專利名稱：接頭分子的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及包含至少兩個能夠結合細胞因子受體的結構域的多肽，其中所述結構域由肽接頭(linker)分子連接。
一組被稱為細胞因子的生長因子參與多種不同的細胞功能。這些功能包括，舉例但非限制，調整免疫系統(tǒng)、調節(jié)能量新陳代謝和控制生長和發(fā)育。細胞因子通過在靶細胞的細胞表面表達的受體介導其作用。細胞因子受體可分為三個單獨的亞組。I型受體(生長激素(GH)家族)由它們的胞外結構域的氨基末端部分的四個保守的半胱氨酸殘基和C-末端部分存在的保守的Trp-Ser-Xaa-Trp-Ser基序所表征。該重復的Cys基序也存在于II型(干擾素家族)和III型(腫瘤壞死因子家族)中。
已知許多細胞因子結構域通過特異位點與它們的關連受體互相作用。一些細胞因子受體具有高親和性結構域結合位點和低親和性結合位點。
例如，已知GH的單獨一個分子與兩個受體分子(GHR)關聯(lián)(Cunningham et al.，1991；de Vos et al.，1992；Sundstrom et al.，1996；Clackson et al.，1998)。其通過GH上兩個獨特的受體-結合位點和兩個受體的胞外結構域的共同的結合囊發(fā)生。GH分子的位點1具有比位點2更高的親和性，并且受體二聚體化被認為是順序發(fā)生的一個受體結合到GH的位點1，隨后第二個受體被召集到位點2。GHR的胞外結構域存在兩個相連結構域，每個約100個氨基酸。激素結合形成三聚復合體GHR-GH-GHR時，這兩個結構域的構象發(fā)生改變。GHR-GH-GHR復合體內化，隨后進行再循環(huán)步驟，通過該步驟受體分子再生并在細胞內繼續(xù)使用。
細胞因子和其它結構域結合經(jīng)常形成受體-結構域復合體。參與復合體形成的受體可能是同源或異源的。例如，紅細胞生成素和GH，形成受體-激素-受體的三聚體復合體。白介素-4形成受體-激素-不同受體的三聚體復合體。腫瘤壞死因子通過形成細胞跨膜腫瘤壞死因子受體(TNF-1/p55或TNF-2/p75)的同型三聚體傳導信號。其它細胞因子，如瘦素(leptin)和GCSF，形成受體-激素-激素-受體的四聚體復合體，并且其它(如白介素6)可能形成由兩個可溶受體分子、兩個跨膜受體分子和兩個細胞因子分子組成的六聚體復合體。每種情況中都有將細胞因子定位于受體復合體的主要高親和性結合位點，和在改變構象或召集其它分子以起始信號傳導中起次要作用的其它位點。
細胞因子的TNF超家族活化用于細胞生存、死亡和分化的信號傳導途徑，該細胞的生存、死亡和分化調控淋巴組織、乳房組織、神經(jīng)組織和外胚層組織的發(fā)育、組織和自身穩(wěn)定。已證明了TNF在宿主防御中的作用，這些作用例如包括脾細胞分化、完全IgG反應和類型轉換、巨噬細胞活化、一氧化氮和活性氧自由基的生成。但是，過量表達時，TNF還與發(fā)病有關。在以下病理中找到該相關性的證據(jù)細菌膿毒病、移植物抗宿主病、腦型瘧、類風濕關節(jié)炎、斑禿/全禿(alopecia areata/generialis)、哮喘、癌癥、Crohn病、糖尿病、肥胖癥、銀屑病和銀屑病關節(jié)炎、結節(jié)病、硬皮病和中毒性休克綜合征。這些病理被公認為是抗TNF劑應用建立的和/或潛在的病理。
細胞因子的過量表達是造成多種人類疾病的原因，例如肢端肥大癥、巨人癥、GH缺乏癥、Turners綜合征、腎衰竭、骨質疏松癥、骨關節(jié)炎、糖尿病、癌癥、肥胖癥、胰島素抵抗、高脂血癥、高血壓、貧血、自身免疫和感染性疾病、包括類風濕關節(jié)炎的炎性疾病。
抑制諸如GH、促乳素或TNF的細胞因子的作用的方法是進行拮抗劑的給藥。
GH拮抗劑的一個例子是Pegvisomant，其為包裹于聚乙二醇(PEG)中的經(jīng)修飾的GH分子。Pegvisomant有許多有益效果，包括，例如由于增加的有效分子量降低了腎小球濾過速度，因而減少產(chǎn)生期望效果所需要的劑量(參見Abuchowski et al J Biol Chem.，252，3578-3581，(1977))。但是，聚乙二醇化的結果是減小該經(jīng)修飾的GH分子對GHR的親和性。
WO03/057729(在此整體并入以作參考)公開了促乳素拮抗劑的一個例子，更具體地是編碼所述促乳素拮抗劑的核苷酸和蛋白質序列。該促乳素拮抗劑包括對人促乳素氨基酸序列的修飾，該修飾用精氨酸殘基代替位點129的甘氨酸殘基。該經(jīng)修飾的促乳素作為促乳素受體活化的抑制劑。
已經(jīng)發(fā)展出許多治療策略以抑制TNF，其基于能夠i)抑制TNF合成(例如使用抑制性細胞因子IL-10、沙利度胺(thalidomide)、皮質類固醇、環(huán)孢菌素A、反義寡核苷酸)；ii)抑制TNF加工處理(例如金屬蛋白酶(TACE)抑制物)；iii)中和TNF(例如使用可溶性TNF受體或TNF抗體)。
我們描述了包含多個細胞因子受體的配體結合結構域的多肽及其在調節(jié)受體介導的細胞因子活化中的用途。
依照本發(fā)明的一方面，提供了包含至少兩個能夠結合細胞因子受體的細胞因子結合結構域的多肽，其中所述結構域通過包含非柔性螺旋區(qū)的肽接頭(linker)分子連接。
本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，所述多肽作為所述細胞因子受體的拮抗劑。可選擇地，所述多肽作為激動劑。
優(yōu)選地，所述多肽包含串聯(lián)排列的結構域。本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，所述多肽包含2、3、4、5、6、7、8、9或10個串聯(lián)排列的結構域。
本發(fā)明的其它優(yōu)選實施方案中，所述多肽包含多于10個串聯(lián)排列的結構域。
優(yōu)選地，所述非柔性螺旋區(qū)包含至少一個拷貝的基序A(EAAAK)xA，或其功能性變體。優(yōu)選地所述肽接頭分子包含兩個拷貝的基序EAAAK，且該肽接頭分子的長度通過遞增的加入至少一個氨基酸是可延長的。
“功能性變體”是通過一個或多個替代、添加、缺失造成氨基酸序列可能不同的接頭分子，但是其保持基本的螺旋的或非螺旋的構象。優(yōu)選的變體是那些通過保守氨基酸替代與參考氨基酸序列相區(qū)別的變體。該替代中特定氨基酸被相似特征的另一氨基酸替代。以下非限制性氨基酸名單被認為是保守取代(相似)a)丙氨酸、絲氨酸和蘇氨酸；b)谷氨酸和天冬氨酸；c)天冬酰胺和谷氨酰胺；d)精氨酸、賴氨酸和組氨酸；e)異亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸和纈氨酸；及f)苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。最優(yōu)選的是基本保持柔性或非柔性的螺旋接頭區(qū)域的氨基酸替代。
本發(fā)明的其它優(yōu)選實施方案中，所述接頭分子包含至少一個柔性非螺旋區(qū)。
如上所述，提供非柔性螺旋區(qū)保持所述結構域的空間分離時，提供柔性非螺旋區(qū)使結構域能夠調整方向進入細胞因子受體的結合位點。
本發(fā)明的一個實施方案中，柔性非螺旋區(qū)位于或接近所述肽接頭分子的氨基末端，因此允許位于該肽接頭分子的氨基末端的結合結構域依據(jù)其關聯(lián)受體調整方向。
本發(fā)明的其它實施方案中，柔性非螺旋區(qū)位于或接近肽接頭分子的羧基末端，因此允許位于該肽接頭分子的羧基末端的結合結構域依據(jù)其關聯(lián)受體調整方向。
本發(fā)明的其它實施方案中，柔性非螺旋區(qū)位于或接近肽接頭分子的氨基和羧基末端，因此允許分別位于該肽接頭分子的氨基末端和羧基末端的結合結構域依據(jù)其關聯(lián)受體調整方向。
優(yōu)選地，柔性非螺旋區(qū)與至少一個結合結構域相鄰。更優(yōu)選地，該柔性非螺旋區(qū)在結合結構域和非柔性螺旋區(qū)之間形成連接。
更優(yōu)選地，所述非柔性螺旋區(qū)包含至少一個拷貝的基序A(EAAAK)xA。所述非柔性螺旋區(qū)的長度通過增加該A(EAAAK)xA基序的重復數(shù)目是可延長的。
本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，A(EAAAK)xA基序中的x少于10個拷貝。更優(yōu)選地，x少于5個拷貝。甚至更優(yōu)選地，x選自1、2、3、4或5個拷貝。
本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，剛性α螺旋接頭和結合結構域之間沒有柔性連接，但是所述結合結構域通過所述非柔性α螺旋接頭直接連接。
本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，所述結合結構域通過由非柔性α螺旋組成的接頭分子連接。
本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，所述接頭分子連接一結合結構域的羧基末端和另一結合結構域的氨基末端。
本發(fā)明的這一實施方案中，所述螺旋接頭在所述第一細胞因子分子的C-末端螺旋和所述第二細胞因子分子的N-末端螺旋之間是連續(xù)的，因此其以基本上固定的方向剛性地連接所述兩個細胞因子結合結構域。例如，其可能涉及刪除第一細胞因子結構域的N-末端和螺旋后C-末端的短區(qū)域，以及第二細胞因子的螺旋前N-末端的短區(qū)域(即第一細胞因子的第182-190位殘基，和第二細胞因子的第1-5位殘基，因為這些是第一細胞因子中C-末端螺旋(如

圖1B中的螺旋4)后和第二細胞因子的N末端(如圖1B中的螺旋1’)前的隨機卷曲構象的短區(qū)域)。
不同構建體中，通過以下方式可以改變該固定的方向(翻譯的和旋轉的)插入1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個另外的氨基酸，或刪除1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個氨基酸，其產(chǎn)生具有新特征的分子，例如拮抗特征。加入額外氨基酸將產(chǎn)生約1.5的所述兩個結構域的附加的相對翻譯和所述兩個結構域的繞螺旋軸的約+100°的相對旋轉。通常，接頭可以從兩個EAAAK單位開始并且通過加入A、AA、AAA、AAAA、EAAAA和EAAAK序列延長。
本發(fā)明的其它優(yōu)選實施方案中，所述多肽的結合結構域彼此相同或相似。
本發(fā)明的其它優(yōu)選實施方案中，所述多肽包含細胞因子的結合結構域，所述細胞因子選自生長激素；瘦素；紅細胞生成素；促乳素；白介素(IL)IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12的p35亞基、IL-13、IL-15；粒細胞集落刺激因子(G-CSF)；粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)；睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)；心臟營養(yǎng)素-1(CT-1)；白細胞抑制因子(LIF)；制瘤素M(OSM)；干擾素、IFNα和IFNγ，腫瘤壞死因子(TNF)α和TNFβ，及RANK配體。
本發(fā)明的其它優(yōu)選實施方案中，至少一個所述結構域包含生長激素結合結構域。
本發(fā)明的其它優(yōu)選實施方案中，所述多肽包含至少兩個生長激素或生長激素變體的結合結構域。
美國專利5,849,535公開了經(jīng)修飾的GH變體，在此引為參考。對GH的該修飾發(fā)生在位點1和位點2的結合位點。對位點1的修飾產(chǎn)生對GHR的親和力高于野生型GH的GH分子，這種修飾的GH分子具有激動劑活性。該文獻還公開了對位點2的修飾，該修飾產(chǎn)生GH拮抗劑。美國專利5,854,026、6,004,931、6,022,711、6,057,292和6,136,563公開了修飾GH而改變GH位點1的親和力的其它例子，其中的每一篇在此均引為參考。對位點2的修飾也有公開，特別是當將GH的氨基酸殘基G120修飾為精氨酸，賴氨酸，色氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸或谷氨酸中的任何一種時，會產(chǎn)生一種具有拮抗特性的GH分子。
在我們同樣待決的申請WO03/070765中(在此引為參考)，我們描述了關于GH受體活化的具有拮抗活性的GH變體的融合。該GH變體通過柔性接頭與該生長激素受體的胞外結構域融合。該嵌合多肽顯示延遲的清除和拮抗活性。提供具有非柔性或部分柔性接頭的類似嵌合多肽也在本發(fā)明公開的范圍內。
本發(fā)明的可選擇的優(yōu)選實施方案中，所述多肽包含至少兩個促乳素或促乳素變體的結合結構域。
本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，所述促乳素變體多肽包含氨基酸序列，其中所述氨基酸序列在人促乳素的位點第129位被修飾。
本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，所述修飾是氨基酸替代。優(yōu)選地，所述替代是用精氨酸氨基酸殘基代替甘氨酸氨基酸殘基。優(yōu)選地，所述修飾還包含至少9、10、11、12、13或14個氨基末端的氨基酸殘基的刪除。
本發(fā)明的可選擇的實施方案中，多肽的結合結構域彼此相似。
本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，所述多肽包含第一結合結構域和第二結合結構域，所述第一結合結構域為生長激素結合結構域，所述第二結合結構域為促乳素結合結構域。
優(yōu)選地，所述多肽由生長激素結合結構域和促乳素結合結構域組成。
本發(fā)明的其它優(yōu)選實施方案中，所述多肽包含第一結合結構域和第二結合結構域，所述第一結合結構域為經(jīng)修飾的生長激素結合結構域，所述第二結合結構域為經(jīng)修飾的促乳素結合結構域。
優(yōu)選地，所述多肽由經(jīng)修飾的生長激素結合結構域和經(jīng)修飾的促乳素結合結構域組成。
本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，所述經(jīng)修飾的生長激素結合結構域包含氨基酸位點第120位甘氨酸的氨基酸替代。優(yōu)選地，所述修飾是用選自精氨酸、賴氨酸、色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸或谷氨酸的氨基酸代替第120位甘氨酸。
本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，所述修飾是用精氨酸氨基酸殘基代替第120位甘氨酸。
本發(fā)明的其它優(yōu)選實施方案中，所述經(jīng)修飾的促乳素結合結構域包含第129位甘氨酸的修飾。優(yōu)選地，所述修飾是用精氨酸氨基酸殘基代替第129位甘氨酸。優(yōu)選地，所述修飾還包含至少9、10、11、12、13或14個氨基末端的氨基酸殘基的刪除。
本發(fā)明的其它優(yōu)選實施方案中，所述多肽還包含細胞因子受體的配體結合結構域。優(yōu)選地，所述受體是生長激素受體。本發(fā)明的其它優(yōu)選實施方案中，所述受體是促乳素受體。
本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，通過包含或由非柔性螺旋區(qū)組成的接頭，所述配體結合結構域可與所述細胞因子結合結構域結合。
本發(fā)明的另一方面，提供編碼本發(fā)明的多肽的核酸分子。
本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，所述核酸是適于所述多肽表達的載體。
通常，所述適于包括提供介導細胞/組織特異表達的轉錄控制序列(啟動子序列)。這些啟動子序列可以是細胞/組織特異的、可誘導的或組成型的。
啟動子是本領域公知的術語，但為了清楚的目的，描述為具有下列特征，這些特征僅僅是舉例，并不產(chǎn)生任何限制。增強子元件是順式作用核酸序列，通常位于基因轉錄起始位點的5′端(增強子也可位于基因序列的3′端或甚至位于內含子序列中，因而其位置獨立)。增強子的功能是增強與其連接的基因的轉錄速率。增強子的活性受與增強子元件特異結合的反式作用轉錄因子(多肽)的影響。轉錄因子的結合/活性(參見Eukaryotic Transcription Factors(真核轉錄因子)，by David SLatchman，Academic Press Ltd，San Diego)受許多環(huán)境因素的影響，這些因素的例子包括，但不限于中間代謝物(如葡萄糖)和/或環(huán)境效應因素(如熱)。
啟動子元件還含有所謂的TATA框和具有轉錄起始位點選擇功能的RNA聚合酶起始選擇(RIS)序列。這些序列還與多肽結合，該多肽具有有利于RNA聚合酶轉錄起始選擇的功能。
所述的適于還包括提供選擇性標記和有助于在真核細胞或原核細胞中保持所述載體的自主復制序列。自主保持的載體被稱為游離型載體。
所述的有助于編碼基因載體表達的適于包括提供轉錄終止子/聚腺苷酸化序列，還包括提供內部核糖體進入位點(IRES)，該IRES具有使排列在雙順反子或多順反子表達盒中的基因編碼載體最大化表達的功能。
這些適于是本領域公知的，有大量的公開文獻涉及到通用的表達載體的構建和重組DNA技術。參見Sambrook等(1989)MolecularCloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbour Laboratory，ColdSpring Harbour，NY；Marston，F(xiàn)(1987)DNA Cloning TechniquesAPractical Approach，第3卷，IRL Press，Oxford UK；DNA CloningF MAusubel等，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，Inc.(1994)。
本發(fā)明的載體可以是基因治療載體，這對于本領域技術人員是顯而易見的。基因治療載體通常是基于病毒的。許多病毒常被用作遞送外源基因的載體。常用的載體包括重組修飾的有包膜的或無包膜的DNA和RNA病毒，優(yōu)選地選自桿狀病毒科、細小病毒科、picornoviridiae、皰疹病毒、痘病毒科、腺病毒科或picornnaviridiae。也可使用嵌合載體，其使用每個母體載體特征的有利元素(例如參見，F(xiàn)eng，et al.(1997)NatureBiotechnology 15866-870)。這種病毒載體可以是野生型的或可經(jīng)重組DNA技術修飾成為復制缺陷的、條件復制的或增殖型的。
優(yōu)選的載體源自腺病毒、腺相關病毒和逆轉錄病毒的基因組。本發(fā)明的大多數(shù)優(yōu)選的實踐中，所述載體源自人腺病毒基因組。特別優(yōu)選的載體源自人血清2型或血清5型腺病毒。通過E1a和/或E1b編碼區(qū)中的修飾或刪除可以減弱這種載體的復制能力(至可被認為是“復制缺陷”的點)。為完成特定表達特征或允許重復給藥或降低免疫反應而對病毒基因組進行的其它修飾是優(yōu)選的。
或者，該病毒載體可以是條件復制的或增殖型的。條件復制病毒載體用于完成在特定細胞類型中的選擇性表達，同時避免不利的廣譜感染。Pennisi，E.(1996)Science 274342-343和Russell，and SJ.(1994)Eur.J.ofCancer 30A(8)1165-1171中描述了條件復制載體的例子。條件復制載體的其它例子包括那些載體，其中病毒復制必需的基因處于只在特定細胞類型或細胞狀態(tài)下活化的啟動子的控制之下，使得缺乏該基因表達時，病毒不復制。于1997年12月16日授權的Henderson et al.的第5,698,443號美國專利和于1999年2月16日授權的Henderson et al.的第5,871,726號美國專利中描述了該載體的例子，此處并入其全部公開以供參考。
此外，可修飾病毒基因組以包括可誘導的啟動子，其只在某些條件下完成復制或表達?？烧T導的啟動子的例子可從科學文獻中獲知(例如參見Yoshida and Hamada(1997)Biochem.Biophys.Res.Comm.230426-430；Iida，et al.(1996)J.Viroi.70(9)6054-6059；Hwang，et al.(1997)J.Virol71(9)7128-7131；Lee，et al.(1997)MoI.Cell.Biol.17(9)5097-5105；和Dreher，et al.(1997)J.Biol.Chem 272(46)；29364-29371.)。
載體還可以是非病毒的，并且可以從多種本領域技術人員容易獲得的商業(yè)來源獲得。例如，該載體可以是游離的或整合的質粒。
本發(fā)明的其它方面，提供了經(jīng)本發(fā)明的核酸和載體轉化或轉染的細胞。
本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，所述細胞是真核細胞。
優(yōu)選地，所述真核細胞選自真菌細胞，例如Saccharomyces cerevisiae，Pichia spp，粘菌(例如Dictyostelium spp)、昆蟲細胞(例如Spodopterafrugiperda)、植物細胞或哺乳動物細胞(例如CHO細胞)。
本發(fā)明的其它優(yōu)選實施方案中，所述細胞是原核細胞。
本發(fā)明的其它方面，提供了制備本發(fā)明的多肽的方法，所述方法包含步驟i)在有利于生產(chǎn)本發(fā)明的多肽的條件下生長本發(fā)明的細胞；及ii)從所述細胞或其生長環(huán)境中分離所述多肽。
本發(fā)明的優(yōu)選方法中，提供具有親和標簽的所述多肽。
親和標簽為本領域已知，包括麥芽糖結合蛋白、谷胱甘肽S轉移酶、鈣調蛋白結合蛋白和將聚組氨酸軌跡工程化到蛋白質中，該蛋白質隨后在含有鎳的基質上被親和純化。許多情況中，可商購的載體和/或試劑盒可用于融合所關注蛋白和合適的親和標簽，該融合蛋白隨后被轉染到宿主細胞中用于表達及隨后的親和基質上的提取和純化。
在我們同樣待決的申請WO03/070765中(在此引為參考)，我們描述了用于多肽的新的親和標簽，其利用包括信號序列的結構域，該信號序列指導向該多肽加入糖基磷脂酰肌醇。包括糖基磷脂酰肌醇標簽的多肽優(yōu)先插入脂質膜中，并且可以對細胞因子受體活化有拮抗效果。因此，本文公開的發(fā)明包括有糖基磷脂酰肌醇分子附著的多肽。
依照本發(fā)明另一方面，提供了包含與第二細胞因子結合結構域連接的第一細胞因子結合結構域的多肽，其中所述多肽還包含細胞因子受體的胞外結構域。
本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，所述第一和第二結合結構域由柔性接頭分子連接。
本發(fā)明的可選擇的優(yōu)選實施方案中，所述第一和第二結合結構域由包含非柔性螺旋區(qū)的肽接頭分子連接。
本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，所述第一和第二結合結構域由包含非柔性螺旋區(qū)和柔性非螺旋區(qū)的肽接頭分子連接。
包含非柔性螺旋區(qū)及非柔性螺旋區(qū)和柔性非螺旋區(qū)的組合的肽接頭分子之前已描述，并且其適用于本發(fā)明的這一實施方案，就如之前說明的細胞因子和細胞因子受體一樣。
本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，所述細胞因子受體的胞外結構域通過接頭分子與該第一或第二細胞因子結合結構域連接。優(yōu)選地，所述接頭分子包含非柔性螺旋區(qū)。
本發(fā)明的可選擇的優(yōu)選實施方案中，所述接頭分子是柔性的。
優(yōu)選地，所述接頭分子包含非柔性螺旋區(qū)和柔性非螺旋區(qū)。
本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，所述細胞因子結合結構域是生長激素或生長激素的變體，并且所述胞外結構域是生長激素的胞外結構域。優(yōu)選地，所述結構域是人的。
本發(fā)明的多肽可能顯示雙功能性。第一，所述包含細胞因子或其部分(其優(yōu)選地通過包含非柔性螺旋區(qū)的接頭分子連接)的第一和第二結構域能夠結合細胞表面細胞因子受體，并且空間位阻這些受體結合成為受體復合物，因此阻止下游細胞信號傳導。第二，提供包含細胞因子或其部分的第三結構域能夠起到可溶性受體的作用，因此在其結合細胞表面受體之前連接任何細胞因子。該第三結構域優(yōu)選地通過包含非柔性螺旋區(qū)的肽接頭分子與第一或第二結構域連接。本發(fā)明的可選擇的實施方案中，所述第三結構域優(yōu)選地通過包含柔性非螺旋區(qū)的肽接頭分子與第一或第二結構域連接。
本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，所述肽接頭分子還包含對蛋白酶剪切敏感的氨基酸序列。
本發(fā)明的另一方面，提供本發(fā)明的多肽或核酸分子作為藥物的用途。
優(yōu)選地提供包含本發(fā)明的多肽或核酸分子的藥物組合物。優(yōu)選地，所述藥物組合物包含載體、賦形劑和/或稀釋劑。
給藥時，本發(fā)明的治療組合物以藥物可接受的制劑的形式給藥。術語“藥物上可接受”是指不妨礙活性成分的生物學活性效果的非毒性物質。所述制劑通?？梢院宣}、緩沖劑、相容載體、防腐劑和任選的其它治療劑。
用在藥物中時，所述鹽應該是藥物可接受的，但是非藥物可接受的鹽可方便地用于制備其藥物可接受的鹽，并且不被排除在本發(fā)明的范圍之外。這種藥理學的和藥物可接受的鹽包括但不限于那些從以下酸制備的鹽鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、馬來酸、乙酸、水楊酸、檸檬酸、蟻酸、丙二酸、琥珀酸等等。而且，藥物可接受的鹽可以以諸如鈉鹽、鉀鹽或鈣鹽的堿金屬鹽或堿土金屬鹽的形式制備。
所述藥物組合物可含有適合的緩沖劑，包括鹽形式的乙酸、鹽形式的檸檬酸、鹽形式的硼酸和鹽形式的磷酸。
如果需要，所述組合物可與藥物可接受的載體組合。如本發(fā)明所用，術語“藥物可接受的載體”是指一種或多種適于向人給藥的相容性固體或液體填充劑、稀釋劑或包被物質。術語“載體”是指天然或合成的有機或無機成分，活性成分與其結合可使應用方便。所述藥物組合物的成分還能夠以特定方式與本發(fā)明的分子共混合，以及與其自身混合，該特定方式使得不產(chǎn)生可能損害期望藥效的相互作用。
所述的藥物組合物可以方便地制成單位劑量形式，并用制藥領域公知的任何方法來制備。所有方法包括將活性劑與組成一個或多個附加成分的載體組合的步驟。通常，按如下所述制備組合物均一地和緊密地將活性化合物與液態(tài)載體、精細分離的固體載體或兩者組合，以及如果需要的話，隨后定形產(chǎn)品。
所述的藥物組合物任選還可以含有合適的防腐劑，如苯扎氯銨、氯丁醇、羥基苯甲酸酯類和噻汞撒。
本發(fā)明的藥物組合物可以采用任何常規(guī)的方式給藥，包括注射或在一段時間內逐漸輸注的方式。所述給藥的例子包括口服、靜脈內、腹膜內、肌肉內、腔內、皮下或透皮給藥。
適于口服給藥的組合物可以以不連續(xù)單位提供，例如膠囊、片劑、錠劑，每單位還有預定劑量的活性化合物。其它組合物包括水溶液或非水溶液的懸浮液例如糖漿、酏劑或乳劑。
本發(fā)明的組合物以有效量給藥?！坝行Я俊笔墙M合物的量，其單獨或與其它劑一起，產(chǎn)生期望的反應。治療如癌癥的具體疾病的情況下，所期望反應是抑制該疾病的進程。這可能涉及只暫時減慢疾病的進程，盡管更優(yōu)選地，其涉及永久阻止疾病的進程。這可以通過通常方法監(jiān)測。
當然，這種劑量取決于具體被治療的疾病狀態(tài)、該狀態(tài)的嚴重程度、包括年齡、物理條件、身高和體重的患者個體的參數(shù)、治療持續(xù)時間、同時進行的治療的性質(如果有的話)、特定給藥途徑和健康從業(yè)者知識和專長的類似因素。這些因素對本領域普通技術人員是已知的，并且只需常規(guī)實驗就可確定。使用最大劑量的單獨成分或其組合是通常優(yōu)選的，該最大劑量是根據(jù)可靠醫(yī)學判斷的最高安全劑量。但是，本領域普通技術人員應了解，患者可能出于醫(yī)學原因、生理原因或幾乎任何其它原因堅持較低劑量或耐受劑量。
本發(fā)明另一方面提供了本發(fā)明的多肽或核酸分子制備用于治療疾病的藥物的用途，所述疾病選自肢端肥大癥、巨人癥、GH缺乏癥、Turners綜合征、腎衰竭、骨質疏松癥、骨關節(jié)炎、糖尿病、癌癥(例如，前列腺癌、宮頸癌、乳腺癌、黑素瘤、肝細胞瘤、腎癌、神經(jīng)膠質瘤，膀胱癌、肺癌、神經(jīng)癌、卵巢癌、睪丸癌、胰腺癌、胃腸癌、淋巴瘤)、肥胖癥、胰島素抵抗、高脂血癥、高血壓、貧血、自身免疫和感染性疾病、包括類風濕關節(jié)炎的炎性疾病。
本發(fā)明還提供治療人或動物個體的方法，包含向該個體給藥有效量的多肽、核酸分子、藥物組合物或藥物。
貫穿本說明書的描述和權利要求，詞語“包含(comprise)”和“含有(contain)”和這些詞的變體，如“包含(comprising)”和“包含(comprises)”，指“包括但不限于”，并且不意謂(并且不)排除其它部分、添加物、成分、完整物或步驟。
貫穿本說明書的描述和權利要求，除非上下文另有要求，單數(shù)包括復數(shù)。具體地，使用不定冠詞時，描述應被理解為預期復數(shù)和單數(shù)，除非上下文另有要求。
本發(fā)明的特定方面、實施方案或實施例描述有關的特征、完整物、特點、化合物、化學部分或組應理解為可用于本文描述其它任何的方面、實施方案或實施例，除非與其不相容。
通過具體例子并參考下述附圖描述本發(fā)明的具體實施方案圖1Aα螺旋(打陰影的矩形)連接細胞因子結構域(橢圓形)。柔性接頭(彎曲的箭頭)分別連接第一細胞因子結構域到該螺旋，及該螺旋到第二細胞因子結構域；圖1Bα螺旋連接細胞因子結構域。柔性接頭分別連接第一細胞因子結構域到該螺旋，及該螺旋到第二細胞因子結構域。
圖2螺旋接頭沒有柔性連接物-取而代之的是，其延續(xù)細胞因子1的C-末端螺旋(4)，并且將其連接到細胞因子2的N-末端螺旋(1’)，形成一個長的螺旋4-接頭-螺旋1’的剛性串聯(lián)體。這兩個細胞因子的相對方向因此固定。但是，通過從該接頭加入或去除氨基酸制備的不同構建體，可以制備一系列剛性串聯(lián)體，其中結構域方向不同。
圖3顯示構建體χ1C1b的圖和核苷酸/氨基酸序列。
圖4顯示接頭設計的縱覽和用于制備有柔性末端的螺旋接頭的串聯(lián)體的引物。
圖5顯示A)GH結構域和接頭之間邊緣區(qū)的設計，其允許通過引物二聯(lián)體的連接制備結構域之間的不間斷的螺旋接頭。B)用于修飾χ1C1b以制備χ1C5的引物。
圖6顯示構建體χ1C5的圖和接頭區(qū)域的序列。
圖7顯示接頭設計的縱覽和用于制備具有剛性螺旋接頭的串聯(lián)體的引物。
圖8所示為顯示構建χ1L1的策略的示意圖。
圖9顯示χ1L1的核苷酸序列。GH結構域以灰色顯示，GHR結構域以粗體顯示，接頭以下劃線顯示。
圖10顯示χ1L1的氨基酸序列。GH結構域以灰色顯示，GHR結構域以粗體顯示，接頭以下劃線顯示。
圖11所示為顯示構建χ1L1的克隆策略的示意圖。
圖12顯示χ1L1的表達。
圖13顯示χ1L1-His的初步純化。使用Co2+柱純化χ1L1-His。
圖14顯示χ1L1表現(xiàn)激動劑活性。
圖15總結了關于剛性或半剛性GH構建體使用的命名法。
圖16a)是包含半剛性接頭序列的GH串聯(lián)體的核酸序列；b)是包含半剛性接頭序列的GH串聯(lián)體的蛋白質序列；c)顯示用于GH串聯(lián)體的構建中的半剛性接頭的例子；d)顯示包含半剛性接頭的GH串聯(lián)體的細菌表達；和e)顯示包含半剛性接頭的GH串聯(lián)體的生物活性。
圖17a)是包含剛性接頭序列的GH串聯(lián)體的核酸序列；b)是包含剛性接頭序列的GH串聯(lián)體的蛋白質序列；c)顯示用于GH串聯(lián)體的構建中的剛性接頭的例子；d)顯示包含剛性接頭的GH串聯(lián)體的細菌表達；和e)顯示包含剛性接頭的GH串聯(lián)體的生物活性。
圖18A顯示T1cEAK2+3his的純化及考馬斯染色和Western印跡分析；圖18B和18C顯示T1cEAK2+3his的生物活性；圖18D顯示TlcEAK2+4his的純化及考馬斯染色和Western印跡分析；并且圖18E和18F顯示T1cEAK2+4his的生物活性。
圖19顯示用于生長激素串聯(lián)體的檢測的ELISA。
圖20示意性顯示通過柔性、半剛性的和剛性的接頭連接的生長激素串聯(lián)體。
圖21顯示促乳素(PRL)、生長激素(GH)及它們的拮抗性突變體的可能組合的例子。
圖22顯示促乳素的核酸和氨基酸序列，以及一個它的拮抗性形式1-14氨基酸截短的G129R突變體(下劃線表示)。
圖23顯示生長激素的核酸和氨基酸序列，以及一個它的拮抗性形式G120R突變體(下劃線表示)。
圖24是促乳素串聯(lián)體的示意圖。
圖25(A)GH剛性串聯(lián)體構建體的示意圖，該構建體有工程化的限制位點NotI和NruI，其允許接頭與毗鄰結構域的末端螺旋直接連接，還促進接頭的變化。(B)PRL-接頭-GH剛性構建體的示意圖，該構建體有工程化的限制位點NotI和NruI，其有與(A)中相似的功能，NotI位點在接頭區(qū)域中并且因此可被連接到結構域A中的截短的PRL基因。(C)PRL剛性串聯(lián)體的示意圖，需要使用簡并的氨基酸密碼在接頭和結構域B中的PRL之間的邊界，工程化獨特的限制位點，使得容易合成和修飾該串聯(lián)體基因。
材料和方法GH串聯(lián)體中接頭的修飾起始于GH-(G4S)-GH分子(χ1C1)的基因，該分子已被修飾以從其表達蛋白的N-末端去除30個氨基酸的突出端，該基因還被亞克隆到修飾的pET21(+)載體中，得到pET21:χ1C1b(圖3)。
對于有柔性末端接頭的螺旋接頭的構建體，通過連接互補寡核苷酸構建構建體；這些寡核苷酸被設計為編碼所需接頭，并且有可以接入載體pET21:χ1C1b的末端，該載體用NotI和EcoRI消化。圖4顯示了這些接頭的縱覽。
對于GH結構域之間的剛性接頭，修飾GH結構域以截短它們的C-末端(GH1)和N-末端(GH2)，使得該結構域在螺旋末端結束。然后使用簡并密碼子設計限制位點，其能夠引入新接頭且不打斷這兩個結構域之間形成的螺旋(圖5A)。設計引物進行這些對GH串聯(lián)體的GH結構域的修飾(圖5b)。所產(chǎn)生的構建體命名為χ1C5(圖6)。使用互補寡核苷酸制備被NotI和NruI位點側翼連接的接頭區(qū)域，然后其被連接到經(jīng)NotI和NruI消化的pET21:χ1C5中。圖7顯示了這些接頭的縱覽。
通過首先轉化pET表達載體至表達株E.coli BL21(DE3)CodonPlusRIPL中進行構建體的表達。表達可在多種不同條件下進行，包括不同的孵育溫度(如室溫、37℃)、不同的培養(yǎng)基(如LB、2YT、5YT等等)、不同的誘導點(即開始誘導培養(yǎng)物的OD600值)、用于誘導培養(yǎng)物的IPTG(或其它誘導物)的不同濃度和誘導后收集細胞的時間。
可將His-標簽添加到所述構建體的C-末端，其有助于其使用固定金屬-離子親和層析(Ni2+或Co2+柱)的純化。沒有His-標簽的構建體可通過多種方法純化，例如離子交換層析、疏水柱和分子大小排阻層析。可能需要一個或多個這樣的純化技術以制備合適純度的蛋白。
χ1C5的構建使用PCR和相關引物制備修飾的GH結構域。使用DiGHNcoGF和GH[AEA3]NotR修飾GH1，并且使用EcoI-(Nru)GH-F和GHΔ*-HR修飾GH2。PCR反應的組成1μl 100pmol/μl正向引物、1μl 100pmol/μl反向引物、1μl pTrcHisGHstop(稀釋的)、1μl10mM dNTPs、5μl 10x擴增緩沖液、1μl 50mM MgSO4、0.5μl Pfx聚合酶、39.5μl無菌水。使用以下溫度譜對這些反應混合物進行PCR95℃、5分鐘，15x(95℃、45秒，55℃、45秒，72℃、45秒)，72℃、5分鐘。使用瓊脂糖膠證實PCR產(chǎn)物，并且分離需要的PCR產(chǎn)物。修飾的GH1被連接到pET21:x1C1b的NcoI和NotI位點之間制備pET21:χ1C4。修飾的GH2被連接到pET21:χ1C4的EcoRI和HindIII位點之間制備pET21:χ1C5。圖8顯示了此過程的縱覽。
接頭改變引物的磷酸化當需要2個或更多引物二聯(lián)體制備接頭時，首先磷酸化含有內部5’-端的引物。為準備磷酸化的每一個引物配制下述反應混合物2μl100pmol/μl寡核苷酸、2μl 10x激酶緩沖液、2μl 10mM ATP、13μl無菌水、1μl T4多核苷酸激酶(10U/μl)。37℃孵育30分鐘，然后70℃孵育10分鐘。然后用退火緩沖液(10mM TRIS，50mM NaCl，1mM EDTA，pH7.5-8.0)1∶10稀釋樣品，獲得0.1pmol/μl的溶液，其可用于下述退火反應。
引物二聯(lián)體的退火用退火緩沖液(10mM TRIS，50mM NaCl，1mM EDTA，pH7.5-8.0)稀釋引物到0.1pmol/μl。在干凈試管中混合10μl互補引物。95℃下孵育該試管2分鐘，并且在40-60分鐘的時間段內使溫度下降到30℃。需要多于一個引物二聯(lián)體時，混合等體積的引物二聯(lián)體以提供含有形成需要的接頭的所有引物二聯(lián)體的溶液。然后冰上保持該溶液。
連接和轉化經(jīng)相關限制酶消化的約200ng載體(如用NotI和EcoRI消化pET21:χ1C1b或用NotI和NruI消化pET21:χ1C5)與4μl退火的引物、1μl連接酶緩沖液、2μl T4 DNA連接酶以及將反應液調整為10μl的無菌水一起孵育。冰中孵育過夜，冰可在此時間內融化。然后向50μl化學感受態(tài)E.coli SURE細胞中加入5μl過夜的連接產(chǎn)物。冰上孵育1小時，然后42℃熱激30秒。向細胞中加入450μl LB培養(yǎng)基，然后37℃孵育30分鐘。4000rpm離心該小量培養(yǎng)物5分鐘，用50μl LB培養(yǎng)基重新懸浮得到的沉淀物，然后涂布于含有羧芐青霉素(100μg/ml)、四環(huán)素(10μg/ml)、葡萄糖(0.3％w/v)的LB平板上。37℃孵育過夜。篩選得到的菌落以檢測接頭改變是否成功。
通用策略的修改使用NotI和NruI消化pET21:χ1C5制備有剛性接頭的構建體，該構建體的制備在轉化后在陰性對照平板(連接反應中沒有引物二聯(lián)體)上產(chǎn)生了大量菌落，因此很難篩選陽性克隆。通過消化載體的去磷酸化解決此問題NotI和NruI消化的15μl pET21:χ1C52μl CIAP 10x緩沖液、1μl CIAP(小牛腸堿性磷酸酶)(10U/μl)和2μl無菌水混合。37℃孵育1小時后80℃孵育30分鐘。使用純化試劑盒(如Qiagen PCR PurificationKit)從溶液中純化DNA。用上述方法磷酸化用于制備引物二聯(lián)體的所有引物。按以上描述將磷酸化的引物二聯(lián)體連接到去磷酸化的載體中。
χ1L1的克隆和表達χ1L1由生長因子GH的兩個結構域和其后的一個細胞外生長因子結構域組成，這些結構域中的每一個目前由(Gly4Ser)4接頭連接(圖8)。圖9顯示了χ1L1的核苷酸序列，圖10顯示了χ1L1的氨基酸序列。
通過將由NheI和XhoI位點側翼連接的hGH基因連接到χ1E2(GHRa-GH-GHRb)中構建χ1L1；這一步得到χ1K1。然后GHR結構域被連接到χ1K1的EcoRI和HindIII位點之間制得χ1L1。圖11顯示了此過程的示意圖。
通過測序檢測χ1L1基因，其被證明是正確的。在E.coli(DE3)BL21CodonPlus RIPL中使用經(jīng)修飾的pET21(+)載體進行表達。1mM IPTG(終濃度)誘導后4小時的OD600為0.5-0.6的LB培養(yǎng)基中表達的蛋白是部分可溶的，并且在使用抗GH的探針的western印跡中觀察到多條不同分子量的條帶(圖12)。
用Co2+柱純化C-末端His-標簽的χ1L1(圖13)。許多污染蛋白質保留在蛋白質制備品中，并且在western印跡中依然觀察到多條不同分子量的條帶。該蛋白質制備品的初步生物測定顯示其有顯著的激動劑活性(圖14)。
促乳素串聯(lián)體的構建和促乳素生長激素串聯(lián)體的構建使用標準PCR技術及隨后的連接和轉化制備的載體來產(chǎn)生PRL和GH串聯(lián)體的構建體?？赏ㄟ^連接和轉化退火的寡核苷酸對到制備的載體中改變接頭。以下顯示了PRL和GH串聯(lián)體的構建體的三個示例性策略。
策略1PRL-(G4S)4-PRL的產(chǎn)生1.對NcoI和NotI位點之間的PRL進行PCR(正向引物＝atatccatgggcTTGCCCATCTGTCC；反向引物＝atatatatatatgggcggccgccGCAGTTGTTGTTGTGG)。
2.用NcoI和NotI消化PCR產(chǎn)物。
3.用NcoI和NotI消化接受載體→pET21(m)χ1C1b(即GH-(G4S)4-GH)。
4.連接PCR產(chǎn)物入載體，獲得pET21(m)PRL-(G4S)4-GH。
5.對EcoRI和HindIIII位點之間的PRL進行PCR(正向引物＝atatgaattcTTGCCCATCTGTCC；反向引物＝atataagcttGCAGTTGTTGTTGTGG)。
6.用EcoRI和HindIIII消化PCR產(chǎn)物。
7.用EcoRI和HindIIII消化接受載體→pET21(m)PRL-(G4S)4-GH。
8.連接PCR產(chǎn)物到載體，獲得pET21(m)PRL-(G4S)4-PRL。
策略2PRL-A(EA3K)2A-GH的產(chǎn)生1.對NcoI和NotI位點之間的PRL進行PCR(正向引物＝atatccatgggcTTGCCCATCTGTCC；反向引物＝atatatatatatgggcggccgccGCAGTTGTTGTTGTGG)。
2.用NcoI和NotI消化PCR產(chǎn)物。
3.用NcoI和NotI消化接受載體→pET21(m)TlaEAK2(即GH-A(EA3K)2A-GH)。
4.連接PCR產(chǎn)物到載體，獲得PRL-A(EA3K)2A-GH。
策略3PRL-A(EA3K)4A-pRL的產(chǎn)生1.退火用于產(chǎn)生A(EA3K)4A接頭的引物。
2.用NotI和EcoRI消化接受載體→pET21(m)PRL-(G4S)4-PRL(來自于上述實例1)。
3.連接寡核苷酸二聚體到載體，獲得PRL-A(EA3K)4A-PRL。
圖24顯示上述策略。
實施例1半剛性串聯(lián)體在含有羧芐青霉素、四環(huán)素和氯霉素的10ml LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)E.coliBL21(DE3)CodonPlus-RIPL細胞。37℃下振蕩生長細胞。OD600為0.4-0.7時用終濃度為1mM的IPTG誘導培養(yǎng)物。收集培養(yǎng)物前再培養(yǎng)4小時。使用溶菌酶、脫氧膽酸鈉和超聲波的組合裂解細胞。然后離心分離可溶部分?？捡R氏亮藍染色的PAGE沒有顯示串聯(lián)體表達的明顯條帶。
用ELISA測定可溶部分，將40ng/點樣孔的串聯(lián)體上樣到12％的PAGE膠。轉移蛋白到PVDF膜，western印跡中使用兔抗-GH Ab(一抗)和抗-兔-HRP Ab(二抗)；參見圖16d。圖16e顯示了包含半剛性接頭的GH串聯(lián)體的生物活性。
實施例2剛性串聯(lián)體在含有羧芐青霉素、四環(huán)素和氯霉素的10ml LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)E.coliBL21(DE3)CodonPlus-RIPL細胞。37℃下振蕩生長細胞。OD600為0.4-0.7時用終濃度為1mM的IPTG誘導培養(yǎng)物。收集培養(yǎng)物前再培養(yǎng)4小時。
使用溶菌酶、脫氧膽酸鈉和超聲波的組合裂解細胞。然后離心分離可溶部分。考馬氏亮藍染色的PAGE沒有顯示串聯(lián)體表達的明顯條帶。
用ELISA測定可溶部分，將40ng/點樣孔的串聯(lián)體上樣到12％的PAGE膠。轉移蛋白到PVDF膜，western印跡中使用兔抗-GH Ab(一抗)和抗-兔-HRP Ab(二抗)；參見圖17d。圖17e顯示了包含半剛性接頭的GH串聯(lián)體的生物活性。
實施例3串聯(lián)體的純化根據(jù)構建體T1cEAK2+3His和T1cEAK2+4His在生物測定中的初始最大活性，選定其用于進一步研究。轉化表達載體到E.coli BL21(DE3)CodonPlus RIPL細胞中并在1L每批培養(yǎng)物中進行表達。使用Ni-螯合的固化的金屬-離子親和層析(IMAC)和離子交換層析純化可溶蛋白質部分。IMAC是第一個純化步驟，使用pH梯度(pH8到pH3)完成初始洗脫；但是，發(fā)現(xiàn)柱清洗中丟失了許多蛋白。因此我們返回使用咪唑洗脫(0到0.5M的咪唑)，使用修改的純化策略，我們實現(xiàn)了＞70％的純度。然后使用離子交換柱(Resource Q)繼續(xù)純化該蛋白至＞90％的純度。圖18說明了此過程。
基于ELISA結果的定量T1cEAK2+3His(RQ13/4)＝215μg/ml；T1cEAK2+3His(RQ14/4)＝177μg/ml。
每種獲得1ml，因此總產(chǎn)量為392μg。其從2升培養(yǎng)物獲得→每升產(chǎn)量＝約200μg。
在更高蛋白質濃度時，T1cEAK2+3-His的活性達到比rhGH更高倍數(shù)的誘導?；谀枖?shù)測試該串聯(lián)體時，獲得相似結果，參見圖18B和圖18C。對T1cEAK2+4His進行了相似分析。圖18D、18E和18F顯示了其純化和生物活性。
基于ELISA結果的定量T1cEAK2+4His(RQ13/4)＝550μg/ml。其從2升培養(yǎng)物獲得→每升產(chǎn)量＝約275μg。在更高蛋白質濃度時，T1cEAK2+4-His的活性達到比rhGH更高倍數(shù)的誘導。基于摩爾數(shù)測試該串聯(lián)體時，獲得相似結果。
實施例4使用Bradford分析測量χ1C3的濃度。平行測定rhGH(@1mg/ml)以證實從Bradford分析獲得的數(shù)據(jù)的準確性。然后在GH生物測定中用χ1C3直接代替GH標準給出串聯(lián)體標準曲線。比對GH標準曲線和串聯(lián)體標準曲線測量純的和不純的串聯(lián)體樣品和rhGH，然后從每一個ELISA板測量蛋白質濃度。GH的ELISA為串聯(lián)體ELISA測定實際值的約2/3。如圖19所示。
實施例5促乳素/GH串聯(lián)體通過PCR向基因末端引入適當?shù)南拗莆稽c使其能夠連接到串聯(lián)體基因中，可以合成有或沒有其相應拮抗突變的促乳素和/或GH串聯(lián)體。
柔性串聯(lián)體通過用基于序列(G4S)n的柔性接頭連接兩個蛋白質結構域來構建串聯(lián)體基因；該蛋白質結構域和接頭的每個末端都有獨特的限制位點(圖20)。
因此通過接入不同的結構域可以改變串聯(lián)體中的所述兩個蛋白質結構域。舉例來說，促乳素(PRL)、促乳素第1至14氨基酸缺失G129R突變體(Δ1-14 PRL.G129R)、生長激素(GH)和生長激素G120R拮抗突變體(GH.G120R)可以多種方式被組合在該串聯(lián)體基因中(圖B)。圖22和23顯示了這些結構域的核苷酸序列和蛋白質序列。
可以使用標準PCR產(chǎn)生欲被適合的限制性內切酶位點側翼連接的所需蛋白質結構域的基因。用這些限制性內切酶消化PCR產(chǎn)物和接受載體，然后連接和轉化，將產(chǎn)生有所需蛋白質結構域的串聯(lián)體?？蓪Φ鞍踪|結構域或接頭使用此方法(圖24)，該接頭可使用已描述的寡核苷酸替代。
半剛性的串聯(lián)體通過用基于序列A(EA3K)nA的螺旋接頭連接兩個蛋白質結構域來構建串聯(lián)體基因；該蛋白質結構域和接頭的每個末端都有獨特的限制位點(圖20)。
因此通過接入不同的結構域可以改變串聯(lián)體中的所述兩個蛋白質結構域。舉例來說，促乳素(PRL)、促乳素第1至14氨基酸缺失G129R突變體(Δ1-14 PRL.G129R)、生長激素(GH)和生長激素G120R拮抗突變體(GH.G1 20R)可以多種方式被組合在該串聯(lián)體基因中(圖21)。圖22和23顯示了這些結構域的核苷酸序列和蛋白質序列。
可以使用標準PCR產(chǎn)生欲被適合的限制性內切酶位點側翼連接的所需蛋白質結構域的基因。用這些限制性內切酶消化PCR產(chǎn)物和接受載體，然后連接和轉化，將產(chǎn)生具有所需蛋白質結構域的串聯(lián)體?？蓪Φ鞍踪|結構域或接頭使用此方法(圖24)，該接頭可使用已描述的寡核苷酸替代。
剛性的串聯(lián)體串聯(lián)體的兩個結構域需要通過結構域A的C-末端α-螺旋和結構域B的N-末端α-螺旋直接連接。因此位于結構域A和結構域B的蛋白質(圖22和23)的基因需要被截短使得螺旋接頭[A(EA3K)nA]直接與這些螺旋相連。
因此
通過用基于序列A(EA3K)nA的螺旋接頭連接兩個蛋白質結構域來構建串聯(lián)體基因；該蛋白質結構域和接頭的每個末端都有獨特的限制位點(圖20)。向接頭區(qū)域的N-末端工程化獨特的NotI位點，向GH的C-末端工程化獨特的NruI位點(圖5和6)；使GH串聯(lián)體中接頭區(qū)域的修飾可行。
包含NotI位點的N-末端接頭序列可以被很容易地直接附加于結構域A位置的PRL基因，使得基于模板PRL-接頭-GH的構建體被構建(圖25)。但是，結構域B是PRL時，必須向接頭和結構域B之間的邊界區(qū)域引入獨特的限制位點(圖25)。
因此，通過接入不同的結構域可以改變串聯(lián)體中的所述兩個蛋白質結構域。舉例來說，促乳素(PRL)、促乳素第1至14氨基酸缺失G129R突變體(Δ1-14 PRL.G129R)、生長激素(GH)和生長激素G120R拮抗突變體(GH.G120R)可以多種方式被組合在該串聯(lián)體基因中(圖21)。依賴其在結構域A或結構域B中的位置，所述蛋白結構域會按上述需求被截短。
可以使用標準PCR產(chǎn)生欲被適合的限制性內切酶位點側翼連接的所需的蛋白質結構域的基因。用這些限制性內切酶消化PCR產(chǎn)物和接受載體，然后連接和轉化，將產(chǎn)生具有所需蛋白質結構域的串聯(lián)體?？蓪Φ鞍踪|結構域或接頭使用此方法(圖24)，并類似于柔性和半剛性接頭所使用的方法學。
權利要求
1.包含至少兩個能夠結合細胞因子受體的結構域的多肽，其中所述結構域由包含非柔性螺旋區(qū)的肽接頭分子連接。
2.如權利要求1所述的多肽，其中所述結構域包含3、4、5、6、7、8、9或10個串聯(lián)排列的結合結構域。
3.如權利要求1所述的多肽，其中所述多肽包含多于10個的串聯(lián)排列的結構域。
4.如權利要求1-3中任一項所述的多肽，其中所述的非柔性螺旋區(qū)包含至少一個拷貝的基序A(EAAAK)xA，或其功能性變體。
5.如權利要求1-4中任一項所述的多肽，其中所述接頭分子包含至少一個柔性非螺旋區(qū)。
6.如權利要求5所述的多肽，其中所述柔性非螺旋區(qū)位于或接近所述肽接頭分子的氨基末端。
7.如權利要求5所述的多肽，其中所述柔性非螺旋區(qū)位于或接近所述肽接頭分子的羧基末端。
8.如權利要求5所述的多肽，其中所述柔性非螺旋區(qū)位于或接近所述肽接頭分子的氨基和羧基末端。
9.如權利要求5-8中任一項所述的多肽，其中所述柔性非螺旋區(qū)與至少一個所述結合結構域相鄰。
10.如權利要求4-9中任一項所述的多肽，其中所述多肽包含少于10個拷貝的EAAAK基序。
11.如權利要求4-9中任一項所述的多肽，其中所述多肽包含少于5個拷貝的EAAAK基序。
12.如權利要求2-11中任一項所述的多肽，其中所述結合結構域通過由非柔性螺旋接頭組成的連接分子連接。
13.如權利要求12所述的多肽，其中所述螺旋接頭連接一個結合結構域的羧基末端和另一個結合結構域的氨基末端。
14.如權利要求13所述的多肽，其中所述螺旋接頭在第一結合結構域的C-末端螺旋和第二結合結構域的N-末端螺旋之間是連續(xù)的，因此以基本上固定的方向剛性地連接所述兩個結合結構域。
15.如權利要求1-14中任一項所述的多肽，其中所述多肽的結合結構域彼此相同或相似。
16.如權利要求15所述的多肽，其中所述多肽包含細胞因子的結合結構域，所述細胞因子選自生長激素；瘦素；紅細胞生成素；促乳素；白介素(IL)IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-11；IL-12的p35亞基、IL-13、IL-15；粒細胞集落刺激因子(G-CSF)；粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)；睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)；心臟營養(yǎng)素-1(CT-1)；白細胞抑制因子(LIF)；制瘤素M(OSM)；干擾素、IFNα和IFNγ，腫瘤壞死因子(TNF)α和TNFβ，及RANK配體。
17.如權利要求16所述的多肽，其中所述至少一個結構域包含生長激素結合結構域或生長激素變體。
18.如權利要求16或17所述的多肽，其中所述多肽包含生長激素或生長激素變體多肽的至少兩個結合。
19.如權利要求16所述的多肽，其中所述多肽包含促乳素或促乳素變體的至少兩個結合結構域。
20.如權利要求19所述的多肽，其中所述促乳素變體多肽包含氨基酸序列，其中所述氨基酸序列在促乳素的位點第129位被修飾。
21.如權利要求20所述的多肽，其中所述修飾是氨基酸替代。
22.如權利要求21所述的多肽，其中所述替代是用精氨酸氨基酸殘基取代甘氨酸氨基酸殘基。
23.如權利要求19-22中任一項所述的多肽，其中所述多肽還包含促乳素的9至14個氨基末端的氨基酸殘基的缺失。
24.如權利要求1-14中任一項所述的多肽，其中所述多肽的結合結構域彼此不相似。
25.如權利要求24所述的多肽，其中所述多肽包含第一結合結構域和第二結合結構域，所述第一結合結構域為生長激素結合結構域，所述第二結合結構域為促乳素結合結構域。
26.如權利要求24所述的多肽，其中所述多肽由生長激素結合結構域和促乳素結合結構域組成。
27.如權利要求24所述的多肽，其中所述多肽包含第一結合結構域和第二結合結構域，所述第一結合結構域為經(jīng)修飾的生長激素結合結構域，所述第二結合結構域為經(jīng)修飾的促乳素結合結構域。
28.如權利要求24所述的多肽，其中所述多肽由經(jīng)修飾的生長激素結合結構域和經(jīng)修飾的促乳素結合結構域組成。
29.如權利要求27或28所述的多肽，其中所述經(jīng)修飾的生長激素結合結構域包含氨基酸位點第120位甘氨酸的氨基酸替代。
30.如權利要求29所述的多肽，其中所述修飾是用選自精氨酸、賴氨酸、色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸或谷氨酸的氨基酸替代甘氨酸。
31.如權利要求30所述的多肽，其中所述修飾是用精氨酸氨基酸殘基替代第120位甘氨酸。
32.如權利要求27-31中任一項所述的多肽，其中所述經(jīng)修飾的促乳素結合結構域包括第129位甘氨酸的修飾。
33.如權利要求32所述的多肽，其中所述修飾是用精氨酸氨基酸殘基替代第129位甘氨酸。
34.如權利要求28-32中任一項所述的多肽，其中所述多肽還包含促乳素的9至14個氨基末端的氨基酸殘基的缺失。
35.如權利要求1-34中任一項所述的多肽，其中所述多肽還包含細胞因子受體的配體結合結構域。
36.如權利要求35所述的多肽，其中所述受體是生長激素受體。
37.如權利要求35所述的多肽，其中所述受體是促乳素受體。
38.編碼權利要求1-37中任一項所述多肽的核酸分子。
39.如權利要求38所述的核酸，其中所述核酸是適于所述多肽表達的載體。
40.用權利要求38或39所述的核酸或載體轉化或轉染的分離細胞。
41.如權利要求40所述的分離細胞，其中所述細胞是真核細胞。
42.如權利要求40所述的分離細胞，其中所述細胞是原核細胞。
43.制備本發(fā)明的多肽的方法，所述方法包含步驟i)在有利于生產(chǎn)權利要求1-37中任一項所述的多肽的條件下生長權利要求40-42中任一項所述的細胞；及ii)從所述細胞或其生長環(huán)境中分離所述多肽。
44.含有與第二細胞因子結合結構域連接的第一細胞因子結合結構域的多肽，其中所述多肽還包含細胞因子受體的胞外結構域。
45.如權利要求44所述的多肽，其中所述第一和第二結合結構域由柔性接頭分子連接。
46.如權利要求44所述的多肽，其中所述第一和第二結合結構域由包含非柔性螺旋區(qū)的肽接頭分子連接。
47.如權利要求44所述的多肽，其中所述第一和第二結合結構域由包含非柔性螺旋區(qū)和柔性非螺旋區(qū)的肽接頭分子連接。
48.如權利要求44-47中任一項所述的多肽，其中所述細胞因子結合結構域是生長激素或生長激素的變體，并且所述胞外結構域是生長激素的胞外結構域。
49.編碼權利要求44-48中任一項所述多肽的核酸分子。
50.如權利要求49所述的核酸分子，其中所述核酸是適于所述多肽表達的載體。
51.包含權利要求49所述核酸分子的載體。
52.權利要求1-39或44-51中任一項所述多肽或核酸分子作為藥物的用途。
53.包括權利要求1-39或44-51中任一項所述多肽或核酸分子的藥物組合物。
54.用權利要求49或51所述的核酸分子或載體轉化或轉染的分離細胞。
55.如權利要求54所述的分離細胞，其中所述細胞是真核細胞。
56.如權利要求54所述的分離細胞，其中所述細胞是原核細胞。
全文摘要
我們公開了包含至少兩個能夠結合細胞因子受體的結構域的治療性多肽，其中所述結構域由肽接頭連接，其中該接頭任選地包含剛性α螺旋區(qū)。
文檔編號C12N15/62GK101014616SQ200580030121
公開日2007年8月8日 申請日期2005年7月18日 優(yōu)先權日2004年7月26日
發(fā)明者彼得·阿蒂米克, 薩班德拉·普拉丹安加, 喬恩·塞耶斯, 理查德·羅斯 申請人:埃斯特瑞恩有限公司