專利名稱：使用2價金屬的核酸捕獲方法
技術領域：
本發(fā)明涉及使用以2價金屬離子為介質的核酸締合體或2價金屬離子固定化基材等的核酸捕獲方法。
背景技術：
在生物技術或臨床診斷等領域，從含有核酸的試樣配制核酸是一項重要的技術。例如在基因重組技術中，需要單獨分離載體DNA或要克隆的DNA的雙鏈，在遺傳病或癌基因方面若要進行基因檢查，需要從血液中的白細胞等中提取核酸。
一般來說，核算并不作為游離分子存在，而是存在于如細菌、細胞、病毒粒子等中，由蛋白質、脂質及糖構成的細胞膜或細胞壁所覆蓋。另外，核酸本身與組蛋白等形成復合體。若要提取以如此狀態(tài)存在的核酸，需要如下操作破壞覆蓋核酸的細胞膜或細胞壁，促使所述復合體的蛋白質變性或分解，使之可溶化、使核酸游離，提取游離的核酸。
作為從細胞調制核酸的方法，通常的方法是將含細胞的試樣用SDS或蛋白酶K處理、可溶化之后，用苯酚變性去除蛋白質，以精制核酸(Molecular Cloning 2ndEdition，9.16-9.23，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)。但是，由于該方法費功夫和時間，因此需要更簡便的方法。
作為用于分離核酸的更為簡便的方法，例如，WO99/22021揭示了使用二氧化硅的方法。用該方法，首先用離液劑處理，溶解細胞，使核酸游離。然后，將核酸吸附到由二氧化硅或其衍生物構成的核酸結合性載體上，用離液劑或有機溶劑離心清洗該載體。最后，用低鹽緩沖液溶出核酸。該方法與苯酚法相比雖然簡便，但尚具有含多個工序、需要離心操作的缺點。另外，由于使用了強烈阻礙PCR等酶反應的高離液鹽或乙醇，需要完全去除這些物質，因此存在操作變得繁雜、費時間等的缺點。
日本專利公開公報特公平8-24583號、特開平8-280384號等揭示了使用如白細胞分離過濾器的細胞吸附型纖維集合體從末梢血白細胞調制核酸的方法。在日本專利公開公報特公平8-24583號所記載的方法中，首先使血液通過白細胞分離過濾器，使血液中的白細胞吸附到過濾器上，與血液中的其他成分分離。使TE(10mM Tris；1mM EDTA；pH7.6)流過、清洗該過濾器，去除血紅蛋白等的蛋白質。如此分離清洗的白細胞與過濾器一起凍結在例如-80℃中，然后放置于室溫中將白細胞解凍。然后在纖維狀物質中加入TE-mix(TE、10mM NaCl、1.5mM MgCl2、pH7.5)，從纖維狀物質中回收吸附在過濾器的纖維狀物質上的白細胞。然而，在日本專利特公平8-24583號公報中揭示了以下方法按照已有的技術(苯酚處理)進行從回收的白細胞提取基因組DNA的操作。即，在白細胞中加入十二烷基硫酸鈉(SDS)等的表面活性劑和蛋白分解酶(蛋白酶K)，在65℃中培養(yǎng)15小時，在其中加入RNA分解酶(核糖核酸酶A)在37℃培養(yǎng)1小時之后，用苯酚試劑處理，用乙醇沉淀、精制DNA。
在日本專利特開平8-280384號公報所揭示的方法有吸附有核細胞后，取出有核細胞中的核酸或蛋白質。作為取出核酸或蛋白質的方法，公開了在極細纖維集合體上結合細胞后，原封不動地通過細胞溶解液進行溶解，或進行破碎。該方法的優(yōu)點是可以將吸附的細胞原封不動地進行破碎、溶解處理。由于可以無需解吸所吸附的細胞而對其進行破碎或溶解，因此比對所吸附的細胞進行解吸的方法更容易實施。然而，在該公報中，對于細胞溶解后的核酸精制，也只沿用已有的技術，而未揭示新的方法。即，用蒸餾水或表面活性劑處理吸附了細胞的極細纖維集合體，用普通的苯酚-氯仿法從通過極細纖維集合體的細胞溶解液中精制核酸。
如上所述，在從末梢血白細胞精制核酸的方法方面，采用類似白細胞分離過濾器的細胞吸附型纖維集合體已經公知，上述方法不過是使用過濾器進行至白細胞的分離或核酸提取的步驟為止，而之后的核酸精制工序采用了已有的核酸精制法。因此，存在核酸的精制工序變復雜，費時間和功夫的缺點。
作為更加簡便的方法，WO00/21973揭示了采用過濾器從細胞直接精制核酸的方法。該方法包含如下工序(1)首先，將含有細胞的試樣經過過濾器，使細胞吸附在過濾器上。(2)然后，溶解吸附在過濾器上的細胞，(3)用過濾器過濾。(4)清洗吸附到過濾器上的核酸。(5)最后，從過濾器中溶出核酸。若從40℃加溫至125℃，則吸附的核酸會溶出，溶出緩沖液的pH為5至11的范圍，鹽濃度可高可低。精制的核酸的A260/A280為1.8，可以作為PCR的模板使用。在WO00/21973中，雖然作為可用于精制核酸的目的的過濾器的例子，列舉了Whatman GF/D variant filters，另一方面，作為不可使用的例子列舉了WhatmanGF/C variant filters，但適用于該方法的過濾器必須是，即使將精制DNA在過濾器通過，也不會捕獲到精制DNA。另外，在該方法中，若溶解細胞之后通過過濾器，則DNA的收率降低80％，因此并不實用。再有，采用該方法從血液調制核酸時，實驗者需要在溶解白細胞之前使紅細胞溶血。加之，在如上所述將細胞吸附到過濾器之后進行精制的方法中，存在必須根據細胞的種類選擇過濾器的缺點。
作為克服這些缺點的更簡便的方法，WO03/006650揭示了采用無紡布分離、擴增及檢測核酸的方法。該方法包含，首先使細胞抽出液接觸無紡布，將細胞提取液中的核酸吸附到無紡布上，然后在該無紡布上加入用于擴增核酸的溶液，將吸附到該無紡布上的核酸作為模板擴增核酸的工序。用該方法無需采用任何特別的試劑，通過使試樣中的核酸接觸無紡布上這樣非常簡便的方法，可以在無紡布上精制核酸。另外，在無紡布上精制的核酸通過接觸核酸合成反應液，可以原封不動進行擴增反應，核酸的檢測非常簡便。然而，在捕獲比較低濃度(1pg/mL～100pg/mL)的核酸時，該方法存在由于試樣中共存的蛋白質如白蛋白或球蛋白等的影響從而捕獲率大幅降低的缺點。
另一方面，作為用于離析核酸的方法使用2價金屬離子的例子，已知的有例如采用二氧化硅的方法(WO99/22021)。在該方法中，首先用離液劑(chaotropic reagent)處理細胞，溶解細胞，游離核酸。然后，將核酸吸附到由二氧化硅或其衍生物構成的核酸結合性載體上，用離液劑或有機溶劑將該載體進行離心清洗。最后，用低鹽緩沖液將核酸溶出。在該方法中，為了在核酸吸附到載體上時維持核酸的固定化，作為對溶液的添加物采用含有鎂的各種鹽類。
該方法并不是作為將離子每固定化于基材側、捕獲液相側的核酸的手段使用，也不是將鎂離子用作為分離核酸的主要手段。日本專利特愿平5-164841號公報中揭示了使用鎂鹽從蛋白質分離雙鏈核酸的方法。在該方法中，通過將含有pK小于9的羥基取代芳香族部分的聚合物作為基材使用，在該基材上使pH7～10、一價或多價的陽離子共存，使含有核酸與蛋白質的液相接觸，從而在使蛋白質及單鏈核酸結合到基材上，將未結合于基材上的雙鏈核酸從液相分離。該方法不含在pH12以上的高堿性條件下使試樣變性的工序，另外，并不是將鎂作為核酸捕獲劑積極地在固定化于基材上。還有，該方法并不是在pH12以上的高堿性條件下使鎂離子與核酸共存，并結合于基材上。

發(fā)明內容
發(fā)明所要解決的課題本發(fā)明的目的在于提供一種從含核酸的試樣中捕獲、回收核酸的方法，該方法比已有的方法更簡便且高收率。本發(fā)明進一步的目的在于提供一種可用于已有的核酸擴增技術的、迅速且簡便的核酸調制法。
解決課題的手段本發(fā)明者認真研究的結果，發(fā)現(xiàn)在試樣中添加氯化鎂等的鎂化合物之后，若通過加入氫氧化鈉等的堿，將pH提高到14附近，則即使在蛋白質共存的試樣中核酸對無紡布的捕獲效率也會戲劇性地回復。進一步研究的結果，令人吃驚的是，發(fā)現(xiàn)在高堿性條件下核酸通過2價金屬離子，更理想的是通過鎂離子的特異作用而形成締合體、及通過形成該締合體，核酸的外觀尺寸增大，在過濾器上的捕獲效率提高，可以高收率地從含核酸的試樣捕獲核酸。
另外，本發(fā)明者在含有核酸的試樣中添加氫氧化鈉，從而調制將pH提高到14附近的試樣，使該試樣通過固定化了鎂的無紡布，則吃驚的是發(fā)現(xiàn)，在蛋白質共存的試樣中核酸對無紡布的捕獲效率戲劇性地提高。本發(fā)明者進一步研究的結果，發(fā)現(xiàn)在高堿性條件下變性為單鏈的核酸與鎂的結合力非常高，液相核酸容易被固相的鎂捕獲。本發(fā)明基于這些發(fā)現(xiàn)而完成。
即，根據本發(fā)明提供將試樣中的核酸捕獲到固相基材表面上的方法及檢測試樣中的核酸的方法，其中，將試樣中的核酸捕獲到固相基材表面上的方法捕獲包括將該試樣調整到pH12以上的工序和下述某一項工序使固定化在固相基材表面上的、至少1種2價金屬離子與該試樣中的核酸結合，捕獲核酸的工序，或使至少1種2價金屬離子與該試樣中的核酸結合之后，使核酸接觸固相基材表面而捕獲的工序；檢測試樣中的核酸的方法包括將試樣調整到pH12以上的工序和下述某一項工序將該試樣調整到pH12以上的工序和下述某一項工序使固定化在固相基材表面上的、至少1種2價金屬離子與該試樣中的核酸結合，捕獲核酸的工序，或使至少1種2價金屬離子與該試樣中的核酸結合之后，使核酸接觸固相基材表面而捕獲的工序；而且還包括以該捕獲的核酸為模板使特定堿基序列的核酸擴增，并對其進行檢測的工序。
在這些方法中，最好是所述至少1種2價金屬離子為鎂。
以下，將上述本發(fā)明大致分為3個形態(tài)進行說明。
根據第1形態(tài)，提供一種將核酸捕獲到固相基材表面上的方法，該方法包括使pH調整為12以上的試樣接觸固相基材表面，該試樣含有核酸及2價金屬離子化合物，所述2價金屬離子化合物最好是鎂化合物。
典型地，該方法至少包括如下工序(a)在含有核酸的試樣中添加2價金屬化合物，最好是鎂化合物的工序；(b)在工序(a)中得到的試樣中添加堿，將試樣的pH調整到12以上，形成試樣中的核酸的締合體的工序，及(c)使工序(b)中得到的試樣接觸固相基材表面，在固相基材表面捕獲核酸的工序。
另外，其它典型的方法中，至少包括如下工序(a)將含有核酸的試樣的pH調整為12以上的工序；(b)在工序(a)中得到的試樣中添加2價金屬化合物，最好是鎂化合物，形成試樣中的核酸的締合體的工序；及(c)使工序(b)中得到的試樣接觸固相基材表面，在固相基材表面捕獲核酸的工序。
從其它觀點來看，本發(fā)明提供一種檢測核酸的方法，該方法包括，使含有核酸及2價金屬化合物，最好是鎂化合物的、pH調整為12以上的試樣接觸固相基材表面，以在該固相基材表面上被捕獲的核酸為模板，使特定堿基序列的核酸擴增并對其進行檢測的工序。
典型地，該方法至少包括如下工序(a)在含有核酸的試樣中添加2價金屬化合物，最好是鎂化合物的工序；(b)在工序(a)中得到的試樣中添加堿，將試樣的pH調整到12以上，形成試樣中的核酸的締合體的工序；(c)使工序(b)中得到的試樣接觸固相基材表面，在固相基材表面捕獲核酸的工序；(d)使含有可以擴增特定堿基序列的寡核苷酸探針、單核苷酸3磷酸及核酸合成酶的溶液與工序(c)中得到的固相基材接觸，以在該固相基材表面捕獲的核酸為模板擴增具有特定堿基序列的核酸的工序；及(e)對具有在工序(d)中擴增的特定堿基序列的核酸進行檢測。
另外，其它典型的形態(tài)，至少包括如下工序(a)將含有核酸的試樣的pH調整為12以上的工序；(b)在工序(a)中得到的試樣中添加2價金屬化合物，最好是鎂化合物，形成試樣中的核酸的締合體的工序；(c)使工序(b)中得到的試樣接觸固相基材表面，在固相基材表面捕獲核酸的工序；(d)使含有可以擴增特定堿基序列的寡核苷酸探針、單核苷酸3磷酸及核酸合成酶的溶液接觸工序(c)中得到的固相基材表面接觸，以在該固相基材表面捕獲的核酸為模板擴增具有特定堿基序列的核酸的工序；及(e)對具有在工序(d)中擴增的特定堿基序列的核酸進行檢測的工序。
還有，在其他形態(tài)中，上述工序(d)及(e)，可以用如下工序替代(d’)使核酸從工序(c)中得到的固相基材表面溶出，在得到的溶出液中加入含有可以擴增特定堿基序列的寡核苷酸探針、單核苷酸3磷酸及核酸合成酶的溶液，以該溶出液中的核酸為模版擴增具有特定堿基序列的核酸；及(e’)對具有在工序(d’)中擴增的特定堿基序列的核酸的工序進行檢測。在上述的溶出工序中，最好能進行熱溶出、表面活性劑溶出、或EDTA溶出。
根據上述各發(fā)明的理想的形態(tài)，提供一種通過過濾，在固相基材表面捕獲核酸的締合體的上述的方法；及固相基材為過濾器的上述方法。
根據第2形態(tài)，提供一種在固相基材表面捕獲核酸的方法，該方法包括使含有核酸和2價金屬化合物及對2價金屬離子具有親和性的高分子化合物的、pH調整為12以上的試樣接觸固相基材表面的工序。
典型地，該方法至少包括如下工序(a)在含有核酸的試樣中添加至少1種2價金屬化合物及對該至少1種2價金屬離子具有親和性的高分子化合物的工序；(b)將工序(a)中得到的試樣的pH調整到12以上，形成試樣中的核酸與至少1種2價金屬化合物及高分子化合物的締合體的工序；及(c)使工序(b)中得到的試樣接觸固相基材表面，在固相基材表面捕獲核酸的締合體的工序。
另外，其它典型的方法，至少包括如下工序(a)將含有核酸的試樣的pH調整為12以上的工序；(b)在工序(a)中得到的試樣中添加至少1種2價金屬化合物及對該至少1種2價金屬離子具有親和性的高分子化合物，形成試樣中的核酸與至少1種2價金屬化合物及高分子化合物的締合體的工序；以及(c)使工序(b)中得到的試樣接觸固相基材表面，在固相基材表面捕獲核酸的締合體的工序。
還有，根據本發(fā)明其他形態(tài)，提供一種檢測核酸的方法，該方法包括使含有核酸和2價金屬化合物及對2價金屬離子具有親和性的高分子化合物的、pH調整為12以上的試樣，接觸固相基材表面，以在該固相基材表面所捕獲的核酸為模板，使特定堿基序列的核酸擴增并對其進行檢測的工序。
典型地，該方法至少包括如下工序(a)在含有核酸的試樣中添加至少1種2價金屬化合物及對該至少1種2價金屬離子具有親和性的高分子化合物的工序；(b)將工序(a)中得到的試樣的pH調整到12以上，形成試樣中的核酸與至少1種2價金屬化合物及高分子化合物的締合體的工序；(c)使工序(b)中得到的試樣接觸固相基材表面，在固相基材表面捕獲核酸的締合體的工序；(d)使含有適于擴增特定堿基序列的寡核苷酸探針、單核苷酸3磷酸及核酸合成酶的溶液與工序(c)中得到的固相基材表面接觸，以在該固相基材表面捕獲的核酸為模板，擴增具有特定堿基序列的核酸的工序；及(e)對具有在工序(d)中擴增的特定堿基序列的核酸進行檢測的工序。
另外，其他典型的形態(tài)，至少包括(a)將含有核酸的試樣的pH調整為12以上的工序；(b)在工序(a)中得到的試樣中添加至少1種2價金屬化合物及對該至少1種2價金屬離子具有親和性的高分子化合物，形成試樣中的核酸與至少1種2價金屬化合物及高分子化合物的締合體的工序；(c)使工序(b)中得到的試樣接觸固相基材表面，在固相基材表面捕獲核酸的締合體的工序；(d)使含有適于擴增特定堿基序列的寡核苷酸探針、單核苷酸3磷酸及核酸合成酶的溶液與工序(c)中得到的固相基材表面接觸，以在該固相基材表面捕獲的核酸為模板，擴增具有特定堿基序列的核酸的工序；及(e)對具有在工序(d)中擴增的特定堿基序列的核酸進行檢測的工序。
在第3形態(tài)中，提供一種在固相基材表面捕獲核酸的方法，該方法包括使含有核酸的、pH12以上的試樣與將2價金屬離子、最好是將鎂離子固定化的固相基材表面接觸的工序。
典型的該方法，至少包括如下工序(a)將2價金屬離子，最好是將鎂離子，在固相基材表面上固定化的工序；(b)將含有核酸的試樣的pH調整為12以上的工序；及(c)使在工序(b)得到的試樣接觸在工序(a)中得到的固相基材表面，在固相基材表面捕獲核酸的工序。
從其它觀點來看，提供一種檢測核酸的方法，該方法包括使含有核酸的、pH調整為12以上的試樣接觸將2價金屬離子、最好是將鎂離子固定化的固相基材表面，以在該固相基材表面上所捕獲的核酸為模板，使特定堿基序列的核酸擴增并對其進行檢測的工序。
典型地，該方法至少包括如下工序(a)將2價金屬離子，最好是將鎂離子，在固相基材表面上固定化的工序；(b)將含有核酸的試樣的pH調整為12以上的工序；(c)使在工序(b)得到的試樣接觸在工序(a)中得到的固相基材表面，在固相基材表面捕獲核酸的工序。
(d)使含有可以擴增特定堿基序列的寡核苷酸探針、單核苷酸3磷酸及核酸合成酶的溶液與工序(c)中得到的固相基材表面接觸，以在該固相基材表面捕獲的核酸為模板擴增具有特定堿基序列的核酸的工序；及(e)對具有在工序(d)中擴增的特定堿基序列的核酸進行檢測的工序。另外，在其他典型的形態(tài)，至少包括下述工序(a)將2價金屬離子，最好是將鎂離子，在固相基材表面上固定化的工序；(b)將含有核酸的試樣的pH調整為12以上的工序；(c)使在工序(b)得到的試樣與在工序(a)中得到的固相基材表面接觸，在固相基材表面捕獲核酸的工序。
(d)使核酸從工序(c)得到的固相基材表面溶出，在得到的溶出液中添加含有可以擴增特定堿基序列的寡核苷酸探針、單核苷酸3磷酸及核酸合成酶的溶液，以在該溶出液中的核酸為模板，擴增具有特定堿基序列的核酸的工序；及(e)對具有在工序(d)中擴增的特定堿基序列的核酸進行檢測的工序。在上述的溶出工序中，最好能進行熱溶出、表面活性劑溶出或EDTA溶出。
根據上述本發(fā)明的理想形態(tài)，提供包括如下的方法通過過濾，在固相基材表面捕獲核酸的上述方法；及上述方法中，固相基材為過濾器；固相基材包含具有可以將2價金屬離子，最好是鎂離子，固定化的殘基的高分子；能夠將2價金屬離子，最好是鎂離子，固定化的殘基為羧基；以及，將固相基材層多層化的固相基材，其中，所述固相基材層是固相基材將2價金屬離子，最好是鎂離子固定化的固相基材層。
還有，從其它觀點來看，根據本發(fā)明，提供核酸的捕獲用具，所述核酸的捕獲用具包含在其表面上固定化2價金屬離子，最好是鎂離子的固相基材；及提供核酸的捕獲用具，所述核酸的捕獲用具包含具有可在其表面上固定化2價金屬離子，最好是鎂離子的殘基的固相基材。
另外，根據本發(fā)明，提供，核酸的檢測套裝，包括(a)在其表面上固定化有2價金屬離子，最好是鎂離子的固相基材；及(b)可以擴增特定堿基序列的寡核苷酸探針、單核苷酸3磷酸及核酸合成酶中的至少一種。
發(fā)明效果本發(fā)明在核酸的捕獲、濃縮及分離精制上無需特別的裝置，就可以簡便地捕獲核酸，擴增、檢測捕獲的核酸。通過2價金屬離子，最好是通過鎂離子捕獲在固相基材表面上捕獲的核酸，可以原封不動作為核酸合成反應的模板使用，更進一步，可以通過表面活性劑、熱或螯合劑等的作用很容易地從固相基材表面溶出，所以可以簡便得到含有核酸的溶出液，進行核酸合成及檢測反應。另外，通過以2價金屬離子，最好是鎂離子形成締合體而捕獲到固相基材表面上的核酸，可以原封不動作為核酸合成反應的模板使用，更進一步，可以通過表面活性劑、熱或螯合劑等的作用很容易地從固相基材表面溶出，所以可以簡便得到含有核酸的溶出液，進行核酸合成及檢測反應。


圖1是顯示在實施例中使用的無紡布固定化的柱的結構的圖。
圖2是顯示無紡布上DNA的LAMP擴增反應時間的比較結果的圖。縱軸表示濁度變?yōu)?.1為止的經過時間。
圖3是顯示在鎂離子固定化無紡布中的核酸捕獲效果(無紡布表面的熒光強度)的圖。
圖4是顯示比較(鎂吸附到聚合物涂層非織造布與多層化過濾器的效果)無紡布上DNA的LAMP擴增反應時間的圖。縱軸表示濁度變?yōu)?.1為止的經過時間，(1)至(5)表示無紡布的狀態(tài)。
圖5是表示比較(試樣有無堿處理的比較)無紡布上DNA的LAMP擴增反應時間的圖?？v軸表示濁度變?yōu)?.1為止的經過時間，(1)及(2)表示無紡布的狀態(tài)。
圖6是顯示測定例5中得到的無紡布表面的熒光強度的結果的圖(生理鹽水試樣)。圖中的數(shù)字表示熒光強度，(1)至(3)表示吸附到無紡布上的試樣編號。
圖7是顯示測定例6中得到的無紡布表面的熒光強度的結果的圖(NaOH處理試樣)。圖中的數(shù)字表示熒光強度，(1)至(4)表示吸附到無紡布上的試樣編號。
圖8是表示將無紡布上DNA的LAMP擴增反應時間進行比較的結果的圖(確認添加氯化鎂帶來的效果)?？v軸表示在LAMP擴增反應中，伴隨焦磷酸鎂生成的濁度(在650nm的吸光度)變?yōu)?.1為止的時間，(1)至(3)表示吸附到無紡布上的試樣編號。
圖9是表示將無紡布上DNA的LAMP擴增反應時間進行比較的結果的圖(討論氯化鎂的添加濃度)。縱軸表示在LAMP擴增反應中，伴隨焦磷酸鎂生成的濁度(在650nm的吸光度)變?yōu)?.1為止的時間。
圖10是表示將無紡布上DNA的LAMP擴增反應時間進行比較的結果的圖(討論試樣pH的影響)?？v軸表示在LAMP擴增反應中，伴隨焦磷酸鎂生成的濁度(在650nm的吸光度)變?yōu)?.1為止的時間。
圖11是顯示在例10中堿性條件下的瓊脂糖凝膠電泳結果的圖(鎂的添加效果)。第1列λDNA、第2列λDNA+0.3％BSA、第3列λDNA+1mM MaCl2、第4列λDNA+0.3％BSA+1mM MaCl2、第5列λDNA+0.3％BSA+1mM MaCl2+1mM EDTA。
圖12顯示在例11中堿性條件下的瓊脂糖凝膠電泳結果的圖(鎂的添加濃度的影響)。5％瓊脂糖、0.05N NaOH、第1列λDNA+0.1mM MaCl2、第2列λDNA+0.2mM MaCl2、第3列λDNA+0.3mM MaCl2、第4列λDNA+0.4mM MaCl2、第5列λDNA+0.5mM MaCl2。
圖13是顯示在例11中pH8條件下的瓊脂糖凝膠電泳結果的圖(鎂的添加效果)。第1列λDNA、第2列λDNA+0.3％BSA、第3列λDNA+1mM MaCl2、第4列λDNA+0.3％BSA+1mM MaCl2、第5列λDNA+0.3％BSA+1mM MaCl2+EDTA。
圖14是表示將無紡布上DNA的LAMP擴增反應時間進行比較的結果的圖(固定化各種二價金屬離子的無紡布的比較)?？v軸表示在LAMP擴增反應中，伴隨焦磷酸鎂生成的濁度(在650nm的吸光度)變?yōu)?.1為止的時間。
圖15是顯示在無紡布上捕獲的DNA的PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳的結果的圖(1％瓊脂糖)。第1～4列是使用的無紡布上有無固定化的鎂離子、及吸取的樣品的順序。
第1列未固定化、BCG菌基因組200pg/生理鹽水/0.2N NaOH第2列未固定化、BCG菌基因組200pg+0.3％HSA/生理鹽水/0.2N NaOH第3列鎂固定化、BCG菌基因組200pg/生理鹽水/0.2N NaOH
第4列鎂固定化、BCG菌基因組200pg+0.3％HSA/生理鹽水/0.2N NaOH。
圖16是表示將無紡布上DNA的LAMP擴增反應時間進行比較的結果的圖(EDTA及鍶的添加效果)?？v軸表示在LAMP擴增反應中，伴隨焦磷酸鎂生成的濁度(在650nm的吸光度)變?yōu)?.1為止的時間。(1)至(5)表示吸附到無紡布上的各試樣。
圖17是表示將無紡布上DNA的LAMP擴增反應時間進行比較的結果的圖(對尿試樣的鎂固定化無紡布的核酸捕獲效果)?？v軸表示在LAMP擴增反應中，伴隨焦磷酸鎂生成的濁度(在650nm的吸光度)變?yōu)?.1為止的時間。橫軸表示在無紡布上吸取的各試樣。圖中左側藍色斜線的柱表示未處理的無紡布、右側紅色柱表示將鎂固定化的無紡布。
圖18是表示將非織布上DNA的LAMP擴增反應時間進行比較的結果的圖(含BSA的清洗液對捕獲核酸捕獲后的無紡布的效果)?？v軸表示在LAMP擴增反應中，伴隨焦磷酸鎂生成的濁度(在650nm的吸光度)變?yōu)?.1為止的時間。橫軸表示含在清洗液中的BSA的濃度。
圖19是表示將無紡布上DNA的LAMP擴增反應時間進行比較的結果的圖(金屬離子親和性高分子的添加效果)。縱軸表示在LAMP擴增反應中，伴隨焦磷酸鎂生成的濁度(在650nm的吸光度)變?yōu)?.1為止的時間。(1)至(4)表示吸附到無紡布上的各試樣。
具體實施例方式
在本發(fā)明中，作為含有核酸的試樣，可以舉例如從含有細胞的試樣中破壞細胞而調制的細胞提取液。在本說明書中，所謂細胞意味著真核細胞、原核細胞或病毒，尤其包括人體細胞、人末梢血白細胞、成為感染癥起因的真菌、細菌或病毒。試樣的種類無特別限定，只要是例如血液、尿、髓液、咳痰、體液、細胞浮游液或細胞培養(yǎng)液等含有細胞的試樣，則其種類無特別限定。另外，試樣也可以是實施過某種處理的處理液。作為處理的方法，可以舉例如，將咳痰等粘性高的試樣通過咳痰處理劑溶解等的方法。
所謂細胞提取液是含有破壞細胞而得到的細胞組成成分的混合物。一般來說，細胞提取液可以使細胞溶解液作用于含有細胞的試樣進行調制。細胞溶解液是，用于破壞細胞，提取核酸的溶液，根據需要含有表面活性劑或酶等，但無需含有這些物質的一部分或全部。作為酶，可以使用蛋白質分解酶，如蛋白酶K等，但是也可以根據細胞種類使用溶菌酶、溶葡萄菌素(葡萄球菌屬)、β1，3-葡聚糖酶、甘露聚糖酶、甲殼質酶(真菌類)等。在最好去除RNA時，只要加入諸如核糖核酸酶A(RNase A)的RNA分解酶即可。另外，也可以不含如上所述的酶。在動物細胞中，可以僅接觸低張液就使細胞破裂。另外，細胞提取液也可以在含有細胞的試樣中施加超聲波、或用均化器破碎等施加物理力而制成。
2價金屬化合物只要是可以向溶液中的核酸供給2價金屬離子的物質，則其種類無特別限定。如2價金屬鹽或2價金屬高分子絡合物等就適合。作為2價金屬鹽，較好的是如氯化物、硫酸鹽或硝酸鹽等。作為2價金屬，較好的是如鋅、錳、鎂等。最理想的是鎂。2價金屬化合物也可以是在調整pH為12以上之前加入到細胞溶解液等的試樣中，或也可以是將試樣調整為pH12以上之后，在試樣接觸過濾器等的固相基材表面之前加入。促進核酸的締合的2價金屬化合物的濃度范圍并無特別限定，較好的是如0.1mM以上。
在本發(fā)明中，用于將試樣調整為pH12以上的試劑并無特別限定，如氫氧化鈉、氫氧化鉀等的強堿比較適合。通過添加適量的該強堿水溶液，可以將試樣的pH調整為12以上。
作為使含有核酸的試樣接觸固相基材表面的手段，可以舉例如，使試樣溶液流過固相基材表面之上，或將試樣溶液吸取到固相基材表面或通過加壓等使試樣溶液透過，或將固相基材浸到試樣溶液中等的手段。
固相基材的材質及形狀無特別限定，但可以使用如多孔質的片狀基材，較好的是可以使用過濾器。過濾器的形狀及材質無特別限定，但可以例示如無紡布、織造布、薄膜過濾器、空心線過濾器、燒結過濾器、玻璃纖維過濾器等。較好的是將由無紡布構成的過濾器作為固相基材使用。所謂無紡布是用機械的、熱的、化學的手段將短纖維或長絲連接或混雜制成片狀或網狀的結構體(第2版纖維便覽纖維學會編丸善)。無紡布可以用各種方法生產，但基本工序包括網(以存有纖維方向的程度齊全的纖維塊的片狀物)的形成工序和網的粘附工序、以及完成工序。作為無紡布，可以使用從天然纖維到化學纖維的各種纖維，但通常用的是棉、人造絲、聚酯、聚丙烯、或尼龍等，作為其他纖維也使用丙烯酸、維尼綸、玻璃纖維、紙漿或碳纖維等。較好的是可以使用聚對苯二甲酸乙二醇酯構成的無紡布。形成網的方式大體可分為濕式、干式、及直接式。直接式是又稱為紡絲直接式的方法，包括收集從溶融高分子溶液紡絲的纖維、直接織網的工序。作為直接式中所含的方法可以舉例如，水刺(spun lace)法、紡粘(spun bound)法、熔噴法、針刺法、縫編法(stitchbound)等，但在本發(fā)明中最適合的是用熔噴法制成的超極細纖維無紡布。
將2價金屬離子在固相基材表面固定化的手段并無特別限定，可以舉例如將2價金屬離子在具有與2價金屬離子形成絡合物的配位基的固相基材表面上進行固定化。通常，作為可以與2價金屬形成絡合物的配位基，可以例示乙醇、苯酚、烯醇、羧酸、醛、酮、醌、醚、酯、酰胺、亞硝基化合物、硝基化合物、N-氧化物、磺酸、次磷酸、亞磷酸、胂酸、伯胺、仲胺、叔胺、偶氮基化合物、希夫氏堿、肟、亞氨或烯胺等，可以組合這些配位基的一種或2種以上進行2價金屬離子的固定。作為具有這些配位基的固相基材，可以舉例如涂覆有機或無機合成高分子、天然高分子、或將這些進行化學修飾的高分子、或具有這些基團的高分子的固相基材等。
通過以被固相基材表面捕獲的核酸為模板擴增特定堿基序列的核酸，可以判斷試樣中是否存在具有該特定堿基序列的核酸，由此可以檢測試樣中所含的具有特定堿基序列的核酸。對于核酸的擴增，可以使用PCR代表的擴增特定目的核酸序列的方法，除PCR之外也可以使用連接酶鏈式反應(LCR)、轉錄-介導擴增(TMA)、分支DNA(bDNA)測定、核酸序列依賴性擴增(NASBA)、鏈置換擴增(SDA)、循環(huán)探針技術(CPT)、Q-β復制酶擴增技術、滾動循環(huán)擴增技術(RCAT)、環(huán)介導等溫擴增(LAMP)、等溫的和嵌合引物起始的核酸擴增(ISCAN)等的方法。不過、核酸的擴增方法不限定于這些。Q-β復制酶擴增技術、RCAT、NASBA、SDA、TMA、LAMP、ISCAN等可以用等溫(規(guī)定溫度)進行擴增反應，其他的PCR、LCR等可以用熱循環(huán)(溫度循環(huán))進行擴增反應。
所謂用于核酸擴增的核酸合成反應是使用DNA依賴性DNA聚合酶、DNA依賴性RNA聚合酶、RNA依賴性RNA聚合酶、反轉錄酶、鏈上取代型DNA聚合酶等，引物特異性地引起5’-3’DNA或RNA合成的反應。在本說明書中，核酸是包括DNA及RNA以及含有非天然型的核酸堿基的DNA及RNA的概念。作為DNA聚合酶，可以舉例如Klenow片段、T4DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶等，但不限定于這些。另外，在用依靠引物和DNA聚合酶的核酸延伸反應檢測特定堿基序列的方法中，有例如前述的SNPs型技術的高溫測序法(pyrosequencing method)、引物延伸法、LAMP法等。
作為檢測具有擴增的特定堿基序列的方法，有例如，根據波長650nm的光的透光度，即濁度的變化檢測伴隨核酸的合成反應生成的焦磷酸和鎂的反應物的沉淀的方法、或根據在含有插入性熒光色素的反應液中，伴隨插入到擴增的核酸中，熒光強度發(fā)生變化檢測的方法等。作為插入性熒光色素，可以舉例如菲啶溴紅(ethidium bromide)、吖啶橙、bisbentimide、二氨苯基吲哚、放線菌素、噻唑、或色霉素或它們的衍生物等。
作為對2價金屬具有親和性的高分子，可以使用例如在側鏈具有可以與2價金屬形成絡合物的配位基的高分子。通常，作為可以與2價金屬形成絡合物的配位基，可以例示醇、苯酚、烯醇、羧酸、醛、酮、醌、醚、酯、酰胺、亞硝基化合物、硝基化合物、N-氧化物、磺酸、次磷酸、亞磷酸、胂酸、伯胺、仲胺、叔胺、偶氮基化合物、希夫氏堿、肟、亞氨或烯胺等。對2價金屬有親和性的高分子，也可以具有2種以上這些配位基。作為具有這些配位基的高分子，可以舉例如有機或無機合成高分子或天然高分子或將這些化學修飾的高分子等。
以下，對上述本發(fā)明的3個形態(tài)分別進行更具體的說明，但本發(fā)明的范圍不限定于下述說明的特定部分。
作為已知方法，若在過濾器中使用無紡布(聚對苯二甲酸乙二醇酯(PET)無紡布、A040C01旭化成株式會社)，觀測在無紡布上核酸的捕獲效率，則僅在試樣含適當鹽的精制DNA溶液時非常高，但若試樣中有蛋白質共存，則極端地低。與此相對，若在同樣的試樣中添加作為2價金屬化合物的氯化鎂之后，通過加入氫氧化鈉將試樣的pH提高到12以上，則核酸對無紡布的捕獲效率戲劇性地恢復。若對無紡布上捕獲的核酸進行同樣的研究顯示，使之進行LAMP擴增反應，比較其反應時間，則通過在堿性條件下使鎂化合物共存，核酸的擴增反應時間大幅縮短，成為擴增模板的核酸有效地被過濾器捕獲。
本發(fā)明的方法的特征之一在于，不使用高離液鹽或乙醇、苯酚、氯仿等的有機溶劑，而是通過添加所謂2價金屬化合物及堿溶液的非常廉價、普通的試劑，可以簡便、迅速且有效地從含有蛋白質等的試樣中捕獲核酸。
此外，另一個特征在于，在堿性條件下，在固形基材表面捕獲到包含在添加有2價金屬化合物的試樣中的核酸之后，可以無需溶出核酸，就直接進行PCR等的核酸合成反應或接下來的特定核酸堿基序列的檢測。即，可以在相同的過濾器上實現(xiàn)從核酸的提取及精制到核酸合成，或者從核酸的提取及精制到特定的核酸堿基序列的檢測。根據該特征，可以顯著地將從試樣中提取核酸到檢測的全部工序簡單化，進而，由于不需要溶出操作，因此可以顯著縮短處理時間。另外，通過將作為固相基材的無紡布配置為陣列狀，或在相同的無紡布上呈陣列狀地點上(spot)核酸，也可以簡單地進行多項目檢測。
作為2價金屬化合物的添加量，雖然多多益善，但是在堿性條件下2價金屬離子通常形成氫氧化物。例如，已知，氫氧化鎂對水的溶解度非常低，為1mM以下左右。2價金屬化合物的添加量應當斟酌氫氧化物的溶解度而適當?shù)卮_定。例如，若鎂化合物的添加量為1mM以上，則在使用過濾器作為固相基材吸取試樣時，會存在因氫氧化物的堵塞而吸取阻力增大，難以在過濾器上的捕獲核酸。不過，對于吸取阻力的情況，可以通過加大過濾器的孔徑來對應。因此，鎂化合物的添加量的上限不僅如此。另一方面，作為本發(fā)明的特征，可以舉例如通過添加非常低濃度的2價金屬化合物，可以達到提高核酸在過濾器上的捕獲效率。這在避免因氫氧化物沉淀引起過濾器堵塞這一點上非常適宜。如作為添加鎂化合物的濃度為0.01mM以上、更好的是0.1mM以上。
此外，顯示對于本發(fā)明的另一特征的試樣的高pH條件，添加2價金屬化合物引起的核酸的捕獲效率提高效果可以在pH12以上的情況下達到。如，最好在試樣中添加氫氧化鈉等的強堿，調制為pH14左右。對于氫氧化鈉等堿的濃度，也根據捕獲的過濾器等固相基材的耐堿強度而有所不同，但最好在如50mM以上、1M以下。通過將核酸捕獲后的過濾器用中性條件的緩沖液清洗，可以降低過濾器表面及內部的pH，也可以向各種酶反應等提供捕獲的核酸。
對于2價金屬離子與核酸之間的相互作用已經進行了很多研究，但由于幾乎所有的金屬離子在高pH下成為氫氧化物、形成沉淀，所以沒有研究在高pH條件下核酸與金屬離子之間的相互作用的例子。在本發(fā)明中得到啟示，通過添加鎂化合物，在堿凝膠電泳中，泳動度越降低，核酸的大小、形態(tài)就越發(fā)生變化。在高pH條件下由于核酸以鎂離子為介質締合，所以外觀上的分子量增大起來，在將過濾器等的固相基材作為過濾材料使用時，核酸的捕獲效率提高。在pH11以下不能實質性地觀察到上述效果。對于核酸與鎂之間的相互作用，已知通常結合于雙鏈核酸的磷酸基上，但在高pH條件下在不至于形成氫氧化物沉淀的濃度中，尚沒有關于鎂離子促使核酸之間締合的現(xiàn)象的報告。此外，也尚沒有在過濾器等的固相基材上捕獲如此締合的核酸的例子。
此外，對于在高pH條件下憑借2價金屬離子形成的核酸的締合體，已知由于加入EDTA從而妨礙了締合。締合的形成很容易被EDTA等螯合劑的添加所阻礙，或締合體被破壞，捕獲效率降低。根據試樣，在生物體來源的成分中有可能含有各種有機酸類等的、對金屬離子具有螯合性能的成分。對該問題，可以通過在高pH下過量添加對氫氧化物的溶解度高的金屬化合物來避免。作為在高pH下對氫氧化物的溶解度高的金屬，可以舉例如堿性金屬或堿性土類金屬。如，對含有0.1mM的鎂化合物的試樣中添加1mM的EDTA之后，若添加10mM的鍶化合物，則可以從pH調整為12以上的試樣中有效地捕獲核酸。
再有，作為本發(fā)明的方法的特征之一，可以舉列如憑借2價金屬離子形成的核酸的締合體，其形成由于添加對2價金屬離子具有親合性的高分子而有所促進。發(fā)現(xiàn)，如在含有血清等的高濃度的蛋白質(7％左右)的試樣中，2價金屬離子與核酸的締合體的形成效率降低，核酸對固相基材的捕獲率降低。啟示若在該試樣中添加對2價金屬離子有親合性的高分子，則2價金屬離子與核酸的締合體的形成效率上升，核酸在固相基材的捕獲率提高。
通常，在細胞提取液中除核酸之外還含有生物體試樣來源的蛋白質。通過在試樣中添加蛋白酶K(終濃度0.1mg/ml)，也可以去除蛋白質，但由于試樣的處理工序增加，所以一般來講并不理想。在本發(fā)明的方法中，由于在蛋白質共存下可以在固相基材上有效捕獲核酸，所以通常不需要在核酸捕獲之前用蛋白酶k處理試樣的工序?？墒?，也存在這樣一種情況含有高濃度的蛋白質的試樣，如血液等的清況下，若使用PET無紡布構成的過濾器作為固相基材，則引起堵塞的可能性很高，所以為更安全地吸取，最好添加蛋白酶k。在本發(fā)明中，由于以2價金屬離子為介質形成核酸的締合體，該締合體的尺寸增大，因此也可以加大用于核酸捕獲的過濾器的孔徑。因此，也可以用孔徑更大的過濾器減小堵塞。
另外，本發(fā)明的方法的其他特征在于，使核酸從細胞游離，以溶液狀態(tài)接觸固相基材表面，所以可以應用于任何種類的細胞，是實用性很高的方法。如上所述，作為細胞，可以用于捕獲人白細胞之類的真核細胞、大腸菌之類的原核細胞、或病毒等的核酸。在將細胞捕獲到直接過濾器等的固相基材并溶解的方法中，需要根據細胞的種類優(yōu)化過濾器的特性或吸附條件。另外，由于必須在不破壞細胞的情況下結合于過濾器上，所以過濾的流速有限，通常需要緩慢通過過濾器。在本發(fā)明的方法中將過濾器作為固相基材使用時，由于使細胞提取液等的試樣以溶液狀態(tài)通過過濾器，所以可以加快流速。
此外，在本發(fā)明的方法中，將由無紡布構成的過濾器作為固相基材使用時，在堿性條件下以2價金屬離子為介質形成的核酸的締合體，僅僅使試樣溶液通過過濾器就很容易地在過濾器上捕獲到。只要是在過濾器的締合體保持能力的范圍內，試樣中所含的細胞數(shù)量或試樣容量就無限制。另一方面，使如FTATM那樣的細胞溶液滲進基材后溶解細胞的方法中，由于基材可吸收的試樣容量為處理量的上限，因此對從大容量試樣中提取核酸的目的不太合適。如，自細胞濃度低的大容量的試樣中，欲回收試樣中所含的全細胞的核酸的情況，需要用離心等其他手段預先濃縮細胞。在本發(fā)明的方法中使用過濾器作為固相基材時，沒有這樣的對試樣容量的限制。另外，由于無紡布可以處理單位面積上的大量細胞或大容量試樣，因此可以容易地增加每單位面積的核酸固定量(核酸密度)。因此，由無紡布構成的過濾器最能適用于本發(fā)明的方法。若核酸在過濾器上的固定量多，則檢測也變得容易，所以在例如利用核酸擴增反應的感染癥診斷這樣要求高靈敏度的情況下，或者核酸擴增不理想的檢查中，比較容易得到試樣，且在用過濾器處理大量試樣時等，本發(fā)明的方法特別有用。
另外，只要試樣中的核酸不分解，就可以使用以任意手段保存的試樣進行本發(fā)明的方法。如，作為含細胞的試樣，既可以使用剛攝取或調制后不久的試樣，也可以用冷凍保存的試樣。血液的情況，無論使用新鮮血還是冷凍保存的血，都可以捕獲及檢測核酸。
根據本發(fā)明的其他的形態(tài)，對于由無紡布構成的過濾器，用低濃度(0.1mM左右)氯化鎂的1N氫氧化鈉溶液事先在無紡布通過之后，若將用氫氧化鈉處理的、含蛋白質的核酸試樣在該無紡布上通過，則核酸對于無紡布的捕獲率戲劇性地回復。另一方面，即使用相同濃度的氯化鎂水溶液事先在無紡布通過，核酸的捕獲率也不恢復。即，這表示若使鎂吸附到無紡布上，需要堿性條件。
通常，PET無紡布在高pH條件下易被水解，在水解后的PET表面上羧基、氫氧基等的存在比例增加。2價金屬離子被推定為在PET無紡布上配位于具有如此螯合性能的官能團并固定于無紡布上的，因此在本發(fā)明中，在固相上固定的2價金屬離子擔當著捕獲試樣液相中的核酸的主要作用。如，用0.125N的氫氧化鈉溶液水解由無紡布構成的過濾器之后，若使調制為pH12以上的、含有蛋白質的核酸試樣通過浸漬于鎂、鋅、錳等的2價金屬化合物水溶液中、在過濾器上固定這些2價金屬離子的無紡布，則核酸在無紡布的捕獲率戲劇性地提高。還有在其他的形態(tài)中，即使在無紡布上涂布含有大量具有螯合性能的羧基的聚-L-谷氨酸，使含有2價金屬離子的水溶液通過，也可以制作將2價金屬離子固定化的過濾器。此外，通過調制將該過濾器層疊2張至4張的多層化過濾器，固定于固相基材上的2價金屬離子的量增大，可以成比例地提高核酸的捕獲效率。
另一方面，即使采用將2價金屬離子固定化的無紡布，在蛋白質共存下，對于未進行堿性處理的試樣，不能在無紡布上有效捕獲核酸。這表示，固定于固相基材上的2價金屬離子欲與液相中的核酸結合，則需要核酸在堿性條件下變性。從這些事情顯示，2價金屬離子和核酸在高pH條件下結合力非常高。
在本發(fā)明的方法中，其特征在于，使調高pH、堿性變性的核酸接觸將2價金屬離子固定化的無紡布等的固相基材，通過該手段，即使在含有蛋白質的試樣中也可以實現(xiàn)非常高的捕獲效率。再有，顯示若將在堿性條件下變性的核酸在無紡布上通過，對在無紡布捕獲的核酸進行LAMP擴增反應，則將2價金屬離子固定化的無紡布與未固定化的無紡布相比，核酸的擴增反應時間大幅縮短，成為擴增模板的核酸則有效地被無紡布捕獲。此外，捕獲核酸后，通過用中性條件的緩沖液清洗過濾器，可以下調過濾器附近的pH，向各種酶反應提供捕獲的核酸。
此外，作為以無紡布為代表的固相基材，將過濾器類浸漬于核酸的擴增反應溶液中進行擴增反應時，存在如下情況通過核酸的擴增酶等吸附到過濾器上，反應效率以一定的比例降低。在捕獲核酸的過濾器上事先涂布酶吸附抑制劑，可以抑制因核酸擴增酶等吸附到過濾器上而生成的反應效率的降低。作為酶吸附抑制劑可以舉例如牛血清白蛋白等。
實施例以下，根據實施例進一步具體說明本發(fā)明。只是，這些實施例僅用于說明，而非限制本發(fā)明的技術的范圍。
例1無紡布上DNA的LAMP擴增反應時間的比較(鎂吸附條件)剪下直徑5mm的圓盤狀的無紡布，切斷2個yellow tip(QSP Pipet tip yellow 1～200μL)，在其中夾入無紡布，制作在前端將無紡布固定化的柱。作為無紡布，使用旭化成株式會社的產品A040C01(以下稱“無紡布固定化柱”)。柱的結構示于圖1。試樣為20pg淋菌來源精制基因組DNA(ATCC700825)，溶解于1mL生理鹽水或0.3％BSA(SIGMA-A2153)生理鹽水溶液中。堿性處理為，在該試樣中添加150μl 8N NaOH，最終濃度為1N。在無紡布固定化柱上連接10ml的泰爾茂注射器，將各試樣全部吸取。對于圖2中，(3)及(4)的實驗，在吸取試樣之前分別將0.1mM氯化鎂(WAKO)的1N NaOH溶液或水溶液各1ml通過無紡布固定化柱。吸取試樣之后，再吸取1mlTBS緩沖液(10mlTris-HClpH8.0、150mMNaCl)進行清洗。
LAMP反應進行如下所謂用于LAMP反應的內側引物表示FIP引物和BIP引物。FIP引物是在5’側具有與目的核酸序列的外鏈相同的、稱為F1c的序列及在3’側具有與目的核酸序列的內鏈互補的、稱為F2的序列的寡核苷酸，BIP引物是在5’側具有與目的核酸序列的內鏈相同的、稱為B1c的序列，及在3’側具有與目的核酸序列的外鏈互補的、稱為B2的序列的寡核苷酸。所謂外側引物是表示F3引物和B3引物，F(xiàn)3引物是與目的核酸序列的內鏈互補的寡核苷酸，B3引物是與目的核酸的外鏈互補的寡核苷酸。環(huán)狀引物表示FL引物和BL引物，促進根據LAMP反應的核酸的擴增反應。FL引物是具有，與F2c序列和F1c序列之間的序列互補的序列的寡核苷酸，其中，F(xiàn)2c序列是與F2序列互補的序列，BL引物是具有，與B2c序列與B1c序列之間的序列互補的序列的寡核苷酸，其中，B2c序列是與B2序列互補。這些內側引物、外側引物及環(huán)狀引物的設計方法，公開于Web網站http//www.eiken.co.ip/中。作為擴增核酸的LAMP反應的目的序列，選擇淋菌的ORF1(Genebankaccession No.S86113)基因，設計LAMP反應的擴增寡核苷酸引物。設計序列編號1的FIP引物、序列編號2的BIP引物、序列編號3的F3引物、序列編號4的B3引物，序列編號5的F環(huán)狀引物、序列編號6的B環(huán)狀引物，委托日本bioservice公司進行化學合成。
在LAMP擴增的反應液中，各含有F3引物和B3引物2.5μM、FIP引物和BIP引物各20μM、FL引物和BL引物各30μM、1.4mM dNTPs、0.8M三甲銨基乙內鹽、20mMtris-HCl(pH8.8)、10mM KCl、10mM(NH4)2SO4、0.1％吐溫20、6.4單元的Bst DNA聚合酶大片段(New England Biolabs)，加入Mg SO4至濃度為8mM。將清洗之后的無紡布固定化柱設置為使無紡布部分在放入50μl上述LAMP擴增反應液的Loopamp反應試管(榮研化學)中，無紡布部分浸漬于反應液中。將無紡布固定化柱與放入有LAMP反應液的Loopamp反應試管在離心機(puchi-Hachi，トミ一工業(yè))中輕輕離心處理5秒之后，設置LoopAmp終點濁度計LA-200(TERAMECKS)，使在64℃反應1小時，同時測定濁度變化。在LAMP擴增反應中，以伴隨焦磷酸鎂的生成而產生的濁度(在650nm處的吸光度)成為0.1為止的時間為縱軸進行比較。
結果示于表2。由該表可知，在含有BSA的樣品中，在無紡布上的核酸的擴增時間延遲，即核酸的捕獲率很低。另一方面顯示，若事先吸取氯化鎂的NaOH溶液，則擴增時間與不含BSA的樣品一樣縮短，核酸的捕獲率很高。但是未在氯化鎂水溶液中見到該效果。在圖2中，(1)至(4)表示吸取到無紡布的試樣，每個試樣進行N＝3次吸取及測定的結果。
(1)淋菌精制基因組DNA20pg/生理鹽水/1N NaOH(2)淋菌精制基因組DNA20pg+0.3％BSA/生理鹽水/1N NaOH(3)吸取0.1mM MgCl2/1N NaOH之后，淋菌精制基因組DNA20pg+0.3％BSA/生理鹽水/1N NaOH(4)吸取0.1mM MgCl2/生理鹽水之后，淋菌精制基因組DNA+0.3％BSA/生理鹽水/1N NaOH例2核酸在鎂吸附無紡布上的捕獲效率室溫條件下，將無紡布(A040C01)在0.1％聚-L-谷氨酸(SIGMA，以下稱PLG)的水溶液中浸漬一晚，之后使之干燥進行涂布。將20ng/μl Cy3熒光標記(Mirus)的λDNA(TAKARA)溶解于1ml0.3％BSA生理鹽水溶液中。堿性處理為，在該試樣中添加75μl8N NaOH，最終成為0.5N NaOH溶液中。DNA的標記化，按照Mirus Label IT Cy3 LabelingKit所附協(xié)議進行。在固定無紡布的柱上連接10ml的泰爾茂注射器，將各試樣全部吸取。每個樣品各進行2次實驗。圖3中，對于(2)，在涂布有0.1％PLG的無紡布吸取試樣之前預先吸取好1ml 100mM MgCl2水溶液。吸取全部樣品后，分解柱，取出無紡布，從熒光測定用載玻片(MATSUNAMI)的內側使用隱形膠帶粘貼。將粘貼有無紡布的載玻片設置在微陣列掃描儀(GSI LUMONICS ScanArrayLite)上，進行熒光影像及熒光強度的測定。
結果示于圖3。從圖中可知使含BSA的試樣直接通過無紡布的，幾乎未觀測到在無紡布上的核酸捕獲，受共存的蛋白質的影響，DNA對無紡布上的捕獲效率顯著降低。另一方面，關于在涂布PLG的無紡布上吸附有鎂的不織布，即便在含有BSA的樣品中，核酸也能有效地被無紡布捕獲到。圖3中的數(shù)字表示熒光強度，(1)及(2)表示無紡布的種類，每種點樣2次(N＝2)。
例3無紡布上DNA的LAMP擴增反應時間的比較(聚合物涂層無紡布和多層化過濾器的效果)作為試樣，采用將20pg淋菌來源的精制基因組DNA(ATCC700825)溶解于1ml生理鹽水或0.3％BSA(SIGMA-A2153)生理鹽水溶液的試樣。在無紡布涂布PLG聚合物同例2。將涂布PLG的無紡布層疊2張或4張，如例1的圖1那樣夾入yellow-tip中，制作了多層化過濾器。對于正控制以外的試樣，如同例2，在吸取試樣之前事先吸取好1ml100mM MgCl2水溶液。無紡布固定化柱上連接10ml的泰爾茂注射器，將各試樣全部吸取。LAMP擴增反應液的調制及無紡布固定化柱的擴增反應的濁度測定全部同例1。
結果示于圖4?？v軸為在LAMP擴增反應中伴隨焦磷酸鎂生成的濁度(650nm處的吸光度)成為0.1為止的時間。在接觸鎂溶液的無紡布之中，涂布PLG的無紡布的核酸捕獲效率增高，啟示羧基對鎂的吸附有用。此外，已表明通過將過濾器多層化，核酸的捕獲率增高。圖4中的數(shù)字表示熒光強度，對(1)至(5)每個進行N＝3次的吸取及測定。
(1)無紡布(1張.未處理)、淋菌精制基因組DNA20pg/生理鹽水/1N NaOH[正控制](2)無紡布(1張.未處理)、吸取100mM MgCl2水溶液后，淋菌精制基因組DNA20pg+0.3％BSA/生理鹽水/1N NaOH(3)無紡布(1張.涂布0.1％聚-L-谷氨酸)、吸取100mM MgCl2水溶液后，淋菌精制基因組DNA20pg+0.3％BSA/生理鹽水/1N NaOH(4)無紡布(2張.涂布0.1％聚-L-谷氨酸)、吸取100mM MgCl2水溶液后，淋菌精制基因組DNA20pg+0.3％BSA/生理鹽水/1N NaOH(5)無紡布(4張.涂布0.1％聚-L-谷氨酸)、吸取100mM MgCl2水溶液后，淋菌精制基因組DNA20pg+0.3％BSA/生理鹽水/1N NaOH例4鎂吸附無紡布上的核酸擴增效率(試樣有無堿性處理的影響)試樣為，20pg淋菌來源精制DNA(ATCC700825)溶解于1mL0.3％BSA(SIGMA-A2153)生理鹽水溶液中。堿性處理時，在該試樣中添加150μ18N NaOH，使最終濃度為1N。對于同例2一樣涂布PLG的無紡布，在吸取試樣之前預先吸取好100mM MgCl2水溶液。在無紡布固定化柱上連接10ml的泰爾茂注射器，將各試樣全部吸取。LAMP擴增反應液的調制及無紡布固定化柱的擴增反應的濁度測定全部同例1。
結果示于圖5。縱軸為在LAMP擴增反應中伴隨焦磷酸鎂生成的濁度(650nm處的吸光度)成為0.1為止的時間。顯示，在吸附鎂的PLG涂布無紡布上，欲從含有蛋白質的試樣中捕獲核酸需要將試樣進行堿性處理。圖5中，左側白色柱表示生理鹽水，右側著色柱表示1N NaOH的結果。每個條件進行N＝3次的吸取及測定。
例5在含有蛋白質試樣中的無紡布的核酸捕獲效率剪下直徑5mm的圓盤狀無紡布，切斷2個yellow tip(QSP Pipet tip yellow 1.200μl)，在其中夾入無紡布，制作在前端將無紡布固定的柱。作為無紡布，使用旭化成株式會社的產品A040C01(以下稱“無紡布固定化柱”)。柱的結構示于圖1。將4μl(40ng)10ng/μl Cy3熒光標記(Mirus)的λDNA(TAKARA)溶解于1ml生理鹽水或0.3％BSA生理鹽水溶液中。負控制時添加4μl純水。DNA的標記化，按照Mirus Label IT Cy3 Labeling Kit所附協(xié)議進行。將無紡布固定化的柱上連接10ml的泰爾茂注射器，將各試樣全部吸取。每份樣品各進行2次實驗。吸取后，將柱分解，取出無紡布，從熒光測定用載玻片(MATSUNAMI)的內側使用隱形膠帶粘貼。粘貼無紡布的載玻片設置在微陣列掃描儀上(GSI LUMONICSScanArrayLite)，進行熒光影像及熒光強度的測定。
結果示于圖6。由該圖可知，在含有0.3％的牛血清白蛋白((SIGMA-A2153)以下稱BSA)的試樣中，與不含的試樣相比，熒光強度明顯降低。即DNA對無紡布上的捕獲效率由于共存的蛋白質的影響而顯著降低。圖中顯示(1)λDNA+0.3％BSA/生理鹽水(2)生理鹽水[負控制](3)λDNA/生理鹽水[正控制]。
例6鎂/NaOH處理試樣中無紡布的核酸捕獲效率將4μl在例1中使用的10ng/μl Cy3熒光標記的λDNA溶解于1ml生理鹽水或0.3％BSA生理鹽水溶液中。添加鎂時，對1ml該試樣添加1μl的100mM氯化鎂(WAKO)，使最終濃度為0.1mM。之后，該試樣中添加75μl 8N NaOH，使之最終成為0.5N NaOH溶液。與例1一樣，在無紡布固定化柱上吸取各試樣，在載玻片上粘貼無紡布之后，與例1一樣測定熒光影像。各試樣進行2次實驗。
結果示于圖7。即使在NaOH處理過的溶液中，含有0.3％BSA的試樣中DNA在無紡布上的捕獲效率也降低。但是即使在含有BSA的試樣中，在添加0.1mM的氯化鎂的試樣中也觀測到與不含有BSA的試樣同樣的捕獲率。圖中顯示(1)λDNA+0.3％BSA+0.1mM MgCl2/生理鹽水/0.5N NaOH(2)λDNA+0.3％BSA/生理鹽水/0.5N NaOH(3)生理鹽水/0.5N NaOH[負控制]
(4)λDNA/生理鹽水/0.5N NaOH[正控制]。
例7鎂/NaOH處理試樣中無紡布捕獲核酸的擴增效率將20pg淋菌來源的精制DNA(ATCC700825)溶解于1mL生理鹽水或0.3％BSA(SIGMA-A2153)生理鹽水溶液中。添加鎂時，對1ml該試樣添加1μl的100mM氯化鎂，使最終濃度為0.1mM。堿處理為，該試樣中添加150μl 8N NaOH，使最終濃度成為1N。將這些含有DNA的試樣全部用無紡布固定化柱吸取，進而吸取1mlTBS緩沖液(10mM、Tris-HCl pH8.0、150mM NaCl)進行清洗。
LAMP反應進行如下所謂用于LAMP反應的內側引物是表示FIP引物和BIP引物。FIP引物是在5’側具有與目的核酸序列的外鏈相同的、稱為F1c的序列、及在3’側具有與目的核酸序列的內鏈互補的、稱為F2的序列的寡核苷酸，BIP引物是在5’側具有與目的核酸序列的內鏈相同的、稱為B1c的序列、及在3’側具有與目的核酸序列的外鏈互補的、稱為B2的序列寡核苷酸。所謂外側引物表示F3引物和B3引物，F(xiàn)3引物是與目的核酸序列的內鏈互補的寡核苷酸，B3引物是與目的核酸的外鏈互補的寡核苷酸。環(huán)狀引物表示FL引物和BL引物，促進由LAMP反應引起的核酸擴增反應。FL引物是具有，與F2c序列和F1c序列之間的序列互補的序列的寡核苷酸，其中，F(xiàn)2c序列與F2序列互補，BL引物是具有，與B2c序列與B1c序列之間的序列互補的序列的寡核苷酸，其中，B2c序列與B2序列互補。這些內側引物、外側引物及環(huán)狀引物的設計方法，公開于Web網站http//www.eiken.co.jp/中。作為擴增核酸的LAMP反應的目的序列，選擇淋菌的ORF1(Genebankaccession No.S86113)基因，設計LAMP反應的擴增寡核苷酸引物。設計序列編號1的FIP引物、序列編號2的BIP引物、序列編號3的F3引物、序列編號4的B3引物，序列編號5的Floop引物、序列編號6的Bloop引物，委托日本bioservice公司進行化學合成。
在LAMP擴增的反應液中含有F3引物和B3引物各2.5μM、FIP引物和BIP引物各20μM、FL引物和BL引物各30μM、1.4mM dNTPs、0.8M三甲銨基乙內鹽、20mMtris-HCl(pH8.8)、10mM KCl、10mM(NH4)2SO4、0.1％Tween 20、6.4單元的Bst DNA聚合酶大片段(New England Biolabs)，加入MgSO4至濃度為8mM。將清洗之后的無紡布固定化柱設置為在放入50μl上述LAMP擴增反應液的Loopamp反應試管(榮研化學)中，使無紡布部分浸于反應液中。將無紡布固定化柱與放入有LAMP反應液的Loopamp反應試管在離心機(puchi-Hachi，トミ一工業(yè))中輕輕離心處理5秒之后，設置LoopAmp終點濁度計LA-200(テラメツケス)，64℃反應1小時，測定濁度變化。在LAMP擴增反應中，以伴隨焦磷酸鎂的生成的濁度(在650nm處的吸光度)成為0.1為止的時間為縱軸進行比較。
結果示于圖8。由該圖可知，含BSA的試樣中無紡布上的核酸擴增時間緩慢，即核酸的捕獲率低，但是添加鎂的體系中，擴增時間與不含BSA的試樣一樣短，核酸的捕獲效率很高。圖中，顯示每個試樣進行N＝3次吸取及測定的結果，顯示(1)淋菌精制基因組DNA/生理鹽水/1N NaOH(2)淋菌精制基因組DNA+0.3％BSA/生理鹽水/1N NaOH(3)淋菌精制基因組DNA+0.3％BSA+0.1mM MgCl2/生理鹽水/1N NaOH。
例8在無紡布上捕獲核酸的擴增效率中鎂濃度的影響20pg淋菌來源精制DNA(ATCC700825)溶解于1mL0.3％BSA(SIGMA-A2153)生理鹽水溶液中。該試樣中添加10μl(最終濃度約10mM)、5μl(同5mM)1M MgCl2、和10μl(同1mM)、5μl(同0.5mM)、1μl(同0.1mM)100mM MgCl2、。堿性處理為，在該試樣中添加150μl 8N NaOH，使最終濃度為1N。將這些含有DNA的試樣全部用無紡布固定化柱吸取，進而吸取1mlTBS緩沖液(10mM、Tris-HClpH8.0、150mM NaCl)進行清洗。LAMP擴增反應液的調制及無紡布固定化柱的擴增反應的濁度測定同例7。結果示于圖9。該圖顯示，添加濃度1mM為止的鎂，即使在BSA共存下也可以得到很高的核酸捕獲率。
例9在無紡布上捕獲核酸的擴增效率中pH的影響20pg淋菌來源的精制DNA(ATCC700825)溶解于500μl 0.6％BSA生理鹽水溶液中。然后，各添加1M的緩沖液(Tris-HClpH7.0、8.0、9.0、碳酸緩沖液pH10.0、11.0)或1N NaOH，作為1ml試樣。將這些含有DNA的試樣，全部用無紡布固定化柱吸取，進而吸取1mlTBS緩沖液(10mM、Tris-HClpH8.0、150mMNaCl)進行清洗。LAMP擴增反應液的調制及無紡布固定化柱的擴增反應的濁度測定同例7。結果示于圖10。圖中的結果顯示每個試樣進行N＝3次吸取及測定的結果?？v軸為在LAMP擴增反應中以伴隨焦磷酸鎂的生成的濁度(在650nm處的吸光度)成為0.1為止的時間。在pH14左右，即強堿處理的試樣中清楚地顯示出鎂的添加效果。
例10在堿性凝膠電泳中的鎂添加效果將瓊脂糖(GibcoBRL Ultra Pure)溶解于0.05N NaOH中，調制0.5％瓊脂糖凝膠。在3μl(300ng)100ng/μlλDNA中添加BSA時，加入3μlBSA，添加MgCl2時添加1μl10mMMgCl2，最后對全部的試樣加入1μl 0.5N NaOH，分別用純水補足體積至10μl。每10μl試樣加入2μl的4×上樣緩沖液(52％蔗糖、0.1％溴甲酚綠、0.168％二甲苯苯胺、200mM NaOH)，將樣品的全部量都加載于各樣品的上樣列中。作為電泳緩沖液，將凝膠浸漬于0.05N NaOH中進行50V、3小時電泳之后，浸漬于中和緩沖液(1M、Tris-HClpH8.0、1.5M NaCl)30分鐘，進行中和。用溶解于中和緩沖液的菲啶溴紅進行30分染色，用Bioimage GelPrint2000i/VGA攝影。結果在圖11顯示。在核酸與鎂離子共存的試樣中，除了加EDTA時之外，泳動度顯著降低。由此啟示在堿性條件下，由于核酸與鎂共存，產生核酸的締合，核酸的外觀尺寸增大、及在EDTA的存在下不產生締合。
例11在堿性凝膠電泳中鎂添加濃度的影響使用的瓊脂糖凝膠及電泳緩沖液同例10。加入3μl 100ng/μl(300ng)λDNA、分別加入1、2、3、4、5μl 1mM MgCl2水溶液，分別用純水補足體積至10μl。每10μl試樣中加入2μl的4×上樣緩沖液(52％蔗糖、0.1％溴甲酚綠、0.168％二甲苯苯胺、200mM NaOH)，將樣品的全部量都加載于各樣品的上樣列中。作為電泳緩沖液，將凝膠浸漬于0.05N NaOH中進行50V、3小時電泳之后，浸漬于中和緩沖液(1M、Tris-HClpH8.0、1.5M NaCl)30分進行中和。用溶解于中和緩沖液的菲啶溴紅進行30分染色，用Bioimage Gel Print2000i/VGA攝影。結果示于圖12。圖中顯示隨著共存的鎂離子濃度的上升，具有能夠泳動的大小尺寸的核酸減少，泳動度低的、大的核酸成分增大。
例12在pH8條件下的凝膠泳動中的鎂添加效果將瓊脂糖(GibcoBRL Ultra Pure)溶解于40mM Tris-醋酸緩沖液中，配制0.5％瓊脂糖凝膠。在3μl 100ng/μl λDNA(300ng)中，添加BSA時加入3μlBSA，添加MgCl2時添加1μl10mM MgCl2，分別用純水補足體積至10μl。每10μl試樣加入2μl的4×上樣緩沖液(52％蔗糖、0.1％溴甲酚綠、0.168％二甲苯苯胺、200mM NaOH)，將樣品的全部量都加載于各樣品的上樣列中。將凝膠浸漬于40mM Tris-醋酸緩沖液中進行50V、30分電泳之后，用菲啶溴紅進行染色，用Bioimage Gel Print2000i/VGA攝影。結果示于圖13。在中性條件下沒有觀察到由于核酸與鎂離子的相互作用而引起的泳動度降低，顯示這是在堿性條件下特有的現(xiàn)象。
例13在無紡布上捕獲核酸的擴增效率中各種2價金屬離子固定化無紡布的比較將剪成3×3cm片狀的無紡布浸漬于0.25N NaOH與乙腈1∶1的混合液構成的5ml水解處理液中，60℃振搖培養(yǎng)1小時。之后，浸漬于純水中，重復2次振搖清洗10分鐘。在10mM的2價金屬氯化物(氯化鋅、氯化鎂、氯化錳)的水溶液中浸漬水解處理的無紡布，室溫中放置一晚之后，浸漬于純水中，重復2次振搖清洗10分鐘，之后在室溫中使之干燥一晚，制作將各種2價金屬離子固定化的無紡布。試樣為，將20pg BCG來源的精制DNA溶解于1mL生理鹽水或0.3％人血清白蛋白(以下稱HAS)(SIGMA)生理鹽水溶液中。在該樣品中添加30μl 8N NaOH，使最終濃度為0.2N。將這些含有DNA的試樣用各種無紡布全部吸取之后，吸取1mlTBS緩沖液進行清洗。關于清洗后的無紡布固定化柱的LAMP擴增，除引物設置(primer set)之外，LAMP擴增反應液的調制及無紡布固定化柱的擴增反應同例7。對于引物設置，作為擴增核酸的LAMP擴增反應的目的序列，選擇結核菌群的16S Ribosomal RNA基因的序列(genebank accession No.NC_000962、X58890、X55588、AF480605)基因，設計LAMP反應的擴增寡核苷酸引物。設計序列編號7的FIP引物、序列編號8的BIP引物、序列編號9的F3引物、序列編號1的B3引物、序列編號11的Floop引物、序列編號12的Bloop引物，委托日本bioservice進行化學合成。
結果示于圖14。該圖顯示除鎂固定化的無紡布以外，在錳固定化的無紡布上，含蛋白質試樣中的核酸的捕獲率也很高。圖中(1)至(5)表示在使用的無紡布上固定化的金屬離子種類、吸取的樣品的順序，對各試樣進行N＝3次吸取及測定的結果。顯示，(1)未固定化、淋菌精制基因組DNA 20pg/生理鹽水/0.2N NaOH[試樣-1](2)未固定化、淋菌精制基因組DNA 20pg+0.3％HSA/生理鹽水/0.2N NaOH[試樣-2](3)鋅、試樣-2(4)鎂、試樣-2(5)錳、試樣-2。
例14在無紡布上捕獲的核酸的PCR擴增反應試樣為，將200pgBCG菌來源的精制基因組DNA溶解于1mL生理鹽水或0.3％HSA(SIGMA)生理鹽水溶液中。在該樣品中添加30μl 8N NaOH，使最終濃度為0.2N。將這些含有DNA的試樣用各種無紡布全部吸取之后，吸取1mlTBS緩沖液進行清洗。鎂固定化的無紡布的制作方法同例13。關于PCR的引物，選擇結核菌群的16S Ribosomal RNA基因的序列，將擴增產物的尺寸設計為1kbp的序列編號13、14，委托日本bioservice化學合成。將清洗后的無紡布固定化柱浸漬于由0.2mM dNTPs、上述引物各0.5μM、3％吐溫20及EX Taq Hot Start Version(TAKARA)試劑盒附帶的緩沖液、EX Taq聚合酶1.25單位構成的50μl的PCR反應液中。在DNA熱循環(huán)儀(珀金埃爾默Perkin Elmer)中，使其在95℃反應5分，循環(huán)1次；95℃20秒、55℃20秒、72℃20秒，循環(huán)30次；72℃7分。各個PCR反應結束之后，在各反應液9μl中加入1μl 10×上樣緩沖液，混合，將全部的量加載在1％瓊脂糖中進行電泳。進行100V、30分電泳之后，用菲啶溴紅進行30分染色，用BioimageGel Print2000i/VGA攝影。
結果示于圖15。雖然在吸取了含有HAS的試樣的無紡布中，可以在鎂固定化的不織布中確認PCR的擴增產物的光帶，但是在未將鎂固定化的無紡布中未能確認擴增產物，啟示在成為模板的試樣中的核酸未被無紡布捕獲。由此可知，通過鎂固定化的無紡布可以捕獲含蛋白質試樣中的核酸，且被該無紡布捕獲的核酸也能夠適用于PCR的擴增反應。
例15EDTA及2價金屬離子共存試樣中無紡布上捕獲核酸的擴增效率試樣為，將20pg BCG菌來源的精制基因組DNA溶解于1mL生理鹽水或0.3％HSA(SIGMA)生理鹽水溶液中。需要加入EDTA時，在該樣品中添加1mM EDTA，需要加入氯化鍶時添加10mM氯化鍶、需要加入氯化鎂時添加0.1mM氯化鎂，在各樣品中分別添加30μl 8N NaOH，使最終濃度為0.2N。LAMP擴增反應液的調制及無紡布固定化柱的擴增反應同例13。
結果示于圖1。該圖顯示，由EDTA引起的對鎂與核酸的締合體形成的阻礙被鍶的添加所抑制，即使在如EDTA那樣的螯合劑成分的存在下，也可以捕獲含蛋白質的試樣中的核酸。圖中(1)至(5)表示吸取到無紡布上的試樣，縱軸表示濁度成為0.1為止的經過時間。
各試樣每個進行N＝3次吸取、測定。
(1)BCG菌精制基因組DNA20pg/生理鹽水/1N NaOH[正控制、試樣-1](2)BCG菌精制基因組DNA20pg+0.3％HSA/生理鹽水/0.2N NaOH[試樣-2](3)試樣-2+0.1mM MgCl2(4)試樣-2+1mM EDTA+0.1mM MgCl2(5)試樣-2+1mM EDTA+10mM SrCl2+0.1mM MgCl2。
例16尿試樣中無紡布上捕獲核酸的擴增效率將淋菌(ATCC700825)在巧克力瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)2天，將回收的菌的懸濁液用生理鹽水稀釋為100萬倍。在500μl生理鹽水或健康人的尿中分別添加10μl稀釋的菌液。在該樣品中添加75μl 8N NaOH，使最終濃度為1N。與例2同樣，準備未處理的無紡布及使鎂通過的涂布有PLG的鎂固定化無紡布2種，將該試樣全部吸取到各自的無紡布之后，吸取1mlTBS緩沖液清洗。LAMP擴增反應液的調制及無紡布固定化柱的擴增反應同例7。
結果示于圖17。該圖顯示，與未處理的無紡布柱相比，在涂布PLG的無紡布上固定鎂的柱，其在無紡布上捕獲核酸的擴增時間明顯地縮短，尿試樣中的核酸的捕獲效率高。
例17在使用了含BSA清洗液的無紡布上捕獲核酸的擴增效率試樣為，將20pgBCG菌來源的精制基因組DNA溶解于1mL 0.3％HSA(SIGMA)生理鹽水溶液中。在該樣品中添加30μl 8NNaOH，使最終濃度為0.2N。同例13制作鎂固定化的無紡布，吸取全部上述試樣之后，吸取1ml0％、0.3％、1％的BSA的TBS緩沖液清洗。對清洗后的無紡布固定化柱，同例13進行LAMP擴增反應。
結果示于圖18。清洗液中越含BSA，LAMP擴增反應時間就越縮短，從中啟示通過用BSA涂布捕獲了核酸的無紡布，核酸的擴增反應加快。
例20在添加了金屬離子親和性高分子的試樣中無紡布上的核酸擴增效率試樣為，將100pg淋菌來源的精制基因組DNA溶解于250μl生理鹽水或7％HSA(SIGMA)生理鹽水溶液中。需要添加氯化鎂時，在該樣品中添加0.5mM氯化鎂。在該樣品中添加金屬離子親和性高分子時，在該樣品中添加50μl分子量8000的聚乙二醇(以下PEG)(SIGMA)20％水溶液。該各樣品中添加7.5μl 8N NaOH，使最終濃度為0.2N。在無紡布固定化柱吸取上述試樣的全部之后，用1ml TBS緩沖液清洗。LAMP擴增反應液的調制及無紡布固定化柱的擴增反應同例7。
結果示于圖19。在7％的高濃度蛋白質中，只添加鎂，核酸的捕獲率并不高，LAMP擴增反應時間長。通過使鎂與金屬離子親和性高分子共存，LAMP擴增反應時間縮短，核酸的捕獲率增高。由此可知，金屬離子親和性高分子促進鎂離子與核酸之間締合體形成作用。
圖中(1)至(4)表示吸取的試樣，對各試樣各進行N＝3次吸取、測定。
(1)淋菌精制基因組DNA/生理鹽水/0.2N NaOH[正控制、試樣-1](2)淋菌精制基因組DNA+7％HSA/生理鹽水/0.2N NaOH[試樣-2](3)試樣-2+0.5mM MgCl2(4)試樣-2+3.3％PEG(8K)+0.5mM MgCl2產業(yè)上的利用可能性根據本發(fā)明，可以從含有核酸的試樣中比已有的方法更簡便且高收率地捕獲、回收核酸。另外，本發(fā)明的方法，可作為能夠用于已有的核酸擴增技術、迅速且簡便的核酸調制法加以利用。
序列表<110>Asahi Kasei Kabushiki Kaisha<120>Method for trapping nucleic acid<130>A51436M<160>14<210>1<211>40<212>DNA<213>Artificial Sequence<400>1cgcccaaaca gtttcacaac ctattttcag gatgtggcgg40<210>2<211>38<212>DNA<213>Artificial Sequence<400>2cgatttctcc cattgggctc cttctacgat gacatcgc38<210>3<211>23<212>DNA<213>Artificial Sequence<400>3cttaattctt ctagtaacaa acc23<210>4<211>21<212>DNA<213>Artificial Sequence<400>4gggaatagtt ggatcattcg g21<210>5<211>18<212>DNA<213>Artificial Sequence<400>5ccagcttgat gaaagccc18<210>6<211>18<212>DNA<213>Artificial Sequence<400>6ggcttgcgaa agtttccg18<210>7<211>39<212>DNA<213>Artificial Sequence<400>7
cacccacgtg ttactcatgc aagtcgaacg gaaaggtct39<210>8<211>36<212>DNA<213>Artificial Sequence<400>8tcgggataag cctggaccac aagacatgca tcccgt 36<210>9<211>17<212>DNA<213>Artificial Sequence<400>9ctggctcagg acgaacg17<210>10<211>16<212>DNA<213>Artificial Sequence<400>10gctcatccca caccgc 16<210>11<211>22<212>DNA<213>Artificial Sequence<400>11gttcgccact cgagtatctc cg 22<210>12<211>20<212>DNA<213>Artificial Sequence<400>12gaaactgggt ctaataccgg 20<210>13<211>22<212>DNA<213>Artificial Sequence<400>13ccatgctctt gatgccccgt tg 22<210>14<211>22<212>DNA<213>Artificial Sequence<400>14tttagccttg cggccgtact cc 2權利要求
1.一種將試樣中的核酸捕獲到固相基材表面上的方法，其包括將該試樣調整到pH12以上的工序和下述某一項工序使固定化在固相基材表面上的至少1種2價金屬離子與該試樣中的核酸結合，捕獲核酸的工序，或使至少1種2價金屬離子與該試樣中的核酸結合之后，使該核酸接觸固相基材表面而捕獲的工序。
2.一種檢測試樣中的核酸的方法，其包括將試樣調整到pH12以上的工序和下述某一項工序將該試樣調整到pH12以上的工序和下述某一項工序使固定化在固相基材表面上的至少1種2價金屬離子與該試樣中的核酸結合，捕獲核酸的工序，或使至少1種2價金屬離子與該試樣中的核酸結合之后，使該核酸接觸固相基材表面而捕獲的工序；而且還包括以該被捕獲的核酸為模板使特定堿基序列的核酸擴增，并對其進行檢測的工序。
3.如權利要求1或2所述的方法，其所述至少1種2價金屬離子為鎂離子。
4.在pH12以上與至少1種2價金屬離子結合，在固相基材表面捕獲到的核酸。
5.如權利要求1所述的方法，其至少包括如下工序(a)在含有核酸的試樣中添加至少一種2價金屬化合物的工序；(b)將工序(a)中得到的試樣的pH調整為12以上，形成試樣中的核酸與至少1種2價金屬離子的締合體的工序；及(c)使工序(b)中得到的試樣接觸固相基材表面，在固相基材表面捕獲所述締合體的工序。
6.如權利要求1所述的方法，其至少包括如下工序(a)將含有核酸的試樣的pH調整為12以上的工序；(b)在工序(a)中得到的試樣中添加至少一種2價金屬化合物，形成試樣中的核酸與至少1種2價金屬離子的締合體的工序；(c)使工序(b)中得到的試樣接觸固相基材表面，在固相基材表面捕獲所述締合體的工序。
7.如權利要求2所述的方法，其至少包括如下工序(a)在含有核酸的試樣中添加至少一種2價金屬化合物的工序；(b)將工序(a)中得到的試樣的pH調整到12以上，形成試樣中的核酸與至少1種2價金屬離子的締合體的工序；(c)使工序(b)中得到的試樣接觸固相基材表面，在固相基材表面捕獲所述締合體的工序；(d)使含有適宜于擴增特定堿基序列的寡核苷酸探針、單核苷酸3磷酸及核酸合成酶的溶液與工序(c)中得到的固相基材表面接觸，以在該固相基材表面捕獲的核酸為模板擴增具有特定堿基序列的核酸的工序；及(e)對具有在工序(d)中擴增的特定堿基序列的核酸進行檢測的工序。
8.如權利要求2所述的方法，其至少包括如下工序(a)將含有核酸的試樣的pH調整為12以上的工序；(b)在工序(a)中得到的試樣中添加至少一種2價金屬化合物，形成試樣中的核酸與至少1種2價金屬離子的締合體的工序；(c)使工序(b)中得到的試樣接觸固相基材表面，在固相基材表面捕獲所述締合體的工序；(d)使含有適宜于擴增特定堿基序列的寡核苷酸探針、單核苷酸3磷酸及核酸合成酶的溶液與工序(c)中得到的固相基材表面接觸，以在該固相基材表面捕獲的核酸為模板擴增具有特定堿基序列的核酸的工序；及(e)對具有在工序(d)中擴增的特定堿基序列的核酸進行檢測的工序。
9.如權利要求5至8中任一項所述的方法，其通過過濾，在固相基材表面捕獲所述締合體。
10.如權利要求5至9中任一項所述的方法，其所述固相基材為過濾器。
11.如權利要求5至9中任一項所述的方法，其所述固相基材為由無紡布形成的過濾器。
12.如權利要求5至11中任一項所述的方法，其所述至少1種2價金屬為鎂。
13.如權利要求12所述的方法，其包括在含有核酸的試樣中添加pH12以上、溶解度為0.2mM以上的金屬離子的工序。
14.一種試劑套裝，用于捕獲試樣中的核酸，或用于捕獲及檢測試樣中的核酸，其包括選自以下各要素所構成的組中的至少2個要素用于從所述試樣中提取核酸的試劑；用于使所述試樣成為pH12以上的試劑；至少一種2價金屬化合物；固相基材；及可以擴增特定堿基序列的寡核苷酸探針、單核苷酸3磷酸及核酸合成酶。
15.在pH12以上通過與至少1種2價金屬離子結合而形成締合體，且在固相基材表面被捕獲到的核酸。
16.如權利要求1所述的方法，其至少包括如下工序(a)在含有核酸的試樣中添加至少1種2價金屬化合物及對該至少1種2價金屬離子具有親和性的高分子化合物的工序；(b)將工序(a)中得到的試樣的pH調整到12以上，形成試樣中的核酸與至少1種2價金屬離子及高分子化合物的締合體的工序；及(c)使工序(b)中得到的試樣接觸固相基材表面，在固相基材表面捕獲所述締合體的工序。
17.如權利要求1所述的方法，其至少包括如下工序(a)將含有核酸的試樣的pH調整為12以上的工序；(b)在工序(a)中得到的試樣中添加至少1種2價金屬化合物及對該至少1種2價金屬離子具有親和性的高分子化合物，形成試樣中的核酸與至少1種2價金屬離子及高分子化合物的締合體的工序；(c)使工序(b)中得到的試樣接觸固相基材表面，在固相基材表面捕獲所述締合體的工序。
18.如權利要求2所述的方法，其至少包括如下工序(a)在含有核酸的試樣中添加至少1種2價金屬化合物及對該至少1種2價金屬離子具有親和性的高分子化合物的工序；(b)將工序(a)中得到的試樣的pH調整到12以上，形成試樣中的核酸與至少1種2價金屬離子及高分子化合物的締合體的工序；(c)使工序(b)中得到的試樣接觸固相基材表面，在固相基材表面捕獲所述締合體的工序；(d)使含有適于擴增特定堿基序列的寡核苷酸探針、單核苷酸3磷酸及核酸合成酶的溶液與工序(c)中得到的固相基材表面接觸，以在該固相基材表面捕獲的核酸為模板，擴增具有特定堿基序列的核酸的工序；及(e)對具有在工序(d)中擴增的特定堿基序列的核酸進行檢測的工序。
19.如權利要求2所述的方法，其至少包括如下工序(a)將含有核酸的試樣的pH調整為12以上的工序；(b)在工序(a)中得到的試樣中添加至少1種2價金屬化合物及對至少1種2價金屬離子具有親和性的高分子化合物，形成試樣中的核酸與至少1種2價金屬離子及高分子化合物的締合體的工序；(c)使工序(b)中得到的試樣接觸固相基材表面，在固相基材表面捕獲所述締合體的工序；(d)使含有適于擴增特定堿基序列的寡核苷酸探針、單核苷酸3磷酸及核酸合成酶的溶液與工序(c)中得到的固相基材表面接觸，以在該固相基材表面捕獲的核酸為模板，擴增具有特定堿基序列的核酸的工序；及(e)對具有在工序(d)中擴增的特定堿基序列的核酸進行檢測的工序。
20.如權利要求16至19中任一項所述的方法，其通過過濾，在固相基材表面捕獲所述締合體。
21.如權利要求16至20中任一項所述的方法，其所述固相基材為過濾器。
22.如權利要求16至21中任一項所述的方法，其所述固相基材為由無紡布形成的過濾器。
23.如權利要求16至22中任一項所述的方法，其所述至少1種2價金屬為鎂。
24.如權利要求23所述的方法，其在含有核酸的試樣中添加pH12以上、溶解度為0.2mM以上的金屬離子。
25.一種試劑套裝，用于捕獲試樣中的核酸或用于捕獲及檢測試樣中的核酸，其包括選自以下各要素所構成的組中的至少2個要素用于從所述試樣中提取核酸的試劑；用于使該試樣成為pH12以上的試劑；至少一種2價金屬化合物；對至少一種2價金屬離子具有親和性的高分子化合物；固相基材；及可以擴增特定堿基序列的寡核苷酸探針、單核苷酸3磷酸及核酸合成酶。
26.在pH12以上通過與至少1種2價金屬離子及對該2價金屬離子具有親和性的高分子化合物結合而形成締合體，且在固相基材表面被捕獲到的核酸。
27.如權利要求1所述的方法，其至少包括如下工序(a)將至少一種2價金屬離子在固相基材表面上固定化的工序；(b)將含有核酸的試樣的pH調整為12以上的工序；及(c)使在工序(b)得到的試樣接觸在工序(a)中得到的固相基材表面，在固相基材表面捕獲核酸的工序。
28.如權利要求2所述的方法，其至少包括如下工序(a)將至少一種2價金屬離子在固相基材表面上固定化的工序；(b)將含有核酸的試樣的pH調整為12以上的工序；(c)使在工序(b)得到的試樣接觸在工序(a)中得到的固相基材表面，在固相基材表面捕獲核酸的工序。(d)使含有適于擴增特定堿基序列的寡核苷酸探針、單核苷酸3磷酸及核酸合成酶的溶液與工序(c)中得到的固相基材表面接觸，以在所述固相基材表面捕獲的核酸為模板擴增具有特定堿基序列的核酸的工序；及(e)對具有在工序(d)中擴增的特定堿基序列的核酸進行檢測的工序。
29.如權利要求27或28所述的方法，其通過過濾，在固相基材表面捕獲所述核酸。
30.如權利要求27至29中任一項所述的方法，其所述固相基材為過濾器。
31.如權利要求27至30中任一項所述的方法，其所述固相基材為由無紡布形成的過濾器。
32.如權利要求27至31中任一項所述的方法，其所述固相基材包含具有可以將至少一種2價金屬離子固定化的殘基的高分子化合物。
33.如權利要求32所述的方法，其所述可以將至少一種2價金屬離子固定化的殘基為羧基。
34.如權利要求27至33中任一項所述的方法，其所述固相基材將可以固定化至少1種2價金屬離子的固性基材層多層化。
35.如權利要求27至34中任一項所述的方法，其所述至少1種2價金屬離子為鎂離子。
36.如權利要求27至31中任一項所述的方法，其固相基材涂布了對至少1種2價金屬離子具有親和性的高分子化合物。
37.如權利要求35所述的方法，其在含有核酸的試樣中添加pH12以上、溶解度為0.2mM以上的金屬離子。
38.一種試劑套裝，用于捕獲試樣中的核酸或用于捕獲及檢測試樣中的核酸，其包括選自以下各要素所構成的組中的至少2個要素用于從該試樣中提取核酸的試劑；用于使該試樣成為pH12以上的試劑；至少一種2價金屬化合物；可以固定化至少一種2價金屬離子的固相基材；固定化了至少一種2價金屬離子的固相基材；可以擴增特定堿基序列的寡核苷酸探針、單核苷酸3磷酸及核酸合成酶。
39.在pH12以上通過與固定化于固相基材表面上的至少1種2價金屬離子結合，在固相基材表面捕獲到的核酸。
40.如權利要求2、7、8、18、19或28中任一項所述的方法，其所述固相基材涂布了酶吸附抑制劑。
41.如權利要求40所述的方法，其所述酶吸附抑制劑為牛血清白蛋白。
全文摘要
本發(fā)明提供將核酸捕獲到固相基材表面上的方法，所述方法為包括使含有核酸的pH12以上的試樣與固定2價金屬離子的固性基材表面接觸的工序的方法及在固相基材表面捕獲核酸的方法，包括以下工序將含有核酸及鎂化合物、pH調整為12以上的試樣接觸固相基材表面。
文檔編號C12N15/09GK101044248SQ20058003574
公開日2007年9月26日 申請日期2005年8月18日 優(yōu)先權日2004年8月20日
發(fā)明者深澤忠, 黑川洋 申請人:旭化成株式會社