專利名稱：制備旋光醇的方法
描述本發(fā)明涉及通過(guò)在醇脫氫酶存在時(shí)還原丁-2-酮來(lái)制備(S)-丁-2-醇的方法。
現(xiàn)有技術(shù)已經(jīng)描述了使用多種生物催化劑將丁-2-酮還原成丁-2-醇[J.Org.Chem.(1992)571526，Chemistry Letters(1987)2089，Arch.Biochem Biophys.(1992)292539]。
但是，這些研究沒(méi)有報(bào)道任何對(duì)映選擇性。此外，還公開(kāi)了R-丁-2-醇的制備[J.Am.Chem.Soc.(1986)108162]。但是在此情形中，得到了只有48％ee的對(duì)映選擇性。
Nakamura等人[TetrahedronAsymmetry(2003)142659，TetrahedronAsymmetry(2002)13971]已經(jīng)闡明了S-丁-2-醇的生物催化合成已經(jīng)達(dá)到了94％ee的對(duì)映選擇性。在這些研究中，使用干燥的白地霉(Geotrichumcandidum)細(xì)胞。但是沒(méi)有詳細(xì)描述催化上述反應(yīng)的酶。
發(fā)明目標(biāo)目標(biāo)是提供通過(guò)丁-2-酮的對(duì)映選擇性還原制備(S)-丁-2-醇的方法，所述方法生產(chǎn)了高化學(xué)產(chǎn)量的具有最大對(duì)映純度的(S)-丁-2-醇。
發(fā)明描述本發(fā)明涉及通過(guò)在醇脫氫酶存在時(shí)還原丁-2-酮來(lái)制備(S)-丁-2-醇的方法，所述醇脫氫酶(i)具有多肽序列SEQ ID NO2，或者
(ii)具有與SEQ ID NO2的序列有至少80％同一性的多肽序列。
適合于本發(fā)明方法的醇脫氫酶(在下文中縮寫(xiě)為ADH)是那些能夠在依賴NAD+的反應(yīng)中氧化2-丙醇以提供2-丙酮的ADH。
另外，適合于本發(fā)明方法的ADH具有SEQ ID NO2的多肽序列或與SEQ ID NO2的序列有至少80％、優(yōu)選是至少90％、特別優(yōu)選是至少95％并且特別是至少97％、98％或99％同一性的序列。
具有SEQ ID NO2的多肽是可從大腸桿菌(Escherichia coli)中得到的丙醇脫氫酶[Swissprot基因座ADHP_ECOLI，登錄P39451；GenBank ID48994873區(qū)互補(bǔ)序列(1550852到1551892；[Science(1997)2771453]。在實(shí)驗(yàn)部分中描述了此酶的分離。
其它適當(dāng)?shù)腁DH是它們的多肽序列與SEQ ID NO2有上述一種序列同一性的那些。
為了在本文中描述的目的，通過(guò)University of Wisconsin的GeneticsComputer Group(GCG)的“GAP”計(jì)算機(jī)程序確定序列同一性，所述程序使用版本10.3，使用GCG所建議的標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)。
從SEQ ID NO2開(kāi)始，此類ADH可以通過(guò)技術(shù)人員已知的特異性或隨機(jī)誘變方法得到。但是可選地，還可以篩選微生物中的ADH，所述ADH催化2-丙醇的相應(yīng)的氧化以提供2-丙酮并且它們的氨基酸序列已經(jīng)與SEQ ID NO2具有所需序列同一性或者是通過(guò)誘變方法得到的，所述的微生物優(yōu)選是下列屬的那些Alishewanella、交替球菌屬(Alterococcus)、Aquamonas、Aranicola、殺雄菌屬(Arsenophonus)、Azotivirga、Brenneria、Buchnera(aphid P-endosymbionts)、布戴維采菌屬(Budvicia)、布丘氏菌屬(Buttiauxella)、Candidatus Phlomobacter、西地西菌(Cedecea)、檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)、Dickeya、愛(ài)德華氏菌屬(Edwardsiella)、腸桿菌屬(Enterobacter)、歐文氏菌屬(Erwinia)、埃希氏菌屬(Escherichia)、愛(ài)文氏菌屬(Ewingella)、Grimontella、哈夫尼菌屬(Hafnia)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、克呂沃爾菌屬(Kluyvera)、勒克氏菌屬(Leclercia)、勒米諾氏菌屬(Leminorella)、米勒氏菌屬(Moellerella)、摩根氏菌屬(Morganella)、肥桿菌屬(Obesumbacterium)、泛菌屬(Pantoea)、果膠桿菌屬(Pectobacterium)、光桿狀菌屬(Photorhabdus)、鄰單胞菌屬(Plesiomonas)、布拉格菌屬(Pragia)、變形菌屬(Proteus)、普羅威登斯菌屬(Providencia)、拉恩氏菌屬(Rahnella)、拉烏爾菌屬(Raoultella)、沙門(mén)氏菌屬(Salmonella)、Samsonia、沙雷氏菌屬(Serratia)、志賀氏菌屬(Shigella)、Sodalis、塔特姆菌屬(Tatumella)、Trabulsiella、Wigglesworthia、致病桿菌屬(Xenorhabdus)、耶爾森氏菌屬(Yersinia)和預(yù)研菌屬(Yokenella)。
可以以純化的或部分純化的形式，或者以微生物本身的形式來(lái)使用ADH。從微生物中回收和純化脫氫酶的方法是技術(shù)人員所充分了解的，例如從K.Nakamura & T.Matsuda，“Reduction of Ketones”in K.Drauz和H.Waldmann，Enzyme Catalysis in Organic Synthesis 2002，第III卷，991-1032，Wiley-VCH，Weinheim，Germany中了解。生成脫氫酶的重組方法同樣是已知的，例如從W.Hummel，K.Abokitse，K.Drauz，C.Rollmann和H.Grger，Adv.Synth.Catal.2003，345，No.1+2，第153-159頁(yè)已知。
用ADH進(jìn)行對(duì)映選擇還原優(yōu)選在適當(dāng)?shù)妮o因子(也稱作共底物)存在時(shí)進(jìn)行。通常用于還原酮的輔因子是NADH和/或NADPH。另外，可以使用ADH作為細(xì)胞系統(tǒng)，其遺傳性包含輔因子或可以添加備選的氧化還原介體(A.Schmidt，E.Hollmann和B.Bühler“Oxidation of Alcohols”in K.Drauz和H.Waldmann，Enzyme Catalysis in Organic Synthesis 2002，第III卷，991-1032，Wiley-VCH，Weinheim)。
此外，優(yōu)選在適當(dāng)?shù)倪€原劑存在時(shí)用ADH進(jìn)行對(duì)映選擇性還原，所述的還原劑再生出在還原期間被氧化的輔因子。適當(dāng)?shù)倪€原劑的實(shí)例是糖，特別是己糖，如葡萄糖、甘露糖、果糖，和/或可氧化的醇，特別是乙醇、丙醇或異丙醇，以及甲酸、亞磷酸或分子氫。為了氧化還原劑并且與之相聯(lián)系地再生出輔酶，可以添加另一種脫氫酶，例如如果使用的還原劑是葡萄糖則是葡萄糖脫氫酶，或者如果使用的還原劑是甲酸，則是甲酸脫氫酶。所述另一種脫氫酶可以作為游離酶或固定化酶使用，或以游離細(xì)胞或固定化細(xì)胞形式使用。它的制備可以分開(kāi)進(jìn)行或通過(guò)在(重組的)脫氫酶菌株中共表達(dá)進(jìn)行。
所要求的方法的優(yōu)選實(shí)施方案是通過(guò)酶系統(tǒng)再生輔因子，該酶系統(tǒng)中使用另一種脫氫酶，特別優(yōu)選是葡萄糖脫氫酶。
本發(fā)明另外涉及ADH制備(R)-丁-2-醇的用途。在此方法的實(shí)施方案中，將外消旋的丁-2-醇與ADH反應(yīng)，其中(S)-丁-2-醇被選擇性氧化以提供丁-2-酮，同時(shí)(R)-丁-2-醇仍然未改變。隨后，將得到的丁-2-酮和(R)-丁-2-醇混合物通過(guò)常規(guī)方法例如蒸餾來(lái)分級(jí)分離，并且因此將(R)-丁-2-醇以純的形式分離。
用在此實(shí)施方案中的優(yōu)選的輔因子是NAD+和NADP+，其可以用適當(dāng)?shù)墓驳孜?氧化劑)再次再生?？梢杂迷诒疚闹械膬?yōu)選的共底物是丙酮，它與已經(jīng)存在的ADH和/或另外使用的脫氫酶一起再生出輔因子并且在此方法中被還原成異丙醇。
“對(duì)映選擇性”意思是為了本發(fā)明目的，按照已知方式，根據(jù)ee(％)＝S-對(duì)映異構(gòu)體-R-對(duì)映異構(gòu)體/(S-對(duì)映異構(gòu)體-R-對(duì)映異構(gòu)體)×100計(jì)算出的S-對(duì)映異構(gòu)體的對(duì)映異構(gòu)體過(guò)量ee(以％)至少是80％，優(yōu)選至少是90％，特別至少是95％并且尤其至少是97％。
根據(jù)本發(fā)明使用的ADH可以以游離形式或固定化形式使用。固定化酶是指固定到惰性支持體上的酶。適當(dāng)?shù)闹С煮w材料和固定到其上的酶公開(kāi)在EP-A-1149849、EP-A-1 069 183和DE-A 100193773以及在其中引用的參考文獻(xiàn)中。在此問(wèn)題上，完整引用這些出版物的公開(kāi)。適當(dāng)?shù)闹С煮w材料的實(shí)例是粘土、粘土礦物如高嶺石、硅藻土、珍珠巖、二氧化硅、氧化鋁、碳酸鈉、碳酸鈣、纖維素粉、陰離子交換劑材料、合成聚合物如聚苯乙烯、丙烯酸類樹(shù)脂、酚醛樹(shù)脂、聚氨基甲酸酯和聚烯烴如聚乙烯和聚丙烯。通常使用細(xì)分的微粒形式的支持體材料用于制備受支持的酶，優(yōu)選是提供多孔形式。支持體材料的顆粒大小通常不大于5mm，特別不大于2mm(篩等級(jí))。類似地，當(dāng)使用脫氫酶作為全細(xì)胞催化劑時(shí)，可以選擇游離形式或固定化形式。支持體材料的實(shí)例是藻酸鈣和角叉菜聚糖。酶和細(xì)胞還可以直接與戊二醛連接(交聯(lián)以產(chǎn)生CLEA)。還描述了對(duì)應(yīng)的和其它固定化方法，如在J.Lalonde和A.Margolin“Immobilization of Enzymes”inK.Drauz和H.Waldmann，Enzyme Catalysis in Organic Synthesis 2002，第III卷，991-1032，Wiley-VCH，Weinheim中所述。
反應(yīng)(丁-2-酮還原成丁-2-醇)可以在水性反應(yīng)介質(zhì)或非水性反應(yīng)介質(zhì)或在2相系統(tǒng)或(微)乳液中進(jìn)行。水性反應(yīng)介質(zhì)優(yōu)選是緩沖的溶液，其通常具有從4到8，優(yōu)選從5到8的pH。除水外，水性溶劑還包含至少一種醇，例如乙醇或異丙醇或二甲亞砜。
非水性反應(yīng)介質(zhì)是指包含少于反應(yīng)介質(zhì)總量的1％(重量)，優(yōu)選少于0.5％(重量)的水的反應(yīng)介質(zhì)。反應(yīng)優(yōu)選在有機(jī)溶劑中進(jìn)行。
適當(dāng)?shù)娜軇┑膶?shí)例是優(yōu)選具有5到8個(gè)碳原子的脂族烴，如戊烷、環(huán)戊烷、己烷、環(huán)己烷、庚烷、辛烷或環(huán)辛烷；優(yōu)選具有1或2個(gè)碳原子的鹵代脂族烴，如二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、二氯乙烷或四氯乙烷；芳香烴如苯、甲苯、二甲苯、氯苯或二氯苯；優(yōu)選具有4到8個(gè)碳原子的脂族無(wú)環(huán)或環(huán)狀醚或醇，如二乙醚、甲基·叔丁基醚、乙基·叔丁基醚、二丙醚、二異丙醚、二丁醚；四氫呋喃或酯如乙酸乙酯或乙酸正丁酯，或酮如甲基·異丁基酮或二烷或其混合物。特別優(yōu)選是使用上述醚，特別是四氫呋喃。
用ADH的還原優(yōu)選在水性-有機(jī)反應(yīng)介質(zhì)中，特別是水性反應(yīng)介質(zhì)中進(jìn)行。
優(yōu)選在0.1g/l到500g/l(特別優(yōu)選是從1g/l到50g/l)的濃度下在酶還原中使用丁-2-酮，隨后可以將其連續(xù)或分批供給。
酶還原通常在低于所使用脫氫酶失活溫度并且高于-10℃的反應(yīng)溫度下進(jìn)行。所述溫度特別優(yōu)選在0到100℃范圍之間，特別是從15到60℃并且尤其是從20到40℃，例如大約30℃。
步驟可以包括，例如，最初將丁-2-酮中引入ADH，溶劑，以及輔酶(根據(jù)需要)、用于再生輔酶的另一種脫氫酶(根據(jù)需要)，和/或另外的還原劑，并且將混合物混合，例如通過(guò)攪拌或搖動(dòng)。但是，還可以將脫氫酶固定到反應(yīng)器(例如柱)中，并且使包含丁-2-酮和輔酶(根據(jù)需要)和/或共底物的混合物穿過(guò)反應(yīng)器。為此目的，混合物可以通過(guò)反應(yīng)器循環(huán)直到實(shí)現(xiàn)所需轉(zhuǎn)化。在方法中，將丁-2-酮的酮基還原成OH基團(tuán)，主要產(chǎn)生了醇的(S)-對(duì)映異構(gòu)體。還原通常完成到基于混合物中存在的丁-2-酮，轉(zhuǎn)化率為至少70％，特別優(yōu)選至少85％并且特別是至少95％。反應(yīng)的進(jìn)行(即酮的連續(xù)還原)在此可以通過(guò)常規(guī)方法如氣相色譜或高壓液相色譜來(lái)監(jiān)控。
本發(fā)明還包含具體公開(kāi)的具有丁-2-醇-脫氫酶活性的酶的“功能等同物”的用途。
對(duì)于本發(fā)明的目的，具體公開(kāi)的酶的“功能等同物”或類似物是這樣的多肽，其與所述具體公開(kāi)的酶不同并且另外具有所需的生物學(xué)活性如底物特異性。因此，例如“功能等同物”是指這樣的酶，其將丁-2-酮還原成相應(yīng)的S-醇并且具有包含在SEQ ID NO2下所列出的任意氨基酸序列的酶的活性的至少20％，優(yōu)選50％，特別優(yōu)選75％，非常特別優(yōu)選90％。此外，功能等同物優(yōu)選在pH4到10之間穩(wěn)定，并且優(yōu)選具有在pH5和8之間的最適pH，以及在20℃到80℃范圍內(nèi)的最適溫度。
根據(jù)本發(fā)明，“功能等同物”特別還指這樣的突變體，它在上述氨基酸序列的至少一個(gè)序列位置中具有不同于具體提到的氨基酸的氨基酸，但是仍然具有上述生物學(xué)活性的一種。因此“功能等同物”包含通過(guò)一種或多個(gè)氨基酸添加、置換、缺失和/或倒位得到的突變體。所述修飾可以發(fā)生在任何序列位置，只要它們產(chǎn)生了具有本發(fā)明性質(zhì)模式的突變體。如果突變體和未修飾多肽之間的反應(yīng)模式質(zhì)量上對(duì)應(yīng)，即例如同樣的底物以不同的速度反應(yīng)，那么也存在功能等同。
可以在下表中找到適當(dāng)?shù)陌被嶂脫Q的實(shí)例原始?xì)埢脫Q實(shí)例Ala SerArg LysAsn Gln；His
原始?xì)埢脫Q實(shí)例Asp GluCys SerGln AsnGlu AspGly ProHis Asn；GlnIle Leu；ValLeu Ile；ValLys Arg；Gln；GluMet Leu；IlePhe Met；Leu；TyrSer ThrThr SerTrp TyrTyr Trp；PheVal Ile；Leu在上述意義中“功能等同物”還是所述多肽的“前體”并且還是“功能衍生物”。
在本上下文中，“前體”是具有或不具有所需生物學(xué)活性的多肽的天然或合成前體。
本發(fā)明多肽的“功能衍生物”同樣可以借助于已知技術(shù)在功能性氨基酸側(cè)基或在它們N-末端或C-末端制備。此類衍生物包含，例如羧酸基團(tuán)的脂族酯、羧酸基團(tuán)的酰胺，該酰胺是通過(guò)與氨或與伯胺或仲胺反應(yīng)可得到的；游離氨基的N-?；苌?，該衍生物是通過(guò)與酰基基團(tuán)反應(yīng)制備的；或游離羥基基團(tuán)的O-?；苌铮撗苌锸峭ㄟ^(guò)與?；鶊F(tuán)反應(yīng)制備的。
在可能的蛋白質(zhì)糖基化情形中，本發(fā)明的“功能等同物”包括去糖基化形式或糖基化形式的上述類型的蛋白質(zhì)，并且還包括通過(guò)改變糖基化方式得到的修飾形式的上述類型的蛋白質(zhì)。
“功能等同物”自然還包括可以從其它生物中得到的多肽以及天然存在的變體。例如，可以通過(guò)序列比較建立同源序列區(qū)的區(qū)域，并且可以在本發(fā)明具體指導(dǎo)的基礎(chǔ)上確定等價(jià)酶。
“功能等同物”同樣包含本發(fā)明多肽的片段，優(yōu)選單獨(dú)結(jié)構(gòu)域或序列基序，例如該片段具有所需的生物學(xué)功能。
此外，“功能等同物”是融合蛋白質(zhì)，其包含任意的上述多肽序列或來(lái)自其的功能等同物，以及至少一種其它異源序列，所述的異源序列與其功能上不同并且在N末端或C末端功能性連接(即沒(méi)有融合蛋白質(zhì)部分的任何實(shí)質(zhì)的相互功能削減)。例如，此類異源序列的非限制性實(shí)例是信號(hào)肽或酶。
本發(fā)明蛋白質(zhì)的同源物可以通過(guò)篩選突變體(例如截短突變體)的組合文庫(kù)來(lái)鑒定。例如，蛋白質(zhì)變體的多樣文庫(kù)可以通過(guò)核酸水平上的組合誘變來(lái)生成，例如通過(guò)酶促連接合成的寡核苷酸混合物。有大量的方法可以用來(lái)從簡(jiǎn)并的寡核苷酸序列制備潛在同源物文庫(kù)。簡(jiǎn)并的基因序列可以在DNA合成儀中化學(xué)合成并且之后將合成的基因連接到適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體中。使用簡(jiǎn)并集合的基因使得在一種混合物中制備編碼所需集合的潛在蛋白質(zhì)序列的所有序列成為可能。技術(shù)人員已知合成簡(jiǎn)并寡核苷酸的方法(例如Narang，S.A.(1983)Tetrahedron 393；Itakura等人(1984)Annu.Rev.Biochem.53323；Itakura等人，(1984)Science 1981056；Ike等人(1983)Nucleic Acids Res.11477)。
在現(xiàn)有技術(shù)中已知篩選通過(guò)點(diǎn)突變或截短制備的組合文庫(kù)的基因產(chǎn)物和篩選cDNA文庫(kù)中的具有所選擇性質(zhì)的基因產(chǎn)物的多種方法?？梢允惯@些技術(shù)適合于快速篩選通過(guò)本發(fā)明同源物組合誘變生成的基因文庫(kù)。篩選進(jìn)行高通量分析的大基因文庫(kù)的最常用技術(shù)包括將基因文庫(kù)克隆到可復(fù)制的表達(dá)載體中，用得到的載體文庫(kù)轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)募?xì)胞，并且在這樣的條件下表達(dá)組合基因，在所述條件下，所需活性的檢測(cè)促進(jìn)了載體的分離，將檢測(cè)該載體編碼的基因的產(chǎn)物。循環(huán)總體誘變(REM)，即增加文庫(kù)中功能性突變體頻率的技術(shù)，可以與篩選測(cè)試組合使用來(lái)鑒別同源物(Arkin和Yourvan(1992)PNAS 897811-7815；Delgrave等人(1993)ProteinEngineering 6(3)327-331)。
本發(fā)明另外涉及編碼具有本發(fā)明脫氫酶活性的酶的核酸序列(例如，單鏈和雙鏈DNA和RNA序列，如cDNA和mRNA)。優(yōu)選是編碼例如SEQID NO2的氨基酸序列或其特征性部分序列的核酸序列，或包含SEQ IDNO1的核酸序列或其特征性部分序列的核酸序列。
在本文提到的所有核酸序列可以以本身已知的方式通過(guò)從核苷酸構(gòu)件的化學(xué)合成來(lái)制備，例如依靠雙螺旋的個(gè)體重疊的互補(bǔ)核酸構(gòu)件的片段縮合。例如使用亞磷酰胺方法以已知方式化學(xué)合成寡核苷酸(Voet，Voet，第二版，Wiley Press New York，第896-897頁(yè))。Sambrook等人(1989)，Molecular CloningA laboratory manual，Cold Spring Harbor LaboratoryPress中描述了合成寡核苷酸的裝配、借助于DNA聚合酶克列諾(Klenow)片段和連接反應(yīng)的缺口補(bǔ)平以及一般克隆方法。
本發(fā)明還涉及核酸序列(單鏈和雙鏈DNA和RNA序列，如cDNA和mRNA)，其編碼任一上述多肽和例如通過(guò)使用人造核苷酸類似物得到的功能等同物。
本發(fā)明涉及編碼本發(fā)明多肽或蛋白質(zhì)或其生物學(xué)活性部分的分離的核酸分子以及核酸片段，所述核酸片段例如可以用作鑒定或擴(kuò)增本發(fā)明編碼核酸的雜交探針或引物。
此外，本發(fā)明核酸分子另外包含來(lái)自編碼基因區(qū)的3’和/或5’端的未翻譯序列。
本發(fā)明另外包含與具體描述的核苷酸序列或其部分互補(bǔ)的核酸分子。
本發(fā)明的核苷酸序列使得可能生成探針和引物，所述探針和引物可以用來(lái)鑒定和/或克隆在其它細(xì)胞類型和生物中的同源序列。此類的探針和引物通常包含核苷酸序列區(qū)，其在“嚴(yán)格”條件(見(jiàn)下)下雜交到本發(fā)明核酸序列的有義鏈或相應(yīng)的反義鏈的至少約12個(gè)，優(yōu)選至少約25個(gè)，例如約40、50或75個(gè)連續(xù)核苷酸。
將“分離的”核酸分子從在該核酸的天然來(lái)源中存在的其它核酸分子中移除，并且此外當(dāng)該“分離的”核酸分子通過(guò)重組技術(shù)制備時(shí)基本沒(méi)有其它細(xì)胞材料或培養(yǎng)基，或者當(dāng)它是化學(xué)合成時(shí)基本沒(méi)有化學(xué)前體或者其它化學(xué)品。
本發(fā)明的核酸分子可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)和本發(fā)明提供的序列信息分離。例如，通過(guò)使用一種具體公開(kāi)的全序列或其部分作為雜交探針并且使用標(biāo)準(zhǔn)雜交技術(shù)從適當(dāng)?shù)腸DNA文庫(kù)中分離出cDNA(如例如在Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.F.和Maniatis，T.Molecular CloningA Laboratory Manual.第二版，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989中所述)。另外，可以通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，基于此類所使用序列構(gòu)建出的寡核苷酸引物分離出包含任意的公開(kāi)序列或其部分的核酸分子?？梢詫⒁赃@種方式擴(kuò)增的核酸克隆到適當(dāng)?shù)妮d體中并且通過(guò)DNA序列分析表征。還可以使用如自動(dòng)DNA合成儀通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)合成方法制備本發(fā)明的寡核苷酸。
原則上本發(fā)明的核酸序列可以從任何生物中鑒定并且分離出來(lái)。優(yōu)選地，可以從真菌、酵母、古細(xì)菌或細(xì)菌中分離本發(fā)明的核酸序列或其同源物。提到的細(xì)菌是革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌。本發(fā)明核酸優(yōu)選分離自革蘭氏陰性細(xì)菌，優(yōu)選來(lái)自α-變形菌門(mén)、β-變形菌門(mén)或γ-變形菌門(mén)，特別優(yōu)選來(lái)自下列目的細(xì)菌酸硫桿狀菌目(Acidithiobacillales)、交替單胞菌目(Alteromonadales)、著色菌目(Chromatiales)、腸桿菌目(Enterobacteriales)、軍團(tuán)菌目(Legionellales)、甲基球菌目(Methylococcales)、海洋螺菌目(Oceanospirillales)、巴斯德氏菌目(Pasteurellales)、假單胞菌目(Pseudomonadales)、硫發(fā)菌目(Thiotrichales)、弧菌目(Vibrionales)、黃色單胞菌目(Xanthomonadales。非常特別優(yōu)選來(lái)自腸桿菌科(Enterobacteriaceae)的細(xì)菌。尤其優(yōu)選來(lái)自埃希氏菌屬(Escherichia)。尤其優(yōu)選來(lái)自物種Escherichia albertii、蟑螂埃希氏菌(Escherichia blattae)、大腸桿菌(Escherichia coli)、弗格森埃希氏菌(Escherichia fergusonii)、赫氏埃希氏菌(Escherichia hermannii)、Escherichia senegalensis和傷口埃希氏菌(Escherichia vulneris)。
特別優(yōu)選是使用來(lái)自大腸桿菌的脫氫酶。
例如，通過(guò)使用常規(guī)雜交方法或PCR技術(shù)，例如通過(guò)基因組或cDNA文庫(kù)，從其它生物中分離本發(fā)明的核酸序列。這些DNA序列在標(biāo)準(zhǔn)條件下與本發(fā)明的序列雜交。對(duì)于雜交，優(yōu)選使用例如來(lái)自活性位點(diǎn)的保守區(qū)的短寡核苷酸，該保守區(qū)可以以技術(shù)人員已知的方式通過(guò)與本發(fā)明脫氫酶比較來(lái)鑒定。但是，還可以使用本發(fā)明核酸的更長(zhǎng)片段或全序列用于雜交。所述標(biāo)準(zhǔn)條件根據(jù)所使用核酸(寡核苷酸、更長(zhǎng)片段或全序列)或根據(jù)哪種核酸類型(DNA或RNA)用于雜交而不同。因此，例如，DNA:DNA雜交體的解鏈溫度比相同長(zhǎng)度的DNA:RNA雜交體解鏈溫度低大約10℃。
根據(jù)核酸，例如，標(biāo)準(zhǔn)條件是指溫度為42和58℃之間，在具有濃度為0.1到5×SSC(1×SSC＝0.15M NaCl，15mM檸檬酸鈉，pH 7.2)的水性緩沖溶液中，或另外存在50％甲酰胺，例如42℃，在5×SSC，50％甲酰胺中。優(yōu)選地，DNA:DNA雜交體的雜交條件是0.1×SSC，并且溫度在大約20℃到45℃之間，優(yōu)選在大約30℃到45℃之間。對(duì)于DNA:RNA雜交體，雜交條件優(yōu)選是0.1×SSC并且溫度在大約30℃到55℃之間，優(yōu)選在大約45℃到55℃之間。指出的雜交溫度是解鏈溫度值，其已經(jīng)通過(guò)例如具有長(zhǎng)度大約100個(gè)核苷酸并且G+C含量為50％，不存在甲酰胺時(shí)來(lái)計(jì)算。DNA雜交的實(shí)驗(yàn)條件在遺傳學(xué)的專業(yè)教科書(shū)如Sambrook等人，“Molecular Cloning”，Cold Spring Harbor Laboratory，1989中描述，并且可以使用技術(shù)人員已知的公式來(lái)計(jì)算，例如作為核酸長(zhǎng)度、雜交體類型或G+C含量的函數(shù)。從下列教科書(shū)中，技術(shù)人員可以得到雜交的其它信息Ausubel等人(編著)，1985，Current Protocols in Molecular Biology，JohnWiley & Sons，New York；Hames和Higgins(編著)，1985，Nucleic AcidsHybridizationA Practical Approach，IRL Press at Oxford University Press，Oxford；Brown(編著)，1991，Essential Molecular BiologyA PracticalApproach，IRL Press at Oxford University Press，Oxford。
本發(fā)明還涉及具體公開(kāi)的或衍生的核酸序列的衍生物。
因此本發(fā)明的其它核酸序列可以來(lái)自SEQ ID NO1并且通過(guò)添加、置換、插入或缺失單一或兩個(gè)或更多核苷酸而與之不同，但是仍然編碼具有所需性質(zhì)模式的多肽。
本發(fā)明還包含含有“沉默”突變的那些核酸序列，或與具體提到的序列相比，根據(jù)具體來(lái)源生物或宿主生物的密碼子選擇已經(jīng)被改變的那些核酸序列，以及其天然存在的變體，例如剪接變體或等位基因變體。
本發(fā)明還涉及通過(guò)保守核苷酸置換得到的序列(即所討論的氨基酸用相同電荷、大小、極性和/或溶解性的氨基酸置換)。
本發(fā)明還涉及通過(guò)序列多態(tài)性來(lái)自具體公開(kāi)的核酸的分子。這些遺傳多態(tài)性可以在種群中個(gè)體間作為天然變異的結(jié)果存在。這些天然變異通常在基因的核苷酸序列中引起1到5％的差異。
此外，例如，衍生物意思是與啟動(dòng)子融合。位于指示的核苷酸序列上游的啟動(dòng)子可以通過(guò)一個(gè)或多個(gè)核苷酸置換、插入、倒位和/或缺失來(lái)改變，但是沒(méi)有損害啟動(dòng)子的功能和功效。此外，所述啟動(dòng)子的功效可以通過(guò)改造它們的序列來(lái)增加或可以將啟動(dòng)子用更有活性的啟動(dòng)子(包括來(lái)自其它物種生物的那些)完全置換。
衍生物還指這樣的變體，在起始密碼子上游-1到-1000堿基或從終止密碼子下游0到1000堿基的區(qū)域中所述變體的核苷酸序列被改變從而改變(優(yōu)選增加)基因表達(dá)和/或蛋白質(zhì)表達(dá)。
本發(fā)明另外包含在“嚴(yán)格條件”下與上述編碼序列雜交的核酸序列。這些多核苷酸可以通過(guò)篩選基因組或cDNA文庫(kù)找到，并且根據(jù)需要，例如通過(guò)PCR，使用適當(dāng)?shù)囊飶钠渲袛U(kuò)增并且之后使用適當(dāng)?shù)奶结樂(lè)蛛x。另外，本發(fā)明的多核苷酸還可以化學(xué)合成。此性質(zhì)是指多核苷酸或寡核苷酸在嚴(yán)格條件下結(jié)合幾乎互補(bǔ)的序列的能力，但是在這些條件下，在非互補(bǔ)配偶體之間沒(méi)有形成非特異鍵。為此目的，序列應(yīng)當(dāng)是70-100％，優(yōu)選是90-100％互補(bǔ)的。能夠彼此特異性結(jié)合的互補(bǔ)序列的性質(zhì)用于如RNA或DNA印跡技術(shù)中，或用于在PCR或RT-PCR中的引物結(jié)合。為此目的，通常使用長(zhǎng)度為至少30個(gè)堿基對(duì)的寡核苷酸。在RNA印跡技術(shù)中，例如，嚴(yán)格條件是指使用50-70℃(優(yōu)選是60-65℃)的洗滌溶液，例如包含0.1％SDS(20×SSC3M NaCl，0.3M檸檬酸鈉，pH 7.0)的0.1×SSC緩沖液，用于洗脫非特異性雜交的cDNA探針或寡核苷酸。如上所述，僅僅在此仍然彼此結(jié)合的核酸是高度互補(bǔ)的那些。嚴(yán)格條件的建立是技術(shù)人員已知的并且在例如Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology，JohnWiley & Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6中描述。
本發(fā)明構(gòu)建體的實(shí)施方案此外本發(fā)明涉及包含受到調(diào)節(jié)核酸序列遺傳調(diào)控的編碼本發(fā)明多肽的核酸序列的表達(dá)構(gòu)建體；并且還涉及包含至少一種這些表達(dá)構(gòu)建體的載體。
本發(fā)明的此類構(gòu)建體優(yōu)選包含特定編碼序列的5’上游啟動(dòng)子和3’下游終止子序列，并且根據(jù)需要還包含在每種情形中有效連接編碼序列的另外的常規(guī)調(diào)節(jié)元件。
“有效連接”是指啟動(dòng)子、編碼序列、終止子，以及根據(jù)需要，另外的調(diào)節(jié)元件以這樣的方式的順序排列，在所述方式中每個(gè)調(diào)節(jié)元件能夠?qū)崿F(xiàn)它在表達(dá)編碼序列中所需要的功能。有效連接的序列的實(shí)例是靶標(biāo)序列，以及增強(qiáng)子、聚腺苷酸化信號(hào)等。其它調(diào)節(jié)元件包括選擇標(biāo)記、擴(kuò)增信號(hào)、復(fù)制起點(diǎn)等。適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)序列在例如Goeddel，Gene ExpressionTechnologyMethods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，CA(1990)中描述。
本發(fā)明核酸構(gòu)建體特別是指其中將本發(fā)明脫氫酶的基因有效或功能性連接到用于調(diào)節(jié)目的(例如增加基因表達(dá))的一種或多種調(diào)節(jié)信號(hào)的那些。
除了這些調(diào)節(jié)序列，這些序列的天然調(diào)節(jié)仍可以存在于實(shí)際結(jié)構(gòu)基因的上游，并且根據(jù)需要可以以這樣的方式被基因改造，在所述方式中關(guān)閉了天然調(diào)節(jié)并且增加了基因表達(dá)。但是，核酸構(gòu)建體還可以有更簡(jiǎn)單的設(shè)計(jì)，即在編碼序列上游沒(méi)有插入其它調(diào)節(jié)信號(hào)并且天然啟動(dòng)子與其調(diào)節(jié)一起沒(méi)有被移除。代替地，以不再有任何調(diào)節(jié)并且基因表達(dá)增加的方式突變天然調(diào)節(jié)序列。
優(yōu)選的核酸構(gòu)建體還有利地包含一種或多種前述增強(qiáng)子序列，其功能性連接到啟動(dòng)子上并且使得核酸序列表達(dá)增加。還可以將其它有利的序列如另外的調(diào)節(jié)元件或終止子插入到DNA序列的3’端。本發(fā)明的核酸可以以一個(gè)或多個(gè)拷貝存在于構(gòu)建體中。根據(jù)需要，為了選擇所述構(gòu)建體的目的，構(gòu)建體還可以包含其它標(biāo)記如抗生素抗性或增養(yǎng)作用-互補(bǔ)基因。
對(duì)于本發(fā)明方法有利的調(diào)節(jié)序列存在于例如啟動(dòng)子中，例如cos、tac、trp、tet、trp-tet、lpp、lac、lpp-lac、lacIq、T7、T5、T3、gal、trc、ara、rhaP(rhaPBAD)SP6、λ-PR或λ-PL啟動(dòng)子，將該啟動(dòng)子有利的用在革蘭氏陰性細(xì)菌中。另外有利的調(diào)節(jié)序列存在于例如革蘭氏陽(yáng)性啟動(dòng)子amy和SPO2、酵母或真菌啟動(dòng)子ADC1、MFalpha、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADH中。在此背景中例如來(lái)自漢遜酵母(Hansenula)的丙酮酸脫羧酶和甲醇氧化酶啟動(dòng)子也是有利的。還可以使用人造啟動(dòng)子用于調(diào)節(jié)。
為了在宿主生物中表達(dá)的目的，將核酸構(gòu)建體有利地插入到載體如質(zhì)?；蚴删w中，例如其使得基因能夠在宿主中最佳表達(dá)。載體是指，除質(zhì)粒和噬菌體外，還有技術(shù)人員已知的任何其它載體，即例如病毒如SV40、CMV、桿狀病毒和腺病毒，轉(zhuǎn)座子、IS元件、噬菌粒、黏粒，以及線性或環(huán)狀DNA。這些載體可以在宿主生物中自主復(fù)制或隨染色體復(fù)制。這些載體構(gòu)成了本發(fā)明另外的實(shí)施方案。適當(dāng)質(zhì)粒的實(shí)例是在大腸桿菌中，pLG338、pACYC184、pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pRep4、pHS1、pKK223-3、pDHE19.2、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN-III113-B1、lgt11或pBdCI；在鏈霉菌(Streptomyces)中，pIJ101、pIJ364、pIJ702或pIJ361；在芽孢桿菌(Bacillus)中，pUB110、pC194或pBD214；在棒桿菌(Corynebacterium)中，pSA77或pAJ667；在真菌中，pALS1、pIL2或pBB116；在酵母中，2αM、pAG-1、YEp6、YEp13或pEMBLYe23；或在植物中pLGV23、pGHlac+、pBIN19、pAK2004或pDH51。所述質(zhì)粒是可能質(zhì)粒的少量選擇。其它質(zhì)粒是技術(shù)人員已知的并且可以在例如書(shū)籍Cloning Vectors(編著Pouwels P.H.等人Elsevier，Amsterdam-NewYork-Oxford，1985，ISBN 0 444 904018)中找到。
為了表達(dá)存在的其它基因，核酸構(gòu)建體有利地還包含用于增加表達(dá)的3’-端和/或5’端調(diào)節(jié)序列，其是根據(jù)宿主生物和所選擇的基因被選擇用于最優(yōu)表達(dá)。
這些調(diào)節(jié)序列用于使基因或蛋白質(zhì)表達(dá)能夠特異性表達(dá)。根據(jù)宿主生物，例如這可以是指基因只有在誘導(dǎo)后表達(dá)或過(guò)量表達(dá)或者它立即表達(dá)和/或過(guò)量表達(dá)。
關(guān)于這一點(diǎn)，調(diào)節(jié)序列或因子可以優(yōu)選積極影響并且因此增加被引入的基因表達(dá)。因此，通過(guò)使用強(qiáng)轉(zhuǎn)錄信號(hào)如啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子，有利地可以在轉(zhuǎn)錄水平上增強(qiáng)調(diào)節(jié)元件。但是，除此之外，例如還可以通過(guò)增加mRNA的穩(wěn)定性來(lái)增強(qiáng)翻譯。
在載體的另一實(shí)施方案中，還可以將包含本發(fā)明核酸構(gòu)建體或本發(fā)明核酸的載體以線性DNA的形式有利地引入到微生物中并且通過(guò)異源或同源重組整合到宿主生物基因組中。此線性DNA可以由線性載體如質(zhì)粒組成或僅由本發(fā)明的核酸構(gòu)建體或核酸組成。
為了能夠在生物中最佳表達(dá)異源基因，有利地根據(jù)在生物中使用的特異性密碼子選擇來(lái)改造核酸序列?？梢越柚趤?lái)自所討論生物的其它已知基因的計(jì)算機(jī)分析，容易地確定密碼子選擇。
通過(guò)將適當(dāng)?shù)膯?dòng)子融合到適當(dāng)?shù)木幋a核苷酸序列和終止子信號(hào)或聚腺苷酸化信號(hào)上來(lái)制備本發(fā)明的表達(dá)盒。常規(guī)重組和克隆技術(shù)描述在例如T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook，Molecular CloningA LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY(1989)中以及T.J.Silhavy，M.L.Berman和L.W.Enquist，Experiments with GeneFusions，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY(1984)中，并且在Ausubel，F(xiàn).M.等人，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Assoc.and Wiley Interscience(1987)中用于本目的。
為了實(shí)現(xiàn)在適當(dāng)?shù)乃拗魃镏械谋磉_(dá)，將重組核酸構(gòu)建體或基因構(gòu)建體有利地插入到使基因能夠在宿主中最優(yōu)表達(dá)的宿主特異性的載體中。載體是技術(shù)人員已知的并且可以在例如“Cloning Vectors”(Pouwels P.H.等人，編著，Elsevier，Amsterdam-New York-Oxford，1985)中找到。
根據(jù)本發(fā)明有用的宿主生物借助于本發(fā)明載體或構(gòu)建體，可以制備重組微生物，例如所述重組微生物用本發(fā)明至少一種載體轉(zhuǎn)化并且可以用于產(chǎn)生本發(fā)明的多肽。有利地，將本發(fā)明的上述重組構(gòu)建體引入到適當(dāng)?shù)乃拗飨到y(tǒng)中并且表達(dá)。關(guān)于這一點(diǎn)，優(yōu)選使用技術(shù)人員已知的常見(jiàn)克隆和轉(zhuǎn)染方法如共沉淀、原生質(zhì)體融合、電穿孔、逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染等，從而引起所述核酸在特定的表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)。適當(dāng)?shù)南到y(tǒng)描述在例如Current Protocols in Molecular Biology，F(xiàn).Ausubel等人，編著，Wiley Interscience，New York 1997，或Sambrook等人Molecular CloningA Laboratory Manual.第二版，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989中。
根據(jù)本發(fā)明，還可以制備同源重組微生物。為此目的，制備包含本發(fā)明基因或編碼序列的至少一部分的載體，在其中，根據(jù)需要已經(jīng)引入了至少一個(gè)氨基酸缺失、氨基酸添加或氫基酸置換，從而修飾(例如功能性破壞)本發(fā)明序列(敲除載體)。例如，引入的序列還可以是來(lái)自相關(guān)微生物的同源物或來(lái)自哺乳動(dòng)物、酵母或昆蟲(chóng)來(lái)源?？蛇x地，可以以這樣的方式設(shè)計(jì)用于同源重組的載體，在所述方式中，在同源重組情形下，內(nèi)源基因被突變或改變但是仍然編碼功能性蛋白質(zhì)(例如可以以內(nèi)源蛋白質(zhì)表達(dá)被因此改變的方式改造上游調(diào)節(jié)區(qū))。本發(fā)明基因的改造部分在同源重組載體中。在例如Thomas，K.R.和Capecchi，M.R.(1987)Cell 51503中描述了適合于同源重組的載體構(gòu)建。
原則上適合于本發(fā)明核酸或核酸構(gòu)建體的重組宿主生物是任何原核或真核生物。有利地，將微生物如細(xì)菌、真菌或酵母用作宿主生物。有利地使用革蘭氏陽(yáng)性菌或革蘭氏陰性細(xì)菌，優(yōu)選下列科的細(xì)菌腸桿菌科、假單胞菌科(Pseudomonadaceae)、根瘤菌科(Rhizobiaceae)、鏈霉菌科(Streptomycetaceae)或諾卡氏菌科(Nocardiaceae)，特別優(yōu)選下列屬的細(xì)菌埃希氏菌屬(Escherichia)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、諾卡氏菌屬(Nocardia)、伯克氏菌屬(Burkholderia)、沙門(mén)氏菌屬(Salmonella)、土壤桿菌屬(Agrobacterium)或紅球菌屬(Rhodococcus)。非常特別優(yōu)選是大腸桿菌屬和種。另外，其它有利的細(xì)菌在α-變形菌門(mén)、β-變形菌門(mén)或γ-變形菌門(mén)的組中找到。
關(guān)于這一點(diǎn)，本發(fā)明宿主生物優(yōu)選包含至少一種在本發(fā)明中描述的并且編碼具有本發(fā)明脫氫酶活性的酶的核酸序列、核酸構(gòu)建體或載體。
用在本發(fā)明方法中的生物取決于以技術(shù)人員已知方式生長(zhǎng)或培養(yǎng)的宿主生物。微生物通常生長(zhǎng)在包含碳源(通常以糖的形式)、氮源(通常以有機(jī)氮源如酵母提取物或鹽如硫酸銨)、痕量元素如鐵鹽、錳鹽、鎂鹽以及維生素(根據(jù)需要)的液體培養(yǎng)基中，在0℃到100℃，優(yōu)選10℃到60℃的溫度下，同時(shí)充入氧氣。關(guān)于這一點(diǎn)，營(yíng)養(yǎng)液的pH可以保持或不保持在固定值，即可以在培養(yǎng)期間調(diào)節(jié)或不調(diào)節(jié)pH。培養(yǎng)可以分批、半分批或連續(xù)進(jìn)行?？梢栽诎l(fā)酵開(kāi)始時(shí)引入營(yíng)養(yǎng)物或隨后以半連續(xù)方式或連續(xù)方式加入。可以將酮直接添加到培養(yǎng)基中，或有利地在培養(yǎng)后添加?？梢詫⒚竿ㄟ^(guò)使用在實(shí)施例中描述的方法從生物中分離或作為粗提取物直接用于反應(yīng)。
本發(fā)明所用多肽的重組制備本發(fā)明另外涉及用培養(yǎng)的產(chǎn)生多肽的微生物重組制備本發(fā)明所使用多肽或其功能性、生物學(xué)活性片段的方法，根據(jù)需要誘導(dǎo)多肽的表達(dá)，并且將所述多肽從培養(yǎng)物中分離。如果需要，多肽還可以在工業(yè)規(guī)模上這種方式來(lái)產(chǎn)生。
可以通過(guò)已知方法培養(yǎng)和發(fā)酵重組微生物。例如在TB培養(yǎng)基或LB培養(yǎng)基中，在20到40℃溫度和6到9的pH下，繁殖細(xì)菌。適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件詳細(xì)描述在例如T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook，MolecularCloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor，NY(1989)中。
如果多肽沒(méi)有分泌到培養(yǎng)基中，隨后通過(guò)已知的蛋白質(zhì)分離方法將細(xì)胞破裂并且從裂解液中得到產(chǎn)物。根據(jù)需要，細(xì)胞可以通過(guò)下列方法破裂通過(guò)高頻超聲、通過(guò)高壓如在弗氏壓碎器中、通過(guò)滲透、通過(guò)去污劑、水解酶或有機(jī)溶劑的作用、通過(guò)使用勻漿器或通過(guò)組合兩種或多種列出的方法。
可以使用已知層析方法如分子篩層析(凝膠過(guò)濾)(例如Q瓊脂糖層析)、離子交換層析和疏水層析，以及還使用其它常規(guī)方法如超濾、結(jié)晶、鹽析、透析和非變性凝膠電泳來(lái)純化多肽。適當(dāng)?shù)姆椒枋鲈诶鏑ooper，F(xiàn).G，Biochemische Arbeitsmethoden，Verlag Walter de Gruyter，Berlin，New York中或在Scopes，R.，Protein Purification，Springer Verlag，NewYork，Heidelberg，Berlin中。
有利地通過(guò)使用這樣的載體系統(tǒng)或寡核苷酸來(lái)分離重組蛋白質(zhì)，所述的載體系統(tǒng)或寡核苷酸通過(guò)特定核苷酸序列延伸cDNA并且因此編碼用來(lái)例如簡(jiǎn)化純化的改造的多肽或融合蛋白質(zhì)。此類適當(dāng)?shù)男揎棇?shí)例是作為錨的“標(biāo)簽”，如已知為六組氨酸錨的修飾，或可以作為抗原被抗體識(shí)別的表位(例如在Harlow，E.和Lane，D.，1988，AntibodiesA LaboratoryManual.Cold Spring Harbor(N.Y.)Press中描述)。這些錨可以用于將蛋白質(zhì)附著到固相支持體如聚合物基質(zhì)上，例如可以將聚合物基質(zhì)裝進(jìn)層析柱中，或可以在微量滴定板或在另一支持體上使用。
同時(shí)，這些錨還可以用于鑒定蛋白質(zhì)。還可以通過(guò)使用常規(guī)標(biāo)記自身或與錨組合來(lái)鑒定蛋白質(zhì)用于衍生所述蛋白質(zhì)，所述常規(guī)標(biāo)記如熒光染料、在與底物反應(yīng)后形成可檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物的酶標(biāo)記或放射性標(biāo)記物。
進(jìn)行本發(fā)明酶還原方法的其它實(shí)施方案在本發(fā)明方法中脫氫酶可以用作游離或固定化酶。
在0℃到95℃之間，優(yōu)選在10℃到85℃之間，特別優(yōu)選在15℃到75℃之間的溫度下有利地進(jìn)行本發(fā)明的方法。
在本發(fā)明方法中，pH有利地保持在大約pH4和12之間，優(yōu)選在pH4.5和9之間，特別優(yōu)選在pH5和8之間。
在本發(fā)明方法中，對(duì)映異構(gòu)純或手性產(chǎn)物如丁-2-醇是指表現(xiàn)出對(duì)映異構(gòu)體富集的對(duì)映異構(gòu)體。在本發(fā)明方法中優(yōu)選達(dá)到對(duì)映異構(gòu)純度為至少70％ee，優(yōu)選至少80％ee，特別優(yōu)選至少90％ee，非常特別優(yōu)選至少是98％ee。
可以使用包含本發(fā)明核酸、核酸構(gòu)建體或載體的生長(zhǎng)細(xì)胞用于本發(fā)明的方法。還可以使用靜息細(xì)胞或破裂的細(xì)胞。破裂的細(xì)胞是指例如通過(guò)用溶劑處理使得通透的細(xì)胞，或例如通過(guò)用酶處理、機(jī)械處理(例如弗氏壓碎或超聲破碎)或其它方法破碎的細(xì)胞。以這種方式得到的粗提取物有利地適合于本發(fā)明方法。還可以使用純化的或部分純化的酶用于方法。有利地可以應(yīng)用在反應(yīng)中的固定化的微生物或酶同樣是適當(dāng)?shù)摹?br> 本發(fā)明的方法可以分批、半分批或連續(xù)操作。
例如在Biotechnology，第3卷，第2版，Rehm等人編著，(1993)，尤其是第II章中描述的，方法可以有利地在生物反應(yīng)器中進(jìn)行。
下列實(shí)施例用于說(shuō)明但不限制本發(fā)明。在此上下文中，參考附圖，其中

圖1描述了通過(guò)用來(lái)自大腸桿菌的脫氫酶還原合成(S)-丁-2醇的典型反應(yīng)模式。
實(shí)驗(yàn)部分實(shí)施例1大腸桿菌丙醇脫氫酶的克隆大腸桿菌丙醇脫氫酶基因序列存放在數(shù)據(jù)庫(kù)中(GenBank ID48994873區(qū)互補(bǔ)序列(1550852到1551892))。根據(jù)已知方法用于從大腸桿菌基因組DNA中擴(kuò)增基因的寡核苷酸來(lái)自丙醇脫氫酶基因的核酸序列。得到的序列對(duì)應(yīng)于公開(kāi)的序列。寡核苷酸的DNA序列在表1中描述。
表1用于制備合成的大腸桿菌丙醇脫氫酶基因的寡核苷酸
PCR條件2μl10×Pfu-Ultra緩沖液(Stratagene)100ng 引物#1(參看表1)
100ng 引物#2(參看表1)1μl dNTP(每種10mM)大約30ng 大腸桿菌染色體DNA1UPfu-Ultra DNA聚合酶添加到20μl H2O溫度程序 將PCR產(chǎn)物(大約1050bp)用限制性內(nèi)切酶NdeI和HindIII消化并且克隆到已經(jīng)相應(yīng)地切開(kāi)的pDHE19.2載體中(克隆按照在DE 19848129中描述的進(jìn)行)。將連接混合物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌XL1 Blue(Stratagene)中。
將得到的質(zhì)粒pDHE-PDH-L轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株TG10 pAgro4pHSG575(TG10大腸桿菌TG1(Stratagene)的RhaA-衍生物；pAgro4Takeshita，S；Sato，M；Toba，M；Masahashi，W；Hashimoto-Gotoh，T(1987)Gene 61，63-74；pHSG575T.Tomoyasu等人(2001)，Mol.Microbiol.40(2)，397-413)。得到的重組大腸桿菌克隆稱作大腸桿菌LU12418。
實(shí)施例2重組丙醇脫氫酶的提供將大腸桿菌LU12418在100ml錐形瓶(擋板)中的20mlLB-Amp/Spec/Cm(100μg/l氨芐青霉素；100μg/l壯觀霉素；20μg/l氯霉素)，0.1mM IPTG，0.5g/l鼠李糖中37℃下生長(zhǎng)18小時(shí)，以5000*g離心10分鐘，用10mM TRIS*HCl，pH 7.0洗滌一次并且重懸在2ml同樣的緩沖液中。
通過(guò)在振動(dòng)粉碎機(jī)中用0.7ml的玻璃珠(d＝0.5mm)破碎大腸桿菌LU12418細(xì)胞糊(3×5分鐘，立即在冰上冷卻)，來(lái)制備無(wú)細(xì)胞的蛋白質(zhì)粗提取物。
實(shí)施例3大腸桿菌LU12418重組脫氫酶活性的測(cè)定在每種情形中，將6個(gè)轉(zhuǎn)化體在100ml錐形瓶(擋板)中的20mlLBAmp/Spec/Cm(100μg/lAmp；100mg/lSpec；20μg/lCm)，0.1mM IPTG，0.5g/l鼠李糖中37℃下生長(zhǎng)18小時(shí)，以5000*g離心10分鐘，用10mMTRIS/HCl，pH 7.0洗滌一次并且重懸在2ml同樣的緩沖液中。
通過(guò)在振動(dòng)粉碎機(jī)中用0.7ml的玻璃珠(d＝0.5mm)破碎細(xì)胞(3×5分鐘，立即在冰上冷卻)，來(lái)得到大腸桿菌LU12418無(wú)細(xì)胞粗提取物。
可以在340nm下在光度計(jì)中監(jiān)測(cè)酮還原過(guò)程中還原的共底物的消耗。10μl稀釋的無(wú)細(xì)胞粗提取物(≈10μg蛋白質(zhì))，10μmol正丙醇和250nmolNADH或NADPH在1ml的50mM KPi、1mM MgCl2，pH 6.5中，30℃下溫育。1單位(1U)對(duì)應(yīng)了在1分鐘內(nèi)還原1μmol正丁醇的酶量。
實(shí)施例4丁-2-醇的分析可以通過(guò)GC測(cè)定丁-2-酮和丁-2-醇的濃度。還可以根據(jù)固定相和流動(dòng)相的選擇來(lái)確定除濃度外的ee值。
a)非手性分析使用下列系統(tǒng)定量反應(yīng)固定相Chromoltih SpeedROD RP18，50×4，6μm，Merck(Darmstadt，Germany)，加熱到45℃流動(dòng)相洗脫液A10mM KH2PO4，pH 2.5洗脫液B乙腈梯度0-0.5分鐘，35％B；0.5-1.0min 35到80％B；1.0-1.2分鐘80％B；1.2-1.3分鐘80％-35％B；1.3-2.0分鐘35％B；流速 1.5ml/分鐘檢測(cè)在230和260nm下UV檢測(cè)存留時(shí)間丁-2-酮大約1.6分鐘丁-2-醇大約1.3分鐘使用可靠材料，產(chǎn)生了校準(zhǔn)系列，在其基礎(chǔ)上可以確定未知樣品的濃度。
b)手性分析固定相 Chiracel OD-H，250×4，6μm，Daicel，加熱到40℃流動(dòng)相 洗脫液A正己烷洗脫液B異丙醇用2.5％B等度流速1.0ml/分鐘檢測(cè)在230和260nm下的UV檢測(cè)存留時(shí)間丁-2-酮大約9.5min(1S)-丁-2-醇大約16.6min(1R)-丁-2-醇大約18.3min使用可靠材料，產(chǎn)生了校準(zhǔn)系列，在其基礎(chǔ)上可以確定未知樣品的濃度。
實(shí)施例5用于輔因子再生的葡萄糖脫氫酶的提供和用葡萄糖脫氫酶的輔因子再生(酶偶聯(lián))葡萄糖脫氫酶可以用于輔因子再生。酶是可商購(gòu)的(例如Jülich FineChemicals，貨號(hào)22.10或19.10)。下面，使用枯草桿菌(Bacillus subtilis)葡萄糖脫氫酶基因(GenBank Acc.No.M12276)并且將其克隆到大腸桿菌XL10Gold克隆中的Puc19質(zhì)粒中。將此構(gòu)建體稱作大腸桿菌LU11293。
制備下列培養(yǎng)基用于大腸桿菌LU11293的發(fā)酵
*鹽溶液2.1g CaCl2*2 H2O3.5g MgSO4*7 H2O14g NH4Cl14ml氨芐青霉素溶液(100mg/ml)溶解在500ml水中并且過(guò)濾滅菌。
在每種情形中，將150ml培養(yǎng)基在2個(gè)1升錐形瓶中滅菌并且用5ml無(wú)菌鹽溶液使其完全。在從LB氨芐青霉素瓊脂平板中接種后，將預(yù)培養(yǎng)物在37℃和200rpm(轉(zhuǎn)/分鐘)下孵育12小時(shí)并且添加到發(fā)酵培養(yǎng)基中。發(fā)酵開(kāi)始于37℃，內(nèi)部壓力0.1巴，pH7.0(用20％磷酸和25％NaOH調(diào)節(jié))，充氣速度為7.51/分鐘和300rpm(用10-20l/分鐘進(jìn)氣和500-1500rpm調(diào)節(jié)pO2在20和50％之間)。2小時(shí)后，添加0.1Mm IPTG用于誘導(dǎo)并且在總時(shí)間13小時(shí)后停止發(fā)酵。在收獲和洗滌細(xì)胞(1.3kg)后，將細(xì)胞儲(chǔ)存在-20℃直到使用(在反應(yīng)混合物中2-20g/l)。
將等摩爾量的葡萄糖和丁-2-酮與1-30U/ml葡萄糖脫氫酶粗提取物和1-30U/ml丙醇脫氫酶粗提取物混合。將0.02-1mmol/l NAD或NADP或者0.02-1mmol/l NADH或NADPH溶解在緩沖液中并且在10-60℃下溫育。通過(guò)自動(dòng)添加堿將pH維持在恒定水平。
實(shí)施例6用丙醇脫氫酶再生輔因子(底物偶聯(lián))還可以通過(guò)丙醇脫氫酶本身再生輔因子。在此情形中，不需要添加單獨(dú)的再生酶。丙醇脫氫酶接受多種一元醇作為還原劑。氧化它們成對(duì)應(yīng)的羰基化合物。適合于用丙醇脫氫酶再生NADH或NADPH的一元醇是異丙醇。
實(shí)施例7用甲酸脫氫酶再生輔因子(酶偶聯(lián))可以使用甲酸脫氫酶用于輔因子再生。酶可以商購(gòu)(例如Jülich FineChemicals貨號(hào)09.11、24.11或25.10)。與實(shí)施例5類似地，因此輔因子也可以用甲酸脫氫酶再生。這包括使用等摩爾量的甲酸和丁-2-酮與1-30U/ml甲酸脫氫酶粗提取物和1-30U/ml丙醇脫氫酶粗提取物。將0.02-1mmol/l NAD或NADP或者0.02-1mmol/l NADH或NADPH溶解在緩沖液中并且在10-60℃下溫育。通過(guò)自動(dòng)添加酸將pH維持在恒定水平。
實(shí)施例8使用大腸桿菌的重組丙醇脫氫酶制備(S)-丁-2-醇根據(jù)實(shí)施例2培養(yǎng)、收獲和破碎大腸桿菌LU12418。
將270g(1.5mol)的D-葡萄糖、135ml(1.5mol)的丁-2-酮、63ml的GDH粗提取物(≈30.5kU)、95ml的PDH粗提取物(≈20kU)和400mg(0.6mmol)的NAD或NADP或者NADH或NADPH溶解在KPi緩沖液(50mMKPi，1mM MgCl2，pH 6.5)中并且在30℃下溫育。反應(yīng)混合物起始體積是3升。通過(guò)自動(dòng)添加2MNaOH將pH維持在恒定水平。圖1描述了典型的反應(yīng)模式。
序列表序列表<110> 巴斯福股份公司<120> 制備旋光醇的方法<130> PF 56053<160> 2<170> PatentIn版本3.1<210> 1<211> 1041<212> DNA<213> 大腸桿菌(Escherichia coli)<220>
<221> CDS<222> (1)..(1041)<223>
<400> 1atg cag aac atc atc cga aaa gga gga act atg aag gct gca gtt gtt48Met Gln Asn Ile Ile Arg Lys Gly Gly Thr Met Lys Ala Ala Val Val1 5 10 15acg aag gat cat cat gtt gac gtt acg tat aaa aca ctg cgc tca ctg96Thr Lys Asp His His Val Asp Val Thr Tyr Lys Thr Leu Arg Ser Leu20 25 30aaa cat ggc gaa gcc ctg ctg aaa atg gag tgt tgt ggt gta tgt cat144Lys His Gly Glu Ala Leu Leu Lys Met Glu Cys Cys Gly Val Cys His35 40 45acc gat ctt cat gtt aag aat ggc gat ttt ggt gac aaa acc ggc gta192Thr Asp Leu His Val Lys Asn Gly Asp Phe Gly Asp Lys Thr Gly Val50 55 60att ctg ggc cat gaa ggc atc ggt gtg gtg gca gaa gtg ggt cca ggt240Ile Leu Gly His Glu Gly Ile Gly Val Val Ala Glu Val Gly Pro Gly65 70 75 80gtc acc tca tta aaa cca ggc gat cgt gcc agc gtg gcg tgg ttc tac288Val Thr Ser Leu Lys Pro Gly Asp Arg Ala Ser Val Ala Trp Phe Tyr85 90 95gaa gga tgc ggt cat tgc gaa tac tgt aac agt ggt aac gaa acg ctc336Glu Gly Cys Gly His Cys Glu Tyr Cys Asn Ser Gly Asn Glu Thr Leu100 105 110tgc cgt tca gtt aaa aat gcc gga tac agc gtt gat ggc ggg atg gcg384Cys Arg Ser Val Lys Asn Ala Gly Tyr Ser Val Asp Gly Gly Met Ala115 120 125gaa gag tgc atc gtg gtc gcc gat tac gcg gta aaa gtg cca gat ggt432Glu Glu Cys Ile Val Val Ala Asp Tyr Ala Val Lys Val Pro Asp Gly130 135 140ctg gac tcg gcg gcg gcc agc agc att acc tgt gcg gga gtc acc acc480Leu Asp Ser Ala Ala Ala Ser Ser Ile Thr Cys Ala Gly Val Thr Thr145 150 155 160tac aaa gcc gtt aag ctg tca aaa att cgt cca ggg cag tgg att gct528Tyr Lys Ala Val Lys Leu Ser Lys Ile Arg Pro Gly Gln Trp Ile Ala165 170 175
atc tac ggt ctt ggc ggt ctg ggt aac ctc gcc ctg caa tac gcg aag576Ile Tyr Gly Leu Gly Gly Leu Gly Asn Leu Ala Leu Gln Tyr Ala Lys180 185 190aat gtc ttt aac gcc aaa gtg atc gcc att gat gtc aat gat gag cag624Asn Val Phe Asn Ala Lys Val Ile Ala Ile Asp Val Asn Asp Glu Gln195 200 205tta aaa ctg gca acc gaa atg ggc gca gat tta gcg att aac tca cac672Leu Lys Leu Ala Thr Glu Met Gly Ala Asp Leu Ala Ile Asn Ser His210 215 220acc gaa gac gcc gcc aaa att gtg cag gag aaa act ggt ggc gct cac720Thr Glu Asp Ala Ala Lys Ile Val Gln Glu Lys Thr Gly Gly Ala His225 230 235 240gct gcg gtg gta aca gcg gta gct aaa gct gcg ttt aac tcg gca gtt768Ala Ala Val Val Thr Ala Val Ala Lys Ala Ala Phe Asn Ser Ala Val245 250 255gat gct gtc cgt gca ggc ggt cgt gtt gtg gct gtc ggt cta ccg ccg816Asp Ala Val Arg Ala Gly Gly Arg Val Val Ala Val Gly Leu Pro Pro260 265 270gag tct atg agc ctg gat atc cca cgt ctt gtg ctg gat ggt att gaa864Glu Ser Met Ser Leu Asp Ile Pro Arg Leu Val Leu Asp Gly Ile Glu275 280 285gtg gtc ggt tcg ctg gtc ggc acg cgc cag gat tta act gaa gcc ttc912Val Val Gly Ser Leu Val Gly Thr Arg Gln Asp Leu Thr Glu Ala Phe290 295 300cag ttt gcc gcc gaa ggt aaa gtg gtg ccg aaa gtc gcc ctg cgt ccg960Gln Phe Ala Ala Glu Gly Lys Val Val Pro Lys Val Ala Leu Arg Pro305 310 315 320tta gcg gac atc aac acc atc ttt act gag atg gaa gaa ggc aaa atc1008Leu Ala Asp Ile Asn Thr Ile Phe Thr Glu Met Glu Glu Gly Lys Ile325 330 335cgt ggc cgc atg gtg att gat ttc cgt cac taa1041Arg Gly Arg Met Val Ile Asp Phe Arg His340 345
<210> 2<211> 346<212> PRT<213> 大腸桿菌<400> 2Met Gln Asn Ile Ile Arg Lys Gly Gly Thr Met Lys Ala Ala Val Val1 5 10 15Thr Lys Asp His His Val Asp Val Thr Tyr Lys Thr Leu Arg Ser Leu20 25 30Lys His Gly Glu Ala Leu Leu Lys Met Glu Cys Cys Gly Val Cys His35 40 45Thr Asp Leu His Val Lys Asn Gly Asp Phe Gly Asp Lys Thr Gly Val50 55 60Ile Leu Gly His Glu Gly Ile Gly Val Val Ala Glu Val Gly Pro Gly65 70 75 80Val Thr Ser Leu Lys Pro Gly Asp Arg Ala Ser Val Ala Trp Phe Tyr85 90 95Glu Gly Cys Gly His Cys Glu Tyr Cys Asn Ser Gly Asn Glu Thr Leu100 105 110Cys Arg Ser Val Lys Asn Ala Gly Tyr Ser Val Asp Gly Gly Met Ala115 120 125
Glu Glu Cys Ile Val Val Ala Asp Tyr Ala Val Lys Val Pro Asp Gly130 135 140Leu Asp Ser Ala Ala Ala Ser Ser Ile Thr Cys Ala Gly Val Thr Thr145 150 155 160Tyr Lys Ala Val Lys Leu Ser Lys Ile Arg Pro Gly Gln Trp Ile Ala165 170 175Ile Tyr Gly Leu Gly Gly Leu Gly Asn Leu Ala Leu Gln Tyr Ala Lys180 185 190Asn Val Phe Asn Ala Lys Val Ile Ala Ile Asp Val Asn Asp Glu Gln195 200 205Leu Lys Leu Ala Thr Glu Met Gly Ala Asp Leu Ala Ile Asn Ser His210 215 220Thr Glu Asp Ala Ala Lys Ile Val Gln Glu Lys Thr Gly Gly Ala His225 230 235 240Ala Ala Val Val Thr Ala Val Ala Lys Ala Ala Phe Asn Ser Ala Val245 250 255Asp Ala Val Arg Ala Gly Gly Arg Val Val Ala Val Gly Leu Pro Pro260 265 270Glu Ser Met Ser Leu Asp Ile Pro Arg Leu Val Leu Asp Gly Ile Glu275 280 285Val Val Gly Ser Leu Val Gly Thr Arg Gln Asp Leu Thr Glu Ala Phe290 295 300
Gln Phe Ala Ala Glu Gly Lys Val Val Pro Lys Val Ala Leu Arg Pro305 310 315 320Leu Ala Asp Ile Asn Thr Ile Phe Thr Glu Met Glu Glu Gly Lys Ile325 330 335Arg Gly Arg Met Val Ile Asp Phe Arg His340 34權(quán)利要求
1.在醇脫氫酶存在下通過(guò)還原丁-2-酮制備(S)-丁-2-醇的方法，其中所述醇脫氫酶(i)具有多肽序列SEQ ID NO2，或(ii)具有與SEQ ID NO2的序列有至少80％同一性的多肽序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中使用NADH作為輔因子進(jìn)行還原。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中酶促再生所使用的輔因子。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中通過(guò)葡萄糖脫氫酶再生所述輔因子。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中在水性系統(tǒng)中進(jìn)行還原。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中醇脫氫酶以固定化形式存在。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所使用的醇脫氫酶在大腸桿菌中表達(dá)。
8.醇脫氫酶在通過(guò)還原丁-2-酮制備(S)-丁-2-醇的方法中的用途，其中所述醇脫氫酶(iii)具有SEQ ID NO2的多肽序列，或(iv)具有與SEQ ID NO2的序列有至少80％同一性的多肽序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及制備S－?。?－醇的酶方法；并且涉及用于進(jìn)行所述方法的酶；涉及編碼所述酶的核酸序列，涉及包含所述核酸序列的表達(dá)盒、載體和重組宿主。
文檔編號(hào)C12P41/00GK101056984SQ200580038467
公開(kāi)日2007年10月17日 申請(qǐng)日期2005年11月15日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月17日
發(fā)明者R·施蒂默爾, B·豪爾, D·德魯, M·布羅伊爾, H·施羅德 申請(qǐng)人:巴斯福股份公司