專利名稱：：合成酶的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及表達藻類乙酰Co-A合成酶的轉基因細胞。三酰甘油中脂肪酸的細胞存儲需要首先通過乙酰CoA合成酶的活動將脂肪酸活化為乙酰CoA酯。通過乙酰CoA合成酶由脂肪酸、ATP和輔酶A產(chǎn)生乙酰CoA。乙酰CoA合成酶對不同鏈長或不同飽和度的脂肪酸具有底物特異性。例如，在大鼠中鑒別出了花生四烯酸酯(20:4n-6)偏好的乙酰CoA合成酶。該酶對花生四烯酸酯和二十碳五烯酸(EPA)具有高親和力并且對軟脂酸酯具有低親和力。在Arabidopsis中已經(jīng)鑒別出了乙酰CoA合成酶的若干同工酶。在幾乎全部的脂肪酸衍生的分子的生物合成途徑中，乙酰CoA合成酶(ACSs)都起著重要作用。長鏈乙酰CoA合酶(LACS)將游離脂肪酸與輔酶A酯化，以形成乙酰CoA，上述過程是主要的活化步驟，其對于通過大多數(shù)脂質(zhì)代謝酶的脂肪酸利用來說是必須的[1]。酶促機理是通過乙酰腺苷酸酯(乙酰-AMP)中間體的形成進行的兩步反應[2]。乙酰CoA在諸如脂肪酸的延長和β氧化、酶活化、細胞信號傳導以及轉錄調(diào)節(jié)等許多代謝途徑中作為重要的中間體[3]。與乙酰CoA合成酶(ACS)在細胞代謝中的多種作用一致，許多真核生物編碼若干不同的特異性活化短鏈(C6-C8)、中鏈(C10-C12)、長鏈(C14-C20)或非常長鏈(＞C22)脂肪酸的ACSs[3]。此外，某些生物體對于每一套乙酰鏈的長度具有多種酶。在植物中，LACS活性已經(jīng)被定位于亞細胞區(qū)室中[4，5]，使得由新脂肪酸合成產(chǎn)生的乙酰鏈被活化為其CoA酯并且隨后被用于諸如涉及發(fā)育種子中膜甘油脂類和貯存脂質(zhì)(三酰甘油類，TAGs)合成的代謝途徑[6]。此外，LACS在脂肪酸轉運中起重要作用。在細菌[7]、酵母(釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae))[8]以及哺乳動物細胞[9]中詳細地研究了該過程。海洋微藻類產(chǎn)生多種脂肪酸，并且某些種類引起了人們的興趣，因為它們含有有益于健康的多不飽和脂肪酸(PUFAs)[11]。在本文的后續(xù)中，多不飽和脂肪酸指PUFA、PUFAs、LCPUFA或LCPUFAs(多不飽和脂肪酸，PUFA；長鏈多不飽和脂肪酸，LCPUFA)。在高等植物中最終重建微藻非常長的多不飽和脂肪酸(VLCPUFA)的生物合成途徑是期望的目標，但是需要引入包括脂肪酸去飽和、延長和活化在內(nèi)的多種酶反應，以形成適于結合到TAGs中的底物。在我們同時待審的申請中，我們描述了編碼與PUFA生物合成途徑相關活性的核酸分子。在WO03/078639中，我們描述了涉及長鏈脂肪酸修飾的諸如延長酶、去飽和酶、乙酰CoA合成酶以及二酰甘油乙酰轉移酶等若干酶的活性，本文引入該文獻作為參考(尤其是其中公開的核酸序列)。這些核酸分子是從藻類Pavlovalutheri中分離出來的。在我們現(xiàn)在未公開的申請PCT/GB04/003057中，我們描述了由藻類Thalassiosirapseudonana(海鏈藻)分離出來的延長酶多肽的特征，本文引入該文獻作為參考(尤其是其中公開的核酸序列)。此外，在我們未公開的申請GB0403452.6中，我們描述了具有新的去飽和酶活性的酶，本文引入該文獻作為參考(尤其是其中公開的核酸序列)。例如，具有Δ11-去飽和酶活性的細胞色素b5去飽和酶和具有Δ6-去飽和酶活性的另一酶，這兩種酶均分離自Thalassiosirapseudonana。我們描述了Thalassiosirapseudonana的乙酰CoA合成酶(TpplascA)基因的特征。該酶對有益健康的VLCPUFAsEPA和二十二碳六烯酸(DHA)具有高活性，并且顯示了增加貯存在酵母TAG中DHA的量。根據(jù)本發(fā)明的一方面，提供了包含核酸分子的轉基因細胞，該核酸分子包含由圖3A所表示的序列組成的核酸分子序列或者在嚴緊雜交條件下與由圖3A所表示的序列雜交的核酸分子，其中所述核酸分子編碼具有乙酰CoA合成酶活性的多肽。在本發(fā)明的一優(yōu)選實施方案中，所述核酸分子包含與圖3A所表示的核酸序列具有約50％同源性的核酸序列。優(yōu)選的所述同源性是與圖3A所表示的核酸序列具有至少50％、60％、70％、80％、90％，或者至少99％的相同性，并且其編碼具有乙酰CoA合成酶活性的多肽。在本發(fā)明的一優(yōu)選實施方案中，所述核酸分子包含圖3A所表示的核酸序列。優(yōu)選地所述核酸分子由圖3A所表示的核酸序列組成。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了轉基因細胞，其中所述細胞適合表達核酸分子，該核酸分子編碼圖3B所示的氨基酸序列所表示的多肽，或者通過增加、刪除或替代至少一個氨基酸殘基進行修飾的變體氨基酸序列，并且其中所述多肽或變體多肽具有乙酰CoA合成酶活性。當兩個互補核酸分子相互形成一定量的氫鍵時，發(fā)生核酸分子的雜交。根據(jù)核酸所處的環(huán)境條件、雜交方法的性質(zhì)以及所使用的核酸分子的成分和長度，雜交的嚴緊性能夠變化。Sambrooketal.，MolecularCloningALaboratoryManual(分子克隆實驗室手冊)(ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NY，2001)；以及Tijssen，LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology-HybridizationwithNucleicAcidProbesPartI，Chapter2(生物化學和分子生物學的實驗室技術-使用核酸探針的雜交)(Elsevier，NewYork，1993)中討論了關于為了達到特定嚴緊性級別所需雜交條件的計算。Tm是核酸分子給定鏈的50％與其互補鏈雜交時的溫度。以下是一組示例性的雜交條件，且不具有限制性非常高的嚴緊性(使具有至少90％相同性的序列雜交)雜交5xSSC在65℃下，16小時洗滌兩次2xSSC在室溫(RT)下，每次15分鐘洗滌兩次0.5xSSC在65℃下，每次20分鐘高嚴緊性(使具有至少80％相同性的序列雜交)雜交5x-6xSSC在65℃-70℃下，16-20小時洗滌兩次2xSSC在室溫下，每次5-20分鐘洗滌兩次1xSSC在55℃-70℃下，每次30分鐘低嚴緊性(使具有至少50％相同性的序列雜交)雜交6xSSC在室溫-55℃下，16-20小時洗滌至少兩次2x-3xSSC在室溫-55℃下，每次20-30分鐘在本發(fā)明的一優(yōu)選實施方案中，所述修飾保持或增強了所述肽的酶活性。變體多肽可以通過可以在任意組合中出現(xiàn)的一次或多次替代、增加、刪除、截斷使氨基酸序列有所不同。優(yōu)選的變體是通過保守氨基酸替代而不同于參照多肽的變體。這些替代是通過類似性質(zhì)的另一氨基酸替代給定的氨基酸。氨基酸的下列非限制性名單被認為是保守替代(類似的)a)丙氨酸、絲氨酸和蘇氨酸；b)谷氨酸和天冬氨酸；c)天冬酰胺和谷氨酰胺；d)精氨酸和賴氨酸；e)異亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸和纈氨酸以及f)苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。最優(yōu)選的變體是保持或增強與和其有差異的參照多肽相同的生物學功能和活性的變體。此外，本發(fā)明的特征在于具有與本文公開的多肽序列，或其片斷以及與其功能相同的多肽有至少75％的序列相同性的多肽序列。在一實施方案中，多肽具有與本文表明的氨基酸序列至少85％的相同性，優(yōu)選至少90％的相同性，更優(yōu)選至少95％的相同性，更優(yōu)選至少97％的相同性，并且最優(yōu)選至少99％的相同性。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，所述核酸分子是從藻類中分離的。所述藻類優(yōu)選選自Amphiphorahyalina、Amphiphorasp.、Chaetocerosgracilis、Coscinodiscussp.、Crypthecodiniumcohnii、Cryptomonassp.、Cylindrothecafusiformis、Hasleaostrearia、Isochrysisgalbana、Nannochloropsisoculata、Naviculasp.、Nitzschiaclosterium、Pavlovalutheri、Phaeodactylumtricornutum、Prorocentrumminimum、Rhizosoleniasetigera、Skeletonemacostatum、Skeletonemasp.、Tetraselmistetrathele、Thalassiosiranitzschioides、Thalassiosiraheterophorma、Thalassiosirapseudonana、Thalassiosirastellaris。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，所述乙酰CoA合成酶活性修飾20個和/或22個碳的多不飽和脂肪酸。優(yōu)選地，所述多不飽和脂肪酸是20:4n6、20:5n3或22:6n3個碳的多不飽和脂肪酸。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了包含本發(fā)明核酸分子的載體。包含本發(fā)明核酸的載體不需要包含啟動子或其它調(diào)節(jié)序列，特別是當載體用于向細胞中引入核酸以重組到基因組中進行穩(wěn)定轉染時。優(yōu)選載體中的核酸可操作地與宿主細胞中用于轉錄的合適的啟動子或其它調(diào)節(jié)元件連接，所述宿主細胞例如是原核生物的(例如細菌)或真核生物的(例如真菌、植物、哺乳動物或昆蟲細胞)。載體可以是在多種宿主中起作用的雙功能表達載體。在編碼本發(fā)明的多肽的核酸的實例中，該核酸可以包含其天然啟動子或其它調(diào)節(jié)元件，并且就cDNA而言，該核酸可以處于合適的啟動子或其它調(diào)節(jié)元件的控制之下用于在宿主細胞中的表達?！皢幼印敝肝挥谵D錄起始位點上游的核苷酸序列，并且其包含轉錄所需的全部調(diào)節(jié)區(qū)域。合適的啟動子包括用于植物細胞表達的組成型的、組織特異性的、誘導型的、發(fā)育的或其它啟動子，所述植物細胞根據(jù)設計包含在植物中。這樣的啟動子包括能夠在植物細胞中起作用的病毒的、真菌的、細菌的、動物的以及源自植物的啟動子。組成型啟動子包括，例如CaMV35S啟動子(Odelletal(1985)Nature313，9810-812)；大米肌動蛋白(McElroyetal(1990)PlantCell2163-171)；泛肽(Christianetal.(1989)PlantMol.Biol.18(675-689)；pEMU(Lastetal(1991)TheorAppl.Genet.81581-588)；MAS(Veltenetal(1984)EMBOJ.3.2723-2730)；ALS啟動子(U.S.ApplicationSerielNo.08/409,297)等。其它組成型啟動子包括美國專利5,608,149；5,608,144；5,604,121；5,569,597；5,466,785；5,399,680，5,268,463和5,608,142中的啟動子?；瘜W調(diào)節(jié)的啟動子可以用于通過外源性化學調(diào)節(jié)劑的應用來調(diào)節(jié)植物中的基因表達。根據(jù)目的，啟動子可以是化學誘導型啟動子，其中化學物質(zhì)的應用誘導基因表達，或者可以是化學抑制型啟動子，其中化學物質(zhì)的應用抑制基因表達。本領域已知化學誘導型啟動子，其包括但不限于被苯磺酰胺除草劑安全劑活化的玉米In2-2啟動子、被作為出土前除草劑使用的疏水親電子化合物活化的玉米GST啟動子以及被水楊酸活化的煙草PR-1a啟動子。其它感興趣的化學調(diào)節(jié)的啟動子包括響應類固醇的啟動子(例如參見，Schemaetal(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA8810421-10425和McNellieetal.(1998)PlantJ.14(2)247-257中的糖皮質(zhì)激素誘導型啟動子)以及四環(huán)素誘導型和四環(huán)素抑制型啟動子(例如參見，Gatzetal.(1991)Mol.Gen.Genet.227229-237和美國專利第5,814,618和5,789,156號，本文引入上述文獻作為參考)。當需要在特定組織中增強表達時，可以使用組織特異性啟動子。組織特異性啟動子包括以下文獻中描述的啟動子Yamamotoetal.(1997)PlantJ.12(2)255-265；Kawamataetal(1997)PlantCellPhysiol.38(7)792-803；Hansenetal(1997)Mol.Gen.Genet.254(3)337-343；Russelletal.(1997)TransgenicRes.6(2)157-168；Rinehartetal(1996)PlantPhysiol.112(3)1331-1341；VanCampetal(1996)PlantPhysiol.112(2)525-535；Canevascnietal(1996)PlantPhysiol.112(2)513-524；Yamamotoetal(1994)PlantCellPhysiol.35(5)773-778；Lam(1994)ResultsProbl.CellDiffer.20181-196；Orozcoetal(1993)PlantMol.Biol.23(6)1129-1138；Mutsuokaetal(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90(20)9586-9590和Guevara-Garciaetal(1993)PlantJ.4(3)495-50。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，所述組織特異性啟動子是在發(fā)育的含油種子中積蓄油的期間具有活性的啟動子，參見Brounetal.(1998)PlantJ.13(2)201-210。“可操作地連接”意思是作為相同核酸分子一部分連接的，其位置和定向適于從啟動子起始的轉錄。與啟動子可操作地連接的DNA處于該啟動子的轉錄起始調(diào)節(jié)之下。在優(yōu)選實施方案中，啟動子是誘導型啟動子或發(fā)育調(diào)節(jié)的啟動子。特殊的啟動子是作為植物載體操作的核酸構建體。Guerineau和Mullineaux(1993)(Planttransformationandexpressionvectors(植物轉化和表達載體)。PlantMolecularBiologyLabfax(植物分子生物學實驗室傳真)(CroyRRDed)Oxford，BIOSScientificPublishers，pp121-148)描述了從前在植物中廣泛成功使用的特定操作和載體。合適的載體可以包括植物病毒衍生的載體(例如參見，EP-A-194809)。載體還可以包括選擇性遺傳標記，例如賦予選擇性表型的遺傳標記，所述表型例如對除草劑的抗性(例如卡那霉素、潮霉素、草丁膦(phosphinotricin)、氯磺隆(chlorsulfuron)、氨甲喋呤、慶大霉素、壯觀霉素、咪唑啉酮和草甘磷)?；蛘?，或此外，所述載體是適合用于哺乳動物細胞轉染或酵母細胞轉染的載體。在后者的實例中，優(yōu)選多拷貝載體，例如2μ的游離型載體?；蛘?，酵母CEN載體和適于轉化諸如釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和畢赤酵母屬(Pichiaspp.)等酵母的整合型載體，該整合型載體例如YIP載體。在本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方案中，所述細胞過量表達由所述核酸分子編碼的乙酰CoA合成酶。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，當與同種非轉化參照細胞相比時，所述過量表達至少為2倍。優(yōu)選所述過量表達是當與同種非轉化參照細胞相比時，至少為3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、或至少10倍。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，所述核酸分子是cDNA。在本發(fā)明另一優(yōu)選實施方案中，所述核酸分子是基因組DNA。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，所述轉基因細胞是真核細胞。在本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方案中，所述轉基因細胞是原核細胞。在本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方案中，所述真核細胞是植物細胞。還提供了包括本發(fā)明植物細胞的植物，及由所述植物產(chǎn)生的種子。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中、所述植物選自玉米(Zeamays)、雙低油菜(Brassicanapus，Brassicarapassp.)、亞麻(Linumusitatissimum)、苜蓿(Medicagosativa)、水稻(Oryzasativa)、黑麥(Secalecerale)、高粱(Sorghumbicolor，Sorghumvulgare)、向日葵(Helianthusannus)、小麥(Tritiumaestivum)、大豆(Glycinemax)、煙草(Nicotianatabacum)、馬鈴薯(Solanumtuberosum)、花生(Arachishypogaea)、棉花(Gossypiumhirsutum)、甘薯(Iopmoeabattus)、木薯(Manihotesculenta)、咖啡(Cofeaspp.)、椰子(Cocosnucifera)、菠蘿(Ananacomosus)、佛手柑(Citrusspp.)、可可(Theobromacacao)、茶(Camelliasenensis)、香蕉(Musaspp.)、鱷梨(Perseaamericana)、無花果(Ficuscasica)、番石榴(Psidiumguajava)、芒果(Mangiferindica)、橄欖(Oleaeuropaea)、番木瓜(Caricapapaya)、腰果(Anacardiumoccidentale)、澳洲堅果(Macadamiaintergrifolia)、扁桃(Prunusamygdalus)、甜菜(Betavulgaris)、燕麥、大麥、蔬菜和觀賞植物。本發(fā)明中植物優(yōu)選作物植物(例如，谷類和豆類、玉米、小麥、馬鈴薯、樹薯、水稻、高粱、小米、木薯、大麥、豌豆)，以及其它根、塊莖或種子作物。重要的種子作物是油菜、甜菜、玉米、向日葵、大豆、高粱和亞麻(亞麻子)。本發(fā)明可應用的園藝作物可包括萵苣、菊苣和蔬菜蕓苔類，包括甘藍、綠花椰菜和花椰菜。本發(fā)明也可應用于煙草、葫蘆、胡蘿卜、草莓、向日葵、番茄、胡椒。提供感興趣種子的谷物植物包括含油種子植物和豆科植物。感興趣種子包括谷物種子，例如玉米、小麥、大麥、水稻、高粱、黑麥等。含油種子植物包括棉花、大豆、紅花、向日葵、蕓苔屬、玉米、苜蓿、棕櫚、椰子等。豆科植物包括豆類和豌豆。豆類包括瓜爾豆、角豆、胡蘆巴、大豆、四季豆、豇豆、綠豆、利馬豆、蠶豆、小扁豆、鷹嘴豆等。根據(jù)本發(fā)明另一方面，提供了包含本發(fā)明植物細胞的種子。優(yōu)選所述種子來自于含油種子植物。根據(jù)本發(fā)明的一方面，提供了本發(fā)明的多肽或細胞在將長鏈脂肪酸與輔酶A酯化以形成乙酰CoA中的用途。根據(jù)本發(fā)明另一方面，提供了反應容器，其包括本發(fā)明的多肽、長鏈脂肪酸、ATP和輔酶A。優(yōu)選所述容器是發(fā)酵罐。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，所述多肽由本發(fā)明的細胞表達。優(yōu)選所述細胞是真核細胞，例如酵母細胞。在本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方案中，所述細胞是原核細胞。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了將長鏈脂肪酸底物與輔酶A酯化以形成乙酰CoA的方法，其包括以下步驟i)提供本發(fā)明的反應容器，并且ii)在允許將長鏈脂肪酸酯化為乙酰CoA的條件下，使在所述反應容器中的細胞生長。有利的是，在本發(fā)明的方法中產(chǎn)生的多不飽和脂肪酸含有至少2個雙鍵，優(yōu)選3個、4個或5個雙鍵。特別優(yōu)選地，脂肪酸含有4個或5個雙鍵。有利的是，本發(fā)明的方法中產(chǎn)生的脂肪酸在脂肪酸鏈中具有18、20、22或24個碳原子；優(yōu)選地，脂肪酸在脂肪酸鏈中具有20、22或24個碳原子。有利的是，飽和脂肪酸與本發(fā)明方法中使用的核酸較小程度地反應或根本不反應?？梢詫⑤^小程度理解為與多不飽和脂肪酸相比，飽和脂肪酸具有低于5％、優(yōu)選低于3％、特別優(yōu)選低于2％的活性。產(chǎn)生的這些脂肪酸可以作為單一產(chǎn)物在本發(fā)明的方法中產(chǎn)生或者存在于脂肪酸混合物中。在本發(fā)明的優(yōu)選方法中，所述長鏈脂肪酸選自18:3n6、20:4n6、18:4n3、20:5n3和22:6n3。本發(fā)明的方法中產(chǎn)生的多不飽和脂肪酸優(yōu)選結合在膜脂中和/或三酰甘油中，但是還可以作為游離脂肪酸出現(xiàn)在生物體中或結合在其它形式的脂肪酸酯中。關于這點，它們還可以以“純產(chǎn)物”存在或者優(yōu)選以多種脂肪酸的混合物或不同甘油酯的混合物的形式存在。結合在三酰甘油中的多種脂肪酸可以衍生自具有4至6個碳原子的短鏈脂肪酸，具有8至12個碳原子的中鏈脂肪酸或具有14至24個碳原子的長鏈脂肪酸，其中所述長鏈脂肪酸是優(yōu)選的并且長鏈脂肪酸(LCPUFA)C18-、C20-、C22-和/或C24-脂肪酸是特別優(yōu)選的。本發(fā)明的方法有利地產(chǎn)生具有多不飽和C18-、C20-、C22-和/或C24-脂肪酸分子的脂肪酸酯，并且在脂肪酸酯中含有至少2個雙鍵。這些脂肪酸分子優(yōu)選含有3個、4個或5個雙鍵并且有利地導致十六碳二烯酸(C16:2Δ9，12)、γ-亞麻酸(＝GLA，C18:3Δ6，9，12)、十八碳四烯酸(＝SDA，C18:4Δ6，9，12，15)、二高-γ-亞麻酸(＝DGLA，20:3Δ8，11，14)、二十碳四烯酸(＝ETA，C20:4Δ5，8，11，14)、花生四烯酸(ARA)、二十碳五烯酸(EPA)或其混合物的合成，優(yōu)選EPA和/或ARA的合成。可以從用于制備油或脂質(zhì)形式的脂肪酸酯的生物體中分離具有多不飽和C18-、C20-、C22-和/或C24-脂肪酸分子的脂肪酸酯，所述油或脂質(zhì)例如是諸如神經(jīng)鞘脂類、磷酸甘油酯類、脂質(zhì)類、糖脂類、磷脂類、單酰甘油類、二酰甘油類、三酰甘油類等的化合物，所述糖脂類例如鞘糖脂，所述磷脂類例如磷脂酰乙醇胺、磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇或雙磷脂酰甘油，所述三酰甘油類包括具有至少2個優(yōu)選3個雙鍵的多不飽和脂肪酸；優(yōu)選以所述脂肪酸酯的二酰甘油類、三酰甘油類和/或磷脂酰膽堿的形式，尤其優(yōu)選以三酰甘油類的形式將其分離。除了這些酯以外，多不飽和脂肪酸也作為游離脂肪酸或結合于其它化合物中出現(xiàn)在生物體，尤其是植物中。通常，多種上述化合物(脂肪酸酯或游離脂肪酸)以約如下分配比存在于生物體中80至90％重量比的三酰甘油類，2至5％重量比的二酰甘油類，5至10％重量比的單酰甘油類，1至5％重量比的游離脂肪酸，2至8％重量比的磷脂類，各種化合物的總量為100％重量比。本發(fā)明的方法產(chǎn)生占優(yōu)選為轉基因植物的轉基因生物體中總脂肪酸的至少3％重量比的LCPUFA，有利地產(chǎn)生至少5％重量比的LCPUFA，優(yōu)選產(chǎn)生至少8％重量比的LCPUFA，尤其優(yōu)選產(chǎn)生至少10％重量比的LCPUFA，最優(yōu)選產(chǎn)生至少15％重量比的LCPUFA。優(yōu)選以結合形式產(chǎn)生脂肪酸。借助于本發(fā)明方法中所使用的核酸，可以在優(yōu)選制備的三酰甘油類的sn1、sn2和/或sn3位引入這些不飽和脂肪酸。因為在本發(fā)明的方法中由起始化合物十六碳二烯酸(C16:2)、亞油酸(C18:2)和亞麻酸(C18:3)進行多個反應步驟，所以該方法的諸如花生四烯酸(ARA)、二十碳五烯酸(EPA)或二十二碳六烯酸(DHA)等終產(chǎn)物不是絕對純的產(chǎn)物，痕量的前體總是存在于終產(chǎn)物中。如果諸如亞油酸和亞麻酸均存在于起始生物體和起始植物中，那么諸如ARA和EPA等終產(chǎn)物以混合物的形式存在?；谒懻摰慕K產(chǎn)物的量，前體的量應該有利地不高于20％重量比，優(yōu)選不高于15％重量比，尤其優(yōu)選不高于10％重量比，最優(yōu)選不高于5％重量比。優(yōu)選地，在本發(fā)明的方法中，轉基因植物中產(chǎn)生的終產(chǎn)物只有ARA或只有EPA，它們?yōu)榻Y合脂肪酸或游離脂肪酸形式。如果同時產(chǎn)生兩種化合物(ARA和EPA)，那么有利地以至少1∶2(EPA∶ARA)的比例產(chǎn)生上述化合物，有利地以至少1∶3的比例產(chǎn)生上述化合物，優(yōu)選以1∶4的比例產(chǎn)生上述化合物，尤其優(yōu)選以1∶5的比例產(chǎn)生上述化合物。由于本發(fā)明的核酸序列，與非轉基因起始生物體相比，通過GC分析的對比得到，多不飽和脂肪酸的產(chǎn)率增加至少50％，優(yōu)選至少80％，尤其優(yōu)選至少100％，特別尤其優(yōu)選至少150％。在另一有利實施方案中，多不飽和脂肪酸的產(chǎn)率增加至少200％，優(yōu)選至少250％，尤其優(yōu)選至少300％。還可以通過上述方法合成化學純的多不飽和脂肪酸或脂肪酸組合物。為此，使用諸如提取、蒸餾、結晶、層析或上述方法的組合等已知的方法，可以從生物體中、培養(yǎng)基中或者生物體和培養(yǎng)基中分離脂肪酸或脂肪酸組合物，該生物體例如是微生物或植物，該培養(yǎng)基為所述生物體在其中或其上生長的培養(yǎng)基。優(yōu)選將這些化學純的脂肪酸或脂肪酸組合物用于食品工業(yè)部門、化妝品工業(yè)部門，尤其是藥物工業(yè)部門。適合于本發(fā)明的方法生產(chǎn)之用的生物體主要是諸如微生物、非人類的動物或植物等任何生物體。優(yōu)選本發(fā)明的方法使用轉基因生物體，例如諸如被孢霉屬(Mortierella)或Traustochytrium的真菌、諸如酵母菌屬(Saccharomyces)或裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)的酵母、諸如Physcomitrella或Ceratodon的蘚類、諸如新桿狀線蟲(Caenorhabditis)的非人類的動物、諸如Crypthecodinium或Phaeodactylum的藻類、或者諸如雙子葉植物或單子葉植物的植物。本發(fā)明的方法中尤其優(yōu)選使用的生物體是屬于產(chǎn)油的生物體，即用于油類的生產(chǎn)，該生物體例如是諸如被孢霉屬(Mortierella)或Traustochytrium的真菌、諸如Crypthecodinium或Phaeodactylum的藻類、或植物，尤其是優(yōu)選包含大量脂質(zhì)化合物的油料作物植物，例如花生、油菜、雙低油菜(canola)、向日葵、紅花、罌粟、芥菜、大麻、蓖麻、橄欖、芝麻、金盞草、石榴屬、月見草、毛蕊花、薊、野玫瑰、榛子、杏仁、澳大利亞堅果、鱷梨、月桂樹、南瓜/西葫蘆、亞麻子、大豆、阿月渾子、琉璃苣、樹(油椰、椰子或胡桃)或可耕農(nóng)作物，例如玉米、小麥、黑麥、燕麥、黑小麥、水稻、大麥、棉花、木薯、胡椒、萬壽菊，茄科植物，例如馬鈴薯、煙草、茄子和番茄，野豌豆屬、豌豆、苜?；蚬嗄局参?咖啡樹、可可樹、茶樹)、柳屬以及多年生牧草和飼料作物。本發(fā)明的優(yōu)選植物是油料作物植物，例如花生、油菜、雙低油菜、向日葵、紅花、罌粟、芥菜、大麻、蓖麻、橄欖、金盞草、石榴屬、月見草、南瓜/西葫蘆、亞麻子、大豆、琉璃苣、樹(油椰、椰子)。尤其優(yōu)選的植物是富含C18:2-脂肪酸和/或C18:3-脂肪酸的植物，例如向日葵、紅花、煙草、毛蕊花、芝麻、棉花、南瓜/西葫蘆、罌粟、月見草、胡桃、亞麻子、大麻、薊或紅花。特別尤其優(yōu)選的植物是諸如紅花、向日葵、罌粟、月見草、胡桃、亞麻子或大麻等植物。優(yōu)選地，本發(fā)明所述的方法除了本發(fā)明的核酸以外，還向生物體中引入編碼脂肪酸或脂質(zhì)代謝的酶的核酸。原則上，脂肪酸或脂質(zhì)代謝的全部基因都可以用于生產(chǎn)多不飽和脂肪酸的方法中，優(yōu)選與本發(fā)明的乙酰CoA合成酶組合來生產(chǎn)多不飽和脂肪酸。優(yōu)選將乙酰CoA合成酶與選自下列脂肪酸或脂質(zhì)代謝的基因組合使用乙酰CoA溶血磷脂乙酰轉移酶、乙酰CoA脫氫酶、乙酰ACP[＝乙酰載體蛋白]去飽和酶、乙酰ACP硫酯酶、脂肪酸乙酰轉移酶、乙酰CoA溶血磷脂乙酰轉移酶、脂肪酸合成酶、脂肪酸羥化酶、乙酰輔酶A羧化酶、乙酰輔酶A氧化酶、脂肪酸去飽和酶、脂肪酸acetylenases、脂氧化酶、三酰甘油脂酶、丙二烯氧化物合酶、過氧化氫物裂合酶或脂肪酸延長酶。尤其優(yōu)選將選自乙酰CoA溶血磷脂乙酰轉移酶、Δ-4-去飽和酶、Δ-5-去飽和酶、Δ-6-去飽和酶、Δ-8-去飽和酶、Δ-9-去飽和酶、Δ-12-去飽和酶、Δ-5-延長酶、Δ-6-延長酶或Δ-9-延長酶的基因與上述乙酰CoA合成酶、甘油-3-磷酸乙酰轉移酶、二酰甘油乙酰轉移酶、卵磷脂膽固醇乙酰轉移酶的基因組合，可以使用單個基因或組合使用多個基因。由于本發(fā)明的方法中所使用的核酸的酶活性，所以可以在本發(fā)明的方法中產(chǎn)生很多種多不飽和脂肪酸，所述核酸編碼具有溶血磷脂酸乙酰轉移酶、甘油-3-磷酸乙酰轉移酶、二酰甘油乙酰轉移酶或卵磷脂膽固醇乙酰轉移酶活性的多肽，所述核酸優(yōu)選與編碼脂肪酸或脂質(zhì)代謝的多肽的核酸序列組合，該編碼脂肪酸或脂質(zhì)代謝的多肽具有乙酰CoA合成酶，Δ-4-、Δ-5-、Δ-6-、Δ-8-去飽和酶或Δ-5-、Δ-6-或Δ-9-延長酶活性。根據(jù)本發(fā)明的方法中所選擇的優(yōu)選為植物的生物體，例如優(yōu)選植物，可以產(chǎn)生游離或結合形式的多種多不飽和脂肪酸的混合物或諸如EPA或ARA或DHA等單一的多不飽和脂肪酸。根據(jù)起始植物中主要的脂肪酸組分(C18:2-或C18:3-脂肪酸)，可以得到來自C18:2-脂肪酸的脂肪酸，例如GLA、DGLA或ARA，或者得到來自C18:3-脂肪酸的脂肪酸，例如SDA、ETA、EPA或DHA。如果用于所述該方法的植物中的不飽和脂肪酸只有亞油酸(＝LA，C18:2Δ9，12)，那么該方法只提供GLA、DGLA和ARA作為產(chǎn)物，所有產(chǎn)物均可以以游離脂肪酸的形式或結合的形式存在。如果用于所述該方法的植物中的不飽和脂肪酸只有α-亞麻酸(＝ALA，C18:3Δ9，12，15)，例如在亞麻子中，那么該方法只提供SDA、ETA和EPA作為產(chǎn)物，如上所述所有產(chǎn)物均可以以游離脂肪酸的形式或結合的形式存在。通過修飾涉及合成的酶、溶血磷脂酸乙酰轉移酶、甘油-3-磷酸乙酰轉移酶、二酰甘油乙酰轉移酶或卵磷脂膽固醇乙酰轉移酶的活性，優(yōu)選與乙酰CoA合成酶，Δ-5-、Δ-6-去飽和酶和/或Δ-6-延長酶組合，或者與乙酰CoA合成酶，Δ-5-、Δ-8-去飽和酶和/或Δ-9-延長酶組合，或者僅與合成級聯(lián)的前三個基因、乙酰CoA合成酶、Δ-6-去飽和酶和/或Δ-6-延長酶、乙酰CoA合成酶、Δ-8-去飽和酶和Δ-9-延長酶組合，可以在優(yōu)選為上述植物的上述生物體中以靶向方式僅產(chǎn)生單個產(chǎn)物。由于Δ-6-去飽和酶和Δ-6-延長酶的活性，根據(jù)起始植物和不飽和脂肪酸，例如形成了GLA和DGLA，或SDA和ETA。優(yōu)選形成DGLA或ETA或其混合物。如果向生物體中，優(yōu)選向植物中另外引入Δ-5-去飽和酶，那么另外形成ARA或EPA。還可以將Δ-5-去飽和酶用于已經(jīng)引入Δ-8-去飽和酶和Δ-9-延長酶的生物體中。優(yōu)選地，根據(jù)生物體或植物中存在的作為合成起始物質(zhì)的脂肪酸，僅合成ARA或EPA或其混合物。因為涉及生物合成級聯(lián)，所以所涉及的終產(chǎn)物并不以純的形式存在于生物體中。終產(chǎn)物中總是另外存在少量的前體化合物。基于終產(chǎn)物DGLA、ETA或其混合物，或者基于終產(chǎn)物ARA、EPA、DHA或其混合物，該少量總計低于20％重量比，優(yōu)選低于15％重量比，尤其優(yōu)選低于10％重量比，最優(yōu)選低于5、4、3、2或1％重量比。為了提高所述的生產(chǎn)優(yōu)選具有高含量多不飽和脂肪酸的油類和/或甘油三酯的方法的產(chǎn)率，優(yōu)選提高合成脂肪酸的起始產(chǎn)物的量；這可以例如通過向生物體中引入編碼Δ-12-去飽和酶多肽的核酸來實現(xiàn)。此方法特別優(yōu)選在產(chǎn)油生物體中，例如含有大量油酸的油菜中。因為這些生物體中僅含有少量的亞油酸(Mikoklajczaketal.，JournaloftheAmericanOilChemicalSociety，38，1961，678-681)，所以優(yōu)選將上述Δ-12-去飽和酶用于生產(chǎn)起始物質(zhì)亞油酸。用于本發(fā)明的核酸優(yōu)選來自植物，例如諸如Isochrysis或Crypthecodinium等藻類，諸如Phaeodactylum等藻類/硅藻，諸如Physcomitrella或Ceratodon等蘚類，或者諸如報春花科(Primulaceae)等高等植物，該報春花科例如Aleuritia、星形金盞草(Calendulastellata)、刺狀骨籽菊(Osteospermumspinescens)或Osteospermumhyoseroidessuch，諸如真菌、細菌、酵母等微生物，所述真菌例如曲霉屬(Aspergillus)、Thraustochytrium、Phytophthora、蟲霉屬(Entomophthora)、毛霉屬(Mucor)或被孢霉屬(Mortierella)，所述細菌例如Shewanella，或者諸如線蟲、昆蟲或人類的動物，所述線蟲例如新桿狀線蟲(Caenorhabditis)。所述核酸有利地來自真菌、動物或者諸如藻類或蘚類的植物，優(yōu)選來自例如新桿狀線蟲(Caenorhabditis)的線蟲。本發(fā)明的方法優(yōu)選使用編碼特定多肽的上述核酸序列或其衍生物或同源物，該特定多肽保持被核酸編碼的蛋白的酶活性。將這些序列與編碼乙酰CoA合成酶的核酸序列組合克隆至表達構建體中并將它們用于引入生物體中并在生物體中表達。由于其構造，這些表達構建體可以使本發(fā)明方法中所產(chǎn)生的多不飽和脂肪酸的優(yōu)選最佳合成成為可能。在優(yōu)選實施方案中，所述方法還包括得到包含在所述方法中使用的核酸序列的細胞或完整生物體的步驟，其中單獨使用本發(fā)明的核酸序列、下述的基因構建體或載體，或與編碼脂肪酸或脂質(zhì)代謝的蛋白質(zhì)的其它氨基酸序列組合轉化所述細胞和/或生物體。在另一優(yōu)選實施方案中，所述方法還包括從培養(yǎng)物中得到精細化學物質(zhì)的步驟。例如就諸如被孢霉屬(Mortierella)、酵母屬(Saccharomyces)或Traustochytrium等微生物培養(yǎng)而言，該培養(yǎng)物可以是發(fā)酵培養(yǎng)物的形式，或者該培養(yǎng)物可以是植物的溫室生長培養(yǎng)物或田地生長培養(yǎng)物。因此產(chǎn)生的細胞或生物體優(yōu)選是產(chǎn)油生物體的細胞，例如諸如花生、油菜、雙低油菜、亞麻子、大麻、大豆、紅花、向日葵或琉璃苣等油料作物植物。就植物細胞、植物組織或植物器官而言，可以將“生長(growing)”理解為，例如在營養(yǎng)培養(yǎng)基上或營養(yǎng)培養(yǎng)基中，或者在基層上或基層中對完整植物的培養(yǎng)，所述基層例如是溶液培養(yǎng)物、盆栽培養(yǎng)料或耕地。為了本發(fā)明的目的，關于核酸序列的實例，“轉基因的”或“重組的”指表達盒(＝基因構建體)或包含本發(fā)明核酸序列的載體或使用本發(fā)明核酸序列、表達盒或載體轉化的生物體，通過重組方法得到的所有特定構建體，其中a)本發(fā)明的核酸序列，或者b)與本發(fā)明的核酸序列可操作地連接的基因控制序列，例如啟動子，或者c)(a)和(b)不處于其天然的遺傳環(huán)境中或者已經(jīng)通過重組方法進行了修飾，所述修飾可以采用諸如替代、增加、刪除、倒位或插入一個或多個核苷酸殘基的形式?？梢詫⑻烊贿z傳環(huán)境理解為原生物體中的基因組或染色體基因座，或者在基因組文庫中的存在。就基因組文庫而言，優(yōu)選保持核酸序列的天然遺傳環(huán)境，至少是部分保持核酸序列的天然遺傳環(huán)境。該環(huán)境至少位于所述核酸序列一側并且具有至少50bp的序列長度，優(yōu)選至少500bp，尤其優(yōu)選至少1000bp，最優(yōu)選至少5000bp。當通過諸如誘變處理的非天然的、合成的(“人工的”)方法修飾天然存在的表達盒時，該天然存在的表達盒-例如本發(fā)明核酸序列的天然啟動子的天然存在的組合成為轉基因表達盒。例如US5,565,350或WO00/15815描述了合適的方法。如上所述，可以將用于本發(fā)明目的的轉基因生物體或轉基因植物理解為，本發(fā)明方法中所使用的核酸不位于其在生物體基因組中的天然基因座上，可以同源或異源地表達所述核酸。然而，如上所述，“轉基因的”還指，雖然本發(fā)明的核酸位于其在生物體基因組的天然基因座上，但是與天然序列相比，該序列已經(jīng)被修飾，和/或天然序列的調(diào)節(jié)序列已經(jīng)被修飾。優(yōu)選可以將“轉基因的”理解為本發(fā)明的核酸在基因組的非天然基因座表達，即發(fā)生所述核酸的同源或優(yōu)選異源表達。優(yōu)選的轉基因生物體是諸如被孢霉屬(Mortierella)的真菌，諸如Physcomitrella的蘚類，諸如(Cryptocodinium)的藻類，或諸如油料作物植物的植物。大體而言，對于本發(fā)明方法中所使用的核酸、表達盒或載體來說，合適的生物體或宿主生物體優(yōu)選能夠合成脂肪酸，尤其是能夠合成不飽和脂肪酸，和/或適合重組基因表達的所有生物體?？梢蕴峒暗膶嵗侵参铩⑽⑸?、藻類或原生動物，所述植物例如是擬南芥(Arabidopsis)，Asteraceae，例如金盞草(Calendula)或農(nóng)作物植物，例如大豆、花生、蓖麻、向日葵、玉米、棉花、亞麻、油菜、椰子、油椰、紅花(Carthamustinctorius)或可可豆，所述微生物例如是真菌、細菌、酵母、藍細菌(cyanobacteria)、纖毛蟲(ciliates)、所述真菌例如是被孢霉屬(Mortierella)、Thraustochytrium、水霉屬(Saprolegnia)或腐霉屬(Pythium)，所述細菌例如是埃希桿菌屬(Escherichia)或Shewanella，所述酵母例如是酵母屬(Saccharomyces)，所述藻類或原生動物例如是溝鞭藻類，該溝鞭藻類例如是Crypthecodinium。優(yōu)選的生物體是能夠天然合成大量油的那些生物體，例如真菌、或者植物、或者酵母，所述真菌例如是Mortierellaalpina、Pythiuminsidiosum，所述植物例如是大豆、油菜、椰子、油椰、紅花、亞麻、大麻、蓖麻、金盞草、花生、可可豆或向日葵，所述酵母例如是釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，尤其優(yōu)選大豆、亞麻、油菜、紅花、向日葵、金盞草、被孢霉屬(Mortierella)或釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。大體而言，除上述轉基因生物體以外，合適的宿主生物體還有轉基因動物，優(yōu)選非人類動物，例如線蟲(C.elegans)。Goeddel，GeneExpressionTechnologyMethodsinEnzymology185(基因表達技術酶學中的方法185)，AcademicPress，SanDiego，CA(1990)詳細地給出了其它可以使用的宿主細胞。Gottesman，S.，GeneExpressionTechnologyMethodsinEnzymology185(基因表達技術酶學中的方法185)，AcademicPress，SanDiego，California(1990)119-128詳細地給出了可以使用的表達株，例如那些具有較低蛋白酶活性的表達株。這些包括了所有表型形式的植物細胞和植物的某些組織、器官和部分，例如來自實際的轉基因植物的和/或可以用于產(chǎn)生轉基因植物的花藥、纖維、根毛、莖桿、胚、愈傷組織、子葉、葉柄、收集的材料、植物組織、生殖組織和細胞培養(yǎng)物。含有本發(fā)明方法中合成的多不飽和脂肪酸的轉基因植物優(yōu)選可以直接上市，而不需要分離合成的油類、脂質(zhì)或脂肪酸。所列的用于本發(fā)明方法的植物指來自實際的轉基因植物的和/或可以用于產(chǎn)生轉基因植物的完整植物和所有的植物部分、植物器官或植物部分，該植物部分例如是葉、莖、種子、根、塊莖、花藥、纖維、根毛、莖桿、胚、愈傷組織、子葉、葉柄、收集的材料、植物組織、生殖組織和細胞培養(yǎng)物。關于這點，所述種子包括種子的全部部分，例如種皮、表皮細胞、種子細胞、胚乳或胚組織。然而，還可以從優(yōu)選為植物的生物體中分離本發(fā)明方法中產(chǎn)生的油、脂肪、脂質(zhì)和/或游離脂肪酸形式的化合物?？梢酝ㄟ^收集生物體得到由所述方法產(chǎn)生的多不飽和脂肪酸，所述生物體來自于其生長的作物或田地?？梢酝ㄟ^壓榨或提取優(yōu)選為植物種子的植物部分完成。關于這點，可以通過已知的冷攪打或冷壓榨而不需要使用熱壓榨得到油類、脂肪、脂質(zhì)和/或游離脂肪酸。為了更加容易地破壞植物部分，尤其是種子，先將其搗碎、蒸或烘焙。然后壓榨或使用溶劑提取使用上述方法預處理的種子，所述溶劑例如是熱己烷。然后再次除去溶劑。就微生物而言，收集后直接提取而不需要其它處理步驟，或者破壞后使用本領域技術人員熟悉的方法提取。如此，可以分離超過96％的本發(fā)明方法中產(chǎn)生的化合物。其后，進一步處理所得的產(chǎn)物，即精練。在所述方法中，首先除去諸如植物粘液的物質(zhì)以及混懸的物質(zhì)。可以使用酶或通過加入諸如磷酸的酸使用化學物理的方法進行被稱為脫泥的步驟。其后，通過使用諸如氫氧化鈉溶液的堿處理除去游離脂肪酸。用水充分洗滌所得的的產(chǎn)物以除去產(chǎn)物中剩余的堿，然后干燥。為了除去產(chǎn)物中剩余的色素，例如使用漂白土或活性炭將產(chǎn)物漂白。最后，例如使用蒸汽將產(chǎn)物除臭。所述方法產(chǎn)生的PUFA或LCPUFA優(yōu)選為在脂肪酸分子中含有至少2個雙鍵的C18-、C20-、C22-和/或C24-脂肪酸分子，優(yōu)選含有3個、4個、5個或6個雙鍵?？梢詮纳矬w中以油、脂質(zhì)或游離脂肪酸的形式分離出這些C18-、C20-、C22-和/或C24-脂肪酸分子。合適的生物體例如是上述提及的生物體。優(yōu)選的生物體是轉基因植物。因此，本發(fā)明的一實施方案是通過上述方法產(chǎn)生的油類、脂質(zhì)或脂肪酸或其部分，尤其優(yōu)選包含PUFA并且來自轉基因植物的油、脂質(zhì)或脂肪酸組合物。本發(fā)明的另一實施方案是油、脂質(zhì)、脂肪酸和/或脂肪酸組合物在飼料、食料、化妝品或藥物中的用途?？梢詫⑿g語“油”、“脂質(zhì)”或“脂肪”理解為包含不飽和或飽和，優(yōu)選為酯化的脂肪酸的脂肪酸混合物。所述油、脂質(zhì)或脂肪優(yōu)選含有大量多不飽和的游離或優(yōu)選為酯化的脂肪酸，特別是亞油酸、γ-亞麻酸、二高-γ-亞麻酸、花生四烯酸、α-亞麻酸、十八碳四烯酸、二十碳四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸或二十二碳六烯酸。不飽和酯化脂肪酸的含量優(yōu)選總計約為30％，更優(yōu)選50％的含量，甚至更優(yōu)選60％、70％、80％或更高的含量。對于分析，例如可以在通過酯基轉移作用將脂肪酸轉化為甲酯后，使用氣相色譜法確定脂肪酸的含量。油、脂質(zhì)或脂肪可以包含多種其它飽和或不飽和脂肪酸，例如金盞草酸(calendulicacid)、棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸、油酸等。油或脂肪中的各種脂肪酸的含量是可以變化的，尤其是根據(jù)起始生物體的不同。如上所述，在本發(fā)明方法中產(chǎn)生的具有優(yōu)選的至少兩個雙鍵的多不飽和脂肪酸例如是神經(jīng)鞘脂類、磷酸甘油酯類、脂質(zhì)、糖脂類、磷脂類、單酰甘油、二酰甘油、三酰甘油或其它脂肪酸酯類。從在本發(fā)明方法中制備的具有優(yōu)選的至少兩個雙鍵的多不飽和脂肪酸開始，例如可以通過諸如KOH或NaOH水溶液等堿的處理，或者優(yōu)選在諸如甲醇或乙醇等醇的存在下，通過酸水解，或者通過酶裂解來釋放存在的多不飽和脂肪酸，并且通過例如相分離以及隨后的諸如H2SO4的酸化來進行分離。還可以不經(jīng)過上述的處理步驟直接釋放脂肪酸。在引入優(yōu)選為植物細胞或植物的生物體后，本發(fā)明方法中所使用的核酸可以存在于單獨的質(zhì)粒中或被整合入宿主細胞的基因組中。就整合入基因組而言，整合可以是隨機的，或是通過重組進行，使得天然基因被引入的拷貝替代，借此調(diào)節(jié)細胞中期望化合物的產(chǎn)生，或者通過基因的反式使用，使得基因與功能性表達單元功能性地連接，所述功能性表達單元包含至少一個確?；虮磉_的序列和至少一個確保被功能性轉錄的基因的多腺苷酸化的序列。優(yōu)選通過用于多平行表達的多表達盒或構建體將所述核酸引入生物體，優(yōu)選引入植物中用于基因的多平行種子特異性表達。蘚類和藻類是僅知的產(chǎn)生大量的諸如花生四烯酸(ARA)和/或二十碳五烯酸(EPA)和/或二十二碳六烯酸(DHA)的多不飽和脂肪酸的植物系統(tǒng)。蘚類在膜脂中含有PUFA，而藻類、與藻類相關的生物體和少量真菌也在三酰甘油部分中積聚大量的PUFA。這就是為什么從這樣的在三酰甘油部分中也積聚PUFA的株中分離出來的核酸分子特別優(yōu)選適合于本發(fā)明的方法，并且因此適合于宿主中脂質(zhì)和PUFA產(chǎn)生的修飾，尤其是在諸如油料作物植物等植物中，該油料作物植物例如是油菜、雙低油菜、亞麻子、大麻、大豆、向日葵和琉璃苣。因此，它們可以優(yōu)選用于本發(fā)明的方法中。為了產(chǎn)生本發(fā)明的長鏈PUFA，首先必須通過去飽和酶的酶活性將多不飽和C16-或C18-脂肪酸去飽和，隨后通過延長酶延長至少兩個碳原子。經(jīng)過一次延長循環(huán)后，該酶活性給出C18-或C20-脂肪酸，并且經(jīng)過2次或3次延長循環(huán)后得到C22-或C24-脂肪酸。本發(fā)明方法中所使用的去飽和酶和延長酶的活性優(yōu)選產(chǎn)生在脂肪酸分子中具有至少兩個雙鍵的C18-、C20-、C22-和/或C24-脂肪酸分子，優(yōu)選地，該分子中具有3個、4個或5個雙鍵；特別優(yōu)選地，產(chǎn)生在脂肪酸分子中具有至少兩個雙鍵的C20-和/或C22-脂肪酸分子，優(yōu)選地，該分子中具有3個、4個或5個雙鍵。在進行第一次去飽和和延長之后，可以進行其它的去飽和步驟，例如在Δ5位。本發(fā)明方法的產(chǎn)物尤其優(yōu)選二高-γ-亞麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸或二十二碳六烯酸。可以通過本發(fā)明的酶活性延長脂肪酸中具有至少兩個雙鍵的游離脂肪酸形式的或酯形式的C18-脂肪酸，所述酯例如是磷脂類、糖脂類、神經(jīng)鞘脂類、磷酸甘油酯、單酰甘油、二酰甘油或三酰甘油。優(yōu)選使用的植物中脂肪酸、油類、脂質(zhì)或脂肪的優(yōu)選生物合成位點是，例如通常是種子或種子的細胞層，以便使本發(fā)明的方法中所使用的核酸的種子特異性表達有意義。然而，很明顯，脂肪酸、油類或脂質(zhì)的生物合成并不需要被限制在種子組織中，而是也可以以組織特異性方式發(fā)生在植物的所有其它部分，例如在表皮細胞中或塊莖中。如果使用諸如酵母、真菌、藻類等微生物作為本發(fā)明方法中的生物體，那么優(yōu)選地這些生物體在發(fā)酵培養(yǎng)物中生長，所述酵母例如是酵母屬(Saccharomyces)或裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)，所述真菌例如是被孢霉屬(Mortierella)、曲霉屬(Aspergillus)、Phytophtora、蟲霉屬(Entomophthora)、毛霉屬(Mucor)或Thraustochytrium，所述藻類例如是Isochrysis、Phaeodactylum或Crypthecodinium。大體而言，，通?？梢酝ㄟ^兩種途徑增加在本發(fā)明方法所使用的生物體中用本發(fā)明方法所產(chǎn)生的多不飽和脂肪酸。優(yōu)選地，可以擴大通過所述方法產(chǎn)生的游離多不飽和脂肪酸的總量和/或酯化多不飽和脂肪酸的含量。優(yōu)選地，通過本發(fā)明的方法擴大轉基因植物中的酯化多不飽和脂肪酸的總量。如果在本發(fā)明的方法中使用微生物作為生物體，那么根據(jù)宿主生物體，使用本領域技術人員熟悉的方法生長或培養(yǎng)微生物。通常，在0℃至100℃下，優(yōu)選在10℃至60℃下，在吹入氧氣下，在含有碳源、氮源、痕量元素的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物，所述碳源通常是糖的形式，所述氮源通常是有機氮源的形式，例如酵母提取物或諸如硫酸銨的鹽，所述痕量元素例如是鐵、錳和鎂，如果合適所述液體培養(yǎng)基中還可以含有維生素。液體培養(yǎng)基的pH可以保持恒定，也就是說在培養(yǎng)期間進行調(diào)節(jié)，或者不保持恒定?？梢苑峙?、半分批或連續(xù)培養(yǎng)培養(yǎng)物?？梢栽诎l(fā)酵開始時提供營養(yǎng)物，或者半連續(xù)地添加營養(yǎng)物，或者連續(xù)地添加營養(yǎng)物。如上所述，可以通過本領域技術人員已知的方法從生物體中分離產(chǎn)生的多不飽和脂肪酸，例如通過提取、蒸餾、結晶，如果合適可以使用鹽進行沉淀，和/或層析。為此，優(yōu)選預先裂解生物體。如果宿主生物體是微生物，那么有利地在0℃至95℃下，優(yōu)選在10℃至85℃下，尤其優(yōu)選在15℃至75℃下優(yōu)選，特別尤其優(yōu)選在15℃至45℃下實行本發(fā)明的方法。在所述方法中，pH值有利地被保持在pH4至12，優(yōu)選pH6至9，尤其優(yōu)選pH7至8?？梢苑峙?、半分批或連續(xù)地操作本發(fā)明的方法。在Chmiel(Bioprozeβtechnik1.EmfuhrungindieBioverfahrenstechnik[Bioprocesstechnology1.IntroductiontoBioprocesstechnology(生物工藝技術1.生物工藝技術簡介)](GustavFischerVerlag，Stuttgart，1991))的教科書中或Storhas(BioreaktorenundperiphereEinrichtungen[Bioreactorsandperipheralequipment(生物反應器和外周設備)](ViewegVerlag，Brunswick/Wiesbaden，1994))的教科書中可以找到已知的培養(yǎng)方法的綜述。所使用的培養(yǎng)基必須適合滿足所討論的株的要求?？梢栽诮炭茣癕anualofMethodsforGeneralBacteriology(普通細菌學方法手冊)”oftheAmericanSocietyforBacteriology(WashingtonD.C.，USA，1981)中找到多種微生物培養(yǎng)基的描述。如上所述，依照本發(fā)明可以使用的這些培養(yǎng)基通常包含一種或多種碳源、氮源、無機鹽、維生素和/或痕量元素。優(yōu)選的碳源是糖，例如單糖、二糖或多糖。非常好的碳源的實例是葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、核糖、山梨糖、核酮糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、棉子糖、淀粉或纖維素。還可以通過諸如糖蜜或其它來自糖精練的副產(chǎn)物等復雜化合物向培養(yǎng)基中加入糖。優(yōu)選加入多種碳源的混合物。其它可能的碳源是油類和脂肪、脂肪酸、醇和/或多元醇和/或有機酸，所述油類和脂肪例如是豆油、葵花油、花生油和/或椰子脂，所述脂肪酸例如是棕櫚酸、硬脂酸和/或亞油酸，所述醇和/或多元醇例如是甘油、甲醇和/或乙醇，所述有機酸例如是乙酸和/或乳酸。氮源通常是有機或無機氮化合物或含有這些化合物的物質(zhì)。氮源的實例包括液體或氣體形式的氨或銨鹽、氨基酸或復雜氮源，所述銨鹽例如是硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、碳酸銨或硝酸銨、硝酸鹽、尿素，所述復雜氮源例如是玉米漿、大豆粗磨粉、大豆蛋白、酵母提取物、肉提取物等。氮源可以單獨使用或以混合物使用?？梢源嬖谟谂囵B(yǎng)基中的無機鹽化合物包括鈣、鎂、鈉、鈷、鉬、鉀、錳、鋅、銅和鐵的氯化物、磷酸鹽和硫酸鹽?？梢詫o機含硫化合物或者有機硫化合物用作產(chǎn)生含硫精細化學物質(zhì)的硫源，尤其是產(chǎn)生蛋氨酸的硫源，所述無機含硫化合物例如是硫酸鹽、亞硫酸鹽、連二亞硫酸鹽、連四硫酸鹽、硫代硫酸鹽、硫化物，所述有機硫化合物例如是硫醇(mercaptans)和硫醇(thiols)。可以將磷酸、磷酸二氫鉀或磷酸氫二鉀或者相應的含鈉鹽用作磷源?？梢韵蚺囵B(yǎng)基中加入螯合劑以便使金屬離子保持在溶液中。特別合適的螯合劑包括諸如兒茶酚或3，4-二羥苯酸等二羥基酚類和諸如檸檬酸等有機酸。本發(fā)明用于培養(yǎng)微生物的發(fā)酵培養(yǎng)基通常包含諸如維生素或生長促進劑等其它生長因子，例如包括生物素、核黃素、硫胺素、葉酸、煙酸、泛酸和吡哆醇。生長因子和鹽通常來自諸如酵母提取物、糖蜜、玉米漿等復雜培養(yǎng)基組分。此外，還可以向培養(yǎng)基中加入合適的前體。培養(yǎng)基化合物的準確組分主要取決于特定的實驗并且根據(jù)每一特定的情況單獨確定。可以在教科書“AppliedMicrobiol.Physiology，APracticalApproach(應用微生物生理學-實踐方法)”(EditorsP.M.Rhodes，P.F.Stanbury，IRLPress(1997)pp.53-73，ISBN0199635773)中找到培養(yǎng)基最優(yōu)化的信息。還可以從商業(yè)供應者處得到生長培養(yǎng)基，例如Standard1(Merck)或BHI(腦心浸液，DIFCO)等。通過加熱(在1.5bar、121℃下，20min)或者過濾滅菌將所有培養(yǎng)基組分滅菌。可以將組分一起滅菌或者如果需要也可以將組分單獨滅菌。所有培養(yǎng)基組分可以在培養(yǎng)開始時就存在或者如果需要，可以連續(xù)添加或者分批添加。培養(yǎng)溫度通常是15℃至45℃，優(yōu)選25℃至40℃，并且可以保持恒定或者在實驗過程中可以改變。培養(yǎng)基的pH應該在5至8.5，優(yōu)選在7.0附近。在培養(yǎng)過程中可以通過加入諸如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氨和氨水等堿性化合物或諸如磷酸或硫酸等酸性化合物來控制培養(yǎng)的pH?？梢酝ㄟ^使用諸如脂肪酸聚乙二醇酯類的消泡劑來控制泡沫。為了維持質(zhì)粒的穩(wěn)定性，可以向培養(yǎng)基中加入具有選擇性作用的合適物質(zhì)，例如抗生素。通過向培養(yǎng)基中引入氧氣或諸如大氣等含氧氣體混合物來維持有氧條件。培養(yǎng)的溫度通常是15℃至45℃，優(yōu)選25℃至40℃。連續(xù)培養(yǎng)直至期望的產(chǎn)物達到最大化。通常在10至160小時實現(xiàn)該目的。使用所述方法得到的發(fā)酵液，特別是含有多不飽和脂肪酸的那些發(fā)酵液通常含有7.5至25％重量比的干重。然后可以進一步處理發(fā)酵液。根據(jù)需要，可以通過分離方法完全或部分除去生物質(zhì)，或者將生物質(zhì)完全留在所述發(fā)酵液中，所述的分離方法例如是離心分離、過濾、傾析或這些方法的組合。優(yōu)選在分離后處理生物質(zhì)。然而，還可以使用諸如借助于旋轉式蒸發(fā)器、薄膜蒸發(fā)器、降膜式蒸發(fā)器，通過反滲透或納米過濾等已知的方法稠化或濃縮發(fā)酵液而不分離細胞。最后，可以處理該濃縮的發(fā)酵液以得到存在于其中的脂肪酸。在本發(fā)明方法中得到的脂肪酸還適合作為感興趣的其它產(chǎn)物的化學合成的起始物質(zhì)。例如，可以與另一脂肪酸組合或單獨使用，將其用于藥物、食料、動物飼料或化妝品的制備。為了引入本發(fā)明的方法中所使用的核酸，優(yōu)選使用已知的方法擴增或連接后者。優(yōu)選根據(jù)PfuDNA聚合酶或Pfu/TaqDNA聚合酶多聚酶混合物的實驗方案進行操作。考慮需要擴增的序列選擇引物。應當適當?shù)剡x擇引物，使得擴增物包含從起始密碼子到中止密碼子的完整編碼序列。擴增后，適當?shù)胤治鰯U增物。例如，根據(jù)質(zhì)量和數(shù)量進行凝膠電泳分離。其后，根據(jù)標準實驗方案(例如Qiagen)純化擴增物。然后得到用于隨后的克隆步驟中使用的純化的擴增物。本領域技術人員已知合適的克隆載體。這包括，特別是能夠在微生物體系中復制的載體，也就是說，確保酵母或真菌中有效克隆并且可以穩(wěn)定轉化植物的載體。必須特別提及的那些載體是適合T-DNA介導的轉化的各種雙元載體和共整合載體系統(tǒng)。通常這樣的載體系統(tǒng)的特征在于，它們至少包含農(nóng)桿菌(Agrobacterium)介導的轉化所需要的vir基因和T-DNA定界序列(T-DNA邊界)。優(yōu)選這些載體系統(tǒng)還包含其它的順式調(diào)節(jié)區(qū)域，例如啟動子和終止子和/或選擇標記，借此可以鑒別合適轉化的生物體。雖然就共整合載體系統(tǒng)而言，病毒基因vir基因和T-DNA序列被安排在相同的載體上，但是雙元系統(tǒng)是基于至少兩種載體的，其一承載vir基因但沒有T-DNA，但是第二個承載T-DNA但沒有vir基因。由于這樣的事實，最后所提及的載體是相對較小的、易于操作的和并且在E.coli和農(nóng)桿菌中復制。這些雙元載體包括來自pBIB-HYG、pPZP、pBecks、pGreen系列的載體。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選使用Bin19、pBI101、pBinAR、pGPTV和pCAMBIA。在Hellensetal.，TrendsinPlantScience(2000)5，446-451中可以找到雙元載體及其應用的綜述。為了制備所述載體，首先使用限制性內(nèi)切酶使載體線性化，然后使用合適的方法使用酶對其進行修飾。其后純化載體并在克隆步驟中使用。在克隆步驟中，使用連接酶，使用類似方法制備的載體片段克隆酶裂解的并且如果合適的話，純化的擴增物。關于這點，特別的核酸構建體或載體或質(zhì)粒構建體可以具有一個或多余一個的編碼基因區(qū)段。這些構建體中的編碼基因區(qū)段優(yōu)選與調(diào)節(jié)序列功能性地連接。特別地，所述調(diào)節(jié)序列包括植物序列，例如上述的啟動子和終止子。優(yōu)選在選擇性的條件下，在微生物中穩(wěn)定地增殖構建體并使異源DNA轉移至植物或微生物中成為可能，特別是在大腸埃希桿菌(Escherichiacoli)和根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)中。可以優(yōu)選使用克隆載體將本發(fā)明方法中所使用的核酸、本發(fā)明的核酸和核酸構建體引入生物體中，該生物體例如是微生物或者優(yōu)選是植物，并且因此可以用于植物的轉化，所述植物的轉化在以下出版和引用的文獻中PlantMolecularBiologyandBiotechnology(植物分子生物學和生物技術)(CRCPress，BocaRaton，F(xiàn)lorida)，Chapter6/7，pp.71-119(1993)；F.F.White，VectorsforGeneTransferinHigherPlants(高等植物中基因轉移的載體)；TransgenicPlants，Vol.1，EngineeringandUtilization，Ed.(轉基因植物，Vol.1，工程與應用)KungandR.Wu，AcademicPress，1993，15-38；B.Jenesetal.，TechniquesforGeneTransfer(基因轉移技術)；TransgenicPlants，Vol.1，EngineeringandUtilization，Ed.(轉基因植物，Vol.1，工程與應用)KungandR.Wu，AcademicPress(1993)，128-143；Potrykus，Annu.Rev.PlantPhysiol.PlantMolec.Biol.42(1991)，205-225。因此，本發(fā)明方法中所使用的核酸、本發(fā)明的核酸和核酸構建體，和/或本發(fā)明方法中所使用的載體可以用于廣譜生物體的重組修飾，優(yōu)選植物的重組修飾，以便使后者成為更好和/或更加有效的PUFA生產(chǎn)者。本發(fā)明中優(yōu)選使用的核酸來自細菌、真菌或植物，該植物例如是藻類或蘚類，例如Shewanella、Physcomitrella、Thraustochytrium、Fusarium、Phytophtora、Ceratodon、Isochrysis、Aleurita、Muscarioides、Mortierella、Borago、Phaeodactylum、Crypthecodinium，或者來自線蟲類，例如新桿狀線蟲(Caenorhabditis)，尤其來自Shewanellahanedai、Physcomitrellapatens、Phytophtorainfestans、Fusariumgraminaeum、Cryptocodiniumcohnii、Ceratodonpurpureus、Isochrysisgalbana、Aleuritafarinosa、Muscarioidesviallii、Mortierellaalpina、Boragoofficinalis、Phaeodactylumtricomutum，或者尤其優(yōu)選來自秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans)。優(yōu)選將本發(fā)明方法中所使用的核酸序列引入能夠使該核酸在諸如微生物或植物等生物體中表達的表達盒。如此，編碼本發(fā)明核酸的核酸序列以及編碼與去飽和酶和/或延長酶組合使用的乙酰CoA合成酶的核酸序列與一種或多種調(diào)節(jié)信號功能性地連接，優(yōu)選將其用于增強基因表達。這些調(diào)節(jié)序列旨在使基因和蛋白質(zhì)進行特異性表達。根據(jù)宿主生物體，這可以指，例如只在誘導后進行基因的表達和/或過量表達，或者立即進行表達和/或過量表達。例如，這些調(diào)節(jié)序列采用與誘導物或阻抑物結合的序列的形式，因此控制核酸的表達。除了這些新的調(diào)節(jié)序列以外，或者不是這些序列，在實際結構基因之前還可以存在這些序列的天然調(diào)節(jié)，并且如果合適，可以遺傳修飾這些序列的天然調(diào)節(jié)，以致排除天然調(diào)節(jié)并增強基因表達。然而，表達盒(＝表達構建體＝基因構建體)的構造還可以更簡單，也就是說沒有額外的調(diào)節(jié)信號插入核酸序列或其衍生物中，并且并沒有除去天然啟動子和其調(diào)節(jié)。或者，突變天然調(diào)節(jié)序列，以致不再發(fā)生調(diào)節(jié)和/或增強基因表達?？梢詫⑦@些經(jīng)修飾的啟動子自身以部分序列的形式(＝具有本發(fā)明的部分核酸的啟動子)放置在天然基因之前，以便增強活性。此外，所述基因構建體還可以優(yōu)選包含一種或多種與啟動子功能地連接的增強子序列，這使核酸序列的增強表達成為可能。還可以將額外的優(yōu)選序列插入所述DNA序列的3’末端，所述額外的優(yōu)選序列例如是其它調(diào)節(jié)元件或終止子。在表達盒(＝基因構建體)中可以存在一個或多個拷貝的乙酰CoA合酶、Δ-4-去飽和酶、Δ5-去飽和酶、Δ-6-去飽和酶和/或Δ-8-去飽和酶基因和/或Δ-5-延長酶、Δ-6-延長酶和/或Δ-9-延長酶基因或者其它涉及脂肪酸生物合成的基因。優(yōu)選在每一表達盒中僅存在一個拷貝的基因?？梢栽谒拗魃矬w中共同表達該基因構建體或這些基因構建體。關于這點，可以在一個或多個載體中插入基因構建體并且以游離形式存在于細胞中，或者插入基因組中。當需要表達的基因存在于一個基因構建體中時，優(yōu)選將其它基因插入宿主基因組中。關于這點，如上所述，調(diào)節(jié)序列或因子可以優(yōu)選對引入基因的基因表達起正效應，因此增強該基因的表達。因此，可以通過使用諸如啟動子和/或增強子等強轉錄信號使調(diào)節(jié)元件增強，優(yōu)選在轉錄水平上發(fā)生。然而，此外，例如通過提高mRNA的穩(wěn)定性還可以增強翻譯。新方法中的優(yōu)選調(diào)節(jié)序列存在于啟動子中并且優(yōu)選在革蘭氏陰性細菌中使用，所述啟動子例如是cos、tac、trp、tet、trp-tet、lpp、lac、lpp-lac、lacIq、T7、T5、T3、gal、trc、ara、SP6、λ-PR和λ-PL啟動子。其它優(yōu)選的調(diào)節(jié)序列例如存在于革蘭氏陽性啟動子amy和SPO2中、酵母和真菌啟動子ADC1、MFα、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADH中或者植物啟動子CaMV/35S[Francketal.，Cell21(1980)285-294]、PRP1[Wardetal.，Plant.Mol.Biol.22(1993)]、SSU、OCS、lib4、usp、STLS1、B33、nos中或者泛素或菜豆蛋白啟動子中。關于這點，還優(yōu)選誘導型啟動子，例如EP-A-0388186(芐基磺酰胺誘導型)、PlantJ.2，1992397-404(Gatzetal，四環(huán)素誘導型)、EP-A-0335528(脫落酸誘導型)或WO93/21334(乙醇或環(huán)己醇誘導型)中描述的啟動子。其它合適的植物啟動子是馬鈴薯的細胞質(zhì)FBP酶啟動子或ST-LSI啟動子(Stockhausetal.，EMBOJ.8，1989，2445)、大豆磷酸核糖焦磷酸氨基轉移酶啟動子(GenbankAccessionNo.U87999)或EP-A-0249676中所述的節(jié)特異性啟動子。尤其優(yōu)選的啟動子是可以在涉及脂肪酸生物合成的組織中表達的啟動子。尤其特別優(yōu)選的是種子特異性啟動子，例如所述的USP啟動子，但是也可以是其它啟動子，例如LeB4、DC3、菜豆蛋白(phaseolin)或napin啟動子。其它尤其優(yōu)選的啟動子是可以用于單子葉或雙子葉植物的種子特異性啟動子以及US5,608,152(油菜napin啟動子)、WO98/45461(擬南芥油體蛋白(oleosin)啟動子)、US5,504,200(菜豆菜豆蛋白啟動子)、WO91/13980(蕓苔屬Bce4啟動子)、Baeumleinetal.，PlantJ.，2，2，1992233-239(來自豆類的LeB4啟動子)中所述的啟動子，這些啟動子適于雙子葉植物。適于單子葉植物的啟動子的實例是大麥lpt-2或lpt-1啟動子(WO95/15389和WO95/23230)、WO99/16890中所述的大麥大麥醇溶蛋白(hordein)啟動子和其它合適的啟動子。大體而言，可以將所有天然啟動子及其調(diào)節(jié)序列用于本發(fā)明的新方法中，例如上述所述的那些啟動子。還可以并且優(yōu)選附加或者單獨使用合成啟動子，特別是當它們介導種子特異性表達時，例如WO99/16890中所述的那些啟動子。為了實現(xiàn)特別高的PUFA含量，尤其是在轉基因植物中實現(xiàn)，應該優(yōu)選以種子特異的方式在油料作物中表達PUFA生物合成基因。為此，可以使用種子特異性啟動子，或者使用在胚和/或胚乳中活躍的啟動子。大體而言，可以從雙子葉植物和單子葉植物中分離種子特異性啟動子。優(yōu)選的啟動子如下USP(＝未知的種子蛋白質(zhì))和豌豆球蛋白(蠶豆)[Baumleinetal.，Mol.GenGenet.，1991，225(3)]、napin(油菜)[US5,608,152]、乙酰載體蛋白(油菜)[US5,315,001和WO92/18634]、油體蛋白(擬南芥)[WO98/45461和WO93/20216]、菜豆蛋白(菜豆)[US5,504,200]、Bce4[WO91/13980]、豆類B4(LegB4啟動子)[Baumleinetal.，PlantJ.，2，2，1992]、Lpt2和lpt1(大麥)[WO95/15389和WO95/23230]、來自水稻、玉米和小麥的種子特異性啟動子[WO99/16890]、Amy32b、Amy6-6和aleurain[US5,677,474]、Bce4(油菜)[US5,530,149]、大豆球蛋白(大豆)[EP571741]、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(大豆)[JP06/62870]、ADR12-2(大豆)[WO98/08962]、異檸檬酸裂解酶(油菜)[US5,689,040]或α-淀粉酶(大麥)[EP781849]?？梢酝ㄟ^化學誘導型啟動子促進植物基因表達(參見綜述Gatz1997，Annu.Rev.PlantPhysiol.PlantMol.Biol.，4889-108)。當期望以時間特異性的方式進行基因表達時，化學誘導型啟動子是特別適合的。這樣的啟動子的實例是水楊酸誘導型啟動子(WO95/19443)、四環(huán)素誘導型啟動子(Gatzetal.(1992)PlantJ.2，397-404)以及乙醇誘導型啟動子。為了確保在若干代內(nèi)生物合成基因向轉基因植物中穩(wěn)定的整合，本發(fā)明方法中所使用的編碼乙酰CoA合酶、Δ-4-去飽和酶、Δ5-去飽和酶、Δ-6-去飽和酶、Δ-8-去飽和酶基因和/或Δ-5-延長酶、Δ-6-延長酶和/或Δ-9-延長酶的每一核酸都應該在單獨啟動子的控制下表達，優(yōu)選在不同于其它啟動子的啟動子的控制下表達，因為重復的序列基元可以導致T-DNA的不穩(wěn)定，并且導致重組事件。關于這點，優(yōu)選按如下方式構建表達盒啟動子之后具有優(yōu)選為多克隆位點接頭(poly-linker)的合適切割位點，用于插入需要表達的核酸，并且如果合適，終止子位于多克隆位點接頭之后。該序列重復若干次，優(yōu)選重復3次、4次或5次，以便在一個構建體中組合多達5個的基因并將這多達5個的基因引入轉基因植物中以便被表達。優(yōu)選地，序列被重復多達3次。為了表達所述核酸序列，通過合適的切割位點，例如多克隆位點接頭中的切割位點，將后者插在啟動子之后。優(yōu)選每一核酸序列具有其自己的啟動子并且如果合適，具有其自己的終止子。然而，有可能在啟動子之后插入多個核酸序列并且如果合適，插入在終止子之前。此處，被插入的核酸在表達盒中的插入位點或序列并不十分重要，也就是說該核酸序列可被插入表達盒的第一個或最后一個位置而并不嚴重影響其表達。優(yōu)選在表達盒中使用不同的啟動子和不同的終止子，所述啟動子例如是USP、LegB4或DC3啟動子。然而，可以在表達盒中只使用一種類型的啟動子。然而這可能導致不希望的重組事件。如上所述，應該優(yōu)選在被引入的生物合成基因的3’末端(終止密碼子之后)使用合適的終止子來中止被引入基因的轉錄。關于這點中使用的序列的實例是OCS1終止子。與啟動子的情況一樣，對于每一基因應該使用不同的終止子序列。如上所述，所述基因構建體還可以包含需要被引入生物體中的其它基因?？梢圆⑶覂?yōu)選向宿主生物體引入并表達調(diào)節(jié)基因，例如由于其酶活性，參與調(diào)節(jié)生物合成途徑的一種或多種基因的誘導物、抑制物或酶的基因。這些基因可以是異源的或同源的。此外，優(yōu)選在核酸構建體或基因構建體中存在脂肪酸或脂質(zhì)代謝的其它生物合成基因；然而，這些基因還可以位于一種或其它核酸構建體上。優(yōu)選使用的脂肪酸或脂質(zhì)代謝的生物合成基因選自下列基因乙酰CoA脫氫酶、乙酰ACP[＝乙酰載體蛋白]去飽和酶、乙酰ACP硫酯酶、脂肪酸乙酰轉移酶、乙酰CoA溶血磷脂乙酰轉移酶、脂肪酸合酶、脂肪酸羥化酶、乙酰輔酶A羧化酶、乙酰輔酶A氧化酶、脂肪酸去飽和酶、脂肪酸acetylenases、脂氧合酶、三酰甘油脂酶、丙二烯氧化物合酶、過氧化氫物裂合酶或者脂肪酸延長酶或其組合。與本發(fā)明的核酸組合的特別優(yōu)選的核酸序列是選自乙酰CoA溶血磷脂乙酰轉移酶、Δ-4-去飽和酶、Δ-5-去飽和酶、Δ-6-去飽和酶、Δ-8-去飽和酶、Δ-9-去飽和酶、Δ-12-去飽和酶、Δ-5-延長酶、Δ-6-延長酶或Δ-9-延長酶的脂肪酸或脂質(zhì)代謝的生物合成基因。關于這點，可以將與其它延長酶和去飽和酶組合的將上述核酸克隆到本發(fā)明的表達盒中并且借助于農(nóng)桿菌可以將上述核酸用于轉化植物。此處，如上所述，所述調(diào)節(jié)序列或因子可以優(yōu)選對引入基因的表達起正效應，并且因此增強該基因的表達。因此，可以通過使用諸如啟動子和/或增強子等強轉錄信號，優(yōu)選地在轉錄水平上增強調(diào)節(jié)元件。然而，例如通過提高mRNA的穩(wěn)定性還可以增強翻譯。大體而言，可以直接向植物或者載體中引入所述表達盒。這些有利的載體，優(yōu)選表達載體，包含編碼溶血磷脂酸乙酰轉移酶、甘油-3-磷酸乙酰轉移酶、二酰甘油乙酰轉移酶或卵磷脂膽固醇乙酰轉移酶以及在本發(fā)明方法中使用的核酸，或者包含單獨使用的或與脂肪酸或脂質(zhì)代謝的其它生物合成基因組合使用的核酸的核酸構建體，所述生物合成基因例如是乙酰CoA溶血磷脂乙酰轉移酶、Δ-4-去飽和酶、Δ-5-去飽和酶、Δ-6-去飽和酶、Δ-8-去飽和酶、Δ-9-去飽和酶、Δ-12-去飽和酶、Δ-5-延長酶、Δ-6-延長酶和/或Δ-9-延長酶。就此而言，術語“載體”指能夠轉運與其結合的另一核酸的核酸分子。一種類型的載體是“質(zhì)?！保錇榭梢赃B接其它DNA片段的環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)。另一種類型的載體是病毒載體，有可能將其它DNA片段連接到病毒的基因組中。某些載體能夠在其被引入的宿主細胞內(nèi)自主復制(例如具有細菌復制起點的細菌載體)。其它載體被引入宿主細胞時，其優(yōu)選地整合入宿主細胞的基因組中，并且因此以宿主基因組一起復制。此外，某些載體可以控制與其功能性連接的基因的表達。就此而言，這些載體指“表達載體”。通常，適于DNA重組技術的表達載體使用質(zhì)粒。在本說明書中，“質(zhì)?！焙汀拜d體”可以互換使用，因為質(zhì)粒是最常使用的載體。然而，本發(fā)明旨在包括具有類似功能的其它形式的表達載體，例如病毒載體。此外，術語“載體”還旨在包括本領域技術人員熟悉的其它載體，例如噬菌體，諸如SV40、CMV、TMV等病毒，轉座子，IS元件，噬粒(phasmids)，噬粒(phagemids)，黏粒，線性或環(huán)狀DNA。本發(fā)明的方法中優(yōu)選使用的重組表達載體包括適于表達宿主細胞中所使用核酸的形式的下述核酸或上述基因構建體，意思是重組表達載體包括基于用于表達的宿主細胞所選擇的一種或多種調(diào)節(jié)序列，該調(diào)節(jié)序列與需要表達的核酸序列功能性地連接。在重組表達載體中，“功能性地連接”意思是感興趣的核苷酸序列以使該核苷酸序列能夠表達的方式與調(diào)節(jié)序列連接，并且它們相互連接的方式使得兩個序列都實施該序列所具有的預定功能(例如在體外轉錄/翻譯體系中，或者如果將載體引入宿主細胞的話，在宿主細胞中)。術語“調(diào)節(jié)序列”旨在包括啟動子、增強子和其它表達控制元件(例如多腺苷酸化信號)。下列文獻及其參考文獻中描述了這些調(diào)節(jié)序列GoeddelGeneExpressionTechnologyMethodsinEnzymology185(基因表達技術酶學中的方法185)，AcademicPress，SanDiego，CA(1990)，或者參見GruberandCrosby，MethodsinPlantMolecularBiologyandBiotechnology(植物分子生物學和生物技術的方法)，CRCPress，BocaRaton，F(xiàn)lorida，Ed.GlickandThompson，Chapter7，89-108。調(diào)節(jié)序列包括那些在多種類型的宿主細胞中控制核苷酸序列的組成型表達的序列以及那些僅在特定條件下在特定宿主細胞中控制核苷酸序列的直接表達的序列。本領域技術人員已知可以根據(jù)諸如需要轉化的宿主細胞、期望蛋白質(zhì)的表達水平等因素來設計表達載體?？梢栽谠思毎蛘婧思毎袑⒅亟M表達載體設計為單獨表達本發(fā)明的核酸或者組合表達本發(fā)明的核酸和其它編碼脂肪酸合成的酶，該酶例如是溶血磷脂酸乙酰轉移酶、甘油-3-磷酸乙酰轉移酶、二酰甘油乙酰轉移酶或卵磷脂膽固醇乙酰轉移酶、乙酰CoA溶血磷脂乙酰轉移酶、去飽和酶和延長酶。這是優(yōu)選的，因為為了簡單起見，通常在微生物中進行載體構建的中間步驟。例如可以在細菌細胞、昆蟲細胞(使用桿狀病毒(Baculovirus)表達載體)、酵母和其它真菌細胞(參見Romanos，M.A.，etal.(1992)“Foreigngeneexpressioninyeastareview”(酵母中外源基因的表達綜述)，Yeast8423-488；vandenHondel，C.A.M.J.J.，etal.(1991)“Heterologousgeneexpressioninfilamentousfungi”(絲狀真菌中異源基因的表達)；MoreGeneManipulationsinFungi(真菌中多基因操控)，J.W.Bennet&L.L.Lasure，Ed.，pp.396-428AcademicPressSanDiego；andvandenHondel，C.A.M.JJ.，&Punt，PJ.(1991)“Genetransfersystemsandvectordevelopmentforfilamentousfungi”(絲狀真菌的基因轉移系統(tǒng)和載體發(fā)展)；AppliedMolecularGeneticsofFungi(真菌的應用分子遺傳學)，Peberdy，J.F.，etal.，Ed.，pp.1-28，CambridgeUniversityPressCambridge)、藻類(Falciatoreetal.，1999，MarineBiotechnology.1，3239-251)、多種纖毛蟲類全毛亞綱、緣毛亞綱、旋唇亞綱、吸管亞綱、四膜蟲屬、草履蟲屬、豆形蟲屬、Glaucoma、Platyophrya、Potomacus、Desaturaseudocohnilembus、Euplotes、Engelmaniella和Stylonychia中，尤其是Stylonychialemnae中，使用如WO98/01572中所述的轉化方法中的載體，優(yōu)選在多細胞植物的細胞中(參見Schmidt，R.andWillmitzer，L.(1988)“HighefficiencyAgrobacteriumtumefaciens-mediatedtransformationofArabidopsisthalianaleafandcotyledonexplants”(高效的擬南芥葉和子葉外植體的根癌農(nóng)桿菌介導的轉化)PlantCellRep.583-586；PlantMolecularBiologyandBiotechnology(植物分子生物學和生物技術)，CPress，BocaRaton，F(xiàn)lorida，Chapter6/7，pp.71-119(1993)；F.F.White，B.Jenesetal.，TechniquesforGeneTransfer(基因轉移技術)；TransgenicPlants，Vol.1，EngineeringandUtilization(轉基因植物，卷1，工程化和利用)，Ed.KungandR.Wu，AcademicPress(1993)，128-43；Potrykus，Annu.Rev.PlantPhysiol.PlantMolec.Biol.42(1991)，205-225(以及其中引用的參考文獻))表達溶血磷脂酸乙酰轉移酶、甘油-3-磷酸乙酰轉移酶、二酰甘油乙酰轉移酶、卵磷脂膽固醇乙酰轉移酶、乙酰CoA溶血磷脂乙酰轉移酶、去飽和酶和/或延長酶基因。Goeddel，GeneExpressionTechnologyMethodsinEnzymology185(基因表達技術酶學中的方法185)，AcademicPress，SanDiego，CA(1990)中討論了合適的宿主細胞。或者，所述重組表達載體可以在體外轉錄和翻譯，例如使用T7-啟動子調(diào)節(jié)序列和T7-聚合酶。在大多數(shù)情況下，原核細胞中蛋白質(zhì)的表達涉及使用包含控制融合或非融合蛋白質(zhì)表達的組成型或誘導型啟動子的載體。通常的融合表達載體是，尤其是pGEX(PharmaciaBiotechInc；Smith，D.B.，andJohnson，K.S.(1988)Gene6731-40)、pMAL(NewEnglandBiolabs，Beverly，MA)和pRIT5(Pharmacia，Piscataway，NJ)，其中谷胱甘肽S-轉移酶、麥芽糖-E結合蛋白和蛋白A分別與重組靶蛋白融合。合適的誘導型非融合E.coli表達載體是并且尤其是pTrc(Amannetal.(1988)Gene69301-315)和pET11d(Studieretal.，GeneExpressionTechnologyMethodsinEnzymology185(基因表達技術酶學中的方法185)，AcademicPress，SanDiego，California(1990)60-89)。來自pTrc載體的靶基因表達是通過宿主RNA聚合酶，基于來自雜交trp-lac融合啟動子的轉錄。來自pET11d載體的靶基因表達是基于T7-gnl0-lac融合啟動子的轉錄，該轉錄是共表達的病毒RNA聚合酶(T7gnl)介導的。該病毒聚合酶由宿主株BL21(DE3)或HMS174(DE3)從常居λ-原噬菌體提供，該常居λ-原噬菌體具有處于lacUV5啟動子轉錄控制下的T7gnl基因。本領域技術人員已知適合原核生物的其它載體，這些載體是，例如在E.coli中，pLG338、pACYC184，例如pBR322等pBR系列、pUC系列例如pUC18或pUC19，M113mp系列、pKC30、pRep4、pHS1、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN-III113-B1、λgt11或pBdCI，在鏈霉菌屬(Streptomyces)中，pIJ101、pIJ364、pIJ702或pU361，在桿菌屬(Bacillus)中，pUB110、pC194或pBD214，在棒狀桿菌屬(Corynebacterium)中，pSA77或pAJ667。在另一實施方案中，表達載體是酵母表達載體。在酵母S.cerevisiae中表達的載體的實例包括pYeDesaturasecl(Baldarietal.(1987)EmboJ.6229-234)、pMFa(KurjanandHerskowitz(1982)Cell30933-943)、pJRY88(Schultzetal.(1987)Gene54113-123)和pYES2(InvitrogenCorporation，SanDiego，CA)。適合用于諸如絲狀真菌等其它真菌中的載體和這些載體的構建方法包括以下文獻中詳細描述的載體和方法vandenHondel，C.A.MJJ.，&Punt，PJ.(1991)“Genetransfersystemsandvectordevelopmentforfilamentousfungi”(絲狀真菌的基因轉移系統(tǒng)和載體發(fā)展)；AppliedMolecularGeneticsoffungi(真菌的應用分子遺傳學)，J.F.Peberdyetal.，Ed.，pp.1-28，CambridgeUniversityPressCambridge；或者MoreGeneManipulationsinFungi(真菌中的多基因操控)[J.W.Bennet&L.L.Lasure，Ed.，pp.396-428AcademicPressSanDiego]。其它合適的酵母載體例如有pAG-1、YEp6、YEp13或pEMBLYe23。或者，使用桿狀病毒表達載體，可以在昆蟲細胞中表達乙酰CoA合成酶、溶血磷脂酸乙酰轉移酶、甘油-3-磷酸乙酰轉移酶、二酰甘油乙酰轉移酶、卵磷脂膽固醇乙酰轉移酶、乙酰CoA溶血磷脂乙酰轉移酶、去飽和酶和/或延長酶?？梢栽谂囵B(yǎng)的昆蟲細胞(例如Sf9細胞)中表達蛋白質(zhì)的桿狀病毒載體包括pAc系列(Smithetal.(1983)Mol.CellBiol.32156-2165)和pVL系列(LucklowandSummers(1989)Virology17031-39)。上述載體只提供一小部分可能的合適載體。本領域技術人員已知其它的質(zhì)粒并且在下列文獻中有所描述例如CloningVectors(克隆載體)(Ed.Pouwels，P.H.，etal.，Elsevier，Amsterdam-NewYork-Oxford，1985，ISBN0444904018)。原核細胞和真核細胞的其它合適的表達系統(tǒng)參見Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.F.，andManiatis，T.，MolecularCloningALaboratoryManual，2ndedition(分子克隆實驗室手冊，第二版)，ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NY，1989中的第16章和第17章。在本發(fā)明方法的另一實施方案中，可以在單細胞植物的細胞(例如藻類)和來自高等植物的植物細胞(例如諸如可耕農(nóng)作物等種子植物)中表達乙酰CoA合成酶、溶血磷脂酸乙酰轉移酶、甘油-3-磷酸乙酰轉移酶、二酰甘油乙酰轉移酶、卵磷脂膽固醇乙酰轉移酶、乙酰CoA溶血磷脂乙酰轉移酶、去飽和酶和/或延長酶，參見Falciatoreetal.，1999，MarineBiotechnology1(3)239-251及其引用的參考文獻。植物表達載體的實例包括下列文獻中描述的那些表達載體Becker，D.，Kemper，E.，Schell，J.，andMasterson，R.(1992)“Newplantbinaryvectorswithselectablemarkerslocatedproximaltotheleftborder”(具有位于左邊界附近的可選標記的新植物雙元載體)，PlantMol.Biol.201195-1197；和Bevan，M.W.(1984)“BinaryAgrobacteriumvectorsforplanttransformation”(用于植物轉化的雙元農(nóng)桿菌載體)，Nucl.AcidsRes.128711-8721；VectorsforGeneTransferinHigherPlants(高等植物中的基因轉移載體)；TransgenicPlants，Vol.1，EngineeringandUtilization(轉基因植物，卷1，工程化和利用)，Ed.KungandR.Wu，AcademicPress，1993，pp.15-38。植物表達盒優(yōu)選包含能夠控制植物細胞中基因表達的調(diào)節(jié)序列并且所述調(diào)節(jié)序列功能性地連接，以便每一序列能夠實現(xiàn)其功能，例如轉錄中止，該轉錄中止例如是多腺苷酸化信號。優(yōu)選的多腺苷酸化信號是那些來自根癌農(nóng)桿菌T-DNA的多腺苷酸化信號或其功能性等價物，該多腺苷酸化信號例如是Ti質(zhì)粒pTiACH5的基因3(Gielenetal.，EMBOJ.3(1984)835etseq.)，其被稱為章魚堿合酶，但是植物中功能性活躍的所有其它終止子也是適合的。因為植物基因表達非常經(jīng)常地不限于轉錄水平，所以植物表達盒優(yōu)選包含功能性連接的其它序列，例如諸如超驅動序列的翻譯增強子，該超驅動序列包含煙草花葉病毒5’非翻譯前導序列，這提高了蛋白質(zhì)/RNA的比例(Gallieetal，1987，Nucl.AcidsResearch158693-8711)。如上所述，植物基因表達必須與合適的啟動子功能性地連接，該啟動子引發(fā)正確時間的或者細胞或組織特異方式的基因表達?？衫玫膯幼邮墙M成型啟動子(Benfeyetal.，EMBOJ.8(1989)2195-2202)，例如來自植物病毒的那些啟動子，例如35SCAMV(Francketal.，Cell21(1980)285-294)、19SCaMV(參見US5352605和WO84/02913)，或者植物啟動子，例如US4,962,028中所述的小核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶(rubisco)亞基。在植物基因表達盒中功能性連接所使用的其它優(yōu)選序列是操控基因產(chǎn)物進入其相應細胞區(qū)室所必須的靶向序列(參見綜述Kermode，Crit.Rev.PlantSci.15，4(1996)285-423及其引用的參考文獻)，所述細胞區(qū)室例如是液泡、細胞核、所有類型的質(zhì)體以及植物細胞的其它區(qū)室，所述質(zhì)體例如是造粉體、葉綠體、色質(zhì)體、細胞外間隙、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、油質(zhì)體、過氧化物酶體。如上所述，可以通過化學誘導型啟動子促進植物基因表達(參見綜述Gatz1997，Annu.Rev.PlantPhysiol.PlantMoI.Biol.，4889-108)。當需要基因表達以時間特異性方式發(fā)生時，化學誘導型啟動子是特別合適的。這樣的啟動子的實例是水楊酸誘導型啟動子(WO95/19443)、四環(huán)素誘導型啟動子(Gatzetal.(1992)PlantJ.2，397-404)和乙醇誘導型啟動子。響應生物或非生物逆境條件的啟動子也是適合的，例如病原體誘導的PRPl基因啟動子(Wardetal.，Plant.MoI.Biol.22(1993)361-366)、熱誘導型番茄hsp80啟動子(US5,187,267)、寒冷誘導型馬鈴薯α-淀粉酶啟動子(WO96/12814)或者創(chuàng)傷誘導型pinII啟動子(EP-A-0375091)。特別優(yōu)選的是那些引起特定組織和器官中基因表達的啟動子，該特定組織和器官中發(fā)生脂肪酸、脂質(zhì)和油類的生物合成，在種子細胞中，例如是胚乳細胞和正在發(fā)育的胚細胞。合適的啟動子是油菜napin基因啟動子(US5,608,152)、蠶豆USP啟動子(Baeumleinetal.，MoIGenGenet，1991，225(3)459-67)、擬南芥油體蛋白啟動子(WO98/45461)、菜豆(Phaseolusvulgaris)菜豆蛋白啟動子(US5,504,200)、蕓苔(Brassica)Bce4啟動子(WO91/13980)或豆球蛋白B4啟動子(LeB4；Baeumleinetal.，1992，PlantJournal，2(2)233-9)，以及在單子葉植物中引起種子特異性表達的啟動子，所述單子葉植物例如是玉米、大麥、小麥、黑麥、水稻等。合適的值得注意的啟動子是大麥lpt2或lpt1基因啟動子(WO95/15389andWO95/23230)或者WO99/16890中描述的來自大麥大麥醇溶蛋白基因、水稻谷蛋白基因、水稻oryzin基因、水稻谷醇溶蛋白基因、小麥麥醇溶蛋白(gliadine)基因、小麥谷蛋白基因、玉米玉米醇溶蛋白(zeine)基因、燕麥谷蛋白基因、高粱kasirin基因或黑麥黑麥堿(secalin)基因的啟動子。特別地，可能需要引起乙酰CoA合酶、溶血磷脂酸乙酰轉移酶、甘油-3-磷酸乙酰轉移酶、二酰甘油乙酰轉移酶或卵磷脂膽固醇乙酰轉移酶的多平行表達，其在本發(fā)明方法中單獨使用，或者與乙酰CoA溶血磷脂乙酰轉移酶、去飽和酶和/或延長酶組合使用?？梢酝ㄟ^多個單獨的表達構建體的同時轉化或者優(yōu)選通過在一個構建體上組合多個表達盒來引入所述表達盒。此外，在每種情況下，可以使用多個表達盒轉化多個載體，然后轉移入宿主細胞。同樣特別合適的啟動子是那些引起質(zhì)體特異性表達的啟動子，因為質(zhì)體構成合成脂質(zhì)生物合成的前體和某些終產(chǎn)物的區(qū)室。WO95/16783和WO97/06250中描述了合適的啟動子，例如病毒RNA聚合酶啟動子，并且WO99/46394中描述了來自擬南芥的clpP啟動子。可以通過常規(guī)的轉化或轉染技術將載體DNA引入至原核細胞或真核細胞中。此處使用的術語“轉化”和“轉染”，接合和轉導旨在包括將外源核酸(例如DNA)引入宿主細胞的本領域已知的多種方法，其包括磷酸鈣或氯化鈣共沉淀、DEAE-葡聚糖介導的轉染、脂轉染、天然感受態(tài)、化學介導的轉移、電穿孔或粒子轟擊?？梢栽赟ambrooketal.(MolecularCloningALaboratoryManual，2nded.(分子克隆實驗室手冊，第二版)，ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NY，1989)和其它實驗室教科書中找到轉化或轉染包括植物細胞在內(nèi)的宿主細胞的合適方法，所述實驗室教科書例如是MethodsinMolecularBiology(分子生物學的方法)，1995，Vol.44，Agrobacteriumprotocols(農(nóng)桿菌實驗方案)，Ed.GartlandandDavey，HumanaPress，Totowa，NewJersey。大體適合接納本發(fā)明的核酸、本發(fā)明的基因產(chǎn)物或本發(fā)明的載體的宿主細胞是所有的原核生物和真核生物。優(yōu)選使用的宿主生物體是諸如真菌或酵母等微生物或植物細胞，優(yōu)選植物或其部分。優(yōu)選使用真菌、酵母或植物，特別優(yōu)選植物，尤其特別優(yōu)選諸如含有大量脂質(zhì)化合物的油料作物植物的植物，例如油菜、月見草、大麻、薊、花生、雙低油菜、亞麻子、大豆、紅花、向日葵、琉璃苣，或下列植物玉米、小麥、黑麥、燕麥、黑小麥、水稻、大麥、棉花、木薯、胡椒、萬壽菊，茄科植物，例如馬鈴薯、煙草、茄子和番茄，野豌豆屬，豌豆，苜蓿，灌木植物(咖啡樹、可可樹、茶樹)，柳屬，樹(油椰、椰子)以及多年生牧草和飼料作物。本發(fā)明尤其優(yōu)選的植物是油料作物植物，例如大豆、花生、油菜、雙低油菜、亞麻子、大麻、月見草、向日葵、紅花、樹(油椰、椰子)。本發(fā)明的上述核酸來自能夠合成PUFA的生物體，例如動物、纖毛蟲、真菌、植物，所述植物例如是藻類或溝鞭藻類。在優(yōu)選實施方案中，此處使用的術語“核酸(分子)”還包括編碼基因區(qū)域的3’和5’末端的非翻譯序列編碼區(qū)的5’末端的序列上游的至少500個、優(yōu)選200個、特別優(yōu)選100個核苷酸以及編碼區(qū)的3’末端的序列下游的至少100個、優(yōu)選50個、特別優(yōu)選20個核苷酸?！胺蛛x的”核酸分子是從存在于所述核酸天然來源之中的其它核酸分子分離的。“分離的”核酸優(yōu)選不具有在特定生物體的基因組DNA中天然地從兩端夾住所述核酸的序列(例如位于所述核酸的5’和3’末端的序列)，所述核酸來自該特定生物體。在各種實施方案中，分離的乙酰CoA合成酶、溶血磷脂酸乙酰轉移酶、甘油-3-磷酸乙酰轉移酶、二酰甘油乙酰轉移酶和/或卵磷脂膽固醇乙酰轉移酶分子可以包含少于約5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的在特定細胞的基因組DNA中天然地從兩端夾住所述核酸分子的核苷酸序列，所述核酸來自該特定細胞。在本發(fā)明的方法中，將上述核酸分子和具有涉及脂質(zhì)和脂肪酸代謝、PUFA輔助因子和酶或者涉及親脂化合物跨膜轉運的乙酰CoA合成酶、溶血磷脂酸乙酰轉移酶、甘油-3-磷酸乙酰轉移酶、二酰甘油乙酰轉移酶或卵磷脂膽固醇乙酰轉移酶活性的蛋白質(zhì)分子用于本發(fā)明方法中以調(diào)節(jié)PUFA在轉基因生物體中的生產(chǎn)，優(yōu)選在植物中，例如玉米，小麥，黑麥，燕麥，黑小麥，水稻，大麥，大豆，花生，棉花，亞麻屬，例如亞麻子或亞麻，蕓苔屬，例如油菜、雙低油菜和蕪箐，胡椒，向日葵，琉璃苣，月見草和萬壽菊，茄科植物，例如馬鈴薯、煙草、茄子和番茄，野豌豆屬，豌豆，木薯，苜蓿，灌木植物(咖啡樹、可可樹、茶樹)，柳屬，樹(油椰、椰子)以及多年生牧草和飼料作物，所述調(diào)節(jié)可以是直接的(例如當脂肪酸生物合成蛋白的過量表達或最優(yōu)化對來自經(jīng)修飾生物體的脂肪酸的產(chǎn)率、生產(chǎn)和/或生產(chǎn)效率具有直接的影響時)和/或可以具有間接影響，其仍然會導致PUFA的產(chǎn)率、生產(chǎn)和/或生產(chǎn)效率增加或者不希望的化合物的減少(例如當脂質(zhì)和脂肪酸代謝、PUFA輔助因子和酶的調(diào)節(jié)導致細胞中期望化合物的產(chǎn)率、生產(chǎn)和/或生產(chǎn)效率或組分的調(diào)節(jié)時，其會導致影響一種或多種脂肪酸的產(chǎn)生)。多種前體分子和生物合成酶的組合導致產(chǎn)生多種脂肪酸分子，其對脂質(zhì)組分具有決定性的影響，因為多不飽和脂肪酸(＝PUFA)不僅結合入三酰甘油而且還結合入膜脂?？梢詫⒅|(zhì)合成分成兩部分脂肪酸的合成及其與sn-3-磷酸甘油的結合，以及極性頭部基團的加入或修飾。膜中使用的通常的脂質(zhì)包括磷脂類、糖脂類、神經(jīng)鞘脂類和磷酸甘油酯。通過乙酰CoA羧化酶將乙酰CoA轉化為丙二酸單酰CoA或通過乙酰轉酰基酶轉化為乙酰ACP而開始脂肪酸的合成?？s合反應后，這兩種產(chǎn)物分子共同形成乙酰乙?；鵄CP，該乙酰乙酰基ACP通過一系列縮合、還原和脫水反應轉化，以便得到具有期望鏈長的飽和脂肪酸分子。通過特異性去飽和酶，藉分子氧好氧地或厭養(yǎng)地催化來自這些分子的不飽和脂肪酸的產(chǎn)生(關于微生物中脂肪酸的合成，參見F.C.Neidhardtetal.(1996)E.coliandSalmonella(大腸埃希桿菌和沙門氏菌).ASMPressWashington，D.C，pp.612-636及其引用的參考文獻；Lengeleretal.(Ed.)(1999)BiologyofProcaryotes(原核生物生物學).ThiemeStuttgart，NewYork，及其引用的參考文獻，以及Magnuson，K.，etal.(1993)MicrobiologicalReviews57522-542及其引用的參考文獻)。為了進行進一步的延長步驟，必須使所得的磷脂結合的脂肪酸從磷脂中回到脂肪酸CoA酯的池中。這可以通過乙酰CoA溶血磷脂乙酰轉移酶進行。此外，這些酶能夠將延長的脂肪酸從CoA酯轉移回磷脂。如果合適，該反應順序可以重復進行。PUFA生物合成前體的實例是油酸、亞油酸和亞麻酸。必須將這些C18-碳脂肪酸延長至C20和C22以便得到二十和二十二個碳鏈類型的脂肪酸。借助于所述方法中使用的溶血磷脂酸乙酰轉移酶、甘油-3-磷酸乙酰轉移酶、二酰甘油乙酰轉移酶或卵磷脂膽固醇乙酰轉移酶，優(yōu)選與乙酰CoA溶血磷脂乙酰轉移酶、諸如Δ-4-、Δ-5-、Δ-6-和Δ-8-去飽和酶等去飽和酶和/或Δ-5-、Δ-6-和Δ-9-延長酶組合，可以得到、提取并用于食料、飼料、化妝品或藥物等多種應用的花生四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸或二十二碳六烯酸和多種其它長鏈PUFA。優(yōu)選地，可以使用上述酶制備在脂肪酸分子中含有至少2個雙鍵的C18-、C20-、C22-和/或C24-脂肪酸，優(yōu)選含有3個、4個、5個或6個雙鍵，以優(yōu)選提供在脂肪酸分子中優(yōu)選含有3個、4個或5個雙鍵的C20-、C22-和/或C24-脂肪酸。去飽和可以發(fā)生在所討論的脂肪酸的延長之前或之后。這就是去飽和酶活性的產(chǎn)物和其它可能的去飽和和延長步驟導致具有高不飽和度的優(yōu)選PUFA的原因，包括由C20-脂肪酸進一步延長為C22-脂肪酸、諸如γ-亞麻酸、二高-γ-亞麻酸、花生四烯酸、十八碳四烯酸、二十碳四烯酸或二十碳五烯酸等脂肪酸。本發(fā)明方法中溶血磷脂酸乙酰轉移酶、甘油-3-磷酸乙酰轉移酶、二酰甘油乙酰轉移酶或卵磷脂膽固醇乙酰轉移酶的底物是C18-、C20-、C22-脂肪酸，例如亞油酸、γ-亞麻酸、α-亞麻酸、二高-γ-亞麻酸、二十碳四烯酸或十八碳四烯酸。優(yōu)選的底物是亞油酸、γ-亞麻酸和/或α-亞麻酸、二高-γ-亞麻酸、花生四烯酸、二十碳四烯酸或十八碳四烯酸。在本發(fā)明的方法中得到游離脂肪酸形式或其酯類形式的在脂肪酸中具有至少2個雙鍵的C18-、C20-、C22-脂肪酸，所述酯類形式例如三酰甘油形式?？梢詫⑿g語“甘油酯”理解為甘油與一個、兩個或三個羧基基團酯化(甘油一酯、甘油二酯或甘油三酯)。還可以將“甘油酯”理解為多種甘油酯的混合物。甘油酯或甘油酯混合物還可以包含其它添加物，例如游離脂肪酸、抗氧化劑、蛋白質(zhì)、碳水化合物、維生素和/或其它物質(zhì)。為了本發(fā)明方法的目的，還可以將“甘油酯”理解為甘油衍生物。除了上述脂肪酸甘油酯以外，還包括甘油磷脂類和甘油糖脂類。關于此可以提及的優(yōu)選實例是甘油磷脂類，例如卵磷脂(磷脂酰膽堿)、心磷脂、磷脂酰甘油、磷脂酰絲氨酸和烷基?；视土字?。此外，隨后必須將脂肪酸轉移至多種修飾位點并結合入三酰甘油貯存脂質(zhì)中。脂質(zhì)合成中另一重要步驟是例如通過甘油脂肪酸乙酰轉移酶將脂肪酸轉移至極性頭部基團(參見Frentzen，1998，Lipid，100(4-5)161-166)。關于植物脂肪酸生物合成和去飽和、脂質(zhì)代謝和脂質(zhì)化合物的膜轉運、β-氧化、脂肪酸的修飾和輔助因子、三酰甘油的貯存和三酰甘油的組裝的出版物及其引用的參考文獻，參看以下文獻Kinney，1997，GeneticEngineering(基因工程)，Ed.JKSetlow，19149-166；OhlroggeandBrowse，1995，PlantCell7957-970；ShanldinandCahoon，1998，Annu.Rev.PlantPhysiol.PlantMol.Biol.49611-641；Voelker，1996，GeneticEngineering(基因工程)，Ed.JKSetlow，18111-13；Gerhardt，1992，Prog.LipidR.31397-417；Gühnemann-Schfer&Kind1，1995，Biochim.BiophysActa1256181-186；Kunauetal，1995，Prog.LipidRes.34267-342；Stymneetal.，1993，BiochemistryandMolecularBiologyofMembraneandStorageLipidsofPlants(植物的膜和貯存脂質(zhì)的生物化學與分子生物學)，Ed.MurataandSomerville，Rockville，AmericanSocietyofPlantPhysiologists，150-158，Murphy&Ross1998，PlantJournal.13(1)1-16。本發(fā)明方法中產(chǎn)生的PUFA包括高等動物不能合成的并且因此必須補充的分子，或者高等動物不能合成足夠量的并且因此必須補充額外量的分子，雖然諸如細菌等其它生物體容易地合成上述分子，而諸如貓等生物體卻不能合成花生四烯酸。為了本發(fā)明的目的，術語“乙酰CoA合成酶、溶血磷脂酸乙酰轉移酶、甘油-3-磷酸乙酰轉移酶、二酰甘油乙酰轉移酶或卵磷脂膽固醇乙酰轉移酶”包括參與脂肪酸及其同系物、衍生物和類似物生物合成的蛋白質(zhì)。為了本發(fā)明的目的，可以將磷脂類理解為磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰甘油和/或磷脂酰肌醇，優(yōu)選磷脂酰膽堿。術語溶血磷脂酸乙酰轉移酶、甘油-3-磷酸乙酰轉移酶、二酰甘油乙酰轉移酶或卵磷脂膽固醇乙酰轉移酶核酸序列包括編碼溶血磷脂酸乙酰轉移酶、甘油-3-磷酸乙酰轉移酶、二酰甘油乙酰轉移酶或卵磷脂膽固醇乙酰轉移酶的核酸序列，并且其部分可以是編碼區(qū)也可以是相應的5’和3’非翻譯序列區(qū)域。術語生產(chǎn)(production)和生產(chǎn)率(productivity)為本領域已知并且其包括在特定時間段內(nèi)和特定發(fā)酵體積中(例如kg產(chǎn)物/小時·升)發(fā)酵產(chǎn)物(式I化合物)的濃度。術語生產(chǎn)效率(productionefficiency)包括獲得特定生產(chǎn)量所需要的時間(例如通過細胞實現(xiàn)精細化學物質(zhì)的一定生產(chǎn)速度所需要的時間)。術語產(chǎn)率(yield)或產(chǎn)物/碳產(chǎn)率為本領域已知并且其包括將碳源轉化為產(chǎn)物(即所述精細化學物質(zhì))的效率。通常將其表示為kg產(chǎn)物/kg碳源。通過提高所述化合物的產(chǎn)率或生產(chǎn)，增加了在特定時間段內(nèi)，在特定培養(yǎng)物數(shù)量中獲得的所述化合物或該化合物的合適分子的數(shù)量。術語生物合成或生物合成途徑為本領域已知并且其包括通過細胞從中間體合成化合物，例如在多步和嚴格調(diào)節(jié)的方法中，所述化合物優(yōu)選有機化合物。術語分解代謝和分解代謝的途徑為本領域已知并且其包括通過細胞裂解化合物以產(chǎn)生分解代謝產(chǎn)物(在更通常的術語中，指小分子或復雜程度更低的分子)，例如在多步和嚴格調(diào)節(jié)的方法中，所述化合物優(yōu)選有機化合物。術語新陳代謝為本領域已知并且其包括發(fā)生在生物體中的全部生物化學反應。因此，某種化合物的新陳代謝(例如脂肪酸的新陳代謝)包括與該化合物相關的細胞中的該化合物的全部生物合成途徑、修飾途徑和分解代謝途徑。引入本專利申請中引用的全部參考文獻、專利申請、專利和公開的專利申請的內(nèi)容作為參考。在說明書和權利要求書中，詞語“包含(comprise)”和“含有(contain)”及其變化，例如“comprising”和“comprises”指“包括但不限于”，并且并不意謂(并且并不)排除其它部分、添加物、組分、整數(shù)或步驟。在說明書和權利要求書中，除非上下文另有需要，單數(shù)包括復數(shù)。特別地，除非上下文另有需要，當使用不定冠詞時，應將所指明的事項理解為包括復數(shù)和單數(shù)。應當理解，與本發(fā)明的特定方面、實施方案或實例一道描述的特征、整數(shù)、特性、化合物、化學部分或基團也可以用于本文所述的任何其它方面、實施方案或實例，除非與之矛盾。現(xiàn)在僅通過實施例并參考以下附圖對本發(fā)明的實施方案進行描述圖1顯示TplacsA和TplacsI基因的RT-PCR的表達分析。收集不同生長階段的Thalassiosira細胞用于總RNA提取和cDNA合成。然后使用TplacsA和TplacsI特異性引物對，對不稀釋(泳道1)和五倍系列稀釋(泳道2-4)的每一cDNA進行PCR。18SrRNA基因用于cDNA合成的對照。括號中給出了每一基因座的特征片段的大小。圖2顯示從過量表達的Y00833轉化體的不含細胞的溶胞產(chǎn)物和Pseudomonassp.乙酰CoA合成酶(Sigma，PACS)中測定LACS酶特異性活性。與可商購的PACS平行，使用來自含有質(zhì)粒pYES2(對照)和pYLACSA的酵母的不含細胞的提取物作為體外LACS分析的酶源。每一值代表一通常實驗中兩份乙酰CoA樣品的平均值土標準偏差；以及圖3A顯示TpLACSA的核酸序列；并且圖3B顯示TpLACSA的氨基酸序列。材料與方法推定編碼長鏈乙酰CoA合酶的一組基因組DNA序列的鑒定硅藻T.pseudonana的基因組草圖已經(jīng)采用全基因組鳥槍法測序至大約9倍的覆蓋度。未加工的序列數(shù)據(jù)由USDepartmentofEnergyJointGenomeInstitute(http://www.jgi.doe.gov/)下載至本地服務器上。使用以下12種已知的長鏈乙酰CoA合成酶蛋白序列作為查詢詞，進行Batchtblastn檢索，其包括三種哺乳動物蛋白小鼠MmLACS4(BC016416)、大鼠RnLACS4(D85189)、人HsLACS4(BC034959)以及9種擬南芥序列AtLACSl(AF503751)、AtLACS2(AF503752)、AtLACS3(AF503753)、AtLACS4(AF503754)、AtLACS5(AF503755)、AtLACS6(AF503756)、AtLACS7(AF503757)、AtLACS8(AF503758)和AtLACS9(AF503759)。得到E值低于0.001的所有無冗余序列，并采用CAP3序列拼接程序[12]將其拼接成重疊序列(contig)。以tblastn結果所示方向將重疊群以三個閱讀框翻譯為氨基酸序列?；谛蛄型葱允謩訕嫿?種推定的乙酰CoA合成酶基因模型并鑒別出同框(in-frame)GT-AG內(nèi)含子邊界。T.pseudonana的培養(yǎng)、RNA提取以及RT-PCR分析如文獻[13]所述培養(yǎng)T.pseudonana。用血細胞計數(shù)器計量細胞數(shù)來監(jiān)測細胞密度。在培養(yǎng)期間，通過測量培養(yǎng)基在220nm處的吸收值的變化，定期測定硝酸濃度[14]。使用RNeasy植物小量試劑盒(Qiagen)，從在不同生長階段收集的細胞中提取總RNA。使用ProstarFirst-strandRT-PCR試劑盒(Stratagene)，從3μg經(jīng)DNAse處理的RNA合成第一鏈cDNA。使用不稀釋和5倍稀釋的cDNA，使用對推定的Thalassiosira長鏈乙酰CoA合酶基因TplacsA特異的引物對如下進行PCR將反應物在95℃加熱5min，然后進行35次如下溫度的循環(huán)95℃下30s，根據(jù)使用的引物對(TplacsA，18SrRVA)在55℃下30s，以及在72℃下2min，然后在72℃單次加熱10min。使用18SrRNA基因以確保用于PCR的不同RNA樣品中具有相同量的cDNA。在1％瓊脂糖凝膠中電泳等份的PCR反應物。酵母中TplacsA的異源表達使用SuperscriptTMDIRnaseH-ReverseTranscriptase(Invitrogen)合成T.pseudonanacDNA，并且使用引物TpLACSANH5’-CCCAAGCTTACCATGGCTACGAACAAATGGT-3’(開放閱讀框起始密碼子以黑體字表示；劃線序列是HindIII位點；斜體序列是添加的丙氨酸密碼子，其在TplacsA原始序列中是不存在的)和TpLACSACE5’-GCGAATTCTTACAACTTGCTCTGTGGAGA-3’(ORF終止密碼子以黑體字表示；劃線序列是EcoRI位點)從T.pseudonanacDNA擴增整個TplacsA編碼區(qū)。使用ExpandHighFidelityPCRsystem(Roche)將可能的PCR錯誤最小化。首先使用TOPOTA克隆試劑盒(Invitrogen)克隆擴增的產(chǎn)物，并通過序列測定檢查克隆的PCR產(chǎn)物的保真度。然后使用HindIII和EcoRI限制重組載體并將其克隆至pYES2(Invitrogen)的半乳糖誘導型GAL1啟動子后對應的位點以構建質(zhì)粒pYLACSA。使用醋酸鋰法將對照載體pYES2和pYLACSA轉化入Saccharomycescerevisiae，使用無尿嘧啶的基本培養(yǎng)基平板篩選轉化體。從Euroscarf酵母缺失株收藏機構(Frankfurt)得到宿主酵母株野生型BY4741(MATa；his3Δ1；1eu2Δ0，met15Δ0；ura3Δ0)和缺失株Y06477(YOR317w::kanMX4，F(xiàn)AA1突變體)、Y01401(YIL009w::kanMX4，F(xiàn)AA3突變體)和Y00833(YMR246w::kanMX4，F(xiàn)AA4突變體)。這三種突變株與BY4741是類等基因系的。對于飼喂和共飼喂實驗，培養(yǎng)物在25或30℃下，在2％(w/v)棉子糖和1％(w/v)TergitolNP-40(Sigma)存在下生長。當OD600nm達到0.2-0.3時，通過補加半乳糖至2％(w/v)來誘導轉基因的表達。此時，添加合適的脂肪酸至50μM的最終濃度。對于乙酰CoA的分析，在25℃下孵育5分鐘、1小時和24小時后收集3ml的細胞樣品。對于總含量和三酰甘油脂肪酸的分析，在30℃下孵育4天后收集細胞(1.5ml樣品)。酵母中酶過量產(chǎn)生和乙酰CoA合成酶的分析細胞在無尿嘧啶的含有2％棉子糖和2％半乳糖的基本培養(yǎng)基中生長過夜。生長后，通過離心分離收集細胞，并將其重新懸浮于100mMMOPS、pH7.5、0.4mMEDTA、5mM2-巰基乙醇、10％甘油、0.01％tritonX-100和蛋白酶抑制劑混合物(Sigma)中。然后將該懸浮液轉移至含有500μl用酸洗滌過的玻璃珠(425-600微米，Sigma)的2mlEppendorf試管中并通過珠子研磨1分鐘，進行5次將細胞裂解。通過離心分離使樣品澄清并將上清液用于分析乙酰CoA的活性。使用Bradford分析和牛血清白蛋白作為標準[15]來確定這些酶提取物中的蛋白濃度。根據(jù)基于使用Pseudomonassp.乙酰CoA合成酶(PACS，Sigma)從游離脂肪酸、ATP和游離CoA合成乙酰CoA的方法[16]而修改的實驗方案，在不含酵母細胞的溶胞產(chǎn)物中確定乙酰CoA合成酶的活性。在1.5ml的Eppendorf試管中將20nmol的總游離脂肪酸干躁。向試管中加入含有100mMMOPSpH7.5、10mMMgCl2、10mMATP、1mM二硫蘇糖醇、0.1％TritonX-100和5mMCoA的分析混合物并超聲處理5分鐘。通過向置于超聲處理浴中的試管中加入2μlPseudomonassp.酶(Sigma)或相同體積的酵母蛋白提取物開始反應，并在25℃下孵育25分鐘。在開始分析后將試管超聲處理5分鐘和10分鐘。通過加入100μl的9∶2甲醇∶氯仿(v/v)、2μl的飽和(NH4)2SO4，、10μl的內(nèi)標物(17:0-CoA，0.12mM的儲液)以及渦旋來中止反應。在18,000g下離心5分鐘以沉淀蛋白之后，將5μl的上清液轉移至錐形的小瓶中，干燥，并加入1ml的氯乙醛derivitizing緩沖液。然后在烘箱中將樣品在85℃下加熱20分鐘并將20μl用于如下所述的乙酰CoA的確定。脂肪酸分析通過離心分離收集酵母細胞和藻細胞。從與文獻[17，18]之前報道的相同的片狀沉淀物進行脂肪酸和乙酰CoA的提取和測量。對于三酰甘油分析，在預先稱重的試管中通過離心分離收集酵母細胞，使用蒸餾水洗滌，并在快速真空轉印儀中離心分離過夜以確定干重。第二天，使用10μl水將片狀沉淀物再水化，然后加入10μltripentadecanoin(5mg/ml)和700μl的2∶1氯仿∶甲醇(v/v)。將細胞轉移至含有用300μl酸洗滌過的玻璃珠(425-600微米，Sigma)的Eppendorf試管中并通過珠子研磨兩次3分鐘將細胞裂解。如文獻[11]所述進行總脂肪酸和三酰甘油脂肪酸的提取和測量。實施例1T.pseudonana的脂肪酸和乙酰CoA的組成Thalassiosira細胞的脂肪酸譜顯示，棕櫚酸(16:0)、棕櫚油酸(16:1n7)和EPA是藻細胞中最豐富的FA(表1)。只測到了很低百分比的ω6C20PUFAs，相反地，測到了大量的ω3十八碳四烯酸(STA，18:4n3)和DHA，表明在這些硅藻細胞中ω3途徑是最活躍的。乙酰CoA譜與FA譜類似，其中棕櫚酸CoA、棕櫚油酸CoA、EPACoA是最豐富的，后者幾乎占乙酰CoA總量的30％。該高水平的EPA-CoA可能能夠作為通過延長至22:5n3并去飽和至22:6n3而進行的DHA合成中的中間體。實施例2T.pseudonana中推定的LACS基因的鑒別在當前序列數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)TplacsA是全長的并且預計含有兩個內(nèi)含子。為了監(jiān)測Thalassiosira細胞中TplacsA的轉錄，通過RT-PCR進行時序表達分析。圖1顯示了通過細胞培養(yǎng)表達的TplacsA。來自藻cDNA的TplacsAORF的擴增和序列測定顯示，它長2025bp并且編碼具有674個氨基酸的蛋白質(zhì)。該ORF與相應基因組DNA序列的比對證明了在序列的后半部分中分別存在96bp和88bp的兩個內(nèi)含子。TpLACSA氨基酸序列和已被功能性表征的LACS的對比表明，所述藻類酶與植物和哺乳動物LACS具有35-40％的序列相同性，在包含推定的AMP-結合結構域中具有高度的同源性。我們下一步的研究關注于TplacsA的功能性表征。實施例3Saccharomycescereviseae的脂肪酸活化缺失突變體的評價為了鑒別用于功能性表征TplacsA的最佳S.cereviseae株，測試了來自Euroscarf收藏機構的若干脂肪酸活化缺失(FAA)突變體。已經(jīng)顯示由基因FAA1和FAA4編碼的蛋白質(zhì)是涉及輸入的C12至C18FAs的活化的主要酶，而FAA3被發(fā)現(xiàn)對超過C18長度的脂肪酸最具有活性[8]。使用空載體對照pYES2轉化的野生型株BY4741和缺失株Y06477、Y01401和Y00833，在三個ω6(18:2n6、18:3n6、20:3n6)或三個ω3(18:4n3、20:5n3、22:6n3)PUFAs存在下，同時孵育。表2顯示在25℃下孵育1小時后，這些不同株中乙酰CoA的組成。出乎意料地，在野生型或FAA突變體中既沒有檢出C20PUFA-CoA也沒有檢出C22PUFA-CoA，表明在該短時間的孵育內(nèi)細胞不能產(chǎn)生相應的乙酰CoA。然而，用作底物的脂肪酸被4種株并入，因為FA譜顯示他們存在于經(jīng)洗滌的酵母細胞中(數(shù)據(jù)未顯示)。在Y06477中未檢出14:0、16:0和18:0-CoAs，表明FAA1基因產(chǎn)物涉及相應飽和脂肪酸的活化。在野生型細胞中測量到了類似百分比的18:3n6CoA和18:4n3CoA，但是它們的量低于18:2n6的測量值。在所有不同的細胞株中，較高的18:2n6CoA百分比表明該FA在酵母細胞中被有效地并入和/或活化。與野生型細胞相比，Y00833具有最低含量的由外源飼喂的不飽和18碳CoA合成的乙酰CoA。這表明，F(xiàn)AA4基因產(chǎn)物在酵母細胞中的不飽和脂肪酸的活化中起重要作用?；赮00833具有低的多的背景使用PUFA的乙酰CoA合成酶活性，并且不具有使用20:5n3和22:6n3的乙酰CoA合成酶活性，選擇Y00833作為用于異源表達研究的細胞株，所述研究的目的在于鑒別編碼PUFA合成酶活性的基因。實施例4TplacsA在S.cereviseaeFAA缺失株Y00833中的異源表達為了確定TpLACSA蛋白的功能，在pYES2的半乳糖誘導型GAL1啟動子之后克隆全長的TplacsAcDNA以產(chǎn)生質(zhì)粒pYLACSA。表3和表4分別給出了存在ω618:3n6和20:4n6以及ω318:4n3和20:5n3FAs下分別進行的孵育實驗的結果。孵育5分鐘后，在空白載體對照pYES2和pYLACSAY00833轉化體中均發(fā)現(xiàn)了C18PUFA-CoA，在后者中的百分數(shù)較高。含有TplacsA基因的Y00833相反，在空白載體對照Y00833中未檢出C20PUFA-CoA。ARA-CoA是在pYLACSA轉化體中測得的最豐富的PUFA-CoA，在孵育5分鐘后達到濃度峰值，然后在隨后的24小時中跌落至該起始濃度的約一半。4種外源飼喂的脂肪酸在細胞中積聚，并且不追隨相應的乙酰CoA所顯示的時序變化(數(shù)據(jù)未顯示)。飼喂60分鐘后在空白載體對照中未檢出C20PUFA-CoA，但是在飼喂24小時后檢出了C20PUFA-CoA。C18ω3和ω6FAs以與pYLACSA轉化體中ARA-CoA類似的形式積聚，該積聚值在孵育的第一個小時內(nèi)增加，然后在24小時后減少。相反地，在整個實驗過程中EPA-CoA增加。TpLACSA還導致內(nèi)源性飽和14:0、16:0和18:0-CoA增加2倍，而16:1和18:1-CoA減少，并且22:1-CoA僅有少許變化。實施例5通過體外分析測定乙酰CoA合成酶的活性為了直接確定TpLACSA的底物特異性，使用適合在游離脂肪酸、ATP和游離CoA存在下測量乙酰CoA的酶產(chǎn)生的分析來測試若干脂肪酸。將可商購的、來自Pseudomonassp.的、利用大圍的脂肪酸底物的乙酰CoA合成酶作為陽性對照。圖2所示的結果證明該酶的廣泛特異性。與從來自pYES2和pYLACSAY00833轉化體的提取物中確定的特異性活性的對比表明，TpLACSA對C20和C22PUFAs具有非常高的活性。有效地，TpLACSA提取物中的20:4n6、20:5n3和22:6n3FAs的活性比空白載體對照高62至222倍，而在棕櫚酸或C18PUFA存在下進行的分析的值僅僅增加2-3倍。在ARA、EPA和DHA游離脂肪酸存在下，pYES2酵母提取物中乙酰CoA的產(chǎn)生是剛可檢出的。實施例6表達TplacsA的酵母中的DHA的貯存為了確定TplacsA基因的表達是否能夠導致貯存于酵母貯存脂質(zhì)中的22:6n3(DHA)的量增加，在DHA存在下，在30℃下孵育4天后，從pYES2和pYLACSAY00833轉化體中提取總脂肪酸和TAG脂肪酸。表5顯示，包含TplacsA基因的Y00833顯示了，基于干重，TAG中DHA的量比空白載體對照高約6倍，以及TAG中總FA比空白載體對照高2倍。僅僅觀察到了內(nèi)源性飽和和單不飽和脂肪酸的少量增加(數(shù)據(jù)未顯示)。參考文獻[1]Groot，P.H.，Scholte，H.R.andHulsmann，W.C.(1976)Adv.LipidRes.14，75-126.Kornberg，A.andPricer，W.E.J.(1953)J.Biol.Chem.204，329-343.Watkins，P.A.(1997)Prog.Lipid.Res.36，55-83.Schnurr，J.A.，Shockey，J.M.，deBoer，G.-J.andBrowse，J.A.(2002)PlantPhysiol.129，1700-1709.Shockey，J.M.，F(xiàn)ulda，M.S.andBrowse，J.A.(2002)PlantPhysiology129，1710-1722.Ohlrogge，J.B.，Browse，J.andSomervilleCR.(1991)Biochim.Biophys.Acta1082，1-26.Black，P.N.，DiRusso，CC，Metzger，A.K.andHeimert，TX.(1992)JBiol.Chem.267，25513-25520.Faergeman，N.J.，Black，P.N.，Zhao，X.D.，Knudsen，J.andDiRusso，CC(2001)J.Biol.Chem.276，37051-37059.Mashek，D.G.，Bornldt，K.E.，Coleman，R.A.，Berger，J.，Bernlohr，D.A.，Black，P.，DiRusso，CC，F(xiàn)arber，S.A.，Guo，W.，Hashimoto，N.，Khodiyar，V.，KuyPers，F(xiàn).A.，Maltais，LJ.，Nebert，D.W.，Renieri，A.，Schaffer，J.E.，Stahl，A.，Watkins，P.A.，Vasiliou，V.andYamamotoT.T.(2004)J.Lipid.Res.，InPress.Lauritzen，L.，Hansen，H.S.，Jorgensen，M.H.andMichaelsen，K.F.(2001)Prog.Lipid.Res.40，1-94.Tonon，T.，Harvey，D.，Larson，T.R.andGraham，LA.(2002)Phytochemistry61，15-24.Huang，X.andMadan，A.(1999)GenomeRes.9，868-877.Tonon，T.，Harvey，D.，Qing，R1，Li，Y.，Larson，T.R.andGrahamLA.(2004)FEBSLett.563，28-34.Collos，Y.，Mornet，F(xiàn).，Sciandra，A.，Waser，N.，Larson，A.andHarrison，PJ.(1999)J.Appl.Phycol.11，179-184.Bradford，M.M.(1976).Anal.Biochem.72，248-254.Taylor，D.C，Weber，N.，Hogge，L.R.andUnderhill，E.W.(1990)Anal.Biochem.184，311-316.Larson，T.R.，Edgell，T.，Byrne，J.，Dehesh，K.andGraham，LA.(2002)PlantJ.32，519-527.Larson，T.R.andGraham，LA.(2001)PlantJ.25，115-125.Meyer，A.，Kirsch，H.，Domergue，F(xiàn).，Abbadi，A.，Sperling，P.，Bauer，J.，Cirpus，P.，Zank，T.K.，Moreau，H.，Roscoe，TJ.，Zahringer，U.andHeinz，E.(2004)J.Lipid.Res.，hipress.Pereira，S.L.，Leonard，A.E.，Huang，Y.-S.，Chuang，L.-T.andMukerji，P.(2004)Biochem.J.，Inpress.Knoll，LJ.，Johnson，D.R.andGordon，J.I.(1994)J.Biol.Chem.269，16348-16356.Domergue，F(xiàn).，Abbadi，A.，Ott，C，Zank，T.K.，Zahringer，U.andHeinz，E.(2003)J.Biol.Chem.278，35115-35126.Qi，B.，F(xiàn)raser，T.，Mugford，S.，Dobson，G.，Sayanova，O.，Butler，J.，Nap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