專利名稱：含有疏水蛋白的充氣食品的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及包含疏水蛋白的冷凍產(chǎn)品。
背景技術(shù)：
冷凍產(chǎn)品在貯藏過程中，其中存在的冰晶因動(dòng)力學(xué)過程如重結(jié)晶其大小往往會(huì)增大。這會(huì)導(dǎo)致不良的產(chǎn)品特性，如不良的外觀和不可接受的口感，和/或?qū)е庐a(chǎn)品損害。之前已有建議使用稱為“抗凍蛋白”(也稱“制約冰晶結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)(ice structuring protein)”)的蛋白質(zhì)來抑制冰重結(jié)晶過程。
發(fā)明概述我們發(fā)現(xiàn)，在真菌中發(fā)現(xiàn)的一類稱為疏水蛋白的蛋白質(zhì)也能夠抑制冷凍產(chǎn)品中的冰晶生長(zhǎng)。
因此，本發(fā)明提供冷凍組合物，如冷凍食品，所述組合物包含疏水蛋白，優(yōu)選分離形式的疏水蛋白。在相關(guān)的方面，本發(fā)明提供冷凍組合物如冷凍食品，其包含能夠在空氣-液體表面裝配的形式的疏水蛋白，并提供加入了所述形式的疏水蛋白的冷凍組合物，如冷凍食品。
優(yōu)選疏水蛋白是II類疏水蛋白。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，疏水蛋白的含量是至少0.001wt％，更優(yōu)選至少0.01wt％。
在一個(gè)實(shí)施方案中，冷凍組合物是充氣的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，冷凍組合物是不充氣的。
在相關(guān)的方面，本發(fā)明提供用以生產(chǎn)本發(fā)明的冷凍食品的組合物，所述組合物包含疏水蛋白，優(yōu)選分離形式的疏水蛋白，以及至少一種所述食品的其余成分，所述組合物為非冷凍形式。優(yōu)選所述組合物包含所述食品的所有其余成分。
在相關(guān)的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用以生產(chǎn)本發(fā)明的冷凍食品的干組合物，所述組合物包含疏水蛋白，優(yōu)選分離形式的疏水蛋白，以及至少一種所述食品其余的非液體成分。優(yōu)選所述組合物包含所述食品所有其余的非液體成分。
本發(fā)明還提供疏水蛋白在抑制冷凍組合物中冰晶生長(zhǎng)的方法中的用途。優(yōu)選疏水蛋白用以抑制冰重結(jié)晶。
在相關(guān)的方面，本發(fā)明還提供疏水蛋白在改變冷凍組合物中冰晶習(xí)性的方法中的用途。
本發(fā)明進(jìn)一步提供抑制冷凍組合物中冰晶生長(zhǎng)例如冰重結(jié)晶的方法，所述方法包括在所述組合物冷凍之前和/或冷凍過程中向組合物加入疏水蛋白。
在相關(guān)的方面，本發(fā)明提供改變冷凍組合物中冰晶習(xí)性的方法，所述方法包括在所述產(chǎn)品冷凍之前和/或冷凍過程中向組合物加入疏水蛋白。
在上述用途和方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述組合物是冷凍食品。
發(fā)明詳述除非另有定義，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有相關(guān)領(lǐng)域(如冷卻糖食品/冷凍糖食品制造、化學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域)普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。冷卻/冷凍糖食品制造中使用的各種術(shù)語和技術(shù)的定義和描述見于Ice Cream，第4版，Arbuckle(1986)，VanNostrand Reinhold Company，New York，NY。用于分子和生化方法技術(shù)可見于Sambrook等，Molecular CloningA Laboratory Manual，第3版(2001)Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.和Ausubel等，Short Protocols in Molecular Biology(1999)第4版，JohnWiley & Sons，Inc.，完全版本名為Current Protocols in MolecularBiology)。
疏水蛋白疏水蛋白是定義明確的一類蛋白質(zhì)(Wessels，1997，Adv.Microb.Physio.381-45；Wosten，2001，Annu Rev.Microbiol.55625-646)，能夠在疏水/親水界面自裝配，具有以下保守序列Xn-C-X5-9-C-C-X11-39-C-X8-23-C-X5-9-C-C-X6-18-C-Xm(SEQ ID No.1)其中X代表任何氨基酸，n和m獨(dú)立代表整數(shù)。通常，疏水蛋白的長(zhǎng)度最多達(dá)125個(gè)氨基酸。保守序列中的半胱氨酸殘基(C)是二硫鍵的一部分。在本發(fā)明情形中，術(shù)語疏水蛋白具有更寬的含義，包括仍顯示在疏水-親水界面自裝配產(chǎn)生蛋白質(zhì)膜的特性的功能等價(jià)蛋白質(zhì)，如包含以下序列或其部分、仍顯示在疏水-親水界面自裝配產(chǎn)生蛋白質(zhì)膜的特性的蛋白質(zhì)Xn-C-X1-50-C-X0-5-C-X1-100-C-X1-100-C-X1-50-C-X0-5-C-X1-50-C-Xm(SEQ ID No.2)按照本發(fā)明的定義，自裝配可通過將蛋白質(zhì)吸附到特氟隆(Teflon)上，并用圓二色性確定二級(jí)結(jié)構(gòu)(一般是α-螺旋)的存在來檢測(cè)(De Vocht等，1998，Biophys.J.742059-68)。
膜的形成可通過將特氟隆薄片(sheet)在蛋白質(zhì)溶液中溫育，然后用水或緩沖液至少洗滌三次來確定(Wosten等，1994，Embo.J.135848-54)。蛋白質(zhì)膜可用任何合適的方法來顯現(xiàn)，如用熒光標(biāo)志進(jìn)行標(biāo)記，或者使用熒光抗體，這在本領(lǐng)域是已經(jīng)確立的。m和n的數(shù)值通常在0-2000的范圍，但更通常是m和n加起來小于100或200。在本發(fā)明情形中，疏水蛋白的定義包括疏水蛋白和另一種多肽的融合蛋白以及疏水蛋白與其它分子如多糖的綴合物。
目前為止得到鑒定的疏水蛋白一般可歸類為I類或II類疏水蛋白。這兩種類型的疏水蛋白在真菌中已被鑒定為分泌蛋白，可在疏水-親水界面自裝配成兩性膜。I類疏水蛋白的裝配物相對(duì)不可溶，而II類疏水蛋白的裝配物則容易溶解于各種溶劑中。
還在絲狀細(xì)菌如放線菌(Actinomycete sp.)和鏈霉菌(Steptomycessp.)中鑒定出疏水蛋白樣蛋白質(zhì)(WO01/74864)。這些細(xì)菌蛋白質(zhì)與真菌疏水蛋白相比，只能最多形成一個(gè)二硫鍵，因?yàn)樗鼈冎挥袃蓚€(gè)半胱氨酸殘基。這種蛋白質(zhì)是具有SEQ ID No.1和2所示共有序列的疏水蛋白功能等價(jià)物的實(shí)例，落入本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
可用任何合適的方法從天然來源如絲狀真菌提取獲得疏水蛋白。例如，可通過培養(yǎng)能將疏水蛋白分泌到生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的絲狀真菌，或者通過用60％乙醇從真菌菌絲體提取，來獲得疏水蛋白。特別優(yōu)選從能天然分泌疏水蛋白的宿主生物分離疏水蛋白。優(yōu)選的宿主是絲孢菌(例如木霉屬)、擔(dān)子菌和子囊菌。特別優(yōu)選的宿主是食品級(jí)生物，如能分泌稱為cryparin的疏水蛋白的栗疫病菌(Cryphonectriaparasitica)(MacCabe和Van Alfen，1999，App.Environ.Microbiol 655431-5435)。
或者，可用重組技術(shù)獲得疏水蛋白。例如可對(duì)宿主細(xì)胞(通常是微生物)進(jìn)行修飾以表達(dá)疏水蛋白，然后疏水蛋白可根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行分離和使用。用以將編碼疏水蛋白的核酸構(gòu)建物引入到宿主細(xì)胞中的方法是本領(lǐng)域公知的。已經(jīng)從16種以上的真菌克隆了超過34個(gè)編碼疏水蛋白的基因(參見例如WO96/41882，該專利給出了在雙孢蘑菇(Agaricus bisporus)中鑒定出的疏水蛋白的序列；和Wosten，2001，Annu Rev.Microbiol.55625-646)。也可以用重組技術(shù)來修飾疏水蛋白序列或者合成具有需要的/改進(jìn)特性的新型疏水蛋白。
通常，用編碼所需疏水蛋白的核酸構(gòu)建物轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞或生物。可將編碼所述多肽的核苷酸序列插入到編碼轉(zhuǎn)錄和翻譯的必需元件的合適表達(dá)載體中，插入的方式要使得所述核苷酸序列在適當(dāng)條件下會(huì)被表達(dá)(例如在適當(dāng)?shù)姆较蛏虾驼_的讀框中，有適合的靶向和表達(dá)序列)。構(gòu)建這些表達(dá)載體所需的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。
有多種表達(dá)系統(tǒng)可用來表達(dá)多肽編碼序列。這些表達(dá)系統(tǒng)包括但不限于細(xì)菌、真菌(包括酵母)、昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)、植物細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)和植物，它們都用用適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體轉(zhuǎn)化。優(yōu)選的宿主是被認(rèn)為是食品級(jí)——公認(rèn)為安全(GRAS)的宿主。
合適的真菌包括酵母如(但不限于)酵母菌屬(Saccharomyces)、(Kluyveromyces)、畢赤氏酵母屬(Pichia)、漢遜酵母屬(Hansenula)、假絲酵母屬(Candida)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)等屬酵母和絲狀真菌如(但不限于)曲霉屬(Aspergillus)、木霉屬(Trichoderma)、毛霉屬(Mucor)、鏈孢霉屬(Neurospora)、鐮刀菌屬(Fusarium)等屬絲狀真菌。
編碼疏水蛋白的序列優(yōu)選在氨基酸水平上與在自然界鑒定的疏水蛋白有至少80％的同一性，更優(yōu)選有至少95％或100％的同一性。但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員可作出不降低疏水蛋白的生物活性的保守置換或其它氨基酸變化。對(duì)于本發(fā)明的目的，這些擁有與天然疏水蛋白的高水平同一性的疏水蛋白，也包括在術(shù)語“疏水蛋白”當(dāng)中。
疏水蛋白可例如按WO 01/57076描述的程序從培養(yǎng)基或細(xì)胞提取物中純化，所述程序涉及將含疏水蛋白的溶液中存在的疏水蛋白吸附到表面上，然后將該表面與表面活性劑如Tween 20接觸，以從該表面洗脫出疏水蛋白。另參見Collen等，2002，Biochim Biophys Acta.1569139-50；Calonje等，2002，Can.J.Microbiol.481030-4；Askolin等，2001，Appl Microbiol Biotechnol.57124-30和De Vries等，1999，Eur J Biochem.262377-85。
冷凍組合物冷凍組合物/冷凍產(chǎn)品包括冷凍食品和冷凍生物材料。冷凍食品包括冷凍植物來源材料如水果和蔬菜，冷凍動(dòng)物來源材料如冷凍肉和魚，以及冷凍加工食品如現(xiàn)成膳食、調(diào)味汁和冷凍糖食如冰淇淋、乳冰、冷凍酸乳酪、冰糕、糖漿飲料、冷凍蛋奶甜羹、水凍冰塊、清涼果汁飲料、格蘭尼它冰糕(Granitas)和冷凍果泥。
本發(fā)明的冷凍組合物可以是充氣的或不充氣的。術(shù)語“充氣”指已例如通過機(jī)械手段有意地將氣體引入到了產(chǎn)品中。氣體優(yōu)選是任何食品級(jí)氣體，如空氣、氮?dú)饣蚨趸肌３錃獬潭?，尤其是在充氣食品的情形中，通常以“膨脹度”來定義。在本發(fā)明的情形中，％膨脹度按體積定義為((充氣終產(chǎn)品的體積-混合料的體積)/混合料的體積)×100產(chǎn)品的膨脹度須根據(jù)所需的產(chǎn)品特性而變。例如，冰淇淋的膨脹度水平通常是約70-100％，而水凍冰塊則是25-30％。
不充氣組合物如冷凍食品的膨脹度優(yōu)選低于20％，更優(yōu)選低于10％。不充氣冷凍食品沒有經(jīng)歷故意的處理步驟如攪打以增加氣體含量。盡管如此，應(yīng)認(rèn)識(shí)到在不充氣冷凍食品的制作過程中，可能有低水平的氣體如空氣摻入到其中。
冷凍糖食品冷凍糖食包括通常包含乳或乳固體的糖食，如冰淇淋、乳冰、冷凍酸乳酪、冰糕和冷凍蛋奶甜羹，以及不含乳或乳固體的冷凍糖食，如水凍冰塊、清涼果汁飲料、格蘭尼它冰糕和冷凍果泥。
冷凍糖食可為復(fù)合產(chǎn)品的形式，產(chǎn)品中至少一部分或區(qū)域(如芯或覆層)不含有疏水蛋白。其實(shí)例是以下產(chǎn)品，其中冰淇淋芯沒有疏水蛋白，包覆芯的冰淇淋、乳冰或水凍冰塊覆層則含有疏水蛋白。應(yīng)認(rèn)識(shí)到，在復(fù)合產(chǎn)品的情況下，所加入的疏水蛋白的wt％只針對(duì)糖食中含有疏水蛋白的成分而不是針對(duì)整個(gè)產(chǎn)品來計(jì)算。
充氣冷凍糖食的膨脹度優(yōu)選是25％-300％，如25％-150％，更優(yōu)選50-150％。
本發(fā)明冷凍組合物中存在的疏水蛋白的量一般須根據(jù)產(chǎn)品配方而變，在充氣產(chǎn)品的情況下根據(jù)空氣相的體積而變。通常，產(chǎn)品須含有至少0.001wt％疏水蛋白，更優(yōu)選至少0.005或0.01wt％。通常產(chǎn)品須含有低于1wt％疏水蛋白。疏水蛋白可來自單一來源或多個(gè)來源，例如疏水蛋白可以是兩種或多種不同的疏水蛋白多肽的混合物。
優(yōu)選疏水蛋白是II型疏水蛋白。
本發(fā)明還涵括用以生產(chǎn)本發(fā)明的冷凍食品的組合物，所述組合物包含疏水蛋白。一般地，疏水蛋白須為分離形式，通常至少部分純化，如以固形物重量計(jì)至少10％或20％純。因此，疏水蛋白并不是作為天然表達(dá)疏水蛋白的天然生物如蘑菇的一部分來加入。相反，疏水蛋白通常須是從天然來源提取得到的，或者是通過在宿主生物中重組表達(dá)獲得的。
這種組合物包括液體預(yù)混合料，例如用以生產(chǎn)冷凍糖食品的預(yù)混合料，和干混合料例如粉末料，其在冷凍之前或冷凍過程中加入含水液體如乳或水。
用以生產(chǎn)本發(fā)明的冷凍食品的組合物除包含疏水蛋白外，還須包含食品中通常包括的其它成分，例如糖、脂肪、乳化劑、調(diào)味劑等。所述組合物可包含制作所述食品所需的所有其余成分，使得它可容易地加工形成本發(fā)明的冷凍食品。
用以生產(chǎn)本發(fā)明的冷凍食品的干組合物除包含疏水蛋白外，還須包含食品中通常包括的其它成分，例如糖、脂肪、乳化劑、調(diào)味劑等。所述組合物可包含制作所述食品所需的所有其余非液體成分，使得使用者所要做的只是加入含水液體如水或乳，所述組合物就可容易地加工形成本發(fā)明的冷凍食品。這些干組合物的實(shí)例包括粉末料和顆粒料，可被設(shè)計(jì)成供工業(yè)使用和零售使用，且得益于體積減少和貨架期延長(zhǎng)。
向組合物中加入的疏水蛋白的形式和數(shù)量，要使得疏水蛋白能抑制冰晶生長(zhǎng)如冰重結(jié)晶和/或改變冰晶習(xí)性。術(shù)語“加入”我們用以指有意地將疏水蛋白引入到組合物中，目的是利用它的抑制冰晶生長(zhǎng)和/或改變冰晶習(xí)性的能力。因此，對(duì)于存在或加入了含有真菌污染物的成分，而真菌污染物可能含有疏水蛋白多肽的情況，這并不等同于本發(fā)明情形當(dāng)中的加入疏水蛋白。
通常，加入到產(chǎn)品中的疏水蛋白的形式是能夠在空氣-液體表面自裝配的形式。
通常，疏水蛋白以分離形式加入的本發(fā)明的組合物中，通常至少部分純化，如固形物重量計(jì)至少10％純。所謂“以分離形式加入”我們指疏水蛋白并不是作為天然表達(dá)疏水蛋白的天然生物如蘑菇的一部分來加入。相反，疏水蛋白通常須是從天然來源提取得到的，或者是通過在宿主生物中重組表達(dá)獲得的。
所加入的疏水蛋白可用以減少或抑制冰晶的生長(zhǎng)，例如以抑制冰重結(jié)晶的過程，和/或改變冰晶習(xí)性(即冰晶形狀)。抑制和/或改變可在冷凍過程中和/或冷凍之后如貯藏過程中發(fā)生。在冷凍過程中對(duì)冰晶生長(zhǎng)和/或冰晶習(xí)性的抑制可用來改變產(chǎn)品的質(zhì)地。冰重結(jié)晶的抑制可提高產(chǎn)品對(duì)熱濫用的穩(wěn)定性。
疏水蛋白也可用來抑制細(xì)胞生物材料中的冰晶生長(zhǎng)如冰重結(jié)晶和/或冰晶習(xí)性。這會(huì)有助于減少用以保存生物材料的冷凍方法對(duì)細(xì)胞造成的損害。這種生物材料包括單細(xì)胞生物和細(xì)胞系的培養(yǎng)物；配子如精子和卵子；和衍生自多細(xì)胞生物(動(dòng)植物)的組織和器官。
因此，本發(fā)明還提供冷凍的細(xì)胞生物材料，其包含分離形式的疏水蛋白，優(yōu)選包含至少0.001wt％疏水蛋白，條件是將人排除在外。
本發(fā)明進(jìn)一步提供疏水蛋白在冷凍細(xì)胞生物材料中抑制冰晶生長(zhǎng)如冰重結(jié)晶和/或改變冰晶習(xí)性的用途。抑制/改變可在生物材料的冷凍過程中和/或冷凍之后發(fā)生。
現(xiàn)參考以下只是示例性而非限制性的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的描述。
附圖簡(jiǎn)述

圖1是顯示充氣冷凍產(chǎn)品的剪切方案(regime)的示圖。
圖2是充氣冷凍產(chǎn)品微結(jié)構(gòu)的掃描電子顯微照片-新鮮的和熱濫用后的(放大倍數(shù)×100)。
圖3是充氣冷凍產(chǎn)品微結(jié)構(gòu)的掃描電子顯微照片-新鮮的和熱濫用后的(放大倍數(shù)×300)。
圖4顯示不充氣產(chǎn)品的掃描電子顯微照片(無HFBII)(50×放大倍數(shù))。
圖5顯示不充氣產(chǎn)品的掃描電子顯微照片(有HFBII)(50×放大倍數(shù))。
實(shí)施例1-充氣冷凍產(chǎn)品用3種類型的蛋白質(zhì)制備充氣冷凍產(chǎn)品A酪蛋白酸鈉(Na Cas)B脫脂奶粉(SMP)C來自里氏木霉(Trichoderma reesei)疏水蛋白(HFB II)對(duì)各產(chǎn)品在溫度濫用方案之前和之后的微結(jié)構(gòu)特性和物理特性進(jìn)行比較。
材料所用材料的具體細(xì)節(jié)在表1中總結(jié)，用以制備每種充氣冷凍產(chǎn)品的配方在表2中顯示。
表1.所用材料
表2.所用配方
充氣冷凍產(chǎn)品的制備混合料(乳狀液)制備所有的混合料均按100g批量制備。對(duì)于混合料A和B(分別含有酪蛋白酸鈉和脫脂奶粉)，將蛋白質(zhì)與蔗糖混合，用磁力攪拌器分散到冷水中。然后將溶液攪拌加熱至60℃，保持5分鐘，接著冷卻至40℃。然后加入熔化的椰子脂，立即用Branson Sonifer(帶6.4mm錐形探頭)在70％振幅下將含水混合料超聲處理3分鐘，探頭浸沒在溶液中。然后將所得乳狀液在-10℃水浴中快速冷卻，直到溶液溫度為5℃，以使脂肪滴結(jié)晶。將混合料在5℃下貯藏備用。
對(duì)于混合料C(含有HFB II)，首先將蔗糖攪拌分散到冷水中。然后，將一半所需濃度的HFB II作為等分試樣加入。接著將溶液在超聲浴中溫和超聲處理30秒，以使HFB II完全分散。然后將此溶液在磁力攪拌器上攪拌和加熱至40℃。在加入熔化的脂肪之前，再將溶液在超聲浴中超聲處理30秒。然后加入熔化的脂肪，所得混合料按對(duì)混合料A和B的描述進(jìn)行乳化和冷卻。接著向此冷溶液中加入另一HFB II等分試樣，以使HFB II濃度達(dá)到0.2％。第一個(gè)0.1％HFBII用以使脂肪乳化和穩(wěn)定化。HFB II的第二次加入則會(huì)提供足夠過量的HFB II，以提供良好的充氣作用和泡沫穩(wěn)定性。
用Malvern Mastersizer 2000對(duì)冷凍的乳狀液進(jìn)行顆粒大小分析。
乳狀液的分析按照這一方法，我們能夠制備出具有小脂肪滴的乳狀液。表3總結(jié)了所測(cè)出的油滴大小。
表3.用Malvern Mastersizer 2000測(cè)出的乳狀液顆粒大小
剪切冷凍方法將80ml混合料在圓柱形垂直安裝帶夾套的不銹鋼容器中同時(shí)進(jìn)行剪切和冷凍，該容器的內(nèi)部大小是高度105mm，直徑72mm。該容器的蓋占滿其內(nèi)部體積的54％，只留下46％(180ml)給樣品。用以剪切樣品的轉(zhuǎn)子由正確大小的矩形推進(jìn)器(尺寸72mm×41.5mm)組成，以在容器旋轉(zhuǎn)過程中刮擦容器的表面邊界(surface edge)。轉(zhuǎn)子上還連接有兩個(gè)半圓形(60mm直徑)高剪切葉片，該葉片與該矩形附加裝置成45°角定位。容器外包圍著夾套，夾套里有冷卻劑流過。
充氣和冷凍樣品(prototype)大體上如下產(chǎn)生用推進(jìn)器在高剪切速度下混合密閉容器里的混合料，以摻入空氣。同時(shí)，冷卻劑流過容器夾套，使混合料冷凍下來。推進(jìn)器還刮擦容器內(nèi)壁，將內(nèi)壁上形成的冰除去并摻入到混合料當(dāng)中。開始時(shí)用高剪切使混合料充氣，然后將剪切速度降下來，以便更好地進(jìn)行冷凍。每種混合料所用的剪切方案在圖1中圖示。
對(duì)于混合料A和B(分別含有酪蛋白酸鈉和脫脂奶粉)的冷凍和充氣步驟，設(shè)定冷凍劑(設(shè)定在-18℃)從時(shí)間＝0分鐘開始循環(huán)?；旌狭螦和B在開始時(shí)攪拌速度較慢，是為了便于冷卻混合料和產(chǎn)生一定的粘度(通過冰的形成和摻入)，然后才用較高的剪切速度進(jìn)行充氣。在高速度下短時(shí)間就將空氣摻入，然后逐步降低速度，以讓樣品達(dá)到至少-5℃。
對(duì)于混合料C(含有HFB II)，將容器冷卻至約5℃，加入樣品，啟動(dòng)高剪切充氣。冷卻劑(設(shè)定在-18℃)在第9分鐘才開啟進(jìn)行循環(huán)，因?yàn)橐a(chǎn)生100％膨脹度所需的時(shí)間增加。一旦開啟冷卻劑進(jìn)行循環(huán)(第9分鐘)，則采取和前面的A和B一樣的剪切-冷卻模式。
在整個(gè)過程結(jié)束時(shí)，測(cè)量膨脹度，將樣品(大約15g)放入小罐中。將每種產(chǎn)品在設(shè)定在-80℃的冷凍裝置中再冷卻10分鐘，然后在-20℃下貯藏。
充氣冷凍產(chǎn)品的分析所有的充氣冷凍產(chǎn)品均按兩種溫度方案進(jìn)行貯藏(a)-20℃。隨后在生產(chǎn)后一星期內(nèi)進(jìn)行分析，我們認(rèn)為這種產(chǎn)品是“新鮮”產(chǎn)品。
(b)使溫度濫用樣品經(jīng)歷-10℃貯藏1或2個(gè)星期，然后分析前在-20℃下貯藏。
表4.從混合料A、B和C制備的產(chǎn)品的過程細(xì)節(jié)和產(chǎn)品膨脹度。
終產(chǎn)品作如下分析剛制得的產(chǎn)品的膨脹度新鮮產(chǎn)品和溫度濫用產(chǎn)品的SEM分析新鮮產(chǎn)品和溫度濫用產(chǎn)品的熔化行為膨脹度每種產(chǎn)品的膨脹度在表4中總結(jié)。所有的混合料都是可充氣的，摻入了大量的空氣。
微結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性方法掃描電鏡術(shù)(SEM)每種產(chǎn)品的微結(jié)構(gòu)用低溫掃描電鏡術(shù)(LTSEM)來顯現(xiàn)。將樣品在干冰上冷卻至-80℃，切出樣品斷片。用Tissue TekOCTTM化合物(PVA 11％、Carbowax 5％和85％非反應(yīng)性成分)，將大小約5mm×5mm×10mm的此斷片安放在樣品支持器上。將樣品包括支持架投入液氮漿(slush)中，并轉(zhuǎn)移到低溫制備室Oxford Instrument CT1500HF中。制備室處在約10-4巴真空下，樣品升溫至-90℃。冰被慢慢蝕刻，暴露出不由冰本身產(chǎn)生的表面細(xì)節(jié)，因此在此溫度下要在恒定真空下除水60-90秒。樣品一旦蝕刻好，就將其冷卻至-110℃以結(jié)束升華作用，并使用氬等離子體包覆以金。這個(gè)過程也發(fā)生在真空下，施加10-1毫巴壓力、6毫安電流45秒。然后將樣品轉(zhuǎn)移到常規(guī)的掃描電子顯微鏡(JSM 5600)，該掃描電子顯微鏡裝配有溫度-160℃的Oxford Instruments冷臺(tái)。檢查樣品，并通過數(shù)字影像擷取軟件捕獲目的區(qū)域。
冷凍斷裂透射電鏡術(shù)(TEM)將樣品放在置于干冰床上的鋁盤上，用冷的解剖刀切出大約5mm×3mm×3mm的小塊。使用Tissue-Tek O.C.T化合物(Sakura Finetek，Europe BV)，將樣品塊垂直安放在大的“禮帽”冷凍斷裂支持器中。立即在液氮下將該支持器放入Cressingtion CFE-50的轉(zhuǎn)移裝置中，并轉(zhuǎn)移到冷凍斷裂室(-180℃)中。樣品用擺動(dòng)式切片刀擊打一次發(fā)生斷裂，然后在-95℃下蝕刻10分鐘。蝕刻出的表面用鉑/碳旋轉(zhuǎn)造影(rotary shadow)(45°)至2nm的厚度，然后用碳包覆至10nm的厚度。將包覆樣品移出冷凍斷裂室和轉(zhuǎn)移裝置，金屬?gòu)?fù)制品就漂浮離開樣品到水上。將復(fù)制品在鉻酸中清洗，用水洗滌數(shù)次，然后收集在400目銅EM網(wǎng)格上。讓網(wǎng)格干燥，然后進(jìn)行TEM檢查。
用在100KV下操作的JEOL 1200EX II顯微鏡進(jìn)行TEM檢查。用Bioscan照相機(jī)和Digital Micrograph軟件(Gatan Inc)獲取影像。
微結(jié)構(gòu)分析結(jié)果用掃描電鏡術(shù)(SEM)檢查了新鮮的和溫度濫用的冷凍產(chǎn)品的微結(jié)構(gòu)。不同放大倍數(shù)的代表性影像見圖2和3。
新鮮樣品的結(jié)果顯示，含有HFB II的產(chǎn)品(從混合料C制備)顯著地且令人驚異地不同于含有更多常規(guī)蛋白質(zhì)(即混合料A或B)的產(chǎn)品。所觀察到的不同特性有氣胞更小，冰晶棱角更多和冰晶融合稍多。對(duì)于產(chǎn)品A和B，我們估計(jì)新鮮樣品中冰晶大小為直徑50-100μm。對(duì)于產(chǎn)品C，我們估計(jì)冰晶大小為直徑40-60μm。
溫度濫用后，SEM影像清楚顯示，含有HFB II的產(chǎn)品(從混合料C制備)還保留著它原來的微結(jié)構(gòu)，即相對(duì)來說冰晶顯現(xiàn)和氣泡粗化的情況極少。在-10℃下貯藏1個(gè)星期和2個(gè)星期也是這樣。但是，含有Na Cas和SMP(分別來自混合料A和B)的樣品僅僅在-10℃的溫度濫用下一個(gè)星期后，就顯示出非常嚴(yán)重的氣泡和冰結(jié)構(gòu)粗化現(xiàn)象。
總的來說，現(xiàn)清楚，被制成含HFBII的冷凍產(chǎn)品比用酪蛋白酸鈉或脫脂奶粉制成的冷凍產(chǎn)品顯示出對(duì)溫度濫用高得多的穩(wěn)定性。HFBII對(duì)氣泡和冰晶大小和穩(wěn)定性兩方面都有影響。
熔化行為方法將冷凍產(chǎn)品的樣品放在室溫(20℃)下的金屬網(wǎng)格上。觀察產(chǎn)品隨時(shí)間的熔化情況，特別是形狀保持力和泡沫穩(wěn)定性。
熔化行為結(jié)果這些微結(jié)構(gòu)上的差異(穩(wěn)定的泡沫和穩(wěn)定的冰)對(duì)冷凍產(chǎn)品的熔化行為有一定的影響。從混合料C(含有HFBII)制得的充氣冷凍樣品，比起用酪蛋白酸鈉或脫脂奶粉(即分別混合料A和B)制得的產(chǎn)品，在熔化時(shí)能更好地保持其形狀。
隨著冰發(fā)生熔化形成水，水會(huì)流過金屬網(wǎng)格。但是，對(duì)于含HFBII的產(chǎn)品，許多泡沫仍保留在網(wǎng)格上，網(wǎng)格下面可觀察到少數(shù)穩(wěn)定的泡沫滴(數(shù)據(jù)未給出)，這兩個(gè)特性在常規(guī)的蛋白質(zhì)(酪蛋白酸鈉和脫脂奶粉)上均沒有觀察到。這說明每種所用的蛋白質(zhì)之間在泡沫穩(wěn)定性方面的差異。
產(chǎn)品A、B和C之間的質(zhì)地差異三種樣品在-10℃下貯藏一個(gè)星期后(即穩(wěn)定濫用樣品)，也可觀察到它們之間在質(zhì)地方面有明顯的差異。在觸摸用酪蛋白酸鈉(A)和脫脂奶粉(B)制得的產(chǎn)品時(shí)，注意到這些產(chǎn)品具有非常松軟和非常易成薄片的質(zhì)地，難以從用于襯墊樣品罐的涂硅紙干凈地取下來。另一方面，用HFB II制得的產(chǎn)品(C)非常結(jié)實(shí)，能非常干凈地從襯墊樣品罐的涂硅紙釋放出來。換句話說，用HFB II制備的產(chǎn)品比用酪蛋白酸鈉或脫脂奶粉制備的產(chǎn)品，在微觀和宏觀規(guī)模上對(duì)溫度濫用都顯示出高得多的穩(wěn)定性。
實(shí)施例2非充氣冷凍產(chǎn)品制備了兩種溶液，一種含有來自里氏木霉的疏水蛋白HFB II。另一種不含疏水蛋白。兩種溶液的組成在表5中顯示。
表5-非充氣產(chǎn)品的配方
HFB II由上述VTT Biotechnology提供，蔗糖由Tate & Lyle提供。黃原膠由CP Kelco(美國(guó)亞特蘭大)提供，屬冷水可分散級(jí)(KeltrolRD)。
非充氣冷凍產(chǎn)品的制備和分析兩種溶液均按100g批量制備。如下制備蔗糖/黃原膠溶液將所需量的室溫去離子水加入到蔗糖和黃原膠的干混合物中，然后用磁力攪拌器混合至溶質(zhì)完全溶解。在樣品2的情況下，然后將HFB II以5.3mg/ml溶液的等分試樣加入，接著將溶液在磁力攪拌器上再混合10分鐘。
非充氣溶液的冷凍以靜止方式進(jìn)行(即不同時(shí)施加剪切)。用每種溶液充滿8ml體積的小平皿。然后將平皿放入-18℃家用冷藏櫥柜中24小時(shí)，在這個(gè)時(shí)間內(nèi)樣品發(fā)生冰凍。
冰凍后，用實(shí)施例1所述的相同制備方法，通過SEM分析每種樣品的微結(jié)構(gòu)。
微結(jié)構(gòu)分析-結(jié)果每種樣品50×放大倍數(shù)的代表性SEM影像可見于圖4和5?？杀鎰e出，含有HFB II的溶液(樣品2)的微結(jié)構(gòu)更細(xì)，含有特征尺寸更小的冰晶。例如，樣品1(圖4)的伸長(zhǎng)的樹枝狀結(jié)構(gòu)比樣品2(圖5)見到的更寬更長(zhǎng)。這說明了疏水蛋白對(duì)減少冰晶生長(zhǎng)過程——導(dǎo)致尺寸更小的冰晶的影響。
上文各單獨(dú)節(jié)內(nèi)容提及到的本發(fā)明各個(gè)不同的特征和實(shí)施方案，在適當(dāng)?shù)那闆r下作了必要的修正也適用于其它節(jié)。因此，在適當(dāng)?shù)那闆r下可將在一節(jié)中載明的特征與在其它節(jié)中載明的特征結(jié)合在一起。
以上說明書中提到的所有出版物通過引用結(jié)合到本文中。不背離本發(fā)明的范圍對(duì)已描述的本發(fā)明方法和產(chǎn)品所作的各種修改和變化，對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說將是顯而易見的。雖然本發(fā)明已結(jié)合具體的優(yōu)選實(shí)施方案進(jìn)行了描述，但應(yīng)認(rèn)識(shí)到，要求保護(hù)的本發(fā)明不應(yīng)不適當(dāng)?shù)叵拗朴谶@些具體實(shí)施方案。實(shí)際上，對(duì)已描述的本發(fā)明各實(shí)施方式所作的各種對(duì)相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)人員來說顯而易見的修改，都意在落入以下權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
序列表<110>Unilever et al.
<120>冰凍食品<130>F3383<140>PCT/EP2005/006997<141>2005-06-27<150>EP04254483.3<151>2004-07-27<150>EP05251282.9<151>2005-03-27<160>2<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>15<212>PRT<213>假定的<220>重復(fù)<221>
<222>(1)..(1)<223>n個(gè)重復(fù)<220>
<221>重復(fù)<222>(3)..(3)<223>11-39個(gè)重復(fù)<220>
<221>重復(fù)<222>(6)..(6)<223>5-8個(gè)重復(fù)<220>
<221>重復(fù)<222>(8)..(8)<223>8-23個(gè)重復(fù)<220>
<221>重復(fù)<222>(10)..(10)<223>5-9個(gè)重復(fù)<220>
<221>重復(fù)<222>(13)..(13)<223>6-18個(gè)重復(fù)<220>
<221>重復(fù)<222>(15)..(15)<223>m個(gè)重復(fù)<400>1Xaa Cys Xaa Cys Cys Xaa Cys Xaa Cys Xaa Cys Cys Xaa Cys Xaa1 5 10 15
<210>2<211>17<212>PRT<213>序列表<220>
<221>重復(fù)<222>(1)..(1)<223>n個(gè)重復(fù)<220>
<221>重復(fù)<222>(3)..(3)<223>1-50個(gè)重復(fù)<220>
<221>重復(fù)<222>(5)..(5)<223>0-5個(gè)重復(fù)<220>
<221>重復(fù)<222>(7)..(7)<223>1-100個(gè)重復(fù)<220>
<221>重復(fù)<222>(9)..(9)<223>1-100個(gè)重復(fù)<220>
<221>重復(fù)<222>(11)..(11)<223>1-50個(gè)重復(fù)<220>
<221>重復(fù)<222>(13)..(13)<223>0-5個(gè)重復(fù)<220>
<221>重復(fù)<222>(15)..(15)<223>1-50個(gè)重復(fù)<220>
<221>重復(fù)<222>(17)..(17)<223>m個(gè)重復(fù)<400>2Xaa Cys Xaa Cys Xaa Cys Xaa Cys Xaa Cys Xaa Cys Xaa Cys Xaa Cys1 5 10 15Xaa
權(quán)利要求
1.一種冷凍組合物，所述組合物包含分離形式的疏水蛋白。
2.權(quán)利要求1的冷凍組合物，所述組合物包含至少0.001wt％的疏水蛋白。
3.一種冷凍組合物，所述組合物包含至少0.001wt％的疏水蛋白。
4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的冷凍組合物，其中所述疏水蛋白是II型疏水蛋白。
5.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的冷凍組合物，所述組合物是不充氣的。
6.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的冷凍組合物，所述組合物是食品。
7.權(quán)利要求6的冷凍食品，所述食品是冷凍糖食品。
8.一種用以生產(chǎn)權(quán)利要求6或7的冷凍食品的組合物，所述組合物包含分離形式的疏水蛋白以及所述食品的其余成分，所述組合物是未冷凍形式。
9.一種用以生產(chǎn)權(quán)利要求6或7的冷凍食品的干組合物，所述組合物包含分離形式的疏水蛋白以及所述食品其余的非液體成分。
10.疏水蛋白在抑制冷凍組合物中冰晶生長(zhǎng)的用途。
11.權(quán)利要求10的用途，其中所述冷凍組合物是食品。
12.疏水蛋白在改變冷凍組合物中冰晶習(xí)性的用途。
13.權(quán)利要求12的用途，其中所述冷凍組合物是食品。
14.疏水蛋白在改進(jìn)冷凍組合物的溫度耐受性中的用途。
15.權(quán)利要求14的用途，其中所述冷凍組合物是食品。
全文摘要
提供了包含疏水蛋白的冷凍組合物。還提供了疏水蛋白在抑制冷凍食品中冰晶生長(zhǎng)和/或改變冰晶習(xí)性的用途。
文檔編號(hào)A23G9/38GK101039596SQ200580032210
公開日2007年9月19日 申請(qǐng)日期2005年6月27日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月27日
發(fā)明者D·L·阿爾德里德, M·J·貝里, D·J·切布拉, A·R·科克斯, M·D·戈?duì)柖? S·戈?duì)柖? R·D·基南, M·E·馬洛恩, S·特威格 申請(qǐng)人:荷蘭聯(lián)合利華有限公司