專(zhuān)利名稱(chēng)：載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及包含siRNA的非-病毒遞送載體。本發(fā)明還涉及靶向的非-病毒遞送載體、制備這些載體的方法、使用這些載體的方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
病毒DNA遞送方法存在許多問(wèn)題，包括免疫應(yīng)答、不能反復(fù)遞送病毒DNA載體、難以產(chǎn)生高病毒滴度和感染病毒的可能性。非-病毒遞送方法提供了沒(méi)有這些問(wèn)題且由此促進(jìn)了用于基因轉(zhuǎn)移的低危險(xiǎn)性、非病毒手段的開(kāi)發(fā)的可選擇性系統(tǒng)。
具有巨大潛能的非病毒傳遞系統(tǒng)包括使用陽(yáng)離子脂質(zhì)體，它們通常由中性磷脂和陽(yáng)離子脂質(zhì)組成。它們已經(jīng)用于將DNA、mRNA、反義寡核苷酸、蛋白質(zhì)和藥物轉(zhuǎn)入細(xì)胞。許多陽(yáng)離子脂質(zhì)體為商購(gòu)的并且目前已經(jīng)合成了許多新的陽(yáng)離子脂質(zhì)。已經(jīng)解釋了這些脂質(zhì)體在體外和體內(nèi)的功效。
在真菌中壓抑并且在植物中轉(zhuǎn)錄后基因沉默的動(dòng)物和基本真核生物中的RNAi為統(tǒng)稱(chēng)作RNA沉默的廣譜家族現(xiàn)象的實(shí)例(12，13)。特異性RNA失活現(xiàn)象因?qū)Σ《靖腥镜姆烙鶛C(jī)制而首先在植物中發(fā)現(xiàn)(14)，并且此后在C.elegans中發(fā)現(xiàn)(15，16)。RNA沉默的常見(jiàn)特征在于產(chǎn)生稱(chēng)作siRNA的小(21-23nt)雙鏈RNAs，它們作為用于減量調(diào)節(jié)基因表達(dá)的特異性決定子起作用(13)。小的雙鏈RNA胞內(nèi)產(chǎn)生中的關(guān)鍵酶為切酶，即一種將長(zhǎng)的雙鏈RNA消化成21-23nt單位的胞質(zhì)核糖核酸酶III(13，17，18)。這些短的雙鏈RNA為非創(chuàng)傷的，并且兩鏈之一與蛋白質(zhì)復(fù)合物和靶轉(zhuǎn)錄物-稱(chēng)作RNA-誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RISC)一其導(dǎo)致靶RNA破壞結(jié)合(19)。21-23個(gè)核苷酸的合成雙鏈RNA序列(siRNA)可以在該過(guò)程中替代并且具有特異性減量調(diào)節(jié)培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的基因功能的潛能(20)，這一發(fā)現(xiàn)開(kāi)啟了RNAi概念在功能性基因組學(xué)程序且甚至在療法中的應(yīng)用之路。早期體內(nèi)研究已經(jīng)證實(shí)了合成siRNA和轉(zhuǎn)基因siRNA減量調(diào)節(jié)成年小鼠外源性和內(nèi)源性基因表達(dá)的潛能(21，22)。因此，由siRNA產(chǎn)生的可能的副作用看起來(lái)可刺激干擾素系統(tǒng)，但只是一點(diǎn)點(diǎn)(23，24)。
盡管已經(jīng)廣泛描述了許多不同核酸的遞送，但是對(duì)siRNA遞送的研究仍處于初級(jí)水平。因此，盡管陽(yáng)離子脂質(zhì)/脂質(zhì)體系統(tǒng)將質(zhì)粒DNA(pDNA)和寡脫氧核苷酸(ODN)遞送至細(xì)胞得到廣泛應(yīng)用(7，9，25-28)，但是文獻(xiàn)中幾乎沒(méi)有涉及含有陽(yáng)離子脂質(zhì)/脂質(zhì)體的siRNA制劑及其在體外或體內(nèi)遞送至細(xì)胞(siFection)的報(bào)導(dǎo)。甚至，涉及含有siRNA的陽(yáng)離子脂質(zhì)/脂質(zhì)體系統(tǒng)的制劑的基礎(chǔ)研究也尚待報(bào)導(dǎo)。
本發(fā)明試圖提供siRNA的非病毒遞送的改進(jìn)。

發(fā)明內(nèi)容
對(duì)siRNA遞送的研究仍然停留在初級(jí)水平上的一個(gè)原因顯然可能是混亂性的，即所有核酸非常相似，并且應(yīng)使用相差無(wú)幾的遞送系統(tǒng)以相差無(wú)幾的方式將它們遞送至細(xì)胞。例如，由于寡核苷酸(ODN)、pDNA和siRNA相似的化學(xué)性質(zhì)，所以可以預(yù)計(jì)siRNA和ODN/pDNA的制劑可以起相似的作用，并且在機(jī)械論上，這兩個(gè)種類(lèi)展示出相似的特征。
從表面來(lái)看，這是正確的。pDNA和siRNA均帶有具有相同負(fù)電荷/核苷酸(nt)比的陰離子磷酸二酯主鏈并且因此應(yīng)與陽(yáng)離子脂質(zhì)體/脂質(zhì)系統(tǒng)發(fā)生靜電相互作用，從而形成能夠?qū)⒑怂徂D(zhuǎn)入細(xì)胞的陽(yáng)離子脂質(zhì)-核酸(lipoplex)顆粒。然而，pDNA和siRNA另外在分子量和分子拓?fù)鋱D方面彼此極為不同，由此可能產(chǎn)生重要的后果。
所有pDNA在用陽(yáng)離子劑中和70-90％的其磷酸二酯主鏈電荷后縮合成60-100nm的小納米顆粒(27-31)。陽(yáng)離子劑縮合的pDNA隨后可以以多種不同形態(tài)存在，這取決于陽(yáng)離子縮合劑，諸如球形、環(huán)形和棒形(27，28)。就pDNA縮合而言，存在相當(dāng)于約400個(gè)核苷酸的最小大小，與所述的陽(yáng)離子劑無(wú)關(guān)(32)。這類(lèi)特性確保了pDNA幾乎被陽(yáng)離子劑完全包囊或包裹并且防止在納米顆粒內(nèi)發(fā)生酶促或物理降解(26，33-40)。
與pDNA相反，siRNA不能縮合成已經(jīng)為小的亞納米核酸的納米尺寸的顆粒。因此，siRNA與陽(yáng)離子脂質(zhì)/脂質(zhì)體系統(tǒng)之間的靜電相互作用形成了兩個(gè)潛在的問(wèn)題。首先是產(chǎn)生尺寸過(guò)度和穩(wěn)定性差的siRNA-lipoplex(LsiR)顆粒的相對(duì)不受控制的相互作用。其次是siRNA分子的不完全包囊，由此使siRNA在遞送至細(xì)胞前受到可能的酶促或物理降解。
這類(lèi)考慮明確了pDNA和siRNA為完全不同類(lèi)型的核酸分子。
因此，本發(fā)明部分基于令人意外的發(fā)現(xiàn)，即包含siRNA和與聚合物偶聯(lián)的脂質(zhì)體的非病毒遞送載體明顯使脂質(zhì)體對(duì)聚集保持穩(wěn)定，而不會(huì)削弱siRNA減量調(diào)節(jié)靶基因的能力。特別地，可以產(chǎn)生包含siRNA的具有30-60nm平均大小的脂質(zhì)體，可以將其與不同量的可以在聚合物(例如聚合物的官能團(tuán))與脂質(zhì)之間形成諸如共價(jià)鍵這類(lèi)鍵的聚合物一起孵育。
由于寡核苷酸(ODN)、pDNA和siRNA相似的化學(xué)性質(zhì)，所以可以預(yù)計(jì)siRNA和ODN/pDNA的制劑可以起相似的作用，并且在機(jī)械論上，這兩個(gè)種類(lèi)展示出相似的特征。換句話(huà)說(shuō)，已經(jīng)預(yù)計(jì)聚乙二醇化siRNA復(fù)合物甚至在低程度聚乙二醇化下也無(wú)法介導(dǎo)靶基因的減量調(diào)節(jié)，這是因?yàn)楸疚乃龅奈墨I(xiàn)中表明這些復(fù)合物無(wú)法被攝入，不能從核內(nèi)體中放出或不能發(fā)現(xiàn)介導(dǎo)其生物學(xué)作用必不可少的靶區(qū)室/分子。
本文提供的證據(jù)令人意外地證實(shí)這類(lèi)推定無(wú)法應(yīng)用于siRNA。
本發(fā)明還部分基于令人意外的發(fā)現(xiàn)，即可以將本文所述的非病毒載體進(jìn)一步與附加物(例如靶向部分-諸如氧化的IgG抗體)一起孵育。不希望受任何特定的理論所束縛，看來(lái)并非形成了覆蓋暴露在脂質(zhì)體表面上的脂質(zhì)的過(guò)量游離官能團(tuán)的聚合物，而是形成了第二層配體-諸如非病毒載體上的靶向部分。
本發(fā)明的概述方面本發(fā)明在第一個(gè)方面中涉及包含脂質(zhì)體的非病毒遞送載體，其中脂質(zhì)體中的一種或多種脂質(zhì)可逆或不可逆地與一種或多種聚合物偶聯(lián)，并且其中脂質(zhì)體包含siRNA。
本發(fā)明在第二個(gè)方面中涉及包含脂質(zhì)體的靶向非病毒遞送載體，其中脂質(zhì)體中的一種或多種脂質(zhì)可逆或不可逆地與一種或多種聚合物和一種或多種附加物偶聯(lián)，并且其中脂質(zhì)體包含siRNA。
本發(fā)明在第三個(gè)方面中涉及將siRNA遞送至細(xì)胞的方法，包括給細(xì)胞、組織或器官環(huán)境提供本發(fā)明第一個(gè)方面的非病毒遞送載體或本發(fā)明第二個(gè)方面的靶向遞送載體的步驟。
本發(fā)明在第四個(gè)方面中涉及本發(fā)明第一個(gè)方面的非病毒遞送載體或本發(fā)明第二個(gè)方面的靶向遞送載體，用于將siRNA遞送至細(xì)胞、組織或器官。
本發(fā)明在第五個(gè)方面中涉及本發(fā)明第一個(gè)方面的非病毒遞送載體或本發(fā)明第二個(gè)方面的靶向遞送載體在制備將siRNA遞送至細(xì)胞、組織或器官的組合物中的應(yīng)用。
本發(fā)明在第六個(gè)方面中涉及制備包含脂質(zhì)體的非病毒遞送載體的方法，其中脂質(zhì)體中的一種或多種脂質(zhì)可逆或不可逆地與一種或多種聚合物偶聯(lián)，并且其中脂質(zhì)體包含siRNA，該方法包括下列步驟(i)使siRNA接觸脂質(zhì)體；和(ii)使步驟(i)中形成的脂質(zhì)體可逆或不可逆地與聚合物偶聯(lián)。
本發(fā)明在第七個(gè)方面中涉及制備包含脂質(zhì)體的靶向非病毒遞送載體的方法，其中脂質(zhì)體中的一種或多種脂質(zhì)可逆或不可逆地與一種或多種聚合物和一種或多種附加物偶聯(lián)，并且其中脂質(zhì)體包含siRNA，該方法包括下列步驟(i)使siRNA接觸脂質(zhì)體；(ii)使步驟(i)中形成的脂質(zhì)體可逆或不可逆地與聚合物偶聯(lián)；和(iii)使步驟(i)或步驟(ii)中形成的脂質(zhì)體可逆或不可逆地與一種或多種附加物偶聯(lián)。
本發(fā)明在第八個(gè)方面中涉及一種方法，該方法包括下列步驟(i)提供本發(fā)明第一個(gè)或第二個(gè)方面的載體；(ii)任選使該載體接觸冷凍保護(hù)劑；和(iii)冷凍干燥該載體。
本發(fā)明在第九個(gè)方面中涉及可通過(guò)本發(fā)明第八個(gè)方面所述方法獲得的或通過(guò)該方法獲得的冷凍干燥的載體。
本發(fā)明在第十個(gè)方面中涉及包含脂質(zhì)和偶聯(lián)部分的脂質(zhì)體，其中脂質(zhì)與偶聯(lián)部分之間的距離為至少1.5nm。
本發(fā)明在第十一個(gè)方面中涉及藥物組合物，包含本發(fā)明第一個(gè)方面的非病毒遞送載體或本發(fā)明第二個(gè)方面的靶向遞送載體和藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑。
本發(fā)明在第十二個(gè)方面中涉及治療患者的方法，包括對(duì)該患者給予醫(yī)學(xué)有效量的本發(fā)明第一個(gè)方面的非病毒遞送載體或本發(fā)明第二個(gè)方面的靶向遞送載體，本發(fā)明第十個(gè)方面的脂質(zhì)體或本發(fā)明第十一個(gè)方面的藥物組合物。
本發(fā)明在第十三個(gè)方面中涉及本發(fā)明第一個(gè)方面的非病毒遞送載體或本發(fā)明第二個(gè)方面的靶向遞送載體或本發(fā)明第十個(gè)方面的脂質(zhì)體，用于治療疾病。
本發(fā)明在第十四個(gè)方面中涉及本發(fā)明第一個(gè)方面的非病毒遞送載體或本發(fā)明第二個(gè)方面的靶向遞送載體或本發(fā)明第十個(gè)方面的脂質(zhì)體在制備治療疾病的組合物中的應(yīng)用。
本發(fā)明在第十五個(gè)方面中涉及與聚合物偶聯(lián)的脂質(zhì)體在制備包含siRNA的非病毒遞送載體中的應(yīng)用。
本發(fā)明在第十六個(gè)方面中涉及與聚合物和一種或多種附加物偶聯(lián)的脂質(zhì)體在制備包含siRNA的靶向非病毒遞送載體中的應(yīng)用。
本發(fā)明在第十七個(gè)方面中涉及基本上如本文所述并且參照實(shí)施例或附圖中任一個(gè)的非病毒遞送載體或靶向非病毒遞送載體。
本發(fā)明在第十八個(gè)方面中涉及基本上如本文所述并且參照實(shí)施例或附圖中任一個(gè)的方法。
本發(fā)明在第十九個(gè)方面中涉及基本上如本文所述并且參照實(shí)施例或附圖中任一個(gè)的應(yīng)用。
本發(fā)明在第二十個(gè)方面中涉及基本上如本文所述并且參照實(shí)施例或附圖中任一個(gè)的脂質(zhì)體。
優(yōu)選實(shí)施方案優(yōu)選可逆或不可逆地與一種或多種聚合物偶聯(lián)的脂質(zhì)體中的一種或多種脂質(zhì)暴露在脂質(zhì)體的表面上。
優(yōu)選脂質(zhì)體包含一種或多種下式的含有氨氧基的脂質(zhì) 其中B為脂質(zhì)；其中X為任選的連接基并且其中R2為H或烴基。
優(yōu)選含有氨氧基的脂質(zhì)為膽固醇基-(dPEG4)2-氨氧基脂質(zhì)(CPA)。
優(yōu)選脂質(zhì)體包含一種或多種陽(yáng)離子脂質(zhì)和/或一種或多種非陽(yáng)離子輔脂質(zhì)。
優(yōu)選陽(yáng)離子脂質(zhì)包含至少一個(gè)脂環(huán)族基團(tuán)。
優(yōu)選至少一個(gè)脂環(huán)族基團(tuán)為膽固醇。
優(yōu)選陽(yáng)離子脂質(zhì)為N′-膽固醇基氧基羰基-3，7-二氮雜壬烷-1，9-二胺(CDAN)。
優(yōu)選非陽(yáng)離子輔脂質(zhì)為磷脂酰乙醇胺。更優(yōu)選非陽(yáng)離子輔脂質(zhì)為二油?；字Ｒ掖及?DOPE)。
優(yōu)選聚合物包含一個(gè)或多個(gè)醛和/酮基。更優(yōu)選聚合物為PEG。
優(yōu)選脂質(zhì)體與約0.1-約5％PEG偶聯(lián)。
優(yōu)選脂質(zhì)體包含一種或多種附加物或可逆或不可逆地與它們偶聯(lián)。
優(yōu)選靶向非病毒遞送載體中的附加物選自糖、碳水化合物和配體組成的組。
優(yōu)選糖選自葡萄糖、甘露糖、乳糖、果糖、麥芽三糖、麥芽庚糖組成的組。
優(yōu)選配體為抗體。
優(yōu)選本發(fā)明第六個(gè)方面的方法包括如下額外的步驟使步驟(i)或步驟(ii)中形成的脂質(zhì)體可逆或不可逆地與一種或多種附加物偶聯(lián)。
優(yōu)選冷凍保護(hù)劑選自蔗糖、海藻糖和乳糖組成的組。
優(yōu)選本發(fā)明第八個(gè)方面的方法包括如下額外的步驟(iv)在使用前使所述載體再水化。
優(yōu)選本發(fā)明第十個(gè)方面的脂質(zhì)體具有下式 其中B為脂質(zhì)；其中X為連接基并且偶聯(lián)為偶聯(lián)部分，其中X主鏈包含至少30個(gè)原子。
優(yōu)選X主鏈包含至少40個(gè)原子。
優(yōu)選X為或包含下式的基團(tuán) 其中n和m獨(dú)立為0-6，優(yōu)選1-6，更優(yōu)選2、3或4，更優(yōu)選2或4。
優(yōu)選X為或包含下式的基團(tuán) 其中n和m獨(dú)立為0-6，優(yōu)選1-6，更優(yōu)選2、3或4，更優(yōu)選2或4。
優(yōu)選X為或包含下式的基團(tuán)
其中m為0-6，優(yōu)選1-6，更優(yōu)選1、2或3，更優(yōu)選1，并且其中n為0-20，優(yōu)選5-15，更優(yōu)選10、11或12，更優(yōu)選11。
優(yōu)選X為或包含下式的基團(tuán) 其中m為0-6，優(yōu)選1-6，更優(yōu)選1、2或3，更優(yōu)選1，并且其中n為0-20，優(yōu)選5-15，更優(yōu)選10、11或12，更優(yōu)選11。
優(yōu)選所述的疾病為肝病和/或肝損傷。
優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明具有許多優(yōu)點(diǎn)。這些優(yōu)點(diǎn)在如下描述中將顯而易見(jiàn)。
作為實(shí)例，本發(fā)明具有優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)樗峁┝耸褂梅遣《窘閷?dǎo)的方法遞送siRNA的方法。
作為另一個(gè)實(shí)例，本發(fā)明具有優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)楸疚乃龅姆遣《具f送載體為血清抗性的并且不太容易降解。
作為另一個(gè)實(shí)例，本發(fā)明具有優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)榉遣《具f送載體對(duì)聚集明顯保持穩(wěn)定，而不會(huì)削弱siRNA減量調(diào)節(jié)靶基因的能力。
作為另一個(gè)實(shí)例，本發(fā)明具有優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)榭梢越o非病毒遞送載體包被另一種物質(zhì)-諸如抗體-以便產(chǎn)生用于將siRNA遞送至所關(guān)注的特異性位點(diǎn)的靶向非病毒遞送載體。


附圖1(a)盡管PEG通過(guò)PEG的醛基與氨氧基脂質(zhì)CPA的氨氧基官能團(tuán)之間形成的肟鍵與siRNA-lipoplex的表面不可逆偶聯(lián)，但是通過(guò)PEG與加載siRNA的lipoplex偶聯(lián)后產(chǎn)生的聚乙二醇化siRNA-lipoplex在體外以劑量-反應(yīng)依賴(lài)性方式介導(dǎo)特異性靶向基因的特異性減量調(diào)節(jié)。
(b)這種特異性基因的特異性減量調(diào)節(jié)依賴(lài)于與siRNA-lipoplex表面偶聯(lián)的PEG的量。
附圖2通過(guò)PEG與加載siRNA的lipoplex偶聯(lián)后產(chǎn)生的聚乙二醇化siRNA-lipoplex隨與表面偶聯(lián)的PEG的量的遞增而表現(xiàn)出血清穩(wěn)定性。
附圖3通過(guò)PEG與加載siRNA的lipoplex偶聯(lián)后產(chǎn)生的聚乙二醇化siRNA-lipoplex表現(xiàn)出不同于非聚乙二醇化類(lèi)似物的藥代動(dòng)力學(xué)特性，使在肝臟中檢測(cè)到的量隨PEG量的遞增而逐步下降。
附圖4令人意外的是，通過(guò)流體動(dòng)力學(xué)注射1μg pDNA(在2ml PBS中)導(dǎo)入雌性Balb/C小鼠肝臟的lacZ基因的減量調(diào)節(jié)在流體動(dòng)力學(xué)注射后8或24小時(shí)在全身遞送20μg siRNA-lipoplex(PEG 0.1％)后達(dá)到80％以上。
附圖5甚至更令人意外的是，感染了指定劑量的lacZ-腺病毒并且在病毒感染后2小時(shí)通過(guò)尾靜脈注射獲得20μg siRNA-lipoplex(PEG0％/0.1％/5％)的雄性Balb/C小鼠表現(xiàn)出最高程度的聚乙二醇化的siRNA-lipoplex(5％PEG)的最大減量調(diào)節(jié)(＞70％)。
附圖6可以將由以0.1-1％總脂質(zhì)(在lipoplex中的摩爾比)聚乙二醇化的siRNA和CDAN/DOPE/CPA(40/50/10；m/m/m)脂質(zhì)體制備的LsiRlipoplex與氧化的IgG抗體在酸性pH下一起孵育，導(dǎo)致抗體通過(guò)其部分氧化的碳水化合物單元與CPA脂質(zhì)共價(jià)偶聯(lián)，正如通過(guò)在與氧化的IgG孵育前(附圖6a)和與氧化的IgG孵育后(附圖6b)對(duì)氨氧基脂質(zhì)體的HPLC分析所證實(shí)的。另外將脂質(zhì)體與(i)PEG2000(CHO)2，隨后與(ii)IgGOX進(jìn)行雙重孵育(附圖6c)。參照附圖6d，附圖6d(A1)表示SDS PAGE凝膠(12.5％Tris/甘氨酸)的結(jié)果。Mw，分子量BenchMark(TM)蛋白梯(Invitrogen)；泳道1，天然未氧化的人纖連蛋白(HFN)IgG；泳道2，HFN-IgG 30分鐘的氧化/10mM高碘酸；泳道3，HFN-IgG 60分鐘的氧化/10mM高碘酸；泳道4，HFN-IgG 120分鐘的氧化/10mM高碘酸；用考馬斯藍(lán)染色凝膠。附圖6d(A2)表示SDS PAGE凝膠(12.5Tris/甘氨酸)的結(jié)果。泳道1，天然未氧化的HFN-IgG；泳道2，F(xiàn)PLC純化后與HFN-IgGOX共價(jià)偶聯(lián)的LsiR lipoplex，級(jí)分1；泳道3，F(xiàn)PLC純化后與HFN-IgGOX共價(jià)偶聯(lián)的LsiR lipoplex，級(jí)分2。注意這兩種FPLC級(jí)分均含有抗體，其Fc片段在高于50kD分子量帶上運(yùn)行，這是與Fc單元的氧化碳水化合物偶聯(lián)的CPA-脂質(zhì)的指征。FPLC中的這兩條帶因lipoplex的不同大小而產(chǎn)生，其中第二級(jí)分表現(xiàn)出明顯高于第一級(jí)分(200nm)的顆粒大小(10′000nm)的，這表明了聚集狀態(tài)。使用標(biāo)準(zhǔn)操作步驟對(duì)凝膠進(jìn)行銀染色以便使蛋白質(zhì)帶顯現(xiàn)。附圖6d(B)表示蔗糖梯度后與HFN-IgGOX共價(jià)偶聯(lián)的LsiR lipoplex的結(jié)果。熒光帶(用箭頭指示的)來(lái)自于熒光標(biāo)記的(Cy3)-siRNA。附圖6d(C)表示HFN-IgGOX的ELISA結(jié)果，表明IgG與人纖連蛋白(HFN)特異性結(jié)合。附圖6d(D)表示在以蔗糖梯度純化后含有共價(jià)偶聯(lián)的HFN-IgGOX的LsiR lipoplex的ELISA結(jié)果，表明了如使用天然和氧化HFN-IgG所觀察到的相似的結(jié)合特征。
附圖7將天然碳水化合物-諸如葡萄糖、甘露糖、乳糖、果糖、麥芽三糖和麥芽庚糖與由以0.1-1％總脂質(zhì)(在lipoplex中的摩爾比)聚乙二醇化的siRNA和CDAN/DOPE/CPA(40/50/10；m/m/m)脂質(zhì)體制備的LsiRlipoplex一起孵育以便形成C1-碳水化合物原子與CPA脂質(zhì)的氨氧基官能團(tuán)的共價(jià)結(jié)合。
附圖8使用冷凍干燥的LsiR對(duì)HeLa的β-半乳糖苷酶減量調(diào)節(jié)。新鮮的LsiR，新鮮制備的LsiR；LsiR 12 FD 25，冷凍干燥并在無(wú)冷凍保護(hù)劑的25μL水中再水化的LsiR復(fù)合物；LsiR 12 FD 100，冷凍干燥并在無(wú)冷凍保護(hù)劑的100μL水中再水化的LsiR復(fù)合物。示意圖分別表示在25μL(FD25)或100μL(FD 100)水中再水化的，以5％/10％或20％(w/v)使用的三種不同冷凍保護(hù)劑(蔗糖、海藻糖或乳糖)的比較。
發(fā)明詳述siRNA如上所述，siRNA為所謂的″RNA誘導(dǎo)的干擾″(RNAi)概念的基礎(chǔ)，所述的″RNA誘導(dǎo)的干擾″(RNAi)是一種在遍及許多真核生物體中保守的轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)節(jié)的方法。
用存在于細(xì)胞中的短(一般少于30個(gè)核苷酸)雙鏈RNA分子誘導(dǎo)RNAi(Fire A等(1998)，Nature 391806-811)。這些短dsRNA分子(或siRNA)導(dǎo)致信使RNA的破壞，這些信使RNA與一種核苷酸拆分中的siRNA共有序列同源性(Elbashir SM等(2001)，Genes Dev，15188-200)。認(rèn)為siRNA和靶向的mRNA結(jié)合裂解靶向的mRNA的RNA-誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物。顯然siRNA的再循環(huán)非常類(lèi)似于多更新酶，其中1個(gè)siRNA分子能夠誘導(dǎo)約1000個(gè)mRNA分子裂解。因此siRNA-介導(dǎo)的mRNA的RNAi降解可非常有效地抑制靶基因的表達(dá)。
本文所述的siRNA可以包含部分純化的RNA，基本上純的RNA，合成RNA或重組產(chǎn)生的RNA以及因一個(gè)或多個(gè)核苷酸的添加、缺失、置換和/或修飾而不同于天然存在的RNA的改變的RNA。
這類(lèi)改變可以包括將非核苷酸物質(zhì)-諸如修飾的核苷酸-添加到例如siRNA的末端上或siRNA的一個(gè)或多個(gè)內(nèi)部核苷酸中，包括使siRNA耐受乃至更耐受核酸酶消化的修飾。
本領(lǐng)域已知許多不同類(lèi)型的修飾。它們包括甲基膦酸和硫代磷酸主鏈和/或在該分子的3′和/或5′末端上吖啶或聚賴(lài)氨酸鏈的添加。可以通過(guò)本領(lǐng)域中可利用的任何方法修飾核苷酸序列?？梢赃M(jìn)行這類(lèi)修飾以便增強(qiáng)siRNA的體內(nèi)活性或壽命。
siRNA的一條或兩條鏈可以包含3′突出端。
因此，siRNA可以包含至少一個(gè)例如長(zhǎng)度為1-約6個(gè)核苷酸(包括核糖核苷酸或脫氧核苷酸)的3′突出端。如果siRNA分子的兩條鏈都包含3′突出端，則突出端的長(zhǎng)度對(duì)每條鏈而言可以相同或不同。
為了提高siRNA的穩(wěn)定性，3′突出端對(duì)降解而言可以保持穩(wěn)定。可以通過(guò)包括嘌呤核苷酸-諸如腺苷或鳥(niǎo)苷核苷酸使突出端穩(wěn)定?；蛘?，用修飾的類(lèi)似物置換嘧啶核苷酸是可接受的并且不會(huì)削弱RNAi降解的效率。
一般而言，siRNA為分離的siRNA形式，它包含長(zhǎng)度約17個(gè)核苷酸至約29個(gè)核苷酸-諸如長(zhǎng)度約19-25個(gè)連續(xù)核苷酸-靶向至靶mRNA的短雙鏈RNA。siRNA包含通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)沃森-克里克堿基配對(duì)相互作用彼此退火的有義RNA鏈和互補(bǔ)反義RNA鏈。有義鏈包含與靶mRNA內(nèi)包含的靶序列相同的核酸序列。
本文所用的術(shù)語(yǔ)″分離的siRNA″意指siRNA通過(guò)人為干預(yù)而改變或與天然狀態(tài)不一樣。分離的siRNA可以以基本上純化的形式存在或可以存在于非天然環(huán)境中，諸如，例如存在于已經(jīng)遞送入了siRNA的細(xì)胞中。
siRNA的有義和反義鏈可以包含兩個(gè)互補(bǔ)的單鏈RNA分子或可以包含單個(gè)分子，其中兩個(gè)互變部分為堿基配對(duì)的并且通過(guò)單鏈發(fā)夾結(jié)構(gòu)共價(jià)連接。
當(dāng)然，人mRNA可以包含靶序列與其相應(yīng)的選擇性剪接形式、關(guān)聯(lián)物或突變體。因此包含這種常見(jiàn)引導(dǎo)序列的單個(gè)siRNA可以誘導(dǎo)RNAi-介導(dǎo)的含有常見(jiàn)引導(dǎo)序列的不同RNA類(lèi)型的降解。
可以使用本領(lǐng)域中的各種方法從指定序列-諸如cDNA序列-相當(dāng)于靶mRNA選擇靶mRNA上的靶序列。例如，siRNA的合理設(shè)計(jì)描述在Nat Biotechnol.(2004)22(3)326-30中?？梢曰谙铝兄笇?dǎo)原則設(shè)計(jì)siRNA。首先，鑒定從AA二核苷酸開(kāi)始的靶mRNA中的約21個(gè)核苷酸的序列。記錄每個(gè)AA并且將3′相鄰核苷酸鑒定為可能的siRNA靶位點(diǎn)。這基于Elbashir等(EMBO J(2001)206877-6888，Nature(2001)411494-498.2和Genes & Dev.(2001)15188-200)的觀察結(jié)果，即含有3′懸垂的UU二核苷酸的siRNA最為有效。然而，已經(jīng)證實(shí)含有另外的3′末端二核苷酸突出端的siRNA可有效地誘導(dǎo)RNAi。然后優(yōu)選使用一種或多種下列標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)一步選擇來(lái)自以上鑒定的序列的靶位點(diǎn)(i)選擇具有30-50％GC含量的siRNA；(ii)消除靶序列中＞4個(gè)T或A的序列段；(iii)選擇沿基因序列長(zhǎng)度的不同位置上的siRNA靶位點(diǎn)；和(iv)消除帶有16-17個(gè)以上連續(xù)堿基對(duì)的與其它編碼序列同源的任何靶序列。
siRNA序列甚至可以來(lái)源于如Kumiko Ui-Tei等在Nucl.AcidsRes.2004，VoI 32，No.3，p.936-48)中所述的驗(yàn)證脫靶減量調(diào)節(jié)的算法。
如果選擇的siRNA序列不對(duì)沉默起作用，那么可以使用下列步驟?？梢詫?duì)基因和可能的多態(tài)現(xiàn)象中的測(cè)序誤差進(jìn)行檢索。關(guān)于siRNA對(duì)目標(biāo)識(shí)別的特異性的研究表明位于siRNA雙螺旋配對(duì)區(qū)中的單點(diǎn)突變足以廢除靶mRNA降解。還可以選擇第二和/或第三個(gè)靶并且制備和測(cè)試相應(yīng)的siRNA。
盡管siRNA沉默通過(guò)選擇mRNA中的單個(gè)靶是非常有效的，但是可能需要設(shè)計(jì)和使用兩種獨(dú)立的siRNA雙螺旋以便控制沉默效應(yīng)的特異性。
可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的許多技術(shù)獲得siRNA。例如，可以使用適當(dāng)被保護(hù)的核糖核苷亞磷酰胺和常規(guī)的DNA/RNA合成儀通過(guò)化學(xué)方式合成siRNA?？梢詫iRNA合成為兩個(gè)單獨(dú)的互補(bǔ)RNA分子或具有兩個(gè)互補(bǔ)區(qū)的單個(gè)RNA分子。
例如，在QIAGEN、Ambion和Ocimum Biosolutions的網(wǎng)站上可以找到設(shè)計(jì)siRNA的其它方法。
siRNA還可以購(gòu)自幾個(gè)公司-諸如Dharmacon(USA)和Qiagen GmbH(Hilden，Germany)。
甚至可以標(biāo)記siRNA。作為實(shí)例，可以使用3′-FITC標(biāo)記抗-GFP標(biāo)記siRNA。
可以使用本領(lǐng)域中公知的方法以重組方式制備siRNA。例如，可以使用任何合適的啟動(dòng)子由重組環(huán)狀或線(xiàn)狀DNA質(zhì)粒表達(dá)siRNA。本發(fā)明的重組質(zhì)粒還可以包含用于在特定組織中或在特定胞內(nèi)環(huán)境中表達(dá)siRNA的誘導(dǎo)型或可調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子。
可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從培養(yǎng)的細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中分離由重組質(zhì)粒表達(dá)的siRNA。可以由重組質(zhì)粒將siRNA表達(dá)為兩個(gè)單獨(dú)的互補(bǔ)RNA分子或具有兩個(gè)互補(bǔ)區(qū)的單個(gè)RNA分子。
例如，適合于表達(dá)本發(fā)明siRNA的質(zhì)粒的選擇，將表達(dá)siRNA的核酸序列插入質(zhì)粒的方法和獲得siRNA的方法描述在例如下列文獻(xiàn)中Science(2002)296550-553；Nat.Biotechnol.(2002)20497-500；Genes Dev.(2002)，16948-958；Nat.Biotechnol.(2002)20500-505；和Nat.Biotechnol.(2002)20505-508。
siRNA序列可以包括那些具有治療和/或診斷用途的siRNA序列-諸如編碼細(xì)胞因子、趨化因子、激素、抗體、改造的免疫球蛋白樣分子、單鏈抗體、融合蛋白、酶、免疫共刺激分子、免疫調(diào)節(jié)分子、靶蛋白的反式顯性負(fù)突變體、毒素、條件毒素、抗原、腫瘤抑制蛋白、生長(zhǎng)因子、膜蛋白、血管活性蛋白和肽類(lèi)、抗病毒蛋白和/或核酶的序列。
靶mRNA可以為或可以來(lái)源于抗細(xì)胞凋亡蛋白livin-2(U73857)，它用于刺激胱天蛋白酶-3，導(dǎo)致使用siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系中編程性細(xì)胞死亡發(fā)作。靶向這種mRNA的這種siRNA序列的一個(gè)實(shí)例為5′-GGGCGU GGU GGG UUC UUG AGC-3′。
靶mRNA可以為或可以來(lái)源于HBV、HCV和/或P-pg。
可以使siRNA靶向至為或來(lái)源于HBV、HCV和/或P-糖蛋白的靶mRNA。
特別地，乙型肝炎病毒的序列包括乙型肝炎病毒分離物2-AII-BR大S蛋白(S)基因(登記號(hào)AY344099.1)；乙型肝炎病毒分離物6-AIII-BR大S蛋白(S)基因(登記號(hào)AY344104.1)；乙型肝炎病毒分離物j13小表面蛋白(S)基因(登記號(hào)AY639927.1)；乙型肝炎病毒分離物j7小表面蛋白(S)基因(登記號(hào)AY639924.1)；乙型肝炎病毒分離物17993(登記號(hào)AY217367.1)；和/或乙型肝炎病毒分離物Q7-1(登記號(hào)AY217365.1)。
優(yōu)選HBV siRNA序列是針對(duì)HBV核心基因的保守序列的。更優(yōu)選HBV siRNA序列選自下列組成的組IA15′-GTCGTCCTTTCTCGGAAAT；IA25′-ACTCATCGGGACTGATAAT；和IA35′-GCGGGACGTCCTTTGTTTA。使用針對(duì)HBV核心基因的保守序列的GPboost算法獲得所述的序列。所有這些19nt RNA序列均由Dharmacon(Colorado，USA)通過(guò)化學(xué)方式合成，其在兩個(gè)3′鏈上具有兩個(gè)DNA堿基對(duì)dTdT突出端。所有序列均進(jìn)行了PAGE純化。序列IA3在體外和體內(nèi)顯示出對(duì)HBV表面抗原減量調(diào)節(jié)的有效模式(結(jié)果未顯示)。
丙型肝炎病毒為與肝相關(guān)的發(fā)病率和死亡率的主要原因。該病毒給肝臟帶來(lái)持續(xù)感染，例如，導(dǎo)致慢性肝炎、肝硬化和肝細(xì)胞癌發(fā)生。尚未研發(fā)出令人意外的治療方法，并且目前干擾素與利巴韋林的聯(lián)合治療在接近50％的患者中失敗。HCV病毒為含有編碼結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)蛋白的單一長(zhǎng)可讀框的正鏈RNA病毒。該病毒基因組的翻譯由位于5′末端上的非翻譯區(qū)(5′-UTR；登記號(hào)D31603)中的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)介導(dǎo)，所述的5′末端上的非翻譯區(qū)在所有病毒株的99.6％中也是保守的。因此，它構(gòu)成了用于siRNA藥物的理想靶標(biāo)。類(lèi)似地，3′-UTR(登記號(hào)D63922)為高度保守的并且已經(jīng)證實(shí)顯示出對(duì)體內(nèi)病毒復(fù)制的重要作用。
丙型肝炎病毒的序列包括人丙型肝炎病毒殼體和包膜x蛋白(登記號(hào)M55970.1)；遍及所有HCV分離物(登記號(hào)M55970.1)中保守的5′-UTR區(qū)(341nt)；和/或非結(jié)構(gòu)蛋白-諸如NS3、NS4、NS5A和NS5B。
丙型肝炎病毒的序列包括丙型肝炎病毒NS3蛋白酶(登記號(hào)BD270935.1)的修飾形式。
優(yōu)選一種或多種siRNA序列定向于HCV的5′末端上的非翻譯區(qū)(5′-UTR；登記號(hào)D31603)或3′-UTR(登記號(hào)D63922)。更優(yōu)選HCV序列選自下列組成的組HCVIA1465′-GTCACGGCTAGCTGTGAAAdTdT；HCVIA1855′-TGCAGAGAGTGCTGATACTdTdT；HCVIA2055′ TGGCCTCTCTGCAGATCATdTdT；HCVIA56-5′-UTR5′TACTGTCTTCACGCAGAAAdTdT；
HCVIA210-5′-UTR 5′CGCTCAATGCCTGGAGATTdTdT；HCVIA211-5′-UTR 5′GCTCAATGCCTGGAGATTTdTdT；和HCVIA258-5′-UTR5′-GTAGTGTTGGGTCGCGAAAdTdT。
所有這些19nt RNA序列由Dharmacon(Colorado，USA)通過(guò)化學(xué)方式合成，其在兩個(gè)3′鏈上帶有兩個(gè)DNA堿基對(duì)dTdT突出端。所有序列均進(jìn)行了PAGE純化。將各個(gè)序列的效能與Yokota等在EMBOReports 4，6，2003，602ff中所述的siRNA331(5′-GGUCUCGUAGACCGUGCAC)進(jìn)行比較。
P-糖蛋白(MDR1基因產(chǎn)物)的序列包括人類(lèi)P-糖蛋白(ABCB1)(登記號(hào)AF399931.1)。
本發(fā)明范圍內(nèi)還包括本文所述核苷酸序列的變體、同源物、片段和衍生物。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，siRNA為分離的siRNA形式，它包含例如約17個(gè)核苷酸-約29個(gè)核苷酸長(zhǎng)度-諸如約19-25個(gè)連續(xù)核苷酸長(zhǎng)度-靶向至靶mRNA的短雙鏈RNA，其中所述的靶mRNA為或來(lái)源于HBV、HCV和P-pg蛋白。
脂質(zhì)體脂質(zhì)體一般為包含含有包囊的水體積的脂雙層膜的完全封閉的結(jié)構(gòu)。脂質(zhì)體可以含有被水相隔離的許多同心脂雙層(多層脂質(zhì)體或MLVs)，或可選擇地，它們可以包含單個(gè)膜雙層(單層脂質(zhì)體)。脂雙層由具有疏水性″尾″區(qū)和親水性″頭″區(qū)的兩個(gè)脂單層組成。在膜雙層中，脂單層的疏水性(非極性)″尾″朝向雙層的中心，而親水性(極性)″頭″朝向水相。
可以用于本文所述的脂質(zhì)體的脂質(zhì)成分一般描述在文獻(xiàn)中。一般而言，它們?yōu)榱字?lèi)-諸如磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰絲氨酸、磷脂酸、磷脂酰肌醇和/或鞘脂類(lèi)。可以使用額外的成分，例如，固醇類(lèi)-諸如膽固醇-或其它成分-諸如脂肪酸(例如硬脂酸、棕櫚酸)、磷酸二鯨蠟酯或半琥珀酸膽固醇酯。此外，脂質(zhì)體膜還可以含有防腐劑。脂質(zhì)體膜還可以含有改變其分散特性的成分。它們包括例如磷脂酰乙醇胺的聚乙二醇化衍生物；脂質(zhì)-諸如GM 1-或糖類(lèi)和疏水性成分-諸如葡聚糖的棕櫚酸或硬脂酸酯類(lèi)的結(jié)合物。
脂質(zhì)體的基本結(jié)構(gòu)可以通過(guò)本領(lǐng)域中公知的多種技術(shù)制備。
例如，一般使用Bangham等(1965 J.MoI.Biol.，13238-252)的方法制備了脂質(zhì)體，由此在反應(yīng)容器內(nèi)減壓下蒸發(fā)懸浮于有機(jī)溶劑中的脂質(zhì)而形成干膜。然后將適量的水相加入到容器中并且攪拌該混合物。然后使該混合物保持靜止、基本上穩(wěn)態(tài)足以形成多層脂質(zhì)體的時(shí)間。
可以使用許多目前可利用的技術(shù)再現(xiàn)性地制備脂質(zhì)體?？梢允褂迷S多這些技術(shù)制備的脂質(zhì)體類(lèi)型包括小型單層脂質(zhì)體(SUVs)[參見(jiàn)Papahadjapoulous and Miller，Biochem.Biophys.Acta.，135，p.624-638(1967)]、反相蒸發(fā)脂質(zhì)體(REV)[參見(jiàn)1980年11月25日授權(quán)的美國(guó)專(zhuān)利US4,235,871]、穩(wěn)定的多層脂質(zhì)體(SPLV)[參見(jiàn)1985年6月11日授權(quán)的美國(guó)專(zhuān)利US 4,522,803]和通過(guò)Cullis等的1984年6月20日提交的共同未決的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)順序號(hào)622,690中所述的擠壓技術(shù)生產(chǎn)的大型單層脂質(zhì)體，該專(zhuān)利申請(qǐng)的名稱(chēng)為″用于生產(chǎn)單層脂質(zhì)體的擠壓技術(shù)″。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用下列方法制備脂質(zhì)體。通過(guò)下列步驟制備脂質(zhì)分別將例如CDAN、DOPE和氨氧基脂質(zhì)(CPA)的適量?jī)?chǔ)備溶液吸移入用硝酸和二甲基甲硅烷基二氯預(yù)處理的圓底燒瓶中，并且在劇烈渦旋下用水水化干脂質(zhì)膜，以便產(chǎn)生多層脂質(zhì)體。
可以通過(guò)將多層脂質(zhì)體聲處理30分鐘生產(chǎn)單層脂質(zhì)體。優(yōu)選將該步驟持續(xù)進(jìn)行，直到達(dá)到小于約30nm的大小。
為了將siRNA加入到脂質(zhì)體中，在劇烈渦旋下將siRNA在水中的溶液滴加到這些脂質(zhì)體中。優(yōu)選將該步驟持續(xù)進(jìn)行，直到達(dá)到約0.1mg/mL的siRNA終濃度。
正如通過(guò)PCS測(cè)定的，所得siRNA lipoplex一般為約30-50nm直徑的測(cè)量值。
可以將本文所述的載體凍干。優(yōu)選冷凍干燥該載體。因此，在另一個(gè)方面中，提供了一種方法，包括下列步驟(i)提供如本文所述的載體；(ii)任選使該載體接觸冷凍保護(hù)劑；和(iii)冷凍干燥該載體。
有利的是，可以在延長(zhǎng)的時(shí)間段內(nèi)儲(chǔ)存冷凍干燥的載體。在儲(chǔ)存后，可以在使用前將載體在水中再水化。
有利的是，在有冷凍保護(hù)劑-諸如蔗糖、海藻糖和乳糖存在下冷凍干燥-不會(huì)削減載體的大小(PCS)和活性。令人意外的是，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在有海藻糖存在下冷凍干燥的載體甚至比新鮮制備的載體更為有效。
使用例如聚乙二醇-α/γ-雙醛(Mw分別為2000或3400；NEKTAR，USA)的溶液，例如以1mg/mL加入聚合物。然后在渦旋下將適量的聚合物加入到siRNA lipoplex中。一般而言，該步驟將產(chǎn)生含有不同量聚合物(例如0.1-5％，m/m總脂質(zhì))的共價(jià)表面-聚乙二醇化的siRNA-lipoplex。可以在減壓下蒸發(fā)一半體積并且在使用，例如注入動(dòng)物前通過(guò)添加PBS補(bǔ)償。
還需要在脂質(zhì)體中包括其它組分-諸如診斷標(biāo)記，包括放射性標(biāo)記、染料、化學(xué)發(fā)光和熒光標(biāo)記；造影劑；成像助劑；附加物等。
脂質(zhì)體優(yōu)選包含一種或多種下式(I)的含氨氧基的脂質(zhì) 其中B為脂質(zhì)；其中X為任選的連接基并且其中R2為H或烴基。優(yōu)選脂質(zhì)為那些描述在國(guó)際(PCT)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)朠CT/GB01/05385中的脂質(zhì)。
本文式(I)中的術(shù)語(yǔ)″烴基″意指包含至少C和H并且可以任選包含一個(gè)或多個(gè)其它合適的置換基的基團(tuán)。這類(lèi)置換基的實(shí)例可以包括鹵素、烷氧基、硝基、烷基、環(huán)狀基團(tuán)等。除為環(huán)狀基團(tuán)的置換基的可能性外，置換基的組合可以形成環(huán)狀基團(tuán)。如果烴基包含一個(gè)以上的C，那么那些碳不一定需要彼此連接。例如，碳中的至少兩個(gè)可以通過(guò)合適的元素或基團(tuán)連接。因此，烴基可以含有雜原子。合適的雜原子對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言顯而易見(jiàn)并且包括例如硫、氮和氧。烴基的非限制性實(shí)例為?；?。
典型的烴基為烴的基團(tuán)。本文的術(shù)語(yǔ)″烴″意指烷基、鏈烯基、炔基中的任一個(gè)，這些基團(tuán)可以為直鏈、支鏈或環(huán)狀的基團(tuán)或芳基。術(shù)語(yǔ)烴還包括那些任選被置換的基團(tuán)。如果烴為其上帶有置換基的支鏈結(jié)構(gòu)，那么置換可以位于烴主鏈或支鏈上；或者，置換可以位于烴主鏈和支鏈上。
烴基/烴/烷基可以為直鏈或支鏈的和/或可以為飽和或不飽和的。
在一個(gè)優(yōu)選的方面中，烴基/烴/烷基可以選自在該基團(tuán)上含有至少一個(gè)雜原子的直鏈或支鏈烴的基團(tuán)。
在一個(gè)優(yōu)選的方面中，烴基/烴/烷基可以為包含至少兩個(gè)碳或其中碳和雜原子總數(shù)至少為2的烴基。
在一個(gè)優(yōu)選的方面中，烴基/烴/烷基可以選自在該基團(tuán)上含有至少一個(gè)雜原子的烴基。優(yōu)選雜原子選自硫、氮和氧。
在一個(gè)優(yōu)選的方面中，烴基/烴/烷基可以選自在該基團(tuán)上含有至少一個(gè)雜原子的直鏈或支鏈烴的基團(tuán)。優(yōu)選雜原子選自硫、氮和氧。
在一個(gè)優(yōu)選的方面中，烴基/烴/烷基可以選自在該基團(tuán)上含有至少一個(gè)雜原子的直鏈或支鏈烷基，優(yōu)選C1-10烷基，更優(yōu)選C1-5烷基。優(yōu)選雜原子選自硫、氮和氧。
在一個(gè)優(yōu)選的方面中，烴基/烴/烷基可以選自在該基團(tuán)上含有至少一個(gè)雜原子的直鏈烷基，優(yōu)選C1-10烷基，更優(yōu)選C1-5烷基。優(yōu)選雜原子選自硫、氮和氧。
烴基/烴/烷基可以選自·C1-10烴基；·C1-5烴基；·C1-3烴基；·烴的基團(tuán)·C1-10烴；·C1-5烴；
·C1-3烴；·烷基；·C1-10烷基；·C1-5烷基；·C1-3烷基。
烴基/烴/烷基可以為直鏈或支鏈的和/或可以為飽和或不飽和的。
烴基/烴/烷基可以為在該基團(tuán)上含有至少一個(gè)雜原子的直鏈或支鏈的烴的基團(tuán)。
優(yōu)選R2為H或烴基。
在一個(gè)優(yōu)選的方面中，R2烴基含有選自O(shè)、N和鹵素的任選的雜原子。
在一個(gè)優(yōu)選的方面中，R2為H。
優(yōu)選脂質(zhì)為或來(lái)源于或包含膽固醇基團(tuán)。
膽固醇基團(tuán)可以為或可以來(lái)源于膽固醇或其衍生物。
膽固醇衍生物的實(shí)例包括置換的衍生物，其中環(huán)狀CH2或CH基團(tuán)中的一個(gè)或多個(gè)和/或直鏈CH2或CH基團(tuán)中的一個(gè)或多個(gè)適當(dāng)被置換。選擇性地或此外，環(huán)狀基團(tuán)中的一個(gè)或多個(gè)和/或直鏈基團(tuán)中的一個(gè)或多個(gè)可以未被置換。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，膽固醇基團(tuán)為膽固醇。
在一個(gè)優(yōu)選的方面中，存在任選的連接基X。
在一個(gè)優(yōu)選的方面中，X為烴基。
在一個(gè)優(yōu)選的方面中，連接基X包含脂質(zhì)或通過(guò)聚胺基團(tuán)與脂質(zhì)連接。
認(rèn)為聚胺基團(tuán)是有利的，因?yàn)樗黾覦NA的結(jié)合能力和所得脂質(zhì)體的基因轉(zhuǎn)移效率。
在一個(gè)實(shí)施方案中，優(yōu)選聚胺基團(tuán)為非天然存在的聚胺。優(yōu)選本發(fā)明聚胺基團(tuán)的胺基中的兩個(gè)或多個(gè)被一個(gè)或多個(gè)基團(tuán)隔離，在自然界未發(fā)現(xiàn)所述的可隔離天然存在的聚胺化合物的胺基的基團(tuán)(即優(yōu)選本發(fā)明的聚胺基團(tuán)帶有非天然的間隔)。
優(yōu)選聚胺基團(tuán)含有通過(guò)亞乙基(-CH2CH2-)基團(tuán)彼此隔離的(彼此隔開(kāi)的)聚胺基團(tuán)的至少兩個(gè)胺。
優(yōu)選聚胺基團(tuán)的胺各自通過(guò)亞乙基(-CH2CH2-)基團(tuán)彼此隔離(彼此隔開(kāi))。
在一個(gè)優(yōu)選的方面中，X為或包含下式的基團(tuán) 其中n和m獨(dú)立為0-6，優(yōu)選1-6，更優(yōu)選2、3或4，更優(yōu)選2或4。在一個(gè)極為優(yōu)選的方面中，m為2且n為4。
在一個(gè)優(yōu)選的方面中，X為或包含下式的基團(tuán) 其中n和m獨(dú)立為0-6，優(yōu)選1-6，更優(yōu)選2、3或4，更優(yōu)選2或4。在一個(gè)極為優(yōu)選的方面中，m為2且n為4在一個(gè)優(yōu)選的方面中，脂質(zhì)體具有下式 其中B為脂質(zhì)并且其中n和m獨(dú)立為0-6，優(yōu)選1-6，更優(yōu)選2、3或4，更優(yōu)選2或4。在一個(gè)極為優(yōu)選的方面中，m為2且n為4。
在一個(gè)優(yōu)選的方面中，X為或包含下式的基團(tuán)
其中m為0-6，優(yōu)選1-6，更優(yōu)選1、2或3，更優(yōu)選1，并且其中n為0-20，優(yōu)選5-15，更優(yōu)選10、11或12，更優(yōu)選11。
在一個(gè)優(yōu)選的方面中，X為或包含下式的基團(tuán) 其中m為0-6，優(yōu)選1-6，更優(yōu)選1、2或3，更優(yōu)選1，并且其中n為0-20，優(yōu)選5-15，更優(yōu)選10、11或12，更優(yōu)選11。
在一個(gè)優(yōu)選的方面中，脂質(zhì)體具有下式 其中B為脂質(zhì)并且其中m為0-6，優(yōu)選1-6，更優(yōu)選1、2或3，更優(yōu)選1，并且其中n為0-20，優(yōu)選5-15，更優(yōu)選10、11或12，更優(yōu)選11。
合適的聚胺類(lèi)的典型實(shí)例包括亞精胺、精胺、caldopentamine、norspermidine和norspermine。備選的優(yōu)選聚胺為caldopentamine。
在一個(gè)極為優(yōu)選的實(shí)施方案中，含有氨氧基的脂質(zhì)為CPA。
優(yōu)選脂質(zhì)體包含一種或多種陽(yáng)離子脂質(zhì)。
各種陽(yáng)離子脂質(zhì)為本領(lǐng)域中公知的。這類(lèi)陽(yáng)離子脂質(zhì)的范例結(jié)構(gòu)在WO 95/02698的表1中提供。
一般而言，可以使用任何陽(yáng)離子脂質(zhì)，既可以為單價(jià)的，也可以為多價(jià)的。
一般優(yōu)選多價(jià)陽(yáng)離子脂質(zhì)。
陽(yáng)離子脂質(zhì)包括胺、酰胺或其衍生物的飽和和不飽和的烷基和脂環(huán)族醚類(lèi)和酯類(lèi)。陽(yáng)離子脂質(zhì)的直鏈和支鏈烷基和烯烴基團(tuán)可以含有1-約25個(gè)碳原子。優(yōu)選的直鏈或支鏈烷基或烯烴基團(tuán)具有6個(gè)或6個(gè)以上碳原子。脂環(huán)族基團(tuán)可以含有約6-30個(gè)碳原子。優(yōu)選的脂環(huán)族基團(tuán)包括膽固醇和其它類(lèi)固醇基團(tuán)?？梢允褂酶鞣N抗衡離子(陰離子)制備陽(yáng)離子脂質(zhì)，所述的抗衡離子尤其包括氯根、溴根、碘根、氟根、乙酸根、三氟乙酸根、硫酸根、亞硝酸根和硝酸根。
眾所周知的陽(yáng)離子脂質(zhì)為N-[1-(2，3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲銨氯化物(DOTMA)。
DOTMA和類(lèi)似物二酯DOTAP(1，2-雙(油酰氧基)-3(三甲銨)丙烷)為商購(gòu)的。
在結(jié)構(gòu)上與DOTMA相關(guān)的額外的陽(yáng)離子脂質(zhì)描述在US 4,897,355中。
與DOTMA和DOTAP相關(guān)的陽(yáng)離子脂質(zhì)的另一個(gè)有用的基團(tuán)通常稱(chēng)作DORI-醚類(lèi)或DORI-酯類(lèi)。DORI脂質(zhì)不同于DOTMA和DOTAP的方面在于三甲銨基團(tuán)的甲基之一被羥乙基置換。DORI脂質(zhì)的油?；梢员黄渌榛蛳N基置換，諸如棕櫚酰基或硬脂?；?。DORI-類(lèi)脂質(zhì)的羥基可以用作進(jìn)一步官能化，例如酯化成胺類(lèi)，如羰基精胺的位置。
可以用于本發(fā)明的遞送載體或復(fù)合物的另外的陽(yáng)離子脂質(zhì)包括那些在WO 91/15501中描述為可用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染的陽(yáng)離子脂質(zhì)。
陽(yáng)離子固醇衍生物，如膽固醇與三烷基銨基團(tuán)連接的3β[N-(N′，N′-二甲氨基乙烷)氨基甲?；鵠膽固醇(DC-Chol)也可以用于本發(fā)明。據(jù)報(bào)導(dǎo)，對(duì)某些細(xì)胞系而言，DC-Chol可以提供比含DOTMA的脂質(zhì)體更有效的轉(zhuǎn)染和更低的毒性。還可以使用DC-Chol聚胺變體，諸如那些描述在WO 97/45442的DC-Chol聚胺變體。
含有羧基精胺的聚陽(yáng)離子脂質(zhì)也可用于本發(fā)明的遞送載體或復(fù)合物。BP-A-304111中描述了含有羧基精胺的陽(yáng)離子脂質(zhì)，包括5-羧基精胺基甘氨酸雙十八烷基-酰胺(DOGS)和二棕櫚?；字Ｒ掖及?-羧基精胺基酰胺(DPPES)?？梢酝ㄟ^(guò)分別用其它烷基或烯烴基置換DOGS和DPPES的十八烷基和棕櫚?；@得另外的陽(yáng)離子脂質(zhì)。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，陽(yáng)離子脂質(zhì)包含至少一種胺、酰胺或其衍生物的飽和或不飽和脂環(huán)族醚或酯。脂環(huán)族基團(tuán)可以含有約6-30個(gè)碳原子。極為優(yōu)選的脂環(huán)族基團(tuán)為膽固醇。
因此，在一個(gè)極為優(yōu)選的實(shí)施方案中，聚陽(yáng)離子脂質(zhì)為基于膽固醇的脂質(zhì)。
優(yōu)選基于膽固醇的脂質(zhì)為N′-膽固醇基氧基羰基-3，7-二氮雜壬烷-1，9-二胺(CDAN) 其中Chol表示下式的基團(tuán) 優(yōu)選本文所述的轉(zhuǎn)化體包括非陽(yáng)離子輔脂質(zhì)，優(yōu)選中性脂質(zhì)，以便形成脂質(zhì)體或脂質(zhì)聚集物。
可用于本發(fā)明的中性脂質(zhì)包括卵磷脂；磷脂酰乙醇胺類(lèi)，諸如DOPE(二油?；字Ｒ掖及?、POPE(棕櫚?；王；字Ｒ掖及?和DSPE(二硬脂?；字Ｒ掖及?；磷脂酰膽堿；磷脂酰膽堿類(lèi)，諸如DOPC(二油酰基磷脂酰膽堿)、DPPC(二棕櫚酰基磷脂酰膽堿)、POPC(棕櫚?；王；字Ｄ憠A)和DSPC(二硬脂?；字Ｄ憠A；磷脂酰甘油；磷脂酰甘油類(lèi)，諸如DOPG(二油?；字８视?、DPPG(二棕櫚?；字８视?和DSPG(二硬脂?；字８视?；磷脂酰絲氨酸類(lèi)，諸如二油?；?或二棕櫚?；字＝z氨酸；二磷脂酰甘油類(lèi)；脂肪酸酯類(lèi)；甘油酯類(lèi)；鞘脂類(lèi)；強(qiáng)心脂類(lèi)(cardolipin)；腦苷類(lèi)；和神經(jīng)酰胺類(lèi)；及其混合物等。中性脂質(zhì)還包括膽固醇和其它3DOH-固醇類(lèi)。
優(yōu)選非陽(yáng)離子輔脂質(zhì)為磷脂酰乙醇胺類(lèi)。更優(yōu)選非陽(yáng)離子輔脂質(zhì)為DOPE(二油?；字Ｒ掖及?。
在一個(gè)優(yōu)選的方面中，脂質(zhì)為適用于成像應(yīng)用的脂質(zhì)。成像脂質(zhì)可以為選自熒光脂質(zhì)、磁共振成像脂質(zhì)、核磁共振成像脂質(zhì)、電子顯微術(shù)和圖象處理脂質(zhì)、電子自旋共振脂質(zhì)和放射性成像脂質(zhì)的脂質(zhì)。在這些類(lèi)別的每一類(lèi)中合適和優(yōu)選的脂質(zhì)如下所述熒光脂質(zhì)例如1，2-二油?；?sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(5-二甲氨基-1-萘磺?；?、1，2-二油?；?sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(1-芘磺?；?、1，2-二油?；?sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(羧基熒光素)、1-油?；?2-[6-[(7-硝基-2-1，3-苯并二唑-4-基)氨基]己?；鵠-sn-甘油-3-磷酸-L-絲氨酸、25-{N-[(7-硝基苯并-2--1，3-二唑-4-基)-甲基]氨基}-27-去甲膽固醇、-油?；?2-[6-[(7-硝基-2-1，3-苯并二唑-4-基)氨基]己?；鵠-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺，1，2-二油?；?sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(麗絲胺若丹明B磺酰基)。
用于磁共振成像和核磁共振成像的脂質(zhì)Gd-DTPA-雙(硬脂酰胺)(Gd-BSA)；Gd-DTPA-雙(肉豆蔻酰胺)(GdDTPA-BMA)、1，2-二肉豆蔻酰基-Sn-甘油-3-磷酸乙醇胺二亞乙基三胺五乙酸酯Gd3+(DMPEDTPAGd3+)；D35-1，2-二己?；?Sn-甘油-3-磷酸膽堿。
電子顯微術(shù)和圖象處理1，2-二油?；?Sn-甘油-3-{[N(5-氨基-1-羧基戊基)亞氨基二乙酸]琥珀酰基}-(鎳鹽)。
電子自旋共振1，2-二酰基-sn-甘油-3-Phosphotempocholine、1-棕櫚?；?2-硬脂?；?n-DOXYL)-sn-甘油-3-磷酸膽堿。
放射性成像
(99m)Tc-DTPA-雙(硬脂酰胺)；(99m)Tc-DTPA-雙(肉豆蔻酰胺)。
此外，可以任選摻入一種或多種兩親化合物以便改變其表面特性。用于本發(fā)明的兩親化合物包括新糖脂類(lèi)(neoglycolipids)，諸如GLU4和GLU7；聚乙二醇脂類(lèi)，諸如N-(O-甲氧基(聚氧乙烯)氧基羰基)-磷脂酰乙醇胺、N-一甲氧基(聚氧乙烯)琥珀?；字Ｒ掖及泛途垩跻蚁┠懝檀济?；非離子型去污劑，諸如烷基糖苷類(lèi)、烷基甲基葡糖酰胺類(lèi)(alkyl methyl glucamides)、蔗糖酯類(lèi)、烷基聚甘油醚類(lèi)、烷基聚氧乙烯醚類(lèi)和烷基脫水山梨糖醇氧乙烯醚類(lèi)和甾族氧乙烯醚類(lèi)；嵌段共聚物，諸如聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物。
因此，在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，脂質(zhì)體包含一種或多種含氨氧基的脂質(zhì)、一種或多種陽(yáng)離子脂質(zhì)(更優(yōu)選一種或多種聚陽(yáng)離子脂質(zhì))和一種以上非陽(yáng)離子輔脂質(zhì)(更優(yōu)選中性脂質(zhì))。
更優(yōu)選脂質(zhì)體包含一種或多種式(I)的含氨氧基的脂質(zhì)(優(yōu)選CPA)和/或其混合物；一種或多種選自DOTMA、DOTAP、DORI-醚類(lèi)或DORI-酯類(lèi)(DC-Chol)、DOGS、DPPES和/或CDAN組成的組的聚陽(yáng)離子脂質(zhì)和/或其混合物；和一種或多種選自DOPE、POPE、DSPE、DOPC、DPPC、DSPC、DOPG、DPPG、DSPG、磷脂酰絲氨酸、雙磷脂酰甘油、脂肪酸酯類(lèi)、甘油酯、鞘脂類(lèi)、強(qiáng)心脂類(lèi)、腦苷類(lèi)和/或神經(jīng)酰胺類(lèi)組成的組的中性脂質(zhì)和/或其混合物。
更優(yōu)選脂質(zhì)體包含選自CPA、CDAN和DOPE組成的組的脂質(zhì)中的一種或多種。
最優(yōu)選脂質(zhì)體包含CPA、CDAN和DOPE。
我們已經(jīng)意外地發(fā)現(xiàn)用于本發(fā)明的特定脂質(zhì)體具有特別的優(yōu)點(diǎn)。這些優(yōu)點(diǎn)不僅適用于本發(fā)明的包含siRNA的遞送載體，而且適用于各種各樣的系統(tǒng)。我們已經(jīng)鑒定了包含通過(guò)具有最小長(zhǎng)度的連接基與偶聯(lián)部分連接的脂質(zhì)的本發(fā)明的脂質(zhì)體能夠制備靶向遞送載體。特別地，這類(lèi)脂質(zhì)體可以用于制備載體，其中某些脂質(zhì)體與一種或多種聚合物偶聯(lián)并且具有最小長(zhǎng)度的連接基(″長(zhǎng)連接基″)的脂質(zhì)體的偶聯(lián)部分突出超過(guò)了由聚合物形成的外殼。包含長(zhǎng)連接基的脂質(zhì)體的突出偶聯(lián)部分隨后可以用于偶聯(lián)另外的基因，例如突出的偶聯(lián)部分可以用于偶聯(lián)靶向部分，諸如抗體。
因此，本發(fā)明在另一個(gè)方面中提供了包含脂質(zhì)和偶聯(lián)部分的脂質(zhì)體，其中脂質(zhì)與偶聯(lián)部分之間的距離為至少1.5nm。優(yōu)選脂質(zhì)與偶聯(lián)部分之間的距離為至少2nm，諸如至少3nm或至少5nm。
本發(fā)明在另一個(gè)方面中提供了下式的脂質(zhì)體 其中B為脂質(zhì)；其中X為連接基并且偶聯(lián)為偶聯(lián)部分，其中X主鏈包含至少30個(gè)原子。
術(shù)語(yǔ)″X(qián)主鏈″意指X與偶聯(lián)部分的連接和X與B的連接之間的X部分內(nèi)的直接鍵合原子的最短鏈。
優(yōu)選X主鏈包含至少40個(gè)原子，諸如至少50個(gè)原子，諸如至少60個(gè)原子。
優(yōu)選X主鏈包含至少40個(gè)碳原子，諸如至少50個(gè)碳原子，諸如至少60個(gè)碳原子。
作為實(shí)例，本文所述的膽固醇氨氧基脂質(zhì)4在結(jié)合氧化的IgG抗體方面未成功，因?yàn)槟懝檀蓟糠峙c氨氧基官能團(tuán)之間的間隔基不夠長(zhǎng)。然而，它成功地偶聯(lián)了聚乙二醇-雙醛(Mw 2000和3400)。
脂質(zhì)B可以為本文所述的任何脂質(zhì)。特別優(yōu)選的是選自下列的脂質(zhì)磷脂類(lèi)，諸如二硬脂?；字Ｒ掖及?DSPE)；基于類(lèi)固醇的脂質(zhì)，諸如膽固醇；基于胺的脂質(zhì)，諸如二環(huán)己胺。
連接基X可以為本文所述的任何連接基。應(yīng)理解所謂連接基一般意指非反應(yīng)性連接基。優(yōu)選連接基為親水性的。
連接基可以為·烴基，諸如十八烷基。
·肽-衍生的，諸如聚甘氨酸。
·聚合物，諸如聚(碳酸乙烯酯)、聚乙二醇(PEG)、N-(2-羥丙基)甲基丙烯酰胺(HMPA)、聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)、聚(D，L-丙交酯)(PLA)和聚(乙交酯)(PGA)。
·碳水化合物，諸如葡聚糖、聚甘露糖、透明質(zhì)酸、寡糖類(lèi)、葡聚糖、普魯蘭。
在某些方面中，連接基自身也可以為具有化學(xué)反應(yīng)性的，例如連接基可以為肽衍生的，諸如聚(賴(lài)氨酸)(PL)或聚(谷氨酸)。
在一個(gè)優(yōu)選的方面中，X為或包含下式的基團(tuán) 其中n和m獨(dú)立為0-6，優(yōu)選1-6，更優(yōu)選2、3或4，更優(yōu)選2或4。在一個(gè)極為優(yōu)選的方面中，m為2且n為4。
在一個(gè)優(yōu)選的方面中，X為或包含下式的基團(tuán) 其中n和m獨(dú)立為0-6，優(yōu)選1-6，更優(yōu)選2、3或4，更優(yōu)選2或4。在一個(gè)極為優(yōu)選的方面中，m為2且n為4在一個(gè)優(yōu)選的方面中，X為或包含下式的基團(tuán) 其中m為0-6，優(yōu)選1-6，更優(yōu)選1、2或3，更優(yōu)選1，并且其中n為0-20，優(yōu)選5-15，更優(yōu)10、11或12，更優(yōu)選11。
在一個(gè)優(yōu)選的方面中，X為或包含下式的基團(tuán) 其中m為0-6，優(yōu)選1-6，更優(yōu)選1、2或3，更優(yōu)選1，并且其中n為0-20，優(yōu)選5-15，更優(yōu)10、11或12，更優(yōu)選11。
偶聯(lián)可以為本文所述的任何偶聯(lián)部分。特別優(yōu)選的是親核基團(tuán)，特別是胺、硫醇、醇、氨氧基、肼、酰肼、疊氮化物。
親電子基團(tuán)，特別是異硫氰酸酯、醛類(lèi)、酮類(lèi)、異氰酸酯類(lèi)、馬來(lái)酰亞胺、一般的Michael受體、鹵化物、甲苯磺酸酯類(lèi)、一般的化學(xué)離去基團(tuán)、活性酯類(lèi)。
光連接基，特別是疊氮化物。
聚合物本文所用的術(shù)語(yǔ)″聚合物″意指包含與包含在脂質(zhì)體中的一種或多種脂質(zhì)發(fā)生相互作用、與它們結(jié)合或與它們偶聯(lián)的一種或多種官能團(tuán)的任何聚合物。
聚合物可以為天然存在的聚合物或其衍生物。
聚合物可以為化學(xué)修飾的聚合物，其中該聚合物可以被修飾以便包括一個(gè)或多個(gè)官能團(tuán)。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，脂質(zhì)體中的一種或多種脂質(zhì)與一種或多種聚合物偶聯(lián)。有利的是，與聚合物偶聯(lián)的脂質(zhì)暴露在脂質(zhì)體表面上，使得聚合物保留在脂質(zhì)體表面上。由于不受任何特定的理論約束，所以認(rèn)為聚合物會(huì)通過(guò)脂質(zhì)體中的脂質(zhì)與聚合物之間的多種相互作用有效包被脂質(zhì)體表面。
脂質(zhì)與聚合物之間的偶聯(lián)可以通過(guò)任何類(lèi)型的相互作用介導(dǎo)-諸如氫鍵相互作用、電荷相互作用、疏水性相互作用、共價(jià)相互作用、范德瓦耳斯相互作用或偶極相互作用。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，相互作用通過(guò)共價(jià)相互作用介導(dǎo)。
優(yōu)選共價(jià)相互作用在聚合物的一個(gè)或多個(gè)基團(tuán)(例如官能團(tuán))與脂質(zhì)體中的一種或多種脂質(zhì)之間發(fā)生。
本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠選擇合適的基團(tuán)以便獲得期望的在聚合物的一個(gè)或多個(gè)基團(tuán)(例如官能團(tuán))與脂質(zhì)體中的一種或多種脂質(zhì)之間的相互作用。
在一個(gè)優(yōu)選的方面中，共價(jià)相互作用發(fā)生在聚合物的一個(gè)或多個(gè)基團(tuán)與脂質(zhì)體中的一種或多種脂質(zhì)的一個(gè)或多個(gè)官能團(tuán)之間，該官能團(tuán)選自胺、硫醇、醇、氨氧基、肼、酰肼、疊氮化物、異硫氰酸酯、醛類(lèi)、酮類(lèi)、異氰酸酯類(lèi)、馬來(lái)酰亞胺、鹵化物、甲苯磺酸酯類(lèi)和酯類(lèi)。特別優(yōu)選的是氨氧基和肼基。
最優(yōu)選共價(jià)相互作用發(fā)生在聚合物的一個(gè)或多個(gè)醛和/或酮基與脂質(zhì)體中的一種或多種脂質(zhì)的一個(gè)或多個(gè)氨氧基之間。
有利的是，提供包含氨氧基的脂質(zhì)能夠便利地使聚合物通過(guò)氨氧基與脂質(zhì)連接。當(dāng)與包含醛或酮基的聚合物反應(yīng)時(shí)，提供了聚合物與脂質(zhì)通過(guò)酰胺基團(tuán)連接的化合物?？梢栽凇鍐喂蕖宸磻?yīng)中便利地制備這類(lèi)連接物。該方法通過(guò)簡(jiǎn)單的透析或過(guò)量的未反應(yīng)附加物避免大量的純化操作步驟。
優(yōu)選聚合物選自單或雙官能聚(乙二醇)(″PEG″)、聚(乙烯醇)(″PVA″)；其它聚(環(huán)氧烷烴)，諸如聚(丙二醇)(″PPG″)；和聚(氧乙基化多元醇)，諸如聚(氧乙基化甘油)、聚(氧乙基化山梨醇)和聚(氧乙基化葡萄糖)等。
正如教導(dǎo)背景技術(shù)的US-A-2001/0021763中所論述，所述的聚合物可以為均聚物或隨機(jī)或嵌段共聚物和三元共聚物，它們基于上述聚合物的單體、直鏈或支鏈或置換或未被置換的與mPEG類(lèi)似的聚合物和具有可用于與連接基連接的單個(gè)活性位置的其它封端的單官能PEG。
合適的另外聚合物的實(shí)例包括聚(唑啉)、聚(丙烯?；鶈徇?(″PAcM″)和聚(乙烯基吡咯烷酮)(″PVP″)。PVP和聚(唑啉)為本領(lǐng)域中眾所周知的聚合物且其制備和在合成mPEG中所述的應(yīng)用對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言應(yīng)顯而易見(jiàn)。PacM及其合成和應(yīng)用描述在US-A-5,629,384和US-A-5,631,322中。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，聚合物為帶有官能醛和/或酮基的聚乙二醇(PEG)或其化學(xué)衍生物。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，聚合物具有2000-1000的分子量。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，聚乙二醇(PEG)具有2000-1000的分子量。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，聚合物帶有一個(gè)或多個(gè)能夠偶聯(lián)一種或多種脂質(zhì)的官能團(tuán)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，聚合物帶有一個(gè)或兩個(gè)和僅一個(gè)或兩個(gè)能夠偶聯(lián)一種或多種脂質(zhì)的官能團(tuán)。
PEG的不同大小可以如附圖1中所述使用并且可以包括單-和雙-醛PEG。
聚乙二醇(PEG)以前已經(jīng)用于改變遞藥系統(tǒng)的生物物理特性。例如，它可以用于將血清穩(wěn)定性賦予基因遞送載體(2-4)。這一構(gòu)思已經(jīng)描述在文獻(xiàn)中，普遍認(rèn)為將PEG配制到基因遞送載體中明顯終止了該基因遞送載體的轉(zhuǎn)染功效(5-8，42)。近來(lái)對(duì)為什么出現(xiàn)該現(xiàn)象的研究表明PEG配制的非病毒基因遞送系統(tǒng)同樣可以被攝入培養(yǎng)的細(xì)胞，但表現(xiàn)出顯著改變的胞內(nèi)運(yùn)輸(9)?？磥?lái)這些PEG配制的載體不會(huì)從包含體中釋放，或PEG誘導(dǎo)的秘密行動(dòng)不會(huì)在胞內(nèi)釋放pDNA，或PEG作為分子抑制pDNA沿著胞內(nèi)微管蛋白系統(tǒng)向細(xì)胞核的胞內(nèi)運(yùn)輸。使用加載了寡核苷酸(ODN)的lipoplex進(jìn)行了類(lèi)似的觀察。Song和同仁觀察到具有不同長(zhǎng)度PEG的單層DODAC/DOPE/PEG-脂質(zhì)陽(yáng)離子脂質(zhì)體系統(tǒng)的胞吞類(lèi)似于非聚乙二醇化的lipoplex，但其內(nèi)含體釋放受到嚴(yán)重危害(10)。部分地根據(jù)這些數(shù)據(jù)，Hoekstra和同仁報(bào)導(dǎo)了在ODN lipoplex中包含10mol％PEG-磷脂酰乙醇胺抑制了其攝入中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞達(dá)70％以上，并且胞內(nèi)部分仍然被截留在內(nèi)含體/溶酶體途徑中。Hoekstra注意到將PEG配制到lipoplex中的操作步驟對(duì)lipoplex脫離內(nèi)含體的潛能而言是關(guān)鍵的。當(dāng)脂質(zhì)體在有DSPE-PEG存在下形成且然后加載ODN時(shí)，ODN的攝取以PEG/脂質(zhì)-濃度依賴(lài)性方式受到強(qiáng)烈抑制。復(fù)合物解離甚至在較低PEG用量(1％)下也受到抑制。相反，當(dāng)將DSPE-PEG摻入預(yù)形成的ODN-lipoplex中時(shí)，聚乙二醇化只限于ODN-lipoplex的外周，并且看來(lái)只有這類(lèi)聚乙二醇化的復(fù)合物才能展示出在遞送中的豐富應(yīng)用，條件是PEG-脂質(zhì)為可交換的(11)。
基于這些結(jié)果，可以預(yù)計(jì)使用siRNA配制的非病毒遞送載體可以表現(xiàn)出與對(duì)ODN和pDNA觀察到相同的趨勢(shì)。
令人意外的是，并非是這種情況。
而是包含脂質(zhì)體的非病毒遞送載體明顯使脂質(zhì)體對(duì)聚集保持穩(wěn)定，而不會(huì)削弱siRNA減量調(diào)節(jié)靶基因的能力，其中脂質(zhì)體中的一種或多種脂質(zhì)以可逆或不可逆方式與一種或多種聚合物-諸如PEG-偶聯(lián)并且其中脂質(zhì)體包含siRNA。
因此，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，非病毒遞送載體包含一種或多種與脂質(zhì)體偶聯(lián)的聚合物，所述的脂質(zhì)體包含一種或多種式(I)的含氨氧基的脂質(zhì)，優(yōu)選CPA和/或其混合物；一種或多種選自DOTMA、DOTAP、DORI-醚類(lèi)或DORJ-酯類(lèi)(DC-Choi)、DOGS、DPPES和/或CDAN組成的組的聚陽(yáng)離子脂質(zhì)和/或其混合物；一種或多種選自DOPE、POPE、DSPE、DOPC、DPPC、DSPC、DOPG、DPPG、DSPG、磷脂酰絲氨酸、雙磷脂酰甘油、脂肪酸酯類(lèi)、甘油酯、鞘脂類(lèi)、強(qiáng)心脂類(lèi)、腦苷類(lèi)和/或神經(jīng)酰胺類(lèi)組成的組的中性脂質(zhì)和/或其混合物。
更優(yōu)選非病毒載體包含與脂質(zhì)體偶聯(lián)的PEG，所述的脂質(zhì)體包含一種或多種式(I)的含氨氧基的脂質(zhì)，優(yōu)選CPA和/或其混合物；一種或多種選自DOTMA、DOTAP、DORI-醚類(lèi)或DORJ-酯類(lèi)(DC-Choi)、DOGS、DPPES和/或CDAN組成的組的聚陽(yáng)離子脂質(zhì)和/或其混合物；一種或多種選自DOPE、POPE、DSPE、DOPC、DPPC、DSPC、DOPG、DPPG、DSPG、磷脂酰絲氨酸、雙磷脂酰甘油、脂肪酸酯類(lèi)、甘油酯、鞘脂類(lèi)、強(qiáng)心脂類(lèi)、腦苷類(lèi)和/或神經(jīng)酰胺類(lèi)組成的組的中性脂質(zhì)和/或其混合物。
更優(yōu)選非病毒遞送載體包含一種或多種與脂質(zhì)體偶聯(lián)的聚合物，所述的脂質(zhì)體包含CPA、CDAN和DOPE和/或其混合物。
最優(yōu)選非病毒遞送載體包含與脂質(zhì)體偶聯(lián)的PEG，所述的脂質(zhì)體包含CPA、CDAN和DOPE和/或其混合物。
非病毒遞送載體如本文所述，一般通過(guò)使一種或多種脂質(zhì)與siRNA和將要包括在脂質(zhì)體中的任何其它成分接觸制備遞送載體。脂質(zhì)可以為包含一種或多種，優(yōu)選兩種或多種脂質(zhì)成分的預(yù)形成的脂質(zhì)體的組成部分。可以將這種最終的復(fù)合物貯存在約-80℃，并且添加10％蔗糖(w/v)，直到使用為止。
如本文所述，還可以為貯存目的在有或沒(méi)有冷凍保護(hù)劑，諸如蔗糖、海藻糖或乳糖存在下冷凍干燥所述的復(fù)合物，而不會(huì)降低活性和顆粒完整性。
可以按照任何次序合并所述成分。如果要加入另外的成分，那么可以在任何階段加入它們，但優(yōu)選與siRNA一起加入。
盡管非病毒遞送載體可以特別充分適合于藥物應(yīng)用，但是它們并不限于該應(yīng)用，并且可以將它們?cè)O(shè)計(jì)成用于如本文所述的食品應(yīng)用、農(nóng)業(yè)應(yīng)用、成像應(yīng)用等等。
附加物除siRNA外，脂質(zhì)體還可以在其中包含一種或多種附加物。
此外，并且如本文所述，脂質(zhì)體可以以可逆或不可逆方式與一種或多種附加物-諸如一種以上靶向部分偶聯(lián)。
附加物可以為有機(jī)化合物或其它化學(xué)品。附加物可以為可獲自任何合適的來(lái)源或由任何合適的來(lái)源產(chǎn)生的化合物，無(wú)論該來(lái)源是天然的還是人工的。附加物可以為氨基酸分子、多肽或其化學(xué)衍生物或其組合。附加物甚至可以為多核苷酸分子-其可以為有義或反義分子或抗體，例如多克隆抗體、單克隆抗體或單克隆人源化抗體。
附加物甚至可以為已知的藥物或化合物或其類(lèi)似物。
附加物可以被設(shè)計(jì)或獲自化合物庫(kù)，所述的化合物可以包括肽類(lèi)以及其它化合物，諸如小有機(jī)分子。
作為實(shí)例，附加物可以為天然物質(zhì)；生物大分子或由生物材料，諸如細(xì)菌、真菌或動(dòng)物(特別是哺乳動(dòng)物)細(xì)胞或組織制備的提取物；有機(jī)或無(wú)機(jī)分子；合成物質(zhì)；半合成物質(zhì)；結(jié)構(gòu)或功能模擬物；肽；肽模擬物；由完整蛋白質(zhì)切割的肽；或通過(guò)合成方式(作為實(shí)例，諸如使用肽合成儀或通過(guò)重組技術(shù)或其組合)合成的肽；重組物；抗體；天然或非天然物質(zhì)；融合蛋白或其等價(jià)物及其突變體、衍生物或組合。
附加物可以為有機(jī)化合物。就某些情況而言，有機(jī)化合物將包含兩個(gè)或多個(gè)烴基。
附加物可以含有鹵素基團(tuán)-諸如氟、氯、溴或碘基團(tuán)。
附加物可以含有烷基、烷氧基、鏈烯基、亞烷基和亞烯基中的一種或多種-這些基團(tuán)可以為非支鏈的或支鏈的。
附加物可以作為立體異構(gòu)體和/或幾何異構(gòu)體存在-例如附加物可以帶有一個(gè)或多個(gè)不對(duì)稱(chēng)和/或幾何中心，并且因此可以以?xún)煞N或多種立體異構(gòu)和/或幾何形式存在。本發(fā)明關(guān)注所有那些附加物各自的立體異構(gòu)體和幾何異構(gòu)體及其混合物的應(yīng)用。
附加物可以為需要應(yīng)用于脂質(zhì)體、在其中給予或在其中使用的任何化學(xué)品或物質(zhì)，并且可以包括，但不限于殺蟲(chóng)劑；除草劑；美容劑和香料；食品增補(bǔ)劑，包括維生素和礦物；矯味劑和其它食品添加劑；成像劑；染料；熒光標(biāo)記；放射性標(biāo)記；質(zhì)粒；載體；病毒顆粒；毒素；催化劑等。
附加物可以包括一種或多種生物活性劑并且包括在對(duì)動(dòng)物，優(yōu)選哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選人給予時(shí)作為有益或治療化合物起作用以便預(yù)防、緩解或治療疾病的任何分子。這種情況可以包括防止疾病在易患該疾病，但尚未診斷為患有該疾病的個(gè)體中發(fā)生；抑制疾病，即阻止其發(fā)展；或緩解疾病，即使多種疾病消退。
附加物的實(shí)例包括，但不限于抗炎藥；抗癌和抗腫瘤藥；抗微生物和抗病毒藥，包括抗生素；抗寄生物藥；血管舒張藥；支氣管擴(kuò)張藥、抗過(guò)敏藥和止喘藥；肽類(lèi)、蛋白質(zhì)、糖蛋白和脂蛋白；碳水化合物；受體；生長(zhǎng)因子；激素和類(lèi)固醇；神經(jīng)遞質(zhì)；止痛藥和麻醉藥；安眠藥；催化劑和酶；疫苗；遺傳物質(zhì)-諸如DNA。
附加物可以選自PEG、糖、碳水化合物和配體組成的組。
糖可以選自葡萄糖、甘露糖、乳糖、果糖、麥芽三糖和麥芽庚糖組成的組(如附圖7中所示)。
化學(xué)合成方法可以通過(guò)化學(xué)合成技術(shù)制備附加物和/或siRNA。
對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言顯而易見(jiàn)的是在合成過(guò)程中需要保護(hù)敏感性官能團(tuán)和使其脫保護(hù)。例如，這可以通過(guò)常規(guī)技術(shù)，如T W Greene和P G M Wuts，John Wiley和Sons Inc.(1991)在″Protective Groupsin Organic Synthesis″和P.J.Kocienski在″Protecting Groups″，Georg Thieme Verlag(1994)中所述來(lái)實(shí)現(xiàn)。
在某些反應(yīng)過(guò)程中，可能的情況是，例如，如果在與具有包含堿敏感性基團(tuán)的旋光中心的底物反應(yīng)中使用堿，那么在某些條件下，可以使存在的任何立體中心外消旋化。例如，在鳥(niǎo)苷酸化步驟過(guò)程中，這是可能的。避免潛在的問(wèn)題應(yīng)該是可能的，諸如通過(guò)選擇反應(yīng)順序、條件、試劑、保護(hù)/脫保護(hù)方案等可實(shí)現(xiàn)這一目的，正如本領(lǐng)域眾所周知的。
可以通過(guò)常規(guī)方法分離和純化附加物和/或siRNA。
可以通過(guò)常規(guī)技術(shù)，例如通過(guò)對(duì)式(I)化合物或其合適的鹽或衍生物的立體異構(gòu)體混合物進(jìn)行分級(jí)結(jié)晶、色譜或H.P.L.C.分離非對(duì)映體。還可以由相應(yīng)的光學(xué)純的中間體或通過(guò)拆分，諸如通過(guò)使用合適的手性支持體對(duì)相應(yīng)的外消旋物進(jìn)行H.P.L.C.或通過(guò)對(duì)相應(yīng)的外消旋物與合適的旋光活性酸或堿反應(yīng)形成的非對(duì)映體鹽進(jìn)行分級(jí)結(jié)晶制備式(I)化合物的單獨(dú)的對(duì)映體。
可以使用完整或部分合成附加物和/或siRNA的化學(xué)方法生產(chǎn)附加物和/或siRNA。例如，如果附加物包含肽，那么可以通過(guò)固相技術(shù)合成該肽，使其從樹(shù)脂上裂解并且通過(guò)制備型高效液相色譜法純化(例如 Creighton(1983)Proteins Structures and MolecularPrinciples，WH Freeman and Co，New York NY)?？梢酝ㄟ^(guò)氨基酸分析或測(cè)序(例如埃德曼降解法；Creighton，文獻(xiàn)同上)證實(shí)合成肽類(lèi)的組成。
可以使用各種固相技術(shù)(Roberge JY等(1995)Science 269202-204)進(jìn)行肽抑制劑的合成，并且，例如，可以使用ABI 43 1 A肽合成儀(Per kin Elmer)，按照制造商提供的使用說(shuō)明進(jìn)行自動(dòng)化合成。另外，可以在直接合成過(guò)程中改變構(gòu)成該附加物的氨基酸序列和/或使用化學(xué)方法將其與來(lái)自其它亞單位的序列或其任何部分結(jié)合以便產(chǎn)生變體附加物。
本文所用的術(shù)語(yǔ)″衍生物″或″衍生的″包括對(duì)附加物的化學(xué)修飾。對(duì)這類(lèi)化學(xué)修飾的解釋可以為用鹵素基團(tuán)、烷基、?；虬被娲鷼?。
附加物可以為修飾的附加物-諸如，但不限于化學(xué)修飾的附加物。
附加物的化學(xué)修飾可以增強(qiáng)或減弱氫鍵相互作用、電荷相互作用、疏水性相互作用、范德瓦耳斯相互作用或偶極相互作用。
靶向非病毒遞送載體本發(fā)明在另一個(gè)方面中涉及非病毒遞送載體的靶向遞送。
可以通過(guò)將一種或多種附加物(例如靶向部分)-諸如肽類(lèi)和/或其它配體-加入到脂質(zhì)體中，優(yōu)選脂質(zhì)體的表面上實(shí)現(xiàn)非病毒遞送載體的靶向遞送。有利的是，使附加物通過(guò)該附加物與暴露在脂質(zhì)體表面上的脂質(zhì)體中的一種或多種脂質(zhì)之間的相互作用與脂質(zhì)體表面偶聯(lián)。
有利的是，能夠?qū)iRNA遞送至可以結(jié)合附加物-諸如靶向部分的特定的細(xì)胞、器官和組織。一般而言，在細(xì)胞、器官和組織之間的結(jié)合將通過(guò)細(xì)胞、器官和/或組織與附加物之間的特異性結(jié)合實(shí)現(xiàn)。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，細(xì)胞、器官和組織可以為肝臟的細(xì)胞、器官或組織或來(lái)源于肝。本文所用的術(shù)語(yǔ)″肝細(xì)胞″意指位于肝臟中的細(xì)胞。肝臟細(xì)胞可以包括，但不限于癌性肝細(xì)胞、肝細(xì)胞、枯否細(xì)胞、伊藤細(xì)胞、襯在肝竇狀隙內(nèi)的內(nèi)皮細(xì)胞、襯在肝血管內(nèi)的血管內(nèi)皮細(xì)胞和偶然居留在肝臟中的任何來(lái)源的任何細(xì)胞(例如異位來(lái)源的轉(zhuǎn)移性癌細(xì)胞)。
優(yōu)選肝臟細(xì)胞為肝細(xì)胞(例如HepG2細(xì)胞)。
有利的是，本文所述的非病毒遞送載體表現(xiàn)出在這類(lèi)細(xì)胞、器官和組織中大量蓄積。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，細(xì)胞、器官和組織可以為脾、肺和/或淋巴結(jié)的細(xì)胞、器官和組織或來(lái)源于脾、肺和/或淋巴結(jié)。
本文所用的術(shù)語(yǔ)″特異性結(jié)合″意指一種或多種細(xì)胞、器官和/或組織與附加物之間的相互作用。這種相互作用一般依賴(lài)于存在的細(xì)胞、器官和/或組織的特定結(jié)構(gòu)特征-諸如抗原決定簇或表位-其由所述附加物識(shí)別，由此使得相互作用(例如結(jié)合)發(fā)生。
優(yōu)選附加物選自糖、碳水化合物和/或配體組成的組。
優(yōu)選糖選自葡萄糖、甘露糖、乳糖、果糖、麥芽三糖、麥芽庚糖組成的組。
附加物甚至可以為配體。
可以使用許多不同的配體，這取決于脂質(zhì)體遞送所靶向的部位。
配體可以被設(shè)計(jì)或獲自化合物庫(kù)，所述的化合物可以包括肽類(lèi)以及其它化合物，諸如小有機(jī)分子。
作為實(shí)例，配體可以為天然物質(zhì)；生物大分子或由生物材料，諸如細(xì)菌、真菌或動(dòng)物(特別是哺乳動(dòng)物)細(xì)胞或組織制備的提取物；有機(jī)或無(wú)機(jī)分子；合成配體；半合成配體；結(jié)構(gòu)或功能模擬物；肽；肽模擬物；衍生的配體；由完整蛋白質(zhì)切割的肽；或通過(guò)合成方式(作為實(shí)例，諸如使用肽合成儀或通過(guò)重組技術(shù)或其組合)合成的肽；重組配體；抗體；天然或非天然配體；融合蛋白或其等價(jià)物及其突變體、衍生物或組合。
優(yōu)選配體為抗體。
本文所用的術(shù)語(yǔ)″抗體″意指完整的抗體、雙特異性抗體或抗體片段，并且包括Fv、ScFv、Fab′和F(ab′)2；單克隆和多克隆抗體；改造的抗體，包括嵌合、CDR-嫁接和人源化抗體；和使用噬菌體展示或選擇性技術(shù)生產(chǎn)的人工選擇的抗體。
嵌合抗體意指部分小鼠抗體與部分人抗體的遺傳改造的融合體。一般而言，嵌合抗體含有約33％的小鼠蛋白和67％的人蛋白。
可以通過(guò)用人蛋白替代小鼠抗體的恒定區(qū)，而且通過(guò)用人蛋白替代抗體可變區(qū)的部分獲得人源化抗體。一般而言，人源化抗體為5-10％的小鼠蛋白和90-95％的人蛋白。
獲得人源化抗體的更尖端的方法不僅包括提供源自人的恒定區(qū)，而且也包括改變可變區(qū)。這使得抗體以盡可能接近人的形式重新成形。例如，這種方法已經(jīng)在下列文獻(xiàn)中報(bào)導(dǎo)Cancer Res(1993)53851-856；Nature(1988)332323-327；Science(1988)2391534-1536；Proc Natl Acad Sci USA(1991)884181-4185；和J Immunol(1992)1481149-1154。
使用標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)制備抗體。抗體可以獲自動(dòng)物血清，或就單克隆抗體或其片段而言，在細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生。重組DNA技術(shù)可以用于按照規(guī)定程序在細(xì)菌或優(yōu)選在哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生抗體。選擇的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)優(yōu)選分泌抗體產(chǎn)物。
例如，上述和其它技術(shù)描述在下列文獻(xiàn)中Kohler和Milstein，(1975)Nature 256495-497；US 4,376,110；Harlow和Lane，Antibodiesa Laboratory Manual，(1988)Cold Spring Harbor。用于制備重組抗體分子的技術(shù)描述在上述參考文獻(xiàn)中，并且例如，也描述在EP 0623679、EP 0368684和EP 0436597中。
可以使用噬菌體展示技術(shù)選擇和產(chǎn)生抗體。用于構(gòu)建噬菌體抗體展示文庫(kù)和λ-噬菌體表達(dá)文庫(kù)的方法在本領(lǐng)域中眾所周知(例如Kang等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，884363；和Clackson等(1991)Nature，352624)。
有利的是，當(dāng)配體為抗體時(shí)，lipoplex偶聯(lián)的抗體顯示出基本上其所有的活性。
優(yōu)選配體為受體-諸如為或來(lái)源于RGD肽的受體(整聯(lián)蛋白受體)、葉酸受體和/或轉(zhuǎn)鐵蛋白受體。
藥用鹽可以以藥學(xué)上可接受的鹽的形式給予非病毒遞送載體。
藥學(xué)上可接受的鹽為本領(lǐng)域眾所周知的，并且例如，包括Berge等在J.Pharm.Sci.，66，1-19(1977)中提及的那些鹽。合適的酸加成鹽由形成無(wú)毒性鹽的酸形成，并且包括鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、硝酸鹽、硫酸鹽、硫酸氫鹽、磷酸鹽、磷酸氫鹽、乙酸鹽、三氟乙酸鹽、葡糖酸鹽、乳酸鹽、水楊酸鹽、檸檬酸鹽、酒石酸鹽、抗壞血酸鹽、琥珀酸鹽、馬來(lái)酸鹽、富馬酸鹽、葡糖酸鹽、甲酸鹽、苯甲酸鹽、甲磺酸鹽、乙磺酸鹽、苯磺酸鹽和對(duì)甲苯磺酸鹽。
當(dāng)存在一個(gè)或多個(gè)酸性部分時(shí)，合適的藥學(xué)上可接受的堿加成鹽可以由形成無(wú)毒性鹽的堿形成，并且包括鋁、鈣、鋰、鎂、鉀、鈉、鋅和藥學(xué)活性胺類(lèi)，諸如二乙醇胺的鹽。
藥學(xué)活性鹽可以將非病毒遞送載體作為藥學(xué)上可接受的鹽給予。一般而言，如果合適，易于通過(guò)使用所需的酸或堿制備藥學(xué)上可接受的鹽。鹽可以從溶液中析出并且可以通過(guò)過(guò)濾收集或可以通過(guò)蒸發(fā)溶劑回收。
藥物組合物本發(fā)明的藥物組合物可以包含治療有效量的非病毒遞送載體。
就人或動(dòng)物應(yīng)用而言，藥物組合物可以為人用和獸用藥，并且一般包含藥學(xué)上可接受的稀釋劑、載體或賦形劑中的任一種或多種。用于治療應(yīng)用的可接受的載體或稀釋劑為本領(lǐng)域眾所周知的，并且例如，描述在emington′s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.(A.R.Gennaro edit.1985)中?？梢愿鶕?jù)預(yù)期的給藥途徑和標(biāo)準(zhǔn)制藥實(shí)踐選擇藥用載體、賦形劑或稀釋劑。藥物組合物可以包含任何合適的粘合劑、潤(rùn)滑劑、懸浮劑、包衣劑、增溶劑作為載體、賦形劑或稀釋劑，或除載體、賦形劑或稀釋劑外，還可以包含任何合適的粘合劑、潤(rùn)滑劑、懸浮劑、包衣劑、增溶劑。
在藥物組合物中可以配有防腐劑、穩(wěn)定劑、染料乃至矯味劑。防腐劑的實(shí)例包括苯甲酸鈉、山梨酸和對(duì)羥基苯甲酸酯類(lèi)。還可以使用抗氧化劑和懸浮劑。
根據(jù)不同的遞送系統(tǒng)，可以存在不同的組成/配制要求。作為實(shí)例，可以將本發(fā)明的藥物組合物配制成可使用微型泵或通過(guò)以下途徑給藥的形式粘膜途徑，例如吸入的鼻腔噴霧劑或氣霧劑或可攝入的溶液或非腸道途徑，其中將組合物配制成用于例如經(jīng)靜脈內(nèi)、肌內(nèi)或皮下途徑遞送的可注射劑型。或者，可以將制劑設(shè)計(jì)成可通過(guò)許多途徑給藥的形式。
如果想要通過(guò)胃腸道粘膜經(jīng)粘膜給予所述的制劑，那么它應(yīng)能夠在經(jīng)過(guò)胃腸道的過(guò)程中保持穩(wěn)定；例如，它應(yīng)耐蛋白水解性降解，在酸性pH下保持穩(wěn)定并且耐膽汁的洗滌作用。
如果合適，可以通過(guò)吸入，以栓劑或陰道栓的形式，通過(guò)局部，以洗劑、溶液、霜?jiǎng)?、軟膏劑或撒粉的形式，通過(guò)使用皮膚貼劑，通過(guò)口服，以含有賦形劑，諸如淀粉或乳糖的片劑形式或以單獨(dú)或與賦形劑的混合物的膠囊或小囊的形式或以含有矯味劑或著色劑的酏劑、溶液或混懸液形式給予藥物組合物，或可以可以將藥物組合物經(jīng)非腸道途徑，例如通過(guò)靜脈內(nèi)、肌內(nèi)或皮下注射。就非腸道給藥而言，最好以無(wú)菌水溶液形式使用組合物，該水溶液可以含有其它物質(zhì)，例如足夠的鹽或單糖類(lèi)以便使該溶液與血液等滲。就口含或舌下給藥而言，可以以可按照常規(guī)方式配制的片劑或錠劑的形式給予組合物。
可以將非病毒遞送載體與環(huán)糊精聯(lián)用。已知環(huán)糊精可與藥物分子形成包合復(fù)合物和非包合復(fù)合物。藥物-環(huán)糊精復(fù)合物的形成可以改變藥物分子的溶解度、溶解速率、生物利用度和/或穩(wěn)定性。藥物-環(huán)糊精復(fù)合物一般用于大部分劑型和給藥途徑。作為直接與藥物復(fù)合的備選方案，可以將環(huán)糊精用作輔助添加劑，例如作為載體、稀釋劑或增溶劑。最常用的是α-、β-和γ-環(huán)糊精并且合適的實(shí)例描述在WO-A-91/11172、WO-A-94/02518和WO-A-98/55148中。
還可以將包含非病毒遞送載體的藥物組合物與用于所關(guān)注疾病的常規(guī)治療方法聯(lián)用。
給藥可以單獨(dú)給予非病毒遞送載體，但一般將其作為藥物組合物給藥-例如，此時(shí)將所述的載體與根據(jù)預(yù)期的給藥途徑和標(biāo)準(zhǔn)制藥實(shí)踐選擇的合適的藥物賦形劑、稀釋劑或載體混合。
例如，可以將非病毒遞送載體以片劑、膠囊、小囊、酏劑、溶液或混懸液的形式給藥，這些劑型可以含有矯味劑或著色劑，它們可以用于即刻-、延緩-、修正-、持續(xù)-、脈沖-或受控-釋放應(yīng)用。
如果藥物為片劑，那么該片劑可以含有賦形劑，諸如微晶纖維素、乳糖、檸檬酸鈉、碳酸鈣、磷酸氫鈣和甘氨酸；崩解劑，諸如淀粉(優(yōu)選玉米淀粉、馬鈴薯淀粉或木薯淀粉)、羥基乙酸淀粉鈉、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉和某些復(fù)合硅酸鹽；和成粒粘合劑，諸如聚乙烯吡咯烷酮、羥丙基甲基纖維素(HPMC)、羥丙基纖維素(HPC)、蔗糖、明膠和阿拉伯樹(shù)膠。另外，可以包括潤(rùn)滑劑-諸如硬脂酸鎂、硬脂酸、二十二烷酸甘油酯和滑石粉。
還可以將相似類(lèi)型的固體組合物用作膠囊填充物。在這方面優(yōu)選的賦形劑包括乳糖、淀粉、纖維素、乳糖或高分子量聚乙二醇類(lèi)。就水性混懸液和/或酏劑而言，可以將所述的制劑與各種增甜劑或矯味劑、著色物質(zhì)或染料、與乳化劑和/或懸浮劑和與稀釋劑，諸如水、乙醇、丙二醇和甘油及其組合合并。
給藥(遞送)途徑可以包括，但不限于口服(例如作為片劑、膠囊或可攝入的溶液)、局部、粘膜(例如作為用于吸入的鼻腔噴霧劑或氣霧劑)、鼻部、非腸道(例如通過(guò)可注射形式)、胃腸道、脊柱內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、子宮內(nèi)、眼內(nèi)、皮內(nèi)、顱內(nèi)、氣管內(nèi)、陰道內(nèi)、腦室內(nèi)、大腦內(nèi)、皮下、眼部(包括玻璃體內(nèi)或房?jī)?nèi)intracameral)、透皮、直腸、口含、陰道、硬膜外、舌下中的一種或多種。
劑量水平一般而言，臨床醫(yī)師會(huì)確定最適合于個(gè)體患者的實(shí)際劑量。
用于特定患者的具體劑量水平和劑量頻率可以改變并且取決于多種因素，包括所用具體化合物的活性、該化合物的代謝穩(wěn)定性和作用期限、年齡、體重、一般健康情況、性別、飲食、給藥方式和時(shí)間、排泄率、聯(lián)合用藥、特定疾病的嚴(yán)重程度和個(gè)體經(jīng)歷的療法。
制劑諸如通過(guò)使用本領(lǐng)域公知的技術(shù)經(jīng)與一種或多種合適的載體、稀釋劑或賦形劑混合，可以將非病毒遞送載體配制成藥物組合物。
疾病本發(fā)明的方面可以用于治療和/或預(yù)防疾病，諸如在WO-A-98/09985中所列的那些疾病。
為便于參照，提供該名單中的一部分巨噬細(xì)胞抑制和/或T細(xì)胞抑制活性和由此的抗炎活性；抗免疫活性，即對(duì)細(xì)胞和/或體液免疫應(yīng)答，包括與炎癥無(wú)關(guān)的應(yīng)答的抑制作用；與病毒和/或其它胞內(nèi)病原體相關(guān)的疾??；抑制巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞粘附胞外基質(zhì)成分和纖連蛋白的能力以及增量調(diào)節(jié)的T細(xì)胞中的fas受體表達(dá)；抑制不需要的免疫反應(yīng)和炎癥，包括關(guān)節(jié)炎，包括類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，與過(guò)敏性相關(guān)的炎癥、變態(tài)反應(yīng)、哮喘、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、膠原疾病和其它自身免疫性疾病，與動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)的炎癥、動(dòng)脈粥樣硬化、動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病、再灌注損傷、心動(dòng)停止、心肌梗死、血管炎癥疾病、呼吸窘迫綜合征或其它心肺疾病，與消化性潰瘍相關(guān)的炎癥、潰瘍性結(jié)腸炎和其它胃腸道疾病，肝纖維化、肝硬化或其它肝病，甲狀腺炎或其它腺病，腎小球性腎炎或其它腎和泌尿系疾病，耳炎或其它耳-鼻-喉科疾病，皮炎或其它皮膚病，牙周病或其它牙病，睪丸炎或附睪-睪丸炎、不孕癥、睪丸創(chuàng)傷或其它與免疫相關(guān)的睪丸疾病，胎盤(pán)機(jī)能障礙、胎盤(pán)機(jī)能不全、習(xí)慣性流產(chǎn)、子癇、先兆子癇和其它與免疫和/或炎癥相關(guān)的婦科疾病，后色素層炎、中間葡萄膜炎、前色素層炎、結(jié)膜炎、脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜炎、葡萄膜視網(wǎng)膜炎、視神經(jīng)炎、眼內(nèi)炎癥、例如視網(wǎng)膜炎或囊狀黃斑水腫、交感性眼炎、鞏膜炎、色素性視網(wǎng)膜炎、degenerativefondus disease中的免疫和炎癥成分、眼外傷中的炎癥成分、因感染導(dǎo)致的眼部炎癥、增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變、急性缺血性視神經(jīng)病、過(guò)度瘢痕形成、例如青光眼過(guò)濾手術(shù)后的瘢痕形成、對(duì)眼植入物的免疫和/或炎癥反應(yīng)和與其它免疫和炎癥相關(guān)的眼科疾病，與自身免疫性疾病或疾患或病癥相關(guān)的炎癥，其中在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)或任何其它器官中，免疫和/或炎癥抑制可能是有益的，帕金森病、因治療帕金森病導(dǎo)致的并發(fā)癥和/或副作用、艾滋病相關(guān)性癡呆、復(fù)雜的HIV-相關(guān)性腦病、德維克病、西德納姆舞蹈、阿爾茨海默病和其它CNS變性性疾病、疾患或病癥，中風(fēng)的炎癥成分、小兒麻痹癥后綜合癥、兒科病癥中的免疫和炎癥成分、脊髓炎、腦炎、亞急性硬化性全腦炎、腦脊髓炎，急性神經(jīng)病、亞急性神經(jīng)病、慢性神經(jīng)病、格-巴綜合征(Guillaim-Barre syndrome)、西德納姆舞蹈(Sydenham chora)、重癥肌無(wú)力、大腦假腫瘤(pseudo-tumour cerebri)、唐氏綜合征、亨延頓舞蹈病、肌萎縮性側(cè)索硬化，CNS壓迫或CNS創(chuàng)傷或CNS感染中的炎癥成分，肌萎縮和營(yíng)養(yǎng)不良中的炎癥成分，和中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥相關(guān)疾病、疾患或病癥，創(chuàng)傷后炎癥，膿毒性休克，感染性疾病，手術(shù)的炎癥并發(fā)癥或副作用、骨髓移植或其它移植并發(fā)癥和/或副作用，基因療法的炎癥和/或免疫并發(fā)癥和副作用，例如因感染病毒載體導(dǎo)致或與AIDS相關(guān)的炎癥，通過(guò)減少單核細(xì)胞或淋巴細(xì)胞的量阻止或抑制體液和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答，治療或改善單核細(xì)胞或淋巴細(xì)胞增殖性疾病，例如白血病，就天然或人造細(xì)胞、組織和器官，諸如角膜、骨髓、器官、晶狀體、起搏器、天然或人造皮膚組織的移植而言，用于預(yù)防和/或治療移植排斥。具體的癌癥相關(guān)病癥包括，但不限于實(shí)體瘤；血液攜帶的腫瘤，諸如白血??；腫瘤轉(zhuǎn)移；良性腫瘤，例如血管瘤、聽(tīng)神經(jīng)瘤、神經(jīng)纖維瘤、沙眼和膿性肉芽腫；類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；銀屑?。谎鄄垦苌杉膊?，例如糖尿病性視網(wǎng)膜病、早產(chǎn)性視網(wǎng)膜病、黃斑變性、角膜移植排斥、新生血管性青光眼、晶狀體后纖維組織增生癥、潮紅；Osier-Webber綜合征；心肌血管發(fā)生；斑塊新生血管形成；毛細(xì)血管擴(kuò)張；血友病關(guān)節(jié)；血管纖維瘤；傷口肉芽發(fā)生；冠狀側(cè)支(corornay collaterals)；大腦側(cè)支(cerebralcollaterals)；動(dòng)靜脈畸形；缺血性肢體血管發(fā)生；新生血管性青光眼；晶狀體后纖維組織增生癥；糖尿病性新生血管形成；與螺桿菌相關(guān)的疾病、骨折、血管發(fā)生、血細(xì)胞生成、排卵、月經(jīng)和胎盤(pán)形成。
本發(fā)明的方面可以用于治療和/或預(yù)防糖尿病-諸如I型和II型糖尿病。
本發(fā)明的方面還可以用于治療和/或預(yù)防癌癥-諸如急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)、急性髓細(xì)胞白血病(AML)、腎上腺皮質(zhì)癌、肛門(mén)癌、膀胱癌、血癌、骨癌、腦腫瘤、乳腺癌、女性生殖系統(tǒng)癌癥、男性生殖系統(tǒng)癌癥、中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤、子宮頸癌、兒童期橫紋肌肉瘤、兒童期肉瘤、慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)、慢性髓細(xì)胞白血病(CML)、結(jié)腸直腸癌、結(jié)腸癌、子宮內(nèi)膜癌、子宮內(nèi)膜肉瘤、食管癌、眼癌、膽囊癌、胃癌、胃腸道癌、毛細(xì)胞性白血病、頭頸癌、肝細(xì)胞癌、何杰金病、咽下部癌、卡波西肉瘤、腎癌、喉癌、白血病、白血病、肝癌、肺癌、惡性纖維組織細(xì)胞瘤、惡性胸腺瘤、黑素瘤、間皮瘤、多發(fā)性骨髓瘤、骨髓瘤、鼻腔和鼻竇癌、鼻咽癌、神經(jīng)系統(tǒng)癌癥、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、非何杰金淋巴瘤、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、甲狀旁腺癌、陰莖癌、咽癌、垂體瘤、漿細(xì)胞瘤、原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤、前列腺癌、直腸癌、呼吸系統(tǒng)癌癥、視網(wǎng)膜成神經(jīng)細(xì)胞瘤、唾液腺癌、皮膚癌、小腸癌、軟組織肉瘤、胃癌、胃癌、睪丸癌、甲狀腺癌、泌尿系統(tǒng)癌癥、子宮肉瘤、陰道癌、血管系統(tǒng)癌癥、特發(fā)性巨球蛋白血和維爾姆斯腫瘤。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的疾病為屬于肝病和/或肝損傷或與之相關(guān)的疾病、病癥或疾患。
肝損傷可能與接觸酒精、肝毒性藥物及其組合相關(guān)。例如，損害劑可以包括抗驚厥藥、苯妥英、卡馬西平和苯巴比妥、興奮性藥物-諸如搖頭丸(3，4-亞甲二氧基去氧麻黃堿)、抗結(jié)核藥和化療劑-諸如異煙肼和利福平。
肝損傷還可能與病原體-諸如細(xì)菌、寄生蟲(chóng)、真菌和病毒感染有關(guān)。例如，肝損傷可能起因于曲霉屬(Aspergillus)真菌感染、血吸蟲(chóng)屬(Schistosoma)寄生蟲(chóng)感染和各種病毒感染，諸如腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺伴隨病毒(AAV)、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、單純皰疹病毒(HSV)、EB病毒(EBV)和副粘病毒感染。
肝病可以包括，但不限于急性肝炎、暴發(fā)性肝炎、慢性肝炎、肝硬化、脂肪肝、酒精性肝病、藥物誘發(fā)的肝病(藥癮性肝炎)、充血性肝炎、自身免疫性肝炎、原發(fā)性膽汁性肝硬變、肝卟啉病、膽管周?chē)住⒂不阅懝苎?、肝纖維化和慢性活動(dòng)性肝炎。
應(yīng)用本文所述的非病毒遞送載體可以用于以siRNA有效轉(zhuǎn)染細(xì)胞-諸如真核細(xì)胞，特別是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
本文所述的非病毒遞送載體可以用于有效橫切肝臟。
非病毒遞送載體可以用于各種siRNA遞送應(yīng)用-諸如基因療法、DNA疫苗遞送和體外轉(zhuǎn)染研究。
非病毒遞送載體可以用于肝臟的各種siRNA遞送應(yīng)用-諸如基因療法、DNA疫苗遞送和體外轉(zhuǎn)染研究。
非病毒遞送載體還可以用于對(duì)患有疾病的患者給予治療基因。
變體/同源物/衍生物本發(fā)明還包括同源物和片段的應(yīng)用。
本文的術(shù)語(yǔ)″同源物″意指與本文所述的核苷酸序列具有一定程度的同源性的實(shí)體。本文的術(shù)語(yǔ)″同源性″可以等同于″同一性″。
在本發(fā)明的上下文中，同源序列被認(rèn)為包括可以與主題序列至少75，85或90％相同，優(yōu)選至少95或98％相同的核苷酸序列。一般而言，同源物將包含與主題序列相同的編碼活性部位等的序列。盡管還可以根據(jù)相似性(即具有相似化學(xué)特性/功能的氨基酸殘基)考慮同源性，但是在本發(fā)明的上下文中優(yōu)選根據(jù)序列同一性表示同源性。
用肉眼，或更通常的是借助于易于得到的序列比較程序進(jìn)行同源性比較。這些商購(gòu)的計(jì)算機(jī)程序可以計(jì)算兩種或多種序列之間的同源性％。
可以計(jì)算相鄰序列內(nèi)的同源性％，即將一種序列與另一種序列進(jìn)行序列對(duì)比，并且將一種序列中的氨基酸各自直接與另一種序列中的相應(yīng)氨基酸進(jìn)行比較，即每次比較一個(gè)殘基。這稱(chēng)作″未出現(xiàn)空缺的″序列比對(duì)。一般而言，僅在相對(duì)短的殘基數(shù)內(nèi)進(jìn)行這類(lèi)未出現(xiàn)空缺的序列比對(duì)。
盡管這是一種極為簡(jiǎn)單和一致性的方法，但是它未能考慮到，例如，在序列的其它相同對(duì)中，一個(gè)插入或缺失會(huì)導(dǎo)致隨后的氨基酸殘基被從序列比對(duì)中逐出，由此可能在進(jìn)行總體序列比對(duì)時(shí)同源性％顯著下降。因此，設(shè)計(jì)大部分序列比較方法以便產(chǎn)生考慮到可能的插入和缺失的最佳序列比對(duì)，而不會(huì)置總體同源性得分于過(guò)度不利地位。通過(guò)在序列比對(duì)中插入″缺口″以試圖使局部同源性最大化而實(shí)現(xiàn)這一目的。
然而，這些更為復(fù)雜的方法給出現(xiàn)在序列比對(duì)中的每個(gè)空缺指定″空缺罰分″，以便對(duì)相同數(shù)目的相同氨基酸而言，具有盡可能少空缺的序列比對(duì)-反映出在兩種比較的序列之間較高的關(guān)聯(lián)性-會(huì)獲得高于具有許多空缺的序列比對(duì)的評(píng)分。一般使用″仿射空缺值″，它們對(duì)一個(gè)空位的存在記一個(gè)相對(duì)高的值，而對(duì)該空缺中各隨后的殘基記一個(gè)較小的罰分。這就是最常用的空缺評(píng)分系統(tǒng)。高空缺罰分當(dāng)然會(huì)產(chǎn)生具有較少空缺的最優(yōu)化序列比對(duì)。大部分序列比對(duì)程序允許改變空缺罰分。然而，優(yōu)選在使用這類(lèi)序列比較軟件時(shí)使用缺省值。例如，當(dāng)使用GCG Wisconsin Bestfit包時(shí)，氨基酸序列的缺省的空缺罰分就空缺而言為-12而對(duì)各伸展而言為-4。
因此最大同源性％的計(jì)算首先需要產(chǎn)生最佳序列比對(duì)，從而要考慮空缺罰分。進(jìn)行這類(lèi)序列比對(duì)的合適的計(jì)算機(jī)程序?yàn)镚CG WisconsinBestfit包(University of Wisconsin，U.S.A.；Devereux等，1984，Nucleic Acids Research 12387)。其它不能進(jìn)行序列比較的軟件的實(shí)例包括，但不限于BLAST包(參見(jiàn)Ausubel等，1999，文獻(xiàn)同上-第18章)、FASTA(Atschul等，1990，J.MoI.Biol.，403-410)和比較工具的GENEWORKS組。BLAST和FASTA均可用于脫機(jī)和聯(lián)機(jī)檢索(參見(jiàn)Ausubel等，1999，文獻(xiàn)同上，第7-58至7-60頁(yè))。然而，就某些應(yīng)用而言，優(yōu)選使用GCG Bestfit程序。稱(chēng)作BLAST 2Sequences的工具也可用于比較蛋白質(zhì)和核苷酸序列(參見(jiàn)FEMS Microbiol Lett1999 174(2)247-50；FEMS Microbiol Lett1999 177(1)187-8)。
盡管可以根據(jù)同一性測(cè)定最終的同源性％，但序列比對(duì)法自身一般不基于全或無(wú)配對(duì)比較。而是一般使用按比例的相似性評(píng)分矩陣，它可以基于化學(xué)相似性或調(diào)優(yōu)間距的每一逐對(duì)比較指定評(píng)分。這類(lèi)常用的矩陣的實(shí)例為BLOSUM6 2矩陣-BLAST程序組的缺省矩陣。如果提供，那么GCG Wisconsin程序一般使用公開(kāi)的缺省值或自定義符號(hào)比較表(進(jìn)一步的詳細(xì)內(nèi)容參見(jiàn)用戶(hù)使用手冊(cè))。就某些應(yīng)用而言，優(yōu)選使用GCG包的公開(kāi)的缺省值，或就其它軟件而言，使用缺省矩陣，諸如BLOSUM62。
一旦軟件產(chǎn)生了最佳序列比對(duì)，就能夠計(jì)算同源性％，優(yōu)選序列同一性％。軟件一般執(zhí)行這一程序作為序列比較的組成部分并且生成數(shù)字結(jié)果。
用于本發(fā)明的核苷酸序列內(nèi)可以包括合成或修飾的核苷酸。對(duì)寡核苷酸的許多不同類(lèi)型的修飾為本領(lǐng)域中公知的。它們包括甲基膦酸和硫代磷酸主鏈和/或在分子的3′和/或5′末端上添加吖啶或聚賴(lài)氨酸鏈。就本發(fā)明的目的而言，應(yīng)理解可以通過(guò)本領(lǐng)域中可利用的任何方法修飾本文所述的核苷酸序列?？梢赃M(jìn)行這類(lèi)修飾以便提高用于本發(fā)明的核苷酸序列的體內(nèi)活性或壽命。
本發(fā)明還涉及與本文所述序列互補(bǔ)的核苷酸序列或其任何衍生物、片段或衍生物的應(yīng)用。
還包括序列的等位基因?！宓任换颉寤颉宓任换蛐蛄小鍨榫幋a蛋白質(zhì)的序列的可選擇形式。等位基因由突變，即核酸序列的改變產(chǎn)生，并且一般產(chǎn)生改變的mRNAs或多肽類(lèi)，其結(jié)構(gòu)或功能可以改變，也可以不改變。優(yōu)選功能不改變。任何指定的基因均可以不具有、具有一種或許多等位基因形式。產(chǎn)生等位基因的通常突變改變一般歸因于氨基酸的缺失、添加或置換。這些類(lèi)型的改變各自可以單獨(dú)或與其它改變組合在指定序列中發(fā)生一次或多次。
術(shù)語(yǔ)″等位基因″還包括遺傳多態(tài)現(xiàn)象-諸如SNPs(單核苷酸多態(tài)性)。
與核苷酸序列相關(guān)的術(shù)語(yǔ)″片段″包括來(lái)自或?qū)π蛄械囊环N(或多種)核苷酸序列的任何置換、變化、修飾、替代、缺失或添加，條件是所得蛋白質(zhì)具有生物活性，優(yōu)選與由全長(zhǎng)核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)具有至少相同的生物活性。該片段可以包含50，60，70，80，90，95，96，97，98或99％的全長(zhǎng)核苷酸序列。
在另一個(gè)方面中，還提供了將siRNA遞送至細(xì)胞或細(xì)胞環(huán)境的方法，包括給細(xì)胞、組織或器官(例如肝)環(huán)境提供本文所述的非病毒遞送載體或靶向遞送載體的步驟。
一般重組DNA方法技術(shù)除非另作陳述，否則本發(fā)明使用化學(xué)、分子生物學(xué)、微生物學(xué)、重組DNA和免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)，它們屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍。這類(lèi)技術(shù)在文獻(xiàn)中闡明。例如，參見(jiàn)J.Sambrook，E.F.Fritsch，和T.Maniatis，1989，Molecular CloningA Laboratory Manual，Second Edition，Books 1-3，Cold Spring Harbor Laboratory Press；Ausubel，F(xiàn).M.等(1995和期刊增刊；Current Protocols inMolecular Biology，第9，13，和16章，John Wiley & Sons，New York，N.Y.)；B.Roe，J.Crabtree，和A.Kahn，1996，DNA Isolation andSequencingEssential Techniques，John Wiley & Sons；M.J.Gait(編者)，1984，Oligonucleotide SynthesisA Practical Approach，IrI Press；和D.M.J.Lilley和J.E.Dahlberg，1992，Methodsof EnzymologyDNA Structure Part ASynthesis和PhysicalAnalysis of DNA Methods in Enzymology，Academic Press。
具體實(shí)施例方式
現(xiàn)在通過(guò)實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明，這些實(shí)施例旨在用于輔助本領(lǐng)域技術(shù)人員實(shí)施本發(fā)明，但不以任何方式來(lái)限定本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例材料和方法薄層色譜法在預(yù)涂布的背襯鋪板的Merck-Kieselgel 60 F254鋁上進(jìn)行薄層色譜法(TLC)并且使用紫外線(xiàn)、碘、酸性鉬酸銨(IV)、酸性乙醇香草醛或如果合適的其它試劑顯色。在Merck-Kieselgel 60(230-400目)上進(jìn)行快速柱色譜法。使用Brucker Esquire 3000、VG-7070B或JEOLSX-102儀記錄質(zhì)譜。在Advance Brucker 400 UltrashieldTM機(jī)器上，使用殘留同位素溶劑作為內(nèi)標(biāo)記錄1H和13C NMR共振(s＝單峰，d＝雙峰，t＝三重峰，q＝四重峰，quin＝五重峰，br＝寬單峰)。
siRNA在本研究中始終使用以評(píng)價(jià)lacZ基因產(chǎn)物減量調(diào)節(jié)的抗-β-galsiRNA-1(5′-CUA CAC AAA UCA GCG AUU UUU-3′)購(gòu)自Dharmacon(USA)并且作為如制造商標(biāo)明的20μM溶液儲(chǔ)存。非特異性siRNA序列(5′-UAG CGA CUA AAC ACA UCA AUU-3′)獲自Dharmacon(USA)，以如制造商標(biāo)明的20μM溶液儲(chǔ)存。3′-FITC標(biāo)記的抗-GFP siRNA序列(5′GGC UAC GUC CAG GAG CGC ACC-3′)獲自Qiagen GmbH(Hi lden，Germany)。序列可以來(lái)源于驗(yàn)證脫靶的減量調(diào)節(jié)的算法(KumikoUi-Tei等，Nucl Acids Res.2004，Vol 32，No.3，p.9 36-48)。來(lái)源于該算法的一種這樣的序列為靶向ATG起始密碼子的lacZ基因648-670上游的抗-β-Gal序列(5′-GCA UAA ACC GAC UAC ACA AAU-3′)。該序列不同于Dharmacon序列的方面在于缺乏例如人基因TIMM8A(線(xiàn)粒體內(nèi)膜8同源物A的易位酶)和NM_OO 1132.1(AFG 3 ATP酶家族基因3)等的潛在的脫靶減量調(diào)節(jié)。
脂質(zhì)體/lipoplex的制備通過(guò)下列步驟制備所有的CDAN/DOPE/氨氧基脂質(zhì)分別將適量的CDAN、DOPE和氨氧基脂質(zhì)(CPA)的儲(chǔ)備溶液吸移入用硝酸(HNO3，純；10分鐘)和二甲基甲硅烷基二氯(Sigma，UK；10分鐘)預(yù)處理的圓底燒瓶中，蒸發(fā)溶劑并且在劇烈渦旋下用水(milliQ，18Ω)水化干脂質(zhì)膜，以便產(chǎn)生pH≈3.5-4的3mg/mL總脂質(zhì)的多層脂質(zhì)體。通過(guò)在Sonomatic水浴(Longford Ultrasonics，UK)中將多層脂質(zhì)體聲處理30分鐘產(chǎn)生單層脂質(zhì)體。通過(guò)對(duì)脂質(zhì)體進(jìn)行廣泛聲處理，溶液變?yōu)橥耆该?，并且通過(guò)PCS不能再測(cè)定脂質(zhì)體尺寸，這是脂質(zhì)體尺寸小于30nm的指示。在劇烈渦旋下將siRNA在水中的溶液(0.28mg/mL)以0.1mg/mL的siRNA終濃度滴加到這些CDAN/DOPE/CPA脂質(zhì)體(3mg/mL)中。如通過(guò)PCS測(cè)定的，得到的siRNA lipoplex一般測(cè)量為30-50nm直徑。制備1mg/mL的聚乙二醇-α/γ-雙醛(Mw分別為2000或3400；NEKTAR，USA)的溶液并且在渦旋下將其適量加入到lipoplex中而得到含有不同量的PEG(0.1-5％，m/m總脂質(zhì))的共價(jià)表面聚乙二醇化的siRNA-lipoplex。在減壓下蒸發(fā)一半體積并且通過(guò)添加PBS補(bǔ)償，此后注入動(dòng)物。
細(xì)胞培養(yǎng)物在實(shí)驗(yàn)前24小時(shí)將HeLa或IGROV-1細(xì)胞以40000個(gè)細(xì)胞/孔接種在48-孔平板的生長(zhǎng)培養(yǎng)基(DMEM/10％FCS/青霉素/鏈霉素)中并且在37℃(10％CO2)下培養(yǎng)。在轉(zhuǎn)染前，用新鮮生長(zhǎng)培養(yǎng)基替代該培養(yǎng)基。OptiMEM-I/DMEM購(gòu)自Invitrogen(UK)。
體內(nèi)轉(zhuǎn)染A.流體動(dòng)力學(xué)模型。通過(guò)尾靜脈注射或通過(guò)注入腹膜腔內(nèi)給20-25g體重的Balb/C小鼠注射含siRNA的lipoplex(200μL，O.1mg/mL siRNA)并且分別維持8小時(shí)或24小時(shí)。在此相應(yīng)的靜息期后，在10秒內(nèi)給動(dòng)物注射在2.5mL PBS中的1μg pUMVC1(7528Bp，University of Michigan Vector Core，在CMV啟動(dòng)子控制下編碼lacZ基因；http://www.med.umich.edu/vcore/Plasmids/)并且保持24小時(shí)，此后解剖分離肝臟并且使用標(biāo)準(zhǔn)ELISA試驗(yàn)(ROCHE)測(cè)定β-半乳糖苷酶活性。正如通過(guò)BCA測(cè)定法(Pierce)測(cè)定的，將所得相對(duì)光單位通過(guò)除以總細(xì)胞蛋白含量標(biāo)準(zhǔn)化。
B.重組腺病毒(lacZ)模型。AdRSV β GaI購(gòu)自Transgene(Strasbourg，F(xiàn)rance)。它是大部分E3區(qū)缺失的5型腺病毒。通過(guò)將不同量的原液注入Balb/C小鼠滴定病毒，并且選擇獲得了約10′000RLU/mg蛋白的肝臟表達(dá)的滴度。一般而言，在PBS(200μL)中稀釋15μL病毒原液并且將其分別注入Balb/C小鼠的尾靜脈或腹膜腔內(nèi)。遵循兩種方案1.在注射siRNA-lipoplex前2小時(shí)注射AdRSVβGaI(附圖5A)和2.在注射AdRSV β GaI(腹膜內(nèi))前8小時(shí)尾靜脈注射200μL siRNA-lipoplex(0.1mg/mL siRNA)/動(dòng)物(附圖5B)。在病毒注射后24小時(shí)進(jìn)行所有的β-半乳糖苷酶ELISA試驗(yàn)。
轉(zhuǎn)染使用PRIMOfectTM(IC-Vec Ltd.，UK)，按照制造商的用法說(shuō)明轉(zhuǎn)染β-Gal報(bào)道基因(pUMVC1-β-Gal，7528Bp)。一般而言，每48-孔轉(zhuǎn)染0.1μg(HeLa)或0.25μg(IGROV-I)pDNA。正如用法說(shuō)明手冊(cè)中推薦的總核酸脂質(zhì)比為1∶12(w/w)。在pDNA轉(zhuǎn)染3小時(shí)時(shí)間后，用新鮮的生長(zhǎng)培養(yǎng)基(150μL)替代轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基，此后使用在新鮮OptiMEM中制備的LsiR顆粒(終體積100μL)進(jìn)行LsiR siFection實(shí)驗(yàn)，此后立即進(jìn)行siFection。
在這項(xiàng)工作中所述的所有siFection均在48-孔平板上進(jìn)行。為此，使用新鮮的OptiMEM將siRNA(0.1μg)稀釋至終體積為100μL。在渦旋下加入4.35μL CDAN/DOPE(0.3mg/mL)(得到脂質(zhì)/siRNA比13∶1[w/w])并且使LsiR lipoplex穩(wěn)定5分鐘。最后將LsiR混合物導(dǎo)入指定的在完整生長(zhǎng)培養(yǎng)基(包括FCS/抗生素)(150μL)中含有細(xì)胞的48-孔平板的適當(dāng)孔中，且在37℃、10％CO2下孵育3小時(shí)。然后用新鮮的生長(zhǎng)培養(yǎng)基替代培養(yǎng)基并且將細(xì)胞孵育16-72小時(shí)，此后進(jìn)行β-Gal報(bào)道基因測(cè)定(Roche，UK)。
實(shí)施例1聚乙二醇化的siRNA-lipoplex參照附圖IA，將DOPE(140μL，在CHCl3中10.68mg/mL)，CDAN·3HCl(271μL，在CHCl3中4mg/mL)和CPA(100μL，在CHCl3中4.4mg/mL)吸移入用硝酸和二甲基甲硅烷基二氯預(yù)處理的圓底燒瓶(5mL)中，并且在減壓下除去溶劑而形成脂質(zhì)膜，通過(guò)在渦旋下添加水(milliQ，1mL)使其再水化。隨后在SonomaticTM水浴(LongfordUltrasonics)中將多層脂質(zhì)體制劑聲處理30分鐘而得到單層脂質(zhì)體(SUV)。將250μL這些脂質(zhì)體吸移入5mL Falcon塑料管中并且在劇烈渦旋下滴加siRNA溶液(0.28mg/mL)，隨后添加聚乙二醇-雙醛(Mw 3400，7.8μL，10mg/mL；5％PEG/總脂質(zhì))。將樣品保持穩(wěn)定15分鐘/RT，此后添加PBS(483μL)。在將樣品保持16小時(shí)/RT后，使體積減少至750μL而得到0.1mg/mL siRNA的siRNA-lipoplex(LsiR)。
參照附圖IB，用PRIMOfectTM(IC-Vec Ltd.，UK)，按照制造商的用法說(shuō)明轉(zhuǎn)染pUMVC1-β-Gal。一般而言，每48-孔轉(zhuǎn)染0.1μg(HeLa)或0.25μg(IGROV-I)pDNA。在將pDNA轉(zhuǎn)染3小時(shí)時(shí)間后，用新鮮的生長(zhǎng)培養(yǎng)基(150μL)替代轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基。如A中所述產(chǎn)生具有不同量PEG(0-5％)的LsiR復(fù)合物。就每一實(shí)驗(yàn)而言，選擇3種用量的siRNA(0.02/0.1/0.5μ gsiRNA/孔；5/30/150nM)并且用OptiMEM稀釋而達(dá)到100μL終體積，將其加入到含有150μL新鮮生長(zhǎng)培養(yǎng)基的各孔(48孔平板)中并且將細(xì)胞孵育16-72小時(shí)，此后進(jìn)行β-Gal報(bào)道基因測(cè)定(Roche，UK)。
實(shí)施例2聚乙二醇化的siRNA-lipoplex的穩(wěn)定性。
研究聚乙二醇化的(Mw 2000)siRNA-lipoplex在80％血清(FCS)中的穩(wěn)定性。如實(shí)施例1和附圖1中所述產(chǎn)生表面聚乙二醇化的LsiR復(fù)合物并且與FCS孵育不同的時(shí)間，此后通過(guò)光子關(guān)聯(lián)能譜法(PCS)測(cè)定顆粒大小。結(jié)果如附圖2中所示。隨著PEG程度的增加，顆粒大小在所研究的時(shí)標(biāo)內(nèi)不會(huì)增加。
有利的是，通過(guò)使PEG與siRNA加載的lipoplex偶聯(lián)后產(chǎn)生的聚乙二醇化的siRNA-lipoplex表現(xiàn)出隨著與表面偶聯(lián)的PEG的量的增加的血清穩(wěn)定性。
實(shí)施例3組織分布研究使用脂質(zhì)[4-14C]膽固醇(Amersham Biosciences)以最終摩爾比為39.95∶50∶10∶0.05的CDAN/DOPE/CPA700/[4-14C]膽固醇標(biāo)記脂質(zhì)體制劑。通過(guò)在渦旋下將siRNA加入到脂質(zhì)體中以脂質(zhì)體/siRNA之比為13∶1(w/w)制備siRNA lipoplex。將樣品濃縮至總體積的一半并且通過(guò)添加PBS補(bǔ)充至原始體積。將200μL(0.1mg/mL siRNA)這些復(fù)合物注入體重約為30g的每只小鼠的尾側(cè)靜脈中。將放射性調(diào)整至約0.035μCI/動(dòng)物。
在1小時(shí)后，麻醉小鼠并且通過(guò)心臟穿刺獲得血液且即刻與15U肝素混合。計(jì)算脂質(zhì)體的血液濃度，推定總血液重量為體重的6％。在頸脫位后，剖離肝、脾、腎、肺和心臟并且稱(chēng)重。以5mL PBS/g器官的濃度在PBS中勻化器官。在60℃下使用Solvable將200μL各器官和100μL血液的等分部分增溶1小時(shí)。然后用0.1mL EDTA(0.1M)，隨后用在0.1mL等分部分中的0.3mL-0.5ml 30％過(guò)氧化氫處理樣品。在室溫下15-30分鐘后，將樣品在60℃下再孵育1小時(shí)。然后向每支小瓶中加入10mL Ultima GoldTM并且使用液體閃爍計(jì)數(shù)器測(cè)定放射性。將附圖3中所示的結(jié)果表示為每個(gè)器官中所注射劑量的百分比(％ID)。
通過(guò)使PEG與siRNA加載的lipoplex偶聯(lián)后產(chǎn)生的聚乙二醇化的siRNA-lipoplex表現(xiàn)出不同于未聚乙二醇化的類(lèi)似物的藥代動(dòng)力學(xué)特性，導(dǎo)致在肝臟中檢測(cè)到的量隨著PEG的量的增加而逐步降低。
實(shí)施例4lacZ基因在肝臟中的減量調(diào)節(jié)將用PEG2000(CHO)2(0.1％)聚乙二醇化的200μL LsiR通過(guò)靜脈內(nèi)給Balb/C小鼠注射并且使動(dòng)物休息8小時(shí)，此后在10秒內(nèi)注射在2.5mL PBS中的1μg pUMVC1-β-Gal(高動(dòng)力性注射)。pDNA注射后24小時(shí)處死動(dòng)物并且通過(guò)ELISA測(cè)定β-半乳糖苷酶表達(dá)。注意僅pDNA和pDNA+LsiR(GFP對(duì)照)產(chǎn)生相同的β-Gal表達(dá)水平，而LsiR(抗-β-Gal)介導(dǎo)80％以上的β-Gal蛋白的減量調(diào)節(jié)。
結(jié)果如附圖4中所示。
令人意外的是，通過(guò)流體動(dòng)力學(xué)注射1μg pDNA(在2ml PBS中)導(dǎo)入雌性Balb/C小鼠肝臟的lacZ基因的減量調(diào)節(jié)在流體動(dòng)力學(xué)注射后8或24小時(shí)全身遞送20μg siRNA-lipoplex(PEG 0.1％)后達(dá)到80％以上。
實(shí)施例5使用聚乙二醇化的LsiR lipoplex對(duì)腺病毒表達(dá)的β-Gal蛋白的減量調(diào)節(jié)為了研究聚乙二醇化水平對(duì)腺病毒表達(dá)的β-Gal蛋白的減量調(diào)節(jié)的影響，通過(guò)尾靜脈注射AdRSV β GaI(200μL總體積)并且使動(dòng)物休息2小時(shí)，此后注射分別使用0/0.1/5％PEG2000(CHO)2聚乙二醇化的LsiR(抗-β-Gal)。結(jié)果如附圖5A中所示。
為了研究腺病毒的注射途徑的影響，在靜脈內(nèi)注射使用PEG3400(CHO)2(5％)聚乙二醇化的LsiR lipoplex后8小時(shí)將AdRSV β GaI注入腹膜腔內(nèi)(200μL總體積)。由于AV的不同注射途徑，所以，β-Gal蛋白的總體水平降至通過(guò)靜脈內(nèi)途徑獲得的水平的10％。
結(jié)果如附圖5B中所示。
令人意外的是，感染指定劑量的lacZ-腺病毒并且在病毒感染后2小時(shí)通過(guò)尾靜脈注射獲得20μg siRNA-lipoplex(PEG 0％/0.1％/5％)的雄性Balb/C小鼠表現(xiàn)出最高聚乙二醇化的siRNA-lipoplex(5％PEG)的最大減量調(diào)節(jié)(＞70％)。
實(shí)施例6(A)HPLC分析對(duì)CDAN/CPA/DOPE(20∶30∶50，m/m/m)脂質(zhì)體進(jìn)行HPLC分析。用70μL水稀釋30μL脂質(zhì)體(3mg/mL)并且將90μL該溶液注入HPLC。通過(guò)蒸發(fā)性光散射檢測(cè)器(ELS)分析峰。結(jié)果如附圖6A中所示。
還研究了在CDAN/CPA/DOPE(20∶30∶50，m/m/m)表面上偶聯(lián)的抗體。將2mg家兔IgG(Sigma)溶于1mL NaOAc(20mM)、NaCl(0.15M)pH 5.9。在單獨(dú)的試管中，制備1mL新鮮的H5IO6并且合并2支試管且在室溫下保持1.5小時(shí)。通過(guò)添加0.5mL乙二醇使反應(yīng)猝滅，此后將完整的反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)入透析管(Spectrum Labs，USA；MWCO12000-14000)并且對(duì)0.1M K2HPO4/0.1％TritonX透析16小時(shí)。回收該溶液并且通過(guò)BCA測(cè)定法測(cè)定IgGOX濃度。將80μL CDAN/CP A/DOPE(20∶30∶50，m/m/m；2mg/mL)和100μL氧化的IgGOX(0.94mg/mL)以37℃/16小時(shí)孵育并且將90μL注入HPLC進(jìn)行分析。結(jié)果如附圖6A中所示。將rt＝27分鐘時(shí)的CPA峰和不與脂質(zhì)體孵育的未氧化的IgG的對(duì)照相比降低了48％。在rt＝36分鐘時(shí)觀察到了在λ＝280nm處具有強(qiáng)吸收的指示為蛋白質(zhì)的新峰，將其分離并且在SDS PAGE上進(jìn)行分析且發(fā)現(xiàn)為具有約20個(gè)拷貝的通過(guò)肟鍵與氧化的Fc-碳水化合物單元共價(jià)結(jié)合的CPA的IgG。
還進(jìn)行了與(i)PEG2000(CHO)2，隨后與(ii)IgGOX的雙重孵育。結(jié)果如附圖6C中所示。令人意外的是，CPA脂質(zhì)的氨氧基官能團(tuán)的高度反應(yīng)性允許CDAN/CPA/DOPE(20∶30∶50，m/m/m)脂質(zhì)體首先與PEG2000(CHO)2(1％)一起孵育而生成血清保護(hù)的脂質(zhì)體，可以進(jìn)一步使其與氧化的IgGOX反應(yīng)以便使抗體與聚乙二醇化脂質(zhì)體的表面共價(jià)結(jié)合(附圖6C(B))。為了這一目的，將30μL CDAN/CPA/DOPE(20∶30∶50，m/m/m)脂質(zhì)體與2μL PEG2000(CHO)2(10-8mol)一起孵育15分鐘/RT，此后分別添加40，60，80或100μL氧化的IgGOX(0.94mg/mL)(附圖6C(B)，1-4)。將該反應(yīng)混合物孵育16小時(shí)并且將90μL注入HPLC進(jìn)行分析(附圖6C(A和B))。盡管在先與PEG(CHO)2一起孵育，但是rt＝27分鐘時(shí)的CPA信號(hào)隨著IgGOX(下圖)的量的增加而逐步減弱，表明CPA脂質(zhì)的剩余的游離氨氧基仍然為反應(yīng)性的，以便使抗體與聚乙二醇化脂質(zhì)體的表面共價(jià)結(jié)合。注意在rt＝35分鐘時(shí)的HPLC信號(hào)表現(xiàn)出在λ＝280nm處指示蛋白質(zhì)的強(qiáng)吸收。
可以將由siRNA和在0.1-1％總脂質(zhì)(lipoplex中的摩爾比)下聚乙二醇化的CDAN/DOPE/CPA(40/50/10；m/m/m)脂質(zhì)體制備的LsiRlipoplex與氧化的IgG抗體在酸性pH下一起孵育，正如通過(guò)對(duì)氨氧基脂質(zhì)體的HPLC分析所證實(shí)的，使得抗體在與氧化的IgG孵育前(附圖6a)和與氧化的IgG孵育后(附圖6b)，通過(guò)其部分氧化的碳水化合物單元與CPA脂質(zhì)共價(jià)結(jié)合。
(B)(i)脂質(zhì)體和IgG制備(CDAN/DOPE/CPA)將164μL DOPE(9.05mg/ml，744g/mol)、279μL CDAN·3HCl(3.88mg/mL，680g/mol)和107μL CPA(4mg/mL，1075g/mol)在5mL圓底燒瓶中混合并且在約30℃下蒸發(fā)溶劑而形成干脂質(zhì)膜。通過(guò)加入1mL水且渦旋1分鐘產(chǎn)生多層脂質(zhì)體。將脂質(zhì)體樣品聲處理20分鐘以便產(chǎn)生＜100nm大小的小單層脂質(zhì)體。
CDAN/DOPE/CPA/DSPErhod將159μL DOPE(9.05mg/ml，744g/mol)、277μL CDAN·3HCl(3.88mg/mL，680g/mol)、45μL CPA(8mg/mL，1075g/mol)和25.8μL DSPE-若丹明(2mg/mL，1301g/mol)在5mL圓底燒瓶中混合。在約30℃下蒸發(fā)溶劑而形成干脂質(zhì)薄膜。通過(guò)加入1mL水且渦旋1分鐘產(chǎn)生多層脂質(zhì)體。將脂質(zhì)體樣品聲處理20分鐘以便產(chǎn)生＜100nm大小的小單層脂質(zhì)體。
IgG的氧化(a)合并260μL IgG儲(chǔ)備溶液(0.38mg/mL)和260μL高碘酸(在水中20mM)并且在室溫和暗處保持30分鐘。然后使樣品在NAP-5-柱上脫鹽。氧化后制備不同的IgG稀釋液(0μL-170μL的補(bǔ)足水而達(dá)到170μL總體積的氧化的IgG)并且與30μL脂質(zhì)體混合(3mg/mL)。在SDS PAGE膠凝上分析40μg蛋白質(zhì)樣品(附圖6d，A1，泳道2)。
(b)合并250μL IgG儲(chǔ)備溶液(0.38mg/mL)和250μL高碘酸(在水中20mM)并且在室溫和暗處保持1小時(shí)。然后將樣品對(duì)乙酸鈉緩沖液(20mM乙酸鈉和150mM NaCl，pH 5.5)透析2小時(shí)。氧化后制備不同的IgG稀釋液(0μL-170μL的補(bǔ)足水而達(dá)到170μL總體積的氧化的IgG)并且與30μL脂質(zhì)體混合(3mg/mL)。在SDS PAGE膠凝上分析40μg蛋白質(zhì)樣品(附圖6d，A1，泳道3)。
(c)合并250μL IgG儲(chǔ)備溶液(0.38mg/mL)和250μL高碘酸(在水中20mM)并且在室溫和暗處保持1小時(shí)。然后將樣品對(duì)乙酸鈉緩沖液(20mM乙酸鈉和150mM NaCl，pH5.5)透析2小時(shí)。氧化后制備不同的IgG稀釋液(0μL-70μL的補(bǔ)足水而達(dá)到70μL總體積的氧化的IgG)并且與30μL脂質(zhì)體混合(3mg/mL)。在SDS PAGE膠凝上分析40μg蛋白質(zhì)樣品(附圖6d，A1，泳道4)。
IgGOX熒光標(biāo)記通過(guò)與50μL NHS-FITC(10mg/mL，DMSO)一起孵育對(duì)70μL(0.2mg/mL)抗體進(jìn)行熒光標(biāo)記。在載玻片-A-Lyzer小型透析裝置10′000 MWCO中進(jìn)行純化。通過(guò)BCA試驗(yàn)進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度測(cè)定并且測(cè)定為0.11mg/mL。
ELISA向NUNC-Immuno平板的各孔中加入5μL HFN(1mg/mL)和40μL TRIS緩沖液(NaCl 0.25M，TRIS 0.02M.pH 7.6)并且將平板在室溫下孵育30分鐘。此后用洗滌緩沖液(Tris 0.02M，NaCl 0.5M，Triton 0.5％，pH 7.6)將平板洗滌3次。通過(guò)向各孔中加入3μL BSA(1mg/mL)和40μL Tris緩沖液封閉孔。然后將平板在37℃下孵育1小時(shí)。此后洗滌平板并且加入75μL的0-60pmol氧化的IgG(0.18mg/mL)或IgGOX-偶聯(lián)的lipoplex(0.11mg/mL蛋白質(zhì))的不同稀釋液。將平板在37℃下孵育1小時(shí)且此后進(jìn)行洗滌。接下來(lái)向各孔中加入50μL的與辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的綿羊抗-小鼠抗體(按照1∶5000稀釋)。將平板在37℃下再孵育1小時(shí)且此后進(jìn)行洗滌。在結(jié)束時(shí)，向各孔中加入50μL SIGMA FASTTMOPD底物并且在平板讀出器中測(cè)定405nm處的吸收度。
(ii)Lipoplex的形成Lipoplex 1CDAN/DOPE/CPA和Cy3-GFP標(biāo)記的siRNA。將100μL CDAN/DOPE/CPA脂質(zhì)體儲(chǔ)備溶液(3mg/mL)與125μL水混合。在渦旋該混合物的同時(shí)，向所述溶液中緩慢加入75μL siRNA Cy3-GFP(0.4mg/mL)。然后向lipoplex中加入53μL PEG2000(CHO)2(0.135mg/mL)并且孵育1小時(shí)。向該混合物中加入100μL IgGOX-(FITC)樣品(0.11mg/mL)并且孵育3小時(shí)。
Lipoplex 2脂質(zhì)體rhod和未標(biāo)記的siRNA。將30μL脂質(zhì)體rhod儲(chǔ)備溶液(3mg/mL)吸移入塑料微量離心管并且向脂質(zhì)體中緩慢加入23μL siRNA(0.4μg/μL)，同時(shí)渦旋。然后向lipoplex中加入53μL PEG2000(CHO)2(0.135mg/mL)。向該混合物中加入100μLIgGOX-(FITC)樣品(0.11mg/mL)并且孵育3小時(shí)。
在4℃下在SORVALL RC M150 GX離心機(jī)中以45000rpm通過(guò)反相蔗糖梯度(20％，10％，5％和0％)將lipoplex純化1.5小時(shí)(附圖6d，B)。從各樣品中取出粉紅色層，在載玻片-A-Lyzer小型透析裝置(10′000MWCO，Pierce)中透析并且在減壓下濃縮至200μL終體積。使用BCA測(cè)定法測(cè)定樣品中的蛋白質(zhì)濃度。凍干30μL各樣品(0.11mg/mL蛋白質(zhì))并且在15μL填充染料中再溶解。然后使樣品在12％Tris-甘氨酸SDS PAGE凝膠上運(yùn)行(附圖6D，A2，泳道3/4)。另外在瓊脂糖CL 6B，20×0.6cm柱上通過(guò)FPLC(0.2MPa，流速0.4mL/分鐘，靈敏度0.05/0.1)純化Lipoplex。將乙酸鈉緩沖液(20mM乙酸鈉和150mM NaCl，pH 5.5)用于分離并且將檢測(cè)器設(shè)定在280nm下。然后在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上濃縮收集的級(jí)分并且測(cè)定PCS。一般而言，回收到兩種級(jí)分，其中第一種級(jí)分呈現(xiàn)出200nm的lipoplex大小而第二種較小的級(jí)分呈現(xiàn)出10′000nm的lipoplex大小，它們?yōu)榫奂腖siR-IgG lipoplex(附圖6D，分別為泳道2和3)。
(iii)結(jié)果分別通過(guò)SDS PAGE和ELISA證實(shí)了氧化后抗體的完整性和活性(附圖6D)?？梢酝ㄟ^(guò)在高碘酸中的孵育時(shí)間和高碘酸的濃度控制氧化抗體的數(shù)量。一般而言，在10mM高碘酸中孵育1小時(shí)產(chǎn)生足夠數(shù)量的氧化碳水化合物以便與脂質(zhì)體和lipoplex中的CPA脂質(zhì)有效偶聯(lián)，而不會(huì)損害活性。從附圖6D/A1中顯而易見(jiàn)，甚至在孵育時(shí)間增加時(shí)，抗體也未受損害。在IgGOX與lipoplex偶聯(lián)和FPLC或蔗糖梯度純化后，SDS顯示出稍高于50kD分子量梯的三種不同的帶(附圖6D，泳道2/3)，這可能歸因于含有不同量偶聯(lián)的CPA脂質(zhì)的IgG Fc-片段。
LsiR-IgG lipoplex的ELISA證實(shí)lipoplex偶聯(lián)的抗體的完全活性。
實(shí)施例7膽固醇基胺2將氯甲酸膽固醇酯1(7.5g，0.0167mol)溶于亞乙基-1，2-二胺(180ml)并且將該混合物攪拌18小時(shí)。用水使反應(yīng)猝滅并且用二氯甲烷萃取。干燥有機(jī)萃取物(MgSO4)并且在真空中除去溶劑而得到殘余物，將其通過(guò)快速柱色譜法純化[CH2Cl2/MeOH/NH3＝192∶7∶1，隨后CH2Cl2/MeOH/NH3＝92∶7∶1(v/v)]而得到純產(chǎn)物2(5.5g，73％)，為白色固體(mp175-177℃)FTIR(石蠟糊)U最大[cm-1]3338(胺)，2977(烷烴)，2830(烷烴)，1692(氨基甲酸酯)；1H NMR(CDCl3)δ(41)0.66(3 H，s，H-18)，0.838-0.854(3H，d，H-27(J＝6.4Hz))，0.842-0.858(3H，d，H-26 (J＝6.4Hz))，0.890-0.906(3H，d，H-21(J＝6.4Hz))，0.922(3H，s，H-19)，1.02-1.63(21H，m，H-1，H-9，H-11，H-12，H-14，H-15，H-16，H-17，H-20，H-22，H-23，H-24，H-25)，1.76-2.1(5H，m，H-2，H-7，H-8)，2.22-2.36(2H，m，H-4)，2.79-2.81(2H，m，H2NCH2)，3.197-3.210(2H，m，H2NCH2CH2)，4.52(1H，m，H-3)，5.31(1H，s，H-6)；13C NMR(CDCl3)δ(41)11.78(C-18)，18.64(C-21)，19.26(C-19)，20.96(C-11)，22.49(C-26)，22.75(C-27)，23.7(C-23)，24.20(C-15)，27.92(C-25)，28.09(C-2)，28.16(C-16)，31.77(C-8)，31.81(C-7)，35.72(C-20)，36.09(C-22)36.46(C-10)，36.91(C-1)，38.50(C-24)，39.43(C-4)，39.64(C-12)，42.2(C-13)，41.70(H2NCH2CH2)，43.55(H2NCH2)，49.91(C-9)，56.04(C-17)，56.59(C-14)，74.20(C-3)，122.39(C-6)，156.39(C＝O)；質(zhì)譜[ESI/+ve]473(M+H)；HRMS(FAB/+ve)計(jì)算值C30H53N2O2(M+H)473.411911；測(cè)定值473.410704。
實(shí)施例8Boc-氨氧基膽固醇基脂質(zhì)3用DMAP(292mg，2.39mmol)、HBTU(373mg，0.987mmol)和胺2(272mg，0.576mmol)依次處理在無(wú)水二氯甲烷中的Boc-氨基-羥乙酸(145mg，0.758mmol)并且將該混合物在室溫下和氮?dú)猸h(huán)境中攪拌15小時(shí)。用7％檸檬酸水溶液使反應(yīng)猝滅并且用二氯甲烷萃取。在真空中濃縮干燥(MgSO4)的萃取物而得到殘余物，將其通過(guò)快速柱色譜法(梯度20％乙酸乙酯/己烷-65％乙酸乙酯/己烷)純化而得到純的Boc-氨氧基膽固醇基脂質(zhì)3(302mg，81％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ(41)8.56(s，1H，BocNHOCH2)，8.2(br，CH2CONHCH2)，5.5(m，1H，chol C6)，5.4(m，1H，chol-O(CO)NH)，4.5(m，1H，chol C-3)，4.3(s，2H，(CO)CH2ONH2)，3.4(m，2H，O(CO)NHCH2CH2)，3.3(m，2H，O(CO)NHCH2CH2)，2.32(m，2H，chol C-24)，1.46(s，3H，Boc)，0.94-2.10(chol C-1，2，4，7，8，9，11，12，14，15，16，17，20，22，23，25)，1.0(s，3H，chol C-19)，0.89(d，3H，J＝6.4，chol C-21)，0.83，0.82(2×d，6H，J＝6.5和2.0Hz)，0.68(s，3H，Chol C-18)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ(41)169.6(NH(CO)CH2ONH2)，157.9(Boc)，156.6(OCONH)，139.7(C-5)，122.4(C-6)，82.8(Boc)，76.2((CO)CH2ONH2)，74.4(C-3)，56.6(C-14)，56.0(C-17)，49.9(C-9)，42.2(C-13)，40.6(C4)，39.4-40.6(C-12，C-4，O(CO)NHCH2CH2重疊)，38.4(C-24)，36.9(C-1)，36.4(C-10)，36.1(C-22)，35.7(C-20)，31.80(C-8)，321.79(C-7)，28.1(C-16和Boc重疊)，28.0(C-2)，27.9(C-25)，24.2(C-15)，23.7(C-23)，22.7(C-26)，22.5(C-27)，20.9(C-11)，19.2(C-19)，18.6(C-21)和11.8(C-18).
質(zhì)譜[ESI/+ve]646[M+H]+；HRMS計(jì)算值C37H64N3O6646.479512；測(cè)定值646.479874。
實(shí)施例9膽固醇基氨氧基脂質(zhì)4然后用在4M在二烷中的HCl(3ml)處理在丙-2-醇(3ml)中的Boc-氨氧基膽固醇基脂質(zhì)3(86mg，0.067mmol)并且在室溫下將該混合物攪拌3小時(shí)。在真空中除去溶劑而得到氨氧基脂質(zhì)4(37mg，98％)；1HNMR(400MHz，d4-MeOD)δ(41)5.35(m，1H，Chol C6)，4.8(m，1H，chol-O(CO)NH)，4.5(s，2H，(CO)CH2ONH2)，4.4(m，1H，chol C-3)，3.3(m，2H，O(CO)NHCH2CH2)，3.1(m，2H，O(CO)NHCH2CH2)，2.32(m，2H，chol C-24)，0.94-2.10(chol C-1，2，4，7，8，9，11，12，14，15，16，17，20，22，23，25)，1.0(s，3 H，chol C-19)，0.89(d，3H，J＝6.4，chol C-21)，0.83，0.82(2×d，6H，J＝6.5和2.0Hz)，0.68(s，3H，chol C-18)；13C NMR 8[ppm](100MHz，CDCl3)171.4(NH(CO)CH2ONH2)，158.3(OCONH)，140.55(C-5)，123.2(C-6)，75.4((CO)CH2ONH2)71.9(C-3)，57.5(C-14)，57.0(C-17)，51.0(C-9)，43.0(C-13)，40.2(C-4)，40.0-40.6(C-12，C-4)，O(CO)NHCH2CH2重疊)，39.2(C-24)，37.8(C-1)，37.3(C-10)，36.9(C-22)，36.6(C-20)，32.7(C-8)，32.6(C-7)，28.9(C-16)，28.8(C-2)，28.7(C-25)，24.9(C-15)，24.5(C-23)，23.2(C-26)，22.9(C-27)，21.8(C-11)，19.7(C-19)，19.2(C-21)和12.3(C-18).
質(zhì)譜[ESI/+ve]546[M+H]+。
實(shí)施例10CPA化合物的合成按照兩步完成膽固醇基-(dPEG4)2-氨氧基脂質(zhì)(CPA)6的合成1)短被保護(hù)的PEG-氨氧基連接基3的固相合成(PABoc，方案1)；和2)膽固醇基-胺(C)與PABoc 3的溶液相偶聯(lián)(方案2)。
使用標(biāo)準(zhǔn)肽Fmoc固相方法，在2-氯三苯甲基氯聚苯乙烯樹(shù)脂[PS-氯三苯甲基-C1](Argonaut，USA)上合成PABoc 3。首先，使短的PEG連接基N-Fmoc-酰氨基-dPEG4TM-酸(Quanta BioDesign，Inc.，USA)在堿性條件下上樹(shù)脂且隨后使用哌啶除去Fmoc保護(hù)基而得到胺1(方案1)。接下來(lái)使用HBTU偶聯(lián)試劑(Novabiochem，UK)使另一種N-Fmoc-酰氨基-dPEG4TM-酸單元與1偶聯(lián)且隨后再次使Fmoc脫保護(hù)。使所得胺在HBTU條件下與N-Boc-氨基-羥乙酸(Novabiochem，UK)偶聯(lián)而得到樹(shù)脂結(jié)合的PABoc 2，然后在弱酸性條件下使其從樹(shù)脂上裂解而得到PABoc 3粗品，認(rèn)為它足夠純(TLC)而無(wú)需進(jìn)一步純化繼續(xù)用于下一步。
方案1Boc-氨氧基-(dPEG4)2-CO2H的合成試劑和條件a)N-Fmoc-酰氨基-dPEG4TM-酸(3當(dāng)量)，在DMF中的Hunig堿(5當(dāng)量)，2小時(shí)，室溫；b)20％在DMF中的哌啶(3×5分鐘)，室溫；c)N-Fmoc-酰氨基-dPEG4TM-酸(3當(dāng)量)，HBTU(5當(dāng)量)，在DMF中的Hünig堿(5當(dāng)量)，1小時(shí)，室溫；d)20％在DMF中的哌啶(3×5分鐘)，室溫；e)Boc-氨基-羥乙酸(3當(dāng)量)，HBTU(5當(dāng)量)，在DMF中的Hünig堿(5當(dāng)量)，1小時(shí)，室溫；和f)50％在DCM中的1，1，1-三氟乙醇，1小時(shí)，室溫。
CPA的合成的完成描述在方案2中。簡(jiǎn)單的說(shuō)，在凈環(huán)境中用過(guò)量的乙二胺處理商購(gòu)的氯甲酸膽固醇酯(Aldrich，UK)，產(chǎn)生膽固醇基-胺4。然后使用HBTU作為偶聯(lián)試劑使PABoc 3與胺4偶聯(lián)，而得到Boc-保護(hù)的膽固醇基-(dPEG4)2-氨氧基3(71％產(chǎn)率)。使用在二烷中的4M HCl使Boc-基團(tuán)脫保護(hù)而得到CPA[膽固醇基-(dPEG4)2-氨氧基脂質(zhì)，6](通過(guò)分析型HPLC測(cè)得產(chǎn)率＞97％)，將其不經(jīng)進(jìn)一步純化用于生物學(xué)研究。
方案2CPA脂質(zhì)的合成試劑和條件a)乙二胺(大大過(guò)量)，室溫，18小時(shí)，75％；b)Boc-氨基-羥乙酸，HBTU，DMAP，二氯甲烷，室溫，18小時(shí)，81％；和c)4MHCl/二烷，丙-2-醇，3小時(shí)，99％。
膽固醇基-Gly-PEG(n＝11)-酰肼(CP11Hyd)的合成膽固醇基-Gly-PEG(n＝11)-酰肼(CP11Hyd)的合成如方案3中所示。用甘氨酸8處理氯甲酸膽固醇酯7得到產(chǎn)率良好的膽固醇基甘氨酸9。接下來(lái)使用肽偶聯(lián)試劑HBTU在有DMAP存在下使O-(2-氨乙基)-O-[2-(Boc-氨基)乙基]癸乙二醇與9偶聯(lián)，從而得到Boc-保護(hù)的膽固醇基-甘氨酸-PEHn＝11-胺10。用TFA除去Boc-基團(tuán)得到游離胺11，它足夠純而即刻用于偶聯(lián)Nh-叔丁氧羰基-琥珀酸一酰肼14，此時(shí)使用聚苯乙烯-結(jié)合的DCC-衍生的樹(shù)脂PS-碳化二亞胺(Argonaut，UK)作為偶聯(lián)試劑。經(jīng)2個(gè)步驟以68％的良好產(chǎn)率得到Boc-保護(hù)的酰肼12。用4M在二烷或TFA中的HCl處理12而順利地得到所需的酰肼13，產(chǎn)率為54％。
方案3CP11Hyd的合成試劑和條件a)E3N(1. 2當(dāng)量)，二烷/水，12小時(shí)，室溫，63％；b)O-(2-氨乙基)-O-[2-(Boc-氨基)乙基]癸乙二醇，HBTU，DMAP，DCM，2天，室溫，97％；c)TFA/DCM(1∶1)，1小時(shí)，室溫；d)Nh-叔丁氧羰基-琥珀酸一酰肼14，E3N，PS-碳化二亞胺，DCM，24小時(shí)，室溫，2步68％；e)在二烷中的4M HCl，2-丙醇，室溫，3小時(shí)，54％。
實(shí)驗(yàn)操作步驟材料與方法Boc-氨基-羥乙酸和HBTU獲自Novabiochem(CN Biosciences，UK)。N-Fmoc-酰氨基-dPEG4TM-酸購(gòu)自Quanta BioDesign Ltd.(Powell，OH，USA)。PS-碳化二亞胺和PS-氯三苯甲基-C1樹(shù)脂獲自ArgonautTechnologies，Inc.(Foster City，CA，USA)。除非另作陳述，否則，所有其它化學(xué)品均購(gòu)自Sigma Aldrich(Dorset，UK)。將干燥的二氯甲烷與五氧化二磷一起蒸餾；其它溶劑作為預(yù)先干燥的商購(gòu)或根據(jù)需要購(gòu)自Sigma-Aldrich(Dorset，UK)或BDH Laboratory Supplies(Poole，UK)。HPLC-級(jí)乙腈購(gòu)自Fisher Chemicals(Leicester，UK)且其它HPLC-級(jí)溶劑購(gòu)自BDH Laboratory Supplies(Poole，UK)。在預(yù)涂布的背襯鋪板的Merck-Kieselgel 60 F254鋁上進(jìn)行薄層色譜法(TLC)并且使用紫外線(xiàn)、碘、酸性鉬酸銨(IV)、酸性乙醇香草醛或如果合適的其它試劑顯色。在Merck-Kieselgel 60(230-400目)上進(jìn)行快速柱色譜法。使用Bruker Esquire 3000、VG-7070B或JEOL SX-102儀記錄質(zhì)譜。在Advance Brucker 400 UltrashieldTM機(jī)器上，使用殘留同位素溶劑作為內(nèi)標(biāo)記錄1H和13C NMR共振(s＝單峰，d＝雙峰，t＝三重峰，q＝四重峰，quin＝五重峰，br＝寬單峰)。在VydacC4肽柱上進(jìn)行分析型HPLC(安裝了Polymer Laboratories PL-ELS1000蒸發(fā)性光散射檢測(cè)器的Hitachi-LaChrom L-7150泵系統(tǒng))，其中使用0.1％TFA水溶液-100％乙腈(0.1％TFA)梯度
，然后100％乙腈(0.1％TFA)[15-25分鐘]，然后100％甲醇[25-45分鐘]。
Boc-氨氧基-(dPEG4)2-CO2H3 使用標(biāo)準(zhǔn)肽固相合成策略合成Boc-氨氧基-(dPEG4)2-CO2H 3使氯三苯甲基氯樹(shù)脂(1.27mmol/g加載量，55mg，0.070mmol)在Dcm中溶脹16小時(shí)。通過(guò)在DMF(15ml)中用N-Fmoc-酰氨基-dPEG4TM-酸(102mg，0.209mmol)和Hünig堿(60μL，0.349mmol)將樹(shù)脂處理1小時(shí)將第一種酸加載到樹(shù)脂上。通過(guò)使用在DMF中的哌啶(20％)進(jìn)行Fmoc脫封閉(2×5分鐘)，隨后使用DMF進(jìn)行充分洗滌。接下來(lái)使所得樹(shù)脂結(jié)合的游離胺與N-Fmoc-酰氨基-dPEG4TM-酸(102mg，0.209mmol)反應(yīng)，在DMF(15ml)中用在Hünig堿(60μL，0.349mmol)中的HBTU(132.5mg，0.209mmol)活化1小時(shí)(就每次偶聯(lián)步驟而言，使用3當(dāng)量的氨基酸，5當(dāng)量的DIEA和3當(dāng)量的HBTU。每次偶聯(lián)進(jìn)行1小時(shí)，隨后用在DMF中的乙酐(10％)在有3當(dāng)量DIEA存在下封端)。最后，使Boc-氨基-羥乙酸(40mg)偶聯(lián)而得到樹(shù)脂結(jié)合的產(chǎn)物。使用3ml的由50％在DCM中的三氟乙醇組成的溶液將化合物裂解4小時(shí)而得到粗殘余物(40mg，0.058mmol)。H(CDCl3)1.48(9H，Boc)，2.51(2H，t，J＝6.1Hz，～CH2CO2H)，2.59(2H，t，J＝6.05，～CH2CONHCH2～)，3.45和3.52(2H和2H，m，CONHCH2CH2)，3.55-3.7(28H，m，CH2OCH2和CH2OCH2)，3.77(4H，m，NHCH2CH2O)，4.34(2H，s，BocHNOCH2CONH)，7.0(1H，m，BocNHO)，7.9(1H，m，CH2NHCOCH2)和8.3(1H，m，CH2NHCOCH2)·C(CDCl3)28.2(Boc)，35.1(～CH2CO2H)，36.8(～CH2CONHCH2～)，38.98和39.24(CONHCH2CH2)，66.7和67.3(CH2CH2CO)，69.6和69.9(NHCH2CH2O)，70.3-70.7(CH2OCH2和CH2OCH2)，75.8(BocHNOCH2CONH)，82.5(季化，Boc)，158(CO，Boc)，169.3和171.8(季化，CH2NHCOCH2)和173.6(季化，CO2H)。ESI-MS 684.30(M-H)+。
膽固醇基-胺4 將氯甲酸膽固醇酯1(7.5g，0.0167mol)溶于亞乙基-1，2-二胺(180ml)并且將該混合物攪拌18小時(shí)。用水使反應(yīng)猝滅并且用二氯甲烷萃取。干燥(MgSO4)有機(jī)萃取物并且在真空中除去溶劑而得到殘余物，將其通過(guò)快速柱色譜法純化[CH2Cl2∶MeOH∶NH3192∶7∶1-＞CH2Cl2∶MeOH∶NH392∶7∶1(v/v)]而得到純的產(chǎn)物2(5.5g，0.0116，73％)，為白色固體(mp 175-177℃)FTIR(石蠟糊)V最大3338(胺)，2977(烷烴)，2830(烷烴)，1692(氨基甲酸酯)cm-1；1H NMR(CDCl3)δ0.66(3H，s，H-18)，0.838-0.854(3H，d，H-27(J＝6.4Hz))，0.842-0.858(3 H，d，H-26(J＝6.4Hz))，0.890-0.906(3H，d，H-21(J＝6.4Hz))，0.922(3H，s，H-19)，1.02-1.63(21H，m，H-1，H-9，H-11，H-12，H-14，H-15，H-16，H-17，H-20，H-22，H-23，H-24，H-25)，1.76-2.1(5H，m，H-2，H-7，H-8)，2.22-2.36(2H，m，H4)，2.79-2.81(2H，m，H2NCH2)，3.197-3.210(2 H，m，H2NCH2CH2)，4.52(1H，m，H-3)，5.31(1H，s，H-6)；13C NMR(CDCl3)δ11.78(C-18)，18.64(C-21)，19.26(C-19)，20.96(C-11)，22.49(C-26)，22.75(C-27)，23.7(C-23)，24.20(C-15)，27.92(C-25)，28.09(C-2)，28.16(C-16)，31.77(C-8)，31.81(C-7)，35.72(C-20)，36.09(C-22)36.46(C-10)，36.91(C-1)，38.50(C-24)，39.43(C-4)，39.64(C-12)，42.2(C-13)，41.70(H2NCH2CH2)，43.55(H2NCH2)，49.91(C-9)，56.04(C-17)，56.59(C-14)，74.20(C-3)，122.39(C-6)，156.39(C＝O)；MS(ESI+ve)473(M+H)；HRMS(FAB+ve)計(jì)算值C30H53N2O2(M+H)473.411911，測(cè)定值473.410704。
Boc-氨氧基-(dPEG4)2-膽固醇基脂質(zhì)(BocCPA)5 用DMAP(22mg，0.18mmol)，HBTU(24mg，0.063mmol)和膽固醇基胺2(28mg，0.0.06mmol)依次處理在無(wú)水二氯甲烷中的Boc-氨氧基-(dPEG4)2-CO2H(40mg，0.058mmol)并且將該混合物在室溫下和氮?dú)猸h(huán)境中攪拌15小時(shí)。用7％檸檬酸水溶液使反應(yīng)猝滅并且用二氯甲烷萃取。在真空中濃縮干燥(MgSO4)的萃取物而得到殘余物，將其通過(guò)快速柱色譜法(梯度DCM∶MeOH∶H2O)純化而得到純的Boc-氨氧基-(dPEG4)2-膽固醇基脂質(zhì)3(47mg，0.0411mmol，71％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3MeOD)5.32(m，1H，Chol C6)，4.35(m，1H，Chol C-3)，4.28(s，2H，(CO)CH2ONH2)，3.67(4H，m，NHCH2CH2O)，3.56-3.61(24H，m，CH2OCH2和CH2OCH2)，3.56(2H，m，CH2CH2CO)，3.50(2H，m，CH2CH2CO)，3.35和3.43(2H和2H，m，CONHCH2CH2)，3.24(m，2H，CholO(CO)NHCH2CH2)，3.18(m，2H，CholO(CO)NHCH2CH2)，2.42(4H，m，～CH2CO2H和～CH2CONHCH2～)2.27(m，2H，Chol C-24)，1.46(s，3H，Boc)，0.94-2.10(Chol C-1，2，4，7，8，9，11，12，14，15，16，17，20，22，23，25)，1.0(s，3H，Chol C-19)，0.89(d，3H，J＝6.4，Chol C-21)，0.83，0.82(2xd，6H，J＝6.5和2.0Hz)，0.68(s，3 H，Chol C-18)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)173.6(季化，CO2H)，173.3，172.8和170.5(NH(CO)CH2ONH2)，158.5(Boc)，156.6(OCONH)，140.166(C-5)，122.92(C-6)，82.61(Boc)，75.77((CO)CH2ONH2)，74.99(C-3)，70.4-70.8(CH2OCH2和CH2OCH2)，69.81和70.04(NHCH2CH2O)，67.56和67.53(CH2CH2CO)，56.7(C-14)，56.55(C-17)，50.5(C-9)，42.7(C-13)，40.63和39.81(CholO(CO)NHCH2CH2)40.14(C-4)，39.88和39.58(CONHCH2CH2)，39.25(C-12)，38.94(C-24)，37.3(C-1)，36.9(C-10)，36.95(～CH2CONHCH2～)，3 6.90(～CH2CO2H)，36.55(C-22)，36.17(C-20)，32.28(C-8)，32.26(C-7)，28.5(C-16和C-2重疊)，28.36(Boc和C-25)，24.6(C-15)，24.17(C-23)，22.99(C-26)，22.73(C-27)，21.4(C-11)，19.6(C-19)，18.96(C-21)和12.11(C-18)。ESI-MS 1162.40[M+K]。
膽固醇基-(dPEG4)2-氨氧基脂質(zhì)6(CPA) 然后用4M在二烷中的HCl(2ml)處理在丙-2-醇(2ml)中的Boc-氨氧基-(dPEG4)2-膽固醇基脂質(zhì)3(40mg，0.035mmol)并且將該混合物在室溫下攪拌3小時(shí)。在真空中除去溶劑而得到CPA脂質(zhì)4(37mg，98％)。1H NMR(400MHz，d4-MeOD)5.31(m，1H，Chol C6)，4.57(s，2H，(CO)CH2ONH2)，4.38(m，1H，Chol C-3)，3.69(4H，m，NHCH2CH2O)，3.53-3.62(28H，m，CH2OCH2和CH2OCH2)，3.37和3.43(2H和2H，m，CONHCH2CH2)，3.26(m，2H，CholO(CO)NHCH2CH2)，3.19(m，2H，CholO(CO)NHCH2CH2)，2.45(4H，m，～CH2CO2H和～CH2CONHCH2～)，2.27(m，2H，Chol C-24)，0.94-1.99(Chol C-1，2，4，7，8，9，11，12，14，15，16，17，20，22，23，25)，0.97(s，3H，Chol C-19)，0.87(d，3H，J＝6.4，Chol C-21)，0.80，0.82(2xd，6H，J＝6.5和2.0Hz)，0.64(s，3H，Chol C-18)；13C NMR(100MHz，CDCl3)173.6(季化，CO2H)，173.3，172.8和170.5(NH(CO)CH2ONH2)，157.6(OCONH)，140.16(C-5)，122.94(C-6)，75.03(C-3)，71.90((CO)CH2ONH2)，70.4-70.83(CH2OCH2和CH2OCH2)，69.54和70.14(NHCH2CH2O)，67.62(2xCH2CH2CO重疊)，57.12(C-14)，56.56(C-17)，50.50(C-9)，42.7(C-13)，40.54和39.91(CholO(CO)NHCH2CH2)40.14(C-4)，39.88(C-12)，39.38和39.65(CONHCH2CH2)，38.94(C-24)，37.3(C-1)，36.95(C-10)，36.87(～CH2CONHCH2～)，36.78(～CH2CO2H)，36.55(C-22)，36.17(C-20)，32.28(C-8)，32.26(C-7)，28.5(C-16和C-2重疊)，28.36(C-25)，24.6(C-15)，24.17(C-23)，22.98(C-26)，22.73(C-27)，21.42(C-11)，19.6(C-19)，18.96(C-21)和12.11(C-18).ESI-MS 1102.50[M+K+Na]+·分析型HPLC1個(gè)峰，RT 31分鐘。
膽固醇基-甘氨酸9 向在0℃下在二烷(35ml)中的膽固醇氯甲酸酯7(1g，2.23mmol)和三乙胺(424μL，2.9mmol)中加入溶于水(15ml)的甘氨酸8。將該混合物在室溫下攪拌12小時(shí)且然后用7％檸檬酸水溶液使反應(yīng)猝滅。用二氯甲烷萃取水層并且干燥(MgSO4)有機(jī)萃取物并且在真空中濃縮。通過(guò)快速柱色譜法(EtOAc/己烷)純化粗殘余物而得到產(chǎn)物，為白色粉末(680mg，1.39mmol，63％)。1HNMR(CDCl3)δ0.68(3H，s，H-18)，0.83-0.87(3H，d，H-27(J＝6.4Hz))，0.842-0.858(3H，d，H-26(J＝6.4Hz))，0.890-0.906(3H，d，H-21(J＝6.4Hz)，0.93(3H，s，H-19)，0.99-1.7(21H，m，H-1，H-9，H-11，H-12，H-14，H-15，H-16，H-17，H-20，H-22，H-23，H-24，H-25)，1.75-2.2(5H，m，H-2，H-7，H-8)，2.2-2.34(2H，m，H-4)，3.95(brs，CH2～甘氨酸)，4.5(1H，m，H-3)，5.15(1H，br s，NH)，5.3(1H，s，H-6)；13C NMR(CDCl3)δ11.88(C-18)，18.74(C-21)，19.32(C-19)，21.13(C-11)，22.55(C-26)，22.90(C-27)，23.9(C-23)，24.40(C-15)，28.07(C-25)，28.13(C-2)，28.3(C-16)，31.90(C-8)，31.96(C-7)，35.88(C-20)，36.27(C-22)36.64(C-10)，37.0(H-1)，38.50(C-24)，39.60(C-4)，39.83(C-12)，42.35(C-13)，42.4，50.15(C-9)，56.24(C-17)，56.80(C-14)，75.13(C-3)，122.67(C-6)，138.8(C-5)，156.7(C＝O)和172.2(COOH)。
膽固醇基-gly-PEG11-NHBoc 10 將膽固醇基-甘氨酸9(150mg，0.309mmol)、O-(2-氨乙基)-O-[2-(Boc-氨基)乙基]癸乙二醇(Fluka，UK)(198mg，0.307mmol)、HBTU(117mg，0.309mmol)和DMAP(114mg，0.927mmol)溶于無(wú)水二氯甲烷(50ml)并且在氮?dú)猸h(huán)境中攪拌2天。用7％檸檬酸水溶液使反應(yīng)猝滅，用二氯甲烷/MeOH混合物萃取水層并且干燥(MgSO4)有機(jī)萃取物且在真空中濃縮。通過(guò)快速柱色譜法(CHCL3/MeOH/H2O)純化所得的粗殘余物而得到產(chǎn)物(335mg；0.301mmol，97％)。
1H NMR(CDCl3)δ0.68(3H，s，H-18)，0.83-0.87(3H，d，H-27(J＝6.4Hz))，0.842-0.858(3H，d，H-26(J＝6.4Hz))，0.890-0.906(3H，d，H-21(J＝6.4Hz))，0.93(3H，s，H-19)，0.99-1.7(21H，m，H-1，H-9，H-11，H-12，H-14，H-15，H-16，H-17，H-20，H-22，H-23，H-24，H-25)，1.75-2.2(5H，m，H-2，H-7，H-8)，2.2-2.34(2H，m，H-4)，3.3-3.7(48H，m，PEG)，3.85(2H，m，CH2～甘氨酸)，4.5(1H，m，H-3)，5.0(1H，br s，NH)，5.3(1H，m，H-6)，5.56(1H，m，NH)和6.75(1H，m，NH)；13C NMR(CDCl3)δ11.88(C-18)，18.74(C-21)，19.36(C-19)，21.07(C-11)，22.58(C-26)，22.84(C-27)，23.9(C-23)，24.3(C-15)，28.03(C-25)，28.17(C-2)，28.25(C-16)，28.46(Boc)，31.90(C-8)，31.96(C-7)，35.88(C-20)，36.27(C-22)36.64(C-10)，37.0(H-1)，38.55(C-24)，39.34(C-4)，39.54(C-12)，39.77，42.35(C-13)，44.0(gly)，50.15(C-9)，56.24(C-17)，56.74(C-14)，69.5-70.5(PEG，24 x CH2)，75.13(C-3)，80.0(Boc，quart C)，122.60(C-6)，139.8(C-5)，156.7(C＝O)，158(C＝O，Boc)和170(CONH)。
HPLC RT＝27分鐘(C-4柱)；ES-MS 1136.4[M+Na]+。
膽固醇基-gly-PEG11-(Boc-酰肼)12 將在TFADCM(5ml5ml)中的膽固醇基-gly-PEG11-NHBoc10(300mg)在室溫下攪拌1小時(shí)。在真空中除去溶劑而得到胺11，將其不經(jīng)進(jìn)一步純化使用(參見(jiàn)方案3)。因此，將胺11(60mg，0.059mmol)、Nh-叔丁氧羰基-琥珀酸一酰肼14(232mg，0.118mmol)(按照Dietzgen等；Z.Naturforsch.B；42，4，(1987)，pp.441-453合成)和三乙胺(16μL)和聚苯乙烯結(jié)合的DCC-樹(shù)脂(加載量1.27mmol/g；140mg；0.1777mmol)(Argonaut Technologie，UK)在二氯甲烷(10ml)中攪拌24小時(shí)。通過(guò)過(guò)濾除去樹(shù)脂并且在真空中濃縮濾液而得到殘余物，將其通過(guò)快速柱色譜法(氯仿/甲醇/水)純化而得到Boc-保護(hù)的酰肼12(49mg，0.040mmol，68％)。
1H NMR(CDCl3)δ0.66(3H，s，H-18)，0.84-0.86(3H，d，H-27(J＝6.4Hz))，0.84-0.87(3H，d，H-26 (J＝6.4Hz))，0.89-0.91(3H，d，H-21(J＝6.4Hz))，0.99(3H，s，H-19)，0.99-1.65(21H，m，H-1，H-9，H-11，H-12，H-14，H-15，H-16，H-17，H-20，H-22，H-23，H-24，H-25)，1.44(3H，Boc)，1.75-2.2(5H，m，H-2，H-7，H-8)，2.2-2.34(2H，m，H-4)，2.55(4H，m，琥珀酸酯亞甲基)，3.3-3.7(48H，m，PEG)，3.85(2H，m，CH2～甘氨酸)，4.5(1H，m，H-3)，5.35(1H，m，H-6)，5.67(1H，br s，NH)，6.85(1H，m，NH)，6.94(1H，m，NH)and12.13(1H，br s，NH)；13C NMR(CDCl3)δ11.8(C-18)，18.65(C-21)，19.28(C-19)，20.99(C-11)，22.50(C-26)，22.75(C-27)，23.77(C-23)，24.22(C-15)，27.94(C-25)，28.08(C-2)，28.15(Boc CH3)，28.20(C-16)，29.70 (琥珀酸酯CH2)，31.37(琥珀酸酯CH2)，31.81(C-8)，31.81(C-7)，35.72(C-20)，36.13(C-22)36.51(C-10)，36.92(H-1)，38.47(C-24)，39.25(C-4)，39.28(C-12)，39.45，39.68，42.26(C-13)，44.22(甘氨酸CH2)，45.66(2xCH2NHCO)49.97(C-9)，56.09(C-17)，56.64(C-14)，69.5-70.86(PEG，24 x CH2)，74.74(C-3)，81.08(Boc，quart C)，122.50(C-6)，139.70(C-5)，155.43(氨基甲酸酯C＝O)，156.27(C＝O，Boc)，169.4(甘氨酸CONH)，172.5(琥珀酸酯C＝O)和172.23(琥珀酸酯C＝O)。HPLC RT＝27分鐘(C-4柱)；MS 1250.3[M+Na]+。
膽固醇基-gly-PEG11-酰肼13(CP11hyd) 將膽固醇基-gly-PEG11-(Boc-酰肼)12(40mg，0.0326mmol)溶于2-丙醇(3ml)且然后用4M在二烷中的HCl(3ml)處理。將該混合物攪拌3小時(shí)并且在真空中濃縮。通過(guò)用乙醚代替MeOH沉淀純化殘余物而得到黃白色樹(shù)膠狀物(20mg，0.0177mmol，54％)。
1H NMR(CD3OD)δ0.71(3H，s，H-18)，0.84-0.86(3H，d，H-27)，0.84-0.87(3H，d，H-26(J＝6.4Hz))，0.88-0.91(3H，d，H-21(J＝6.4Hz))，0.99(3H，s，H-19)，0.99-1.65(21H，m，H-1，H-9，H-11，H-12，H-14，H-15，H-16，H-17，H-20，H-22，H-23，H-24，H-25)，1.75-2.2(5H，m，H-2，H-7，H-8)，2.2-2.34(2H，m，H-4)，2.6(4H，m，琥珀酸酯亞甲基)，3.3-3.7(48H，m，PEG)，3.85(2H，m，CH2～甘氨酸)，4.45(1H，m，H-3)和5.35(1H，m，H-6)；13C NMR(CD3OD)δ12.6(C-18)，18.65(C-21)，19.28(C-19)，20.99(C-11)，22.50(C-26)，22.75(C-27)，23.77(C-23)，24.22(C-15)，27.94(C-25)，28.08(C-2)，28.15(Boc CH3)，28.20(C-16)，29.70(琥珀酸酯CH2)，31.37(琥珀酸酯CH2)，31.81(C-8)，31.81(C-7)，35.72(C-20)，36.13(C-22)36.51(C-10)，36.92(H-1)，38.47(C-24)，39.25(C-4)，39.28(C-12)，39.45，39.68，42.26(C-13)，44.22(甘氨酸CH2)，45.66(2xCH2NHCO)49.97(C-9)，56.09(C-17)，56.64(C-14)，69.5-70.86(PEG，24 x CH2)，74.74(C-3)，81.08(Boc，quart C)，122.50(C-6)，139.70(C-5)，155.43(氧基甲酸酯C＝O)，156.27(C＝O，Boe)，169.4(甘氨酸CONH)，172.5(琥珀酸酯C＝O)和172.23(琥珀酸酯C＝O).HPLC RT＝27分鐘(C-4柱)；ES-MS 1150.3[M+Na]+。
實(shí)施例11冷凍干燥和再水化的LsiR lipoplex通過(guò)以3mg/mL脂質(zhì)水化CDAN/DOPE(50∶50，m/m)凍干粉在去離子水中制備多層脂質(zhì)體。在水中稀釋siRNA并且緩慢加入到脂質(zhì)體中，同時(shí)渦旋至得到siRNA終濃度為20μg/mL(siRNA)的LsiR復(fù)合物，脂質(zhì)/siRNA之比為12∶1(w/w)。制備蔗糖、海藻糖和乳糖(Sigma，UK)的30％(w/v)的儲(chǔ)備溶液并且將適當(dāng)體積的這些溶液加入到LsiRlipoplex中而分別得到5、10和20％(w/v)的終濃度。復(fù)合物形成時(shí)的LsiR濃度隨著使用冷凍保護(hù)劑的量的不同而改變。例如，制備20μg/mL的不含冷凍保護(hù)劑的LsiRs，同時(shí)制備60μg/mL的含有20％冷凍保護(hù)劑的LsiRs。冷凍干燥25μL lipoplex(0.5μg siRNA)并且使所得粉末以20μg/mL(25μL)或5μg/mL(100μL)在水中水化，渦旋并且使其在室溫下保持穩(wěn)定15分鐘。通過(guò)PCS對(duì)這些LsiR顆粒的大小測(cè)定表明，這些顆粒展示出與凍干/再水化過(guò)程前相同的大小。
如所述的使用0.2μg/孔pDNA/孔進(jìn)行pDNA轉(zhuǎn)染。在pDNA轉(zhuǎn)染后3小時(shí)在37℃/10％CO2下將0.1μg/孔的這些冷凍干燥/再水化的LsiR孵育3小時(shí)。簡(jiǎn)單的說(shuō)，就新鮮LsiR和以20μg/mL(siRNA)冷凍干燥/再水化的LsiR而言，將5μL相應(yīng)的復(fù)合物加入到250μL含有生長(zhǎng)細(xì)胞的各孔中的完全生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。就以5μg/mL(siRNA)融化/再水化的LsiR而言，將20μL復(fù)合物加入到250μL含有生長(zhǎng)細(xì)胞的各孔中的完全生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。孵育3小時(shí)后，除去siFECTion培養(yǎng)基并且用400μL新鮮完全生長(zhǎng)培養(yǎng)基替代。
結(jié)果如附圖8中所示。
令人意外的是，在有海藻糖存在下冷凍干燥并且在25或100μL水中再水化的LsiR lipoplex甚至可以比新鮮制備的LsiR lipoplex更好地減量調(diào)節(jié)lacZ報(bào)道基因。
將上述說(shuō)明書(shū)中提及的所有出版物引入本文作為參考。本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)可以在不脫離本發(fā)明范圍和實(shí)質(zhì)的情況下對(duì)本發(fā)明所述的方法和系統(tǒng)進(jìn)行各種變型和改變。盡管已經(jīng)結(jié)合具體優(yōu)選的實(shí)施方案描述了本發(fā)明，但是應(yīng)理解如權(quán)利要求中所述的本發(fā)明不應(yīng)只限于這類(lèi)具體的實(shí)施方案。實(shí)際上，對(duì)化學(xué)、生物學(xué)和分子生物學(xué)或相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是所述的用于實(shí)施本發(fā)明的方式的各種變型均在如下權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。
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權(quán)利要求
1.包含脂質(zhì)體的遞送載體，其中脂質(zhì)體中的一種或多種脂質(zhì)可逆或不可逆地與一種或多種聚合物偶聯(lián)，并且其中脂質(zhì)體包含siRNA。
2.權(quán)利要求1的遞送載體，其中可逆或不可逆地與一種或多種聚合物偶聯(lián)的脂質(zhì)體中的一種或多種脂質(zhì)暴露在脂質(zhì)體表面。
3.權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的遞送載體，其中脂質(zhì)體包含一種或多種式(I)的含有氨氧基的脂質(zhì) 其中B為脂質(zhì)；其中X為任選的連接基并且其中R2為H或烴基。
4.權(quán)利要求3的遞送載體，其中含有氨氧基的脂質(zhì)為CPA。
5.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的遞送載體，其中脂質(zhì)體包含一種或多種陽(yáng)離子脂質(zhì)和/或一種或多種非-陽(yáng)離子輔脂質(zhì)。
6.權(quán)利要求5的遞送載體，其中陽(yáng)離子脂質(zhì)包含至少一個(gè)脂環(huán)基。
7.權(quán)利要求6的遞送載體，其中至少一個(gè)脂環(huán)基為膽固醇。
8.權(quán)利要求6或權(quán)利要求7的遞送載體，其中陽(yáng)離子脂質(zhì)為N′-膽固醇基氧基羰基-3，7-二氮雜壬烷-1，9-二胺(CDAN)。
9.權(quán)利要求5的遞送載體，其中非-陽(yáng)離子輔脂質(zhì)為磷脂酰乙醇胺。
10.權(quán)利要求9的遞送載體，其中非-陽(yáng)離子輔脂質(zhì)為二油?；字Ｒ掖及?DOPE)。
11.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的遞送載體，其中聚合物包含一個(gè)或多個(gè)醛和/或酮基。
12.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的遞送載體，其中聚合物為PEG。
13.權(quán)利要求12的遞送載體，其中脂質(zhì)體與約0.1-約5％PEG偶聯(lián)。
14.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的遞送載體，其中脂質(zhì)體包含一種或多種附加物或可逆或不可逆地與之偶聯(lián)。
15.包含脂質(zhì)體的靶向遞送載體，其中脂質(zhì)體中的一種或多種脂質(zhì)可逆或不可逆地與一種或多種聚合物和一種或多種附加物偶聯(lián)，并且其中脂質(zhì)體包含siRNA。
16.權(quán)利要求15的靶向遞送載體，其中附加物選自糖、碳水化合物和配體組成的組。
17.權(quán)利要求16的靶向遞送載體，其中糖選自葡萄糖、甘露糖、乳糖、果糖、麥芽三糖、麥芽庚糖組成的組。
18.權(quán)利要求16或權(quán)利要求17的遞送載體，其中配體為抗體。
19.遞送siRNA的方法，包括給細(xì)胞、組織或器官環(huán)境提供權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)的遞送載體或權(quán)利要求15-18中任一項(xiàng)的靶向遞送載體的步驟。
20.權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)的遞送載體或權(quán)利要求15-18中任一項(xiàng)的靶向遞送載體，用于將siRNA遞送至細(xì)胞、組織或器官。
21.權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)的遞送載體或權(quán)利要求15-18中任一項(xiàng)的靶向遞送載體在制備用于將siRNA遞送至細(xì)胞、組織或器官的組合物中的應(yīng)用。
22.制備包含脂質(zhì)體的遞送載體的方法，其中脂質(zhì)體中的一種或多種脂質(zhì)可逆或不可逆地與一種或多種聚合物偶聯(lián)，并且其中脂質(zhì)體包含siRNA，該方法包括下列步驟(i)使siRNA接觸脂質(zhì)體；和(ii)使步驟(i)中形成的脂質(zhì)體可逆或不可逆地與聚合物偶聯(lián)。
23.權(quán)利要求22的方法，包括如下額外步驟(iii)步驟(i)或步驟(ii)中形成的脂質(zhì)體可逆或不可逆地與一種或多種附加物偶聯(lián)。
24.制備包含脂質(zhì)體的靶向遞送載體的方法，其中脂質(zhì)體中的一種或多種脂質(zhì)可逆或不可逆地與一種或多種聚合物和一種或多種附加物偶聯(lián)，并且其中脂質(zhì)體包含siRNA，該方法包括下列步驟(i)使siRNA接觸脂質(zhì)體；(ii)使步驟(i)中形成的脂質(zhì)體可逆或不可逆地與聚合物偶聯(lián)；和(iv)使步驟(i)或步驟(ii)中形成的脂質(zhì)體可逆或不可逆地與一種或多種附加物偶聯(lián)。
25.一種方法，包括下列步驟(i)提供權(quán)利要求1-18中任一項(xiàng)的載體；(ii)任選使所述載體與冷凍保護(hù)劑接觸；和(iii)冷凍干燥該載體。
26.權(quán)利要求25的方法，其中冷凍保護(hù)劑選自蔗糖、海藻糖和乳糖組成的組。
27.權(quán)利要求25或權(quán)利要求26的方法，包括下列額外的步驟(iv)在使用前使所述載體再水化。
28.可通過(guò)或通過(guò)權(quán)利要求25或權(quán)利要求26所述方法獲得的冷凍干燥的載體。
29.包含脂質(zhì)和偶聯(lián)部分的脂質(zhì)體，其中脂質(zhì)與偶聯(lián)部分之間的距離為至少1.5nm。
30.權(quán)利要求29的具有下式的脂質(zhì)體 其中B為脂質(zhì)；其中X為連接基并且偶聯(lián)為偶聯(lián)部分，其中X主鏈包含至少30個(gè)原子。
31.權(quán)利要求30的脂質(zhì)體，其中X主鏈包含至少40個(gè)原子。
32.權(quán)利要求30或31的脂質(zhì)體，其中X為或包含下式的基團(tuán) 其中n和m獨(dú)立為0-6，優(yōu)選1-6，更優(yōu)選2、3或4，更優(yōu)選2或4。
33.權(quán)利要求30或31的脂質(zhì)體，其中X為或包含下式的基團(tuán) 其中n和m獨(dú)立為0-6，優(yōu)選1-6，更優(yōu)選2、3或4，更優(yōu)選2或4。
34.權(quán)利要求30或31的脂質(zhì)體，其中X為或包含下式的基團(tuán) 其中m為0-6，優(yōu)選1-6，更優(yōu)選1、2或3，更優(yōu)選1，并且其中n為0-20，優(yōu)選5-15，更優(yōu)選10、11或12，更優(yōu)選11。
35.權(quán)利要求30或31的脂質(zhì)體，其中X為或包含下式的基團(tuán) 其中m為0-6，優(yōu)選1-6，更優(yōu)選1、2或3，更優(yōu)選1，并且其中n為0-20，優(yōu)選5-15，更優(yōu)選10、11或12，更優(yōu)選11。
36.藥物組合物，包含權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)的遞送載體或權(quán)利要求15-18的靶向遞送載體或權(quán)利要求29-35中任一項(xiàng)的脂質(zhì)體和藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑。
37.治療患者疾病的方法，包括對(duì)該患者給予醫(yī)學(xué)有效量的權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)的遞送載體或權(quán)利要求15-18中任一項(xiàng)的靶向遞送載體或權(quán)利要求29-35中任一項(xiàng)的脂質(zhì)體或權(quán)利要求36的藥物組合物。
38.權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)的遞送載體或權(quán)利要求15-18中任一項(xiàng)的靶向遞送載體或權(quán)利要求29-35中任一項(xiàng)的脂質(zhì)體，用于治療疾病。
39.權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)的遞送載體或權(quán)利要求15-18中任一項(xiàng)的靶向遞送載體或權(quán)利要求29-35中任一項(xiàng)的脂質(zhì)體在制備用于治療疾病的組合物中的應(yīng)用。
40.權(quán)利要求37的方法、權(quán)利要求39的載體或權(quán)利要求39的應(yīng)用，其中所述的疾病為肝病和/或肝損傷。
41.與聚合物偶聯(lián)的脂質(zhì)體在制備包含siRNA的遞送載體中的應(yīng)用。
42.與聚合物和一種或多種附加物偶聯(lián)的脂質(zhì)體在制備包含siRNA的靶向遞送載體中的應(yīng)用。
43.基本上如本文所述并且參照實(shí)施例或附圖中任一個(gè)的遞送載體。
44.基本上如本文所述并且參照實(shí)施例或附圖中任一個(gè)的方法。
45.基本上如本文所述并且參照實(shí)施例或附圖中任一個(gè)的應(yīng)用。
46.基本上如本文所述并且參照實(shí)施例或附圖中任一個(gè)的脂質(zhì)體。
全文摘要
本發(fā)明涉及包含脂質(zhì)體的非病毒遞送載體，其中脂質(zhì)體中的一種或多種脂質(zhì)可逆或不可逆地與一種或多種聚合物偶聯(lián)，并且其中脂質(zhì)體包含siRNA。
文檔編號(hào)C12N15/88GK101094691SQ200580033953
公開(kāi)日2007年12月26日 申請(qǐng)日期2005年7月6日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月13日
發(fā)明者M·凱勒, M·喬根森, A·D·米勒, E·佩羅澤爾 申請(qǐng)人:Ic Vec有限公司