專(zhuān)利名稱(chēng)：：通過(guò)rh核心蛋白聚糖-Fc融合蛋白抑制纖維發(fā)生的方法通過(guò)rh核心蛋白聚糖-Fc融合蛋白抑制纖維發(fā)生的方法發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及通過(guò)施用肝星形細(xì)胞活化和成纖維細(xì)胞活化的拮抗劑來(lái)抑制纖維發(fā)生(尤其是肝纖維發(fā)生)的方法。本發(fā)明還涉及制備融合蛋白構(gòu)建體和生產(chǎn)融合蛋白。
背景技術(shù)：
：關(guān)于肝纖維化，纖維化在結(jié)構(gòu)改造的最終共有途徑中起著性的作用，所述結(jié)構(gòu)改造減少了損傷后的正常器官功能。它是針對(duì)發(fā)育或炎癥疾病的最具根本破壞性和最不需要的應(yīng)答中的一種，而且在暴露于高氧壓后的數(shù)百萬(wàn)的處于許多不同疾病進(jìn)程的晚期階段的個(gè)體中被觀(guān)察到，所述疾病包玩者如囊性纖維化、間質(zhì)性腎炎、肝硬化和肺纖維化。肝纖維化的特征在于肝中的細(xì)卜基質(zhì)組分的過(guò)量沉積。如S丄.Friedman在題為"MolecularRegulationofHepaticFibrosis,anIntegratedCellularResponsetoTissueInjuiy，"JBiolChem2000;275:2247-2250的文章中所述，有幾種肝細(xì)胞類(lèi)型參與基i^沉積，主要類(lèi)型是如B.Tuchweber等在題為"ProliferationandPhenotypicModulationofPortalFibroblastsintheEarlyStagesofCholestaticFibrosisintheRat，"LabInvest1996;74:265-278的文章所述的肝星形細(xì)胞(HSC)和門(mén)成纖維細(xì)胞。在過(guò)去的10年間，已有大量注意力關(guān)注于造成肝中的纖維發(fā)生細(xì)胞活化的刺激物。如以上Friedman之文章i，，主要焦點(diǎn)是在生長(zhǎng)因子和氧化劑應(yīng)itt。纖維發(fā)生經(jīng)典地是由器官成纖維細(xì)胞介導(dǎo)的，所述細(xì)胞^ii足量的I和m型膠原蛋白。肝中纖維發(fā)生的表達(dá)已是以前幾年詳盡研究的主題。該過(guò)程的細(xì)胞因子調(diào)節(jié)是復(fù)雜的。一般認(rèn)為i和m型膠原蛋白是主要的纖維變性膠原蛋白，而且它們由肝星形細(xì)胞(HSC)和成纖維細(xì)胞良好地表達(dá)。這些膠原蛋白的表達(dá)由細(xì)胞因子復(fù)^調(diào)節(jié)。例如，腫瘤壞死因子P1CTGF(31)敘l」^a程中是早期而且關(guān)鍵的組分。一般認(rèn)為，在肺、肝和腎中TGF(31是針對(duì)這些膠原蛋白基因的調(diào)節(jié)分子。(Wahl，S.M.，1992J.Clin.Immunol.12:61-74;Sh羅a^K.和Ziyadeh,F.N.，1993SeminarsinNephrology13:116-128;Roberts等，1986Proc.Nat'lAcadSci,USA83:4167-4171。)最重要的肝纖維化硬化的成因是慢性乙型和丙型肝炎的感染和長(zhǎng)期酗酒。肝硬化是肝纖維化的臨床終點(diǎn)。直到目前，沒(méi)有可用的回OT硬化的有效方法，而那些受到威脅到生命的肝功能損傷的人只能指望肝移植5fe搶救?？墒?，每年新硬化病例的數(shù)目為可用于移植的肝的數(shù)目5至10倍。所以，防止纖維發(fā)生和早期治療纖維化是硬化的最佳療法(AchordJL.1991，ComprTher.17:57-64，Habib等，2001，PostgradMed.109:101-13)。抑制纖維發(fā)生的策略可以分成如下幾組(a)抗炎齊訴n抗氧化劑；(b)細(xì)胞因子或細(xì)胞因子受體的拮抗抓(c)M^細(xì)胞活化的抑制抓和(d)抗膠原蛋白劑p.MontgomeryBissell，2001，EXPERIMENTALandMOLECULARMEDICINE,Vol.33:179-190)。可是，這些試劑中的大部分在治療纖維化中并不是很有效或者有嚴(yán)重的副作用。因此需要開(kāi)發(fā)新的用于抑制肝纖維發(fā)生和治療肝纖維化的方法。其他背景有，如美國(guó)專(zhuān)利5,824,655所述，核心蛋白聚糖己被用于通過(guò)利用基因治療來(lái)限制TGF-P活性。另外，如美國(guó)專(zhuān)利6,436,900戶(hù)腿，核心蛋白聚糖已被用于治療病理學(xué)?？墒?，后一個(gè)專(zhuān)利沒(méi)有討論肝疾病的治療。核心蛋白聚糖是小的富含亮氨酸的多功能蛋白聚糖，而且它由核心蛋白和共價(jià)連接的糖胺聚組成。人的核心蛋白聚糖核心蛋白質(zhì)的大小和^f量是359個(gè)氨基酸；39746Da，豬的是360個(gè)tt酸。該分子的原始功能涉及原纖維形成。核心蛋白聚糖體內(nèi)結(jié)合I、n和IV型膠原蛋白并^S具有增加的穩(wěn)定性并改變了溶解度的纖維形成。(Krusius和Ruoslahti，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，83:7683-7687(1986);Day等，Biochem.J.，248:801-805(1987);Pearson等，J.Biol.Chem,，258:15101-15104(1983);Vogel等，Biochem,J.223:587-597(1984)。)有證據(jù)顯示，核心蛋白聚糖在細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)控中起著作用。在中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞中核心蛋白聚糖的表達(dá)已經(jīng)被證明會(huì)導(dǎo)致斷氐的生頓率、降低的飽和密度禾口改變的形態(tài)學(xué)(Yamaguichi和Ruoslahti.Nature336:244-246(1988))。核心蛋白聚糖的這些生長(zhǎng)抑制性質(zhì)包括(a)在靜止期核心蛋白聚糖的表達(dá)顯著地提高；(b)活躍增殖的或經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)鵬艮少親核心蛋白聚糖；(c)艦病毒轉(zhuǎn)化能消除核心蛋白聚達(dá)；和(d)在各種致瘤的細(xì)胞系和腫瘤組織中通過(guò)其控制區(qū)的甲基化而抑制核心蛋白聚糖的基因轉(zhuǎn)錄(Iozzd，等CritRev.Biochem.Mol.Biol.32:141-174(1997))。核心蛋白聚糖通過(guò)結(jié)合EGFR的離散的區(qū)域而抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，從而導(dǎo)致產(chǎn)生能抑制EGFR功能并活化EGF受#^MAP激,p21軸的蛋白質(zhì)模擬物。(Moscatello等J.ClinInvest.15;101(2):406-12.(1998);Santo等，JBiolChem20;277:35671-81(2002》核心蛋白聚糖也通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞介導(dǎo)的血管發(fā)生抑制腫瘤生長(zhǎng)(Grant等，Oncogene21:4765-77(2002》。據(jù)報(bào)道，核心蛋白聚糖通過(guò)干擾轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-卩(TGF-(3)~~纖維發(fā)生的主要刺激物的生物活ttt減少纖維發(fā)生。TGF-p不僅調(diào)節(jié)作為對(duì)組織損傷的正常應(yīng)答部分的細(xì)M卜基質(zhì)(ECM)積聚和沉積ECM，而且調(diào)節(jié)病理上的纖維化。TGF-P體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的改變對(duì)于多種組織的纖維化疾病是重要的(WellsRG.AmJPhysiolGas加intestLiverPhysiol.279:G845-50.(2000》。作為T(mén)GF畫(huà)卩抑制劑，核心蛋白聚Wl其蛋白質(zhì)部分特異結(jié)合并中和TGF-p配體以以劑量依賴(lài)的方式體外干擾TGF-p生物活性。在體內(nèi)，TGF-p的超表達(dá)導(dǎo)致顯著的肺纖維化，其可通過(guò)伴隨的核心蛋白聚糖超，而顯著降低(Yamaguchi等，Nature346:281-284，(1990);Kolb等，AmJPhysiolLungCellMolPhysiol.280:L1327-34(2001》。核心蛋白聚糖參與細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)。已發(fā)現(xiàn)，核心蛋白聚糖減少在膠原蛋白網(wǎng)格中培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞凋亡(Schonherr等，EurJCellBiol.78:44-55(1999))。核心蛋白聚糖在EC中作為信號(hào)傳導(dǎo)分子并M3！Akt1性和非,性途徑影響細(xì)胞的存活(Schonherr等，AnnNYAcadSci.973:149-52(2002》。在擴(kuò)大生物活性的努力中，F(xiàn)c融合蛋白已經(jīng)得到關(guān)注。已注意到，重組蛋白是正出現(xiàn)的一類(lèi)治療劑。一種這類(lèi)llt布是使用免疫球蛋白Fc區(qū)制備融合蛋白。抗體包含兩個(gè)功能獨(dú)立的部分，即被稱(chēng)作"Fab"的可變結(jié)構(gòu)域，其結(jié)合抗原，和被稱(chēng)作"Fc"的恒定結(jié)構(gòu)域，其提供了與諸如補(bǔ)體或吞噬細(xì)胞的效應(yīng)子功能的連接。免疫球蛋白的Fc部分具有長(zhǎng)的血漿半衰期，而Fab是短命的。(Capon，等.，Nature337:525-531(1989))Fc融合蛋白應(yīng)保持親本蛋白的生物活性并具有比其親本更長(zhǎng)的半衰期，這是因?yàn)镮gG能循環(huán)幾天(WO99/25044)。注意到，美國(guó)專(zhuān)利6,277,375提及突變的Fc片段來(lái)延長(zhǎng)生物半衰期，美國(guó)專(zhuān)利6,660,843也一樣?？墒?，這些專(zhuān)禾瞎殿有將Fc片，用于核心蛋白聚糖上。發(fā)明M研究對(duì)與TGFpi所i秀發(fā)的肝星形細(xì)胞活化和肝纖維化相關(guān)的纖維變性條件的拮抗作用，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)特定配制的核心蛋白聚糖融合蛋白通過(guò)更有效地抑帝岍纖維發(fā)魏提高肝纖維化的弱化。在該蛋白質(zhì)中，用肽接頭將{針布的Fc片段加到rh核心蛋白聚糖上。發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)能更有效地治療肝纖維化并具有延長(zhǎng)了50%的生物半衰期。更具體地，發(fā)測(cè)針布的核心蛋白聚糖拮抗齊鵬ihl干纖維化的發(fā)展，尤其在病毒性肝炎病程中，如慢性乙型肝炎和慢性丙型肝炎。在一個(gè)實(shí)施方案中，rh核心蛋白聚糖-Fc融合蛋白包含rh核心蛋白聚糖、肽接頭和f針布的人IgGFc片段或結(jié)構(gòu)i爽表示為IgGlFc)。也發(fā)現(xiàn)，,使用長(zhǎng)度為約20或更少的氨基酸的柔性肽接頭，而且柔性肽接頭含兩個(gè)或更多的選自甘氮酸、絲氨酸、丙氨酸和蘇氨酸的氨基酸。IgGFc變體具有非裂|#寺性，其帶有艦用10個(gè)新的氨基酸替代通常!柳的4個(gè)氨基酸而制成的斷布的Fc片段。因?yàn)閘頓了l針布的Fc片段和肽接頭，所以發(fā)現(xiàn)rh核心蛋白聚糖-Fc融合蛋白的生物學(xué)半衰期比單獨(dú)使用核心蛋白聚糖的長(zhǎng)50%。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，公開(kāi)了用于從諸如Cos-7細(xì)亂系的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系制備或生產(chǎn)主題重組融合蛋白的方法。如所觀(guān)察到的，rh核心蛋白聚糖-Fc融合蛋白特征在于并顯示出相對(duì)于rh核心蛋白聚糖增強(qiáng)的生物學(xué)活性并延長(zhǎng)了血清半衰期而無(wú)不希望的副作用，從而導(dǎo)致改善的藥物代謝動(dòng)力學(xué)和藥物動(dòng)力學(xué)。因此，只需要更低的齊暖和更少的注射就能獲得相似的功效?？傊景l(fā)明涉及通過(guò)直接施用重組的rh核心蛋白聚糖和rh核心蛋白聚糖-Fc融合蛋白來(lái)體外和/或體內(nèi)抑制肝纖維發(fā)生的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，在核心蛋白聚糖和Fc鉸鏈片段之間提供接頭以形成融合蛋白，所述融合蛋白增加了核心蛋白聚糖的生物學(xué)活性，并增加了結(jié)合TGF-(3的能力，并延長(zhǎng)了核心蛋白聚糖在血清中的壽命，其中Fc鉸鏈片段是斷布的Fc形式，其包括用IO個(gè)不同的氮基酸替代4個(gè)N-末端氨基酸，戶(hù)/M替徹每核心蛋白聚糖-Fc蛋白的絲延長(zhǎng)50%。附圖簡(jiǎn)述本發(fā)明的這些和其它特征將結(jié)合詳細(xì)說(shuō)明、結(jié)合附圖來(lái)更好地理解，其中圖1A和IB顯示了在用CCl.sub.4(四氯化碳)處理8周(蘇7^f和曙紅(HE)染色)后核心蛋白聚糖處理,肝纖維化的作用，其中圖1A顯示了對(duì)單獨(dú)用CC1.sub.4處理的大鼠的作用，而圖IB顯示了對(duì)用CCl.sub.4和rh核心蛋白聚糖處理的大鼠的作用。(X100);圖2A和2B顯示了rh核心蛋白聚糖和rh核心蛋白聚糖-Fc對(duì)由TGF|31誘發(fā)的肝星形細(xì)胞增殖的作用，其中LX-2細(xì)胞(人HSC細(xì)胞系)^^蟲(chóng)地或在2n^mlTGF(31存在的情況下暴露于rh核心蛋白聚糖或rh核心蛋白聚糖-Fc48小時(shí)，而且其中通過(guò)測(cè)量染料3-(4,5-二甲基噻唑-2基)-2，5二苯基四P^MIT)的減少來(lái)評(píng)估細(xì)胞數(shù)目，其中圖2A顯示了rh核心蛋白聚糖對(duì)由TGF卩1誘發(fā)的LX-2細(xì)胞增殖的作用((C;對(duì)照；D:rh核心蛋白聚糖(4ug/ml);T:TGF(31(2ng/ml);T+D:TGF卩l(xiāng)(2n^ml)加rh核心蛋白聚糖(4pg/ml))。(*指對(duì)照對(duì)TGF卩1p<0.05;#指TGF卩1對(duì)TGF(31加rh核心蛋白聚糖p<0.05。N=4)，而且其中圖2B顯示了rh核心蛋白聚糖-Fc對(duì)由TGF|31誘發(fā)的LX-2細(xì)胞增殖的作用((C;對(duì)照；T:TGF卩l(xiāng)(2ng/ml);D-Fc:rh核心蛋白聚糖-Fc(1pg/ml);T+D-Fc:TGF(31(2ng/ml)加rh核心蛋白聚糖-Fc(1pg/ml))。(**指對(duì)照對(duì)TGFpip<0.01;弁指TGF(31對(duì)TGF卩1加rh核心蛋白聚糖p<0.05。N=4);圖3A和3B顯示了rh核心蛋白聚糖和rh核心蛋白聚糖-Fc處艦用TGF卩l(xiāng)刺激的HSC細(xì)胞的MMP-2(基質(zhì)金屬蛋白酶-2)mRNA水平的作用，圖3A和3B中用rh核心蛋白聚糖或rh核心蛋白聚糖-Fc^^魁也或在2ng/mlTGF(31存在的情況下處理LX-2細(xì)胞24小時(shí)，收獲細(xì)胞用于總RNA提取，進(jìn)行RT-PCR以檢測(cè)rh核心蛋白聚糖和rh核心蛋白聚糖-Fc對(duì)用TGF卩1朿微的LX-2細(xì)胞的MMP-2mRNA水平的作用，而且其中將GADPH用作為對(duì)照，圖3A顯示了rh核心蛋白聚糖處MMMP-2的作用，而圖3B顯示了rh核心蛋白聚糖-Fc處自MMP-2的作用((C;對(duì)照；D:rh核心蛋白聚糖；T:TGF卩l(xiāng)(2ng/ml);D+T:TGF卩l(xiāng)(2ng/ml)加rh核心蛋白聚糖(4p^ml);I>Fc:rh核心蛋白聚糖-Fc(1pg/ml);T+D-Fc:TGF卩l(xiāng)(2ng/ml)加rh核心蛋白聚糖-Fc(1pg/ml))。圖4A和4B顯示了rh核心蛋白聚糖和rh核心蛋白聚H-Fc處W"用TGF(31刺激的HSC細(xì)胞的TTMP-l(基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑-l)mRNA7jC平的作用，其中在圖4A和4B中，LX-2細(xì)胞分別用rh核心蛋白聚糖或rh核心蛋白聚糖-Fc^4魁也或在2ng/mlTGFpi存在的情況下處理24小時(shí)，其中收獲rh核心蛋白聚糖和rh核心蛋白聚糖-Fc處理過(guò)的細(xì)胞用于總RNA提取，其中進(jìn)行RT-PCR以檢測(cè)rh核心蛋白聚糖和rh核心蛋白聚糖-Fc對(duì)用TGF-(3刺激的LX-2細(xì)胞的T1MP-1mRNA水平的作用，其中將GADPH用作對(duì)照，圖4A顯示了rh核心蛋白聚糖處艦TMP-1的作用，而圖4B顯示了rh核心蛋白聚糖-Fc處艦TIMP-1的作用。((C;對(duì)照；D:rh核心蛋白聚糖；T:TGF卩1(2n^ml);D+T:TGF(31(2ng/ml)加rh核心蛋白聚糖(4pg/ml);D-Fc:rh核心蛋白聚糖-Fc(1pg/ml);T+D-Fc:TGFpi(2ng/ml)加rh核心蛋白聚糖-Fc(1Mg/ml).);圖5A和5B顯示了rh核心蛋白聚糖和rh核心蛋白聚糖-Fc處M用TGF(31刺激的HSC細(xì)胞的膠原蛋白m蛋白7jC平的作用，其中LX-2細(xì)胞用rh核心蛋白聚糖或rh核心蛋白聚糖-Fc在2ng/mlTGF(31存在的情況下處理24小時(shí)，而且收獲培養(yǎng)基，圖5A顯示，進(jìn)行蛋白印跡以評(píng)估rh核心蛋白聚糖禾口rh核心蛋白聚糖-Fc對(duì)用TGFpi刺激的LX-2細(xì)胞的膠原蛋白IE蛋白K平的作用，而圖5B顯示了定量結(jié)果。T:TGF(31(2ng/ml);T+D:TGF(31(2n^ml)加rh核心蛋白聚糖(4|ag/ml);T+D-Fc:TGF卩1(2ng/ml)加rh核心蛋白聚糖-Fc(1Hg/ml)。T+Fc:TGF卩1(2n^ml)加Fc(1pg/ml))。圖6顯示了rh核心蛋白聚糖-Fc融合蛋白構(gòu)建體，其包括1:核心蛋白聚糖；2:接頭；3:免疫球蛋白Fc片段；4:二硫鍵。圖7A和7B顯示了rh核心蛋白聚糖-Fc核酸分子的蛋白表達(dá)，其中用rh核心蛋白聚糖-Fc重會(huì)M粒轉(zhuǎn)染Cos-7，用G418(0.6mg/ml)篩選，其中收集培養(yǎng)基用于蛋白印跡，而且其中將核心蛋白聚糖重會(huì)服粒用作對(duì)照，圖7A顯示了抗-IgGFc，而圖7B顯示了抗人核心蛋白聚糖抗體，其與用于檢測(cè)rh核心蛋白聚糖-Fc融合蛋白的HRP綴合，其中對(duì)于圖7A，M:豐gi己；泳道l-3:轉(zhuǎn)染了rh核心蛋白聚糖、rh核心蛋白聚糖-Fc和載體的細(xì)胞的培養(yǎng)基。泳道4:來(lái)自Sigma的核心蛋白聚糖對(duì)照，而且其中對(duì)于圖7B，M:^H己；泳道1-3:轉(zhuǎn)染了rh核心蛋白聚糖、rh核心蛋白聚糖-Fc和載體的細(xì)胞的細(xì)胞溶解產(chǎn)物，泳道4-6:轉(zhuǎn)染了rh核心蛋白聚糖、rh核心蛋白聚糖-Fc和載體的細(xì)胞的培養(yǎng)基，泳道7:來(lái)自Sigma的楊L、蛋白聚糖對(duì)照；禾口圖8A和8B顯示了rh核心蛋白聚糖-Fc壽命的50%延長(zhǎng)，其中用rh核心蛋白聚糖-Fc重會(huì)M粒轉(zhuǎn)染Cos-7，并且其中收集培養(yǎng)基并于37'C溫育從0天到5天的不同時(shí)間，其中將rh核心蛋白聚糖用作對(duì)照，并且其中用蛋白印跡來(lái)測(cè)定rh核心蛋白聚糖的穩(wěn)定性，其中對(duì)于圖8A的泳道l、3、5、7、9和11:于37。C溫育核心蛋白聚糖0、1、2、3、4禾口5天?！窢t2、4、6、8、10和12:于37。C溫育核心蛋白聚糖-Fc0、1、2、3、4禾口5天，而且其中圖8B顯示了蛋白印跡的定量。詳細(xì)說(shuō)明1.rh核心蛋白聚糖和rh核心蛋白聚糖-Fc對(duì)纖維化(尤其是肝纖維化)的作用首先研究rh核心蛋白聚糖對(duì)四氯化碳(ccg誘發(fā)的大鼠肝纖維化的作用。如圖1A中所示，與X寸照相比，用CCU處理8周誘發(fā)出了顯著的纖維化，形成了缺少中央靜脈的小結(jié)并消失了肝小葉的正常結(jié)構(gòu)。如圖2B中所示，最初用CC^處理后2周，在余下的6周將rh核心蛋白聚糖與CC^一慰婦寸。如所觀(guān)察到的，加入rh核心蛋白聚糖顯著減少了纖維發(fā)生的病理學(xué)改變。也研究了rh核心蛋白聚糖和rh核心蛋白聚糖-Fc對(duì)由TGF-p誘發(fā)的肝星形細(xì)胞(HSC)活化的作用。HSC活化是肝纖維發(fā)生的基本過(guò)程。纖維發(fā)生呈現(xiàn)為HSC的增殖禾啣卜基質(zhì)的改造，包括，肝細(xì)胞基底膜中的膠原蛋白IV的降解和過(guò)量細(xì)卜基質(zhì)組分(如膠原蛋白i和膠原蛋白m)粗干中的沉積。在該過(guò)程中，基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)和金屬蛋白酶組織抑制劑l(TMP-l)的皿在mRNA7K平被上調(diào)。膠原蛋白IV是MMP-2的底物。HMP-1是MMP-1的抑制劑，其能清除膠原蛋白I和m的沉積。發(fā)現(xiàn)rh核心蛋白聚糖和rh核心蛋白聚糖-FcM抑制細(xì)胞增殖、膠原蛋白m產(chǎn)生和由TGF-J3刺激的MMP-2和TIMP-1，來(lái)消除TGF-p對(duì)肝TO細(xì)胞的作用。根據(jù)這些結(jié)果并考慮到rh核心蛋白聚糖和rh核心蛋白聚糖-Fc有非常好的安全特征的事實(shí)，可將rh核心蛋白聚糖-Fc用作拋干纖維發(fā)生的藥物。肝纖維發(fā)生是活躍的過(guò)程，其導(dǎo)致肝中過(guò)量的細(xì)麟基質(zhì)組分的沉積。其已在許多狀況下觀(guān)察到，如慢性乙型和丙型病毒性肝炎、酒精性肝病、藥物誘發(fā)的肝病、血色素沉著癥、自身免疫性肝炎、Wilson病、原發(fā)性膽汁性肝硬化、硬化性膽管炎、肝血吸蟲(chóng)病等。纖維發(fā)生可在其它器官中類(lèi)似地發(fā)生，如肺、腎、胰、心和艦。本發(fā)明尤其有助于治療肝纖維化。"肝纖維化"是肝中的細(xì)卜基質(zhì)組分已確定的過(guò)量沉積。其終點(diǎn)是肝硬化。在本發(fā)明，的實(shí)施方案中，rh核心蛋白聚糖-Fc用于防止肝纖維化的發(fā)展，所述肝纖維化可在已感染了肝炎病毒(如乙型肝炎病毒(HBV)、或丙型肝炎病毒(HCV))的患者中發(fā)生。更具體地，慢性病毒幽干炎尤其是針對(duì)乙型慢鵬干炎禾吶型慢性肝炎。術(shù)語(yǔ)"需要該治療的患者"指的是任何患有器官疾病的人受試者或哺乳動(dòng)物，包括綿羊、牛、狗、貓、嚙齒類(lèi)動(dòng)物、兔或山羊，在戶(hù)脫疾病中觀(guān)察到了纖維發(fā)生或通常由疾病發(fā)展導(dǎo)致纖維發(fā)生。術(shù)語(yǔ)"治療"和"防止"包括在任何現(xiàn)象發(fā)展階段或在其發(fā)生前治療和預(yù)防纖維發(fā)生。本發(fā)明的目的尤其是防止、或減少或減輕患有器官疾病的患者的肝纖維化。根據(jù)本發(fā)明，治療有效量的rh核心蛋白聚糖-Fc的4OT有效M^或防liJ干纖維化發(fā)展。2.rh核心蛋白聚糖-Fc融合蛋白的分子結(jié)構(gòu)本發(fā)明提供了用于防止纖維化的融合蛋白。本發(fā)明的融合蛋白和/或編碼該融合蛋白的核酸可直接向需要用抗纖維化蛋白治療的哺乳動(dòng)物施用。因而，本發(fā)明掛共了融合蛋白，其包含本文中被稱(chēng)為楊H、蛋白聚糖的靶蛋白、人工接頭和免疫球蛋白Fc區(qū)或片段。因?yàn)槎垠w構(gòu)建體是優(yōu)選的，所以主題融合蛋白特征為二聚體，其ilil相鄰亞基中半胱氨酸間的一對(duì)二硫鍵交聯(lián)。在圖6中，將二硫鍵描述為M每個(gè)重鏈內(nèi)的部分免疫球蛋白鉸鏈區(qū)或片段將兩個(gè)免疫球蛋白重鏈Fc區(qū)、片段或結(jié)構(gòu)域連在一起，并因此具有該分子天然形式的特征。應(yīng)當(dāng)理解，免疫球蛋白Fc區(qū)或片段包括至少一部力，鏈區(qū)、CH2結(jié)構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)敏參見(jiàn)SEQ.ID.NO.1和2)。在本發(fā)明中，F(xiàn)c區(qū)N-末端的核酸序歹提輕微斷布的，從cctgtctocgggtaaa至atcactagtgaa加gcggccgctcgagtctag(參見(jiàn)8￡(^.10^0.3)。注意至1」，在Fc區(qū)或片段《封布中，用IO個(gè)氨基酸ITSEFAAARV(參見(jiàn)SEQ.ID.NO.4)替代4個(gè)驢酸SPGK。通體性接頭將Fc區(qū)附著到核心蛋白聚糖的c-末端。本文中所用的術(shù)語(yǔ)"多肽接頭"被理解為指能將兩個(gè)并不天然連在一起的蛋白質(zhì)連在一起的肽序列。多肽接頭包含多種氨基酸，如丙氨酸、甘氨酸和絲氨酸或這些氨基酸的組合。多3太接頭包含一系列長(zhǎng)度為約19個(gè)殘基的甘氨酸和絲氨MI太(參見(jiàn)SEQ.ID.Na5和6)。可是，預(yù)計(jì)最佳的接頭長(zhǎng)度和氨基酸組成可由常規(guī)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定。本文中所用的重組分子具有構(gòu)型X-Fc，其中X是革E分子。例如，免疫球蛋白Fc區(qū)可通過(guò)鏈間二硫鍵結(jié)合以產(chǎn)生圖6中所示類(lèi)型的構(gòu)建體。本文中所用的術(shù)語(yǔ)"核心蛋白聚糖"被離為指錄核心蛋白聚糖(參見(jiàn)SEQIDNO:7禾口8)。實(shí)施例:過(guò)rh核心蛋白聚糖抑制大鼠的肝纖維發(fā)生材料和方法，動(dòng)物和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)禾,可接受的倫理指導(dǎo)方針行所有實(shí)驗(yàn)。該研究中4頓重量為200-250g的雄性Wistar大鼠(北京醫(yī)科大學(xué))。動(dòng)物能自由微食物和t畑7jC。艦將CC14與橄欖油混合來(lái)制備40%CC14(Sigma)。通過(guò)以3ml/kg體重皮下注射給予40。/。CC14，一周兩次，進(jìn)行8周，來(lái)誘發(fā)出肝損傷和纖維化。CC14的對(duì)照動(dòng)物僅接受橄欖油。每天以20ug/kg/d體重的齊糧胸莫內(nèi)^ffirh核心蛋白聚糖。/Affl核心蛋白聚糖轉(zhuǎn)染的Cos-7細(xì)胞的培養(yǎng)基中提取rh核心蛋白聚糖。這樣，可區(qū)分3組，每組包括7只動(dòng)物。組I:只有橄欖油；組II:40%CC14;組m:40%CC14加rh核心蛋白聚糖。在第三周開(kāi)始rh核心蛋白聚糖治療并持續(xù)6周。在指定的時(shí)間點(diǎn)，處死動(dòng)物。從幾個(gè)葉中取肝樣品并在液氮中冷凍。也收tt清樣品。肝功能測(cè)試在自動(dòng)分析儀上進(jìn)行常規(guī)肝功能血液測(cè)試，包括透明質(zhì)酸糖胺多糖(hyaluronan)、IVMjK原酶、YGT和轉(zhuǎn)氨酶。纖維化iffe在用福爾馬林固定的、石蠟包埋的、用蘇木精和曙紅(HE)染色的切片，行纖維化評(píng)估。用圖像分析系統(tǒng)獲取圖片。將來(lái)自一系歹贖驗(yàn)的所有樣品同時(shí)染色。由高級(jí)病理學(xué)者判斷肝纖維化沉積并用METAVIR等級(jí)分級(jí)，期各纖維化分級(jí)為F0沃纖維化)到F4(硬化)。METAVIR等級(jí)是廣泛j頓的等級(jí)，其具有極好的觀(guān)測(cè)者間的可靠性。表l顯示了結(jié)果。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表1中的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析通過(guò)WILCOXON進(jìn)行，在其他表和圖中使用SPSS11.0軟件通過(guò)ANOVA進(jìn)行。結(jié)果用rh核心蛋白聚糖對(duì)CC14-處理的大鼠進(jìn)行處理造成纖維化的減少。在用CC14處理8周并用rh核心蛋白聚糖處理6周后的大鼠組中，與用CC14單獨(dú)處理的相比，結(jié)果最顯著(WDXOXON得出pO.Ol)。肝功能的生物化學(xué)測(cè)試如表2所示。表l.用CC14處理8周并用rh核心蛋白聚糖處理6周后的大鼠肝的病理學(xué)改變紹.<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>表2中的結(jié)果標(biāo)為平均值士lSD。CC14^^蟲(chóng)處理和CC14加rh核心蛋白聚糖之間的大鼠肝功肯她清生物化學(xué)測(cè)試的差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上是顯著的。N=JOT的動(dòng)物數(shù)。在肝纖維發(fā)生期間，由于有纖維組織廣泛沉積，所以細(xì)M卜基質(zhì)成分(如透明質(zhì)酸(HA)、膠原蛋白VI(cIV)和許多它們的分解產(chǎn)物)的血清水平將由于改3t和復(fù)發(fā)的瘢痕形成而增加。血清丙氨酸和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT和AST)水平與纖維化并不良好相關(guān)。可是，具有記錄的、持續(xù)正常ALT水平的患者，通常患有輕微，號(hào)的肝炎而沒(méi)有或只有輕微階段的纖維化。肝損傷(尤其是漫性肝損傷)狀況中發(fā)現(xiàn)了Y-GT的增加。注意到Y(jié)-GT與纖維化良好相關(guān)。實(shí)施例2rh核心蛋白聚糖和rh核心蛋白聚糖-FciM:抑制HSC細(xì)胞活化來(lái)抑制纖維發(fā)生為了闡明纖維發(fā)生中rh核心蛋白聚糖和rh核心蛋白聚糖-Fc的作用，檢查了rh核心蛋白聚糖和rh核心蛋白聚糖-Fc對(duì)由TGF-pi刺激的HSC細(xì)胞活化的作用。HSC活化是肝纖維發(fā)生的基本過(guò)程。它呈現(xiàn)為HSC的增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的改造，包括，基底膜中的膠原蛋白IV的,和過(guò)量細(xì)胞外基質(zhì)組分(如膠原蛋白I和膠原蛋白m)的沉積，和MMP和TIMP表達(dá)的mRNA7K平的改變。TGF-pi是該過(guò)程中最重要的活化因子之一。材料和方法細(xì)胞本發(fā)明人《頓確立的被稱(chēng)作LX-2的人HSC細(xì)鵬。這些細(xì)胞己進(jìn)行充分表征，并顯示出許多與HSC初級(jí)培養(yǎng)物的相似性。rh核心蛋白聚糖從人成纖維細(xì)胞系中克隆全長(zhǎng)核心蛋白聚糖基因，然后將基因插入pCDNA3.1載^(Invitrogen)并將基因與聚(組氨酸)(poly(histadine))尾在C-末端重組，以用于純化。用重會(huì)頓粒轉(zhuǎn)染Cos-7細(xì)胞。因?yàn)榇蠖鄶?shù)核心蛋白聚糖被分泌入培養(yǎng)基，所以收集培養(yǎng)基并利用ProBond純化系統(tǒng)(Invitrogen)進(jìn)行核心蛋白聚糖純化，其中用鎳柱進(jìn)行Ms-tag核心蛋白聚糖純化。rh核心蛋白聚糖-Fc審!J備±核心蛋白聚糖-Fc的方法如實(shí)施例3戶(hù)腿。細(xì)胞增殖測(cè)定將LX-2細(xì)胞(2000/孔)接種于96L微量培養(yǎng)板中24小時(shí)。用補(bǔ)加有0.5%FBS的DMEM替代培養(yǎng)基并使細(xì)胞饑餓48小時(shí)。饑鵬，將培養(yǎng)基用補(bǔ)加了2%血清的DMEM培養(yǎng)基替代。然后加入試劑處理細(xì)胞并將LX-2細(xì)胞單獨(dú)地或在2n^mlTGF(31存在的情況下暴露于rh核心蛋白聚糖或rh核心蛋白聚糖-Fc48小時(shí)。通過(guò)測(cè)量染料3-(4,5-二甲基噻唑-2基)-2,5二苯基四P^(MIT)的鈔來(lái)刑古細(xì)胞數(shù)目?；|(zhì)金屬蛋白膝2(MMP-2)的皿和基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑-l(TIMP-l)的mRNA水平MMP-2是能降解膠原蛋白IV的酶，而TTMP-1通過(guò)抑制由基質(zhì)金屬蛋白酶的降解而增加纖維化沉積。通過(guò)培養(yǎng)的LX-2細(xì)胞測(cè)量rh核心蛋白聚糖和rh核心蛋白聚糖-Fc對(duì)MMP-2和TIMP-1mRNA表達(dá)的作用。將2><105個(gè)LX-2細(xì)胞接種于6-孑L細(xì)胞培養(yǎng)板24小時(shí)。然后用補(bǔ)加有0.5%FBS的DMEM替代培養(yǎng)基。使細(xì)胞饑餓24小時(shí)。饑餓后，將培養(yǎng)基用補(bǔ)加了2%血清的DMEM培養(yǎng)基替代。然后加入試劑處理細(xì)胞并將LX-2細(xì)胞^^i也或在2ng/mlTGFpi存在的情況下暴露于rh核心蛋白聚糖或rh核心蛋白聚糖-Fc24小時(shí)。最后，收獲細(xì)胞并用TRIZOL試劑(GIBCOL，MD，美國(guó))裂解。然后根據(jù)廠(chǎng)商規(guī)程提取總RNA。進(jìn)行RT-PCRo通過(guò)管,因——甘油醛-3-磷M5兌氫斷GADPH)，標(biāo)準(zhǔn)化MMP-2和TIPM-1的基因^ii7乂平。m型膠原蛋白蛋白水平的皿過(guò)量細(xì)胞外基質(zhì)組分(如膠原蛋白m)的沉積是纖維發(fā)生期間的病理學(xué)過(guò)程。M培養(yǎng)的LX-2細(xì)胞測(cè)量rh核心蛋白聚糖或rh核心蛋白聚糖-Fc對(duì)膠原蛋白m表達(dá)的作用。將2xl05個(gè)LX-2細(xì)胞接種于6-孔細(xì)胞培養(yǎng)板24小時(shí)。然后用補(bǔ)加有0.5%FBS的DMEM替代培養(yǎng)基并使細(xì)胞饑餓24小時(shí)。饑餓后，將培養(yǎng)基用補(bǔ)加了2%血清的DMEM培養(yǎng)基替代。然后加入試劑處理細(xì)胞并將LX-2細(xì)胞在2ng/mlTGF(31存在的情況下暴露于rh核心蛋白聚糖或rh核心蛋白聚糖-Fc48小時(shí)。收獲培養(yǎng)基并進(jìn)行蛋白印跡以評(píng)估rh核心蛋白聚糖和rh核心蛋白聚糖-Fc對(duì)用TGF-pi處理的LX-2細(xì)胞的膠原蛋白m水平的作用結(jié)果增殖如圖2所示，TGF-pi增加了LX-2細(xì)胞增殖。TGF-pi(2ng/ml)對(duì)LX-2的促有絲分裂作用被同時(shí)加入的rh核心蛋白聚糖(4ug/ml)或rh核心蛋白聚糖-Fc(lu^ml)消除了。因?yàn)閘ug/ml的rh核心蛋白聚糖-Fc育站到4ug/mlrh核心蛋白聚糖的同樣效果，所以rh核心蛋白聚糖-Fc顯示出增強(qiáng)的體外生物學(xué)活性，相對(duì)于核心蛋白聚糖為至少4倍。在不存在TGF-pi盼瞎況下，rh核心蛋白聚糖或rh核心蛋白聚糖-Fc^^蟲(chóng)都不對(duì)細(xì)胞增殖具有顯著的作用。MMP-2禾口TIMP-1如圖3和4所示，TGF-(31(2ng/ml)提高了LX-2中的MMP-2和TMP-l表達(dá)，而rh核心蛋白聚糖和rh核心蛋白聚糖-Fc抑制該提高。m型膠原蛋白圖5顯示了TGF-pi(2ng/ml)增加LX-2細(xì)胞培養(yǎng)基中m型膠原蛋白的蛋白水平，而rh核心蛋白聚糖和rh核心蛋白聚糖-Fc消除TGF-(31的作用。實(shí)施例3l.構(gòu)建編碼h核心蛋白聚糖-Fc融合蛋白的基因融合蛋白從幾個(gè)DNA片段組裝而成。為了獲得編碼前導(dǎo)肽和人核心蛋白聚糖成熟蛋白的基因，從人成纖維細(xì)胞中提取總RNA，并進(jìn)行RT-PCR以克隆核心蛋白聚糖。表3顯示了用于克隆h核心蛋白聚lt-Fc融合蛋白的寡核苷列。根據(jù)廠(chǎng)商說(shuō)明書(shū)，將產(chǎn)生的長(zhǎng)度為約1077bp的DNA片隨翻入定向TOPO克隆載體中，如pCDNA3.1(Invetrogen)。fflilDNA測(cè)序確證人核心蛋白聚糖基因序列。禾,從人淋巴細(xì)胞中帝恪的RNA和誠(chéng)的5鄰3'弓卿(表3)通過(guò)反轉(zhuǎn)錄禾卩PCR來(lái)獲得編碼人IgGl的Fc區(qū)或片段(Fc.sub..gamma.l)的基因。產(chǎn)生的Fc.sub..gamma.lDNA片段含IgGl的鉸鏈、CH2和CH3結(jié)構(gòu)域的部分序列，將該片MM入pGEM-TEasy載^(Promaga)中。通過(guò)DNA測(cè)序確證Fc基因序列。為了制備h核心蛋白聚糖-Fc.sub..gamma.l融合基因，用NotI從Fc質(zhì)粒上切下Fc片段并瓊月^^電泳*^屯化。用NotI在核心蛋白聚糖C-末端對(duì)核心蛋白聚糖質(zhì)米i^行單1^刀割。然后將純化的Fc片段插入核心蛋白聚糖質(zhì)粒的切口以形成h核心蛋白聚糖-Fc.sub..gamma.l融合基因(圖6)。融合基因包含核心蛋白聚糖、柔啦太接頭和{針布的Fc.sub..gamma.l基因。用以下方齒針布Fc片段在RT-PCR期間fflil3'引物從Fc片段的C-末端去除4個(gè)氨基酸。在Fc片段l細(xì)入核心蛋白聚糖質(zhì)粒中的切口后，將來(lái)自pGEM-TEasy和pCDNA3.1載體并編碼10個(gè)氨基酸的序列引入到Fc片段C-末端。終止密碼子也被弓l入到Fc片段C-末端(參見(jiàn)SEQIDNos.3和4)。表3引物名稱(chēng)序列核心蛋白聚糖正向弓|物5'CACCATGAAGGCCACTATCATCCTC3'核心蛋白聚糖反向弓l物5'CTTATAGTTTCCGAGTTGAATGGC3'IGG1FC正向引物5'ACTCACACATGCCCACCGT3'IGG1FC反向引物5，GAGAGGCTCTTCTGCGTG3'由pGEM-TEasy和pCDNA3.1載體J^共的楊。、蛋白聚糖C-末段和Fc片段N-末端之間的序列形成了柔啦太接頭。核心蛋白聚糖和Fc部分之間存在肽接頭增加了核心蛋白聚糖結(jié)構(gòu)域的靈活性。對(duì)于本發(fā)明，肽接頭具有以下有益特征它由長(zhǎng)度為19的氨基酸鄉(xiāng)賊，并包含2種頗多以下氨基酸甘氨酸、絲氨酸、丙氨酸和蘇氨酸(SEQDDNo,6)。2在轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系中皿融合蛋白將重組pCDNA3.1表達(dá)載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞系中，以獲得hDecrin-Fc融合蛋白的表達(dá)。為了穩(wěn)定的高水平的表達(dá)，的宿主細(xì)胞系是Cos-7。優(yōu)選的轉(zhuǎn)染方法是lipofectin^(Iiwitrogen)。轉(zhuǎn)染后2天，將培養(yǎng)基用含0.6mg/ml的G418的生長(zhǎng)培養(yǎng)基替換。M抗人核心蛋白聚糖和Fc蛋白印跡測(cè)試^^擇藥物的轉(zhuǎn)染子的融合蛋白分泌(圖7A和B)。產(chǎn)生高水平h核心蛋白聚糖-Fc融合蛋白的孔被亞克隆。在Cos-7細(xì)胞中產(chǎn)生的重組h核心蛋白聚糖-Fc顯示出與天然核心蛋白聚糖中發(fā)現(xiàn)的非常相似的糖胺聚糖模式。當(dāng)在摩爾基礎(chǔ)上與rHuEPO進(jìn)行比較時(shí)，根據(jù)本發(fā)明表達(dá)并產(chǎn)生的h核心蛋白聚糖-Fc融合蛋白顯示出增強(qiáng)的生物學(xué)活性。3.體外生物學(xué)測(cè)定在LX-2細(xì)胞中進(jìn)行體外生物學(xué)測(cè)定以測(cè)試rh核心蛋白聚糖-Fc^3制HSC細(xì)胞活化而抑制纖維發(fā)生的作用(參見(jiàn)實(shí)施例2)。4.體外穩(wěn)定性研究因?yàn)槊庖咔虻鞍椎腇c部分有長(zhǎng)的半衰肌所以預(yù)計(jì)Fc融合蛋白能保持親本蛋白的生物活性并比其親本有更長(zhǎng)的半衰期。M以下方法進(jìn)行rh核心蛋白聚糖-Fc的穩(wěn)定性測(cè)定收集轉(zhuǎn)染了rh核心蛋白聚糖-Fc的Cos-7細(xì)胞的培養(yǎng)基并在37t:溫育不同時(shí)間。將rh核心蛋白聚糖用作對(duì)照。用蛋白印跡測(cè)定rh核心蛋白聚糖-Fc和rh核心蛋白聚糖的穩(wěn)定性。圖8顯示了，核心蛋白聚糖-Fc融合蛋白的糊軍率低于核心蛋白聚糖，其中50%的rh核心蛋白聚糖在5天后降解，而僅有25%的rh核心蛋白聚糖-Fc在5天后(^軍。SEQIDNo.1長(zhǎng)度660類(lèi)型DNA生物智人(Homosapiens)序列1actcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctc60ttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtg120gtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtg180gaggtgcataatgccaagacaaagecgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtg240gtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaag300gtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcag360ccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccag420gtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggag480agcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggc540tccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtc600ttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctca660SEQIDNo.2長(zhǎng)度220類(lèi)型PRO生物智人(Homos叩iens)序列2ThrHisThrCysProProCysProAlaProGluLeuLeuGlyGlyPro151015SerValPheIxuPheProProLysProLysAspThrLeuMetlieSer202530ArgThrProGluValThrCysValValValAspValSerHisGluAsp354045ProGluValLysPheAsnTrpTyrValAspGlyValGluValHisAsn505560.AlaLysThrLysProArgGluGluGinTyrAsnSerThrTyrArgVal65707580ValSerValLeuThrValLeuHisGinAspTrpLeuAsnGlyLysGlu859095TyrLysCysLysValSerAsnLysAlaLeuProAlaProlieGluLys100105110ThrlieSerLysAlaLysGlyGinProArgGluProGinValTyrThr115120125LeuProProSerArgAspGluLeuThrLysAsnGinValSerLeuThr130135140CysLeuValLysGlyPheTyrProSerAspHeAlaValGluTrpGlu145150155160SerAsnGlyGinProGluAsnAsnTyrLysThrThrProProValLeu165170175AspSerAspGlySerPhePheLeuTyrSerLysLeuThrValAspLys180185l卯SerArgTrpGinGinGlyAsnValPheSerCysSerValMetHisGlu195200205AlaLeuHisAsnHisTyrThrGinLysSerLeuSer210215220SEQIDNo.3長(zhǎng)度33類(lèi)型DNA生物人工的接頭序列3atcactagtg肌ttcgcggccgctegagtctag33SEQIDNo.4長(zhǎng)度10類(lèi)型PRO生物人工的序列4lieThrSerGluPheAlaAlaAlaArgVal1510SEQIDNo.5長(zhǎng)度57類(lèi)型DNA生物人工的序列5aagggtcaagacaattctgcagatatccagcacagtggcggccgcgggaattcgatt57SEQIDNo.6度19型PRO物人工的列6LysGlyGinAspAsnSerAlaAsplieGinHisSerGlyGlyArgGly151015AsnSerlieSEQIDNo.7長(zhǎng)度1077類(lèi)型DNA生物智人(Homosapiens)序列7atgaaggccactatcatcctccttctgcttgcacaagtttcctgggctggaccgtttcaa60cagagaggcttatttgactttatgctagaagatgaggcttctgggataggcccagaagtt120cctgatgaccgcgacttcgagccctccctaggcccagtgtgccccttecgctgtcaatgc180catcttcgagtggtccagtgttctgatttgggtctggacaaagtgccaaaggatcttccc240cctgacacaactctgctagacctgcaaaacaacaaaataaccgaaatcaaagatggagac300tttaagaacctgaagaaccttcacgcattgattcttgtcaacaataaaattagcaaagtt360agtcctggagcatttacacctttggtgaagttggaacgactttatctgtccaagaatcag420ctgaaggaattgccagaaaaaatgcccaaaactcttcaggagctgcgtgcccatgagaat480gagatcaccaaagtgcgaaaagttactttcaatggactgaaccagatgattgtcatagaa540ctgggcaccaatccgctgaagagctcaggaattgaaaatggggctttccagggaatgaag^00aagctctcctacatccgcattgctgataccaatatcaccagcattcctcaaggtcttcct660ccttcccttacggaattacatcttgatggcaacaaaatcagcagagttgatgcagctagc720ctgaaaggactgaataatttggctaagttgggattgagtttcaacagcatctctgctgtt780gacaatggctctctggccaacacgcctcatctgagggagcttcacttggacaacaacaag8;0cttaccagagtacctggtgggctggcagagcataagtacatccaggttgtctaccttcat900aacaacaatatctctgtagttggatcaagtgacttctgcccacctggacacaacacc咖960aaggcttcttattcgggtgtgagtcttttcagc助cccggtccagtactgggagatacag1020ccatccaccttcagatgtgtctacgtgcgctctgccattcaactcggaaactataag1077長(zhǎng)類(lèi)生序SEQIDNo.8長(zhǎng)度359類(lèi)型PRO生物智人(Homosapiens)序列8MetLysAlaThrlieHeLeuLeuLeuLeuAlaGinValSerTrpAla151015GlyProPheGinGinArgGlyLeuPheAspPheMetLeuGluAspGlu202530AlaSerGlylieGlyProGluValProAspAspArgAspPheGluPro354045SerLeuGlyProValCysProPheArgCysGinCysHisLeuArgVal505560ValGinCysSerAspLeuGlyLeuAspLysValProLysAspLeuPro65707580ProAspThrThrLeuLeuAspLeuGinAsnAsnLyslieThrGluUe859095LysAspGlyAspPheLysAsnLeuLysAsnLeuHisAlaLeulieLeu100105110ValAsnAsnLyslieSerLysValSerProGlyAlaPheThrProLeu115120125ValLysLeuGluArgLeuTyrLeuSerLysAsnGinLeuLysGluLeu130135140ProGluLysMetProLysThrLeuGinGluLeuArgAlaHisGluAsn145150155160GlulieThrLysValArgLysValThrPheAsnGlyLeuAsnGinMet165170175HeVallieGluLeuGlyThrAsnProLeuLysSerSerGlylieGlu180185190AsnGlyAlaPheGinGlyMetLysLysLeuSerTyrlieArglieAla195200205AspThrAsnlieThrSerHeProGinGlyLeuProProSerLeuThr210215220GluLeuHisLeuAspGlyAsnLyslieSerArgValAspAlaAlaSer225230235240LeuLysGlyLeuAsnAsnLeuAlaLysLeuGlyLeuSerPheAsnSer245250255HeSerAlaValAspAsnGlySerLeuAlaAsnThrProHisLeuArg260265270GluLeuHisLeuAspAsnAsnLysLeuThrArgValProGlyGlyLeu275280285AlaGluHisLysTyrlieGinValValTyrLeuHisAsnAsnAsnlie2卯295300SerValValGlySerSerAspPheCysProProGlyHisAsnThrLys305310315320LysAlaSerTyrSerGlyValSerLeuPheSerAsnProValGinTyr325330335TrpGluHeGinProSerThrPheArgCysValTyrValArgSerAla340345350lieGinLeuGlyAsnTyrLys355盡管本發(fā)明已結(jié)合各種附圖的優(yōu)選實(shí)施方案進(jìn)行了描述，然而要理解的是，可用其他相似的實(shí)施方案，或可對(duì)所述實(shí)施方案進(jìn)行修改或添加從而執(zhí)行本發(fā)明的相同功能，而不偏離它。所以，本發(fā)明不應(yīng)限于倒可單一的實(shí)施方案，而可根據(jù)附加權(quán)禾腰求書(shū)所弓間的寬度和范圍來(lái)解釋。權(quán)利要求1.用于抑制肝纖維發(fā)生的方法，該方法包括向需要該治療的患者施用有效量的肝星形細(xì)胞活化的rh核心蛋白聚糖-Fc拮抗劑。2.權(quán)利要求1的方法，其中所述拮抗劑防止病毒性肝炎和域誘發(fā)的肝損傷病程中肝纖維化的發(fā)展。3.權(quán)利要求1的方法，其中所述拮抗劑防止慢性肝炎和域誘發(fā)的肝損傷病程中肝纖維化的發(fā)展。4.權(quán)利要求1的方法，其中所述拮抗齊提與肝星形細(xì)胞活化相關(guān)的纖維變性狀況的拮抗劑。5.權(quán)禾腰求l的方法，其中戶(hù)誠(chéng)拮抗劑是核心蛋白聚糖融合蛋白。6.權(quán)利要求5的方法，其中所述融合蛋白是由核酸分子編碼的，其包含通過(guò)肽接頭相連的核心蛋白聚糖和IgGI1Fc片段。7.權(quán)利要求6的方法，其中所述含19個(gè)氨基酸的肽接頭出現(xiàn)在rh核心蛋白聚糖和其中的人IgGlFc之間；而^js;M肽接頭含8銷(xiāo)自甘氨酸、絲氨酸、丙氨酸和蘇氨酸的氨基酸。8.權(quán)利要求6的方法，其中所述人IgGlFc含有N-末端調(diào)節(jié)的人IgGl的鉸鏈、Cffi和CH3結(jié)構(gòu)域的部分。9.權(quán)利要求6的方法，其中戶(hù)脫rh核心蛋白聚糖-Fc融合蛋白顯示出增強(qiáng)的體外生物學(xué)活性，其相對(duì)于核心蛋白聚糖為至少4倍。10.權(quán)禾腰求6的方法，其中所述rh核心蛋白聚糖-Fc融合蛋白顯示出比其親本蛋白——核心蛋白聚糖更長(zhǎng)的壽命。11.生產(chǎn)rh核心蛋白聚糖-Fc融合蛋白的方法，其包括使用能在其生長(zhǎng)培養(yǎng)基中以在48小時(shí)時(shí)間段內(nèi)超過(guò)每百萬(wàn)細(xì)胞10.mu,g來(lái)產(chǎn)生rh核心蛋白聚糖-Fc融合蛋白的Cos-7細(xì)胞系。12.制備含rh核心蛋白聚糖、柔啦太接頭和{針布的人IgGlFc的重組融合蛋白的方纟去，其包括以下步驟產(chǎn)生Cos隱7細(xì)鵬；禾口，在其生長(zhǎng)培養(yǎng)基中以在48小時(shí)時(shí)間段內(nèi)超過(guò)每百萬(wàn)細(xì)胞lO.mu.g來(lái)皿重組蛋白的條件下，使細(xì)胞系生長(zhǎng)，其中所述重組融合蛋白顯示出增強(qiáng)的體外生物學(xué)活性，其相對(duì)于核心蛋白聚糖為至少4倍，而沒(méi)有不希望的副作用。13.權(quán)利要求12的方法，其中所述人IgGFc包含N-末端有l(wèi)針布的人IgGl的鉸鏈、CH2、和CH3結(jié)構(gòu)域的部分，其中IgGlFcN-末端的4個(gè)氨基酸SPGK被10個(gè)氨基酸ITSEFAAARV替代。全文摘要本發(fā)明涉及通過(guò)直接施用重組的rh核心蛋白聚糖和rh核心蛋白聚糖-Fc融合蛋白來(lái)體外和/或體內(nèi)抑制肝纖維發(fā)生的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了介于核心蛋白聚糖(Decorin)和Fc鉸鏈片段之間的接頭，以形成融合蛋白，所述融合蛋白增加核心蛋白聚糖的生物學(xué)活性，并增加與TGF-β結(jié)合的能力，以及延長(zhǎng)核心蛋白聚糖在血清中的壽命，其中Fc鉸鏈片段是Fc的修飾形式，其包括用能延長(zhǎng)核心蛋白聚糖-Fc蛋白壽命50％的10個(gè)不同的氨基酸替換4個(gè)N-末端氨基酸。文檔編號(hào)C12N15/12GK101115839SQ200580037190公開(kāi)日2008年1月30日申請(qǐng)日期2005年7月18日優(yōu)先權(quán)日2004年8月30日發(fā)明者孔祥復(fù),張碧源,張雅鷗,楊夢(mèng)甦,鄭思敏申請(qǐng)人:楊夢(mèng)甦;孔祥復(fù);張雅鷗;鄭思敏;張碧源