專利名稱：酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于飼料添加劑的酶領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及可用于增強(qiáng)食物和動物飼料中磷酸酯消化的肌醇六磷酸酶。
背景技術(shù)：
和現(xiàn)有技術(shù)肌醇六磷酸(phytate)為谷物和豆類中磷的主要存儲形式。然而，單胃動物如豬、家禽和魚不能代謝或吸收肌醇六磷酸(或植酸(phytic acid))，并且因此將其排泄，導(dǎo)致家畜高產(chǎn)區(qū)的磷污染。而且，肌醇六磷酸也通過螯合金屬制劑如鈣、銅和鋅而在單胃動物中作為抗?fàn)I養(yǎng)劑。
為了提供給這些動物生長和健康足夠的磷酸酯，向其飲食中添加無機(jī)磷酸酯。這種添加是昂貴的，并且進(jìn)一步增加污染問題。
通過肌醇六磷酸酶的作用，肌醇六磷酸通常由其水解，而產(chǎn)生低級肌醇磷酸酯和無機(jī)磷酸酯。肌醇六磷酸酶可用作動物飼料的添加劑，在其中改善動物對有機(jī)磷的利用率，并且減少環(huán)境的磷酸鹽(酯)(phosphate)污染(Wodzinski RJ，Ullah AH.Adv Appl Microbiol.42，263-302(1996))。
許多真菌(Wyss M.等.Appl.Environ.Microbiol.65(2)，367-373(1999)Berka R.M.等.Appl.Environ.Microbiol.64(11)，4423-4427(1998)；Lassen S.等.Appl.Environ.Microbiol.67(10)，4701-4707(2001))和細(xì)菌(Greiner R.等.Arch.Biochem.Biophys.303(1)，107-113(1993)；Kerovuo等.Appl.Environ.Microbiol.64(6)，2079-2085(1998)；Kim H.W.等.Biotechnol.Lett.25，1231-1234(2003)；Greiner R.等.Arch.Biochem.Biophys.341(2)，201-206(1997)；Yoon S.J.等.Enzyme andmicrobial technol.18，449-454(1996)；Zinin N.V.等.FEMS Microbiol.Lett.236，283-290(2004)))來源的肌醇六磷酸酶已在文獻(xiàn)中描述。
然而迄今為止，這些肌醇六磷酸酶沒有一種呈現(xiàn)有效用作動物飼料補(bǔ)充物所需的特性。尤其，真菌肌醇六磷酸酶傾向于是蛋白水解不穩(wěn)定的(Igbasan F.A.等.Arch.Anim.Nutr.53，353-373(2000))，并且因此易受降解，而大多數(shù)細(xì)菌肌醇六磷酸酶僅對肌醇六磷酸具有窄的底物特異性，并且很難降解中間程度磷酸化的肌醇磷酸酯(Greiner R.等.，Arch.Biochem.Biophys.303(1)，107-113(1993)；Kerovuo J等.Biochem.J.352，623-628(2000))。
因此存在對改進(jìn)的肌醇六磷酸酶的需求。
發(fā)明概要在寬泛的方面，本發(fā)明涉及源自細(xì)菌的肌醇六磷酸酶以及其修飾的形式。本發(fā)明尤其涉及源自細(xì)菌布丘氏菌屬(Buttiauxella sp.)的肌醇六磷酸酶，以及其變體/修飾形式，所述變體/修飾形式針對與野生型(親本)酶相比的改進(jìn)特性進(jìn)行選擇和/或改造。
本發(fā)明因為提供新的肌醇六磷酸酶而是有益的，所述新的肌醇六磷酸酶具有使其作為飼料酶特別有用和有效的特性。本發(fā)明尤其涉及如本文所述的分離的和/或純化的新肌醇六磷酸酶多肽，或其功能片段，或變體，或其修飾形式，或其修飾形式。本發(fā)明還提供編碼所述肌醇六磷酸酶的核酸序列。
為了有效用作食物或動物飼料的酶添加劑，該肌醇六磷酸酶必須組合許多不同的特性。為了能降解動物胃的酸性環(huán)境中的植酸，其必須在低pH有活性，優(yōu)選在大范圍的pH值中有活性。此外，其必須具有高的特異性活性和優(yōu)選高的熱穩(wěn)定性，以使得蛋白質(zhì)經(jīng)得住在飼料如飼料團(tuán)粒的制備中常用的高溫。
同樣重要的是酶具有廣泛的底物特異性，所述底物特異性允許其不僅水解肌醇六磷酸，而且水解肌醇六磷酸降解的中間產(chǎn)物，如肌醇五磷酸、肌醇四磷酸和肌醇三磷酸。對豬中肌醇六磷酸降解的研究表明這些肌醇寡磷酸酯另外在小和大腸中基本上維持不溶，并且因此難以被該動物和腸道微生物群落產(chǎn)生的堿性磷酸酶接近(Schlemmer U.等.Arch.Anim.Nutr.55，255-280(2001))。已鑒定了不同酶在底物特異性譜上的變化。例如，由來自枯草芽孢桿菌(B.subtilis)的肌醇六磷酸酶產(chǎn)生的肌醇三磷酸基本上耐受該酶的進(jìn)一步水解[Kerovuo J.等.Biochem J.352，623-628(2000)]。
在本發(fā)明的另一個方面，提供了質(zhì)?；蜉d體系統(tǒng)，或轉(zhuǎn)化的或轉(zhuǎn)基因生物體，其包括如本文所述的新肌醇六磷酸酶或其修飾形式。
本發(fā)明的另一個方面涉及轉(zhuǎn)基因生物體，其被修飾以表達(dá)如本文所述的新肌醇六磷酸酶或其修飾形式，并且因此能產(chǎn)生肌醇六磷酸酶。本發(fā)明進(jìn)一步提供用于肌醇六磷酸酶生物技術(shù)生產(chǎn)的手段和方法，以及其作為飼料添加劑的用途。
本發(fā)明的各方面存在于權(quán)利要求和下列注釋中。
為便于參考，本發(fā)明的這些和更多方面將在合適的章節(jié)標(biāo)題下論述。然而，每一章節(jié)下的教導(dǎo)并不一定限于每一特定的章節(jié)。
如參照本發(fā)明所用的，術(shù)語“生產(chǎn)”(“produce”)、“產(chǎn)生”(“producing”)、“生產(chǎn)的”(“produced”)、“可生產(chǎn)的”(“produceable”)、“產(chǎn)物”(“production”)與相應(yīng)的術(shù)語“制備”(“prepare”)、“制備”(“preparing”)、“制備的”(“prepared”)、“制備”(“preparation”)、“生成的”(“generated”)、“生成”(“generation”)和“可制備的”(“preparable”)同義。
如參照本發(fā)明所用的，術(shù)語“表達(dá)”(“expression”)、“表達(dá)”(“expresses”)、“表達(dá)的”(“expressed”)、“可表達(dá)的”(“expressable”)與相應(yīng)的術(shù)語“轉(zhuǎn)錄”(“transcription”)、“轉(zhuǎn)錄”(“transcribes”)、“轉(zhuǎn)錄的”(“transcribed”)和“可轉(zhuǎn)錄的”(“transcribable”)同義。
如參照本發(fā)明所用的，術(shù)語“轉(zhuǎn)化”(“transformation”)和“轉(zhuǎn)染”(“transfection”)指將核酸序列導(dǎo)入宿主、宿主細(xì)胞、組織或器官的方法。
涉及可用于本發(fā)明的核苷酸序列的其他方面包括包括本發(fā)明序列的構(gòu)建體；包括用于本發(fā)明的序列的載體；包括用于本發(fā)明的序列的質(zhì)粒；包括用于本發(fā)明的序列的轉(zhuǎn)化細(xì)胞；包括用于本發(fā)明的序列的轉(zhuǎn)化組織；包括用于本發(fā)明的序列的轉(zhuǎn)化器官；包括用于本發(fā)明的序列的轉(zhuǎn)化宿主；包括用于本發(fā)明的序列的轉(zhuǎn)化生物體。本發(fā)明還包括利用其表達(dá)用于本發(fā)明的核苷酸序列的方法，如在宿主細(xì)胞中表達(dá)；包括轉(zhuǎn)移其的方法。本發(fā)明進(jìn)一步包括分離該核苷酸序列，如從宿主細(xì)胞分離的方法。
涉及可用于本發(fā)明的氨基酸序列的其他方面包括編碼用于本發(fā)明的氨基酸序列的構(gòu)建體；編碼用于本發(fā)明的氨基酸序列的載體；編碼用于本發(fā)明的氨基酸序列的質(zhì)粒；表達(dá)用于本發(fā)明的氨基酸序列的轉(zhuǎn)化細(xì)胞；表達(dá)用于本發(fā)明的氨基酸序列的轉(zhuǎn)化組織；表達(dá)用于本發(fā)明的氨基酸序列的轉(zhuǎn)化器官；表達(dá)用于本發(fā)明的氨基酸序列的轉(zhuǎn)化宿主；表達(dá)用于本發(fā)明的氨基酸序列的轉(zhuǎn)化生物體。本發(fā)明還包括利用其純化用于本發(fā)明的氨基酸序列的方法，如在宿主細(xì)胞中表達(dá)；包括轉(zhuǎn)移所述序列，且隨后純化所述序列的方法。
附圖簡述

圖1顯示了通過DEAE-瓊脂糖層析從布丘氏菌屬(Buttiauxella)P1-29純化的重組肌醇六磷酸酶的SDS PAGE分析。該圖呈現(xiàn)了包含布丘氏菌屬肌醇六磷酸酶樣品的泳道的數(shù)字照相圖像的掃描圖。
圖2顯示了來自布丘氏菌屬P1-29的肌醇六磷酸酶的pH譜。
圖3顯示了來自布丘氏菌屬P1-29的純化的重組肌醇六磷酸酶對不同磷酸化程度的肌醇磷酸酯組分和模式底物的底物特異性?？s寫IP6-肌醇六磷酸，IP5，IP4和IP3-分別指同分異構(gòu)肌醇五磷酸、肌醇四磷酸和肌醇三磷酸的混合物。Fru P2-果糖1，6-二磷酸，F(xiàn)ru P1-果糖6-磷酸。
SEQ ID NO1列出獲得用于細(xì)菌菌株鑒定的序列。
SEQ ID NO2列出包括來自布丘氏菌屬P1-29的肌醇六磷酸酶基因的多核苷酸序列。
SEQ ID NO3列出來自布丘氏菌屬P1-29的肌醇六磷酸酶基因的氨基酸序列。
發(fā)明詳述本發(fā)明的特征為包括對應(yīng)于布丘氏菌屬肌醇六磷酸酶或其修飾形式、同源物、變體、功能等同物或有效片段的氨基酸序列的酶。
術(shù)語“肌醇六磷酸酶”指能催化磷酸酯，包括肌醇六磷酸水解并且釋放無機(jī)磷酸酯的蛋白質(zhì)或多肽。除肌醇六磷酸外，某些肌醇六磷酸酶能水解至少一些中間程度磷酸化的肌醇磷酸酯。
術(shù)語“對應(yīng)于布丘氏菌屬的肌醇六磷酸酶”指不必從布丘氏菌屬來源獲得的酶。反而該酶優(yōu)選必須具有布丘氏菌屬肌醇六磷酸酶的相同的功能特征或序列。例如，布丘氏菌屬肌醇六磷酸酶可能為源自布丘氏菌屬的變體，但其并不天然存在于布丘氏菌屬物種中。
布丘氏菌屬包括，Buttiauxella agrestis、Buttiauxella brennerae、Buttiauxella ferragutiae、Buttiauxella gaviniae、Buttiauxella izardii、Buttiauxellanoackiae、Buttiauxella warmboldiae。布丘氏菌屬物種的菌株可從DSMZ(German National Resource Centre for Biological Material)得到。肌醇六磷酸酶優(yōu)選通過本文所述的方法從布丘氏菌屬鑒定，例如與SEQ ID No 2雜交。優(yōu)選的用于分離本發(fā)明的多肽和/或多核苷酸的布丘氏菌屬菌株列于實施例中。
本發(fā)明的術(shù)語“野生型肌醇六磷酸酶”或“野生型”描述了具有在自然界中找到的氨基酸序列的肌醇六磷酸酶。
本發(fā)明的術(shù)語“肌醇六磷酸酶酶變體”、“肌醇六磷酸酶變體”或“變體”描述了具有源自親本肌醇六磷酸酶氨基酸序列的氨基酸序列、但由于一個或多個氨基酸取代、插入和/或缺失而不同的肌醇六磷酸酶，所述氨基酸取代、插入和/或缺失總稱為“突變”。設(shè)想對于進(jìn)一輪制備肌醇六磷酸酶變體的方法，如分子進(jìn)化，肌醇六磷酸酶變體可能也是親本肌醇六磷酸酶。
根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“一個或多個同源多肽”，在此也描述為“同源物”，描述了多肽，優(yōu)選肌醇六磷酸酶(即“同源肌醇六磷酸酶”或“同源酶”)，其與第一多肽/肌醇六磷酸酶/酶的氨基酸序列相比具有超過75％序列同一性，優(yōu)選具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同源性。
術(shù)語“其功能等同物”指該酶必須具有與布丘氏菌屬肌醇六磷酸酶的幾乎相同的功能特征。術(shù)語“修飾形式”或“變體”指該酶已從其原來的形式被修飾，但保留與布丘氏菌屬肌醇六磷酸酶的相同的酶促功能特征。尤其，術(shù)語“變體”或“修飾形式”包括具有源自親本/野生型肌醇六磷酸酶氨基酸序列的氨基酸序列、并且具有一個或多個氨基酸取代、插入和/或缺失的肌醇六磷酸酶，所述氨基酸取代、插入和/或缺失總稱為突變。修飾形式或變體與親本酶相比可能呈現(xiàn)改變的酶特征。優(yōu)選，修飾形式或變體具有一種或多種下列增強(qiáng)的表型提高的熱穩(wěn)定性和/或；提高的蛋白水解(例如胃蛋白酶)穩(wěn)定性和/或；提高的比活和/或；更廣的底物特異性和/或；更廣pH范圍的活性。術(shù)語“功能”或“有效”片段指保留幾乎相同的酶促功能或作用的布丘氏菌屬肌醇六磷酸酶的片段或部分。
優(yōu)選本發(fā)明這方面的肌醇六磷酸酶具有與布丘氏菌屬肌醇六磷酸酶相同的序列或至少75％同一的(同源的)序列。
適當(dāng)?shù)?，該酶包括如SEQ ID NO3所示的氨基酸序列、或具有其至少75％同一性(同源性)的序列、或其功能片段。在一優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供如SEQ ID NO3所示氨基酸序列或具有與其至少75％同一性(同源性)的序列或其有效片段的分離和/或純化的多肽。當(dāng)涉及SEQ ID No 3和包括SEQ ID No 3的多肽時，設(shè)想這也指表達(dá)期間共加工的或翻譯后加工的的多肽，所述加工例如通過信號肽裂解。翻譯后裂解也可能發(fā)生在C-末端。因此在一優(yōu)選的實施方案中，其有效片段(也稱為其功能片段)為由天然宿主或相配的合適表達(dá)宿主產(chǎn)生的成熟多肽。
在另一實施方案中，肌醇六磷酸酶的特征在于其源自以登錄號NCIMB41248保藏的布丘氏菌屬菌株P(guān)1-29。
在一優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明第一個方面的任何實施方案的肌醇六磷酸酶，其包括在下列位點(根據(jù)SEQ ID No.3的編號而編號)的一個或多個突變59、70、122、125、167、193、197、204、209、211、221、223、225、240、242、244、268、281、289、294、303、336、351。
這些位點的特征在于該酶在這些位點的誘變導(dǎo)致所需酶特征的改良。
下列取代可以是優(yōu)選的變體K59A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或YT70A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、V、W或YA122C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或YD125A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或YT167A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、V、W或YH193A、C、D、E、F、G、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或YF197A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y
T204A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、V、W或YT209A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、V、W或YA211C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或YG221A、C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或YI223A、C、D、E、F、G、H、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或YS225A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W或YK240A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或YA242C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或YD244A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或YA268C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或YL281A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或YQ289A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V、W或YA294C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或YN303A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或YI336A、C、D、E、F、G、H、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或YN351A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y“保守突變”指根據(jù)氨基酸特征，與所示的氨基酸殘基相比，對氨基酸殘基的突變?yōu)楸Ｊ氐耐蛔?。氨基酸特征包括殘基的大小、疏水性、極性、電荷、pK-值和本領(lǐng)域已知的其他氨基酸特征。優(yōu)選的保守突變作為保守取代在下面列出。
尤其優(yōu)選的實施方案中，突變位于一個或多個下列位點K59；T167；K240；T167；K240；D244；Q289；T209和F197。
這些特定位點的優(yōu)選突變?nèi)缟纤校鼉?yōu)選的突變包括K59E；T167V；K240T；T167I；K240E；D244C；Q289Y；T209K和F197S。
另外優(yōu)選的實施方案中，提供包括選自以下的突變組合的肌醇六磷酸酶D125E/H193R；A294E/N303K；T167I/K240T；D223E/K240E/N351D；T167I/K240T/A294E/N303K；T167I/K240E/A242S/A294E/N303K；A122T/T167I/F197S/T209K/A211P/K240E/A294E/N303K；A122T/T167I/F197S/T209K/A211P/K240E/A242S/S281L/Q289Y/A294E/N303K；A122T/D125E/H193R/F197S/T209K/A211P/S221N/G225A/K240E/A294E/N303K；D125E/T167I/H193R/F197S/T204I/T209K/A211P/K240E/A268V/Q289H/A294E/N303K；A122T/T167I/H193R/F197S/T204I/T209K/A211P/K240E/A268V/Q289H/A294E/N303K/I336F和N70Y/D125E/T167I/H193R/F197S/T204I/T209K/A211P/K240E/A268V/Q289H/A294E/N303K。
因此，根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的肌醇六磷酸酶為一種變體，其包括如SEQ IDNO3所列的氨基酸序列或其有效片段，(或其同源物，優(yōu)選該肌醇六磷酸酶的特征為其源自以登錄號NCIMB 41248保藏的布丘氏菌屬菌株P(guān)1-29或其同源物)，只是另外具有一種或多種上面所列的氨基酸突變或一種上面所列的突變組合。
這些實施方案中，命名法表明了包括SEQ ID NO3所示的氨基酸序列的肌醇六磷酸酶，其具有通過引用SEQ ID NO3中氨基酸位點表明的突變。該命名法在底下更詳細(xì)地描述。
適當(dāng)?shù)?，這些變體顯示對于下列任何一項的改良的特征溫度穩(wěn)定性、pH范圍、胃蛋白酶穩(wěn)定性、比活、底物特異性和更廣的底物特異性。在此公開了用于確定這些特征的合適方法。
尤其，肌醇六磷酸酶特征的改良是針對食物和飼料加工條件下的酶穩(wěn)定性，在胃運送期間的酶穩(wěn)定性和在人或動物胃和/或腸道中的酶活性和穩(wěn)定性，使得該改良的變體尤其適于用作飼料添加劑。因此，除其他參數(shù)之外，所述改良包括在提高的溫度下穩(wěn)定性的提高，優(yōu)選65℃以上的溫度，抗蛋白水解消化的穩(wěn)定性的提高，優(yōu)選消化道的蛋白酶如胃蛋白酶，在低pH下催化活性的提高，優(yōu)選pH5.5以下的催化活性，和從肌醇六磷酸，且優(yōu)選此外肌醇磷酸酯，釋放磷酸鹽(酯)基團(tuán)的總效率。
命名法在本說明書和權(quán)利要求中使用了常規(guī)的氨基酸殘基一字母和三字母代碼。為了易于參照，利用下述命名法描述酶變體中的突變親本酶的氨基酸；位點；取代的一個或多個氨基酸。根據(jù)該命名法，例如用甘氨酸殘基取代第20位的丙氨酸表示為Ala20Gly或A20G。在相同位點處缺失丙氨酸表示為Ala20*或A20*。插入另一個氨基酸殘基(例如甘氨酸)表示為Ala20AlaGly或A20AG。缺失連續(xù)的一段氨基酸殘基(例如位點20的丙氨酸和位點21的甘氨酸之間)表示為Δ(Ala20-GlY21)或Δ(A20-G21)。當(dāng)親本酶序列與用于編號所述位點插入的酶序列相比含有“缺失”(例如在缺失的位點20插入丙氨酸)時，表示為*20Ala或*20A。多個突變由加號或斜杠隔開。例如，A20G+E21S或A20G/E21S分別表示在第20和21位丙氨酸和谷氨酸分別由甘氨酸和絲氨酸取代的兩個突變。當(dāng)給定位點的氨基酸殘基用兩個或更多可選擇的氨基酸殘基取代時，這些殘基由逗號或斜杠隔開。例如，位點20的丙氨酸用甘氨酸或谷氨酸取代表示為A20G，E或A20G/E或者A20G、A20E。當(dāng)在此鑒定出適于修飾的位點，而沒有暗示任何具體的修飾時，應(yīng)理解為任何氨基酸殘基可取代該位置存在的氨基酸殘基。因此，例如當(dāng)提到修飾第20位的丙氨酸但未具體說明時，應(yīng)理解為丙氨酸可以缺失，或用任何其它氨基酸取代(即R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、V中的任何一個)。
適當(dāng)?shù)?，本發(fā)明的肌醇六磷酸酶或功能等同物的特征為所述肌醇六磷酸酶具有至少100U/mg或200U/mg，優(yōu)選至少300U/mg的比活，其中所述比活通過將所述肌醇六磷酸酶如實施例1中詳述的溶液在中溫育而測定，所述溶液包含pH3.5的含有2mM肌醇六磷酸，0.8mM CaCl2的200mM乙酸鈉緩沖液。本發(fā)明的肌醇六磷酸酶或其功能等同物也適合表征為所述肌醇六磷酸酶在約pH4-4.5具有活性最大值，其中所述活性通過將所述肌醇六磷酸酶在溶液中溫育而測定，所述溶液包含含有2mM肌醇六磷酸，0.8mMCaCl2的200mM乙酸鈉緩沖液。本發(fā)明的肌醇六磷酸酶也可適當(dāng)?shù)乇碚鳛樗黾〈剂姿崦妇哂性趐H2.5和5.5觀察到的40％或以上的最大活性，其中甘氨酸鹽酸鹽緩沖液用于測定在pH2.5時的活性。
適當(dāng)?shù)?，在一個實施方案中，本發(fā)明的肌醇六磷酸酶或功能等同物表征為所述肌醇六磷酸酶具有330U/mg或更高的比活，其中所述比活通過將所述肌醇六磷酸酶在溶液中溫育而測定，所述溶液為包含2mM肌醇六磷酸，0.8mM CaCl2的pH3.5的200mM乙酸鈉緩沖液。在另一實施方案中，本發(fā)明的肌醇六磷酸酶或其功能等同物也可適當(dāng)?shù)乇碚鳛樗黾〈剂姿崦冈诩spH3和pH 4-4.5具有兩個活性最大值，其中所述活性通過將所述肌醇六磷酸酶在在溶液中溫育而測定，所述溶液為包含2mM肌醇六磷酸，0.8mMCaCl2的200mM乙酸鈉緩沖液。
另一個方面，本發(fā)明提供分離和/或純化的核酸分子或核苷酸序列，其編碼包括對應(yīng)布丘氏菌屬肌醇六磷酸酶或其同源物的氨基酸序列的酶。適當(dāng)?shù)?，所述分離和/或純化的核酸分子編碼包括如SEQ ID NO3所示的氨基酸序列或與其具有至少75％同一性(同源性)的序列或其有效片段的多肽。在一個實施方案中，該核酸分子編碼包括SEQ ID NO3并且在包含本文所列的優(yōu)選位點的突變或本文所列的任何特定的突變或突變組合的多肽。在另一實施方案中，本發(fā)明提供分離和/或純化的核酸分子，其包括與SEQ ID NO2相同或互補(bǔ)、或包含SEQ ID NO2的任何合適的密碼子取代、或包括與SEQ ID NO2具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同源性序列的核苷酸序列。
仍進(jìn)一步的方面中，本發(fā)明涉及顯示為以下的核苷酸序列以及核苷酸序列的用途(a)以SEQ ID No.2呈現(xiàn)的核苷酸序列，(b)核苷酸序列，其為以SEQ ID No.2呈現(xiàn)的核苷酸序列的變體、同源物、衍生物或片段；(c)核苷酸序列，其為SEQ ID No.2所示的核苷酸序列的補(bǔ)體；(d)核苷酸序列，其為以SEQ ID No.2呈現(xiàn)的核苷酸序列的變體、同源物、衍生物或片段的補(bǔ)體；(e)核苷酸序列，其能與SEQ ID No.2所示的核苷酸序列雜交；(f)核苷酸序列，其能與以SEQ ID No.2呈現(xiàn)的核苷酸序列的變體、同源物、衍生物或片段雜交；(g)核苷酸序列，其與能雜交SEQ ID No.2所示核苷酸序列的核苷酸序列互補(bǔ)；(h)核苷酸序列，其是能與以SEQ ID No.2呈現(xiàn)的核苷酸序列的變體、同源物、衍生物或片段雜交的核苷酸序列的補(bǔ)體；(i)核苷酸序列，其能與SEQ ID No.2所示的核苷酸序列的補(bǔ)體雜交；(j)核苷酸序列，其能與以SEQ ID No.2呈現(xiàn)的核苷酸序列的變體、同源物、衍生物或片段的補(bǔ)體雜交；核苷酸如果能在中等嚴(yán)謹(jǐn)度，更優(yōu)選高嚴(yán)謹(jǐn)度，更優(yōu)選很高嚴(yán)謹(jǐn)度條件下雜交，則認(rèn)為其雜交至上述核苷酸(e)、(f)、(g)、(h)、(i)或(j)中的一種。
為了制備雜交斑點，可利用用于印跡的標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)方案(例如用于DNA雜交的Southern印跡)。靶DNA的量取決于靶序列的相對豐度。如果利用純的靶序列，每千堿基對多核苷酸優(yōu)選1-5pg的DNA。通常，對于具有109dpm/mg比活的放射性探針，檢測極限為約0.5pg DNA，相當(dāng)于復(fù)雜基因組(例如人)的3.3mg基因組DNA中500bp長度的單拷貝基因。實際上將利用約10mg基因組DNA—例如為了篩選生物體，如微生物，其包含本發(fā)明編碼肌醇六磷酸酶的多核苷酸。如果靶DNA為細(xì)菌的或例如質(zhì)粒，為了避免過度曝光將因此需稀釋DNA。靶DNA例如通過點印跡或經(jīng)從電泳凝膠印跡而印跡。優(yōu)選的條件在Membrane Transfer and DetectionMethods，Amersham International plc，UK.-PI/162/85/1中描述。優(yōu)選利用Hybond N+帶陽電荷的尼龍膜(Amersham Life Science)。優(yōu)選根據(jù)Pharmacia的Ready to Go DNATM標(biāo)記試劑盒制備探針以制備＞1×109dpm/μg的探針。該探針以每毫升雜交緩沖液1×106dpm的濃度用于雜交緩沖液。印跡優(yōu)選在雜交緩沖液(6xSSC，5xDenhardt溶液和0.5％SDS，以及100mg/ml緩沖液的變性的鮭精DNA)中65℃預(yù)雜交1小時，隨后在包含變性的標(biāo)記探針的雜交緩沖液中在65℃振蕩雜交12小時。隨后用在2xSSC，0.1％SDS中的合適體積的洗滌緩沖液(通常50ml)在65℃洗滌一個或多個印跡30分鐘，隨后為在合適體積的洗滌緩沖液(通常50ml)中進(jìn)行第二次洗滌，所述洗滌緩沖液對于中等嚴(yán)謹(jǐn)度洗滌是相同的洗滌緩沖液(2xSSC，0.1％SDS)，或0.1％xSSC，0.1％SDS在65℃10分鐘(高嚴(yán)謹(jǐn)度)，對于很高的嚴(yán)謹(jǐn)度洗滌，第二次洗滌可在70℃重復(fù)。
本發(fā)明的核苷酸序列可包括編碼SEQ ID No.3或其有效片段或變體、修飾形式、同源物或其衍生物的序列。
尤其，本發(fā)明提供包括如本文所述的肌醇六磷酸酶或其同源物或衍生物的質(zhì)?；蜉d體系統(tǒng)。優(yōu)選，該質(zhì)?；蜉d體系統(tǒng)包括如SEQ ID No2所示的核酸序列、或與其至少75％同源的序列、或其有效片段。適當(dāng)?shù)?，該質(zhì)?；蜉d體系統(tǒng)為用于任何下述酶在微生物中表達(dá)的表達(dá)載體，所述酶由SEQ ID No2所示的核酸序列或與其至少75％同源的(同一的)序列編碼。在此描述了合適的表達(dá)載體。此外，本發(fā)明提供了用于表達(dá)本文所述的任何修飾的酶或變體或功能片段的質(zhì)?；蜉d體系統(tǒng)。在此描述了合適的表達(dá)載體。
肌醇六磷酸酶變體本發(fā)明涉及通過親本肌醇六磷酸酶的氨基酸序列中的一個或多個氨基酸殘基的修飾對親本肌醇六磷酸酶的特性的改良。
用作本發(fā)明親本酶的肌醇六磷酸酶包括來自細(xì)菌的野生型肌醇六磷酸酶，優(yōu)選獲自或源自布丘氏菌屬的肌醇六磷酸酶，其具有Seq ID No.3中所給出的氨基酸序列或其有效片段，或與Seq ID No 3具有超過75％，優(yōu)選超過80％，更優(yōu)選超過90％，更優(yōu)選超過95％、96％、97％、98％，優(yōu)選超過99％同一性的氨基酸序列(即同源多肽)，或其有效片段。
本發(fā)明改良的肌醇六磷酸酶變體優(yōu)選具有與Seq ID No 3或其有效片段的同一性或超過75％、優(yōu)選超過80％、更優(yōu)選超過90％、更優(yōu)選超過95％、96％、97％、98％，優(yōu)選超過99％的同一性。然而，也可以設(shè)想那些變體可以是與SEQ ID No 3異源的(即不同源)。例如通過重組技術(shù)(如外介導(dǎo)的重組，或家族改組)產(chǎn)生的變體可產(chǎn)生變體，雖然利用本發(fā)明的親本肌醇六磷酸酶制備的變體也可具有小于75％的同源性。
序列比對以及序列同一性的測定可通過本領(lǐng)域已知的計算機(jī)程序如GCG程序包提供的GAP而合適地進(jìn)行(Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.，(1970)，Journal ofMolecular Biology，48，p.443-453)。可以利用GAP按照下述設(shè)置進(jìn)行多肽序列比較3.0的GAP產(chǎn)生罰分和0.1的GAP延伸罰分。例如利用序列比對測定同源多肽中的相應(yīng)位點。
在一種或多種下列表達(dá)宿主中異源表達(dá)后，鑒定肌醇六磷酸酶大腸桿菌K12；枯草芽孢桿菌；釀酒酵母。也可利用其他的表達(dá)宿主。
本發(fā)明肌醇六磷酸酶特性的改良針對在食物和飼料加工中的用途，以及用作食物和飼料產(chǎn)品添加劑的用途。尤其，改良針對在食物和飼料加工條件下的穩(wěn)定性，在胃運送期間的穩(wěn)定性，和在人或動物胃和/或腸道中的活性和穩(wěn)定性。除其他參數(shù)之外，所述改良包括在提高的溫度下穩(wěn)定性的提高，優(yōu)選65℃以上的溫度，抗蛋白水解消化的穩(wěn)定性的提高，優(yōu)選消化道的蛋白酶如胃蛋白酶，在低pH下催化活性的提高，優(yōu)選pH 5.5以下的催化活性，和從肌醇六磷酸釋放磷酸鹽(酯)基團(tuán)的總效率。
提高的溫度下穩(wěn)定性的提高通過該酶的失活溫度定量。失活溫度定義為肌醇六磷酸酶在該溫度溫育一定的持續(xù)時間、并且隨后冷卻至室溫后，殘留活性為同樣的肌醇六磷酸酶在室溫下、在相同的條件溫育相同的持續(xù)時間后殘留活性的50％時的溫度。熱穩(wěn)定性差異為以℃表示的兩種酶失活溫度之間的差異。
通過野生型肌醇六磷酸酶的序列和結(jié)構(gòu)分析以及通過親本酶的誘變，尤其通過將突變引入Seq ID No 3中所給出的野生型氨基酸序列中，并且篩選具有改良特性的酶變體，而找到所要突變以獲得改良特性的位點和/或區(qū)域。因此，已鑒定了對改良肌醇六磷酸酶特性是重要的親本酶內(nèi)的某些區(qū)域以及位點。
因此，本發(fā)明涉及具有改良特性的肌醇六磷酸酶變體，其與親本肌醇六磷酸酶相比，包括在一個或多個下列位點(根據(jù)Seq ID No 3編號的編號)的突變59，70，122，125，167，193，197，204，209，211，221，223，225，240，242，244，268，281，289，294，303，336，351和/或在與Seq ID No 3的氨基酸序列所示的肌醇六磷酸酶同源的肌醇六磷酸酶中相應(yīng)位點的突變。這些位點的特征為這些位點的誘變導(dǎo)致酶特性的改良。
K59E；T167V；K240T；T167I；K240E；D244C；Q289Y；T209K和F197S或每一位點的保守突變。
具體的優(yōu)選突變組合包括D125E/H193R；A294E/N303K；T167I/K240T；D223E/K240E/N351D；T167I/K240T/A294E/N303K；T167I/K240E/A242S/A294E/N303K；A122T/T167I/F197S/T209K/A211P/K240E/A294E/N303K；A122T/T167I/F197S/T209K/A211P/K240E/A242S/S281L/Q289Y/A294E/N303K；A122T/D125E/H193R/F197S/T209K/A211P/S221N/G225A/K240E/A294E/N303K；D125E/T167I/H193R/197S/T204I/T209K/A211P/K240E/A268V/Q289H/A294E/N303K；A122T/T167I/H193R/F197S/T204I/T209K/A211P/K240E/A268V/Q289H/A294E/N303K/I336F和N70Y/D125E/T167I/H193R/F197S/T204I/T209K/A211P/K240E/A268V/Q289H/A294E/N303K。
制備肌醇六磷酸酶變體的方法本發(fā)明廣泛的實施方案中提供制備一個或多個肌醇六磷酸酶變體的方法。
在一優(yōu)選的實施方案中制備肌醇六磷酸酶變體的方法包括下列連續(xù)的步驟a)選擇至少一種親本肌醇六磷酸酶，其中該至少一種親本肌醇六磷酸酶選自i)包括如本文所述的對應(yīng)于布丘氏菌屬肌醇六磷酸酶的氨基酸序列的多肽或其修飾形式、同源多肽、變體、功能等同物或有效片段，或ii)如本文所述的至少一種肌醇六磷酸酶變體；b)通過引入所述親本肌醇六磷酸酶的至少一種改變以獲得至少一種肌醇六磷酸酶變體而產(chǎn)生至少一種肌醇六磷酸酶變體，其中所述改變?yōu)樗鲇H本肌醇六磷酸酶氨基酸殘基的插入、缺失或取代或其組合；c)篩選所述的至少一種肌醇六磷酸酶變體以鑒定改良的肌醇六磷酸酶變體，其與親本肌醇六磷酸酶相比具有選自以下的一個或多個改良特性i.更高的熱穩(wěn)定性和/或ii.比活和/或iii.蛋白水解的穩(wěn)定性d)制備所述改良的肌醇六磷酸酶變體，優(yōu)選產(chǎn)生分離和/或純化的肌醇六磷酸酶變體。
在一優(yōu)選的實施方案中，步驟b)期間產(chǎn)生肌醇六磷酸酶變體的群體，并且在步驟c)中篩選至少部分所述的肌醇六磷酸酶變體群體。
在一優(yōu)選的實施方案中步驟a)包括將權(quán)利要求11至13的編碼親本肌醇六磷酸酶的核苷酸序列進(jìn)行突變，并且步驟b)包括在宿主細(xì)胞中表達(dá)步驟(a)中獲得的突變核苷酸序列，以及步驟c)包括篩選宿主細(xì)胞或其提取物中具有所述一個或多個改良特性的改良的肌醇六磷酸酶變體。
另外的實施方案中，步驟c)以及可選擇的d)后，進(jìn)一步包括步驟a)至c)以及可選擇的d)的至少一輪重復(fù)，其中優(yōu)選在所述的隨后一個或多個循環(huán)中，針對步驟a)的至少一種親本肌醇六磷酸酶選擇根據(jù)該方法制備的所述至少一種肌醇六磷酸酶變體和/或改良的肌醇六磷酸酶變體。
在進(jìn)一步優(yōu)選的實施方案中，步驟c)包括篩選表達(dá)改良肌醇六磷酸酶變體的宿主細(xì)胞，該變體與i)所述親本肌醇六磷酸酶和/或ii)包括SEQ IDNo 3的多肽或其功能片段相比，具有至少2.5的熱穩(wěn)定性差異。
在另外的實施方案中，步驟c)包括篩選表達(dá)改良肌醇六磷酸酶變體的宿主細(xì)胞，該變體與i)所述親本肌醇六磷酸酶和/或ii)包括SEQ ID No 3的多肽或其功能片段相比，具有至少30的胃蛋白酶穩(wěn)定性。
在另外的實施方案中，步驟c)包括篩選表達(dá)改良的肌醇六磷酸酶變體的宿主細(xì)胞，該變體與i)所述親本肌醇六磷酸酶和/或ii)包括SEQ ID No3的多肽相比，具有與由SEQ ID No 3編碼的肌醇六磷酸酶相比至少110的比活比率。
本發(fā)明還提供制備肌醇六磷酸酶變體的方法，其包括a)選擇親本肌醇六磷酸酶，其中該親本肌醇六磷酸酶選自i.與SEQ ID No 3具有至少75％同源性的親本肌醇六磷酸酶或其功能片段ii.源自布丘氏菌屬的親本肌醇六磷酸酶iii.至少一種肌醇六磷酸酶變體b)在親本肌醇六磷酸酶的氨基酸殘基中制造至少一種變化，所述變化為氨基酸殘基插入、缺失或取代，以獲得肌醇六磷酸酶變體c)篩選肌醇六磷酸酶變體，其與親本肌醇六磷酸酶相比具有如本文所述的改良的特性，優(yōu)選選自下列一種或多種i.更高的熱穩(wěn)定性和/或ii.比活和/或iii.蛋白水解穩(wěn)定性和/或d)制備肌醇六磷酸酶變體。
任選地，至少步驟a)至c)可在一次或多次隨后的(反復(fù)的)循環(huán)中重復(fù)。因此，設(shè)想親本肌醇六磷酸酶為通過上述方法a)至c)的先前循環(huán)而制備的肌醇六磷酸酶變體。
在另外的實施方案中，本發(fā)明提供制備肌醇六磷酸酶變體的方法，包括下列步驟a)提供親本肌醇六磷酸酶，選自(i)與SEQ ID No 3具有至少75％同源性的親本肌醇六磷酸酶或其功能片段(ii)源自布丘氏菌屬的親本肌醇六磷酸酶，(iii)至少一種肌醇六磷酸酶變體b)通過親本肌醇六磷酸酶的改變產(chǎn)生肌醇六磷酸酶變體的群體，優(yōu)選所述一個或多個改變通過親本肌醇六磷酸酶中至少一個氨基酸殘基的插入、缺失或取代或任何其組合而獲得。
c)針對群體篩選肌醇六磷酸酶變體，其與親本肌醇六磷酸酶相比具有如本文所述的改良的特性，優(yōu)選選自下列中一種或多種(i)更高的熱穩(wěn)定性和/或(ii)更高的比活和/或(iii)更高的蛋白水解穩(wěn)定性，d)從肌醇六磷酸酶群體選擇一種或多種肌醇六磷酸酶變體，e)任選循環(huán)重復(fù)步驟(a)至(c)，并且優(yōu)選其中在一個循環(huán)中所選的肌醇六磷酸酶變體用作后面的循環(huán)中的起始肌醇六磷酸酶。
在另外的實施方案中，本發(fā)明提供制備肌醇六磷酸酶變體的方法，其包括a)將編碼親本肌醇六磷酸酶的核苷酸序列進(jìn)行誘變，其中該親本肌醇六磷酸酶選自i.與SEQ ID No 3具有至少75％同源性的親本肌醇六磷酸酶或其功能片段ii.源自布丘氏菌屬的親本肌醇六磷酸酶iii.至少一種肌醇六磷酸酶變體b)在宿主細(xì)胞中表達(dá)步驟(a)中獲得的突變核苷酸序列，和c)篩選表達(dá)肌醇六磷酸酶變體的宿主細(xì)胞，所述肌醇六磷酸酶變體與親本肌醇六磷酸酶相比具有如本文所述的改良的特性，優(yōu)選選自下列一種或多種i)更高的熱穩(wěn)定性和/或ii)更高的比活和/或iii)更高的蛋白水解穩(wěn)定性和/或d)制備由宿主細(xì)胞表達(dá)的肌醇六磷酸酶變體。
任選地，步驟a)至c)，可選擇地包括d)可在一次或多次隨后的(反復(fù)的)循環(huán)中重復(fù)。
在另外的實施方案中，本發(fā)明提供制備肌醇六磷酸酶變體的方法，包括下列步驟a)將編碼親本肌醇六磷酸酶的核苷酸序列進(jìn)行誘變，以產(chǎn)生改變的核苷酸變體的群體，其中優(yōu)選所述一個或多個改變通過親本肌醇六磷酸酶中至少一個氨基酸殘基的插入、缺失或取代或任何其組合而獲得，并且其中該親本肌醇六磷酸酶選自(i)與SEQ ID No 3具有至少75％同源性的肌醇六磷酸酶或其功能片段(ii)源自布丘氏菌屬的肌醇六磷酸酶，(iii)至少一種肌醇六磷酸酶變體(b)在相應(yīng)的宿主細(xì)胞群體中表達(dá)步驟(a)中獲得的核苷酸變體群體，和(c)針對群體篩選肌醇六磷酸酶變體，其與親本肌醇六磷酸酶相比具有如本文所述的改良的特性，優(yōu)選選自一種或多種(i)更高的熱穩(wěn)定性和/或(ii)更高的比活和/或(iii)更高的蛋白水解穩(wěn)定性，(d)從肌醇六磷酸酶群體選擇一種或多種肌醇六磷酸酶變體，(e)任選循環(huán)重復(fù)步驟(a)至(b)，并且優(yōu)選，其中在一個循環(huán)中所選的肌醇六磷酸酶變體用作下一循環(huán)的起始肌醇六磷酸酶。
當(dāng)合適時，在上述制備肌醇六磷酸酶變體的方法中，所述核苷酸序列優(yōu)選為DNA序列。
核苷酸序列優(yōu)選為分離和/或純化的核酸分子或核苷酸序列，其編碼包括如本文所述的對應(yīng)布丘氏菌屬肌醇六磷酸酶的氨基酸序列的酶，或其同源物。
肌醇六磷酸酶親本優(yōu)選選自SEQ ID No 3或其功能片段或如本文所述的SEQ ID No 3公開的布丘氏菌屬肌醇六磷酸酶的同源物。
本發(fā)明涉及制備肌醇六磷酸酶變體方法的上述實施方案中，編碼親本肌醇六磷酸酶/核苷酸的親本肌醇六磷酸酶/核苷酸優(yōu)選為野生型肌醇六磷酸酶。
然而，另外親本可以是通過先前循環(huán)的誘變制備的變體，即在一個實施方案中，制備肌醇六磷酸酶變體的方法為反復(fù)的，其中步驟a)至c)(任選包括步驟d))重復(fù)至少超過一次。所述實施方案中第一輪誘變所用的誘變方法優(yōu)選為易錯PCR，更優(yōu)選錯誤閾值PCR(error threshold PCR)。隨后的循環(huán)也可以是易錯PCR，更優(yōu)選錯誤閥值PCR，但另外可為基于重組的誘變，其中在第一輪誘變中鑒定的至少兩種獨立的改良變體的組在第二或隨后輪的誘變期間被重組，以產(chǎn)生至少一種重組變體(例如利用家族改組或重組酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法)。
對技術(shù)人員顯而易見的是也可利用替代的誘變方法，包括合理的設(shè)計，位點掃描誘變，或化學(xué)/輻射誘導(dǎo)的誘變。
本發(fā)明涉及制備肌醇六磷酸酶變體方法的上述實施方案中，優(yōu)選針對更高的熱穩(wěn)定性篩選肌醇六磷酸酶變體。
本發(fā)明涉及制備肌醇六磷酸酶變體方法的上述實施方案中，優(yōu)選對至少單個參數(shù)篩選肌醇六磷酸酶變體，所述單個參數(shù)優(yōu)選選自更高的熱穩(wěn)定性，更高的蛋白水解穩(wěn)定性或更高的比活，最優(yōu)選更高的熱穩(wěn)定性。
優(yōu)選，對所述第一個參數(shù)的篩選在至少第一輪誘變中進(jìn)行，所述誘變包括至少步驟a)至c)，其中c)包括至少對所述第一個參數(shù)的篩選。該第一輪誘變能因此后接進(jìn)一步的(反復(fù)的)的誘變，以及包括步驟a)至c)(任選地包括d))的選擇，其中所述在另外的循環(huán)中的選擇可選自如所述第一輪的步驟c)中所用的相同的選擇參數(shù)，或者可替換地，不同的參數(shù)。
在制備肌醇六磷酸酶變體的上述方法的反復(fù)循環(huán)期間，優(yōu)選所述第一個參數(shù)選自更高的熱穩(wěn)定性、更高的蛋白水解穩(wěn)定性或更高的比活，最優(yōu)選更高的熱穩(wěn)定性。優(yōu)選，當(dāng)進(jìn)行第一輪誘變以選擇具有更高熱穩(wěn)定性的變體時，在包括步驟a)至c)的隨后(反復(fù)的)一個或多個誘變循環(huán)期間，所述參數(shù)選自更高的熱穩(wěn)定性，更高的蛋白水解穩(wěn)定性或更高的比活，最優(yōu)選更高的蛋白水解穩(wěn)定性或更高的比活。
本發(fā)明涉及制備肌醇六磷酸酶變體方法的上述實施方案中，優(yōu)選在至少一輪誘變(步驟a至c)，優(yōu)選超過一個循環(huán)，即反復(fù)的選擇循環(huán)中，針對更高的熱穩(wěn)定性和更高的蛋白水解穩(wěn)定性以及更高的比活篩選肌醇六磷酸酶變體。
親本肌醇六磷酸酶優(yōu)選源自布丘氏菌屬P1-29。
在制備肌醇六磷酸酶變體的方法中，所述方法包括將編碼親本肌醇六磷酸酶的DNA序列誘變，編碼親本肌醇六磷酸酶的DNA序列優(yōu)選經(jīng)受隨機(jī)誘變，更優(yōu)選經(jīng)受易錯PCR，更優(yōu)選經(jīng)受錯誤閥值PCR。
優(yōu)選的誘變編碼親本肌醇六磷酸酶的DNA序列的方法為易錯PCR，更優(yōu)選為錯誤閾值PCR，其他的誘變方法可代替易錯/錯誤閾值PCR或和易錯PCR/錯誤閾值PCR一起使用。參見實施例12，其提供了合適的易錯PCR和錯誤閾值PCR方法的參照。另外合適的誘變PCR方法由Cadwell和Joyce(PCR Methods Appl.3(1994)，136-140)公開。
當(dāng)用在涉及“肌醇六磷酸酶變體制備方法”的實施方案的語境中時，術(shù)語“在宿主細(xì)胞中表達(dá)”優(yōu)選定義為如本文定義的在活體生物、器官或細(xì)胞中生產(chǎn)肌醇六磷酸酶變體。優(yōu)選的宿主為大腸桿菌K12；枯草芽孢桿菌；釀酒酵母。在一種或多種下列表達(dá)宿主中異源表達(dá)后，鑒定本文詳述的肌醇六磷酸酶大腸桿菌K12；枯草芽孢桿菌；釀酒酵母。
不過，考慮到為了選擇如本文所述的肌醇六磷酸酶變體的目的，所述方法可應(yīng)用表達(dá)肌醇六磷酸酶變體的體外方法，優(yōu)選用于所述方法的步驟(c)中，其利用分離自一個或多個活體生物或病毒的一個或多個細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄和翻譯機(jī)制。本發(fā)明的變體肌醇六磷酸酶的所述體外生產(chǎn)也可以用于選擇優(yōu)選的變體肌醇六磷酸酶。體外表達(dá)可以適當(dāng)?shù)乩脴?biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行。關(guān)于參考文件請參見Promega公司的′In vitro Expression Guide′(部分號BR053)。
變體表型的定義。
優(yōu)選利用實施例12中公開的方法來測定具有更高熱穩(wěn)定性(熱穩(wěn)定性差異)的變體。
通過制備肌醇六磷酸酶變體的方法制備的變體肌醇六磷酸酶優(yōu)選具有至少1.5的熱穩(wěn)定性差異(T.D)，更優(yōu)選2，2.5，3，3.5，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，最優(yōu)選至少20。
優(yōu)選通過實施例12中公開的方法測定具有更高蛋白水解穩(wěn)定性的變體。
本發(fā)明的肌醇六磷酸酶變體優(yōu)選具有至少45％，優(yōu)選50％，55％，更優(yōu)選至少60％或65％，最優(yōu)選至少70％的蛋白水解穩(wěn)定性(殘留活性)。
本發(fā)明的肌醇六磷酸酶變體優(yōu)選具有pH 4.0時大于100％野生型活性的比活，優(yōu)選大于105％，110％，更優(yōu)選大于114％。
其他變體實施方案本發(fā)明另外的實施方案中提供用于制備包括肌醇六磷酸酶變體的動物飼料的方法，所述方法包括連續(xù)的步驟i)進(jìn)行制備肌醇六磷酸酶變體的一種或多種上述方法，和ii)將制備的肌醇六磷酸酶變體添加至動物飼料。
本發(fā)明具體的實施方案中提供用于制備包括肌醇六磷酸酶變體的動物飼料的方法，所述方法包括a)選擇親本肌醇六磷酸酶，其中該親本肌醇六磷酸酶選自i.與SEQ ID No 3具有至少75％同源性的親本肌醇六磷酸酶或其功能片段ii.源自布丘氏菌屬，優(yōu)選布丘氏菌屬P1-29的親本肌醇六磷酸酶，和/或iii.至少一種肌醇六磷酸酶變體；b)在親本肌醇六磷酸酶中制造至少一種變化，所述變化為氨基酸殘基的插入、缺失或取代，以獲得肌醇六磷酸酶變體，c)篩選肌醇六磷酸酶變體，其與親本肌醇六磷酸酶相比具有如本文所述的改良的特性，優(yōu)選選自下列的一種或多種i.更高的熱穩(wěn)定性和/或ii.比活和/或iii.蛋白水解穩(wěn)定性和/或d)制備肌醇六磷酸酶變體，e)將制備的肌醇六磷酸酶變體添加至動物飼料。
本發(fā)明另外的實施方案中提供用于制備包括肌醇六磷酸酶變體的動物飼料的方法，所述方法包括a)將編碼親本肌醇六磷酸酶的核苷酸(優(yōu)選DNA)序列進(jìn)行誘變，其中所述親本肌醇六磷酸酶選自編碼以下的核苷酸i.與SEQ ID No 3具有至少75％同源性的親本肌醇六磷酸酶或其功能片段，和/或ii.源自布丘氏菌屬的親本肌醇六磷酸酶，優(yōu)選布丘氏菌屬P1-29，b)將步驟(a)中獲得的突變核苷酸(優(yōu)選DNA)序列在宿主細(xì)胞中表達(dá)，和c)篩選表達(dá)肌醇六磷酸酶變體的宿主細(xì)胞，所述變體與親本肌醇六磷酸酶相比具有如本文所述的改良的特性，優(yōu)選選自下列一種或多種
i.更高的熱穩(wěn)定性和/或ii.更高的比活和/或iii.更高的蛋白水解穩(wěn)定性和/或d)制備由所述宿主細(xì)胞表達(dá)的肌醇六磷酸酶變體f)將制備的肌醇六磷酸酶變體添加至動物飼料。
制備肌醇六磷酸酶變體的方法的所述實施方案和優(yōu)選方面還應(yīng)用到制備包含肌醇六磷酸酶變體的動物飼料的上述方法中。
本發(fā)明的另一方面提供用本文所述的編碼肌醇六磷酸酶的核酸轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。
適當(dāng)?shù)乇景l(fā)明這方面的宿主細(xì)胞包括肌醇六磷酸酶，其包含如SEQ IDNO3所示的氨基酸序列或其功能片段或與其具有至少75％同源性的序列。
在一優(yōu)選的實施方案中，所述宿主細(xì)胞產(chǎn)生肌醇六磷酸酶。
本發(fā)明的另一方面提供用本發(fā)明的編碼肌醇六磷酸酶的核酸轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。優(yōu)選，肌醇六磷酸酶為本文所述的布丘氏菌屬肌醇六磷酸酶或其同源物或衍生物。適當(dāng)?shù)厮黾〈剂姿崦赴ㄈ魏稳鏢EQ ID NO3所示的氨基酸序列或其功能片段或與其至少75％同源(同一)的序列。優(yōu)選，所述宿主細(xì)胞產(chǎn)生肌醇六磷酸酶。
在一個實施方案中，可用于本發(fā)明的核苷酸序列可獲自(盡管它實際上不一定要獲自)布丘氏菌屬，盡管將認(rèn)識到分離和/或純化自等同菌株的酶可以等同地使用。
適當(dāng)?shù)厮鏊拗骷?xì)胞源自微生物，包括細(xì)菌和真菌，包括酵母。尤其優(yōu)選的實施方案中，宿主細(xì)胞為原核的細(xì)菌細(xì)胞。合適的細(xì)菌宿主細(xì)胞包括來自不同原核分類組的細(xì)菌，其包括變形菌門(proteobacteria)，包括α，β，γ，Δ和ε細(xì)部的成員，革蘭氏陽性細(xì)菌如放線菌綱(Actinomycetes)，硬壁菌門(Firmicutes)，梭菌屬(Clostridium)和近緣生物，黃桿菌屬(flavobacteria)，藍(lán)細(xì)菌(cyanobacteria)，綠色硫細(xì)菌(green sulfurbacteria)，綠色無硫細(xì)菌(green non-sulfurbacteria)，和archaea。特別優(yōu)選的是腸桿菌科(Enterobacteriaceae)，如大腸桿菌，屬于γ細(xì)部和低GC革蘭氏陽性細(xì)菌如桿菌屬(Bacillus)的變形菌門。
合適的真菌宿主細(xì)胞包括酵母，所述酵母選自下組子囊菌門(Ascomycota)，包括酵母綱(Saccharomycetes)，如畢赤酵母屬(Pichia)，漢森酵母屬(Hansenula)，和酵母屬(saccharmyces)，裂殖酵母綱(Schizosaccharmycetes)，如粟酒裂殖酵母(Schizosacchromyces pombe)，和變形子囊菌門(anamorphic Ascomycota)，包括曲霉屬(Aspergillus)。
其它合適的真核宿主細(xì)胞包括昆蟲細(xì)胞，如SF9，SF21，Trychplusiani和M121細(xì)胞。例如，本發(fā)明的多肽可以方便地在昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)中表達(dá)。除了在培養(yǎng)的昆蟲細(xì)胞中表達(dá)之外，肌醇六磷酸酶基因還可以在完整的昆蟲生物體中表達(dá)。病毒載體如桿狀病毒可以感染完整的昆蟲。大型昆蟲，如蠶蛾，提供高產(chǎn)量的異源蛋白?？梢愿鶕?jù)常規(guī)提取技術(shù)將蛋白質(zhì)從昆蟲中提取出來。適用于本發(fā)明的表達(dá)載體包括所有能夠在昆蟲細(xì)胞系中表達(dá)外源蛋白的載體。
其它宿主細(xì)胞包括選自下組的植物細(xì)胞原生質(zhì)體、細(xì)胞、愈傷組織、組織、器官、種子、胚、胚珠、合子等。本發(fā)明還提供已經(jīng)轉(zhuǎn)化并包含本發(fā)明的重組DNA的完整植物。
術(shù)語″植物″一般包括真核藻類、有胚植物，其包括苔蘚植物門(Bryophyta)、蕨類植物門(Pteridophyta)和種子植物門(Spermatophyta)，如裸子植物亞門(Gymnospermae)和被子植物亞門(Angiospermae)。
優(yōu)選，所述宿主細(xì)胞是微生物。優(yōu)選的微生物包括原核細(xì)菌細(xì)胞，優(yōu)選大腸桿菌(E.coli)、枯草芽孢桿菌(B.Subtilis)和桿菌屬的其它物種，酵母，優(yōu)選多形漢森氏酵母(Hansenula Polymorpha)和粟酒裂殖酵母。
本發(fā)明的另一方面提供了細(xì)菌細(xì)胞菌株布丘氏菌屬P1-29，由DaniscoGlobal Innovation，Sokeritehtaantie 20，F(xiàn)IN-02460Kantvik，F(xiàn)inland在2004年9月22日保藏，保藏號NCIMB 41248。可將這種細(xì)胞直接摻入飼料中。
在另一方面，提供了一種生產(chǎn)肌醇六磷酸酶的方法，包括用本發(fā)明的表達(dá)載體或質(zhì)粒轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，在肌醇六磷酸酶的表達(dá)條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞，和從宿主細(xì)胞培養(yǎng)基中提取所述肌醇六磷酸酶。
適當(dāng)?shù)厮龇椒ㄊ巧a(chǎn)肌醇六磷酸酶的方法，包括在宿主細(xì)胞中表達(dá)如SEQ ID NO3所示的氨基酸序列或與其具有至少75％同源性的序列或其有效片段，以及從宿主細(xì)胞培養(yǎng)基中提取分泌的蛋白。
本發(fā)明的另一方面提供一種包含本發(fā)明的肌醇六磷酸酶的飼料組合物。優(yōu)選該飼料組合物包含濃度為10-10000U/kg飼料，優(yōu)選200-2000U/kg飼料，更優(yōu)選500-1000U/kg飼料的肌醇六磷酸酶。
在一個實施方案中，該飼料組分包含本發(fā)明的宿主細(xì)胞。
在另一方面提供根據(jù)本發(fā)明的肌醇六磷酸酶在食品或動物飼料中的應(yīng)用。
優(yōu)選的方面在隨附的權(quán)利要求書和后面的介紹以及實施例部分中給出優(yōu)選的方面。
其他優(yōu)點本發(fā)明是有益的，因為它提供了具有許多特性的肌醇六磷酸酶，這些特性使得其作為動物飼料的添加劑特別有用。
特別地，本發(fā)明的肌醇六磷酸酶在低pH下具有活性，優(yōu)選pH 2-5.5的范圍，活性最大值在pH 4-4.5左右。適當(dāng)?shù)乇景l(fā)明的肌醇六磷酸酶在胃環(huán)境的低pH下具有活性(pH 2.5時保留約40％的最大活性)。
另外，本發(fā)明的肌醇六磷酸酶在天然宿主和在異源表達(dá)期間都可以有效地分泌，由此導(dǎo)致更加有效的生產(chǎn)和分離，用于添加到飼料中。
而且，本發(fā)明的肌醇六磷酸酶優(yōu)選具有寬泛的底物特異性，包括五磷酸酯，四磷酸酯，三磷酸酯和二磷酸酯底物，由此增加了可用于動物吸收的總磷酸酯(可得到的磷酸酯)。本發(fā)明的肌醇六磷酸酶還優(yōu)選具有300U/mg+/-大約10％的高比活，優(yōu)選至少300U/mg。
本發(fā)明的產(chǎn)物可以用作食品和飼料的添加劑/補(bǔ)充物。該產(chǎn)物還可以用于各種肌醇磷酸酯的商業(yè)生產(chǎn)。
肌醇六磷酸/植酸/肌醇六磷酸酶植酸(肌-肌醇六磷酸(myo-inositol hexakisphosphate))是谷類、豆類、油籽作物中的重要組分。鹽的形式，肌醇六磷酸，是磷在這些植物中的主要儲存形式。
肌醇六磷酸酶催化植酸的磷酸單酯水解，其導(dǎo)致逐步形成肌-肌醇五-，四-，三-，二-和單磷酸酯，以及無機(jī)磷酸酯的釋放。
本文所用的術(shù)語″野生型肌醇六磷酸酶″或″野生型″指具有天然發(fā)現(xiàn)的氨基酸序列的肌醇六磷酸酶。
術(shù)語″肌醇六磷酸酶變體″或″變體″或″修飾形式″指具有源自親本肌醇六磷酸酶氨基酸序列的氨基酸序列的肌醇六磷酸酶，其具有一個或多個氨基酸取代、插入和/或缺失，所述取代、插入和/或缺失總稱為″突變″。
術(shù)語″親本肌醇六磷酸酶″或″親本酶″指由其衍生出肌醇六磷酸酶變體的肌醇六磷酸酶。親本肌醇六磷酸酶可以是野生型肌醇六磷酸酶或另一種肌醇六磷酸酶變體。尤其在本發(fā)明中，″親本肌醇六磷酸酶″可以源自布丘氏菌屬。適當(dāng)?shù)?，″親本肌醇六磷酸酶″源自如本文所述的布丘氏菌屬菌株P(guān)1-29，其優(yōu)選具有SEQ ID NO3所示的氨基酸序列。
分離的一方面，優(yōu)選核苷酸或氨基酸序列為分離的形式。術(shù)語″分離的″意指該序列至少基本上不含至少一種其它組分，而這種組分是與該序列天然相關(guān)聯(lián)的，如天然所發(fā)現(xiàn)的那樣。
純化的一方面，優(yōu)選核苷酸或氨基酸序列為純化的形式。術(shù)語″純化的″意指該序列處于相對純的狀態(tài)—至少1％，5％純的或10％純的，更優(yōu)選至少20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％純的。在優(yōu)選的實施方案中，當(dāng)涉及多肽時，如上定義的純度根據(jù)通過SDS-PAGE電泳從其他多肽純化而確定。在優(yōu)選的實施方案中，當(dāng)涉及多核苷酸時，如上定義的純度根據(jù)從其他多核苷酸純化而確定。
核苷酸序列本發(fā)明的范圍包括編碼具有如本文所定義的特定特性的酶的核苷酸序列。
如本文所用的術(shù)語″核苷酸序列″指寡核苷酸序列、核酸或多核苷酸序列，及其變體，同源物，片段和衍生物(如其部分)。核苷酸序列可以是基因組或合成或重組起源的，其可以是雙鏈或單鏈的，不管代表有義鏈還是反義鏈。
涉及本發(fā)明的術(shù)語″核苷酸序列″或″核酸分子″包括基因組DNA，cDNA，合成DNA，和RNA。優(yōu)選其指DNA，更優(yōu)選指編碼本發(fā)明的cDNA序列。
在優(yōu)選的實施方案中，當(dāng)涉及和當(dāng)被本發(fā)明的自身范圍所包括時，核苷酸序列并不包括處于天然環(huán)境之中、并與其天然相關(guān)聯(lián)的一個或多個序列相連的根據(jù)本發(fā)明的天然核苷酸序列，而所述天然相關(guān)聯(lián)的序列也處于其天然環(huán)境之中。為了方便參考，我們將把這種優(yōu)選的實施方案稱為“非天然核苷酸序列”。在這點上，術(shù)語″天然核苷酸序列″意指處于其天然環(huán)境之中的完整核苷酸序列，以及當(dāng)它與天然相關(guān)聯(lián)的完整啟動子可操作性連接之時，所述啟動子也處于天然環(huán)境之中。不過，本發(fā)明的范圍所包括的氨基酸序列可以是其天然生物中表達(dá)后分離和/或純化的核苷酸序列產(chǎn)物。不過，本發(fā)明的范圍所包括的氨基酸序列優(yōu)選可以在其天然生物中由核苷酸序列所表達(dá)，但是其中所述核苷酸序列并不在該生物中與所述核苷酸序列天然相關(guān)聯(lián)的啟動子的控制之下。
核苷酸序列的制備一般，本發(fā)明的范圍所包括的氨基酸序列或用于本發(fā)明的核苷酸序列是利用重組DNA技術(shù)制備的(即，重組DNA)。不過，在本發(fā)明的備選實施方案中，可以利用本領(lǐng)域公知的化學(xué)方法全部或部分地合成核苷酸序列(參見Caruthers MH(1980)Nuc Acids Res Symp Ser 215-23和Horn T等，(1980)Nuc Acids Res Symp Ser 225-232)。
由產(chǎn)生所述酶的任何細(xì)胞或生物可以鑒定和/或分離和/或純化出編碼具有如本文所定義的特定特性的酶或適于修飾的酶的核苷酸序列。本領(lǐng)域已知多種方法來鑒定和/或分離和/或純化核苷酸序列。舉例來說，一旦已經(jīng)鑒定和/或分離和/或純化了合適的序列，就可以使用PCR擴(kuò)增技術(shù)以制備更多序列。
作為進(jìn)一步的舉例，利用來自產(chǎn)生所述酶的生物的染色體DNA或信使RNA可以構(gòu)建基因組DNA和/或cDNA文庫。如果已知該酶的氨基酸序列或該酶的部分氨基酸序列，可以合成標(biāo)記的寡核苷酸探針并用來由基因組文庫鑒定編碼酶的克隆，所述文庫由所述生物制備?；蛘?，可以利用包含與另一種已知酶基因同源的序列的經(jīng)標(biāo)記的寡核苷酸探針來鑒定編碼酶的克隆。在后一種情況中，利用低嚴(yán)謹(jǐn)度的雜交和洗滌條件。
或者，可以通過將基因組DNA片段插入表達(dá)載體，如質(zhì)粒中，用得到的基因組DNA文庫轉(zhuǎn)化酶陰性細(xì)菌，隨后將轉(zhuǎn)化的細(xì)菌鋪平板到包含該酶底物(例如對于產(chǎn)葡萄糖苷酶(麥芽糖酶)的酶，底物為麥芽糖)的瓊脂板上，由此得以鑒定表達(dá)該酶的克隆，來鑒定編碼酶的克隆。
在又一個備選方案中，可以通過已確立的標(biāo)準(zhǔn)方法合成性制備編碼酶的核苷酸序列，例如由Beucage S.L.等，(1981)Tetrahedron Letters 22，p1859-1869所述的氨基磷酸酯(phosphoroamidite)方法，或由Matthes等，(1984)EMBO J.3，p 801-805所述的方法。在氨基磷酸酯方法中，例如在自動DNA合成儀中合成寡核苷酸，純化，退火并克隆在合適的載體中。
核苷酸序列可以是混合的基因組和合成起源的，混合的合成和cDNA起源的，或混合的基因組和cDNA起源的，通過根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)連接合成的、基因組的或cDNA起源(根據(jù)需要)的片段而制備。每一個連接的片段都對應(yīng)于完整核苷酸序列的各部分。還可以通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)利用特定引物來制備DNA序列，例如在US 4,683,202或在Saiki R K等，(Science(1988)239，pp 487-491)中所述的。
由于遺傳密碼的簡并性，可以輕易地生產(chǎn)核苷酸序列，其中對于一些或所有由原始核苷酸序列編碼的氨基酸改變了三聯(lián)體密碼子用法，由此產(chǎn)生與原始核苷酸具有低同源性的核苷酸序列，但是其編碼與原始核苷酸序列所編碼的相同、或變體氨基酸序列。例如，對于大多數(shù)氨基酸來說，遺傳密碼的簡并性是在三聯(lián)體密碼子中的第三個位置上(擺動位置)(參考文獻(xiàn)見Stryer，Lubert，Biochemistry，Third Edition，F(xiàn)reeman Press，ISBN0-7167-1920-7)，因此，所有三聯(lián)體密碼子都在第三位置上發(fā)生“擺動”的核苷酸序列與原始核苷酸序列將具有大約66％的同一性，然而，改變的核苷酸序列將與原始核苷酸序列編碼相同或變異的一級氨基酸序列。
因此，本發(fā)明進(jìn)一步涉及任何核苷酸序列，所述核苷酸序列對于編碼氨基酸的至少一個三聯(lián)體密碼子改變了三聯(lián)體密碼子用法，但是其與原始核苷酸序列編碼的多肽序列具有相同、或變體多肽序列。
另外，具體的生物一般對于用來編碼氨基酸的三聯(lián)體密碼子有所偏好。優(yōu)選的密碼子用法表是隨處可得的，并且可以用來制備密碼子優(yōu)化基因。常規(guī)使用這些密碼子優(yōu)化技術(shù)來優(yōu)化異源宿主中的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。
分子進(jìn)化一旦分離和/或純化了編碼酶的核苷酸序列，或鑒定了推定的編碼酶的核苷酸序列，可以希望修飾選定的核苷酸序列，例如希望對序列進(jìn)行突變從而制備根據(jù)本發(fā)明的酶。
可以利用合成性寡核苷酸引入突變。這些寡核苷酸包含位于所需突變位點側(cè)翼的核苷酸序列。
在Morinaga等(Biotechnology(1984)2，p646-649)中描述了合適的方法。在Nelson和Long(Analytical Biochemistry(1989)，180，p 147-151)中描述了將突變引入編碼酶的核苷酸序列的另一種方法。
除了諸如上面所述的定點誘變之外，還可以例如利用商業(yè)試劑盒如來自Stratagene的GeneMorph PCR誘變試劑盒，或來自Clontech的DiversifyPCR隨機(jī)誘變試劑盒隨機(jī)引入突變。
獲得新序列的第三種方法是對非同一性的核苷酸序列進(jìn)行片段化，通過利用任一種限制性酶或酶如DNA酶I，并重新組配編碼功能性蛋白質(zhì)的完整核苷酸序列?；蛘呖梢允褂靡粋€或多個非同一性核苷酸序列并在完整核苷酸序列的組配過程中引入突變。
因而，有可能在體內(nèi)或體外在核苷酸序列中產(chǎn)生多個定點或隨機(jī)突變，隨后通過各種方法篩選編碼多肽的改良的功能性。
作為非限制性實例，可以將多核苷酸序列的突變或天然變體與野生型或其它突變或天然變體重組以產(chǎn)生新的變體。也可以針對所編碼多肽的改良的功能性篩選這些新的變體。通過本領(lǐng)域公知的各種方法，例如錯誤閾值誘變(Error Threshold Mutagenesis)(WO 92/18645)，寡核苷酸介導(dǎo)的隨機(jī)誘變(US 5,723,323)，DNA改組(US 5,605,793)，外介導(dǎo)的(exo-mediated)基因組配(WO 0058517)產(chǎn)生新的優(yōu)選變體。例如在WO0134835，WO 02/097130，WO 03/012100，WO03/057247，WO 2004/018674，US 6,303,344和US 6,132,970中描述了其它合適的方法。
上述和類似的分子進(jìn)化方法的應(yīng)用可以鑒定和選擇本發(fā)明的酶的變體而無需任何蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)或功能的現(xiàn)有知識，所述變體具有優(yōu)選的特性，并且可以生產(chǎn)不可預(yù)測但有益的突變或變體。本領(lǐng)域有許多應(yīng)用分子進(jìn)化以優(yōu)化或改變酶活性的實例，所述實例包括，但不限于下列的一種或多種在宿主細(xì)胞中或體外優(yōu)化的表達(dá)和/或活性，提高的酶活性，改變的底物和/或產(chǎn)物特異性，提高或降低的酶學(xué)或結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，在優(yōu)選的環(huán)境條件，例如，溫度、pH、底物中改變的酶活性/特異性。
上述分子進(jìn)化方法可用于制備如本文所述的肌醇六磷酸酶變體的方法中。
氨基酸序列本發(fā)明的范圍還包括具有如本文所定義的特異性質(zhì)的酶的氨基酸序列。
如本文所用的，術(shù)語″氨基酸序列″與術(shù)語″多肽″和/或術(shù)語″蛋白質(zhì)″同義。在一些情況下，術(shù)語″氨基酸序列″與術(shù)語″肽″同義。在一些情況下，術(shù)語″氨基酸序列″與術(shù)語″酶″同義。
氨基酸序列可以由合適的來源制備/分離，或者其可以合成制備或者可以通過利用重組DNA技術(shù)來制備。
本發(fā)明所包括的酶可以結(jié)合其它酶使用。因而本發(fā)明還包括酶的組合，其中所述組合包含本發(fā)明的酶和另一種酶，其可以是根據(jù)本發(fā)明的另一種酶。在后面的部分中對這方面進(jìn)行討論。
當(dāng)涉及或者當(dāng)被本發(fā)明的自身范圍所包括時，氨基酸序列優(yōu)選不是天然酶。在這一點上，術(shù)語″天然酶″意指在其天然環(huán)境下的完整酶，并且當(dāng)其由天然核苷酸序列表達(dá)。
變體/同源物/衍生物本發(fā)明還包括酶的任何氨基酸序列或編碼這種酶的任何核苷酸序列的變體、同源物和衍生物的用途。
在這里，術(shù)語“同源物”意指與氨基酸序列和核苷酸序列具有一定同源性的實體。在這里，術(shù)語″同源性″可以等同于“同一性”。適當(dāng)?shù)?，在本文中″同源的″指在利用下面更加詳?xì)介紹的比對算法來比對其序列之后兩種酶之間的序列同一性。
在本文中，同源的氨基酸序列用來包括可以與序列至少75，80，81，85或90％同一，優(yōu)選至少95，96，97，98或99％同一的氨基酸序列。一般，同源物將例如與目標(biāo)氨基酸序列包含相同的活性位點。盡管同源性也可以用相似性(即具有類似化學(xué)特性/功能的氨基酸殘基)來考慮，在本發(fā)明的上下文中，優(yōu)選用序列同一性表示同源性。
“功能片段”意指保留該多肽的特征性特性的多肽片段。在本發(fā)明的上下文中，肌醇六磷酸酶的功能片段是保留完整蛋白質(zhì)的肌醇六磷酸切割能力的片段。
在本文中，同源的核苷酸序列用來包括可以與編碼本發(fā)明的酶的核苷酸序列(目標(biāo)序列)至少75，80，81，85或90％同一性，優(yōu)選至少95，96，97，98或99％同一的核苷酸序列。一般，同源物將包含與目標(biāo)核苷酸序列編碼相同活性位點等的序列。盡管同源性也可以用相似性(即具有類似化學(xué)特性/功能的氨基酸殘基)來考慮，在本發(fā)明的上下文中，優(yōu)選用序列同一性表示同源性。
對于氨基酸序列和核苷酸序列來說，可以通過肉眼，或者更常借助于易于得到的序列比較程序來進(jìn)行同源性比較。這些商業(yè)上現(xiàn)有的計算機(jī)程序可以計算兩個或多個序列之間的％同源性。
％同源性可通過毗鄰序列來計算，即，將一個序列與另一個序列進(jìn)行序列對比，并且一個序列中的每個氨基酸直接與另一個序列的相應(yīng)氨基酸進(jìn)行每次一個殘基的比較。這被稱為“無缺口的”序列對比。通常，所述無缺口的對比只在相對少量的殘基中進(jìn)行。
盡管這是非常簡單且一致的方法，但是它沒有考慮到，例如，在序除此之外相同的列配對中，一個插入或缺失將導(dǎo)致隨后的氨基酸殘基被逐出序列對比，因此當(dāng)進(jìn)行整體排列時，將很可能導(dǎo)致％同源性的大幅度下降。因此，多數(shù)序列比較方法被設(shè)計成考慮到可能的插入和缺失而不會對整體同源性積分不適當(dāng)?shù)亓P分，從而產(chǎn)生最佳的序列對比。這通過在序列對比中插入“缺口”來試圖最大化局部的同源性而實現(xiàn)。
但是，這些更復(fù)雜的方法對序列對比中出現(xiàn)的每個缺口指定了“缺口罰分”，這樣，對于相同數(shù)量的相同氨基酸，帶有盡可能少的缺口的序列對比——反映兩個比較序列之間的更高相關(guān)性—將比有較多缺口的序列獲得更高的積分。一般用“遠(yuǎn)交缺口計分(Affine gap costs)”來給缺口的存在扣(charge)較多的計分，給缺口中每個隨后的殘基扣較少罰分。這是最普遍使用的缺口積分系統(tǒng)。高缺口罰分當(dāng)然將產(chǎn)生具有較少缺口的最優(yōu)化的序列對比。多數(shù)序列對比程序允許修改缺口罰分。但是當(dāng)使用這種軟件作序列比較時，優(yōu)選使用缺省值。例如，當(dāng)使用GCG Wisconsin Bestfit包時，氨基酸序列的缺省缺口罰分是缺口為-12，每個延伸為-4。
因此最大％同源性的計算首先需要產(chǎn)生考慮到缺口罰分的最佳序列對比。用于進(jìn)行這種比對的合適的計算機(jī)程序是GCG Wisconsin Bestfit軟件包(Devereux等，1984，Nucleic Acids Research 12387)?？梢赃M(jìn)行序列比較的其他軟件的例子包括，但不局限于BLAST軟件包(參見Ausubel等，1999，Short Protocols in Molecular Biology，第四版，第18章)，F(xiàn)ASTA(Atschul等，1990，J.Mol.Biol.，403-410)和GENEWORKS比較工具系列。BLAST和FASTA都可得到，用于脫機(jī)和聯(lián)機(jī)檢索(參見Ausubel等，1999，ShortProtocols in Molecular Biology，第7-58到7-60頁)。
不過，對于一些應(yīng)用，優(yōu)選使用GCG Bestfit程序。一種稱作BLAST2序列的新工具也可以用于比較蛋白和核苷酸序列(見FEMS MicrobiolLett 1999174(2)247-50；FEMS Microbiol Lett 1999177(1)187-8和tatiana@ncbi.nlm.nih.gov)。
盡管最終同源性百分比可以根據(jù)同一性而測量，對比過程自身一般不以全或無成對比較為基礎(chǔ)。相反，通常使用按比例繪制的(scaled)相似性評分矩陣將得分分配到每個以化學(xué)相似性或進(jìn)化距離為基礎(chǔ)而進(jìn)行的成對比較。這種常用矩陣的一個例子是BLOSUM62矩陣，即BLAST程序系列的缺省矩陣。GCG Wisconsin程序一般用公共默認(rèn)值或如果已提供，則使用自定義符號比較表(更詳細(xì)內(nèi)容見用戶手冊)。對于一些應(yīng)用，優(yōu)選將公共默認(rèn)值用于GCG軟件包，或在使用其它軟件的情況下，使用缺省矩陣，如BLOSUM62。
或者，可以利用DNASISTM(Hitachi軟件)中的多重比對特征，基于類似于CLUSTAL(Higgins DG&Sharp PM(1988)，Gene 73(1)，237-244)的算法來計算百分比同源性。
一旦軟件產(chǎn)生最優(yōu)對比，就有可能計算％同源性，優(yōu)選％序列同一性。軟件一般作為序列比較的一部分進(jìn)行此計算并產(chǎn)生以數(shù)字表示的結(jié)果。
本發(fā)明優(yōu)選的方面中利用用于計算百分比序列同源性/同一性的下列軟件和設(shè)置。對于氨基酸序列的同一性(同源性)或″陽性″百分比，通過AlignXVectorNTI(來自Invitrogen Corporation，Carlsbad，California，USA.的VectorNTI Advance 9.1)對每一可能的氨基酸序列對計算。設(shè)置為缺省參數(shù)(缺口開放罰分-10，缺口延伸罰分0.1)。
對于核酸序列的同一性(同源性)或″陽性″百分比，通過來自InformaxInc.(USA)的AlignX VectorNTI程序?qū)γ恳豢赡艿暮怂嵝蛄袑τ嬎?。設(shè)置為對DNA的默認(rèn)設(shè)置，為缺口開放罰分15和缺口延伸罰分6.66(對于多重比對為相同的設(shè)置)。
優(yōu)選氨基酸同一性(同源性)跨越全長氨基酸序列計算，或?qū)τ诤怂釣榫幋a相應(yīng)全長氨基酸序列的對應(yīng)多核苷酸。
序列也可以有氨基酸殘基的缺失、插入或取代，其產(chǎn)生沉默改變并導(dǎo)致產(chǎn)生功能等同物?？梢愿鶕?jù)氨基酸特性(如殘基的極性、電荷、溶解性、疏水性、親水性、和/或雙親性)的相似而進(jìn)行有意的氨基酸取代，所以將氨基酸以官能團(tuán)分類在一起是有用的。氨基酸可以僅僅以它們的側(cè)鏈特性而分類在一起。不過，包括突變數(shù)據(jù)等更加有用。由此衍生的氨基酸組有可能由于結(jié)構(gòu)的原因而是保守的。這些組能夠以Venn圖表的形式描述(LiVingstone C.D.和Barton GJ.(1993)″Protein sequence alignmentsastrategy for the hierarchical analysis of residue conservation″Compiit.ApplBiosci.9745-756)(Taylor W.R.(1986)″The classification of amino acidconservation″J.Theor.Biol.119；205-218)。例如根據(jù)下表可以制備保守性取代，所述表描述了普遍接受的氨基酸分類的Venn圖表。
本發(fā)明也包含可以發(fā)生的同源取代(這里用到的取代和替代都表示現(xiàn)有氨基酸殘基與備選殘基的交換)，即相似物取代相似物，如堿性取代堿性，酸性取代酸性，極性取代極性等等。也可發(fā)生非-同源取代，即從一類殘基取代為另一類，或者包括引入非天然氨基酸如鳥氨酸(以下簡稱Z)，二氨基丁酸鳥氨酸(以下簡稱B)，正亮氨酸鳥氨酸(以下簡稱O)，吡啶丙氨酸，噻吩丙氨酸，萘基丙氨酸和苯基甘氨酸。
也可通過非天然氨基酸進(jìn)行替代。
變體氨基酸序列可以包括可以插入序列的任意兩個氨基酸殘基之間的適當(dāng)間隔子基團(tuán)，包括烷基，例如甲基、乙基或丙基，以及氨基酸間隔子，如甘氨酸或β丙氨酸殘基。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將容易理解變異的其它形式，其包括類肽形式的一種或更多氨基酸殘基的存在。為了免除懷疑，“類肽形式”用來指變體氨基酸殘基，其中α碳取代基是在殘基的氮原子上，而不是在α碳上。制備類肽形式的肽的方法是本領(lǐng)域中公知的，如Simon RJ等，PNAS(1992)89(20)，9367-9371和Horwell DC，Trends Biotechnol.(1995)13(4)，132-134。
用于本發(fā)明的核苷酸序列可以包括合成或修飾的核苷酸。寡核苷酸的許多不同類型的修飾是本領(lǐng)域已知的。這些包括甲基膦酸酯和硫代磷酸酯主鏈，和/或在分子的3′和5′端添加吖啶或多聚賴氨酸鏈。為了本發(fā)明的目的，要理解在此所描述的核苷酸序列可以通過本領(lǐng)域已有的任何方法進(jìn)行修飾?？梢赃M(jìn)行這種修飾以便提高體內(nèi)活性或本發(fā)明的核苷酸序列的壽命。
本發(fā)明還包括與本文給出的序列互補(bǔ)的核苷酸序列，或其任何衍生物、片段或其衍生物的用途。如果序列與其片段互補(bǔ)那么該序列可以用作探針來在其它生物等中鑒定類似的編碼序列。
可以以多種方式獲得與本發(fā)明的序列不具有100％同源性但是落在本發(fā)明范圍內(nèi)的多核苷酸?？梢岳缤ㄟ^探測從許多個體，例如來自不同種群的個體制備的DNA文庫，來獲得本文所述的序列的其它變體。此外，可以獲得其它的同源物并且這樣的同源物及其片段通常能夠任選地與在本文的序列表中顯示的序列雜交。這樣的序列可以通過探測制備自其它物種的cDNA文庫或來自其它物種的基因組DNA文庫，并在中度至高嚴(yán)格條件下，用包含在后附的序列表中的任何一個序列的全部或部分的探針探測這些文庫來獲得。應(yīng)用類似的考慮來獲得本發(fā)明的多肽或核苷酸序列的物種同源物和等位基因變體。
還可以使用簡并PCR來獲得變體和菌株/物種同源物，所述簡并PCR使用這樣的引物，所述引物被設(shè)計以靶向變體和同源物中的序列，所述序列編碼本發(fā)明的序列中的保守氨基酸序列。保守序列可以例如通過比對來自數(shù)種變體/同源物的氨基酸序列進(jìn)行預(yù)期。序列比對可以使用本領(lǐng)域已知的計算機(jī)軟件來進(jìn)行。例如，廣泛使用GCG Wisconsin PileUp程序。
在簡并PCR中使用的引物包含一個或多個簡并位點并且將在這樣的嚴(yán)格條件下使用，所述嚴(yán)格條件低于用針對已知序列的單序列引物克隆序列所使用的那些條件。
或者，這些多核苷酸可以通過被表征的序列的定點誘變來獲得。這在例如需要沉默密碼子序列變化以優(yōu)化特定宿主細(xì)胞的密碼子偏好的情況中可以是有用的，在所述特定宿主細(xì)胞中多核苷酸序列被表達(dá)。可能需要其它的序列變化以引入限制性酶識別位點，或改變由所述多核苷酸編碼的多肽的性質(zhì)或功能。
可以使用本發(fā)明的多核苷酸(核苷酸序列)來產(chǎn)生引物，例如PCR引物，用于選擇性擴(kuò)增反應(yīng)的引物，探針例如，通過常規(guī)方式，使用放射性或非放射性標(biāo)記標(biāo)記以具有顯示性的標(biāo)記，或者可以將所述多核苷酸克隆入載體中。這些引物、探針和其它片段的長度將至少為15，優(yōu)選至少20，例如至少25，30或40個核苷酸，并且也被本文所用的術(shù)語本發(fā)明的多核苷酸所包括。
可以重組性地，合成性地，或通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法來生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸如DNA多核苷酸和探針。其還可以通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行克隆。通常，將通過合成方法來生產(chǎn)引物，包括一次一個核苷酸來逐步生產(chǎn)所需的核酸序列。利用自動技術(shù)實現(xiàn)此的技術(shù)可以輕易在現(xiàn)有技術(shù)中獲得。
一般將利用重組方法來生產(chǎn)較長的多核苷酸，例如利用PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))克隆技術(shù)?？梢詫⒁镌O(shè)計成包含合適的限制性酶識別位點從而可以將擴(kuò)增的DNA克隆入合適的克隆載體中。
生物學(xué)活性優(yōu)選所述變體序列等與本文所給出的序列至少同樣具有生物學(xué)活性。
如本文所用的“生物學(xué)活性”指一種序列，其具有與天然發(fā)生的序列相似的結(jié)構(gòu)功能(但不必同等程度)，和/或相似的調(diào)控功能(但不必同等程度)，和/或相似的生化功能(但不必同等程度)。
尤其，變體序列或其修飾形式具有與本文鑒定的肌醇六磷酸酶酶學(xué)譜相似的酶學(xué)譜。這種譜包括諸如作為分泌蛋白的特征，具有pH2-5.5范圍的最佳pH，優(yōu)選4.0-4.5，在pH2-5.5范圍下保留至少50％的最大活性，和/或具有超過300U/mg的比活。
雜交本發(fā)明還包括與本發(fā)明的序列互補(bǔ)的序列或可以與本發(fā)明的序列或其互補(bǔ)序列雜交的序列。
如本文所用的術(shù)語“雜交”應(yīng)包括“使核酸鏈通過堿基配對與互補(bǔ)鏈結(jié)合的過程”，以及在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)中進(jìn)行的擴(kuò)增過程。
本發(fā)明還包含可以與這里所述序列，或其任意衍生物、片段或其衍生物互補(bǔ)的序列雜交的核苷酸序列的用途。
術(shù)語“變體”還包括可以與這里所述核苷酸序列雜交的序列互補(bǔ)的序列。
優(yōu)選，術(shù)語“變體”包括可以在嚴(yán)謹(jǐn)條件下(如50℃和0.2×SSC{1×SSC＝0.15M NaCl，0.015M檸檬酸鈉pH7.0})與此處呈現(xiàn)的核苷酸序列雜交的序列互補(bǔ)的序列。
更優(yōu)選，術(shù)語“變體”包括可以在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下(如65℃和0.1×SSC{1×SSC＝0.15M NaCl，0.015M檸檬酸鈉pH7.0})與此處呈現(xiàn)的核苷酸序列雜交的序列互補(bǔ)的序列。
本發(fā)明還涉及可以與本發(fā)明的核苷酸序列雜交的核苷酸序列(包括本文給出序列的互補(bǔ)序列)。
本發(fā)明還涉及與可以與本發(fā)明的核苷酸序列雜交的核苷酸序列(包括本文給出序列的互補(bǔ)序列)互補(bǔ)的核苷酸序列。
可以在中度到最大嚴(yán)謹(jǐn)度條件下與本文給出的核苷酸序列雜交的多核苷酸序列也包括在本發(fā)明的范圍中。
在一個優(yōu)選方面，本發(fā)明包含可以在嚴(yán)謹(jǐn)條件下(如50℃和0.2×SSC)與本發(fā)明的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列雜交的核苷酸序列。
在一個更優(yōu)選的方面，本發(fā)明包含可以在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下(如65℃和0.1×SSC)與本發(fā)明的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列雜交的核苷酸序列。
定點誘變一旦分離和/或純化出編碼酶的核苷酸序列，或鑒定出推定的編碼酶的核苷酸序列，可以預(yù)期使序列突變，從而制備本發(fā)明的酶。
可以用合成寡核苷酸引入突變。這些寡核苷酸含有所需突變位點的側(cè)翼核苷酸序列。
適合的方法公開于Morinaga等(Biotechnology(1984)2，p646-649)中。另一種將突變引入編碼酶的核苷酸序列中的方法描述于Nelson和Long(Analytical Biochemistry(1989)，180，p147-151)。另一種方法描述于Sarkar和Sommer(Biotechniques(1990)，8，p404-407-“The megaprimer methodof site directed mutagenesis”)中。
重組的在一方面，用于本發(fā)明的序列是重組序列—即已經(jīng)利用重組DNA技術(shù)制備的序列。
這些重組DNA技術(shù)是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能力范圍內(nèi)的技術(shù)。這些技術(shù)在文獻(xiàn)，例如，J.Sambrook，E.F.Fritsch，和T.Maniatis，1989，MolecularCloningA Laboratory Manual，Second Edition，Books 1-3，Cold Spring HarborLaboratory Press中進(jìn)行了解釋。
合成的在一方面，用于本發(fā)明的序列是合成的序列—即已經(jīng)通過體外化學(xué)或酶學(xué)合成制備的序列。其包括但不限于，用宿主生物偏好的密碼子用法制備的序列—所述宿主生物如甲基營養(yǎng)型酵母畢赤酵母屬和漢森酵母屬。
酶的表達(dá)用于本發(fā)明的核苷酸序列可以被并入重組可復(fù)制載體。該載體可以用于復(fù)制、和在相容性宿主中和/或由相容性宿主以酶的形式表達(dá)該核苷酸序列。
可以用控制序列例如調(diào)控序列控制表達(dá)。
通過核苷酸序列表達(dá)而由宿主重組細(xì)胞產(chǎn)生的酶可以被分泌，或包含在細(xì)胞內(nèi)，這取決于使用的序列和/或載體?？梢詫⒕幋a序列設(shè)計為具有信號序列，該信號序列增強(qiáng)編碼序列通過特定原核或真核細(xì)胞膜的直接分泌。
有利地，本發(fā)明的酶是分泌的。
表達(dá)載體術(shù)語“質(zhì)?！?、“載體系統(tǒng)”或“表達(dá)載體”意指能夠體內(nèi)或體外表達(dá)的構(gòu)建體。在本發(fā)明的上下文中，這些構(gòu)建體可以用來將編碼酶的基因?qū)胨拗骷?xì)胞中。適當(dāng)?shù)?，其表達(dá)可被導(dǎo)入的基因可以稱作“可表達(dá)的轉(zhuǎn)基因”。
優(yōu)選，將表達(dá)載體摻入合適的宿主生物體的基因組。術(shù)語“摻入”優(yōu)選包括穩(wěn)定摻入基因組。
本文所述的核苷酸序列，包括本發(fā)明的核苷酸序列，可以存在于載體中，其中核苷酸序列被可操作性連接到調(diào)控序列上，所述調(diào)控序列能夠通過適當(dāng)宿主生物體提供核苷酸序列的表達(dá)。
用于本發(fā)明的載體可以被轉(zhuǎn)化到下面所述的適當(dāng)宿主細(xì)胞中，從而提供本發(fā)明多肽的表達(dá)。
載體例如質(zhì)粒、粘?；蚴删w載體的選擇通常將取決于其將要導(dǎo)入的宿主細(xì)胞。
用于本發(fā)明的載體可以包含一種或多個可選擇的標(biāo)記基因—如賦予抗生素抗性例如氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素或四環(huán)素抗性的基因?；蛘?，可以通過共轉(zhuǎn)化來實現(xiàn)選擇(如WO91/17243中所述)。
可以體外使用載體，例如來生產(chǎn)RNA，或用來轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)或感染宿主細(xì)胞。
因而，在另一個實施方案中，本發(fā)明提供制備本發(fā)明的核苷酸序列的方法，該方法是通過將本發(fā)明的核苷酸序列導(dǎo)入可復(fù)制的載體，將該載體導(dǎo)入相容的宿主細(xì)胞中，和在能夠帶來載體復(fù)制的條件下生長所述宿主細(xì)胞而進(jìn)行的。
所述載體可以進(jìn)一步包含能夠使載體在所研究的宿主細(xì)胞中復(fù)制的核苷酸序列。這些序列的實例為質(zhì)粒pUC19，pACYC177，pUB110，pE194，pAMBl，pIJ101、pTZ12和pET11的復(fù)制起點。
調(diào)控序列在一些應(yīng)用中，用于本發(fā)明的核苷酸序列可操作性地連接到調(diào)控序列上，所述調(diào)控序列能夠提供核苷酸序列的表達(dá)，如通過選定的宿主細(xì)胞的表達(dá)。例如，本發(fā)明包括這樣一種載體，其包含可操作性地連接到這種調(diào)控序列上的本發(fā)明的核苷酸序列，即所述載體是表達(dá)載體。
術(shù)語“可操作性地連接”指一種毗連，其中所述組分的關(guān)系使得其以其所希望的方式發(fā)揮作用。以特定的方式連接“可操作性地連接”到編碼序列上的調(diào)控序列，從而在與控制序列相容的條件下實現(xiàn)編碼序列的表達(dá)。
術(shù)語“調(diào)控序列”包括啟動子和增強(qiáng)子和其它表達(dá)調(diào)控信號。
以本領(lǐng)域正常意義使用術(shù)語“啟動子”，例如RNA聚合酶結(jié)合位點。
還可以通過選擇異源調(diào)控區(qū)例如啟動子、分泌前導(dǎo)區(qū)和終止子區(qū)域來增加編碼本發(fā)明的酶的核苷酸序列的表達(dá)。
優(yōu)選，根據(jù)本發(fā)明的核苷酸序列可操縱地與至少一個啟動子連接。
指導(dǎo)核苷酸序列在細(xì)菌、真菌或酵母宿主中轉(zhuǎn)錄的合適的啟動子的實例是本領(lǐng)域眾所周知的。
構(gòu)建體構(gòu)建體術(shù)語“構(gòu)建體”—其與術(shù)語如“綴合物”、“盒”和“雜交體”同義—包括按照本發(fā)明使用直接或間接連接于啟動子的核苷酸序列。
間接連接的實例是在啟動子和本發(fā)明的核苷酸序列之間提供適合的間隔子基團(tuán)，如內(nèi)含子序列，如Sh1-內(nèi)含子或ADH內(nèi)含子。涉及本發(fā)明的術(shù)語“融合的”也是如此，其包括直接或間接連接。在一些情況中，該術(shù)語不包括核苷酸序列的天然組合，所述核苷酸序列編碼與野生型基因啟動子相關(guān)聯(lián)的蛋白質(zhì)，并且當(dāng)它們均處在天然環(huán)境中時。
所述構(gòu)建體可以甚至包含或表達(dá)容許選擇遺傳構(gòu)建體的標(biāo)記。
對于一些應(yīng)用而言，優(yōu)選地，本發(fā)明的構(gòu)建體至少包含與啟動子可操縱連接的本發(fā)明的核苷酸序列。
宿主細(xì)胞涉及本發(fā)明的術(shù)語″宿主細(xì)胞″包括任何細(xì)胞，所述細(xì)胞包含如上所述的核苷酸序列或表達(dá)載體，并且用于重組生產(chǎn)具有如本文定義的具體的性質(zhì)的酶，或用于本發(fā)明的方法。
因此，本發(fā)明的另一個實施方案提供用表達(dá)本發(fā)明所述的酶的核苷酸序列轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。選擇細(xì)胞來與所述載體相容并且所述細(xì)胞可以例如是原核生物(例如細(xì)菌)、真菌、酵母或植物細(xì)胞。優(yōu)選地，所述宿主細(xì)胞不是人細(xì)胞。
合適的細(xì)菌宿主生物的實例是革蘭氏陽性或革蘭氏陰性細(xì)菌物種。
在一優(yōu)選的實施方案中，宿主細(xì)胞為大腸桿菌，如已觀察到布丘氏菌屬P1-29肌醇六磷酸酶在大腸桿菌中有效分泌。在一種或多種下列表達(dá)宿主中異源表達(dá)后，鑒定肌醇六磷酸酶，包括變體大腸桿菌K12；枯草芽孢桿菌；釀酒酵母。這些宿主因此也是優(yōu)選的。
根據(jù)編碼本發(fā)明的酶的核苷酸序列的性質(zhì)和/或?qū)τ谶M(jìn)一步加工表達(dá)的蛋白質(zhì)的需要，可以優(yōu)選真核宿主，如酵母或其它真菌。通常，酵母細(xì)胞優(yōu)于真菌細(xì)胞，因為它們易于操縱。然而，一些蛋白質(zhì)不易從酵母細(xì)胞中分泌，或在一些情況中不能正確加工(例如，在酵母中過度糖基化)。在這些情況中，應(yīng)該選擇不同的真菌宿主生物。
使用合適的宿主細(xì)胞—如酵母，真菌和植物宿主細(xì)胞—可以提供翻譯后修飾(例如，十四烷酰化，糖基化，平截，lapidation和酪氨酸、絲氨酸或蘇氨酸磷酸化)，因為可能需要給本發(fā)明的重組表達(dá)產(chǎn)物賦予優(yōu)化的生物活性。
宿主細(xì)胞可以是蛋白酶缺陷或蛋白酶負(fù)型菌株。
可以修飾宿主細(xì)胞的基因型來提高表達(dá)。
宿主細(xì)胞修飾的實例包括蛋白酶缺陷，稀有tRNA′s的補(bǔ)充，和改變在細(xì)胞質(zhì)中的還原電勢以增加二硫鍵形成。
例如，宿主細(xì)胞大腸桿菌可以過量表達(dá)稀有的tRNA′s以提高異源蛋白質(zhì)的表達(dá)，如在Kane(Curr Opin Biotechnol(1995)，6，494-500″Effects ofrare codon clusters on high-level expression of heterologus proteins in E.coli″中例示/描述。所述宿主細(xì)胞可以缺乏許多還原酶，因此有利于形成穩(wěn)定的二硫鍵，如在Bessette(Proc Natl Acad Sci USA(1999)，96，13703-13708″Efficient folding of proteins with multiple disulphide bonds in the Escherichiacoli cytoplasm″)中例示/描述。
在一個實施方案中，本發(fā)明上下文中的宿主細(xì)胞包括可以直接添加到動物飼料中的那些細(xì)胞。
生物體涉及本發(fā)明的術(shù)語″生物體″包括這樣的任何生物，所述生物可以包括編碼如在本發(fā)明中所述的酶的核苷酸序列和/或獲自其中產(chǎn)物，和/或其中當(dāng)本發(fā)明的核苷酸序列存在于所述生物中時，啟動子可以容許根據(jù)本發(fā)明的核苷酸序列的表達(dá)。
合適的生物體可以包括原核生物、真菌、酵母或植物。
涉及本發(fā)明的術(shù)語″轉(zhuǎn)基因生物″可以包括這樣的任何生物，所述生物包括編碼如在本發(fā)明中所述的酶的核苷酸序列和/或獲自其中的產(chǎn)物，和/或其中啟動子可以容許根據(jù)本發(fā)明的核苷酸序列在所述生物中的表達(dá)的任何生物。優(yōu)選地，將所述核苷酸序列摻入所述生物的基因組中。
術(shù)語″轉(zhuǎn)基因生物″不包括當(dāng)它們在其天然啟動子控制下時，在它們天然環(huán)境中的天然核苷酸編碼序列，所述天然啟動子也在其天然環(huán)境中。
因此，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因生物包括這樣的生物，所述生物包含編碼如本發(fā)明所述的酶的核苷酸序列，根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)建體，根據(jù)本發(fā)明的載體，根據(jù)本發(fā)明的質(zhì)粒，根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞，根據(jù)本發(fā)明的組織，或其產(chǎn)物的中任何一種，或其組合。
例如，所述轉(zhuǎn)基因生物還可以包括在異源啟動子控制下編碼本發(fā)明的酶的核苷酸序列。
宿主細(xì)胞/生物體的轉(zhuǎn)化如前面指出，宿主生物可以是原核生物體或真核生物體。合適的原核生物宿主的實例包括大腸桿菌和枯草芽孢桿菌。
關(guān)于原核宿主的轉(zhuǎn)化的教導(dǎo)在本領(lǐng)域的文獻(xiàn)中有充分記載，例如見Sambrook等(Molecular CloningA Laboratory Manual，第二版，1989，ColdSpring Harbor Laboratory Press)。其它合適的方法在本文實施例中提出。如果使用原核宿主，那么核苷酸序列可能需要在轉(zhuǎn)化前進(jìn)行適當(dāng)?shù)匦揎棥缤ㄟ^去除內(nèi)含子進(jìn)行修飾。
絲狀真菌細(xì)胞可以使用本領(lǐng)域已知的各種方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化——諸如包括形成原生質(zhì)體和轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體，隨后以已知方式再生細(xì)胞壁的方法。在EP 0 238 023中描述了將曲霉屬(Aspergillus)用作宿主微生物。
另一種宿主生物體可以是植物。用于轉(zhuǎn)化植物的一般技術(shù)的綜述可以見于Potrykus(Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol42205-225)和Christou(Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17-27)的文章。關(guān)于植物轉(zhuǎn)化的另外的教導(dǎo)可以見于EP-A-0449375。
關(guān)于真菌、酵母和植物的轉(zhuǎn)化的一般教導(dǎo)見于下面的部分。
轉(zhuǎn)化的真菌宿主生物可以是真菌——如絲狀真菌。合適的這樣的宿主的實例包括屬于高濕霉屬(Thermomyces)，支頂孢屬(Acremonium)，曲霉屬，青霉屬(Penicillium)，毛霉屬(Mucor)，脈孢菌(Neurospora)，木霉屬(Trichoderma)等屬的任何成員。
關(guān)于轉(zhuǎn)化絲狀真菌的教導(dǎo)綜述于US-A-5741665，其陳述了轉(zhuǎn)化絲狀真菌的的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，培養(yǎng)所述真菌是本領(lǐng)域眾所周知的。用于粗糙鏈孢霉(N.crassa)的技術(shù)的廣泛綜述見于例如Davis和de Serres，Methods Enzymol(1971)17A79-143。
關(guān)于轉(zhuǎn)化絲狀真菌的另外的教導(dǎo)綜述于US-A-5674707。
在一方面，宿主生物可以是曲霉菌屬生物，如黑曲霉(Aspergillus niger)。
還可以按照，例如Turner G.1994(Vectors for genetic manipulation.InMartinelli S.D.，Kinghorn J.R.(Editors)Aspergillus50years on.Progress inindustrial microbiology vol 29.Elsevier Amsterdam 1994.pp.641-666)的教導(dǎo)制備根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因曲霉屬。
基因在絲狀真菌中的表達(dá)已經(jīng)綜述于Punt等.(2002)Trends Biotechnol2002May；20(5)200-6，Archer&Peberdy Crit Rev Biotechnol(1997)17(4)273-306中。
轉(zhuǎn)化的酵母在另一個實施方案中，轉(zhuǎn)基因生物體可以是酵母。
在例如Methods Mol Biol(1995)，49341-54，和Curr Opin Biotechnol(1997)Oct；8(5)554-60中提供關(guān)于異源基因在酵母中表達(dá)的原理的綜述。
在該方面，可以將酵母——諸如物種釀酒酵母(Saccharomyces cerevisi)或巴斯德畢赤氏酵母(Pichia pastoris)(見FEMS Microbiol Rev(2000 24(1)45-66)用作異源基因表達(dá)的載體。
在E Hinchcliffe E Kenny(1993，″Yeasts as a vehicle for the expression ofheterologous genes″，Yeasts，Vol 5，Anthony H Rose and J Stuart Harrison，eds，第二版，Academic Press Ltd.)中提供在釀酒酵母中異源基因表達(dá)和基因產(chǎn)物的分泌的原理的綜述。
對于酵母的轉(zhuǎn)化，已經(jīng)開發(fā)了一些轉(zhuǎn)化方法。例如，可以按照Hinnen等，(1978，Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 75，1929)；Beggs，J D(1978，Nature，London，275，104)；和Ito，H等(1983，J Bacteriology 153，163-168)的教導(dǎo)制備根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因的酵母。
可以使用各種選擇標(biāo)記——如營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記、顯性抗生素抗性標(biāo)記來選擇轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞。
轉(zhuǎn)化的植物/植物細(xì)胞適合于本發(fā)明的宿主生物可以是植物。一般技術(shù)的綜述可以見于Potrykus(Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol42205-225)和Christou(Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 199417-27)的文章。
培養(yǎng)和生產(chǎn)用本發(fā)明的核苷酸序列轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞可以在有益于編碼的酶的產(chǎn)生并有利于酶從所述細(xì)胞和/或培養(yǎng)基中回收的條件下培養(yǎng)。
用于培養(yǎng)所述細(xì)胞的培養(yǎng)基可以是適合于培養(yǎng)目的宿主細(xì)胞并獲得所述酶的表達(dá)的任何常用培養(yǎng)基。
可以在細(xì)胞的表面上呈現(xiàn)由重組細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。
酶可以從宿主細(xì)胞中分泌并可以方便地使用眾所周知的方法從培養(yǎng)基中回收。
分泌可以希望使酶從表達(dá)宿主中分泌到其中酶可能更易于回收的培養(yǎng)基中。根據(jù)本發(fā)明，分泌前導(dǎo)序列可以基于期望的表達(dá)宿主進(jìn)行選擇。雜交體信號序列也可以用于本發(fā)明的背景中。
異源分泌前導(dǎo)序列的典型實例是從真菌淀粉葡糖苷酶(AG)基因(glaA-例如來自曲霉菌的18和24個氨基酸的形式)，α-因子基因(酵母，例如，酵母屬(Saccharomyces)，克魯維酵母屬(Kluyveromyces)和漢森氏酵母屬(Hansenula))或α-淀粉酶基因(芽孢桿菌屬)起源的那些。
作為實例，在大腸桿菌中的異源蛋白質(zhì)的分泌在Methods Enzymol(1990)182132-43中進(jìn)行綜述。
檢測用于檢測和測量氨基酸序列的表達(dá)的各種方法是本領(lǐng)域眾所周知的。實例包括酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)，放射免疫測定法(RIA)和熒光激活的細(xì)胞分選術(shù)(FACS)。
廣泛種類的標(biāo)記和綴合技術(shù)是本領(lǐng)域那些技術(shù)人員已知的并且可以用在多種核酸和氨基酸測試中。
許多公司如Pharmacia Biotech(Piscataway，NJ)，Promega(Madison，WI)，和US Biochemical Corp(Cleveland，OH)提供用于這些步驟的商業(yè)試劑盒和方法。
適合的報告分子或標(biāo)記包括那些放射性核素，酶，熒光，化學(xué)發(fā)光，或顯色劑以及底物，輔因子，抑制劑，磁性顆粒等。教導(dǎo)這些標(biāo)記的應(yīng)用的專利包括US-A-3,817,837；US-A-3,850,752；US-A-3,939,350；US-A-3,996,345；US-A-4,277,437；US-A-4,275,149和US-A-4,366,241。
此外，可以如在US-A-4,816,567中所顯示產(chǎn)生重組免疫球蛋白。
檢測肌醇六磷酸酶活性的其它合適的測試法是本領(lǐng)域已知的并且在本文進(jìn)行例示。
融合蛋白可以將根據(jù)本發(fā)明使用的氨基酸序列作為融合蛋白進(jìn)行制備，從而例如有助于提取和純化。融合蛋白配偶體的實例包括谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)，6xHis，GAL4(DNA結(jié)合和/或轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域)和β-半乳糖苷酶。在融合蛋白配偶體和目標(biāo)蛋白序列之間包括蛋白水解剪切位點從而容許去除融合蛋白序列也可以是有利的。
優(yōu)選地，融合蛋白不會干擾蛋白質(zhì)序列的活性。
已經(jīng)在Curr Opin Biotechnol(1995)6(5)501-6中綜述了在大腸桿菌中的基因融合表達(dá)系統(tǒng)。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，氨基酸序列可以連接于異源序列以編碼融合蛋白。例如，為了篩選能夠影響物質(zhì)活性的試劑的肽庫，編碼表達(dá)由商購抗體識別的異源表位的嵌合物質(zhì)可以是有用的。
其它序列還可以結(jié)合一個或多個另外的目標(biāo)蛋白質(zhì)(POI)或目標(biāo)核苷酸序列(NOI)來使用根據(jù)本發(fā)明應(yīng)用的序列。
POI的非限制性實例包括木聚糖酶，脂肪酶，酸性磷酸酶和/或其它。這些包括例如調(diào)節(jié)飼料粘性的酶。所述NOI甚至可以是任何那些序列的反義序列。
POI甚至可以是融合蛋白，從而例如有助于提取和純化或有利于增加體內(nèi)肌醇六磷酸代謝。
POI甚至可以與分泌序列融合。
其它的序列也可以有利于分泌或增加分泌的POI的產(chǎn)率。這些序列可以編碼伴侶蛋白，如例如在英國專利申請9821198.0中所述的黑曲霉cyp B基因的產(chǎn)物。
可以出于許多原因?qū)幋aPOI的NOI進(jìn)行改造從而改變它們的活性，包括但不限于，改進(jìn)其表達(dá)產(chǎn)物的加工和/或表達(dá)的改變。作為進(jìn)一步的實例，還可以修飾NOI以優(yōu)化在特定宿主細(xì)胞中的表達(dá)?？赡苄枰渌男蛄懈淖儚亩胂拗菩悦缸R別位點。
編碼POI的NOI在其中可以包括合成或修飾的核苷酸——諸如甲基膦酸酯和硫代磷酸酯主鏈。
可以修飾編碼POI的NOI從而增加細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性和半衰期?？赡艿男揎棸?，但不限于，加入分子的5′和/或3′末端的旁側(cè)序列或在所述分子的主鏈中使用硫代磷酸酯或2’O-甲基而不是磷酸二酯鍵。
抗體本發(fā)明的一個方面涉及與SEQ ID No.3的氨基酸具有免疫反應(yīng)性的氨基酸。
可以通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，諸如用本發(fā)明的物質(zhì)進(jìn)行免疫或通過使用噬菌體展示文庫產(chǎn)生抗體。
出于本發(fā)明的目的，除非相反地指出，術(shù)語“抗體”包括，但不限于，多克隆，單克隆，嵌合的，單鏈，F(xiàn)ab片段，通過Fab表達(dá)文庫產(chǎn)生的片段及其模擬物。這些片段包括完整抗體的片段，其保留它們對于目標(biāo)物質(zhì)，F(xiàn)v，F(xiàn)(ab′)和F(ab′)2片段，以及單鏈抗體(scFv)，融合蛋白和包括抗體的抗原結(jié)合位點的其它合成蛋白質(zhì)的結(jié)合活性。此外，抗體及其片段可以是人源化抗體。中和抗體，即，抑制物質(zhì)多肽的生物活性的那些，對于診斷和治療是尤其優(yōu)選的。
如果需要多克隆抗體，用本發(fā)明的序列(或包含其免疫表位的序列)免疫選定的哺乳動物(例如，小鼠，兔，山羊，馬等)。根據(jù)宿主的物種，可以使用各種佐劑來增加免疫應(yīng)答。
收集來自被免疫的動物的血清，并根據(jù)已知的方法對其進(jìn)行處理。如果包含針對本發(fā)明的序列(或包含其免疫表位的序列)的多克隆抗體的血清包含針對其它抗原的抗體，可以通過免疫親和層析來純化多克隆抗體。用于產(chǎn)生和加工多克隆抗血清的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的。為了可以制備這些抗體，本發(fā)明還提供本發(fā)明的多肽或其片段，其半抗原化(haptenise)成另一種多肽來在動物或人中用作免疫原。
針對本發(fā)明的序列(或包含其免疫表位的序列)的單克隆抗體還可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地制備，并且包括，但不限于，雜交瘤技術(shù)Koehler和Milstein(1975Nature 256495-497)，人B-細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kosbor等，(1983)Immunol Today 472；Cote等，(1983)Proc Natl Acad Sci802026-2030)和EBV-雜交瘤技術(shù)(Cole等，(1985)Monoclonal Antibodiesand Cancer Therapy，Alan Rickman Liss Inc，pp 77-96)。
此外，可以使用為產(chǎn)生“嵌合抗體”所開發(fā)的技術(shù)，剪接小鼠抗體基因與人抗體基因從而獲得具有適合的抗原特異性和生物活性的分子(Morrison等(1984)Proc Natl Acad Sci 816851-6855；Neuberger等，(1984)Nature312604-608；Takeda等，(1985)Nature 314452-454)。
或者，可以將對于生產(chǎn)單鏈抗體所述的技術(shù)(美國專利號4,946,779)進(jìn)行改進(jìn)以產(chǎn)生物質(zhì)特異性單鏈抗體。
還可以產(chǎn)生包含對于所述物質(zhì)的特異性結(jié)合位點的抗體片段。例如，這樣的片段包括，但不限于，可以通過用胃蛋白酶消化抗體分子產(chǎn)生的F(ab′)2片段和可以通過還原F(ab′)2片段的二硫鍵產(chǎn)生的Fab片段。或者，可以構(gòu)建Fab表達(dá)文庫以容許快速和容易地鑒定具有需要的特異性的單克隆Fab片段。(Huse WD等，(1989)Science 2561275-1281)。
大規(guī)模應(yīng)用在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，將編碼布丘氏菌屬衍生的肌醇六磷酸酶的氨基酸序列或本發(fā)明的方法用于大規(guī)模的應(yīng)用。具體而言，本發(fā)明的方法可以用于大規(guī)模生產(chǎn)肌醇六磷酸酶以作為食品或飼料組合物的添加劑/補(bǔ)充物進(jìn)行工業(yè)應(yīng)用。
優(yōu)選，在培養(yǎng)宿主生物后，所述氨基酸序列以每升總細(xì)胞培養(yǎng)物體積的5g到每升約10g的量產(chǎn)生。
優(yōu)選，在培養(yǎng)宿主生物體后，所述氨基酸序列以每升總細(xì)胞培養(yǎng)物體積的100mg到約每升900mg的量產(chǎn)生。
優(yōu)選，在培養(yǎng)宿主生物后，所述氨基酸序列以每升總細(xì)胞培養(yǎng)物體積的250mg到約每升500mg的量產(chǎn)生。
肌醇六磷酸酶的應(yīng)用如上文指出，本發(fā)明還涉及如本文所述的肌醇六磷酸酶的生產(chǎn)。
具體而言，本發(fā)明還涉及將在本文公開的氨基酸序列用于制備有機(jī)和無機(jī)的磷酸鹽(酯)化合物。
因此，本發(fā)明還涉及將編碼肌醇六磷酸酶的核苷酸序列用于產(chǎn)生表達(dá)所述肌醇六磷酸酶的表達(dá)載體或系統(tǒng)。
此外，本發(fā)明涉及將這些表達(dá)載體或系統(tǒng)用于產(chǎn)生表達(dá)肌醇六磷酸酶的宿主細(xì)胞。
本發(fā)明還涉及將修飾的宿主細(xì)胞用于產(chǎn)生有機(jī)和無機(jī)磷酸鹽(酯)化合物的前體或用于產(chǎn)生特定的有機(jī)磷酸鹽(酯)化合物。
合適的有機(jī)和無機(jī)磷酸鹽(酯)化合物包括肌-肌醇五-，四-，三-，二-和單磷酸。
因此適當(dāng)?shù)?，本發(fā)明提供產(chǎn)生有機(jī)磷酸鹽(酯)化合物的方法，所述方法包括用衍生自布丘氏菌屬的肌醇六磷酸酶處理肌醇六磷酸。優(yōu)選地，所述方法的特征在于所述酶包含如SEQ ID NOs3所顯示的氨基酸序列，或與其具有至少75％同一性(同源性)的序列或有效片段，或其修飾形式。適當(dāng)?shù)?，有機(jī)磷酸鹽(酯)是肌醇六磷酸或肌-肌醇二-，三-，四-，和五磷酸的所有可能的立體異構(gòu)體。其它合適的有機(jī)磷酸鹽(酯)包括肌醇-四磷酸和肌醇-寡磷酸。在優(yōu)選的實施方案中，所述方法是體內(nèi)生物技術(shù)方法。
用于生產(chǎn)有機(jī)磷酸鹽(酯)化合物的這些方法可以適當(dāng)?shù)匕ㄏ铝胁襟Ea)提供包含可表達(dá)的轉(zhuǎn)基因的宿主細(xì)胞，所述轉(zhuǎn)基因包含布丘氏菌屬肌醇六磷酸酶；b)在適合于表達(dá)所述轉(zhuǎn)基因的條件下培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)基因生物；和c)從所述培養(yǎng)物中回收有機(jī)磷酸鹽(酯)化合物。
可以將所述化合物用于許多應(yīng)用，包括用于測試肌醇六磷酸酶的特征。一些肌醇磷酸酯涉及作為在細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)的信號分子，并可以將其用作研究用化學(xué)藥品。
在另一方面，提供生產(chǎn)食品或動物飼料的方法。動物飼料典型地在飼料粉碎機(jī)中生產(chǎn)，其中首先將原材料研磨成適合的顆粒大小，接著將其混合以適合的添加劑。接著，可以以醪液或粒狀沉淀形式生產(chǎn)飼料；后者典型地包括將溫度升高到目標(biāo)溫度，接著將所述飼料通過模具以產(chǎn)生特定大小的粒狀沉淀的方法。隨后，可以加入液體添加劑如脂肪和酶。在運輸之前，使所述粒狀沉淀冷卻。動物飼料的生產(chǎn)還可以包括另外的步驟，所述另外的步驟包括在粒化之前進(jìn)行擠壓或膨脹。
因此，本發(fā)明還提供編碼肌醇六磷酸酶的氨基酸序列或表達(dá)肌醇六磷酸酶的宿主細(xì)胞的用途，用于產(chǎn)生肌醇六磷酸酶以制備食品或飼料產(chǎn)品。在一方面，提供了將如本文所述的氨基酸序列用于制備食品或飼料產(chǎn)品的用途。在另一方面，提供了將根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞用于制備食品或飼料產(chǎn)品的用途。在另一方面，提供將根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)載體或系統(tǒng)用于制備食品或飼料產(chǎn)品的用途。
本發(fā)明還包括使用酶作為飼料的組分與其它組分組合遞送給動物。
與其它組分的組合本發(fā)明的酶可以與其它組分或載體組合使用。
用于飼料的酶的合適的載體包括小麥(粗研的)。此外，存在許多封裝技術(shù)，包括基于脂肪/蠟覆蓋的那些技術(shù)、加入植物樹膠等。
其它組分的實例包括下列各項的一個或多個增稠劑，膠凝劑，乳化劑，粘合劑，晶體改性劑，甜味劑(包括人工甜味劑)，流變學(xué)改性劑，穩(wěn)定劑，抗氧化劑，染料，酶，載體，媒介物，賦形劑，稀釋劑，潤滑劑，增香劑，著色物質(zhì)，懸浮劑，崩解劑，顆粒粘合劑等。這些其它的組分可以是天然的。這些其它的組分可以通過使用化學(xué)和/或酶學(xué)技術(shù)進(jìn)行制備。
用于本文的術(shù)語“增稠劑或膠凝劑”用于本文時，指通過延緩或阻止顆粒移動來防止分離的產(chǎn)品，所述顆粒為不可混溶的液體、空氣、或不可溶的固體的小滴。
將用于本文的術(shù)語“穩(wěn)定劑″定義為防止產(chǎn)品(例如食品)隨時間變化的成分或成分的組合。
用于本文的術(shù)語“乳化劑”指防止乳狀液分離的成分(例如食品成分)。
用于本文的術(shù)語“粘合劑″指通過物理或化學(xué)反應(yīng)將產(chǎn)品粘合在一起的成分(例如，食品成分)。
用于本文的術(shù)語“晶體改性劑”指影響脂肪或水的結(jié)晶作用的成分(例如食品成分)。
“載體”或“媒介物”指適合于化合物施用的材料并且包括本領(lǐng)域已知的任何這樣的材料，諸如例如任何液體，凝膠，溶劑，液體稀釋劑，增溶劑等，其是無毒的并且不會以有害的方式與所述組合物的任何組分相互作用。
在營養(yǎng)上可接受的載體的實例包括，例如，谷物，水，鹽溶液，醇，聚硅氧烷，蠟，礦脂，植物油等。
賦形劑的實例包括下列各項的一個或多個微晶纖維素和其它的纖維素，乳糖，檸檬酸鈉，碳酸鈣，磷酸氫鈣，甘氨酸，淀粉，乳糖和高分子量的聚乙二醇。
崩解劑的實例包括下列各項的一個或多個淀粉(優(yōu)選地是谷物、馬鈴薯或木薯淀粉)，羥基乙酸淀粉鈉，交聯(lián)羧甲纖維素鈉和某些復(fù)雜的硅酸鹽。
顆粒的粘合劑的實例包括下列各項的一個或多個聚乙烯吡咯烷酮，羥丙基甲基纖維素(HPMC)，羥丙基纖維素(HPC)，蔗糖，麥芽糖，明膠和阿拉伯膠。
潤滑劑的實例包括下列各項的一個或多個硬脂酸鎂，硬脂酸，甘油二十二烷酸酯和滑石。
稀釋劑的實例包括下列各項的一個或多個水，乙醇，丙二醇和甘油，及其組合。
所述其它的組分可以同時(例如，當(dāng)它們一起在混合物中時，或甚至當(dāng)它們以不同的路徑遞送時)或順序地(例如它們可以通過不同的路徑遞送)使用。
用于本文的術(shù)語“適合于動物或人食用的組分”意指作為添加物被添加或可以添加到本發(fā)明的組合物中的化合物，其可以是具有營養(yǎng)益處的、是纖維取代物或通常對于消費者具有有益作用。
作為實例，組分可以是益生元如藻酸鹽(酯)，黃原膠，果膠，槐豆膠(LBG)，旋復(fù)花粉，瓜爾膠，半乳糖寡糖(GOS)，果糖寡糖(FOS)，乳蔗糖，大豆寡糖，palatinose，異麥芽寡糖，葡糖寡糖和木糖寡糖。
食品或飼料物質(zhì)可以將所述化合物用作食品或飼料物質(zhì)，或用在食品或飼料物質(zhì)的制備中。在此處，術(shù)語“食品”以廣泛意義使用，并且包括用于人的食物和食品以及用于動物的食物(即飼料)。關(guān)于在牲畜飼養(yǎng)中供應(yīng)給動物的產(chǎn)品，使用術(shù)語″飼料″。在優(yōu)選的方面，食品或飼料由單胃動物如豬，家禽和魚食用。
根據(jù)使用和/或應(yīng)用的模式和/或施用的模式，食品或飼料可以以溶液的形式或作為固體形式存在。
食品和飼料成分和添加物可以將化合物用作食品或飼料成分。
用于本文的術(shù)語“食品或飼料成分”包括被添加或可以被添加到食品或食料中的制劑，并且包括可以以低水平使用在多種產(chǎn)品中的制劑。
根據(jù)使用和/或應(yīng)用的模式和/或施用的模式，食品成分可以以溶液的形式或作為固體形式存在。
所述化合物可以是食品添加物或可以被添加到食品添加物中。
食品和飼料組合物用于單胃動物的飼料組合物典型地包括包含植物產(chǎn)物的組合物，所述植物產(chǎn)物包含肌醇六磷酸。這些組合物包括基于玉米粉，大豆粉，油菜籽粉，棉籽粉，玉米，小麥，燕麥和高梁的飼料。
本文所述的肌醇六磷酸酶可以是食品或飼料組合物，或可以被添加到食品或飼料組合物中。
本發(fā)明還提供制備食品或飼料成分或添加物的方法，所述方法包括將由本發(fā)明的方法生產(chǎn)的肌醇六磷酸酶或按照本發(fā)明的組合物與另一種食品成分混合。制備方法或食品成分也是本發(fā)明的另一個方面。在上面提出了制備動物飼料的方法。所述酶還可以以固體制劑的形式或作為飼料添加劑如預(yù)混合液進(jìn)行添加。固體形式典型地在混合步驟之前或其過程中進(jìn)行添加，液體形式典型地在沉淀步驟后添加。
藥物還可以將本發(fā)明的肌醇六磷酸酶用在藥物制劑中或用于組合到糧食中從而提供某些藥物作用。例如，EP 1,389,915描述了將肌醇六磷酸酶用在食品或飲料中以增加用于人的食品或飲料中的鈣，鐵和/或鋅的有效性。
此外，EP 1,392,353描述了包含肌醇六磷酸酶的藥物或營養(yǎng)添加物，其對于增加生命元素，例如鈣和鐵的生物利用率和對抗缺陷型疾病是有用的。
在此處，術(shù)語“藥物”以廣泛意義應(yīng)用，并且包括用于人的藥物和/或營養(yǎng)藥以及用于動物的藥物和/或營養(yǎng)藥(即，獸醫(yī)應(yīng)用)。在優(yōu)選的方面，所述藥物用于人應(yīng)用和/或用于動物飼養(yǎng)。
所述藥物可以用于治療目的，其可以在性質(zhì)上是治療性的、緩和性的或預(yù)防性的。所述藥物甚至可以用于診斷目的。
當(dāng)用作藥物，或用在藥物的制備中時，本發(fā)明的產(chǎn)物和/或化合物可以與下列各項的一個或多個結(jié)合使用藥用載體，藥用稀釋劑，藥用賦形劑，藥用佐劑，藥用活性成分。
根據(jù)使用和/或應(yīng)用模式和/或施用模式，藥物可以以溶液的形式或作為固體形式存在。
藥物成分可以將本發(fā)明的產(chǎn)物和/或化合物用作藥物成分。在此處，本發(fā)明的產(chǎn)品和/或組合物可以是單一的活性成分或其可以是許多(即，2個或更多)活性成分中的至少一種。
根據(jù)使用和/或應(yīng)用的模式和/或施用的模式，藥物成分可以以溶液的形式或作為固體形式存在。
藥物成分可以以泡騰產(chǎn)品的形式存在以提高藥物的溶解性質(zhì)。
形式本發(fā)明的產(chǎn)品和/或化合物可以以任何合適的形式使用——不管是當(dāng)單獨存在時還是以組合物形式存在時。同樣地，按照本發(fā)明產(chǎn)生的肌醇六磷酸酶(即，成分，諸如食品成分，功能性食品成分或藥物成分)可以以任何合適的形式使用。
形式的合適的實例包括下列各項的一個或多個片劑，丸劑，膠囊，ovules，溶液，或混懸液，它們可以包含增香劑或著色劑，用于即刻的，延緩的，改進(jìn)的，持續(xù)的，脈沖式的或受控的釋放應(yīng)用。
作為實例，如果所述產(chǎn)品和/或組合物以片劑形式使用——如用作功能性成分——所述片劑還可以包含下列各項的一個或多個賦形劑，崩解劑，顆粒粘合劑，或潤滑劑。
用在制備所述形式中的在營養(yǎng)上可接受的載體的實例包括，例如，水，鹽溶液，醇，聚硅氧烷，蠟，礦脂等。
用于所述形式的優(yōu)選的賦形劑包括乳糖，淀粉，纖維素，乳糖，或高分子量的聚乙二醇。
對于水性混懸液和/或酏劑，可以將肌醇六磷酸酶裂解化合物組合以各種甜味劑或增香劑，著色物質(zhì)或染料，組合以乳化劑和/或懸浮劑和組合以稀釋劑如水，乙醇，丙二醇和甘油及其組合。
所述形式還可以包括明膠膠囊；纖維膠囊，纖維片劑等。
一般重組DNA方法技術(shù)除非另外指出，本發(fā)明使用常規(guī)的化學(xué)技術(shù)，分子生物學(xué)技術(shù)，微生物學(xué)技術(shù)，重組DNA技術(shù)和免疫學(xué)技術(shù)，它們都在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。這些技術(shù)都在文獻(xiàn)中有所闡述。見，例如J.Sambrook，E.F.Fritsch，和T.Maniatis，1989，Molecular CloningA Laboratory Manual，第二版，Books 1-3，Cold Spring Harbor Laboratory Press；Ausubel，F(xiàn).M.等.(1995 and periodic supplements；Current Protocols in Molecular Biology，ch.9，13，和16，John Wiley & Sons，New York，N.Y.)；B.Roe，J.Crabtree，和A.Kahn，1996，DNA Isolation and SequencingEssential Techniques，JohnWiley & Sons；M.J.Gait(Editor)，1984，Oligonucleotide SynthesisA PracticalApproach，Irl Press；和，D.M.J.Lilley和J.E.Dahlberg，1992，Methods ofEnzymologyDNA Structure Part ASynthes is and Physical Analysis of DNAMethods in Enzymology，Academic Press.將這些一般性文章的每個并入本文作為參考。
實施例現(xiàn)在在下面的非限制性實施例中進(jìn)一步舉例說明本發(fā)明。
實施例1.肌醇六磷酸酶活性測試。
μl＝微升肌醇六磷酸酶測試在微量滴定板中進(jìn)行。反應(yīng)混合物(100μl)包含在200mM醋酸鈉緩沖液，pH 3.5中的2mM肌醇六磷酸和0.8mM CaCl2。使反應(yīng)在37℃進(jìn)行1小時，隨后通過改進(jìn)的已知方法(Heinonen J.K.，LahtiRJ.Anal Biochem.113(2)，313-317(1981))來測量釋放的磷酸鹽(酯)。簡言之，在每個微量滴定板孔中將200μl的新鮮制備的AMM溶液(7.5NH2SO4，15mM鉬酸銨和丙酮—1∶1∶2)加入100μl的反應(yīng)混合物中。加入AMM試劑后，在不早于10分鐘和不晚于30分鐘的時間內(nèi)，測量在390nm的吸光度。通過用已知濃度的磷酸鹽(酯)溶液構(gòu)建校準(zhǔn)曲線來測定磷酸鹽(酯)的量。為了測試不同pH值下的肌醇六磷酸酶活性，使用下列的(全部為200mM)緩沖液介于pH 2.0和3.0之間的甘氨酸/HCl，介于pH 3.5和5.5之間的乙酸鈉/乙酸，介于pH 6.0和7.5之間的Tris/馬來酸。
實施例2.產(chǎn)生肌醇六磷酸酶的菌株P(guān)1-29細(xì)菌菌株P(guān)1-29最初從一堆腐爛的植物材料中分離，所述植物材料從芬蘭南部森林的水坑底部收集。可以在許多簡單培養(yǎng)基上在30℃需氧培養(yǎng)所述菌株，所述培養(yǎng)基例如LB(1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl，pH 7.4)或低磷酸鹽(酯)培養(yǎng)基PP1(1％蛋白胨，1％牛肉提取物，0.5％酵母提取物，CaCl2-0.2M)。通過用NaOH將pH調(diào)節(jié)到11并煮沸10分鐘制備培養(yǎng)基。通過過濾去除沉淀物，并再次調(diào)整pH到5.5，通過在121℃高壓滅菌15分鐘來對所述培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌。
在液體PP1培養(yǎng)基中生長后，發(fā)現(xiàn)所述菌株在pH 3.5和5.5都顯示肌醇六磷酸酶活性(如在實施例1中所述測試)。在3.5和5.5的活性的比率是約1.3。還在P1-29的細(xì)胞和培養(yǎng)物上清液中分別測量活性。根據(jù)這些測量，大部分肌醇六磷酸酶活性為在細(xì)胞培養(yǎng)上清液中發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞結(jié)合的10-20％活性。
所述菌株保藏于NCIMB，登錄號為No 41248。
實施例3.從菌株P(guān)1-29中分離染色體DNA基本上用標(biāo)準(zhǔn)方法(Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，New York，1996)來制備染色體DNA。將250ml在LB培養(yǎng)基中30℃過夜培養(yǎng)的培養(yǎng)物在10,000rpm離心30分鐘，用20ml的50mM tris-HCl，5mM EDTA pH 8洗滌，并重懸于10ml的冷TES(50mMtris-HCl，5mM EDTA，15％葡萄糖pH 8)中。加入溶菌酶至10mg/ml，并在37℃溫育細(xì)胞混懸液30-60分鐘，直到裂解發(fā)生，所述裂解通過將100μl的反應(yīng)混合物稀釋到1ml的1％SDS中并檢查“粘液(slimy)”稠度進(jìn)行確定。在此時，分別將SDS和蛋白酶K(Sigma)加入到終濃度1％和0.5mg/ml。將反應(yīng)混合物在56℃溫育30分鐘，隨后加入2ml的5M NaCl和1.4ml的10％十六烷基三甲基溴化銨(Sigma)。在65℃持續(xù)溫育15分鐘。用氯仿/異戊醇(24∶1)提取溶液1次，并用苯酚/氯仿提取一次。提取后，將水相與0.6體積的異丙醇混合，通過離心(10,000rpm，15min)收集DNA沉淀，用70％乙醇洗滌，真空干燥并重懸在2ml的10mM tris-HCl，1mM EDTA pH 8，5μg/ml RNA酶中。
實施例4.細(xì)菌菌株P(guān)1-29的分類學(xué)鑒定使用引物536f(CAGCMGCCGCGGTAATWC)和1392r(ACGGGCGGTGTGTRC)，(Lane，D.J.In Nucleic acid techniques inbacterial systematics，Stackbrandt，E.和Goodfellow，M.eds，John Wiley &Sons，New Yorkpp 115-117(1991))，用Taq DNA聚合酶(Roche)通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)來擴(kuò)增菌株P(guān)1-29的16S rRNA基因片段。使用下列程序1)在95℃進(jìn)行5分鐘的初始DNA變性步驟；2)在94℃1分鐘，在55℃1分鐘，在72℃1分鐘，進(jìn)行30個循環(huán)；3)在70℃進(jìn)行最終的延伸步驟10分鐘。在0.8％瓊脂糖凝膠中通過電泳純化PCR產(chǎn)物，所述產(chǎn)物約900堿基對大小，并根據(jù)生產(chǎn)商的說明書，使用凝膠純化試劑盒(Qiagen)，將其從凝膠中提取出來。通過Medprobe(Norway)的商業(yè)服務(wù)對純化的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序。所測序的區(qū)域列于SEQ ID No 1。將該序列與在GenBank數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)中的DNA序列進(jìn)行比較。發(fā)現(xiàn)該序列與來自幾個布丘氏菌屬菌株，如B.izardii DSM 9397，B.gaviniaeDSM 9393和B.noackiae ATCC 51607T的16S RNA基因的序列最為匹配(691個核苷酸中的688-689，99.6-99.7％)。因此，可以在分類學(xué)上將菌株P(guān)1-29分類為布丘氏菌屬。
實施例5.從布丘氏菌屬P1-29中克隆肌醇六磷酸酶基因?qū)⒉记鹗暇鷮倬關(guān)1-29的染色體DNA用限制性核酸內(nèi)切酶Sau3A部分消化，并將所述消化產(chǎn)物在1％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行分級。使用凝膠純化試劑盒(Qiagen)從凝膠上分離3-5kb的DNA片段，并將其與BamHI消化的去磷酸化的λ-ZAP臂(Stratagene)連接起來。隨后的文庫構(gòu)建步驟按照Stratagene的ZAP Express預(yù)消化的載體/Gigapack克隆試劑盒的說明書進(jìn)行。將文庫的噬菌體形式通過生產(chǎn)商(Stratagene)所述的“大量切除”(“massexcision”)方法轉(zhuǎn)化為質(zhì)粒形式。通過與早期公開的在培養(yǎng)皿上檢測肌醇六磷酸酶活性的方法(Howson和Davis.Enzyme Microb.Technol.5，377-382(1983)；Chen J.C.Biotechnology techniques 12(10)751-761(1998)；RiccioMX.等，J.Appl.Microbiol.82，177-185(1997))類似的方法來進(jìn)行質(zhì)粒文庫的篩選。通過亞克隆來分離并純化數(shù)個肌醇六磷酸酶陽性克隆。將這些分離物培養(yǎng)在液體培養(yǎng)物(LB培養(yǎng)基，在30℃和200rpm約24小時)中并在得到的細(xì)胞混懸液中測量肌醇六磷酸酶活性(實施例1)。選擇具有最高肌醇六磷酸酶活性(在pH 3.5約1.2U/ml)的一個克隆進(jìn)行隨后的表征。將分離自該克隆的質(zhì)粒DNA命名為pBK(P1-29)，并通過插入DNA的部分DNA測序進(jìn)行表征(測序服務(wù)獲自Medprobe(Norway)。將包含肌醇六磷酸酶基因的這一序列列在SEQ ID No2中。布丘氏菌屬肌醇六磷酸酶的推導(dǎo)氨基酸序列列為SEQ ID No3。使用由NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)提供的BLAST服務(wù)對SEQ ID No3與GenBank中序列進(jìn)行比較，該比較鑒定了來自變形肥桿菌(Obesumbacteriumproteus)(GenBank登錄號No AAQ90419)的肌醇六磷酸酶是布丘氏菌屬P1-29肌醇六磷酸酶的最接近的已知同源物。然而，同源性水平很低—在兩種蛋白質(zhì)中僅有約74％的氨基酸殘基是相同的。
實施例6.來自布丘氏菌屬P1-29的肌醇六磷酸酶基因的擴(kuò)增和表達(dá)通過PCR擴(kuò)增肌醇六磷酸酶基因。將菌株布丘氏菌屬P1-29的染色體DNA用作模板，并將寡核苷酸o29-5(GGAATTCATATGACGATCTCTGCGTTTAAC)和o29-3(GGAATTCGGATCCTTA-CTGTAGCTGGCAGCCTG)用作引物。使用Expand High Fidelity PCR系統(tǒng)試劑盒(Roche)進(jìn)行擴(kuò)增。使用下列程序1)在94℃進(jìn)行初始DNA變性3分鐘；2)在94℃45秒，在55℃45秒，在68℃1分鐘，在72℃1分鐘，在74℃1分鐘，進(jìn)行35個循環(huán)；3)在72℃進(jìn)行最終的延伸步驟10分鐘。將得到的PCR產(chǎn)物通過在0.8％的瓊脂糖凝膠上電泳，隨后使用凝膠純化試劑盒(Qiagen)從凝膠上提取DNA來進(jìn)行純化。用限制性酶NdeI和BamHI來消化純化的PCR產(chǎn)物，并通過PCR純化試劑盒(Qiagen)將其從反應(yīng)混合物中分離。將載體質(zhì)粒pET11a(Novagen)用限制性核酸內(nèi)切酶NdeI和BamHI進(jìn)行消化，使用蝦堿性磷酸酶(Roche)進(jìn)行去磷酸化，并在0.8％瓊脂糖凝膠上通過電泳純化。從凝膠上切下線性化的質(zhì)粒DNA條帶，使用凝膠純化試劑盒(Qiagen)進(jìn)行純化。使用T4DNA連接酶(Roche)連接兩段純化的DNA片段。將連接反應(yīng)物用70％乙醇沉淀，用乙醇洗滌，并直接重懸在50μl的電感受態(tài)大腸桿菌XL1-Blue MRF’細(xì)胞中。將所述混懸液轉(zhuǎn)移到0.1cm的電穿孔杯(BioRad)中，并使用GenePulser Xcell(BioRad)裝置，在1800V、25μF和200Ω進(jìn)行電穿孔。電穿孔后立即加入1ml的LB培養(yǎng)基，將細(xì)胞混懸液轉(zhuǎn)移到15ml的塑料管(Falcon)中并在37℃溫育，搖動(200rpm)1小時。將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞在包含100μg/ml氨芐青霉素的LB平板上鋪板，并在37℃過夜溫育。將24個轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)在液體培養(yǎng)物中，并使用該培養(yǎng)物測試肌醇六磷酸酶的活性和質(zhì)粒DNA的分離。選擇產(chǎn)生最高肌醇六磷酸酶活性和產(chǎn)生預(yù)期限制圖譜的質(zhì)粒DNA的一個克隆。將由該克隆包含的、命名為pET11(P1-29)的質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌株BL21(DE3)pLysS(Novagen)。將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞混懸液在包含2％的葡萄糖的LB中，于37℃搖動1小時，并將其接種到包含氨芐青霉素(100μg/ml)和葡萄糖(2％)的50ml的LB中，在30℃，搖動(200rpm)過夜培養(yǎng)。在600nm測量得到的培養(yǎng)物的OD，并使用所述培養(yǎng)物接種1升的LB+氨芐青霉素(100μg/ml)到OD600為0.04。繼續(xù)在30℃培養(yǎng)過夜。在這樣的培養(yǎng)物中的肌醇六磷酸酶活性典型地是8-12U/ml。約40g％的肌醇六磷酸酶活分泌到培養(yǎng)基中，而剩余的保持與細(xì)胞關(guān)聯(lián)。這些觀察結(jié)果顯示布丘氏菌屬P1-29肌醇六磷酸酶在大腸桿菌中的分泌在一定程度上比在其天然宿主中更有效。在相同的條件下培養(yǎng)的、用pET11轉(zhuǎn)化的對照菌株BL21(DE3)pLysS的培養(yǎng)物中的活性低于0.05U/ml。
實施例7.來自布丘氏菌屬P1-29的重組肌醇六磷酸酶的純化將用pET11(P1-29)轉(zhuǎn)化的BL21(DE3)pLysS的培養(yǎng)物進(jìn)行離心以去除細(xì)菌細(xì)胞，使用旋轉(zhuǎn)式汽化器將其濃縮到起始體積的約1/10并針對水進(jìn)行透析直到溶液的傳導(dǎo)性減少到低于250μS/cm。用tris堿將溶液的pH調(diào)節(jié)到8.0，并將其上樣到以25mM tris-HCl，pH 8.0平衡的DEAE SepharoseFast Flow(Amersham Biosciences)的柱(3×20cm)上。用平衡緩沖液以3ml/min的流速洗滌所述柱30分鐘，隨后用在25mM tris-HCl，pH 8.0中的三個連續(xù)梯度的NaCl0-50mM，50-150mM和150-500mM進(jìn)行洗脫。三個梯度的每個梯度設(shè)置為進(jìn)行1小時，流速恒定為3ml/min。收集9ml的級分并測試肌醇六磷酸酶活性。檢測到一個強(qiáng)的活性峰。使用Centriplusconcentrators(Amicon)來濃縮在峰級分中的蛋白質(zhì)，并通過使用12％凝膠和標(biāo)準(zhǔn)的Laemmli緩沖液系統(tǒng)用SDS PAGE進(jìn)行分析。這種分析的結(jié)果顯示通過DEAE Sepharose獲得的重組布丘氏菌屬P1-29肌醇六磷酸酶的制備物包含單一顯著的蛋白質(zhì)組分?；谀z的數(shù)字圖像的掃描(圖1)進(jìn)行的半定量分析顯示純度約65％。
實施例8.來自布丘氏菌屬P1-29的重組肌醇六磷酸酶的pH譜在實施例1中所述的緩沖液和條件下，研究布丘氏菌屬P1-29肌醇六磷酸酶(按照實施例7純化)的活性對pH的依賴性。所述酶在廣泛的pH區(qū)域(2-5.5)具有活性，其中在約pH 4.5具有最大值，并且在約pH3具有曲線的強(qiáng)“肩峰”(圖2)。
實施例9.來自布丘氏菌屬P1-29的重組肌醇六磷酸酶的底物特異性通過離子交換層析從用真菌肌醇六磷酸酶(Natuphos)處理的肌醇六磷酸的部分水解產(chǎn)物分離肌醇磷酸酯級分，所述肌醇磷酸酯每個肌醇?xì)埢齻€、四個或五個磷酸酯。這些制備物的產(chǎn)生和純化是BioChemis Ltd(St.Petersburg，Russia)提供的商業(yè)服務(wù)。通過HPLC判斷(SandbergA.S.，Ahderinne R.J.Food Sci.51(3)，547-550)具有的不同磷酸化程度的肌醇磷酸酯的每個級分的污染少于5％。將商購果糖1，6-二磷酸和果糖6-磷酸(Sigma)用作模型底物來用于評估布丘氏菌屬P1-29肌醇六磷酸酶對二磷酸酯和單磷酸酯底物的特異性。使用最終反應(yīng)混合物中2mM濃度的底物，在pH 3.5，通過標(biāo)準(zhǔn)測試法(實施例1)測量按照實施例7純化的布丘氏菌屬肌醇六磷酸酶對不同底物的活性。結(jié)果(圖3)顯示所述酶具有極其廣泛的底物特異性。其針對五磷酸酯、四磷酸酯和三磷酸酯的活性基本上等于或稍微高于將肌醇六磷酸作為底物時的活性。甚至果糖1，6-二磷酸(其對于大部分肌醇六磷酸酶是相當(dāng)差的底物)也被布丘氏菌屬肌醇六磷酸酶(尤其是P1-29來源的肌醇六磷酸酶)有效地水解。也可檢測到果糖6-磷酸的水解，雖然其效率比其他受檢測底物的水解低得多。
實施例10.來自布丘氏菌屬P1-29的重組肌醇六磷酸酶的比活使用按照實施例7的純化制備物來評估布丘氏菌屬P1-29肌醇六磷酸酶的比活。根據(jù)實施例1在pH 3.5測量肌醇六磷酸酶活性。通過用BCA蛋白質(zhì)測試試劑盒(Pierce)測量總蛋白質(zhì)濃度并通過用SDS PAGE估計的肌醇六磷酸酶含量(實施例7)對其進(jìn)行校正來計算肌醇六磷酸酶濃度。按照這些測量，來自布丘氏菌屬P1-29的重組肌醇六磷酸酶的比活在37℃為約300U/mg。
實施例11.肌醇六磷酸酶變體的產(chǎn)生和表征使用如上列出的誘變方法，諸如在Morinaga等中公開的方法(Biotechnology(1984)2，p646-649)，或在Nelson和Long(AnalyticalBiochemistry(1989)，180，p 147-151)中公開的方法，或在WO 92/18645中所述的錯誤閾值(Error Threshold)誘變方法，通過序列SEQ ID No.2的誘變構(gòu)建肌醇六磷酸酶變體。用于誘變PCR的其他合適的方法由Cadwell和Joyce(PCR Methods Appl.3(1994)，136-140)公開。
在一種或多種下列表達(dá)宿主中異源表達(dá)后，對肌醇六磷酸酶變體進(jìn)行表征大腸桿菌K12；枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)；釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
肌醇六磷酸酶變體源自SEQ ID No 3，其在一個或多個氨基酸位點存在不同，包括兩個位點，三個位點，四個位點，五個位點，六個位點，七個位點，八個位點，九個位點，十個位點，十一個位點，十二個位點。其中如此處所述進(jìn)行合適的反復(fù)誘變循環(huán)。
肌醇六磷酸酶變體的表征1.熱穩(wěn)定性通過酶的失活溫度對所述變體的熱穩(wěn)定性進(jìn)行表征。通過測量在不同的溫度下溫育10分鐘，并隨后冷卻到室溫后肌醇六磷酸酶的殘留活性來測定失活溫度。失活溫度是這樣的溫度，在所述溫度下，殘余的活性是在相同的條件下在室溫溫育相同時間后的殘留活性的50％。當(dāng)適合時，通過從測量的活性數(shù)據(jù)進(jìn)行內(nèi)推和外推法來確定相應(yīng)于50％殘留活性的溫度。通過將兩種酶的失活溫度彼此扣除來計算以℃表示的熱穩(wěn)定性的差異。
表1列出了不同變體的熱穩(wěn)定性差異表1來自以Seq ID No 3所示的親本肌醇六磷酸酶的變體的熱穩(wěn)定性差異(TD)
2.其它特征其它特征也被改良。
使用如上所述的測試法來比較選定變體的熱穩(wěn)定性、比活和胃蛋白酶穩(wěn)定性。通過與對照條件相比，在胃蛋白酶溫育后，在pH 3.5，37℃測量的殘留活性來表征這些變體的胃蛋白酶穩(wěn)定性(殘留活性＝在胃蛋白酶溫育后的活性/在對照條件下溫育后的活性)。在pH 2.0，0.25mg/ml胃蛋白酶，1mM CaCl2和5mg/ml BSA于37℃進(jìn)行胃蛋白酶溫育2小時。對照條件是在pH 5.0，1mM CaCl2和5mg/ml BSA，在37℃2小時。
表2顯示選定變體的性質(zhì)(來自根據(jù)Seq ID No.3的野生型肌醇六磷酸酶并與其比較)表2來自以Seq ID No.3所示的親本肌醇六磷酸酶的變體的胃蛋白酶穩(wěn)定性
表3來自以Seq ID No.3所示的親本肌醇六磷酸酶的變體的比活
將在上述說明書中提及的所有的出版物，和在所述出版物中引用的文獻(xiàn)都并入本文作為參考。本發(fā)明所述方法和系統(tǒng)的各種改進(jìn)和變化對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的，而不背離本發(fā)明的范圍和精神。盡管本發(fā)明已經(jīng)結(jié)合具體的優(yōu)選實施方案進(jìn)行描述，應(yīng)該理解的是要求保護(hù)的本發(fā)明不應(yīng)該被局限于這些具體的實施方案。實際上，對于分子生物學(xué)或相關(guān)領(lǐng)域中的那些技術(shù)人員顯而易見的用來進(jìn)行本發(fā)明的所述模式的各種改進(jìn)意圖包含在下述權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
序列表SEQ ID No1ACTACGACGCACTTTATGAGGTCCGCTTGCTCTCGCGAGGTCGCTTCTCTTTGTATGCGCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCTACTCGTAAGGGCCATGATGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCAGTTTATCACTGGCAGTCTCCTTTGAGTTCCCGGCCGAACCGCTGGCAACAAAGGATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATTTCACAACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTCTCACAGTTCCCGAAGGCACTAAGGCATCTCTGCCAAATTCTGTGGATGTCAAGAGTAGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCATTTGAGTTTTAACCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGTCGACTTAACGCGTTAGCTCCGGAAGCCACTCCTCAAGGGAACAACCTCCAAGTCGACATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCACCTGAGCGTCAGTCTTTGTCCAGGGGGCCGCCTTCGCCACCGGTATTCCTCCAGATCTCTACGCATTTCACCGCTACACCTGGAATTCTACCCCCCTCTACAAGACTCTAGCCTGCCAGTTTCGAATGCAGTTCCCAGGTTGAGCCCGGGGSEQ ID No 2TTTCACATAGCAAACAACAACGAGACGAACTCGACGTTACCGCTTTGCTTCTGGAGTATATTTATCAGACTCAAACACCCCAAAGAAAAGAGGCTGTAAATGACGATCTCTGCGTTTAACCGCAAAAAACTGACGCTTCACCCTGGTCTGTTCGTAGCACTGAGCGCCATATTTTCATTAGGCTCTACGGCCTATGCCAACGACACTCCCGCTTCAGGCTACCAGGTTGAGAAAGTGGTAATACTCAGCCGCCACGGGGTGCGAGCACCAACCAAAATGACACAGACCATGCGCGACGTAACACCTAATACCTGGCCCGAATGGCCAGTAAAATTGGGTTATATCACGCCACGCGGTGAGCATCTGATTAGCCTGATGGGCGGGTTTTATCGCCAGAAGTTTCAACAACAGGGCATTTTATCGCAGGGCAGTTGCCCCACACCAAACTCAATTTATGTCTGGGCAGACGTTGATCAGCGCACGCTTAAAACTGGCGAAGCTTTCCTGGCAGGGCTTGCTCCGGAATGTCATTTAACTATTCACCACCAGCAGGACATCAAAAAAGCCGATCCGCTGTTCCATCCGGTGAAAGCGGGCACCTGTTCAATGGATAAAACTCAGGTCCAACAGGCCGTTGAAAAAGAAGCTCAAACCCCCATTGATAATCTGAATCAGCACTATATTCCCTTTCTGGCCTTGA
TGAATACGACCCTCAACTTTTCGACGTCGGCCTGGTGTCAGAAACACAGCGCGGATAAAAGCTGTGATTTAGGGCTATCCATGCCGAGCAAGCTGTCGATAAAAGATAATGGCAACAAAGTCGCTCTCGACGGGGCCATTGGCCTTTCGTCTACGCTTGCTGAAATTTTCCTGCTGGAATATGCGCAAGGGATGCCGCAAGCGGCGTGGGGGAATATTCATTCAGAGCAAGAGTGGGCGTCGCTACTGAAACTGCATAACGTCCAGTTTGATTTGATGGCACGCACGCCTTATATCGCCAGACATAACGGCACGCCTTTATTGCAGGCCATCAGCAACGCGCTGAACCCGAATGCCACCGAAAGCAAACTGCCTGATATCTCACCTGACAATAAGATCCTGTTTATTGCCGGACACGATACCAATATTGCCAATATCGCAGGCATGCTCAACATGCGCTGGACGCTACCTGGGCAACCCGATAACACCCCTCCGGGCGGCGCTTTAGTCTTTGAGCGTTTGGCCGATAAGTCAGGGAAACAATATGTTAGCGTGAGCATGGTGTATCAGACTCTCGAGCAGTTGCGCTCCCAAACACCACTTAGCCTTAATCAACCTGCGGGAAGCGTACAGCTAAAAATTCCTGGCTGTAACGATCAGACGGCTGAAGGATACTGCCCGCTGTCGACGTTCACTCGCGTGGTTAGCCAAAGCGTGGAACCAGGCTGCCAGCTACAGTAAATATCAGACAAAAAAAATGCCGCTCGCGATTAAGCGAACGGCATTACTTCCTAGCTTCCCAGCTCGGATTAGCATGGCGAGAGCCGAAAAACTTSEQ ID No3MTISAFNRKKLTLHPGLFVALSAIFSLGSTAYANDTPASGYQVEKVVILSRHGVRAPTKMTQTMRDVTPNTWPEWPVKLGYITPRGEHLISLMGGFYRQKFQQQGILSQGSCPTPNSIYVWADVDQRTLKTGEAFLAGLAPECHLTIHHQQDIKKADPLFHPVKAGTCSMDKTQVQQAVEKEAQTPIDNLNQHYIPFLALMNTTLNFSTSAWCQKHSADKSCDLGLSMPSKLSIKDNGNKVALDGAIGLSSTLAEIFLLEYAQGMPQAAWGNIHSEQEWASLLKLHNVQFDLMARTPYIARHNGTPLLQAISNALNPNATESKLPDISPDNKILFIAGHDTNIANIAGMLNMRWTLPGQPDNTPPGGALVFERLADKSGKQYVSVSMVYQTLEQLRSQTPLSLNQPAGSVQLKIPGCNDQTAEGYCPLSTFTRVVSQSVEPGCQLQ
權(quán)利要求
1.一種多肽，其包含對應(yīng)于布丘氏菌屬肌醇六磷酸酶或其修飾形式、同源多肽、變體、功能等同物或有效片段的氨基酸序列。
2.權(quán)利要求1的多肽，其包含如SEQ ID NO3中所示的氨基酸序列或與其具有至少75％同一性(同源性)，優(yōu)選具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性(同源性)的序列或其功能片段。
3.權(quán)利要求1或2的多肽，其中所述多肽為分離的和/或純化的。
4.權(quán)利要求1-3的多肽，其中所述多肽顯示肌醇六磷酸酶活性。
5.權(quán)利要求1-4的多肽，其特征在于它可獲自、優(yōu)選源自以登錄號NCIMB 41248保藏的布丘氏菌屬菌株P(guān)1-29。
6.權(quán)利要求4或5的多肽或其功能等同物，其特征在于所述肌醇六磷酸酶具有至少100，更優(yōu)選至少200，最優(yōu)選至少300U/mg的比活，其中所述比活通過將所述肌醇六磷酸酶在溶液中在37℃的溫度溫育而測定，所述溶液包含溶于200mM醋酸鈉緩沖液、pH4.5中的2mM肌醇六磷酸、0.8mMCaCl2。
7.權(quán)利要求4-6的多肽或其功能等同物，其特征在于所述肌醇六磷酸酶在約pH3-6，優(yōu)選約pH4-5，最優(yōu)選約pH4.5具有活性最大值，其中所述活性通過將所述肌醇六磷酸酶在溶液中在37℃的溫度溫育而測定，所述溶液包含溶于200mM醋酸鈉緩沖液中的2mM肌醇六磷酸、0.8mM CaCl2。
8.權(quán)利要求1至7中任一項的多肽，其在至少一個下列位點(根據(jù)SEQID No.3中的編號方法進(jìn)行編號)包含突變59、70、122、125、167、193、197、204、209、211、221、223、225、240、242、244、268、281、289、294、303、336或351。
9.權(quán)利要求8的多肽，其中所述肌醇六磷酸酶包括一個或多個下列突變K59A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；或T70A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、V、W或Y；或A122C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；或D125A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；或T167A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、V、W或Y；或H193A、C、D、E、F、G、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；或F197A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；或T204A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、V、W或Y；或T209A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、V、W或Y；或A211C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；或G221A、C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；或I223A、C、D、E、F、G、H、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；或S225A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W或Y；或K240A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；或A242C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；或D244A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；或A268C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；或L281A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；或Q289A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V、W或Y；或A294C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；或N303A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y；或I336A、C、D、E、F、G、H、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；或N351A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y。
10.權(quán)利要求8或9的多肽/肌醇六磷酸酶，其包括選自下組的至少一個突變K59E；T167V；K240T；T167I；K240E；D244C；Q289Y；T209K或F197S。
11.權(quán)利要求8至10的多肽/肌醇六磷酸酶，其包括選自下組的突變組合D125E/H193R；或A294E/N303K；或T167I/K240T；或D223E/K240E/N351D；或T167I/K240T/A294E/N303K；或T167I/K240E/A242S/A294E/N303K；或A122T/T167I/F197S/T209K/A211P/K240E/A294E/N303K；或A122T/T167I/F197S/T209K/A211P/K240E/A242S/S281L/Q289Y/A294E/N303K；或A122T/D125E/H193R/F197S/T209K/A211P/S221N/G225A/K240E/A294E/N303K；或D125E/T167I/H193R/F197S/T204I/T209K/A211P/K240E/A268V/Q289H/A294E/N303K；或A122T/T167I/H193R/F197S/T204I/T209K/A211P/K240E/A268V/Q289H/A294E/N303K/I336F或N70Y/D125E/T167I/H193R/F197S/T204I/T209K/A211P/K240E/A268V/Q289H/A294E/N303K。
12.權(quán)利要求8至11的多肽/肌醇六磷酸酶，其中所述分離的多肽或肌醇六磷酸酶為改良的肌醇六磷酸酶變體，其與親本肌醇六磷酸酶相比具有選自以下的一個或多個改良的特性i.更高的熱穩(wěn)定性和/或ii.比活和/或iii.蛋白水解穩(wěn)定性。
13.選自以下的分離的核酸分子i)編碼權(quán)利要求1至12任一項的肌醇六磷酸酶的分離的核酸分子；ii)核酸，其在中等嚴(yán)謹(jǐn)度條件下，優(yōu)選高或很高的嚴(yán)謹(jǐn)度條件下與編碼SEQ ID No.3的多肽或其同源物的核酸雜交；iii)分離的核酸分子，其包括SEQ ID NO2所示的序列或其同源物；iv)核酸，其在中等嚴(yán)謹(jǐn)度條件下，優(yōu)選高或很高的嚴(yán)謹(jǐn)度條件下與SEQ ID No.2或其互補(bǔ)序列雜交。
14.權(quán)利要求13的分離的核酸分子，其編碼多肽，所述多肽包括如SEQID NO3所示的氨基酸序列或與其具有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性(同源性)的序列或其有效片段。
15.權(quán)利要求13或14的分離的核酸分子，其包括核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQ ID NO.2相同或互補(bǔ)或包含SEQ ID NO.2的任何密碼子的任何合適的密碼子取代或包括與SEQ ID NO.2具有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同源性的序列。
16.權(quán)利要求13至15的分離的核酸分子，其中所述核酸分子編碼權(quán)利要求8至12的多肽。
17.質(zhì)?；蜉d體系統(tǒng)，其包括權(quán)利要求13至16的核苷酸。
18.權(quán)利要求17的質(zhì)粒或載體系統(tǒng)，其中所述質(zhì)粒或載體系統(tǒng)為微生物中用于表達(dá)權(quán)利要求1至12的任一種酶的表達(dá)載體，和/或包括權(quán)利要求13至16的多核苷酸。
19.用權(quán)利要求17或18任一項的質(zhì)?；蜉d體系統(tǒng)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。
20.權(quán)利要求19的宿主細(xì)胞，其包含肌醇六磷酸酶，所述肌醇六磷酸酶包含如SEQ ID NO3所示的氨基酸序列或其功能片段，或與其至少75％同源的同源多肽序列。
21.權(quán)利要求19或20的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞源自于微生物，所述微生物包括細(xì)菌，如枯草芽孢桿菌、大腸桿菌，和真菌，其包括酵母，如多形漢森氏酵母、粟酒裂殖酵母、釀酒酵母，以及絲狀真菌，如木霉屬和曲霉屬，如米曲霉。
22.權(quán)利要求21的宿主細(xì)胞，其中所述微生物為原核細(xì)菌細(xì)胞，優(yōu)選大腸桿菌。
23.細(xì)菌細(xì)胞菌株布丘氏菌屬P1-29，以登錄號NCIMB 41248保藏。
24.產(chǎn)生多肽的方法，其包括在宿主細(xì)胞中表達(dá)權(quán)利要求1至12的氨基酸序列和/或表達(dá)權(quán)利要求13至16的多核苷酸，并且從宿主細(xì)胞培養(yǎng)基分離所述肌醇六磷酸酶。
25.生產(chǎn)食品或動物飼料的方法，其包含向所述食品或動物飼料上噴灑液體形式的權(quán)利要求1-12任一項的多肽的步驟。
26.生產(chǎn)食品或動物飼料的方法，其包含將作為干燥產(chǎn)品的權(quán)利要求1-12任一項的多肽與所述食品或動物飼料混合的步驟。
27.權(quán)利要求1至12任一項的肌醇六磷酸酶在食物或動物飼料中的用途。
28.食物或動物飼料組合物，其包括i)權(quán)利要求1至12任一項的肌醇六磷酸酶，和/或ii)通過權(quán)利要求25或26的方法產(chǎn)生的動物飼料。
29.制備肌醇六磷酸酶變體的方法，所述方法包括下列連續(xù)的步驟a)選擇至少一種親本肌醇六磷酸酶，其中所述至少一種親本肌醇六磷酸酶選自i)權(quán)利要求1-12的多肽和/或ii)至少一種肌醇六磷酸酶變體；b)通過在所述親本肌醇六磷酸酶中引入所述親本肌醇六磷酸酶的至少一種變化，以獲得至少一種肌醇六磷酸酶變體，所述變化是氨基酸殘基的插入、缺失或取代或其組合；c)篩選所述至少一種肌醇六磷酸酶變體以鑒定改良的肌醇六磷酸酶變體，所述肌醇六磷酸酶變體與親本肌醇六磷酸酶相比具有選自以下的一種或多種改良的特性i.更高的熱穩(wěn)定性和/或ii.比活和/或iii.蛋白水解穩(wěn)定性和/或d)制備所述改良的肌醇六磷酸酶變體，優(yōu)選以產(chǎn)生分離和/或純化的肌醇六磷酸酶變體。
30.權(quán)利要求29的方法，其中在步驟b)期間產(chǎn)生肌醇六磷酸酶變體的群體，以及在步驟c)中篩選至少一部分所述肌醇六磷酸酶變體的群體。
31.權(quán)利要求29或30的方法，其中步驟a)包括將編碼親本肌醇六磷酸酶的權(quán)利要求11至13的核苷酸序列進(jìn)行誘變，并且步驟b)包括在宿主細(xì)胞中表達(dá)步驟(a)中獲得的突變的核苷酸序列，且步驟c)包括針對宿主細(xì)胞或其一種或多種提取物篩選具有所述一個或多個改良特性的改良的肌醇六磷酸酶變體。
32.權(quán)利要求29至31的方法，其在步驟c)和任選的d)后，進(jìn)一步包括隨后的至少一輪重復(fù)步驟a)至c)和可選擇的d)的步驟，其中優(yōu)選在所述隨后的一輪或多輪中，從根據(jù)權(quán)利要求29至31的方法制備的所述至少一種肌醇六磷酸酶變體和/或改良的肌醇六磷酸酶變體中選擇步驟a)的至少一種親本肌醇六磷酸酶。
33.權(quán)利要求29至32的方法，其中步驟c)包括篩選表達(dá)改良的肌醇六磷酸酶變體的宿主細(xì)胞，該肌醇六磷酸酶變體與i)所述親本肌醇六磷酸酶和/或ii)包括SEQ ID No 3的多肽相比，具有至少2.5的熱穩(wěn)定性差異。
34.權(quán)利要求29至33的方法，其中步驟c)包括篩選表達(dá)改良的肌醇六磷酸酶變體的宿主細(xì)胞，該肌醇六磷酸酶變體與i)所述親本肌醇六磷酸酶和/或ii)包括SEQ ID No 3的多肽相比，具有至少30的胃蛋白酶穩(wěn)定性。
35.權(quán)利要求29至34的方法，其中步驟c)包括篩選表達(dá)改良的肌醇六磷酸酶變體的宿主細(xì)胞，該肌醇六磷酸酶變體與i)所述親本肌醇六磷酸酶和/或ii)包括SEQ ID No 3的多肽相比，具有當(dāng)與由SEQ ID No 3編碼的肌醇六磷酸酶相比時至少110的比活比率。
36.根據(jù)權(quán)利要求29至35的方法制備的改良的肌醇六磷酸酶變體。
37.多核酸構(gòu)建體，優(yōu)選DNA構(gòu)建體，其包括編碼權(quán)利要求16或權(quán)利要求36任一項的改良的肌醇六磷酸酶變體的多核酸序列。
38.重組表達(dá)載體，其包括權(quán)利要求37的多核酸構(gòu)建體。
39.宿主細(xì)胞，其用權(quán)利要求37的DNA多核酸和/或權(quán)利要求38的載體轉(zhuǎn)化。
40.產(chǎn)生改良的肌醇六磷酸酶變體的方法，其包括在允許表達(dá)所述改良的肌醇六磷酸酶變體的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求39的宿主細(xì)胞。
41.飼料或食物組合物，其包括至少一種權(quán)利要求8至12或36任一項的改良的肌醇六磷酸酶變體，或權(quán)利要求38的宿主細(xì)胞，其中所述食物或飼料組合物優(yōu)選根據(jù)權(quán)利要求25或26的方法制備。
全文摘要
本發(fā)明涉及酶和方法。尤其描述了用編碼細(xì)菌肌醇六磷酸酶和其變體的核酸轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。
文檔編號C12N1/20GK101052715SQ200580035619
公開日2007年10月10日 申請日期2005年10月17日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月18日
發(fā)明者安德烈·米亞斯尼科夫, 維杰伊·庫瑪, 奧利弗·肯施, 克勞斯·佩倫加爾, 伯吉塔·勒思納, 烏爾里克·凱特林, 安德烈·科爾特曼 申請人:丹尼斯科公司