專(zhuān)利名稱(chēng)：：轉(zhuǎn)基因玉米種子中增強(qiáng)的玉米醇溶蛋白減少的制作方法轉(zhuǎn)基因玉米種子中增強(qiáng)的玉米醇溶蛋白減少相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用本申請(qǐng)根據(jù)35U.S.C.119(e)要求于2004年2月10日提交的臨時(shí)申請(qǐng)60/543,157號(hào)、2004年2月10日提交的臨時(shí)申請(qǐng)60/543,187號(hào)和2004年8月11日提交的臨時(shí)申請(qǐng)60/600,859號(hào)、2005年2月10日提交的實(shí)用新型申請(qǐng)11/057062號(hào)的優(yōu)先^又，所有申請(qǐng)的全部公開(kāi)內(nèi)容在此引入作為參考。序列表的引入文件"53428B.ST25.txt"包含了計(jì)算機(jī)可讀形式的序列表，有21kb(在MS-window中測(cè)量)，于2005年2月9日創(chuàng)建，位于隨同提交的CDROM上，并在此引入作為參考。發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明公開(kāi)了氨基酸水平提升的轉(zhuǎn)基因玉米種子、用于產(chǎn)生反義RNA基因抑制環(huán)的重組DNA構(gòu)建體以及這種構(gòu)建體和表達(dá)反義RNA基因抑制環(huán)的轉(zhuǎn)基因植物的制備和使用方法。背景與其它植物相比，或與營(yíng)養(yǎng)學(xué)上基于牛奶或雞蛋設(shè)定的"完美，，蛋白質(zhì)模式相比，某些植物的特定氨基酸水平低。根據(jù)這些標(biāo)準(zhǔn)，玉米的賴(lài)氨酸、曱硫氨酸和色氨酸水平低。在轉(zhuǎn)基因植物中提高氨基酸水平的努力包括表達(dá)重組DNA,與天然基因相比，該重組DNA能高水平地編碼氨基酸合成途徑中的蛋白質(zhì)。一個(gè)用于在玉米中產(chǎn)生提升水平賴(lài)氨酸的此類(lèi)基因是編碼細(xì)菌二氫吡啶二羧酸合酶的基因。使氨基酸水平達(dá)到更高的策略包括抑制氨基酸分解代謝途徑中蛋白質(zhì)的編碼基因?；蛞种瓢ㄓ糜谝种苹虻霓D(zhuǎn)錄或與該基因相應(yīng)的mRNA的積累來(lái)阻止轉(zhuǎn)錄物翻譯為蛋白質(zhì)的任一種熟知的方法。更詳細(xì)地說(shuō)，在美國(guó)專(zhuān)利5,107,065(Shewmaker等)和美國(guó)專(zhuān)利5,759,829(Shewmaker等)中公開(kāi)了通過(guò)在植物細(xì)胞中插入帶有反義方向DNA的重組DNA構(gòu)建體來(lái)調(diào)節(jié)基因表達(dá)從而進(jìn)行基因抑制。如Redenbaugh等在"SafetyAssessmentofGeneticallyEngineeredFlavrSavrTMTomato,CRCPress,Inc.(1992)"中公開(kāi)的，用這種用于基因抑制的反義方向DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的植物可包含整合型DNA,所述DNA是通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化而整合到植物中的、因若干拷貝轉(zhuǎn)移DNA(T-DNA)的共同插入而排列成的反向重復(fù)。反向重復(fù)插入可構(gòu)成T-DNA的一部分或全部，例如，T-DNA可含有完整或部分反義構(gòu)建體的反向重復(fù)。當(dāng)轉(zhuǎn)化構(gòu)建體是簡(jiǎn)單的反義DNA構(gòu)建體時(shí)，對(duì)包含反向重復(fù)元件的插入DNA的篩選能夠提高對(duì)基因沉默有效的轉(zhuǎn)化事件的鑒定效率。在美國(guó)專(zhuān)利5,283，184(Jorgensen等)和美國(guó)專(zhuān)利5,231,020(Jorgensen等)中公開(kāi)了由帶有有義方向DNA的插入重組DNA構(gòu)建體產(chǎn)生的基因抑制。如Jorgensen等在MoLGen.Genet,207:471-477(1987)中所公開(kāi)的，在此類(lèi)有義構(gòu)建體通過(guò)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的植物中提供基因抑制的插入T-DNA，主要以反向重復(fù)結(jié)構(gòu)構(gòu)成。還可參見(jiàn)Stam等在ThePlantJournal,12:63-82(1997)和DeBuck等在PlantMol.Biol.46433-445(2001)的報(bào)道，他們利用分離法研究支持了Jorgensen的發(fā)現(xiàn)，即在許多事件中，基因沉默是由多聚的轉(zhuǎn)基因T-DNA介導(dǎo)的，其中這些T-DNA以反向重復(fù)布置。當(dāng)用簡(jiǎn)單的有義方向DNA構(gòu)建體進(jìn)行轉(zhuǎn)化時(shí)，對(duì)包含反向重復(fù)元件的插入DNA的篩選能夠提高基因沉默的效率。用兩套獨(dú)立的轉(zhuǎn)錄單位同時(shí)從有義方向DNA和反義方向DNA進(jìn)行RNA轉(zhuǎn)錄，也能有效地實(shí)施基因沉默，例如，Shewmaker等在美國(guó)專(zhuān)利5,107,065中公開(kāi)的，在其實(shí)施例1中，制備了具備有義和反義ara力基因的雙元載體。在國(guó)際公布說(shuō)明書(shū)WO99/53050號(hào)(Waterhouse等)中公開(kāi)了相似的構(gòu)建體。還可參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利6,326,193,其中將靶基因DNA與反向啟動(dòng)子操作性連接。植物中的基因抑制可以通過(guò)下述轉(zhuǎn)化構(gòu)建體來(lái)實(shí)現(xiàn)該構(gòu)建體能產(chǎn)生至少能沿其部分長(zhǎng)度形成雙鏈RNA的RNA。在EP0426195Al(Goldbach等)中公開(kāi)的植物基因抑制中，用于轉(zhuǎn)錄出發(fā)夾形RNA的重組DNA構(gòu)建體將對(duì)煙草斑跡枯萎病毒的抗性提供給轉(zhuǎn)基因植物。還可參見(jiàn)Sijen等，ThePlantCell,Vol.8,2277-2294(1996),其公開(kāi)了利用攜帶豇豆花葉病毒基因反向重復(fù)(反義接有義之后)的構(gòu)建體在轉(zhuǎn)基因植物中介導(dǎo)病毒抗性。還可參見(jiàn)國(guó)際公布說(shuō)明書(shū)98/53083號(hào)(Grierson等)和相關(guān)的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公布說(shuō)明書(shū)2003/0175965Al號(hào)(Lowe等)，其公開(kāi)了利用包含前接5'非翻譯區(qū)反向重復(fù)的基因編碼序列的雙鏈RNA構(gòu)建體進(jìn)行基因抑制。在國(guó)際7>布說(shuō)明書(shū)WO99/53050號(hào)(Waterhouse等)和國(guó)際公布說(shuō)明書(shū)WO99/49029號(hào)(Graham抑制的構(gòu)建體。還可參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公布說(shuō)明書(shū)2002/0048814Al號(hào)(Oeller),其中DNA構(gòu)建體被轉(zhuǎn)錄為帶有形成發(fā)夾的多聚(T)-多聚(A)尾的有義或反義RNA。還可參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公布說(shuō)明書(shū)2003/0018993Al號(hào)(Gutterson等)，其中在有義或反義DNA之后接NOS基因3'非翻譯區(qū)的反向重復(fù)。還可參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公布說(shuō)明書(shū)2003/0036197Al號(hào)(Glassman等)，其中用于減少革巴mRNA表達(dá)的RNA包含與耙mRNA有同源性的區(qū)段和具有與內(nèi)源RNA無(wú)關(guān)的互補(bǔ)RNA區(qū)的區(qū)段。在美國(guó)專(zhuān)利6,506,559(Fire等)中公開(kāi)了通過(guò)植物中產(chǎn)生雙鏈RNA來(lái)抑制基因表達(dá)，例如抑制取食植物的線蟲(chóng)中的基因表達(dá)。在美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)10/465,800(Fillatti)中公開(kāi)了在植物中使用的多基因抑制載體。通過(guò)表達(dá)包含與靶基因啟動(dòng)子DNA反向重復(fù)操作性連接的啟動(dòng)子的DNA構(gòu)建體，可實(shí)施轉(zhuǎn)錄抑制，如啟動(dòng)子反式抑制。Mette等在TheEMBOJournal,Vol.18,pp.241-148,(1999)和Mette等在TheEMBOJournal,Vol.19,pp.5194-5201-148,(2000)中公開(kāi)了可用于此類(lèi)通過(guò)啟動(dòng)子反式抑制介導(dǎo)的基因抑制的構(gòu)建體，上述兩篇文獻(xiàn)都在此引入作為參考。披露用于植物中基因抑制的材料和方法的所有上述的專(zhuān)利、申請(qǐng)和國(guó)際公布說(shuō)明書(shū)在此可1入作為參考。發(fā)明概述RNA的方法和重組DNA構(gòu)建體。在本方面的一個(gè)方面，用于抑制多個(gè)把基因的重組DNA構(gòu)建體從其5，至3'方向包含與反義方向DNA元件操作性連接的啟動(dòng)子元件和有義方向DNA元件，其中有義方向DNA元件比反義方向DNA元件短，而且從有義方向DNA轉(zhuǎn)錄的有義方向RNA與從反義方向DNA元件轉(zhuǎn)錄的反義方向RNA的5，最前端互補(bǔ)，因此所轉(zhuǎn)錄的RNA形成用于抑制多個(gè)靶基因的反義方向RNA環(huán)?？蓪⒂辛x方向DNA克隆作為反義方向DNA元件的5'最前端區(qū)段的反向重復(fù)。帶有此類(lèi)有義方向DNA的構(gòu)建體被轉(zhuǎn)錄為RNA,該RNA形成具有雙鏈RNA區(qū)段、在其末端閉合的反義方向RNA環(huán)，如圖1所示。為了形成反義方向RNA環(huán)，互補(bǔ)的DNA元件宜不大于反義方向DNA元件長(zhǎng)度的一半，優(yōu)選不大于反義方向DNA元件長(zhǎng)度的三分之一，如，不大于反義方向DNA元件長(zhǎng)度的四分之一。重組DNA元件的總體長(zhǎng)度是可變的。諸如，反義方向DNA元件可以由500-5000個(gè)核苦酸構(gòu)成，而互補(bǔ)DNA元件可以由50-500個(gè)核苷酸構(gòu)成。在許多情況中，為了允許反義方向RNA環(huán)形成，反義反義轉(zhuǎn)錄單位可被設(shè)計(jì)用于抑制多個(gè)基因，其中DNA被排列為帶有兩個(gè)或多個(gè)來(lái)自不同待抑制靶基因的反義方向元件，反義方向元件之后接互補(bǔ)的、如與反義方向元件的5'最前端至少部分互補(bǔ)的有義方向元件。本發(fā)明還提供通過(guò)在植物細(xì)胞中提供可轉(zhuǎn)錄出反義RNA環(huán)的本發(fā)明重組DNA構(gòu)建體來(lái)抑制基因表達(dá)的方法。在本發(fā)明的其他方面，諸如用于向植物提供除增強(qiáng)氨基酸水平之外的其它性狀，待抑制的耙基因可以是植物基因、植物害蟲(chóng)基因、植物病原體基因或其組合。在本發(fā)明的構(gòu)建體、方法和植物中，待沉默的靶基因可以是天然基因或外源基因，或者是下述生物體的基因該生物體攝食或接觸其細(xì)胞中包含本發(fā)明的環(huán)形反義RNA的植物之組織。植物病原體包括病毒，如黃瓜花葉病毒；纟田菌，如斯氏歐文氏菌(5rvWm'aWem/W//)(玉米細(xì)菌性枯萎)；和真菌，如豆薯層銹菌CP/2io/worapac/j,/7z力)(大豆銹病真菌)。植物害蟲(chóng)包括線蟲(chóng)，如大豆胞嚢線蟲(chóng)和根結(jié)線蟲(chóng)；和各個(gè)目的昆蟲(chóng)，包括鱗翅目(Lepidoptera)(諸如歐洲玉米螟)、鞘翅目(Coleoptera)(諸如十一星瓜葉甲)和同翅目(Homoptera)(諸如蚜蟲(chóng))昆蟲(chóng)。附圖簡(jiǎn)述圖1是可用于本發(fā)明的產(chǎn)生反義方向RNA環(huán)的重組DNA構(gòu)建體的圖示說(shuō)明。圖2是顯示使用本發(fā)明構(gòu)建體產(chǎn)生的基因抑制的蛋白質(zhì)印跡分析。圖3顯示指示玉米醇溶蛋白含量的質(zhì)譜譜圖。圖4是用于本發(fā)明一個(gè)方面的載體構(gòu)建體設(shè)計(jì)的圖解。圖5所示為表明野生型種子和轉(zhuǎn)基因種子中玉米醇溶蛋白含量的質(zhì)譜譜圖。圖6說(shuō)明谷粒蛋白質(zhì)含量與其游離氨基酸水平的相關(guān)性。詳細(xì)描述SEQIDNO:l和SEQIDNO:2是重組DNA構(gòu)建體的核香酸序列，所迷構(gòu)建體用于在轉(zhuǎn)基因植物中轉(zhuǎn)錄出可形成抑制一個(gè)或多個(gè)基因的反義方向RNA環(huán)。有關(guān)那些構(gòu)建體元件的描述見(jiàn)表1和表2。在此使用的"互補(bǔ)"是指由于排列的核苷酸的互補(bǔ)性準(zhǔn)許C-G和A-T或A-U成鍵而能夠雜交的多核苷酸，諸如DNA的有義鏈和反義鏈，或RNA的自身互補(bǔ)鏈。在此使用的"載體"指能夠在宿主細(xì)胞中復(fù)制和/或另一DNA區(qū)段與其操作性連接而導(dǎo)致該連接片段復(fù)制的DNA分子。質(zhì)粒就是典型的載體。在此使用的"轉(zhuǎn)基因"生物體，諸如植物或種子，是其基因組已經(jīng)由于含外源遺傳物質(zhì)或天然遺傳物質(zhì)的額外拷貝的重組DNA的摻入而纟皮改變，i者io由于該生物體或;^且先生物體的壽爭(zhēng)^匕或重組而被改變的生物體。轉(zhuǎn)基因植物包括通過(guò)轉(zhuǎn)化法得到的原初植抹的子代植抹，包括用野生型植株或其它轉(zhuǎn)基因植株培育轉(zhuǎn)基因植抹的子代。在本發(fā)明中特別關(guān)注的作物包括玉米、大豆、棉花、canola(油菜)、小麥、水稻、向日葵、紅花和亞麻，但并不僅限于這些。關(guān)注的其它作物包括可生產(chǎn)蔬菜、水果、草和木的植物。用于植物轉(zhuǎn)化的重組DNA構(gòu)建體本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地制備用于在轉(zhuǎn)基因植物中產(chǎn)生環(huán)狀反義RNA基因抑制劑的重組DNA構(gòu)建體。通常，此類(lèi)DNA構(gòu)建體至少包含啟動(dòng)子，其在待抑制靶組織中有活性；可轉(zhuǎn)錄DNA元件，其具有與待抑制靶基因的核苷酸序列互補(bǔ)的序列；和轉(zhuǎn)錄終止元件。所拷貝的、用于基因抑制構(gòu)建體中可轉(zhuǎn)錄DNA的靶基因元件，可以是啟動(dòng)子元件、內(nèi)含子元件、外顯子元件、5'UTR元件或3，UTR元件。雖然從待抑制靶基因序列拷貝的DNA的最小長(zhǎng)度被認(rèn)為是約21或23個(gè)核苦酸，但優(yōu)選較大的核苷酸區(qū)段，如可長(zhǎng)至革巴基因的全長(zhǎng)。任一DNA區(qū)段的有效長(zhǎng)度是在50-5000個(gè)核香酸范圍內(nèi)，比方說(shuō)長(zhǎng)度為500-5000個(gè)核苷酸的反義方向DNA,而互補(bǔ)DNA元件的長(zhǎng)度可以是50-500個(gè)核苷酸或更多。DNA元件可以包括基因的多個(gè)部分，諸如與UTR、外顯子和內(nèi)含子中相鄰的或分隔的基因元件互補(bǔ)的核苷酸。根據(jù)需要，此類(lèi)構(gòu)建體還可包含其它調(diào)節(jié)元件和編碼轉(zhuǎn)運(yùn)肽、信號(hào)肽、選擇標(biāo)記和可篩選標(biāo)記的DNA。參照?qǐng)D1,其圖解顯示了重組DNA構(gòu)建體，它含有啟動(dòng)子元件、反義方向DNA元件(表示為"a/sDNA")、互補(bǔ)的有義方向DNA元件(表示為"sDNA")和提供多聚腺苷酸信號(hào)和位點(diǎn)的DNA(表示為"polyA位點(diǎn)")。該DNA構(gòu)建體可轉(zhuǎn)錄出含有反義方向RNA區(qū)段和與反義方向RNA區(qū)段之5'最前端互補(bǔ)的互補(bǔ)RNA區(qū)段的RNA。反義方向RNA的5'末端和3，末端能自我雜交，形成閉合反義方向RNA環(huán)的雙鏈RNA區(qū)段。例如，如果被轉(zhuǎn)錄的反義方向DNA鏈的5，最前端核苷酸序列是5'-CGGCATA-,則從提供反義元件的源DNA克隆來(lái)的反向重復(fù)DNA的被轉(zhuǎn)錄鏈的3'最前端序列將是-TATGCCG-3，。由于這些序列，反義方向RNA環(huán)將從dsRNA區(qū)段的一邊展延，如5'誦GCCGUAU---------3'國(guó)CGGCAUA---------反義方向DNA和其自身互補(bǔ)DNA可以是相鄰的，或被載體DNA分隔，如被分隔載體裝配用限制性位點(diǎn)的至多約100個(gè)核苷酸左右的載體DNA所分隔。用市售材料和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法可以進(jìn)行重組DNA構(gòu)建體的組裝。一種用于組建轉(zhuǎn)化用DNA構(gòu)建體和載體的有用技術(shù)是GATEWAYTM克隆技術(shù)(可以從InvitrogenLifeTechnologies獲得,Carlsbad,California),它利用來(lái)自X噬菌體載體構(gòu)建的整合酶油系統(tǒng)的位點(diǎn)特異性重組酶LR克隆反應(yīng)，取代了限制性核酸內(nèi)切酶和連接酶。該LR克隆反應(yīng)在美國(guó)專(zhuān)利5,888,732和6,277,608、美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)/^開(kāi)說(shuō)明書(shū)2001283529、2001282319和20020007051中公開(kāi)，所有上述文獻(xiàn)都在此引入作為參考。也由Invitrogen供應(yīng)的GATEWAYTM克隆技術(shù)使用手冊(cè)也對(duì)常規(guī)克隆任一所需DNA到含有可操作植物表達(dá)元件的載體中提供了簡(jiǎn)明的指導(dǎo)。Aslankhs,C.等在NucleicAcidsRes.,18，6069-6074,1990和Rashtchian，A.等在Biochem.,206,91-97,1992中公開(kāi)了可替代載體的構(gòu)建方法，其利用不依賴(lài)于連接的克隆技術(shù)，其中帶有5'單鏈末端和3'單鏈末端的DNA片段被連接到隨后能在體內(nèi)擴(kuò)增的所需載體中。大量的在植物細(xì)胞中有活性的啟動(dòng)子已在文獻(xiàn)中得到描述。這些括在根瘤土壤桿菌G4gra6artehwmrt/we/acz'e"。的腫瘤談導(dǎo)質(zhì)粒上攜帶的胭脂堿合成酶(nos)啟動(dòng)子和章魚(yú)堿合成酶(ocs)啟動(dòng)子、花椰菜花葉病毒啟動(dòng)子(caulimovirus),長(zhǎng)口花挪菜花葉病毒(cauliflowermosaicvirus)或玄參花葉病毒的啟動(dòng)子。舉例來(lái)說(shuō)，請(qǐng)參閱以下文獻(xiàn)美國(guó)專(zhuān)利5，322,938和5,858,742，其公開(kāi)了多種形式的衍生于花椰菜花葉病毒的組成型啟動(dòng)子(CaMV35S);美國(guó)專(zhuān)利5,378,619，其公開(kāi)了玄參花葉病毒(FMV)35S啟動(dòng)子；美國(guó)專(zhuān)利5,420,034,其公開(kāi)了油菜籽蛋白啟動(dòng)子；美國(guó)專(zhuān)利6,437,217,其公開(kāi)了玉米R(shí)S81啟動(dòng)子；美國(guó)專(zhuān)利5,641,876,其公開(kāi)了水稻肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子；美國(guó)專(zhuān)利6，426，446,其公開(kāi)了玉米R(shí)S324啟動(dòng)子；美國(guó)專(zhuān)利6,429,362，其公開(kāi)了玉米PR-1啟動(dòng)子；美國(guó)專(zhuān)利6,232,526，其/厶開(kāi)了玉米A3啟動(dòng)子；美國(guó)專(zhuān)利6,177,611,其公開(kāi)了組成型玉米啟動(dòng)子；美國(guó)專(zhuān)利6,433,252，其公開(kāi)了玉米L3油質(zhì)蛋白啟動(dòng)子；美國(guó)專(zhuān)利6,429,357,其公開(kāi)了水稻肌動(dòng)蛋白2啟動(dòng)子和內(nèi)含子；美國(guó)專(zhuān)利5,837,848，其公開(kāi)了根特異性啟動(dòng)子；美國(guó)專(zhuān)利6,084,089，其公開(kāi)了冷誘導(dǎo)型啟動(dòng)子；美國(guó)專(zhuān)利6,294，714,其公開(kāi)了光誘導(dǎo)型啟動(dòng)子；美國(guó)專(zhuān)利6,140，078，其公開(kāi)了鹽誘導(dǎo)型啟動(dòng)子；美國(guó)專(zhuān)利6,252,138,其公開(kāi)了病原體誘導(dǎo)型啟動(dòng)子；美國(guó)專(zhuān)利6,175,060,其公開(kāi)了磷缺乏誘導(dǎo)型啟動(dòng)子；美國(guó)專(zhuān)利6,635,806,其公開(kāi)了coixin啟動(dòng)子；U.S.2002/0192813Al，其公開(kāi)了可用于設(shè)計(jì)有效植物表達(dá)載體的5'、3'和內(nèi)含子元件；U.S.2004/0216189Al,其公開(kāi)了玉米葉綠體醛縮酶啟動(dòng)子；和U.S.2004/0123347Al,其公開(kāi)了水缺乏誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，所有這些文獻(xiàn)在此引入作為參考。這些啟動(dòng)子和大量其它的在植物細(xì)胞中有功能的啟動(dòng)子都是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，可用于本發(fā)明的重組多核苦酸中以在轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞中提供所需基因的表達(dá)。此外，這些啟動(dòng)子可經(jīng)過(guò)改變，以便含有多個(gè)"增強(qiáng)子序列"以有助于提高基因表達(dá)。這些增強(qiáng)子在本領(lǐng)域是已知的。通過(guò)包含具有這種構(gòu)建體的增強(qiáng)子序列，選定蛋白的表達(dá)可得以提高。這些增強(qiáng)子通常存在于在真核細(xì)胞中有功能的啟動(dòng)子的5'至轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)間，但是通常被插入到編碼序列的上游(5')或下游(3，)。在某些情況下，這些5'增強(qiáng)子元件是內(nèi)含子。作為增強(qiáng)子特別有用的是水稻肌動(dòng)蛋白1基因(見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利5,641,876)和氷稻肌動(dòng)蛋白2基因的5'內(nèi)含子、玉米葉綠體脫氫酶基因內(nèi)含子、玉米熱休克蛋白70基因內(nèi)含子(美國(guó)專(zhuān)利5,593,874)和玉米皺縮1基因。在本發(fā)明的其它方面，為了使種子組成得到改善，需要在植物種子組織中充分表達(dá)。用于種子組成修飾的示例性啟動(dòng)子包括來(lái)源于種子基因的啟動(dòng)子，如油菜籽蛋白(U.S.5,420,034)、玉米L3油質(zhì)蛋白(U.S.6,433,252)、玉米醇溶蛋白Z27(Russell等(1997)jy頻ge"/cto.6(2):157-166)、球蛋白1(Belanger等(簡(jiǎn))129:863-872)、谷蛋白1(Russell(1997)同上述)和過(guò)氧化物氧還蛋白抗氧化劑(Perl)(Stacy等(1996)尸/awfMo/B/o/.31(6):1205-1216)。依據(jù)本發(fā)明制備的重組DNA構(gòu)建體通常包括3'元件，它通常包含多聚腺苷酸信號(hào)和位點(diǎn)，特別是當(dāng)該重組DNA用于蛋白表達(dá)以及基因抑制時(shí)。眾所周知的3'元件包括來(lái)自根瘤土壤桿菌基因的3'元件，如mw3'、加/3'、加r3'、3'、ocs3'、^73'，諸如/>開(kāi)于美國(guó)專(zhuān)利U.S.6,090,627中的元件，該文獻(xiàn)在此引入作為參考；來(lái)自植物基因的3'元件，如來(lái)自小麥(7>/"cwmcr^ev^m)熱休克蛋白17"、小麥泛蛋白基因、小麥果糖-l,6-二磷酸酶基因、水稻谷蛋白基因、水稻乳酸脫氬酶基因和水稻P-微管蛋白基因的3'元件，上述元件公開(kāi)于美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)說(shuō)明書(shū)2002/0192813Al中，該文獻(xiàn)在此1入作為參考；和豌豆(尸zramra"vwm)核酮糖二磷酸羧化酶基因(rZwJ)和來(lái)源于宿主植物基因的3'元件?；蛞种浦亟MDNA構(gòu)建體還可以與賦予農(nóng)學(xué)上關(guān)注的其它性狀的DNA疊加，后者包括提供除草劑抗性或抗蟲(chóng)性的DNA，如利用來(lái)自蘇云金芽孢桿菌CSacZ〃ws^z"n"ge"w力的基因提供抗鱗翅目(lepidopteran)、共翅目(coliopteran)、同翅目(homopteran)、半翅目(hemiopteran)和其它昆蟲(chóng)的抗性。對(duì)其抗性在植物中有用的除草劑包括草甘膦除草劑、膦絲菌素除草劑、oxynil除草劑、咪唑啉酮除草劑、二硝基苯胺除草劑、吡啶除草劑、磺酰脲除草劑、雙丙氨酰膦除草劑、氨磺酰除草劑和草丁磷除草劑。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠?qū)崿F(xiàn)提供疊加的性狀(參照美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)說(shuō)明書(shū)2003/0106096A1和2002/0112260A1、美國(guó)專(zhuān)利5,034,322、5,776,760、6,107,549和6，376,754);和昆蟲(chóng)/線蟲(chóng)/病毒抗性，可參考美國(guó)專(zhuān)利5，250，515、5,880,275、6,506,599、5,986,175和美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)說(shuō)明書(shū)2003/0150017Al。上述所有文獻(xiàn)在此引入作為參考。轉(zhuǎn)化方法用重組DNA轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的許多方法是本領(lǐng)域已知的，并可以用于本發(fā)明。對(duì)于植物轉(zhuǎn)化，兩種通常使用的方法是農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化和孩M立轟擊。微粒轟擊法在美國(guó)專(zhuān)利5,015,580(大豆)、5,550,318(玉米)、5，538,880(玉米)、5,914,451(大豆)、6,160,208(玉米)、6,399,861(玉米)和6,153,812(小麥)中有說(shuō)明，農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化在美國(guó)專(zhuān)利5，159，135(棉花)、5,824,877(大豆)、5,591,616(玉米)和6,384,301(大豆)中有描述，上述所有文獻(xiàn)在此引入作為參考。對(duì)于基于根瘤土壤桿菌的植物轉(zhuǎn)化系統(tǒng)而言，在轉(zhuǎn)化構(gòu)建體上存在的附加元件包括T-DNA左右邊界序列，以促進(jìn)重組多核苷酸摻入到植物基因組中。一般來(lái)說(shuō)，將重組DNA隨機(jī)地(即在非特異性位置)引入靶抹系的基因組是有效的。在特殊情況下，靶向重組DNA插入以達(dá)到位點(diǎn)特異性整合可能是有用的，諸如，用以取代基因組中現(xiàn)存的基因、使用植物基因組中現(xiàn)存的啟動(dòng)子、或在已知對(duì)基因表達(dá)有活性的預(yù)定位點(diǎn)插入重組多核香酸。現(xiàn)有的已知在植物中起作用的幾個(gè)位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)包括在美國(guó)專(zhuān)利4,959,317中描述的cre-lox和美國(guó)專(zhuān)利5,527，695中描述的FLP-FRT,這兩篇文獻(xiàn)都在此引入作為參考。本發(fā)明的轉(zhuǎn)化方法優(yōu)選在培養(yǎng)基上和受控環(huán)境中的組織培養(yǎng)物中實(shí)施。"培養(yǎng)基，，是指用于在體外，即在完整的活生物體之外，使細(xì)胞生長(zhǎng)的眾多營(yíng)養(yǎng)物的混合物。受體細(xì)胞靶包括但不受限于分生組織細(xì)胞、愈傷組織、未成熟胚和配子細(xì)胞如小孢子、花粉、精子和卵細(xì)胞。設(shè)想了任何能再生可育植抹的細(xì)胞都可用作受體細(xì)胞。愈傷組織可以由包括但不受限于未成熟胚、幼苗頂端分生組織、小孢子等等的組織源引發(fā)。能增殖為愈傷組織的細(xì)胞也是遺傳轉(zhuǎn)化用的受體細(xì)胞。本發(fā)明的制備轉(zhuǎn)基因植物的實(shí)際轉(zhuǎn)化方法和材料，諸如各種培養(yǎng)基和受體靶細(xì)胞、未成熟胚的轉(zhuǎn)化和隨后可育轉(zhuǎn)基因植物的再生，都在美國(guó)專(zhuān)利6，194,636和6,232,526中公開(kāi)，所述文獻(xiàn)在此引入作為參考?？蓮目捎霓D(zhuǎn)基因植物收獲轉(zhuǎn)基因植物的種子，并將其用于培育本發(fā)明轉(zhuǎn)化植物的后代世系，包括用于篩選農(nóng)學(xué)性狀增強(qiáng)的植物的雜交林系。除了用重組DNA直接轉(zhuǎn)化植物外，還可以通過(guò)將帶有重組DNA的第一植抹與無(wú)該DNA的第二植抹雜交來(lái)制備轉(zhuǎn)基因植物。例如，可將重組DNA導(dǎo)入適合轉(zhuǎn)化的第一林系以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物，該轉(zhuǎn)基因植物可與第二抹系雜交，使該重組DNA漸滲進(jìn)入第二抹系d含有能提供增強(qiáng)農(nóng)學(xué)性狀(如產(chǎn)量提高)的重組DNA的轉(zhuǎn)基因植物，可與含有賦予另一性狀(如除草劑抗性或抗蟲(chóng)性)的其它重組DNA的轉(zhuǎn)基因抹系進(jìn)行雜交，從而產(chǎn)生含有賦予兩種性狀的重組DNA的子代植抹。通常，在這種用于組合性狀的育種中，提供額外性狀的轉(zhuǎn)基因植物是雄性系，而攜帶基礎(chǔ)性狀的轉(zhuǎn)基因植物是雌性系。這種雜交的子代將發(fā)生分離，因而一些植株攜帶有兩個(gè)親本性狀的DNA，而一些植抹攜帶一個(gè)親本性狀的DNA;這些植抹可以用與親本重組DNA相關(guān)聯(lián)的標(biāo)記來(lái)鑒別。攜帶兩個(gè)親本性狀的DNA的子代植物可以與雌性親本系進(jìn)行多次回交，如通常6-8次，產(chǎn)生子代植物，它的基因型與一個(gè)原始轉(zhuǎn)基因親本系基本相同，但是其含有另一個(gè)轉(zhuǎn)基因親本系的重組DNA。在實(shí)施轉(zhuǎn)化時(shí)，在任一次轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中，通常將DNA僅導(dǎo)入少量的扭細(xì)胞中。標(biāo)記基因用于提供有效的系統(tǒng)，來(lái)鑒定由于接受并整合轉(zhuǎn)基因DNA構(gòu)建體到其基因組中而被穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。優(yōu)選的標(biāo)記基因提供賦予對(duì)選擇劑(如抗生素或除草劑)抗性的選擇性標(biāo)記。本發(fā)明的植物可對(duì)其有抗性的任一除草劑，都可用作選擇標(biāo)記試劑。使?jié)撛诘霓D(zhuǎn)化細(xì)胞暴露于該選擇劑。一般說(shuō)來(lái)，在存活細(xì)胞群體中將有賦予抗性的基因整合于其中并以足以允許細(xì)胞存活的水平表達(dá)的那些細(xì)胞。可對(duì)細(xì)胞進(jìn)一步測(cè)試以確認(rèn)外源DNA穩(wěn)定整合。常用素如卡那霉素和巴龍霉素("/^//)、潮霉素B(ap/2/K)和慶大霉素(aac3和mcC4)，除草劑如草丁磷(6ar或戶0和草甘膦(ara4或EPSPS)。這些可選擇標(biāo)記的實(shí)例在美國(guó)專(zhuān)利5,550,318、5,633,435、5，780,708和6,118,047中有說(shuō)明，所有上述文獻(xiàn)在此引入作為參考。還可使用能提供目測(cè)鑒定轉(zhuǎn)化子的篩選標(biāo)記，諸如表達(dá)有色或熒光蛋白質(zhì)如焚光素酶或綠色焚光蛋白(GFP)的基因，或者表達(dá)P-葡萄糖苷酶的基因或]3-葡糖醛酸酶基因(GUS),其各種顯色底物是已知的。能經(jīng)受得住接觸選擇劑的細(xì)胞，或在篩選測(cè)驗(yàn)中記錄為陽(yáng)性的細(xì)胞，可以在再生培養(yǎng)基中培養(yǎng)并成熟為植抹。在轉(zhuǎn)移至用于成熟的溫室或生長(zhǎng)室之前，發(fā)育中的小植株可以被轉(zhuǎn)移至植物生長(zhǎng)混合物，并經(jīng)健化，如在約85%相對(duì)濕度、600ppmC02和25-250微愛(ài)因斯坦n^s-1的光照的環(huán)境受控室中健化。在鑒定轉(zhuǎn)化體后，讓植物再生約6周至10個(gè)月，情況取決于起始組織。植株可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)植物育種法授粉，產(chǎn)生種子，如轉(zhuǎn)基因玉米通常使用自花授粉?？蓪?duì)該再生轉(zhuǎn)化植株或其子代種子或植物進(jìn)行重組DNA表達(dá)的測(cè)試和增強(qiáng)農(nóng)學(xué)性狀是否存在的篩選。轉(zhuǎn)基因植物和種子與對(duì)照植物比較，由本發(fā)明提供的轉(zhuǎn)基因植物種子發(fā)育產(chǎn)生具有增強(qiáng)性狀的轉(zhuǎn)基因植物。通過(guò)篩選轉(zhuǎn)化植林或子代種子中的增強(qiáng)性狀，鑒定帶有增強(qiáng)性狀植物的這類(lèi)種子。為保證效率，設(shè)計(jì)了一種篩選程序來(lái)評(píng)價(jià)含有重組DNA的多重轉(zhuǎn)基因植物(事件)，如來(lái)自2-20次或更多次轉(zhuǎn)基因事件的多重體植物。由此處提供的轉(zhuǎn)基因種子發(fā)育的轉(zhuǎn)基因植物顯示出引起產(chǎn)量增加的改善的農(nóng)學(xué)性狀或其它增加^f直物價(jià)值的性狀，例如種子品質(zhì)改善。特別感興趣的是是由于以下原因而產(chǎn)量提高的植物植物生長(zhǎng)和發(fā)育改善、脅迫抗性、種子發(fā)育改善、光應(yīng)答反應(yīng)提高、花粉發(fā)育改善或者碳和/或氮代謝改善。對(duì)于能產(chǎn)生種子和子代植物的可育轉(zhuǎn)基因植物而言能經(jīng)受得住的許多轉(zhuǎn)基因事件，不會(huì)顯示出增強(qiáng)的農(nóng)學(xué)性狀。必需進(jìn)行篩選，以通過(guò)各種測(cè)定方法評(píng)估該性狀以檢測(cè)出增強(qiáng)的農(nóng)學(xué)性狀，從本文描述的轉(zhuǎn)化植物群體中鑒別帶有增強(qiáng)農(nóng)學(xué)性狀的轉(zhuǎn)基因植物。這些測(cè)定方法也可以采取許多方式，包括但不受限于用于檢測(cè)植物在化學(xué)組成、生物量、生理特性、形態(tài)結(jié)構(gòu)變化的分析。實(shí)施例1本實(shí)施例說(shuō)明轉(zhuǎn)化載體的制備，該轉(zhuǎn)化載體可用于將本發(fā)明的重組DNA構(gòu)建體插入到轉(zhuǎn)基因植物中來(lái)實(shí)踐本發(fā)明的方法。LKB/SDH基因編碼賴(lài)氨酸酮戊二酸還原酶(LKR)和酵母氨酸脫氫酶(SDH)的前體蛋白，這兩種酶存在于賴(lài)氨酸分解代謝途徑中。對(duì)LKR的抑制表現(xiàn)在賴(lài)氨酸含量的改變，如含量增加。通過(guò)在植物中表達(dá)重組DNA構(gòu)建體可實(shí)施LKR抑制，其中該重組DNA構(gòu)建體能產(chǎn)生從反義方向LKRDNA和有義方向LKRDNA轉(zhuǎn)錄的、形成反義方向RNA環(huán)的穩(wěn)定化反義RNA。制備在來(lái)自根瘤土壤桿菌的左右邊界間含有兩個(gè)轉(zhuǎn)錄單位的轉(zhuǎn)化載體。一個(gè)用于標(biāo)記的轉(zhuǎn)錄單位包含(a)水稻肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子和水稻肌動(dòng)蛋白內(nèi)含子的DNA,(b)來(lái)自擬南芥(aRABIDOPSIS)EPSPS的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的DNA,(c)根瘤土壤桿菌arOa(草甘膦抗性標(biāo)記)的DNA，和(d)根瘤土壤桿菌NOSS終止子的DNA，另一個(gè)用于LKR基因抑制的轉(zhuǎn)錄單位包含(a)玉蜀黍(ZeaMAYS)GLBI啟動(dòng)子的DNA,(b)玉蜀黍ADHI內(nèi)含子的DNA,(c)玉蜀黍LKR的反義方向DNA片段，(d)玉蜀黍LKR的有義方向DNA片段，和(e)玉蜀黍GLBI終止子的DNA。SEQIDNO:l是包含上面描述的標(biāo)記和基因抑制元件的轉(zhuǎn)化載體的DNA序列。有關(guān)SEQIDNO:l中所含該轉(zhuǎn)化載體元件的描述見(jiàn)下表1。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>用以表l中所列元件制備的載體轉(zhuǎn)化玉米植物組織。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化，得到了轉(zhuǎn)基因玉米植抹。培育來(lái)自兩個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)基因插入事件的轉(zhuǎn)基因植物，產(chǎn)生Fl代種子。分析來(lái)自每一事件的六粒成熟種子以確定轉(zhuǎn)化和ZXR抑制是否成功。切開(kāi)成熟的轉(zhuǎn)基因種子以提取蛋白質(zhì)并用蛋白質(zhì)印跡分析法進(jìn)行分析。參見(jiàn)圖2,與野生型比較，來(lái)自其中一個(gè)事件的種子顯示/XA沒(méi)有減少；而來(lái)自另一事件的種子顯示出分離(l:l半合型:野生型)，因?yàn)榕c野生型比較，六粒種子中的三粒顯示出ZXR顯著減少。實(shí)施例2本實(shí)施例說(shuō)明可用于將本發(fā)明的重組DNA構(gòu)建體插入到轉(zhuǎn)基因植物中而實(shí)施本發(fā)明方法的寬范圍的實(shí)施方案。用以下DNA元件制備轉(zhuǎn)化載體，其中(a)"pGcx"是指來(lái)源于Co/義/ac/7wa-乂0Z7/的y畫(huà)coixin基因的啟動(dòng)子DNA;(b)"pZ27"是指來(lái)源于玉蜀黍y-玉米醇溶蛋白基因的啟動(dòng)子DNA;(c)"pZ27t"是指在pZ27的3'區(qū)域有59個(gè)核苷酸的前導(dǎo)序列缺失的啟動(dòng)子DNA;(d)"Z19as，，是指來(lái)自玉蜀黍19千道爾頓a-玉米醇溶蛋白基因之編碼序列的351個(gè)核苦酸反義方向區(qū)段的DNA;(e)"Z19s，，是指來(lái)自玉蜀黍19千道爾頓a-玉米醇溶蛋白基因之編碼序列的351個(gè)核苷酸有義方向區(qū)段的DNA,是Z19as的反向重復(fù)；(f)"Z22as"是指來(lái)自玉蜀黍22千道爾頓a-玉米醇溶蛋白基因之編碼序列的789個(gè)核苷酸反義方向區(qū)段的DNA;(g)"Z22asL"是指來(lái)自玉蜀黍22千道爾頓a-玉米醇溶蛋白基因之編碼序列的785個(gè)核苷酸反義方向區(qū)段的DNA;(h)"Z22asSI"是指來(lái)自玉蜀黍22千道爾頓a-玉米醇溶蛋白基因之編碼序列的789個(gè)核苷酸反義方向區(qū)段的DNA,其含有在非配對(duì)區(qū)域插入的來(lái)自玉蜀黍GB1基因內(nèi)含子3的長(zhǎng)520個(gè)核苷酸的可剪接內(nèi)含子；(i)"Z22s，，是指來(lái)自玉蜀黍22千道爾頓a-玉米醇溶蛋白基因之編碼序列的289個(gè)核苷酸有義方向區(qū)段的DNA;是Z22as5'末端的反向重復(fù)；和(j)"TE9"是指來(lái)自豌豆(Pisumsativum)RbcS2基因的有義方向多聚腺核苦酸信號(hào)和位點(diǎn)的DNA。參見(jiàn)表2和SEQIDNO:2，除了用包含下圖所示元件的轉(zhuǎn)錄單位取代用于丄X7基因抑制的轉(zhuǎn)錄單位外，使用實(shí)施例1中的方法制備了包含"構(gòu)建體2a"的轉(zhuǎn)化載體"構(gòu)建體2a，，pZ27-Z19as-Z22asL-Z22s-Z19s-TE9表2SEQEDNO:2的^J^DNA區(qū)段的注釋1-357根瘤土壤桿菌右邊界376-1744水稻肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子和水稻肌動(dòng)蛋白內(nèi)含子的DNA1784-2011根瘤土壤桿菌EPSPS葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的DNA2012-3379才艮瘤土壤桿菌"w力(草甘膦抗性標(biāo)記)的DNA3395-3647才艮瘤土壤桿菌iVOS終止子的DNA3479-4391豌豆A6c^終止子的DNA4398-4748Z19s的DNA4755-5043Z22s的DNA5050-5835Z22asL的DNA5842-6192Z19as的DNA6204-7305玉蜀黍Z27啟動(dòng)子的DNA7353-7794根瘤土壤桿菌左邊界轉(zhuǎn)化玉米愈傷組織，選擇有單拷貝轉(zhuǎn)化載體的事件以培育為植抹。在29個(gè)單拷貝事件中，有26個(gè)培育出的植株的種子顯示出l9千道爾頓a-玉米醇溶蛋白和22千道爾頓a-玉米醇溶蛋白顯著減少。使用表3所示元件，用類(lèi)似方法制備了其它的轉(zhuǎn)化載體。表3構(gòu)建體2blpGcx-Z19as-Z22asSI-Z22s-Z19s-TE9構(gòu)建體2b2*pGcx-Z19as國(guó)Z22asSI-Z22s-ZI9s-TE9構(gòu)建體2cpZ27-Z19as-Z22asSI-Z22s-Z19s-TE9構(gòu)建體2dPZ27t-Z19as-Z22asSI-Z22s-Z19s-TE9構(gòu)建體2ePZ27-Z19as-Z22asL-Z19s-TE9*構(gòu)建體2b2被插入到還包含有用于表達(dá)另一個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄單位的轉(zhuǎn)化載體中，在該轉(zhuǎn)錄單位中具有鄰接pGcx的啟動(dòng)子。在表4中報(bào)告了從單拷貝事件培育的植抹所產(chǎn)生的種子中a-玉米醇溶蛋白被抑制的效率，表中報(bào)告了與所測(cè)試的每一種構(gòu)建體產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因事件總數(shù)目相比a-玉米醇溶蛋白減少的轉(zhuǎn)基因事件的數(shù)目。玉米醇溶蛋白減少的表型可以通過(guò)MALDI-TOFMS(基質(zhì)輔助激光解析飛行時(shí)間質(zhì)譜)分析來(lái)MJ察。圖3是證明玉米醇溶蛋白減少的典型的i普?qǐng)D。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>實(shí)施例3本實(shí)施例說(shuō)明在帶有構(gòu)建體2a(pMON"566;表2和圖4A)和構(gòu)建體2e(pMON73566;表3、表5和圖4B)的轉(zhuǎn)基因植物中玉米醇溶蛋白減少以及由從單拷貝事件培育的植抹所得的谷粒的油脂、蛋白質(zhì)和氨基酸分布型，如表4所才良告的。參見(jiàn)表5和SEQIDNO:2，除了用包含下圖所示元件的轉(zhuǎn)錄單位取代用于LKR基因抑制的轉(zhuǎn)錄單位外，使用實(shí)施例1中的方法制備了包含"構(gòu)建體2e"的轉(zhuǎn)化載體"構(gòu)建體2e，，PZ27-Zl9as-Z22asL-Zl9s-TE9表5<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>轉(zhuǎn)化玉米未成熟胚，選擇有單拷貝轉(zhuǎn)化載體的事件以培育為植抹。在14個(gè)單拷貝事件中，有2個(gè)培育出的植抹的種子顯示出19千道爾頓a-玉米醇溶蛋白和22千道爾頓a-玉米醇溶蛋白兩者都顯著減少(表4)。玉米醇溶蛋白減少在帶有pMON73567(其含有針對(duì)19kD和22kDa-玉米醇溶蛋白兩者基因序列的dsRNA)的轉(zhuǎn)基因植物中，29抹中有26株顯示出19kD和22kDa-玉米醇溶蛋白兩者的積蓄量都減少(表4，構(gòu)建體2a;圖4A;圖5B)。另外，在帶有pMON73566(其含有僅針對(duì)19kDa-玉米醇溶蛋白基因序列的dsRNA，而將22kDa-玉米醇溶蛋白基因序列用作所述環(huán))的轉(zhuǎn)基因植物中，14抹中有2林顯示出19kD和22kDa-玉米醇溶蛋白兩者的積蓄量都減少(表4，構(gòu)建體2e;圖4B;圖5B)。IO抹其它的pMON73566事件大多表現(xiàn)出19kDa-玉米醇溶蛋白減少(表4,構(gòu)建體2e;圖4B;圖5C)。從每種構(gòu)建體挑選出2個(gè)代表性事件用于進(jìn)行到下一世代，以收集純合玉米穗用于組成分析。選擇了包含構(gòu)建體pMON73567的事件M80442和M82186以及包含構(gòu)建體pMON73566的事件M80780和M80791。M80442、M82186和M80791表現(xiàn)出19kD和22kDa-玉米醇溶蛋白兩者都減少，而M80780只表現(xiàn)出19kDa-玉米醇溶蛋白減少。含油量將來(lái)自2種減少玉米醇溶蛋白的構(gòu)建體pMON73566和pMON73567的4個(gè)事件(M80442、M82186、M80780和M80791)種植在大田，通過(guò)分子測(cè)定法檢測(cè)接合性。利用濕法化學(xué)油提取法測(cè)定了純合轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性玉米穗和對(duì)照玉米穗的谷粒中的油脂。稱(chēng)量約100mg研碎的樣品，置于半填充砂的11ml壓力池中。再加入額外的砂將池填滿，將一張濾紙放在頂部，用螺旋帽蓋上該池。然后按月g廠商的方案,將池置于theDionexAcceleratedSolventExtractor(Dionex，Sunnyvale,CA)的圓盤(pán)傳送帶上。用石油醚在1000psig(磅每平方英寸表壓)和105。C下經(jīng)過(guò)3個(gè)提取步驟進(jìn)行油脂的提取。將最終提取產(chǎn)物加到預(yù)先稱(chēng)量過(guò)的小瓶中。在氮?dú)饬骰蚩諝饬飨掠?7。C蒸發(fā)溶劑2小時(shí)，然后稱(chēng)量小瓶。樣品含油量的分析一式三份進(jìn)行。對(duì)照谷粒的含油量平均為3.8%(表6)。轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性谷粒的平均含油量范圍從4.0%至5.2%。所有4個(gè)轉(zhuǎn)基因事件種子的平均含油量呈現(xiàn)比野生型植物種子的平均含油量有所增加；M82186事件的含油量增加被認(rèn)為是統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>表6,油脂、蛋白質(zhì)和淀粉含量的計(jì)算是基于干物質(zhì)。除油脂外，每個(gè)玉米穗的堆積谷粒(bulkedkemels)的近似含量用近紅外線透射(NIT)分析。b含油量是用濕化學(xué)法得到。粗體數(shù)字表示用Dunnett氏檢驗(yàn)與LH244數(shù)字有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異((1=0.05)。a數(shù)據(jù)是平均值士標(biāo)準(zhǔn)差。。大小的測(cè)量是以克計(jì)算的ioo顆谷粒的重量。氨基酸分布型用耙向19kDot-玉米醇溶蛋白的反義構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物，展現(xiàn)出成熟玉米種子中賴(lài)氨酸含量增加高至35%(Huang等，2004;Huang等，200》。在包含耙向19kD和22kDa-玉米醇溶蛋白兩者的pMON73567和pMON73566構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因植物中，賴(lài)氨酸含量的增加明顯更大。如表7所示，在所分析的事件中，在M80780中觀察到賴(lài)氨酸含量增加最少，為66%((4035ppm轉(zhuǎn)基因-2"8ppm野生型)/2438ppm野生型)，在M80791中發(fā)現(xiàn)賴(lài)氨酸含量增加最多，為105%((5003ppm轉(zhuǎn)基因-2438ppm野生型)/2438ppm野生型)。相似地，與野生型LH244比較，轉(zhuǎn)基因植物的色氨酸含量高得多(表7)。表7研碎谷粒的總氨基酸分析<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>表7，樣品是各個(gè)玉米穗堆積谷粒的研碎物。a數(shù)據(jù)(ppm)是玉米穗的平均值，用事件士標(biāo)準(zhǔn)差表示。測(cè)量了每一個(gè)事件的4個(gè)同源玉米穗。這些數(shù)據(jù)以表6中所測(cè)量的未扣除水份的蛋白質(zhì)的百分比表示。粗體數(shù)字表示用Dunnett氏檢驗(yàn)與LH244數(shù)字有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(a=0.05)。Asx,天冬氨酸和天冬酰胺；Gk,谷氨酸和谷酰胺。在于這些轉(zhuǎn)基因植物種子中顯示出顯著增加的游離氨基酸中，有天冬氨酸、天冬酰胺和谷氨酸(表8)。，業(yè)已表明，這些游離氨基酸的積累量增加當(dāng)CordapA存在時(shí)能增強(qiáng)賴(lài)氨酸生物合成(Huang等2005;Monsanto專(zhuān)利申請(qǐng)11/077089,于2005年3月10日提交)。表8<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>表8,樣品是各個(gè)玉米穗堆積谷粒的研碎物。a數(shù)據(jù)(ppm)是玉米穂的平均值，用事件士標(biāo)準(zhǔn)差表示。測(cè)量了每一個(gè)事件的4個(gè)同源玉米穗。粗體數(shù)字表示用Dunnett氏檢驗(yàn)與LH244數(shù)字有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(a=0.05)。蛋白質(zhì)含量認(rèn)為天冬酰胺合成酶的組成型表達(dá)通過(guò)將游離氨基酸通量從營(yíng)養(yǎng)組織供應(yīng)到發(fā)育的玉米穗中，增加玉米種子中的蛋白質(zhì)含量。這些玉米醇溶蛋白降低系不僅游離氨基酸水平提高(表8),而且其蛋白質(zhì)積累量也與游離氨基酸的水平成比例(表6)。這些結(jié)果提示，將玉米醇溶蛋白降低和天冬酰胺合成酶表達(dá)結(jié)合可能有協(xié)同效應(yīng)，這可能導(dǎo)致玉米蛋白質(zhì)的質(zhì)和量?jī)烧叨嫉玫礁纳啤１景l(fā)明設(shè)想了應(yīng)用來(lái)自其它玉米醇溶蛋白(包括但不限于19kD和22kDa-玉米醇溶蛋白、16kD和27kDy-玉米醇溶蛋白、10kD5-玉米醇溶蛋白和15kD(3-玉未醇溶蛋白中的其它成員)的反義方向DNA元件和有義方向DNA元件，作為用于抑制多于一個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄或者與這些基因相應(yīng)的mRNA積累從而阻止這些轉(zhuǎn)錄物翻譯為蛋白質(zhì)的方法。特別是，設(shè)想的a-玉米醇溶蛋白包括在19kD大小范圍的所有變異體和在22kD大小范圍的所有變異體。的指示進(jìn)行制造和使用，而無(wú)需過(guò)多的實(shí)驗(yàn)。雖然本發(fā)明的材料和方法是以優(yōu)選實(shí)施方案和說(shuō)明性實(shí)施例來(lái)描述，但是對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，顯然在不偏離本發(fā)明的理念、精神和范圍的情況下，可對(duì)本文所述的材料和方法應(yīng)用變體。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的發(fā)明的精神、范圍和理念內(nèi)權(quán)利要求1.用于抑制多個(gè)玉米醇溶蛋白靶基因的重組DNA構(gòu)建體，其以5′至3′方向包含啟動(dòng)子元件，其與來(lái)自多個(gè)玉米醇溶蛋白靶基因的多個(gè)反義方向DNA元件操作性連接；反義方向DNA元件，其以5′至3′方向命名為元件1、元件2；和來(lái)自多個(gè)玉米醇溶蛋白靶基因的多個(gè)有義方向DNA元件，其以5′至3′方向命名為元件3、元件4；其中反義方向DNA元件2在其3′端至少有一部分序列與其自身或與有義方向DNA元件3不互補(bǔ)，并且其中由有義方向DNA元件轉(zhuǎn)錄的有義方向RNA與由反義方向DNA元件轉(zhuǎn)錄的反義方向RNA元件的5′最末端互補(bǔ)。2.權(quán)利要求1中所述的重組DNA構(gòu)建體，其中反義方向DNA元件1和2來(lái)自兩個(gè)不同的待抑制耙基因，有義方向DNA元件3和4自兩個(gè)不同的待抑制靶基因。3.權(quán)利要求1中所述的重組DNA構(gòu)建體，其中反義方向DNA元件1來(lái)自待抑制的19kDa-玉米醇溶蛋白靶基因，反義方向DNA元件2來(lái)自待抑制的22kDa-玉米醇溶蛋白靶基因，有義方向DNA元件3來(lái)自待抑制的22kDa-玉米醇溶蛋白靶基因，并且比反義方向DNA元件2短而且只與元件2的5'末端互補(bǔ)，有義方向DNA元件4來(lái)自待抑制的19kDa-玉米醇i^蛋白靶基因而且與元件15，末端的至少一部分序列互補(bǔ)。4.權(quán)利要求1中所述的重組DNA構(gòu)建體，其中多于1個(gè)玉米醇溶蛋白靶基因選自19kD和22kDa-玉米醇溶蛋白、16kD和27kDy-玉米醇溶蛋白、10kD5-玉米醇溶蛋白和15kDP-玉米醇溶蛋白。5.用于抑制多于1個(gè)玉米醇溶蛋白靶基因的重組DNA構(gòu)建體，其以5'至3'方向包含啟動(dòng)子元件，其與來(lái)自多于1個(gè)玉米醇溶蛋白靶基因的多于1個(gè)反義方向DNA元件操作性連接；反義方向DNA元件，其以5'至3'方向命名為元件1、元件2;和來(lái)自至少一個(gè)玉米醇溶蛋白靶基因的至少一個(gè)反義方向DNA元件，命名為元件3;其中反義方向DNA元件2在其3'端至少有一部分序列與其自身或與有義方向DNA元件3不互補(bǔ)，并且由有義方向DNA元件轉(zhuǎn)錄的有義方向RNA與由反義方向DNA元件轉(zhuǎn)錄的反義方向RNA的5'最末端互補(bǔ)。6.權(quán)利要求5中所述的重組DNA構(gòu)建體，其中反義方向DNA元件1和2來(lái)自兩個(gè)待抑制靶基因，有義方向DNA元件3來(lái)自待抑制靶基因。7.權(quán)利要求5中所述的重組DNA構(gòu)建體，其中反義方向DNA元件1來(lái)自待抑制的19kDa-玉米醇溶蛋白靶基因，反義方向DNA元件2來(lái)自待抑制的22kDa-玉米醇溶蛋白靶基因，有義方向DNA元件3來(lái)自待抑制的19kDa-玉米醇溶蛋白靶基因。8.權(quán)利要求5中所述的重組DNA構(gòu)建體，其中多于1個(gè)玉米醇溶蛋白靶基因選自19kD和22kDa-玉米醇溶蛋白、16kD和27kD^玉米醇溶蛋白、10kD5-玉米醇溶蛋白和15kDp-玉米醇溶蛋白，其中至少1個(gè)玉米醇溶蛋白靶基因選自19kD和22kDa-玉米醇溶蛋白、16kD和27kD，玉米醇溶蛋白、10kD5-玉米醇溶蛋白和15kD|3-玉米醇溶蛋白。9.具有增強(qiáng)的賴(lài)氨酸、增強(qiáng)的油脂和增強(qiáng)的色氨酸中至少一種的玉米種子的制備方法，包括以下步驟a)用用于抑制多于1個(gè)玉米醇溶蛋白靶基因的權(quán)利要求1或權(quán)利要求4的重組DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞；和b)將植物細(xì)胞再生成為可育的轉(zhuǎn)基因植抹，其中該植株在其基因組中包含該構(gòu)建體；和c)從植林收荻種子，其中該種子相對(duì)于未用該構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的同一品種的種子而言，具有增強(qiáng)的賴(lài)氨酸、增強(qiáng)的油脂和增強(qiáng)的色氨酸中的至少一種。10.具有增強(qiáng)的賴(lài)氨酸、增強(qiáng)的油脂和增強(qiáng)的色氨酸中至少一種的玉米種子的制備方法，包括以下步驟d)用用于抑制多于1個(gè)玉米醇溶蛋白靶基因的權(quán)利要求5或權(quán)利要求8的重組DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞；和e)將植物細(xì)胞再生成為可育的轉(zhuǎn)基因植抹，其中該植抹在其基因組中包含該構(gòu)建體；和f)從植抹收獲種子，其中該種子相對(duì)于未用該構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的同一品種的種子而言，具有增強(qiáng)的賴(lài)氨酸、增強(qiáng)的油脂和增強(qiáng)的色氨酸中的至少一種。11.轉(zhuǎn)基因植物，其在基因組中含有用于抑制多于1個(gè)玉米醇溶蛋白靶基因的權(quán)利要求1或權(quán)利要求4的DNA構(gòu)建體；12.從權(quán)利要求11的植物中收獲的種子。13.從權(quán)利要求11的植物中收獲的種子，其中有義方向DNA元件來(lái)自兩個(gè)待抑制靶基因，反義方向DNA元件來(lái)自兩個(gè)待抑制靶基因。14.權(quán)利要求12的種子的加工產(chǎn)品，其中產(chǎn)品是飼料、膳食或經(jīng)部分純化的蛋白質(zhì)組合物。15.轉(zhuǎn)基因植物，其在基因組中含有用于抑制多于1個(gè)玉米醇溶蛋白把基因的權(quán)利要求5或權(quán)利要求8的DNA構(gòu)建體。16.從權(quán)利要求15的植物中收獲的種子。17.從權(quán)利要求15的植物中收獲的種子，其中有義方向DNA元件來(lái)自兩個(gè)待抑制耙基因，反義方向DNA元件來(lái)自兩個(gè)待抑制靶基因。18.權(quán)利要求16的種子的加工產(chǎn)品，其中產(chǎn)品是飼料、膳食或經(jīng)部分純化的蛋白質(zhì)組合物。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了氨基酸水平提升的轉(zhuǎn)基因玉米種子、用于產(chǎn)生反義RNA抑制環(huán)的重組DNA構(gòu)建體以及這種構(gòu)建體和表達(dá)反義RNA抑制環(huán)的轉(zhuǎn)基因植物的制備和使用方法。文檔編號(hào)C12N15/66GK101128588SQ200580034856公開(kāi)日2008年2月20日申請(qǐng)日期2005年8月11日優(yōu)先權(quán)日2004年8月11日發(fā)明者M(jìn)·H·呂蒂,T·馬爾瓦,黃士杰申請(qǐng)人:孟山都技術(shù)有限公司