專利名稱：干細(xì)胞的分化的制作方法
相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用本申請(qǐng)要求以2004年7月29日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)60/592,027作為優(yōu)先權(quán)基礎(chǔ)。2004年7月29日提交的流水號(hào)為60/592,027的申請(qǐng)通過引用的方式全部納入本文。
背景技術(shù)：
多潛能干細(xì)胞例如人類多潛能干細(xì)胞，具有使我們理解以及治療許多目前醫(yī)學(xué)難以克服的慢性疾病的能力均得到顯著改變和拓展的前景。從藥物開發(fā)到單克隆抗體的生成再到細(xì)胞療法的產(chǎn)生可見，通過可產(chǎn)生特定的細(xì)胞類型例如任意的人類細(xì)胞類型，有望使人類細(xì)胞生物學(xué)發(fā)生很大轉(zhuǎn)變。將多潛能干細(xì)胞應(yīng)用于醫(yī)學(xué)和工業(yè)就要求能夠在體外產(chǎn)生大量單一細(xì)胞類型。通過已知的形態(tài)發(fā)生素、激素或其他化學(xué)物質(zhì)的處理指導(dǎo)細(xì)胞分化的現(xiàn)有策略已獲得某些成功的例子，但均始終不能達(dá)到實(shí)驗(yàn)室以外的任何實(shí)際應(yīng)用所必需的細(xì)胞質(zhì)量和體積。能夠在體外產(chǎn)生各種細(xì)胞類型面臨極大的需求。通過體外免疫系統(tǒng)的單克隆抗體生產(chǎn)，用于糖尿病治療的胰島生產(chǎn)以及用于神經(jīng)相關(guān)功能障礙的神經(jīng)前體生產(chǎn)，這些只是需要穩(wěn)定可靠地生產(chǎn)特定細(xì)胞類型的人類疾病的幾個(gè)方面。這個(gè)工程的經(jīng)濟(jì)意義是很顯著的。僅是單克隆抗體的應(yīng)用就是好幾十億美元的產(chǎn)業(yè)。美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院(National Institutes of Health)估計(jì)美國(guó)每年用于糖尿病的花費(fèi)為1320億美元(http//diabetes.niddk.nih.gov/dm/pubs/statistics/index.htm#14)。美國(guó)每年用于神經(jīng)變性疾病的花費(fèi)估計(jì)超過1000億美元(http//www.alzheimers.org/pubs/prog00.htm#The％20Impact％20of％20Alzheimer％92s％20Disease)。
胚胎干細(xì)胞生物學(xué)的實(shí)際應(yīng)用會(huì)要求產(chǎn)生大量同種細(xì)胞類型。在定向分化前大規(guī)模培養(yǎng)未分化的干細(xì)胞存在一系列的難題，這提示著需要其他的解決方案。ES和EG細(xì)胞系需要向細(xì)胞培養(yǎng)基中加入昂貴的重組激素例如成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和白血病抑制因子以維持它們的生長(zhǎng)并使它們保持不分化狀態(tài)?？偟膩?lái)說，ES和EG細(xì)胞系仍是在飼養(yǎng)層上培養(yǎng)。它們生長(zhǎng)緩慢，冷凍及復(fù)蘇較差，難于傳代。雖然目前取得了一定進(jìn)展，使得可以更容易地制備ES和EG細(xì)胞培養(yǎng)物，但它們?nèi)允冀K需要相當(dāng)多的資源和具備一定知識(shí)的專業(yè)人員。
定向分化還存在其他的問題。分化可通過改變激素環(huán)境、形成類胚胎體(embryoid body)或者兩者結(jié)合啟動(dòng)。類胚胎體的形成是目前運(yùn)用最廣泛的一般方法。此方法似乎可產(chǎn)生由類胚胎體內(nèi)各種組織類型的并列而得的許多不同細(xì)胞。此方法的問題圍繞著同源形成而產(chǎn)生。在靜態(tài)培養(yǎng)中，會(huì)形成各種大小和形狀的類胚胎體，導(dǎo)致可變化的分化過程。而且，雖然實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的方法例如懸滴可避免這些問題，但用于大規(guī)模時(shí)仍存在問題。盡管使用激素和化學(xué)物質(zhì)而非形成類胚胎體來(lái)指導(dǎo)分化似乎是更具吸引力的方法，但我們對(duì)器官發(fā)生所需的復(fù)雜相互作用的理解還很不夠。要填補(bǔ)我們的認(rèn)識(shí)上的這些空白還需要對(duì)不易進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的胚胎學(xué)過程進(jìn)行辛苦和艱難的分析。
本文公開的是可以在體外產(chǎn)生幾乎任何細(xì)胞類型的方法，以及在所述方法中使用的或來(lái)源于所述方法的組合物。產(chǎn)生的這些細(xì)胞系可被克隆、表征、冷凍、以及以任何所需量使用，同時(shí)例如保持正常核型的優(yōu)點(diǎn)。這些細(xì)胞的可用性將能實(shí)現(xiàn)目前所預(yù)想的人類干細(xì)胞的許多潛在應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
所公開的內(nèi)容是涉及細(xì)胞和細(xì)胞系的生產(chǎn)的方法和組合物。


附圖闡釋了一些實(shí)施方案，并與具體實(shí)施方式
一同闡釋所公開的方法和組合物，將其引入本說明書并作為本說明書的一部分。
圖1表示使用激活的顯性負(fù)性成對(duì)轉(zhuǎn)化基因的依序表達(dá)，可逆轉(zhuǎn)化的盒的一個(gè)實(shí)例的示意圖。該示意圖下面顯示的是多潛能干細(xì)胞至分化細(xì)胞的進(jìn)程中該盒被活化部分的暫時(shí)性進(jìn)程。
圖2A-2C表示可用于分離來(lái)自ACTEG1的肝細(xì)胞來(lái)源細(xì)胞系的質(zhì)粒的實(shí)例，所述ACTEG1是生殖嵴來(lái)源多潛能干細(xì)胞。
圖3表示使用可切除的激活癌基因的可逆性轉(zhuǎn)化的盒的一個(gè)實(shí)例的示意圖。
圖4表示ploxHBV-aRas的結(jié)構(gòu)，它是可用于形成圖3所示盒的質(zhì)粒的一個(gè)實(shí)例。
圖5表示使用溫度敏感性轉(zhuǎn)化基因的可逆性轉(zhuǎn)化的盒的一個(gè)實(shí)例的示意圖。
圖6表示如Stratagene所指出的pEGSH質(zhì)粒的示意圖。
圖7表示所公開的組織特異性可逆性轉(zhuǎn)化(TSRT)方法的一種形式的框圖。
圖8表示使用驅(qū)動(dòng)顯性負(fù)性ras表達(dá)的四環(huán)素調(diào)節(jié)性CMV啟動(dòng)子和驅(qū)動(dòng)a-ras表達(dá)的組織特異性啟動(dòng)子的可逆性轉(zhuǎn)化的盒的一個(gè)實(shí)例的示意圖。
具體實(shí)施例方式
在公開和描述本申請(qǐng)的化合物、組合物、物品、裝置和/或方法前，應(yīng)當(dāng)理解的是除非另外說明，它們不限于具體的合成方法或具體的重組生物技術(shù)方法，或者除非另外說明，它們不限于具體的試劑；因?yàn)樗鼈兝硭?dāng)然地可以有所變化。還應(yīng)當(dāng)理解的是，本文所使用的術(shù)語(yǔ)只是出于描述具體的實(shí)施方案的目的，而不意在限制。
已有很多作者著述了關(guān)于人類多潛能干細(xì)胞的可能應(yīng)用的文獻(xiàn)(例如Gearhart，J(1998)Science 282，1061-1062；Pera，MF，et al.，(2000)J.Cell Sci.113，5-10；Trounson，A(2001)Reprod FertilDev.2001；13(7-8)523-32；Sussman，NL，Kelly，JH.(1994)USPatent 5,368,555)。這些文獻(xiàn)涉及從藥物開發(fā)中的目標(biāo)評(píng)價(jià)和毒性測(cè)試到試圖通過將新的β細(xì)胞植入胰中來(lái)治療I型糖尿病的各方面。這些應(yīng)用的每一種均需要大量來(lái)自受控的和可新生的來(lái)源的分化細(xì)胞?，F(xiàn)有技術(shù)不能滿足這一要求，但本文公開的組合物和方法可以受控的和可重生的方式在體外生產(chǎn)大量所需細(xì)胞類型。
人類多潛能干細(xì)胞具有使我們治療許多目前醫(yī)學(xué)難以克服的慢性疾病的能力得到顯著變化和拓展的前景。神經(jīng)變性疾病、神經(jīng)肌肉病、糖尿病、自身免疫性疾病、白血病和心臟病均是旨在替換和再生受損害組織的基于細(xì)胞的療法的目標(biāo)疾病的實(shí)例。
這一設(shè)想主要是基于使用多潛能干細(xì)胞以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小鼠的成功(Zambrowicz，BP，Sands，AT(2003)Nat.Rev.Drug Disc.2，38-51)。體外改變干細(xì)胞和用靶向突變生成小鼠的能力使得對(duì)于基因調(diào)節(jié)和功能以及哺乳動(dòng)物發(fā)育的理解快速發(fā)展。這又轉(zhuǎn)而使得能夠在小鼠模型上模擬人類疾病，從而促進(jìn)藥物開發(fā)進(jìn)程。對(duì)小鼠上的多潛能干細(xì)胞的研究已表明它們對(duì)于器官的任何組織有所幫助，并表明目的基因基本上可被隨意改變——可根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)的需要在單個(gè)組織中被關(guān)閉、缺失、激活或表達(dá)。
當(dāng)這些結(jié)果真正地激發(fā)了人們對(duì)于人類多潛能干細(xì)胞的研究熱情時(shí)，它們也提出了將此項(xiàng)研究由小鼠延及至人所帶來(lái)的核心問題。由于轉(zhuǎn)基因小鼠作為模型的成功以及它能夠復(fù)制導(dǎo)致器官型分化的組織的復(fù)雜相互作用，因而對(duì)于限定體外再現(xiàn)分化的條件所給予的關(guān)注基本上己較少。然而為了實(shí)現(xiàn)基于細(xì)胞的療法的設(shè)想，將需要在體外產(chǎn)生大量特異細(xì)胞類型或細(xì)胞類型組。為了避免文獻(xiàn)普遍記載證明的多功能干細(xì)胞被植入非它們的正常環(huán)境時(shí)易形成腫瘤的傾向，使分化的干細(xì)胞包括完全同質(zhì)的群體將是有益的，所謂完全同質(zhì)的群體即它們?yōu)榭寺〉幕驗(yàn)榘爰兓?Andrew，PW(2002)Philos.Trans.R.Soc.Lond.B.Biol.Sci.357，405-417)。因此，本文公開了同質(zhì)分化干細(xì)胞、克隆分化干細(xì)胞、半純化分化干細(xì)胞和混合分化干細(xì)胞。本文還公開了細(xì)胞群，它們可以但不必是克隆的、可以但不必是相同細(xì)胞類型的、以及可以但不必是可被生產(chǎn)的所有細(xì)胞類型亞群的細(xì)胞群。這些細(xì)胞群可用于例如治療、用于體內(nèi)毒性分析或用于例如藥物篩選等其他類型的體外分析。本文還公開了半純化的細(xì)胞類型組，其含有至少99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％、80％、79％、78％、77％、76％、75％、74％、73％、72％、71％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％或25％的特定細(xì)胞類型，例如本文公開的任何細(xì)胞的任意組合、本文公開的任何細(xì)胞或肝細(xì)胞。
本文公開了一種用于生產(chǎn)分化的干細(xì)胞和/或一種或多種細(xì)胞類型的方法。還公開了由所公開的方法生產(chǎn)的細(xì)胞和/或細(xì)胞類型。該方法通常包括在促進(jìn)分化的條件下培養(yǎng)干細(xì)胞并選擇出或篩選出一種或多種細(xì)胞和/或細(xì)胞類型。使用的干細(xì)胞可包括這樣的核酸區(qū)段——該核酸區(qū)段包含與編碼標(biāo)記的核酸序列可操作性連接的轉(zhuǎn)錄控制元件。選擇或篩選可基于所述標(biāo)記?？蛇x擇出或篩選出表達(dá)標(biāo)記的細(xì)胞和/或細(xì)胞類型，或者可選擇出或篩選出不表達(dá)標(biāo)記的細(xì)胞和/或細(xì)胞類型。由此可由干細(xì)胞獲得特定的細(xì)胞和/或細(xì)胞類型。
轉(zhuǎn)錄控制元件可以是組織特異性、細(xì)胞特異性、細(xì)胞類型特異性和/或細(xì)胞譜系特異性的轉(zhuǎn)錄控制元件，這表示轉(zhuǎn)錄控制元件使得或促進(jìn)與轉(zhuǎn)錄控制元件可操作性連接的核酸序列分別在特異組織、細(xì)胞、細(xì)胞類型和/或細(xì)胞譜系中表達(dá)。因此，在公開的方法中，該標(biāo)記可在轉(zhuǎn)錄控制元件具有特異性的組織、細(xì)胞、細(xì)胞類型和/或細(xì)胞譜系中表達(dá)。由此方法可由干細(xì)胞獲得特定的細(xì)胞、特定組織的細(xì)胞、特定的細(xì)胞類型和/或特定細(xì)胞譜系的細(xì)胞。
本文公開的方法具有提供一種特征或特性(表達(dá)標(biāo)記或不表達(dá)標(biāo)記)的優(yōu)點(diǎn)，通過所述特征或特性可從干細(xì)胞和非目的分化細(xì)胞中選擇或篩選目的分化細(xì)胞。所公開方法的構(gòu)思是與轉(zhuǎn)錄控制元件可操作性連接的標(biāo)記僅在或主要在起始干細(xì)胞已分化為所需的細(xì)胞或組織類型(轉(zhuǎn)錄控制元件具特異性的組織或細(xì)胞類型)時(shí)表達(dá)(或不表達(dá))。通過選擇與目的細(xì)胞、細(xì)胞類型、細(xì)胞譜系和/或組織相關(guān)的轉(zhuǎn)錄控制元件使得任何目的細(xì)胞、細(xì)胞類型、細(xì)胞譜系和/或組織被靶向。
一類有用的標(biāo)記是轉(zhuǎn)化劑(transformation agent)，例如癌基因。在這種情況下，轉(zhuǎn)化劑的表達(dá)可引起細(xì)胞轉(zhuǎn)化。其結(jié)果可以是表達(dá)轉(zhuǎn)化劑的細(xì)胞的生長(zhǎng)和/或優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng)。在分化干細(xì)胞的環(huán)境中，由于大多其他分化干細(xì)胞即使生長(zhǎng)也生長(zhǎng)得很緩慢，因而轉(zhuǎn)化及與其相關(guān)的生長(zhǎng)可使得表達(dá)轉(zhuǎn)化劑的細(xì)胞選擇性生長(zhǎng)和/或優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng)。通過使用與標(biāo)記相關(guān)的選擇壓力可以選擇表達(dá)(或不表達(dá))該標(biāo)記的細(xì)胞。例如許多已知的基因和蛋白質(zhì)可用于賦予細(xì)胞選擇優(yōu)勢(shì)或選擇劣勢(shì)?？赏ㄟ^鑒別表達(dá)(或不表達(dá))標(biāo)記的細(xì)胞來(lái)篩選表達(dá)(或不表達(dá))該標(biāo)記的細(xì)胞。例如許多已知的酶和蛋白質(zhì)構(gòu)成和/或產(chǎn)生可檢測(cè)的信號(hào)。這種信號(hào)就是細(xì)胞鑒定的基礎(chǔ)。
該方法還包括標(biāo)記表達(dá)的逆轉(zhuǎn)。這可通過例如移去全部或部分核酸區(qū)段來(lái)完成，例如切除全部或部分核酸區(qū)段；使核酸區(qū)段、轉(zhuǎn)錄控制元件和/或標(biāo)記失活；阻抑核酸區(qū)段、轉(zhuǎn)錄控制元件和/或標(biāo)記；和/或?qū)牒?或表達(dá)逆轉(zhuǎn)劑從而移去全部或部分所述核酸區(qū)段。核酸區(qū)段的切除可通過多種方式實(shí)現(xiàn)。例如，可使用重組酶通過位點(diǎn)特異性重組切除該核酸區(qū)段。逆轉(zhuǎn)劑可改變或/減弱標(biāo)記的作用。例如，當(dāng)該標(biāo)記為轉(zhuǎn)化劑例如Ras時(shí)，可通過表達(dá)顯性負(fù)性Ras使得細(xì)胞轉(zhuǎn)化(Ras的作用)被逆轉(zhuǎn)。公開的包括使用轉(zhuǎn)化劑和隨后使轉(zhuǎn)化被逆轉(zhuǎn)的方法形式可被稱為組織特異性可逆轉(zhuǎn)化(TSRT)。盡管TSRT是指組織特異性可逆轉(zhuǎn)化，但這只是為了方便，而意指的TSRT是指轉(zhuǎn)化劑的組織特異性、細(xì)胞特異性、細(xì)胞類型特異性和/或細(xì)胞譜系特異性表達(dá)。
所述的逆轉(zhuǎn)操作的組合可用于實(shí)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)。例如，核酸區(qū)段的切除和逆轉(zhuǎn)劑的表達(dá)可以在本文公開的方法中聯(lián)合使用。當(dāng)需要基因改變極小的細(xì)胞(例如與相同類型的天然細(xì)胞相比)時(shí)，核酸區(qū)段的移除是有用的逆轉(zhuǎn)操作。例如如果細(xì)胞將用于治療，它就是理想的。
本文所公開的是涉及使用干細(xì)胞作為起始材料、用于建立任意特定細(xì)胞類型的分化細(xì)胞系的組織特異性可逆轉(zhuǎn)化的策略。所公開的方法利用了轉(zhuǎn)化基因的組織特異性表達(dá)，該方法可用于鑒定和培養(yǎng)特定的細(xì)胞類型。如本文所述，在該方法的某些形式中，然后可以使用多種可能的過程之一使轉(zhuǎn)化事件被逆轉(zhuǎn)，從而得到非轉(zhuǎn)化的分化細(xì)胞的克隆群或半純化群，包括分化的或半純化的細(xì)胞群或者克隆細(xì)胞群。
公開了涉及例如多潛能干細(xì)胞的經(jīng)修飾干細(xì)胞的組合物和方法，其中所述多潛能干細(xì)胞含有例如其表達(dá)被轉(zhuǎn)錄控制元件控制的標(biāo)記，所述轉(zhuǎn)錄控制元件例如組織特異性啟動(dòng)子、細(xì)胞類型特異性啟動(dòng)子、細(xì)胞特異性啟動(dòng)子和/或細(xì)胞譜系特異性啟動(dòng)子。如本文所述，然后經(jīng)修飾的多潛能干細(xì)胞可在可使細(xì)胞增殖或類胚胎體(EB)和分化細(xì)胞形成的條件下生長(zhǎng)。當(dāng)干細(xì)胞形成EB時(shí)，EB通過自發(fā)分化產(chǎn)生許多不同的細(xì)胞類型。在所公開方法的某些形式中，使EB形成一段所需時(shí)間后，通過例如在針對(duì)標(biāo)記的同源選擇培養(yǎng)基(cognate selection media)中培養(yǎng)細(xì)胞來(lái)施加選擇壓力。基于這點(diǎn)，當(dāng)有許多(數(shù)目取決于在沒有選擇壓力時(shí)使EB發(fā)育的時(shí)間長(zhǎng)短)不同的細(xì)胞類型時(shí)，選擇性壓力使得具有表達(dá)標(biāo)記的細(xì)胞被選擇性增殖或可見。具有選擇性標(biāo)記的細(xì)胞為一種或多種需要的分化細(xì)胞類型，因?yàn)樵摌?biāo)記可被設(shè)計(jì)成在一種或多種所需的細(xì)胞類型中由于組織特異性啟動(dòng)子而優(yōu)勢(shì)表達(dá)或選擇性表達(dá)。還應(yīng)當(dāng)理解的是，在某些系統(tǒng)中可有一個(gè)以上的組織特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)標(biāo)記。由于具有通過不同啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的多個(gè)標(biāo)記，可使得對(duì)于組織特異性啟動(dòng)子并不在單一組織中唯一表達(dá)的細(xì)胞類型的選擇嚴(yán)格性增加。還應(yīng)當(dāng)理解的是，在選擇步驟后可有鑒定所需細(xì)胞的一個(gè)或多個(gè)其他鑒定步驟。然后這些經(jīng)鑒定的細(xì)胞可被進(jìn)一步分離或培養(yǎng)。
在選擇性條件(例如選擇壓力)下一段時(shí)間后，可移去選擇性條件促進(jìn)細(xì)胞增殖，然后再施加選擇壓力。因此形成多個(gè)反復(fù)選擇循環(huán)，增加了選擇的嚴(yán)格性。選擇循環(huán)還可發(fā)生于具有一種以上類型的由于相同組織特異性啟動(dòng)子而表達(dá)的標(biāo)記的系統(tǒng)中。在該方法的某些形式中，可這樣進(jìn)行這些反復(fù)選擇循環(huán)，例如利用第一標(biāo)記，然后利用第二標(biāo)記，然后再利用第一標(biāo)記以及利用第二標(biāo)記，如此反復(fù)。選擇壓力完成后，所需的分化細(xì)胞可在非選擇條件下生長(zhǎng)，此時(shí)如果需要可移除該標(biāo)記和相關(guān)的DNA。有多種方法實(shí)現(xiàn)移除，包括例如使用重組酶技術(shù)，例如Cre-lox技術(shù)或溫度特異性突變標(biāo)記。還應(yīng)當(dāng)理解的是，標(biāo)記可被整合入多潛能干細(xì)胞染色體或被載于外染色體表達(dá)盒，例如哺乳動(dòng)物人工染色體。
本文公開了使用干細(xì)胞作為起始材料，建立任意特定細(xì)胞類型的分化細(xì)胞系的方法和組合物。此機(jī)制可使用用來(lái)鑒定和培養(yǎng)特定細(xì)胞類型的例如轉(zhuǎn)化基因等標(biāo)記的組織特異性表達(dá)。然后使用多種可能的方法可使該轉(zhuǎn)化事件被逆轉(zhuǎn)，得到克隆的或半純化的非轉(zhuǎn)化分化細(xì)胞群。
例如，公開了關(guān)于人類肝特異性啟動(dòng)子/增強(qiáng)子的組合物和方法，所述肝特異性啟動(dòng)子/增強(qiáng)子來(lái)自驅(qū)動(dòng)RAS基因的不同變種的乙肝病毒核心抗原。在該方法的某些形式中，可使用與可由蛻皮激素誘導(dǎo)的顯性負(fù)性RAS偶聯(lián)的激活的RAS作為逆轉(zhuǎn)劑。在該方法的某些形式中，HBV/RAS構(gòu)建體側(cè)翼帶有可被CRE重組酶切除的loxP位點(diǎn)。該方法的某些形式可利用產(chǎn)生的溫度敏感性(ts)激活的RAS。
通常標(biāo)記構(gòu)建體可被轉(zhuǎn)染入干細(xì)胞系，例如人類胚胎生殖(EG)細(xì)胞系。然后例如通過形成類胚胎體可使生成的細(xì)胞系啟動(dòng)分化。在這種方法中，天然的生物過程導(dǎo)致了合適的細(xì)胞類型的發(fā)育。當(dāng)細(xì)胞變?yōu)樗璧募?xì)胞類型例如肝細(xì)胞時(shí)，組織或細(xì)胞特異性啟動(dòng)子例如肝特異性構(gòu)建體將被激活，并將表達(dá)標(biāo)記。該細(xì)胞例如被轉(zhuǎn)化或通過標(biāo)記的表達(dá)被標(biāo)記?？墒褂眠x擇性培養(yǎng)基，例如對(duì)于轉(zhuǎn)化的細(xì)胞使用軟瓊脂；當(dāng)被置于選擇性培養(yǎng)基時(shí)，EB中僅有適當(dāng)分化的轉(zhuǎn)化細(xì)胞可存活或者具有選擇優(yōu)勢(shì)。轉(zhuǎn)化的細(xì)胞將優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng)或選擇性生長(zhǎng)并形成集落?？商暨x集落并重新鋪板以克隆?？捎脴?biāo)準(zhǔn)方法使細(xì)胞生長(zhǎng)至所需的數(shù)量和構(gòu)型以便應(yīng)用。在適宜的時(shí)間可使用逆轉(zhuǎn)信號(hào)，例如對(duì)于基因開關(guān)可使用蛻皮激素、對(duì)于lox構(gòu)建體可使用CRE重組酶或者對(duì)于ts構(gòu)建體可利用溫度變動(dòng)，使得細(xì)胞群與原代培養(yǎng)物在功能上等同。
例如，公開了含有包含P-I結(jié)構(gòu)的核酸區(qū)段的多潛能干細(xì)胞，其中P為轉(zhuǎn)錄控制元件，I為編碼標(biāo)記的序列，其中所述標(biāo)記可包括轉(zhuǎn)化劑。
公開了其中標(biāo)記由異源核酸表達(dá)而來(lái)的細(xì)胞，其中所述核酸還包括自殺基因，其中P為組織特異性轉(zhuǎn)錄控制元件，其中P使得I優(yōu)勢(shì)表達(dá)或選擇性表達(dá)，其中無(wú)限增殖因子為溫度許可性因子，其中I包括SV40大T抗原，其中核酸區(qū)段側(cè)翼有位點(diǎn)特異性切除序列，其中I側(cè)翼有位點(diǎn)特異性切除序列，其中P側(cè)翼有位點(diǎn)特異性切除序列，和/或其中P-I側(cè)翼有位點(diǎn)特異性切除序列X，形成X-P-I-X。
還公開了通過將所述核酸區(qū)段從本文公開的干細(xì)胞切除而產(chǎn)生的細(xì)胞。
公開了這樣的細(xì)胞——其中使用腺病毒介導(dǎo)的位點(diǎn)特異性切除法來(lái)切除包含P-I結(jié)構(gòu)的核酸區(qū)段，和/或其中包含P-I結(jié)構(gòu)的核酸分子的切除導(dǎo)致未切除核酸分子的重組。
公開了從干細(xì)胞獲得有條件地永生的細(xì)胞類型群體的方法，包括用含有一種本文公開的P-I核酸分子的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染干細(xì)胞，在一種環(huán)境中培養(yǎng)干細(xì)胞以使得P轉(zhuǎn)錄控制元件被激活，由此使得I被優(yōu)勢(shì)表達(dá)或選擇性表達(dá)，以及選擇表達(dá)I的細(xì)胞類型。
公開的方法還包括提高表達(dá)I的細(xì)胞群的純度的步驟，其中提高純度的步驟包括形成克隆的或半純化的細(xì)胞群，還包括切除核酸，還包括冷凍所選擇的細(xì)胞類型，和/或還包括向細(xì)胞群中加入目的基因。
公開了獲得有條件地永生的細(xì)胞類型的方法，包括用含有一種本文所公開的P-I核酸分子的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染多潛能干細(xì)胞，激活控制元件P，由此使得I被優(yōu)勢(shì)表達(dá)或選擇性表達(dá)，選擇表達(dá)I的細(xì)胞類型并切除含有P-I核酸分子的構(gòu)建體，將選擇的細(xì)胞類型與一種環(huán)境接觸以使原來(lái)含有包含P-I核酸分子的構(gòu)建體的核酸的末端重新結(jié)合，以及冷凍所選擇的細(xì)胞類型。
公開了其中使得干細(xì)胞培養(yǎng)物自發(fā)分化為類胚胎體的方法。
還公開了獲得一種細(xì)胞培養(yǎng)物的方法，包括用含有一種本文所公開的P-I核酸分子的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染多潛能干細(xì)胞，將干細(xì)胞與一種環(huán)境接觸以使轉(zhuǎn)錄控制元件P被激活并使I優(yōu)勢(shì)表達(dá)或選擇性表達(dá)，培養(yǎng)表達(dá)I的細(xì)胞。
公開的方法還包括克隆表達(dá)I的培養(yǎng)細(xì)胞。
公開了治療患者的方法，包括給予本文公開的細(xì)胞，例如通過移植本文公開的細(xì)胞。
公開了測(cè)定組合物的毒性的方法，包括將組合物與由本文所公開的方法生產(chǎn)的細(xì)胞共同培養(yǎng)。
公開了含有包含P-I結(jié)構(gòu)的核酸分子構(gòu)建體的多潛能干細(xì)胞，其中P為組織特異性轉(zhuǎn)錄控制元件，P使得I優(yōu)勢(shì)表達(dá)或選擇性表達(dá)，I為溫度許可性無(wú)限增殖因子。
公開了含有包含X-P-I-X結(jié)構(gòu)的核酸分子構(gòu)建體的多潛能干細(xì)胞，其中P為組織特異性轉(zhuǎn)錄控制元件，P使得I優(yōu)勢(shì)表達(dá)或選擇性表達(dá)，I為溫度許可性無(wú)限增殖因子，X為位點(diǎn)特異性切除序列。
公開了這樣的細(xì)胞——其中P-I被切除，其中通過腺病毒介導(dǎo)的位點(diǎn)特異性切除法在X處切除P-I，和/或其中P-I的切除使得原來(lái)含有包含P-I核酸分子的構(gòu)建體的核酸分子重組。
公開了獲得干細(xì)胞來(lái)源的有條件地永生的細(xì)胞類型的方法，包括用含有本文公開的核酸分子構(gòu)建體P-I的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染多潛能干細(xì)胞，將干細(xì)胞與一種環(huán)境接觸以使轉(zhuǎn)錄控制元件P激活并使I優(yōu)勢(shì)表達(dá)或選擇性表達(dá)，選擇表達(dá)I的干細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞類型，以及克隆和冷凍所選擇的細(xì)胞類型。
公開了獲得干細(xì)胞來(lái)源的有條件地永生的細(xì)胞類型的方法，包括用含有本文所公開的核酸分子構(gòu)建體X-P-I-X的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染多潛能干細(xì)胞，將干細(xì)胞與一種環(huán)境接觸以使轉(zhuǎn)錄控制元件P被激活并使I優(yōu)勢(shì)表達(dá)或選擇性表達(dá)，選擇表達(dá)I的干細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞類型，并克隆和冷凍選擇的細(xì)胞類型。
公開了獲得干細(xì)胞來(lái)源的有條件地永生的細(xì)胞類型的方法，包括用含有本文所公開的核酸分子構(gòu)建體X-P-I-X的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染多功能干細(xì)胞，將干細(xì)胞與一種環(huán)境接觸以使轉(zhuǎn)錄控制元件P被激活并使I優(yōu)勢(shì)表達(dá)或選擇性表達(dá)，選擇表達(dá)I的干細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞類型，切除含有P-I核酸分子的構(gòu)建體，以及克隆和冷凍選擇的細(xì)胞類型。
公開了其中P和I被包含于相同的載體或者其中P和I被包含于不同的載體的細(xì)胞。
公開了用于從干細(xì)胞產(chǎn)生分化細(xì)胞的組合物和方法。特別地，該方法的可用形式包括位點(diǎn)特異性重組和組織特異性可逆轉(zhuǎn)化(TSRT)的過程。該方法可使用例如flp/frt介導(dǎo)的重組和組織特異性啟動(dòng)子，以激活例如ras的轉(zhuǎn)化并鑒定合適的細(xì)胞。然后使用例如四環(huán)素調(diào)節(jié)的顯性負(fù)性ras表達(dá)，可逆轉(zhuǎn)該轉(zhuǎn)化。這些技術(shù)的依次應(yīng)用得到任意所需細(xì)胞類型，這些細(xì)胞類型在不需全面了解它們的發(fā)育程序時(shí)就可被克隆、積聚和培養(yǎng)。轉(zhuǎn)化的逆轉(zhuǎn)得到可驗(yàn)證為一致的分化細(xì)胞群。該方法概括于圖7，可使用例如圖8圖示的核酸區(qū)段?？赏ㄟ^關(guān)閉核酸區(qū)段中的組織特異性啟動(dòng)子(TS啟動(dòng)子)選擇任何細(xì)胞類型。在這個(gè)實(shí)例中使用α-MHC啟動(dòng)子。圖8中的組織特異性選擇子由四環(huán)素調(diào)節(jié)性CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的顯性負(fù)性ras和組織特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的a-ras組成。目的組織類型的形成激活啟動(dòng)子并使細(xì)胞轉(zhuǎn)化。需要時(shí)，可通過加入四環(huán)素來(lái)逆轉(zhuǎn)該轉(zhuǎn)化。
該方法可使用可在確定的無(wú)飼養(yǎng)條件下培養(yǎng)的干細(xì)胞，例如人類胚胎生殖(EG)細(xì)胞系。在該方法的某些形式中，TSRT過程可用于這些細(xì)胞，用來(lái)鑒定和培養(yǎng)在類胚胎體分化的過程中形成的細(xì)胞類型，以及利用轉(zhuǎn)化基因的能力的優(yōu)勢(shì)，所述轉(zhuǎn)化基因例如由于組織特異性啟動(dòng)子而表達(dá)以驅(qū)動(dòng)細(xì)胞生長(zhǎng)的ras。然后這些細(xì)胞可被克隆、表征并凍存于主細(xì)胞庫(kù)(Master cell bank)中以備在需要時(shí)使用。當(dāng)使用細(xì)胞時(shí)，例如在藥物篩選時(shí)或細(xì)胞療法時(shí)，轉(zhuǎn)化過程可被相應(yīng)的顯性負(fù)性ras的表達(dá)被逆轉(zhuǎn)。使用此方法，任何所需的細(xì)胞類型均可被鑒定、培養(yǎng)至任意所需規(guī)模，以及定量轉(zhuǎn)變?yōu)槲崔D(zhuǎn)化的表形。
公開的方法可包括例如使用適用于該方法的經(jīng)修飾的干細(xì)胞。例如可向干細(xì)胞系例如EG細(xì)胞系內(nèi)插入frt重組位點(diǎn)，以使組織特異性選擇子插入至對(duì)于每次選擇的同一已知位點(diǎn)。選擇子可以是含有例如表達(dá)調(diào)節(jié)性轉(zhuǎn)化劑的核酸區(qū)段。獨(dú)立的分離物可被表征以鑒定具有最佳整合位點(diǎn)的干細(xì)胞系。結(jié)果得到的干細(xì)胞系可被稱為frt插入(FI)系。frt插入系可用來(lái)產(chǎn)生四環(huán)素調(diào)節(jié)的插入位點(diǎn)。得到的四環(huán)素操縱子frt插入(TOFI)系可使得顯性負(fù)性轉(zhuǎn)化劑調(diào)節(jié)性表達(dá)以逆轉(zhuǎn)該轉(zhuǎn)化。
flp是λ整合酶家族的一員，因它能在酵母中翻轉(zhuǎn)DNA區(qū)段而得名(Branda and Dymecki，(2004)Talking about a revolutiontheimpact of site specific recombinases on genetic analyses in mice.Developmental Cell 6，7-28)。它通過特異性識(shí)別序列frt(flp重組酶靶標(biāo))介導(dǎo)重組。已經(jīng)證實(shí)frt序列的插入可使含有第二個(gè)frt序列的質(zhì)粒發(fā)生位點(diǎn)特異性整合。已經(jīng)證實(shí)flp/frt在胚胎干細(xì)胞中可有效地起作用(Dymecki，(1996)Flp recombinase promotes sitespecific DNA recombination in embryonic stem cells and transgenicmice.Proc.Natl.Acad.Sci.93，6191-6196)。
通過將frt位點(diǎn)(或其他位點(diǎn)特異性重組或插入位點(diǎn))插入至干細(xì)胞系，選擇子構(gòu)建體(即與ras連接的組織特異性啟動(dòng)子)在任何篩選中均可靶向于相同的位點(diǎn)。這樣消除了DNA非定向插入的問題，在DNA非定向插入中DNA整合入隨分化程序開啟或關(guān)閉的基因組的一段中或者整合入功能性基因中。雖然在常規(guī)DNA插入系統(tǒng)中這不是一個(gè)不可克服的問題(通?？赏ㄟ^在選擇培養(yǎng)基中繼續(xù)生長(zhǎng)來(lái)克服)，但本發(fā)明公開的方法提供了一個(gè)優(yōu)越的解決方案。該公開的方法可以利用選擇子的隨機(jī)插入，但因?yàn)樾枰獙?duì)每次插入評(píng)估插入效果，這就需要更多的操作。利用重組位點(diǎn)可使得合適的細(xì)胞一次產(chǎn)生。然后該細(xì)胞可被重復(fù)使用，重復(fù)重組入相同的位點(diǎn)以選擇其他細(xì)胞類型。由于重組入已有的位點(diǎn)，所有的轉(zhuǎn)染子應(yīng)是相同的，從而可收集整個(gè)表面皿，避免了反復(fù)克隆的問題。使用flp/frt系統(tǒng)還可使轉(zhuǎn)染效率最高。
基于例如使用在所需的細(xì)胞類型中激活的轉(zhuǎn)錄控制元件，公開的方法可用于制備任意所需的細(xì)胞類型。例如通過使用例如α肌球蛋白重鏈(αMHC)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的ras在公開的方法中可生成心肌細(xì)胞。然后可使用插入的四環(huán)素調(diào)節(jié)的顯性負(fù)性ras來(lái)逆轉(zhuǎn)心肌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。溫度敏感性轉(zhuǎn)化體或選擇子(含有表達(dá)調(diào)節(jié)性轉(zhuǎn)化劑的核酸區(qū)段)的切除通過flp重組酶的調(diào)節(jié)性表達(dá)而實(shí)現(xiàn)。
A組合物1.干細(xì)胞干細(xì)胞被定義為(Gilbert，(1994)DEVELOPMENTAL BIOLOGY，4thEd.Sinauer Associates，Inc.Sunderland，MA.，p.354)“能夠廣泛增殖、產(chǎn)生更多干細(xì)胞(自我更新)以及更多的分化的細(xì)胞子代”的細(xì)胞。這些特征可稱作干細(xì)胞潛能。多潛能干細(xì)胞、成體干細(xì)胞、胚泡來(lái)源干細(xì)胞、生殖嵴來(lái)源干細(xì)胞、畸胎瘤來(lái)源干細(xì)胞、全能干細(xì)胞、多能干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞(ES)、胚胎生殖細(xì)胞(EG)以及胚胎癌細(xì)胞(EC)均是干細(xì)胞的實(shí)例。
干細(xì)胞可具有多種不同性質(zhì)以及不同類別的這些性質(zhì)。例如在某些形式中，干細(xì)胞在未分化的狀態(tài)能增殖至少10、15、20、30或更多代。在某些形式中，干細(xì)胞可增殖一年以上不分化。干細(xì)胞在增殖和/或分化時(shí)還可維持正常的核型。干細(xì)胞還能保持分化成中胚層、內(nèi)胚層和外胚層組織包括生殖細(xì)胞、卵子和精子的能力。一些干細(xì)胞還可以是能夠在不分化的狀態(tài)下在體外無(wú)限增殖的細(xì)胞。一些干細(xì)胞還可以在更長(zhǎng)時(shí)間的培養(yǎng)中維持正常的核型。有些干細(xì)胞甚至在更長(zhǎng)時(shí)間的培養(yǎng)后還可維持分化成全部三種胚胎層(內(nèi)胚層、中胚層和外胚層)的衍生物的潛能。一些干細(xì)胞可在生物體形成任意細(xì)胞類型。一些干細(xì)胞在某些條件下可形成類胚胎體，例如在不維持未分化生長(zhǎng)的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)時(shí)。一些干細(xì)胞可通過與例如胚泡融合形成嵌合體。
一些干細(xì)胞可通過多種標(biāo)記來(lái)定義。例如，一些干細(xì)胞表達(dá)堿性磷酸酶。一些干細(xì)胞表達(dá)SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60和/或TRA-1-81。一些干細(xì)胞不表達(dá)SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60和/或TRA-1-81。一些干細(xì)胞表達(dá)Oct4和Nanog(Rodda et al.，J.Biol.Chem.280，24731-24737(2005)；Chambers et al.，Cell 113，643-655(2003))。應(yīng)了解的是一些干細(xì)胞在mRNA水平上表達(dá)這些標(biāo)記，而還有其他一些還在蛋白質(zhì)水平上在例如細(xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)表達(dá)它們。
應(yīng)當(dāng)理解干細(xì)胞可具有本文所述的任何干細(xì)胞性質(zhì)或類別或類別和性質(zhì)的任意組合。例如一些干細(xì)胞可表達(dá)堿性磷酸酶，而不表達(dá)SSEA-1，增殖至少20代，以及能分化成任意細(xì)胞類型。另一組干細(xì)胞例如可在細(xì)胞表面表達(dá)SSEA-1，能夠形成內(nèi)胚層、中胚層和外胚層組織，以及培養(yǎng)一年也不分化。另一組干細(xì)胞例如可以是表達(dá)SSEA-1的多潛能干細(xì)胞。另一組干細(xì)胞例如可以是表達(dá)堿性磷酸酶的胚泡來(lái)源干細(xì)胞。
可使用強(qiáng)化所需類型的干細(xì)胞的性質(zhì)的任何培養(yǎng)手段。例如可在堿性成纖維生長(zhǎng)因子、白血病抑制因子、膜相關(guān)青灰因子和可溶性青灰因子存在時(shí)培養(yǎng)干細(xì)胞，從而產(chǎn)生多潛能胚胎干細(xì)胞。參見美國(guó)專利5,690,926、5,670,372和5,453,357,這些文獻(xiàn)中至少關(guān)于獲得和給養(yǎng)培養(yǎng)物中的多潛能干胚胎細(xì)胞的資料均通過引用的方式納入本文。還可在胚胎成纖維細(xì)胞上培養(yǎng)干細(xì)胞，解離的細(xì)胞可重新在胚胎飼養(yǎng)細(xì)胞上鋪板。參見例如美國(guó)專利6,200,806和5,843,780，這些文獻(xiàn)中至少關(guān)于獲得和給養(yǎng)干細(xì)胞的資料通過引用的方式納入本文。
一類干細(xì)胞為多潛能胚胎干細(xì)胞。本文所使用的多潛能胚胎干細(xì)胞意為可在胚胎或成體產(chǎn)生許多分化的細(xì)胞類型的細(xì)胞，所述分化的細(xì)胞包括生殖細(xì)胞(精子和卵子)。多潛能胚胎干細(xì)胞也能夠自我更新。因此，這些細(xì)胞不僅構(gòu)成生殖細(xì)胞系以及產(chǎn)生許多組成成體專門器官的終末分化細(xì)胞，而且能使它們自己再生。
一類干細(xì)胞為能夠自我更新并且可分化成中胚層、外胚層和內(nèi)胚層的細(xì)胞類型但不產(chǎn)生生殖細(xì)胞即精子或卵子的細(xì)胞。
另一類干細(xì)胞為能夠自我更新并可分化成中胚層、外胚層和內(nèi)胚層的細(xì)胞類型但不產(chǎn)生胎盤細(xì)胞的干細(xì)胞。
另一類干細(xì)胞為非來(lái)源于胚胎或胎兒的任意類型干細(xì)胞的成體干細(xì)胞。雖然能產(chǎn)生全部三種細(xì)胞類型的成體干細(xì)胞已有描述(例如2004年6月3日公布的Furcht等人的公布號(hào)為No.20040107453的美國(guó)專利申請(qǐng)和PCT/US02/04652中，這些文獻(xiàn)中至少關(guān)于成體干細(xì)胞和培養(yǎng)成體干細(xì)胞的資料通過引用的方式納入本文)，但通常成體干細(xì)胞產(chǎn)生新細(xì)胞類型的能力有限并且產(chǎn)生的是特定的譜系。成體干細(xì)胞的一個(gè)實(shí)例是多能造血干細(xì)胞，它可形成所有血液細(xì)胞例如紅細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞和B細(xì)胞。諸如此類的細(xì)胞因在造血譜系中的多潛能性而被稱作“多潛能造血干細(xì)胞”。多潛能成體干細(xì)胞為具有多潛能性能的成體干細(xì)胞(參見例如公布號(hào)為No.20040107453的美國(guó)專利申請(qǐng)No.10/467963)。
另一類干細(xì)胞為胚泡來(lái)源干細(xì)胞，它為來(lái)源于從例如64、100或150個(gè)細(xì)胞期前的胚泡所獲得的細(xì)胞的多潛能干細(xì)胞。胚泡來(lái)源干細(xì)胞可來(lái)源于胚泡的內(nèi)部細(xì)胞群集，并常用于轉(zhuǎn)基因小鼠的研究(Evans andKaufinan，(1981)Nature 292154-156；Martin，(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.787634-7638)。從培養(yǎng)的胚泡中分離的胚泡來(lái)源干細(xì)胞可產(chǎn)生永久細(xì)胞系，永久細(xì)胞系可無(wú)期限地保留它們不分化的特性。可使用任何當(dāng)代分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)胚泡來(lái)源干細(xì)胞進(jìn)行操作，然后在將其植入新的胚泡。該胚泡可產(chǎn)生攜帶有胚泡來(lái)源干細(xì)胞基因組成的完全意義上的動(dòng)物。(Misra and Duncan，(2002)Endocrine 19229-238)。這類性質(zhì)和操作一般可應(yīng)用于胚泡來(lái)源干細(xì)胞。應(yīng)當(dāng)理解，胚泡來(lái)源干細(xì)胞可從植入前或植入后的胚胎獲得，并可分別被稱作植入前胚泡來(lái)源干細(xì)胞和植入后胚泡來(lái)源干細(xì)胞。
另一類干細(xì)胞為生殖嵴來(lái)源干細(xì)胞，它為來(lái)源于從例如在排卵后的6、7、8、9或10周時(shí)或在6、7、8、9或10周后(即發(fā)育階段)的人類胚胎或胎兒獲得的細(xì)胞的多潛能干細(xì)胞。在5-6周的階段進(jìn)行堿性磷酸酶染色。生殖嵴來(lái)源干細(xì)胞可來(lái)源于例如6-10周的人類胚胎或胎兒的生殖嵴，來(lái)自生殖嵴細(xì)胞。
另一類干細(xì)胞為胚胎來(lái)源干細(xì)胞，所述干細(xì)胞來(lái)源于最長(zhǎng)妊娠6周的150個(gè)或以上細(xì)胞的胚胎。通常胚胎來(lái)源干細(xì)胞來(lái)源于由胚泡內(nèi)部細(xì)胞群集細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞或?qū)⒊蔀樯翅占?xì)胞的細(xì)胞，生殖嵴細(xì)胞可來(lái)自內(nèi)部細(xì)胞群集細(xì)胞，例如在發(fā)育過程中遷移至生殖嵴的細(xì)胞。
其他組的干細(xì)胞為胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)、胚胎生殖細(xì)胞(EG細(xì)胞)和胚胎癌細(xì)胞(EC細(xì)胞)。
還公開了另一類稱作畸胎瘤來(lái)源干細(xì)胞的干細(xì)胞，此類干細(xì)胞為來(lái)源于畸胎癌并以缺乏正常核型為特征的干細(xì)胞?；グ楹币娔[瘤，與多數(shù)腫瘤不同，它由許多種不同的組織類型組成?；グ┑难芯勘砻魉鼈冇擅撾x了通常的控制機(jī)制的原始生殖腺組織產(chǎn)生。這類性質(zhì)和操作通?？蓱?yīng)用于畸胎瘤來(lái)源干細(xì)胞。
干細(xì)胞還可根據(jù)其發(fā)育潛能分類。一類干細(xì)胞為可生長(zhǎng)成完整生物體的干細(xì)胞。另一類干細(xì)胞為不能生長(zhǎng)成整個(gè)生物體，但可成為體內(nèi)的任意其他細(xì)胞類型的干細(xì)胞(如上文所述具有多潛能性能)。另一類干細(xì)胞為僅成為特定細(xì)胞類型例如血細(xì)胞或骨細(xì)胞的干細(xì)胞。其他類的干細(xì)胞包括全能干細(xì)胞、多潛能干細(xì)胞和多能干細(xì)胞。
公開的方法和組合物通常通過引用“干細(xì)胞”或“多潛能干細(xì)胞”來(lái)描述。然而，公開的方法不限于使用干細(xì)胞和多潛能干細(xì)胞。特別考慮到公開的方法和組合物可使用或包括任意類型或類別的干細(xì)胞，例如成體干細(xì)胞、胚泡來(lái)源干細(xì)胞、生殖嵴來(lái)源干細(xì)胞、畸胎瘤來(lái)源干細(xì)胞、全能干細(xì)胞和多能干細(xì)胞或具有任何本文所述的性質(zhì)的干細(xì)胞。特別考慮并描述了在本公開方法和組合物中的或與本公開方法和組合物一起使用的、單獨(dú)或以任意組合使用的、任意類型或類別的干細(xì)胞的用途。
2.體外干細(xì)胞的分化直到最近，多潛能干細(xì)胞的研究工作仍幾乎只限于小鼠。雖然已有來(lái)源于其他幾個(gè)物種的細(xì)胞系，但小鼠的實(shí)驗(yàn)集中了大多數(shù)的工作的優(yōu)點(diǎn)。小鼠作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷牧硪粋€(gè)結(jié)果是不必再?gòu)?qiáng)調(diào)建立促進(jìn)體外分化的條件的研究工作。產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小鼠相對(duì)簡(jiǎn)單，這使得為確定細(xì)胞培養(yǎng)條件的不確定的和偶然性的研究工作失去信心，所述條件為模擬導(dǎo)致器官型分化的極其復(fù)雜的細(xì)胞相互作用的條件。隨著人類多潛能干細(xì)胞系的公布，在體外調(diào)節(jié)分化的能力已有突飛猛進(jìn)的發(fā)展。
在例如飼養(yǎng)層上并用適宜的培養(yǎng)基使所給養(yǎng)的多潛能干細(xì)胞無(wú)限期地保持不分化。將其從飼養(yǎng)層上移出并在懸液中培養(yǎng)會(huì)導(dǎo)致凝集物和其他分化細(xì)胞的形成(Kyba，M，(2003)Meth.Enzymol.365，114-129)。這些凝集物開始組織和產(chǎn)生胚泡的某些特性。這些原始胚泡(protoblastocyst)稱為類胚胎體(EB)。在EB內(nèi)增殖和分化的進(jìn)行性周期大致是按照發(fā)育的模式發(fā)生。當(dāng)在EB中可鑒定到很多不同的組織類型時(shí)，若沒有外部指導(dǎo)，分化就會(huì)紊亂，因而不能導(dǎo)致形成顯著數(shù)量的任意一種細(xì)胞類型(Fairchild，PJ，(2003)Meth.Enzymol.365，169-186)。已制定了很多策略來(lái)指導(dǎo)更大比例的細(xì)胞循著特定的發(fā)育路線(Wassarman，PM，Keller，GM.(2003)METHODS IN ENZYMOLOGY，Differentiation of Embryonic Stem Cells，vol.365，ElsevierAcademic Press，New York，NY，510p.)。這些策略已經(jīng)采用了使用已知的形態(tài)發(fā)生素處理、改變激素環(huán)境、在特定的基質(zhì)上培養(yǎng)以及在體外相繼使用化學(xué)物質(zhì)以影響分化的方式。所有這些策略在某些應(yīng)用中已經(jīng)是成功的，但是它們都不能產(chǎn)生同質(zhì)的一種細(xì)胞類型的細(xì)胞。
除了同質(zhì)性的問題外，當(dāng)人們考慮到在其他應(yīng)用中實(shí)際使用特定細(xì)胞類型的可能性時(shí)還出現(xiàn)了另一個(gè)問題。例如，用于毒性測(cè)試的正常人類肝細(xì)胞在藥物開發(fā)中十分有用。直接來(lái)源于人類肝臟的細(xì)胞——人類原代肝細(xì)胞的供給極為短缺。來(lái)源于干細(xì)胞系的肝細(xì)胞可解決這個(gè)問題，但需要獲得顯著數(shù)目的來(lái)源于干細(xì)胞系的肝細(xì)胞。所公開的組合物和方法能夠解決這個(gè)問題。
為了使干細(xì)胞來(lái)源的產(chǎn)品用于實(shí)際應(yīng)用中，需要產(chǎn)生大量的相同細(xì)胞。理想地，這可以是一種可廣泛使用而不必對(duì)于每種細(xì)胞類型都需要繁冗的實(shí)驗(yàn)的通用方法。
3.細(xì)胞特異性產(chǎn)生組織特異性可逆選擇(例如轉(zhuǎn)化)提供了一種產(chǎn)生分化的干細(xì)胞的有用方法。所公開的方法使得可以鑒定和培養(yǎng)任意特定類型的永久細(xì)胞系，然后可使整個(gè)群體回復(fù)為正常表型或者從該群體中被清除。
公開了使用將發(fā)育為任何所需細(xì)胞類型的組織特異性可逆轉(zhuǎn)化干細(xì)胞系的組合物和方法。該公開的方法應(yīng)用了轉(zhuǎn)化基因的組織特異性表達(dá)。還公開了經(jīng)任意數(shù)量的策略例如顯性負(fù)性形式的轉(zhuǎn)化基因的表達(dá)，來(lái)逆轉(zhuǎn)該轉(zhuǎn)化的方法，所述策略要根據(jù)所需細(xì)胞產(chǎn)品的背景而定。公開的組合物和方法避免了大規(guī)模地培養(yǎng)干細(xì)胞，因?yàn)楦杉?xì)胞自身只需在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模上生長(zhǎng)以分離所需的細(xì)胞類型；它們發(fā)育為能被克隆和表征的個(gè)體細(xì)胞系，所述克隆和表征就如同目前在任意大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用上進(jìn)行的一樣，并且這些細(xì)胞系可被表征和冷凍；由于該組合物和方法利用了生物學(xué)本身的能力，而不是試圖在大規(guī)模級(jí)別重復(fù)這些復(fù)雜的過程，因此它們繞過了目前難懂的生物學(xué)理論；該細(xì)胞系在一般培養(yǎng)條件的培養(yǎng)中的表現(xiàn)如同大多轉(zhuǎn)化細(xì)胞系，即胰島素、運(yùn)鐵蛋白、硒，普通細(xì)胞培養(yǎng)基對(duì)于大多數(shù)的這些細(xì)胞系是足夠的。應(yīng)當(dāng)理解本文公開的非轉(zhuǎn)化方法也是可以使用的，并可與轉(zhuǎn)化的方法互換。
4.經(jīng)修飾的干細(xì)胞公開了經(jīng)修飾的干細(xì)胞。經(jīng)修飾的干細(xì)胞是具有不同于原細(xì)胞背景的遺傳背景的干細(xì)胞。例如，經(jīng)修飾的干細(xì)胞可以是表達(dá)標(biāo)記的干細(xì)胞，標(biāo)記可由外加的染色體核酸或整合的核酸表達(dá)。干細(xì)胞可通過多種途徑進(jìn)行修飾，包括通過表達(dá)標(biāo)記的方式修飾。標(biāo)記可以是使得可對(duì)干細(xì)胞或干細(xì)胞來(lái)源細(xì)胞進(jìn)行選擇或篩選的物質(zhì)。例如標(biāo)記可以是轉(zhuǎn)化基因例如Ras，它提供給細(xì)胞在非轉(zhuǎn)化細(xì)胞不能生長(zhǎng)的條件下生長(zhǎng)的能力。
細(xì)胞可被施以選擇壓力，這是指細(xì)胞在被設(shè)計(jì)成以某些與標(biāo)記有關(guān)的方式改變細(xì)胞群體的條件下生長(zhǎng)或被置于該條件下。例如，如果標(biāo)記賦予表達(dá)標(biāo)記的細(xì)胞抗生素抗性，那么該細(xì)胞群體可被置于存在該抗生素的條件下。只有表達(dá)傳遞抗生素抗性的基因的細(xì)胞可以存活，或其相對(duì)于不表達(dá)抗生素抗性基因的細(xì)胞具有存活優(yōu)勢(shì)。在所述方法的某種形式中，表達(dá)標(biāo)記基因以及具有選擇優(yōu)勢(shì)的細(xì)胞可以相對(duì)于不具有標(biāo)記的其他細(xì)胞而言被選擇性擴(kuò)增，也就是說它們比不具有標(biāo)記的細(xì)胞可以以更快的速度生長(zhǎng)或存活。在該方法的某些形式中，具有標(biāo)記的細(xì)胞的選擇具有一定的選擇嚴(yán)格性。選擇嚴(yán)格性是標(biāo)記從不具有標(biāo)記的細(xì)胞中鑒別具有該標(biāo)記的細(xì)胞的效率。例如選擇嚴(yán)格性可以是諸如產(chǎn)生標(biāo)記的細(xì)胞比非標(biāo)記表達(dá)細(xì)胞具有至少2、4、8、10、15、20、25、30、40、50、75、100、200、400、500、800、1000、2000、4000、10,000、25000、50000倍的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。在該方法的某些形式中，選擇嚴(yán)格性可表示為在一段時(shí)間內(nèi)(例如一代)存活的表達(dá)標(biāo)記的細(xì)胞的百分比相對(duì)于在相同時(shí)間內(nèi)存活的不表達(dá)標(biāo)記的細(xì)胞的百分比的選擇比率。例如所公開的是可產(chǎn)生下述選擇比率的標(biāo)記，所述選擇比率至少為1、1.5、2、4、8、10、15、20、25、30、40、50、75、100、200、400、500、800、1000、2000、4000、10000、25000、50000或100000。該標(biāo)記使得表達(dá)標(biāo)記的細(xì)胞選擇性生長(zhǎng)或可見，這意為表達(dá)標(biāo)記的細(xì)胞可優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng)或選擇性生長(zhǎng)或可從不表達(dá)標(biāo)記的細(xì)胞中被識(shí)別出來(lái)。
a)標(biāo)記標(biāo)記或標(biāo)記產(chǎn)品可用于確定標(biāo)記或某些其他核酸是否已被遞送至細(xì)胞并在遞送后表達(dá)。例如標(biāo)記可以是標(biāo)記基因或報(bào)告基因的表達(dá)產(chǎn)物?？捎玫臉?biāo)記基因的實(shí)例包括大腸桿菌lacZ基因，該基因編碼β-半乳糖苷酶、腺苷磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(APRT)和次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HPRT)。熒光蛋白質(zhì)也可用作標(biāo)記和標(biāo)記產(chǎn)品。熒光蛋白質(zhì)的實(shí)例包括綠色熒光蛋白(GFP)、綠色造礁珊瑚熒光蛋白(green reef coralfluorescent protein，G-RCFP)、青色熒光蛋白(cyan fluorescentprotein，CFP)、紅色熒光蛋白(RFP或dsRed2)以及黃色熒光蛋白(YFP)。
(1)陰性選擇標(biāo)記標(biāo)記可以是可選擇的標(biāo)記。用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的合適的可選擇標(biāo)記的實(shí)例為二氫葉酸還原酶(DHFR)、胸苷激酶、新霉素、新霉素類似物G418、濕霉素和嘌呤霉素。當(dāng)這類可選標(biāo)記被成功轉(zhuǎn)入哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中時(shí)，若置于選擇壓力下，則被轉(zhuǎn)化的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞可存活。有兩種廣泛應(yīng)用的不同類別的選擇方案。第一類基于細(xì)胞代謝和突變細(xì)胞系的使用，所述突變細(xì)胞系缺乏不依賴于補(bǔ)加培養(yǎng)基生長(zhǎng)的能力。兩個(gè)實(shí)例是CHO的DHFR細(xì)胞和小鼠LTK細(xì)胞。這些細(xì)胞缺乏在不添加例如胸苷或次黃嘌呤的營(yíng)養(yǎng)成分的條件下生長(zhǎng)的能力。由于這些細(xì)胞缺乏完整的核酸合成途徑所必需的某些基因，所以除非在補(bǔ)加培養(yǎng)基中提供了所缺少的核苷酸，否則它們不能存活。相對(duì)于補(bǔ)加培養(yǎng)基而言的另一種方法是將完整的DHFR或TK基因?qū)敕謩e缺乏DHFR或TK基因的細(xì)胞中，從而改變它們的生長(zhǎng)需求。未被DHFR或TK基因轉(zhuǎn)化的個(gè)體細(xì)胞將不能在非補(bǔ)加培養(yǎng)基中存活。
(2)顯性選擇標(biāo)記第二類為顯性選擇，是指用于任意細(xì)胞類型并且不需要使用突變細(xì)胞系的選擇方案的選擇。這些方案通常使用抑制宿主細(xì)胞生長(zhǎng)的藥物。那些具有新基因的細(xì)胞可表達(dá)表現(xiàn)出藥物抗性的蛋白質(zhì)，從而可經(jīng)選擇后存活。這類顯性選擇的實(shí)例使用了藥物新霉素(Southern P.andBerg，P.，J.Molec.Appl.Genet.1327(1982))、霉酚酸(Mulligan，R.C.and Berg，P.Science2091422(1980))或潮霉素(Sugden，B.et al.，Mol.Cell.Biol.5410-413(1985))。這三個(gè)實(shí)例應(yīng)用了真核生物控制下的細(xì)菌基因以表現(xiàn)出分別對(duì)適宜的藥物G418或新霉素(遺傳霉素)、xgpt(霉酚酸)或潮霉素的抗性。其他實(shí)例包括新霉素類似物G418和嘌呤霉素。
(3)轉(zhuǎn)化基因轉(zhuǎn)化基因可用作標(biāo)記。轉(zhuǎn)化基因是任何編碼使得細(xì)胞具有至少一種癌細(xì)胞的特性的蛋白質(zhì)或RNA的序列，所述癌細(xì)胞特性例如在能夠軟瓊脂上生長(zhǎng)。其他特性包括例如接觸抑制作用的缺失以及不依賴于生長(zhǎng)因子。另外，轉(zhuǎn)化的細(xì)胞可發(fā)生形態(tài)學(xué)上的改變，例如細(xì)胞變得不那么圓。轉(zhuǎn)化基因也可被稱作轉(zhuǎn)化性基因。轉(zhuǎn)化基因、轉(zhuǎn)化性基因和它們的產(chǎn)物可被稱為轉(zhuǎn)化質(zhì)或轉(zhuǎn)化劑。轉(zhuǎn)化劑也可稱作無(wú)限增殖因子。
癌基因可以是轉(zhuǎn)化基因，通常轉(zhuǎn)化基因?qū)?huì)是癌基因。癌基因通常編碼信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)系統(tǒng)的組成部分。通常癌基因的正?；虍a(chǎn)物調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)，發(fā)生于蛋白質(zhì)或表達(dá)的突變解除了對(duì)此活性的控制或使該活性增加。癌基因通常編碼信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑例如MARK途徑或Ras途徑中的分子，例如生長(zhǎng)因子、生長(zhǎng)因子受體、轉(zhuǎn)錄因子(erbA編碼甲狀腺激素受體(甾體激素受體)、re1形成調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的配對(duì)組合(NF-κB)、v-re1禽類網(wǎng)狀內(nèi)皮增殖、jun以及fos)、蛋白激酶、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、絲氨酸/蘇氨酸激酶、核內(nèi)蛋白、生長(zhǎng)因子受體激酶或胞質(zhì)酪氨酸激酶。應(yīng)該理解，組合的許多癌基因可能成為轉(zhuǎn)化性的。特別考慮了所公開的癌基因和轉(zhuǎn)化基因的組合的所有系列。某些癌基因例如Ras靠其自身轉(zhuǎn)化。
膜相關(guān)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子常為癌基因。膜相關(guān)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子例如Ras通過其他分子與鄰近受體的結(jié)合被間接激活。鄰近受體的激活導(dǎo)致癌基因變?yōu)榧せ畹?，啟?dòng)了導(dǎo)致正常細(xì)胞行為改變的信號(hào)級(jí)聯(lián)系統(tǒng)。受體酪氨酸激酶也可以是癌基因。受體酪氨酸激酶是能將磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移至靶分子的酶。當(dāng)靶分子例如生長(zhǎng)因子與激酶的細(xì)胞外部分結(jié)合時(shí)，信號(hào)就穿過細(xì)胞膜引起信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)。這一類型的癌基因的實(shí)例為HER2蛋白。受體相關(guān)激酶也是膜相關(guān)酶，但它們通過與其他鄰近受體結(jié)合而激活。此結(jié)合使得激酶磷酸化靶蛋白質(zhì)而導(dǎo)致信號(hào)向核的轉(zhuǎn)導(dǎo)。Src是這一類型癌基因的一個(gè)實(shí)例。轉(zhuǎn)錄因子是與沿DNA螺旋的特定序列結(jié)合而導(dǎo)致結(jié)合的基因在核內(nèi)表達(dá)的蛋白質(zhì)。這一類型的癌基因的實(shí)例為myc。一些轉(zhuǎn)錄因子為抑制劑，例如Rb。端粒末端轉(zhuǎn)移酶是一種維持染色體末端的蛋白質(zhì)-RNA復(fù)合物。如果端粒末端轉(zhuǎn)移酶不存在或存在量很少，染色體就隨著每次細(xì)胞分裂而縮短，直至發(fā)生嚴(yán)重?fù)p害。端粒末端轉(zhuǎn)移酶在大多數(shù)正常細(xì)胞中不表達(dá)或不存在或表達(dá)量或存在量很少，但是在多數(shù)的轉(zhuǎn)化細(xì)胞中該酶存在的濃度高于同質(zhì)的未轉(zhuǎn)化細(xì)胞中的濃度。凋亡調(diào)節(jié)蛋白是起控制程序性細(xì)胞死亡作用的蛋白質(zhì)。當(dāng)DNA受損害或發(fā)生其他損傷時(shí)就會(huì)發(fā)生凋亡。許多癌基因在它們的正常狀態(tài)時(shí)阻抑細(xì)胞死亡，例如Bc1-2。
非窮舉的癌基因有ab1(酪氨酸激酶活性)、ab1/bcr(融合產(chǎn)生的新蛋白質(zhì))、Af4/hrx(融合影響hrx的轉(zhuǎn)錄因子產(chǎn)物)、akt-2(編碼一種蛋白質(zhì)——卵巢癌1絲氨酸/蘇氨酸激酶)、alk(編碼一種受體酪氨酸激酶)、ALK/NPM(融合產(chǎn)生的新蛋白質(zhì))、am11(編碼轉(zhuǎn)錄因子)、am11/mtg8(融合產(chǎn)生的新蛋白質(zhì))、ax1(編碼一種受體酪氨酸激酶)、bc1-2，3，6(阻抑凋亡(程序性細(xì)胞死亡)、bcr/ab1(融合產(chǎn)生的新蛋白質(zhì))、c-myc(細(xì)胞增殖和DNA合成)、db1(鳥嘌呤核苷酸交換因子)、dek/can(融合產(chǎn)生的新蛋白質(zhì))、E2A/pbx1(融合產(chǎn)生的新蛋白質(zhì))、egfr(酪氨酸激酶)、en1/hrx(融合產(chǎn)生的新蛋白質(zhì))、erg/c16(融合產(chǎn)生的新蛋白質(zhì))、erbB(酪氨酸激酶)、erbB-2(原為neu)(乳房酪氨酸激酶)、ets-1(一些啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄因子)、ews/fli-1(融合產(chǎn)生的新蛋白質(zhì))、fms(酪氨酸激酶)、fos(API的轉(zhuǎn)錄因子)、fps(酪氨酸激酶)、gip(膜相關(guān)G蛋白)、gli(轉(zhuǎn)錄因子)、gsp(膜相關(guān)G蛋白)、HER2/neu(基因融合產(chǎn)生的新蛋白質(zhì))、hox11(DNA結(jié)合蛋白的過表達(dá))、hrx/en1(融合產(chǎn)生的新蛋白質(zhì))、hrx/af4(融合產(chǎn)生的新蛋白質(zhì))、hst(編碼成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子)、IL-3(蛋白質(zhì)的過表達(dá))、int-2(編碼成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子)、jun(轉(zhuǎn)錄因子)、kit(酪氨酸激酶)、KS3(生長(zhǎng)因子)、K-sam(編碼生長(zhǎng)因子受體)、Lbc(鳥嘌呤核苷酸交換因子)、lck(酪氨酸激酶對(duì)T細(xì)胞受體基因的再定位)、lmo-1，(2T細(xì)胞受體基因附近的轉(zhuǎn)錄因子的再定位)、L-myc(細(xì)胞增殖和DNA合成)、lyl-1(DNA結(jié)合蛋白的過表達(dá))、lyt-10(IgH基因附近的轉(zhuǎn)錄因子的再定位)、lt-10/Cα1(融合產(chǎn)生的新蛋白質(zhì))、mas(血管緊張肽受體)、mdm-2(編碼肉瘤1p53抑制劑)、MLH1(DNA錯(cuò)配修復(fù))、m11(基因融合產(chǎn)生的新蛋白質(zhì))、MLM(編碼p16——一種抑制細(xì)胞周期的負(fù)性生長(zhǎng)調(diào)節(jié)子)、mos(絲氨酸/蘇氨酸激酶)、MSH2(DNA錯(cuò)配修復(fù))、mtg8/am11(融合產(chǎn)生的新蛋白質(zhì))、myb(編碼有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子)、MYH11/CBFB(融合產(chǎn)生的新蛋白質(zhì))、neu(現(xiàn)為erb-2)(酪氨酸激酶)、N-myc(細(xì)胞增殖和DNA合成)、NPM/ALK(融合產(chǎn)生的新蛋白質(zhì))、nrg/re1(融合產(chǎn)生的新蛋白質(zhì))、ost(鳥嘌呤核苷酸交換因子)、pax-5(轉(zhuǎn)錄因子對(duì)IgH基因的再定位)、pbx1/E2A(融合產(chǎn)生的新蛋白質(zhì))、pim-1(絲氨酸/蘇氨酸激酶)、PML/RAR(融合產(chǎn)生的新蛋白)、PMS1，2(DNA錯(cuò)配修復(fù))、PRAD-1(編碼細(xì)胞周期蛋白D1，該蛋白質(zhì)在細(xì)胞周期的G1期很重要)、raf(絲氨酸/蘇氨酸激酶)、RAR/PML(融合產(chǎn)生的新蛋白)、rasH(參與細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo))、rasK(參與細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo))、rasN(參與細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo))、re1/nrg(融合產(chǎn)生的新蛋白)、ret(編碼受體酪氨酸激酶的DNA重排)、rhom-1，2(DNA結(jié)合蛋白的過表達(dá))、ros(酪氨酸激酶)、ski(轉(zhuǎn)錄因子)、sis(生長(zhǎng)因子)、set/can(基因融合產(chǎn)生的新蛋白)、Src(酪氨酸激酶)、tal-1，2(轉(zhuǎn)錄因子的過表達(dá))、tan-1(蛋白質(zhì)的過表達(dá))、Tiam-1(鳥嘌呤核苷酸交換因子)、TSC2(GTP酶激活劑)、trk(重組的融合蛋白)。
轉(zhuǎn)化基因的一個(gè)實(shí)例是Ras基因，其一個(gè)實(shí)例示于SEQ ID NO2。ras癌基因家族包括3個(gè)主要成員K-ras、H-ras和N-ras。所有這三種癌基因與多種癌癥都有關(guān)。K-ras癌基因發(fā)現(xiàn)于12p12染色體，編碼一種21kD的蛋白質(zhì)(p21ras)。P21參與了G蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。K-ras癌基因的突變導(dǎo)致了G蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的組成性激活，這導(dǎo)致異常的增殖和分化。
在50％以上的結(jié)腸直腸腺瘤和癌中都存在激活K-ras的突變，絕大多數(shù)發(fā)生于癌基因的密碼子12處。K-ras突變是胰腺癌和膽管癌中最常見的遺傳異常之一(75％以上)。K-ras突變?cè)诜蜗倭鲋幸草^頻繁。
同樣，所公開的轉(zhuǎn)化基因可與具有具體的實(shí)驗(yàn)中所需的性質(zhì)的其他基因或者各組別轉(zhuǎn)化基因配對(duì)。不同的情況會(huì)使用不同的轉(zhuǎn)化策略。例如，用激活的/顯性負(fù)性對(duì)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞可使得多個(gè)周期回復(fù)。那么這些細(xì)胞同時(shí)具有原代細(xì)胞和細(xì)胞系的優(yōu)點(diǎn)。這些細(xì)胞可被擴(kuò)增、抑制、操作，然后再擴(kuò)增。使用Cre/lox回復(fù)的細(xì)胞成為原代細(xì)胞的類似物，在基因組中只保留有34bp lox位點(diǎn)。這些細(xì)胞可用于細(xì)胞療法處置。
b)表達(dá)系統(tǒng)遞送至細(xì)胞的核酸通常含有表達(dá)控制系統(tǒng)，這些表達(dá)控制系統(tǒng)常為組織特異性的。細(xì)胞含有組織特異性表達(dá)控制系統(tǒng)，也可能還含有不必為組織特異性的另一表達(dá)控制系統(tǒng)。表達(dá)控制系統(tǒng)為引起目的核酸表達(dá)的系統(tǒng)。例如，病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)中的插入基因常含有啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子以幫助控制所需基因產(chǎn)物的表達(dá)。啟動(dòng)子通常是在相對(duì)于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的相對(duì)固定的位置起作用的一個(gè)或多個(gè)DNA序列。啟動(dòng)子含有RNA聚合酶和轉(zhuǎn)錄因子的基本相互作用所需的核心元件，還可含有上游元件和反應(yīng)元件。影響轉(zhuǎn)錄的序列可被稱為轉(zhuǎn)錄控制元件。
(1)組織特異性和細(xì)胞特異性啟動(dòng)子分化是指導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)一組特定轉(zhuǎn)錄因子的過程，所述轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄該細(xì)胞類型的特性基因家族。然后這些轉(zhuǎn)錄因子在特征基因的啟動(dòng)子處聯(lián)合起作用以使同源的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)。通過此方式，有限數(shù)目的轉(zhuǎn)錄因子基因可特異性調(diào)節(jié)更大組的基因(Alberts，B，Bray，D，Lewis，J，Raff，M，Roberts，K，Watson，JD.(1994)MOLECULARBIOLOGY OF THE CELL，3rd Ed.，Garland Publishing，New York，NY，1294p)。
組織特異性啟動(dòng)子只是在特定的生物環(huán)境中作用才最為有效(Kelly，JH，Darlington，GJ.(1985)Ann.Rev.Gen.19，273-296)。例如清蛋白是成人肝細(xì)胞的主要蛋白質(zhì)產(chǎn)物，它僅在該細(xì)胞類型中顯著表達(dá)。這是通過人類清蛋白基因的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的，所述人類清蛋白基因具有只在肝細(xì)胞中驅(qū)動(dòng)清蛋白基因表達(dá)的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子。許多轉(zhuǎn)基因小鼠的實(shí)驗(yàn)已證實(shí)，異源基因在清蛋白啟動(dòng)子/增強(qiáng)子的控制下幾乎僅在肝細(xì)胞中專一地表達(dá)(Pinkert，CA，et al.，(1987)Genes Dev.3，268-76)。由于是通過特定基因和蛋白質(zhì)的表達(dá)來(lái)定義細(xì)胞類型，每個(gè)特異類型具有在該細(xì)胞類型中專一或幾乎專一表達(dá)的特異基因。視紫紅質(zhì)僅在視網(wǎng)膜細(xì)胞中表達(dá)，心肌球蛋白僅在心肌細(xì)胞中表達(dá)，胰島素僅在胰的β細(xì)胞中表達(dá)。每個(gè)這些基因均是由僅在該細(xì)胞類型中作用的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。
(a)細(xì)胞特異性基因具有細(xì)胞特異性啟動(dòng)子表3中為示例性的基因列表，這些基因全部或部分在所示出的特異類型組織中表達(dá)。應(yīng)當(dāng)理解每個(gè)這些基因都具有含允許特異性表達(dá)模式的調(diào)節(jié)元件的5’上游區(qū)域。所公開的是包括每個(gè)這些基因的5’上游區(qū)域的100、350、500、750、1000、1500、2000、2500、3000、4000或5000個(gè)堿基的核酸，該核酸例如與本文公開的轉(zhuǎn)化性基因操作性連接。還公開了制備和使用這些基因的5’上游區(qū)域的方法，包括識(shí)別和分離包含于這些區(qū)域內(nèi)的、具有本文所述特定性質(zhì)的特異元件的方法。方法為已知的，可用于識(shí)別調(diào)節(jié)元件。
表3附隨本申請(qǐng)。
(b)特異性啟動(dòng)子存在許多可用于本文公開的方法和組合物的細(xì)胞特異性啟動(dòng)子。啟動(dòng)子也可識(shí)別與基因轉(zhuǎn)錄物相關(guān)的調(diào)節(jié)區(qū)域來(lái)識(shí)別，所述基因轉(zhuǎn)錄物為細(xì)胞類型特異性的或存在于在細(xì)胞類型亞型中的。
例如，包括啟動(dòng)子和增強(qiáng)子的脂肪細(xì)胞調(diào)節(jié)序列，例如來(lái)自人類脂連蛋白基因序列的-908至+14的序列，可用于鑒定脂肪細(xì)胞(SEQ IDNO9)。(Iwaki，M.，et al.Diabetes 52，1655-1663，2003，GenbankNo.Q15848和NM-004797，這些文獻(xiàn)中至少關(guān)于脂連蛋白基因和調(diào)節(jié)序列(包括序列和獲得該序列的方法)的資料被引入本文。)另一個(gè)實(shí)例是包括啟動(dòng)子和增強(qiáng)子的肝細(xì)胞調(diào)節(jié)序列，例如人類乙肝病毒序列從1610至1810的序列(SEQ ID NO22)、人類α-1-抗胰蛋白酶啟動(dòng)子序列從-137至-37的序列(SEQ ID NO10)和人類清蛋白基因序列從-434至+12的序列(SEQ ID NO11)。(Gabriela Kramer，M.，et al.Molecular Therapy 7，375-385(2003)，其中至少關(guān)于干細(xì)胞調(diào)節(jié)序列(包括該序列和獲得該序列的方法)的資料被引入本文。)還公開了包括啟動(dòng)子和增強(qiáng)子的心臟細(xì)胞調(diào)節(jié)序列。例如人類肌球蛋白輕鏈基因序列VLC1序列從-357至+40的序列(SEQ ID NO12)以心臟細(xì)胞特異性方式起作用。(Kurabayashi，el al.，J.Biol.Chem.265，19271-19278，(1990)，其中至少關(guān)于心臟調(diào)節(jié)序列(包括該序列和獲得該序列的方法)的資料被引入本文)。
還公開了例如啟動(dòng)子和增強(qiáng)子的視網(wǎng)膜調(diào)節(jié)序列，例如人類視紫紅質(zhì)基因的調(diào)節(jié)序列，例如從-176至+70的以及從-2140至-1894的246bp的序列(SEQ ID NO13)(Nie el al.，J.Biol.Chem.271，2667-2675，(1996)，其中至少關(guān)于視網(wǎng)膜調(diào)節(jié)序列(包括該序列和獲得該序列的方法)的資料被引入本文)。
還公開了例如啟動(dòng)子和增強(qiáng)子序列的B細(xì)胞調(diào)節(jié)序列，例如調(diào)節(jié)人類免疫球蛋白重鏈啟動(dòng)子和增強(qiáng)子元件的序列(Maxwell，IH，et al.Cancer Res.51，4299-4304，(1991)，其中至少關(guān)于B細(xì)胞調(diào)節(jié)序列(包括該序列和獲得該序列的方法)的資料被引入本文)。
還公開了例如啟動(dòng)子和增強(qiáng)子序列的內(nèi)皮細(xì)胞調(diào)節(jié)序列，例如人類E選擇素基因的調(diào)節(jié)序列，例如從-547至+33的序列(SEQ ID NO14)(Maxwell，IH，et al.Angiogenesis 6，31-38，(2003)，其中至少關(guān)于內(nèi)皮調(diào)節(jié)序列(包括該序列和獲得該序列的方法)的資料被引入本文)。
還公開了例如啟動(dòng)子和增強(qiáng)子的T細(xì)胞調(diào)節(jié)序列，例如人類前T細(xì)胞受體的調(diào)節(jié)序列，例如從-279至+5的序列(SEQ ID NO15)，T細(xì)胞調(diào)節(jié)序列可包括上游增強(qiáng)子元件(Reizis and Leder，Exp.Med.，194，979-990，(2001)，其中至少關(guān)于T細(xì)胞調(diào)節(jié)序列(包括該序列和獲得該序列的方法)的資料被引入本文)。
還公開了例如啟動(dòng)子和增強(qiáng)子序列的巨噬細(xì)胞調(diào)節(jié)序列，例如人類HCgp-39基因的序列從-308至+2的序列(SEQ ID NO16)(Rehli，M.，et al.J.Biol.Chem.278，44058-44067，(2003)，其中至少關(guān)于巨噬細(xì)胞調(diào)節(jié)序列(包括該序列和獲得該序列的方法)的資料被引入本文)。
還公開了例如啟動(dòng)子和增強(qiáng)子的腎細(xì)胞的調(diào)節(jié)序列，例如人類尿調(diào)節(jié)素基因的調(diào)節(jié)序列，例如該基因的從-3.7kb開始的啟動(dòng)子序列(SEQ ID NO17)(Zbikows ka，HM，et al.Biochem.J.365，7-11，(2002)，其中至少關(guān)于腎細(xì)胞調(diào)節(jié)序列(包括該序列和獲得該序列的方法)的資料被引入本文)。
還公開了例如啟動(dòng)子和增強(qiáng)子的腦調(diào)節(jié)序列，例如人類谷氨酸受體2基因(GluR2)的調(diào)節(jié)序列，例如該基因的從-302至+320的序列(SEQID NO18)(Myers，SJ，et al.J.Neuroscience 18，6723-6739，(1998)，其中至少關(guān)于腦調(diào)節(jié)序列(包括該序列和獲得該序列的方法)的資料被引入本文)。
還公開了例如啟動(dòng)子和增強(qiáng)子的肺細(xì)胞調(diào)節(jié)序列，例如人類表面活性蛋白A2(SP-A2)的調(diào)節(jié)序列，例如該基因的從-296至+13的序列(SEQ ID NO19)(Young，PP，CR Mendelson Am.J.Physiol.271，L287-289，(1996)，其中至少關(guān)于肺細(xì)胞調(diào)節(jié)序列(該序列和獲得該序列的方法)的資料被引入本文)。
還公開了例如啟動(dòng)子和增強(qiáng)子的胰細(xì)胞調(diào)節(jié)序列，例如人類胰島素基因的調(diào)節(jié)序列，例如該基因的從-279開始的序列(SEQ ID NO20)(Boam，DS，et al.J.Biol.Chem.265，8285-8296，(1990)，其中至少關(guān)于胰細(xì)胞調(diào)節(jié)序列(包括該序列和獲得該序列的方法)的資料被引入本文)。
還公開了例如啟動(dòng)子和增強(qiáng)子的骨骼肌調(diào)節(jié)序列，例如人類快骨骼肌肌鈣蛋白C基因的調(diào)節(jié)序列，例如該基因的從-978至+1的序列(SEQID MO21)(Gahlmann，R，L.Kedes J.Biol.Chem.265，12520-12528，(1990)，其中至少關(guān)于骨骼肌調(diào)節(jié)序列(包括該序列和獲得該序列的方法)的資料被引入本文)。
還公開了含有自殺基因的核酸，例如本文所公開的那些，其中例如該基因被開啟則會(huì)殺死細(xì)胞，例如這些基因可在其表達(dá)上被調(diào)節(jié)。例如自殺基因也可包括在cre-lox重組位點(diǎn)內(nèi)，這樣在發(fā)生如本文所公開的轉(zhuǎn)化后、在細(xì)胞或成組細(xì)胞已在轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中選擇性生長(zhǎng)后，轉(zhuǎn)化性基因?qū)⒈恢亟M酶例如Cre切除，自殺基因也將被切除。然后在含開啟自殺基因的適宜條件的非轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中，只允許發(fā)生了重組的那些細(xì)胞存活。使用標(biāo)記的此種結(jié)果有許多變化形式和組合，存在的本文公開的組合物和方法的組合也有多種。
(2)病毒啟動(dòng)子和增強(qiáng)子來(lái)自哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞內(nèi)載體的、控制轉(zhuǎn)錄的優(yōu)選啟動(dòng)子可從各種來(lái)源獲得，例如病毒基因組，例如多瘤(病毒)、猿猴病毒40(SV40)、腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、乙型肝炎病毒和最優(yōu)選的巨細(xì)胞病毒；或者來(lái)自異源哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子例如β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子。SV40病毒的早期和晚期啟動(dòng)子可作為SV40限制性片段方便地獲得，該區(qū)段還含有SV40的病毒復(fù)制起點(diǎn)(Fiers et al.，Nature，273113(1978))。人類巨細(xì)胞病毒的即時(shí)早期啟動(dòng)子作為HindIIIE限制性片段方便地獲得(Greenway，P.J.et al.，Gene18355-360(1982))。當(dāng)然，來(lái)自宿主細(xì)胞或相關(guān)物種的啟動(dòng)子在本文中也是可用的。
增強(qiáng)子通常是指在距轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的非固定距離起作用的DNA序列，它可以從5’端(Laimins，L.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.78993(1981))或從3’端(Lusky，M.L.，et al.，Mol.Cell Bio.31108(1983)))至轉(zhuǎn)錄單位。此外，增強(qiáng)子可在內(nèi)含子內(nèi)(Banerji，J.L.etal.，Cell33729(1983))以及編碼序列自身內(nèi)(Osborne，T.F.，etal.，Mol.Cell Bio.41293(1984))。它們通常長(zhǎng)度在10至300bp間，并以順式方式起作用。增強(qiáng)子起到增強(qiáng)源自鄰近啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄的作用。增強(qiáng)子常含有介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的反應(yīng)元件。啟動(dòng)子也可以含有介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的反應(yīng)元件。增強(qiáng)子?？蓻Q定基因表達(dá)的調(diào)節(jié)。已經(jīng)由哺乳動(dòng)物的基因(珠蛋白、彈性蛋白酶、清蛋白、α-胎兒球蛋白和胰島素)得知了許多增強(qiáng)子序列，通常人們會(huì)使用來(lái)自真核細(xì)胞病毒的增強(qiáng)子用于一般表達(dá)。優(yōu)選的實(shí)例為在復(fù)制起點(diǎn)后側(cè)(late side)的SV40增強(qiáng)子(bp 100-270)、巨細(xì)胞病毒早期啟動(dòng)子增強(qiáng)子、復(fù)制起點(diǎn)后側(cè)的多瘤增強(qiáng)子和腺病毒增強(qiáng)子。
啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子可特異地被觸發(fā)它們功能的光或特異性的化學(xué)事件激活。系統(tǒng)可被例如四環(huán)素和地塞米松等的試劑所調(diào)節(jié)。還有通過暴露于輻射例如γ射線，或者通過烷基化化療藥物來(lái)增強(qiáng)病毒載體基因表達(dá)的方法。
啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子區(qū)域可作為組成性啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子起作用，以使待轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄單位區(qū)域的表達(dá)最大化。在某些構(gòu)建體中，啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子區(qū)域在所有真核細(xì)胞類型中應(yīng)均具有活性，即使它只在特定的細(xì)胞類型中、在特定的時(shí)間表達(dá)。此類型的一種優(yōu)選的啟動(dòng)子為CMV啟動(dòng)子(650個(gè)堿基)。其他優(yōu)選的啟動(dòng)子為SV40啟動(dòng)子、巨細(xì)胞病毒(全長(zhǎng)啟動(dòng)子)和逆轉(zhuǎn)錄載體LTF。
已表明，所有特異性調(diào)節(jié)元件均可被克隆，并可用于構(gòu)建在特異的細(xì)胞類型例如黑素瘤細(xì)胞中選擇性表達(dá)的表達(dá)載體。膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)啟動(dòng)子已用于在膠質(zhì)源細(xì)胞中選擇性表達(dá)基因。
用于真核宿主細(xì)胞(酵母、真菌、昆蟲、植物、動(dòng)物、人或有核細(xì)胞)的表達(dá)載體還可含有影響mRNA表達(dá)的轉(zhuǎn)錄終止所必需的序列。這些區(qū)域作為在編碼組織因子蛋白質(zhì)的mRNA的非翻譯部分中的多聚腺苷酸區(qū)段轉(zhuǎn)錄。3’端非翻譯區(qū)還包括轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)。優(yōu)選地，轉(zhuǎn)錄單位也含有多聚腺苷酸化區(qū)域。該區(qū)域的一個(gè)好處是它增加了轉(zhuǎn)錄單位將如同mRNA一樣被處理和轉(zhuǎn)運(yùn)的可能性。在表達(dá)構(gòu)建體中的多聚腺苷酸化信號(hào)的識(shí)別和使用是很成熟的手段。優(yōu)選地，應(yīng)在轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體中使用同源多聚腺苷酸化信號(hào)。在某些轉(zhuǎn)錄單位中，多聚腺苷酸化區(qū)域來(lái)源于SV40早期多聚腺苷酸化信號(hào)，由大約400個(gè)堿基組成。另外優(yōu)選地，轉(zhuǎn)錄單位只含有其他標(biāo)準(zhǔn)序列或含有與上述序列組合的其他標(biāo)準(zhǔn)序列以改善源自構(gòu)建體的表達(dá)或改善構(gòu)建體的穩(wěn)定性。
(c)可逆轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化是使細(xì)胞喪失應(yīng)答正常調(diào)節(jié)其生長(zhǎng)的信號(hào)的能力的方法。它可采用喪失功能突變的形式，例如導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)抑制物例如PTEN的喪失，或者采用獲得功能突變的形式，由此基因變成的永久激活的，例如在許多RAS突變中發(fā)生的那樣。許多實(shí)驗(yàn)室已表明向正常細(xì)胞插入一個(gè)或多個(gè)這些轉(zhuǎn)化基因可解除對(duì)其生長(zhǎng)的通常限制并使其增殖(Downward，J.(2002)Nat.Rev.Cancer 3，11-22)?？赡孓D(zhuǎn)化在一種情形中激活轉(zhuǎn)化基因，然后在另一種情形下關(guān)閉該基因。有多種方式實(shí)現(xiàn)這種逆轉(zhuǎn)。
組織特異性啟動(dòng)子/增強(qiáng)子與可逆轉(zhuǎn)化基因的結(jié)合可從分化干細(xì)胞中鑒定和培養(yǎng)任意特異細(xì)胞類型。該系統(tǒng)提供了上述雙重優(yōu)點(diǎn)，因此具有通用性并可用于產(chǎn)生大量特異細(xì)胞類型。事實(shí)上，可建立永久的、克隆的或半純化的分化細(xì)胞系，該細(xì)胞系可被表征和冷凍。逆轉(zhuǎn)后全部細(xì)胞群體均回復(fù)，由此提供了具有特征的、分化的、正常的細(xì)胞的無(wú)限來(lái)源。
(1)顯性負(fù)性逆轉(zhuǎn)許多轉(zhuǎn)化基因例如RAS具有另一已知的顯性負(fù)性突變。例如，顯性負(fù)性RAS掩蔽了RAS信號(hào)傳送中所必需的另一種蛋白質(zhì)RAF，這樣RAS信號(hào)傳導(dǎo)就被關(guān)閉了(Fiordalisi，(2002)J Biol Chem..29，10813-23)。使用這類激活的/顯性負(fù)性基因?qū)μ峁┮粋€(gè)可逆系統(tǒng)。這類基因?qū)鏡AS、SRC和p53都是已知的(Barone and Cowtneidge，(1995)Nature.1995 Nov 30；378(6556)509-12；Willis A，et al.，Oncogene.2004 Mar 25；23(13)2330-8)。
(2)溫度敏感突變體逆轉(zhuǎn)另一種實(shí)現(xiàn)可逆轉(zhuǎn)化的機(jī)制是使用溫度敏感性突變體實(shí)現(xiàn)(Jat，PS，et al.，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.88，5096-5100)。溫度敏感(ts)蛋白在許可溫度下是穩(wěn)定的，但在限制性溫度下不穩(wěn)定。T抗原(TAg)是熟知的SV40病毒轉(zhuǎn)化基因，它具有多個(gè)ts突變體。當(dāng)tsTAg被插入至正常細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞在32℃為轉(zhuǎn)化性的并且增殖，但在39℃被抑制并回復(fù)為正常細(xì)胞。幾個(gè)這類溫度敏感性突變體例如SV40T抗原和逆轉(zhuǎn)錄病毒E1A都是已知的(Fahnestock，ML，Lewis，JB.(1989)J.Virol.63，2348-2351)。
(3)重組酶逆轉(zhuǎn)可逆轉(zhuǎn)化的第三種機(jī)制實(shí)際上是可逆地插入轉(zhuǎn)化基因。Cre/lox和flp/frt是用于可逆插入的兩種這樣的機(jī)制(Sauer.B.(2002)Endocrine 19，221-228；Schaft，J，et al.，(2001)Genesis 31，6-10)。如果將基因轉(zhuǎn)染至每個(gè)末端被lox重組位點(diǎn)加帽的靶細(xì)胞，那么用CRE重組酶對(duì)細(xì)胞的處理將切除所插入的序列，只剩下僅有的lox序列。同樣，如果將基因轉(zhuǎn)染至每個(gè)末端被frt加帽的靶細(xì)胞，那么使用flp的處理將切除所插入的序列，只剩下flp系列。
公開的組合物包括含一種或多種本文公開的序列的細(xì)胞，例如包含胰島素啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)化基因的細(xì)胞，例如包含重組酶序列的純化的或半純化的或克隆的細(xì)胞群體，所述重組酶序列例如在發(fā)生重組后仍保留的lox或flp序列，例如，其中該細(xì)胞是先前的含有本文所公開的一種或多種核酸的細(xì)胞。
5.通過公開的方法和組合物產(chǎn)生的細(xì)胞成人人體產(chǎn)生許多不同的細(xì)胞類型。關(guān)于人類的細(xì)胞類型的信息可從下述網(wǎng)站獲得http//encyclopedia.Thefreedictionary.com/List％20of％20distinct％20cell％20types％20in％20the％20adult％20human％20body。這些不同的細(xì)胞類型包括但不限于，角化上皮細(xì)胞、濕復(fù)層屏障上皮細(xì)胞(Wet Stratified Barrier Epithelial Cell)、外分泌上皮細(xì)胞、激素分泌細(xì)胞、上皮吸收細(xì)胞(消化道、外分泌腺和尿生殖道)、代謝和儲(chǔ)存細(xì)胞、屏障功能細(xì)胞(肺、消化道、外分泌腺和尿生殖道)、閉合內(nèi)部體腔被覆上皮細(xì)胞(Epithelial Cells LiningClosed Internal Body Cavities)、具有推進(jìn)功能的纖毛細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)分泌細(xì)胞、收縮性細(xì)胞、血液和免疫系統(tǒng)細(xì)胞、感覺傳導(dǎo)細(xì)胞、自主神經(jīng)細(xì)胞、感覺器官和外周神經(jīng)元支持細(xì)胞、中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、晶狀體細(xì)胞、色素細(xì)胞、生殖細(xì)胞和撫育細(xì)胞。還包括本文公開細(xì)胞的任何干細(xì)胞和祖細(xì)胞以及它們所導(dǎo)致的細(xì)胞。本文公開的方法中產(chǎn)生的目的細(xì)胞可參考這類細(xì)胞的一個(gè)或多個(gè)特征來(lái)鑒定。這些特征中有許多是已知的，有一些特征在本文中有述。
細(xì)胞類型基于組織學(xué)研究的一般估計(jì)，在成人體內(nèi)大約有200個(gè)不同種類的表現(xiàn)出不同結(jié)構(gòu)和功能的細(xì)胞(David S.Goodsell，The Machineryof Life，Springer-Verlag，New York，1993；Bruce Alberts，DennisBray，Julian Lewis，Martin Raff，Keith Roberts，James D.Watson，The Molecular Biology of the Cell，Second Edition，GarlandPublishing，Inc.，New York，1989；Arthur J.Vander，James H.Sherman，Dorothy S.Luciano，Human PhysiologyThe Mechanismsof Body Function，F(xiàn)ifth Edition，McGraw-Hill Publishing Company，New York，1990)。這些代表著特征顯著不同的細(xì)胞類型的離散類別，而不是根據(jù)形態(tài)學(xué)的連續(xù)系的任意細(xì)分。傳統(tǒng)的分類是基于顯微形態(tài)和結(jié)構(gòu)，以及基于粗略的化學(xué)性質(zhì)(例如對(duì)不同的染料的親合性)，但更新的免疫技術(shù)已揭示例如有10種以上不同類型的淋巴細(xì)胞。藥理學(xué)和生理學(xué)檢測(cè)揭示了有多種不同的平滑肌細(xì)胞變種——例如子宮壁平滑肌細(xì)胞對(duì)雌激素和(在妊娠晚期的)催產(chǎn)素高度敏感，而腸壁平滑肌細(xì)胞則不敏感。
人體細(xì)胞包括角化上皮細(xì)胞、表皮角質(zhì)形成細(xì)胞(分化表皮細(xì)胞)、表皮基細(xì)胞(干細(xì)胞)、指甲和趾甲角質(zhì)形成細(xì)胞、甲床基細(xì)胞(干細(xì)胞)、髓毛干細(xì)胞、皮質(zhì)毛干細(xì)胞、表皮毛干細(xì)胞、表皮毛根鞘細(xì)胞、赫胥黎層毛根鞘細(xì)胞、亨勒層毛根鞘細(xì)胞、外毛根鞘細(xì)胞、毛母質(zhì)細(xì)胞(干細(xì)胞)、濕復(fù)層屏障上皮細(xì)胞、角膜、舌、口腔、食管、肛管、遠(yuǎn)端尿道和陰道的復(fù)層扁平上皮的表面上皮細(xì)胞、角膜、舌、口腔、食管、肛管、遠(yuǎn)端尿道和陰道的上皮基細(xì)胞(干細(xì)胞)、尿上皮細(xì)胞(被覆膀胱和尿道)、外分泌上皮細(xì)胞、唾液腺粘液細(xì)胞(富含多糖的分泌)、唾液腺漿液細(xì)胞(富含糖蛋白酶的分泌)、舌的馮·埃布納腺細(xì)胞(清洗味蕾)、乳腺細(xì)胞(分泌乳)、淚腺細(xì)胞(分泌淚)、耳的盯聹腺(分泌蠟)、外泌汗腺暗細(xì)胞(分泌糖蛋白)、外泌汗腺明細(xì)胞(分泌小分子)、頂泌汗腺細(xì)胞(有氣味的分泌，性腺激素敏感性)、眼瞼睫毛腺細(xì)胞(特殊汗腺)、皮脂腺細(xì)胞(富含脂質(zhì)的皮質(zhì)分泌)、鼻嗅腺細(xì)胞(清洗嗅覺上皮)、十二指腸內(nèi)十二指腸腺細(xì)胞(酶和堿性粘液)、精囊細(xì)胞(分泌精液成分，包括用于精子泳動(dòng)的果糖)、前列腺細(xì)胞(分泌精液成分)、尿道球腺細(xì)胞(分泌粘液)、巴多林腺細(xì)胞(分泌陰道潤(rùn)滑液)、尿道腺細(xì)胞(分泌粘液)、子宮內(nèi)膜細(xì)胞(分泌糖類)、呼吸道和消化道的離體杯形細(xì)胞(分泌粘液)、胃被覆粘液細(xì)胞(分泌粘液)、胃腺產(chǎn)酶細(xì)胞(分泌胃蛋白酶原)、胃腺泌酸細(xì)胞(分泌鹽酸)、胰腺腺泡細(xì)胞(分泌碳酸氫鹽和消化酶)、小腸帕內(nèi)特細(xì)胞(分泌溶菌酶)、肺II型肺細(xì)胞(分泌表面活性物質(zhì))、肺克拉拉細(xì)胞、激素分泌細(xì)胞、分泌生長(zhǎng)激素的垂體前葉細(xì)胞、分泌促卵泡激素的垂體前葉細(xì)胞、分泌黃體生成素的垂體前葉細(xì)胞、分泌促乳素的垂體前葉細(xì)胞、分泌促腎上腺皮質(zhì)激素的垂體前葉細(xì)胞、分泌促甲狀腺激素的垂體前葉細(xì)胞、分泌促黑色素細(xì)胞激素的垂體中葉細(xì)胞、分泌催產(chǎn)素的垂體后葉細(xì)胞、分泌血管升壓素的垂體后葉細(xì)胞、分泌5-羥色胺的消化道和呼吸道細(xì)胞、分泌內(nèi)啡肽的消化道和呼吸道細(xì)胞、分泌促生長(zhǎng)素抑制素的消化道和呼吸道細(xì)胞、分泌胃泌素的消化道和呼吸道細(xì)胞、分泌胰泌素的消化道和呼吸道細(xì)胞、分泌膽囊收縮素的消化道和呼吸道細(xì)胞、分泌胰島素的消化道和呼吸道細(xì)胞、分泌胰高血糖素的消化道和呼吸道細(xì)胞、分泌鈴蟾肽的消化道和呼吸道細(xì)胞、分泌甲狀腺激素的甲狀腺細(xì)胞、分泌降鈣素的甲狀腺細(xì)胞、分泌甲狀旁腺素的甲狀旁腺細(xì)胞、甲狀旁腺嗜酸性細(xì)胞、分泌腎上腺素的腎上腺細(xì)胞、分泌去甲腎上腺素的腎上腺細(xì)胞、分泌類固醇激素(鹽皮質(zhì)激素和糖皮質(zhì)激素)的腎上腺細(xì)胞、分泌睪酮的間質(zhì)細(xì)胞、分泌雌激素的卵泡的卵泡膜細(xì)胞、分泌孕酮的裂卵泡黃體細(xì)胞、腎小球旁器細(xì)胞(分泌腎素)、腎致密斑細(xì)胞、腎極周細(xì)胞、腎系膜細(xì)胞、上皮吸收細(xì)胞(消化道、外分泌腺和尿生殖道)、腸刷狀緣細(xì)胞(帶微絨毛)、外分泌腺分泌管細(xì)胞、膽囊上皮細(xì)胞、腎近端小管刷狀緣細(xì)胞、腎遠(yuǎn)端小管細(xì)胞、輸精小管無(wú)纖毛細(xì)胞、附睪主細(xì)胞、附睪基細(xì)胞、代謝和儲(chǔ)存細(xì)胞、肝細(xì)胞(肝臟細(xì)胞)、白脂肪細(xì)胞、褐色脂肪細(xì)胞、肝脂細(xì)胞、屏障功能細(xì)胞(肺、消化道、外分泌腺和尿生殖道)、I型肺細(xì)胞(肺的襯里氣室(lining air space))、胰導(dǎo)管細(xì)胞(泡心細(xì)胞)、非復(fù)層導(dǎo)管細(xì)胞(汗腺的、唾液腺的、乳腺的等)、腎小球壁細(xì)胞、腎小球足細(xì)胞、亨利氏袢細(xì)段細(xì)胞(腎)、腎集合管細(xì)胞、導(dǎo)管細(xì)胞(精囊的、前列腺的等)、閉合內(nèi)部體腔被覆上皮細(xì)胞、血管和淋巴管內(nèi)皮有孔細(xì)胞、血管和淋巴管內(nèi)皮連續(xù)細(xì)胞、血管和淋巴管內(nèi)皮脾細(xì)胞、滑膜細(xì)胞(被覆關(guān)節(jié)腔、分泌透明質(zhì)酸)、漿膜細(xì)胞(被覆腹膜腔、胸膜腔和心包腔(或圍心腔))、扁平細(xì)胞(被覆耳的外淋巴隙)、扁平細(xì)胞(被覆耳的內(nèi)淋巴隙(endolymphatic space))、具有微絨毛的內(nèi)淋巴囊柱狀細(xì)胞(被覆耳的內(nèi)淋巴隙)、沒有微絨毛的內(nèi)淋巴囊柱狀細(xì)胞(被覆耳的內(nèi)淋巴隙)、暗細(xì)胞(被覆耳的內(nèi)淋巴隙)、前庭膜細(xì)胞(被覆耳的內(nèi)淋巴隙)、血管紋基細(xì)胞(被覆耳的內(nèi)淋巴隙)、血管紋緣細(xì)胞(被覆耳的內(nèi)淋巴隙)、克勞迪烏斯細(xì)胞(被覆耳的內(nèi)淋巴隙)、伯特歇爾細(xì)胞(被覆耳的內(nèi)淋巴隙)、脈絡(luò)叢細(xì)胞(分泌腦脊液)、軟膜蛛網(wǎng)膜扁平細(xì)胞、眼色素睫狀上皮細(xì)胞、眼非色素睫狀上皮細(xì)胞、角膜內(nèi)皮細(xì)胞、具有推進(jìn)功能的纖毛細(xì)胞、呼吸道纖毛細(xì)胞、輸卵管纖毛細(xì)胞(雌性)、子宮內(nèi)膜纖毛細(xì)胞(雌性)、睪丸網(wǎng)纖毛細(xì)胞(雄性)、輸精小管纖毛細(xì)胞(雄性)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)纖毛室管膜細(xì)胞(被覆腦室)、細(xì)胞外基質(zhì)分泌細(xì)胞、成釉質(zhì)細(xì)胞上皮細(xì)胞(分泌牙釉質(zhì))、耳前庭器官半月平面上皮細(xì)胞(分泌蛋白聚糖)、柯替器齒間上皮細(xì)胞(分泌包覆毛細(xì)胞的覆膜)、疏松結(jié)締組織成纖維細(xì)胞、角膜成纖維細(xì)胞、腱成纖維細(xì)胞、骨髓網(wǎng)狀組織成纖維細(xì)胞、其他(非上皮)成纖維細(xì)胞、毛細(xì)血管周細(xì)胞、椎間盤髓核細(xì)胞、成牙骨質(zhì)細(xì)胞/牙骨質(zhì)細(xì)胞(分泌齒根骨樣牙骨質(zhì))、成牙本質(zhì)細(xì)胞/牙細(xì)胞(odontocyte)(分泌牙本質(zhì))、透明軟骨軟骨細(xì)胞、纖維軟骨軟骨細(xì)胞、彈性軟骨軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞/骨細(xì)胞、骨原細(xì)胞(成骨細(xì)胞的干細(xì)胞)、眼玻璃體玻璃體細(xì)胞、耳的外淋巴隙星形細(xì)胞、收縮細(xì)胞(contractile cell)、紅骨骼肌細(xì)胞(慢)(Red skeletal muscle cell)、白骨骼肌細(xì)胞(快)(White skeletal muscle cell)、中間型骨骼肌細(xì)胞(Intermediateskeletal muscle cell)、肌梭-核袋細(xì)胞、肌梭-核鏈細(xì)胞、衛(wèi)星細(xì)胞(干細(xì)胞)、普通心肌細(xì)胞、結(jié)性心肌細(xì)胞(nodal heart muscle cell)、浦肯野纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞(各種類型)、虹膜肌上皮細(xì)胞、外分泌腺肌上皮細(xì)胞、血液和免疫系統(tǒng)細(xì)胞、紅細(xì)胞(紅血球)、巨核細(xì)胞、單核細(xì)胞、結(jié)締組織巨噬細(xì)胞(各種類型)、表皮朗格漢斯細(xì)胞、破骨細(xì)胞(骨中)、樹突細(xì)胞(淋巴組織中)、小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(中樞神經(jīng)系統(tǒng)中)、嗜中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、輔助性T淋巴細(xì)胞、抑制性T淋巴細(xì)胞、殺傷性T淋巴細(xì)胞、IgM B淋巴細(xì)胞、IgG B淋巴細(xì)胞、IgA B淋巴細(xì)胞、IgE B淋巴細(xì)胞、殺傷細(xì)胞、血液和免疫系統(tǒng)的干細(xì)胞和定向祖細(xì)胞(各種類型)、感覺傳導(dǎo)細(xì)胞、眼光感受器視桿細(xì)胞、眼光感受器藍(lán)色敏感視錐細(xì)胞、眼光感受器綠色敏感視錐細(xì)胞、眼光感受器紅色敏感視錐細(xì)胞、柯替器耳內(nèi)毛細(xì)胞、柯替器耳外毛細(xì)胞、耳前庭器官I型毛細(xì)胞(加速和重力)、耳前庭器官II型毛細(xì)胞(加速和重力)、I型味蕾細(xì)胞、嗅覺神經(jīng)元、嗅覺上皮基細(xì)胞(嗅覺神經(jīng)元的干細(xì)胞)、I型頸動(dòng)脈體細(xì)胞(血液pH感受器)、II型頸動(dòng)脈體細(xì)胞(血液pH感受器)、表皮梅克爾細(xì)胞(觸覺感受器)、觸覺敏感一級(jí)感覺神經(jīng)元(各種類型)、冷敏感一級(jí)感覺神經(jīng)元、熱敏感一級(jí)感覺神經(jīng)元、疼痛敏感一級(jí)感覺神經(jīng)元(各種類型)、本體感受一級(jí)感覺神經(jīng)元(各種類型)、自主神經(jīng)元細(xì)胞、膽堿能神經(jīng)細(xì)胞(各種類型)、腎上腺素能神經(jīng)細(xì)胞(各種類型)、肽能神經(jīng)細(xì)胞(各種類型)、感覺器官和外周神經(jīng)元支持細(xì)胞、柯替器內(nèi)柱細(xì)胞、柯替器外柱細(xì)胞、柯替器內(nèi)指細(xì)胞、柯替器外指細(xì)胞、柯替器邊緣細(xì)胞、柯替器漢森細(xì)胞、前庭器官支持細(xì)胞、I型味蕾支持細(xì)胞、嗅覺上皮支持細(xì)胞、神經(jīng)鞘細(xì)胞、衛(wèi)星細(xì)胞(將外周神經(jīng)細(xì)胞體包囊)、腸膠質(zhì)細(xì)胞、中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞(類型繁多，仍難于分類)、星形膠質(zhì)細(xì)胞(各種類型)、少突膠質(zhì)細(xì)胞、晶狀體細(xì)胞、前晶狀體上皮細(xì)胞、含晶體蛋白的晶狀體纖維細(xì)胞、色素細(xì)胞、黑色素細(xì)胞、視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞、生殖細(xì)胞、卵原細(xì)胞/卵母細(xì)胞、精母細(xì)胞、精原細(xì)胞(精母細(xì)胞的干細(xì)胞)、撫育細(xì)胞、卵泡細(xì)胞、支持細(xì)胞(睪丸)、胸腺上皮細(xì)胞。
按照細(xì)胞功能來(lái)組織該細(xì)胞列表，省略了平滑肌細(xì)胞、CNS中的各類神經(jīng)元、各種關(guān)聯(lián)的結(jié)締組織和成纖維細(xì)胞類型以及例如角質(zhì)形成細(xì)胞的成熟細(xì)胞的中間狀態(tài)的細(xì)分(只給出了干細(xì)胞和分化的細(xì)胞類型)。另外，該目錄表示的是成人的人類表型中所發(fā)現(xiàn)的約219個(gè)細(xì)胞種類的詳盡列舉(復(fù)雜性理論和種系發(fā)生的比較表明，對(duì)于具有約105個(gè)基因數(shù)(N基因)的人類而言，最多的細(xì)胞類型數(shù)為約N基因1/2，即370種細(xì)胞類型)(S.A.Kauffman，″Metabolic Stability and Epigenesis inRandomly Constructed Genetic Nets，″J.Theoret.Biol.22(1969)437-467；Stuart A.Kauffman，The Origins of OrderSelf-organization and Selection in Evolution，Oxford UniversityPress，New York，1993)。
細(xì)胞標(biāo)記已有一些用于區(qū)分以及鑒定細(xì)胞的鑒別特征。不同的細(xì)胞類型在大小、形態(tài)、密度上具有獨(dú)特性，并具有不同的細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞表面以及分泌性蛋白的表達(dá)狀況。所描述的標(biāo)記可用于鑒別和定義本文所提供的分化細(xì)胞。這些標(biāo)記可通過使用本技術(shù)領(lǐng)域已知的方法，使用本技術(shù)領(lǐng)域已知的抗體、探針、引物或其他這類靶向手段來(lái)評(píng)價(jià)。常規(guī)用于鑒別和區(qū)分分化細(xì)胞類型的標(biāo)記實(shí)例在表4中提供。
表4常用于鑒定和表征細(xì)胞類型的標(biāo)記





細(xì)胞表面抗原常用作標(biāo)記以鑒別和區(qū)分細(xì)胞。幾乎所有細(xì)胞均存在對(duì)于物種(異種型)、器官、組織或細(xì)胞類型的抗原特異性，——可能涉及多達(dá)約104種不同的抗原?？捎糜趨^(qū)分細(xì)胞類型的細(xì)胞表面抗原的實(shí)例在表5中提供。
表5人類細(xì)胞表面抗原

對(duì)于紅細(xì)胞而言，Rh、Kell、Duffy和Kidd血型系統(tǒng)中的抗原專一地存在于紅細(xì)胞的質(zhì)膜上，而在血漿中的血小板、淋巴細(xì)胞、粒細(xì)胞上，或者在例如唾液、乳汁或羊水等的身體分泌物中還未檢測(cè)到所述抗原(P.L.Mollison，C.P.Engelfriet，M.Contreras，BloodTransfusions in Clinical Medicine，Ninth Edition，BlackwellScientific，Oxford，1993)。因此該四抗原組中任何一員的檢測(cè)都為紅細(xì)胞鑒定確立了唯一的標(biāo)記。MNS和Lutheran抗原也只限于紅細(xì)胞，但有兩點(diǎn)例外GPA糖蛋白(MN活性)還存在于腎毛細(xì)血管內(nèi)皮(P.Hawkins，S.E.Anderson，J.L.McKenzie，K.McLoughlin，M.E.J.Beard，D.N.J.Hart，″Localization of MN Blood Group Antigens inKidney，″Transplant.Proc.17(1985)1697-1700)，以及，Lub樣糖蛋白出現(xiàn)于腎內(nèi)皮細(xì)胞和肝臟肝細(xì)胞上(D.J.Anstee，G.Mallinson，J·E·Yendle，et al.，″Evidence for the occurrence of Lub-activeglycoproteins in human erythrocytes，kidney，and liver，″International Congress ISBT-BBTS Book of Abstracts，1988，p.263)。與之截然不同的是ABH抗原存在于許多非RBC組織細(xì)胞上，例如腎和唾液腺(Ivan M.Roitt，Jonathan Brostoff，David K.Male，Immunology，Gower Medical Publishing，New York，1989)。在幼胚中，ABH可存在于除了中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的所有內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞上(Aron E.Szulman，″The ABH antigens in human tissues andsecretions during embryonal development，″J.Histochem.Cytochem.13(1965)752-754)。ABH、Lewis、I和P血型抗原存在于血小板和淋巴細(xì)胞，至少部分歸因于從血漿至細(xì)胞膜上的吸附。粒細(xì)胞具有I抗原，但無(wú)ABH(P.L.Mollison，C.P.Engelfriet，M.Contreras，Blood Transfusions in Clinical Medicine，NinthEdition，Blackwell Scientific，Oxford，1993)。
除了與身體組織共有的HLA抗原之外，血小板在其質(zhì)膜上還表達(dá)血小板特異性的同種異體抗原。目前有五種已被識(shí)別的已在分子水平上被定義的人類血小板同種異體抗原(HPA)系統(tǒng)。所給出的表型頻率是高加索人群的；非洲人群和亞洲人群的頻率可能有相當(dāng)大的變化。例如28％的高加索人的血小板上表達(dá)HPA-1b，而日本人群中只有4％。(Thomas J.Kunicki，Peter J.Newman，″The molecular immunologyof human platelet proteins，″Blood 80(1992)1386-1404)。
具有某種特定功能活性的淋巴細(xì)胞可通過各種其細(xì)胞表面呈現(xiàn)的分化標(biāo)記來(lái)區(qū)分。例如，所有成熟的T細(xì)胞表達(dá)一組名為CD3復(fù)合物的多肽鏈。輔助性T細(xì)胞還表達(dá)CD4糖蛋白，而細(xì)胞毒性T細(xì)胞和抑制性T細(xì)胞表達(dá)名為CD8的標(biāo)記(Wayne M.Becker，David W.Deamer，TheWorld of the Cell，Second Edition，Benjamin/Cummings PublishingCompany，Redwood City CA，1991)。因此CD3+CD4+CD8-表型可肯定地鑒定出輔助性T細(xì)胞，而檢測(cè)出CD3+CD4-CD8+可獨(dú)特地鑒定出細(xì)胞毒性T細(xì)胞或抑制性T細(xì)胞。所有B淋巴細(xì)胞在其表面表達(dá)免疫球蛋白(它們的抗原受體或Ig)，可基于這一點(diǎn)將其與T細(xì)胞區(qū)分開，例如如同Ig+II類MHC+。
淋巴細(xì)胞表面還呈現(xiàn)代表特異性基因產(chǎn)物的特殊標(biāo)記，該產(chǎn)物僅在細(xì)胞分化的特征時(shí)期表達(dá)。例如，I期B祖細(xì)胞呈現(xiàn)CD34+PhiLCD19-、II期呈現(xiàn)CD34+PhiL+CD19-、III期呈現(xiàn)CD34+PhiL+CD19+，最后在B前體期呈現(xiàn)CD34-PhiL+CD19+(Una Chen，″Chapter 33.LymphocyteEngineering，Its Status of Art and Its Future，″in Robert P.Lanza，Robert Langer，William L.Chick，eds.，Principles of TissueEngineering，R.G.Landes Company，Georgetown TX，1997，pp.527-561)。
白細(xì)胞具有嗜中性粒細(xì)胞特異性抗原和各種受體特異性的免疫球蛋白結(jié)合特異性。例如，單核細(xì)胞FcRI受體呈現(xiàn)測(cè)得的IgG1+++IgG2-IgG3+++IgG4+結(jié)合特異性，單核細(xì)胞FcRIII受體具有IgG1++IgG2-IgG3++IgG4-，嗜中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞的FcRII受體顯示IgG1+++IgG2+IgG3+++IgG4+。嗜中性粒細(xì)胞在其表面還具有β-葡聚糖受體(Vicki Glaser，″Carbohydrate-Based Drugs Move CLoser toMarket，″Genetic Engineering News，15 April 1998，pp.1，12，32，34)。
組織細(xì)胞也在其表面呈現(xiàn)特異性組別的區(qū)分標(biāo)記。甲狀腺微粒體-微絨毛抗原是甲狀腺所特有的(Ivan M.Roitt，Jonathan Brostoff，David K.Male，Immunology，Gower Medical Publishing，New York，1989)。膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)是一種星形膠質(zhì)細(xì)胞的免疫細(xì)胞化學(xué)標(biāo)記(Carlos Lois，Jose-Manuel Garcia-Verdugo，ArturoAlvarez-Buylla，″Chain Migration of Neuronal Precursors，″Science 271(16 February 1996)978-981)，突觸融合蛋白1A和1B為僅發(fā)現(xiàn)于神經(jīng)細(xì)胞質(zhì)膜的磷蛋白(Nicole Calakos，Mark K.Bennett，Karen E.Peterson，Richard H.Scheller，″Protein-ProteinInteractions Contributing to the Specificity of IntracellularVesicular Trafficking，″Science 263(25 February 1994)1146-1149)。α-胞襯蛋白是唾液腺細(xì)胞的器官特異性自身抗原標(biāo)記(NorioHaneji，Takanori Nakamura，Koji Takio，et al.，″Identificationof alpha-Fodrin as a Candidate Autoantigen in Primary Sjogren’sSyndrome，″Science 276(25 April 1997)604-60)。受精蛋白(ADAM家族的一員)存在于哺乳動(dòng)物精細(xì)胞的質(zhì)膜上(Tomas Martin，UlrikeObst，Julius Rebek Jr.，″Molecular Assembly and EncapsulationDirected by Hydrogen-Bonding Preferences and the Filling ofSpace，″Science 281(18 September 1998)1842-1845)。肝細(xì)胞呈現(xiàn)ALB+++GGT-CK19-以及連接蛋白32、運(yùn)鐵蛋白和主要尿蛋白(MUP)的表型標(biāo)記，而膽細(xì)胞呈現(xiàn)AFP-GGT+++CK19+++以及BD.1抗原、堿性磷酸酶和DPP4標(biāo)記(Lola M.Reid，″Chapter 31.Stem Cell/LineageBiology and Lineage-Dependent Extracellular Matrix ChemistryKeys to Tissue Engineering of Quiescent Tissues such as Liver，″in Robert P.Lanza，Robert Langer，William L.Chick，eds.，Principles of Tissue Engineering，R.G.Landes Company，Georgetown TX，1997，pp.481-514)。100KD的質(zhì)膜鳥苷三磷酸酶家族涉及披有網(wǎng)格蛋白的小泡轉(zhuǎn)運(yùn)，包括發(fā)動(dòng)蛋白I(僅在神經(jīng)元表達(dá))、發(fā)動(dòng)蛋白II(存在于所有組織)和發(fā)動(dòng)蛋白III(限于精巢、腦、肺)，每種至少有4個(gè)不同的同種型，發(fā)動(dòng)蛋白II還顯現(xiàn)于在高爾基體外側(cè)網(wǎng)絡(luò)中的細(xì)胞內(nèi)位置(Martin Schnorf，Ingo Potrykus，GuntherNeuhaus，″Microinjection TechniqueRoutine System forCharacterization of Microcapillaries by Bubble PressureMeasurement，″Experimental Cell Research 210(1994)260-267)。表6列舉了肝生成細(xì)胞(hepatopoietic cell)(例如成肝細(xì)胞(hepatoblast))和造血細(xì)胞(例如祖紅細(xì)胞)的多種獨(dú)特抗原標(biāo)記。
表6人類肝生成細(xì)胞和造血細(xì)胞的獨(dú)特抗原標(biāo)記

至1998年已發(fā)現(xiàn)細(xì)胞特異性細(xì)胞粘附分子的至少四個(gè)主要家族——免疫球蛋白(Ig)超家族(包括N-CAM和ICAM-1)、整聯(lián)蛋白超家族、鈣粘著蛋白家族和選擇蛋白家族(見下文)。
整聯(lián)蛋白是表達(dá)于多種細(xì)胞的約200KD的細(xì)胞表面粘附受體，大多細(xì)胞表達(dá)幾種整聯(lián)蛋白。多數(shù)整聯(lián)蛋白參與與細(xì)胞骨架基底的連接，這些整聯(lián)蛋白介導(dǎo)與細(xì)胞外基質(zhì)的細(xì)胞連接。細(xì)胞類型特異性的實(shí)例包括血小板特異性整聯(lián)蛋白(αIIbβ3)、白細(xì)胞特異性β2整聯(lián)蛋白、晚期激活(αLβ2)淋巴細(xì)胞抗原、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)軸突整聯(lián)蛋白(α6β1)和角質(zhì)形成細(xì)胞整聯(lián)蛋白(α5β1)(Richard O.Hynes，″IntegrinsVersatility，Modulation，and Signaling in Cell Adhesion，″Cell69(3 April 1992)11-25))。在1998年已經(jīng)知道至少20種不同的異源二聚體整聯(lián)蛋白受體。
723-748殘基跨膜蛋白質(zhì)的鈣粘著蛋白分子家族又提供了另一種細(xì)胞特異性的細(xì)胞-細(xì)胞粘附途徑(Masatoshi Takeichi，″CadherinsA molecular family important in selective cell-cell adhesion，″Ann.Rev.Biochem.59(1990)237-252)。鈣粘著蛋白與細(xì)胞骨架連接。傳統(tǒng)意義上的鈣粘著蛋白包括E-(上皮)鈣粘著蛋白、N-(神經(jīng)或A-CAM)鈣粘著蛋白和P-(胎盤)鈣粘著蛋白，但在1998年已經(jīng)知道該家族的至少12種不同的成員(Elizabeth J.Luna，Anne L.Hitt，″Cytoskeleton-Plasma Membrane Interactions，″Science 258(1992)955-964)。它們富集于(但不是只存在于)細(xì)胞間連接處的細(xì)胞表面，似乎對(duì)于維持多細(xì)胞體系構(gòu)架很關(guān)鍵。細(xì)胞優(yōu)選與表達(dá)相同鈣粘著蛋白類型的其他細(xì)胞粘附。肝臟肝細(xì)胞僅表達(dá)E-鈣粘著蛋白；肺間充質(zhì)細(xì)胞、視軸突和神經(jīng)上皮細(xì)胞僅表達(dá)N-鈣粘著蛋白；肺上皮細(xì)胞表達(dá)E-和P-鈣粘著蛋白。鈣粘著蛋白家族成員還以不同空間時(shí)間形式分布于胚胎中，當(dāng)細(xì)胞分化時(shí)，鈣粘著蛋白各類型的表達(dá)動(dòng)態(tài)地發(fā)生改變(Masatoshi Takeichi，″CadherinsA molecular familyimportant in selective cell-cell adhesion，″Ann.Rev.Biochem.59(1990)237-252)。
糖類在細(xì)胞識(shí)別中很關(guān)鍵。所有細(xì)胞都具有由糖蛋白和糖脂組成的很薄的糖包衣(多糖包被)，其中至1998年已鑒定了約3000個(gè)不同的基序。在細(xì)胞發(fā)育、分化或致病時(shí)，糖類細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)的全部組成部分特征性地發(fā)生改變。例如，當(dāng)胚胎恰恰發(fā)育到8至16個(gè)細(xì)胞的時(shí)期時(shí)，胚胎從一簇松散的細(xì)胞緊壓成平滑的球形，此時(shí)細(xì)胞表面會(huì)出現(xiàn)一種獨(dú)特的三糖(SSEA-1或Lex)。
理論上糖類基序比基于核苷酸或蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)更具有組合多樣性。核苷酸和氨基酸僅以一種方式互相連接，而寡糖和多糖中的單糖單位可在多個(gè)位點(diǎn)結(jié)合。因此兩個(gè)氨基酸僅形成兩個(gè)不同的二肽，而兩個(gè)相同的單糖可結(jié)合形成11個(gè)不同的二糖，因?yàn)槊總€(gè)單糖有6個(gè)碳，給予了每個(gè)單位6個(gè)不同的連接位點(diǎn)，從而總共有6+5＝11個(gè)可能的組合。四個(gè)不同的核苷酸僅形成24個(gè)不同的四核苷酸，但四個(gè)不同的單糖可形成35560個(gè)不同的四糖，包括許多帶有分支結(jié)構(gòu)的四糖(NathanSharon，Halina Lis，″Carbohydrates in Cell Recognition，″Scientific American 268(January 1993)82-89)。單獨(dú)的六糖可形成約1012種不同的結(jié)構(gòu)，相比之下，六肽僅有6.4×107種結(jié)構(gòu)；9-聚糖類有成摩爾的異構(gòu)體(Roger A.Laine.Glycobiology 4(1994)1-9)。
跨膜糖蛋白的CD44家族是介導(dǎo)ECM結(jié)合、細(xì)胞遷移和淋巴細(xì)胞歸巢的80-95KD的細(xì)胞粘附受體。CD44抗原顯示了多種細(xì)胞特異性和組織特異性的糖基化模式，每個(gè)細(xì)胞類型以其自身獨(dú)特的糖類結(jié)構(gòu)排列修飾CD44核心蛋白(Jayne Lesley，Robert Hyman，Paul W.Kincade，″CD44 and Its Interaction with Extracellular Matrix，″Advancesin Immunology 54(1993)271-335；Tod A.Brown，Todd Bouchard，TomSt.John，Elizabeth Wayner，William G.Carter，″HumanKeratinocytes Express a New CD44 Core Protein(CD44E)as aHeparin-Sulfate Intrinsic Membrane Proteoglycan with AdditionalExons，″J.Cell Biology l13(April 1991)207-221)。已在淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞和角質(zhì)化細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)了不同的CD44細(xì)胞表面分子。CD44在神經(jīng)系統(tǒng)的表達(dá)雖限于健康青年人的白質(zhì)(包括星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞)，但伴隨著年齡或疾病因素還會(huì)在灰質(zhì)出現(xiàn)(Jayne Lesley，Robert Hyman，Paul W.Kincade，″CD44and Its Interaction with Extracellular Matrix，″Advances inImmunology 54(1993)271-335)。一些組織為CD44陰性，包括肝臟肝細(xì)胞、腎管形上皮、心肌、精巢和皮膚的一部分。
約50KD細(xì)胞粘附受體糖蛋白分子的選擇蛋白家族(Ajit Varki，″Selectin ligands，″Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91(August1994)7390-7397；Masatoshi Takeichi，″CadherinsA molecularfamily important in selective cell-cell adhesion，″Ann.Rev.Biochem.59(1990)237-252)可識(shí)別多種細(xì)胞表面抗原糖類，并幫助白細(xì)胞定位于炎癥區(qū)域(白細(xì)胞運(yùn)輸)。選擇蛋白不與細(xì)胞骨架連接(Elizabeth J.Luna，Anne L.Hitt，″Cytoskeleton-Plasma MembraneInteractions，″Science 258(6 November 1992)955-964)。白細(xì)胞呈現(xiàn)L-選擇蛋白、血小板呈現(xiàn)P-選擇蛋白、內(nèi)皮細(xì)胞呈現(xiàn)E-選擇蛋白(以及L和P)的受體。被選擇蛋白識(shí)別的細(xì)胞特異性分子包括腫瘤粘蛋白寡糖(被L、P和E識(shí)別)、腦糖脂(P和L)、嗜中性粒細(xì)胞糖蛋白(E和P)、白細(xì)胞唾液酸糖蛋白(E和P)和內(nèi)皮蛋白聚糖(P和L)(Ajit Varki，(1994))。相關(guān)的MEL-14糖蛋白歸巢受體家族，可使白細(xì)胞向帶有“地址素”代碼的特異的淋巴組織歸巢，所述“地址素”為在腸派爾集合淋巴結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)、肺相關(guān)淋巴結(jié)、滑膜細(xì)胞和哺乳期乳腺內(nèi)皮的細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞特異性表面抗原。歸巢受體還可使一些淋巴細(xì)胞區(qū)分結(jié)腸和空腸(Ted A.Yednock，Steven D Rosen，“Lymphocyte Homing，”Advances in Immunology 44(1989)313-378；Lloyd M.Stoolman，″Adhesion Molecules Controlling LymphocyteMigration，″Cell 56(24 March 1989)907-910)。選擇蛋白相關(guān)的相互作用和化學(xué)引誘物受體和整聯(lián)蛋白-Ig一同調(diào)節(jié)白細(xì)胞連續(xù)外滲，為體內(nèi)的細(xì)胞位置確定了“三位區(qū)域碼”(Timothy A.Springer，″Traffic Signals on Endothelium for Lymphocyte Recirculation andLeukocyte Emigration，″Annu.Rev.Physiol.57(1995)827-872)。
最后，可根據(jù)細(xì)胞固有的跨膜細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白來(lái)將細(xì)胞分類。例如紅細(xì)胞膜含有血型糖蛋白C(約25KD，約3000個(gè)分子/平方微米)和3級(jí)離子交換劑(Band 3ion exchanger)(90-100KD，約10,000個(gè)分子/平方微米)(Elizabeth J.Luna，Anne L.Hitt，″Cytoskeleton-Plasma Membrane Interactions，″Science 258(6November 1992)955-964；M.J.Tanner，″The major integralproteins of the human red cell，″Baillieres Clin.Haematol.6(June 1993)333-356)；血小板膜包括GP Ib-IX糖蛋白復(fù)合物(186KD)；嗜中性粒細(xì)胞的細(xì)胞膜伸展性需要跨膜蛋白質(zhì)膜橋蛋白(17KD)；以及，橫紋肌細(xì)胞膜在跨膜抗肌萎縮蛋白-糖蛋白復(fù)合物的最外的部分含有特異性層粘連蛋白結(jié)合糖蛋白(156KD)(Elizabeth J.Luna，AnneL.Hitt，″Cytoskeleton-Plasma Membrane Interactions，″Science258(6 November 1992)955-964)。細(xì)胞表面還經(jīng)常出現(xiàn)多種糖類結(jié)合蛋白質(zhì)(凝集素)，這些蛋白質(zhì)可區(qū)分不同的單糖和寡糖(Nathan Sharon，Halina Lis，″Carbohydrates in Cell Recognition，″ScientificAmerican 268(January 1993)82-89)。細(xì)胞特異性凝集素包括肝細(xì)胞的半乳糖(去唾液酸糖蛋白)結(jié)合的和巖藻糖結(jié)合凝集素、成纖維細(xì)胞的甘露糖基-6-磷酸鹽(M6P)凝集素、肺泡巨噬細(xì)胞甘露糖基-N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合凝集素、尿路上皮細(xì)胞的艤糖半乳二糖(galabiose)結(jié)合凝集素以及心、腦和肺中的幾種半乳糖結(jié)合凝集素(Nathan Sharon，(1993)；Mark J.Poznansky，Rudolph L.Juliano，“BiologicalApproaches to the Controlled Delivery of DrugsA CriticalReview，″Pharmacological Reviews 36(1984)277-336；Karl-AndersKarlsson，″GlycobiologyA Growing Field for Drug Design，″Trendsin Pharmacological Sciences 12(July 1991)265-272；N.Sharon，H.Lis，″Lectins --proteins with a sweet toothfunctions incell recognition，″Essays Biochem.30(1995)59-75)。
以下及本文其他段落進(jìn)一步描述了在所公開的方法中產(chǎn)生的細(xì)胞類型。
(a)角質(zhì)化上皮細(xì)胞角質(zhì)化上皮細(xì)胞包括包含表皮角質(zhì)形成細(xì)胞(分化表皮細(xì)胞)。角質(zhì)形成細(xì)胞構(gòu)成了大約90％的表皮細(xì)胞。根據(jù)角質(zhì)形成細(xì)胞形態(tài)學(xué)，將表皮分為四層，包括基底層(在與真皮的連接處)、顆粒層、棘層和角質(zhì)層。通過角質(zhì)形成細(xì)胞的分化，角質(zhì)形成細(xì)胞在基底層開始它們的發(fā)育。它們向上推進(jìn)穿過表皮各層，進(jìn)行逐步分化至到達(dá)角質(zhì)層，在角質(zhì)層它們形成死亡的、平扁的、高度角質(zhì)化的細(xì)胞層，稱為鱗狀物。這一層形成了阻止外源物質(zhì)和傳染性物質(zhì)進(jìn)入人體的有效屏障，并使失水程度最小化。角質(zhì)化上皮細(xì)胞還包括上皮基細(xì)胞，上皮基細(xì)胞是上皮干細(xì)胞。角質(zhì)化上皮細(xì)胞還包括指甲和趾甲的角質(zhì)形成細(xì)胞、甲床基細(xì)胞(干細(xì)胞)、髓毛干細(xì)胞、皮質(zhì)毛干細(xì)胞、表皮毛干細(xì)胞、表皮毛根鞘細(xì)胞、赫胥黎層毛根鞘細(xì)胞、亨勒層毛根鞘細(xì)胞、外毛根鞘細(xì)胞和毛母質(zhì)細(xì)胞(干細(xì)胞)。還包括本文公開的細(xì)胞的任意干細(xì)胞和祖細(xì)胞以及它們所導(dǎo)致的細(xì)胞。
(b)濕復(fù)層屏障上皮細(xì)胞人類濕復(fù)層屏障上皮細(xì)胞包括角膜、舌、口腔、食管、肛管、遠(yuǎn)端尿道和陰道的復(fù)層扁平上皮的表面上皮細(xì)胞，以及角膜、舌、口腔、食管、肛管、遠(yuǎn)端尿道和陰道的上皮基細(xì)胞(干細(xì)胞)，以及尿上皮細(xì)胞(被覆膀胱和尿道)。還包括本文公開的細(xì)胞的任意干細(xì)胞和祖細(xì)胞以及它們所導(dǎo)致的細(xì)胞。
在動(dòng)物解剖學(xué)中，上皮是由上皮細(xì)胞組成的組織。該組織通常包覆身體的部分，如同細(xì)胞膜包覆細(xì)胞。它也用于形成腺體。人皮膚的最外層以及口和體腔粘膜由死亡的扁平上皮構(gòu)成。上皮細(xì)胞也被覆肺、胃腸道、生殖道和尿道的內(nèi)部，還構(gòu)成外分泌腺和內(nèi)分泌腺。還包括本文公開的細(xì)胞的任意干細(xì)胞和祖細(xì)胞以及它們所導(dǎo)致的細(xì)胞。
(c)外分泌上皮細(xì)胞外分泌上皮細(xì)胞包括唾液腺粘液細(xì)胞(產(chǎn)生富含多糖的分泌物)、唾液腺漿液細(xì)胞(富含糖蛋白酶的分泌)、舌的馮·埃布納腺細(xì)胞(清洗味蕾)、乳腺細(xì)胞(分泌乳)、淚腺細(xì)胞(分泌淚)和耳的盯聹腺(分泌蠟)、外泌汗腺暗細(xì)胞(分泌糖蛋白)、外泌汗腺明細(xì)胞(分泌小分子)、頂泌汗腺細(xì)胞(有氣味的分泌，性腺激素敏感性)、眼瞼睫毛腺細(xì)胞(特殊汗腺)、皮脂腺細(xì)胞(富含脂質(zhì)的皮質(zhì)分泌)、鼻嗅腺細(xì)胞、十二指腸內(nèi)十二指腸腺細(xì)胞(酶和堿性粘液)、精囊細(xì)胞(分泌精液成分)、前列腺細(xì)胞(分泌精液成分)、尿道球腺細(xì)胞(分泌粘液)、巴多林腺細(xì)胞(分泌陰道潤(rùn)滑液)、尿道腺細(xì)胞(分泌粘液)、子宮內(nèi)膜細(xì)胞(分泌糖類)、呼吸道和消化道的離體杯形細(xì)胞(分泌粘液)、胃被覆粘液細(xì)胞(分泌粘液)、胃腺產(chǎn)酶細(xì)胞(分泌胃蛋白酶原)、胃腺泌酸細(xì)胞(分泌鹽酸)、胰腺腺泡細(xì)胞(分泌碳酸氫鹽和消化酶)、小腸帕內(nèi)特細(xì)胞(分泌溶菌酶)、肺II型肺細(xì)胞(分泌表面活性物質(zhì))和肺克拉拉細(xì)胞。還包括本文公開的細(xì)胞的任意干細(xì)胞和祖細(xì)胞以及它們所導(dǎo)致的細(xì)胞。
(d)激素分泌細(xì)胞激素分泌細(xì)胞包括垂體前葉細(xì)胞；生長(zhǎng)激素細(xì)胞；垂體催乳素細(xì)胞；促甲狀腺素細(xì)胞(thyrotroph)；促性腺激素細(xì)胞(gonadotroph)；促皮質(zhì)激素細(xì)胞；垂體中葉細(xì)胞，分泌促黑色素細(xì)胞激素；大細(xì)胞性神經(jīng)分泌細(xì)胞，分泌催產(chǎn)素，分泌血管升壓素；消化道和呼吸道細(xì)胞，分泌5-羥色胺、內(nèi)啡肽、促生長(zhǎng)素抑制素、胃泌素、胰泌素、膽囊收縮素、胰島素、胰高血糖素、鈴蟾肽；甲狀腺細(xì)胞、甲狀腺上皮細(xì)胞、濾泡旁細(xì)胞；甲狀旁腺細(xì)胞；甲狀旁腺主細(xì)胞、嗜酸性細(xì)胞；腎上腺細(xì)胞、嗜鉻細(xì)胞，分泌類固醇激素(鹽皮質(zhì)激素和糖皮質(zhì)激素)；睪丸間質(zhì)細(xì)胞，分泌睪酮；卵泡膜內(nèi)層細(xì)胞，分泌雌激素；裂卵泡黃體細(xì)胞，分泌孕酮；腎小球旁器細(xì)胞(分泌腎素)；腎致密斑細(xì)胞；腎極周細(xì)胞和腎系膜細(xì)胞。還包括本文公開的細(xì)胞的任意干細(xì)胞和祖細(xì)胞以及它們所導(dǎo)致的細(xì)胞。
(e)上皮吸收細(xì)胞(消化道、外分泌腺和尿生殖道)上皮吸收細(xì)胞包括腸刷狀緣細(xì)胞(帶微絨毛)、外分泌腺分泌管細(xì)胞、膽囊上皮細(xì)胞、腎近端小管刷狀緣細(xì)胞、腎遠(yuǎn)端小管細(xì)胞、輸精小管無(wú)纖毛細(xì)胞、附睪主細(xì)胞和附睪基細(xì)胞。還包括本文公開的細(xì)胞的任意干細(xì)胞和祖細(xì)胞以及它們所導(dǎo)致的細(xì)胞。
(f)代謝和儲(chǔ)存細(xì)胞代謝和儲(chǔ)存細(xì)胞包括肝細(xì)胞(肝臟細(xì)胞)、白脂肪細(xì)胞、褐色脂肪細(xì)胞和肝脂細(xì)胞。還包括本文公開的細(xì)胞的任意干細(xì)胞和祖細(xì)胞以及它們所導(dǎo)致的細(xì)胞。
(g)屏障功能細(xì)胞(肺、消化道、外分泌腺和尿生殖道)屏障功能細(xì)胞包括I型肺細(xì)胞(肺的襯里氣室)、胰導(dǎo)管細(xì)胞(泡心細(xì)胞)、非復(fù)層導(dǎo)管細(xì)胞(汗腺的、唾液腺的、乳腺的等)、腎小球壁細(xì)胞、腎小球足細(xì)胞、亨利氏袢細(xì)段細(xì)胞(腎)、腎集合管細(xì)胞和導(dǎo)管細(xì)胞(精囊的、前列腺的等)。還包括本文公開的細(xì)胞的任意干細(xì)胞和祖細(xì)胞以及它們所導(dǎo)致的細(xì)胞。
(h)閉合內(nèi)部體腔被覆上皮細(xì)胞閉合內(nèi)部體腔被覆上皮細(xì)胞包括血管和淋巴管內(nèi)皮有窗細(xì)胞、血管和淋巴管內(nèi)皮連續(xù)細(xì)胞、血管和淋巴管內(nèi)皮脾細(xì)胞、滑膜細(xì)胞(被覆關(guān)節(jié)腔、分泌透明質(zhì)酸)、漿膜細(xì)胞(被覆腹膜腔、胸膜腔和心包腔)、扁平細(xì)胞(被覆耳的外淋巴隙)、扁平細(xì)胞(被覆耳的內(nèi)淋巴隙)、具有微絨毛的內(nèi)淋巴囊柱狀細(xì)胞(被覆耳的內(nèi)淋巴隙)、沒有微絨毛的內(nèi)淋巴囊柱狀細(xì)胞(被覆耳的內(nèi)淋巴隙)、暗細(xì)胞(被覆耳的內(nèi)淋巴隙)、前庭膜細(xì)胞(被覆耳的內(nèi)淋巴隙)、血管紋基細(xì)胞(被覆耳的內(nèi)淋巴隙)、血管紋緣細(xì)胞(被覆耳的內(nèi)淋巴隙)、克勞迪烏斯細(xì)胞(被覆耳的內(nèi)淋巴隙)、伯特歇爾細(xì)胞(被覆耳的內(nèi)淋巴隙)、脈絡(luò)叢細(xì)胞(分泌腦脊液)、軟膜蛛網(wǎng)膜扁平細(xì)胞、眼色素睫狀上皮細(xì)胞、眼非色素睫狀上皮細(xì)胞和角膜內(nèi)皮細(xì)胞。還包括本文公開的細(xì)胞的任意干細(xì)胞和祖細(xì)胞以及它們所導(dǎo)致的細(xì)胞。
(i)具有推進(jìn)功能的纖毛細(xì)胞具有推進(jìn)功能的纖毛細(xì)胞包括呼吸道纖毛細(xì)胞、輸卵管纖毛細(xì)胞(雌性)、子宮內(nèi)膜纖毛細(xì)胞(雌性)、睪丸網(wǎng)纖毛細(xì)胞(雄性)、輸精小管纖毛細(xì)胞(雄性)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)纖毛室管膜細(xì)胞(被覆腦室)。還包括本文公開的細(xì)胞的任意干細(xì)胞和祖細(xì)胞以及它們所導(dǎo)致的細(xì)胞。
(j)細(xì)胞外基質(zhì)分泌細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)分泌細(xì)胞包括成釉質(zhì)細(xì)胞上皮細(xì)胞(分泌牙釉質(zhì))、耳前庭器官半月平面上皮細(xì)胞(分泌蛋白聚糖)、柯替器齒間上皮細(xì)胞(分泌包覆毛細(xì)胞的覆膜)、疏松結(jié)締組織成纖維細(xì)胞、角膜成纖維細(xì)胞、腱成纖維細(xì)胞、骨髓網(wǎng)狀組織成纖維細(xì)胞、其他非上皮成纖維細(xì)胞、毛細(xì)血管周細(xì)胞、椎間盤髓核細(xì)胞、成牙骨質(zhì)細(xì)胞/牙骨質(zhì)細(xì)胞(分泌齒根骨樣牙骨質(zhì))、成牙本質(zhì)細(xì)胞/牙細(xì)胞(分泌牙本質(zhì))、透明軟骨軟骨細(xì)胞、纖維軟骨軟骨細(xì)胞、彈性軟骨軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞/骨細(xì)胞、骨原細(xì)胞(成骨細(xì)胞的干細(xì)胞)、眼玻璃體的玻璃體細(xì)胞和耳的外淋巴隙星形細(xì)胞。還包括本文公開的細(xì)胞的任意干細(xì)胞和祖細(xì)胞以及它們所導(dǎo)致的細(xì)胞。
(k)收縮細(xì)胞收縮細(xì)胞包括紅骨骼肌細(xì)胞(慢)、白骨骼肌細(xì)胞(快)、中間型骨骼肌細(xì)胞、肌梭核袋細(xì)胞、肌梭核鏈細(xì)胞、衛(wèi)星細(xì)胞(干細(xì)胞)、普通心肌細(xì)胞、結(jié)性心肌細(xì)胞、浦肯野纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞(各種類型)、虹膜肌上皮細(xì)胞和外分泌腺肌上皮細(xì)胞。還包括本文公開的細(xì)胞的任意干細(xì)胞和祖細(xì)胞以及它們所導(dǎo)致的細(xì)胞。
(l)血液和免疫系統(tǒng)細(xì)胞血液和免疫系統(tǒng)細(xì)胞包括紅細(xì)胞(紅血球)、巨核細(xì)胞(血小板前體)、單核細(xì)胞、結(jié)締組織巨噬細(xì)胞(各種類型)、表皮朗格漢斯細(xì)胞、破骨細(xì)胞(骨中)、樹突細(xì)胞(淋巴組織中)、小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(中樞神經(jīng)系統(tǒng)中)、嗜中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、輔助性T細(xì)胞、抑制性T細(xì)胞、細(xì)胞毒性T細(xì)胞、B細(xì)胞、天然殺傷細(xì)胞、網(wǎng)織紅細(xì)胞和血液和免疫系統(tǒng)的干細(xì)胞和定向祖細(xì)胞(各種類型)。還包括本文公開的細(xì)胞的任意干細(xì)胞和祖細(xì)胞以及它們所導(dǎo)致的細(xì)胞。
(m)感覺傳導(dǎo)細(xì)胞感覺傳導(dǎo)細(xì)胞包括眼光感受器視桿細(xì)胞、眼光感受器藍(lán)色敏感視錐細(xì)胞、眼光感受器綠色敏感視錐細(xì)胞、眼光感受器紅色敏感視錐細(xì)胞、柯替器耳內(nèi)毛細(xì)胞、柯替器耳外毛細(xì)胞、耳前庭器官I型毛細(xì)胞(加速和重力)、耳前庭器官II型毛細(xì)胞(加速和重力)、I型味蕾細(xì)胞、嗅感受器神經(jīng)元、嗅覺上皮基細(xì)胞(嗅覺神經(jīng)元的干細(xì)胞)、I型頸動(dòng)脈體細(xì)胞(血液pH感受器)、II型頸動(dòng)脈體細(xì)胞(血液pH感受器)、表皮梅克爾細(xì)胞(觸覺感受器)、觸覺敏感一級(jí)感覺神經(jīng)元(各種類型)、冷敏感一級(jí)感覺神經(jīng)元、熱敏感一級(jí)感覺神經(jīng)元、疼痛敏感一級(jí)感覺神經(jīng)元(各種類型)和本體感受一級(jí)感覺神經(jīng)元(各種類型)。還包括本文公開的細(xì)胞的任意干細(xì)胞和祖細(xì)胞以及它們所導(dǎo)致的細(xì)胞。
(n)自主神經(jīng)元細(xì)胞自主神經(jīng)細(xì)胞包括膽堿能神經(jīng)細(xì)胞(各種類型)、腎上腺素能神經(jīng)細(xì)胞(各種類型)和肽能神經(jīng)細(xì)胞(各種類型)。還包括本文公開的細(xì)胞的任意干細(xì)胞和祖細(xì)胞以及它們所導(dǎo)致的細(xì)胞。
(o)感覺器官和外周神經(jīng)元支持細(xì)胞感覺器官和外周神經(jīng)元支持細(xì)胞包括柯替器內(nèi)柱細(xì)胞、柯替器外柱細(xì)胞、柯替器內(nèi)指細(xì)胞、柯替器外指細(xì)胞、柯替器邊緣細(xì)胞、柯替器漢森細(xì)胞、前庭器官支持細(xì)胞、I型味蕾支持細(xì)胞、嗅覺上皮支持細(xì)胞、神經(jīng)鞘細(xì)胞、衛(wèi)星細(xì)胞(將外周神經(jīng)細(xì)胞體包囊)和腸膠質(zhì)細(xì)胞。還包括本文公開的細(xì)胞的任意干細(xì)胞和祖細(xì)胞以及它們所導(dǎo)致的細(xì)胞。
(p)中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞包括神經(jīng)元細(xì)胞(類型繁多)、星形膠質(zhì)細(xì)胞(各種類型)和少突膠質(zhì)細(xì)胞。還包括本文公開的細(xì)胞的任意干細(xì)胞和祖細(xì)胞以及它們所導(dǎo)致的細(xì)胞。
(q)晶狀體細(xì)胞晶狀體細(xì)胞前晶狀體上皮細(xì)胞和含晶體蛋白的晶狀體纖維細(xì)胞。還包括本文公開的細(xì)胞的任意干細(xì)胞和祖細(xì)胞以及它們所導(dǎo)致的細(xì)胞。
(r)色素細(xì)胞色素細(xì)胞包括黑色素細(xì)胞和視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞。還包括本文公開的細(xì)胞的任意干細(xì)胞和祖細(xì)胞以及它們所導(dǎo)致的細(xì)胞。
(s)生殖細(xì)胞生殖細(xì)胞包括卵原細(xì)胞/卵母細(xì)胞、精母細(xì)胞和精原細(xì)胞(精母細(xì)胞的干細(xì)胞)。還包括本文公開的細(xì)胞的任意干細(xì)胞和祖細(xì)胞以及它們所導(dǎo)致的細(xì)胞。
(t)撫育細(xì)胞撫育細(xì)胞包括卵泡細(xì)胞、支持細(xì)胞(睪丸)和胸腺上皮細(xì)胞。還包括本文公開的細(xì)胞的任意干細(xì)胞和祖細(xì)胞以及它們所導(dǎo)致的細(xì)胞。
6.用于組合物和方法的特征和技術(shù)(a)序列相似性應(yīng)當(dāng)理解，如本文所述，使用術(shù)語(yǔ)同源性和同一性意義是相同的，即指的是相似性。因此例如，如果詞語(yǔ)同源性的使用是用于兩個(gè)非天然序列之間，那么應(yīng)當(dāng)理解的是它并不一定表示這兩個(gè)序列間的進(jìn)化關(guān)系，而是著眼于它們的核酸序列間的相似性和相關(guān)性。用于確定兩個(gè)進(jìn)化上相關(guān)的分子間的同源性的許多方法常用于任意兩個(gè)或多個(gè)核酸和蛋白質(zhì)，以測(cè)量序列的相似性而不考慮它們是否是進(jìn)化上相關(guān)的。
總的來(lái)說，應(yīng)當(dāng)理解的是，定義本文所公開的基因和蛋白質(zhì)的任意已知變體和衍生物或可產(chǎn)生的變體和衍生物的一種方法，是通過根據(jù)與特異已知序列相比的同源性來(lái)定義該變體或衍生物。本文其他部分也論述了本文公開的具體序列的同一性。一般而言，本文所公開的基因和蛋白質(zhì)的變體通常與規(guī)定序列或天然序列相比具有至少約70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性。本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解如何確定兩個(gè)蛋白質(zhì)或核酸例如基因間的同源性。例如可在比對(duì)了兩個(gè)序列后計(jì)算同源性以便使該同源性為最高程度的同源性。
其他計(jì)算同源性的方法可通過公開的算法進(jìn)行。用于比較的最佳序列比對(duì)可通過Smith and Waterman Adv.Appl.Math.2482(1981)的局部同源性算法、通過Needleman and Wunsch，J.MoL Biol.48443(1970)的同源性比對(duì)算法、通過Pearson and Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.852444(1988)的查找相似性的方法、通過下列算法(Wisconsin Genetics軟件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，WI)的計(jì)算化工具或通過審查的方式來(lái)進(jìn)行。
通過例如Zuker，M.Science 24448-52，1989，Jaeger et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 867706-7710，1989，Jaeger et al.Methods Enzymol.183281-306，1989中公開的算法，可獲得核酸的相同類型的同源性，上述文獻(xiàn)中至少與核酸比對(duì)相關(guān)的資料通過引用的方式納入本文。應(yīng)當(dāng)理解通?？墒褂萌我夥椒ǎ谀承┣闆r下各種這些方法的結(jié)果可不同，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解如果使用至少一種上述方法發(fā)現(xiàn)了同一性，那么就可以說該序列具有所述的同一性并公開于本文。
例如，如本文所使用的，所述的具有與另一序列相比的特定百分比同源性的序列是指具有由上述任意一種或多種計(jì)算方法所計(jì)算出的所述同源性的序列。例如，如果使用Zuker計(jì)算方法，第一序列被計(jì)算為具有與第二序列相比的80％的同源性，即使按照其他任何計(jì)算方法計(jì)算出該第一序列與第二序列相比都不具有80％的同源性，那么，如本文所定義的，第一序列也仍具有與第二序列相比的80％的同源性。另一個(gè)實(shí)例，如果使用Zuker計(jì)算方法和Pearson和Lipman計(jì)算方法，第一序列被計(jì)算為具有與第二序列相比的80％的同源性，即使通過Smith和Waterman計(jì)算方法、Needleman和Wunsch計(jì)算方法、Jaeger計(jì)算方法或任意其他計(jì)算方法計(jì)算，第一序列不具有與第二序列相比的80％的同源性，那么，如本文所定義的，第一序列也仍具有與第二序列相比的80％的同源性。再一個(gè)實(shí)例，如果使用每一種計(jì)算方法，第一序列都被計(jì)算為具有與第二序列相比的80％的同源性(盡管實(shí)際上不同的計(jì)算方法常得到不同的計(jì)算的同源性百分比)，那么如本文所定義的，第一序列具有與第二序列相比的80％的同源性。
(b)雜交/選擇性雜交術(shù)語(yǔ)雜交通常意為至少兩種核酸分子例如引物或探針和基因間的序列驅(qū)動(dòng)的相互作用。序列驅(qū)動(dòng)的相互作用意為以核苷酸特異性的方式發(fā)生于兩種核苷酸或核苷酸類似物或核苷酸衍生物間的相互作用。例如G與C相互作用或者A與T相互作用即為序列驅(qū)動(dòng)的相互作用。通常序列驅(qū)動(dòng)的相互作用發(fā)生于核苷酸的沃森-克里克面或Hoogsteen面。兩種核酸的雜交受到本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的許多條件和參數(shù)的影響。例如鹽濃度、pH和反應(yīng)溫度均影響到兩種核酸分子是否會(huì)雜交。
兩種核酸分子間的選擇性雜交的參數(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。例如，選擇性雜交條件可被定義為嚴(yán)格雜交的條件。例如，雜交的嚴(yán)格性是通過雜交和/或洗滌步驟的溫度和鹽濃度共同控制的。例如實(shí)現(xiàn)選擇性雜交的雜交條件可包括在比Tm(解鏈溫度，在該溫度下一半的分子與其雜交配對(duì)的另一部分解離)低大約12-25℃的溫度下，在高離子強(qiáng)度溶液(6×SSC或6×SSPE)中雜交，然后在所選的溫度和鹽濃度的組合的條件下洗滌，此時(shí)洗滌溫度為比Tm低大約5℃至20℃。在初步實(shí)驗(yàn)中，可根據(jù)經(jīng)驗(yàn)容易地確定溫度和鹽濃度條件，在該實(shí)驗(yàn)中使固定在濾膜上的參照DNA的樣品與帶標(biāo)記的目的核酸雜交，然后在不同嚴(yán)格度的條件下洗滌。對(duì)于DNA-RNA雜交和RNA-RNA雜交而言雜交溫度通常較高一些。可使用如上所述的或本領(lǐng)域已知的(Sambrook et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual，2nd Ed.，Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York，1989；Kunkelet al.Methods Enzymol.1987154367，1987，上述文獻(xiàn)中至少與核酸雜交相關(guān)的資料通過引用的方式納入本文)條件以達(dá)到嚴(yán)格度。優(yōu)選的DNADNA雜交的嚴(yán)格條件可以是在約68℃(水溶液中)，在6×SSC或6×SSPE中雜交，之后在68℃洗滌。如果需要，當(dāng)所需的互補(bǔ)程度降低時(shí)，雜交的嚴(yán)格性可作相應(yīng)減小，并且還根據(jù)尋找可變性的任何區(qū)域中的G-C或A-T的豐富程度而定。同樣，如果需要，當(dāng)所需的同源性增大時(shí)，雜交和洗滌的嚴(yán)格性可作相應(yīng)增加，并且還根據(jù)需要高同源性的任何區(qū)域中的G-C或A-T的豐富程度而定，所有這些均為本領(lǐng)域已知。
另一種定義選擇性雜交的方法是通過著眼于一種核酸與其他核酸結(jié)合的量(百分比)。例如，選擇性雜交的條件可以為至少約60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的限量核酸與非限量核酸結(jié)合時(shí)的條件。通常非限量引物要過量例如10或100或1000倍。此種類型的測(cè)定可在限量引物和非限量引物均比它們的kd低例如10倍或100倍或1000倍時(shí)進(jìn)行，或者只是一種核酸分子為例如10倍或100倍或1000倍時(shí)進(jìn)行，或兩種核酸分子之一或兩者均在kd之上時(shí)的條件下進(jìn)行。
另一種定義選擇性雜交的方法是通過著眼于引物的百分比，所述引物是在需要雜交以促使所需的酶操作的條件下得到酶操作的引物。例如，選擇性雜交條件可以是至少約60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的引物在促使酶操作的條件下進(jìn)行酶操作時(shí)的條件，例如，如果酶操作是DNA延伸，那么選擇性雜交條件可以是至少約60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的引物分子被延伸時(shí)的條件。優(yōu)選的條件還包括廠商所建議的或本領(lǐng)域所指出的適于酶進(jìn)行操作的條件。
正如同源性一樣，應(yīng)當(dāng)理解本文公開的用于確定兩種核酸分子間的雜交水平的方法有許多種。應(yīng)當(dāng)理解這些方法和條件可提供不同百分比的兩種核酸分子間的雜交，但是除非另外指明，否則滿足任何方法的參數(shù)都是足夠的。例如，如果需要80％雜交并且只要在這些方法的任意一種中所要求的參數(shù)內(nèi)發(fā)生雜交，就認(rèn)為它在本文得到了公開。
應(yīng)當(dāng)理解，本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，如果組合物或方法滿足用于單獨(dú)或聯(lián)合確定雜交的這些標(biāo)準(zhǔn)的任意一條，那么它就是本文所公開的組合物或方法。
(c)核酸本文公開了基于核酸的多種分子，包括例如編碼例如Ras以及本文公開的任意其他蛋白質(zhì)的核酸，以及各種功能性核酸。所公開的核酸包括例如核苷酸、核苷酸類似物或核苷酸替代物。本文討論了這些分子及其他分子的非窮盡性實(shí)例。應(yīng)當(dāng)理解，例如當(dāng)載體在細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，表達(dá)的mRNA通常由A、C、G和U組成。同樣，應(yīng)當(dāng)理解，如果例如通過例如外源性送遞使反義分子導(dǎo)入細(xì)胞或細(xì)胞環(huán)境中，那么反義核酸分子由核苷酸類似物構(gòu)成是有利的，這樣可減少在細(xì)胞環(huán)境中反義核酸分子的降解。
(1)核苷酸和相關(guān)分子核苷酸是含有堿基部分、糖部分和磷酸部分的分子。核苷酸可通過它們的磷酸部分和糖部分形成核苷間鍵連接在一起。核苷酸的堿基部分可以是腺嘌呤-9-基(A)、胞嘧啶-1-基(C)、鳥嘌呤-9-基(G)、尿嘧啶-1-基(U)和胸腺嘧啶-1-基(T)。核苷酸的糖部分為核糖或脫氧核糖。核苷酸的磷酸部分為五價(jià)磷酸鹽。核苷酸的非限制實(shí)例可以是3’-AMP(3’-單磷酸腺苷)或5’-GMP(5’-單磷酸鳥苷)。
核苷酸類似物是含有對(duì)堿基、糖或磷酸部分的一些類型的修飾的核苷酸。在本領(lǐng)域內(nèi)對(duì)核苷酸的修飾是已熟知的，可包括例如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羥甲基胞嘧啶、黃嘌呤、次黃嘌呤和2-氨基腺嘌呤以及在糖或磷酸部分的修飾。
核苷酸替代物為具有與核苷酸相似的功能屬性的分子，但它不含磷酸部分，例如肽核酸(PNA)。核苷酸替代物是以沃森-克里克或Hoogsteen的方式識(shí)別核酸的分子，但它通過除磷酸部分以外的其他部分連接在一起。當(dāng)與適宜的靶核酸相互作用時(shí)，核苷酸替代物能夠符合雙螺旋類型的結(jié)構(gòu)。
還可能將其他類型的分子(綴合物)與核苷酸或核苷酸類似物連接以增強(qiáng)例如細(xì)胞的攝入。綴合物可與核苷酸或核苷酸類似物化學(xué)連接。這類綴合物包括但不限于脂質(zhì)部分例如膽固醇部分(Letsinger etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1989，86，6553-6556)。
沃森-克里克相互作用是與核苷酸或核苷酸類似物或核苷酸替代物的沃森-克里克面的至少一種相互作用。核苷酸、核苷酸類似物或核苷酸替代物的沃森-克里克面包括嘌呤堿基核苷酸、核苷酸類似物或核苷酸替代物的C2、N1和C6位置，和嘧啶堿基核苷酸、核苷酸類似物或核苷酸替代物的C2、N3、C4位置。
Hoogsteen相互作用是在核苷酸或核苷酸類似物的Hoogsteen面發(fā)生的相互作用，Hoogsteen面暴露在雙鏈DNA的大溝中。Hoogsteen面包括嘌呤核苷酸的C6位置的反應(yīng)基團(tuán)(NH2或O)和N7位置。
(2)序列與例如Ras以及公開于Genbank的本文公開的任意其他蛋白質(zhì)相關(guān)的序列有多種，這些序列和其他序列以及其中所含有個(gè)體子序列(subsequence)的序列通過引用的方式全部納入本文。
本文提供了多種序列，這些以及其他序列可在Genbank中在www.pubmed.gov.上找到。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道如何分辨序列的差異和區(qū)別，知道如何使與具體序列相關(guān)的組合物和方法適應(yīng)其他相關(guān)序列?？筛鶕?jù)本文所公開內(nèi)容給出的任意序列信息以及本領(lǐng)域所已知的任意序列信息來(lái)設(shè)計(jì)引物和探針。
(3)引物和探針?biāo)_的組合物包括引物和探針，它們能與本文所公開的基因相互作用。該引物可用于支持DNA擴(kuò)增反應(yīng)。通常引物可以序列特異性的方式被延伸。序列特異性方式的引物延伸包括其中與引物雜交或以其他方式連接的核酸分子的序列和/或組合物指導(dǎo)或影響引物延伸所產(chǎn)生的產(chǎn)物的組合物或序列的任意方法。因此，序列特異性方式的引物延伸包括但不限于，PCR、DNA序列測(cè)定、DNA延伸、DNA聚合、RNA轉(zhuǎn)錄或逆轉(zhuǎn)錄。優(yōu)選以序列特異性方式擴(kuò)增引物的技術(shù)和條件。引物可用于DNA擴(kuò)增反應(yīng)，例如PCR或直接測(cè)序。應(yīng)當(dāng)理解，還可使用非酶技術(shù)延伸引物，其中例如用于延伸引物的核苷酸或寡核苷酸為被修飾的，以使它們進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)從而以序列特異性方式延伸引物。通常所公開的引物與核酸或核酸區(qū)域雜交，或者它們與核酸的互補(bǔ)部分或核酸區(qū)域的互補(bǔ)部分雜交。
(4)功能性核酸功能性核酸是具有特異性功能例如結(jié)合靶分子或催化特異的反應(yīng)的核酸分子。功能性核酸可分為下述類別，但下述類別并不意在限制。例如，功能性核酸包括反義核酸、適體、核酶、三鏈形成分子(triplexforming molecule)、RNAi和外部指導(dǎo)序列。功能性核酸可作為靶分子所具有的特異活性的影響劑、抑制劑、調(diào)節(jié)劑和刺激劑起作用，或者功能性核酸可具有獨(dú)立于任何其他分子的新活性。
功能性核酸分子可與任何大分子例如DNA、RNA、多肽或糖鏈相互作用。因此功能性核酸可與Ras的mRNA或Ras的基因組DNA相互作用或者它們可與Ras多肽相互作用。功能性核酸常基于靶分子和功能性核酸分子間的序列同源性而被設(shè)計(jì)成可與其他核酸相互作用。在其他情形中，功能性核酸分子和靶分子的特異性識(shí)別并不是基于功能性核酸分子和靶分子的序列同源性，而是基于使得特異性識(shí)別發(fā)生的三級(jí)結(jié)構(gòu)的形成。
反義分子被設(shè)計(jì)成可通過規(guī)范或非規(guī)范堿基對(duì)與靶核酸分子相互作用。反義分子和靶分子的相互作用被設(shè)計(jì)為促使通過例如RNA酶H介導(dǎo)的RNA-DNA雜交體的降解的靶分子的破壞?；蛘撸戳x分子被設(shè)計(jì)為干擾正常發(fā)生于靶分子的加工功能，例如轉(zhuǎn)錄或復(fù)制?？苫诎蟹肿拥男蛄性O(shè)計(jì)反義分子。存在許多通過尋找靶分子的最易接近的區(qū)域來(lái)優(yōu)化反義效率的方法。示例性的方法可以是使用DMS和DEPC的體外選擇實(shí)驗(yàn)和DNA修飾研究。優(yōu)選地，反義分子結(jié)合靶分子的解離常數(shù)(kd)小于或等于10-6、10-8、10-10或10-12。有助于設(shè)計(jì)和使用反義分子的方法和技術(shù)的代表性范例可以在以下非窮盡性列舉的美國(guó)專利中得到5,135,917、5,294,533、5,627,158、5,641,754、5,691,317、5,780,607、5,786,138、5,849,903、5,856,103、5,919,772、5,955,590、5,990,088、5,994,320、5,998,602、6,005,095、6,007,995、6,013,522、6,017,898、6,018,042、6,025,198、6,033,910、6,040,296、6,046,004、6,046,319和6,057,437。
適體是與靶分子優(yōu)選以特異的方式相互作用的分子。通常，適體為折疊成確定的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)例如莖環(huán)或G-四聯(lián)體的、長(zhǎng)度為15-50個(gè)堿基的小核酸。適體可與小分子例如ATP(美國(guó)專利5,631,146)和茶堿(美國(guó)專利5,580,737)，以及大分子例如逆轉(zhuǎn)錄酶(美國(guó)專利5,786,462)和凝血酶(美國(guó)專利5,543,293)結(jié)合。適體可緊密地結(jié)合，其與靶分子解離的kds小于10-12M。優(yōu)選地，適體與靶分子結(jié)合的kd小于10-6、10-8、10-10或10-12。適體可以以很高程度的特異性與靶分子結(jié)合。例如，已分離出了與分子的僅單一位點(diǎn)上不同的靶分子和其他分子間的結(jié)合親和力差異大于10000倍的適體(5,543,293)。優(yōu)選地，適體與靶分子的kd比與背景結(jié)合分子的kd低至少10、100、1000、10,000或100,000倍。優(yōu)選地，例如當(dāng)進(jìn)行對(duì)多肽的比較時(shí)，背景分子是不同的多肽。例如，當(dāng)確定Ras適體的特異性時(shí)，背景蛋白質(zhì)可以是血清清蛋白。如何制備和使用適體以與多種不同的靶分子結(jié)合的代表性實(shí)例可在下述非窮盡列舉性列舉的美國(guó)專利中得到5,476,766、5,503,978、5,631,146、5,731,424、5,780,228、5,792,613、5,795,721、5,846,713、5,858,660、5,861,254、5,864,026、5,869,641、5,958,691、6,001,988、6,011,020、6,013,443、6,020,130、6,028,186、6,030,776和6,051,698。
核酶是可在分子內(nèi)或分子間催化化學(xué)反應(yīng)的核酸分子。因此核酶是催化性核酸。優(yōu)選地，核酶催化分子間反應(yīng)。有許多不同類型的核酶催化核酸酶或核酸聚合酶類型反應(yīng)，這類反應(yīng)基于天然系統(tǒng)中存在的核酶，例如錘頭狀核酶(例如但不限于下述美國(guó)專利5,334,711、5,436,330、5,616,466、5,633,133、5,646,020、5,652,094、5,712,384、5,770,715、5,856,463、5,861,288、5,891,683、5,891,684、5,985,621、5,989,908、5,998,193、5,998,203、Ludwig和Sproat的WO 9858058、Ludwig和Sproat的WO9858057和Ludwig和Sproat的WO9718312)、發(fā)夾型核酶(例如但不限于下述美國(guó)專利5,631,115、5,646,031、5,683,902、5,712,384、5,856,188、5,866,701、5,869,339和6,022,962)以及四膜蟲核酶(例如但不限于下述美國(guó)專利5,595,873和5,652,107)。還有許多在天然系統(tǒng)中不存在的核酶，但已被基因工程改造為可從頭催化特異反應(yīng)(例如但不限于下述美國(guó)專利5,580,967、5,688,670、5,807,718和5,910,408)。優(yōu)選的核酶裂解RNA或DNA底物，更優(yōu)選地裂解RNA底物。核酶通常通過識(shí)別和與靶底物的結(jié)合以及隨后裂解來(lái)裂解核酸底物。這種識(shí)別常大多基于規(guī)范或非規(guī)范堿基對(duì)相互作用。此性質(zhì)使得核酶成為核酸靶特異性裂解的特別優(yōu)良候選物，因?yàn)榘械孜锏淖R(shí)別基于靶底物序列。如何制備和使用核酶以催化多種不同的反應(yīng)的代表性實(shí)例可在下述非窮盡列舉的美國(guó)專利中得到5,646,042、5,693,535、5,731,295、5,811,300、5,837,855、5,869,253、5,877,021、5,877,022、5,972,699、5,972,704、5,989,906和6,017,756。
三鏈形成功能性核酸分子為可與雙鏈或單鏈核酸相互作用的分子。當(dāng)三鏈分子與靶區(qū)域相互作用時(shí)，形成被稱為三鏈體的結(jié)構(gòu)，其中有三條DNA鏈形成基于沃森-克里克和Hoogsteen堿基對(duì)的復(fù)合物。三鏈分子可以以高親和力和高特異性與靶區(qū)域結(jié)合，因此三鏈分子是優(yōu)選的。優(yōu)選地，三鏈形成分子結(jié)合靶分子的kd小于10-6、10-8、10-10或10-12。如何制備和使用三鏈形成分子以結(jié)合多種不同的靶分子的代表性實(shí)例可在下述非窮盡性美國(guó)專利中得到5,176,996、5,645,985、5,650,316、5,683,874、5,693,773、5,834,185、5,869,246、5,874,566和5,962,426。
外部指導(dǎo)序列(EGS)是與靶核酸結(jié)合形成復(fù)合物的分子，該復(fù)合物被裂解靶分子的RNA酶P識(shí)別。EGS可被設(shè)計(jì)為特異性靶向所選的RNA分子。RNA酶P有助于細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)移RNA(tRNA)的加工。通過使用導(dǎo)致靶RNA:EGS復(fù)合物模擬天然tRNA底物的EGS，可補(bǔ)充RNA酶P以實(shí)際上裂解任何RNA序列。(Yale的WO 92/03566和Forster and Altman，Science 238407-409(1990))類似地，真核EGS/RNA酶P指導(dǎo)的RNA裂解可被用于裂解真核細(xì)胞內(nèi)的所需靶標(biāo)。(Yuan et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA898006-8010(1992)；Yale的WO 93/22434；Yale的WO 95/24489；Yuan and Altman，EMBO J 14159-168(1995)和Carrara et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)922627-2631(1995)。)如何制備和使用EGS分子以促進(jìn)多種不同的靶分子裂解的代表性實(shí)例可在下述非窮盡列舉的美國(guó)專利中得到5,168,053、5,624,824、5,683,873、5,728,521、5,869,248和5,877,162。
還應(yīng)當(dāng)理解，所公開的核酸可用于RNAi或RNA干擾。RNAi被認(rèn)為包括RNA干擾(RNAi)的兩步機(jī)制起始步驟和效應(yīng)物步驟。例如，在第一步中，投入的雙鏈(ds)RNA(siRNA)被處理成小片段，例如21-23核苷酸‘指導(dǎo)序列’。RNA擴(kuò)增似乎能在整個(gè)的動(dòng)物體中發(fā)生。然后指導(dǎo)RNA通常可被摻入能降解RNA的蛋白質(zhì)RNA復(fù)合物即核酸酶復(fù)合物中，其已被稱作RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RISC)。此RISC復(fù)合物在第二個(gè)效應(yīng)物步驟中起到破壞由指導(dǎo)序列通過堿基對(duì)相互作用而識(shí)別的mRNA的作用。RNAi包括通過任何方式將雙鏈RNA導(dǎo)入之細(xì)胞中的作用，所述導(dǎo)入作用觸發(fā)導(dǎo)致靶RNA降解的事件。RNAi是一種轉(zhuǎn)錄后基因沉默的形式。所公開的RNA發(fā)夾可以在RNAi中起作用。關(guān)于制備和使用RNAi分子的描述可參見例如Hammond et al.，Nature Rev Gen 2110-119(2001)；Sharp，Genes Dev 15485-490(2001)，Waterhouse et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95(23)13959-13964(1998)，上述文獻(xiàn)中至少關(guān)于遞送和制備RNAi分子的資料或其全部?jī)?nèi)容通過引用的方式納入本文。
已有顯示RNAi在包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞在內(nèi)的許多細(xì)胞中均起作用。為了在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中起作用，優(yōu)選地，將被用作RISC復(fù)合物內(nèi)的引導(dǎo)序列的RNA分子更短一些。例如，長(zhǎng)度小于或等于50或40或30或29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11或10個(gè)核苷酸。這些RNA分子也可在3’或5’末端具有相對(duì)于待降解靶RNA的突出端。這些突出端可至少為或小于或等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。RNAi在哺乳動(dòng)物干細(xì)胞例如小鼠ES細(xì)胞中起作用。
(d)組合物向細(xì)胞的送遞可用于在體外或在體內(nèi)將核酸送遞至細(xì)胞的組合物和方法有許多種。這些方法和組合物可大致分成兩類基于病毒的送遞系統(tǒng)和非基于病毒的送遞系統(tǒng)。例如，核酸可通過許多直接送遞系統(tǒng)例如電穿孔、脂轉(zhuǎn)染、磷酸鈣沉淀、質(zhì)粒、病毒載體、病毒核酸、噬菌體核酸、噬菌體、粘粒，或者經(jīng)細(xì)胞或載體中的遺傳物質(zhì)例如陽(yáng)離子脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)移來(lái)進(jìn)行送遞。合適的轉(zhuǎn)染手段包括病毒載體、化學(xué)轉(zhuǎn)染子或者例如電穿孔和DNA直接擴(kuò)散等物理機(jī)械方法，所述合適的轉(zhuǎn)染手段描述于例如Wolff，J.A.，et al.，Science，247，1465-1468，(1990)和Wolff，J.A.Nature，352，815-818，(1991)。這類方法是本領(lǐng)域內(nèi)已知的，并可容易地適用于本文描述的組合物和方法。在某些情況中，該方法會(huì)被改變?yōu)樘貏e對(duì)于大DNA分子起作用。另外，通過使用載體的靶向特征，這些方法可用于靶向某些疾病和細(xì)胞群。
(1)基于核酸的送遞系統(tǒng)轉(zhuǎn)移載體可以是下述任何核苷酸構(gòu)建物，所述任何核苷酸構(gòu)建物用于將基因送遞至細(xì)胞(例如質(zhì)粒)，或者作為送遞基因的總策略的一部分，例如作為重組逆轉(zhuǎn)錄病毒或腺病毒的一部分(Ram et al.CancerRes.5383-88，(1993))。
本文所使用的質(zhì)?；虿《据d體是這樣的媒介，該媒介可將所公開的核酸例如表達(dá)Ras的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞而不發(fā)生降解，并包括使得基因在所送遞至的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的啟動(dòng)子。載體可來(lái)源于病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒。病毒載體例如腺病毒、腺伴隨病毒、皰疹病毒、痘苗病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、艾滋病病毒、神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)病毒(neuronal trophic virus)、新培斯病毒和其他RNA病毒，包括具有HIV骨架的這些病毒。任何具有使其適于用作載體的這些病毒的性質(zhì)的任何病毒科也是優(yōu)選的。逆轉(zhuǎn)錄病毒包括鼠馬羅尼白血病病毒(murine Maloney Leukemia virus)、MMLV和表現(xiàn)的MMLV作為載體所需特性的逆轉(zhuǎn)錄病毒。逆轉(zhuǎn)錄載體與其他病毒載體相比可攜帶較大的遺傳有效負(fù)載，即轉(zhuǎn)基因或標(biāo)記基因，由于此原因逆轉(zhuǎn)錄病毒為一種常用載體。然而，它們?cè)诜窃鲋臣?xì)胞中并不實(shí)用。腺病毒載體相對(duì)穩(wěn)定，易于操作，具有高滴度，而且可以氣溶膠形式送遞，可轉(zhuǎn)染不分裂的細(xì)胞。痘病毒載體較大并具有一些可以插入基因的位點(diǎn)，它們具有熱穩(wěn)定性并可在室溫下貯存?？墒褂靡驯换蚬こ谈脑斓妮d體，從而抑制由病毒抗原引發(fā)的宿主生物體的免疫反應(yīng)。這一類型的優(yōu)選載體將攜帶白細(xì)胞介素8或10的編碼區(qū)域。
與用化學(xué)或物理方法向細(xì)胞中導(dǎo)入基因相比，病毒載體可以具有較高的處理能力(導(dǎo)入基因的能力)。通常，病毒載體包括復(fù)制和殼體化所必需的非結(jié)構(gòu)性早期基因、結(jié)構(gòu)性晚期基因、RNA聚合酶III轉(zhuǎn)錄物、末端反向重復(fù)序列，以及控制病毒基因組的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的啟動(dòng)子。當(dāng)病毒被改造為載體時(shí)，通常移除一個(gè)或多個(gè)早期基因，并將基因或基因/啟動(dòng)子盒插入病毒基因組中以取代被移除的病毒DNA。此類型的構(gòu)建體可攜帶最多約8kb的外源遺傳物質(zhì)。被移除的早期基因的必要功能通常由已被改造以反式(in trans)表達(dá)早期基因產(chǎn)物的細(xì)胞系提供。
(a)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科的動(dòng)物病毒，包括任何型、亞科、屬或向性在內(nèi)。Verma，I.M.，Retroviral vectors for genetransfer In Microbiology-1985，American Society forMicrobiology，pp.229-232，Washington，(1985)總地描述了逆轉(zhuǎn)錄病毒，該文獻(xiàn)通過引用的方式納入本文。將逆轉(zhuǎn)錄病毒用于基因治療的方法的實(shí)例描述于美國(guó)專利4,868,116和4,980,286，PCT申請(qǐng)WO90/02806和WO89/07136，以及Mulligan，Science 260926-932(1993)中；這些文獻(xiàn)所教導(dǎo)的內(nèi)容通過引用的方式納入本文。
逆轉(zhuǎn)錄病毒本質(zhì)上是其中包裝有核酸負(fù)載的包(package)。核酸負(fù)載攜帶有包裝信號(hào)，它確保復(fù)制的子代分子被有效地包裝在包裝衣殼(package coat)內(nèi)。除包裝信號(hào)之外，還有許多在復(fù)制中以及在復(fù)制好的病毒的包裝中順式(in cis)所需的分子。通常逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組包括參與形成蛋白衣殼的gag、pol和env基因。gag、pol和env基因通常被要轉(zhuǎn)移至靶細(xì)胞的外源DNA所取代。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體通常包括用于納入包裝衣殼的包裝信號(hào)、對(duì)gag轉(zhuǎn)錄單位的起始發(fā)出信號(hào)的序列、包括逆轉(zhuǎn)錄中結(jié)合tRNA引物的引物結(jié)合位點(diǎn)在內(nèi)的逆轉(zhuǎn)錄必需元件、在DNA合成過程中指導(dǎo)RNA鏈交換(switch)的末端重復(fù)序列、作為DNA合成中第二鏈合成的引發(fā)位點(diǎn)的5’到3’LTR的富含嘌呤的序列、以及使得逆轉(zhuǎn)錄病毒的DNA態(tài)(DNA state)插入物能夠插入宿主基因組中的靠近LTR末端的特殊序列。gag、pol和env基因的移除使得約8kb的外源序列能夠插入病毒基因組，被逆轉(zhuǎn)錄，并在復(fù)制時(shí)被包裝入新的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒中。所述的核酸量對(duì)于送遞一個(gè)至多個(gè)基因是足夠的，這根據(jù)每個(gè)轉(zhuǎn)錄物的大小而定。優(yōu)選插入?yún)^(qū)段中包括陽(yáng)性或陰性選擇性標(biāo)記以及其他基因。
由于大部分逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中的復(fù)制工具和包裝蛋白都已經(jīng)被除去(gag、pol和env)，該載體通常通過將其置于包裝細(xì)胞系來(lái)產(chǎn)生。包裝細(xì)胞系是已用含有復(fù)制和包裝工具但是沒有任何包裝信號(hào)的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系。當(dāng)攜帶所選DNA的載體轉(zhuǎn)染到所述細(xì)胞系中時(shí)，借助輔助細(xì)胞以順式形式提供的工具，含有目的基因的載體可被復(fù)制并被包裝成新的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒。用作工具的基因組不被包裝，因?yàn)樗鼈內(nèi)鄙俦匦璧男盘?hào)。
(b)腺病毒載體復(fù)制缺陷型腺病毒的構(gòu)建物已有所描述(Berkner et al.，J.Virology 611213-1220(1987)；Massie et al.，Mol.Cell.Biol.62872-2883(1986)；Haj-Ahmad et al.，J.Virology 57267-274(1986)；Davidson et al.，J.Virology 611226-1239(1987)；Zhang″Generation and identification of recombinant adenovirusby liposome-mediated transfection and PCR analysis″BioTechniques 15868-872(1993))。使用這些病毒作為載體的益處在于它們?cè)谀軌騻鞑サ狡渌?xì)胞類型的程度上是受到限制的，因?yàn)樗鼈兛稍陂_始被感染的細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，但是不能形成新的感染性病毒顆粒。已經(jīng)顯示重組腺病毒在體內(nèi)直接送遞至氣道上皮、肝細(xì)胞、血管內(nèi)皮、CNS實(shí)質(zhì)以及許多其他組織部位之后，可實(shí)現(xiàn)高效的基因轉(zhuǎn)移(Morsy，J.Clin.Invest.921580-1586(1993)；Kirshenbaum，J.Clin.Invest.92381-387(1993)；Roessler，J.Clin.Invest.921085-1092(1993)；Moullier，Nature Genetics 4154-159(1993)；La Salle，Science 259988-990(1993)；Gomez-Foix，J.Biol.Chem.26725129-25134(1992)；Rich，Human Gene Therapy4461-476(1993)；Zabner，Nature Genetics 675-83(1994)；Guzman，Circulation Research 731201-1207(1993)；Bout，HumanGene Therapy 53-10(1994)；Zabner，Cell 75207-216(1993)；Caillaud，Eur.J.Neuroscience 51287-1291(1993)；以及Ragot，J.Gen.Virology 74501-507(1993))。重組腺病毒通過與特異的細(xì)胞表面受體結(jié)合，然后病毒以與野生型或復(fù)制缺陷型腺病毒相同的方式通過受體介導(dǎo)的胞吞作用內(nèi)化，實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)(Chardonnetand Dales，Virology 40462-477(1970)；Brown and Burlingham，J.Virology 12386-396(1973)；Svensson and Persson，J.Virology55442-449(1985)；Seth，et al.，J.Virol.51650-655(1984)；Seth，et al.，Mol.Cell.Biol.41528-1533(1984)；Varga et al.，J.Virology 656061-6070(1991)；Wickham et al.，Cell73309-319(1993))。
病毒載體可以是基于E1基因已被移除的腺病毒的載體，這些病毒在諸如人類293細(xì)胞系等的細(xì)胞系中產(chǎn)生。E1和E3基因均可從腺病毒基因組中被移除。
(c)腺伴隨病毒載體另一種類型的病毒載體基于腺伴隨病毒(AVV)。這種缺陷型細(xì)小病毒是優(yōu)選的載體，因?yàn)樗軌蚋腥驹S多細(xì)胞類型而對(duì)人類沒有致病性。AAV型載體可轉(zhuǎn)運(yùn)約4至5kb，野生型AAV被認(rèn)為可穩(wěn)定地插入19號(hào)染色體。優(yōu)選具有這種位點(diǎn)特異性整合特性的載體。這種類型載體的一種可用形式是由Avigen，San Francisco，CA生產(chǎn)的P4.1 C載體，所述載體可包括單純皰疹病毒胸苷激酶基因HSV-tk和/或標(biāo)記基因，例如編碼綠色熒光蛋白(GFP)的基因。
在另一種類型的AAV病毒中，AAV含有一對(duì)末端反向重復(fù)序列(ITR)，所述ITR側(cè)翼有至少一個(gè)含有與異源基因可操作地相連的、指導(dǎo)細(xì)胞特異性表達(dá)的啟動(dòng)子的表達(dá)盒。此處的上下文中的異源性指天然AAV或B19細(xì)小病毒不含有的任何核苷酸序列或基因。
通常所述AAV和B19的編碼區(qū)已經(jīng)被刪除，產(chǎn)生安全的無(wú)細(xì)胞毒性的載體。AAV的ITR或其修飾物使病毒具有感染性和位點(diǎn)特異性整合作用，但是不具有細(xì)胞毒作用，且上述啟動(dòng)子指導(dǎo)細(xì)胞特異性表達(dá)。美國(guó)專利6,261,834中關(guān)于AAV載體的資料通過引用的方式納入本文。
因而公開的載體提供了能夠整合到哺乳動(dòng)物染色體中而基本上沒有毒性的DNA分子。
在病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒中插入的基因通常包括啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子，以幫助控制所需基因產(chǎn)物的表達(dá)。啟動(dòng)子通常是當(dāng)處在對(duì)于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)來(lái)說相對(duì)固定的位置時(shí)起作用的一段或多段DNA序列。啟動(dòng)子包括RNA聚合酶和轉(zhuǎn)錄因子的基本相互作用所需的核心元件，還可以包括上游元件和反應(yīng)元件。
(d)高載量病毒載體對(duì)大型人類皰疹病毒的分子遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)已經(jīng)提供了使異源DNA大片段在允許皰疹病毒感染的細(xì)胞中被克隆、增殖并定居的方法(Sun etal.，Nature genetics 833-41，1994；Cotter and Robertson，CurrOpin Mol Ther 5633-644，1999)。這些大型DNA病毒(單純皰疹病毒(HSV)和EB病毒(EBV))具有將大于150kb的人類異源DNA片段送遞至特定細(xì)胞的潛力。EBV重組體可使受感染B-細(xì)胞中的DNA大片段保持為附加體DNA。單個(gè)克隆攜帶的最高達(dá)330kb的人類基因組插入物在遺傳學(xué)上似乎是穩(wěn)定的。這些附加體的保持需要在感染EBV的過程中組成性表達(dá)的特定的EBV核蛋白(EBNA1)。另外，這些載體可以被用于可在體外短暫地產(chǎn)生大量蛋白的轉(zhuǎn)染。皰疹病毒擴(kuò)增子系統(tǒng)也正被用來(lái)包裝＞220kb的DNA區(qū)段以及用于感染可將DNA穩(wěn)定地保持為附加體的細(xì)胞。
其他有用的系統(tǒng)包括，例如，復(fù)制性的和宿主限制的非復(fù)制性的痘苗病毒載體。
(2)基于非核酸的系統(tǒng)所公開的組合物可以各種途徑送遞至靶細(xì)胞。例如，該組合物可通過電穿孔或通過脂質(zhì)轉(zhuǎn)染或通過磷酸鈣沉淀送遞。選擇的送遞機(jī)制部分取決于靶細(xì)胞的類型和送遞發(fā)生在例如體內(nèi)還是體外。
因此，除了公開的載體，所述組合物還可以包括例如，脂質(zhì)諸如脂質(zhì)體，諸如陽(yáng)離子脂質(zhì)體(例如DOTMA、DOPE、DC-膽固醇)或陰離子脂質(zhì)體。如果需要，脂質(zhì)體可以進(jìn)一步包括幫助靶向特定細(xì)胞的蛋白質(zhì)。包括化合物和陽(yáng)離子脂質(zhì)體的組合物的給藥可以給至向靶器官輸送的血液中，或吸入呼吸道而靶向呼吸道的細(xì)胞。關(guān)于脂質(zhì)體參見，例如Brigham et al.Am.J.Resp.Cell.Mol.Biol.195-100(1989)；Felgner et al.Proc.Natl.Acad.Sci USA 847413-7417(1987)；美國(guó)專利4,897,355。此外，所述化合物可以作為可靶向諸如巨噬細(xì)胞的特定細(xì)胞類型的微囊劑的組分給藥，或其中所述化合物從微囊劑的擴(kuò)散或釋放被設(shè)計(jì)為具有特定的速率或劑量的微囊劑的組分給藥。
在上述包括外源DNA的給藥和攝取進(jìn)入受試者的細(xì)胞的方法中(即基因轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染)，組合物可以通過各種機(jī)制送遞至細(xì)胞。例如，可以通過脂質(zhì)體送遞，可采用市售脂質(zhì)體制品，例如LIPOFECTIN、LIPOFECTAMINE(GIBCO-BRL，Inc.，Gaithersburg，MD)、SUPERFECT(QIAGEN，Inc.Hilden，Germany)和TRANSFECTAM(Promega Biotec，Inc.，Madison，WI)，以及其他根據(jù)本領(lǐng)域操作標(biāo)準(zhǔn)開發(fā)的脂質(zhì)體。另外，所公開的核酸或載體可在體內(nèi)通過電穿孔(該技術(shù)可獲自Genetronics，Inc.(San Diego，CA))，以及通過借助SONOPORATION機(jī)(ImaRx Pharmaceutical Corp.，Tucson，AZ)來(lái)送遞。
原料可以存在于溶液或懸浮液中(例如，摻入微粒、脂質(zhì)體或細(xì)胞中)。這些原料可以通過抗體、受體或受體配體靶向特定的細(xì)胞類型。以下參考文獻(xiàn)為應(yīng)用這種技術(shù)使特定蛋白靶向到腫瘤組織的實(shí)例(Senter，et al.，BioconjugateChem.，2447-451，(1991)；Bagshawe，K.D.，Br.J.Cancer，60275-281，(1989)；Bagshawe，et al.，Br.J.Cancer，58700-703，(1988)；Senter，et al.，Bioconjugate Chem.，43-9，(1993)；Battelli，et al.，CancerImmunol.Immunother.，35421-425，(1992)；Pietersz andMcKenzie，Immunolog.Reviews，12957-80，(1992)；以及Roffler，et al.，Biochem.Pharmacol，422062-2065，(1991))。這些技術(shù)能夠用于各種其他具體的細(xì)胞類型。諸如“隱形”(″stealth″)載體和其他抗體綴合的脂質(zhì)體(包括介導(dǎo)藥物對(duì)結(jié)腸癌尋靶的脂質(zhì))的載體，通過細(xì)胞特異性配體介導(dǎo)DNA尋靶的受體，指引對(duì)腫瘤尋靶的淋巴細(xì)胞以及體內(nèi)對(duì)鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞尋靶的高度特異的治療性逆轉(zhuǎn)錄病毒。以下參考文獻(xiàn)為應(yīng)用該技術(shù)來(lái)使特定蛋白靶向腫瘤組織的實(shí)例(Hughes et al.，Cancer Research，496214-6220，(1989)以及Litzinger and Huang，Biochimica et BiophysicaActa，1104179-187，(1992))。一般而言，受體參與組成性或者配體誘導(dǎo)的胞吞作用途徑。簇集于網(wǎng)格蛋白小窩之中的這些受體，通過網(wǎng)格蛋白小泡進(jìn)入細(xì)胞，經(jīng)過其中受體被分類的酸化內(nèi)體，然后重新循環(huán)到細(xì)胞表面，儲(chǔ)存于細(xì)胞內(nèi)或者于溶酶體中降解。內(nèi)化途徑具有多種功能，例如養(yǎng)分?jǐn)z入、激活蛋白的去除、大分子的清除、病毒和毒素的條件化進(jìn)入、配體的解離與降解以及受體水平的調(diào)節(jié)。許多受體遵循一條以上的胞內(nèi)途徑，這根據(jù)細(xì)胞類型、受體濃度、配體類型、配體價(jià)態(tài)和配體濃度而定。受體介導(dǎo)的胞吞作用的分子機(jī)制和細(xì)胞機(jī)制已有綜述(Brown and Greene，DNA and Cell Biology 106，399-409(1991))。
被送遞至細(xì)胞中的將被整合到宿主細(xì)胞基因組的核酸，通常包括整合序列。這些序列通常是病毒相關(guān)序列，尤其在使用基于病毒的系統(tǒng)時(shí)。這些病毒整合系統(tǒng)還可被納入將要用諸如脂質(zhì)體的基于非核酸的送遞系統(tǒng)送遞的核酸中，由此包含在送遞系統(tǒng)中的核酸可被整合到宿主基因組中。
其他整合到宿主基因組中的通用方法包括，例如，被設(shè)計(jì)為促進(jìn)與宿主基因組同源重組的系統(tǒng)。這些系統(tǒng)通常依賴于位于要表達(dá)的核酸側(cè)翼的序列，所述序列與宿主細(xì)胞基因組中的靶序列具有足夠的同源性，在宿主細(xì)胞基因組中載體核酸和靶核酸之間發(fā)生重組，導(dǎo)致所送遞的核酸被整合到宿主基因組之中。這些促進(jìn)同源重組所必需的系統(tǒng)和方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
(3)體內(nèi)/離體如本文所述，所述組合物可以在可藥用載體中給藥并可通過本領(lǐng)域所熟知的各種機(jī)制(例如，裸露DNA的攝取、脂質(zhì)體融合、通過基因槍的DNA肌內(nèi)注射、內(nèi)吞作用等等)在體內(nèi)和/或離體送遞至受試者的細(xì)胞。
如果采用離體方法，可根據(jù)本領(lǐng)域所熟知的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程將細(xì)胞或組織取出并保存在體外。組合物可以通過任何基因轉(zhuǎn)移機(jī)制被導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，諸如，例如磷酸鈣介導(dǎo)的基因送遞、電穿孔法、顯微注射法或脂蛋白體法。然后根據(jù)針對(duì)該細(xì)胞或組織類型的標(biāo)準(zhǔn)方法，轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞可以被注入(例如，在可藥用的載體中)或等位移植回受試者體內(nèi)。將各種細(xì)胞移植或注入受試者體內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)方法是已知的。
(e)肽(1)蛋白質(zhì)變體已知的和本文所考慮的公開的蛋白質(zhì)有許多變體。此外，除了已知功能系變體之外，還有許多也在公開的方法和組合物中起作用的蛋白質(zhì)的衍生物。蛋白質(zhì)變體和衍生物為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知并能夠參與氨基酸序列修飾。例如，氨基酸序列修飾物通常屬于置換、插入或缺失變體這三類中的一類或多類。插入包括氨基和/或羧基末端融合以及單個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的序列內(nèi)插入。插入通常是與氨基或羧基末端融合相比而言較小的插入，例如，大約一至四個(gè)殘基的插入。通過體外交聯(lián)或通過編碼該融合物的DNA轉(zhuǎn)化的重組細(xì)胞培養(yǎng)物，將大得足以將免疫原性賦予靶序列的多肽進(jìn)行融合，從而制備例如實(shí)施例中所述的免疫原性的融合蛋白衍生物。缺失的特征是一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基從蛋白序列中除去。通常，不超過約2至6個(gè)殘基在蛋白分子中的任何一個(gè)位置被刪除。這些變體通常通過在編碼蛋白質(zhì)的DNA中的核苷酸的位點(diǎn)特異性誘變，從而產(chǎn)生編碼變體的DNA，然后在重組細(xì)胞培養(yǎng)物中表達(dá)該DNA來(lái)制備。在具有已知序列的DNA中預(yù)先設(shè)定的位點(diǎn)上進(jìn)行置換型突變的技術(shù)已被熟知，例如M13引物誘變和PCR誘變。氨基酸置換通常為單個(gè)殘基，但是可在許多不同的位置同時(shí)發(fā)生；插入通常近似為約1至10個(gè)氨基酸殘基；缺失的范圍為約1至30個(gè)殘基。缺失或插入優(yōu)選在鄰近對(duì)中產(chǎn)生，即2個(gè)殘基的缺失或2個(gè)殘基的插入。置換、缺失、插入或其任何組合可以相結(jié)合以得到最終的構(gòu)建體。所述突變不得將序列置于閱讀框之外，并且優(yōu)選不形成會(huì)產(chǎn)生二級(jí)mRNA結(jié)構(gòu)的互補(bǔ)區(qū)。置換型變體是指其中至少一個(gè)殘基被除去而在其位置上插入不同的殘基。這類置換通常依照以下表1和2進(jìn)行，并且被稱為保守性置換。
表1氨基酸縮寫


表2氨基酸置換

通過選擇比表2中所示置換的保守性更低的置換，即選擇對(duì)維持(a)置換區(qū)的多肽骨架結(jié)構(gòu)，例如片層或螺旋構(gòu)象，(b)位于靶點(diǎn)的分子的電荷和疏水性或者(c)側(cè)鏈的大小方面的效果上差別更顯著的殘基，可能產(chǎn)生功能或免疫識(shí)別上的重大改變。一般預(yù)計(jì)在蛋白特性上產(chǎn)生最大改變的置換是這樣的置換，其中(a)諸如絲氨?；蛱K氨酰基等親水殘基置換(或被置換成)諸如亮氨?；?、異亮氨?；?、苯丙氨酰基、纈氨?；虮滨；鹊氖杷詺埢?；(b)半胱氨酸或脯氨酸置換(或被置換成)任何其他殘基；(c)諸如賴氨?；⒕滨；蚪M氨?；染哂袔в姓姾蓚?cè)鏈的殘基置換(或被置換成)諸如谷氨?；蛱於滨；葞ж?fù)電的殘基；或(d)諸如苯丙氨酸的具有龐大側(cè)鏈的殘基置換(或被置換成)諸如甘氨酸的沒有側(cè)鏈的殘基，在此情況下，(e)通過增加硫酸化和/或糖基化(作用)位點(diǎn)的數(shù)目。
例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉一個(gè)氨基酸殘基被另一個(gè)在生物學(xué)和/或化學(xué)上相似的殘基置換是保守置換。例如，保守置換是用一個(gè)疏水性殘基置換另一個(gè)疏水性殘基，或者用一個(gè)極性殘基置換另一個(gè)極性殘基。所述置換包括例如Gly、Ala；Val、Ile、Leu；Asp、Glu；Asn、Gln；Ser、Thr；Lys、Arg；和Phe、Tyr的組合。各種明確公開序列的這種保守置換的變體包括在本文所提供的嵌合體多肽中。
置換型或缺失型突變可以用于插入N-糖基化(Asn-X-Thr/Ser)或O-糖基化(Ser或Thr)位點(diǎn)。半胱氨酸或其他不穩(wěn)定的殘基的缺失也是所希望的。諸如Arg等潛在蛋白水解位點(diǎn)的缺失或置換，可通過例如缺失一個(gè)堿性殘基或用谷氨酰胺酰基或組氨?；鶜埢脫Q一個(gè)堿性殘基而實(shí)現(xiàn)。
某些翻譯后衍生化是重組宿主細(xì)胞對(duì)所表達(dá)的多肽進(jìn)行作用的結(jié)果。谷氨酰胺酰基和天冬酰胺?；鶜埢３Ｔ诜g后脫去酰氨基變成相對(duì)應(yīng)的谷氨酰基和天冬?；鶜埢??；蛘?，這些殘基可在溫和的酸性條件下脫去酰氨基。其他的翻譯后修飾包括脯氨酸和賴氨酸的羥基化，絲氨酸或蘇氨酸上羥基基團(tuán)的磷酸化，賴氨酸、精氨酸和組氨酸側(cè)鏈o-氨基基團(tuán)的甲基化(T.E.Creighton，ProteinsStructureand Molecular Properties，W.H.Freeman & Co.，San Franciscopp 79-86 )，N末端氨基的乙?；?，以及某些情況下C末端羧基的酰胺化。
應(yīng)當(dāng)理解的是，定義本文所公開蛋白質(zhì)的變體和衍生物的一種方法是根據(jù)與特定已知序列的同源性/同一性來(lái)定義變體和衍生物。特別公開了此處公開的這些蛋白和其他蛋白的變體，它們與所述序列有至少70％或75％或80％或85％或90％或95％的同源性。本領(lǐng)域技術(shù)人員容易知道如何確定兩種蛋白的同源性。例如，同源性可在對(duì)這兩條序列比對(duì)后使其同源性達(dá)到最高水平來(lái)進(jìn)行計(jì)算。
其他計(jì)算同源性的方法可通過公布的算法執(zhí)行。用于比較的序列最佳比對(duì)可以通過Smith and Waterman Adv.Appl.Math.2482(1981)的局部同源性算法、Needleman and Wunsch，J.MoL Biol.48443(1970)的同源性比對(duì)算法、Pearson and Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.852444(1988)的查找相似性方法、這些算法的計(jì)算機(jī)化工具(Wisconsin Genetics軟件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，WI)或通過審查的方式來(lái)進(jìn)行。
對(duì)核酸而言，能夠通過例如在Zuker，M.Science 24448-52，1989，Jaeger et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 867706-7710，1989，Jaeger et al.Methods Enzymol.183281-306，1989中公開的算法獲得相同類型的同源性，上述文獻(xiàn)中至少與核酸比對(duì)相關(guān)的資料通過引用的方式納入本文。
應(yīng)當(dāng)理解的是，保守突變和同源性的描述可以以任何組合方式結(jié)合起來(lái)，如與某特定序列具有至少70％同源性的實(shí)施方案，其中該變體為保守突變。
由于本說明書詳述了各種蛋白質(zhì)和蛋白序列，應(yīng)當(dāng)理解的是，編碼這些蛋白質(zhì)序列的核酸也被公開。這可包括與具體蛋白質(zhì)序列相關(guān)的所有簡(jiǎn)并序列，即含有編碼一個(gè)具體蛋白質(zhì)序列的序列的所有核酸，以及編碼該蛋白序列的所公開變體和衍生物的包括簡(jiǎn)并核酸在內(nèi)的所有核酸。因此，盡管各具體的核酸序列沒有在此列出，應(yīng)當(dāng)理解的是，通過所公開的蛋白質(zhì)序列，各條或每條序列實(shí)際上都在此得到公開和描述。還應(yīng)當(dāng)理解的是，盡管氨基酸序列沒有指出在生物體內(nèi)是哪種具體DNA序列編碼這種蛋白質(zhì)，但是由于其中所公開蛋白質(zhì)的具體變體在此得到公開，因而已知的在具體細(xì)胞內(nèi)編碼從該細(xì)胞產(chǎn)生的所述蛋白質(zhì)的核酸序列也是已知的并在此得到公開和描述。
應(yīng)當(dāng)理解的是，有許多氨基酸和肽類似物能夠被引入所公開的組合物中。例如，有許多D氨基酸或者與表1和表2中所示的氨基酸具有不同功能性取代基的氨基酸。自然存在的肽的相對(duì)立體異構(gòu)體以及肽類似物的立體異構(gòu)體也得到公開。通過使tRNA分子負(fù)載選定的氨基酸，以及通過對(duì)利用如琥珀密碼子的遺傳構(gòu)建體進(jìn)行基因工程改造以將類似的氨基酸以位點(diǎn)特異性的方式插入到肽鏈中，可容易地將這些氨基酸摻入到多肽鏈中(Thorson et al.，Methods in Molec.Biol.7743-73(1991)，Zoller，Current Opinion in Biotechnology，3348-354(1992)；Ibba，Biotechnology & Genetic EngineeringReviews 13197-216(1995)，Cahill et al.，TIBS，14(10)400-403(1989)；Benner，TIB Tech，12158-163(1994)；Ibba and Hennecke，Bio/technology，12678-682(1994)，所有上述文獻(xiàn)中至少與氨基酸類似物相關(guān)的資料通過引用的方式納入本文)。
可生產(chǎn)與肽類似的分子，但是它們不是通過天然肽鍵連接的。例如，氨基酸或氨基酸類似物的連接鍵可包括CH2NH--、--CH2S--、--CH2--CH2--、--CH＝CH--(順式和反式)、--COCH2--、--CH(OH)CH2--以及--CHH2SO-(這些實(shí)例及其他實(shí)例可見于Spatola，A.F.inChemistry and Biochemistry of Amino Acids，Peptides，andProteins，B.Weinstein，eds.，Marcel Dekker，New York，p.267(1983)；Spatola，A.F.，Vega Data(March 1983)，Vol.1，Issue3，Peptide Backbone Modifications(general review)；Morley，Trends Pharm Sci(1980)pp.463-468；Hudson，D.et al.，Int JPept Prot Res14177-185(1979)(--CH2NH--，CH2CH2--)；Spatola etal.Life Sci 381243-1249(1986)(--CHH2--S)；Hann J.Chem.Soc Perkin Trans.I 307-314(1982)(--CH--CH--，順式和反式)；Almquist et al.J.Med.Chem.231392-1398(1980)(--COCH2--)；Jennings-White et al.Tetrahedron Lett 232533(1982)(--COCH2--)；Szelke et al.European Appln，EP 45665 CA(1982)9739405(1982)(--CH(OH)CH2--)；Holladay et al.Tetrahedron.Lett 244401-4404(1983)(--C(OH)CH2--)；以及Hruby Life Sci 31189-199(1982)(--CH2--S--)；所述每一篇文獻(xiàn)均通過引用的方式納入本文。特別優(yōu)選的非肽連接鍵是--CH2NH--。應(yīng)當(dāng)理解的是，所述肽類似物在鍵原子之間可有多個(gè)原子，例如b-丙氨酸，g-氨基丁酸等等。
氨基酸類似物和類似物和肽類似物常常具有強(qiáng)化的或所希望的性質(zhì)，例如更經(jīng)濟(jì)的生產(chǎn)、更好的化學(xué)穩(wěn)定性、強(qiáng)化的藥理學(xué)性質(zhì)(半衰期、吸收、效價(jià)和效力等)、改變的特異性(例如較寬的生物學(xué)活性作用譜)、降低的抗原性等等。
D-氨基酸可用來(lái)產(chǎn)生更加穩(wěn)定的肽，因?yàn)镈氨基酸不為肽酶等所識(shí)別。將共有序列中的一種或多種氨基酸系統(tǒng)性地替換為同類型的D氨基酸(例如D-賴氨酸代替L-賴氨酸)可用來(lái)產(chǎn)生更穩(wěn)定的肽。半胱氨酸殘基可用來(lái)環(huán)化或?qū)蓚€(gè)或多個(gè)肽連接在一起。這有利于將肽限制于特定的構(gòu)象(Rizo and Gierasch Ann.Rev.Biochem.61387(1992)，該文獻(xiàn)通過引用的方式納入本文)。
(f)藥物載體/藥物學(xué)產(chǎn)物的送遞如上所述，所述組合物還可通過可藥用載體在體內(nèi)給藥。所謂“可藥用的”是指并非在生物學(xué)上或者在其他方面不合需要的物質(zhì)，即該物質(zhì)可與所述核酸或者載體一起給予受試者，而并不導(dǎo)致任何不良的生物學(xué)效應(yīng)，或者并不以有害的方式與包含該物質(zhì)的藥學(xué)組合物的任何其他成分相互作用?？扇菀椎剡x擇載體以將活性成分的任何降解最小化，以及將在該受試者體內(nèi)的任何不良副作用最小化，這為本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員所熟知。
該組合物可以以口服的、腸胃外的(例如靜脈內(nèi)的)、肌內(nèi)注射的、腹膜內(nèi)注射的、經(jīng)皮的、體外的、局部的等方式給藥，包括局部鼻內(nèi)給藥或者吸入給藥。本文所使用的“局部鼻內(nèi)給藥”是指所述組合物通過一個(gè)或兩個(gè)鼻孔送遞至鼻和鼻道，可包括通過噴射機(jī)制或者微滴機(jī)制送遞，或者通過核酸和載體的氣霧化送遞。通過吸入方式的組合物的給藥可通過經(jīng)鼻和經(jīng)口的噴射或者微滴機(jī)制的送遞。還可通過插管法直接送遞至呼吸系統(tǒng)的任何區(qū)域(例如肺)。所需的組合物的精確量因受試者而異，這取決于物種、年齡、體重和受試者的綜合情況，所治療的變應(yīng)性病癥的嚴(yán)重性，所使用的具體核酸或者載體，及其給藥模式等等。因而，不可能為每種組合物指定精確的量。然而，利用本文的教導(dǎo)，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員僅利用常規(guī)實(shí)驗(yàn)即能夠確定合適的量。
若采用組合物的腸胃外給藥，則通常以注射為特征。注射劑可制備為常規(guī)形式的，可為液體溶液或者懸液，或適于注射前懸浮溶于液體中的固體形式，或?yàn)槿闋钜?。一種新近修訂過的腸胃外給藥的方法涉及緩釋或者持續(xù)釋放體系的使用，以便維持不變的劑量。參見例如美國(guó)專利3,610,795，該文獻(xiàn)通過引用的方式納入本文。
該物質(zhì)可以是溶液、懸液的形式(例如，摻入微粒、脂質(zhì)體或者細(xì)胞之中)。這些可以通過抗體、受體或受體配體而靶向特定的細(xì)胞類型。下面的參考文獻(xiàn)是利用此技術(shù)將特定蛋白靶向到腫瘤組織的實(shí)例(Senter，et al.，Bioconjugate Chem.，2447-451，(1991)；Bagshawe，K.D.，Br.J.Cancer，60275-281，(1989)；Bagshawe，et al.，Br.J.Cancer，58700-703，(1988)；Senter，et al.，Bioconjugate Chem.，43-9，(1993)；Battelli，et al.，CancerImmunol.Immunother.，35421-425，(1992)；Pietersz and McKenzie，Immunolog.Reviews，12957-80，(1992)；以及Roffler，et al.，Biochem.Pharmacol，422062-2065，(1991))。諸如“隱形”載體和其他抗體綴合的脂質(zhì)體(包括介導(dǎo)藥物對(duì)結(jié)腸癌尋靶的脂質(zhì))的載體，通過細(xì)胞特異性配體介導(dǎo)DNA尋靶的受體，指引對(duì)腫瘤尋靶的淋巴細(xì)胞，以及體內(nèi)對(duì)鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞尋靶的高度特異的治療性逆轉(zhuǎn)錄病毒。下面的參考文獻(xiàn)是利用此技術(shù)將特定蛋白靶向到腫瘤組織的實(shí)例(Hughes et al.，Cancer Research 496214-6220，(1989)以及Litzinger and Huang，Biochimica et Biophysica Acta，1104179-187，(1992))。一般而言，受體參與組成性或者配體誘導(dǎo)的胞吞作用途徑。簇集于網(wǎng)格蛋白小窩之中的這些受體，通過網(wǎng)格蛋白小泡進(jìn)入細(xì)胞，經(jīng)過其中受體被分類的酸化內(nèi)體，然后重新循環(huán)到細(xì)胞表面，儲(chǔ)存于細(xì)胞內(nèi)或者于溶酶體中降解。所述內(nèi)化途徑具有各種功能，例如養(yǎng)分?jǐn)z入、激活蛋白的去除、大分子的清除、病毒和毒素的條件化進(jìn)入、配體的解離與降解以及受體水平的調(diào)節(jié)。許多受體遵循一條以上的胞內(nèi)途徑，這根據(jù)細(xì)胞類型、受體濃度、配體類型、配體價(jià)態(tài)和配體濃度而定。受體介導(dǎo)的胞吞作用的分子機(jī)制和細(xì)胞機(jī)制已有綜述(Brown和Greene，DNA and Cell Biology 106，399-409(1991))。
(1)可藥用載體所述組合物，包括抗體，可結(jié)合可藥用載體在治療上得到應(yīng)用。
合適的載體及其制劑在RemingtonThe Science and Practiceof Pharmacy(19th ed.)ed.A.R.Gennaro，Mack Publishing Company，Easton，PA 1995中有述。通常，在制劑中使用合適量的可藥用的鹽，以使制劑具有等滲性?？伤幱幂d體的實(shí)例包括但不限于鹽水、林格液(Ringer’s solution)和葡萄糖溶液。所述溶液的pH值優(yōu)選約5至約8，更優(yōu)選約7至約7.5。另外，載體包括緩釋制劑，例如包含抗體的固體疏水性聚合物的半透性基質(zhì)，所述基質(zhì)的形式為成形的物品，例如薄膜、脂質(zhì)體或微粒。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，根據(jù)例如給藥途徑和所給組合物的濃度，某些載體可能是更優(yōu)選的。
藥物的載體為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知。最通常的情況下所述載體是對(duì)人類給藥的標(biāo)準(zhǔn)載體，包括諸如無(wú)菌水、鹽水和生理pH的緩沖液的溶液。所述組合物可以肌內(nèi)或皮下給藥?？筛鶕?jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員所采用的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程給予其他化合物。
除了選定的分子外，藥物組合物可以包括載體、增稠劑、稀釋劑、緩沖劑、防腐劑、表面活性劑等等。藥物組合物還可以包括一種或多種活性組分，例如抗微生物劑、抗炎劑、麻醉劑等等。
所述藥物組合物可以以多種途徑給藥，這取決于是需要局部還是全身治療以及要治療的區(qū)域。給藥可以通過局部(包括眼部、陰道、直腸、鼻內(nèi))用藥、口服、吸入，或者諸如通過靜脈滴注、皮下、腹膜內(nèi)或肌內(nèi)注射的腸胃外給藥。所公開的抗體可通過靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、腔內(nèi)或經(jīng)皮給藥。
用于胃腸外給藥的制劑包括無(wú)菌的水性或非水性溶液、懸浮液和乳狀液。非水性溶劑的實(shí)例為丙二醇、聚乙二醇、諸如橄欖油的植物油以及諸如油酸乙酯的注射用有機(jī)酯。水性載體包括水、含醇/含水溶液、乳狀液或包括鹽水和緩沖介質(zhì)的懸浮液。腸胃外載體包括氯化鈉溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化鈉、乳酸林格液或不揮發(fā)油。靜脈內(nèi)載體包括流體和營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑、電解質(zhì)補(bǔ)充劑(例如基于林格氏葡萄糖的電解質(zhì)補(bǔ)充劑)等等。也可以存在防腐劑和其他添加劑，例如，諸如抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑以及惰性氣體等等。
用于局部給藥的制劑可以包括軟膏劑、洗劑、乳膏、凝膠劑、滴劑、栓劑、噴霧劑、液體和粉劑。常規(guī)的藥物載體，含水、粉末或含油基質(zhì)，增稠劑等等可能是必需的或合乎需要的。
用于口服給藥的組合物包括粉末或顆粒、水或非水介質(zhì)中的懸浮液或溶液、膠囊劑、囊劑或片劑。增稠劑、調(diào)味劑、稀釋劑、乳化劑、分散助劑或粘合劑可能是合乎需要的。
某些組合物有可能以可藥用的酸或堿加成鹽的形式給藥，所述酸或堿加成鹽通過與無(wú)機(jī)酸(例如鹽酸、氫溴酸、高氯酸、硝酸、硫氰酸、硫酸和磷酸)以及有機(jī)酸(例如甲酸、乙酸、丙酸、羥乙酸、乳酸、丙酮酸、乙二酸、丙二酸、丁二酸、順丁烯二酸和反丁烯二酸)反應(yīng)形成，或通過與無(wú)機(jī)堿(例如氫氧化鈉、氫氧化銨、氫氧化鉀)和有機(jī)堿(例如一，二，三烷基和芳基胺和取代的乙醇胺)反應(yīng)形成。
(2)治療用途組合物給藥的有效劑量和方案可以根據(jù)經(jīng)驗(yàn)來(lái)決定，而作出這種決定是在本領(lǐng)域的技術(shù)范圍之內(nèi)。組合物給藥的劑量范圍應(yīng)大到足以產(chǎn)生所需的能影響疾病癥狀的效果。所述劑量不應(yīng)當(dāng)大到以至于引起不良副作用，例如不想要的交叉反應(yīng)、過敏反應(yīng)等等。一般而言，所述劑量會(huì)根據(jù)患者的年齡、健康狀況、性別和患病程度；給藥途徑或者是否在方案中還使用其他藥物而變化，并且可由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定。如果出現(xiàn)任何禁忌癥，所述劑量可以由個(gè)人醫(yī)生來(lái)調(diào)整。劑量可以變化并可以以每日一劑或多劑給藥，給藥一天或多天。用藥指導(dǎo)可以在關(guān)于給定藥物類別的合適劑量的文獻(xiàn)中找到。例如，在選擇抗體的合適劑量上的指導(dǎo)可在關(guān)于抗體的治療性用途的文獻(xiàn)中找到，例如Handbook of Monoclonal Antibodies，F(xiàn)errone et al.，eds.，NogesPublications，Park Ridge，N.J.，(1985)ch.22 and pp.303-357；Smith et al.，Antibodies in Human Diagnosis and Therapy，Haberet al.，eds.，Raven Press，New York(1977)pp.365-389。單獨(dú)使用抗體的通常日劑量范圍可為在每日每千克體重1μg至高達(dá)100mg或更高，這根據(jù)上述的因素而定。
g)芯片和微陣列公開了其上至少有一處是本文所公開的任何核酸序列、肽或細(xì)胞所闡明的序列或其部分的芯片。還公開了其上至少有一處是本文所公開的任何肽序列所闡明的序列或其部分的芯片。例如，它可以具有不同的96孔板，例如其中一個(gè)有肝細(xì)胞、一個(gè)有肺細(xì)胞、一個(gè)有心臟細(xì)胞，它們可與試劑和介質(zhì)一起作為試劑盒裝運(yùn)。然后最終的使用者可例如向孔中加入待測(cè)物。另一個(gè)實(shí)例包括使用薄膜上的化學(xué)物質(zhì)的高密度陣列，然后用含有組合物例如細(xì)胞或其他物質(zhì)的各種溶液洗滌薄膜，之后若組合物與芯片上的某些物質(zhì)相互作用則給出指示，從而進(jìn)行篩選。
還公開了其上至少有一處是本文所公開的任何核酸序列、肽或細(xì)胞所闡明的序列或其部分的變體的芯片。還公開了其上至少有一處是本文所公開的任何肽序列所闡明的序列或其部分的變體的芯片。
(h)計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)應(yīng)當(dāng)理解，公開的核酸和蛋白質(zhì)可表示為由核苷酸或氨基酸所構(gòu)成的序列。表示這些序列的方式有多種，例如鳥苷核苷酸可表示為G或g。類似地，氨基酸纈氨酸可表示為Val或V。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道如何以存在的多種方式中的任一種來(lái)表示或表達(dá)任意的核酸或蛋白質(zhì)序列，其每一種均被認(rèn)為是在本文公開內(nèi)容的范圍。在此特別考慮的是這些序列在計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)上的呈現(xiàn)，例如市售軟盤、磁帶、芯片、硬盤、光盤和視盤或其他計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)。還公開了所公開序列的二進(jìn)制代碼表示法。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道什么是計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)。因此，核酸或蛋白質(zhì)序列記錄、儲(chǔ)存或保存在計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)上。
公開了包括本文所述序列以及該序列相關(guān)的信息的計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)。
(i)試劑盒本文公開了裝有能夠被用于實(shí)施本文所公開的方法的試劑的試劑盒。所述試劑盒可包括此處詳述的任何試劑或試劑組合，或可理解為在所公開的方法的實(shí)施過程中所需的或有益的試劑或試劑組合。例如，該試劑盒可包括編碼所需分子的核酸或在所述方法的某種形式中詳述的經(jīng)修飾的ES細(xì)胞，以及使用它們所需要的緩沖劑和酶。試劑盒的其他實(shí)例包括用于毒性篩選的由本文所述的方法獲得的細(xì)胞。這些細(xì)胞可代表可給出相關(guān)的藥物篩選情況的許多種終末分化的細(xì)胞。該細(xì)胞例如還可包括標(biāo)記，或其標(biāo)記已被切除。由于該方法允許使用多潛能干細(xì)胞作為起始細(xì)胞，因而從共同的一種多潛能干細(xì)胞就可獲得多種細(xì)胞類型，它們因而可具有共同基因型。試劑盒可包括例如可包被有本文公開的組合物的平板，例如96孔板。
B.方法1.使用經(jīng)修飾的干細(xì)胞的方法經(jīng)修飾的干細(xì)胞可用于鑒定和選擇所需的細(xì)胞類型和所需細(xì)胞類型的培養(yǎng)物。一般而言，經(jīng)修飾的干細(xì)胞可在允許所有細(xì)胞生長(zhǎng)的條件下培養(yǎng)。然后可向經(jīng)修飾的干細(xì)胞施加選擇壓力，例如遷移至可選擇出轉(zhuǎn)化基因的存在的軟瓊脂。表達(dá)選擇基因例如轉(zhuǎn)化基因的這些細(xì)胞將繼續(xù)生長(zhǎng)或可被鑒定出。因?yàn)榻?jīng)修飾的干細(xì)胞已被改造，使得選擇基因僅在單一細(xì)胞類型或細(xì)胞類型亞型中表達(dá)，所以只有這些細(xì)胞會(huì)繼續(xù)增殖或保持可被鑒定出。進(jìn)一步或另外的鑒定步驟，例如通過針對(duì)特定細(xì)胞類型標(biāo)記的細(xì)胞分選或者可視化及隨后的傳代培養(yǎng)和克隆，可產(chǎn)生單一細(xì)胞類型的細(xì)胞群，若被克隆則產(chǎn)生由一個(gè)祖細(xì)胞生成的單一細(xì)胞類型的細(xì)胞群。由于經(jīng)修飾的干細(xì)胞可在適宜的條件下形成類胚胎體，然后由于類胚胎體可自發(fā)產(chǎn)生任意細(xì)胞類型，因而通過使得經(jīng)修飾的干細(xì)胞經(jīng)歷自發(fā)形成類胚胎體以及通過隨后的如本文所述的選擇(例如針對(duì)轉(zhuǎn)化基因的選擇)的過程可獲得任意所需的細(xì)胞類型的細(xì)胞。應(yīng)當(dāng)理解，用這些方法和其他本文公開的方法以及所公開的組合物可生產(chǎn)出任意所需的細(xì)胞類型，例如本文公開的那些類型。為了啟動(dòng)類胚胎體的形成，通常利用胰酶或一些其他的解離方法將未分化的干細(xì)胞傳代至未處理的無(wú)飼養(yǎng)層的塑料皿中。不經(jīng)過特殊的處理，細(xì)胞通常不容易貼壁。在上述條件下，干細(xì)胞將分裂形成具有空洞的獨(dú)立的細(xì)胞球。
2.使用分化的細(xì)胞的方法本文公開的制備經(jīng)修飾的干細(xì)胞的方法可生產(chǎn)適合體內(nèi)方法和/或離體方法和/或體外方法的細(xì)胞。例如，激活的/顯性負(fù)性轉(zhuǎn)化基因策略例如可能最適于體外應(yīng)用，但是由于例如轉(zhuǎn)化基因的標(biāo)記會(huì)保留在細(xì)胞內(nèi)，從而對(duì)于細(xì)胞療法而言可能并不理想。另一方面，CRE/lox適用于細(xì)胞療法，因?yàn)槔甾D(zhuǎn)化基因的標(biāo)記被從終細(xì)胞切除了。而且，對(duì)于體內(nèi)機(jī)制，該標(biāo)記可被置于例如哺乳動(dòng)物人工染色體的染色體外的盒中，然后可利用多種機(jī)制將其從終細(xì)胞中全部除去。
(a)確定分化條件的方法公開了在確定和優(yōu)化分化干細(xì)胞的條件的方法中使用所公開的細(xì)胞的方法。分化過程以細(xì)胞在成為終細(xì)胞類型前從一種前體細(xì)胞向下一種細(xì)胞行進(jìn)的逐步方式進(jìn)行。造血系統(tǒng)中就存在一個(gè)實(shí)例，其中原始干細(xì)胞產(chǎn)生各種前體，這些前體在終B細(xì)胞或T細(xì)胞出現(xiàn)前轉(zhuǎn)而又產(chǎn)生其他前體。公開的方法和組合物可用于定義該進(jìn)程或任意其他從前體至終產(chǎn)物的進(jìn)程，還包括所公開的可逆轉(zhuǎn)化體系。
大多數(shù)功能已被熟知的基因是在終組織中表達(dá)的基因。這些基因的啟動(dòng)子可用于所公開的方法和組合物中，因?yàn)樗鼈兪墙K末細(xì)胞類型啟動(dòng)子。終末細(xì)胞類型是不再分化的細(xì)胞類型。清蛋白是基因在終末細(xì)胞中表達(dá)的一個(gè)很好的實(shí)例。清蛋白僅在肝細(xì)胞中表達(dá)。它的啟動(dòng)子由一系列已知的轉(zhuǎn)錄因子驅(qū)動(dòng)，所述轉(zhuǎn)錄因子例如CAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白(C/EBP)和叉頭(forkhead)家族蛋白(Schrem，H.，et al.Pharmacol.Rev.54，129-158，2002.)。使用公開的方法和組合物，例如組織特異性可逆轉(zhuǎn)化法，可將成為肝細(xì)胞的細(xì)胞從由類胚胎體產(chǎn)生的其他細(xì)胞的混合物中鑒定出來(lái)。可使用由清蛋白控制轉(zhuǎn)錄因子之一驅(qū)動(dòng)的啟動(dòng)子作為組織特異性選擇子，并剛好在細(xì)胞成為肝細(xì)胞之前鑒定出該細(xì)胞。然后可分離該細(xì)胞，使用標(biāo)準(zhǔn)基因組技術(shù)，可鑒別在該細(xì)胞中表達(dá)的基因，并且可鑒別其他選擇子即在該細(xì)胞中獨(dú)特表達(dá)的基因。使用每個(gè)其他選擇子重復(fù)該過程可追溯回譜系的起源。
該方法的變化形式可用于界定所述過程中的每一步的細(xì)胞培養(yǎng)條件。將例如轉(zhuǎn)化基因如激活的Ras基因用作標(biāo)記，可對(duì)在各種條件下的軟瓊脂中出現(xiàn)的集落多少進(jìn)行定量。使用綠色熒光蛋白或乳酸脫氫酶也可進(jìn)行定量。通過改變培養(yǎng)條件以及選擇子、細(xì)胞或譜系特異性啟動(dòng)子，可在每一階段使遵循某一特定途徑的細(xì)胞數(shù)目最多，或者可鑒別任意其他所需特征。將每一階段的產(chǎn)量最大化可允許例如人們制定可不使用選擇子就導(dǎo)致所需細(xì)胞類型的分化方案。
(b)重建的免疫系統(tǒng)在此公開了能產(chǎn)生和修飾任意所需人類細(xì)胞類型的方法和組合物。例如，公開了人類免疫系統(tǒng)的體外重建。目前可通過三步法在小鼠中生產(chǎn)單克隆抗體。首先用所期望的抗原接種小鼠。幾天后取出小鼠的脾，將留存于脾內(nèi)的免疫細(xì)胞與小鼠B淋巴瘤系融合。這樣可使B細(xì)胞在脾中無(wú)限增殖。然后培養(yǎng)它們，并選擇產(chǎn)生合適抗體的融合。
小鼠單克隆抗體用于人類的治療效果不佳，因?yàn)樗鼈儽蛔R(shí)別為外源物質(zhì)并被破壞掉。目前用于治療的單克隆抗體，例如治療乳腺癌的Herceptin_，為人源化或嵌合抗體以最大程度地減少這些問題，但這些問題不能完全消除。全人單克隆抗體可解決這些問題。然而，這意味著要用抗原來(lái)接種人類。在已嘗試了此法的很少的實(shí)例中，該方法并不受到歡迎，同時(shí)也不成功。如本文所述，組織特異性的干細(xì)胞的可逆轉(zhuǎn)化可以選擇出人類免疫細(xì)胞B、T和巨噬細(xì)胞系的匹配組。這只能通過來(lái)自干細(xì)胞實(shí)現(xiàn)，因?yàn)锽、T和巨噬細(xì)胞應(yīng)來(lái)自相同的遺傳背景以便正確地起作用。當(dāng)確定了合適的細(xì)胞，可將它們一起培養(yǎng)以產(chǎn)生體外免疫系統(tǒng)。在該系統(tǒng)中培養(yǎng)的抗原可被處理并正確地呈遞至B細(xì)胞，由此擴(kuò)增了同類細(xì)胞。在培養(yǎng)的過程中，這些細(xì)胞可優(yōu)勢(shì)增殖或選擇性增殖而占到總B細(xì)胞群的較高百分比。然后這些細(xì)胞可被克隆并選出產(chǎn)生合適抗體的細(xì)胞。由于它們?yōu)檗D(zhuǎn)化細(xì)胞，因而它們可被表征、冷凍，然后無(wú)限增殖，產(chǎn)生全人單克隆抗體。該系統(tǒng)可顯著擴(kuò)展單克隆抗體用于治療的可用性。
(c)毒性檢測(cè)制藥企業(yè)想削減新藥發(fā)現(xiàn)和開發(fā)的巨大成本的需求迫使人們對(duì)引起藥物候選物失敗的各因素進(jìn)行檢查。除了效力的問題，最常見的失敗原因是毒性(van de Waterbeemd，H，Gifford，E.(2003)Nat.Rev.Drug Disc.2，192-204)。更成問題的是那些已經(jīng)上市但由于未認(rèn)識(shí)到的毒性只好撤回的化合物。曲格列酮和曲伐沙星是被召回或者由于肝毒性而受到嚴(yán)重縮減的化合物的眾所周知的實(shí)例，格帕沙星具有肌肉毒性的問題，特非那定和阿司咪唑由于心臟毒性而被召回(Suchard，J.(2001)Int.J.Med.Toxicol.4，15-20)。
理想地，新化合物的毒性屬性可在開發(fā)早期被認(rèn)識(shí)和避免?；谌祟惛渭?xì)胞系的ACTIVTox被設(shè)計(jì)為為研究結(jié)構(gòu)毒性關(guān)系而提供的高通量代謝活性平臺(tái)。通過在多個(gè)濃度的一系列檢測(cè)來(lái)篩選化合物，以得到可由化學(xué)師使用以指導(dǎo)下一個(gè)合成周期的結(jié)構(gòu)分級(jí)。通過這種方法，化合物的毒性屬性可降至最小，而治療屬性可被最大程度地放大。
通過開發(fā)一組相關(guān)的細(xì)胞系，可將ACTIVTox的這一構(gòu)思推廣。可針對(duì)一組匹配的非轉(zhuǎn)化細(xì)胞系在高通量體系中檢測(cè)新的化合物，增加了在臨床試驗(yàn)中成功的可能性。使用本文所公開的方法，上述組可由代表許多組織(盡可能相近地匹配)的多個(gè)細(xì)胞系組成。這可通過對(duì)來(lái)自例如EG系的親代干細(xì)胞系的測(cè)定中使用的細(xì)胞系進(jìn)行衍化，并通過相同的機(jī)理被可逆轉(zhuǎn)化而實(shí)現(xiàn)。這些細(xì)胞可組成來(lái)自單一個(gè)體的成組組織樣本，從而使遺傳背景差異性的問題減至最小。
使用本文公開的方法的預(yù)測(cè)毒理學(xué)還可用更大的細(xì)胞集合來(lái)進(jìn)行。公開的是測(cè)試對(duì)心、神經(jīng)元、腸、腎、肝、肌肉或肺細(xì)胞系的毒性的方法。和對(duì)肝的測(cè)試一樣，可使用同樣的化合物在同樣的毒性檢測(cè)中產(chǎn)生和篩選這些細(xì)胞系。
一個(gè)實(shí)例是搏動(dòng)心臟細(xì)胞培養(yǎng)物。制藥公司主要關(guān)注的是被稱為QT延長(zhǎng)的現(xiàn)象，QT延長(zhǎng)可導(dǎo)致心律失常并可能導(dǎo)致死亡(Belardinelli，L.，et al.Trends in Pharmocol.Sci.24，619-625，2003)。幾種化合物，例如特非那定，由于這個(gè)嚴(yán)重的副作用而被從市場(chǎng)上撤回。目前，由于QT延長(zhǎng)是電學(xué)現(xiàn)象，所以除了在動(dòng)物和人體中以外，很難檢測(cè)QT延長(zhǎng)。使用搏動(dòng)心臟細(xì)胞培養(yǎng)物可進(jìn)行針對(duì)這一問題的直接檢測(cè)。
通過在同樣的測(cè)定中使用許多不同的細(xì)胞類型來(lái)檢測(cè)相同的化合物，可在用于人體檢測(cè)前確定新的化合物的可能毒性的清晰概況。這將對(duì)新藥開發(fā)的成本和速度產(chǎn)生顯著影響，因?yàn)槟壳盀橹古R床檢測(cè)還是最昂貴的研究階段。
(d)用于開發(fā)應(yīng)用的特異性靶細(xì)胞(1)多巴胺特異性神經(jīng)元組織特異性可逆轉(zhuǎn)化還使得可以開發(fā)用于藥物開發(fā)應(yīng)用的特異性細(xì)胞類型。目前因?yàn)檫€無(wú)法獲得天然的含靶細(xì)胞，所以經(jīng)常在已被遺傳操作以含有目的靶的細(xì)胞上檢測(cè)新藥。一個(gè)實(shí)例是多巴胺能神經(jīng)元。許多神經(jīng)活性藥物是針對(duì)多巴胺受體的，例如三環(huán)抗抑郁劑或用于藥物成癮性的多巴胺重?cái)z取抑制劑。本文公開了目的特異細(xì)胞類型(例如未被任意其他細(xì)胞類型污染的多巴胺能神經(jīng)元)的無(wú)限量及可重復(fù)供給的可獲得性。
(e)用于靶標(biāo)驗(yàn)證的基因敲除公開的方法和組合物，例如組織特異性可逆轉(zhuǎn)化，以及靶標(biāo)基因、同源重組，可使得特定基因缺失或被修飾的細(xì)胞發(fā)育。藥物開發(fā)中的一個(gè)中心問題是治療性靶標(biāo)的驗(yàn)證。該測(cè)定法是用來(lái)確定當(dāng)某具體蛋白質(zhì)被藥物阻斷或激活時(shí)，實(shí)際上該蛋白質(zhì)是否會(huì)顯示出所希望的治療效果?；蚯贸蚧蚯萌胄∈蟪Ｓ糜诖藨?yīng)用(Zambrowicz，BP，etal.Nat.Rev.Drug Disc.2，38-51，2003)。如用本文公開內(nèi)容產(chǎn)生的公開的細(xì)胞和細(xì)胞系將提供類似的體外驗(yàn)證的可能性。一個(gè)具體的實(shí)例是人類低密度脂蛋白受體的基因敲除。LDL受體被用作許多人類病毒包括人類乙肝病毒的進(jìn)入通道。利用本文公開的細(xì)胞例如干細(xì)胞中的同源重組技術(shù)，可損害LDL受體基因，因此無(wú)法合成LDL受體蛋白。在這些細(xì)胞中使用組織特異性可逆轉(zhuǎn)化，可形成無(wú)LDL受體的人類肝細(xì)胞。這些細(xì)胞可用于檢查L(zhǎng)DL受體在HBV感染中的作用。如果例如這些細(xì)胞不能被HBV感染，則可稱該LDL受體為抗HBV療法的驗(yàn)證有效的靶?？芍贫愃频牟呗砸援a(chǎn)生獲得功能或喪失功能的突變體以用于其它目的。使用與上述相同的實(shí)例，LDL受體可在正常不表達(dá)該蛋白質(zhì)的細(xì)胞中被激活。
(f)離體細(xì)胞療法
(1)肝輔助裝置公開了基于本文公開的肝臟細(xì)胞系的肝輔助裝置。美國(guó)每年完成的肝移植有大約5,000例?，F(xiàn)在等待移植的名單上大約還有17,000例。每年等待移植的名單上的患者有大約1500例死亡。
目前還沒有如同對(duì)于腎病患者的血液透析一樣的支持已進(jìn)入肝病末期的患者的方法。由于肝具有再生能力，該短暫的關(guān)鍵時(shí)期內(nèi)的支持可使患者存活，直至可獲得合適的器官，或者最好情況是用他們自己的肝。
在美國(guó)和英國(guó)已經(jīng)開發(fā)了一種肝輔助裝置并在動(dòng)物以及52位患者身上進(jìn)行了測(cè)試(Sussman，NL，et al.，(1992)Hepatology16，60-65；Sussman，NL，et al.，(1994)Artificial Organs 18，390-396；Millis，JM，et al.，(2002)Transplantation 74，1735-1746)。在此裝置中，用實(shí)現(xiàn)肝的功能的人類肝臟細(xì)胞系填充中空纖維藥筒(如同在腎透析中使用的一樣)。通過乙酸纖維素纖維使該細(xì)胞與患者的免疫系統(tǒng)相分離。血液被泵過纖維的內(nèi)腔，小分子經(jīng)纖維擴(kuò)散至細(xì)胞，它們?cè)诩?xì)胞中被適宜地代謝。該裝置是安全的，雖然足夠有力地證明其有效性的試驗(yàn)沒有進(jìn)行，但無(wú)對(duì)照的證據(jù)表明它能挽救生命。使用動(dòng)物肝細(xì)胞的其他類似裝置似乎也是有效的(Hui，T，etal.，(2001)J.Hepatobiliary Pancreat Surg.8，1-15)。
實(shí)際應(yīng)用的問題出現(xiàn)于要裝入裝置中的肝細(xì)胞來(lái)源。為了具有有效性，每個(gè)裝置需要大約200g細(xì)胞，即肝總質(zhì)量的15％至20％。雖然肝細(xì)胞在體內(nèi)具有再生能力，但它在培養(yǎng)物中即便是在該課題研究后幾十年也不能進(jìn)行任何程度的分裂。對(duì)于使用人類肝臟來(lái)供給用于支持裝置的細(xì)胞，在開篇的段落中描述的統(tǒng)計(jì)量并不令人鼓舞。移植完全受到器官的限制。動(dòng)物肝臟的使用可補(bǔ)給足量的細(xì)胞，但需要長(zhǎng)期穩(wěn)定地獲取新器官，并且還出現(xiàn)了再生性和質(zhì)量控制的問題。這個(gè)問題可通過應(yīng)用人類肝臟細(xì)胞系來(lái)解決，該細(xì)胞系是無(wú)限增殖的并被凍存于細(xì)胞庫(kù)中(Sussman，NL & Kelly，JH.(1995)ScientificAmericanScience and Medicine 2，68-77)。這些細(xì)胞可為裝置提供持續(xù)更新的可再生的無(wú)限補(bǔ)給。
不幸的是，由于這些細(xì)胞的腫瘤來(lái)源，它們?cè)谟糜谌祟愔委煏r(shí)出現(xiàn)了許可性和調(diào)節(jié)的問題。由本文公開的組合物和方法生產(chǎn)的所公開的肝細(xì)胞可避開這一難題，因?yàn)樵诨貜?fù)后它們就不再是細(xì)胞系。
(g)遺傳匹配的細(xì)胞系由于遺傳干擾(noise)水平可被顯著降低，遺傳匹配的細(xì)胞系可用于基因表達(dá)研究和蛋白組學(xué)研究。
在所公開的細(xì)胞以前，使用培養(yǎng)物中的細(xì)胞來(lái)研究基因表達(dá)的一個(gè)主要缺點(diǎn)是這些細(xì)胞并不具有相同的遺傳背景。在不同的個(gè)體中，不同組的基因以不同的水平表達(dá)。這取決于遺傳和環(huán)境因素。而且，大多的培養(yǎng)物的細(xì)胞來(lái)源于腫瘤，根據(jù)定義，腫瘤為遺傳異常的并通常含有多種倒位、重復(fù)以及完全重復(fù)或缺失的染色體。
從相同的干細(xì)胞中分離的一組細(xì)胞如同來(lái)自一個(gè)個(gè)體的組織樣本。例如，來(lái)自肝和腸的細(xì)胞的遺傳背景應(yīng)是相同的。這就使得能夠更為明確地確定基因和蛋白質(zhì)的組織特異性表達(dá)，因?yàn)閭€(gè)體差異性被消除了。所公開的方法和組合物可用于從任意本文公開的細(xì)胞中生產(chǎn)具體細(xì)胞類型的遺傳匹配的細(xì)胞，例如任意來(lái)源(例如任意唯一的個(gè)體)的干細(xì)胞。
(h)發(fā)育途徑的鑒別和控制如先前所述，轉(zhuǎn)錄因子聯(lián)合作用以影響組織特異性的基因表達(dá)。公開的組合物和方法可用于鑒別激活了某些特異性針對(duì)給定細(xì)胞類型的基因的細(xì)胞時(shí)期。以肝細(xì)胞為例，清蛋白主要是成體肝細(xì)胞的產(chǎn)物。已知了一些調(diào)節(jié)它表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子。其中一個(gè)因子是C/EBP——參與中間代謝的許多基因的調(diào)節(jié)中的因子(Darlington，GJ，(1998)J.Biol.Chem.273，30057-30060)。例如在EG體系中使用C/EBP的啟動(dòng)子，可鑒定出激活該基因的細(xì)胞。其中之一是成肝細(xì)胞即肝細(xì)胞的前體。通過然后選擇其表達(dá)調(diào)節(jié)C/EBP的基因，我們可循著發(fā)育途徑逐步回溯至起點(diǎn)。
C.定義除非在上下文中另外明確指明，說明書和隨附的權(quán)利要求中所使用的單數(shù)形式的“一個(gè)”、“一種”和“該”包括復(fù)數(shù)指代對(duì)象。因此，例如，提及“一種藥物載體”包括兩種或更多種這類載體的混合物等等。
公開了用于制備所公開的組合物的組分，還公開了在本文公開的方法中使用的該組合物本身。本文公開了這些以及其他物質(zhì)，應(yīng)當(dāng)理解的是在公開這些物質(zhì)的組合、子集、相互作用和群組等的時(shí)候，盡管關(guān)于這些化合物的每種不同的個(gè)體和集體的組合和排列可能并未明確地公開，但每種都在此被特別地考慮和描述。例如，如果公開和討論了一種具體的經(jīng)修飾的ES細(xì)胞，并且討論了可制成許多包括經(jīng)修飾的ES細(xì)胞在內(nèi)的分子的許多修飾物，則除非另外特別指明，經(jīng)修飾的ES細(xì)胞和可能的修飾物的每種和各種組合和排列均得到特別地考慮。因此，如果公開了一類分子A、B和C，并且還公開了一類分子D、E和F以及組合分子A-D的實(shí)例，則即使沒有每個(gè)逐一列舉，每個(gè)也單獨(dú)和共同得到考慮，意即A-E，A-F，B-D，B-E，B-F，C-D，C-E以及C-F等組合也被認(rèn)為公開了。同樣，這些分子的任何子集或組合也被公開了。因此，例如，A-E，B-F和C-E的子群被認(rèn)為公開了。將這一概念適用于本申請(qǐng)的所有方面，包括但不限于，制備和應(yīng)用公開組合物的方法中的步驟。因此，如果有多個(gè)其他步驟可以實(shí)施，應(yīng)當(dāng)理解的是，所述其他步驟的每一步都可以以所公開方法的任何具體實(shí)施方案或?qū)嵤┓桨傅慕M合來(lái)實(shí)施。
應(yīng)當(dāng)理解，本文公開了很多不同的組合物和方法步驟，本文所公開的每種組合物和方法的各種和每種組合和排列均被考慮并公開。例如，列舉的轉(zhuǎn)化性基因、啟動(dòng)子、細(xì)胞類型、重組酶的組合、經(jīng)修飾的干細(xì)胞、標(biāo)記、細(xì)胞特異性基因以及它們每個(gè)的單獨(dú)的或總體的每種組合均被公開，由此提供了成千上萬(wàn)的具體實(shí)施方案和成組實(shí)施方案。只要公開了各列舉和各部分，則即使不特別列舉每一種組合，各組合也得到公開。
還應(yīng)當(dāng)理解，除非特別指出相反的情況，或者對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言應(yīng)作相反的理解以外，若論述了一個(gè)具體實(shí)施方案，例如Ras轉(zhuǎn)化性基因，則所有其他轉(zhuǎn)化性基因由于該列舉或?qū)嵤┓桨敢驳玫焦_，同樣對(duì)于本文所公開的每種組合物和方法而言也是類似的。
本文中范圍可以表示為從“約”一個(gè)具體的數(shù)值，和/或至“約”另一個(gè)具體的數(shù)值。當(dāng)表示為這種范圍時(shí)，另一個(gè)實(shí)施方案包括從前述的一個(gè)具體的數(shù)值和/或至前述的另一個(gè)具體的數(shù)值。類似地，當(dāng)通過在前面使用“約”將數(shù)值表示為近似值時(shí)，應(yīng)當(dāng)理解的是，該具體的數(shù)值構(gòu)成另一個(gè)實(shí)施方案。應(yīng)當(dāng)進(jìn)一步理解的是，該范圍的每一個(gè)的端點(diǎn)既在與其他端點(diǎn)相關(guān)時(shí)具有意義，也在獨(dú)立于其他端點(diǎn)時(shí)具有意義。還應(yīng)當(dāng)理解的是本文公開了許多數(shù)值，除了數(shù)值本身外每一個(gè)數(shù)值還被公開為“約”該具體數(shù)值。例如，如果公開了數(shù)值“10”，那么也公開了“約10”。還應(yīng)當(dāng)理解的是，當(dāng)公開了一個(gè)數(shù)值時(shí)，“小于或等于”該數(shù)值，“大于或等于該數(shù)值”以及數(shù)值間可能的范圍也得到公開，這正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所恰當(dāng)理解的那樣。例如，如果公開了數(shù)值“10”，則也公開了“小于或等于10”以及“大于或等于10”。還應(yīng)該理解，在通篇申請(qǐng)中，以各種不同的形式給出數(shù)據(jù)，并且該數(shù)據(jù)表示終點(diǎn)、起點(diǎn)以及各數(shù)據(jù)點(diǎn)的任意組合的范圍。例如，如果公開了具體數(shù)據(jù)點(diǎn)“10”以及具體數(shù)據(jù)點(diǎn)15，那么應(yīng)該理解大于、大于或等于、小于、小于或等于10和15同10和15之間的范圍一起被公開了。還應(yīng)當(dāng)理解，兩個(gè)具體單位間的每個(gè)單位也被公開了。例如，如果公開了“10”和“15”，那么11、12、13和14也被公開。
通篇所使用的“受試者”意為個(gè)體。因此“受試者”可包括，例如，馴養(yǎng)動(dòng)物(例如貓、狗等)、牲畜(例如牛、馬、豬、綿羊、山羊等)、實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物(例如小鼠、兔、大鼠、豚鼠等)、哺乳動(dòng)物、非人類哺乳動(dòng)物、靈長(zhǎng)類、非人類靈長(zhǎng)類、嚙齒動(dòng)物、禽類、爬行動(dòng)物、兩棲類、魚以及任意其他動(dòng)物。受試者可以是哺乳動(dòng)物例如靈長(zhǎng)類或人類。
“治療”或“療法”并不是指完全治愈。它是指減輕了存在的疾病的癥狀和/或減少了導(dǎo)致癥狀的一種或多種存在的細(xì)胞、生理或生物化學(xué)病因或機(jī)理。應(yīng)當(dāng)理解本文所使用的減輕是相對(duì)于疾病狀況而言的，包括疾病的分子狀況，而不僅僅是疾病的生理狀況。
“減少”或減少的其他形式意為減少事件或特征。應(yīng)當(dāng)理解，它通常是相對(duì)于一些標(biāo)準(zhǔn)或期望值，也就是說它是相對(duì)的，但該標(biāo)準(zhǔn)或期望值并不總是必需被提及。例如，“減少磷酸化”意為減少相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)或?qū)φ债a(chǎn)生的磷酸化的量。
“抑制”或抑制的其他形式意為阻礙或約束某具體特征。應(yīng)當(dāng)理解它通常是相對(duì)于一些標(biāo)準(zhǔn)或期望值，也就是說它是相對(duì)的，但該標(biāo)準(zhǔn)或期望值并不總是必需被提及。例如，“抑制磷酸化”意為阻礙或約束相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)或?qū)φ债a(chǎn)生的磷酸化的量。
“阻止”或阻止的其他形式意為使具體的特征或狀況停止。“阻止”不需要與對(duì)照比較，因?yàn)樗ǔ１壤鐪p少或抑制更絕對(duì)。正如本文所使用的，某些事(或物)可被較少但不被抑制或阻止，但某些事(或物)可被減少，也可以被抑制或阻止。應(yīng)當(dāng)理解，當(dāng)使用減少、抑制或阻止時(shí)，除非另外特別指明，另兩個(gè)詞語(yǔ)也被表達(dá)公開了。因此，如果公開了抑制磷酸化，則減少和阻止磷酸化也被公開了。
術(shù)語(yǔ)“治療有效的”意為所使用的組合物的量為改善疾病或病癥的一種或多種病因或癥狀的足夠量。所述改善只需減輕或改變而并不必須消除。術(shù)語(yǔ)“載體”意為一種化合物、組合物、物質(zhì)或結(jié)構(gòu)，其在與一種化合物或組合物聯(lián)合時(shí)，基于預(yù)期目的或用途有助于或便于該化合物或組合物的制備、貯存、給藥、送遞、有效性、選擇性或任意其他特征。例如，可選擇一種載體以使活性成分的降解程度最小，并使受試者的任意不良副作用最少。
通篇申請(qǐng)的說明書和權(quán)利要求書中，詞語(yǔ)“包括”和該詞的變化形式，例如“包含”和“含有”意為“包括但不限于”，這意為不排除例如其他添加劑、組分、整數(shù)或步驟。
除非特別指明，本文所使用的術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞”，是指?jìng)€(gè)體細(xì)胞、細(xì)胞系、原代培養(yǎng)物或來(lái)源于這類細(xì)胞的培養(yǎng)物。“培養(yǎng)物”是指包含相同類型或不同類型的分離細(xì)胞的組合物。
細(xì)胞系是具體細(xì)胞類型的培養(yǎng)物，由于使得該細(xì)胞系“永生”了，因此該細(xì)胞系可無(wú)限繁殖。
細(xì)胞培養(yǎng)物是生長(zhǎng)在例如瓊脂的培養(yǎng)基上的細(xì)胞群。
原代細(xì)胞培養(yǎng)物是來(lái)自細(xì)胞或者直接取自活體生物的培養(yǎng)物，該培養(yǎng)物未被無(wú)限增殖化。
術(shù)語(yǔ)“前藥”意在包括在生理?xiàng)l件下轉(zhuǎn)變成治療活性劑的化合物。制備前藥的通常方法應(yīng)包括選擇在生理?xiàng)l件下可被水解以暴露出所需分子的部分。在其他實(shí)施方案中，前藥可借助宿主動(dòng)物的酶活性轉(zhuǎn)變。
術(shù)語(yǔ)“代謝產(chǎn)物”是指將化合物引入例如患者的生物環(huán)境之后產(chǎn)生的活性衍生物。
在關(guān)于藥物組合物的方面使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“穩(wěn)定的”在本領(lǐng)域中通常理解為意為在指定貯存條件下一段規(guī)定時(shí)間段后活性成分的損失小于某量，通常為10％。認(rèn)為組合物是穩(wěn)定的所要求的時(shí)間是相對(duì)于每種產(chǎn)品的使用而言的，它是根據(jù)以下因素來(lái)規(guī)定的在最終使用前的生產(chǎn)該產(chǎn)品的商業(yè)實(shí)踐、維持其質(zhì)量控制和檢驗(yàn)、將其運(yùn)送至批發(fā)商或直接至消費(fèi)者(這期間它又維持在貯存狀態(tài))。包括安全性因素的幾個(gè)月時(shí)間，藥物的最短產(chǎn)品期限通常為一年，優(yōu)選18個(gè)月以上。本文使用的術(shù)語(yǔ)“穩(wěn)定的”是就市場(chǎng)客觀實(shí)際和在易達(dá)到的條件例如2℃至8℃的冷藏條件下貯存和運(yùn)輸產(chǎn)品的能力而言的。
說明書以及最后的權(quán)利要求書中所提及的組合物或物品中具體成分或組分的重量份，表示該成分或組分和以重量份表示的該組合物或物品中的任意其他成分或組分間的重量關(guān)系。因此，在含有2份重量份的組分X和5份重量份的組分Y的配合物中，X和Y存在的重量比為2∶5，并且無(wú)論在該復(fù)合物中是否含有其他組分，它們均以該比例存在。
除非特別說明為相反的情況之外，組分的重量百分比基于包含了該組分的制劑或組合物的總重。
在本說明書和以下的權(quán)利要求書中，將會(huì)提及許多術(shù)語(yǔ)，定義它們的含義如下所述“任選的”或“任選地”意為隨后所描述的事件或情況可以發(fā)生或可以不發(fā)生，以及該描述包括其中所述事件或情況發(fā)生的例子以及不發(fā)生的例子。
“引物”是能夠支持一些類型的酶操作并可與靶核酸雜交從而使酶操作得以發(fā)生的探針亞類。引物可以由本領(lǐng)域可用的不干擾酶操作的核苷酸或者核苷酸衍生物或類似物的任意組合制得。
“探針”是能夠與靶核酸相互作用的分子，通常是以序列特異性方式例如通過雜交相互作用。核酸雜交為本領(lǐng)域所熟知并在本文得到詳述。通常探針可以由本領(lǐng)域可用的核苷酸或者核苷酸衍生物或類似物的任意組合制得。
在公開的方法中使用的核酸區(qū)段也可被稱為核酸序列和核酸分子。除非上下文另外指明，所提及的核酸區(qū)段、核酸序列和核酸分子意在指可與任意其他核酸分離的或可摻入任意其他核酸的或?yàn)槿我馄渌怂岬囊徊糠值木哂刑囟ㄐ蛄泻?或功能的寡核苷酸或多核苷酸鏈。
在通篇申請(qǐng)中，參考了各種出版物。這些出版物的公開內(nèi)容通過引用的方式全文納入本申請(qǐng)，以便更充分地描述本發(fā)明所屬領(lǐng)域的狀況?；谝匈噮⒖嘉墨I(xiàn)的句子中所論述的包含在所述參考文獻(xiàn)中的素材，因此在此還通過引用的方式將該參考文獻(xiàn)單獨(dú)地并特別地納入本文。
D.制備組合物的方法除非另有特別說明，本文所公開的組合物和實(shí)施所公開的方法所必需的組合物可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何用于制備該具體試劑或化合物的方法制備，。
1.核酸合成例如，核酸諸如用作引物的寡核苷酸可用標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)合成法制備或以酶學(xué)方法或其他已知方法生產(chǎn)。這類方法包括從先用標(biāo)準(zhǔn)的酶消化然后分離核苷酸片段(參見例如Sambrook et al.，Molecular cloningA Laboratory Manual，2nd Edition(Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989)Chapters 5，6)到完全的合成法，例如利用Milligen或Beckman System 1 Plus DNA合成儀(例如，馬薩諸塞州伯林頓的Milligen-Biosearch的Model 8700自動(dòng)合成儀，或ABI Model 380B)的氰乙基亞磷酰胺法?？捎糜谥苽涔押塑账岬暮铣煞ㄒ苍贗kuta et al.，Ann.Rev.Biochem.53323-356(1984)(phosphotriester and phosphitetriester methods)和Naranget al.，Methods Enzymol.，65610-620(1980)(phosphotriestermethod)中得到描述。蛋白質(zhì)核酸分子可用已知的方法如Nielsen etal.，Bioconjug.Chem.53-7(1994))所述方法來(lái)制備。
2.肽合成生產(chǎn)所公開蛋白質(zhì)的一種方法是用蛋白質(zhì)化學(xué)技術(shù)將兩個(gè)或多個(gè)肽或多肽連在一起。例如，肽或多肽可使用當(dāng)前可用的實(shí)驗(yàn)室設(shè)備用Fmoc(9-芴甲氧羰基，9-fluorenylmethyloxycarbonyl)或Boc(叔丁氧羰基，tert-butyloxycarbonyl)化學(xué)方法化學(xué)合成(AppliedBiosystems，Inc.，F(xiàn)oster City，CA)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地理解，與所公開的蛋白相應(yīng)的肽或多肽例如可用標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)反應(yīng)合成。例如，一種肽或多肽可被合成并且不從其合成樹脂上切割下來(lái)，而另一種肽或蛋白的其他片段可被合成并隨后將其從樹脂上切割下來(lái)，從而暴露在另一片段中被功能性封閉的末端基團(tuán)。通過肽縮合反應(yīng)，這兩個(gè)片段可通過分別在其羧基和氨基末端的肽鍵共價(jià)連接以形成抗體或其片段。(Grant GA(1992)Synthetic PeptidesA User Guide.W.H.Freeman and Co.，N.Y.(1992)；Bodansky M and Trost B.，Ed.(1993)Principles of Peptide Synthesis.Springer-Verlag Inc.，NY(上述文獻(xiàn)中至少與肽合成相關(guān)的資料通過引用的方式納入本文))。或者，如本文所述，肽或多肽可在體內(nèi)獨(dú)立合成。這些獨(dú)立的肽或多肽被分離后，就可以通過類似的肽縮合反應(yīng)被連接起來(lái)，從而形成肽或其片段。
例如，克隆的或合成的肽區(qū)段的酶連接反應(yīng)使得相對(duì)較短的肽片段能夠被連接起來(lái)以產(chǎn)生較大的肽片段、多肽或整個(gè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域(Abrahmsen L et al.，Biochemistry，304151(1991))?；蛘撸蓱?yīng)用合成肽的天然化學(xué)連接從較短的肽片段合成構(gòu)建較大的肽或多肽。此方法包括兩步化學(xué)反應(yīng)(Dawson et al.Synthesis of Proteinsby Native Chemical Ligation.Science，266776-779(1994))。第一步是無(wú)保護(hù)的合成肽-硫代酸酯與另一個(gè)包含氨基末端Cys殘基的無(wú)保護(hù)的肽區(qū)段的化學(xué)選擇性反應(yīng)，產(chǎn)生硫酯連接的中間體作為初始共價(jià)產(chǎn)物。保持反應(yīng)條件不變，此中間體經(jīng)歷自發(fā)的迅速的分子內(nèi)反應(yīng)，從而在該連接位點(diǎn)形成天然的肽鍵(Baggiolini M et al.(1992)FEBS Lett.30797-101；Clark-Lewis I et al.，J.Biol.Chem.，26916075(1994)；Clark-Lewis I et al.，Biochemistry，303128(1991)；Rajarathnam K et al.，Biochemistry 336623-30(1994))。
或者，無(wú)保護(hù)的肽區(qū)段可被化學(xué)連接，其中作為化學(xué)連接反應(yīng)結(jié)果的于肽區(qū)段間形成的鍵是非天然的鍵(非肽鍵)(Schnolzer，M et al.Scierce，256221(1992))。此技術(shù)已被用來(lái)合成大量具有完全生物活性的相對(duì)純的蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域類似物(deLisle Milton RC etal.，Techniques in Protein Chemistry IV.Academic Press，NewYork，pp.257-267(1992))。
3.制備組合物的方法公開了制備組合物以及制備導(dǎo)致組合物的中間體的方法。例如，公開了由所公開的方法生產(chǎn)的細(xì)胞。可制備這些組合物的方法有多種，例如合成化學(xué)方法和標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)方法。應(yīng)當(dāng)理解，制備這些和其他所公開的組合物的方法被特別地予以公開。
公開了通過包括以操作性方式將包含本文所公開序列的核酸，和控制該核酸表達(dá)的序列連接的方法生產(chǎn)的核酸分子。
還公開了通過包括以操作性方式將包含具有本文所公開序列的80％同一性的序列的核酸分子，和控制該核酸表達(dá)的序列連接的方法生產(chǎn)的核酸分子。
公開了通過包括以操作性方式將包含在嚴(yán)格的雜交條件下可與本文所公開序列雜交的序列的核酸分子，和控制該核酸表達(dá)的序列連接的方法生產(chǎn)的核酸分子。
公開了通過包括以操作性方式將包含編碼本文所公開肽的序列的核酸分子，和控制該核酸分子表達(dá)的序列連接的方法生產(chǎn)的核酸分子。
公開了通過包括以操作性方式將包含編碼具有本文所公開肽的80％同源性的肽的序列的核酸分子，和控制該核酸分子表達(dá)的序列連接的方法生產(chǎn)的核酸分子。
公開了通過包括以操作性方式將包含編碼具有本文所公開肽的80％同源性的肽的序列的核酸分子(其中肽序列的任何改變均為保守性改變)，和控制該核酸分子表達(dá)的序列連接的方法生產(chǎn)的核酸。
公開了由用任意公開的核酸轉(zhuǎn)化細(xì)胞的方法來(lái)生產(chǎn)的細(xì)胞。公開了由用任意非天然形成的公開的核酸轉(zhuǎn)化細(xì)胞的方法來(lái)生產(chǎn)的細(xì)胞。還公開了由本文所述方法生產(chǎn)的不同的細(xì)胞的組合。還提供了由本文所述方法生產(chǎn)的細(xì)胞與其他細(xì)胞混合的組合。根據(jù)具體需求和應(yīng)用，這些細(xì)胞可具有各種純度。
公開了由表達(dá)所公開的任意核酸的方法生產(chǎn)的所公開的任意肽。公開了由表達(dá)公開的任意核酸的方法生產(chǎn)所公開的任意非天然形成的肽。公開了由表達(dá)所公開的任意非天然核酸的方法生產(chǎn)的公開的任意肽。
公開了由用本文公開的任意核酸分子轉(zhuǎn)染動(dòng)物體內(nèi)的細(xì)胞的方法產(chǎn)生的動(dòng)物。公開了由用本文公開的任意核酸分子轉(zhuǎn)染動(dòng)物體內(nèi)的細(xì)胞的方法產(chǎn)生的動(dòng)物，其中該動(dòng)物為哺乳動(dòng)物。還公開了由用本文公開的任意核酸分子轉(zhuǎn)染動(dòng)物體內(nèi)的細(xì)胞的方法產(chǎn)生的動(dòng)物，其中該哺乳動(dòng)物為小鼠、大鼠、兔、牛、羊、豬或靈長(zhǎng)類。
還公開了由將本文公開的任意細(xì)胞加至動(dòng)物的方法產(chǎn)生的動(dòng)物。
公開了通過用本文公開的核酸轉(zhuǎn)化細(xì)胞的方法生產(chǎn)本文所公開的任意干細(xì)胞。還公開了通過本文所公開的方法生產(chǎn)的任意細(xì)胞，所述方法例如分離選擇的特定的細(xì)胞類型和使用所公開的經(jīng)修飾的干細(xì)胞的方法。
E.使用組合物的方法1.將組合物用作研究工具的方法所公開的組合物可以多種方式作為研究工具應(yīng)用。
組合物可用作例如組合化學(xué)方案或其他篩選方案中的靶標(biāo)，以分離出具有與具體細(xì)胞類型相關(guān)的所需功能屬性的分子。
所公開的組合物可如本文所述地用作微陣列中的試劑或者用作探測(cè)或分析現(xiàn)有微陣列的試劑。所公開的組合物可用于分離或鑒定單核苷酸多態(tài)性的任何已知方法中。該組合物還可用于確定例如本文所公開的具體細(xì)胞類型中的具體基因的等位基因分析的任何方法中。該組合物還可用于與芯片/微陣列相關(guān)的篩選分析的任何已知方法中。該組合物還可用于利用所公開的組合物的計(jì)算機(jī)可讀的具體形式的任何已知方法中，以例如研究關(guān)聯(lián)性或進(jìn)行與所公開組合物相關(guān)的分子模型分析。
2.基因修飾和基因斷開的方法公開的組合物和方法可用于針對(duì)任何可進(jìn)行基因斷開和經(jīng)修飾的動(dòng)物中的基因斷開和修飾?；蛐揎椇突驍嚅_是指圍繞以用哺乳動(dòng)物的種系來(lái)擴(kuò)增經(jīng)修飾的方式選擇性移除或改變動(dòng)物例如哺乳動(dòng)物的染色體的基因或一段序列的方法、技術(shù)和組合物。一般而言，用被設(shè)計(jì)為可與例如如本文所述的細(xì)胞內(nèi)所含的具體染色體的某區(qū)域同源重組的載體轉(zhuǎn)化細(xì)胞。該同源重組的發(fā)生可產(chǎn)生具有例如在框架中引入的外源性DNA以及周圍DNA(surrounding DNA)的染色體。此類型的方案使得可以將特異性很高的突變例如點(diǎn)突變引入該細(xì)胞所含的基因組內(nèi)。本文公開了進(jìn)行此類型的同源重組的方法。類似地，干細(xì)胞例如多潛能干細(xì)胞可用于敲除基因以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，此細(xì)胞可用于本文所述的方法中以產(chǎn)生可在多種測(cè)定中與動(dòng)物進(jìn)行比較的細(xì)胞系。
在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行同源重組的一個(gè)優(yōu)選特征是該細(xì)胞應(yīng)能夠被培養(yǎng)，因?yàn)榘l(fā)生所需重組的頻率很低。
通過本文所述方法產(chǎn)生該細(xì)胞后，則可由此細(xì)胞通過干細(xì)胞技術(shù)或克隆技術(shù)產(chǎn)生動(dòng)物。例如，如果核酸被轉(zhuǎn)染進(jìn)入的細(xì)胞為該器官的干細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染和培養(yǎng)后該細(xì)胞可用于產(chǎn)生包含種系細(xì)胞中的基因修飾或基因斷開的器官，然后所述細(xì)胞又可用于產(chǎn)生在所有細(xì)胞中都具有該基因修飾或斷開的另一只動(dòng)物。在用于產(chǎn)生所有其細(xì)胞中都含有該基因修飾或斷開的動(dòng)物的其他方法中可使用克隆技術(shù)。通常這些技術(shù)取轉(zhuǎn)染細(xì)胞的細(xì)胞核，并通過融合或置換將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞核與之后可操作的卵母細(xì)胞融合以產(chǎn)生動(dòng)物。使用克隆技術(shù)代替ES技術(shù)的方法的優(yōu)勢(shì)在于不是ES細(xì)胞的細(xì)胞可被轉(zhuǎn)染。例如成纖維細(xì)胞，非常易于培養(yǎng)，可用作被轉(zhuǎn)染的并發(fā)生基因修飾或斷開的細(xì)胞，然后從該細(xì)胞獲得的細(xì)胞可用于克隆整個(gè)動(dòng)物。
F.具體實(shí)施方案公開了含有核酸區(qū)段的多潛能干細(xì)胞，其中所述核酸區(qū)段包含P-I結(jié)構(gòu)，其中P為轉(zhuǎn)錄控制原件，I為編碼標(biāo)記的序列，其中該標(biāo)記包括轉(zhuǎn)化劑。
還公開了在轉(zhuǎn)錄控制元件被激活而使I被優(yōu)勢(shì)表達(dá)或選擇性表達(dá)的條件下培養(yǎng)多潛能干細(xì)胞而生產(chǎn)的分化細(xì)胞，其中該多潛能干細(xì)胞含有核酸區(qū)段，其中所述核酸區(qū)段包含P-I結(jié)構(gòu)，其中P為轉(zhuǎn)錄控制元件，I為編碼標(biāo)記的序列，其中該標(biāo)記包括轉(zhuǎn)化劑。
還公開了一種方法，該方法包括將分化細(xì)胞導(dǎo)入受試者，其中分化細(xì)胞是通過在轉(zhuǎn)錄控制因子被激活而使I被優(yōu)勢(shì)表達(dá)或選擇性表達(dá)的條件下培養(yǎng)多潛能干細(xì)胞而產(chǎn)生的，其中該多潛能干細(xì)胞含有核酸區(qū)段，其中所述核酸區(qū)段包含P-I結(jié)構(gòu)，其中P為轉(zhuǎn)錄控制元件，I為編碼標(biāo)記的序列，其中該標(biāo)記為轉(zhuǎn)化劑。
還公開了測(cè)定組合物毒性的方法，該方法包括將組合物與分化細(xì)胞共同培養(yǎng)以及對(duì)分化細(xì)胞測(cè)定毒性效應(yīng)，其中該分化細(xì)胞是通過在轉(zhuǎn)錄控制元件被激活而使I被優(yōu)勢(shì)表達(dá)或選擇性表達(dá)的條件下培養(yǎng)多潛能干細(xì)胞來(lái)產(chǎn)生的，其中該多潛能干細(xì)胞含有核酸區(qū)段，其中所述核酸區(qū)段包含P-I結(jié)構(gòu)，其中P為轉(zhuǎn)錄控制元件，I為編碼標(biāo)記的序列，其中所述標(biāo)記包括轉(zhuǎn)化劑。
還公開了測(cè)定化合物毒性的方法，該方法包括將該化合物與分化細(xì)胞共同培養(yǎng)，以及對(duì)分化細(xì)胞測(cè)定毒性效應(yīng)，其中該分化細(xì)胞是通過在轉(zhuǎn)錄控制元件被激活而使I被優(yōu)勢(shì)表達(dá)或選擇性表達(dá)的條件下培養(yǎng)多潛能干細(xì)胞來(lái)產(chǎn)生的，其中該多潛能干細(xì)胞含有核酸區(qū)段，其中所述核酸區(qū)段包含P-I結(jié)構(gòu)，其中P為轉(zhuǎn)錄控制元件，I為編碼標(biāo)記的序列，其中該標(biāo)記包括轉(zhuǎn)化劑。
還公開了測(cè)定組合物對(duì)細(xì)胞的目標(biāo)效應(yīng)的方法，該方法包括將組合物與分化細(xì)胞共同培養(yǎng)，以及對(duì)分化細(xì)胞測(cè)定目標(biāo)效應(yīng)，其中該分化細(xì)胞是通過在轉(zhuǎn)錄控制元件被激活而使I被優(yōu)勢(shì)表達(dá)或選擇性表達(dá)的條件下培養(yǎng)多潛能干細(xì)胞來(lái)產(chǎn)生的，其中該多潛能干細(xì)胞含有核酸區(qū)段，其中所述核酸區(qū)段包含P-I結(jié)構(gòu)，其中P為轉(zhuǎn)錄控制元件，I為編碼標(biāo)記的序列，其中該標(biāo)記包括轉(zhuǎn)化劑。
還公開了測(cè)定化合物對(duì)細(xì)胞的目標(biāo)效應(yīng)的方法，該方法包括將化合物與分化細(xì)胞共同培養(yǎng)，以及對(duì)分化細(xì)胞測(cè)定目標(biāo)效應(yīng)，其中該分化細(xì)胞是通過在轉(zhuǎn)錄控制元件被激活而使I被優(yōu)勢(shì)表達(dá)或選擇性表達(dá)的條件下培養(yǎng)多潛能干細(xì)胞來(lái)產(chǎn)生的，其中該多潛能干細(xì)胞含有核酸區(qū)段，其中所述核酸區(qū)段包含P-I結(jié)構(gòu)，其中P為轉(zhuǎn)錄控制元件，I為編碼標(biāo)記的序列，其中該標(biāo)記包括轉(zhuǎn)化劑。
還公開了從干細(xì)胞的產(chǎn)生分化細(xì)胞的方法，該方法包括在轉(zhuǎn)錄控制元件被激活而使I被優(yōu)勢(shì)表達(dá)或選擇性表達(dá)的條件下培養(yǎng)干細(xì)胞，從而獲得分化細(xì)胞，其中該干細(xì)胞含有核酸區(qū)段，其中所述核酸區(qū)段包含P-I結(jié)構(gòu)，其中P為轉(zhuǎn)錄控制元件，I為編碼標(biāo)記的序列，其中該標(biāo)記包括轉(zhuǎn)化劑，其中I為異源核酸序列。
還公開了獲得干細(xì)胞來(lái)源的有條件地永生的細(xì)胞類型的方法，該方法包括在轉(zhuǎn)錄控制元件被激活而使I被優(yōu)勢(shì)表達(dá)或選擇性表達(dá)，的條件下培養(yǎng)干細(xì)胞，從而獲得干細(xì)胞來(lái)源的有條件地永生的細(xì)胞類型，其中該干細(xì)胞含有核酸區(qū)段，其中所述核酸區(qū)段包含P-I結(jié)構(gòu)，其中P為轉(zhuǎn)錄控制元件，I為編碼標(biāo)記的序列，其中該標(biāo)記包括轉(zhuǎn)化劑，其中I為異源核酸序列。
還公開了獲得干細(xì)胞來(lái)源的有條件地永生的細(xì)胞類型的方法，該方法包括用包含P-I結(jié)構(gòu)的核酸區(qū)段轉(zhuǎn)染干細(xì)胞，其中P為轉(zhuǎn)錄控制元件，I為編碼標(biāo)記的序列，其中該標(biāo)記包括轉(zhuǎn)化劑；在轉(zhuǎn)錄控制元件被激活而使I被優(yōu)勢(shì)表達(dá)或選擇性表達(dá)的條件下培養(yǎng)干細(xì)胞，從而獲得干細(xì)胞來(lái)源的有條件地永生的細(xì)胞類型。
還公開了從干細(xì)胞獲得分化細(xì)胞的方法，該方法包括用包含P-I結(jié)構(gòu)的核酸區(qū)段轉(zhuǎn)染干細(xì)胞，其中P為轉(zhuǎn)錄控制元件，I為編碼標(biāo)記的序列，其中該標(biāo)記包括轉(zhuǎn)化劑；以及在轉(zhuǎn)錄控制元件被激活而使I被優(yōu)勢(shì)表達(dá)或選擇性表達(dá)的條件下培養(yǎng)干細(xì)胞，從而獲得分化細(xì)胞。
還公開了從干細(xì)胞獲得分化細(xì)胞的方法，該方法包括用包含P-I結(jié)構(gòu)的核酸區(qū)段轉(zhuǎn)染干細(xì)胞，其中P為轉(zhuǎn)錄控制元件，I為編碼標(biāo)記的序列；以及在轉(zhuǎn)錄控制元件被激活而使I被優(yōu)勢(shì)表達(dá)或選擇性表達(dá)的條件下培養(yǎng)干細(xì)胞，其中轉(zhuǎn)錄控制元件被激活的條件為干細(xì)胞分化的條件，從而獲得分化細(xì)胞。
還公開了含有包含P-I結(jié)構(gòu)的核酸分子的多潛能干細(xì)胞，其中P為轉(zhuǎn)錄控制元件，I為編碼標(biāo)記的序列，其中該標(biāo)記包括轉(zhuǎn)化劑。還公開了通過從干細(xì)胞切除一種核酸而產(chǎn)生的細(xì)胞，其中該干細(xì)胞含有包含P-I結(jié)構(gòu)的核酸分子，其中P為轉(zhuǎn)錄控制元件，I為編碼標(biāo)記的序列，其中該標(biāo)記包括轉(zhuǎn)化劑。
還公開了從干細(xì)胞獲得有條件地永生的細(xì)胞群的方法，包括用含有權(quán)利要求1中所述的一種P-I核酸分子的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染干細(xì)胞；在轉(zhuǎn)錄控制元件P被激活而使I被優(yōu)勢(shì)表達(dá)或選擇性表達(dá)的環(huán)境中培養(yǎng)該干細(xì)胞；以及選擇表達(dá)I的細(xì)胞類型。
還公開了從干細(xì)胞獲得有條件地永生的細(xì)胞群的方法，包括用含有權(quán)利要求1中所述的一種P-I核酸分子的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染干細(xì)胞；在轉(zhuǎn)錄控制元件P被激活而使I被優(yōu)勢(shì)表達(dá)或選擇性表達(dá)的環(huán)境中培養(yǎng)該干細(xì)胞；以及選擇表達(dá)I的細(xì)胞類型。
還公開了獲得有條件地永生的細(xì)胞類型的方法，包括用含有一種P-I核酸分子的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染多潛能干細(xì)胞；激活控制元件P而使I被優(yōu)勢(shì)表達(dá)或選擇性表達(dá)；選擇表達(dá)I的細(xì)胞類型，以及；切除含有P-I核酸分子的構(gòu)建體；將所選擇的構(gòu)建體與一種環(huán)境接觸使得先前含有包含P-I核酸分子的構(gòu)建體的核酸的末端重組；以及冷凍選擇的細(xì)胞類型。
還公開了獲得細(xì)胞培養(yǎng)物的方法，包括用含有一種P-I核酸分子的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染多潛能干細(xì)胞；將干細(xì)胞與一種環(huán)境接觸以使轉(zhuǎn)錄控制元件P被激活并且使I優(yōu)勢(shì)表達(dá)或選擇性表達(dá)；以及，培養(yǎng)表達(dá)I的細(xì)胞；其中P為轉(zhuǎn)錄控制元件，I為編碼標(biāo)記的序列，其中該標(biāo)記包括轉(zhuǎn)化劑。
還公開了含有包含P-I結(jié)構(gòu)的核酸分子構(gòu)建體的多潛能干細(xì)胞，其中P為組織特異性轉(zhuǎn)錄控制元件，P使得I優(yōu)勢(shì)表達(dá)或選擇性表達(dá)，I為溫度許可性無(wú)限增殖因子。
還公開了含有包含X-P-I-X結(jié)構(gòu)的核酸分子構(gòu)建體的多潛能干細(xì)胞，其中P為組織特異性轉(zhuǎn)錄控制元件，P使得I優(yōu)勢(shì)表達(dá)或選擇性表達(dá)，I為溫度許可性無(wú)限增殖因子，X為位點(diǎn)特異性切除序列。
還公開了獲得干細(xì)胞來(lái)源的有條件地永生的細(xì)胞類型的方法，包括用含有核酸分子構(gòu)建體P-I的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染多潛能干細(xì)胞；將該細(xì)胞與一種環(huán)境接觸以使轉(zhuǎn)錄控制因子被激活并使I優(yōu)勢(shì)表達(dá)或選擇性表達(dá)；選擇表達(dá)I的干細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞類型；以及，克隆和冷凍所選擇的細(xì)胞類型；其中P為轉(zhuǎn)錄控制元件，I為編碼標(biāo)記的序列，其中該標(biāo)記包括轉(zhuǎn)化劑。
還公開了獲得干細(xì)胞來(lái)源的有條件地永生的細(xì)胞類型的方法，包括用含有核酸分子構(gòu)建體X-P-I-X的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染多潛能干細(xì)胞；將該細(xì)胞與一種環(huán)境接觸以使轉(zhuǎn)錄控制因子被激活并使I優(yōu)勢(shì)表達(dá)或選擇性表達(dá)；選擇表達(dá)I的干細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞類型；以及，克隆和冷凍所選擇的細(xì)胞類型；其中X為位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)，P為轉(zhuǎn)錄控制元件，I為編碼標(biāo)記的序列，其中該標(biāo)記包括轉(zhuǎn)化劑。
還公開了獲得干細(xì)胞來(lái)源的有條件地永生的細(xì)胞類型的方法，包括用含有權(quán)利要求11所述的核酸分子構(gòu)建體X-P-I-X的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染多潛能干細(xì)胞；將該細(xì)胞與一種環(huán)境接觸以使轉(zhuǎn)錄控制因子被激活并使I優(yōu)勢(shì)表達(dá)或選擇性表達(dá)；選擇表達(dá)I的干細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞類型；切除含有P-I核酸分子的構(gòu)建體；以及，克隆和冷凍所選擇的細(xì)胞類型；其中X為位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)，P為轉(zhuǎn)錄控制元件，I為編碼標(biāo)記的序列，其中該標(biāo)記包括轉(zhuǎn)化劑。
還公開了治療患者的方法，包括移植來(lái)源于干細(xì)胞的細(xì)胞類型。還公開了治療患者的方法，包括移植來(lái)源于干細(xì)胞的細(xì)胞類型。還公開了測(cè)定組合物毒性的方法，包括將組合物與來(lái)源于干細(xì)胞的細(xì)胞共同培養(yǎng)。
該核酸區(qū)段可以是異源核酸區(qū)段。該核酸區(qū)段可以是外源核酸區(qū)段。所述標(biāo)記可以是異源的。I可以是異源核酸序列。P和I可以包含于相同的載體中。P和I可以包含于不同的載體中。該核酸區(qū)段還可包括自殺基因。P可以是組織特異性轉(zhuǎn)錄元件。P可以是細(xì)胞類型特異性轉(zhuǎn)錄控制元件。P可以是細(xì)胞譜系特異性轉(zhuǎn)錄控制元件。P可以是細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄控制元件。P可使得I優(yōu)勢(shì)表達(dá)或選擇性表達(dá)。
所述標(biāo)記包括溫度許可性無(wú)限增殖因子。轉(zhuǎn)化劑可以是溫度許可因子。I可包括SV40大T抗原.該核酸區(qū)段側(cè)翼可有位點(diǎn)特異性切除序列。I側(cè)翼可有位點(diǎn)特異性切除序列。P側(cè)翼可有位點(diǎn)特異性切除序列。該核酸區(qū)段還可包括X，其中X可以是位點(diǎn)特異性切除序列，其中X位于P-I側(cè)翼，其中該核酸區(qū)段包含X-P-I-X結(jié)構(gòu)。該核酸區(qū)段可在X處被切除。X可以是loxP位點(diǎn)。
轉(zhuǎn)錄控制元件可被激活的條件可為干細(xì)胞分化的條件。干細(xì)胞可在轉(zhuǎn)錄控制元件被激活的條件下分化?？赏ㄟ^使得干細(xì)胞自發(fā)分化為類胚胎體來(lái)激活轉(zhuǎn)錄控制元件。所述核酸區(qū)段可從分化細(xì)胞中切除?？捎孟俨《窘閷?dǎo)的位點(diǎn)特異性切除法將該核酸區(qū)段切除?？捎弥亟M酶將該核酸區(qū)段切除。所述重組酶可以是Cre。該核酸區(qū)段的切除導(dǎo)致該核酸區(qū)段可被切除的該核酸分子的重組。
I的表達(dá)的效果可被逆轉(zhuǎn)。I的表達(dá)的效果可為分化細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，其中I的表達(dá)的效果的逆轉(zhuǎn)可為分化細(xì)胞轉(zhuǎn)化的逆轉(zhuǎn)。可通過表達(dá)顯性負(fù)性轉(zhuǎn)化劑逆轉(zhuǎn)I的表達(dá)的效果。可通過切除所述核酸區(qū)段逆轉(zhuǎn)I的表達(dá)的效果。分化細(xì)胞可以是肝細(xì)胞。分化細(xì)胞可以是干細(xì)胞來(lái)源的有條件地永生的細(xì)胞。
分化細(xì)胞可通過將分化細(xì)胞給予受試者而導(dǎo)入。分化細(xì)胞可通過將分化細(xì)胞移植至受試者體內(nèi)而導(dǎo)入。轉(zhuǎn)錄控制元件可被激活的條件可以是干細(xì)胞分化的條件。干細(xì)胞可在轉(zhuǎn)錄控制元件被激活的條件下分化。轉(zhuǎn)錄控制元件可通過使得干細(xì)胞自發(fā)分化成類胚胎體而被激活。
所述方法還可包括選擇表達(dá)I的細(xì)胞。該方法還可包括增加表達(dá)I的細(xì)胞的純度。增加純度可包括形成克隆的或半純化的細(xì)胞群。該方法還可包括切除核酸區(qū)段。該方法還可包括克隆分化細(xì)胞。該方法還可包括培養(yǎng)分化細(xì)胞。該方法還可包括冷凍分化細(xì)胞。該方法還可包括將目的基因加至所選的細(xì)胞。該方法還可包括切除核酸區(qū)段；以及冷凍所選擇的細(xì)胞。當(dāng)所述核酸區(qū)段被切除時(shí)，先前含有該核酸區(qū)段的核酸的末端可重組。該方法還可包括培養(yǎng)表達(dá)I的細(xì)胞。該方法還可包括克隆所培養(yǎng)的表達(dá)I的細(xì)胞。該方法還可包括將分化細(xì)胞導(dǎo)入受試者。
分化細(xì)胞可通過將分化細(xì)胞給予受試者而導(dǎo)入。分化細(xì)胞可通過將分化細(xì)胞移植至受試者體內(nèi)而導(dǎo)入。該方法還可包括將組合物與分化細(xì)胞一同培養(yǎng)，以及對(duì)分化細(xì)胞測(cè)定毒性效應(yīng)。該方法還可包括將化合物與分化細(xì)胞一同培養(yǎng)，以及對(duì)分化細(xì)胞測(cè)定毒性效應(yīng)。該方法還可包括將組合物與分化細(xì)胞一同培養(yǎng)，以及對(duì)分化細(xì)胞測(cè)定目標(biāo)效應(yīng)。該方法還可包括將化合物與分化細(xì)胞一同培養(yǎng)，以及對(duì)分化細(xì)胞測(cè)定目標(biāo)效應(yīng)。該方法還可包括通過選擇標(biāo)記來(lái)選擇分化細(xì)胞。該方法還可包括篩選出鑒定為表達(dá)標(biāo)記的分化細(xì)胞。干細(xì)胞可在轉(zhuǎn)錄控制元件被激活的條件下分化。轉(zhuǎn)錄控制元件可通過使得干細(xì)胞自發(fā)分化為類胚胎體而被激活。
所述標(biāo)記可由異源核酸表達(dá)。該核酸還可包括自殺基因。P可以是組織特異性轉(zhuǎn)錄控制元件。P可使得I優(yōu)勢(shì)表達(dá)或選擇性表達(dá)。無(wú)限增殖因子可以是溫度許可性因子。I可包括SV40大T抗原。所述核酸分子側(cè)翼可有位點(diǎn)特異性切除序列。I側(cè)翼可有位點(diǎn)特異性切除序列。P側(cè)翼可有位點(diǎn)特異性切除序列。P-I側(cè)翼可有位點(diǎn)特異性切除序列X而形成X-P-I-X?？墒褂孟俨《窘閷?dǎo)的位點(diǎn)特異性切除將包括P-I結(jié)構(gòu)的核酸分子切除。包括P-I結(jié)構(gòu)的核酸分子的切除可導(dǎo)致未切除的核酸分子重組。
所述方法還可包括增加表達(dá)I的細(xì)胞群純度。增加純度可包括形成克隆的或半純化的細(xì)胞群。該方法還可包括切除所述核酸。該方法還可包括冷凍所選擇的細(xì)胞類型。該方法還可包括將目的基因加至所述細(xì)胞群?？刂圃的激活可包括使得干細(xì)胞培養(yǎng)物自發(fā)分化為類胚胎體。該方法還可包括克隆所培養(yǎng)的表達(dá)I的細(xì)胞。
P-I可被切除。P-I可通過腺病毒介導(dǎo)的位點(diǎn)特異性切除法在X處被切除。P-I的切除使得先前含有包含P-I核酸分子的構(gòu)建體的核酸重組。P和I可包含于相同的載體中。P和I可包含于不同的載體中。
G.實(shí)施例提出下面的實(shí)施例以提供給本領(lǐng)域普通技術(shù)人員關(guān)于如何制得和評(píng)估本申請(qǐng)所要求保護(hù)的化合物、組合物、物品、裝置和/或方法的完整公開和描述，并且這些實(shí)施例是純粹為示例性的而不非依在限制所公開的內(nèi)容。已努力確保關(guān)于數(shù)字方面(如數(shù)量和溫度等)的準(zhǔn)確性，但是某些誤差和偏差是可以解釋的。除非另有說明，份數(shù)是重量份數(shù)，溫度以℃計(jì)或者處于環(huán)境溫度，壓力為大氣壓或者接近大氣壓。
實(shí)施例1-利用激活的/顯性負(fù)性轉(zhuǎn)化基因?qū)M(jìn)行人類肝細(xì)胞細(xì)胞系的鑒定利用激活的和顯性負(fù)性轉(zhuǎn)化基因的連續(xù)表達(dá)對(duì)始于人類EG細(xì)胞的人類肝細(xì)胞系的鑒定可如下所述地進(jìn)行。可用含人類乙肝病毒核心啟動(dòng)子/增強(qiáng)子(SEQ ID NO1)驅(qū)動(dòng)激活的H-RAS基因(SEQ ID NO2)的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染人類EG細(xì)胞，該構(gòu)建體任選還含有蛻皮激素可誘導(dǎo)的基因開關(guān)啟動(dòng)子(SEQ ID NO3)驅(qū)動(dòng)的顯性負(fù)性H-RAS基因(SEQ ID NO4)(Sandig et al.，(1996)Gene Therapy 3，1002-1009；Saez et al.，(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.97，14512-14517)。激活的H-RAS基因可在EG細(xì)胞分化后被轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)化的肝細(xì)胞可在軟瓊脂中分離、克隆、增殖和冷凍。將培養(yǎng)物以低密度鋪板，然后用松甾酮A處理以誘導(dǎo)顯性負(fù)性RAS并逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化。細(xì)胞如預(yù)期地生長(zhǎng)停滯于匯合密度以下。由產(chǎn)生的清蛋白、可證實(shí)cyp1A和cyp3A為肝細(xì)胞。
可使用pHBV-aRAS和ACTEG1細(xì)胞進(jìn)行這種轉(zhuǎn)化以生成可被從類胚胎體中識(shí)別的肝細(xì)胞系。
a)方法(1)質(zhì)粒如圖2所示的質(zhì)粒pLS-RAS含有驅(qū)動(dòng)激活的H-Ras轉(zhuǎn)錄的來(lái)自乙肝病毒的啟動(dòng)子增強(qiáng)子以及驅(qū)動(dòng)顯性負(fù)性H-Ras的蛻皮激素可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。含有Ras的質(zhì)粒可獲自Upstate，Inc.。激活的Ras質(zhì)粒和顯性負(fù)性Ras質(zhì)粒均可用Bg1 II和BamHI消化以移除CMV啟動(dòng)子增強(qiáng)子。通過PCR擴(kuò)增可從pEco63(ATCC)分離出對(duì)應(yīng)于人類乙肝病毒1610至1810核苷酸的序列。該區(qū)段可連接至Bg1 II/BamHI酶切的、含有激活的Ras的質(zhì)粒，以形成pHBV-Ras(圖2)。當(dāng)需要成為構(gòu)建體的一部分時(shí)，對(duì)應(yīng)于pEGSH(Stratagene，在Salk Institute許可下)的蛻皮激素可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子的序列可通過PCR擴(kuò)增獲得，并可連接至Bg1II/BamHI酶切的、含有顯性負(fù)性Ras的質(zhì)粒以形成pEcdys-Ras(圖2)。
含有蛻皮激素可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子、顯性負(fù)性Ras和polyA添加位點(diǎn)的序列可通過PCR從pEcdys-Ras擴(kuò)增。質(zhì)粒pLS-Ras可通過下述方法構(gòu)建將線性化pHBV-Ras用SspI消化，再將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物平端連接到氨芐青霉素抗性基因和HBV啟動(dòng)子和增強(qiáng)子之間。
(2)細(xì)胞培養(yǎng)人類EG細(xì)胞系A(chǔ)CTEG1可在含15％Knockout血清替代物的Knockout DMEM(均來(lái)自Invitrogen)中的小鼠STO飼養(yǎng)層上培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基添加了如下列文獻(xiàn)所述的用于其他EG細(xì)胞系的谷氨酰胺、巰基乙醇、非必需氨基酸、毛喉素或LIF、堿性成纖維生長(zhǎng)因子和白血病抑制因子(美國(guó)專利5,690,926、5,670,372和5,453,357，deMiguel and Donovan，(2002)Meth.Enzymol.365，353-363)。可通過電穿孔將pHBV-aRAS轉(zhuǎn)染至ACTEG1(人類生殖嵴來(lái)源干細(xì)胞，它為多潛能干細(xì)胞)中，以實(shí)現(xiàn)從EG細(xì)胞系中分離特定細(xì)胞系?？稍诨|(zhì)膠平板上選擇G418抗性的集落。將會(huì)選擇出ACTEG-RAS以用于進(jìn)一步研究。
為了誘導(dǎo)分化，可從基質(zhì)膠包被的平板上將細(xì)胞取出，并可通過懸滴培養(yǎng)形成聚集體。兩天后可收集類胚胎體并重鋪于未包被的培養(yǎng)皿中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。每?jī)商煸亠曫B(yǎng)細(xì)胞一次。在第12天時(shí)可收集EB，并將其懸于含有含5％精制小牛血清的Amphioxus Cell TechnologiesMed3的軟瓊脂中。一周內(nèi)在瓊脂中即可見集落?？商暨x集落，將其分散于5％血清的Med中并將其鋪于24孔板中?？勺源蠖囝惻咛ンw形成轉(zhuǎn)化的集落。這些集落為肝細(xì)胞標(biāo)記例如cyp1A和cyp3A陽(yáng)性。
可測(cè)定來(lái)自匯合的培養(yǎng)物的培養(yǎng)基中產(chǎn)生的清蛋白。細(xì)胞可用胰蛋白酶消化并使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)。然后將細(xì)胞懸于足夠的細(xì)胞培養(yǎng)基中使得懸液中的細(xì)胞密度近似為每毫升3個(gè)細(xì)胞。然后可將懸液等分于96孔板的孔中，每孔200微升。得到的培養(yǎng)物每孔少于1個(gè)細(xì)胞。通過此方式，顯現(xiàn)的集落已知由單個(gè)細(xì)胞產(chǎn)生。這樣就確保了該克隆群具有同種遺傳背景。
同樣的克隆步驟可用于從混合的群中分離特定細(xì)胞類型的細(xì)胞。如果軟瓊脂中產(chǎn)生的集落為混合譜系的，如上所述地克隆細(xì)胞可將它們分為各自同質(zhì)的群體。然后可通過任意的多種機(jī)制檢查這些克隆中的目的細(xì)胞類型。通常的方法可在培養(yǎng)上清液中測(cè)量已知的分泌蛋白質(zhì)。例如，對(duì)肝細(xì)胞集落分析時(shí)可測(cè)量清蛋白。鑒定特定細(xì)胞類型的其他方法為形態(tài)學(xué)目測(cè)檢查，用特異性針對(duì)該細(xì)胞類型產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的抗體進(jìn)行染色，或測(cè)量由該細(xì)胞類型產(chǎn)生的特定RNA。
(3)基因開關(guān)感受系(gene switch competent line)的產(chǎn)生為了產(chǎn)生基因開關(guān)感受系，可利用電穿孔用pERV3(StratageneCorp)轉(zhuǎn)染ACTEG1細(xì)胞以插入蛻皮激素受體。該質(zhì)粒pERV3(或來(lái)自Invitrogen的pVgRXR)編碼蛻皮激素敏感啟動(dòng)子的表達(dá)所必需的雜交體蛻皮激素受體。在基質(zhì)膠包被的平板上選擇潮霉素抗性的集落。將會(huì)選擇出ACTEG1-Hyg1用于進(jìn)一步研究。如果使用pVgRXR，則選擇Zeocin抗性的集落?？蛇x擇出ACTEG1-Zeo1用于進(jìn)一步研究。關(guān)閉轉(zhuǎn)化基因后可產(chǎn)生細(xì)胞系的凋亡。(Hilger，RA，et al.，(2002)Onkologie 25，511-518)。由于可使用不同的激素濃度調(diào)節(jié)或滴定所產(chǎn)生的顯性負(fù)性的量，因而蛻皮激素啟動(dòng)子系統(tǒng)可抑制凋亡。
若使用pERV3，則可利用電穿孔用pLS-Ras轉(zhuǎn)染ACTEG1-Hygl?？蛇x擇并擴(kuò)增G418抗性的集落?？蛇x擇出ACTEG1-Hyg。若使用pVgRXR，則可利用電穿孔用pLS-Ras轉(zhuǎn)染ACTEG1-Zeo1。可選擇并擴(kuò)增G418抗性的集落。可選擇出ACTEG1-ZeoNeo(AZN)。
為了誘導(dǎo)分化，將細(xì)胞從基質(zhì)膠包被的平板中取出，通過懸滴培養(yǎng)形成聚集體。兩天后，可收集類胚胎體并重鋪于未包被的培養(yǎng)皿中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。每?jī)商煸亠曫B(yǎng)培養(yǎng)物一次。在第12天時(shí)可收集EB，將其懸于含有含5％精制小牛血清的Amphioxus Cell TechnologiesMed3的軟瓊脂中。一周內(nèi)瓊脂中即可見集落?？商暨x集落，將其分散于含5％血清的Med3中，并將其鋪于24孔板中。
可測(cè)定來(lái)自匯合的培養(yǎng)物的培養(yǎng)基中產(chǎn)生的人類清蛋白。集落應(yīng)是陽(yáng)性的。可通過有限稀釋，在96孔板中選擇和克隆幾種培養(yǎng)物。ACTHep1至ACTHep6的細(xì)胞系可在75cm2的平板中生長(zhǎng)至匯合，用胰蛋白酶消化并冷凍于可控速度的冷凍機(jī)中，然后在液氮的蒸汽相中貯存。
可進(jìn)一步對(duì)ACTHep1-6進(jìn)行表征?？扇缟纤鍪垢鞴芙鈨霾⒃诤?％血清的Med3中鋪板。可擴(kuò)增細(xì)胞，然后以每孔10,000細(xì)胞的密度將細(xì)胞鋪于96孔板中。過夜培養(yǎng)后，可將培養(yǎng)基更換為含5％血清以及10μM松甾酮A的Med3。再過24小時(shí)后，細(xì)胞生長(zhǎng)終止，并停滯于匯合密度以下。選擇具有立方形外觀且具有明顯核的肝細(xì)胞?？捎僧a(chǎn)生清蛋白、乙氧基試鹵靈(ethoxyresorufin)代謝為試鹵靈(resorufin)(cyp1A活性)以及由睪酮形成6-β羥基睪酮(cyp3A活性)來(lái)確認(rèn)肝細(xì)胞(Kelly，JH，Sussman，NL(2000)J.Biomol.Scr.5，249-253)。
實(shí)施例2-利用CRE/lox重組而回復(fù)的人類肝細(xì)胞系的鑒定通過激活轉(zhuǎn)化基因的組織特異性表達(dá)，然后用Cre重組酶切除，可鑒定人類肝細(xì)胞系。人類生殖嵴來(lái)源干細(xì)胞可用含驅(qū)動(dòng)激活的H-RAS基因(側(cè)翼有l(wèi)oxP位點(diǎn))的人類乙肝病毒啟動(dòng)子/增強(qiáng)子轉(zhuǎn)染。可如上所述地分離肝細(xì)胞譜系的細(xì)胞系。可用表達(dá)Cre重組酶的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞以切除激活的癌基因。Cre重組酶處理的細(xì)胞會(huì)停止分裂并表達(dá)分化的肝細(xì)胞的標(biāo)記，例如清蛋白的產(chǎn)生、cyp1和cyp3的表達(dá)。
a)方法(1)質(zhì)粒肝細(xì)胞特異性選擇質(zhì)粒pHBV-aRas如上所述可用于通過插入合成的loxP寡聚體(SEQ ID NO5和6)構(gòu)建ploxHBV-aRas。SspI可用于將pHBV-aRas在氨芐青霉素抗性基因和HBV啟動(dòng)子/增強(qiáng)子之間線性化。寡聚體5’ATT ATA ACT TCG TAT AAT GTA TGC TAT ACG AAG TTA T3’(SEQ ID NO5)可被連接以在5’側(cè)以重構(gòu)Ssp1位點(diǎn)。然后可用BbsI使該質(zhì)粒線性化，寡聚體5’ATA ACT TCG TAT AAT GTA TGC TAT ACG AAGTTA TGA AGA C3’(SEQ ID NO6)可被連接以在3’側(cè)以重構(gòu)BbsI。得到的質(zhì)粒ploxHBV-aRas示于圖4。
(2)細(xì)胞培養(yǎng)如上所述培養(yǎng)人類EG細(xì)胞系A(chǔ)CTEG-1。采用電穿孔將質(zhì)粒ploxHBV-aRas轉(zhuǎn)染至ACTEG-1中，利用G418選擇集落。
如上所述可在軟瓊脂中的分化以及選擇之后分離肝細(xì)胞。細(xì)胞系Heplox1至Heplox6可被擴(kuò)增和冷凍。
可擴(kuò)增Heplox1。以10,000個(gè)細(xì)胞/cm2的密度將細(xì)胞鋪于含5％精制小牛血清的Med3中。含有在CMV啟動(dòng)子控制下的Cre重組酶基因的質(zhì)粒pBS185可通過電穿孔被導(dǎo)入至Heplox1中。兩天后，大量的細(xì)胞應(yīng)停止分裂。如上所述測(cè)定培養(yǎng)物中清蛋白的產(chǎn)生以及cyp1A和cyp3A的活性。
ploxHBV-aRas的切除效率不可能是100％。隨著培養(yǎng)時(shí)間增加，未被切除轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的集落可能會(huì)變得明顯。可采用其他策略例如在丙氧鳥苷(gancyclovir)中的二次選擇，以獲得被切除的細(xì)胞的100％選擇。單純皰疹病毒胸苷激酶賦予人類細(xì)胞對(duì)丙氧鳥苷的敏感性。若HSV-TK基因被包括在初始選擇質(zhì)粒中，則保留了該質(zhì)粒的細(xì)胞會(huì)在存在丙氧鳥苷時(shí)死亡。通過使用CRE重組酶逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化，然后在丙氧鳥苷中培養(yǎng)，則只有缺失了ploxHBV-aRAS的細(xì)胞才會(huì)存活。轉(zhuǎn)化是可逆轉(zhuǎn)的。待檢測(cè)的特征可為細(xì)胞抑制在低于匯合的密度，肝特異性特征的表達(dá)的放大?？赏ㄟ^PCNA和BrdU染色進(jìn)行細(xì)胞分裂的測(cè)量；可進(jìn)行清蛋白ELISA、產(chǎn)生乙氧基試鹵靈代謝、二芐基熒光素的代謝。
實(shí)施例3-利用溫度敏感的轉(zhuǎn)化基因?qū)θ祟惛渭?xì)胞系的鑒定。
利用組織特異性啟動(dòng)子和溫度敏感的轉(zhuǎn)化基因的表達(dá)可進(jìn)行人類肝細(xì)胞系的鑒定。可用含有驅(qū)動(dòng)溫度敏感性激活的RAS基因(SEQ IDNO7)的人類乙肝病毒啟動(dòng)子轉(zhuǎn)染人類生殖嵴來(lái)源多潛能干細(xì)胞(DeClue et al.，(1991)Mol.Cell.Biol.11，3132-3138)。類胚胎體在37℃分化12天后，可將集落分散于軟瓊脂中并在32℃培養(yǎng)。如上所述可分離肝細(xì)胞譜系的細(xì)胞。當(dāng)將這些細(xì)胞重鋪板并調(diào)至39℃時(shí)，它們停止分裂并表達(dá)人類肝細(xì)胞的標(biāo)記，例如清蛋白、cyp1A和cyp3A.
(a)方法(1)質(zhì)粒通過寡核苷酸定向誘變(Promega)可將aRAS的絲氨酸39突變?yōu)镃ys39。通過EcoRI可將激活的RAS從pHBV-aRAS中切除并將其亞克隆至可選擇的質(zhì)粒pALTER1中。寡核苷酸5’-GAATACGACCCCACTATAGAGGATTGCTACCGGAAGCAGGTGGTCATTGAT-3’可用于將絲氨酸39變?yōu)榘腚装彼?9(SEQ ID NO8)?？赏ㄟ^抗生素選擇使得適宜的質(zhì)粒留存，并就該插入物對(duì)質(zhì)粒測(cè)序以確保準(zhǔn)確性?？捎肊coR1將突變的aRAS(現(xiàn)稱為tsaRAS)從pALTER中切除，并插入EcoR1切割的pHBV-aRAS中以產(chǎn)生pHBV-tsaRAS。
(2)細(xì)胞培養(yǎng)可如上所述地培養(yǎng)人類生殖嵴來(lái)源多潛能干細(xì)胞系A(chǔ)CTEG-1。采用電穿孔轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pHBV-tsaRAS，可選擇G418抗性的集落。在如上所述的分化后，在32℃培養(yǎng)軟瓊脂板以分離轉(zhuǎn)化的人類肝細(xì)胞系?？煞蛛x、克隆和冷凍ACTtsHepl至6。選擇ACTtsHepl用于進(jìn)一步表征。于32℃培養(yǎng)的細(xì)胞可用胰蛋白酶消化，以10,000個(gè)細(xì)胞/cm2鋪板，然后在39℃下培養(yǎng)。兩天內(nèi)細(xì)胞停止分裂，停滯于匯合密度以下，并表達(dá)人類肝細(xì)胞標(biāo)記例如清蛋白、cyp1A和cyp3A。
可利用可逆轉(zhuǎn)化基因的組織特異性表達(dá)來(lái)選擇多種細(xì)胞類型。利用RAS或一些其他轉(zhuǎn)化基因可實(shí)現(xiàn)幾種其他細(xì)胞類型的分離。分離的細(xì)胞的分析可包括分析被選擇的細(xì)胞類型的特征標(biāo)記的表達(dá)。
實(shí)施例4-在中空纖維生物反應(yīng)器中培養(yǎng)本文所公開的一種肝細(xì)胞系，以形成肝輔助裝置的基礎(chǔ)a)方法基本按Amphioxus Cell Technologies中所述的人類肝臟細(xì)胞系HepG2/C3A的培養(yǎng)法在中空纖維生物反應(yīng)器中培養(yǎng)ACTHep1和ACTtsHep1(Sussman et al，Hepatology 16，60-65，1992)。簡(jiǎn)而言之，用含血清的培養(yǎng)基在滾瓶中培養(yǎng)細(xì)胞。各含有約1g細(xì)胞的兩瓶細(xì)胞用胰蛋白酶消化，懸于50ml培養(yǎng)基中，并接種至中空纖維藥筒的毛細(xì)管外側(cè)。將這些藥筒保持在自動(dòng)系統(tǒng)例如Cellex Maximizer系統(tǒng)中。接種后，可將這些藥筒在含胰島素的無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)約兩周，在此期間它們?cè)鲋持脸錆M培養(yǎng)空間。每天監(jiān)測(cè)葡萄糖的消耗和清蛋白的產(chǎn)生，每天葡萄糖的消耗在約12g時(shí)達(dá)到峰值，每天產(chǎn)生超過1g的人類清蛋白(Kelly，(1997)IVD Technology 3，30-37)。
對(duì)于這些裝置中的HepG2/C3A，它們復(fù)制肝特異性生物化學(xué)的能力已得到全面的表征。對(duì)裝有ACTHep1和ACTtsHep1細(xì)胞系的裝置可進(jìn)行類似的分析?？蓮闹T如生長(zhǎng)曲線和培養(yǎng)基消耗的速度的基礎(chǔ)指標(biāo)開始這些研究。人們可確定它們與腫瘤來(lái)源的細(xì)胞系有多少相似。例如，HepG2/C3A可基本上無(wú)限期地保持在這些裝置中。對(duì)于腫瘤來(lái)源的細(xì)胞系有一點(diǎn)是清楚的，當(dāng)細(xì)胞死亡被新細(xì)胞所替代時(shí)就確立了某種穩(wěn)定狀態(tài)?？蓽y(cè)定達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)所需的ACTHep1細(xì)胞的量，并且，由于細(xì)胞不是轉(zhuǎn)化的細(xì)胞而且在回復(fù)后不會(huì)在裝置中無(wú)限分裂，因而可添加新的細(xì)胞?？蓽y(cè)定這些裝置通過產(chǎn)生尿素代謝氨，代謝藥物例如利多卡因、咖啡因和咪達(dá)唑侖，從丙酮酸和乳酸合成葡萄糖以及產(chǎn)生血清蛋白質(zhì)例如清蛋白、運(yùn)鐵蛋白和IX因子的能力。
實(shí)施例5-一組用于毒理學(xué)檢測(cè)的包含多種組織類型的匹配細(xì)胞系的產(chǎn)生(a)方法以上構(gòu)建的質(zhì)粒可構(gòu)成選擇新細(xì)胞系的基礎(chǔ)。為合適的組織選擇組織特異性啟動(dòng)子/增強(qiáng)子，然后將其拼接入質(zhì)粒以取代HBV序列。可具代表性的組織包括例如肝、腎、心、腦、肌肉和腸。這涉及到多種細(xì)胞類型，例如對(duì)于腦就可選擇幾種細(xì)胞系，例如神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細(xì)胞等。這些細(xì)胞的每一種可例如由相同的多潛能細(xì)胞系產(chǎn)生，例如從如上所述的人類EG細(xì)胞系A(chǔ)CTEG1產(chǎn)生。因此，這組細(xì)胞具有相同的基因型，提供了多種優(yōu)勢(shì)。
實(shí)施例6-體外免疫系統(tǒng)(IVIS)的產(chǎn)生單克隆抗體(MAB)技術(shù)在25年多前就由Kohler和Milstein開發(fā)了(Kohler and Milstein，(1975)Nature 256，495-497)。然而，治療應(yīng)用的MAB仍相對(duì)很少。主要原因是小鼠單克隆抗體被識(shí)別為外源物質(zhì)，因此作為治療劑而言具有很短的有效壽命。目前市場(chǎng)上的MAB是通過向抗體基因中引入突變而被“人源化”的，所述突變是用人類抗體中存在的氨基酸替換小鼠的那些氨基酸。
全人抗體的生產(chǎn)目前被多個(gè)問題所阻礙。將抗原注射至小鼠，然后幾天后取其脾，與小鼠骨髓瘤融合以無(wú)限增殖化，從而產(chǎn)生小鼠單克隆抗體。將抗原注入人體通常不可行，在少許的此類嘗試的示例中也以失敗而告終。此外，目前技術(shù)上還不允許取人類的脾，因而需要使用外周血細(xì)胞。最后，合適的人類骨髓瘤非常難以分離。
IVIS可通過將整個(gè)人類抗體產(chǎn)生系統(tǒng)移至試管中而避開了這些問題。從本文所述的干細(xì)胞開始，可產(chǎn)生例如多潛能干細(xì)胞或EG細(xì)胞、匹配的T細(xì)胞、B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞系?？蛇x擇B和T細(xì)胞，使其處于適宜分化時(shí)期以使其適于被抗原免疫。由于三個(gè)細(xì)胞系是由相同親代系發(fā)育而來(lái)，它們應(yīng)具有相同的遺傳背景，極其類似于人類自身的免疫系統(tǒng)。細(xì)胞可彼此識(shí)別并以復(fù)合的相互協(xié)作的方式作用以刺激B細(xì)胞增殖和抗體合成。因?yàn)樵摲蛛x步驟可使B細(xì)胞有條件地?zé)o限增殖，所以可分離該產(chǎn)生抗體的細(xì)胞，之后可按從實(shí)驗(yàn)室級(jí)別至生產(chǎn)級(jí)別的任意所需量生長(zhǎng)。
(a)方法
(1)質(zhì)粒每種必需的質(zhì)?？蓮膒LS-RAS構(gòu)建而得，含有活性ras和顯性負(fù)性ras。對(duì)于B細(xì)胞的選擇，pB-RAS可通過首先用BamH1切除HBV啟動(dòng)子/增強(qiáng)子來(lái)構(gòu)建。人類免疫球蛋白重鏈啟動(dòng)子可連接至該位點(diǎn)以形成pB-RAS。對(duì)于T細(xì)胞的選擇使用前T細(xì)胞啟動(dòng)子(pT-RAS)，對(duì)于巨噬細(xì)胞的選擇使用人類CHI 3L1基因啟動(dòng)子，從而制得類似的構(gòu)建體。指導(dǎo)B、T和巨噬細(xì)胞系的分化所需的骨髓間質(zhì)細(xì)胞系可用來(lái)自骨髓間質(zhì)細(xì)胞抗原1(BST1)基因的啟動(dòng)子來(lái)選擇。
(2)骨髓間質(zhì)細(xì)胞的選擇可將BST1啟動(dòng)子連接至Bam/Bg1 II酶切的pLS-RAS中以制得pBST-RAS?？蓪⑺D(zhuǎn)染至ACTEG-1中，并可通過EB的形成啟動(dòng)分化。在EB形成后5天產(chǎn)生所得的骨髓間質(zhì)細(xì)胞系A(chǔ)CT-BMST1(Kramer et al，Meth.Enzymol.365，251-268，2003)，可通過BST1的表達(dá)進(jìn)行表征。
(3)B細(xì)胞的選擇B細(xì)胞可從ACTEG-1發(fā)育而來(lái)?？扇缟纤龅貙①|(zhì)粒pB-RAS轉(zhuǎn)染至干細(xì)胞中。可如文獻(xiàn)中所述地啟動(dòng)B細(xì)胞由轉(zhuǎn)染干細(xì)胞系的分化(Cho，SK，Zuniga-Pflucker，JC Meth.Enzymol.365，158-169，2003)。人類ACT-BMST1可代替小鼠OP9間質(zhì)細(xì)胞系。人類Ig重鏈可用于選擇任意發(fā)育時(shí)期的B細(xì)胞?？删虸g輕鏈的產(chǎn)生對(duì)幾種細(xì)胞系進(jìn)行表征以分離適宜發(fā)育時(shí)期的B細(xì)胞。
(4)T細(xì)胞選擇T細(xì)胞可通過含前T細(xì)胞受體啟動(dòng)子的質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染而從ACTEG-1發(fā)育而來(lái)。分離此干細(xì)胞系后，可如文獻(xiàn)中所述地進(jìn)行T細(xì)胞分化(Schmitt et al.Nat.Immunol.5，410-417，2004)。ACT-BMST1可代替小鼠OP9間質(zhì)細(xì)胞系。成熟T細(xì)胞可通過CD4和CD8抗原的表達(dá)來(lái)進(jìn)行表征。
(5)巨噬細(xì)胞的選擇人類巨噬細(xì)胞系可通過含驅(qū)動(dòng)ras的CHI 3L1基因啟動(dòng)子的質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染而從ACTEG-1發(fā)育而來(lái)。第6天的類胚胎體中有大量的巨噬細(xì)胞集落(Kennedy and Keller，Meth.Enzymol.365，39-59，2003)。
(6)體外免疫系統(tǒng)每個(gè)各自的細(xì)胞系均可被克隆、表征和冷凍。可在24孔板中的匹配的ACT-BMST1系上培養(yǎng)無(wú)限增殖的、匹配的B、T和巨噬細(xì)胞系。兩周內(nèi)每三天可將抗原與新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)基一起加入。兩周內(nèi)每次加入培養(yǎng)基時(shí)，可通過酶聯(lián)免疫測(cè)定法測(cè)定上清液中抗原特異性抗體的存在。檢測(cè)到抗體后，可稀釋并克隆孔中的各細(xì)胞。經(jīng)過驗(yàn)證后，就可從每個(gè)B細(xì)胞克隆中繼續(xù)產(chǎn)生抗體?？蓪⒈磉_(dá)適宜抗原的克隆冷凍用于進(jìn)一步表征或者生產(chǎn)。
實(shí)施例7-人類胚胎生殖細(xì)胞系Hay1的建立采用Matsui等人((1992)Cell 70，841-847)所述的技術(shù)建立人類EG系。簡(jiǎn)而言之，從10周的男性胚胎中解剖出生殖嵴，用胰蛋白酶-EDTA解離，并鋪于輻照STO飼養(yǎng)層上?？捎锰砑恿朔潜匦璋被岷挺?巰基乙醇、60ng/ml人類干細(xì)胞因子(SCF)、10ng/ml人類白血病抑制因子(LIF)和10ng/ml人類堿性成纖維生長(zhǎng)因子(FGF)的含15％胎牛血清的DMEM每天飼養(yǎng)細(xì)胞。在第5天，對(duì)兩個(gè)培養(yǎng)瓶中的一個(gè)進(jìn)行堿性磷酸酶染色。觀察到許多陽(yáng)性細(xì)胞。在第6天，細(xì)胞用胰蛋白酶-EDTA傳代，并以1分4的方式分至新鮮的輻照STO層上。重復(fù)該過程，每次傳代均進(jìn)行堿性磷酸酶染色。在第5代時(shí)，使用可控速度的冷凍機(jī)，將幾小管細(xì)胞冷凍于15％胎牛血清以及10％二甲基亞砜的DMEM中。此后該細(xì)胞在絲裂霉素C處理過的STO飼養(yǎng)層上常規(guī)傳代。
(a)Hay1的特征如下所述，飼養(yǎng)層上以及塑料上的Hay1細(xì)胞如同與遷移的原始生殖細(xì)胞類似的延長(zhǎng)細(xì)胞一樣生長(zhǎng)(Shamblott et al.(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.95，13726-13731；Turnpenny et al.(2003)StemCells 21，598-609)。Hay1顯示出的形態(tài)與Turnpenny等人所述的細(xì)胞相同。除了堿性磷酸酶，細(xì)胞還對(duì)SSEA-1、TRA1-60以及TRA1-80染色呈陽(yáng)性。人類EG細(xì)胞不同于人類ES細(xì)胞的一個(gè)特征是表達(dá)SSEA-1。核型的確定以及多組織腫瘤的形成正在進(jìn)行中。當(dāng)轉(zhuǎn)用低貼壁塑料且無(wú)飼養(yǎng)物或激素添加物時(shí)，它們易形成囊狀類胚胎體。當(dāng)將這些類胚胎體重鋪于組織培養(yǎng)塑料上時(shí)，細(xì)胞表現(xiàn)出顯著不同的形態(tài)以及喪失堿性磷酸酶的表達(dá)。
(b)在確定的條件下的Hay1的培養(yǎng)飼養(yǎng)層的使用使得干細(xì)胞在多方面的應(yīng)用中的用途變得復(fù)雜。飼養(yǎng)層的使用顯著提高了標(biāo)準(zhǔn)體外毒性測(cè)定例如MTT或刃天青還原中的背景，使得結(jié)果混淆。Hay1可在確定的條件下常規(guī)生長(zhǎng)。標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基由KO-DMEM、15％KO血清替代物、谷氨酰胺、非必需氨基酸、β-MeSH、10ng/ml制瘤素M、10ng/ml SCF和25ng/ml bFGF組成。使用該培養(yǎng)基，Hay1持續(xù)表達(dá)上文所列舉的標(biāo)記并且約每3至4天倍增。這比它們?cè)陲曫B(yǎng)層上的倍增稍慢。
(c)Hay1表達(dá)Oct4和Nanog表面標(biāo)記和堿性磷酸酶是對(duì)于干細(xì)胞而言方便的標(biāo)記，而逐漸明確的一點(diǎn)是轉(zhuǎn)錄因子Oct4和Nanog的表達(dá)是干細(xì)胞的基本特征(Roddaet al.(2005)J.Biol.Chem.280，24731-24737；Chambers et al.(2003)Cell 113，643-655))。采用實(shí)時(shí)RT-QPCR檢測(cè)Hay1中這些因子的表達(dá)。將標(biāo)準(zhǔn)確定條件下的細(xì)胞表達(dá)與已經(jīng)過EB形成以及之后在Med3(Kelly and Sussman，(2000)J.Biomol.Screen.5，249-254)中培養(yǎng)而經(jīng)歷分化的細(xì)胞表達(dá)相比較，所述Med3培養(yǎng)基為Weymouth’sMAB、Ham’s F12和William’s E的混合物。它還含有5％的精制小牛血清(Hyclone)。使用肌動(dòng)蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果顯示Oct4和Nanog均在Hay1中表達(dá)，分化后該表達(dá)顯著減少。
(d)Hay1依賴于生長(zhǎng)所需的gp130信號(hào)傳導(dǎo)在多種已知影響干細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的條件檢測(cè)下Hay1的生長(zhǎng)。小鼠和人類EG細(xì)胞在培養(yǎng)中需要生長(zhǎng)所需的gp130信號(hào)的來(lái)源(Shamblott et al.(1998)；Koshimuzu et al.(1996)Development122，1235-1242)。當(dāng)從培養(yǎng)基中單獨(dú)除去三種肽激素因子(Onc M、SCF、bFGF)的每一種時(shí)，每一種對(duì)生長(zhǎng)都具有某些作用。然而，除去制瘤素則完全抑制培養(yǎng)物的生長(zhǎng)，并且?guī)滋靸?nèi)它們變?yōu)閴A性磷酸酶陰性。
(e)FGF誘導(dǎo)Oct4和Nanog從培養(yǎng)物中除去FGF對(duì)培養(yǎng)物的生長(zhǎng)具有輕微的負(fù)面影響，對(duì)形態(tài)學(xué)也有影響，使得細(xì)胞變得更扁平且在皿上更加展開。除去FGF后檢測(cè)培養(yǎng)物中Oct4和Nanog的表達(dá)，觀察到表達(dá)顯著降低。重新加入FGF則使得Oct4的表達(dá)恢復(fù)至先前的水平。由于Oct4控制Nanog表達(dá)(Rodda et al.(2005))，期望誘導(dǎo)Oct4也可增加nanog，而這一點(diǎn)已被觀察到。
(f)Zeocin敏感性在建立frt插入系的制備過程中，測(cè)試了Hay1對(duì)zeocin的敏感性。標(biāo)準(zhǔn)滴定曲線表明75μg/ml的濃度是有效的選擇濃度。
實(shí)施例8-心肌細(xì)胞的衍生(a)frt插入(FI)細(xì)胞系FI Hay1的建立使用Lipofectamine 2000(脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺試劑)將質(zhì)粒pFrt/lac/Zeo(Invitrogen)轉(zhuǎn)染至Hay1中。48小時(shí)后，通過改變成含有75μg/ml Zeocin(Invitrogen)的培養(yǎng)基可選擇抗性細(xì)胞。非抗性細(xì)胞在大約7天時(shí)死亡。預(yù)計(jì)效率大約為1×10-5/μg?？蛇x擇約10種單獨(dú)的轉(zhuǎn)染子并用于lacZ表達(dá)的檢測(cè)?？赏ㄟ^DNA印跡法評(píng)價(jià)質(zhì)粒的拷貝數(shù)。可選擇帶有單一插入的轉(zhuǎn)染子用于進(jìn)一步分析。為檢測(cè)插入物在分化過程中的表現(xiàn)，可使細(xì)胞經(jīng)過EB形成、然后在含5％的精制小牛血清的Med3中培養(yǎng)1周?？稍俅卧u(píng)價(jià)它們的lacZ表達(dá)。由于還可以維持Zeo選擇條件，因此預(yù)期所有存活的細(xì)胞都保留了LacZ的表達(dá)。一般的策略是維持對(duì)插入物的選擇壓力以確保周圍DNA的表達(dá)，如同在許多其他研究中已成功采用的那樣(Zweigerdt et al.，(2001)Cytotherapy 5，399-413；Liu et al.(2004)Stem CellsDev.13，636-645；Schuldiner et al.，(2003)Stem Cells 21，257-265)。
然后可就插入位點(diǎn)對(duì)10個(gè)克隆進(jìn)行評(píng)價(jià)。理想的克隆應(yīng)將該DNA引入基因組的一些冗余的或非功能性的區(qū)段中。雖然最終這可能是有些主觀的評(píng)價(jià)，但重要的是該位點(diǎn)不應(yīng)被引至功能基因中，這會(huì)干擾后來(lái)的分化的克隆的分離。可從細(xì)胞中分離DNA，插入的DNA以及一些周圍序列可通過質(zhì)粒拯救(plasmid rescue)被回收，并可被測(cè)序(Organet al.，(2004)BMC Cell Biology 5，41)。位點(diǎn)的引入可通過與人類序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較來(lái)確定。
(b)四環(huán)素操縱基因frt插入細(xì)胞系TOFI Hay1的產(chǎn)生如上所述，利用脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺試劑，如上所述所產(chǎn)生的細(xì)胞系可用pcDNA6/TR_(Invitrogen)轉(zhuǎn)染，并就殺稻瘟素抗性進(jìn)行選擇。此質(zhì)粒在CMV啟動(dòng)子的控制下表達(dá)四環(huán)素阻遏物。在如上所述的選擇壓力下評(píng)價(jià)多克隆的繼續(xù)表達(dá)。如上，可評(píng)價(jià)插入的位點(diǎn)以選擇合適的克隆用于進(jìn)一步評(píng)價(jià)。
使用pcDNA5/Frt/TO/CAT(試劑盒提供的對(duì)照質(zhì)粒)評(píng)價(jià)frt插入克隆的效率。質(zhì)粒pcDNA5/Frt/TO(Invitrogen)是frt靶向質(zhì)粒，用于后續(xù)的選擇研究。它包含緊挨被四環(huán)素調(diào)節(jié)的CMV啟動(dòng)子3’端的克隆位點(diǎn)。氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)已被插入該質(zhì)粒用作對(duì)照。質(zhì)粒pcDNA5/Frt/TO/CAT可與pOG44(Invitrogen)一起被共轉(zhuǎn)染至TOFIHay1細(xì)胞系中，以暫時(shí)表達(dá)flp重組酶。frt-CAT質(zhì)?？砂邢騎OFI Hay1中的frt插入位點(diǎn)，進(jìn)行重組和合并。該插入是被編排的以使其破壞Zeo抗性基因，但它攜帶有潮霉素抗性基因。被成功靶向的克隆應(yīng)為潮霉素和殺稻瘟素抗性以及Zeo敏感的。
frt介導(dǎo)的重組的效率可通過檢測(cè)每毫克pcDNA/Frt/TO/CAT所獲得的潮霉素抗性、殺稻瘟素抗性的克隆數(shù)來(lái)評(píng)價(jià)。插入的CAT基因的表達(dá)效率可采用上述的分化方案評(píng)價(jià)?？蓪?shí)行該方案的兩種變化形式，一種是在全過程中存在有四環(huán)素，一種是僅在已經(jīng)發(fā)生分化后才加入四環(huán)素。
(c)選擇子質(zhì)粒的構(gòu)建可使用Introvigen的Multisite Gateway三片段載體構(gòu)建系統(tǒng)來(lái)構(gòu)建選擇子質(zhì)粒(Hartley et al.，(2000)Genome Res.10，1788-1795)。此系統(tǒng)利用位點(diǎn)特異性λ整合酶序列和蛋白質(zhì)在有序排列的序列中克隆和重組片段。激活的ras和顯性負(fù)性ras獲自UpstateBiotechnology?？墒褂靡毽苏厦肝稽c(diǎn)的特異性引物來(lái)擴(kuò)增a-ras和dn-ras序列。然后通過使用整合酶系統(tǒng)它們可被克隆至試劑盒的特異性質(zhì)粒中。
已表明人類α-MHC啟動(dòng)子的從-454延至+32的序列指導(dǎo)高水平的組織特異性表達(dá)(Yamauchi-Takihara et al.(1989)Proc.Natl，Acad.Sci.86，3504-3508；Sucharov et al.(2004)Mol.Cell.Biol.24，8705-8715)。該序列以及該整合酶位點(diǎn)可被克隆至MultisiteGateway試劑盒的第三質(zhì)粒中。之后這些序列可被重組至第四質(zhì)粒中以形成具有“dn-ras-α-MHC啟動(dòng)子-a-ras”基因順序的克隆。
可用PCR擴(kuò)增從dn-ras經(jīng)過啟動(dòng)子延至a-ras基因末端的序列，并使用拓?fù)洚悩?gòu)酶克隆化將其克隆至pcDNA5/Frt/TO中，以產(chǎn)生選擇子質(zhì)粒用于插入至TOFI Hay1位點(diǎn)中的frt重組位點(diǎn)中?？煞Q其為心臟選擇子(cardiac selector)質(zhì)粒。
(d)心臟選擇性干細(xì)胞系的產(chǎn)生心臟選擇子質(zhì)?？膳cpOG一起被轉(zhuǎn)染至TOFI Hay1中以暫時(shí)表達(dá)flp重組酶。如上所述，在frt位點(diǎn)的重組插入了潮霉素抗性基因而且破壞了Zeocin抗性。合適的重組體應(yīng)是殺稻瘟素抗性、潮霉素抗性以及Zeo敏感的。可在潮霉素/殺稻瘟素中選擇克隆，然后檢測(cè)其對(duì)Zeocin的敏感性?？墒褂觅|(zhì)粒拯救和測(cè)序來(lái)驗(yàn)證已構(gòu)建的DNA序列的正確性。該細(xì)胞現(xiàn)應(yīng)具有基因順序?yàn)椤癈MV啟動(dòng)子-TO調(diào)節(jié)阻遏物-dn-ras-α-MHC啟動(dòng)子-a-ras”的插入物。可稱該細(xì)胞系為Hay1-cadio。
(e)心肌細(xì)胞系的鑒別和克隆在含5％的精制小牛血清以及加入了潮霉素/殺稻瘟素的Med3中，通過類胚胎體的形成來(lái)啟動(dòng)Hay1-cardio的分化。四天后，將該類胚胎體放回組織培養(yǎng)塑料中以使附著，并用相同的培養(yǎng)基飼養(yǎng)。大約14天后，在該處于分化的Hay1中出現(xiàn)了多批搏動(dòng)的細(xì)胞?？捎^察培養(yǎng)物中搏動(dòng)區(qū)域的出現(xiàn)，但心肌細(xì)胞的ras轉(zhuǎn)化已顯示出阻斷搏動(dòng)(Engelmann et al.(1993)J.Mol.Cell.Cardiol.25，197-213)?？捎脽o(wú)選擇子的TOFI Hay1的匹配培養(yǎng)物一起平行操作作為心肌分化開始的標(biāo)志。
當(dāng)在培養(yǎng)物中檢測(cè)到心肌分化時(shí)，可用胰蛋白酶消化細(xì)胞，并將其鋪于由相同的基于Med3的培養(yǎng)基構(gòu)成的軟瓊脂中。用其他a-ras轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系的對(duì)照實(shí)驗(yàn)表明集落可在一周內(nèi)鑒定?？商暨x集落，將其分散于新鮮培養(yǎng)基中并重鋪于組織培養(yǎng)塑料中。可分析細(xì)胞的心肌特異性標(biāo)記例如真正的α-MHC的表達(dá)以及a-ras的表達(dá)。
(f)回復(fù)為“正?！毙募〖?xì)胞向培養(yǎng)基中加入1μg/ml四環(huán)素可釋放四環(huán)素阻遏物并激活dn-ras的轉(zhuǎn)錄。探索性實(shí)驗(yàn)可用于確定dn-ras的作用和加至培養(yǎng)物中能使轉(zhuǎn)化逆轉(zhuǎn)但不殺傷細(xì)胞或破壞心肌功能的四環(huán)素的適宜量。適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)的明確標(biāo)志是在培養(yǎng)物內(nèi)出現(xiàn)同步搏動(dòng)。
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序列。對(duì)于SEQ ID NO9-23，指代物是指啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)。所有真實(shí)序列來(lái)自加尼福尼亞大學(xué)圣克魯斯基因組生物信息網(wǎng)站，即http//genome.ucsc.edu/index.html？org＝Human&db＝hg15&hgsid＝34607112。SEQ ID NO1是人類乙肝病毒核心啟動(dòng)子/增強(qiáng)子。SEQ IDNO2為激活的H-RAS基因。SEQ ID NO3為蛻皮激素可誘導(dǎo)基因開關(guān)啟動(dòng)子。SEQ ID NO4為顯性負(fù)性H-RAS基因。SEQ ID NO5用于構(gòu)建Cre-lox位點(diǎn)。SEQ ID NO6用于構(gòu)建該Cre-lox位點(diǎn)。SEQ ID NO7為溫度敏感性激活的RAS基因。SEQ ID NO8為將激活的ras的絲氨酸39改變?yōu)榘腚装彼?9的寡聚序列。SEQ ID NO9為脂肪細(xì)胞人類脂連蛋白基因序列的從-908至+14位。Iwaki，M.，et al.Diabetes 52，1655-1663，2003。SEQ ID NO10為人類α-1-抗胰蛋白酶啟動(dòng)子序列的從-137至-37位。SEQ ID NO11為人類清蛋白基因序列的從-434至+12位。SEQ ID NO12為人類肌球蛋白輕鏈基因VLC1序列的從-357至+40位。Kurabayashi，M.，el al.J.Biol.Chem.265，19271-19278，1990。SEQ ID NO13為人類視紫紅質(zhì)基因序列的從-176至+70以及從-2140至-1894的246bp。Nie，Z.，el al.J.Biol.Chem.271，2667-2675，1996。SEQ ID NO14為人類E選擇素基因序列的從-547至+33位。Maxwell，IH，et al.Angiogenesis 6，31-38，2003。SEQID NO15為人類前T細(xì)胞受體序列的從-279至+5位以及上游增強(qiáng)子元件。Reizis，B，P.Leder.J.Exp.Med.，194，979-990，2001。SEQ ID NO16為人類CHI 3L1基因的從-308至+2位。Rehli，M.，etal.J.Biol.Chem.278，44058-44067，2003。SEQ ID NO17為從-3.7kb的人類尿調(diào)制蛋白基因啟動(dòng)子序列。Zbikowska，HM，et al.Biochem.J.365，7-11，2002。SEQ ID NO18為人類谷氨酸受體2基因(GluR2)序列的從-302至+320位。Myers，SJ，et al.J.Neuroscience 18，6723-6739，1998。SEQ ID NO19為人類表面活性蛋白A2(SP-A2)序列的從-296至+13位。Young，PP，CR MendelsonAm.J.Physiol.271，L287-289，1996。SEQ ID NO20為從-279的人類胰島素基因序列。Boam，DS，et al.J.Biol.Chem.265，8285-8296，1990。SEQ ID NO21為人類快骨骼肌肌鈣蛋白C基因序列的從-978至+1位。Gahlmann，R，L.Kedes J.Biol.Chem.265，12520-12528，1990。SEQ ID NO22為人類乙肝病毒序列的從1610至1810位。Gabriela Kramer，M.，et al.Molecular Therapy 7，375-385。SEQ ID NO23為B細(xì)胞人類免疫球蛋白重鏈啟動(dòng)子。Staudt，L.M.，Lenardo，M.J.Ann.Rev.Immunol.9，373-398，1991基因名IGH@基因庫(kù)無(wú)。SEQ ID NO24為L(zhǎng)ox序列，重組后的剩余序列。SEQ IDNO25為frt序列。SEQ ID NO26為pEGSH，4829bp。SEQ ID NO27為pERV3，8433bp。
表3





















































































































序列表<110>Plurion，Inc.
J.H.凱利<120>干細(xì)胞的分化<130>16016.0007P1<150>60/592,027<151>2004-07-29<160>29<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>202<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述/注釋＝合成構(gòu)建體<400>1cacgtcgcat ggagaccacc gtgaacgccc accaggtctt gcccaaggtc ttacataaga60ggactcttgg actctcagca atgtcaacga ccgaccttga ggcatacttc aaagactgtg120tgtttaaaga ctgggaggag ttgggggagg agattaggct aaaggtcttt gtactaggag180gctgtaggca taaattggtc tg 202<210>2<211>677<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述/注釋＝合成構(gòu)建體<400>2atgacagaat acaagcttgt ggtggtgggc gctggaggcg tgggaaagag tgccctgacc60atccagctga tccagaacca ctttgtggac gaatacgacc ccactataga ggattcctac120cggaagcagg tggtcattga tggggagacg tgcctgttgg acatcctgga taccgccggc180ctggaggagt acagcgccat gcgggaccag tacatgcgca ccggggaggg cttcctgtgt240gtgtttgcca tcaacaacac caagtctttt gaggacatcc accagtacag ggagcagatc300aaacgggtga aggactcgga tgatgtgccc atggtgctgg tggggaacaa gtgtgacctg360gctgcacgca ctgttgaatc tcggcaggct caggacctcg cccgaagcta cggcatcccc420tacatcgaga cctcggccaa gacccggcag ggagtggagg atgccttcta cacgttggtg480cgtgagatcc ggcagcacaa gctgcggaag ctgaaccctc ctgatgagag tggccccggc540tgcatgagct gcaagtgtgt gctctcctga cgcagcacaa gctcagaaca tggaggtgcc600ggatgcagaa agaaggtgca gacgaaagga ggaggaagaa agaacggaag caaggaagaa660agaaagggct gctggag 677<210>3
<211>530<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述/注釋＝合成構(gòu)建體<400>3tatagatctc ggccgcatat taagtgcatt gttctcgata ccgctaagtg cattgttctc60gttagctcga tggacaagtg cattgttctc ttgctgaaag ctcgatggac aagtgcattg120ttctcttgct gaaagctcga tggacaagtg cattgttctc ttgctgaaag ctcagtaccc180gggtcggagt actgccccgc ccctagcgat tagccccggc cccgcatagc tccgccccgg240gagtaccctc gaccgccgga gtataaatag aggcgcttcg tctacggagc gacaattcaa300ttcaaacaag caaagtgaac acgtcgctaa gcgaaagcta agcaaataaa caagcgcagc360tgaacaagct aaacaatctg cagtaaagtg caagttaaag tgaatcaatt aaaagtaacc420agcaaccaag taaatcaact gcaactactg aaatctgcca agaagtaatt attgaataca480agaagacaac tctgaatact ttcaaaagtt accgagaaag aagaactcag 530<210>4<211>677<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述/注釋＝合成構(gòu)建體<400>4atgacagaat acaagcttgt ggtggtgggc gctggaggcg tgggaaagag tgccctgacc60atccagctga tccagaacca ctttgtggac gaatacgacc ccactataga ggattcctac120cggaagcagg tggtcattga tggggagacg tgcctgttgg acatcctgga taccgccggc180ctggaggagt acagcgccat gcgggaccag tacatgcgca ccggggaggg cttcctgtgt240gtgtttgcca tcaacaacac caagtctttt gaggacatcc accagtacag ggagcagatc300aaacgggtga aggactcgga tgatgtgccc atggtgctgg tggggaacaa gtgtgacctg360gctgcacgca ctgttgaatc tcggcaggct caggacctcg cccgaagcta cggcatcccc420tacatcgaga cctcggccaa gacccggcag ggagtggagg atgccttcta cacgttggtg480cgtgagatcc ggcagcacaa gctgcggaag ctgaaccctc ctgatgagag tggccccggc540tgcatgagct gcaagtgtgt gctctcctga cgcagcacaa gctcagaaca tggaggtgcc600ggatgcagaa agaaggtgca gacgaaagga ggaggaagaa agaacggaag caaggaagaa660agaaagggct gctggag 677<210>5<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
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<213>人工序列<220>
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<223>人工序列的描述/注釋＝合成構(gòu)建體<400>7atgacagaat acaagcttgt ggtggtgggc gctggaggcg tgggaaagag tgccctgacc60atccagctga tccagaacca ctttgtggac gaatacgacc ccactataga ggattgctac120cggaagcagg tggtcattga tggggagacg tgcctgttgg acatcctgga taccgccggc180ctggaggagt acagcgccat gcgggaccag tacatgcgca ccggggaggg cttcctgtgt240gtgtttgcca tcaacaacac caagtctttt gaggacatcc accagtacag ggagcagatc300aaacgggtga aggactcgga tgatgtgccc atggtgctgg tggggaacaa gtgtgacctg360gctgcacgca ctgttgaatc tcggcaggct caggacctcg cccgaagcta cggcatcccc420tacatcgaga cctcggccaa gacccggcag ggagtggagg atgccttcta cacgttggtg480cgtgagatcc ggcagcacaa gctgcggaag ctgaaccctc ctgatgagag tggccccggc540tgcatgagct gcaagtgtgt gctctcctga cgcagcacaa gctcagaaca tggaggtgcc600ggatgcagaa agaaggtgca gacgaaagga ggaggaagaa agaacggaag caaggaagaa660agaaagggct gctggag 677<210>8<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述/注釋＝合成構(gòu)建體<400>8gaatacgacc ccactataga ggattgctac cggaagcagg tggtcattga t 51<210>9<211>1084<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述/注釋＝合成構(gòu)建體<220>
<221>misc_feature<222>(1001)...(1084)<223>第一外顯子的第一核苷酸
<400>9tcagatcctg cccttcaaaa acaaaacatg agcgtgccaa gaaagtccaa ggtgttgaat60gttgccactt caagcctaaa ctttctagga acacctaagt gggtggcagc ttccagttct120ccaggctgct tctaggccag agctgggttc cacaagagac agaataggca tatatatgct180taaggaactg gaaaaacagg ctctctctct ctcacaaaca cacacacaca cataccaagg240tagctgtcaa aatgttatcc gaaattttgg aaccaaaaaa tcttgaaaga tggtattcca300atatcacatt ttatgtaagt tttctattat attagattca aattacgatt cgaggccaca360agctttaaga attcagggcc tttttaactt gccaagcccc acaccactcc aggaacttcc420ccacacccca gttctcagaa ttcatgtgca aggtctttcc taaatccagg gtccaggtca480gagagtggag gatgtgctct atttcttacc tgattgcaga cccctctgac agtgctccct540tctgaagcac tcactgtctg aacgtacaca gtctcagact taatcatgca cagtgagcaa600gactgtggtg tgataattgg cgtccctgac ttattagggc aaatctatgg gagggggaga660cctcctggac cactgagcaa ttaattcatt tacattagga agtttctccg tcagatgcag720gaaaaaaatc ttgttttcct gctgtggttt tgacttttgc cccatcttct gttgctgttg780taggaggcaa aataagggtc aaggcctgga aacacaagtg ctttgactga agctccactt840ggcttccgaa gcccaagctg ggttgtacca ggttccctag ggtgcaggct gtgggcaact900gccagggaca tgtgcctgcc caccggcctc tggccctcac tgagttggcc aatgggaaat960gacaattgtg aggtggggac tgcctgcccc cgtgagtacc aggctgttga ggctgggcca1020tctcctcctc acttccattc tgactgcagt ctgtggttct gattccatac cagaggggct1080cagg 1084<210>1O<211>1232<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述/注釋＝合成構(gòu)建體<220>
<221>misc_feature<222>(1001)...(1232)<223>第一外顯子的第一核苷酸<400>10agagccccaa ggtggaggca taaatgggac tggtgaatga cagaaggggc aaaaatgcac60tcatccattc actctgcaag tatctacggc acgtacgcca gctcccaagc aggtttgcgg120gttgcacagc gggcgatgca atctgattta ggcttttaaa gggattgcaa tcaagtgggg180ccccactagc ctcaaccctg tacctcccct cccctccacc cccagcagtc tccaaaggcc240tccaacaacc ccagagtggg ggccatgtat ccaaagaaac tccaagctgt atacggatca300cactggtttt ccaggagcaa aaacagaaac aggcctgagg ctggtcaaaa ttgaacctcc360tcctgctctg agcagcctgg ggggcagact aagcagaggg ctgtgcagac ccacataaag420agcctactgt gtgccaggca cttcacccga ggcacttcac aagcatgctt gggaatgaaa480cttccaactc tttgggatgc aggtgaaaca gttcctggtt cagagaggtg aagcggcctg540cctgaggcag cacagctctt ctttacagat gtgcttcccc acctctaccc tgtctcacgg600ccccccatgc cagcctgacg gttgtgtctg cctcagtcat gctccatttt tccatcggga660ccatcaagag ggtgtttgtg tctaaggctg actgggtaac tttggatgag cggtctctcc720gctctgagcc tgtttcctca tctgtcaaat gggctctaac ccactctgat ctcccagggc780ggcagtaagt cttcagcatc aggcattttg gggtgactca gtaaatggta gatcttgcta840ccagtggaac agccactaag gattctgcag tgagagcaga gggccagcta agtggtactc900tcccagagac tgtctgactc acgccacccc ctccaccttg gacacaggac gctgtggttt960ctgagccagg tacaatgact cctttcggta agtgcagtgg aagctgtaca ctgcccaggc1020aaagcgtccg ggcagcgtag gcgggcgact cagatcccag ccagtggact tagcccctgt1080ttgctcctcc gataactggg gtgaccttgg ttaatattca ccagcagcct cccccgttgc1140ccctctggat ccactgctta aatacggacg aggacagggc cctgtctcct cagcttcagg1200
caccaccact gacctgggac agtgaatcga ca 1232<210>11<211>1039<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述/注釋＝合成構(gòu)建體<220>
<221>misc_feature<222>(1001)...(1039)<223>第一外顯子的第一核苷酸<400>11aaaattattc ttccttcgct ttgtttttag acataatgtt aaatttattt tgaaatttaa60agcaacataa aagaacatgt gatttttcta cttattgaaa gagagaaagg aaaaaaatat120gaaacaggga tggaaagaat cctatgcctg gtgaaggtca agggttctca taacctacag180agaatttggg gtcagcctgt cctattgtat attatggcaa agataatcat catctcattt240gggtccattt tcctctccat ctctgcttaa ctgaagatcc catgagatat actcacactg300aatctaaata gcctatctca gggcttgaat cacatgtggg ccacagcagg aatgggaaca360tggaatttct aagtcctatc ttacttgtta ttgttgctat gtctttttct tagtttgcat420ctgaggcaac atcagctttt tcagacagaa tggctttgga atagtaaaaa agacacagaa480gccctaaaat atgtatgtat gtatatgtgt gtgtgcatgc gtgagtactt gtgtgtaaat540ttttcattat ctataggtaa aagcacactt ggaattagca atagatgcaa tttgggactt600aactctttca gtatgtctta tttctaagca aagtatttag tttggttagt aattactaaa660cactgagaac taaattgcaa acaccaagaa ctaaaatgtt caagtgggaa attacagtta720aataccatgg taatgaataa aaggtacaaa tcgtttaaac tcttatgtaa aatttgataa780gatgttttac acaactttaa tacattgaca aggtcttgtg gagaaaacag ttccagatgg840taaatataca caagggattt agtcaaacaa ttttttggca agaatattat gaattttgta900atcggttggc agccaatgaa atacaaagat gagtctagtt aataatctac aattattggt960taaagaagta tattagtgct aatttccctc cgtttgtcct agcttttctc ttctgtcaac1020cccacacgcc tttggcaca 1039<210>12<211>1051<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述/注釋＝合成構(gòu)建體<220>
<221>misc_feature<222>(1001)...(1051)<223>第一外顯子的第一核苷酸<400>12aggaatctag gggtgaaagc tgagaaactg gtccctgggc cagcaggggc tgaagaggga60ggctgctgaa ctggcctggg gcgactgccc tagagggagc agcatccttt ctcttgccct120ttgtgggggt tcctggagac ccttggaccc atagccaggg ctacagctgc ctgccatgac180cagacactca catacagaca catgtaaaca cccagacata aacacacaga agcaacaccc240gcagacacac tcacatagac acatagacac accacgcaca cataaagacc cagacccaca300gagacaaatg cagacacccg ggccatccct tacatagaca cagatacgga gcacacatag360
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<223>人工序列的描述/注釋＝合成構(gòu)建體<220>
<221>misc_feature<222>(2201)...(2295)<223>第一外顯子的第一核苷酸<400>13gaacaaaaca gacatcatcc cacctctttc cactacaggc caagcaccat gctggtctct60gggaaccctg ttgtgagcaa gacagaccca ggcttaccct tgtggactca tgttacaggc120agggagacgg gcacaaaaca caaataaaaa gcttccatgc tgtcagaagc actatgcaaa180aagcaagatg ctgaggtact gctaagctgt gtgggatggg ggctcagccc ggccagggag240gggccagttg tgggtcagtc ttgacccaag gcatccagga caccctcctt ctggccatga300gggtccacgt cagaatcaaa ccctcacctt aacctcatta gcgttgggca taatcaccag360gccaagcgcc ttaaactacg agaggcccca tcccacccgc cctgccttag ccctgccacg420tgtgccaaac gctgttagac ccaacaccac ccaggccagg tagggggctg gagcccaggt480gggctgcagg gaagggggca ctcttctgag cagacagatc tgggaatcct gggtgggaag540agagacagtg agagagagat taagggatat ttcccaggca tcagggcttt gcactctcag600gggtccttcc gcctggatgt ccttcccctg aagcttcctc ctgttgttcc gttctcagct660caagctccag cttctcagag aagcctcctg tgttgggagt ggctgcgact gaactgtccc720tactgttatt cgctcttcta tttgtttgtg gtccctgtgc cccctcaccc cacaaaaaca780ctggcttctt gtgagcagga gcttgctctt tcgtgtaccc tgtgtgtccc caaggaccaa840gcaccttgtc tgggccacag taggtgctca atacacatgt tggctggaca gtggtcactg900agcggccgca cgtcgggcac tctcagcact tgcacaggcc gccccagaca ccccacttca960ttcctgggag gtgtcatcat gttgcttgga cgacggggag agggggacct gccagtgttg1020gcctccattt tcccccagtc atctgccccc aaggctctga ctactttctt tctcacggta1080catcctgcta ttctggaatc ggccctcgtg gggccacctg gtacatggca tttgaggccc1140tcgtggctga ttaggcctcc cccaacagtg ccctgtctgc tgcctccagg gccagcctcc1200ccttcagact ggagtcccct gaagggttct gcccctcccc tgctctggta gccccctcca1260tcctccctcc ctccactcca tctttggggg catttgagtc acctttctac accagtgatc1320tgcccaagcc actgctcact ttcctctgga taaagccagg ttccccggcc tagcgttcaa1380gacccattac aactgccccc agcccagatc ttccccacct agccacctgg caaactgctc1440cttctctcaa aggcccaaac atggcctccc agactgcaac ccccaggcag tcaggccctg1500tctccacaac ctcacagcca ccctggacgg aatctgcttc ttcccacatt tgagtcctcc1560tcagcccctg agctcctctg ggcagggctg tttctttcca tctttgtatt cccaggggcc1620tgcaaataaa tgtttaatga acgaacaaga gagtgaattc caattccatg caacaaggat1680tgggctcctg ggccctaggc tatgtgtctg gcaccagaaa cggaagctgc aggttgcagc1740
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<223>人工序列的描述/注釋＝合成構(gòu)建體<220>
<221>misc_feature<222>(1002)...(1116)<223>第一外顯子的第一核苷酸<400>14agagtttcac tcgtttccca ggctggagtg cactggcgtg atcttggctc actgcaacct60ccacttcccg ggttcaagcg attctcctgc ctcagcctcc cgagtagctg ggattacagg120catgcgccac catgcccagc taattttgta tttttagtag agatggcgtt tctccatgtt180ggtcaggctg gtcttgaact cccggcctca ggtgatccgc ctgcctcggc ctcccaaagt240ggtgggatta caggcgtgag ccactgtgcc tggcctcctt tttatttttt tcactgaaca300aaccatgaaa ctttcccaga tgtaaatatc tatttcccat ttttcttttt ttaaaataag360gcattatttt aaccatttga gtgttagata ttatttttag ataatatttt aatttaggca420taactgccgt gcaaaatctg aagattaata tctaccttgt gagtcattcc tctgtgagac480agtgcatgtt aaatatgttg aattggcagg tgaaaaagga agaaaaaatg agtagtgatt540ggttatccac agctatgaat gagaaattga aggtagtaga ctatggatga caaacctatt600cttggtttcc ttctgtttct gaaattctaa ttactaccac aactacatga gagacactac660taacaagcaa agttttacaa ctttttaaag acatagactt tatgttatta taattaaaaa720tcatgcattt ttgtcatatt aataaaattg catatacgat ataaaggcat ggacaaaggt780gaagtagctt caagagacag agtttctgac atcattgtaa ttttaagcat cgtggatatt840cccgggaaag tttttggatg ccattgggga tttcctcttt actggatgtg gacaatatcc900tcctattatt cacaggaagc aatccctcct ataaaagggc ctcagccgaa gtagtgttca960gctgttcttg gctgacttca catcaaaact cctatactga cctgagacag aggcagcagt1020gatacccacc tgagagatcc tgtgtttgaa caactgcttc ccaaaacgga aagtatttca1080agcctaaacc tttgggtgaa aagaactctt gaagtc 1116<210>15<211>1081<212>DNA<213>人工序列<220>
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<221>misc_feature
<222>(1002)...(1081)<223>第一外顯子的第一核苷酸<400>15caacataggc aacaaagcaa gactccatct ctacaaaaaa tcaaaataaa aataaattag60ctgggtgtgg tagcgcatgc ctgtggtctt agctactcag gaggctgacg aaggaggatc120acttgagccc aggagttcaa gactgcagtg agctatgatt gtactgccgc attctagcct180gggcaacaaa gaaagaaccc catctctaaa aaaaaaaatt aaataaataa aaggagggct240gtaacaacat ggcaaaaagt ttactgggca tcttttttta tttttttttt ttgagatggc300gtctcgctct gtcgcccagg ttggagtgca gtggcacaat cttggctcac tgcaagctcc360acctcccggg ttcacaccat tctcctgcct cagcctcctg aatagctggg actacaggtg420cccgtcacca cacccagcta atttttttgt atttttagta gagacggggt ttcaccgtgt480tagccaggat ggtcttgatc tcctgacctt gtgatccgct cgtctcagcc tcccaaagtg540ctgggattac aggcgtgagc cactgcgcct ggccctgggt atctttttgc ctataataaa600gccagccatc taaaaacagt tcaagccctg gctctggtac ctgtcagctg tgtggccctg660ggcgggtccc tcactctctg tgagcctcag ttgcctcacc tgtgaaatgt aactcagtgg720ttgagtggat caagtgaagg gctgtatgtc aagcccctgt caagccacct ggtgctccgt780gtcctgtgga tggtagctgc cctgaagcgg gactttgcag actgaagtgc tgtctcttca840gagggagtgc aggtgtccgg ctcctggtgt gggagaggca ccctgtgctc cctggcccgt900gagacaagat tgggtttggg ggccagggca ggagtagggg cccgtcacca ggggaaacgg960ctcgtggtag agcagctgag gtgcagctgg gcctgtggcc tagaaggcag tcttgtgggt1020gcctcctccc ccagccgcaa ctcaggtctg cagctgggtc ctgcctcctt ccgagtgggc1080c1081<210>16<211>1126<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>人工序列的描述/注釋＝合成構(gòu)建體<220>
<221>misc_feature<222>(1001)...(1027)<223>第一外顯子的第一核苷酸<400>21ccagcacgca gtagtgctcg aggcagggag cgtgtttatc aagagggata aacttgatac60gaactctgta cgaaggaagg tgtaggtgga tggaggggtg tgtgctgcca ctgagcacaa120gaaccccacg gggtggcctg ccaaagttca aaacgaggga gacaggttga tctggaccca180ggaactacag tgctgaatcc taaaccgggg aaagatgaga cctagaagag ggaggtggta240acctaattgg agggtgagga gggaaagagc ctgccacaga tggggcatct ataggggtgc300tgttgaataa ctgagagcag ctgacttaag cccgaagtgg gtacttctcc ctgggcagat360gggaggtctg ggacaggctc ctctggcaga agggctcctg gccaccctgt cctaaggtgg420gtcagtcact tcctccttca ccagttccac agcatcttac tatgagcttg gcattcgagg480cttctcttgg cagggccctg cactcctagc ctctccttgc acattgcacc cccattccag540agaggtttag ttaaaggcgg gggttaccaa gtcagtcaga tcttgggcaa gtcaccactc600ctccagagcc tcagtttcct tatctggaaa gtggaggtca tggcaacccg ccaacctggt660tggatgggag cctgagctgt tgtgttgcac cttgcctggg gcccacgact ttgtagctcc720tgtcctgcac tgggcttatg ttttcattca ttccagaaac cttttcagag agtccctttg780gggagtgtgg gggacaggag ggaaagaaac ctggtccttg tagccgttcg tctgctccct840gccctgggca gaggacgtgg ggactcaggc cagcctgaga tcactgggac cagaggaggg900gctggaggat actacacgca ggggtgggct gggctgggct gggctgggcc aggaatgcag960cggggcaggg ctatttaagt caagggccgg ctggcaaccc cagcaagctg tcctgtgagc1020cgccagc 1027<210>22<211>240
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述/注釋＝合成構(gòu)建體<400>22cgtcgcatgg agaccaccgt gaacgcccac caggtcttgc ccaaggtctt acataagagg60actcttggac tctcagcaat gtcaacgacc gaccttgagg catacttcaa agactgtgtg120tttaaagact gggaggagtt gggggaggag attaggctaa aggtctttgt actaggaggc180tgtaggcata aattggtctg ttcaccagca ccatgcaact ttttcacctc tgcctaatca240<210>23<211>2562<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述/注釋＝合成構(gòu)建體<220>
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<223>人工序列的描述/注釋＝合成構(gòu)建體<400>27cacctgacgc gccctgtagc ggcgcattaa gcgcggcggg tgtggtggtt acgcgcagcg60tgaccgctac acttgccagc gccctagcgc ccgctccttt cgctttcttc ccttcctttc120tcgccacgtt cgccggcttt ccccgtcaag ctctaaatcg ggggctccct ttagggttcc180gatttagtgc tttacggcac ctcgacccca aaaaacttga ttagggtgat ggttcacgta240gtgggccatc gccctgatag acggtttttc gccctttgac gttggagtcc acgttcttta300atagtggact cttgttccaa actggaacaa cactcaaccc tatctcggtc tattcttttg360atttataagg gattttgccg atttcggcct attggttaaa aaatgagctg atttaacaaa420aatttaacgc gaattttaac aaaatattaa cgcttacaat ttacgcgtcc agacatgata480agatacattg atgagtttgg acaaaccaca actagaatgc agtgaaaaaa atgctttatt540tgtgaaattt gtgatgctat tgctttattt gtaaccatta taagctgcaa taaacaagtt600aacaacaaca attgcattca ttttatgttt caggttcagg gggaggtgtg ggaggttttt660taaagcaagt aaaacctcta caaatgtggt atggctgatt atgatcatga acagactgtg720aggactgagg ggcctgaaat gagccttggg actgtgatct aaaatacaca aacaattaga780atcagtagtt taacacatta tacacttaaa aattttatat ttaccttaga gctttaaatc840tctgtaggta gtttgtccaa ttatgtcaca ccacagaagt aaggttcctt cacaaagatc900gcggccgcct aagtcatttg gtgcggcgcc tccagcatct ccataaggaa ggtgtcaatg960ggtgtgtccc cgatgagctt gaagaagaag agatgttcca ggcatttgag cccgatggag1020cgcagagccg gcaggcggag caagagctta gcgaaccttc ccggctgctc tgggtacttg1080tgcttgcagt aggcctccaa ggacgcatag accttctccc tcagcgcctc cacctcggcc1140gggttcgaga gccccttgga gtcagggtta aagaggacga tggcgcgcag gcagcccagc1200tccgtcttgt ccatctgcat gtcccgcatc ttggacacaa gctccgtcag caccctgtca1260aagatggcgc ccacccctgc gctgtgggcg ctgttccggt ggacgtgcag cccggtggcc1320aggaggatcc cgtccttcac ggcgatggag cggtgggaga aggaggcgat gagcagctca1380ttccagcctg cccgcagcag gatgacctgg tcgtccaggg gcagctctga gaagtgtggg1440atccgcttgg cccactccac cagggtgaaa agctgtttgt cggctgcttg gcaaatgttg1500gtgacagggt cgttcggcga gctggggttc agccccatgt ttgcctccac gtaggtctcg1560gtcttgggct ccacggccag ctcagcctcc aggatcctct ccaccggcat gtcctcgttg1620gcgctgctgg tcgactccac ctcattctcg ttccggtcct tgccacgctg ccgctcctcc1680tgcacggctt cccgcttcat gcccatggcc aggcacttct ggtagcggca gtactggcac1740cggttccgct gccgcttgtc aatcaggcag tccttgttgt cgcggcaggt gtaggtcagg1800
tccttgcgca ccgtccgctt gaagaagccc ttgcacccct cgcagctgta cactccatag1860tgcttgcctg aggagcggtc cccgcagatg gcgcagatgt gcttggtgaa ggaagccatg1920tttcctgagg ggtgggcggg gaccttgagg acgccattga ggcccagggg gggcttgatg1980tcctcgctgc tgctgacggg gttcataggt gagctgagct gggggctgcc agtgctgaag2040cccagggtgg gtgtggtggg caccgacatg gagtgggggc ccatggggga gctgatgacc2100gagaaaggcg ggcccatgcc gttgatgggg gagctcaggg tgctgatggg agaatgcagc2160tgtcccgggg agccgatgcc aggccccagg gacgggtgca gcgagggggc agccatggag2220cctcgccccg tcggggaggt gagggaggag ttcacctggg tggagaaatc gagcggcagg2280aaatgtttgg tgtccaagtc ttcttcagaa ataagttttt gttccatatt atcgatcgtg2340tttttcaaag gaaaaccacg tccccgtggt tcggggggcc tagacgtttt ttaacctcga2400ctaaacacat gtaaagcatg tgcaccgagg ccccagatca gatcccatac aatggggtac2460cttctgggca tccttcagcc ccttgttgaa tacgcttgag gagagccatt tgactctttc2520cacaactatc caactcacaa cgtggcactg gggttgtgcc gcctttgcag gtgtatctta2580tacacgtggc ttttggccgc agaggcacct gtcgccaggt ggggggttcc gctgcctgca2640aagggtcgct acagacgttg tttgtcttca agaagcttcc agaggaactg cttccttcac2700gacattcaac agaccttgca ttcctttggc gagaggggaa agacccctag gaatgctcgt2760caagaagaca gggccaggtt tccgggccct cacattgcca aaagacggca atatggtgga2820aaataacata tagacaaacg cacaccggcc ttattccaag cggcttcggc cagtaacgtt2880aggggggggg gagggagagg ggggtaaccc tatgcagtcg tcgagtgctc cgacttaacc2940gccactcccc cgataagctg ctcttggtgc gaatgcaggg ctacacccat caaggccatc3000gccgtctggg cgttcgcata catgctgacg ttgccgccca ccccaacacc gactccaact3060ccgttgccca tcggtaccgc tgatgtggtg gagctagcgg taacggcagc cgtgatactg3120ctggtggttg ccggcgtgat gggtcctatg gccgcacttc cgcccatgta ttcgctgctc3180gtactgaccg cggacaagga accaggtgcg gttacggagg cgggcacggg agcggagacg3240ggaaggagct gtggctgtgg ttgaatctgt ggctggagtt gcgtctgaag ctgtgggtgg3300agctggggtt gcagttgacc ttgcagctga ggtggtagct gaggttgtag ctgcggctgt3360gtctggtgct gggaatcgtt ctgggtcagg gaggagggtt ggggctgggg ctgaggctga3420ggctgatgct gggccgcggc tgccgccgcc gaagtggagg cagagtcgca atcaatgccg3480gcggtaatgg cgcccccaac cgatgcccgc atacgctcag cccgctcgag acgctcgttc3540tcctcctggg taatctgaag gtgcgactgg accgatggcg ggatggcatg aacgtcccag3600atctcctcga ggaacttggg cagtttgcgg tttttgagct ttagtgagaa acacatctcg3660gcgttctggt tgcccagcgt acgcagctcg gtgaggatcg agagcagctt tgcgtagaag3720acgaggctca ttgagtcgcc gcagtggcgg ttgagtatat aaatgcgtag cgtgtcgatg3780tagtagctct ggatcgcttc gactagctgg gccttctcca ggcccggccg gtccgagaag3840atcacaatgg cagtgagaag cgcgtattcg acgttgtcca ccttcatcga gaacatttgg3900cggcagaaat gcagcaggtc ttcaatgtta tcagccattc cggccatttt gtaagaatcc3960cgcgtatatg atctattatt cgcgaagaat attgagtccg agctgtggtc atagcgtcgt4020gccatacgca gcatcatcac ctccgacgag caggccttta gtaacgtgat ctggtcctcc4080tggggtatct ttgtaaacgc tggtagacct ttagcaaact caacaatcaa ctggaccgtg4140agtatggtta tctcggttat atgccgaaag ctgacgtccg tttggctctc gttctcatcg4200ggttgactca ttatacgcct gagatcctct tcagatggct gctcatagcc atcctggtac4260caaattaact tgtatataac ggccaactga ttgtacgtta aggaaggtat attgcgcgct4320tgacacttgg ccaatatttc atcaggtagt agcggaatag tggcatgctg gggcggctcg4380catgtcataa ggtcaagaat ctccttctta acaaagtctt ggccgccacc agaggccaag4440ctgccattgc cgccatgctg agagctcggc gaagtggtca ttttgtcctt ctccttctgg4500gccttctttt cgcgccgctt catcgcacat tggttctccg ggacgacgca ttccggccgc4560atacccacgg ccaggcactt tttcaggcgg cactcctgac actttcgcct catgtacatg4620tccatttcgc aggcgcgccc gaacttgcag cagtagacgg cgctcttcgt aacgctgcgt4680cgaaagaaca ccttgcagga tccacaggtg agggcgttgt agtggtagcc ggaggccctg4740tcgccgcaaa ccaggcacag ctcctcttgc acccgtggcg caggtccctt cttgctcttc4800ttcacatcgc agctttcgtt cgccgagtat ccgttcaagc tgctcgaagg cgagagatca4860tcgcgacctg aagatataga atttgatatt cttctagatg tacctagaag cttcccaccg4920tactcgtcaa ttccaagggc atcggtaaac atctgctcaa actcgaagtc ggccatatcc4980agagcgccgt agggggcgga gtcgtggggg gtaaatcccg gacctgggga atccccgtcc5040cccaacatgt ccagatcgaa atcgtctagc gcgtcggcat gcgccatcgc cacgtcctcg5100ccgtctaagt ggagttcgtc ccccaggctg acatcggtcg ggggggccaa gtcttcttca5160gaaataagtt tttgttccat ggtggcggcc ggccactagc ggatctgacg gttcactaaa5220
ccagctctgc ttatatagac ctcccaccgt acacgcctac cgcccatttg cgtcaatggg5280gcggagttgt tacgacattt tggaaagtcc cgttgatttt ggtgccaaaa caaactccca5340ttgacgtcaa tggggtggag acttggaaat ccccgtgagt caaaccgcta tccacgccca5400ttgatgtact gccaaaaccg catcaccatg gtaatagcga tgactaatac gtagatgtac5460tgccaagtag gaaagtccca taaggtcatg tactgggcat aatgccaggc gggccattta5520ccgtcattga cgtcaatagg gggcgtactt ggcatatgat acacttgatg tactgccaag5580tgggcagttt accgtaaata ctccacccat tgacgtcaat ggaaagtccc tattggcgtt5640actatgggaa catacgtcat tattgacgtc aatgggcggg ggtcgttggg cggtcagcca5700ggcgggccat ttaccgtaag ttatgtaacg cggaactcca tatatgggct atgaactaat5760gaccccgtaa ttgattacta ttaataacta atgcaacggc gctgcagcca ctgcatggcg5820gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc5880cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc5940ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga6000ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc6060ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat6120agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg6180cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc6240aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga6300gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact6360agaaggacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt6420ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag6480cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg6540tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa6600aggatcttca cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata6660tatgagtaac ctgaggctat ggcagggcct gccgccccga cgttggctgc gagccctggg6720ccttcacccg aacttggggg gtggggtggg gaaaaggaag aaacgcgggc gtattggccc6780caatggggtc tcggtggggt atcgacagag tgccagccct gggaccgaac cccgcgttta6840tgaacaaacg acccaacacc gtgcgtttta ttctgtcttt ttattgccgt catagcgcgg6900gttccttccg gtattgtctc cttccgtgtt tcagttagcc tccccctagg gtgggcgaag6960aactccagca tgagatcccc gcgctggagg atcatccagc cggcgtcccg gaaaacgatt7020ccgaagccca acctttcata gaaggcggcg gtggaatcga aatctcgtga tggcaggttg7080ggcgtcgctt ggtcggtcat ttcgaacccc agagtcccgc tcagaagaac tcgtcaagaa7140ggcgatagaa ggcgatgcgc tgcgaatcgg gagcggcgat accgtaaagc acgaggaagc7200ggtcagccca ttcgccgcca agctcttcag caatatcacg ggtagccaac gctatgtcct7260gatagcggtc cgccacaccc agccggccac agtcgatgaa tccagaaaag cggccatttt7320ccaccatgat attcggcaag caggcatcgc catgggtcac gacgagatcc tcgccgtcgg7380gcatgctcgc cttgagcctg gcgaacagtt cggctggcgc gagcccctga tgctcttcgt7440ccagatcatc ctgatcgaca agaccggctt ccatccgagt acgtgctcgc tcgatgcgat7500gtttcgcttg gtggtcgaat gggcaggtag ccggatcaag cgtatgcagc cgccgcattg7560catcagccat gatggatact ttctcggcag gagcaaggtg agatgacagg agatcctgcc7620ccggcacttc gcccaatagc agccagtccc ttcccgcttc agtgacaacg tcgagcacag7680ctgcgcaagg aacgcccgtc gtggccagcc acgatagccg cgctgcctcg tcttgcagtt7740cattcagggc accggacagg tcggtcttga caaaaagaac cgggcgcccc tgcgctgaca7800gccggaacac ggcggcatca gagcagccga ttgtctgttg tgcccagtca tagccgaata7860gcctctccac ccaagcggcc ggagaacctg cgtgcaatcc atcttgttca atcatgcgaa7920acgatcctca tcctgtctct tgatcgatct ttgcaaaagc ctaggcctcc aaaaaagcct7980cctcactact tctggaatag ctcagaggcc gaggcggcct cggcctctgc ataaataaaa8040aaaattagtc agccatgggg cggagaatgg gcggaactgg gcggagttag gggcgggatg8100ggcggagtta ggggcgggac tatggttgct gactaattga gatgcatgct ttgcatactt8160ctgcctgctg gggagcctgg ggactttcca cacctggttg ctgactaatt gagatgcatg8220ctttgcatac ttctgcctgc tggggagcct ggggactttc cacaccctaa ctgacacaca8280ttccacagct ggttctttcc gcctcaggac tcttcctttt tcaatattat tgaagcattt8340atcagggtta ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg tatttagaaa aataaacaaa8400taggggttcc gcgcacattt ccccgaaaag tgc 8433<210>
28<211>151<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述/注釋＝合成構(gòu)建體<400>28gaactcagac acagcagaag agcaattggt accggatccg atatcgatgc ggccgctcga60gactagtgag ctcgtcgact ctagactctt ctggttctgg cgactataag gatgacgatg120acaagtaata gccctttagt gagggttaat t 151<210>29<211>11<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述/注釋＝合成構(gòu)建體<400>29Gly Ser G1y Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys1 5 10
權(quán)利要求
1.一種含有一種核酸區(qū)段的多潛能干細(xì)胞，其中所述核酸區(qū)段包含P-I結(jié)構(gòu)，其中P為轉(zhuǎn)錄控制元件，I為編碼一種標(biāo)記的序列，其中所述標(biāo)記包括轉(zhuǎn)化劑。
2.權(quán)利要求1的干細(xì)胞，其中所述核酸區(qū)段為異源核酸區(qū)段。
3.權(quán)利要求1的干細(xì)胞，其中所述核酸區(qū)段為外源核酸區(qū)段。
4.權(quán)利要求1的干細(xì)胞，其中所述標(biāo)記為異源標(biāo)記。
5.權(quán)利要求1的干細(xì)胞，其中P和I包含于同一載體。
6.權(quán)利要求1的干細(xì)胞，其中P和I包含于不同的載體。
7.權(quán)利要求1的干細(xì)胞，其中I為異源核酸序列。
8.權(quán)利要求7的干細(xì)胞，其中所述核酸區(qū)段還包括自殺基因。
9.權(quán)利要求7的干細(xì)胞，其中P為組織特異性轉(zhuǎn)錄控制元件。
10.權(quán)利要求7的干細(xì)胞，其中P為細(xì)胞類型特異性轉(zhuǎn)錄控制元件。
11.權(quán)利要求7的干細(xì)胞，其中P為細(xì)胞譜系特異性轉(zhuǎn)錄控制元件。
12.權(quán)利要求7的干細(xì)胞，其中P為細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄控制元件。
13.權(quán)利要求7的干細(xì)胞，其中P使得I優(yōu)勢(shì)表達(dá)或選擇性表達(dá)。
14.權(quán)利要求7的干細(xì)胞，其中所述標(biāo)記包括溫度許可性無(wú)限增殖因子。
15.權(quán)利要求7的干細(xì)胞，其中所述轉(zhuǎn)化劑為溫度許可性因子。
16.權(quán)利要求7的干細(xì)胞，其中I包括SV40大T抗原。
17.權(quán)利要求7的干細(xì)胞，其中所述核酸區(qū)段的側(cè)翼有位點(diǎn)特異性切除序列。
18.權(quán)利要求7的干細(xì)胞，其中I的側(cè)翼有位點(diǎn)特異性切除序列。
19.權(quán)利要求7的干細(xì)胞，其中P的側(cè)翼有位點(diǎn)特異性切除序列。
20.權(quán)利要求7的干細(xì)胞，其中所述核酸區(qū)段還包括X，其中X為位點(diǎn)特異性切除序列，其中X位于P-I的側(cè)翼，其中所述核酸區(qū)段包括X-P-I-X結(jié)構(gòu)。
21.權(quán)利要求20的干細(xì)胞，其中所述核酸區(qū)段在X處被切除。
22.權(quán)利要求21的干細(xì)胞，其中X為loxP位點(diǎn)。
23.一種分化細(xì)胞，所述細(xì)胞通過培養(yǎng)權(quán)利要求7的干細(xì)胞而產(chǎn)生，所述培養(yǎng)在轉(zhuǎn)錄控制元件被激活而使得I優(yōu)勢(shì)表達(dá)或選擇性表達(dá)的條件下進(jìn)行。
24.權(quán)利要求23的分化細(xì)胞，其中使得轉(zhuǎn)錄控制元件被激活的條件為干細(xì)胞分化的條件。
25.權(quán)利要求23的分化細(xì)胞，其中所述干細(xì)胞在轉(zhuǎn)錄控制元件被激活的條件下分化。
26.權(quán)利要求23的分化細(xì)胞，其中通過使所述干細(xì)胞自發(fā)分化為類胚胎體來(lái)激活所述轉(zhuǎn)錄控制元件。
27.權(quán)利要求23的分化細(xì)胞，其中所述核酸區(qū)段從分化細(xì)胞中被切除。
28.權(quán)利要求27的分化細(xì)胞，其中利用腺病毒介導(dǎo)的位點(diǎn)特異性切除法來(lái)切除所述核酸區(qū)段。
29.權(quán)利要求27的分化細(xì)胞，其中利用重組酶切除所述核酸區(qū)段。
30.權(quán)利要求29的分化細(xì)胞，其中所述重組酶為Cre。
31.權(quán)利要求27的分化細(xì)胞，其中核酸區(qū)段的切除導(dǎo)致被切除所述核酸區(qū)段的核酸分子的重組。
32.權(quán)利要求23的分化細(xì)胞，其中I的表達(dá)的效果被逆轉(zhuǎn)。
33.權(quán)利要求32的分化細(xì)胞，其中所述I的表達(dá)的效果為分化細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，其中I的表達(dá)的效果的逆轉(zhuǎn)是分化細(xì)胞轉(zhuǎn)化的逆轉(zhuǎn)。
34.權(quán)利要求32的分化細(xì)胞，其中所述I的表達(dá)的效果被顯性負(fù)性轉(zhuǎn)化劑的表達(dá)而逆轉(zhuǎn)。
35.權(quán)利要求32的分化細(xì)胞，其中所述I的表達(dá)的效果被所述核酸區(qū)段的切除而逆轉(zhuǎn)。
36.權(quán)利要求23的分化細(xì)胞，其中所述分化細(xì)胞為肝細(xì)胞。
37.權(quán)利要求23的分化細(xì)胞，其中所述分化細(xì)胞為干細(xì)胞來(lái)源的有條件地永生的細(xì)胞。
38.一種方法，包括將權(quán)利要求23的分化細(xì)胞導(dǎo)入受試者。
39.權(quán)利要求38的方法，其中通過向受試者給予所述分化細(xì)胞而導(dǎo)入分化細(xì)胞。
40.權(quán)利要求38的方法，其中通過將分化細(xì)胞移植至受試者而導(dǎo)入分化細(xì)胞。
41.一種測(cè)定組合物毒性的方法，所述方法包括將該組合物與權(quán)利要求23的分化細(xì)胞共同培養(yǎng)，并且評(píng)價(jià)對(duì)該分化細(xì)胞的毒性效應(yīng)。
42.一種測(cè)定化合物毒性的方法，所述方法包括將該化合物與權(quán)利要求23的分化細(xì)胞共同培養(yǎng)，并且評(píng)價(jià)對(duì)該分化細(xì)胞的毒性效應(yīng)。
43.一種測(cè)定組合物對(duì)細(xì)胞的目標(biāo)效應(yīng)的方法，所述方法包括將該組合物與權(quán)利要求23的分化細(xì)胞共同培養(yǎng)，并且評(píng)價(jià)對(duì)該分化細(xì)胞的目標(biāo)效應(yīng)。
44.一種測(cè)定化合物對(duì)細(xì)胞的目標(biāo)效應(yīng)的方法，所述方法包括將該化合物與權(quán)利要求23的分化細(xì)胞共同培養(yǎng)，并且評(píng)價(jià)對(duì)該分化細(xì)胞的目標(biāo)效應(yīng)。
45.一種從干細(xì)胞獲得分化細(xì)胞的方法，所述方法包括培養(yǎng)權(quán)利要求7的干細(xì)胞，所述培養(yǎng)在使得轉(zhuǎn)錄控制因子被激活而使I優(yōu)勢(shì)表達(dá)或選擇性表達(dá)的條件下進(jìn)行，從而獲得分化細(xì)胞。
46.一種獲得干細(xì)胞來(lái)源的有條件地永生的細(xì)胞類型的方法，所述方法包括培養(yǎng)權(quán)利要求7的干細(xì)胞，所述培養(yǎng)在使得轉(zhuǎn)錄控制元件被激活而使I優(yōu)勢(shì)表達(dá)或選擇性表達(dá)的條件下進(jìn)行，從而獲得干細(xì)胞來(lái)源的有條件地永生的細(xì)胞類型。
47.一種獲得干細(xì)胞來(lái)源的有條件地永生的細(xì)胞類型的方法，所述方法包括用包含P-I結(jié)構(gòu)的核酸區(qū)段轉(zhuǎn)染干細(xì)胞，其中P為轉(zhuǎn)錄控制元件，I為編碼標(biāo)記的序列，其中所述標(biāo)記包括轉(zhuǎn)化劑；培養(yǎng)上述干細(xì)胞，所述培養(yǎng)在使得轉(zhuǎn)錄控制元件被激活而使I優(yōu)勢(shì)表達(dá)或選擇性表達(dá)的條件下進(jìn)行，從而獲得干細(xì)胞來(lái)源的有條件地永生的細(xì)胞類型。
48.一種從干細(xì)胞獲得分化細(xì)胞的方法，所述方法包括用包含P-I結(jié)構(gòu)的核酸區(qū)段轉(zhuǎn)染干細(xì)胞，其中P為轉(zhuǎn)錄控制元件，I為編碼標(biāo)記的序列，其中所述標(biāo)記包括轉(zhuǎn)化劑；培養(yǎng)上述干細(xì)胞，所述培養(yǎng)在使得轉(zhuǎn)錄控制元件被激活而使I優(yōu)勢(shì)表達(dá)或選擇性表達(dá)的條件下進(jìn)行，從而獲得分化細(xì)胞。
49.權(quán)利要求48的方法，其中所述使得轉(zhuǎn)錄控制元件被激活的條件為所述干細(xì)胞分化的條件。
50.權(quán)利要求48的方法，其中所述干細(xì)胞在轉(zhuǎn)錄控制元件被激活的條件下分化。
51.權(quán)利要求48的方法，其中通過使所述干細(xì)胞自發(fā)分化為類胚胎體來(lái)激活所述轉(zhuǎn)錄控制元件。
52.權(quán)利要求48的方法，還包括選擇表達(dá)I的細(xì)胞。
53.權(quán)利要求48的方法，還包括提高表達(dá)I的細(xì)胞的純度。
54.權(quán)利要求53的方法，其中提高純度包括形成克隆的或半純化的細(xì)胞群。
55.權(quán)利要求48的方法，還包括切除所述核酸區(qū)段。
56.權(quán)利要求48的方法，還包括克隆所述分化細(xì)胞。
57.權(quán)利要求48的方法，還包括培養(yǎng)所述分化細(xì)胞。
58.權(quán)利要求48的方法，還包括冷凍所述分化細(xì)胞。
59.權(quán)利要求48的方法，還包括向所選細(xì)胞中加入目的基因。
60.權(quán)利要求48的方法，還包括切除核酸區(qū)段；和冷凍所選擇的細(xì)胞。
61.權(quán)利要求60的方法，其中當(dāng)所述核酸區(qū)段被切除時(shí)，先前含有該核酸區(qū)段的核酸的末端重新結(jié)合。
62.權(quán)利要求48的方法，還包括培養(yǎng)表達(dá)I的細(xì)胞。
63.權(quán)利要求62的方法，還包括克隆所培養(yǎng)的表達(dá)I的細(xì)胞。
64.權(quán)利要求48的方法，還包括將所述分化細(xì)胞導(dǎo)入受試者。
65.權(quán)利要求64的方法，其中通過向受試者給予所述分化細(xì)胞而導(dǎo)入分化細(xì)胞。
66.權(quán)利要求64的方法，其中通過將分化細(xì)胞移植至受試者而導(dǎo)入分化細(xì)胞。
67.權(quán)利要求48的方法，還包括將一種組合物與所述分化細(xì)胞共同培養(yǎng)，并且評(píng)價(jià)對(duì)分化細(xì)胞的毒性效應(yīng)。
68.權(quán)利要求48的方法，還包括將一種化合物與所述分化細(xì)胞共同培養(yǎng)，并且評(píng)價(jià)對(duì)分化細(xì)胞的毒性效應(yīng)。
69.權(quán)利要求48的方法，還包括將一種組合物與所述分化細(xì)胞共同培養(yǎng)，并且評(píng)價(jià)對(duì)該分化細(xì)胞的目標(biāo)效應(yīng)。
70.權(quán)利要求48的方法，還包括將一種化合物與所述分化細(xì)胞共同培養(yǎng)，并且評(píng)價(jià)對(duì)該分化細(xì)胞的目標(biāo)效應(yīng)。
71.一種從干細(xì)胞獲得分化細(xì)胞的方法，所述方法包括用包含P-I結(jié)構(gòu)的核酸區(qū)段轉(zhuǎn)染干細(xì)胞，其中P為轉(zhuǎn)錄控制元件，I為編碼標(biāo)記的序列；培養(yǎng)上述干細(xì)胞，所述培養(yǎng)在使得轉(zhuǎn)錄控制元件被激活而使I優(yōu)勢(shì)表達(dá)或選擇性表達(dá)的條件下進(jìn)行，其中使得轉(zhuǎn)錄控制元件激活的條件為干細(xì)胞分化的條件，從而獲得分化細(xì)胞。
72.權(quán)利要求71的方法，還包括通過對(duì)所述標(biāo)記的篩選來(lái)選擇所述分化細(xì)胞。
73.權(quán)利要求71的方法，還包括通過鑒別表達(dá)所述標(biāo)記的細(xì)胞來(lái)篩選分化細(xì)胞。
74.權(quán)利要求71的方法，其中所述干細(xì)胞在轉(zhuǎn)錄控制元件被激活的條件下分化。
75.權(quán)利要求71的方法，其中通過使所述干細(xì)胞自發(fā)分化為類胚胎體來(lái)激活所述轉(zhuǎn)錄控制元件。
全文摘要
所公開的是用于鑒定特異細(xì)胞類型的組合物和方法。
文檔編號(hào)C12N5/074GK101031640SQ200580033038
公開日2007年9月5日 申請(qǐng)日期2005年7月29日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月29日
發(fā)明者J·H·凱利 申請(qǐng)人:干細(xì)胞創(chuàng)新有限公司