專利名稱：呈遞抗原的人γδT細(xì)胞的制備和在免疫治療中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及制備有效呈遞抗原的人γδT細(xì)胞的方法、通過該方法制得的γδT細(xì)胞及其在免疫治療、抗原鑒定和免疫力診斷中的用途。
背景技術(shù)：
適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的細(xì)胞成分將免疫系統(tǒng)的細(xì)胞成分分成先天性免疫系統(tǒng)的細(xì)胞和適應(yīng)性(獲得性或特異性)免疫系統(tǒng)的細(xì)胞。先天性免疫系統(tǒng)的細(xì)胞包括(特別是)外周血中的單核細(xì)胞、粒細(xì)胞、天然殺傷細(xì)胞和血管外區(qū)室中的肥大細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞(DC)，血管外區(qū)室包括外周組織，如皮膚、氣道、胃腸道和泌尿生殖道，內(nèi)臟以及次級(jí)淋巴組織，如脾臟、淋巴結(jié)(LN)和派伊爾結(jié)(PP)。先天性細(xì)胞的主要功能是a)通過中和和限制傳染性顆粒的傳播并通過腫瘤細(xì)胞清除來提供即時(shí)的保護(hù)，b)健康組織的免疫監(jiān)控，和c)啟動(dòng)適應(yīng)性免疫應(yīng)答。適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的細(xì)胞包括淋巴細(xì)胞，如T和B細(xì)胞。通過稱為T細(xì)胞抗原受體(TCR)和B細(xì)胞抗原受體(BCR)的克隆型細(xì)胞表面抗原受體的存在來區(qū)分出先天性細(xì)胞和適應(yīng)性細(xì)胞。每個(gè)淋巴細(xì)胞攜帶識(shí)別特定抗原的截然不同的TCR或BCR。通過T和B細(xì)胞發(fā)育過程中以及效應(yīng)T和B細(xì)胞產(chǎn)生時(shí)的抗原親和力成熟過程中多個(gè)可變TCR或BCR基因片段的重排決定了抗原識(shí)別的特異性。外周血中的原初、未經(jīng)歷過抗原的T細(xì)胞彼此間的TCR抗原選擇性是不同的，單個(gè)原初T細(xì)胞響應(yīng)由含有它們特異性抗原的物質(zhì)引起的免疫激活開始擴(kuò)充。因此，在適應(yīng)性免疫應(yīng)答的過程中，一組具有潛在傳染性因子特異性TCR的原初T細(xì)胞通過細(xì)胞增殖開始擴(kuò)充，并發(fā)育成a)即時(shí)參與對(duì)潛在傳染性因子的防御的效應(yīng)T細(xì)胞，和發(fā)育成b)對(duì)這種特定潛在傳染性因子長(zhǎng)期保護(hù)的記憶T細(xì)胞。效應(yīng)T細(xì)胞的壽命短，即，在免疫應(yīng)答的消退期的過程中消失，而記憶T細(xì)胞的壽命長(zhǎng)，并根據(jù)它們最初的組織滯留或優(yōu)先的再循環(huán)途徑分成記憶T細(xì)胞亞類(Moser等，2004)。根據(jù)雜二聚TCR的組成將T細(xì)胞進(jìn)一步分成αβT細(xì)胞和γδT細(xì)胞(見下文)；αβ-TCR由α-和β-蛋白鏈構(gòu)成，而γδ-TCR由γ-和δ-蛋白鏈構(gòu)成。正常健康人中所有CD3+T細(xì)胞的大部分(＞80％)是αβT細(xì)胞。TCR結(jié)合不變的CD3分子，CD3分子將T細(xì)胞與B細(xì)胞和所有其他類型免疫細(xì)胞區(qū)分開來。大部分αβT細(xì)胞以所謂的主要組織相容性復(fù)合體(MHC)分子限制方式來識(shí)別抗原。這與以MHC非限制方式直接結(jié)合名義抗原的B細(xì)胞中的BCR相反。術(shù)語(yǔ)MHC限制指的是TCR識(shí)別其抗原的模式，并涉及在包括DC的呈遞抗原細(xì)胞(APC)上抗原肽和MHC分子一起，稱為MHC-肽復(fù)合體的呈遞(見下文)。存在兩種主要類型的MHC分子，即I類MHC(MHC-I)和II類MHC(MHC-II)，其引發(fā)αβT細(xì)胞兩個(gè)主要亞類，即CD8+αβT細(xì)胞和CD4+αβT細(xì)胞的TCR。CD4+αβT細(xì)胞上的TCR識(shí)別MHC-II-肽復(fù)合體，而CD8+αβT細(xì)胞上的TCR識(shí)別MHC-I-肽復(fù)合體。明顯相反，人外周血中γδT細(xì)胞的主要亞類不表達(dá)CD4或CD8，并且對(duì)于抗原識(shí)別其TCR不需要MHC-限制(見下文)。
γδT細(xì)胞γδT細(xì)胞是CD3+T細(xì)胞獨(dú)特的亞類，CD3+T細(xì)胞的特征在于由Vγ-和Vδ-基因片段編碼的TCR(Morita等，2000；Carding和Egan，2002)。根據(jù)它們?cè)谘夯蚪M織中最初的滯留、其VγVδ-TCR的蛋白鏈組成及其抗原選擇性將它們進(jìn)一步分類。在人體中，表達(dá)γδT細(xì)胞(Vδ1+T細(xì)胞)的Vδ1+-TCR鏈主要在皮膚、氣道、消化道和泌尿生殖道的上皮或上皮相連的/粘膜組織以及幾個(gè)內(nèi)臟中，并構(gòu)成外周血中γδT細(xì)胞的次要部分(＜20％)。Vδ1+T細(xì)胞的TCR識(shí)別由MHC相關(guān)CD1分子呈遞的脂質(zhì)抗原。此外，Vδ1+T細(xì)胞響應(yīng)應(yīng)激相關(guān)蛋白，包括MHC相關(guān)分子MICA和MICB，以及熱激蛋白。認(rèn)為它們提供了防御腫瘤和其他應(yīng)激細(xì)胞的第一線防御，此外，認(rèn)為它們有助于傷口愈合、組織修復(fù)和自體免疫。在健康個(gè)體的人外周血中，γδT細(xì)胞構(gòu)成總CD3+T細(xì)胞的2-10％，且大部分(＞80％)的外周血γδT細(xì)胞是表達(dá)Vγ2Vδ2+-TCR鏈的γδT細(xì)胞(Vγ2Vδ2+γδT細(xì)胞)(Morita等，2000；Carding和Egan等，2002)。它們對(duì)于主要微生物來源的小非肽抗原是高度選擇性的，并且不需要由經(jīng)典MHC分子呈遞抗原，而這對(duì)于肽選擇性αβT細(xì)胞是典型的(見上文)。Vγ2Vδ2+γδT細(xì)胞抗原包括異戊二烯基-焦磷酸酯，如異戊烯焦磷酸酯(IPP)，烷基胺和新發(fā)現(xiàn)的見于大部分人微生物病原體和共生細(xì)菌中的類異戊二烯生物合成途徑中的代謝物(Morita等，2000；Eberl等，2003)。這些Vγ2Vδ2+γδT細(xì)胞抗原中的一些，如IPP和烷基胺，還通過壞死的組織細(xì)胞來釋放。人Vγ2Vδ2+γδT細(xì)胞的同源物，攜帶對(duì)微生物來源的小非肽抗原具有選擇性的同源VγVδ-TCR，還確實(shí)存在于高等靈長(zhǎng)類，如獼猴中，但不存在于嚙齒類，包括老鼠和兔子中。還不清楚為什么Vγ2Vδ2+γδT細(xì)胞的存在限于高等靈長(zhǎng)類，但是可以推測(cè)它們通過進(jìn)化進(jìn)程發(fā)展以滿足對(duì)微生物獨(dú)特的種特異性選擇的細(xì)胞保護(hù)的特殊需要。Vγ2Vδ2+γδT細(xì)胞在外周血Vγ2Vδ2+γδT細(xì)胞的組織培養(yǎng)過程中體外，或在高等靈長(zhǎng)類如獼猴接種疫苗實(shí)驗(yàn)過程中體內(nèi)，響應(yīng)模式抗原IPP或微生物提取物而迅速擴(kuò)充(Chen和Letvin，2003)。此外，人的微生物感染通常與外周血Vγ2Vδ2+γδT細(xì)胞的巨大擴(kuò)充相關(guān)，達(dá)到高至＞60％總外周血CD3+T細(xì)胞的水平。這些發(fā)現(xiàn)支持人Vγ2Vδ2+γδT細(xì)胞在微生物感染期間的免疫過程中起重要作用的見解(Morita等，2000；Carding和Egan等，2002；Chen和Letvin，2003)。它們對(duì)通常在微生物(包括病原體和共生細(xì)菌)中發(fā)現(xiàn)的非肽抗原的唯一選擇性表明Vγ2Vδ2+γδT細(xì)胞中的TCR執(zhí)行和to11-樣受體(TLR)相似的功能，TLR響應(yīng)微生物來源的不同配體引發(fā)DC和其他APC的激活和成熟。
γδT細(xì)胞通過快速分泌啟動(dòng)先天性免疫系統(tǒng)細(xì)胞募集的趨化因子和刺激呈遞抗原細(xì)胞并提高粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞的細(xì)菌殺傷的促炎性細(xì)胞因子(TNF-α，IFN-γ)而有助于病原體消除(Morita等，2000；Carding和Egan等，2002；Chen和Letvin，2003)。它們還表達(dá)用于殺傷受感染細(xì)胞或腫瘤組織細(xì)胞的天然殺傷細(xì)胞受體。這些發(fā)現(xiàn)支持γδT細(xì)胞主要執(zhí)行先天性功能的見解，盡管已知促炎性細(xì)胞因子如TNF-α的分泌也有助于局部適應(yīng)性免疫應(yīng)答。另一方面，γδT細(xì)胞直接參與適應(yīng)性免疫應(yīng)答的證據(jù)不明確。例如，報(bào)道了CD1限制的T細(xì)胞誘導(dǎo)呈遞CD1-脂質(zhì)復(fù)合體的DC的成熟。此外，對(duì)小鼠的研究證明了沒有進(jìn)一步解釋?duì)忙腡細(xì)胞在B細(xì)胞應(yīng)答中的作用，且顯示出人γδT細(xì)胞在體外共培養(yǎng)過程中調(diào)節(jié)B細(xì)胞應(yīng)答(Brandes等，2003)。最后，對(duì)獼猴的研究證明了Vγ2Vδ2+γδT細(xì)胞能夠引發(fā)對(duì)牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis)抗原的體內(nèi)記憶應(yīng)答(Chen和Letvin，等)。總的說來，這些發(fā)現(xiàn)提供了γδT細(xì)胞能夠與適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的細(xì)胞如B細(xì)胞和DC相互作用的證據(jù)。這些免疫調(diào)節(jié)功能中的大部分歸因于由γδT細(xì)胞引起的細(xì)胞因子產(chǎn)生或尚未得到解釋。重要地，這些發(fā)現(xiàn)中沒有一個(gè)支持γδT細(xì)胞在呈遞抗原中的作用。淋巴細(xì)胞功能與淋巴細(xì)胞遷移潛能密切相關(guān)，如通過趨化因子受體和粘附分子的表達(dá)所確定的(Moser等，2004)。因此，將αβT細(xì)胞分成a)表達(dá)LN-歸巢趨化因子受體CCR7但缺乏炎性趨化因子受體的原初T細(xì)胞，b)壽命短的效應(yīng)T細(xì)胞，該細(xì)胞攜帶反映感染部位炎癥狀況的趨化因子受體和誘導(dǎo)性粘附分子的不同組合，和c)靜息的、壽命長(zhǎng)的記憶T細(xì)胞的三個(gè)亞類。根據(jù)它們的移動(dòng)潛能，即它們的細(xì)胞表面趨化因子受體和粘附分子的表達(dá)特征的T細(xì)胞亞類的區(qū)別，與它們的分化狀態(tài)和免疫過程中的潛在功能相關(guān)。值得注意的是，趨化因子受體和粘附分子的“特征剖析”廣泛用于白細(xì)胞亞類，包括DC以及T和B細(xì)胞的表型和功能限定(Moser等，2004)。人外周血γδT細(xì)胞的遷移特征明顯不同于人外周血αβT細(xì)胞的遷移特性(Brandes等，2003)。最值得注意的是，大部分(＞80％)的Vγ2Vδ2+γδT細(xì)胞(此后稱為“γδT細(xì)胞”)缺乏CCR7，因此被排除在次級(jí)淋巴組織外，但反映出炎癥遷移特征(Brandes等，2003)。明顯相反，外周血中大部分(＞70％)的αβT細(xì)胞表達(dá)CCR7，這與它們通過次級(jí)淋巴組織(脾臟、LN、PP)的連續(xù)再循環(huán)相一致，在次級(jí)淋巴組織中它們審視APC中合適的MHC-肽復(fù)合體的存在。在進(jìn)行中的適應(yīng)性免疫應(yīng)答的情況中，αβT細(xì)胞的選擇在接觸呈遞它們的相關(guān)抗原的APC的過程中變成激活的并分化成具有炎癥歸巢潛能的CCR7陰性效應(yīng)細(xì)胞。相反，外周血γδT細(xì)胞的特征在于響應(yīng)感染部位產(chǎn)生的炎性趨化因子的即時(shí)組織動(dòng)員的炎癥遷移程序。激活時(shí)，例如，響應(yīng)微生物提取物抗原或限定的小非肽抗原(如IPP)，γδT細(xì)胞中的遷移特征從炎癥表型快速轉(zhuǎn)變成LN-歸巢表型，如通過炎性趨化因子受體的下調(diào)和CCR7的誘導(dǎo)所證明的(Brandes等，2003)。與αβT細(xì)胞相反，γδT細(xì)胞在LN中相對(duì)稀少，這與它們存在于這些位置上的MHC限制APC完全無關(guān)的獨(dú)特激活模式相一致(Brandes等，2003)。γδT細(xì)胞的出現(xiàn)率在疾病相關(guān)的LN中(特別是在生發(fā)中心)提高，表明γδT細(xì)胞可能有助于體液(抗體)應(yīng)答和其他可能的適應(yīng)性免疫過程的啟動(dòng)。
總的來說，人γδT細(xì)胞的遷移特征及其在LN中的偶爾存在表明這些細(xì)胞在適應(yīng)性免疫應(yīng)答啟動(dòng)中的作用。然而，這種作用沒有得到進(jìn)一步的確定且不存在γδT細(xì)胞可以起呈遞抗原細(xì)胞作用的證據(jù)。
樹突細(xì)胞(DC)DC形成不同類別的白細(xì)胞，源自骨髓中的造血始祖細(xì)胞，并主要存在于血管外的部位，包括上皮/粘膜組織(特別是皮膚、氣道和胃腸道/泌尿生殖道)和次級(jí)淋巴組織(脾臟、LN、PP)(Banchereau和Steinman，1998；Steinman等，2003；Banchereau等，2004)。在外周血中，DC或DC前體構(gòu)成小于1％的單核白細(xì)胞。不同DC亞類的組織位置不同，如以主要存在于軟組織邊緣上皮中的間質(zhì)DC、存在于表皮中的朗格漢斯細(xì)胞(LC)和具有LN歸巢偏向的類漿細(xì)胞DC舉例說明的。這些DC亞類是完全分化的非增殖細(xì)胞，具有幾天至幾周的有限壽命，表明它們?cè)诜€(wěn)定條件下被骨髓產(chǎn)生的前體持續(xù)替代。相反，人記憶T細(xì)胞存活很多年并通過穩(wěn)態(tài)(體內(nèi)穩(wěn)態(tài))增殖來維持。組織滯留DC的主要功能是局部抗原的攝取和加工，其通過輸入淋巴管至排出LN的重新定位和抗原特異性適應(yīng)性免疫應(yīng)答的啟動(dòng)(Banchereau和Steinman，1998；Steinman等，2003；Banchereau等，2004)。當(dāng)在致耐受條件下，即不存在促炎性T細(xì)胞共刺激下向T細(xì)胞呈遞抗原時(shí)，DC還誘導(dǎo)耐受性。相似地，呈遞抗原B細(xì)胞已經(jīng)顯示出誘導(dǎo)耐受性(Zhong等，1997)。認(rèn)為對(duì)自體抗原的免疫耐受性的破壞是自體免疫疾病的常見誘因，因此，呈遞自體抗原的致耐受DC是免疫體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的必需調(diào)節(jié)物。在健康外周組織中，DC以完全分化但“未成熟”的狀態(tài)存在。未成熟DC表達(dá)一組用于至局部感染、炎癥或組織損傷的快速募集的炎性趨化因子受體。它們自身的致免疫性差，即，不能夠誘導(dǎo)初次適應(yīng)性免疫應(yīng)答。但是，它們專長(zhǎng)于抗原攝取(通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞或液相胞飲機(jī)制)、抗原加工和將肽加載到胞內(nèi)MHC-I/II分子上和細(xì)胞表面呈遞。因?yàn)槲闯墒霥C通常不表達(dá)LN-歸巢受體CCR7，所以目前還不知道這種類型的DC怎樣到達(dá)脾臟、LN和PP中的T細(xì)胞區(qū)域。許多成熟信號(hào)，包括病毒或細(xì)菌衍生的引發(fā)toll-樣受體(TLR)的刺激物、宿主細(xì)胞衍生的炎癥介質(zhì)(特別是干擾素[IFN]-γ、腫瘤壞死因子[TNF]-α、白細(xì)胞間介素[IL]-1、前列腺素E2[PGE2]、組織生長(zhǎng)因子)和T細(xì)胞共刺激分子(CD40-配體/CD154)，誘導(dǎo)DC“成熟”(Banchereau和Steinman，1998；Steinman等，2003；Banchereau等，2004)。在DC成熟的早期過程中，DC分泌高水平的炎性趨化因子，用于通過募集另外的未成熟DC和先天性免疫系統(tǒng)的細(xì)胞(單核細(xì)胞、粒細(xì)胞、天然殺傷細(xì)胞)來增強(qiáng)炎癥應(yīng)答。隨后，炎癥遷移程序逐漸地由LN-歸巢遷移程序替代，后者的特征在于炎性趨化因子受體由CCR7替代。CCR7對(duì)于敏化的DC響應(yīng)存在于淋巴管上以及存在于脾臟、LN和PP中的T細(xì)胞區(qū)域中的兩種CCR7-選擇性趨化因子ELC/CCL19和SLC/CCL21從外周組織至排出LN的有效重新定位是必要的。因此，CCR7表達(dá)標(biāo)志著成熟的或正在成熟的DC。除了LN歸巢特征外，成熟DC的特征還有大量MHC-I/II-肽復(fù)合體以及適當(dāng)刺激原初(未經(jīng)歷過抗原的)αβT細(xì)胞所需要的不同共刺激分子的穩(wěn)定細(xì)胞表面表達(dá)(Banchereau和Steinman，1998；Steinman等，2003；Banchereau等，2004)。DC也稱為“專門”APC，因?yàn)樗鼈冊(cè)诔醮蚊庖邞?yīng)答過程中能夠刺激原初αβT細(xì)胞。記憶(經(jīng)歷過抗原的)T細(xì)胞具有較低的激活閾值，并因此響應(yīng)低嚴(yán)謹(jǐn)性的刺激方案。區(qū)分這兩種分化狀態(tài)的DC功能雙重性是DC生理學(xué)的標(biāo)志并與局部炎癥、感染和組織損傷密切相關(guān)，這兩種分化狀態(tài)為a)外周組織中的未成熟的、呈遞抗原DC和b)組織-排出LN中的重新定位的成熟的、呈遞抗原和共刺激DC。最后，適應(yīng)性免疫應(yīng)答的結(jié)果(質(zhì)量和數(shù)量)極大程度地由應(yīng)答啟動(dòng)的“模式”來決定。已知關(guān)于病原體消除所需要的免疫應(yīng)答類型，DC“指示”LN和PP的T細(xì)胞區(qū)域內(nèi)的原初T細(xì)胞(Banchereau和Steinman，1998；Steinman等，2003；Banchereau等，2004)。因此，組織中的炎癥環(huán)境直接影響DC成熟，且由于DC重新定位，還決定了排出LN內(nèi)的T細(xì)胞分化。原初T細(xì)胞分化的不同效應(yīng)子命運(yùn)包括T輔助細(xì)胞(特別是產(chǎn)生IFN-γ/TNF-α的1型T輔助[Th1]細(xì)胞，產(chǎn)生IL-4/IL-5/IL-13的Th2細(xì)胞)、調(diào)節(jié)T細(xì)胞和細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)的專門亞類。效應(yīng)T細(xì)胞歸巢至炎癥部位，快速引發(fā)效應(yīng)子功能(細(xì)胞因子分泌、裂解/殺滅受感染細(xì)胞/腫瘤細(xì)胞)并具有有限的壽命。相反，記憶T細(xì)胞是初次免疫的耐久產(chǎn)物并引發(fā)優(yōu)良的對(duì)回憶抗原的免疫應(yīng)答。
免疫治療中的樹突細(xì)胞DC是“生物界的佐劑”，即，構(gòu)成最專門的誘導(dǎo)保護(hù)性免疫應(yīng)答的細(xì)胞系統(tǒng)，因此正在開發(fā)用于人免疫治療中(Fong和Engleman，2000；Steinman等，2003；Schuler等，2003；Figdor等，2004)。潛在的應(yīng)用包括癌癥治療、對(duì)抗病原體(如人免疫缺陷病毒[HIV]-1和丙肝病毒)的疫苗接種和自體免疫疾病的治療。目前的DC治療方案包括
1.從患者血液分離和純化DC前體(骨髓產(chǎn)生的CD34+造血前體或外周血CD14+或CD11c+細(xì)胞)。
2.在體外細(xì)胞培養(yǎng)過程中使DC產(chǎn)生。
3.體外加載用于由成熟DC呈遞肽的抗原。
4.通過單次或重復(fù)注射呈遞肽的DC來治療患者。
目前，免疫治療中DC的應(yīng)用面臨幾個(gè)問題(Fong和Engleman，2000；Steinman等，2003；Schuler等，2003；Figdor等，2004)。簡(jiǎn)而言之，DC前體在外周血中不足且在體外培養(yǎng)過程中不增殖，需要使用患者的大量血樣來重復(fù)操作。DC在功能上是非純一的并可以誘導(dǎo)相反的或不利的作用，例如代替效應(yīng)T細(xì)胞產(chǎn)生的免疫抑制。此外，DC在功能上是不穩(wěn)定的并經(jīng)歷預(yù)定順序的不可逆分化步驟，結(jié)果為受到損害的(“耗盡的”)免疫功能。這在通過體外操作產(chǎn)生功能上相似的DC制劑中造成極大的困難。最后，用于免疫治療中的呈遞肽DC的產(chǎn)生是技術(shù)上苛求的、費(fèi)時(shí)的且高成本的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明描述了呈遞抗原的人γδT細(xì)胞的簡(jiǎn)單分離和體外制備及其用作免疫治療中有效的呈遞抗原細(xì)胞(APC)的用途。人γδT細(xì)胞的效力和功效與樹突細(xì)胞(DC)相似，加工抗原和向αβT細(xì)胞呈遞抗原肽并誘導(dǎo)原初αβT細(xì)胞中的抗原特異性應(yīng)答(增殖和分化)。γδT細(xì)胞在外周血中相對(duì)常見(CD3+T細(xì)胞的2-10％)，易于通過多種簡(jiǎn)單技術(shù)從外周血純化，在簡(jiǎn)單刺激條件下體外培養(yǎng)1天內(nèi)獲得“成熟”狀態(tài)(MHC-II以及必要的粘附分子和共刺激分子的表達(dá))，在體外培養(yǎng)7天或更長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)維持有效的呈遞抗原功能并誘導(dǎo)強(qiáng)烈的初次和再次T輔助細(xì)胞應(yīng)答。此外，γδT細(xì)胞在用于存儲(chǔ)和之后使用的體外培養(yǎng)過程中容易擴(kuò)充。
本發(fā)明涉及制備有效呈遞抗原的人γδT細(xì)胞的方法，該方法包括從人外周血單核細(xì)胞中選擇γδT細(xì)胞，用誘導(dǎo)呈遞抗原功能的刺激物處理選定的細(xì)胞，并將所述抗原應(yīng)用于這些細(xì)胞(在誘導(dǎo)呈遞抗原功能之前、期間或之后)，涉及通過該方法制得的有效呈遞抗原的人γδT細(xì)胞，及其在免疫治療中和在制備用于免疫治療的藥物中的用途，涉及用這樣的有效呈遞抗原的人γδT細(xì)胞治療腫瘤或慢性或復(fù)發(fā)性傳染病的方法，涉及用靶向γδT細(xì)胞的疫苗對(duì)抗腫瘤或誘導(dǎo)傳染或非傳染病物質(zhì)的接種方法和涉及這樣的靶向γδT細(xì)胞的疫苗在制備藥物中的用途，涉及鑒定新的腫瘤或病原體衍生的抗原的方法，和涉及使用這樣的有效呈遞抗原的人γδT細(xì)胞診斷患者免能力的方法。


圖1(1A和1B).受刺激的γδT細(xì)胞呈現(xiàn)多種呈遞抗原、共刺激和粘附分子。
通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行細(xì)胞表面分子的檢查，使用從外周血新鮮分離的或用IPP刺激和體外培養(yǎng)1或7天后的γδT細(xì)胞(γδT)，或使用用抗CD3/CD28刺激1天后的αβT細(xì)胞(αβT)，或使用新鮮分離的外周血單核細(xì)胞(M)。各個(gè)點(diǎn)陣(dot-blot)上方的數(shù)字表示體外培養(yǎng)時(shí)間；(0d)新鮮分離的，(1d)1天或(7d)7天。用同型相配的對(duì)照抗體染色來確定陽(yáng)性，且水平線表示對(duì)99％背景染色的門控。
圖2.受刺激的γδT細(xì)胞表達(dá)功能性CCR7并應(yīng)答LN趨化因子SLC/CCL21。
數(shù)據(jù)摘自Brandes等，2003。A)用IPP刺激36小時(shí)后檢查γδT細(xì)胞中的細(xì)胞趨化性應(yīng)答，并以已經(jīng)應(yīng)答所示趨化因子而遷移的細(xì)胞分?jǐn)?shù)(％)來表示，即全部輸入細(xì)胞的％。C＝對(duì)照(空白)。B)通過流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定CCR7表達(dá)，n＝細(xì)胞計(jì)數(shù)。實(shí)線和虛線表示分別在I PP刺激的(參見趨化性)和靜息的外周血γδT細(xì)胞上的CCR7表達(dá)；填滿的柱狀圖描繪了使用同型抗體的對(duì)照染色。
圖3.受刺激的γδT細(xì)胞和原初αβT細(xì)胞之間快速而大范圍的聚集物形成。
將刺激1天的γδT細(xì)胞和自體的原初CD4+αβT細(xì)胞以1∶5的比例一起培養(yǎng)3小時(shí)(γδT，2個(gè)實(shí)例)。將分別作為陽(yáng)性和陰性對(duì)照的成熟單核細(xì)胞衍生的DC(DC)和刺激1天的αβT細(xì)胞(αβT)與自體的原初αβT細(xì)胞混合。從相同供體分離所有細(xì)胞來排除抗原的相互作用。將原初CD4+αβT細(xì)胞加載CFSE，用于通過熒光顯微鏡來鑒別。用Zeiss-Axiovert 35倒置顯微鏡獲取活細(xì)胞的相差和熒光圖像，并將圖像重疊合并。
圖4.受刺激的γδT細(xì)胞誘導(dǎo)靜息CD4+αβT細(xì)胞中有效的TT-特異性增殖應(yīng)答。
在20μg/ml TT存在下將γδT細(xì)胞刺激1天，洗滌，然后以1∶2的比例加入CFSE標(biāo)記的TT-特異性αβT細(xì)胞中。在培養(yǎng)4天(4d)和6天(6d)后，通過流式細(xì)胞術(shù)檢查CD4+細(xì)胞中的CFSE信號(hào)(γδT(+TT))。作為陽(yáng)性對(duì)照，在20μg/ml TT存在下使單核細(xì)胞衍生的DC成熟(DC(+TT))，并在與呈遞TT的γδT細(xì)胞相同的條件下以1∶10的比例用于刺激αβT細(xì)胞。作為陰性對(duì)照，分別用在TT不存在下刺激和成熟的γδT細(xì)胞(γδT(-TT))和DC(DC(-TT))共培養(yǎng)αβT細(xì)胞。柱狀圖上方的水平條表示未分裂的(非反應(yīng)性)細(xì)胞中CFSE信號(hào)的位置；n＝細(xì)胞計(jì)數(shù)。
圖5.TT-特異性CD4+αβT細(xì)胞的增殖需要接觸TT-呈遞γδT細(xì)胞。
完全如圖4中所述的進(jìn)行TT-呈遞γδT細(xì)胞和CFSE標(biāo)記的應(yīng)答細(xì)胞的制備以及數(shù)據(jù)分析。在兩室組織培養(yǎng)系統(tǒng)中，將TT-呈遞γδT細(xì)胞和TT-特異性應(yīng)答(CD4+αβ+T)細(xì)胞加入下部室(B)中，并將應(yīng)答細(xì)胞單獨(dú)加入上部室(A)中。兩個(gè)室由多孔膜隔開，多孔膜允許可溶蛋白質(zhì)自由交換，但完整的細(xì)胞不可以。柱狀圖上方的水平條表示對(duì)未分裂的加載CFSE的細(xì)胞的門控。
圖6.TT-呈遞γδT細(xì)胞誘導(dǎo)TT-特異性CD4+αβT細(xì)胞中的TCR下調(diào)。
在遞增濃度，從0(未加入TT)至1,000μg/ml的TT存在下，分別刺激和γδT細(xì)胞和DC并使之成熟，然后以APC應(yīng)答細(xì)胞1∶2的比例用靜息TT-特異性CD4+αβT細(xì)胞培養(yǎng)。18小時(shí)后，通過流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定αβT細(xì)胞上的CD3表達(dá)水平，并表示為與沒有加入TT的細(xì)胞相比較的平均熒光強(qiáng)度(MFI)％。完全如圖4中所述的進(jìn)行TT-呈遞γδT細(xì)胞和應(yīng)答細(xì)胞的制備以及數(shù)據(jù)分析。
圖7.TT-呈遞γδT細(xì)胞誘導(dǎo)TT特異性CD4+αβT細(xì)胞上激活標(biāo)記的表達(dá)。
用在10μg/ml TT存在(+TT)或不存在(-TT)下刺激的γδT細(xì)胞培養(yǎng)5天后，通過流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定TT特異性CD4+αβT細(xì)胞(應(yīng)答細(xì)胞)上激活標(biāo)記CD25、ICOS和OX40的水平(參見圖4)?？招暮吞顫M的柱狀圖分別表示使用特異性和對(duì)照同型抗體的熒光染色；n＝細(xì)胞計(jì)數(shù)。水平條表示對(duì)標(biāo)記陽(yáng)性的細(xì)胞的門控，柱狀圖上方的數(shù)字表示陽(yáng)性程度，表示為陽(yáng)性細(xì)胞百分比(％)和平均熒光強(qiáng)度(MFI)。
圖8.異種EBV-B細(xì)胞和TT-特異性CD4+αβT細(xì)胞在功能上不向?qū)T特異性應(yīng)答細(xì)胞呈遞TT。
將CP.EBV細(xì)胞、應(yīng)答細(xì)胞(TT-特異性CD4+αβT細(xì)胞)和γδT細(xì)胞(作為陰性對(duì)照)在20μg/ml TT存在下培養(yǎng)1天，洗滌，照射，然后以1∶2的比例加入TT-特異性CD4+αβT細(xì)胞中。培養(yǎng)3天(3d)和8天(8d)后，通過流式細(xì)胞術(shù)檢查CD4+細(xì)胞中的CFSE信號(hào)。CP.BSV和應(yīng)答細(xì)胞制備、CFSE-標(biāo)記和流式細(xì)胞術(shù)描述于“實(shí)施例”中。
圖9.受刺激的γδT細(xì)胞在加工和呈遞復(fù)合蛋白抗原(PPD)中也是有效的。
在20μg/ml PPD的存在(+PPD)或不存在(-PPD)下刺激/成熟γδT細(xì)胞和DC，并分析在靜息的自體PPD-特異性CD4+αβT細(xì)胞中增殖的誘導(dǎo)。作為另外的陰性對(duì)照，在γδT細(xì)胞或DC不存在下但在20μg/ml PPD存在下培養(yǎng)PPD-特異性CD4+αβT細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)設(shè)置與圖4中所用的相同。γδT細(xì)胞和DC制備、PPD-特異性CD4+αβT細(xì)胞的CFSE-標(biāo)記和流式細(xì)胞術(shù)描述于“實(shí)施例”中。
圖10.加載TSST-1的γδT細(xì)胞誘導(dǎo)自體原初CD4+αβT細(xì)胞中的增殖。
將受刺激的γδT細(xì)胞(γδT)、受刺激的CD4+αβT細(xì)胞(αβT)、成熟的DC(DC)和新鮮分離的血液?jiǎn)魏思?xì)胞(M)加載10ng/mlTSST-1，并以1∶5的比例和新鮮分離的、CFSE標(biāo)記的原初CD4+αβT細(xì)胞混合。培養(yǎng)4天后，通過流式細(xì)胞術(shù)來測(cè)定Vβ2+-αβT細(xì)胞(Vβ2)中的增殖應(yīng)答。點(diǎn)陣中的垂直和水平線限定了對(duì)Vβ2+-αβT細(xì)胞和分裂細(xì)胞的門控；左上和左下象限分別顯示了分裂的Vβ2+-細(xì)胞和分裂的Vβ2neg-細(xì)胞，而右上和右下象限分別顯示了未分裂的Vβ2+-細(xì)胞和未分裂的Vβ2neg-細(xì)胞；數(shù)字指的是各個(gè)象限內(nèi)存在的全部細(xì)胞的百分比。根據(jù)“實(shí)施例”進(jìn)行細(xì)胞制備、TSST-1-加載和流式細(xì)胞術(shù)。
圖11.加載TSST-1的γδT細(xì)胞表明了有效的APC功能(TSST-1的滴定)。
用遞增濃度的TSST-1加載受刺激的γδT細(xì)胞(γδT)和αβT細(xì)胞(αβT)、樹突細(xì)胞(DC)和單核細(xì)胞(M)，并以1∶5的比例與CFSE標(biāo)記的原初CD4+αβT細(xì)胞混合。培養(yǎng)4天后，通過流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定每個(gè)培養(yǎng)孔中分裂的Vβ2+-αβT細(xì)胞數(shù)目(Vβ2+T)(參見圖10的左上象限)。測(cè)試的呈遞抗原細(xì)胞是圖10中所示的那些，除外，還有培養(yǎng)7天然后加載不同濃度TSST-1的受刺激的γδT細(xì)胞(γδT 7d)。每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)加上誤差棒表示來自2次單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)的重復(fù)值的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)，且數(shù)據(jù)表示3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。根據(jù)“實(shí)施例”進(jìn)行細(xì)胞增殖、TSST-1加載和流式細(xì)胞術(shù)。
圖12.加載TSST-1的γδT細(xì)胞表明了有效的APC功能(APC的滴定)。
將受刺激的γδT細(xì)胞和成熟DC加載1μg/ml或100ng/mlTSST-1，并在各種稀釋度(1∶5至1∶200)的APCαβT細(xì)胞(APCγδT細(xì)胞或成熟DC)測(cè)試在原初CD4+αβT細(xì)胞中增殖的誘導(dǎo)。根據(jù)“實(shí)施例”進(jìn)行細(xì)胞增殖、TSST-1加載和流式細(xì)胞術(shù)。
圖13(13A和13B).加載TSST-1的γδT細(xì)胞誘導(dǎo)原初CD4+αβT細(xì)胞中的T輔助細(xì)胞分化。
將加載10ng/ml TSST-1的受刺激的γδT細(xì)胞、αβT細(xì)胞或成熟DC與原初CD4+αβT細(xì)胞混合，并如圖10中所述的檢查Vβ2+應(yīng)答細(xì)胞增殖。培養(yǎng)4天后，通過流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定Vβ2+應(yīng)答細(xì)胞中記憶標(biāo)記CD45RO的表達(dá)和細(xì)胞分裂的程度。培養(yǎng)21天后，當(dāng)細(xì)胞恢復(fù)至靜息、非增殖狀態(tài)時(shí)，用PMA/離子霉素刺激細(xì)胞并通過流式細(xì)胞術(shù)檢查胞內(nèi)細(xì)胞因子IL-4和IFN-γ的產(chǎn)生(圖13B)。左上、右上和右下象限中的數(shù)字分別限定了所產(chǎn)生的Th2、Th0和Th1細(xì)胞的分?jǐn)?shù)(全部細(xì)胞的百分比)，且各個(gè)點(diǎn)陣上方的數(shù)字指的是細(xì)胞培養(yǎng)開始時(shí)APC與應(yīng)答細(xì)胞的比例。細(xì)胞增殖、TSST-1加載和細(xì)胞因子產(chǎn)生的測(cè)定描述于“實(shí)施例”中。
圖14.通過加載TSST-1的γδT細(xì)胞誘導(dǎo)原初CD4+αβT細(xì)胞中的增殖是細(xì)胞接觸依賴性的。
將受刺激的γδT細(xì)胞加載100ng/ml TSST-1并將CFSE標(biāo)記的原初CD4+αβT細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)(A)或以1∶5的APC∶應(yīng)答細(xì)胞比例和γδT細(xì)胞一起培養(yǎng)(B)。圖5中描述了兩室培養(yǎng)系統(tǒng)和CFSE流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)分析。
圖15.γδδT細(xì)胞誘導(dǎo)初次CD8+T細(xì)胞應(yīng)答。
以遞減的APC應(yīng)答細(xì)胞比例使用原初CD8+αβT細(xì)胞和異種IPP-刺激的γδT細(xì)胞(圓圈)、LPS-成熟的單核細(xì)胞衍生的DC(方塊)或超抗原刺激的αβT細(xì)胞(三角形)的混合白細(xì)胞應(yīng)答(表示6次實(shí)驗(yàn))。通過圖5中所述的流式細(xì)胞數(shù)據(jù)分析來評(píng)定CFSE標(biāo)記的CD8+應(yīng)答細(xì)胞中的增殖應(yīng)答。
圖16.γδT細(xì)胞誘導(dǎo)原初CD88+T細(xì)胞分化成細(xì)胞毒性T細(xì)胞。
在培養(yǎng)14天后，檢查源自如圖15中所述的混合白細(xì)胞應(yīng)答的CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞溶解活性。細(xì)胞毒性試定包括效應(yīng)細(xì)胞，即，源自混合白細(xì)胞應(yīng)答的CD8+T細(xì)胞，和CFSE標(biāo)記的靶細(xì)胞。靶細(xì)胞混合物含有1∶1比例的真實(shí)靶細(xì)胞(異種CD4+T細(xì)胞)和陰性對(duì)照靶細(xì)胞(自體CD4+T細(xì)胞)。在混合之前用不同濃度的CFSE標(biāo)記真實(shí)和陰性對(duì)照靶細(xì)胞，以便區(qū)分這兩個(gè)靶細(xì)胞亞類。
(A)效應(yīng)細(xì)胞不存在下靶細(xì)胞混合物的流式細(xì)胞術(shù)分析表示陰性對(duì)照(C)和真實(shí)靶(T)細(xì)胞群。
(B)30∶1、10∶1、3∶1和1∶1比例的CD8+T細(xì)胞和靶細(xì)胞共培養(yǎng)12小時(shí)后，通過測(cè)量真實(shí)靶細(xì)胞群數(shù)量的減少(箭頭)來評(píng)定靶細(xì)胞溶解的程度。箭頭所示的數(shù)目指的是特異性殺滅的百分比，且涉及與具有低CFSE熒光的對(duì)照細(xì)胞計(jì)數(shù)相比較，具有高CFSE熒光細(xì)胞計(jì)數(shù)(真實(shí)靶細(xì)胞)的損失。
左列CD8+T細(xì)胞源自使用IPP-刺激的γδT細(xì)胞作為APC的混合白細(xì)胞應(yīng)答。
右列CD8+T細(xì)胞源自使用成熟DC作為APC的混合白細(xì)胞應(yīng)答。
圖17.γδT細(xì)胞表達(dá)高水平的內(nèi)吞細(xì)胞表面蛋白DEC205(CD205)和CD11b。
通過圖7中所述的流式細(xì)胞術(shù)分析從外周血新鮮分離的γδT細(xì)胞(γδT)和未成熟DC(DC)中的CD205和CD11b表達(dá)。點(diǎn)陣圖中的垂直和水平線限定了表達(dá)CD205或CD11b細(xì)胞的門控，且圖中的右上象限描繪了對(duì)CD205和CD11b呈雙陽(yáng)性的細(xì)胞；數(shù)字指的是各個(gè)象限內(nèi)存在的全部細(xì)胞的百分比。通過用同型相配對(duì)照抗體染色來確定陽(yáng)性，且水平或垂直線表示對(duì)99％背景染色的門控。
發(fā)明詳述流程圖概括了本發(fā)明通過分離和體外處理人外周血γδT細(xì)胞制備有效呈遞抗原的人γδT細(xì)胞(Vγ2 Vδ2+γδT細(xì)胞，此后稱為“γδT細(xì)胞”)的方法。盡管分離和體外增殖γδT細(xì)胞的方案本身是已知的，但還沒有描述刺激和抗原應(yīng)用或肽加載的特定結(jié)合。起始物料是通過差速離心或免疫吸附加工過的人外周血，分別產(chǎn)生擴(kuò)充的或新鮮分離的高純度γδT細(xì)胞。短期(例如，24小時(shí))刺激結(jié)合抗原應(yīng)用或肽加載結(jié)果形成用于免疫治療的具有有效呈遞抗原功能的γδT細(xì)胞。
a)在異戊烯焦磷酸酯(IPP)或如下所示的具有γδT細(xì)胞選擇性的其它小分子量非肽化合物的存在下，γδT細(xì)胞在外周血淋巴細(xì)胞(PBL)培養(yǎng)過程中容易擴(kuò)充(Morita等，2000；Eberl等，2003)。IPP或具有γδT細(xì)胞選擇性的其它小分子量非肽化合物也可用于誘導(dǎo)如下文所述選定的γδT細(xì)胞的呈遞抗原功能。培養(yǎng)10-21天后，絕大部分活的、擴(kuò)充的細(xì)胞是Vγ2Vδ2+)γδT細(xì)胞，通過菲可帕克(Ficoll-Paque)離心將其從死細(xì)胞中分離出來并立即用于呈遞抗原細(xì)胞(APC)產(chǎn)生或貯存于液氮中。或者，如“實(shí)施例”中所述，通過陽(yáng)性選擇從外周血單核細(xì)胞(PBMC)中直接分離出γδT細(xì)胞。
流程圖有效遞呈抗原人γδT細(xì)胞的制備
b)用(Vγ2Vδ2+)γδT細(xì)胞選擇性化合物或植物凝集素(PHA)或如下文所列的用于誘導(dǎo)抗原攝取，呈遞功能和共刺激分子表達(dá)的其它刺激物刺激新鮮分離的和擴(kuò)充的γδT細(xì)胞一段短的時(shí)間(例如，12至96小時(shí))。
c)在刺激(b)之前、期間或之后用抗原處理γδT細(xì)胞，結(jié)果形成呈遞抗原的γδT細(xì)胞。這種抗原應(yīng)用包括各種獨(dú)立的方法，(特別是)如加入來自腫瘤、微生物或病毒感染細(xì)胞的復(fù)雜提取物或確定的蛋白質(zhì)或編碼這樣的病原體衍生蛋白質(zhì)的DNA/RNA，以純化的核物質(zhì)或包裝于表達(dá)載體中或減毒病毒的形式加入用于γδT細(xì)胞的轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)導(dǎo)和內(nèi)源表達(dá)以及微生物、病原體或腫瘤細(xì)胞衍生抗原的加工。
d)代替短期刺激程序過程中將抗原(以蛋白質(zhì)或DNA/RNA的形式)加入γδT細(xì)胞中(b和c的結(jié)合)，可以按次序進(jìn)行這些步驟。然后使用不需要胞內(nèi)蛋白水解加工的確定的肽抗原將刺激的γδT細(xì)胞“加載”一段短的時(shí)間。
除了IPP之外，步驟(a)中認(rèn)為的具有(Vγ2Vδ2+)γδT細(xì)胞選擇性的備選小分子量非肽抗原是(E)-4-羥基-3-甲基-丁-2-烯基焦磷酸酯(HMB-PP)、焦磷酸乙酯(EPP)、焦磷酸法呢酯(FPP)、二甲基烯丙基磷酸酯(DMAP)、二甲基烯丙基焦磷酸酯(DMAPP)、乙基-腺苷三磷酸酯(EPPPA)、牦牛兒焦磷酸酯(GPP)、牦牛兒牦牛兒焦磷酸酯(GGPP)、異戊烯基-腺苷三磷酸酯(IPPPA)、磷酸一乙酯(MEP)、焦磷酸一乙酯(MEPP)、3-甲酰-1-丁基-焦磷酸酯(TUBAg 1)、X-焦磷酸酯(TUBAg 2)、3-甲酰-1-丁基-尿苷三磷酸酯(TUBAg 3)、3-甲酰-1-丁基-脫氧胸苷三磷酸酯(TUBAg 4)、一乙基烷基胺、焦磷酸烯丙酯、焦磷酸巴豆酯、二甲基烯丙基-γ-尿苷三磷酸酯、巴豆基-γ-尿苷三磷酸酯、烯丙基-γ-尿苷三磷酸酯、乙胺、異丁胺、仲丁胺、異戊胺和含有氮的雙膦酸酯。優(yōu)選使用IPP由B細(xì)胞或替代物來呈遞。
例如通過將人Vγ2Vδ2-TCR的抗體加入人外周血單核細(xì)胞中，例如1-3小時(shí)孵育，接著磁性細(xì)胞分選來進(jìn)行陽(yáng)性選擇?；蛘?，通過將人VγVδ-TCR的抗體加入人外周血單核細(xì)胞中(總-γδT細(xì)胞選擇)接著磁性細(xì)胞分選來進(jìn)行陽(yáng)性選擇。
用作步驟(b)中誘導(dǎo)呈遞抗原功能刺激物的Vγ2Vδ2u)γδT細(xì)胞選擇性化合物是IPP和如上步驟(a)中所示的其它非肽化合物，例如，4-羥基-3-甲基-丁-2-烯基焦磷酸酯或其它相關(guān)的微生物代謝物?；蛘撸瑢HA或替代物用作誘導(dǎo)抗原攝取、呈遞功能和共刺激分子表達(dá)的刺激物。
為了抑制γδT細(xì)胞增殖，如果需要，可以照射刺激的細(xì)胞。
用作步驟(c)和/或(d)中蛋白質(zhì)的抗原實(shí)例是使用DC作為呈遞抗原細(xì)胞的免疫治療方案中常用的那些并與治療靶，例如，腫瘤細(xì)胞、傳染性因子(微生物，包括病毒、細(xì)菌、酵母和寄生物)相關(guān)，和病原體相關(guān)的毒素。這樣的抗原包括(但不限于)腫瘤相關(guān)抗原(腫瘤特異性代謝、結(jié)構(gòu)和細(xì)胞表面蛋白等)；病毒相關(guān)抗原(病毒編碼的包膜、結(jié)構(gòu)、代謝和酶蛋白，例如，不同病毒分化體的HIV gp 120蛋白、HIV Tat、HIV蛋白酶，例如特別是源自肝炎病毒、流感病毒、人巨細(xì)胞病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、狂犬病病毒、皰疹病毒的包膜、結(jié)構(gòu)、代謝和酶蛋白)；細(xì)菌相關(guān)抗原(細(xì)菌編碼的細(xì)胞壁、結(jié)構(gòu)、代謝和酶蛋白等，例如特別是源自分枝桿菌屬(Mycobacteria)(例如肺結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis)、麻風(fēng)分枝桿菌(M.leprae))、單核細(xì)胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、肺炎球菌(Pneumococci)、葡萄球菌屬(Staphylococci)(例如，金黃色葡萄球菌(S.aureus))、鏈球菌屬(Streptococci)(例如釀膿鏈球菌(S.pyogenes)、肺炎鏈球菌(S.pneumoniae))、霍亂弧菌(Vibrio cholerae)、破傷風(fēng)梭菌(Clostridium tetani)的那些)；酵母和真菌相關(guān)抗原(酵母/真菌編碼的細(xì)胞壁、結(jié)構(gòu)、代謝和酶蛋白等，例如特別是源自白色假絲酵母(Candida albicans)、煙曲霉(Aspergillus fumigatus)的那些)；和病原體產(chǎn)生的毒素(細(xì)菌腸毒素，特別是例如葡萄球菌腸毒素、中毒性休克綜合征毒素、破傷風(fēng)毒素)。用作蛋白質(zhì)的抗原實(shí)例還包括與引起提高的抗生素治療抗性的細(xì)菌和引起全世界致命疾病的那些微生物(特別是例如，瘧原蟲屬(Plasmodia)(例如惡性瘧原蟲(P.falciparum)、間日瘧原蟲(P.vivax)、三日瘧原蟲(P.malariae)、利什曼蟲屬(Leishmania)、錐蟲屬(Trypanosoma)、內(nèi)阿米巴屬(Entamoeba)、血吸蟲屬(Schistosoma)、絲蟲屬(Filaria))相關(guān)的那些。步驟(c)中以RNA/DNA形式使用的抗原包括血液和組織細(xì)胞轉(zhuǎn)染方案中常用的那些并包括(但不限于)編碼來自腫瘤細(xì)胞、傳染性因子(微生物，包括病毒、細(xì)菌、酵母和寄生物)的蛋白質(zhì)的那些，和病原體相關(guān)毒素，如上所示。
如“有效呈遞抗原的人γδT細(xì)胞”中所用的“有效”意思是這樣的細(xì)胞的呈遞抗原功能比得上DC的相應(yīng)呈遞抗原功能?！坝行А笔抢缭谕鹊臈l件下至少10％和DC一樣有效，差異是不同細(xì)胞形態(tài)，包括細(xì)胞形狀和表面積的結(jié)果。
短期刺激的γδT細(xì)胞一律表達(dá)趨化因子受體CCR7，其是APC歸巢至淋巴結(jié)和派伊爾結(jié)的先決條件，因此對(duì)于適應(yīng)性免疫應(yīng)答的啟動(dòng)是關(guān)鍵因素。靜息外周血γδT細(xì)胞不表達(dá)MHC-II分子，因此，不能夠以致耐受性方式來呈遞肽抗原。這種“安全性”問題使γδT細(xì)胞遠(yuǎn)離具有已知耐受性誘導(dǎo)特征的其它APC，如DC和B細(xì)胞。呈遞抗原的γδT細(xì)胞的應(yīng)用包括，特別是，在腫瘤患者治療中對(duì)腫瘤和在慢性感染或不當(dāng)免疫力患者治療中對(duì)微生物和病毒的免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)和/或提高。此外，呈遞抗原的γδT細(xì)胞可以用于鑒定新的腫瘤和其它病原體產(chǎn)生的具有強(qiáng)烈免疫原性特征的用于免疫治療中潛在應(yīng)用的抗原。最后，描述了γδT細(xì)胞監(jiān)控(特別是)免疫抑制個(gè)體的適應(yīng)性免疫力(免疫力的狀態(tài))的應(yīng)用。
現(xiàn)在參照附圖來更詳細(xì)地描述本發(fā)明，附圖給出了本發(fā)明方法的效率的充足證據(jù)。
圖1描述了從外周血分離后不久的或刺激并培養(yǎng)1或7天后的γδT細(xì)胞上細(xì)胞表面分子的表達(dá)。為了比較，還檢查了刺激1天的αβT細(xì)胞和新鮮分離的單核細(xì)胞上的相同細(xì)胞表面分子。圖1中所示的細(xì)胞表面分子包括MHC-II；共刺激分子CD80和CD86，即用于原初和記憶T細(xì)胞上存在的受體CD28的兩種選擇性配體；CD70，即CD27的配體；CD40，即CD154/CD40-配體的受體以及粘附分子CD54/ICAM-1、CD11a/αL-整聯(lián)蛋白和CD18/β2-整聯(lián)蛋白，它們參與細(xì)胞與細(xì)胞的接觸。這些數(shù)據(jù)證明了新鮮分離的γδT細(xì)胞具有適度水平的粘附分子但缺少原初T細(xì)胞激活和分化必需的MHC-II和共刺激分子。相反，γδT細(xì)胞的短期(1天)刺激導(dǎo)致MHC-II和共刺激分子非常高水平的表達(dá)并進(jìn)一步提高了粘附分子的表達(dá)。值得注意的是，除了CD40和CD54，這些細(xì)胞表面分子的水平都在γδT細(xì)胞7天的培養(yǎng)過程中得到維持或進(jìn)一步提高。明顯相反，相同系列的分子(除了單核細(xì)胞上的CD86)在αβT和單核細(xì)胞上適度表達(dá)或不存在。
表1中的數(shù)字總結(jié)了對(duì)細(xì)胞表面分子在γδT細(xì)胞上以及為了比較，在αβT細(xì)胞、單核細(xì)胞和成熟DC上的表達(dá)的廣泛研究的結(jié)果。列表包括圖1中所示的實(shí)例以及其它的細(xì)胞表面分子。數(shù)字表示平均表達(dá)水平，表示為平均熒光強(qiáng)度(MFI)的平均值，和相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)。注意到激活的γδT細(xì)胞上的MHC-II(HLA-DR)、共刺激分子和粘附分子的顯著陽(yáng)性，其類似成熟DC但遠(yuǎn)超過在激活的αβT細(xì)胞和單核細(xì)胞中所看到的水平。
圖2和表2對(duì)應(yīng)于以前由Brandes等，2003發(fā)表的結(jié)果，并在此包括來描述與本發(fā)明有關(guān)的激活人γδT細(xì)胞的另外的特征。表2列出了趨化因子受體的表達(dá)水平，其在新鮮分離的外周血γδT細(xì)胞與受刺激的γδT細(xì)胞之間明顯不同。外周血中的γδT細(xì)胞表達(dá)趨化因子受體和粘附分子(圖1中所示的)，用于快速募集至炎癥和感染部位，而γδT細(xì)胞的短期激活部分抑制這些炎癥遷移特性(即CCR2和CCR5的下調(diào))并代之以快速誘導(dǎo)CCR7表達(dá)，用于有效歸巢至脾臟、LN和PP的T細(xì)胞區(qū)域。
表1.人γδT細(xì)胞上細(xì)胞表面分子的表達(dá)水平。

a如實(shí)施例中所述刺激細(xì)胞并通過流式細(xì)胞術(shù)來檢查所示分子的細(xì)胞表面表達(dá)。
MFI＝平均熒光強(qiáng)度；SD ＝標(biāo)準(zhǔn)偏差；(n)表示獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的數(shù)目。
bn.d.表示未測(cè)定。
表2.人γδT細(xì)胞中趨化因子受體的表達(dá)

a數(shù)據(jù)摘自Brandes等，Blood(2003)圖2說明了短期激活的γδT細(xì)胞的遷移特性，如通過體外趨化性分析所評(píng)定的(Brandes等，2002)。數(shù)據(jù)清楚地證明了在激活的γδT細(xì)胞中對(duì)CCR7配體SLC/CCL21的響應(yīng)性和強(qiáng)烈降低的對(duì)CCR5(和CCR1、CCR3)配體RANTES/CCL5的響應(yīng)性。數(shù)據(jù)進(jìn)一步證明了細(xì)胞表面趨化因子受體水平的改變直接反映在對(duì)相應(yīng)趨化因子的遷移應(yīng)答中。
共同地，圖1-2和表1-2中概括的結(jié)果強(qiáng)調(diào)了受刺激的而不是靜息的(新鮮分離的)外周血γδT細(xì)胞表達(dá)許多LN歸巢和原初T細(xì)胞刺激所需要的必要因子，包括粘附分子和共刺激分子以及趨化因子受體。將這些遷移和APC相關(guān)參數(shù)的激活誘導(dǎo)調(diào)節(jié)與DC中發(fā)生的激活誘導(dǎo)改變進(jìn)行充分比較(Banchereau和Steinman，1998；Steinman等，2003；Banchereau等，2004)。此外，這些數(shù)據(jù)意味著刺激的人γδT細(xì)胞可以充當(dāng)比得上DC的有效APC。
快速、廣泛和抗原無關(guān)的細(xì)胞簇形成是DC-T細(xì)胞相互作用的特征且是原初T細(xì)胞的抗原依賴性刺激和分化的先決條件。圖3證明了受刺激的γδT細(xì)胞在培養(yǎng)3小時(shí)內(nèi)也誘導(dǎo)原初(靜息)CD4+T細(xì)胞巨大的細(xì)胞成簇。值得注意的是，這些簇在抗原不存在下形成，表明粘附分子和共刺激分子引起了這種效果。γδT細(xì)胞介導(dǎo)的簇形成至少和使用成熟DC觀察到的情況一樣旺盛。相反，1天激活的αβT細(xì)胞或新鮮分離的單核細(xì)胞(未顯示)的效率要低得多，這與這些細(xì)胞上降低水平的粘附分子和共刺激分子相一致。這些數(shù)據(jù)提供了短期激活的γδT細(xì)胞具有有效的APC功能的進(jìn)一步證據(jù)。
激活的γδT細(xì)胞能夠攝取、加工和呈遞抗原，用于引發(fā)抗原特異性CD4+αβT細(xì)胞系中的應(yīng)答。圖4顯示了破傷風(fēng)毒素(TT)特異性CD4+αβT細(xì)胞應(yīng)答短期刺激的呈遞TT的γδT細(xì)胞的增殖或應(yīng)答作為對(duì)照的呈遞TT的DC的增殖。TT特異性CD4+αβT細(xì)胞系源自提供γδT細(xì)胞的相同供體。將靜息TT-特異性CD4+αβT細(xì)胞加載CFSE，并通過用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量培養(yǎng)細(xì)胞中CFSE信號(hào)的降低來測(cè)定應(yīng)答細(xì)胞的增殖(參見“實(shí)施例”)。在細(xì)胞分裂過程中，將CFSE內(nèi)容物分配到兩個(gè)子細(xì)胞上，使得每輪細(xì)胞分裂的特征在于CFSE信號(hào)降低50％。這種類型的分析允許測(cè)定a)非應(yīng)答細(xì)胞與增殖細(xì)胞(輸入/最大與降低的CFSE信號(hào))的分?jǐn)?shù)，b)具有不同輪細(xì)胞分裂的細(xì)胞亞類，和c)實(shí)驗(yàn)開始時(shí)已經(jīng)應(yīng)答APC的細(xì)胞的分?jǐn)?shù)。通過進(jìn)行3H-胸苷摻入測(cè)定不能獲得這種信息，這種測(cè)定是測(cè)定細(xì)胞增殖的備選方法。圖4顯示了γδT細(xì)胞能夠誘導(dǎo)TT-特異性CD4+T細(xì)胞中的增殖且這種應(yīng)答完全取決于抗原，因?yàn)樵赥T不存在下受刺激的γδT細(xì)胞是沒有活性的。這進(jìn)一步顯示了在培養(yǎng)的第4天至第6天，CD4+T細(xì)胞持續(xù)增殖，如通過CFSE信號(hào)的進(jìn)一步降低所證實(shí)的(在圖4中移至熒光信號(hào)的左側(cè))。值得注意的是，γδT細(xì)胞在這種應(yīng)答中和成熟DC的有效性相似，這證明了短期刺激的γδT細(xì)胞具有有效的呈遞抗原功能。
圖5說明了這樣的事實(shí)TT特異性增殖應(yīng)答需要TT呈遞γδT細(xì)胞與應(yīng)答TT特異性CD4+αβT細(xì)胞(應(yīng)答細(xì)胞)之間的細(xì)胞接觸。通過多孔膜從含有TT-呈遞γδT細(xì)胞和應(yīng)答細(xì)胞的共培養(yǎng)物中分離出來的應(yīng)答細(xì)胞沒有增殖。多孔膜防止了兩個(gè)培養(yǎng)區(qū)室之間的細(xì)胞交換，但不防止可溶性介質(zhì)的交換。因此，圖5中的結(jié)果還證明了在TT-呈遞γδT細(xì)胞和應(yīng)答細(xì)胞共培養(yǎng)的過程中產(chǎn)生的細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子對(duì)分開培養(yǎng)的應(yīng)答細(xì)胞的增殖沒有影響。
TCR引發(fā)伴隨著TCR內(nèi)在化，導(dǎo)致細(xì)胞表面TCR和附屬分子如CD3的下調(diào)。圖6證明了TT-呈遞γδT細(xì)胞誘導(dǎo)TT-特異性應(yīng)答細(xì)胞中的TCR下調(diào)(參見圖4)，如通過細(xì)胞表面CD3的喪失所評(píng)定的。因此，γδT細(xì)胞具有攝取和加工TT以及以足以TCR接合的方式向TT-特異性應(yīng)答細(xì)胞呈遞MHC-II-肽復(fù)合體形式的TT-衍生肽的能力。因?yàn)榧せ畹亩皇庆o息的外周血γδT細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞表面MHC-II分子，所以呈遞抗原功能與γδT細(xì)胞激活密切相關(guān)。圖6還顯示出TCR下調(diào)是受刺激的γδT細(xì)胞上TT-肽密度的函數(shù)，其通過改變?chǔ)忙腡細(xì)胞刺激過程中加入的TT量來控制。明顯地，刺激的γδT細(xì)胞上存在的TT-衍生的MHC-II-肽復(fù)合體越多，應(yīng)答細(xì)胞上變?yōu)榻雍虾拖抡{(diào)的TCR就越多。γδT細(xì)胞和DC之間TCR下調(diào)的不同效力很可能是由于細(xì)胞形態(tài)的顯著差異引起的，因?yàn)槌墒斓某蔬f抗原DC的細(xì)胞表面積大于刺激的γδT細(xì)胞＞10倍(Miller等，2004)。
除了增殖外，TT-呈遞γδT細(xì)胞還誘導(dǎo)TT-特異性CD4+αβT細(xì)胞中激活標(biāo)記的表達(dá)。圖7顯示了應(yīng)答細(xì)胞的細(xì)胞表面上T細(xì)胞激活標(biāo)記包括CD25、ICOS和CD134/OX40的上調(diào)，這些T細(xì)胞激活標(biāo)記應(yīng)答TCR引發(fā)而重新表達(dá)或提高。與在T細(xì)胞增殖的誘導(dǎo)中一樣，這些激活標(biāo)記的高水平表達(dá)完全取決于由短期刺激的γδT細(xì)胞的TT-肽呈遞，因?yàn)橛肨T不存在下受刺激的γδT細(xì)胞不誘導(dǎo)這些激活標(biāo)記。
圖8顯示出異種EB病毒(EBV)-無限增殖化B細(xì)胞和自體應(yīng)答細(xì)胞缺少TT-呈遞功能。一個(gè)刺激γδT細(xì)胞的方案包括使用照射的、IPP-呈遞細(xì)胞，該細(xì)胞是自體B細(xì)胞，或者為了體外實(shí)驗(yàn)的方便，是EBV-B細(xì)胞系，即異種CP.EBV系。圖8證明了TT-處理的CP.EBV細(xì)胞不能誘導(dǎo)TT-特異性CD4+αβT細(xì)胞的增殖，表明CP.EBV材料并未有助于用TT-肽呈遞γδT細(xì)胞獲得的強(qiáng)烈增殖應(yīng)答。此外，圖8說明了αβT細(xì)胞系憑借自身的TT-呈遞功能差。
使用復(fù)雜/未確定的抗原肺結(jié)核分枝桿菌純化的蛋白質(zhì)衍生物(PPD)獲得了與圖4-8中所示的使用TT的情況相似的結(jié)果。圖9顯示了用作為APC的PPD-肽呈遞γδT細(xì)胞或PPD-肽呈遞DC刺激后培養(yǎng)4天或8天后PPD-特異性CD4+αβT細(xì)胞的增殖應(yīng)答。再次，在自體條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，即，APC(γδT細(xì)胞和DC)和應(yīng)答細(xì)胞(PPD-特異性CD4+αβT細(xì)胞系)源自相同的供體。如對(duì)于TT所證明的，增殖應(yīng)答是PPD-特異性的且在γδT細(xì)胞和DC之間沒有顯著不同。此外，αβT細(xì)胞系自身不能誘導(dǎo)PPD-特異性應(yīng)答細(xì)胞中的增殖。與PPD相比較，使用TT相同濃度的抗原γδT細(xì)胞和DC誘導(dǎo)更有力的應(yīng)答，這是由于TT(Mr[TT]150kDa)和PPD(Mr[PPD]≥10,000kDa)之間的復(fù)雜性差異引起的。復(fù)雜抗原，如PPD或完整的微生物，抗原肽的全部組成部分高度不同，其結(jié)果是各個(gè)APC以低水平呈遞離散的MHC-肽復(fù)合體。相一致地，克隆的、PPD特異性CD4+T細(xì)胞與PPD呈遞APC的共培養(yǎng)過程中的TCR下調(diào)沒有在TT-系統(tǒng)中所觀察到的那么明顯(圖6)。
總而言之，使用TT-特異性和PPD-特異性應(yīng)答細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)證明了本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)刺激的(而不是靜息的)源自人外周血的γδT細(xì)胞具有有效的抗原攝取、呈遞抗原和T細(xì)胞刺激功能。這些γδT細(xì)胞的效力和功效是顯著的并比得上使用DC獲得的結(jié)果。
有效APC如DC的特征是它們誘導(dǎo)初次適應(yīng)性免疫應(yīng)答的能力，所述免疫應(yīng)答涉及原初(未經(jīng)歷過抗原的)T細(xì)胞的刺激及其分化成具有產(chǎn)生細(xì)胞因子或殺滅靶細(xì)胞能力的抗原特異性效應(yīng)T細(xì)胞(Banchereau和Steinman，1998；Steinman等，2003；Banchereau等，2004)。完全分化的記憶T細(xì)胞具有降低的激活閾值，且共刺激不存在下的TCR引發(fā)足以啟動(dòng)效應(yīng)子功能。下圖中顯示的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了受刺激的γδT細(xì)胞也具有與DC相當(dāng)?shù)挠行С蔬f抗原功能。因此，代替經(jīng)歷過抗原的CD4+αβT細(xì)胞系(圖4-9)，將自體新鮮分離的原初CD4+αβT細(xì)胞用作潛在的應(yīng)答細(xì)胞。
圖10顯示了CFSE標(biāo)記的、原初CD4+αβT細(xì)胞應(yīng)答加載中毒性休克綜合征毒素(TSST-1)的、短期刺激的γδT細(xì)胞和加載TSST-1的成熟DC的增殖程度，與加載TSST-1的刺激的αβT細(xì)胞或加載TSST-1的新鮮分離的單核細(xì)胞相比較。TSST-1結(jié)合APC上的MHC-II分子，且對(duì)于含有Vβ2-鏈的αβ-TCR是選擇性的。4-10％的外周血CD3+T細(xì)胞是Vβ2+并以高親和力應(yīng)答TSST-1呈遞APC。如圖10中所證明的，加載TSST-1的γδT細(xì)胞在誘導(dǎo)原初Vβ2+-T細(xì)胞中的增殖中是專門的APC，如通過CFSE信號(hào)的降低所證明的，且在帶有Vβ2+-TCR的原初CD4+αβT細(xì)胞中這種應(yīng)答比帶有Vβ2neg-TCR的細(xì)胞明顯得多。最后，在完成細(xì)胞擴(kuò)充后，大部分所得到的記憶T細(xì)胞表達(dá)Vβ2+-TCR(也參閱表3)。重要地，增殖應(yīng)答比得上使用加載TSST-1的DC獲得的結(jié)果。在這些條件下，加載TSST-1的αβT細(xì)胞或單核細(xì)胞完全沒有活性，表明在這些細(xì)胞中TSST-1呈遞和/或共刺激水平不足以誘導(dǎo)有效的初次T細(xì)胞應(yīng)答。
表3.長(zhǎng)期培養(yǎng)(21天)過程中的αβT細(xì)胞表達(dá)和Th細(xì)胞分化

aAPC是加載了TSST-1的刺激1天的γδT細(xì)胞或成熟DC，并以1∶5或1∶1的比例加入原初CD4+αβT細(xì)胞中。
bTSST-1是用于加載APC的抗原；或者，在APC不存在下用PHA直接激活原初CD4+αβT細(xì)胞。
cVβ2+應(yīng)答細(xì)胞的百分比是如圖10中所述的通過流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定的。
d細(xì)胞因子極化的Th細(xì)胞百分比分?jǐn)?shù)是如圖13中所述的通過測(cè)量胞內(nèi)細(xì)胞因子測(cè)定的。
e未測(cè)定的數(shù)據(jù)。
除了共刺激分子外，很大程度上決定原初CD4+αβT細(xì)胞中的動(dòng)力學(xué)和增殖程度的參數(shù)是APC上MHC-II-TSST-1復(fù)合體的密度以及APC與應(yīng)答細(xì)胞之間的比例。圖11顯示了Vβ2+應(yīng)答細(xì)胞應(yīng)答遞增濃度的用于加載不同類型APC的TSST-1的增殖。在加入原初CD4+αβT細(xì)胞之前，將APC進(jìn)行洗滌來去掉過量的TSST-1(參見“實(shí)施例”)。自體APC的名單包括刺激1天的或刺激7天的γδT細(xì)胞、成熟DC、新鮮分離的單核細(xì)胞和刺激1天的αβT細(xì)胞。刺激1天的γδT細(xì)胞在低到1ng/ml的TSST-1加載濃度下誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖應(yīng)答，且就最大應(yīng)答而言和DC同等有效。DC的效力約高10倍可能是由于它們極度擴(kuò)充的細(xì)胞表面積(Miller等，2004)，這允許更頻繁的或更大范圍的接觸應(yīng)答細(xì)胞(也參閱圖6)。重要的是，用加載TSST-1之前的7天培養(yǎng)過程中擴(kuò)充的刺激的γδT細(xì)胞仍然獲得實(shí)質(zhì)性的增殖應(yīng)答。明顯地，γδT細(xì)胞在延長(zhǎng)的時(shí)間段內(nèi)維持APC功能，這與觀察到的粘附分子和共刺激分子的保持相一致(也參閱圖1和表1)。單核細(xì)胞和αβT細(xì)胞的效力低于γδT細(xì)胞＞100倍。這些數(shù)據(jù)證明了刺激的γδT細(xì)胞具有有效的呈遞抗原功能。
在圖12所示的實(shí)驗(yàn)中，代替APC加載過程中的TSST-1滴定，使APC與原初應(yīng)答細(xì)胞的比例在1∶5至1∶200之間變化，同時(shí)保持TSST-1加載濃度為100ng/ml或1μg/ml。如圖11測(cè)定原初Vβ2+CD4+αβT細(xì)胞的增殖應(yīng)答。刺激1天的γδT細(xì)胞和DC之間不存在明顯的差異，且在最高的APC稀釋度(1∶200)下，增殖應(yīng)答仍然在最大應(yīng)答的28-40％的范圍。這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步說明了γδT細(xì)胞作為有效的APC的勝任性。
初次免疫應(yīng)答涉及原初CD4+T細(xì)胞分化成極化的Th1、Th2或Th0細(xì)胞，它們分別具有產(chǎn)生1型(IFN-γ)、2型(IL-4)或0型(IFN-γ+IL-4)細(xì)胞因子的能力。原初CD4+T細(xì)胞具有分化成這些極化Th細(xì)胞任一種的能力。在原初T細(xì)胞引發(fā)時(shí)由APC提供的共刺激環(huán)境決定了T細(xì)胞極化。有效的APC不僅誘導(dǎo)原初T細(xì)胞的增殖，而且還支持它們分化成效應(yīng)細(xì)胞。圖13證明了刺激的γδT細(xì)胞在合適的共刺激環(huán)境中完全能夠呈遞TSST-1，用于產(chǎn)生效應(yīng)Th細(xì)胞。用加載TSST-1的γδT細(xì)胞引發(fā)后4天，大部分Vβ2+原初CD4+T細(xì)胞已經(jīng)通過增殖和記憶標(biāo)記CD45RO的表達(dá)產(chǎn)生應(yīng)答。21天培養(yǎng)后，大部分細(xì)胞恢復(fù)成靜息狀態(tài)，一律表達(dá)CD45RO并由Vβ2+T細(xì)胞構(gòu)成(表3)。重要地，大部分細(xì)胞產(chǎn)生Th1、Th2或Th0細(xì)胞特有的細(xì)胞因子，且通過將加載TSST-1的γδT細(xì)胞與應(yīng)答細(xì)胞的比例增加至1∶1進(jìn)一步提高了Th1極化。此外，使用DC看到的更顯著效果可能是由于如上所述的形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)所引起的(Miller等，2004)(也參閱圖6、9)。相反，抗原非選擇性激活(植物凝集素)不導(dǎo)致Vβ2+T細(xì)胞的選擇性擴(kuò)充(表3)，且刺激的αβT細(xì)胞不能誘導(dǎo)CD45RO表達(dá)和原初CD4+αβT細(xì)胞的增殖(圖13)。
如使用TT-特異性和PPD-特異性CD4+αβT細(xì)胞所看到的(參見，例如，圖5)，原初CD4+αβT細(xì)胞中應(yīng)答的誘導(dǎo)完全取決于與加載TSST-1的γδT細(xì)胞的細(xì)胞與細(xì)胞接觸(圖14)。刺激的γδT細(xì)胞在原初CD4+αβT細(xì)胞中誘導(dǎo)強(qiáng)烈的抗原特異性應(yīng)答并以有效APC的典型方式支持它們的增殖和分化。
CD4+T細(xì)胞識(shí)別APC上的II-類MHC-肽復(fù)合體，而CD8+T細(xì)胞識(shí)別APC上的I類MHC-肽復(fù)合體。I類MHC分子在血細(xì)胞和組織細(xì)胞上普遍表達(dá)；因此，體內(nèi)的所有細(xì)胞都是CD8+T細(xì)胞的潛在靶細(xì)胞。值得注意的是，CD8+T細(xì)胞是對(duì)病毒感染和腫瘤的防御中的關(guān)鍵參與者，并且通常成功的疫苗接種取決于抗原選擇性的、細(xì)胞毒性CD8+T細(xì)胞的產(chǎn)生。圖15證明了Vδ2+T細(xì)胞是初次CD8+T細(xì)胞應(yīng)答誘導(dǎo)中的非常有效的APC。將原初的、未觸及的CD8+αβ T細(xì)胞用作增殖測(cè)定中的應(yīng)答細(xì)胞，該測(cè)定包含IPP-刺激的γδ T細(xì)胞、成熟DC或超抗原刺激的αβT細(xì)胞作為APC(所有細(xì)胞都來自相同的供體)。γδT細(xì)胞在誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞增殖中完全比得上或甚至優(yōu)于DC，而αβT細(xì)胞是較差的APC。圖16證明了γδT細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞毒性效應(yīng)T細(xì)胞的分化。數(shù)據(jù)說明了γδT細(xì)胞與DC在驅(qū)動(dòng)原初CD8+T細(xì)胞分化成同種異體抗原特異性的細(xì)胞毒性T細(xì)胞中是不可區(qū)分的。共同地，TCR-刺激的Vδ2+T細(xì)胞以類似APC的“專門”方式誘導(dǎo)了原初CD4+和CD8+αβT細(xì)胞中的強(qiáng)烈促炎性應(yīng)答。
γδT細(xì)胞還表達(dá)內(nèi)吞受體，如C-型凝集素DEC-205(CD205)和具有多種蛋白和非蛋白配體選擇性的整聯(lián)蛋白亞基CD11b。已知CD205和CD11b在DC上高度表達(dá)(Banchereau和Steinman，1998；Steinman等，2003；Banchereau等，2004)。圖17證明了γδT細(xì)胞，與DC相似，本能地表達(dá)高水平的這些內(nèi)吞受體。與向DC的抗原遞送的新方法類似，這些數(shù)據(jù)證明了抗原，包括用于腫瘤和傳染性因子的蛋白疫苗，也可以靶向γδT細(xì)胞，用于體內(nèi)抗原加工和呈遞。
這些實(shí)驗(yàn)的細(xì)節(jié)證明了本發(fā)明制備有效呈遞抗原的人γδT細(xì)胞的方法，包括從人外周血單核細(xì)胞中選擇γδT細(xì)胞，用誘導(dǎo)呈遞抗原功能的刺激物處理選定的細(xì)胞，并將所述抗原用于受刺激的細(xì)胞，提供了與DC相當(dāng)?shù)腁CP。
特別地，本發(fā)明涉及這樣的制備有效呈遞抗原的人γδT細(xì)胞的方法，其中使用人VγVδ-T細(xì)胞受體的抗體進(jìn)行磁性細(xì)胞分選來選擇γδT細(xì)胞。或者，通過在誘導(dǎo)表達(dá)Vγ2Vδ2+-T細(xì)胞受體鏈的γδT細(xì)胞選擇性擴(kuò)充的結(jié)構(gòu)上確定的小分子量非肽化合物的存在下培養(yǎng)新鮮分離的外周血淋巴細(xì)胞來進(jìn)行γδT細(xì)胞選擇，例如在IPP存在下，例如由B細(xì)胞或替代物呈遞的。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種特定的方法，其中用于誘導(dǎo)有效呈遞抗原功能的刺激物是小分子量非肽化合物或替代物或植物凝集素，和另一種特定的方法，其中以以下形式來應(yīng)用抗原確定的蛋白質(zhì)，未確定的蛋白質(zhì)混合物，或粗制或富集的腫瘤和受感染細(xì)胞提取物，例如其中所應(yīng)用的抗原是病原體-或腫瘤細(xì)胞-衍生的肽，或病原體衍生的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)以在允許所述病原體衍生的蛋白質(zhì)內(nèi)源性表達(dá)的條件下編碼其的DNA或RNA的形式，特別是以純化的DNA或RNA或含有這樣的DNA或RNA的遞送載體的形式來應(yīng)用。如果抗原是DNA或RNA形式，則選擇條件使得所述DNA或RNA可以得到適當(dāng)表達(dá)?？乖膽?yīng)用可以在用于誘導(dǎo)呈遞抗原功能的γδT細(xì)胞刺激之前、期間或之后進(jìn)行。如果以肽(蛋白質(zhì)片段)來應(yīng)用抗原，其應(yīng)用也可以在刺激后的稱為“肽加載”的分開步驟中進(jìn)行。
如此前所述的根據(jù)本發(fā)明制得的有效呈遞抗原的人γδT細(xì)胞可以用于免疫治療中。這樣的用途與DC在免疫治療中的已知用途相似，因此克服了使用DC的缺陷，如在外周血中的不足、體外增殖的無能、異種性和功能不穩(wěn)定性。
特別地，如之前所述的根據(jù)本發(fā)明制得的有效呈遞抗原的人γδT細(xì)胞可以用于制備免疫治療中所用的藥物(藥物組合物)。
本發(fā)明還涉及藥物組合物，包含如前文中所述的根據(jù)本發(fā)明制得的有效呈遞抗原的人γδT細(xì)胞，尤其可以用于上文和下文中所述的疾病的治療。特別優(yōu)選的是用于非腸道給藥于人的組合物，如靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、粘膜或粘膜下給藥。該組合物包含所述細(xì)胞和藥物學(xué)上可接受的載體。本發(fā)明的細(xì)胞的用量取決于待治療的疾病和年齡、體重和個(gè)體狀況、個(gè)體藥物動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)和給藥方式。該藥物組合物包含約0.01％至約50％的本發(fā)明的細(xì)胞。單位劑型是例如安瓿或小瓶。
優(yōu)選的是使用等滲水性懸浮液。該藥物組合物可以包含賦形劑，例如防腐劑、穩(wěn)定劑、濕潤(rùn)劑和/或乳化劑、增溶劑、用于調(diào)節(jié)滲透壓的鹽和/或緩沖劑，并以本身已知的方式，例如通過常規(guī)的混合方法制得。通常在無菌條件下進(jìn)行注射制劑的制備，例如填充到安瓿或小瓶中，并將容器密封。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及腫瘤或慢性或復(fù)發(fā)性傳染病的治療方法，其中將有效呈遞抗原的人γδT細(xì)胞注射至需要的患者中。特別地，該方法涉及所述γδT細(xì)胞，例如含有該細(xì)胞的藥物組合物，通過皮內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、粘膜或粘膜下途徑的單次或重復(fù)應(yīng)用。
在腫瘤治療方法中，使用γδT細(xì)胞，該細(xì)胞已經(jīng)在確定的腫瘤蛋白質(zhì)或粗制(未確定的)腫瘤細(xì)胞提取物的存在下受到刺激，或者，已經(jīng)使用常規(guī)用于轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)活的血細(xì)胞或組織細(xì)胞的重組RNA/DNA技術(shù)處理獲得了該細(xì)胞。優(yōu)選，如果用于直接加載至細(xì)胞表面MHC分子上的確定的腫瘤肽是已知的，那么將這樣的肽加入受刺激的γδT細(xì)胞中、孵育、洗滌并立即用于治療。重要的是強(qiáng)調(diào)每次給予所用的γδT細(xì)胞數(shù)量以及γδT細(xì)胞給予的途徑和頻率取決于免疫應(yīng)答誘導(dǎo)中所用的單個(gè)腫瘤抗原的功效以及個(gè)體患者中存在的腫瘤的類型和位置。例如，優(yōu)選的方案是每次給予1-20×106細(xì)胞/0.5-2ml，以兩周至兩個(gè)月的間隔使用相同或較低量細(xì)胞的繼續(xù)給予1至6次。
在慢性或復(fù)發(fā)性傳染病的治療方法中，使用已經(jīng)在優(yōu)選減毒形式的確定的傳染性因子或粗制(未確定的)感染細(xì)胞提取物的存在下受到刺激的γδT細(xì)胞，或者已經(jīng)使用常規(guī)用于轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)活的血細(xì)胞或組織細(xì)胞的重組RNA/DNA技術(shù)處理獲得的γδT細(xì)胞。優(yōu)選的治療方案與上述的治療方案一致。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及接種對(duì)抗腫瘤或慢性或復(fù)發(fā)性傳染病疫苗的方法，其中將已經(jīng)應(yīng)用了非傳染性和非致腫瘤性抗原的有效呈遞抗原的人γδT細(xì)胞注射至待接種疫苗的患者中。出于接種疫苗的目的，使用此前所述的相同程序，但是其中使用已經(jīng)應(yīng)用了非傳染性和非致腫瘤性抗原的γδT細(xì)胞。按照腫瘤免疫治療的描述(見上文)來制備疫苗呈遞抗原γδT細(xì)胞和給予這些細(xì)胞用于給患者接種對(duì)抗腫瘤抗原或傳染性因子的疫苗。優(yōu)選的方案是基于DC的疫苗接種治療中常用的那些方案。如下所述檢查這樣治療過的患者的免疫狀態(tài)，即，疫苗應(yīng)答的能力(功效、動(dòng)力學(xué)等)。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及另一種(預(yù)防性或治療性)接種對(duì)抗腫瘤疫苗或接種對(duì)抗誘導(dǎo)傳染性或非傳染性疾病物質(zhì)疫苗的方法，包括將靶向γδT細(xì)胞的疫苗給藥于個(gè)體。優(yōu)選，這樣的靶向γδT細(xì)胞的疫苗是由疫苗劑和靶向γδT細(xì)胞的分子構(gòu)成的混雜化合物。靶向γδT細(xì)胞的分子是γδT細(xì)胞上內(nèi)吞受體，包括但不限于CD11b和CD205特異性的抗體或配體。疫苗劑是需要產(chǎn)生對(duì)抗其的免疫保護(hù)的蛋白質(zhì)或相關(guān)分子。
靶向γδT細(xì)胞的疫苗的給藥需要使用靶向γδT細(xì)胞的疫苗重復(fù)治療個(gè)體，通過注射、口服或任何其他產(chǎn)生最佳免疫保護(hù)的疫苗遞送方案重復(fù)治療個(gè)體。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及鑒定新的腫瘤或病原體衍生抗原的方法，包括從人外周血單核細(xì)胞中選擇γδT細(xì)胞，用誘導(dǎo)有效呈遞抗原功能的刺激物處理選定的細(xì)胞，使用未確定的蛋白質(zhì)混合物的部分，或腫瘤和受感染細(xì)胞的粗制或富集提取物，或源自腫瘤和傳染性因子的RNA或DNA文庫(kù)，測(cè)試自體原初αβT細(xì)胞的體外激活，并比較不同抗原部分的激活結(jié)果。
在該方法中，將γδT細(xì)胞用作體外篩選工具，用于鑒定新的和改良的抗原，用于治療性和預(yù)防性疫苗接種中。如有效呈遞抗原的人γδT細(xì)胞制備方法中所述的進(jìn)行γδT細(xì)胞的分離、選擇和刺激。在應(yīng)用抗原的步驟中，使用粗制抗原制品(例如，細(xì)胞提取物或未確定的混合物)的部分或源自腫瘤和傳染性因子的RNA/DNA文庫(kù)。然后測(cè)試這樣制得的γδT細(xì)胞中相同供體的原初αβT細(xì)胞，即自體αβT細(xì)胞的激活。這些體外免疫應(yīng)答測(cè)定中的讀出是αβT細(xì)胞中的增殖和細(xì)胞因子產(chǎn)生，或任何其他的αβT細(xì)胞激活的簡(jiǎn)單測(cè)量。培養(yǎng)條件優(yōu)選為以上圖10-14和“實(shí)施例”中對(duì)于αβT細(xì)胞應(yīng)答TSST-1呈遞γδT細(xì)胞所述的那些條件。當(dāng)比較不同抗原部分激活效果時(shí)，提高的αβT細(xì)胞應(yīng)答表明抗原來源就免疫原性而言是“富集的”。進(jìn)一步加工相應(yīng)的“富集”部分，并使用進(jìn)一步分級(jí)的抗原重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟的整個(gè)周期。最后，“富集”抗原來源的重復(fù)分級(jí)(蛋白質(zhì)或DNA文庫(kù)分級(jí))產(chǎn)生具有最大的免疫刺激功能的單個(gè)蛋白質(zhì)?？梢酝ㄟ^蛋白酶剪切進(jìn)一步操作這樣的新蛋白質(zhì)，并相應(yīng)地分析剪切混合物中用于直接加載至APC上的(小)免疫原性肽的產(chǎn)生。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及診斷患者免疫力的方法，包括從患者的外周血單核細(xì)胞中選擇γδT細(xì)胞，用誘導(dǎo)有效呈遞抗原功能的刺激物處理選定的細(xì)胞，應(yīng)用必須確定對(duì)其的免疫力的抗原，和測(cè)試自體αβT細(xì)胞的體外激活。
在該方法中，將γδT細(xì)胞及其對(duì)來自相同供體的抗原特異性記憶αβT細(xì)胞的影響用作體外工具，用于診斷患者對(duì)于特定抗原的免能力和用于測(cè)定疫苗接種是否已經(jīng)成功。如有效呈遞抗原的人γδT細(xì)胞的制備方法中所述的進(jìn)行γδT細(xì)胞的分離、選擇和刺激。在應(yīng)用抗原的步驟中，將必須確定對(duì)其的免疫力的特定抗原用于受刺激的γδT細(xì)胞。培養(yǎng)條件和用于測(cè)定αβT細(xì)胞應(yīng)答(體外免疫應(yīng)答測(cè)定)的讀出優(yōu)選為以上圖10-14和“實(shí)施例”中對(duì)于αβT細(xì)胞應(yīng)答TSST-1呈遞γδT細(xì)胞所述的那些。決定性差異在于監(jiān)控記憶αβT細(xì)胞而不是原初αβT細(xì)胞的在用呈遞抗原γδT細(xì)胞刺激過程中提高的免疫應(yīng)答(增殖、細(xì)胞因子產(chǎn)生等)。成功的免疫治療(疫苗接種)導(dǎo)致抗原特異性效應(yīng)/記憶T細(xì)胞的產(chǎn)生，其與原初αβT細(xì)胞相比較，在免疫狀態(tài)的體外監(jiān)控過程中給予許多倍提高的免疫應(yīng)答。優(yōu)選使用大量(未分級(jí)的)αβT細(xì)胞進(jìn)行這些測(cè)試，因?yàn)榭乖禺愋杂洃洣力耇細(xì)胞在成功接種疫苗的個(gè)體中是高度富集的。
實(shí)施例縮寫DC樹突細(xì)胞LN淋巴結(jié)PP派伊爾氏結(jié)TCR T細(xì)胞抗原受體BCR B細(xì)胞抗原受體MHC 主要組織相容性復(fù)合體APC 呈遞抗原細(xì)胞Vδ1+T細(xì)胞 表達(dá)Vδ1+-TCR鏈的γδT細(xì)胞Vγ2Vδ2+T細(xì)胞 表達(dá)Vγ2Vδ2+-TCR鏈的γδT細(xì)胞IPP 焦磷酸異戊烯酯TT破傷風(fēng)梭菌破傷風(fēng)毒素PPD 肺結(jié)核分枝桿菌純化的蛋白質(zhì)衍生物TSST-1金黃色葡萄球菌中毒性休克綜合征毒素1PHA 植物凝集素
IFN-γ 干擾素-γTNF-α 腫瘤壞死因子-αIL白細(xì)胞介素FACS 熒光激活的細(xì)胞分選MFI 平均熒光強(qiáng)度SD標(biāo)準(zhǔn)誤差CFSE 羧基熒光素二乙酸酯琥珀酰亞胺基酯1.細(xì)胞分離和產(chǎn)生γδT細(xì)胞根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案(Brandes等，2003)通過菲克帕克(Ficoll-Paque)離心從肝素處理的供體血液血沉棕黃層或新鮮血液中分離人外周血單核細(xì)胞(PBMC)。使用來自Miltenyi Biotec的磁性細(xì)胞分選系統(tǒng)，用人VγVδ-TCR的抗體從PBMC中陽(yáng)性選擇γδT細(xì)胞。以這種方式，50ml新鮮血液常規(guī)產(chǎn)生2-5×106個(gè)細(xì)胞，γδT細(xì)胞純度為98-99％。
原初αβT細(xì)胞通過陰性磁性細(xì)胞分選分別用VγVδ-TCR、CD1c、CD14、CD16、CD19、CD25、CD45RO、CD56、HLA-DR加CD4或CD8的特異性抗體從PBMC中分離出未觸及的、原初CD4+或CD8+αβT細(xì)胞(98-99％純度)，接著熒光激活細(xì)胞分選對(duì)這些標(biāo)記染色陰性的細(xì)胞。
αβT細(xì)胞系通過磁性細(xì)胞分選用人CD4的抗體從PBMC中陽(yáng)性選擇CD4+αβT細(xì)胞。用呈遞TT或PPD的自體照射(30Gy)的PBMC刺激CD4+αβT細(xì)胞，第一個(gè)循環(huán)中的細(xì)胞比例為1∶100，此后循環(huán)中的細(xì)胞比例為1∶10，并在含有IL-2的培養(yǎng)基中擴(kuò)充。在抗原選擇和擴(kuò)充三個(gè)循環(huán)后通過基于CFSE的增殖測(cè)定(見下文)來檢驗(yàn)抗原特異性。
B細(xì)胞通過陰性磁性細(xì)胞分選從PBMC中分離出B細(xì)胞。將B細(xì)胞直接用于γδT細(xì)胞刺激(見下文)，或?qū)細(xì)胞系按照標(biāo)準(zhǔn)方案通過EBV-誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化來傳代，然后用于γδT細(xì)胞刺激。
單核細(xì)胞通過陽(yáng)性磁性細(xì)胞分選用人CD14的抗體從PBMC中分離出單核細(xì)胞，并在洗脫磁性捕獲的細(xì)胞之前嚴(yán)格地洗滌分離柱，使得CD14高單核細(xì)胞富集。
DC通過在含有10％FCS的培養(yǎng)基中在IL-4(10ng/ml)和GM-CSF(25ng/ml)的存在下培養(yǎng)CD14高細(xì)胞來產(chǎn)生單核細(xì)胞衍生的DC。6-7天培養(yǎng)后，大部分細(xì)胞是未成熟的，如通過HLA-DR、CD1a、CD14、CD80、CD83、CD86和CCR7的細(xì)胞表面染色所評(píng)定的。通過在100ng/ml LPS(來自馬流產(chǎn)沙門氏菌(Salmonella abortus equi))存在下再培養(yǎng)8小時(shí)來誘導(dǎo)DC成熟(Langenkamp等，2000)。通過細(xì)胞表面DC成熟標(biāo)記HLA-DR、CD80、CD83、CD86和CCR7的流式細(xì)胞染色來確認(rèn)DC成熟。
2.T細(xì)胞刺激γδT細(xì)胞如所述的(Brandes等，2003)，將1∶10稀釋度的異種或自體EBV-轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞系或初級(jí)B細(xì)胞呈遞的50μM焦磷酸異戊烯酯(IPP)用于激活靜息(新鮮分離的)γδT細(xì)胞。在補(bǔ)充8％人血清的培養(yǎng)基中在IL-2(20或200IU/ml)存在下培養(yǎng)γδT細(xì)胞。
αβT細(xì)胞在涂敷了10μg/ml抗-CD3抗體(OCT3)加250ng/ml抗-CD28抗體(28.2)，或者涂敷了10ng/ml 13-乙酸12-肉豆蔻佛波醇(PMA)加1μg/ml離子霉素，或者涂敷了1μg/ml PHA的平板上激活陽(yáng)性選擇的αβT細(xì)胞，并在補(bǔ)充了8％人血清的培養(yǎng)基中在IL-2(200IU/ml)的存在下培養(yǎng)。
3.羧基熒光素二乙酸琥珀酰亞胺基酯(CFSE)標(biāo)記用PBS-洗滌細(xì)胞并用補(bǔ)充了1％FCS的PBS-中的2.5μM CFSE(Molecular Probes，Eugene，OR)在室溫標(biāo)記4分鐘。用補(bǔ)充了5％FCS的冰冷的PBS-重復(fù)洗滌細(xì)胞來停止標(biāo)記。將CFSE標(biāo)記的細(xì)胞立即用于細(xì)胞激活和增殖測(cè)定中。
4.體外呈遞抗原測(cè)定向αβT細(xì)胞系呈遞抗原在10-20μg/ml TT(Berna Biotech，Bern，Switzerland)或20μg/ml PPD(Statens Serum Institut Copenhagen，Denmark)存在下通過呈遞IPP的和照射的(100Gy)異種EBV-B細(xì)胞系CP-EBV激活血液γδT細(xì)胞(見上文)24至60小時(shí)。用TT或PPD將單核細(xì)胞衍生的DC培養(yǎng)相同的一段時(shí)間并成熟最后8小時(shí)(見上文)。照射(對(duì)于γδT細(xì)胞和DC分別為26和40Gy)并徹底洗滌后，將這些APC以1∶5的比例(如果沒有另外指出)用于刺激TT-和PPD-特異性CD4+αβT細(xì)胞克隆。在不同的培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)，通過流式細(xì)胞術(shù)檢查應(yīng)答細(xì)胞中的激活標(biāo)記(HLA-DR、ICOS和CD25)的表達(dá)，TCR內(nèi)在化(細(xì)胞表面CD3的喪失)和細(xì)胞增殖(CFSE熒光信號(hào)的降低)。
原初CD4+αβT細(xì)胞的引發(fā)γδT細(xì)胞和αβT刺激后或單核細(xì)胞衍生的DC成熟后或從PBMC分離出單核細(xì)胞后，用各種濃度的中毒性休克綜合征毒素(TSST-1)(Toxin Technology，Sarasota，F(xiàn)L)將這些潛在的APC在37℃脈沖1小時(shí)。然后，用12Gy(或?qū)τ贒C為40Gy)照射潛在的APC、徹底洗滌并與CFSE標(biāo)記的原初CD4+αβT細(xì)胞混合(常規(guī)以1∶5的比例)。通常，96孔圓底平板含有在無外源細(xì)胞因子的培養(yǎng)基中的8×103個(gè)APC和4×104個(gè)CFSE標(biāo)記的應(yīng)答細(xì)胞。在4天后通過流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞增殖。
在Th細(xì)胞分化測(cè)定中，在培養(yǎng)的第5天加入100IU/ml IL-2，并在隨后的10-16天期間將細(xì)胞擴(kuò)充直至應(yīng)答細(xì)胞停止增殖并恢復(fù)到靜息狀態(tài)(Langenkamp等，2000)。在第21天，通過測(cè)量胞內(nèi)細(xì)胞因子產(chǎn)生來檢查Th細(xì)胞分化。在10μg/ml布雷菲德菌素A(Sigma-Aldrich)的存在下用PMA/離子霉素刺激細(xì)胞6小時(shí)，然后用2％多聚甲醛固定，用含有2％FCS的PBS中的0.5％皂苷滲透，用IL-2、IFN-γ、IL-4和Vβ2-TCR的抗體染色，并通過流式細(xì)胞術(shù)分析。
原初CD8+αβT細(xì)胞的引發(fā)在混合白細(xì)胞應(yīng)答中，與異種CFSE標(biāo)記的原初CD8+αβT細(xì)胞共培養(yǎng)照射過的IPP刺激的γδT細(xì)胞、超抗原激活的αβT細(xì)胞或LPS成熟的DC。通常，96孔圓底平板的每孔中含有4×104個(gè)CFSE標(biāo)記的應(yīng)答細(xì)胞和4×104個(gè)細(xì)胞至4個(gè)細(xì)胞范圍內(nèi)的APC，對(duì)應(yīng)于1∶1至1∶10,000的APC應(yīng)答細(xì)胞比例。在培養(yǎng)6天后通過流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞增殖。與原初CD8+αβT細(xì)胞的混合白細(xì)胞應(yīng)答14天后，在細(xì)胞毒性測(cè)定中評(píng)價(jià)CD8+效應(yīng)細(xì)胞產(chǎn)生，該測(cè)定包括與分別用高(1μM)和低劑量(0.05μM)的CFSE標(biāo)記的異種(真實(shí)靶)和自體(陰性對(duì)照)CD4+T細(xì)胞的混合物共培養(yǎng)12小時(shí)，接著通過流式細(xì)胞術(shù)分析CFSE信號(hào)。真實(shí)靶細(xì)胞計(jì)數(shù)的減少表明CD8+效應(yīng)細(xì)胞引起的抗原特異性殺滅，而陰性對(duì)照細(xì)胞計(jì)數(shù)的減少表明由CD8+效應(yīng)細(xì)胞引起的非特異性靶細(xì)胞殺滅。
5.培養(yǎng)基全部使用的培養(yǎng)基是補(bǔ)充了2mM L-谷氨酰胺、1％非必需氨基酸、1％丙酮酸鈉、50μg/ml青霉素/鏈霉素、5×10-5M 2-巰基乙醇和10％FCS(Hyclone Laboratories，Logan，UT或GIBCO BRL)或8％人血清(SwissRed Cross，Bern，Switzerland)的RPMI 1640培養(yǎng)基。使用基于骨髓瘤的表達(dá)系統(tǒng)來產(chǎn)生人重組IL-2。
6.流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞制備將細(xì)胞在補(bǔ)充了2％FCS和0.01％鈉-酸的冰冷的PBS-中洗滌兩次。用10mg/ml人免疫球蛋白阻斷10分鐘后，依次用不同細(xì)胞蛋白質(zhì)特異性的第一抗體或同型相配對(duì)照抗體將細(xì)胞在冰上孵育20分鐘，洗滌，并在未標(biāo)記第一抗體的情況中，進(jìn)一步用熒光標(biāo)記物標(biāo)記的第二種試劑孵育。最后洗滌后，用FACSCalibur(Becton Dickinson，SanJose，CA)測(cè)量細(xì)胞結(jié)合的熒光，并通過CellQuestPro軟件(BectonDickinson)分析記錄的數(shù)據(jù)。
抗體抗體來源來自BD PharMingen，San Diego，CA的小鼠單克隆抗體抗-CD1a(HI149)、CD3(UCHT1)、CD4(RPA-T4)、CD8(HIT8α)、CD11b(D12)、CD14(MΦP9)、CD16(3G8)、CD19(HIB19)、CD20(2H7)、CD25(M-A251)、CD40(5C3)、CD45RA(HI100)、CD45RO(UCHL-1)、CD50(TU41)、CD54(HA58)、CD56(B159)、CDw70(Ki-24)、CD80(L307.4)、CD83(HB15e)、CD86(2331；FUN1)、CD134(L106)、CD205(MG 38)、HLA-DR(G46-6)、總-VγVδ-TCR(11F2)、IL-2(MQ1-17H12)、IL-4(8D4-8)、IFNγ(B27)和IL-10(No 20705A)；來自DAKO Diagnostics，Glastrup，Sweden的小鼠單克隆抗體抗-CD1a(Nal/34-HLK)和CD19(HD37)；來自Immunotech，Marseille，F(xiàn)rance的小鼠單克隆抗體抗-TCRVβ2(MPB2D5)；來自Diaclone，Besancon，F(xiàn)rance的小鼠單克隆抗體抗-CD138(B-134)；來自Leinco Technologies，St.Louis，MO的小鼠單克隆抗體抗-CD102(B-T1)；來自R.Pardi，Milano，Italy的小鼠單克隆抗體抗-CD11a(TS1-22)和CD18(TS1-18)；來自R.A.Kroczek，Berlin，Germany的小鼠單克隆抗體抗-ICOS(F44)；來自M.Lipp，Berlin，Germany的大鼠單克隆抗體抗-CCR7(3D12)。將這些抗體用于流式細(xì)胞術(shù)分析或細(xì)胞分離。
使用以下的第二抗體，綴合物和對(duì)照抗體來自Sigma-Aldrich，St.Louis，MO的RPE綴合的山羊抗小鼠IgG；來自JacksonImmunoResearch Laboratories，West Grove，PA的RPE綴合的驢抗大鼠IgG；來自DAKO的RPE以及RPE-Cy5綴合的鏈霉抗生物素蛋白(SA)；來自BD PharMingen的APC綴合的SA；來自Sigma-Aldrich的小鼠對(duì)照IgG1(MOPC21)；來自BD PharMingen的其它同型相配對(duì)照抗體。
7.腫瘤或慢性/復(fù)發(fā)性感染的免疫治療為了制備受刺激的、腫瘤呈遞抗原γδT細(xì)胞，從腫瘤患者(或慢性/復(fù)發(fā)性感染患者，見下文)中抽取50-150ml外周血并如上所述進(jìn)行γδT細(xì)胞的分離和抗原加載。或者，在Vγ2Vδ2+-TCR刺激條件下(參見以上用IPP激活γδT細(xì)胞的方法)在20-1000IU/ml IL-2的存在下通過體外培養(yǎng)來擴(kuò)充這樣新鮮分離的γδT細(xì)胞，然后貯存于液氮中，用于之后制備腫瘤(或疫苗，見下文)呈遞抗原γδT細(xì)胞。重要地，代替確定的腫瘤/疫苗蛋白，許多其它的將抗原遞送至用于制備APC的γδT細(xì)胞的途徑是可能存在的，(特別是)包括加入粗制(未限定的)腫瘤細(xì)胞提取物或受感染細(xì)胞的提取物(見下文)，或者，通過通常用于轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)活的血細(xì)胞或組織細(xì)胞的重組RNA/DNA技術(shù)來處理γδT細(xì)胞。此外，如果直接加載到細(xì)胞表面MHC分子上的確定的腫瘤(或疫苗，見下文)肽是已知的，那么將0.1-10μg/ml這樣的肽加入1-10×106個(gè)細(xì)胞/ml受刺激的γδT細(xì)胞中，然后將其在20-37℃孵育一段短的時(shí)間，用等滲磷酸鹽緩沖鹽溶液洗滌2次，并立即用于治療。重要的是強(qiáng)調(diào)每次給予所用的γδT細(xì)胞數(shù)量以及γδT細(xì)胞給予的途徑和頻率取決于由所用單個(gè)腫瘤(或疫苗，見下文)抗原誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的功效以及個(gè)體患者中存在的腫瘤的類型和位置。方案按照基于DC的免疫治療中常用的那些方案(Fong和Engleman，2000；Steinman等，2003；Schuler等，2003；Figdor等，2004)，即，每次給予1-20×106個(gè)細(xì)胞/0.5-2ml，以兩周至兩個(gè)月的間隔繼續(xù)給予相同或較低劑量的細(xì)胞1至6次。
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權(quán)利要求
1.制備有效呈遞抗原的人γδT細(xì)胞的方法，包括從人外周血單核細(xì)胞中選擇γδT細(xì)胞，用誘導(dǎo)呈遞抗原功能的刺激物處理選定的細(xì)胞，并將所述抗原用于由這些細(xì)胞的攝取和呈遞。
2.權(quán)利要求1的方法，其中通過標(biāo)準(zhǔn)方案用人VγVδ-T細(xì)胞受體的抗體進(jìn)行磁性細(xì)胞分選來選擇γδT細(xì)胞。
3.權(quán)利要求1的方法，其中在誘導(dǎo)表達(dá)Vγ2 Vδ2+-T細(xì)胞受體鏈的γδT細(xì)胞選擇性擴(kuò)充的結(jié)構(gòu)上確定的小分子量非肽化合物的存在下培養(yǎng)新鮮分離的外周血淋巴細(xì)胞來進(jìn)行γδT細(xì)胞選擇。
4.權(quán)利要求3的方法，其中結(jié)構(gòu)上確定的小分子量非肽化合物是焦磷酸異戊烯酯。
5.權(quán)利要求1的方法，其中誘導(dǎo)呈遞抗原功能的刺激物是小分子量非肽化合物。
6.權(quán)利要求5的方法，其中結(jié)構(gòu)上確定的小分子量非肽化合物是焦磷酸異戊烯酯。
7.權(quán)利要求5的方法，其中結(jié)構(gòu)上確定的小分子量非肽化合物是4-羥基-3-甲基-丁-2-烯基焦磷酸酯。
8.權(quán)利要求1的方法，其中誘導(dǎo)呈遞抗原功能的刺激物是植物凝集素。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所應(yīng)用的抗原呈確定的蛋白質(zhì)、未確定的蛋白質(zhì)混合物或粗制或富集的腫瘤或受感染細(xì)胞的提取物的形式。
10.權(quán)利要求1的方法，其中所應(yīng)用的抗原是病原體-或腫瘤細(xì)胞-衍生的肽。
11.權(quán)利要求9的方法，其中抗原是病原體衍生的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)以在允許所述病原體衍生的蛋白質(zhì)內(nèi)源性表達(dá)的條件下編碼其的DNA或RNA的形式來應(yīng)用。
12.權(quán)利要求11的方法，其中DNA或RNA是純化的DNA或RNA或含有這樣的DNA或RNA的遞送載體。
13.通過權(quán)利要求1的方法制備的有效呈遞抗原的人γδT細(xì)胞。
14.有效呈遞抗原的人γδT細(xì)胞在免疫治療中的用途。
15.有效呈遞抗原的人γδT細(xì)胞在制備用于免疫治療或疫苗接種的藥物中的用途。
16.治療腫瘤或慢性或復(fù)發(fā)性傳染病的方法，其中將有效呈遞抗原的人γδT細(xì)胞注射至需要的患者中。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中注射包括所述γδT細(xì)胞通過皮內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、粘膜或粘膜下途徑的單次或重復(fù)施用。
18.接種對(duì)抗腫瘤或誘導(dǎo)慢性或復(fù)發(fā)性傳染病物質(zhì)的疫苗的方法，其中將有效呈遞抗原的人γδT細(xì)胞注射至待接種疫苗的患者中，對(duì)該細(xì)胞已經(jīng)應(yīng)用了用于攝取和呈遞的非傳染性和非致腫瘤性抗原。
19.靶向γδT細(xì)胞的疫苗在制備用于免疫治療或疫苗接種的藥物中的用途。
20.接種對(duì)抗腫瘤或誘導(dǎo)傳染性或非傳染性疾病物質(zhì)的疫苗的方法，其中將靶向γδT細(xì)胞的疫苗給藥于待接種的患者。
21.權(quán)利要求20的方法，其中靶向γδT細(xì)胞的疫苗是由疫苗劑和靶向γδT細(xì)胞的分子構(gòu)成的混雜化合物。
22.權(quán)利要求21的方法，其中靶向γδT細(xì)胞的分子是γδT細(xì)胞上內(nèi)吞受體特異性的抗體或配體。
23.權(quán)利要求21的方法，其中靶向γδT細(xì)胞的分子是CD11b和CD205特異性的抗體或配體。
24.權(quán)利要求21的方法，其中疫苗劑是需要產(chǎn)生對(duì)抗其的免疫保護(hù)的蛋白質(zhì)。
25.權(quán)利要求20的方法，其中靶向γδT細(xì)胞的疫苗的給藥需要重復(fù)的注射或口服。
26.鑒定新的腫瘤相關(guān)或病原體衍生抗原的方法，包括從人外周血單核細(xì)胞中選擇γδT細(xì)胞，用誘導(dǎo)呈遞抗原功能的刺激物處理選定的細(xì)胞，應(yīng)用未確定的蛋白質(zhì)混合物的部分或腫瘤和受感染細(xì)胞的粗制或富集提取物，或源自腫瘤和傳染性因子的RNA或DNA文庫(kù)，測(cè)試自體原初αβT細(xì)胞的體外激活，并選擇具有提高的抗原性的蛋白質(zhì)樣品。
27.診斷患者免疫力的方法，包括從患者的外周血單核細(xì)胞中選擇γδT細(xì)胞，用誘導(dǎo)呈遞抗原功能的刺激物處理選定的細(xì)胞，應(yīng)用必須確定對(duì)其的免疫力的抗原，和測(cè)試自體原初αβT細(xì)胞的體外激活。
全文摘要
本發(fā)明涉及制備有效呈遞抗原的人γδT細(xì)胞的方法、通過該方法制得的γδT細(xì)胞及其在免疫治療、疫苗接種、疫苗研發(fā)和診斷中的用途。這些人γδT細(xì)胞的效力和功效與樹突細(xì)胞(DC)相似，加工抗原并對(duì)αβT細(xì)胞呈遞抗原肽和誘導(dǎo)原初αβT細(xì)胞中的抗原特異性應(yīng)答(增殖和分化)。易于從外周血純化γδT細(xì)胞，在刺激下體外培養(yǎng)1天內(nèi)獲得“成熟”狀態(tài)(必要的粘附分子、共刺激分子和主要組織相容性復(fù)合體分子的表達(dá))并誘導(dǎo)強(qiáng)烈的初次和再次T輔助細(xì)胞和細(xì)胞毒性T細(xì)胞應(yīng)答。γδT細(xì)胞可以用于腫瘤或慢性或復(fù)發(fā)性傳染病的治療方法中、用于新的腫瘤或病原體衍生抗原的鑒定中和用于患者免疫力的診斷中。
文檔編號(hào)C12N5/08GK101031641SQ200580032379
公開日2007年9月5日 申請(qǐng)日期2005年8月11日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月19日
發(fā)明者B·莫瑟, M·布蘭德斯 申請(qǐng)人:伯哈德·莫瑟