精為代表。優(yōu)選含有上述的蛋白酶、和作用于糖化氨基酸和/或糖化肽的酶的試劑。蛋白酶和作用于糖化氨基酸和/或糖化肽的酶可以混合在同一溶液中，但優(yōu)選使用由蛋白酶試劑和檢出試劑構(gòu)成的試劑，所述蛋白酶試劑含有蛋白酶，所述檢出試劑含有作用于糖化氨基酸和/或糖化肽的酶。蛋白酶反應(yīng)促進(jìn)劑可以混合于上述蛋白酶試劑和檢出試劑中的任意一種試劑，只要蛋白酶反應(yīng)促進(jìn)劑在蛋白酶作用于糖化蛋白質(zhì)之時(shí)或之前存在即可。而且，更優(yōu)選在含有蛋白酶的試劑中添加蛋白酶穩(wěn)定劑，在含有作用于糖化氨基酸和/或糖化肽的酶的試劑中添加作用于糖化氨基酸和/或糖化肽的酶穩(wěn)定劑。
此外，更優(yōu)選如下方式將用于酶反應(yīng)檢出的色素、以環(huán)糊精為代表的本發(fā)明的用于酶反應(yīng)檢出的色素穩(wěn)定劑和過(guò)氧化氫酶混合，將過(guò)氧化酶添加于其他試劑中，在測(cè)定時(shí)將二者混合。這是因?yàn)椋羯嘏c過(guò)氧化酶共同存在，則可能在保存過(guò)程中發(fā)生反應(yīng)而顯色。
作為可以用于本發(fā)明的具體的蛋白酶試劑，可以以如下方式得到確定pH、緩沖劑和蛋白酶的濃度，以使蛋白質(zhì)的分解反應(yīng)能夠有效進(jìn)行，然后適當(dāng)制備蛋白酶反應(yīng)促進(jìn)劑和蛋白酶穩(wěn)定劑，并且以有效的濃度將所制備的蛋白酶反應(yīng)促進(jìn)劑和蛋白酶穩(wěn)定劑添加至蛋白酶試劑中。
作為可以用于本發(fā)明的緩沖劑，可以使用任意的緩沖劑，只要該緩沖劑不會(huì)影響到用于酶反應(yīng)檢出的色素的穩(wěn)定性即可，具體例與上述相同。作為測(cè)定時(shí)的緩沖劑濃度，設(shè)定緩沖劑的使用濃度是重要的，測(cè)定時(shí)的緩沖劑濃度的上限為80mM以下，更優(yōu)選為50mM以下；并且其下限為0.1mM以上，優(yōu)選為1mM以上。
例如，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)為白蛋白、測(cè)定對(duì)象為糖化白蛋白的情況下，使用蛋白酶型XXIV(Sigma Aldrich Japan K.K.制造)時(shí)，蛋白質(zhì)分解活性在pH7～10附近較強(qiáng)，因此優(yōu)選反應(yīng)的pH為7～10。
此外，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)為血紅蛋白、測(cè)定對(duì)象為糖化血紅蛋白或血紅蛋白A1c的情況下，使用上述Toyozyme NEP(TOYOBO Co.，Ltd.制造)時(shí)，蛋白質(zhì)分解活性在pH6.0～9.0附近較強(qiáng)，因此優(yōu)選反應(yīng)的pH為6.0～9.0。
對(duì)于蛋白酶濃度，只要是能夠在實(shí)際使用的反應(yīng)時(shí)間內(nèi)充分分解被測(cè)溶液中的蛋白質(zhì)的濃度即可。所述蛋白酶濃度的下限為10U/ml以上，優(yōu)選為100U/ml以上，最優(yōu)選為500U/ml以上；所述蛋白酶濃度的上限為1.0×106U/ml以下，優(yōu)選為5.0×105U/ml以下，最優(yōu)選為3.0×105U/ml以下。
作為蛋白酶反應(yīng)促進(jìn)劑，可以使用任意的蛋白酶反應(yīng)促進(jìn)劑，只要是本發(fā)明的蛋白酶反應(yīng)促進(jìn)劑即可。作為蛋白酶反應(yīng)促進(jìn)劑的使用濃度，可以使用任意濃度，只要該濃度能夠有效地使蛋白質(zhì)變性，且能提高蛋白酶對(duì)蛋白質(zhì)的作用即可。例如，通常，所述蛋白酶反應(yīng)促進(jìn)劑的使用濃度下限為0.01％以上，優(yōu)選為0.05％以上，最優(yōu)選為0.1％以上；其上限為50％以下，優(yōu)選為40％以下，最優(yōu)選為30％以下。
作為蛋白酶穩(wěn)定劑的使用濃度，可以使用任意濃度，只要該濃度能使所述蛋白酶在冷藏下以液體狀態(tài)保存6個(gè)月還顯示出穩(wěn)定的試劑性能即可。例如在使用二甲亞砜的情況下，通常，所述濃度下限為1％以上，優(yōu)選5％以上；所述濃度上限為60％以下，優(yōu)選為50％以下。
作為過(guò)氧化氫酶的使用濃度，可以使用任意濃度，只要該濃度為能夠除去使在酶反應(yīng)的檢出中使用的色素變得不穩(wěn)定的過(guò)氧化氫等的濃度即可。例如，通常，所述濃度下限為0.1U/ml以上，優(yōu)選為1U/ml以上，最優(yōu)選為2U/ml以上；所述濃度上限為3000U/ml以下，優(yōu)選為1500U/ml以下，最優(yōu)選為1500U/ml。
對(duì)于可以用于本發(fā)明的含有作用于糖化氨基酸和/或糖化肽的酶的測(cè)定試劑，可以以如下方法確定其組成關(guān)于作用于所使用的糖化氨基酸和/或糖化肽的酶的最佳pH，應(yīng)選擇能使反應(yīng)有效進(jìn)行的pH，然后決定作用于糖化氨基酸和/或糖化肽的酶量。接下來(lái)，還可以添加過(guò)氧化酶、作用于糖化氨基酸和/或糖化肽的酶的穩(wěn)定劑和疊氮化鈉等疊氮化物，當(dāng)?shù)鞍酌冈噭┲惺褂眠^(guò)氧化氫酶時(shí)，添加疊氮化鈉可以阻止過(guò)氧化氫酶的作用。
例如，在蛋白質(zhì)為白蛋白、測(cè)定對(duì)象為糖化白蛋白的情況下，使用例如上述KAOD或KAOD-V(Asahi Kasei Pharma Co.制造)時(shí)，由于在pH為6.5～10的寬區(qū)域內(nèi)顯示出最大活性的50％以上的活性，因此優(yōu)選反應(yīng)的pH為6.5～10。另外，例如在蛋白質(zhì)為血紅蛋白、測(cè)定對(duì)象為糖化血紅蛋白或血紅蛋白A1c的情況下，使用例如上述衍生自棒彎孢YH923的KAOD時(shí)，在pH為6.0～10的寬區(qū)域內(nèi)顯示出最大活性的50％以上的活性，因此優(yōu)選反應(yīng)的pH為6.0～10。
作為作用于糖化氨基酸和/或糖化肽的酶的使用濃度，可以使用任意濃度，只要是能夠測(cè)定糖化蛋白質(zhì)的濃度即可，通常所述濃度下限為0.5U/ml以上，優(yōu)選為1U/ml以上；所述濃度上限為1000U/ml以下，優(yōu)選為500U/ml以下。
作為過(guò)氧化酶的使用濃度，可以使用任意濃度，只要是能夠測(cè)定由測(cè)定體系產(chǎn)生的過(guò)氧化氫的濃度即可。通常所述濃度下限為0.01U/ml以上，優(yōu)選為0.1U/ml以上；所述濃度上限為100U/ml以下，優(yōu)選為50U/ml以下。
作為作用于糖化氨基酸和/或糖化肽的酶的穩(wěn)定劑的使用濃度，可以使用任意濃度，只要該濃度能使上述酶在冷藏下以液體狀態(tài)保存6個(gè)月還顯示出穩(wěn)定的試劑性能即可。例如在使用山梨糖醇的情況下，通常所述濃度下限為0.1％以上，優(yōu)選1％以上；所述濃度上限為30％以下，優(yōu)選為20％以下。
為了阻止過(guò)氧化氫酶反應(yīng)而使用疊氮化物時(shí)，作為所使用的疊氮化物的濃度，可以使用任意濃度，只要該濃度能充分阻止過(guò)氧化氫酶的活性即可。例如使用疊氮化鈉時(shí)，作為其使用濃度，通常下限為0.01％以上，優(yōu)選0.05％以上；上限為10％以下，優(yōu)選為5％以下。
在基于本發(fā)明的糖化蛋白質(zhì)的測(cè)定方法中，使用作用于糖化氨基酸和/或糖化肽的酶時(shí)，例如在使用脫氫酶作為所述酶的情況下，對(duì)于所述酶的作用的檢出可以以下述方式測(cè)定輔酶的變化量來(lái)進(jìn)行。例如在使用NAD作為所述輔酶時(shí)，對(duì)于由該輔酶所產(chǎn)生的變化量，可以利用公知技術(shù)(例如，使用比色計(jì)在作為還原型輔酶的還原型NAD的最大吸收波長(zhǎng)區(qū)域、即340nm附近的波長(zhǎng)下測(cè)定還原型NAD)來(lái)直接定量，或者使用各種心肌黃酶、諸如吩嗪硫酸甲酯等電子受體、或各種四唑鹽等還原性顯色試劑來(lái)間接定量NAD，所述四唑鹽以以下四唑鹽為代表硝基四唑鹽、2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺基苯基)-2H-四唑單鈉鹽(WST-1)、2-(4-碘苯基)-3-(2，4-二硝基苯基)-5-(2，4-二磺基苯基)-2H-四唑單鈉鹽(WST-3)(上述四唑鹽由Dojindo Laboratories制造)。此外，還可以利用其他公知的方法直接或間接地測(cè)定。
此外，例如使用氧化酶時(shí)，優(yōu)選測(cè)定氧的消耗量或反應(yīng)生成物的量。例如使用酮胺氧化酶的情況下，作為反應(yīng)生成物，是由反應(yīng)生成的過(guò)氧化氫和葡糖醛酮，該過(guò)氧化氫和葡糖醛酮都可以以公知的方法直接或間接地測(cè)定。
對(duì)于上述過(guò)氧化氫的量，可以通過(guò)如下方法進(jìn)行定量。例如，既可以使用過(guò)氧化酶等來(lái)生成色素等，然后根據(jù)顯色、發(fā)光和熒光等來(lái)定量，也可以利用電化學(xué)的方法來(lái)定量，還可以使用過(guò)氧化氫酶等以使醇生成醛，然后定量所生成的醛的量。
過(guò)氧化氫的顯色體系可以使用Trinder試劑和無(wú)色型試劑等。所述Trinder試劑在過(guò)氧化酶的存在下，通過(guò)成色劑和發(fā)色團(tuán)的氧化縮合而生成色素，所述成色劑為4-氨基安替比林(4-AA)或3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙(MBTH)等，所述發(fā)色團(tuán)為苯酚等；所述無(wú)色型試劑在過(guò)氧化酶的存在下直接氧化而顯色，所述無(wú)色型試劑例如有N-(羧甲基氨基羰基)-4，4-雙(二甲氨基)聯(lián)苯胺(DA64)和10-(羧甲基氨基羰基)-3，7-雙(二甲氨基)吩噻嗪(DA67)(上述化合物為Wako Pure Chemical Industries，Inc.制造)。
另外，在使用電極測(cè)定過(guò)氧化氫時(shí)，對(duì)于電極材料沒(méi)有特別限制，只要該材料是能夠與過(guò)氧化氫交換電子的材料即可，例如可以舉出鉑、金、或銀等。作為使用電極的測(cè)定方法，可以使用電流測(cè)定法、電位測(cè)定法、庫(kù)倫分析法等公知的方法，還可以使電子傳遞體介于氧化酶或基質(zhì)與電極之間，以對(duì)所得到的氧化還原電流或氧化還原電量進(jìn)行測(cè)定。作為電子傳遞體，可以使用具有電子轉(zhuǎn)移功能的任意物質(zhì)，例如二茂鐵衍生物或苯醌衍生物等物質(zhì)。此外，還可以使電子傳遞體介于由氧化酶反應(yīng)生成的過(guò)氧化氫與電極之間，以測(cè)定所得的氧化還原電流或氧化還原電量。
另外，在本發(fā)明的測(cè)定方法和測(cè)定試劑中，當(dāng)然也可以單獨(dú)使用蛋白酶，還可以在蛋白酶的反應(yīng)前后或反應(yīng)的同時(shí)，使其他內(nèi)蛋白酶或其他外蛋白酶產(chǎn)生作用。
此外，在基于本發(fā)明的測(cè)定糖化蛋白質(zhì)的酶反應(yīng)試劑的組成中，也可以適當(dāng)選擇添加例如表面活性劑、鹽類、和防腐劑等。
可以適當(dāng)添加0.01％～10％、優(yōu)選0.05％～5％的表面活性劑，例如聚氧乙烯烷基醚類、聚氧乙烯山梨聚糖脂肪酸酯類和聚乙烯醇等；可以適當(dāng)添加1mM～5M、優(yōu)選10mM～1M的各種金屬鹽類，例如氯化鋰、氯化鈉、氯化鉀、氯化錳、氯化鈷、氯化鋅和氯化鈣等；可以適當(dāng)添加0.01％～10％、優(yōu)選0.05％～1％的各種防腐劑，例如疊氮化鈉。proclin(SUPELCO制造)作為上述各種防腐劑中的一種防腐劑，可以適當(dāng)添加0.01％～10％、優(yōu)選0.02％～5％。
可以用于本發(fā)明的糖化蛋白質(zhì)的測(cè)定方法包括下述內(nèi)容向上述本發(fā)明的用于測(cè)定糖化蛋白質(zhì)的酶反應(yīng)試劑的組合物中添加0.001ml～0.5ml被測(cè)溶液，在37℃的溫度下反應(yīng)，在進(jìn)行比率測(cè)定時(shí)，可以以上述方法直接地或間接地對(duì)反應(yīng)開(kāi)始一定時(shí)間后的兩點(diǎn)間的幾分鐘至幾十分鐘(例如反應(yīng)開(kāi)始3分鐘后和4分鐘后的1分鐘，或是反應(yīng)開(kāi)始3分鐘后和8分鐘后的5分鐘)內(nèi)變化的輔酶、溶解氧、過(guò)氧化氫或其他生成物的量進(jìn)行測(cè)定；在進(jìn)行終點(diǎn)測(cè)定時(shí)，也可以同樣地對(duì)檢出反應(yīng)開(kāi)始一定時(shí)間后變化的輔酶、溶解氧、過(guò)氧化氫或其他生成物的量進(jìn)行測(cè)定。此時(shí)可以與使用濃度已知的糖化蛋白質(zhì)進(jìn)行測(cè)定時(shí)得到的吸光度等的變化進(jìn)行比較，由此求出被測(cè)溶液中糖化蛋白質(zhì)的量。
作為可以在本發(fā)明的測(cè)定方法中使用的校正物質(zhì)，除了上述濃度已知的蛋白質(zhì)外，也可以使用濃度已知的糖化氨基酸、或糖化肽。作為糖化氨基酸、或糖化肽的例子，可以使用市售的合成肽，在測(cè)定血紅蛋白A1c時(shí)，可以使用糖化纈氨酰-組氨酸、糖化纈氨酰-組氨酰-亮氨酸、糖化纈氨酰-組氨酰-亮氨酰-蘇氨酸或糖化纈氨酰-組氨酰-亮氨酰-蘇氨酰-脯氨酸等。對(duì)于校正物質(zhì)中肽的濃度，只要該濃度能足以測(cè)定由試樣產(chǎn)生的肽的濃度即可。
作為可以用于本發(fā)明的測(cè)定糖化蛋白質(zhì)比率用試劑的組合物，可以向上述糖化蛋白質(zhì)測(cè)定用試劑組合物中，另外或同時(shí)添加測(cè)定蛋白質(zhì)的組分。例如，蛋白質(zhì)為糖化白蛋白時(shí)，可以另外測(cè)定白蛋白；蛋白質(zhì)為糖化血紅蛋白或血紅蛋白A1c時(shí)，可以另外測(cè)定血紅蛋白。可以利用公知的方法測(cè)定白蛋白或血紅蛋白。
作為另外測(cè)定白蛋白的方法，可以使用任意方法，只要是公知的測(cè)定白蛋白的方法即可。在這種方法中，可以舉出利用白蛋白特異性色素的方法等，所述白蛋白特異性色素有溴甲酚綠(以下縮寫為BCG)、溴甲酚紫(以下縮寫為BCP)、溴酚藍(lán)(以下縮寫為BPB)、甲基橙(以下縮寫為MO)、或2-(4′-羥偶氮苯)苯甲酸(以下縮寫為HABA)等。此外，當(dāng)作為測(cè)定對(duì)象的蛋白質(zhì)為血紅蛋白時(shí)，可以使用任意方法，只要是公知的測(cè)定血紅蛋白的方法即可。在這種方法中，可以舉出例如正鐵血紅蛋白法、氰化正鐵血紅蛋白法、疊氮化正鐵血紅蛋白法、綠色發(fā)色團(tuán)形成法、或氧合血紅蛋白法等。所謂綠色發(fā)色團(tuán)形成法，是使綠色發(fā)色團(tuán)形成試劑與血紅蛋白反應(yīng)，從而形成穩(wěn)定的生成物(綠色發(fā)色團(tuán))的方法，所述綠色發(fā)色團(tuán)與英國(guó)專利公開(kāi)第2052056號(hào)公報(bào)中記載的堿性正鐵血紅素D-575具有同樣的吸收光譜。
作為可以用于本發(fā)明的在同一反應(yīng)槽中連續(xù)進(jìn)行血紅蛋白的測(cè)定和血紅蛋白A1c的測(cè)定的方法，可以使用任意方法，只要該方法使用本發(fā)明的含有蛋白酶反應(yīng)促進(jìn)劑的試劑即可。具體方法如下向含有蛋白酶反應(yīng)促進(jìn)劑的第1反應(yīng)試劑中添加試樣，一定時(shí)間后(例如3分鐘后或5分鐘后等)測(cè)定血紅蛋白在具有特殊吸收的波長(zhǎng)下(例如220nm～900nm，優(yōu)選280nm～800nm)的吸光度，然后添加含有酮胺氧化酶的第2反應(yīng)試劑，一定時(shí)間后(例如3分鐘后或5分鐘后等)測(cè)定顯色色素在具有最大吸收的波長(zhǎng)附近的吸光度。此時(shí)，蛋白酶可以包含于第1反應(yīng)試劑和第2反應(yīng)試劑中的任意一種試劑中。而且，通過(guò)將上述測(cè)定的血紅蛋白的吸光度和血紅蛋白A1c的吸光度與另外的血紅蛋白濃度和血紅蛋白A1c濃度已知的試樣的吸光度進(jìn)行比較，可以換算出血紅蛋白濃度和血紅蛋白A1c濃度。通常以血紅蛋白A1c濃度對(duì)總血紅蛋白濃度的比率來(lái)表示血紅蛋白A1c值，因此，可以用血紅蛋白A1c濃度除以總血紅蛋白濃度，將血紅蛋白A1c濃度換算成比率。
進(jìn)而，作為本發(fā)明以在同一反應(yīng)槽中連續(xù)進(jìn)行血紅蛋白的測(cè)定和血紅蛋白A1c的測(cè)定為特征的方法，優(yōu)選使用同一波長(zhǎng)測(cè)定血紅蛋白和血紅蛋白A1c，然后測(cè)定副波長(zhǎng)下的值，并從測(cè)定波長(zhǎng)的值中減去副波長(zhǎng)的值，測(cè)定副波長(zhǎng)的目的是為了扣除其他來(lái)自試樣的雜質(zhì)等的影響。作為測(cè)定波長(zhǎng)可以使用任意波長(zhǎng)，優(yōu)選顯色色素具有最大吸收的波長(zhǎng)附近，例如使用上述DA67時(shí)，作為測(cè)定波長(zhǎng)，可以在500nm～700nm下測(cè)定，優(yōu)選550nm～660nm，作為副波長(zhǎng)，可以在600nm～800nm下測(cè)定，優(yōu)選650nm～750nm。
本發(fā)明的試劑可以以液態(tài)制品、液態(tài)制品的冷凍品、液態(tài)制品的冷凍干燥品、或液態(tài)制品的干燥品(通過(guò)加熱干燥和/或風(fēng)干和/或減壓干燥等方法)的劑型來(lái)提供，優(yōu)選劑型為液態(tài)制品。
作為成為本發(fā)明的測(cè)定對(duì)象的試樣，可以使用任意試樣，只要是至少含有血紅蛋白或糖化蛋白質(zhì)的被測(cè)溶液即可，作為優(yōu)選的被測(cè)溶液可以舉出血液成分，例如血清、血漿、血球、全血或經(jīng)過(guò)分離的紅血球等。此外，預(yù)先以蛋白酶將經(jīng)過(guò)分離的紅血球或糖化血紅蛋白進(jìn)行切斷，所得到的蛋白酶處理液(溶血液)也可以用作優(yōu)選的被測(cè)溶液。另外，紅血球的分離可以通過(guò)公知的離心分離法進(jìn)行分離，例如在3000轉(zhuǎn)的速度下離心3分鐘左右來(lái)進(jìn)行分離。此外，作為經(jīng)過(guò)分離的紅血球的溶血方法，用蒸餾水溶血即可。
在本發(fā)明的用于測(cè)定糖化蛋白質(zhì)的試劑和方法中，作為測(cè)定對(duì)象的糖化蛋白質(zhì)，可以舉出例如糖化白蛋白或血紅蛋白A1c(也可以包括糖化血紅蛋白)，但作為測(cè)定對(duì)象的糖化蛋白質(zhì)不受這些例子的任何限制，可以測(cè)定任意糖化蛋白質(zhì)。
試樣中除了作為測(cè)定目標(biāo)的糖化蛋白質(zhì)(例如血紅蛋白A1c或糖化白蛋白)以外，含有原本就存在的糖化氨基酸和/或糖化肽，從而影響到測(cè)定，在這種情況下，例如在對(duì)接受高能量氨基酸輸液的患者的試樣進(jìn)行測(cè)定時(shí)或是對(duì)血紅蛋白A1c進(jìn)行測(cè)定時(shí)，由于分子內(nèi)存在大量的糖化氨基酸，因此僅憑酶的特異性是無(wú)法特異性地測(cè)定出作為目標(biāo)的β鏈N末端的糖化，在這種情況下，需要將這些目標(biāo)以外的成分消除后再進(jìn)行測(cè)定。
可以使用作用于糖化氨基酸和/或糖化肽的酶來(lái)進(jìn)行消除反應(yīng)，例如在上述含有原本存在的糖化氨基酸和/或糖化肽而影響測(cè)定的情況下，可以使用含有下述第一試劑和第二試劑的試劑所述第一試劑中含有作用于糖化氨基酸和/或糖化肽的酶，所述第二試劑中含有蛋白酶。
對(duì)于含有第一試劑和第二試劑的試劑的組成(所述第一試劑中含有作用于糖化氨基酸和/或糖化肽的酶，所述第二試劑中含有蛋白酶)，可以通過(guò)使用不含有用于上述消除反應(yīng)的試劑的蛋白酶試劑和用于測(cè)定糖化氨基酸的試劑來(lái)進(jìn)行混合調(diào)制。當(dāng)?shù)谝辉噭┖偷诙噭┑幕旌媳炔皇?∶1，而是例如1∶3、1∶4、或1∶5等情況時(shí)，可以在混合時(shí)進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，以使各成分成為能夠有效發(fā)揮作用的濃度。即，當(dāng)?shù)谝辉噭┡c第二試劑的混合比為1∶4時(shí)，可以使第一試劑中混合的成分處于5/4的濃度范圍，使第二試劑中混合的成分處于所述第一試劑濃度范圍的5倍的濃度范圍。
而且，關(guān)于含有第一試劑和第二試劑的試劑的組成(所述第一試劑含有蛋白酶、和作用于糖化氨基酸和/或糖化肽、能夠?qū)⒉挥裳t蛋白的β鏈N末端產(chǎn)生的糖化氨基酸和/或糖化肽消除的酶；所述第二試劑含有作用于糖化氨基酸和/或糖化肽、能夠?qū)⒂裳t蛋白的β鏈N末端產(chǎn)生的糖化氨基酸和/或糖化肽檢出的酶)，可以通過(guò)使用在不含有用于所述消除反應(yīng)的試劑的蛋白酶試劑中添加下述酶、和用于測(cè)定糖化氨基酸的試劑來(lái)進(jìn)行混合制備，所述酶為作用于糖化氨基酸和/或糖化肽、能夠?qū)⒉挥裳t蛋白的β鏈N末端產(chǎn)生的糖化氨基酸和/或糖化肽消除的酶，所述酶的添加量為0.5U/ml～1000U/ml，優(yōu)選為1.0U/ml～500U/ml。當(dāng)?shù)谝辉噭┖偷诙噭┑幕旌媳炔皇?∶1，而是例如1∶3、1∶4、或1∶5等情況時(shí)，可以在混合時(shí)進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，以使各成分成為能夠有效發(fā)揮作用的濃度。即，當(dāng)?shù)谝辉噭┡c第二試劑的混合比為1∶4時(shí)，可以使第一試劑中混合的成分處于5/4的濃度范圍，使第二試劑中混合的成分調(diào)整至所述第一試劑濃度范圍的5倍的濃度范圍。
此外，由于通過(guò)消除反應(yīng)生成的過(guò)氧化氫給檢出反應(yīng)帶來(lái)不好的影響，因此可以在第一試劑中混合過(guò)氧化氫酶和/或過(guò)氧化酶來(lái)進(jìn)行分解該過(guò)氧化氫?？梢曰旌?U/ml～2000U/ml、優(yōu)選5U/ml～1000U/ml的過(guò)氧化氫酶，也可以混合其他的量?？梢韵虻诙噭┲谢旌?.001％～0.1％、優(yōu)選0.02％～0.09％的疊氮化鈉。此外，可以混合0.1U/ml～100U/ml、優(yōu)選0.2U/ml～50U/ml的過(guò)氧化酶，也可以混合其他的量。
實(shí)施例基于實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說(shuō)明，但本發(fā)明并不限于如下實(shí)施例。
蛋白酶反應(yīng)促進(jìn)劑的篩選<試劑>
1)R-1 蛋白質(zhì)分解試劑50mM Tris(三羥甲基氨基甲烷)緩沖液(Wako Pure ChemicalIndustries，Inc.制造)，pH為7.04000U/ml 中性蛋白酶(TOYOBO Co.，Ltd.制造)1.5mMCaCl2(Wako Pure Chemical Industries，Inc.制造)+試驗(yàn)樣品
2)R-2糖化氨基酸檢出試劑50mM Tris緩沖液(Wako Pure Chemical Industries，Inc.制造)，pH為7.530U/ml KAOD(衍生自棒彎孢(Curvularia clavata)YH923，Asahi Kasei Pharma Co.制造，在特開(kāi)2004-275013號(hào)公報(bào)中記載有制造方法)80U/ml 過(guò)氧化酶(Sigma Aldrich Japan K.K.制造)80μM DA-67(Wako Pure Chemical Industries，Inc.制造)作為試驗(yàn)樣品分別獨(dú)立使用如下物質(zhì)。其中，()內(nèi)的濃度為試劑R1中的最終濃度。
Tween-20(1％)、Brij35(1％)、Triton X-100(1％)、脫氧膽酸(1％)、亞氨基二乙酸(IDA，1mM)、ZnSO4(0.1 mM)、AlCl3(0.1mM)、亞鐵氰化鉀(0.01mM)、山梨糖醇(5％)、葡萄糖(5％)、亞硝酸鈉(2mM)、二甲亞砜(10％)、5’-三磷酸腺苷(ATP，2mM)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD，2mM)、黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD，2mM)(以上試劑為Wako Pure ChemicalIndustries，Inc.制造)，椰油酰肌氨酸鈉(肌氨酸鹽CN-30，1％)、肉豆蔻酰肌氨酸鈉(肌氨酸鹽MN，1％)、棕櫚酰肌氨酸鈉(肌氨酸鹽PN，1％)、月桂酰甲基丙氨酸鈉(丙氨酸鹽LN-30，1％)、聚氧乙烯(3)十三烷基醚乙酸鈉(ECTD-3NEX，1％)、聚氧乙烯(6)十三烷基醚乙酸鈉(ECTD-6NEX，1％)、聚氧乙烯(10)月桂基醚乙酸(AKYPO-RLM100，1％)、磷酸月桂酯(PhostenHLP，1％)、N-月桂酰甲基?；撬徕c(LMT，1％)、N-硬脂酰甲基牛磺酸鈉(SMT，1％)、月桂基硫酸鈉(SLS，1％)、聚氧乙烯(2)月桂基醚硫酸三乙醇胺(SBL-2T-36，1％)、聚氧乙烯(4)月桂基醚硫酸三乙醇胺(SBL-4T，1％)、或聚氧乙烯(3)烷基醚硫酸三乙醇胺(SBL-203-27，1％)、月桂基二甲氨基乙酸甜菜堿(AM-301，1％)、單硬脂酸聚氧乙烯(15)甘油酯(TMGS-15，1％)、3-[(3-膽酰胺基丙基)二甲氨]丙磺酸內(nèi)鹽(CHAPS，1％)(以上試劑為NikkoChemicals Co.，Ltd.制造)，WST-3(2mM，Dojindo Laboratories制造)。
<操作方法>
向在37℃下保溫的180μl R-1中添加20μl HbA1c測(cè)定用試劑標(biāo)準(zhǔn)品(一次校正物質(zhì)JDS HbA1c Lot2，福祉醫(yī)療技術(shù)振興會(huì)制造，30倍稀釋品)，于37℃引發(fā)反應(yīng)，準(zhǔn)確地在5分鐘后添加45μl R-2。在660nm下測(cè)定添加R-2前的吸光度和添加R-2后5分鐘的吸光度。將上述試驗(yàn)樣品的蛋白酶反應(yīng)促進(jìn)效果的評(píng)價(jià)結(jié)果示出于表1。表1中表示的AH-AL是吸光度AH減去吸光度AL的差，所述吸光度AH從等級(jí)為4(9.88％)的一次校正物質(zhì)得到，所述吸光度AL從等級(jí)為2(5.38％)的一次校正物質(zhì)中得到。此處，只要AH-AL大，就可以判斷為具有蛋白酶反應(yīng)促進(jìn)效果。尤其是當(dāng)AH-AL為20以上時(shí)，說(shuō)明具有優(yōu)異的促進(jìn)效果。
由表1可知，在以下物質(zhì)中具有效果作為N-?；被猁}的肌氨酸鹽CN-30、肌氨酸鹽MN、肌氨酸鹽PN、丙氨酸鹽LN-30、作為烷基醚羧酸鹽的ECTD-3NEX、ECTD-6NEX、AKYPO-RLM100、作為N-酰基?；撬猁}的LMT、SMT、作為聚氧乙烯烷基醚硫酸鹽的SBL-2T-36、SBL-4T和SBL-203-27。
由此表明含有乙酸基的化合物或其鹽、N-酰基?；撬峄蚱潲}、或者聚氧乙烯烷基醚硫酸或其鹽具有蛋白酶反應(yīng)促進(jìn)效果。此外還表明，N-?；被峄蚱潲}、或者烷基醚羧酸或其鹽作為含有乙酸基的化合物或其鹽，具有蛋白酶反應(yīng)促進(jìn)效果。
由表1的結(jié)果可知，作為N-?；被峄蚱潲}，如下通式(1)所示的化合物或其鹽具有蛋白酶反應(yīng)促進(jìn)效果；R1-CO-R2(1)通式(1)中，R1表示烷基或烯基，R2表示從氨基酸或氨基酸衍生物中的氨基上除去氫原子后得到的一價(jià)基團(tuán)。其中，優(yōu)選滿足如下條件的化合物R1為CH3(CH2)n-(此處，n為10～14的整數(shù))或十七碳-8-烯基，和/或R2為標(biāo)準(zhǔn)氨基酸、N-甲基丙氨酸或肌氨酸。
由表1可知，作為烷基醚羧酸或其鹽，如下通式(2)所示的化合物具有蛋白酶反應(yīng)促進(jìn)效果；R3-O-(CH2-CH2-O)m-CH2COOM(2)通式(2)中，R3表示烷基，m表示3～10的整數(shù)，M表示氫原子或與羧酸形成鹽的金屬。其中，優(yōu)選R3為CH3(CH2)Q-(此處，Q為10或11)的化合物。另外，使用TPM-PS代替DA67也會(huì)得到大致相同的結(jié)果。而且，雖然添加糖不會(huì)促進(jìn)蛋白酶反應(yīng)，但是當(dāng)使用添加有山梨糖醇的試劑作為對(duì)照時(shí)，對(duì)照的吸光度變化為6.5mAbs，而且，在N-?；被帷⑼榛阳人?、N-?；；撬岷途垩跻蚁┩榛蚜蛩猁}中，觀察到了大約4.3倍的反應(yīng)促進(jìn)效果。另外，當(dāng)吸光度的變化為10mAbs以上時(shí)也能夠進(jìn)行測(cè)定，這種情況下，計(jì)算出的反應(yīng)促進(jìn)效果為1.5倍，因此，能夠得到1.5倍以上的反應(yīng)促進(jìn)效果就可以。

含有蛋白酶反應(yīng)促進(jìn)劑的試劑<試劑>
血紅蛋白測(cè)定試劑50mM Tris緩沖液(Wako Pure Chemical Industries，Inc.制造)，pH為7.01％肌氨酸鹽MN0.05％ 疊氮化鈉在上述試劑中，另外還制備了使用AKYPO-RLM100、SMT、或SBL-2Z-36來(lái)代替肌氨酸鹽MN的試劑。
含有蛋白酶反應(yīng)促進(jìn)劑和蛋白酶的試劑<試劑>
1)R-1蛋白質(zhì)分解試劑50mM Tris緩沖液(Wako Pure Chemical Industries，Inc.制造)，pH為7.04000U/ml 中性蛋白酶(TOYOBO Co.，Ltd.制造，Toyozyme NEP)1.5mMCaCl2(Wako Pure Chemical Industries，Inc.制造)1％ 丙氨酸鹽LN-300.05％ 疊氮化鈉使用糖化纈氨酰-組氨酰-亮氨酰-蘇氨酰-脯氨酸和糖化纈氨酰-亮氨酰-絲氨酰-脯氨酰-丙氨酸對(duì)本試劑的蛋白酶特異性進(jìn)行確認(rèn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，本試劑對(duì)血紅蛋白的β鏈N末端具有較高的特異性，而實(shí)際上對(duì)α鏈N末端不起作用。進(jìn)而，對(duì)衍生自嗜熱解朊芽孢桿菌(BacillusthermoproteolyticusRokko)的嗜熱菌蛋白酶和高溫蛋白酶(thermoase)(Daiwa Kasei K.K.制造)、衍生自芽孢桿菌(Bacillus sp.ASP-842FERM BP-08641)的蛋白酶、以及衍生自溶桿菌屬(Lysobacter enzymogenesYK366 FERM BP-10010)的蛋白酶也同樣地確認(rèn)了基質(zhì)特異性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)也可以使用這些蛋白酶以替代中性蛋白酶(TOYOBO Co.，Ltd.制造，Toyozyme NEP)。
含有蛋白酶反應(yīng)促進(jìn)劑、蛋白酶、作用于糖化氨基酸和/或糖化肽的酶、蛋白酶穩(wěn)定劑和/或作用于糖化氨基酸和/或糖化肽的酶的穩(wěn)定劑的試劑(HbA1c用)<試劑>
1)R-1蛋白質(zhì)分解試劑50mM Tris緩沖液(Wako Pure Chemical Industries，Inc.制造)，pH為7.04000U/ml 中性蛋白酶(TOYOBO Co.，Ltd.制造)1.5mMCaCl2(Wako Pure Chemical Industries，Inc.制造)1％ 丙氨酸鹽LN-306％ DMSO0.05％ 疊氮化鈉2)R-2糖化氨基酸檢出試劑2-1)R-2-A50mM Tris緩沖液(Wako Pure Chemical Industries，Inc.制造)，pH為7.560U/ml KAOD (衍生自棒彎孢YH923，Asahi Kasei Pharma Co.制造，在特開(kāi)2004-275013號(hào)公報(bào)中記載有制造方法或衍生自WO2004/104203中記載的侵管新赤殼(Neocosmospora vasinfecta)474菌株)160U/ml 過(guò)氧化酶(Sigma Aldrich Japan K.K.制造)10％ 山梨糖醇0.1％疊氮化鈉2-1)R-2-B50mM Tris緩沖液(Wako Pure Chemical Industries，Inc.制造)，pH為7.5160μM DA-67(Wako Pure Chemical Industries，Inc.制造)[實(shí)施例5]含有蛋白酶反應(yīng)促進(jìn)劑、蛋白酶、作用于糖化氨基酸和/或糖化肽的酶、蛋白酶穩(wěn)定劑和/或作用于糖化氨基酸和/或糖化肽的酶的穩(wěn)定劑的試劑(HbA1c用)
<試劑>
1)R-1蛋白質(zhì)分解試劑50mMTris緩沖液(Wako Pure Chemical Industries，Inc.制造)，pH為7.04000U/ml中性蛋白酶(TOYOBO Co.，Ltd.制造)1.5mM CaCl2(Wako Pure Chemical Industries，Inc.制造)1％ 丙氨酸鹽LN-306％ DMSO0.05％ 疊氮化鈉2)R-2糖化氨基酸檢出試劑50mMTris緩沖液(Wako Pure Chemical Industries，Inc.制造)，pH為7.560U/ml KAOD(衍生自棒彎孢YH923，Asahi Kasei Pharma Co.制造，在特開(kāi)2004-275013號(hào)公報(bào)中記載有制造方法或衍生自WO2004/104203中記載的侵管新赤殼(Neocosmospora vasinfecta)474菌株)160U/ml 過(guò)氧化酶(Sigma Aldrich Japan K.K.制造)10％山梨糖醇0.1％ 疊氮化鈉160μM DA-67(Wako Pure Chemical Industries，Inc.制造)2％ 2-羥丙基-β-環(huán)糊精(日本食品加工株式會(huì)社制造)[實(shí)施例6]含有第一試劑和第二試劑的試劑(第一試劑含有蛋白酶、和作用于糖化氨基酸和/或糖化肽、能夠?qū)⒉挥裳t蛋白的β鏈N末端產(chǎn)生的糖化氨基酸和/或糖化肽消除的酶；第二試劑含有作用于糖化氨基酸和/或糖化肽、能夠?qū)⒂裳t蛋白的β鏈N末端產(chǎn)生的糖化氨基酸和/或糖化肽檢出的酶)<試劑>
1)R-1蛋白質(zhì)分解試劑50mM Tris緩沖液(Wako Pure Chemical Industries，Inc.制造)，pH為7.0
4000U/ml 中性蛋白酶(TOYOBO Co.，Ltd.制造)1.5mMCaCl2(Wako Pure Chemical Industries，Inc.制造)1％ 丙氨酸鹽LN-306％ DMSO0.05％ 疊氮化鈉10U/ml KAOD(Asahi Kasei Pharma Co.制造)2)R-2糖化氨基酸檢出試劑50mM Tris緩沖液(Wako Pure Chemical Industries，Inc.制造)，pH為7.560U/ml KAOD(衍生自棒彎孢YH923，Asahi Kasei Pharma Co.制造，在特開(kāi)2004-275013號(hào)公報(bào)中記載有制造方法)160U/ml 過(guò)氧化酶(Sigma Aldrich Japan K.K.制造)10％ 山梨糖醇0.1％疊氮化鈉160μM DA-67(Wako Pure Chemical Industries，Inc.制造)2％ 2-羥丙基-β-環(huán)糊精(日本食品加工株式會(huì)社制造)[實(shí)施例7]含有第一試劑和第二試劑的試劑(第一試劑含有作用于糖化氨基酸和/或糖化肽的酶，第二試劑含有蛋白酶)<試劑>
1)R-1蛋白質(zhì)分解試劑50mM Tris緩沖液(Wako Pure Chemical Industries，Inc.制造)，pH為7.012U/ml KAOD(衍生自棒彎孢YH923，Asahi Kasei Pharma Co.制造，在特開(kāi)2004-275013號(hào)公報(bào)中記載有制造方法)32U/ml 過(guò)氧化酶(Sigma Aldrich Japan K.K.制造)6％ 山梨糖醇0.05％ 疊氮化鈉32μMDA-67(Wako Pure Chemical Industries，Inc.制造)2％ 2-羥丙基-β-環(huán)糊精(日本食品加工株式會(huì)社制造)
1％ 丙氨酸鹽LN-302)R-2糖化氨基酸檢出試劑50mM Tris緩沖液(Wako Pure Chemical Industries，Inc.制造)，pH為7.520000U/ml 中性蛋白酶(TOYOBO Co.，Ltd.制造)1.5mM CaCl2(Wako Pure Chemical Industries，Inc.制造)30％ DMSO0.05％疊氮化鈉[實(shí)施例8]含有蛋白酶反應(yīng)促進(jìn)劑、蛋白酶、作用于糖化氨基酸和/或糖化肽的酶、蛋白酶穩(wěn)定劑和/或作用于糖化氨基酸和/或糖化肽的酶的穩(wěn)定劑的試劑(GA用)1)R-1蛋白質(zhì)分解試劑50mM Tris緩沖液(Wako Pure Chemical Industries，Inc.制造)，pH為7.08mM 4-AA10％ DMSO10000U/ml衍生自地衣芽孢桿菌的蛋白酶(Sigma Aldrich JapanK.K.制造)(所使用的是經(jīng)過(guò)DEAE-瓊脂糖樹(shù)脂提純并脫鹽的蛋白酶)0.001675％ BCP(Wako Pure Chemical Industries，Inc.制造)0.05％ 疊氮化鈉0.5％ Tween20(41％ 丙氨酸鹽LN-30)2)R-2糖化氨基酸檢出試劑50mM Tris緩沖液(Wako Pure Chemical Industries，Inc.制造)，pH為7.55％山梨糖醇20U/ml KAOD(Asahi Kasei Pharma Co.制造)5U/ml 過(guò)氧化酶(Sigma Aldrich Japan K.K.制造)10mM N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺鈉鹽二氫化物(TOOS，Dojindo Laboratories制造)0.05％疊氮化鈉[實(shí)施例9]血紅蛋白的測(cè)定和試劑的穩(wěn)定性使用實(shí)施例2的試劑對(duì)血紅蛋白濃度已知的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行測(cè)定。
<血紅蛋白測(cè)定試劑的反應(yīng)步驟>
使用自動(dòng)分析計(jì)(日立7170S型自動(dòng)分析計(jì)，日立制作所制造)進(jìn)行測(cè)定。向20μl試樣中添加180μl試劑，測(cè)定660nm下的吸光度變化。使用水作為對(duì)照，5分鐘后計(jì)算試樣和水的吸光度之差。使用經(jīng)過(guò)5級(jí)稀釋的血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)品作為試樣。
結(jié)果示于圖1。如圖1所示，使用本發(fā)明的蛋白酶反應(yīng)促進(jìn)劑(肌氨酸鹽MN、AKYPO-RLM100、SMT和SBL-2Z-36)能夠定量血紅蛋白。而且，于37℃對(duì)使用肌氨酸鹽MN作為蛋白酶反應(yīng)促進(jìn)劑的試劑進(jìn)行了4天的保存試驗(yàn)。將HbA1c測(cè)定用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(一次校正物質(zhì)JDS HbA1cLot2，福祉醫(yī)療技術(shù)振興會(huì)制造，等級(jí)1，血紅蛋白濃度為135g/L)稀釋30倍，以此作為校正物質(zhì)對(duì)5.5g/dl血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行測(cè)定，血紅蛋白的測(cè)定值在保存試驗(yàn)前為54mAbs(4.5g/L)，在保存試驗(yàn)后為50mAbs(4.6g/L)。由這些結(jié)果可以推斷本試劑在冷藏下能保持6個(gè)月以上的穩(wěn)定狀態(tài)。
血紅蛋白A1c的測(cè)定和血紅蛋白A1c比率的計(jì)算使用實(shí)施例4、5的試劑對(duì)試樣進(jìn)行了測(cè)定。
<試樣>
1)HbA1c測(cè)定用試劑標(biāo)準(zhǔn)品(一次校正物質(zhì)JDS HbA1c Lot2，福祉醫(yī)療技術(shù)振興會(huì)制造)，30倍稀釋物2)向9容積的一次校正物質(zhì)JDS HbA1c Lot2的30倍稀釋物中添加1容積的乳糜(2000度，干涉檢查，Sysmex Co.制造)而得到的含乳糜血紅蛋白<R-2試劑的制備>在使用實(shí)施例4的試劑時(shí)，在使用前將R-2-A試劑和R-2-B試劑以1∶1的比例進(jìn)行混合。實(shí)施例5的試劑直接使用。
<血紅蛋白A1c測(cè)定試劑的反應(yīng)步驟>
使用自動(dòng)分析計(jì)(日立7170S型自動(dòng)分析計(jì)，日立制作所制造)進(jìn)行測(cè)定。向20μl試樣中添加180μl試劑R-1，于37℃保溫，然后測(cè)定660nm的主波長(zhǎng)和700nm的副波長(zhǎng)下的吸光度變化。5分鐘后添加45μl試劑R-2，于37℃保溫，測(cè)定660nm的主波長(zhǎng)和700nm的副波長(zhǎng)下的吸光度變化。通過(guò)使用HbA1c測(cè)定用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(一次校正物質(zhì)JDS HbA1c Lot2，福祉醫(yī)療技術(shù)振興會(huì)制造，等級(jí)1；血紅蛋白濃度為135g/L，HbA1c值為4.04％；和等級(jí)5；血紅蛋白濃度為132g/L，HbA1c值為12.63％)作為校正物質(zhì)，將得到的值換算為測(cè)定值。通過(guò)在即將添加R-2試劑之前的測(cè)光來(lái)定量血紅蛋白，通過(guò)在添加R-2試劑5分鐘之后的測(cè)光來(lái)定量HbA1c。
血紅蛋白和HbA1c的校準(zhǔn)曲線于圖2和圖3中示出。由HbA1c測(cè)定用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的HbA1c％和HbA1c濃度計(jì)算出HbA1c濃度。由圖2可知，使用本發(fā)明的蛋白酶反應(yīng)促進(jìn)劑可以對(duì)血紅蛋白A1c進(jìn)行定量。此外，由圖3可知，也可以同時(shí)對(duì)血紅蛋白進(jìn)行定量。由此表明，通過(guò)利用本發(fā)明可以在同一反應(yīng)槽中連續(xù)測(cè)定血紅蛋白和HbA1c。
而且，在含乳糜血紅蛋白的測(cè)定中，在不減去副波長(zhǎng)的情況下，在試樣和R-1混合時(shí)所算出的吸光度較高，對(duì)于一次校正物質(zhì)(JDS HbA1cLot2，福祉醫(yī)療技術(shù)振興會(huì)制造，等級(jí)1，HbA1c值為4.04％)測(cè)定5次后的重現(xiàn)性，其CV值為3.5％，另一方面，對(duì)于在減去副波長(zhǎng)的情況下的重現(xiàn)性，其CV值為1.5％，準(zhǔn)確性得到了提高。由此表明，在同一波長(zhǎng)下測(cè)定血紅蛋白和HbA1c，可以通過(guò)減去副波長(zhǎng)來(lái)準(zhǔn)確地測(cè)定HbA1c。并且，使用衍生自棒彎孢YH923(Asahi Kasei Pharma Co.制造，在特開(kāi)2004-275013號(hào)公報(bào)中記載有制造方法)或衍生自WO 2004/104203中記載的侵管新赤殼(Neocosmospora vasinfecta)474菌株的酮胺氧化酶時(shí)，也得到了同樣的結(jié)果。
此外，將本試劑R-1和R-2-A在液體狀態(tài)下于37℃保存4天，對(duì)其穩(wěn)定性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。將實(shí)施例4的試劑R-2-B在冷藏下保存，在即將使用前混合R-2-A和R-2-B。測(cè)定的結(jié)果如下對(duì)于等級(jí)為3的一次校正物質(zhì)JDS HbA1c Lot2(血紅蛋白濃度為145g/L，HbA1c值為7.32％)的30倍稀釋物中的血紅蛋白定量值，在保存試驗(yàn)前，實(shí)施例4的試劑為58mAbs、4.8g/L，實(shí)施例5的試劑為55mAbs、4.8g/L，在保存試驗(yàn)后，實(shí)施例4的試劑為56mAbs、4.7g/L，實(shí)施例5的試劑為54mAbs、4.7g/L。另外，對(duì)于HbA1c的計(jì)算值，在保存試驗(yàn)前，實(shí)施例4的試劑為7.5％，實(shí)施例5的試劑為7.6％；在保存試驗(yàn)后，實(shí)施例4的試劑為7.6％，實(shí)施例5的試劑為7.5％。此外，在冷藏保存3個(gè)月的數(shù)據(jù)中也未發(fā)現(xiàn)測(cè)定值中出現(xiàn)差異。由這些結(jié)果可以推斷，實(shí)施例4的試劑R-1、R-2-A、和實(shí)施例5的試劑在冷藏下能保持6個(gè)月以上的穩(wěn)定狀態(tài)。一般來(lái)說(shuō)，無(wú)色型色素的反應(yīng)性雖高但不穩(wěn)定，在實(shí)施例4的試劑中，需要將無(wú)色型色素與其他成分分開(kāi)保存，但是由于添加環(huán)糊精而使色素變得穩(wěn)定，從而能夠使之與其他成分共存于同一個(gè)容器中。
并且，在實(shí)施例4和實(shí)施例5的試劑中使用了具有如下特征的酶作為蛋白酶，是從糖化血紅蛋白或其片段的糖化后的β鏈N末端切掉糖化氨基酸和/或糖化肽的蛋白酶，而不是實(shí)質(zhì)性地從糖化血紅蛋白或其片段的糖化后的α鏈N末端切掉糖化氨基酸和/或糖化肽的蛋白酶，以該蛋白酶作為作用于糖化氨基酸和/或糖化肽的酶，該蛋白酶對(duì)糖化纈氨酰-組氨酸的作用高于對(duì)糖化纈氨酰-亮氨酸的作用。由于等級(jí)為3的JDSHbA1c Lot2的定量值與表示值一致，所以表明血紅蛋白A1c得到了準(zhǔn)確的測(cè)定。
引入了消除體系(elimination system)的試劑的性能<試劑>
使用實(shí)施例6、7的試劑。
<試樣>
向9容積的HbA1c測(cè)定用試劑標(biāo)準(zhǔn)品(一次校正物質(zhì)JDS HbA1cLot2，等級(jí)3(HbA1c值為7.32％)，福祉醫(yī)療技術(shù)振興會(huì)制造)的30倍稀釋物中添加1容積的糖化氨基酸，以此作為試樣。并且，作為對(duì)照物使用以蒸餾水代替糖化氨基酸的上述稀釋物。作為添加的糖化氨基酸的濃度，使用2mM的糖化Z-賴氨酸水溶液(FZL)和2mM的糖化纈氨酸水溶液(FV)(糖化氨基酸以Hashiba等人的方法(Hashiba H，J.Agric.Food Chem.2470，1976)來(lái)合成和提純)。
<反應(yīng)步驟>
按照與實(shí)施例10相同的步驟測(cè)定試樣。
測(cè)定的結(jié)果中，等級(jí)為3的一次校正物質(zhì)JDS HbA1c Lot2(HbA1c值為7.32％)的HbA1c定量值為在使用實(shí)施例6的試劑的情況下，對(duì)照物、添加FZL的試樣和添加FV的試樣的依次為7.2％、7.3％和7.1％，在使用實(shí)施例7的試劑的情況下，依次為7.3％、7.4％和7.1％，確認(rèn)了進(jìn)行了消除反應(yīng)，測(cè)定到了準(zhǔn)確的值。
糖化白蛋白的測(cè)定、糖化白蛋白比率的計(jì)算和試劑的穩(wěn)定性<糖化白蛋白測(cè)定試劑的反應(yīng)步驟>
使用實(shí)施例5的試劑。向240μl于37℃保溫后的R-1中添加8μl對(duì)照血清H(BML Inc.制造，根據(jù)用法制備并以蒸餾水進(jìn)行5級(jí)稀釋)，測(cè)定其在546nm的主波長(zhǎng)(副波長(zhǎng)為700nm)下的吸光度。于37℃開(kāi)始反應(yīng)，準(zhǔn)確地在5分鐘后添加80μl的R-2。測(cè)定添加R-2前和添加R-25分鐘后的吸光度。并且使用蒸餾水代替基質(zhì)溶液來(lái)測(cè)定，以此作為空白，用由對(duì)照基質(zhì)溶液得到的吸光度變化減去空白試樣的吸光度變化，求出ΔA0。同時(shí)對(duì)Lucica GA用校正物質(zhì)(Asahi Kasei Pharma Co.制造)進(jìn)行測(cè)定并比較吸光度，由此進(jìn)行值的換算。用剛剛添加試樣之后的吸光度減去即將添加R-2之前的吸光度，根據(jù)得到的吸光度差來(lái)求出白蛋白的測(cè)定值。用添加R-25分鐘之后的吸光度減去即將添加R-2之前的吸光度，根據(jù)得到的吸光度差來(lái)求出糖化白蛋白的測(cè)定值。
在不含有蛋白酶反應(yīng)促進(jìn)劑(丙氨酸鹽LN-30)的情況下，蛋白酶的反應(yīng)慢，對(duì)照血清(BML Inc.制造，未稀釋)的GA測(cè)定的靈敏度為32mAbs，該靈敏度是含有蛋白酶反應(yīng)促進(jìn)劑時(shí)(48mAbs)的66％。反應(yīng)速率加快了1.5倍。
而且，經(jīng)過(guò)5級(jí)稀釋的對(duì)照血清的測(cè)定值于圖4示出。由圖4可知，使用本試劑可以在同一反應(yīng)槽中、在同一波長(zhǎng)下，對(duì)白蛋白和糖化白蛋白進(jìn)行定量，能夠良好地測(cè)定出糖化白蛋白值(％)。
進(jìn)而，將本試劑在液體狀態(tài)下于37℃保存4天，作為結(jié)果，對(duì)照血清(BML Inc.制造，未稀釋)的測(cè)定值如下GA測(cè)定的靈敏度為48mAbs，白蛋白測(cè)定的靈敏度為60mAbs、GA值為44.8％；而保存后，GA測(cè)定的靈敏度為46mAbs，白蛋白測(cè)定的靈敏度為61mAbs、GA值為44.5％。由這些結(jié)果可以推斷，本試劑在冷藏下能保持6個(gè)月以上的穩(wěn)定狀態(tài)。
用于酶反應(yīng)檢出的色素的穩(wěn)定劑的篩選<試劑>
1)R-1含色素試劑200mM Tris緩沖液(Wako Pure Chemical Industries，Inc.制造)，pH為7.5200μM DA-64、DA-67或0.04％的MBTH(Wako Pure ChemicalIndustries，Inc.制造)+試驗(yàn)樣品2)R-2含過(guò)氧化酶試劑200mM Tris緩沖液(Wako Pure Chemical Industries，Inc.制造)，pH為7.510U/ml 過(guò)氧化酶(Sigma Aldrich Japan K.K.制造)0.04％ TOOS(Wako Pure Chemical Industries，Inc.制造，但只在R-1中使用MBTH的情況下添加)作為試驗(yàn)樣品使用如下物質(zhì)。其中，()內(nèi)的濃度為R-1中的最終濃度。
Tween-20(1％)、Brij35(1％)、Triton X-100(1％)、脫氧膽酸(1％)、亞氨基二乙酸(IDA，1mM)、ZnSO4(0.1mM)、AlCl3(0.1mM)、亞鐵氰化鉀(0.1mM)、山梨糖醇(5％)、葡萄糖(5％)、亞硝酸鈉(2mM)、二甲亞砜(DMSO，10％)(以上試劑為Wako Pure Chemical Industries，Inc.制造)，2-羥丙基-β-環(huán)糊精(2HP β CD，0.5％，2％，5％)、甲基-β-環(huán)糊精(M β CD，0.5％，2％，5％)(以上試劑為日本食品加工株式會(huì)社制造)。
<操作方法>
將在37℃下保溫的500μl R-1和500μl R-2混合，于37℃加熱2分鐘，測(cè)定吸光度(A0)，添加10μl 500μM的過(guò)氧化氫或蒸餾水。于37℃加熱，準(zhǔn)確地在添加過(guò)氧化氫5分鐘后測(cè)定吸光度(A1)，計(jì)算吸光度的變化ΔA(A1-A0)。在使用DA64作為色素時(shí)，在750nm下測(cè)定吸光度，在使用DA67作為色素時(shí)，在660nm下測(cè)定吸光度，在使用4-AA-TOOS作為色素時(shí)，在570nm下測(cè)定吸光度。
在制備試劑后立即將其分別于37℃保存2天后、于37℃保存9天，然后，對(duì)蒸餾水的空白的靈敏度以及過(guò)氧化氫的靈敏度進(jìn)行測(cè)定。
表2-1和表2-2表示空白和用于酶反應(yīng)檢出的色素在保存上的關(guān)系。由表2-1和表2-2可知，金屬鹽和2-羥丙基-β-環(huán)糊精、甲基-β-環(huán)糊精對(duì)空白具有抑制效果。此外，表3表示測(cè)定500μM的過(guò)氧化氫時(shí)，該色素與金屬鹽以及該色素與環(huán)糊精濃度在保存上的關(guān)系。應(yīng)用金屬鹽時(shí)，從表2-2中未觀察到空白的上升，但是，從表3可知，過(guò)氧化氫本身的靈敏度沒(méi)有表現(xiàn)出來(lái)。此外，由表3可以看出，濃度為0.5％以上的環(huán)糊精對(duì)該色素具有穩(wěn)定效果。 單位Abs
單位Abs

過(guò)氧化氫酶的添加對(duì)含有環(huán)糊精和用于酶反應(yīng)檢出的色素的試劑的影響效果<試劑>
1)R-1含色素試劑200mM Tris緩沖液(Wako Pure Chemical Industries，Inc.制造)，pH為7.5200μM DA-67(Wako Pure Chemical Industries，Inc.制造)2％ 2-羥丙基-β-環(huán)糊精(日本食品加工株式會(huì)社制造)±500U/ml過(guò)氧化氫酶(Wako Pure Chemical Industries，Inc.制造)
2)R-2含過(guò)氧化酶試劑200mM Tris緩沖液(Wako Pure Chemical Industries，Inc.制造)，pH為7.510U/ml 過(guò)氧化酶(Sigma Aldrich Japan K.K.制造)0.05％ 疊氮化鈉(Wako Pure Chemical Industries，Inc.制造)<操作方法>
操作方法與實(shí)施例13相同。在制備試劑后立即將其分別于37℃保存2天后、于37℃保存9天，然后對(duì)蒸餾水的空白的靈敏度以及過(guò)氧化氫的靈敏度進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果于表4示出。由表4可知，由于添加了過(guò)氧化氫酶，使保存后的空白顯著降低，用于酶反應(yīng)檢出的色素的穩(wěn)定性得到上升。

緩沖溶液的濃度對(duì)含有環(huán)糊精和用于酶反應(yīng)檢出的色素的試劑的影響效果<試劑>
1)R-1含色素試劑50mM、80mM、100mM、200mM Tris緩沖液(Wako PureChemical Industries，Inc.制造)，pH為7.510μMDA-67(Wako Pure Chemical Industries，Inc.制造)2％ 2-羥丙基-β-環(huán)糊精(日本食品加工株式會(huì)社制造)4000U/ml Toyozyme NEP(TOYOBO Co.，Ltd.制造)500U/ml 過(guò)氧化氫酶(Wako Pure Chemical Industries，Inc.制造)1％ 肌氨酸鹽LN(Nikko Chemicals Co.，Ltd.制造)2)R-2含過(guò)氧化酶試劑
50mMTris緩沖液(Wako Pure Chemical Industries，Inc.制造)，pH為7.578U/ml 過(guò)氧化酶(Sigma Aldrich Japan K.K.制造)26U/ml 衍生自棒彎孢YH923的KAOD(Asahi Kasei PharmaCo.制造，在特開(kāi)2004-275013號(hào)公報(bào)中記載有制造方法)0.05％ 疊氮化鈉(Wako Pure Chemical Industries，Inc.制造)<操作方法>
使用自動(dòng)分析計(jì)(日立7170S型自動(dòng)分析計(jì)，日立制作所制造)進(jìn)行測(cè)定。向20μl試樣中添加180μl試劑R-1，于37℃保溫，然后測(cè)定660nm的主波長(zhǎng)和700nm的副波長(zhǎng)下的吸光度變化。5分鐘后添加45μl試劑R-2，于37℃保溫，測(cè)定660nm的主波長(zhǎng)和700nm的副波長(zhǎng)下的吸光度變化。另外，試樣中使用HbA1c測(cè)定用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(一次校正物質(zhì)JDSHbA1c Lot2，福祉醫(yī)療技術(shù)振興會(huì)制造，等級(jí)1；135g/L，4.04％和等級(jí)5；132g/L，12.63％)的30倍稀釋物。
在制備試劑后立即將其分別于37℃保存2天、4天和9天，然后測(cè)定并計(jì)算等級(jí)5的靈敏度～等級(jí)1的靈敏度。
結(jié)果于表5示出。由表5可知，將緩沖劑的濃度控制在80mM以下時(shí)，用于酶反應(yīng)檢出的色素的穩(wěn)定性顯著提高。

含有環(huán)糊精和用于酶反應(yīng)檢出的色素的試劑(HbA1c用)<試劑>
1)R-1含色素試劑50mM Tris緩沖液(Wako Pure Chemical Industries，Inc.制造)，pH為7.510μM DA-67(Wako Pure Chemical Industries，Inc.制造)
2％ 2-羥丙基-β-環(huán)糊精(日本食品加工株式會(huì)社制造)4000U/ml Toyozyme NEP(TOYOBO Co.，Ltd.制造)500U/ml 過(guò)氧化氫酶(Wako Pure Chemical Industries，Inc.制造)1％ 肌氨酸鹽LN(Nikko Chemicals Co.，Ltd.制造)2)R-2含過(guò)氧化酶試劑50mM Tris緩沖液(Wako Pure Chemical Industries，Inc.制造)，pH為7.578U/ml 過(guò)氧化酶(Sigma Aldrich Japan K.K.制造)26U/ml 衍生自棒彎孢YH923的KAOD(Asahi Kasei PharmaCo.制造，在特開(kāi)2004-275013號(hào)公報(bào)中記載有制造方法)0.05％ 疊氮化鈉(Wako Pure Chemical Industries，Inc.制造)[實(shí)施例17]含有環(huán)糊精和用于酶反應(yīng)檢出的色素的試劑(GA用)<試劑>
1)R-1含色素試劑50mM Tris緩沖液(Wako Pure Chemical Industries，Inc.制造)，pH為7.010μMDA-67(Wako Pure Chemical Industries，Inc.制造)2％ 2-羥丙基-β-環(huán)糊精(日本食品加工株式會(huì)社制造)10％ DMSO10000U/ml衍生自地衣芽孢桿菌的蛋白酶(Sigma Aldrich JapanK.K.制造)(所使用的蛋白酶是經(jīng)過(guò)DEAE-瓊脂糖樹(shù)脂提純并脫鹽的蛋白酶1)500U/ml過(guò)氧化氫酶(Wako Pure Chemical Industries，Inc.制造)2)R-2糖化氨基酸檢出試劑50mM Tris緩沖液(Wako Pure Chemical Industries，Inc.制造)，pH為7.55％ 山梨糖醇20U/ml KAOD(Asahi Kasei Pharma Co.制造)5U/ml 過(guò)氧化酶(Sigma Aldrich Japan K.K.制造)
0.05％ 疊氮化鈉[實(shí)施例18]血紅蛋白A1c的測(cè)定、血紅蛋白A1c比率的計(jì)算和試劑的穩(wěn)定性使用實(shí)施例16的試劑對(duì)試樣進(jìn)行了測(cè)定。
<試樣>
1)HbA1c測(cè)定用試劑標(biāo)準(zhǔn)品(一次校正物質(zhì)JDS HbA1c Lot2，福祉醫(yī)療技術(shù)振興會(huì)制造)的30倍稀釋物<血紅蛋白A1c測(cè)定試劑的反應(yīng)步驟>
使用自動(dòng)分析計(jì)(日立7170S型自動(dòng)分析計(jì)，日立制作所制造)進(jìn)行測(cè)定。向20μl試樣中添加180μl試劑R-1，于37℃保溫。在添加試樣5分鐘后，添加45μl試劑R-2，于37℃保溫5分鐘。試樣在即將添加試劑R-2之前(A1)和添加試劑R-25分鐘后(A2)測(cè)定660nm的主波長(zhǎng)和700nm的副波長(zhǎng)下的吸光度變化。此外，以HbA1c測(cè)定用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(一次校正物質(zhì)JDS HbA1c Lot2，福祉醫(yī)療技術(shù)振興會(huì)制造，等級(jí)1；血紅蛋白濃度為135g/L，HbA1c值為4.04％和等級(jí)5；血紅蛋白濃度為132g/L，HbA1c值為12.63％)作為校正物質(zhì)，將得到的值換算為測(cè)定值。通過(guò)使用A1的計(jì)算來(lái)定量血紅蛋白，根據(jù)使用A2-A1的值的計(jì)算來(lái)定量HbA1c。
血紅蛋白和HbA1c的校準(zhǔn)曲線于圖5和圖6中示出。由圖5和圖6可知，利用本發(fā)明的用于酶反應(yīng)檢出的色素的穩(wěn)定化方法，能夠?qū)ρt蛋白A1c和血紅蛋白進(jìn)行定量。顯然，由于能夠?qū)ρt蛋白A1c和血紅蛋白進(jìn)行定量，因此，可以計(jì)算出血紅蛋白A1c比率。
進(jìn)而，將本試劑在液體狀態(tài)下于37℃保存4天，其結(jié)果如下等級(jí)為3的一次校正物質(zhì)JDS HbA1c Lot2(血紅蛋白濃度為145g/L，HbA1c值為7.32％)的30倍稀釋物的血紅蛋白定量值在保存試驗(yàn)前為40mAbs、4.8g/L，在保存試驗(yàn)后為38mAbs、4.7g/L。而且HbA1c的計(jì)算值在保存試驗(yàn)前為7.2％，在保存試驗(yàn)后為7.3％。此外，在冷藏保存3個(gè)月的數(shù)據(jù)中也未發(fā)現(xiàn)測(cè)定值中出現(xiàn)差異。由這些結(jié)果可以推斷出，本試劑在冷藏下能保持6個(gè)月以上的穩(wěn)定狀態(tài)。
糖化白蛋白的測(cè)定、糖化白蛋白比率的計(jì)算和試劑的穩(wěn)定性<糖化白蛋白測(cè)定試劑的反應(yīng)步驟>
使用實(shí)施例17的試劑。向240μl于37℃保溫后的R-1中添加8μl對(duì)照血清H(BML Inc.制造，根據(jù)用法制備并以蒸餾水進(jìn)行5級(jí)稀釋)，于37℃開(kāi)始反應(yīng)，準(zhǔn)確地在5分鐘后添加80μl R-2。在660nm的主波長(zhǎng)和70nm的副波長(zhǎng)下，測(cè)定添加R-2前和添加R-25分鐘后的吸光度。并且使用蒸餾水代替基質(zhì)溶液來(lái)測(cè)定，以此作為空白，用由對(duì)照基質(zhì)溶液得到的吸光度變化減去空白試樣的吸光度變化，求出ΔA0。同時(shí)對(duì)LucicaGA用校正物質(zhì)(Asahi Kasei Pharma Co.制造)進(jìn)行測(cè)定并比較吸光度，由此進(jìn)行值的換算。使用Aquaauto Kaonos ALB試劑(Kainos，Inc.制造)并按照該試劑的用量來(lái)進(jìn)行白蛋白的測(cè)定。經(jīng)過(guò)5級(jí)稀釋的對(duì)照血清的測(cè)定值于圖7示出。由圖7可知，使用本試劑可以對(duì)白蛋白和糖化白蛋白進(jìn)行定量，能夠良好地測(cè)定出糖化白蛋白值(％)。
進(jìn)而將本試劑在液體狀態(tài)下于37℃保存4天，作為結(jié)果，對(duì)照血清L(BML Inc.制造，未稀釋)的測(cè)定值是，GA測(cè)定的靈敏度為150mAbs，GA值為18.3％；而保存后，GA測(cè)定的靈敏度為146mAbs，GA值為18.2％。由這些結(jié)果可以推斷出，本試劑在冷藏下能保持6個(gè)月以上的穩(wěn)定狀態(tài)。
工業(yè)實(shí)用性本發(fā)明的測(cè)定用試劑和測(cè)定方法可以用于臨床檢查。
權(quán)利要求
1.一種蛋白酶反應(yīng)促進(jìn)劑，該蛋白酶反應(yīng)促進(jìn)劑包含下述物質(zhì)中的至少一種含有乙酸基的化合物或其鹽、N-?；；撬峄蚱潲}、或者聚氧乙烯烷基醚硫酸或其鹽。
2.如權(quán)利要求1所述的蛋白酶反應(yīng)促進(jìn)劑，其中，所述含有乙酸基的化合物或其鹽為N-?；被峄蚱潲}，或是烷基醚羧酸或其鹽。
3.如權(quán)利要求2所述的蛋白酶反應(yīng)促進(jìn)劑，其中，所述N-酰基氨基酸或其鹽為如下通式(1)所示的化合物或其鹽；R1-CO-R2(1)通式(1)中，R1表示烷基或烯基，R2表示從氨基酸或氨基酸衍生物的氨基上除去一個(gè)氫原子后得到的一價(jià)基團(tuán)。
4.如權(quán)利要求3所述的蛋白酶反應(yīng)促進(jìn)劑，其中，所述N-?；被峄蚱潲}滿足下述I)和/或II)I)R1為CH3(CH2)n-或十七碳-8-烯基，其中，n為10～14的整數(shù)；II)所述氨基酸或氨基酸衍生物為N-甲基丙氨酸或肌氨酸。
5.如權(quán)利要求2所述的蛋白酶反應(yīng)促進(jìn)劑，其中，所述烷基醚羧酸或其鹽為如下通式(2)所示的化合物，R3-O-(CH2-CH2-O)m-CH2COOM(2)通式(2)中，R3表示烷基，m表示3～10的整數(shù)，M表示氫原子或與羧酸形成鹽的金屬。
6.如權(quán)利要求5所述的蛋白酶反應(yīng)促進(jìn)劑，其中，R3為CH3(CH2)Q-，此處，Q為10或11。
7.如權(quán)利要求1～6任意一項(xiàng)所述的蛋白酶反應(yīng)促進(jìn)劑，其特征是，在對(duì)由蛋白酶反應(yīng)生成的產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)定的方法中，所述蛋白酶反應(yīng)促進(jìn)劑將蛋白酶反應(yīng)速率加快1.5倍以上，在所述蛋白酶反應(yīng)中，蛋白酶至少與蛋白酶反應(yīng)促進(jìn)劑共存，以使反應(yīng)得到促進(jìn)。
8.一種試劑，其特征是，該試劑含有權(quán)利要求1～7任意一項(xiàng)所述的蛋白酶反應(yīng)促進(jìn)劑。
9.一種試劑，其特征是，所述試劑含有下述i)～iii)i)如權(quán)利要求1～7任意一項(xiàng)所述的蛋白酶反應(yīng)促進(jìn)劑；ii)蛋白酶；和iii)作用于糖化氨基酸和/或糖化肽的酶。
10.如權(quán)利要求8或9所述的試劑，其特征是，所述試劑還含有蛋白酶穩(wěn)定劑、和/或作用于糖化氨基酸和/或糖化肽的酶的穩(wěn)定劑。
11.如權(quán)利要求8～10任意一項(xiàng)所述的試劑，其特征是，所述試劑為液態(tài)，在冷藏下能保持6個(gè)月以上的穩(wěn)定狀態(tài)。
12.如權(quán)利要求9～11任意一項(xiàng)所述的試劑，其中，所述蛋白酶從糖化血紅蛋白或其片段的糖化后的β鏈N末端切掉糖化氨基酸和/或糖化肽，而不是實(shí)質(zhì)性地從糖化血紅蛋白或其片段的糖化后的α鏈N末端切掉糖化氨基酸和/或糖化肽。
13.如權(quán)利要求9～12任意一項(xiàng)所述的試劑，其特征是，所述作用于糖化氨基酸和/或糖化肽的酶對(duì)糖化纈氨酰-組氨酸的作用高于對(duì)糖化纈氨酰-亮氨酸的作用。
14.如權(quán)利要求8～13任意一項(xiàng)所述的試劑，其特征是，所述試劑還含有無(wú)色型色素和色素穩(wěn)定劑。
15.如權(quán)利要求14所述的試劑，其中，所述色素穩(wěn)定劑為環(huán)糊精。
16.如權(quán)利要求8～15任意一項(xiàng)所述的試劑，其特征是，所述試劑還含有第一試劑和第二試劑；所述第一試劑含有蛋白酶；和作用于糖化氨基酸和/或糖化肽、能夠?qū)⒉挥裳t蛋白的β鏈N末端產(chǎn)生的糖化氨基酸和/或糖化肽消除的酶；所述第二試劑含有作用于糖化氨基酸和/或糖化肽、能夠?qū)⒂裳t蛋白的β鏈N末端產(chǎn)生的糖化氨基酸和/或糖化肽檢出的酶。
17.如權(quán)利要求8～15任意一項(xiàng)所述的試劑，其特征是，所述試劑含有第一試劑和第二試劑所述第一試劑含有作用于糖化氨基酸和/或糖化肽的酶；所述第二試劑含有蛋白酶。
18.如權(quán)利要求16或17所述的試劑，其特征是，所述第一試劑還含有過(guò)氧化氫酶和/或過(guò)氧化酶。
19.如權(quán)利要求8～18任意一項(xiàng)所述的試劑，其特征是，在由第一試劑和第二試劑構(gòu)成的試劑盒中，在同一試劑中含有蛋白酶和過(guò)氧化氫酶，且在不含有過(guò)氧化氫酶的試劑中含有疊氮化鈉。
20.一種促進(jìn)蛋白酶反應(yīng)的方法，所述方法利用權(quán)利要求1～7任意一項(xiàng)所述的蛋白酶反應(yīng)促進(jìn)劑來(lái)促進(jìn)蛋白酶反應(yīng)。
21.如權(quán)利要求20所述的促進(jìn)蛋白酶反應(yīng)的方法，其特征是，利用權(quán)利要求7所述的蛋白酶反應(yīng)促進(jìn)劑，將蛋白酶反應(yīng)速率加快1.5倍以上。
22.一種測(cè)定血紅蛋白、血紅蛋白Alc或糖化白蛋白的方法，所述方法利用權(quán)利要求8～19任意一項(xiàng)所述的試劑來(lái)進(jìn)行測(cè)定。
23.如權(quán)利要求22所述的方法，其特征是，在同一反應(yīng)槽中連續(xù)進(jìn)行血紅蛋白的測(cè)定和血紅蛋白Alc的測(cè)定。
24.如權(quán)利要求23所述的方法，其特征是，在同一波長(zhǎng)下進(jìn)行血紅蛋白的測(cè)定和血紅蛋白Alc的測(cè)定。
25.如權(quán)利要求24所述的方法，其特征是，設(shè)定副波長(zhǎng)以測(cè)定出一個(gè)值，然后從測(cè)定值中減去該值。
26.如權(quán)利要求22～25任意一項(xiàng)所述的方法，其特征是，特異性地測(cè)定血紅蛋白Alc的β鏈N末端的糖化氨基酸和/或糖化肽。
27.如權(quán)利要求22～26任意一項(xiàng)所述的方法，其特征是，以溶血液、血紅蛋白溶液或血紅蛋白的β鏈N末端的糖化肽為校正物質(zhì)來(lái)測(cè)定血紅蛋白Alc，然后由校準(zhǔn)曲線計(jì)算出定量值。
28.如權(quán)利要求22所述的方法，其特征是，在同一反應(yīng)槽中連續(xù)進(jìn)行白蛋白的測(cè)定和糖化白蛋白的測(cè)定。
29.如權(quán)利要求28所述的方法，其特征是，在同一波長(zhǎng)下進(jìn)行白蛋白的測(cè)定和糖化白蛋白的測(cè)定。
30.一種色素穩(wěn)定劑，該色素用于酶反應(yīng)的檢出，所述色素穩(wěn)定劑的特征在于含有環(huán)糊精。
31.如權(quán)利要求30所述的穩(wěn)定劑，其特征是，所述環(huán)糊精為β-環(huán)糊精類。
32.如權(quán)利要求31所述的穩(wěn)定劑，其特征是，所述β-環(huán)糊精類為甲基-β-環(huán)糊精或2-羥丙基-β-環(huán)糊精。
33.如權(quán)利要求30～32任意一項(xiàng)所述的穩(wěn)定劑，其特征是，在酶反應(yīng)的檢出中使用的色素是通過(guò)過(guò)氧化酶的作用而顯色的色素。
34.如權(quán)利要求33所述的穩(wěn)定劑，其特征是，通過(guò)過(guò)氧化酶的作用而顯色的色素是無(wú)色型色素。
35.一種試劑，所述試劑含有權(quán)利要求30～34任意一項(xiàng)所述的穩(wěn)定劑和在酶反應(yīng)的檢出中使用的色素。
36.如權(quán)利要求35所述的試劑，其特征是，所述試劑還含有過(guò)氧化氫酶。
37.如權(quán)利要求35或36所述的試劑，其特征是，所述試劑還含有測(cè)定時(shí)濃度為80mM以下的緩沖劑。
38.如權(quán)利要求35～37任意一項(xiàng)所述的試劑，其特征是，所述試劑還含有蛋白酶。
39.如權(quán)利要求38所述的試劑，其特征是，所述試劑還含有蛋白酶反應(yīng)促進(jìn)劑。
40.如權(quán)利要求35～39任意一項(xiàng)所述的試劑，其特征是，在測(cè)定時(shí)，環(huán)糊精的濃度為0.5重量％以上。
41.如權(quán)利要求35～40任意一項(xiàng)所述的試劑，其特征是，所述試劑為液態(tài)，并且在冷藏下能保持6個(gè)月以上的穩(wěn)定狀態(tài)。
42.一種色素的穩(wěn)定化方法，所述色素用于酶反應(yīng)的檢出，所述穩(wěn)定化方法的特征是，利用權(quán)利要求30～34任意一項(xiàng)所述的穩(wěn)定劑。
43.一種糖化蛋白質(zhì)或糖化蛋白質(zhì)比率的測(cè)定方法，其特征是，所述方法利用權(quán)利要求35～41任意一項(xiàng)所述的試劑。
44.如權(quán)利要求43所述的方法，其特征是，所述糖化蛋白質(zhì)是糖化白蛋白、糖化血紅蛋白、或血紅蛋白Alc，所述糖化蛋白質(zhì)比率是糖化白蛋白值、糖化血紅蛋白值、或血紅蛋白Alc值。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種含有蛋白酶反應(yīng)促進(jìn)劑和/或色素穩(wěn)定劑的試劑。本發(fā)明的目的在于提供一種蛋白酶反應(yīng)促進(jìn)劑、一種用于酶反應(yīng)檢出的色素穩(wěn)定劑和酶反應(yīng)檢出的方法，所述蛋白酶反應(yīng)促進(jìn)劑比現(xiàn)有已知的蛋白酶反應(yīng)促進(jìn)劑更有用；本發(fā)明的目的還在于提供一種利用上述試劑和方法來(lái)測(cè)定糖化蛋白質(zhì)和糖化蛋白質(zhì)比率的試劑及測(cè)定方法。本發(fā)明提供一種蛋白酶反應(yīng)促進(jìn)劑及利用該蛋白酶反應(yīng)促進(jìn)劑來(lái)促進(jìn)蛋白酶反應(yīng)的方法，所述蛋白酶反應(yīng)促進(jìn)劑包含下述物質(zhì)中的至少一種含有乙酸基的化合物或其鹽、N－?；；撬峄蚱潲}、或者聚氧乙烯烷基醚硫酸或其鹽。而且，本發(fā)明提供一種添加含有環(huán)糊精的穩(wěn)定劑以使用于酶反應(yīng)檢出的色素穩(wěn)定化。另外，本發(fā)明提供一種通過(guò)使環(huán)糊精和所述色素共存來(lái)使色素穩(wěn)定化的方法。此外，本發(fā)明還提供一種測(cè)定糖化蛋白質(zhì)和糖化蛋白質(zhì)比率的試劑及測(cè)定方法，所述試劑和測(cè)定方法使用含有上述酶反應(yīng)促進(jìn)劑和/或環(huán)糊精的試劑。
文檔編號(hào)C12Q1/37GK101023168SQ200580030020
公開(kāi)日2007年8月22日 申請(qǐng)日期2005年8月4日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月5日
發(fā)明者高妻卓司, 永井陽(yáng)子, 今村茂行 申請(qǐng)人:旭化成制藥株式會(huì)社