專利名稱：三價(jià)金屬介導(dǎo)的均相發(fā)光鄰近試驗(yàn)的制作方法
相關(guān)申請的交叉參考本申請要求2004年9月17日提交的題為“三價(jià)金屬介導(dǎo)的均相發(fā)光鄰近試驗(yàn)”的美國臨時(shí)專利申請?zhí)?0/610,799的優(yōu)先權(quán)，將其全部內(nèi)容納入本文作參考并用于所有目的。
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及進(jìn)行生物試驗(yàn)，具體是激酶試驗(yàn)的材料和方法。
各種胞內(nèi)蛋白質(zhì)和脂質(zhì)底物的磷酸化在許多細(xì)胞過程(如生長、增殖、凋亡、分化和細(xì)胞周期行進(jìn))中起到重要作用。激酶，負(fù)責(zé)磷酸化細(xì)胞中的酶(包括其它激酶)，激酶和脂質(zhì)被鑒定為可能的治療介入的主要靶點(diǎn)。廣義上，將激酶分為酪氨酸(即在酪氨酸氨基酸殘基上發(fā)生磷酸化)或絲氨酸/蘇氨酸(即在絲氨酸或蘇氨酸氨基酸殘基上發(fā)生磷酸化)激酶。在迄今鑒定的大約518種人激酶中，約85％是絲氨酸/蘇氨酸(S/T)激酶，其余分類為酪氨酸激酶。Manning，G.，Whyte，D.B.，Martinez，R.，Hunter，T.和Sudarsanam，S.“人類基因組的蛋白激酶組”(The protein kinase complement of thehuman genome).Science 298，1912-34(2002)。
已經(jīng)描述了在可能的激酶抑制性化合物存在下高通量測定激酶活性的許多體外試驗(yàn)。關(guān)于現(xiàn)有的高通量篩選(HTS)激酶試驗(yàn)，以及任何HTS試驗(yàn)，我們關(guān)心的包括檢測試劑的成本和評價(jià)和優(yōu)化該試驗(yàn)的時(shí)間成本。為此，高度優(yōu)選非放射性試驗(yàn)，因?yàn)榉派湫詮U料的處置非常昂貴。同時(shí)，均相試驗(yàn)(即不需要洗滌步驟的試驗(yàn))需要較少的試驗(yàn)步驟，同時(shí)出現(xiàn)的篩選人工副產(chǎn)物(artifact)的可能來源減少且更適合HTS，一般提供較高的試驗(yàn)通量以及較低的與設(shè)備采購和維護(hù)相關(guān)的首次和后續(xù)資金成本。
一種滿足這些要求的目前可用的體外激酶試驗(yàn)技術(shù)是Perkin Elmer LAS，Inc.的AlphaScreenTM(放大發(fā)光鄰近均相試驗(yàn))。AlphaScreenTM依靠偶聯(lián)供體和受體珠(直徑約為250nm)之間的生物分子相互作用。Ullman，E.F.等，“發(fā)光氧溝流免疫試驗(yàn)通過化學(xué)發(fā)光測定顆粒結(jié)合動(dòng)力學(xué)”(Luminescent oxygen channeling immunoassaymeasurement of particle binding kinetics by chemiluminescence).Proc Natl Acad Sci USA91，5426-30(1994)。在AlphaScreenTM激酶試驗(yàn)中，將生物素化的肽或蛋白質(zhì)底物結(jié)合于供體珠，如果是磷酸化的，則與偶聯(lián)于磷酸化特異性抗體(一般是磷酸化-酪氨酸特異性)的受體珠接近。Warner，G.，Illy，C，Pedro，L.，Roby，P.和Bosse，R.“AlphaScreenTM激酶HTS平臺”(AlphaScreenTMkinase HTS platforms).Curr.Med.Chem.11，721-730(2004)。彼此相距約200nm以內(nèi)的供體和受體珠發(fā)出發(fā)光信號，讀出為520-620nm之間發(fā)出的光。AlphaScreenTM激酶試驗(yàn)的信噪比(S/B)通常大于10(Warner，G.，Illy，C，Pedro，L.，Roby，P.和Bosse，R. AlphaScreen激酶HTS平臺”(AlphaScreenTMkinase HTS platforms).Curr.Med.Chem.11，721-730(2004))，該試驗(yàn)可用于大蛋白質(zhì)底物。然而，雖然可獲得用于依賴磷酸化-特異性抗體進(jìn)行檢測的試驗(yàn)技術(shù)的高質(zhì)量抗-磷酸化酪氨酸抗體，但普通抗-磷酸化絲氨酸或抗-磷酸化蘇氨酸抗體的質(zhì)量一般不夠高，以致于不能產(chǎn)生強(qiáng)烈信號。因此，需要磷酸化序列特異性抗體，這將增加試驗(yàn)優(yōu)化和評價(jià)所需的時(shí)間，并增加總試驗(yàn)成本。在篩選具體S/T激酶或不能獲得高親和性或高特異性抗體的其它酶類型時(shí)，采用磷酸化特異性抗體排除了采用AlphaScreenTM。
另一種目前可用的體外均相、非放射性激酶試驗(yàn)技術(shù)是Molecular DevicesCorporation的IMAPTM(固定的磷酸金屬親和)。EVIAPTM利用表面上絡(luò)合有三價(jià)金屬離子的納米顆粒。Sportsman，J.R.，Daijo，J.和Gaudet，E.A.信號轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)現(xiàn)中的熒光偏振試驗(yàn)(Fluorescence polarization assays in signal transduction discovery).Comb.Chem.High Throughput Screen 6，195-200(2003)。已知三價(jià)過渡金屬(如Ga3+、Fe3+、Al3+、In3+、Ru3+、Sc3+、Y3+)可以高親和力和特異性結(jié)合于磷酸基團(tuán)。Osterberg，R.“O-磷酸絲氨酸的金屬和氫離子結(jié)合特性”(Metal and hydrogen-ion binding properties ofO-phosphoserine).Nature 179，476-477(1957)；Muszynska，G.，Andersson，L.和Porath，J.“磷酸化蛋白選擇性吸附于凝膠固定的鐵螯合物上”(Selective adsorption ofphosphoproteins on gel-immobilized ferric chelate).Biochemistry 25，6850-3(1986)；和Posewitz，M.C.和Tempst，P.“磷酸化肽的固定鎵(III)親和色譜”(Immobilized gallium(III)affinity chromatography of phosphopeptides).Anal Chem.71，2883-2892(1999)。IMAPTM依賴磷酸化后結(jié)合IMAPTM納米顆粒時(shí)熒光標(biāo)記肽底物的熒光偏振增加。此系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)是能夠結(jié)合肽底物中的游離磷酸基團(tuán)，而不影響周圍的氨基酸，這與磷酸化抗體不同。然而，因?yàn)闊晒馄駵y定的是分子流動(dòng)性的改變，在生物系統(tǒng)中最大信號范圍(S-B)一般限于約350mP。這使生物試驗(yàn)中信噪比(S/B)在理論上最大約為8，然而在實(shí)際中，S/B常常為2或更低(參見例如J. Biomolecular Screening 8(6)694-700(2003))。而且，因?yàn)榇蠓肿拥墓逃衅窈芨?即背景B顯著增加)，在底物是蛋白質(zhì)或大蛋白質(zhì)片段時(shí)，S/B變得太小，以致于不能使用。信噪比低的試驗(yàn)更可能產(chǎn)生假陽性結(jié)果，假陽性結(jié)果可顯著影響HTS程序的總有效性和重復(fù)性。Walters，W.P.和Namchuk，M.設(shè)計(jì)篩選如何使你的努力成為成功(Designing screenshow to makeyour hits a hit).Nat.Rev.Drug Dis.2，259-266(2003)。
因此，需要有助于在潛在激酶抑制性化合物存在下可靠地高通量測定激酶活性的改進(jìn)的體外試驗(yàn)技術(shù)。
發(fā)明概述本發(fā)明通過提供體外激酶試驗(yàn)技術(shù)解決了這些問題，該技術(shù)的特征如下(1)試驗(yàn)信噪比(S/B)和范圍(S-B)高；(2)均相；(3)非放射性；和(4)不需要磷酸化特異性抗體。由于如本文所述的本發(fā)明能鑒定蛋白質(zhì)(或組成部分，如多肽或肽)或其它生物大分子(如單核苷酸、二核苷酸或三核苷酸，環(huán)狀核苷酸或磷酸取代的肌醇)上是否存在磷酸基團(tuán)，可將其廣泛應(yīng)用于任何磷酸化或去磷酸化反應(yīng)酶，并提供用于蛋白激酶和其它酶類型，包括脂質(zhì)(lipid)激酶、磷酸酶、磷酸二酯酶等的非常強(qiáng)效且靈活的試驗(yàn)形式。
在一種情況下，該試驗(yàn)包括將放大發(fā)光鄰近試驗(yàn)供體和受體珠與激酶和激酶抑制性候選化合物混合。珠中的一種，通常是供體珠，其表面上結(jié)合有能夠被激酶磷酸化的生物分子，如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)或核酸(或其組成部分，如蛋白質(zhì)的組成部分-肽)。另一種珠，通常是受體珠，表面上(例如)通過合適鍵合基(linker)絡(luò)合有三價(jià)金屬離子，鍵合基有(例如)三乙酸腈(NTA；也稱為羧甲基-賴氨酸)、亞氨基二乙酸(IDA)或合適取代的含N雜環(huán)，如疊氮雜環(huán)，如疊氮環(huán)壬烷并壬烷，如1-丙基氨基-4-乙酸基(acetato)-1，4，7-三氮雜環(huán)壬烷。當(dāng)供體和受體顆粒足夠接近時(shí)產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號，這發(fā)生在激酶磷酸化該生物分子并且三價(jià)金屬離子結(jié)合于磷酸基團(tuán)時(shí)。如果激酶抑制性候選化合物是激酶抑制性化合物，那么相對于缺少抑制性候選化合物的對照組合物發(fā)出的化學(xué)光，試驗(yàn)組合物發(fā)出的化學(xué)光減少或消失到激酶被抑制的程度。這提供了激酶抑制的指標(biāo)或測定方法，或二者。
也提供了可用于進(jìn)行這些試驗(yàn)的組合物和試劑盒。
如上所述，雖然本文主要參照蛋白質(zhì)或組成部分(包括多肽或肽)激酶試驗(yàn)描述了本發(fā)明，但它可廣泛應(yīng)用于任何磷酸化或去磷酸化反應(yīng)酶。本發(fā)明的組合物和方法也可用于其他類型酶，包括脂質(zhì)激酶、磷酸酶和磷酸二酯酶的試驗(yàn)。
對脂質(zhì)激酶而言，比如PI3K，磷酸化反應(yīng)是PI-4，5-P2至PI-3，4，5-P。PI(磷脂酰肌醇)本身也可用作底物。一旦PI或PIP2被磷酸化，該珠顯示出化學(xué)發(fā)光信號增加。
對于磷酸酶和磷酸二酯酶而言，該試驗(yàn)以與激酶試驗(yàn)相反的方式進(jìn)行，因?yàn)榱姿崦负土姿岫ッ溉コ姿峄鶊F(tuán)，例如，磷酸酶或磷酸二酯酶抑制劑會產(chǎn)生比對照高的化學(xué)發(fā)光信號。下面詳細(xì)描述本發(fā)明這些和其它的方面和優(yōu)點(diǎn)。
附圖簡要說明

圖1說明了適合按照本發(fā)明進(jìn)行三價(jià)金屬介導(dǎo)的均相發(fā)光鄰近激酶試驗(yàn)的組合物組分。
圖2和3是實(shí)施例1所測試的各條件下的發(fā)光計(jì)數(shù)圖。
圖4-7是實(shí)施例2所測試的各條件下的發(fā)光計(jì)數(shù)圖。
發(fā)明詳述下面詳細(xì)描述本發(fā)明具體實(shí)施方式
。附圖中說明了具體實(shí)施方式
的例子。雖然結(jié)合這些具體實(shí)施方式
描述了本發(fā)明，但是應(yīng)理解，本發(fā)明不受限于這些具體實(shí)施方式
。相反，旨在覆蓋替代、修改或等價(jià)形式，這些可包括在所附權(quán)利要求書限定的本發(fā)明構(gòu)思和范圍內(nèi)。在以下說明書中，列出了許多具體細(xì)節(jié)，以全面理解本發(fā)明?？稍跊]有一些或全部這些具體細(xì)節(jié)的情況下實(shí)施本發(fā)明。在其它情況下，沒有詳細(xì)描述公知的操作方法，是為了不多余地使本發(fā)明難以理解。
概述本發(fā)明提供了具有以下特征的體外激酶試驗(yàn)技術(shù)試驗(yàn)信噪比(S/B)和范圍(S-B)高；(2)均相；(3)非放射性；和(4)不需要磷酸化特異性抗體。由于如本文所述的本發(fā)明能鑒定蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)(或組成部分，如多肽或肽)或其它生物大分子(如單核苷酸、二核苷酸或三核苷酸，環(huán)狀核苷酸或磷酸取代的肌醇)上是否存在磷酸基團(tuán)，可將其廣泛應(yīng)用于任何磷酸化或去磷酸化反應(yīng)酶，提供用于蛋白激酶和其它酶類型，包括脂質(zhì)激酶、磷酸酶、磷酸二酯酶等的非常強(qiáng)效且靈活的試驗(yàn)形式。
在一個(gè)實(shí)施方式中，該試驗(yàn)包括將放大發(fā)光鄰近試驗(yàn)供體和受體珠與激酶和激酶抑制性候選化合物混合。珠中的一種，通常是供體珠，其表面上結(jié)合有能夠被激酶磷酸化的生物分子，如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)或核酸(或其組成部分，如蛋白質(zhì)的組成部分-肽)。另一種珠，通常是受體珠，表面上(例如)通過合適鍵合基絡(luò)合有三價(jià)金屬離子(如Ga3+、Fe3+、Al3+、In3+、Ru3+、Sc3+、Y3+)，鍵合基有(例如)三乙酸腈(NTA；也稱為羧甲基-賴氨酸)、亞氨基二乙酸(IDA)或合適取代的含N雜環(huán)，如疊氮雜環(huán)，如疊氮環(huán)壬烷并壬烷，如1-丙基氨基-4-乙酸基(acetato)-1，4，7-三氮雜環(huán)壬烷。應(yīng)理解，在此激酶試驗(yàn)和按照本發(fā)明的任何試驗(yàn)中，珠的表面組分可顛倒，如三價(jià)金屬離子可以在供體珠上，激酶底物(用于磷酸化/去磷酸化的生物分子)可以在受體珠上。
當(dāng)供體和受體顆粒足夠接近時(shí)產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號，這發(fā)生在激酶磷酸化生物分子并且三價(jià)金屬離子結(jié)合于磷酸基團(tuán)時(shí)。出于本申請目的，化學(xué)發(fā)光(或形容詞，化學(xué)發(fā)光的)指從一種化合物(化學(xué)發(fā)光化合物)與反應(yīng)性化學(xué)物質(zhì)(包括單線態(tài)氧)的化學(xué)反應(yīng)直接或間接產(chǎn)生的發(fā)光，包括發(fā)射任何熒光或磷光光子。如果激酶抑制性候選化合物實(shí)際上是激酶抑制性化合物，那么相對于缺少抑制性候選化合物的對照組合物發(fā)出的化學(xué)光，試驗(yàn)組合物發(fā)出的化學(xué)光減少或消失到激酶被抑制的程度。這提供了激酶抑制的指標(biāo)或測定方法，或二者。
也提供了可用于進(jìn)行這些試驗(yàn)的組合物和試劑盒。
下面參照一種實(shí)施方式--激酶試驗(yàn)，主要是蛋白激酶試驗(yàn)描述本發(fā)明。
三價(jià)金屬介導(dǎo)的均相發(fā)光鄰近激酶試驗(yàn)已知，三價(jià)過渡金屬，包括Fe3+可以高親和力和特異性結(jié)合于磷酸基團(tuán)，這一現(xiàn)象已被用于發(fā)展激酶試驗(yàn)，尤其是上述IMAPTM技術(shù)。然而，激酶試驗(yàn)而非IMAPTM中采用三價(jià)金屬離子是未知的。由于在供體珠上產(chǎn)生單線態(tài)氧并傳達(dá)至受體珠對操作現(xiàn)有的放大發(fā)光鄰近均相試驗(yàn)技術(shù)至關(guān)重要，如上所述，所以在現(xiàn)有技術(shù)中單態(tài)離子猝滅劑的存在是禁忌的。上述AlphaScreenTM試驗(yàn)技術(shù)的供應(yīng)商明確指出，某些過渡金屬離子，包括Fe3+，已證明是有效的單線態(tài)氧淬滅劑，在與AlphaScreenTM產(chǎn)品一起提供的文獻(xiàn)中強(qiáng)烈推薦避免使用它們。參見以全文納入本文作參考并用于所有目的《使用AlphaScreenTM的實(shí)踐指南》(A Practical Guide to Working withAlphaScreenTM)，第22頁，PerkinElmer，Inc.(2003)。然而，本發(fā)明意外發(fā)現(xiàn)，用三價(jià)金屬離子替代上述現(xiàn)有的放大發(fā)光鄰近均相使用技術(shù)中所用的磷酸化特異性抗體提供了增強(qiáng)的試驗(yàn)。
圖1說明適合按照本發(fā)明進(jìn)行三價(jià)金屬介導(dǎo)的均相發(fā)光鄰近激酶試驗(yàn)的組合物100的組成。鄰近試驗(yàn)利用偶聯(lián)供體102和受體104顆粒之間的生物分子相互作用進(jìn)行工作。在優(yōu)選實(shí)施方式中，顆粒是聚合物珠，如Ullman，E.F.等，“發(fā)光氧溝流免疫試驗(yàn)通過化學(xué)發(fā)光測定顆粒結(jié)合動(dòng)力學(xué)”(Luminescent oxygen channelingimmunoassaymeasurement of particle binding kinetics by chemiluminescence).ProcNatl Acad Sci USA 91，5426-30(1994)和美國專利號6,703,248所述，將它們?nèi)募{入本文作參考并用于所有目的。按照這些公開，珠是市售的AlphaScreenTM珠，購自Perkin Elmer Life and Analytical Sciences(馬薩諸塞州波士頓)。聚合物珠可由一種或多種聚合物組成，如聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚氯乙烯、聚乙烯基萘和聚甲基丙烯酸酯。合適的珠可以是膠乳顆粒形式。而且，聚合物珠包括增塑劑，如高級烷基芳族化合物、高級烷氧基芳族化合物和碳氟化合物，例如其含量約為0.1-25重量％。珠的直徑可約為20nm-100μm，如直徑約175nm-275nm。用于生物試驗(yàn)(如激酶試驗(yàn))時(shí)，將珠分散于水性介質(zhì)110，如合適緩沖液中。
供體珠102摻入了光敏劑，由光源如激光激發(fā)(活化)后，光敏劑將環(huán)境氧(ambientoxygen)轉(zhuǎn)變?yōu)閱尉€態(tài)氧。合適光敏劑的例子包括內(nèi)過氧化物或酞菁。供體珠也具有表面包衣103，以有利于生物分子106結(jié)合。通常，表面包衣與生物分子106上的鍵合基108互補(bǔ)。例如，供體珠表面包衣103是抗生物素蛋白，如鏈霉抗生物素蛋白，那么生物分子106上的互補(bǔ)鍵合基108是生物素。其它合適的鍵合基包括谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、蛋白A、蛋白G和螯合的Ni2+(用于6x組氨酸標(biāo)記分子)。合適的供體珠是AlphaScreen供體珠，購自Perkin Elmer Life and Analytical Sciences(馬薩諸塞州波士頓)。
在激酶試驗(yàn)中，生物分子106，如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)或核酸(或其組成部分，如蛋白質(zhì)的組成部分肽)能夠被激酶磷酸化，以調(diào)節(jié)其生物活性。它通過供體珠表面包衣103和鍵合基108結(jié)合于供體珠表面。根據(jù)具體試驗(yàn)中感興趣的激酶選擇生物分子106。例如，如果試驗(yàn)?zāi)康氖氰b定蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶PDK1的抑制劑，那么生物分子106是能夠被PDK1磷酸化的蛋白(或組成部分)，如本領(lǐng)域所知。本發(fā)明試驗(yàn)適用的激酶的一些例子如下該激酶可以是蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶，包括Akt激酶家族、Aurora激酶家族、PDK1、MAPKAP K2、Erk激酶家族、CAMK激酶家族、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(如CDK1、CDK2、CDK4、CDK6)、RAF激酶家族、酪蛋白激酶家族、PKC家族、PKA家族、PKB家族、PKG家族、GSK3β、ROCK、SGK、Rsk家族和Nek家族；蛋白酪氨酸激酶，包括受體酪氨酸激酶，如FGFR、EGFR、PDGFR、c-Kit、IGFR、胰島素受體、TrkA、TrkB、TrIcC、c-Met或c-Ret，以及胞質(zhì)酪氨酸激酶，如Src、Lck、Lyn、Fyn、Yes、Syk、Hck、Ab1和Eph家族；或脂質(zhì)激酶，如PI3激酶、PI4激酶或PI5激酶。
受體珠104摻入了在單線態(tài)氧存在下產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號的化學(xué)發(fā)光化合物。因此，當(dāng)活化供體102和受體104珠接近時(shí)，即當(dāng)珠之間的距離不大于單線態(tài)氧在其壽命中在水溶液中穿過的距離，如不大于約200nm時(shí)，產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號。在一個(gè)實(shí)施方式中，化學(xué)發(fā)光化合物是二甲基噻吩衍生物，發(fā)射的發(fā)光信號讀出為520-620nm的發(fā)射光。
受體顆粒104通常具有表面包衣112，以防止非特異性結(jié)合，如右旋糖苷(dextran)或多肽水凝膠的包衣。它也具有(如)通過鍵合基115絡(luò)合于珠104表面的三價(jià)金屬離子114，鍵合基115共價(jià)結(jié)合于受體顆粒104的表面包衣112。三價(jià)金屬離子114可以是Ga3+、Fe3+、Al3+、In3+、Ru3+、Sc3+和Y3+中的至少一種。
已證明，可能通過用三價(jià)金屬代替二價(jià)Ni2+絡(luò)合的三乙酸腈(NTA；也稱為羧甲基-賴氨酸)或亞氨基二乙酸(IDA)樹脂(一般用于純化含6×His的蛋白質(zhì))將三價(jià)金屬離子絡(luò)合于色譜基材。Porath，J.基于IMAC-固定的金屬離子親和力的色譜.TrendsAnal.Chem.7，254-259(1988)，全文納入本文作參考并用于所有目的。已發(fā)現(xiàn)，通過在該技術(shù)中采用二價(jià)Ni2+絡(luò)合的三乙酸腈(NTA)AlphaScreenTM受體珠，可將三價(jià)金屬離子絡(luò)合于適合用作本發(fā)明受體珠的聚合物珠。此外，如以下實(shí)施例進(jìn)一步所述，三價(jià)金屬離子可直接偶聯(lián)于適合用作受體珠的樹脂，如AlphaScreenTM未偶聯(lián)“原始”受體珠。AlphaScreenTM珠可購自Perkin Elmer Life and Analytical Sciences(馬薩諸塞州波士頓)。
三價(jià)金屬離子也可通過鍵合基115絡(luò)合于適合用作本發(fā)明受體珠的聚合物珠，鍵合基115是合適取代的含N雜環(huán)，如疊氮雜環(huán)，如疊氮環(huán)壬烷并壬烷。化合物1-乙酸基-4-芐基-疊氮環(huán)壬烷已被描述為蛋白質(zhì)純化和其它應(yīng)用中Ni/NTA的替代物(D.L.Johnson和LX.Martin，J.Am.Chem.Soc.2005，127，2018-2019(和相關(guān)的支持信息)，將全文納入本文作參考并用于所有目的)。合適的取代將提供能將疊氮雜環(huán)連接于受體珠104表面的官能團(tuán)，如上所述，受體珠104通常具有表面包衣112以防止非特異性結(jié)合，如右旋糖苷或多肽水凝膠的包衣。合適的取代包括羧酸基團(tuán)和游離胺。這種合適鍵合基115的一個(gè)具體例子是1-丙基氨基-4-乙酸基-1，4，7-三氮雜環(huán)壬烷 其制備如以下實(shí)施例所述。
雖然不想受限于理論，但應(yīng)相信，疊氮雜環(huán)鍵合基115可更強(qiáng)地絡(luò)合三價(jià)金屬離子，從而抵抗用作試驗(yàn)反應(yīng)終止物的金屬例子螯合劑(如EDTA)從受體珠上剝下離子。而且，據(jù)信，此種類型鍵合基的剛性也可定向使絡(luò)合的金屬離子離開受體珠表面并向供體珠移動(dòng)，從而提高該試驗(yàn)的信號。
如上所述，活化的供體珠和受體珠接近時(shí)產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號。這可以在珠上的表面結(jié)合基團(tuán)之間發(fā)生生物相互作用時(shí)實(shí)現(xiàn)。如果生物分子已被激酶磷酸化，受體珠104上的三價(jià)金屬離子114將結(jié)合于生物分子106的磷酸基團(tuán)116，以使珠保持接近。然而，如果候選化合物是激酶抑制性化合物，它將抑制生物分子的磷酸化，并從而抑制化學(xué)發(fā)光信號的產(chǎn)生，相對于缺少抑制性候選化合物的對照組合物發(fā)出的化學(xué)光，試驗(yàn)組合物發(fā)出的化學(xué)光減少或消失到激酶被抑制的程度。這提供了激酶抑制的指標(biāo)或測定方法，或二者。
因此，可按照本發(fā)明進(jìn)行試驗(yàn)來檢測激酶抑制性化合物。該方法包括提供一種組合物，其包含供體顆粒以及受體顆粒，該供體顆粒含光敏劑和表面結(jié)合的、能被激酶磷酸化的未磷酸化生物分子，該受體顆粒具有絡(luò)合于其表面的三價(jià)金屬離子以及化學(xué)發(fā)光化合物。化學(xué)發(fā)光化合物的特征是在光敏劑被活化且供體和受體顆粒接近時(shí)它產(chǎn)生發(fā)光信號。將激酶和激酶抑制性候選化合物引入組合物，以使在沒有候選化合物的情況下不發(fā)生磷酸化。有許多方式來完成此過程。在磷酸化反應(yīng)開始時(shí)，必須存在三種組分激酶、激酶底物(如待磷酸化的生物分子，如蛋白質(zhì)(或組成部分))和ATP。將這三種組分中的任意兩種組合并混合，或加入含有該化合物的孔中。必須在發(fā)生磷酸化的所有必需組分混合之前加入候選抑制劑，然后加入第三種組分。
然后，可通過檢測抑制性候選化合物對激酶的抑制確定該候選化合物是否為激酶抑制劑，激酶抑制的觀察結(jié)果為相對于缺少抑制性候選化合物的對照組合物發(fā)出的化學(xué)光，化學(xué)發(fā)光減少或消失。
應(yīng)注意，在發(fā)光鄰近試驗(yàn)，如用AlphaScreenTM技術(shù)進(jìn)行的試驗(yàn)之前，推薦的終止緩沖液包含常用和方便的金屬螯合劑EDTA。按照本發(fā)明的三價(jià)金屬離子-介導(dǎo)的發(fā)光鄰近試驗(yàn)可以或可以不采用包含EDTA的終止緩沖液，這取決于EDTA對三價(jià)金屬離子的相對親和力和用于將三價(jià)金屬離子絡(luò)合于受體珠的鍵合基。EDTA的親和力大于鍵合基時(shí)，為了避免加入反應(yīng)終止緩沖液時(shí)從珠上剝離三價(jià)金屬離子的風(fēng)險(xiǎn)，可將另一種反應(yīng)終止緩沖液用于該試驗(yàn)。例如，非-EDTA緩沖液，如不含EDTA的IMAPTM結(jié)合緩沖液可用于這種情況，以避免金屬離子剝離。在這種情況下低pH溶液也可提供可接受的終止緩沖液。當(dāng)鍵合基的親和力大于EDTA時(shí)，可采用EDTA。
因此，本發(fā)明的一些實(shí)施方式，如采用NTA三價(jià)金屬離子鍵合基的實(shí)施方式不采用含EDTA的反應(yīng)終止緩沖液，因?yàn)镋DTA是足夠強(qiáng)的金屬螯合劑，它可能從受體珠上剝離NTA絡(luò)合的金屬離子。另一方面，含EDTA的反應(yīng)終止緩沖液可用于采用疊氮雜環(huán)鍵合基，如1-丙基氨基-4-乙酸基-1，4，7-三氮雜環(huán)壬烷的本發(fā)明實(shí)施方式，因?yàn)榇蠹蚁嘈胚@種鍵合基絡(luò)合三價(jià)金屬離子的親和力大于EDTA，從而防止EDTA從該珠上剝離金屬離子。
本發(fā)明實(shí)施方式本發(fā)明可具體實(shí)施為組合物、試劑盒或方法，例如一種組合物，其包含含光敏劑的供體顆粒；含有化學(xué)發(fā)光化合物的受體顆粒，該化合物的特征是在光敏劑被活化且供體和受體顆粒接近時(shí)它產(chǎn)生發(fā)光信號；和絡(luò)合于供體或受體顆粒之一的表面的三價(jià)金屬離子。
一種組合物，其包含聚合物顆粒，該聚合物顆粒包含絡(luò)合于該顆粒表面的三價(jià)金屬離子并含有光敏劑和化學(xué)發(fā)光化合物中的一種。該顆粒的特征可以是，當(dāng)含有光敏劑和化學(xué)發(fā)光化合物中另外一種的第二種顆粒與其接近且光敏劑被活化時(shí)產(chǎn)生發(fā)光信號。
一種用于試驗(yàn)的試劑盒，該試劑盒在包裝組合中包括進(jìn)行試驗(yàn)的試劑，該試劑包含含光敏劑的供體顆粒；含化學(xué)發(fā)光化合物的受體顆粒，該化合物的特征是在光敏劑被活化且供體和受體顆粒接近時(shí)它產(chǎn)生發(fā)光信號；和絡(luò)合于供體或受體顆粒之一的表面的三價(jià)金屬離子。該試劑盒也可包含進(jìn)行三價(jià)金屬介導(dǎo)的均相發(fā)光鄰近試驗(yàn)的說明書，如按照下述本發(fā)明方面檢測激酶抑制性化合物的方法。
一種檢測激酶抑制性化合物的方法，該方法包括提供一種組合物，其包含含光敏劑和能被激酶磷酸化的表面結(jié)合的未磷酸化生物分子的供體顆粒，以及包含絡(luò)合于顆粒表面的三價(jià)金屬離子和化學(xué)發(fā)光化合物的受體顆粒，該化合物的特征是在光敏劑被活化且供體和受體顆粒接近時(shí)它產(chǎn)生發(fā)光信號；將激酶抑制性候選化合物引入該組合物；將激酶引入該組合物；和通過檢測抑制性候選化合物對激酶的抑制確定該激酶抑制性候選化合物是激酶性化合物，激酶抑制的觀察結(jié)果為相對于缺少抑制性候選化合物的對照組合物發(fā)出的化學(xué)光，化學(xué)發(fā)光減少。
一種檢測磷酸酶或磷酸二酯酶抑制性化合物的方法，該方法包括提供一種組合物，其包含含光敏劑和能被磷酸酶或磷酸二酯酶去磷酸化的、表面結(jié)合的、磷酸化生物分子的供體顆粒，以及包含絡(luò)合于顆粒表面的三價(jià)金屬離子和化學(xué)發(fā)光化合物的受體顆粒，該化合物的特征是在光敏劑被活化且供體和受體顆粒接近時(shí)它產(chǎn)生發(fā)光信號；將磷酸酶或磷酸二酯酶引入該組合物；將磷酸酶或磷酸二酯酶抑制性候選化合物引入該組合物；和通過檢測抑制性候選化合物對磷酸酶或磷酸二酯酶的抑制確定該磷酸酶或磷酸二酯酶抑制性候選化合物是磷酸酶或磷酸二酯酶抑制性化合物，酶抑制的觀察結(jié)果為相對于缺少抑制性候選化合物的對照組合物發(fā)出的化學(xué)光，化學(xué)發(fā)光增加。
對于本發(fā)明的任何組合物、試劑盒或方法被光源激發(fā)后，活化的光敏劑可將環(huán)境氧轉(zhuǎn)變?yōu)閱尉€態(tài)氧。光源可以是激光。光敏劑可以是內(nèi)過氧化物。化學(xué)發(fā)光化合物可以是二甲基噻吩衍生物。受體和供體顆?？煞稚⒂谒越橘|(zhì)中。接近距離不大于單線態(tài)氧在其壽命中在水溶液中穿過的距離，如不大于200nm。顆粒可以是聚合物珠。聚合物珠可包含選自下組的聚合物聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚氯乙烯、聚乙烯基萘和聚甲基丙烯酸酯。聚合物珠可包含約0.1-25重量％的增塑劑，增塑劑選自高級烷基芳族化合物、高級烷氧基芳族化合物和碳氟化合物。在一些情況下，聚合物珠的直徑可以約為20nm-100μm。在其它情況下，聚合物珠的直徑可以175nm-275nm。另外，該珠可包含膠乳顆粒。在一些情況下，可將三價(jià)金屬離子絡(luò)合于受體顆粒表面；在其它情況下，絡(luò)合于供體珠表面?？赏ㄟ^含N鍵合基將三價(jià)金屬離子絡(luò)合于供體或受體顆粒之一的表面上，含氮鍵合基例如羧甲基-賴氨酸或1-丙基氨基-4-乙酸基-1，4，7-三氮雜環(huán)壬烷鍵合基之一，如1-丙基氨基-4-乙酸基-1，4，7-三氮雜環(huán)壬烷鍵合基。供體顆粒還可包含表面包衣，以有利于能夠被激酶磷酸化的生物分子的結(jié)合。包衣可包含互補(bǔ)結(jié)合對之一。供體珠還可包含表面結(jié)合的生物分子，選自蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸和其組成部分，生物分子能夠被激酶磷酸化以調(diào)節(jié)其生物活性。激酶可選自蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶、蛋白酪氨酸激酶和脂質(zhì)激酶。例如，激酶可以是蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶，選自Akt激酶家族、Aurora激酶家族、PDK1、MAPKAP K2、Erk激酶家族、CAMK激酶家族、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶、RAF激酶家族、酪蛋白激酶家族、PKC家族、PKA家族、PKB家族、PKG家族、GSK3β、ROCK、SGK、Rsk家族或Nek家族；或者，激酶可以是蛋白酪氨酸激酶，選自受體酪氨酸激酶或胞質(zhì)酪氨酸激酶；或者，激酶可以是受體酪氨酸激酶，選自FGFR、EGFR、PDGFR、c-Kit、IGFR、胰島素受體、TrkA、TrkB、TrkC、c-Met或c-Ret；或者，激酶可以是胞質(zhì)酪氨酸激酶，選自Src、Lck、Lyn、Fyn、Yes、Syk、Hck、Ab1或Eph家族；或者，激酶可以是脂質(zhì)激酶，選自PI3激酶、PI4激酶或PI5激酶。該生物分子還可包含與供體珠上表面包衣互補(bǔ)的鍵合基。供體珠包衣可包含抗生物素蛋白，如鏈霉抗生物素蛋白，生物分子上的互補(bǔ)鍵合基可包含生物素。受體珠上的三價(jià)金屬離子與供體珠上磷酸化生物分子的磷酸基團(tuán)之間的生物學(xué)相互作用可以維持珠相互接近。三價(jià)金屬離子可選自Ga3+、Fe3+、A13+、In3+、Ru3+、Sc3+或Y3+。在本發(fā)明方法中，可在引入激酶之前或同時(shí)引入激酶抑制性候選化合物，還可將ATP引入該組合物。
實(shí)施例提供以下實(shí)施例是為了說明本發(fā)明的某些方面和組成材料及其制備。這些實(shí)施例將用于進(jìn)一步說明本發(fā)明，但不旨在以任何方式限制本發(fā)明范圍。
實(shí)施例1材料和方法AlphaScreenTM鏈霉抗生物素蛋白供體珠、AlphaScreenTMNi2+-螯合受體珠和AlphaScreenTM未偶聯(lián)″原始″受體珠購自Perkin Elmer Life and Analytical Sciences(馬薩諸塞州波士頓)。IMAPTM結(jié)合緩沖液獲自Molecular Devices(加利福亞州桑尼維爾)，為5x濃縮液。三價(jià)金屬離子鹽購自Sigma Aldrich，密蘇里州圣路易斯(FeCl3)和Alfa Aesar，馬薩諸塞州Ward Hill(GaCl3和AlCl3)。Akt3激酶和生物素化Crosstide底物購自Upstate，弗吉尼亞州夏洛茨維爾。氰基硼氫鈉和羧甲基-L-賴氨酸購自SigmaAldrich。由獲自VWR International，賓夕法尼亞州西切斯特的研究級材料制備本文所述其它溶液。起初，開發(fā)了將三價(jià)金屬離子絡(luò)合于AlphaScreenTM受體珠的兩種方法，如下所述。
方法1用三價(jià)金屬離子取代Ni2+-螯合AlphaScreenTM珠子上的Ni2+1)通過離心(13,000×g 20分鐘，4℃)獲得250μg(50μl，5mg/ml)Ni2+-螯合受體珠沉淀。
2)將沉淀珠重懸于1mL剝離緩沖液(500mM NaCl，100mM EDTA，50mMTrisHCl，pH8)。渦旋，超聲處理，在37℃避光孵育1小時(shí)。
3)在0.1M TrisHCl，pH8中洗滌3×(13,000×g 20分鐘，4℃)。
4)重懸于1mL 100mM的M3+溶液(如FeCl3、GaCl3或GaNO3)。渦旋，超聲處理，在37℃避光孵育1小時(shí)。
5)用1mL儲存緩沖液(25mM HEPES/100mM NaCl，pH7.4)洗滌2×。
6)將最終洗出物重懸于100μl儲存緩沖液。
方法2通過NTA(羧甲基-賴氨酸)將三價(jià)金屬離子直接偶聯(lián)于AlphaScreenTM受體珠1)在1.5ml小離心管中混合以下物質(zhì)400μg原始AlphaScreenTM醛受體珠(40μl，20mg/ml)10μl 1％吐溫-208μl NaCNBH4(氰基硼氫鈉)溶液(25mg/ml)400μg羧甲基-賴氨酸(40μl，20mg/ml的0.1M MOPS溶液，pH8)62μl 0.1M MOP，pH82)37℃避光振蕩孵育反應(yīng)48-60小時(shí)。
3)加入10μl 1M Tris-HCl，pH7.5以阻斷反應(yīng)。37℃避光孵育1小時(shí)。
4)離心珠，傾析上清，渦旋重懸于200μl 0.1M Tris-HCl，pH8。
5)重復(fù)步驟4兩次。
6)將珠重懸于在1.5mM NaOH中制備的100mM M3+溶液(如FeCl3、GaCl3或GaNO3)。37℃避光孵育1小時(shí)。
7)通過13,000×g 4℃離心20分鐘和重懸于200μl 0.1M Tris-HCl，pH8進(jìn)行洗滌。
8)重復(fù)步驟7兩次。
9)最終洗滌后，將沉淀重懸于受體珠儲存緩沖液(25mM HEPES/100mM NaCl，pH7.4)。
結(jié)果方法1方案.用完全反應(yīng)緩沖液(CRB10mM TrisHCl，10mM MgCl2，0.01％BSA，lmM DTT，pH7.2)將生物素化Crosstide肽(552μM母液)和ATP(10mM母液)分別稀釋至1μM和20μM，制得2×濃縮底物/ATP溶液。用CRB將Akt3激酶(Upstate，約2μM的母液)稀釋至20nM，制得2×濃縮激酶溶液。將10μl 2×底物/ATP溶液與單獨(dú)的10μl CRB或10μl 2×Akt3激酶溶液(最終試驗(yàn)濃度10nM Akt3，10μM ATP，500nM Crosstide)混合，室溫孵育2小時(shí)。作為對照，將一些反應(yīng)與5μM強(qiáng)效泛激酶(pan-kinase)抑制劑星孢素一起預(yù)孵育15分鐘。加入30μl AlphaScreenTM鏈霉抗生物素蛋白供體(10μg/ml)和三價(jià)金屬離子絡(luò)合受體(20μg/ml)珠混合物的3×濃縮IMAPTM結(jié)合緩沖液終止反應(yīng)。用Packard Fusion Alpha讀出各條件的發(fā)光計(jì)數(shù)，見圖1和2(圖1和2所示值為4次重復(fù)試驗(yàn)的平均值)。
方法2方案.用完全反應(yīng)緩沖液(CRB10mM TrisHCl，10mM MgCl2，0.01％BSA，1mM DTT，pH7.2)將生物素化Crosstide肽(552μM母液)和ATP(10mM母液)分別稀釋至1μM，制得2×濃縮底物/ATP溶液。然后連續(xù)1∶1稀釋此溶液，以產(chǎn)生肽濃度固定(1μM)、但ATP濃度不同(20、10、5和2.5μM)的溶液。用CRB連續(xù)稀釋Akt3激酶(Upstate，約2μM的母液)，以制備2×濃縮激酶溶液(20、10、5和2.5nM)。
將10μl各2×底物/ATP溶液與單獨(dú)的10μl CRB或10μl各2×Akt3激酶溶液(最終試驗(yàn)濃度1.25-10nM Akt3，1.25-10μM ATP，500nM Crosstide)混合，室溫孵育1和2小時(shí)。作為對照，將一些反應(yīng)與5μM星孢素一起預(yù)孵育15分鐘。最后孵育2小時(shí)后，通過首先加入15μl AlphaScreenTM鏈霉抗生物素蛋白供體(0.1μg/μl)，然后加入15μl Fe3+絡(luò)合受體(0.2μg/μl)珠的3×濃縮IMAPTM結(jié)合緩沖液終止反應(yīng)。用Packard FusionAlpha讀出各條件的發(fā)光計(jì)數(shù)，見圖3-6。
討論結(jié)果明確表明，三價(jià)金屬離子(M3+)取代的AlphaScreenTM受體珠可以是快速優(yōu)化和評價(jià)激酶試驗(yàn)的有力而簡單的方法。M3+取代的珠不難制備，在預(yù)實(shí)驗(yàn)中成功檢測了Crosstide磷酸化，S/B比約為20。
實(shí)施例2通過1-丙基氨基-4-乙酸基-1，4，7-三氮雜環(huán)壬烷將三價(jià)金屬離子直接偶聯(lián)于AlphaScreenTM受體珠三價(jià)金屬離子可通過1-丙基氨基-4-乙酸基-1，4，7-三氮雜環(huán)壬烷或另一種含N雜環(huán)偶聯(lián)于AlphaScreenTM受體珠，其偶聯(lián)方式與上述方法2通過NTA偶聯(lián)中所述的方式相同。簡要說，原始AlphaScreenTM醛受體珠可與1-丙基氨基-4-乙酸基-1，4，7-三氮雜環(huán)壬烷、吐溫-20和NaCNBH4(氰基硼氫鈉)緩沖液溶液混合。37℃避光振蕩孵育該反應(yīng)48-60小時(shí)，然后加入1M Tris-HCl，pH7.5以阻斷反應(yīng)，然后再37℃避光孵育1小時(shí)。然后離心珠，傾析上清，將沉淀的珠重懸于0.1M Tris-HCl，pH8。將此離心和重懸過程重復(fù)兩次，然后將珠重懸于在1.5mM NaOH中制備的100mM M3+溶液(如FeCl3、GaCl3或GaNO3)，37℃避光孵育1小時(shí)。然后通過離心和重懸于0.1M Tris-HCl，pH8數(shù)次洗滌珠，最后重懸于受體珠儲存緩沖液(25mM HEPES/100mMNaCl，pH7.4)。
實(shí)施例31-丙基氨基-4-乙酸基-1，4，7-三氮雜環(huán)壬烷的合成可通過任何合適技術(shù)獲得或制備1-丙基氨基-4-乙酸基-1，4，7-三氮雜環(huán)壬烷，并已(例如)按照全文納入本文作為參考并用于所有目的的A.Warden，B.Graham，M.T.W.Heam，L.Spiccia Org.Letters，2001，3，2855-2858(和相關(guān)支持信息)所述方法的以下修改而合成。將1，4，7-三氮雜環(huán)壬烷三(tris)HCl(2.0g)溶解于水(12mL)。用30分鐘逐份加入氫氧化鈉(1.3g)，在室溫下攪拌得到的溶液1小時(shí)。將混合物真空濃縮為白色糊狀物，通過數(shù)次甲苯濃縮進(jìn)一步干燥。將甲苯加入得到的殘留物中，超聲處理得到的懸液數(shù)分鐘，然后傾析去除白色固體。將二甲基甲酰胺乙酸二甲酯加入甲苯溶液中，將該混合物加熱回流4小時(shí)。將該反應(yīng)混合物冷卻至室溫，濃縮產(chǎn)生淡黃色油狀物。將此油狀物溶解于乙腈(5mL)，加入N-(3-溴丙基)鄰苯二甲酰亞胺(2.1g)，產(chǎn)生深黃色溶液。攪拌該溶液過夜，產(chǎn)生白色沉淀，過濾收集該沉淀并用乙腈和醚(ether)洗滌(從濾出物中回收其它固體)，產(chǎn)生2.2g(理論值67％)1-(N-(3-丙基)苯二甲酰亞氨基)-1，4，7-三氮雜環(huán)壬烷正脒(orthoamidinium)溴。LC/MS Rt＝1.4分鐘，m/z＝327。將1-(N-(3-丙基)苯二甲酰亞氨基)-1，4，7-三氮雜環(huán)壬烷正脒溴(870mg)溶解于水(10mL)，加熱回流過夜，然后真空濃縮。通過與甲苯共蒸發(fā)去除殘留水，得到粘性黃色油狀物，立即將其溶解于乙腈。超聲處理5分鐘后，加入碳酸鈉(2g)和溴乙酸乙酯(0.29mL)，將得到的混合物加熱回流2天。冷卻至室溫后，過濾去除固體，真空濃縮濾出液，得到黃色油狀物。將該油狀物溶于水并萃取到氯仿中。用硫酸鎂干燥合并的有機(jī)相，過濾并濃縮產(chǎn)生499mg淡黃色油狀物。將此油狀物溶解于5MHCl(11mL)，加熱到93℃ 20小時(shí)。將該溶液冷卻至室溫，然后放入冰箱過夜，形成白色沉淀。過濾去除固體，濃縮濾出液，產(chǎn)生油狀殘留物，將其溶解于氫溴酸(4mL)和乙酸(4mL)中。加入醚(ether)直到觀察到兩層，將該混合物儲存于冰箱3天。在氮?dú)鈴?fù)蓋層下過濾收集得到的白色固體，用水洗滌。在真空中進(jìn)一步干燥該固體，得到300mg標(biāo)題化合物。LC/MS Rt＝0.3分鐘m/z＝245。NMR(1H，300MHz)與公開數(shù)據(jù)相同。
其它實(shí)施方式如上所述，雖然本文主要參照蛋白激酶試驗(yàn)描述了本發(fā)明，但它可廣泛應(yīng)用于任何磷酸化或去磷酸化反應(yīng)酶。本發(fā)明的組合物和方法也可用于其他類型酶，包括脂質(zhì)激酶、磷酸酶和磷酸二酯酶的試驗(yàn)。
對脂質(zhì)激酶而言，比如PI3K，生理反應(yīng)是PI-4，5-P2至PI-3，4，5-P。PI(磷脂酰肌醇)本身也可用作底物。一旦PI或PIP2被磷酸化，由于加入磷酸基團(tuán)使該珠的信號增加。
對于磷酸酶和磷酸二酯酶而言，該試驗(yàn)以與激酶試驗(yàn)相反的方式進(jìn)行，因?yàn)榱姿崦负土姿岫ッ改苋コ姿峄鶊F(tuán)，例如，磷酸酶或磷酸二酯酶抑制劑會產(chǎn)生比對照高的化學(xué)發(fā)光信號。
結(jié)論雖然根據(jù)幾個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式描述了本發(fā)明，但是本發(fā)明不應(yīng)僅限于上述特定情況?？刹捎蒙鲜鰞?yōu)選實(shí)施方式的許多變化形式。因此，應(yīng)參照所附權(quán)利要求書廣義解釋本發(fā)明。
將本文引用的所有參考文獻(xiàn)全文納入本文作參考并用于所有目的。
權(quán)利要求
1.一種組合物，其包含含光敏劑的供體顆粒；含有化學(xué)發(fā)光化合物的受體顆粒，所述化合物的特征是在光敏劑被活化且供體和受體顆粒接近時(shí)它產(chǎn)生發(fā)光信號；和絡(luò)合于供體或受體顆粒之一的表面的三價(jià)金屬離子。
2.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，在被光源激發(fā)后，活化的光敏劑能將環(huán)境氧轉(zhuǎn)變?yōu)閱尉€態(tài)氧。
3.如權(quán)利要求2所述的組合物，其特征在于，所述光源是激光。
4.如權(quán)利要求3所述的組合物，其特征在于，所述光敏劑是內(nèi)過氧化物。
5.如權(quán)利要求2所述的組合物，其特征在于，所述化學(xué)發(fā)光化合物是二甲基噻吩衍生物。
6.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述顆粒分散于水性介質(zhì)中。
7.如權(quán)利要求6所述的組合物，其特征在于，所述接近距離不大于單線態(tài)氧在其壽命中在水溶液中穿過的距離。
8.如權(quán)利要求7所述的組合物，其特征在于，所述距離不大于200nm。
9.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述顆粒是聚合物珠。
10.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述三價(jià)金屬離子絡(luò)合于所述受體顆粒表面。
11.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述三價(jià)金屬離子絡(luò)合于所述供體顆粒表面。
12.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述三價(jià)金屬離子通過含N鍵合基絡(luò)合于所述供體或受體顆粒之一的表面。
13.如權(quán)利要求12所述的組合物，其特征在于，所述三價(jià)金屬離子通過羧甲基-賴氨酸和1-丙基氨基-4-乙酸基-1，4，7-三氮雜環(huán)壬烷鍵合基之一絡(luò)合于所述供體或受體顆粒之一的表面。
14.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述三價(jià)金屬離子選自Ga3+、Fe3+、Al3+、In3+、Ru3+、Sc3+或Y3+。
15.一種組合物，其包含含光敏劑的供體顆粒；含有化學(xué)發(fā)光化合物的受體顆粒，所述化合物的特征是在光敏劑被活化且供體和受體顆粒接近時(shí)它產(chǎn)生發(fā)光信號；和通過1-丙基氨基-4-乙酸基-1，4，7-三氮雜環(huán)壬烷鍵合基絡(luò)合于所述受體顆粒表面的三價(jià)金屬離子。
16.一種用于試驗(yàn)的試劑盒，所述試劑盒在包裝組合中包括進(jìn)行試驗(yàn)的試劑，所述試劑包含，含光敏劑的供體顆粒；含化學(xué)發(fā)光化合物的受體顆粒，所述化合物的特征是在光敏劑被活化且供體和受體顆粒接近時(shí)它產(chǎn)生發(fā)光信號；和絡(luò)合于供體或受體顆粒之一的表面的三價(jià)金屬離子。
17.如權(quán)利要求16所述的試劑盒，其特征在于，所述三價(jià)金屬離子通過含N鍵合基絡(luò)合于所述供體或受體顆粒之一的表面。
18.如權(quán)利要求17所述的試劑盒，其特征在于，所述三價(jià)金屬離子通過羧甲基-賴氨酸和1-丙基氨基-4-乙酸基-1，4，7-三氮雜環(huán)壬烷鍵合基之一絡(luò)合于所述供體或受體顆粒之一的表面。
19.如權(quán)利要求18所述的試劑盒，其特征在于，所述三價(jià)金屬離子通過1-丙基氨基-4-乙酸基-1，4，7-三氮雜環(huán)壬烷鍵合基絡(luò)合于受體顆粒表面。
20.如權(quán)利要求16所述的試劑盒，還包括進(jìn)行三價(jià)金屬介導(dǎo)的均相發(fā)光鄰近試驗(yàn)的說明書。
21.一種檢測激酶抑制性化合物的方法，所述方法包括提供一種組合物，其包含，含光敏劑和能被激酶磷酸化的、表面結(jié)合的未磷酸化生物分子的供體顆粒，和含絡(luò)合于其顆粒表面的三價(jià)金屬離子和化學(xué)發(fā)光化合物的受體顆粒，所述化合物的特征是在光敏劑被活化且供體和受體顆粒接近時(shí)它產(chǎn)生發(fā)光信號；將激酶抑制性候選化合物引入所述組合物；將激酶引入所述組合物；和通過檢測抑制性候選化合物對激酶的抑制，確定該激酶抑制性候選化合物是激酶性化合物，激酶抑制的觀察結(jié)果為，相對于缺少抑制性候選化合物的對照組合物發(fā)出的化學(xué)光，化學(xué)發(fā)光減少。
22.如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，所述三價(jià)金屬離子通過含N鍵合基絡(luò)合于所述供體或受體顆粒之一的表面。
23.如權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于，所述三價(jià)金屬離子通過羧甲基-賴氨酸和1-丙基氨基-4-乙酸基-1，4，7-三氮雜環(huán)壬烷鍵合基之一絡(luò)合于所述受體顆粒的表面。
24.如權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于，所述三價(jià)金屬離子通過1-丙基氨基-4-乙酸基-1，4，7-三氮雜環(huán)壬烷鍵合基絡(luò)合于受體顆粒表面。
25.如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，在引入所述激酶前引入所述激酶抑制性候選化合物。
26.如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，同時(shí)引入所述激酶抑制性候選化合物和所述激酶。
27.一種檢測磷酸酶或磷酸二酯酶抑制性化合物的方法，所述方法包括提供一種組合物，其包含，含光敏劑和能被磷酸酶或磷酸二酯酶去磷酸化的、表面結(jié)合的磷酸化生物分子的供體顆粒，和包含絡(luò)合于顆粒表面的三價(jià)金屬離子和化學(xué)發(fā)光化合物的受體顆粒，所述化合物的特征是在光敏劑被活化且供體和受體顆粒接近時(shí)它產(chǎn)生發(fā)光信號；將磷酸酶或磷酸二酯酶引入所述組合物；將磷酸酶或磷酸二酯酶抑制性候選化合物引入所述組合物；和通過檢測抑制性候選化合物對磷酸酶或磷酸二酯酶的抑制，確定該磷酸酶或磷酸二酯酶抑制性候選化合物是磷酸酶或磷酸二酯酶抑制性化合物，酶抑制的觀察結(jié)果為，相對于缺少抑制性候選化合物的對照組合物發(fā)出的化學(xué)光，化學(xué)發(fā)光增加。
全文摘要
一種體外蛋白激酶試驗(yàn)技術(shù)，它的特征為(1)試驗(yàn)信噪比(S/B)和范圍(S－B)高；(2)均相；(3)非放射性；和(4)不需要磷酸化特異性抗體。所述試驗(yàn)包括(例如)通過合適鍵合基將三價(jià)金屬離子(如Ga
文檔編號C12Q1/42GK101023183SQ200580031496
公開日2007年8月22日 申請日期2005年9月19日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月17日
發(fā)明者R·C·郭, T·D·道斯, T·D·馬查朱斯基 申請人:希龍公司