專利名稱：：植物木質(zhì)素含量的調(diào)控的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及通過操控木質(zhì)素生物合成途徑來進(jìn)行基因修飾的植物(尤其是樹木)，且更具體而言，本發(fā)明涉及通過下調(diào)4CL、C3H、CCR、C4H、Cald5H、SAD或CCoAOMT來進(jìn)行基因修飾的植物以實(shí)現(xiàn)改變木質(zhì)素含量。
背景技術(shù)：
：木質(zhì)素(一種復(fù)雜的酚類聚合物)是次生木質(zhì)部細(xì)胞壁中的主要組份。一般而言，木質(zhì)素占木頭(wood)干重的25%，此使其成為地球上繼纖維素之后第二豐富的有機(jī)化合物。盡管木質(zhì)素有利于維持莖的強(qiáng)度和剛度并可保護(hù)微原纖維免受物理、化學(xué)和生物攻擊，但其會(huì)妨礙將木頭轉(zhuǎn)化成紙的過程。為了釋放用于造紙用的木纖維，必須自經(jīng)過加工的木屑中去除大部分木質(zhì)素。自木纖維中提取木質(zhì)素是一個(gè)艱難且昂貴的過程，涉及有害的化學(xué)品并產(chǎn)生毒性廢物。因此，從業(yè)人員已經(jīng)在尋找更成本有效且對(duì)環(huán)境更友好的減少木制品中木質(zhì)素含量的方法。一個(gè)替代方案涉及對(duì)木質(zhì)素生物合成途徑進(jìn)行基因修飾。例如，Chiang等人己經(jīng)試圖通過對(duì)植物的木質(zhì)素單體生物合成途徑進(jìn)行基因修飾來減少植物中的木質(zhì)素含量。參見W002/20717。所述方法涉及用來自苯基丙烷途徑的多個(gè)基因轉(zhuǎn)化植物、在木質(zhì)素單體生物合成途徑中納入關(guān)鍵木質(zhì)素控制位點(diǎn)，例如酶4-香豆酸酯-CoA連接酶(4CL)、松柏醛5-羥化酶(Cald5H)、S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)依賴型5-羥基松柏醛、O-甲基轉(zhuǎn)移酶(AldOMT)、松柏醇脫氫酶(CAD)和關(guān)鍵醇脫氫酶(sinewyalcoholdehydrogenase,SAD)。同時(shí)，人們已經(jīng)試圖通過將這些基因的拷貝單獨(dú)地導(dǎo)入植物基因組中來減少木質(zhì)素含量。參見(例如)WO00/58489(Scald);WO99/24561(4CL)。從業(yè)人員還在反義策略中運(yùn)用這些基因來調(diào)節(jié)木質(zhì)素生物合成。參見(例如)WO99/24561。盡管這些方法中的某些方法已成功地下調(diào)了木質(zhì)素合成，但木質(zhì)素的下調(diào)可能會(huì)對(duì)植物表現(xiàn)型不利。Anterola等人，P/i;ytoc/iem!'^7,61:221-294(2002)。因此，需要用于調(diào)節(jié)木質(zhì)素表達(dá)的改進(jìn)方法。一種在mRNA水平使基因表達(dá)沉默的最新方法已經(jīng)作為先前技術(shù)的有效替代方案出現(xiàn)。RNA干擾現(xiàn)象(RNAi)是一個(gè)通過導(dǎo)入可導(dǎo)致基因以序列特異性方式沉默的雙鏈RNA(dsRNA)來引發(fā)的轉(zhuǎn)錄后過程。繼首先在線蟲(C.e/egaw)中發(fā)現(xiàn)RNA干擾現(xiàn)象(Fire等人，脂騰'391:806-811(1998)和美國專利第6,506,559號(hào))之后，人們發(fā)現(xiàn)了許多其中導(dǎo)入dsRNA可誘導(dǎo)序列特異性沉默效應(yīng)的生物體實(shí)例。例如，據(jù)報(bào)導(dǎo)，RNAi天然存在于各種生物體(如線蟲、錐體蟲、植物、真菌和動(dòng)物)中。實(shí)際上，RNAi最有可能用于保護(hù)生物體免受病毒侵襲，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)座子活性和消除異常轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。對(duì)果蠅黑腹果蠅(Drw叩MameZ朋ogay敏)的研究表明RNAi為兩步作用機(jī)制(Elbashir等人，Ge廳Z)ev.，15(2):188-200(2001))。首先，借助稱作切酶(Dicer)的酶將長的dsRNA切成21-23個(gè)核糖核苷酸(nt)片段，稱為小干擾RNA(siRNAs)。然后，siRNA與核糖核酸酶復(fù)合體(對(duì)于RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體稱為RISC)結(jié)合，此使這個(gè)復(fù)合體耙向互補(bǔ)mRNA。RISC隨后切割與互補(bǔ)siRNA相對(duì)的靶向mRNA，此使得所述mRNA對(duì)其它RNA降解途徑敏感。RNAi可為控制木質(zhì)素合成的先前方法提供替代方案。然而，在實(shí)現(xiàn)該可能性之前，必須研發(fā)可在木質(zhì)素合成過程中引發(fā)RNAi過程的DNA構(gòu)建體。
發(fā)明內(nèi)容在一個(gè)實(shí)施例中，提供用于調(diào)節(jié)木質(zhì)素相關(guān)基因的表達(dá)的DNA構(gòu)建體。在另一實(shí)施例中，提供調(diào)節(jié)植物中木質(zhì)素表達(dá)的方法。另外，還產(chǎn)生包含用于調(diào)節(jié)木質(zhì)素相關(guān)基因的表達(dá)的DNA構(gòu)建體的重組植物。在一個(gè)實(shí)施例中，DNA構(gòu)建體包含以可操作方式連接到第一段DNA片段的啟動(dòng)子，所述第一段DNA片段對(duì)應(yīng)于木質(zhì)素單體生物合成途徑中的基因的至少一部分；間隔區(qū)DNA片段；和與所述第一段DNA片段互補(bǔ)的第二段DNA片段，其中所述第一段和第二段DNA片段在所述DNA構(gòu)建體中分別沿5'至3'方向排列。在某些實(shí)施例中，木質(zhì)素單體生物合成途徑中的基因選自由4CL、C3H、CCR、C4H、Cald5H、SAD或CCoAOMT組成的群組。在另一實(shí)施例中，DNA構(gòu)建體包含以可操作方式連接到第一段DNA片段的啟動(dòng)子，所述第一段DNA片段對(duì)應(yīng)于4-香豆酸酯輔酶A連接酶(4CL)基因的至少一部分；間隔區(qū)DNA片段；和與所述第一段DNA片段互補(bǔ)的第二段DNA片段，其中所述第一段和第二段DNA片段在所述DNA構(gòu)建體中分別沿5'至3'方向排列。本發(fā)明還提供包括使用這些構(gòu)建體來調(diào)節(jié)、抑制和/或減少植物中木質(zhì)素的表達(dá)的方法。在又一實(shí)施例中，一種抑制植物細(xì)胞中木質(zhì)素表達(dá)的方法包括將沿5'至3'方向包括下列各部分的構(gòu)建體整合于所述植物細(xì)胞的基因組中啟動(dòng)子、對(duì)應(yīng)于4CL基因的至少一部分的第一段DNA片段、間隔區(qū)DNA片段和與所述第一段DNA片段互補(bǔ)的第二段DNA片段；及使所述植物細(xì)胞生長。本發(fā)明還提供通過這些方法產(chǎn)生的植物和植物細(xì)胞，以及源自所述植物和植物細(xì)胞的紙和木制品。本發(fā)明還提供源自這些轉(zhuǎn)基因植物的紙漿和紙漿制品。另一方面，本發(fā)明提供源自這些轉(zhuǎn)基因植物的實(shí)木制品。木制品包括(例如)木料、木材和復(fù)合材料。在再一實(shí)施例中，產(chǎn)生沿5'至3'方向包含下列各部分的植物細(xì)胞啟動(dòng)子、對(duì)應(yīng)于4CL基因的至少一部分的第一段DNA片段、間隔區(qū)DNA片段和與所述第一段DNA片段互補(bǔ)的第二段DNA片段。以可操作方式連接到第一段DNA片段的啟動(dòng)子對(duì)于植物細(xì)胞基因組而言可以是內(nèi)源的或外源的。在其它實(shí)施例中，產(chǎn)生其中所述第一段DNA片段對(duì)應(yīng)于C3H、C4H、CCR或CCoAOMT基因的至少一部分的植物細(xì)胞。在植物中，LIM蛋白質(zhì)己顯示可控制木質(zhì)素生物合成途徑中的許多對(duì)于研發(fā)木頭十分重要的基因(KawaokaA，EbinumaH2001TranscriptionalcontrolofligninbiosynthesisbytobaccoLIMprotein.P/jytoc/iem^^y57:1149-1157,Kawaoka等人，fVa/^/22:289-301(2000))。因此，在再一實(shí)施例中，產(chǎn)生沿5'至3'方向包含下列各部分的植物細(xì)胞啟動(dòng)子、對(duì)應(yīng)于LIM基因的至少一部分的第一段DNA片段、間隔區(qū)DNA片段及與所述第一段DNA片段互補(bǔ)的第二段DNA片段。在另一實(shí)施例中，一種制造木頭的方法包括將沿5'至3'方向包含下列各部分的DNA構(gòu)建體整合于植物細(xì)胞的基因組中啟動(dòng)子、對(duì)應(yīng)于木質(zhì)素單體生物合成途徑中的基因的至少一部分的第一段DNA片段、間隔區(qū)DNA片段和與所述第一段DNA片段互補(bǔ)的第二段DNA片段；使所述植物細(xì)胞生長及獲得所述木頭。另一方面，一種制造木漿的方法包括將沿5'至3'方向包含下列各部分的DNA構(gòu)建體整合于植物細(xì)胞的基因組中啟動(dòng)子、對(duì)應(yīng)于木質(zhì)素單體生物合成途徑中的基因的至少一部分的第一段DNA片段、間隔區(qū)DNA片段和與所述第一段DNA片段互補(bǔ)的第二段DNA片段；使所述植物細(xì)胞生長及獲得所述木漿。在另一實(shí)施例中，一種造紙方法包括將沿5'至3'方向包含下列各部分的DNA構(gòu)建體整合于植物細(xì)胞的基因組中啟動(dòng)子、對(duì)應(yīng)于木質(zhì)素單體生物合成途徑中的基因的至少一部分的第一段DNA片段、間隔區(qū)DNA片段和與所述第一段DNA片段互補(bǔ)的第二段DNA片段；使所述植物細(xì)胞生長及獲得所述紙。另一方面，一種DNA構(gòu)建體包含以可操作方式連接到第一段DNA片段的啟動(dòng)子，所述第一段DNA片段對(duì)應(yīng)于木質(zhì)素單體生物合成途徑中的基因的至少一部分；間隔區(qū)DNA片段；和與所述第一段DNA片段互補(bǔ)的第二段DNA片段，其中所述第一段和第二段DNA片段在所述DNA構(gòu)建體中分別沿5'至3'方向排列且木質(zhì)素單體生物合成途徑中的所述基因是4CL基因且其中所述DNA構(gòu)建體選自由pARB1202、pARB675和pARB599組成的群組。在另一實(shí)施例中，一種DNA構(gòu)建體包含以可操作方式連接到對(duì)應(yīng)于4CL基因的至少一部分的DNA片段上的啟動(dòng)子以便沿在反義方向生成所述DNA片段的轉(zhuǎn)錄本，其中所述DNA構(gòu)建體為pARB1201、pARB598、pARB411和pARB412。在另一實(shí)施例中，一種DNA構(gòu)建體包含以可操作方式連接到對(duì)應(yīng)于4CL基因的至少一部分的DNA片段上的啟動(dòng)子以便沿正義方向生成所述DNA片段的轉(zhuǎn)錄本，其中所述DNA構(gòu)建體為pARB368。在其它方面，一種DNA構(gòu)建體包含以可操作方式連接到對(duì)應(yīng)于CAld5H基因的至少一部分的DNA片段上的啟動(dòng)子，其中所述DNA構(gòu)建體選自由pARB1203、pARB1205、pARB675、pARB661、pARB662和pARB374組成的群組。在再一實(shí)施例中，一種DNA構(gòu)建體包含以可操作方式連接到對(duì)應(yīng)于SAD基因的至少一部分的DNA片段上的啟動(dòng)子，其中所述DNA構(gòu)建體選自由pARB486、pARB487和pARB488組成的群組。一方面，本發(fā)明提供抑制植物中木質(zhì)素表達(dá)的方法，其包括將包含如下啟動(dòng)子的DNA構(gòu)建體整合于所述植物的基因組中所述啟動(dòng)子以可操作方式連接到對(duì)應(yīng)于4CL基因的至少一部分的DNA片段上以便沿反義方向生成所述DNA片段的轉(zhuǎn)錄本。另一方面，抑制植物中木質(zhì)素表達(dá)的方法包括將包含如下啟動(dòng)子的DNA構(gòu)建體整合于所述植物的基因組中所述啟動(dòng)子以可操作方式連接到對(duì)應(yīng)于4CL基因的至少一部分的DNA片段上以便沿反義方向生成所述DNA片段的轉(zhuǎn)錄本。另外，或另一選擇為，所述方法可采用包含如下啟動(dòng)子的DNA構(gòu)建體所述啟動(dòng)子以可操作方式連接到對(duì)應(yīng)于CAW5H基因的至少一部分的DNA片段上。在其它方面，抑制植物中木質(zhì)素表達(dá)的方法涉及包含如下啟動(dòng)子的DNA構(gòu)建體:所述啟動(dòng)子以可操作方式連接到對(duì)應(yīng)于SAD基因的至少一部分的DNA片段上。本發(fā)明還提供通過這些方法產(chǎn)生的植物和植物細(xì)胞，以及源自所述植物和植物細(xì)胞的紙和木制品。本發(fā)明還提供源自這些轉(zhuǎn)基因植物的紙漿和紙漿制品。另一方面，本發(fā)明提供源自這些轉(zhuǎn)基因植物的實(shí)木制品。所述木制品包括(例如)木料、木材和復(fù)合材料。參照下列詳細(xì)說明可易知本發(fā)明的其它目的、特征和優(yōu)點(diǎn)。詳細(xì)說明和具體實(shí)例表示較佳實(shí)施例，但其僅出于說明目的，因此所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員自此詳細(xì)說明可易知屬于本發(fā)明精神和范圍內(nèi)的各種變化形式和修改形式。而且，所述實(shí)例闡明本發(fā)明的原理而不能夠期望這些實(shí)例具體闡明對(duì)于那些熟悉先前技術(shù)的人而言明顯有用的可應(yīng)用本發(fā)明的所有實(shí)例。圖1(A)(SEQIDNO:5、6、7、8、15、9和64，分別按照出現(xiàn)順序給出)及圖l(B)(SEQIDNO:16、17、10、11、12和13)提供用于制造某些本文所述DNA構(gòu)建體的引物和組份。圖2(A)(SEQIDNO:65、25和26分別按照出現(xiàn)順序給出)及圖2(B)(SEQIDNO:34和33)提供用于本文所述DNA構(gòu)建體的組份。圖3提供顯示所得轉(zhuǎn)基因桉樹高度的條形圖。圖4A提供顯示所得轉(zhuǎn)基因桉樹高度的條形圖，而圖4B圖示所述轉(zhuǎn)基因樹木的平均木質(zhì)素含量。圖5提供松樹4CL基因(SEQIDNO:66)的核酸序列。.圖6(A)(SEQIDNO:18、19、20和21，分別按照出現(xiàn)順序給出)及圖6(B)(SEQIDNO:22、23、24和48，分別按照出現(xiàn)順序給出)可鑒別若干松樹4CL片段的核酸序列。圖7提供本發(fā)明DNA構(gòu)建體的總體設(shè)計(jì)。圖8提供用于調(diào)節(jié)松樹中木質(zhì)素的若干4CLDNA構(gòu)建體的示意圖。圖9提供用于調(diào)節(jié)松樹中木質(zhì)素的若干4CLDNA構(gòu)建體的示意圖。圖10以圖形方式說明通過4CLRNAi構(gòu)建體調(diào)節(jié)木質(zhì)素水平。木質(zhì)素?cái)?shù)值是通過NMR測量的細(xì)胞壁材料中的木質(zhì)素百分比。圖11是桉樹4CL構(gòu)建體pARB345的質(zhì)粒圖。圖12是桉樹4CL構(gòu)建體pARB339的質(zhì)粒圖。圖13是桉樹4CL構(gòu)建體pARB341的質(zhì)粒圖。圖14提供火炬松試樣的質(zhì)譜。20000=對(duì)照；1268b=包含DNA構(gòu)建體pARB585的轉(zhuǎn)基因樹。圖15A是使用質(zhì)量范圍為m/z50-200的轉(zhuǎn)基因火炬松試樣所收集質(zhì)譜的PC1分值對(duì)PC2分值的散點(diǎn)圖。圖15B是突出顯示構(gòu)建體pWVC41和對(duì)照的聚集狀況的散點(diǎn)圖。圖16A是突出顯示構(gòu)建體pWVK154、pWVC40和對(duì)照的聚集狀況的散點(diǎn)圖。圖16B是突出顯示構(gòu)建體pWVK158、pWVC46和對(duì)照的聚集狀況的散點(diǎn)圖。圖17是來自圖16A中所選構(gòu)建體的火炬松試樣的質(zhì)譜。被賦予木質(zhì)素峰值的熱解片段在對(duì)照譜圖的上方示出。圖18是經(jīng)pWVK154轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因火炬松種系和未經(jīng)轉(zhuǎn)化對(duì)照種系的13CCP/MAS譜圖。所述譜圖表明轉(zhuǎn)基因種系與對(duì)照種系相比，芳族碳和甲氧基碳相對(duì)于碳水化合物區(qū)域減少(60-110ppm)。圖19是使用2種主要組份通過PLS模型完全交叉驗(yàn)證測定的PLS預(yù)計(jì)木質(zhì)素?cái)?shù)值和NMR測定木質(zhì)素?cái)?shù)值的散點(diǎn)圖。圖20提供木質(zhì)素構(gòu)建體pARB1201和pARB1203的質(zhì)粒圖。圖21提供木質(zhì)素構(gòu)建體pARB675和pARB598的質(zhì)粒圖。圖22提供木質(zhì)素構(gòu)建體pARB661和pARB662的質(zhì)粒圖。圖23提供木質(zhì)素構(gòu)建體pARB599的質(zhì)粒圖。圖24提供木質(zhì)素構(gòu)建體pARB1205和pARB1202的質(zhì)粒圖。圖25提供木質(zhì)素構(gòu)建體pARB368和pARB486的質(zhì)粒圖。圖26提供木質(zhì)素構(gòu)建體pARB487和pARB488的質(zhì)粒圖。圖27提供木質(zhì)素構(gòu)建體pARB411和pARB412的質(zhì)粒圖。圖28提供木質(zhì)素構(gòu)建體pARB374的質(zhì)粒圖。具體實(shí)施例方式在一個(gè)實(shí)施例中，DNA構(gòu)建體可用于抑制靶向基因的表達(dá)。本文所述構(gòu)建體和方法可用于各活體外或活體內(nèi)細(xì)胞中。一般而言，所述構(gòu)建體通過編碼雙鏈RNA(dsRNA)和引發(fā)RNA干擾(RNAi)來選擇性地抑制耙基因。在一較佳實(shí)施例中，所述DNA構(gòu)建體可用于減少植物中的木質(zhì)素含量。一方面，本發(fā)明提供一種用于調(diào)節(jié)植物的木質(zhì)素含量的DNA構(gòu)建體。在一個(gè)實(shí)施例中，一種DNA構(gòu)建體包括以可操作方式連接到第一段DNA片段的啟動(dòng)子，所述第一段DNA片段對(duì)應(yīng)于4-香豆酸酯輔酶A連接酶(4CL)基因的至少一部分；間隔區(qū)DNA片段；和與所述第一段DNA片段互補(bǔ)的第二段DNA片段，其中所述第一段和第二段DNA片段在所述DNA構(gòu)建體中分別沿5'至3'方向排列。因此，當(dāng)轉(zhuǎn)錄時(shí)，所述DNA構(gòu)建體產(chǎn)生包含下列各部分的RNA分子:對(duì)應(yīng)于4CL基因的至少一部分的第一段RNA片段、間隔區(qū)RNA片段和與所述第一段RNA片段互補(bǔ)的第二段RNA片段。包含C3H、C4H、CCoAOMT、松柏醛5-羥化酶(也稱作阿魏酸酯-5-羥化酶(F5H))和CCR的DNA片段的構(gòu)建體可以類似的方式作業(yè)。盡管不完全了解本發(fā)明的運(yùn)作機(jī)制且發(fā)明者并不希望將其發(fā)明限制于任何特定理論，但人們認(rèn)為所得RNA分子的第一段和第二段RNA片段可形成莖環(huán)。所述莖環(huán)的dsRNA可能會(huì)降解為長度約為21-23個(gè)核苷酸的小干擾RNA(siRNA)。隨后，siRNA與核糖核酸酶復(fù)合體(對(duì)于RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體稱為RISC)結(jié)合，此使這個(gè)復(fù)合體耙向互補(bǔ)mRNA。RISC然后切割與互補(bǔ)siRNA相對(duì)的靶向mRNA，此使得所述mRNA對(duì)其它RNA降解途徑敏感。在另一實(shí)施例中，DNA構(gòu)建體包含以可操作方式連接到對(duì)應(yīng)于4CL基因的至少一部分的DNA片段上的啟動(dòng)子以便沿反義方向生成所述DNA片段的轉(zhuǎn)錄本。在再一實(shí)施例中，DNA構(gòu)建體包含以可操作方式連接到對(duì)應(yīng)于4CL基因的至少一部分的DNA片段上的啟動(dòng)子以便沿正義方向生成所述DNA片段的轉(zhuǎn)錄本。在其它實(shí)施例中，DNA構(gòu)建體包含以可操作方式連接到對(duì)應(yīng)于CAW5H基因或SAD基因的至少一部分的DNA片段上的啟動(dòng)子。定義短語"靶基因"和"相關(guān)基因"在本文中可互換使用。如本文中所理解，靶基因用于指專用于調(diào)節(jié)或抑制的基因。耙向基因可包含或可不含調(diào)控元件，例如，轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)或增強(qiáng)子?？蛇x擇用于抑制的基因包括那些編碼結(jié)構(gòu)蛋白(例如，細(xì)胞壁蛋白)或調(diào)控蛋白(例如，轉(zhuǎn)錄因子和受體)的基因以及其它功能基因。而且，該術(shù)語不僅欲包括多肽的編碼區(qū)而且欲包括DNA中存在的內(nèi)含子、調(diào)控元件、啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止子。因此，"靶基因的至少一部分"意欲包括轉(zhuǎn)錄序列的至少一部分和/或啟動(dòng)子的至少一部分和/或相關(guān)基因終止子的至少一部分。本文所述DNA構(gòu)建體最基本地包括一個(gè)啟動(dòng)子、一或多個(gè)DNA片段和一個(gè)轉(zhuǎn)錄終止子。本文所用"DNA片段"意欲指包含至少若干個(gè)相鄰堿基的脫氧核糖核酸分子。對(duì)應(yīng)于耙基因的DNA片段的長度可為30個(gè)堿基對(duì)(bp)或更多，較佳為至少50bp且少于2000bp，且更佳為至少100bp且少于750bp。DNA片段可為單鏈或雙鏈。本發(fā)明上下文中的DNA片段可包括基因或cDNA或其一部分，或者其可包括啟動(dòng)子或調(diào)控元件或其一部分。術(shù)語"RNA片段"是指包含至少若干個(gè)相鄰堿基的核糖核酸分子。RNA片段可為編碼完整多肽的轉(zhuǎn)錄本(即，mRNA分子)或者其可為所述轉(zhuǎn)錄本的一部分。而且，RNA片段不需要編碼多肽或其任何部分，只要所述片段符合本文所定義RNA片段的品質(zhì)。例如，RNA片段可包括不編碼肽的內(nèi)含子、5'-UTR或3'-UTR。當(dāng)包含啟動(dòng)子、調(diào)控元件或非基因序列的DNA片段受到轉(zhuǎn)錄時(shí)，也可產(chǎn)生RNA片段。術(shù)語"間隔區(qū)"是指隔離2個(gè)DNA或RNA片段的一系列相鄰核苷酸。在一個(gè)實(shí)例中，"間隔區(qū)DNA片段"編碼隔離2個(gè)RNA片段的"間隔區(qū)RNA片段"。間隔區(qū)長度可在寬范圍內(nèi)變化，自10個(gè)堿基對(duì)(bp)至2000bp或更多。當(dāng)非常長的DNA互補(bǔ)片段被短間隔區(qū)隔離時(shí)，構(gòu)建體可能會(huì)不穩(wěn)定。因此，間隔區(qū)較佳應(yīng)為其所隔離片段長度的1/4至2倍。例如，如果存在長度為160bp的互補(bǔ)DNA片段，則二者之間的間隔區(qū)片段較佳可介于40至320bp之間。間隔區(qū)可編碼自轉(zhuǎn)錄本切除的內(nèi)含子，以使所得間隔區(qū)RNA遠(yuǎn)遠(yuǎn)短于轉(zhuǎn)錄本的互補(bǔ)DNA片段。"互補(bǔ)"RNA或DNA片段是彼此可以特異性方式結(jié)合的片段。較佳地，2個(gè)互補(bǔ)片段的序列彼此之間應(yīng)至少80%互補(bǔ)。更佳地，互補(bǔ)性應(yīng)為至少85%、卯％、95%、96%、97%、98%、99%或甚至是100%。彼此互補(bǔ)的DNA片段的長度可為30個(gè)堿基對(duì)(bp)或更長，較佳為至少50bp且少于2000bp且更佳為至少100bp且少于750bp。例如，95%互補(bǔ)性意指互補(bǔ)RNA或DNA片段的核苷酸將以精確的堿基對(duì)堿基的方式彼此結(jié)合，只是一個(gè)RNA或DNA片段對(duì)于另一互補(bǔ)RNA或DNA片段鏈的100個(gè)堿基可能含有至多5個(gè)點(diǎn)突變。點(diǎn)突變可為刪除堿基或取代堿基形式。而且，參考序列的這些突變可發(fā)生在一個(gè)互補(bǔ)核苷酸序列的5'或3'末端位置或兩個(gè)末端位置之間分別散布于參考序列中各核苷酸中或參考序列中一或多個(gè)相鄰基團(tuán)中的任何地方。事實(shí)上，可通過(例如)使用GAP計(jì)算機(jī)程序(6.0版，可自UniversityofWisconsinDeneticsComputerGro叩(UWGCG)獲得)對(duì)比序列信息來確定互補(bǔ)性百分比以及一致性。所述GAP程序利用Needleman和Wunsch比對(duì)方法(1970)。簡單來說，GAP程序?qū)⑾嗨菩远x為相似的被比對(duì)符號(hào)(即，核苷酸或氨基酸)數(shù)量除以兩個(gè)序列中較短一個(gè)序列中的總符號(hào)數(shù)量。GAP程序的較佳缺省參數(shù)包括(1)核苷酸的單元比較矩陣(含有表示一致性的數(shù)值1和表示不一致的數(shù)值0)，及Gribskov和Burgess加權(quán)比較矩陣(1986)，(2)對(duì)于每個(gè)空隙罰分為3.0且對(duì)于每個(gè)空隙中的每個(gè)符號(hào)額外罰分為0.10;和(3)對(duì)于末端空隙無罰分?；蛘?，可使用Bestfit程序(WisconsinSequenceAnalysisPackage,Version8forUnix,DeneticsComputerGroup,UniversityResearchPark,575ScienceDrive,Madison,Wis.53711)評(píng)定互補(bǔ)性百分比。Bestfit使用Smith和Waterman局部同源算法(AdvancesinAppliedMathematics2:482-489(1981))來搜尋兩個(gè)序列間最佳同源片段。當(dāng)使用Bestfit或任何其它序列比對(duì)程序來測定一具體序列是否有(例如)95%等同于本發(fā)明的參考序列時(shí)，當(dāng)然應(yīng)將參數(shù)設(shè)定為能計(jì)算全長參考核苷酸序列的一致性百分比并允許在參考序列中含有占核苷酸總數(shù)量至多5%的同源空隙。在對(duì)置DNA鏈上具有相似或相同序列的兩個(gè)DNA片段被稱作"反向重復(fù)序列"。通過具有反向DNA重復(fù)序列的區(qū)域轉(zhuǎn)錄可產(chǎn)生彼此"互補(bǔ)"的RNA片段。包含兩個(gè)互補(bǔ)的RNA片段的轉(zhuǎn)錄本可形成具有雙鏈區(qū)的單一RNA分子。所述雙鏈區(qū)有時(shí)被稱為"莖環(huán)"或"發(fā)夾結(jié)構(gòu)"。"轉(zhuǎn)錄終止子"意指編碼可造成RNA聚合酶停止或延遲轉(zhuǎn)錄的RNA轉(zhuǎn)錄本3'-末端的DNA片段。由于大多數(shù)真核mRNA在其3'-末端添加有poly(A)片段，因此大多數(shù)轉(zhuǎn)錄終止子可確定添加有腺苷殘基的一個(gè)或多個(gè)堿基。因此，轉(zhuǎn)錄終止子可包含編碼mRNA的3'-UTR的至少一部分的DNA，所述mRNA緊鄰且包括其中添加有poIy(A)尾的核苷酸。轉(zhuǎn)錄終止子還可包括緊隨聚腺苷酸化作用位點(diǎn)之后的DNA序列的至少一部分以便為轉(zhuǎn)錄停止位點(diǎn)提供更完整的DNA背景。轉(zhuǎn)錄終止子還包括可終止轉(zhuǎn)錄的片段，但不包括用于聚腺苷酸化作用的終止子，例如，組蛋白基因或核糖體RNA基因的轉(zhuǎn)錄終止子。本文所用DNA構(gòu)建體還包括載體。術(shù)語"載體"是指能夠在宿主細(xì)胞內(nèi)自動(dòng)復(fù)制的DNA分子。如那些所屬領(lǐng)域的人員所知，載體包括但不限于質(zhì)粒、粘粒、噬菌粒、病毒載體、噬菌體載體、酵母載體、哺乳動(dòng)物載體和諸如此類。通常，載體會(huì)包含編碼抗藥性標(biāo)記的基因，即胸苷激酶基因或補(bǔ)充營養(yǎng)缺陷體的基因。為了有助于選擇含有這些載體的宿主細(xì)胞純系，人們已將各種抗生素抗性基因并入載體中。例如，并入欲導(dǎo)入細(xì)菌宿主細(xì)胞的載體中的抗生素抗性基因包括但不限于對(duì)選自由下列組成群組的抗生素產(chǎn)生抗性的基因氨芐西林(ampicillin)、卡那霉素(kanamycin)、四環(huán)素、新霉素(neomycin)、G418、殺稻瘟菌素(blastocidin)S和氯霉素。用于補(bǔ)充營養(yǎng)缺陷體的基因是編碼可促進(jìn)宿主利用營養(yǎng)或功能組份(例如，嘌呤、嘧啶、氨基酸(例如，賴氨酸、色氨酸、組氨酸、白氨酸、半胱氨酸)或鞘脂)的酶或蛋白質(zhì)的基因。另外，載體還將包括用于特定宿主細(xì)胞的復(fù)制起點(diǎn)(復(fù)制子)。例如，各種原核復(fù)制子己為那些所屬領(lǐng)域的人員所熟知且其可用于引導(dǎo)原核宿主細(xì)胞中重組分子的自動(dòng)復(fù)制和維持。術(shù)語"以可操作方式連接"是指DNA的化學(xué)融合、連接或合成以便在對(duì)于擬轉(zhuǎn)錄成RNA片段的DNA序列適當(dāng)?shù)姆较蛏闲纬蓡?dòng)子-DNA序列組合?？赏ㄟ^啟動(dòng)子(可聯(lián)合其它調(diào)控元件)調(diào)控啟動(dòng)子-DNA序列的轉(zhuǎn)錄?；蛘撸刹煌ㄟ^啟動(dòng)子調(diào)控啟動(dòng)子-DNA片段的轉(zhuǎn)錄。在啟動(dòng)子-DNA序列組合的構(gòu)造中，通常較佳的情形是使啟動(dòng)子位于距DNA片段的初始密碼子上游一段距離處，所述距離和啟動(dòng)子與其在其自然背景中控制的片段之間的距離大致相同。然而，如此項(xiàng)技術(shù)所知，在不損失啟動(dòng)子功能的情況下，可允許所述距離有顯著變化。術(shù)語"啟動(dòng)子"指能夠結(jié)合RNA聚合酶以引發(fā)轉(zhuǎn)錄的天然或合成核苷酸序列。這些啟動(dòng)子為那些所屬領(lǐng)域的人員所熟知且其可包括細(xì)菌、病毒、真菌、植物、哺乳動(dòng)物或其它真核生物啟動(dòng)子，這些啟動(dòng)子的選擇取決于被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞或生物體。人們預(yù)計(jì)，當(dāng)所抑制構(gòu)建體在與靶基因相同的組織中轉(zhuǎn)錄時(shí)，靶基因沉默將是最有效的。盡管有證據(jù)表明可將沉默信號(hào)移位至植物的遠(yuǎn)端部分(例如，PalauquiandVaucheret,1998，PNAS95:9675-9680.)，但是某些細(xì)胞可能不能夠接受此信號(hào)。例如，病毒抑制構(gòu)建體并不能使生長芽尖端的GFP表達(dá)沉默(Dalmay等人，2000,PlantCell12:369-379)。為了使在許多類別細(xì)胞中表達(dá)的基因沉默，較佳采用具有至少中等強(qiáng)度的組成型啟動(dòng)子。可在植物中起作用的組成型啟動(dòng)子的實(shí)例是病毒啟動(dòng)子，例如CaMV或FiMV(Sanger等人，1990.PlantMol.Biol.14:433-443);細(xì)菌啟動(dòng)子，例如胭月旨氨酸合成酶(mw)或甘露氨酸合成酶(mw);或植物啟動(dòng)子，例如那些來自芥菜屬肌動(dòng)蛋白2或遏^"歪^W基因者(An等人，1996，PlantJ.10:107-121;Norris等人，1993,PlantMol.Biol.21:895-906)。使用組成型啟動(dòng)子來驅(qū)動(dòng)抑制構(gòu)建體還可使具有限制表達(dá)方式的靶基因沉默。然而，可能需要避免抑制構(gòu)建體的表達(dá)超出沉默表現(xiàn)型所需要的程度?？墒褂门c靶基因具有類似表達(dá)方式的抑制構(gòu)建體啟動(dòng)子。例如，如果計(jì)劃使表達(dá)木質(zhì)部的靶基因沉默，則可使用荷蘭芹4CL基因的啟動(dòng)子(Hauffe等人，1993,PlantJ.4:235-253)，或如果耙向分生組織特異性基因，則可使用阿拉伯芥/^OL/F^M啟動(dòng)子(Springer等人，1995，Science268:877-880)。在一個(gè)實(shí)施例中，啟動(dòng)子源自不同于被轉(zhuǎn)化物種的物種以避免相同啟動(dòng)子序列之間的相互作用。用于在真核細(xì)胞中表達(dá)的各種其它啟動(dòng)子己為此項(xiàng)技術(shù)所熟知，包括但不限于病毒或病毒樣基本啟動(dòng)子，如SV40晚期啟動(dòng)子和RSV啟動(dòng)子；及真菌或哺乳動(dòng)物細(xì)胞啟動(dòng)子(參見，例如Larsen等人，1995,NucleicAcidsRes.23:1223-1230;Donis等人，1993，BioTechniques15:786-787;Donda等人，1993，Mol.Cell.Endocrinol.90:R23-26;和Huper等人，1992,InVitroCellDev.Biol.28A:730-734)?？稍谡婧思?xì)胞中用于引導(dǎo)重組分子在真核宿主細(xì)胞中復(fù)制和維持的各種復(fù)制子(其為重組分子的一部分)已為那些所屬領(lǐng)域的人員所熟知。術(shù)語"調(diào)控元件"是指可影響DNA轉(zhuǎn)錄或mRNA轉(zhuǎn)譯的特異性或效率的核酸序列，包括但不限于轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)、增強(qiáng)子、和轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)譯引發(fā)和終止信號(hào)。增強(qiáng)子序列是指與附近DNA片段相比，以相對(duì)獨(dú)立于其位置和方向的方式呈現(xiàn)增加轉(zhuǎn)錄效率的DNA元件。因此，視DNA構(gòu)建體而定，增強(qiáng)子可位于特定DNA片段的上游或下游以增加轉(zhuǎn)錄效率?？墒褂么隧?xiàng)技術(shù)中已知的重組DNA方法將這些調(diào)控元件插入構(gòu)建體DNA序列中。其它調(diào)控元件包括但不限于RNA片段上的5'未轉(zhuǎn)譯區(qū)(5'UTR)以及RNA片段上的3'UTR(即，包括poly(A)尾)，其對(duì)于達(dá)成穩(wěn)定性及有效轉(zhuǎn)譯RNA片段或轉(zhuǎn)錄本而言是必需的。本文所用"盒"是一類包含啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄終止子和插入這二者之間的DNA片段的DNA構(gòu)建體。盒可用于在其中啟動(dòng)子處于激活狀態(tài)的宿主細(xì)胞或生物體中驅(qū)動(dòng)DNA或RNA片段的表達(dá)。術(shù)語"實(shí)質(zhì)序列一致性"描述兩個(gè)或更多個(gè)核苷酸序列的相關(guān)性。較佳地，所述序列彼此之間至少80%是相同的，如上文所計(jì)算。更佳地，所述一致性應(yīng)為至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或甚至100%。"約"將為所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所了解且在使用此詞語的上下文中具有一定程度的不同。如果使用此詞語的上下文中所使用的此詞語不為所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所了解，則"約"將意指特定詞語的至多±10%。討論本發(fā)明一方面提供用于調(diào)節(jié)植物中木質(zhì)素含量的DNA構(gòu)建體。在一個(gè)實(shí)施例中，一種DNA構(gòu)建體包含以可操作方式連接到第一段DNA片段的啟動(dòng)子，所述第一段DNA片段對(duì)應(yīng)于4-香豆酸酯輔酶A連接酶(4CL)基因的至少一部分；間隔區(qū)DNA片段；和與所述第一段DNA片段互補(bǔ)的第二段DNA片段，其中所述第一段和第二段DNA片段在所述DNA構(gòu)建體中分別沿5'至3'方向排列。組成型啟動(dòng)子，例如來自輻射松(P.radiata)的超級(jí)泛素(s叩erubiquitin)(美國專利第6,380,459號(hào)，其以引用的方式并入本文中)，可用于驅(qū)動(dòng)靶基因4CL或其它木質(zhì)素生物合成基因的表達(dá)。在另一實(shí)施例中，本發(fā)明的DNA構(gòu)建體包含特異性地引導(dǎo)木質(zhì)部表達(dá)的啟動(dòng)子。自火炬松(Ptoe&)的4CL基因上游區(qū)分離的啟動(dòng)子片段(美國專利第6,252,135號(hào)，其以引用的方式并入本文中)是一個(gè)顯示強(qiáng)木質(zhì)部優(yōu)選型表達(dá)的啟動(dòng)子的實(shí)例。本文所述實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明在本發(fā)明DNA構(gòu)建體中使用4CL啟動(dòng)子可有效地減少木質(zhì)素含量而不會(huì)對(duì)植物高度造成不利影響。本發(fā)明構(gòu)建體的第一段和第二段DNA片段可源自任何4CL基因。在一較佳實(shí)施例中，當(dāng)改變松樹或桉樹中的木質(zhì)素含量時(shí)，所述第一段和第二段DNA片段源自輻射松(松樹)的4CL基因(美國專利申請(qǐng)公開案第20030131373號(hào))或巨桉(五.的4CL基因(美國專利第6,410,718號(hào))。同樣地，本發(fā)明構(gòu)建體的第一段和第二段DNA片段可源自4CL基因的任何部分。例如，可使用約50bp、100bp、200bp、400bp、600bp或1000bp的片段。本文所示其它示范性長度包括189bp、327bp、334bp、373bp、389bp和668bp。在較佳實(shí)施例中，第一段DNA片段包括選自圖示于圖SEQIDNO18、19、20、21、22、23、24、33和48中的序列的片段。第一段DNA片段可源自4CL基因的正義鏈或反義鏈。由于第二段DNA片段與第一段DNA片段互補(bǔ)且因此源自反向鏈，因此第一段DNA片段的鏈選擇必然會(huì)影響第二段DNA片段的來源。如上文所述，間隔區(qū)DNA片段編碼用于隔離其它RNA片段的間隔區(qū)RNA片段。間隔區(qū)RNA片段在本發(fā)明中可充當(dāng)由本發(fā)明構(gòu)建體的DNA盒轉(zhuǎn)錄形成的莖環(huán)中的環(huán)。間隔區(qū)DNA片段可以是完全合成的或源自天然DNA序列。在一個(gè)實(shí)施例中，間隔區(qū)DNA片段是源自內(nèi)含子。示范性間隔區(qū)DNA片段如圖1所示?？墒褂么隧?xiàng)技術(shù)中熟知的設(shè)計(jì)用于操控核酸分子的方法和技術(shù)來分離先前鑒別的相關(guān)基因或其部分或啟動(dòng)子。例如，用于分離、純化和克隆核酸分子的方法以及闡述使用真核和原核宿主細(xì)胞及在其中表達(dá)核酸和蛋白質(zhì)的方法和技術(shù)由Sambrook等人闡述于MolecularCloning:ALaboratoryManual(第2版，ColdSpringHarbor,N.Y.，1989)禾卩CurrentProtocolsinMolecularBiology(FrederickM.Ausubel等人編寫，JohnWiley&Sons,Inc.,1987)中，其揭示內(nèi)容以引用的方式并入本文中?？蓪嚓P(guān)基因或啟動(dòng)子的至少一部分的DNA構(gòu)建體導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，如上文所述，所述宿主細(xì)胞可為個(gè)體細(xì)胞、培養(yǎng)中細(xì)胞、作為宿主生物體一部分的細(xì)胞、受精卵母細(xì)胞或配子體或胚細(xì)胞。術(shù)語"導(dǎo)入"是指此項(xiàng)技術(shù)中己知的用于將重組載體DNA傳遞到靶宿主細(xì)胞中的標(biāo)準(zhǔn)程序。這些程序包括(但不限于)轉(zhuǎn)染、感染、轉(zhuǎn)化、自然吸收、電穿孔、基因槍法和土壤桿菌法。土壤桿菌法已經(jīng)被成功地用于各種物種，包括楊樹(Leple，J.C等人，1992.PlantCellRep.11:137-141.)、桉樹(Tournier，V.等人，2003.TransgenicRes.12:403-411)和松樹(美國專利第6,518,485號(hào)(基因槍)和美國公開專利申請(qǐng)案第20020100083號(hào))。土壤桿菌法是用于成功地獲得轉(zhuǎn)基因火炬松、挪威云杉(Wenck，A.R.等人，1999.PlantMol.Biol.39:407-416.)、7乂稻(Hiei,Y.等人，1997.PlantMol.Biol.35:205-218,;Cheng,X.等人，1998.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.95:2767-2772.)、小麥(Cheng，M.等人，1997.PlantPhysiol.115:971-980.)和玉米(Ishida，Y.等人，1996.NatBiotechnol.14:745-750.)的再生植物的唯一公開方法。轉(zhuǎn)化法己經(jīng)被用于諸如大麥(Tingay，S.等人，1997.PlantJ.11:1369-1376.)、甘蔗(Arencibia,A.D.等人，1998.TransgenicResearch7:1陽10;Enriquez-Obregon,G.A.等人，1998.Plant206:20-27.)、香蕉(May,G.D.等人，1995.Bio/Technology13:486-492.)、石刁柏(A^^ragwc#'dnafc)(Ddbreil，B.等人，1993.PlantCellRep.12:129-132.)和早花百子蓮(Agapa"f/uwpraeco;c)(Suzuki,S.等人，2001.PlantSci.161:89-97.)等種系?？梢愿鞣N方式測量DNA構(gòu)建體在調(diào)節(jié)木質(zhì)素含量方面的效能。例如，可按照USDairyForageResearchCenter(Madison,Wisconsin)所用程序?qū)Σ缓崛∥锏哪ニ樵嚇舆M(jìn)行乙酰溴木質(zhì)素測定(Fukushima,R.S.和Hatfield,R.D.,丄Ag.FoodCAem.,49(7):3133(2001))。還可使用熱解分子束質(zhì)譜。所述方法包括在惰性氦氣氛中于50(TC下迅速加熱試樣(O.lg)。通過擴(kuò)展經(jīng)過一取樣孔繼而形成分子束直接對(duì)所生成的熱解產(chǎn)物實(shí)時(shí)取樣，此可提供快速試樣驟冷并可抑制試樣冷凝。所述質(zhì)譜儀提供所有取樣產(chǎn)物的通用檢測且分子束取樣可確保對(duì)來自初始分子的代表性產(chǎn)物進(jìn)行檢測(Magrini等人，5m^ranme加aZPo^riwz,116:255-268(2002))。在另一實(shí)例中，可使用核磁共振法(NMR)來分析木質(zhì)素結(jié)構(gòu)。NMR是一種通過測量核在磁場影響下所吸收的射頻電磁輻射來檢測分子的亞原子和結(jié)構(gòu)信息的分析方法。通常，IH和13C是采用Li，S.和K.Lundquist方法(A^&c/^Z/Paperie化arc/z■/.,3.191-195)來定性未衍生化木質(zhì)素的兩種主要核。木質(zhì)素水平的降低和可能伴隨的樹木CHO水平的增加對(duì)于紙漿工業(yè)可為經(jīng)濟(jì)的且環(huán)保的優(yōu)勢。減少枝條中的木質(zhì)素可減少制漿所需化學(xué)品且甚至可能減少漂白紙漿所需化學(xué)品的量。下列實(shí)例用于闡明本發(fā)明的各個(gè)實(shí)施例且不應(yīng)以任何方式將其詮釋為限制本發(fā)明的范圍。實(shí)例實(shí)例1.cDNA文庫的構(gòu)造為了鑒別輻射松和巨桉數(shù)據(jù)庫中的木質(zhì)素單體合成、木質(zhì)素單體運(yùn)輸和木質(zhì)素聚合候選基因，可對(duì)cDNA序列與公共結(jié)構(gòu)域序列進(jìn)行比較(通過SWISS-PROT/TrEMBLID)以針對(duì)松樹和桉樹數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜尋(通過重疊群(contig)確定無冗余，預(yù)計(jì)值<1.0e-2)。隨后獲得用于這些匹配物的重疊群一致DNA和蛋白質(zhì)序列并鑒別重復(fù)序列。然后使用蛋白質(zhì)序列進(jìn)行多序列比對(duì)。使用其余松樹和桉樹序列以及阿拉伯芥成員可產(chǎn)生蛋白質(zhì)比對(duì)。自該蛋白質(zhì)比對(duì)產(chǎn)生樹狀圖。通過引物步移法分析這些序列以提供一全長序列(最佳HT取自全長序列經(jīng)分析的重疊群)。還提取來自玉米、棉花、水稻和楊樹的公共結(jié)構(gòu)域木質(zhì)素單體合成、木質(zhì)素單體運(yùn)輸和木質(zhì)素聚合基因序列并與松樹和桉樹數(shù)據(jù)庫對(duì)比。完整引物步移的松樹和桉樹序列也與自身序列對(duì)比并取前500個(gè)匹配物。實(shí)施此舉以便可使用所述序列進(jìn)一步搜尋并通過使用阿拉伯芥超家族確保未遺漏松樹和桉樹數(shù)據(jù)庫中的任何數(shù)據(jù)。此搜尋找到在先前搜尋中未發(fā)現(xiàn)的另外4個(gè)序列。然后也將這些序列發(fā)送到經(jīng)引物步移的全長序列。在引物步移后去除少量的額外重復(fù)體之后，鑒別松樹和桉樹的引物步移木質(zhì)素單體合成、木質(zhì)素單體運(yùn)輸和木質(zhì)素聚合超家族成員。通過與ClustalX、對(duì)應(yīng)樹狀圖和MEME/MAST分析比對(duì)來確定這些序列的分類。為了鑒別cDNA文庫中部分cDNA序列5'或3'的額外序列，使用SMARTRACEcDNA擴(kuò)增套組(ClontechLaboratories,PaloAlto，Calif)對(duì)cDNA末端(RACE)進(jìn)行5'和3'快速擴(kuò)增。一般來說，所述方法具體包括如下步驟首先分離poly(A)mRNA，進(jìn)行第一鏈和第二鏈cDNA合成以生成雙鏈cDNA、鈍化cDNA末端且隨后將SMARTRACE銜接子連接至cDNA以形成經(jīng)銜接子連接的dscDNA文庫。基因特異性引物被設(shè)計(jì)為與銜接子特異性引物一起用于5'和3'RACE反應(yīng)。使用5'和3'RACE反應(yīng)，可獲得、排序和克隆5'和3'RACE片段。可重復(fù)此過程直至鑒別出全長基因的5'和3'末端。通過PCR使用對(duì)基因的5'和3'末端具有特異性的引物(通過末端對(duì)末端PCR)可產(chǎn)生全長cDNA。例如，為了擴(kuò)增第一鏈cDNA的基因的缺失5'區(qū)，自模板序列的反向鏈將引物從5'設(shè)計(jì)為3'且其來自模板序列的介于100-200bp之間的區(qū)域。成功的擴(kuò)增應(yīng)在模板的5'末端與PCR產(chǎn)物之間得到100bp的DNA序列重疊區(qū)。使用ConcertReagentProtocol(Invitrogen，Carlsbad,CA)及標(biāo)準(zhǔn)分離和提取程序自4種松樹組織(即，籽苗、木質(zhì)部、韌皮部和結(jié)構(gòu)根部)提取RNA。然后用Dnase、使用10U/微升DNaseI(RocheDiagnostics,Basel,Switzerland)處理所得RNA。對(duì)于100叱RNA，使用9pi10xDNase緩沖液(Invitrogen，Carlsbad,CA)、10piRocheDNaseI和90^不含Rnase的水。然后在室溫下將RNA培育15分鐘并加入1/10體積的25mMEDTA。使用RNeasy微型套組(Qiagen，Venlo，TheNetherlands)按照制造商的方案進(jìn)行RNA純化。為了合成cDNA，使用自木質(zhì)部、韌皮部、籽苗和根部提取的RNA且隨后按照制造商的方案使用SMARTRACEcDNA擴(kuò)增套組(ClontechLaboratoriesInc，PaloAlto,CA)。對(duì)于RACEPCR，組合來自4種組織的cDNA。通過混合等體積的來自木質(zhì)部、韌皮部、根部和籽苗組織的cDNA來形成用于PCR的主混合物。在96孔PCR平板中進(jìn)行PCR反應(yīng)，并將1ml引物從引物稀釋平板(10mM)移至對(duì)應(yīng)的孔位置。將49ml主混合物等份加至具有引物的PCR平板中。使用DeneAmp9700(AppliedBiosystems，F(xiàn)osterCity,CA)以下列參數(shù)開始熱循環(huán)94。C(5sec),72'C(3min)，5個(gè)循環(huán)；94°C(5sec)，70。C(10sec)，72。C(3min)，5個(gè)循環(huán);94。C(5sec)，68。C(10sec)，72°C(3min)，25個(gè)循環(huán)。按照標(biāo)準(zhǔn)程序使用瓊脂糖凝膠分離cDNA。通過按照制造商說明書使用Qiagen96-孔凝膠稀釋套組切除凝膠片段并自所述凝膠洗提凝膠片段。按照下列說明將PCR產(chǎn)物連接到96孔板中的pGEMTeasy(Promega,Madison,WI)過夜用水將60-80ngDNA、5pi2X快速連接緩沖液、0.5pipGEMTeasy載體、0.1^DNA連接酶補(bǔ)足至10^并培育過夜。按照標(biāo)準(zhǔn)程序?qū)⒚總€(gè)純系轉(zhuǎn)化到大腸桿菌(￡.中并從按照標(biāo)準(zhǔn)方案選取的12個(gè)純系提取DNA。使用l呢瓊脂糖凝膠來驗(yàn)證DNA提取和DNA品質(zhì)。通過限制酶消化、使用限制性內(nèi)切酶EcoRI和凝膠電泳并按照標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室程序測定各個(gè)純系中適當(dāng)尺寸插入體的存在。實(shí)例2.松樹4CL表達(dá)載體的構(gòu)造制備一系列包含來自火炬松4CL基因的至少一部分的重組構(gòu)建體并評(píng)定其減少植物中木質(zhì)素含量的能力。一般而言，每一DNA構(gòu)建體均包含以可操作方式連接到第一段DNA片段的啟動(dòng)子，所述第一段DNA片段對(duì)應(yīng)于4CL基因的至少一部分；間隔區(qū)DNA片段；和與所述第一段DNA片段互補(bǔ)的第二段DNA片段，其中所述第一段和第二段DNA片段在所述DNA構(gòu)建體中分別沿5'至3'方向排列。設(shè)計(jì)11種構(gòu)建體并使用輻射松4CL基因的不同片段(圖5)和不同啟動(dòng)子制備這些構(gòu)建體。構(gòu)建體的一般設(shè)計(jì)圖示于圖7至9中。使用超級(jí)泛素啟動(dòng)子(美國專利第6,380,459號(hào)，RanjanJPerera等人，Plant&AnimalGenomeVIIIConference(2000))作為組成型啟動(dòng)子，而使用來自火炬松的4CL啟動(dòng)子(美國專利第6,252,135號(hào))作為維管優(yōu)選型啟動(dòng)子。使用源自擬南芥YABBY基因(SEQIDNO:64)的內(nèi)含子(FosterTM等人，HamCWZ,14(7):1497-1508(2002))作為間隔區(qū)DNA片段。構(gòu)建體利用圖示于圖5中的來自輻射松的4CL基因部分。圖6A-6B提供所述構(gòu)建體中所用的4CLRNAi片段的核酸序列(A至H)(SEQIDNO:18-24和48)。通過向質(zhì)粒pBluescript(BRLGibcoLifeTechnologies,GaithersburgMD)的多克隆位點(diǎn)添加額外的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)來制備骨架載體。通過消化具有A^/和^f/的質(zhì)粒及使用Klenow禾BT4聚合酶(Invitrogen公司，CarlsbadCA)填充末端來破壞初始pBluescript載體中的7VW/和位點(diǎn)。通過平端連接來環(huán)化質(zhì)粒并隨后用限制性內(nèi)切酶和照M///消化以促進(jìn)連接子克隆。將含有額外限制酶切位點(diǎn)的連接子(在5'末端受到磷酸化)(在SEQIDNO:1和2中給出)一起退火并連接到經(jīng)EcoRI/Hindlll消化的pBluescript載體中。將來自輻射松超級(jí)泛素基因(美國專利第6,380,459號(hào))的3'UTR克隆到質(zhì)粒pBI-121中(Jefferson等人，服卵/6:3901-3907，1987)。首先，使用標(biāo)準(zhǔn)PCR技術(shù)及SEQIDNO:3和4中給出的引物來擴(kuò)增所述基因的3'UTR片段。這些引物含有額外的核苷酸以提供SW/限制酶切位點(diǎn)以供用于克隆到經(jīng)SW/消化的質(zhì)粒pBI-121中。然后，將含有nos終止子的3'UTR片段轉(zhuǎn)移至pBluescript質(zhì)粒中。借助PCR使用SEQIDNO:5和6中給出的引物擴(kuò)增pBI-121的3'UTR和nos終止子片段，用K;m/和Cto/切除并克隆到經(jīng)《;w///7Cto/消化的經(jīng)修飾pBluescript中。向此構(gòu)造物中添加具有內(nèi)含子的輻射松超級(jí)泛素啟動(dòng)子序列。首先，使用標(biāo)準(zhǔn)PCR技術(shù)及SEQIDNO:7和8的引物自美國專利第6,380,459號(hào)中鑒別的輻射松超級(jí)泛素序列擴(kuò)增啟動(dòng)子/內(nèi)含子序列。然后使用X^/和i^/限制酶消化將經(jīng)擴(kuò)增片段連接到基礎(chǔ)載體中。使用標(biāo)準(zhǔn)PCR技術(shù)及SEQIDNO:10和11的引物擴(kuò)增來自輻射松cDNA的輻射松4CL內(nèi)含子序列(SEQIDNO:9)，然后使用T-尾連接克隆到經(jīng)Xcm/消化的載體骨架中。為了自巨尾桉和輻射松分離和定性木質(zhì)素單體合成、木質(zhì)素單體運(yùn)輸和木質(zhì)素聚合樣基因，自植物組織提取總RNA(使用Chang等人的方案，PlantMol.Biol.Rep.11:113-116(1993))。自韌皮部(P)、形成層(C)、擴(kuò)展木質(zhì)部(XI)、及分化和木質(zhì)化木質(zhì)部(X2)獲得植物組織試樣。使用Poly(A)QuikmRNA分離套組(Stratagene，LaJolla,CA)或DynalBeadsOligo(dT)25(Dynal，Skogen，Norway)自總RNA制備物分離mRNA。通過逆轉(zhuǎn)錄酶合成、然后按照制造商的方案使用ZAPExpresscDNA合成套組(Stratagene)將所得cDNA純系插入LambdaZAP中來從經(jīng)純化mRNA構(gòu)造cDNA表達(dá)文庫。使用GigapackIIPackagingExtract(Stratagene)用來自5mL連接反應(yīng)物的等份試樣(1-5(A，取決于所述文庫)封裝所得cDNA。使用具有ExAssist輔助噬菌體(Stratagene)的XLOLR細(xì)胞(Stratagene)和XL1-BlueMRP'細(xì)胞來實(shí)施所述文庫的大塊切除。切除的噬菌粒用NZY肉湯(GibcoBRL,Ga池ersburg,MD)稀釋并鋪在含有X-gal和異丙基硫基-P-半乳糖苷(IPTG)的LB-卡那霉素瓊脂平板上。在平鋪及選擇用于DNA微量制備物的菌落中，99%含有適用于測序的插入體。在具有卡那霉素的NZY肉湯中培養(yǎng)陽性菌落并借助堿裂解方法和聚乙二醇(PEG)沉淀方法純化cDNA。使用1%瓊脂糖凝膠來篩選用于染色體污染的測序模板。使用TurboCatalyst800機(jī)器(PerkinElmer/AppliedBiosystemsDivision,FosterCity,CA)按照制造商的方案來制備染色引物序列。使用PerkinElmer/AppliedBiosystemsDivisionPrism377序列分析儀獲得陽性純系DNA序列。首先自5'末端且在某些情況下也可自3'末端對(duì)cDNA純系測序。對(duì)于某些純系，使用外切核酸酶III刪除分析(在pBK-CMV中產(chǎn)生一不同尺寸的亞純系文庫)或通過使用設(shè)計(jì)為相關(guān)基因鑒別區(qū)的基因特異性引物直接測序可獲得內(nèi)部序列。使用實(shí)例1中所述方法，自木質(zhì)部構(gòu)造輻射松cDNA表達(dá)文庫并進(jìn)行篩選。在PerkinElmer/AppliedBiosystemsDivisionPrism377序列分析儀上使用正向和反向引物獲得陽性純系DNA序列并將所測定序列與上述EMBL數(shù)據(jù)庫中的已知序列對(duì)比。根據(jù)與其它植物物種已知序列的相似性，將所分離DNA序列鑒別為編碼4CL(SEQIDNO:18-24和48)和咖啡?；鵆oA甲基轉(zhuǎn)移酶(SEQIDNO:44)。使用標(biāo)準(zhǔn)PCR技術(shù)和引物SEQIDNO:12和13擴(kuò)增來自輻射松4CLcDNA純系的片段。對(duì)所述引物進(jìn)行設(shè)計(jì)以向擴(kuò)增片段的兩個(gè)末端添加和CtoZ限制酶切位點(diǎn)。擴(kuò)增片段的核苷酸序列作為SEQIDNO:24提供。沿正義方向克隆輻射松4CL片段時(shí)，需使用限制酶/^/切割擴(kuò)增片段、使用Klenow平端化并將其克隆到位于平端化Cto/位點(diǎn)的骨架載體中。沿反義方向克隆輻射松4CL片段時(shí)，需使用Pw/消化擴(kuò)增片段并將其克隆到經(jīng)i^r/消化的骨架載體中。使用設(shè)計(jì)類似于上文那些用于Pr4CL和PDK內(nèi)含子序列者的引物擴(kuò)增yabby內(nèi)含子序列(Foster等人，2002,PlantCell.14(7):1497-1508)并將其克隆到上文所述的載體骨架中。使用設(shè)計(jì)類似于那些用于SEQIDNO:24者的引物擴(kuò)增6個(gè)額外的片段(SEQIDNO:18-23)，不同之處為將SEQIDNO:18的引物設(shè)計(jì)為向擴(kuò)增片段的兩個(gè)末端添加Sma/限制酶切位點(diǎn)；將SEQIDNO:19的引物設(shè)計(jì)為在擴(kuò)增片段的兩個(gè)末端添加fo^/和限制酶切位點(diǎn)；將SEQIDNO:22的引物設(shè)計(jì)為在擴(kuò)增片段的兩個(gè)末端添加Pw/限制酶切位點(diǎn)。將SEQIDNO:23的引物設(shè)計(jì)為向擴(kuò)增片段的一個(gè)末端添加SmoT限制酶切位點(diǎn)而向該擴(kuò)增片段的另一個(gè)末端添加5coi/和限制酶切位點(diǎn)。按照上文所述或通過使用所列舉限制酶沿正義和反義方向?qū)⑺?個(gè)片段克隆到骨架載體中。將含有啟動(dòng)子::正義片段::內(nèi)含子::反義片段::3'UTR::nos終止子構(gòu)建體的完整RNAi盒自如上文所述pBluescript質(zhì)粒移除并使用標(biāo)準(zhǔn)克隆技術(shù)將其克隆到雙元載體pART27或pART29(經(jīng)7VW/消化)中。.雙元載體pART29是經(jīng)修飾pART27載體(Gleave,/^a"fMo/.歷C塗1203-1207,1992)，其含有阿拉伯芥遍在蛋白3(UBQ3)啟動(dòng)子而非nos5'啟動(dòng)子且無lacZ序列。通過iVw/限制酶消化將含有啟動(dòng)子::正義片段::內(nèi)含子::反義片段::3'UTR::nos終止子構(gòu)建體的完整RNAi盒(SEQIDNO:14)自pBluescript質(zhì)粒移除并使用標(biāo)準(zhǔn)克隆技術(shù)將其克隆到雙元載體pART29(經(jīng)WW/消化)中以產(chǎn)生最終載體pARB513。通過下列來重新改造構(gòu)建體以供用于松樹移除Notl片段并將這些片段插入具有NotI位點(diǎn)以及組成型啟動(dòng)子表達(dá)GUS(以驗(yàn)證不使用PCR時(shí)的轉(zhuǎn)化)和可選標(biāo)記盒(其包含受阿拉伯芥UbqlO啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的叩tII)的基礎(chǔ)載體中。使用限制酶NotI自表l"被改造者"列中所列各載體移除啟動(dòng)子::4CLRNAi盒。使用限制酶NotI來線性化載體pWVR31并用SAP處理以防止其重退火到其原本狀態(tài)。將每一片段連接到Notl位點(diǎn)處的pWVR31以生成表1中所列載體。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>構(gòu)建體pWVK154、pWVK143、pWVC46和pWVC40由美國典型培養(yǎng)物保藏中心(P.O.Box1549，Manassas,Virginia,USA,20108)在2004年9月21日保存且分別給予ATCC登錄號(hào)PTA-6229、PTA-6228、PTA-6227和PTA-6226。通過分別將來自火炬松的4CL啟動(dòng)子(美國專利第6,252,135號(hào))和來自輻射松的超級(jí)泛素基因(美國專利第6,380,459號(hào))以及GUS(內(nèi)含子)基因(參考)克隆到載體pWVR31中來生成對(duì)照載體pWVC41和pWVK159。骨架載體pWVR5是其中35S啟動(dòng)子GUS序列被移除且NOS啟動(dòng)子被來自阿拉伯芥的UBQ10啟動(dòng)子(Sun，C.W&Callis,J(1997)PlantJ.,11:101-111)代替的pBI121載體(Clontechlaboratories,PaloAltoCA)。為了制備載體pWVR8，需擴(kuò)增肌動(dòng)蛋白II啟動(dòng)子(MEAGHER,/欣CytoZ，125:139-163(1991))并將其與GUS+內(nèi)含子基因一起克隆到pWVR5載體中(Ohta等人，PZa^CeW尸/zyWC,31:805-813(1990))。自載體pWVR8(阿拉伯芥肌動(dòng)蛋白II::GUSINT，UBQIO::NPTII)改造骨架載體pWVR31。通過PCR使用引物擴(kuò)增來自阿拉伯芥的UBQll啟動(dòng)子(NorrisSR等人，(1993)P^mrMW說'"21(5):895-906)且用此代替來自pWVR8的肌動(dòng)蛋白II啟動(dòng)子以制備載體pWVR31。另外，還可按照上文所述構(gòu)造表2中所列舉載體，但下列序列的至少一個(gè)會(huì)受到修飾啟動(dòng)子和/或雙元載體。為了將表2中所列舉的不同啟動(dòng)子克隆到最終載體中，需用Snial和Sstl限制酶和使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)消化輻射松超級(jí)泛素啟動(dòng)子內(nèi)含子載體，使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將此片段克隆至含有下列各部分的Bluescript載體中來自火炬松的4CL啟動(dòng)子、來自巨桉的COMT啟動(dòng)子或來自輻射松的LIM啟動(dòng)子?；鹁嫠?CL啟動(dòng)子(美國專利第6,252,135號(hào))、巨桉COMT啟動(dòng)子(美國專利第10/703,091號(hào))和輻射松LIM啟動(dòng)子(美國專利申請(qǐng)案第10/717,897號(hào))全部使用設(shè)計(jì)類似于那些用于擴(kuò)增具有上述內(nèi)含子的輻射松超級(jí)泛素啟動(dòng)子序列者的引物來擴(kuò)增且隨后將其連接到上述Bluescript基礎(chǔ)載體中。通過A^/限制酶消化自pBluescript質(zhì)粒移除含有啟動(dòng)子::正義片段::內(nèi)含子::反義片段::3'UTR::nos終止子構(gòu)建體的完整RNAi盒并使用標(biāo)準(zhǔn)克隆技術(shù)將其克隆至雙元載體pART29或pWVK147(經(jīng)A^/消化)中。pWVK147載體是其中35S啟動(dòng)子GUS序列被移除且NOS啟動(dòng)子被來自阿拉伯芥的UBQ10啟動(dòng)子代替(Sim，C.W&Callis，J(1997)尸to"〃.'11:101-111)以驅(qū)動(dòng)nptll基因的pBI121載體(Clontechlaboratories,PaloAltoCA)。通過添加連接于Apal和Kpnl位點(diǎn)的銜接子可向載體添加獨(dú)特的HpaI限制酶切位點(diǎn)。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>使用與那些上文所述者相同的方法構(gòu)造表3中所列舉載體，不同之處為使用標(biāo)準(zhǔn)PCR技術(shù)并使用引物SEQIDNO:16和17來擴(kuò)增PDK內(nèi)含子序歹ij(Wesley等人，/^w27:581-590,2001)(SEQIDNO:15)。對(duì)于每個(gè)構(gòu)建體，表達(dá)盒中的表達(dá)基因均是4CL片段G(SEQIDNO:24)。表3.<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>實(shí)例3.桉樹4CL表達(dá)載體的構(gòu)造按照上文所述制備一系列含有4CL基因的至少一部分的重組構(gòu)建體并評(píng)定其減少植物中木質(zhì)素含量的能力。一般而言，每一DNA構(gòu)建體包含以可操作方式連接到第一段DNA片段的啟動(dòng)子，所述第一段DNA片段對(duì)應(yīng)于來自巨桉的4CL基因的至少一部分(美國專利第6,410,718號(hào))；間隔區(qū)DNA片段；和與所述第一段DNA片段互補(bǔ)的第二段DNA片段，其中所述第一段和第二段DNA片段在所述DNA構(gòu)建體中分別沿5'至3'方向排列。首先使用不同片段長度的4CL基因和不同的啟動(dòng)子制備3種構(gòu)建體。參見表16。所述構(gòu)建體的一般設(shè)計(jì)圖示于圖7中。超級(jí)泛素啟動(dòng)子(美國專利第6,380,459號(hào)；RanjanJPerera等人，Plant&AnimalGenomeVIIIConference(2000))用作組成型啟動(dòng)子，而來自火炬松SEQIDNO:77中4CL基因的啟動(dòng)子用作維管優(yōu)選型啟動(dòng)子。來自阿拉伯芥(FosterTM等人，P/"加Ce,14(7):1497-1508(PlantCell))YABBY基因的內(nèi)含子用作間隔區(qū)DNA片段。圖2A和2B提供4CLRNAi200bp片段(SEQIDNO:33)和4CLRNAi600bp片段(SEQIDNO:34)的核酸序列。骨架載體的構(gòu)造如實(shí)例2中所述。使用標(biāo)準(zhǔn)PCR技術(shù)和SEQIDNO:25和26中給出的引物擴(kuò)增來自巨桉4CLcDNA纟屯系(美國專利第6，410，718號(hào))的片段。對(duì)引物進(jìn)行設(shè)計(jì)以向擴(kuò)增片段的兩個(gè)末端添加P^/及C/"/限制酶切位點(diǎn)。擴(kuò)增片段的核苷酸序列在SEQIDNO:27中給出。為了沿正義方向克隆4CL片段，需用限制酶Pw/切割擴(kuò)增片段并將其克隆到骨架載體中。為了沿反義方向克隆4CL片段，需用Ck/消化擴(kuò)增片段并將其克隆到骨架載體中。通過Ww/限制酶消化自pBluescript質(zhì)粒移除含有啟動(dòng)子::正義片段::內(nèi)含子::反義片段::3TJTR::nos終止子構(gòu)建體的完整RNAi盒(SEQIDNO:32)并將其克隆至如實(shí)例2所述的雙元載體pART29(經(jīng)A^/消化)中以產(chǎn)生最終載體pAB583。通過使用設(shè)計(jì)類似于那些以上實(shí)例的片段中所用者的引物擴(kuò)增另外4個(gè)片段(SeqIDNO:28-31)來構(gòu)造表4中所列舉的最終載體。將所有5個(gè)片段沿正義和反義方向克隆到如上所述的骨架載體中，然后將完整RNAi盒克隆到如上所述的pART29中。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>使用與那些上文所述者相同的方法構(gòu)造表5中所列舉的載體，不同之處為使用標(biāo)準(zhǔn)PCR技術(shù)用引物SEQIDNO:16和17來擴(kuò)增PDK內(nèi)含子序列(Wesley等人，Ptow27:581-590,2001)(SEQIDNO:15)。表5最終載體啟動(dòng)子沿正向和反向克隆的RNAi片段用作間隔區(qū)的內(nèi)含子pARB578超級(jí)泛素(SEQIDNO:76)Euc.4CL200bp(SEQEDNO:27)SEQIDNO:15pARB579超級(jí)泛素(SEQIDNO:76)Euc.4CX223bp(SEQIDNO:28)SEQIDNO:15pARB580超級(jí)泛素(SEQIDNO:76)Euc.4CL300bp(SEQIDNO:29)SEQIDNO:15pARB581超級(jí)泛素(SEQEDNO:76)Euc.4CL336bp(SEQEDNO:30)SEQIDNO:15pARB582超級(jí)泛素(SEQIDNO:76)Euc.4CL500bp(SEQIDNO:31)SEQEDNO:15按照實(shí)例2中所述構(gòu)造表6中所列舉載體，其中有下列變化。使用設(shè)計(jì)類似于那些用于Pr4CL和PDK內(nèi)含子序列者的引物來擴(kuò)增yabby內(nèi)含子序列(Foster等人,2002,PlantCell.14(7):1497-1508)并將其克隆到如實(shí)例2所述的載體骨架中。使用設(shè)計(jì)類似于那些以上實(shí)例中片段SEQIDNO:27-31所用者的引物來擴(kuò)增片段插入體SEQEDNO:33和34。在下表6中指定處按照實(shí)例2中所述用火炬松4CL啟動(dòng)子替代來自輻射松超級(jí)泛素啟動(dòng)子+內(nèi)含子的啟動(dòng)子。將所列舉片段插入體和啟動(dòng)子克隆到如以上實(shí)例2中所述的最終載體中，然后將完整RNAi盒克隆到pART27中。yabby內(nèi)含子(SEQIDNO:64)在每一構(gòu)建體中均用作間隔區(qū)。表6最終載體驅(qū)動(dòng)RNAi盒的啟動(dòng)子在yabby內(nèi)含子間隔區(qū)周圍沿正向和反向克隆的RNAi片段pARB339輻射松超級(jí)泛素+內(nèi)含子(SEQIDNO:76)Euc.4CL200(SEQIDNO:33)pARB341輻射松超級(jí)泛素+內(nèi)含子(SEQIDNO:76)Euc.4CL600(SEQIDNO:34)pARB345火炬松4CL(SEQIDNO:77)Euc.4CL200(SEQIDNO:33)pARB347火炬松4CL(SEQIDNO:77)Euc.4CL600(SEQIDNO:34)通過iV^/限制酶消化自上文所列舉pARB345(SEQIDNO:89)最終載體移除包含啟動(dòng)子::正義片段::內(nèi)含子::反義片段::3'UTR::nos終止子構(gòu)建體的完整RNAi盒及使用標(biāo)準(zhǔn)克隆技術(shù)將其克隆至雙元載體pARB1002或pARB1005(經(jīng)NotI消化)中來構(gòu)造表7中所列舉的最終載體。表7<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>類似地，通過自pARB599刪除開花基因來產(chǎn)生載體pARB1202。這樣，pARB1202就包括含有下列各部分的RNAi盒火炬松4CL啟動(dòng)子(SEQIDNO:77)、正義Euc.4CL200bp片段(SEQIDNO:33)、yabby內(nèi)含子(SEQIDNO:64)和反義Euc.4CL200bp片段(SEQIDNO:33)。pARB1202的示意圖提供于圖24中。為了調(diào)節(jié)桉樹植物中木質(zhì)素含量，可使用包含啟動(dòng)子、第一段DNA片段和內(nèi)含子的各種組合的構(gòu)建體。利用從備選構(gòu)建體中選擇的構(gòu)建體，從業(yè)人員可獲得具有期望數(shù)量的木質(zhì)素含量和生長的植物。在此方面，美國專利公開案第20040146904號(hào)和第20040163146號(hào)揭示多種維管優(yōu)選型啟動(dòng)子且這些案件的全文均以引用的方式并入本文中。表8提供了可用于此方面的各種構(gòu)建體。表8<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>構(gòu)建體pARB339、pARB345和pARB599由美國典型培養(yǎng)物保藏中心(P.O.Box1549,Manassas,Virginia,USA,20108)在2004年9月21日保存且分別給予其ATCC登錄號(hào)PTA-6222、PTA-6223和PTA-6225。實(shí)例4:分離下列巨桉cDNA:CCoAOMT、C3H、C4H和CCR構(gòu)造兩個(gè)巨桉cDNA表達(dá)文庫(一個(gè)來自單一樹木各種組織的混合物且一個(gè)來自單一樹木的樹葉)并按照下列篩選。使用Chang等人的方案(i^aWMo/ecwZarAWogy尺eiwrter11:113-116，1993)自植物組織提取mRNA，其中有少許變動(dòng)。具體而言，將試樣溶于CPC-RNAXB(100mMTris-Cl,pH8,0;25mMEDTA;2.0MNaCl;2%CTAB;2%PVP和0.05%Spermidine*3HC1)中并用氯仿異戊醇(24:1)提取。用乙醇沉淀mRNA并使用Poly(A)QuikmRNA分離套組(Stratagene，LaJolla，CA)純化全部RNA制備物。通過反向轉(zhuǎn)錄酶合成并隨后按照制造商的方案使用ZAPExpresscDNA合成套組(Stratagene)將所得cDNA純系插入LambdaZAP中來從經(jīng)純化m認(rèn)A構(gòu)造cDNA表達(dá)文庫。使用GigapackIIPackagingExtract(Stratagene)并用1^試樣DNA(來自5fil連接混合物)封裝所得cDNA。使用XL1-BlueMRF細(xì)胞和XLOLR細(xì)胞(Stratagene)用ExAssist輔助噬菌體(Stratagene)對(duì)所述文庫進(jìn)行大塊切除。切除的噬菌粒用NZY肉湯(GibcoBRL，Gaithersburg，MD)稀釋并鋪在含有X-gal和異丙基硫基-P-半乳糖苷(IPTG)的LB-卡那霉素瓊脂平板上。在平鋪和選擇用于DNAminiprep的菌落中，99%含有適用于測序的插入體。在具有卡那霉素的NZY肉湯中培養(yǎng)陽性菌落并借助堿裂解方法和聚乙二醇(PEG)沉淀方法純化cDNA。使用1%瓊脂糖凝膠來篩選用于染色體污染的測序模板。使用TurboCatalyst800機(jī)器(PerkinElmer/AppliedBiosystems，F(xiàn)osterCity,CA)按照制造商的方案制備染色引物序列。使用PerkinElmer/AppliedBiosystemsPrism377序列分析儀獲得陽性純系的DNA序列。首先自5'末端且在某些情況下也可自3'末端對(duì)cDNA純系測序。對(duì)于某些純系而言，使用亞克隆片段獲得內(nèi)部序列。通過使用限制酶圖譜的標(biāo)準(zhǔn)程序并亞克隆到pBluescriptIISK+載體來實(shí)施亞克隆。使用2.0.4版FASTA算法(1996年2月)(可在因特網(wǎng)上于ftp站點(diǎn)ftp:〃ftp.virginia.edu/pub/fasta/獲得)或BLASTN算法(2.0.4版[1998年2月24日]或2.0.6版[1998年9月16日])比較所測定cDNA序列與EMBL數(shù)據(jù)庫(1996年3月46版)中的已知序列。使用冗余序列的多次比對(duì)來構(gòu)建可靠的一致序列。根據(jù)與其它植物種系已知序列的相似性，將本發(fā)明的分離聚核苷酸鑒別為編碼特定酶。使用上文所述程序分離編碼下列多肽的源自巨桉文庫的cDNA序列咖啡?；鵆oA甲基轉(zhuǎn)移酶(美國專利第6,410,718號(hào))、肉桂酸酯-4-羥化酶(C4H)(美國專利第6,410,718號(hào))、p-香豆酸酯-3-羥化酶(C3H)(美國專利第5，981，837號(hào))禾卩CCR(美國專利第6,410,718號(hào))。實(shí)例5.輻射松LIM表達(dá)載體的構(gòu)造按照實(shí)例2中所述構(gòu)造表9中所列舉的最終載體，其中有下列變動(dòng)使用不同的片段、啟動(dòng)子和/或內(nèi)含子。使用標(biāo)準(zhǔn)PCR技術(shù)和設(shè)計(jì)類似于那些實(shí)例2中所用者的引物擴(kuò)增來自輻射松LIMcDNA純系(專利申請(qǐng)案第WO00/53724號(hào))的兩個(gè)片段(SEQIDNO:38和39)。按照實(shí)例2中所述沿正義和反義方向?qū)⑤椛渌蒐IM片段克隆到骨架載體中。通過以類似于實(shí)例2中所述的方式改變啟動(dòng)子來構(gòu)造表9中最終載體，其含有不同于骨架載體中所含啟動(dòng)子的啟動(dòng)子。使用實(shí)例2中所述方法將yabby內(nèi)含子(SEQIDNO:64)插入最終載體中。將完整RNAi盒克隆到pART27或pART29中，如實(shí)例1和2中所述。表9.<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>為了在松樹中使用基于pART27的載體，必須重新改造構(gòu)建體以移除所選盒nos::叩tll。如實(shí)例2中所述，可移除Notl片段并將其插入具有Notl位點(diǎn)以及組成型啟動(dòng)子表達(dá)GUS(以檢驗(yàn)不使用PCR時(shí)的轉(zhuǎn)化)和可選標(biāo)記盒(其包含受阿拉伯芥UbqlO啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的叩tll)的基礎(chǔ)載體中。載體pWVR31可用作新基礎(chǔ)載體。實(shí)例6.巨桉LIM表達(dá)載體的構(gòu)造按照實(shí)例2中所述構(gòu)造骨架質(zhì)粒。使用標(biāo)準(zhǔn)PCR技術(shù)和被設(shè)計(jì)為可向擴(kuò)增片段的兩個(gè)末端添加和Wa/限制酶切位點(diǎn)的引物擴(kuò)增來自巨桉LIMcDNA純系(專利申請(qǐng)案第WO00/53724號(hào))的兩個(gè)片段(SEQIDNO:40和41)。沿正義方向克隆LIM片段時(shí)，使用限制酶Ecoi/和XkJ切割擴(kuò)增片段、使用Klenow進(jìn)行平端化并將其克隆至在平端化CZa/位點(diǎn)含有yabby內(nèi)含子和輻射松超級(jí)泛素啟動(dòng)子序列(實(shí)例2中所述)的骨架載體中。沿反義方向克隆LIM片段時(shí)，使用限制酶Ea^/和處a/切割擴(kuò)增片段、使用Klenow進(jìn)行平端化并使用標(biāo)準(zhǔn)克隆技術(shù)將其克隆到位于平端化Pstl位點(diǎn)的相同骨架載體中。通過iV^/限制酶消化自骨架載體移除含有啟動(dòng)子::正義片段::內(nèi)含子::反義片段::3'UTR::nos終止子構(gòu)建體的完整RNAi盒并使用標(biāo)準(zhǔn)克隆技術(shù)將其克隆到雙元載體pART29(經(jīng)NotI消化)中。為了獲得表10所列的含有不同啟動(dòng)子的最終載體，需使用實(shí)例2中所述方法取代所述啟動(dòng)子序列。使用此方法構(gòu)造表10中所列舉載體。<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>實(shí)例7.松樹CCoAOMT表達(dá)載體的構(gòu)造按照實(shí)例2中所述克隆下列載體，其中變動(dòng)之處是使用設(shè)計(jì)類似于那些實(shí)例2中所用者并用于實(shí)例2中所述方法中的引物來擴(kuò)增來自松樹CCo-OMT(咖啡?；?輔酶O-甲基轉(zhuǎn)移酶)(SEQIDNO:42)的片段。還可使用實(shí)例2中所述方法通過添加yabby內(nèi)含子和使用pART27雙元載體來修飾最終載體。<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>為了在松樹中使用所述載體，必須重新改造構(gòu)建體以移除所選盒nos::nptll。如實(shí)例2中所述，可移除Notl片段并將其插入具有Notl位點(diǎn)以及組成型啟動(dòng)子表達(dá)GUS(以檢驗(yàn)不使用PCR時(shí)的轉(zhuǎn)化)和可選標(biāo)記盒(其包含受阿拉伯芥Ubql0啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的nptll)的基礎(chǔ)載體中。載體pWVRH可用作新基礎(chǔ)載體。實(shí)例8.其它松樹CCoAOMT表達(dá)載體的構(gòu)造按照實(shí)例3中所述克隆下列載體，其中變動(dòng)之處是使用設(shè)計(jì)類似于那些實(shí)例4中所用者并用于實(shí)例4中所述方法中的引物擴(kuò)增來自松樹CCo-AOMT(咖啡?；?輔酶AO-甲基轉(zhuǎn)移酶)(SEQIDNO:43)的片段。還可借助上文所述方法通過添加PDK內(nèi)含子、使用具有內(nèi)含子的輻射松超級(jí)泛素啟動(dòng)子或火炬松4CL啟動(dòng)子和使用pWVK147雙元載體來修飾最終載體。<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>實(shí)例9.巨桉CCoAOMT表達(dá)載體的構(gòu)造按照實(shí)例3中所述克隆下列載體，其中變動(dòng)之處為使用設(shè)計(jì)類似于那些實(shí)例3中所用者并用于實(shí)例3中所述方法中的引物擴(kuò)增來自巨桉(￡.gramfc)CCoAOMT(咖啡酰基輔酶AO-甲基轉(zhuǎn)移酶)(SEQIDNO:44)純系的片段(在實(shí)例4中分離，其在W098/11205中作為部分序列提出)。還可借助實(shí)例3中所述方法通過添加PDK內(nèi)含子或桉樹木質(zhì)部內(nèi)含子、巨桉COMT485bp啟動(dòng)子(SEQIDNO:78))及使用pART29雙元載體來修飾最終載體。表13<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>按照實(shí)例3中所述克隆下列載體，其中變動(dòng)之處為使用設(shè)計(jì)類似于那些實(shí)例3中所用者并用于實(shí)例3中所述方法中的引物擴(kuò)增來自巨桉CCR(肉桂?；鵆oA還原酶)純系(SEQIDNO:45)(在實(shí)例4中分離)的片段。還可借助實(shí)例3中所述方法通過添加PDK內(nèi)含子或桉樹木質(zhì)部內(nèi)含子、巨桉COMT485bp啟動(dòng)子(SEQIDNO:78))、及使用pART29雙元載體來修飾最終載體。表14<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>按照實(shí)例3中所述克隆下列載體，其中變動(dòng)之處為使用設(shè)計(jì)類似于那些實(shí)例2中所用者并用于實(shí)例3中所述方法中的引物擴(kuò)增來自巨桉C3H純系(SEQIDNO:46)(在實(shí)例4中分離)或巨桉C4H純系(SEQIDNO:47)(在實(shí)例4中分離，其在WO00/22099中作為部分序列提出)的片段。來自巨桉的阿拉伯半乳聚糖啟動(dòng)子(SEQIDNO:35)或來自火炬松的4CL啟動(dòng)子(美國專利第6,252,135號(hào))用于這些載體。用^m///限制酶消化輻射松超級(jí)泛素啟動(dòng)子內(nèi)含子載體并使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將其克隆至含有火炬松4CL啟動(dòng)子(經(jīng)SamiZ/消化)或巨桉阿拉伯半乳聚糖啟動(dòng)子(經(jīng)0。/消化)的Bluescript載體中。使用設(shè)計(jì)類似于那些擴(kuò)增具有內(nèi)含子的輻射松超級(jí)泛素啟動(dòng)子序列所用者的引物來擴(kuò)增火炬松4CL啟動(dòng)子和巨桉阿拉伯半乳聚糖啟動(dòng)子且隨后將其連接到實(shí)例3中所述的Bluescript基礎(chǔ)載體中。還可借助實(shí)例3中所述方法通過添加Pr4CL內(nèi)含子和使用pARB1002雙元載體來修飾最終載體。表15.<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>使用下列程序?qū)?個(gè)含有兩個(gè)不同長度的RNAi片段的不同構(gòu)建體pARB339、pARB341禾卩pARB345(見表16)轉(zhuǎn)化到巨桉中。表16.<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>使用在伸長培養(yǎng)基(具有l(wèi)(iMBAP、20g/L蔗糖和7g/L瓊脂的MS)中微體繁殖培養(yǎng)的克隆巨桉葉片外植體進(jìn)行轉(zhuǎn)化。按照Burrel等人的國際公開案第WO00/12715號(hào)中所述進(jìn)行轉(zhuǎn)化，所述案件以引用的方式并入本文中。按照WO00/12715中所述選擇轉(zhuǎn)基因外植體，只是省略NAA且培養(yǎng)基含有50mg/L卡那霉素和250mg/L特美汀(timentin)。將外植體在此培養(yǎng)基上保留2周且隨后在2周后將其轉(zhuǎn)移至含有100mg/L卡那霉素和250mg/L特美汀的培養(yǎng)基且再過2周將其轉(zhuǎn)移至含有150mg/L卡那霉素和250mg/L特美汀的培養(yǎng)基。隨后按月將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至含有150mg/L卡那霉素和250mg/L特美汀的新鮮培養(yǎng)基中直至可收集到健康的單芽。將單芽置于伸長培養(yǎng)基上以增殖推定的轉(zhuǎn)基因組織。當(dāng)可自增殖組織收集約200mg組織時(shí)，自初始外植體移除此增殖組織以用于PCR分析。使用PuRe化《Ready-To-GoPCR珠粒(AmershamBiosciences)按照制造商的說明書進(jìn)行PCR分析以確定啟動(dòng)子和所選基因的存在。隨后進(jìn)一步用含有150mg/L卡那霉素和250mg/L特美汀的伸長培養(yǎng)基進(jìn)一步增殖具有陽性PCR結(jié)果的組織并將其保留為儲(chǔ)存培養(yǎng)物。為了產(chǎn)生用于進(jìn)一步測試的轉(zhuǎn)基因植物，將一些芽置于伸長培養(yǎng)基上。將芽保留在此培養(yǎng)基上直至其高約2-3cm。如果此需要l個(gè)月以上，則每隔一個(gè)月將芽置于新鮮的培養(yǎng)基上。當(dāng)芽高為2-3cm時(shí)，移除單芽并置于生根培養(yǎng)基中。在生根培養(yǎng)基中10天以后，將植物轉(zhuǎn)移至溫室中。那些熟悉植物轉(zhuǎn)化和植物組織培養(yǎng)的人員應(yīng)了解許多不同的培養(yǎng)基和間隔期可適于再生本發(fā)明植物。使植物在溫室中于盆栽混合物中生長6個(gè)月，使用適當(dāng)?shù)臐穸确桨负蜌⒄婢鷦┮钥刂普婢L。使植物在環(huán)境溫度及毛管水灌溉下生長于網(wǎng)格小室中。將植物栽培在5L塑料袋中補(bǔ)充有緩慢釋放肥料的以土壤-少量泥煤為主的堆肥中。以破壞性方式對(duì)約6個(gè)月期的植物取樣以進(jìn)行木質(zhì)素總量分析。髙度測量表17列舉使用卡那霉素選擇并在6個(gè)月后于土壤中存活的微體繁殖植物的百分比、在植入土壤中后第20周觀測的矮小植物百分比及在將經(jīng)pARB339、pARB341或pARB345轉(zhuǎn)化的桉樹植物植入土壤中后第22周觀測的植物平均高度。經(jīng)pARB341轉(zhuǎn)化的植物的存活數(shù)據(jù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于經(jīng)pARB339或pARB345轉(zhuǎn)化的植物的存活數(shù)據(jù)。在經(jīng)pARB341轉(zhuǎn)化并存活的全部植物中，有82%是矮小的，此表明DNA載體pARB341與其它兩種載體(pARB339和pARB345)相比可在更大程度上影響植物的高度和存活率。表17.<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>圖3和圖4A中所示數(shù)據(jù)表明每一構(gòu)建體對(duì)植物高度造成的明顯影響。盡管經(jīng)pARB345和pARB339轉(zhuǎn)化的每組植物中最高的植物個(gè)體是接近的(分別為159cm和168cm)，但最矮的pARB339植物(53cm，64cm)較最矮的pARB345植物(91cm，96cm)矮很多。此圖并不包含收集用于分析的矮小pARB341試樣的平均高度。矮小pARB341植物的平均高度為13cm。木質(zhì)素分析在約6個(gè)月時(shí)對(duì)按照以上實(shí)例中所述產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因桉樹取樣以用于木質(zhì)素分析。自所有待分析試樣收集底部20cm莖。通過剝離自所述莖移除樹皮、韌皮部和初生皮層且隨后在液氮中迅速冷凍所述莖試樣。按照制造商說明書在Flexi-Dry微處理器控制-耐腐蝕凍干機(jī)(StoneRidge,NewYork,USA)中對(duì)冷凍試樣實(shí)施冷凍干燥。在Wiley磨機(jī)(ArthurH.Thomas公司；Philadelphia,U.S.A)中研磨試樣且隨后在環(huán)式磨機(jī)中再次研磨。隨后將所研磨試樣在55。C下干燥最少1天并在此溫度下儲(chǔ)存直至使用。通過將所研磨材料懸浮于溶劑或溶液中、用超聲波凈化器提取、離心且隨后傾倒出上清液等一系列階段自試樣分離細(xì)胞壁材料。使用下列提取順序兩種濃度的NaCl、乙醇水溶液；CHCl3:MeOH;和丙酮。為了移除淀粉，洗滌所提取細(xì)胞壁材料，在叁-乙酸鹽緩沖液中加熱以使淀粉膠凝化且隨后用a-淀粉酶處理。在酶處理之后，離心所述懸浮液并用乙醇和丙酮洗滌所得沉淀，使其靜置過夜且隨后在55'C下干燥。所分離細(xì)胞材料用于使用Fukushima,R.S.和Hatfield,R.D.(2001)/Ag,FoodC/^m.49(7):3133-9中所述方案進(jìn)行的小規(guī)模木質(zhì)素測定。結(jié)果示于圖4A和圖4B中。pARB341中的RNAi盒使所有轉(zhuǎn)化植物中的矮小植物達(dá)82%。所收集的這些植物試樣顯示其將木質(zhì)素水平減少至約正常水平的80%。當(dāng)與另兩種被測試載體相比時(shí)，此載體對(duì)植物高度具有最大的影響且其對(duì)減少木質(zhì)素水平也有很大的影響。盡管木質(zhì)素減少等級(jí)的極端的特征是矮小表現(xiàn)型，但在此研究中受到鑒別的所有植物中的最低木質(zhì)素轉(zhuǎn)基因種系(transline)(pARB345轉(zhuǎn)基因種系)具有合理的正常高度。因此，在許多pARB341轉(zhuǎn)化體中見到的矮小現(xiàn)象可能是由基因(不包括在木質(zhì)化次生木質(zhì)部中表達(dá)的4CL基因，例如，在植物其它部分表達(dá)的4CL基因或與4CL具有部分同源性的基因)受到抑制而造成的單獨(dú)現(xiàn)象。pARB345中的RNAi盒與pARB339中的RNAi盒相比能更有效地產(chǎn)生木質(zhì)素明顯減少的表現(xiàn)型。pARB345中的200bpRNAi盒能夠使木質(zhì)素減少多達(dá)-25%也不會(huì)引發(fā)在許多轉(zhuǎn)化體中由600bpRNAi盒(其受pARB341中的相同啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng))產(chǎn)生的矮化效應(yīng)。自以上木質(zhì)素分析選擇經(jīng)pARB345轉(zhuǎn)化的9株植物并使用熱解分子束質(zhì)譜及通過用于方法對(duì)比的固態(tài)^CNMR對(duì)從第一試樣以上部位收獲的第二個(gè)20cm莖試樣進(jìn)行木質(zhì)素含量測定。所有3種方法給出近似相同的木質(zhì)素減少數(shù)值。實(shí)施熱解分子束質(zhì)譜時(shí)，在石英舟中稱重每一試樣并在由石英管(內(nèi)徑為2.5cm)構(gòu)成的反應(yīng)器中熱解所述試樣，其中氦以5L/min(在STP下)流過。以使分子束質(zhì)譜儀的采樣口位于所述石英反應(yīng)器末端內(nèi)部的方式放置反應(yīng)管。使用采用ExtrelTMTQMSC50型質(zhì)譜儀的分子束質(zhì)譜儀進(jìn)行熱解蒸氣分析，如Evans&Milne(1987)(Energy&Fuels,1:123-37)中所述。對(duì)所述反應(yīng)器進(jìn)行電加熱且將其溫度保持在550°C。盡管熱解反應(yīng)在不超過50秒內(nèi)完成，但總的熱解時(shí)間為90秒。據(jù)估計(jì)，熱解蒸氣在反應(yīng)器熱解區(qū)中的滯留時(shí)間為75ms且其足夠短以使得石英反應(yīng)器中的二次裂化反應(yīng)降至最低。用TekniventVector2tm數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)使用22eV電子碰撞電離電壓獲得介于20-450Da之間的質(zhì)譜數(shù)據(jù)。使用此系統(tǒng)，可同時(shí)并實(shí)時(shí)對(duì)輕氣體和重焦油取樣。熱解蒸氣的質(zhì)譜可提供分子片段的快速、半定量圖示。使用質(zhì)量范圍介于m/z50與200間的pyMBMS圖譜進(jìn)行的主要組份分析突出顯示來自木質(zhì)素和碳水化合物的熱解產(chǎn)物同時(shí)能最大程度地減少小熱解片段和電子撞擊片段(低于m/z50)和提取物(高于m/z200)。實(shí)施木質(zhì)素含量的NMR測定時(shí)，在4.7T及交叉極化(CP)和變角度旋轉(zhuǎn)(MAS)下于一BrukerAvance200MHz光譜儀中收集高分辨率、固態(tài)13CNMR質(zhì)譜。使用可變振幅交叉極化(整個(gè)交叉極化期間的線性斜坡為1db)來最小化在較高M(jìn)AS轉(zhuǎn)速下對(duì)Hartma皿-Hahn錯(cuò)配序列敏感的未質(zhì)子化芳族碳原子的變化(S.0Smith,LKustanovich,X.Wu，O.B.Peersen,JournalofMageneticResonance(1994)104:334-339)。在53.6kHz下匹配iH和"C域并在匹配期間將ldB斜坡施加于質(zhì)子r.f.。采集時(shí)間為0.033秒且掃頻寬度為31.3kHz。在7000Hz速率下，進(jìn)行變角度旋轉(zhuǎn)。使用2ms接觸時(shí)間和1.0秒脈沖重復(fù)率來平均2000-4000次掃描。在相對(duì)峰值強(qiáng)度方面觀測到的差異及積分面積可用于確定類似試樣間的差異。使用Haw等人1984(J.F.Haw.,G.E.Maciel.，H.A.Schroder,AnalyticalChemistry56:1323)的方法自芳香族(IIOppm-160ppm)區(qū)和碳水化合物(40ppm-100ppm)區(qū)的積分面積計(jì)算重量免木質(zhì)素?cái)?shù)值。.使用Unscrambler7.8版軟件程序(CAMOA/S，Trondheim，Norway)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。使用隱結(jié)構(gòu)投影(PLS-1)算法(其一次僅處理1個(gè)Y-變量)來構(gòu)造用于預(yù)測松樹試樣木質(zhì)素含量的模型。使用pyMBMS譜作為X-矩陣(310個(gè)變量(m/z值介于50與360之間))并使用通過固態(tài)NMR測量的木質(zhì)素?cái)?shù)值作為Y-矩陣來形成可預(yù)知木質(zhì)素含量的模型。在進(jìn)行分析之前，將質(zhì)譜歸一化為總離子電流。使用完全交叉驗(yàn)證進(jìn)行模型驗(yàn)證，其中自所述數(shù)據(jù)中系統(tǒng)地移除一個(gè)試樣，利用其余試樣建立模型且隨后使用此模型來預(yù)測自數(shù)據(jù)組移除的試樣的Y-變量數(shù)值。持續(xù)所述過程直至已經(jīng)移除并自Y-矩陣預(yù)測全部試樣。配合度(g卩，高相關(guān)系數(shù))和最小剩余誤差是用于選擇最佳模型的標(biāo)準(zhǔn)。自NMR木質(zhì)素?cái)?shù)值和pyMBMS譜來構(gòu)造可預(yù)測木質(zhì)素含量的PLS1模型。當(dāng)選取來自相同種系的1株以上樹木作為試樣來進(jìn)行NMR分析時(shí)，取各樹木對(duì)應(yīng)質(zhì)譜的平均值并使用其構(gòu)建模型。使用介于50至360間的m/z數(shù)值構(gòu)造PLS模型。此范圍是根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定的，以便基于完全交叉驗(yàn)證模型的相關(guān)系數(shù)提供最佳模型。表18顯示9個(gè)所選試樣的NMR結(jié)果的對(duì)比。NMRwt免木質(zhì)素?cái)?shù)值與所選試樣的PCI分值的對(duì)比顯示PCI分值可精確地反映火炬松試樣中的木質(zhì)素含量且PCI分值可用于評(píng)定不同構(gòu)造物的木質(zhì)素含量。在NMR測定的木質(zhì)素含量與如上文所述由乙酰溴測定的含量之間也有極佳的相關(guān)性。表18.<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>將使用均苯三酚/HCl測定松柏醛單元的木質(zhì)素組織化學(xué)測試應(yīng)用于取自含有本發(fā)明DNA構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因植物側(cè)枝的手切切片。均苯三酚(也稱作Weisner試劑)是一種木質(zhì)素染劑(Pomar等人，/VotopZa纖a，220(1-2):17-28(2002))且Maule染劑用于特定地檢測紫丁香基木質(zhì)素亞單位(Lewis等人，PZaWP/o^'o/AfW41:455-496(1990)。經(jīng)pARB339和pARB345轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物未顯示與對(duì)照未轉(zhuǎn)化植物的可觀測差異。正常高度的pARB341植物也不具有與對(duì)照植物的可觀測差異而矮小的pARB341植物具有降低的均苯三酚染色量，表明這些試樣中的木質(zhì)素水平大大地降低了。檢查矮小pARB341轉(zhuǎn)基因種系的染色切片，顯示在轉(zhuǎn)基因種系與轉(zhuǎn)基因種系之間存在不同。具有特別極端的解剖學(xué)表現(xiàn)型的一個(gè)矮小轉(zhuǎn)基因種系的兩個(gè)無性系分株在其外觀方面是高度一致的，表明所觀測到的木質(zhì)素沉積和解剖學(xué)的微擾具有(轉(zhuǎn))基因基礎(chǔ)。也使用Maule染劑對(duì)矮小和正常高度的pARB341植物的手切切片染色。此染劑是紫丁香基木質(zhì)素亞單元的特異性染劑(StrivastavaLM1966.Histochemicalstudiesonlignin.TappiJournal49:173-183)。如同經(jīng)均苯三酚染色的切片一樣，在矮小植物中觀測到的木質(zhì)素明顯少于"正常的"植物且矮小植物莖干中明顯缺乏維管分化。矮小pARB341植物由于具有粉色的木質(zhì)而在表現(xiàn)型上也不同于其高大對(duì)應(yīng)植物。這可在剝離莖干時(shí)觀測到。與高大植物相比，這些植物的莖干也較軟且有彈性。令人感興趣的是，當(dāng)剝?nèi)淦?、韌皮和初生皮層時(shí),具有高大/"正常"表現(xiàn)型的少數(shù)pARB345植物也具有粉色木質(zhì)。通過聚焦顯微鏡檢查來檢査兩個(gè)野生型試樣和10個(gè)轉(zhuǎn)基因試樣。所檢査的10個(gè)轉(zhuǎn)基因試樣包括5株pARB339植物，一株具有粉色木質(zhì)；2株矮小pARB341植物，均具有粉色木質(zhì)；和3株pARB345植物，其中2株具有粉色木質(zhì)。將2-3cm長的莖干片段固定在福爾馬林醋酸-酒精(FAA)中。在水中洗滌試樣并使用滑動(dòng)式切片機(jī)以30-60mm厚度切片。使用番紅和均苯三酚/HCl對(duì)切片進(jìn)行染色以供用于借助聚焦顯微鏡檢查進(jìn)行解剖學(xué)分析。一些試樣使用甲苯胺藍(lán)色染劑檢査。所有試樣均含有大量及不同數(shù)量的受拉木質(zhì)，其通常以綴塊形式僅存在于莖干的一側(cè)。其特征為具有或多或少未木質(zhì)化次生壁的極厚壁纖維。在所有試樣的受拉木質(zhì)中，木質(zhì)化程度的減少通過均苯三酚/HCl所染紅色的減少和經(jīng)番紅染色后綠色熒光的增加及通過使用甲苯胺藍(lán)色所染粉色來證實(shí)。為了自受拉木質(zhì)效應(yīng)辨別轉(zhuǎn)基因表現(xiàn)型，使用聚焦顯微鏡檢査法及番紅染色(且亦使用均苯三酚/HCl染色)對(duì)所有試樣中未顯示典型受拉木質(zhì)染色圖案的正常木質(zhì)莖干區(qū)進(jìn)行檢查。大多數(shù)試樣中的正常纖維或?qū)Ч芗?xì)胞壁組成沒有明顯改變的跡象。來自pARB341轉(zhuǎn)基因樹木的2個(gè)試樣顯示表明細(xì)胞壁組成發(fā)生變化的解剖學(xué)表現(xiàn)型導(dǎo)管直徑明顯減少且導(dǎo)管細(xì)胞壁呈現(xiàn)波浪形外觀。這些試樣中的至少一個(gè)還顯示了木質(zhì)部(木髓中的木質(zhì)化組織)外側(cè)的變化。然而，應(yīng)注意的是來自上文所鑒別的非矮小低木質(zhì)素試樣的試樣未顯示可通過聚焦顯微鏡檢査法測定的解剖學(xué)異常。結(jié)果表明本發(fā)明構(gòu)建體可導(dǎo)致出現(xiàn)生長高度、木質(zhì)素含量減少和解剖學(xué)表現(xiàn)型改變的各種組合。因此，所揭示方法能夠產(chǎn)生和選擇呈現(xiàn)最佳表現(xiàn)型組合的轉(zhuǎn)基因樹木以用于生產(chǎn)紙漿或其它木制品。實(shí)例13.對(duì)火炬松中4CL構(gòu)建體的評(píng)估使用PyMBMS評(píng)估木質(zhì)素火炬松(巧mwto^a)和雜交松樹(火炬松；c剛松)胚細(xì)胞系是使用美國專利第5,856,191號(hào)中所述方案自單獨(dú)不成熟雌配子的合子胚產(chǎn)生并使用美國專利第5,506,136號(hào)中闡述的方案保持。在維持培養(yǎng)基上培養(yǎng)l-3個(gè)月之后，凍存組織培養(yǎng)物，儲(chǔ)存長達(dá)數(shù)年時(shí)間并隨后使用美國專利第6,682,931號(hào)的方法復(fù)蘇。熟悉植物組織培養(yǎng)技術(shù)的人員應(yīng)了解，其它凍存和恢復(fù)方案均可應(yīng)用于本方法且不應(yīng)將此實(shí)例的詳細(xì)闡述詮釋為限制所述方法的應(yīng)用。通過按照美國專利第5,491,090號(hào)的方法用1g每種組織接種250mlNephdo帶側(cè)壁的燒瓶(KontesChemistryandLifeSciencesProducts)來建立來自每一種基因不同組織培養(yǎng)細(xì)胞系的均勻懸浮培養(yǎng)物。將含有存于液體培養(yǎng)基中的細(xì)胞的燒瓶置于處于23°C+2匸溫度的黑暗培養(yǎng)室中且以100rpm轉(zhuǎn)動(dòng)的旋轉(zhuǎn)振蕩器上。一周后，通過向培養(yǎng)燒瓶中注入15ml新鮮培養(yǎng)基使每個(gè)燒瓶中液體達(dá)35ml并旋動(dòng)以使細(xì)胞分布均勻。通過將細(xì)胞和培養(yǎng)基傾倒入燒瓶的側(cè)壁部分、使細(xì)胞沉降30分鐘并隨后測量沉降細(xì)胞體積(SCV)來測量細(xì)胞生長。當(dāng)SCV大于或等于最大SCV的一半(燒瓶體積的50%被植物細(xì)胞占據(jù))時(shí)，將各培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至總共含有80ml細(xì)胞和培養(yǎng)基的500ml帶側(cè)壁的燒瓶中并將轉(zhuǎn)移培養(yǎng)物保持在相同的條件下。準(zhǔn)備進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移時(shí)，通過高壓蒸汽滅菌對(duì)聚酯膜載體進(jìn)行滅菌并將其置于單獨(dú)的無菌布氏漏斗中，且對(duì)于每種細(xì)胞系的6個(gè)復(fù)制板中的每一個(gè)，將l-3毫升松樹胚性懸浮液移至各載體以便胚組織均勻地分布。自所述組織抽吸液體培養(yǎng)基并按照美國專利公開案第20020100083號(hào)中所述的方法將具有胚形成組織的各載體置于用于土壤桿菌培育的凝膠化準(zhǔn)備培養(yǎng)基上。具體而言，通過所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的技術(shù)將雙元構(gòu)建體pWVC60、pWVC62、pWVK158、pWVK154、pWVK157、pWVK155、pWVK143、pWVC46、pWVC40、pWVC43和pWVC44各自導(dǎo)入不同的根癌土壤桿菌(Agra^acfen'wm似me/adew)分離物中，且在通過常用技術(shù)施與乙酰丁香酮時(shí)引發(fā)毒性，此時(shí)將每種經(jīng)誘導(dǎo)土壤桿菌分離物與植物材料的各復(fù)制品混合。將這些細(xì)胞在黑暗中于22'C+2'C下共同培養(yǎng)約72小時(shí)。在共同培養(yǎng)后，按照美國專利公開案第20020100083號(hào)中所述的方法自所述培養(yǎng)物去除土壤桿菌。然后以2周間隔將聚酯膜載體上載有的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至新鮮的選擇培養(yǎng)基中。在許多培養(yǎng)皿上眾多隔離區(qū)中的選擇培養(yǎng)基上均發(fā)生了積極生長。在選擇試劑存在下此積極生長通常表示生長組織已經(jīng)將選擇基因整合入其染色體中并受到穩(wěn)定轉(zhuǎn)化。這些積極生長的區(qū)域被視為獨(dú)立轉(zhuǎn)化事件且因此被稱作推定的轉(zhuǎn)基因亞系。通過將生長轉(zhuǎn)基因扇區(qū)轉(zhuǎn)移至補(bǔ)充有相應(yīng)選擇試劑的新鮮半固體維持培養(yǎng)基中可增加推定的轉(zhuǎn)基因胚形成組織。在達(dá)到約2g之后選擇推定的轉(zhuǎn)化亞系使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)實(shí)施聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增以驗(yàn)證轉(zhuǎn)基因的存在。表19.用于PCR的引物對(duì)(SEQIDN068-75，分別按照出現(xiàn)順序給出)<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>也可使用來自每一亞系的材料進(jìn)行GUS染色和顯微鏡檢查。對(duì)于GUS染色，通過按照植物轉(zhuǎn)化技術(shù)中熟知的技術(shù)對(duì)來自各轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系的細(xì)胞在暴露于生色葡糖醛酸酶酶底物"X-gluc"(可自Inalco購得)后進(jìn)行深藍(lán)染色來檢測被插入wVM基因(其編碼在組織培養(yǎng)細(xì)胞中表達(dá)的酶P-葡糖醛酸酶)。顯微鏡檢查表明細(xì)胞分化已經(jīng)恢復(fù)且轉(zhuǎn)基因的瞬時(shí)表達(dá)對(duì)這些轟擊展現(xiàn)正常的頻率?？砂l(fā)芽的胚按照下列制備。當(dāng)己經(jīng)在選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)的細(xì)胞團(tuán)增殖到至少1克后，將每一細(xì)胞團(tuán)再次分別重新懸浮于液體培養(yǎng)基中。當(dāng)使細(xì)胞懸浮液成為均勻的(最大值的一半)SCV時(shí)，將等量的懸浮培養(yǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到無菌膜載體上并將其置于如美國專利第5,506,136號(hào)所述的發(fā)育/成熟培養(yǎng)基上以形成可收獲的高品質(zhì)第3階段(子葉)胚。在黑暗生長室中于23+2'C下培育培養(yǎng)皿。每3周將膜載體轉(zhuǎn)移到含有新鮮培養(yǎng)基的新陪替氏培養(yǎng)皿(petridish)中。在第9周時(shí)，以目測方式分析第3階段(子葉)胚的發(fā)芽品質(zhì)并收獲到美國專利第5,506,136號(hào)所述培養(yǎng)基上的纖維載體上并在黑暗中于4'C土2'C的溫度下培育約4周。接下來，在黑暗中于25'C土2'C溫度下將其纖維載體上的胚在密封容器中的水上培育約3周。在進(jìn)行以上兩次處理之后，將其纖維載體上的胚轉(zhuǎn)移至發(fā)芽培養(yǎng)基并在黑暗中于25'C士2'C的溫度下將其培育約3天。然后自其纖維載體移除胚并將其置于新鮮發(fā)芽培養(yǎng)基的表面上。在光中于25。C土2。C的溫度下進(jìn)行發(fā)芽。每周檢查一次發(fā)芽平板，持續(xù)約4周，并將發(fā)芽胚轉(zhuǎn)移到含有100ml發(fā)芽培養(yǎng)基的MAGENTA⑧箱中以轉(zhuǎn)化成幼苗。將含有正在發(fā)育幼苗的MAGENTA⑧箱在光中于25。C士2。C下培育約8-12周。當(dāng)幼苗形成上胚軸(約2-4cm的新生芽)時(shí)，將其轉(zhuǎn)移至填充有盆栽用混合物[2:1:2的泥炭:珍珠巖:蛭石，含有602g/m3OSMOCOTE月巴料(18-6-12)、340g/m3白云石石灰和78g/m3MICRO-MAX微量營養(yǎng)混合物(SierraChemical公司)]的容器中。使所述幼苗生長在陰暗的溫室中并偶爾噴灑水霧，達(dá)約2周時(shí)間。使其脫離水霧以在溫室環(huán)境中適應(yīng)約4周。然后將幼苗轉(zhuǎn)移至室外陰涼處達(dá)約6周以適應(yīng)最終環(huán)境，然后移到完全日曬條件下。然后使這些幼苗在容器中生長直至條件允許田間種植。測量經(jīng)上述RNAi載體轉(zhuǎn)化的5個(gè)月期火炬松樹的高度并記錄結(jié)果(表20)。對(duì)高度數(shù)據(jù)進(jìn)行鄧肯多重范圍(DuncanMultipleRange)檢驗(yàn)且發(fā)現(xiàn)經(jīng)含有pWVKl57、pWVK155、pWVC40、pWVC43和pWVC44的RNAi盒的載體轉(zhuǎn)化的植物與GUS對(duì)照植物(pWVC41)相比不具有任何明顯的高度差別，而所有其它經(jīng)轉(zhuǎn)化系與對(duì)照相比均顯示明顯的高度差異。還測得單一未轉(zhuǎn)化對(duì)照的高度為21.1cm但沒有對(duì)此試樣進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，因?yàn)樗龈叨葹閱我唤Y(jié)果而非多個(gè)試樣的平均值。在5個(gè)月時(shí)測量所有經(jīng)轉(zhuǎn)化樹木和對(duì)照樹木的根部干重但沒有觀測到對(duì)照試樣與轉(zhuǎn)基因試樣之間存在明顯的差異。通過自每一莖干切割約20mg組織自以上經(jīng)轉(zhuǎn)化樹木或?qū)φ瘴崔D(zhuǎn)化樹木收集約200個(gè)7個(gè)月期的試樣。在石英舟中對(duì)每一試樣稱重并在由石英管(內(nèi)徑為2.5cm)構(gòu)成的反應(yīng)器中熱解所述試樣，其中氦以5L/min(在STP下)流過。以使分子束質(zhì)譜計(jì)的采樣口位于石英反應(yīng)器末端內(nèi)部的方式放置反應(yīng)管。使用采用ExtrelTMModelTQMSC50質(zhì)譜儀的分子束質(zhì)譜儀進(jìn)行熱解蒸氣分析，如Evans&Milne(1987)(Energy&Fuels,1:123-37)中所述。對(duì)所述反應(yīng)器進(jìn)行電加熱且將其溫度保持在550°C。盡管熱解反應(yīng)在不超過50秒內(nèi)完成，但總的熱解時(shí)間為90秒。據(jù)估計(jì)，熱解蒸氣在反應(yīng)器熱解區(qū)中的滯留時(shí)間為75ms且其足夠短以最大程度地減少石英反應(yīng)器中的二次裂化反應(yīng)。用TekniventVector2，數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)使用22eV電子碰撞電離電壓獲得介于20-450Da之間的質(zhì)譜數(shù)據(jù)。使用此系統(tǒng)可同時(shí)并實(shí)時(shí)對(duì)輕氣體和重焦油取樣。熱解蒸氣的質(zhì)譜可提供分子片段的快速、半定量圖示。連續(xù)兩天以成段方式收集火炬松試樣組和標(biāo)準(zhǔn)試樣的復(fù)制物質(zhì)譜以減少可能由于光譜儀每天偏移引起的與數(shù)據(jù)分析相關(guān)的問題。對(duì)兩天所收集質(zhì)譜的組合分析表明僅存在最小的光譜儀偏移。檢查所述光譜可確定轉(zhuǎn)基因試樣的質(zhì)譜不同于對(duì)照的質(zhì)譜。來自轉(zhuǎn)基因和對(duì)照火炬松試樣的熱解產(chǎn)物的pyMBMS譜的實(shí)例示于圖14中。使用介于m/z50與200之間質(zhì)量范圍的火炬松pyMBMS譜的主要組份分析突出顯示來自木質(zhì)素和碳水化合物的熱解產(chǎn)物同時(shí)最大程度地減少小熱解片段和電子撞擊片段(低于m/z50)和提取物(高于m/z200)。通過選擇含有較多關(guān)于木質(zhì)素的信息和較少關(guān)于提取物的信息的質(zhì)量范圍，構(gòu)建體之間的明顯差異會(huì)變得明了。圖15A顯示對(duì)于所有所分析轉(zhuǎn)基因試樣使用m/z50-200質(zhì)量范圍所收集的質(zhì)譜的PCI分值對(duì)PC2分值的散點(diǎn)圖。自此散點(diǎn)圖，我們可得出如下結(jié)論經(jīng)某些載體轉(zhuǎn)化的植物與對(duì)照未轉(zhuǎn)化植物相比顯示明顯的不同，這是因?yàn)樽再|(zhì)譜分析和PC裝載所測定的木質(zhì)素?cái)?shù)量不同，而其它則沒有明顯不同。圖15B、16A和16B提供額外的鑒別信息。經(jīng)pWVC41轉(zhuǎn)化的樹木是GUS對(duì)照轉(zhuǎn)基因樹木且其未顯示不同于對(duì)照未轉(zhuǎn)化樹木。經(jīng)pWVC40和pWVK154轉(zhuǎn)化的樹木均含有編碼松樹4CL片段D的序列(SEQIDNO:21)且經(jīng)pWVC46和pWVK158轉(zhuǎn)化的樹木均含有編碼松樹4CL片段C的序列(SEQIDNO:20)。這些轉(zhuǎn)化體中的每一個(gè)在散點(diǎn)圖上與對(duì)照試樣分開，此表明轉(zhuǎn)基因試樣與對(duì)照試樣之間的木質(zhì)素?cái)?shù)量是不同的。圖17顯示圖16A中所選試樣(即對(duì)照、轉(zhuǎn)基因試樣pWVC40和pWVK154)的擴(kuò)展質(zhì)譜區(qū)。很明顯，由木質(zhì)素?zé)峤猱a(chǎn)生的峰值相對(duì)于可賦予碳水化合物和提取物(參見表21)的其它峰值有所降低。對(duì)其它構(gòu)建體進(jìn)行類似的質(zhì)譜分析表明PC1可反映每一試樣中的木質(zhì)素濃度。圖15-16中右側(cè)試樣具有最高的木質(zhì)素含量且左側(cè)試樣具有遠(yuǎn)低于其的木質(zhì)素含量。經(jīng)pWVK158、pWVK154、pWVC46和pWVC40轉(zhuǎn)化的7個(gè)月期火炬松樹顯示當(dāng)與未轉(zhuǎn)化對(duì)照和GUS轉(zhuǎn)化對(duì)照相比時(shí)，木質(zhì)素含量減少最大。經(jīng)pWVK158、pWVK154和pWVC42轉(zhuǎn)化的樹木較未轉(zhuǎn)化和GUS轉(zhuǎn)化樹木明顯更矮，而經(jīng)pWVC40轉(zhuǎn)化的樹木具有明顯木質(zhì)素減少但無明顯高度減少。使用核磁共振譜評(píng)估木質(zhì)素在4.7T及交叉極化(CP)和變角度旋轉(zhuǎn)(MAS)下于BrukerAvance200MHz光譜儀中收集高分辨率、固態(tài)"CNMR譜。使用可變振幅交叉極化(整個(gè)極化期間的線性斜坡為1db)來最小化在較高M(jìn)AS轉(zhuǎn)速下對(duì)Hartmann-Hahn錯(cuò)配序列敏感的未質(zhì)子化芳族石發(fā)原子的變化(S.OSmith,I.Kustanovich，X.Wu,0.B.Peersen,JournalofMageneticResonance(1994)104:334-339)。在53.6kHz下匹配&和13C域并在匹配期間將ldB斜坡施加于質(zhì)子r.f.。采集時(shí)間為0.033秒且掃頻寬度為31.3kHz。在7000Hz速率下，進(jìn)行變角度旋轉(zhuǎn)。使用2ms接觸時(shí)間和1.0秒脈沖重復(fù)速率來平均2000-4000次掃描。在相對(duì)峰值強(qiáng)度方面觀測到的差異及積分面積可用于鑒別類似試樣間的差異。使用Haw等人1984(J.RHaw.，GE.Maciel.,H.A.Schroder,AnalyticalChemistry56:1323)的方法自芳香族(IIOppm-160ppm)區(qū)和碳水化合物(40ppm-100ppm)區(qū)的積分面積計(jì)算重量％木質(zhì)素?cái)?shù)值。.根據(jù)其pci分值選擇12個(gè)試樣并使用固態(tài)13CNMR測定木質(zhì)素含量。在某些情況下，將來自相同種系的若干試樣組合以獲得一足夠大的試樣以供NMR分析。圖18顯示對(duì)照種系(兩個(gè)試樣組合)與轉(zhuǎn)化種系pWVK154(四個(gè)試樣組合)的NMR譜的對(duì)比。NMR譜證實(shí)了pyMBMS分析的結(jié)果，即pWVK154轉(zhuǎn)基因種系較對(duì)照種系具有低得多的木質(zhì)素含量。通過結(jié)合對(duì)木質(zhì)素和碳水化合物結(jié)構(gòu)的某些假定對(duì)芳香族區(qū)和碳水化合物區(qū)進(jìn)行積分來確定重量％木質(zhì)素(參見Haw等人，(1984)Amz/yft'ca/C&mZ^7，56:1323)。12個(gè)所選試樣的結(jié)果在表22中給出。利用所選試樣的PCI分值進(jìn)行的NMRwt呢木質(zhì)素?cái)?shù)值對(duì)比顯示，PCI分值可精確地反映火炬松試樣中的木質(zhì)素?cái)?shù)量且PC1記分可用于評(píng)定不同構(gòu)建體的木質(zhì)素含量。使用多變量數(shù)據(jù)分析評(píng)估木質(zhì)素使用Unscrambler7.8版軟件程序(CAMOA/S,Trondheim，Norway)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。使用隱結(jié)構(gòu)投影(PLS-1)算法(其一次僅處理1個(gè)Y-變量)來構(gòu)造用于預(yù)測松樹試樣木質(zhì)素含量的模型。使用pyMBMS譜作為X-矩陣(310個(gè)變量(m/z值介于50與360之間))并使用通過固態(tài)NMR測量的木質(zhì)素?cái)?shù)值作為Y-矩陣來形成可預(yù)知木質(zhì)素含量的模型。在進(jìn)行分析之前，將質(zhì)譜歸一化為總離子電流。使用完全交叉驗(yàn)證進(jìn)行模型驗(yàn)證，其自所述數(shù)據(jù)中系統(tǒng)地移除一個(gè)試樣，利用其余試樣建立模型且隨后使用此模型來預(yù)測自數(shù)據(jù)組移除的試樣的Y-變量數(shù)值。持續(xù)所述過程直至移除并自Y-矩陣預(yù)測全部試樣。配合度(即，高相關(guān)系數(shù))和最小剩余誤差是用于選擇最佳模型的標(biāo)準(zhǔn)。自NMR木質(zhì)素?cái)?shù)值和pyMBMS譜構(gòu)造可預(yù)測木質(zhì)素含量的PLS1模型。當(dāng)選取來自相同種系的1株以上的樹木作為試樣來進(jìn)行NMR分析時(shí)，取所述樹木的對(duì)應(yīng)質(zhì)譜的平均值并使用其構(gòu)建模型。使用介于50至360之間的m/z值構(gòu)造PLS模型。此范圍是以經(jīng)驗(yàn)方式確定的，以便基于完全交叉驗(yàn)證模型的相關(guān)系數(shù)提供最佳模型。示于圖19中的最終完全交叉驗(yàn)證模型具有0.9的RMSEP和0.94的rM直。使用由NationalRenewableEnergyLaboratory(Golden,Colorado)石開發(fā)的基于NMR的模型測定每一轉(zhuǎn)化種系的木質(zhì)素水平。表20顯示每一RNAi構(gòu)建體與未轉(zhuǎn)化對(duì)照相比的木質(zhì)素百分比。所有轉(zhuǎn)化體顯示木質(zhì)素相對(duì)于對(duì)照植物有所減少，但不同的種系具有不同數(shù)量的木質(zhì)素。包含具有片段C或D的構(gòu)建體的轉(zhuǎn)化體顯示最大的木質(zhì)素減少。表20.RNAi構(gòu)建體對(duì)木質(zhì)素水平的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>圖10提供顯示自每一轉(zhuǎn)化體所獲得的木質(zhì)素?cái)?shù)值的圖形。所述構(gòu)建體是按照沿X-軸的平均高度順序列出。因此，所述結(jié)果顯示在松樹中，片段C和D與生長以及木質(zhì)素的平均減少相關(guān)。片段E既不減少生長，也不在很大程度上減少木質(zhì)素。自片段A(受任何啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng))或片段F(受4CL啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng))可見，最佳木質(zhì)素減少并不伴隨平均生長減少。這些構(gòu)建體構(gòu)成森林學(xué)應(yīng)用的適當(dāng)表現(xiàn)型。表21提供與火炬松木頭試樣的熱解分子束質(zhì)譜相關(guān)的質(zhì)譜峰值分配(Evans等人，&1:123-137(1987))。表21.<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>1片段離子。表22:通過NMR測得的木質(zhì)素重量9fc數(shù)值用以轉(zhuǎn)化種系的構(gòu)建體NMR測定的木質(zhì)素重量％<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>實(shí)例14.松樹轉(zhuǎn)化體的田間測試從122行中的每一行中選出4-8個(gè)基因等同的繁殖體(無性系分株)用于田間種植，對(duì)于16個(gè)構(gòu)建體的每一個(gè)均包含約相等數(shù)量的行，共以隨機(jī)劃塊設(shè)計(jì)方式種植約1000株樹苗。將經(jīng)4CL啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的構(gòu)建體和超級(jí)泛素啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系種植于約500株樹苗的單獨(dú)區(qū)塊(各自具有對(duì)應(yīng)的對(duì)照)中。表23中用星號(hào)標(biāo)記的構(gòu)建體產(chǎn)生至少一些矮小轉(zhuǎn)化體。自所述表中可見，具有受超級(jí)泛素啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的構(gòu)建體的轉(zhuǎn)化體更有可能顯示矮小。同時(shí)，具有受4CL啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的構(gòu)建體的轉(zhuǎn)化體更有可能顯示木質(zhì)素減少而沒有明顯的矮化現(xiàn)象，如可自下表23中所見，其中運(yùn)用鄧肯多重范圍檢驗(yàn)來測量高度。在表23中可觀測到，較大高度類別中主要呈現(xiàn)含有受維管優(yōu)選型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的構(gòu)建體的轉(zhuǎn)化體。因此，具有組織優(yōu)選型啟動(dòng)子的構(gòu)建體較佳。表23.在田間測試中種植的4CLRNAi轉(zhuǎn)化樹木和對(duì)照樹木。按照轉(zhuǎn)基因樹木的平均高度(在第8個(gè)月時(shí)測量)和根部質(zhì)量(在第12個(gè)月時(shí)測得，即在植入田間時(shí))進(jìn)行評(píng)定<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>對(duì)高度和根部質(zhì)量統(tǒng)計(jì)進(jìn)行鄧肯多重范圍檢驗(yàn)。實(shí)例15.碳水化合物水平的評(píng)估次生木質(zhì)部(木材)主要由纖維素(一種線性葡萄糖聚合物)、半纖維素(一種被發(fā)現(xiàn)與纖維素相關(guān)的線性雜多糖；在裸子植物中，主要的組份糖是甘露糖)和木質(zhì)素(一種不能夠通過水解來解聚的酚類聚合物)組成。不同水平的碳水化合物(CHO)和木質(zhì)素可影響樹木在諸如制漿等過程中的使用。纖維素是紙漿產(chǎn)品的主要組份且產(chǎn)率還可受與纖維素相關(guān)的半纖維素的數(shù)量和類別的影響。另外，木材的纖維素含量與強(qiáng)度正相關(guān)，其對(duì)于紙漿和實(shí)木制品均非常重要。Harding等人(1999)(7Vaf歷ofec/moU7(8):808-12)發(fā)現(xiàn)具有較低木質(zhì)素水平的轉(zhuǎn)基因白楊樹顯示升高的CHO水平。Harding等人認(rèn)為CHO水平的升高歸因于具有較低木質(zhì)素水平的樹木保存了植物結(jié)構(gòu)完整性且這些樹木會(huì)顯示對(duì)制漿更有用?？蓽y試總木質(zhì)素?cái)?shù)量被測試的轉(zhuǎn)基因植物材料的碳水化合物(CHO)，其作為所存在纖維素和半纖維素?cái)?shù)量的量度。對(duì)不含提取物的磨碎試樣進(jìn)行碳水化合物分析。這些試樣用72%硫酸分2個(gè)階段水解，首先通過在室溫下培育1/2小時(shí)、然后在12CTC下培育1小時(shí)、倒出并通過離子層析來分析。自層析圖確定阿拉伯聚糖、半乳聚糖、葡聚糖、木聚糖和甘露聚糖的百分比干木重量(DWW)。Hu等人(1999)(NatureBiotechnology17:808-812)闡明下調(diào)4CL基因的轉(zhuǎn)基因白楊樹呈現(xiàn)高達(dá)45%的木質(zhì)素含量減少和15%的纖維素含量增加。估測實(shí)例15中被測試木質(zhì)素的轉(zhuǎn)基因樹木的碳水化合物水平可確定這些構(gòu)建體是否顯示木質(zhì)素含量減少與纖維素含量增加之間的相關(guān)性。轉(zhuǎn)基因樹木CHO的測定結(jié)果表明與經(jīng)轉(zhuǎn)化樹木中纖維素或半纖維素含量的變化相關(guān)的那些構(gòu)建體。這些結(jié)果表明這些構(gòu)建體能夠調(diào)節(jié)與紙漿產(chǎn)率及紙漿纖維和實(shí)木制品的強(qiáng)度相關(guān)的纖維素含量。所述構(gòu)建體可改變經(jīng)轉(zhuǎn)化樹木中的纖維素或半纖維素含量。經(jīng)轉(zhuǎn)化樹木的木質(zhì)素水平減少和CHO水平增加可為紙漿工業(yè)提供經(jīng)濟(jì)和環(huán)保優(yōu)勢。具體而言，木質(zhì)素含量減少會(huì)減少制漿和漂白過程中所用的化學(xué)品。實(shí)例16.用于分析木質(zhì)素含量的其它方法在此實(shí)例中，對(duì)先前在實(shí)例13中檢查的樹木基因純系的較老試樣進(jìn)行解剖學(xué)分析以比較6個(gè)月期植物與約18個(gè)月期植物之間的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)和木質(zhì)素含量。另外，通過聚焦顯微鏡檢查法檢査其木質(zhì)素總量、CHO數(shù)量被測試且在實(shí)例11和13中分別被微漿化的轉(zhuǎn)基因植物材料以觀看所存在的細(xì)胞結(jié)構(gòu)。將試樣固定于福爾馬林醋酸-酒精(FAA)中。在水中洗滌試樣并使用滑動(dòng)式切片機(jī)以30-60mm厚度切片。使用番紅染色對(duì)切片進(jìn)行染色并使用聚焦顯微鏡檢查。還對(duì)所述試樣施用木質(zhì)素組織化學(xué)測試，其使用均苯三酚/HCl測定松柏醛單元。一些試樣還使用作為木質(zhì)素另一染劑的甲苯胺藍(lán)色染劑進(jìn)行檢査。此解剖學(xué)分析可鑒別所存在反應(yīng)木頭的數(shù)量和轉(zhuǎn)基因植物的木頭(木質(zhì)部)細(xì)胞是否相對(duì)于對(duì)照植物顯示任何不同。這些結(jié)果表明在實(shí)例12和13中顯示具有減少木質(zhì)素水平但顯示正常形態(tài)學(xué)的轉(zhuǎn)基因樹與具有"正常"/較高木質(zhì)素水平的非轉(zhuǎn)基因樹在細(xì)胞結(jié)構(gòu)方面不存在明顯的不同。這些結(jié)果進(jìn)一步證明所觀測的6個(gè)月期樹木的細(xì)胞結(jié)構(gòu)與所觀測到的18個(gè)月期樹木試樣的細(xì)胞結(jié)構(gòu)是一致的。實(shí)例17.低木質(zhì)素樹木的加工為了測定木質(zhì)素含量降低是否轉(zhuǎn)化成了對(duì)制槳工藝的改進(jìn)，可對(duì)所述實(shí)例的轉(zhuǎn)基因樹木進(jìn)行微漿化。用于確定牛皮紙制漿木材資源適宜性的重要參數(shù)為紙漿產(chǎn)率、制漿速率、堿耗量、纖維品質(zhì)和紙漿漂白性能。木頭試樣經(jīng)空氣干燥、制成碎片且然后在烘箱中于105'C下干燥至少2天直至達(dá)到恒定重量。在連接到Stalsvets多消化器制漿單元(Sdlsvets,Sweden)的旋轉(zhuǎn)臂的150mL不銹鋼反應(yīng)器中進(jìn)行牛皮紙制槳。所述反應(yīng)器旋轉(zhuǎn)通過聚乙烯浴，所述聚乙烯浴由具有12.5kW總?cè)萘康碾娂訜崞骷訜岵⒂蒓mron控制器(Omron公司，Illinois,USA)來控制。典型的制漿條件為有效的堿量14%(以Na20計(jì)》液體硫化率30%液體木材比率6:1最高制漿溫度170°C到達(dá)最高溫度的時(shí)間90分鐘H-因子通過改變170'C下的時(shí)間來測定那些熟悉紙漿制造技術(shù)的人員應(yīng)理解微制漿條件的許多其它組合亦可用于測試本發(fā)明樹木的木頭可制漿性。所述反應(yīng)器在冷水中驟冷并使用布氏漏斗過濾出經(jīng)烹煮的碎片。保留濾液以用于殘留堿分析。用自來水充分洗滌經(jīng)烹煮碎片且隨后在標(biāo)準(zhǔn)英式粉碎機(jī)中摻合15分鐘。所得紙漿用布氏漏斗過濾并用水洗滌直至濾液為清澈的。將紙漿墊在60'C下干燥過夜并通過稱重測定總產(chǎn)量。殘留堿通過用0.5M鹽酸滴定至第一個(gè)拐點(diǎn)來測定(Milanova，E.andDorris,G.M.,A/oni/cPw/p朋dPaperi"earc/z丑，9(1),4-9(1994))。堿耗量是碎片上的有效堿量與黑色液體中殘留堿之差，表示為烘箱干燥碎片的百分比(以N^O計(jì))。紙漿k數(shù)值通過半階改變AppitaStandard201m-86(AS/NZS1301.201s:2002)來確定。制漿速率計(jì)算為達(dá)到給定烹煮時(shí)間的k數(shù)值。紙漿漂白性能通過在10%稠度下使用D-Eo-D序歹U(Kibblewhite等人，A/^"a,51(2)，1145-121(1998))按照下述對(duì)紙漿漂白來測定D階段:0.25活性氯系數(shù)，100%工業(yè)二氧化氯，5CTC，60分鐘。Eo階段:2%NaOH，0.25mPaO2，70°C，60分鐘。D階段1%CIO"7(TC，180分鐘。在漂白之后，于pH4-5.5下制備5g亮度墊并在23°C/50%RH下使用L&WElrepho(Lorentzen&Wettre,Kista,Sweden)平衡后測定亮度。使用KamanFiberglas系統(tǒng)(MetsAutomation,Kaman，F(xiàn)inland)分析諸如平均纖維長度、寬度和管腔尺寸等纖維性質(zhì)和標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果與轉(zhuǎn)化中所用類型的構(gòu)建體相關(guān)且表明所述構(gòu)建體可有效地調(diào)節(jié)牛皮紙制漿所用木材資源的適宜性。實(shí)例18.反義構(gòu)建體生成反義轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)構(gòu)建體可用于調(diào)控植物中的木質(zhì)素含量。在此方面，本文所揭示任何啟動(dòng)子均可與來自本文所揭示任何基因的序列組合以產(chǎn)生可生成反義轉(zhuǎn)錄本的重組構(gòu)建體。利用巨桉4CL基因的若干示范性表達(dá)盒提供于表24中。pARB1201、pARB598、pARB411和pARB412的載體圖譜分別提供于圖20、圖21和圖27中。構(gòu)建體pARB598由美國典型培養(yǎng)物保藏中心(P.O.Box1549，Manassas,Virginia,USA,20108)在2004年9月21日保存且給予ATCC登錄號(hào)PTA-6224。表24.<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>實(shí)例19.4CL的正義構(gòu)建體用于調(diào)節(jié)植物中木質(zhì)素的構(gòu)建體還可通過組合本文所揭示任何啟動(dòng)子與所定向4CL基因的至少一部份來制備以生成正義轉(zhuǎn)錄本。這些構(gòu)建體產(chǎn)生高水平的可抑制靶基因表達(dá)的4CL正義轉(zhuǎn)錄本。示范性構(gòu)建體是pARB368，其圖示于圖25中。此構(gòu)建體的表達(dá)盒包括輔射松4CL啟動(dòng)子(SEQIDNO:77)，其以可操作方式連接到按照美國專利第6,410,718號(hào)所述分離的來自巨桉的全長4CLcDNA(SEQIDNO:84)。實(shí)例20.包含Cald5H的構(gòu)建體用于調(diào)節(jié)植物中木質(zhì)素的構(gòu)建體可通過組合本文所揭示任何啟動(dòng)子與Cald5H基因的至少一部分來制備。這些構(gòu)建體可通過變更轉(zhuǎn)化體中愈創(chuàng)木基紫丁香基木質(zhì)素單體比率來改變轉(zhuǎn)基因植物的木質(zhì)素組成。若干示范性表達(dá)盒提供于表25中。所述載體的質(zhì)粒圖譜提供于圖20-22、圖24和圖28中。將這些構(gòu)建體的每一個(gè)設(shè)計(jì)為過度表達(dá)Cald5H并由此評(píng)定轉(zhuǎn)化植物中的紫丁香基含量。這些構(gòu)建體中所用Cald5H基因(SEQIDNO:83)自楓香樹木質(zhì)部cDNA文庫分離，如美國專利第6，252，135號(hào)所述。表25.<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>實(shí)例21.包含SAD的構(gòu)建體用于調(diào)節(jié)植物中木質(zhì)素的構(gòu)建體可通過組合本文所揭示任何啟動(dòng)子與SAD基因的至少一部分來制備。這些構(gòu)建體可通過變更轉(zhuǎn)化體中愈創(chuàng)木基紫丁香基木質(zhì)素單體比率來改變轉(zhuǎn)基因植物的木質(zhì)素組成。若干示范性表達(dá)盒提供于表26中。所述載體的質(zhì)粒圖譜提供于圖25-26中。將這些構(gòu)建體的每一種設(shè)計(jì)為過度表達(dá)SAD并由此評(píng)定轉(zhuǎn)化植物中的紫丁香基含量。這些構(gòu)建體中所用EGBASAD基因(SEQIDNO:85)自巨桉cDNA文庫分離，所述文庫自成熟的芽蕾產(chǎn)生這些構(gòu)建體中所用EHUASAD基因(SEQIDNO:86)是自cDNA文庫分離，所述cDNA文庫自發(fā)育的桉樹傘狀花序(未開放傘狀蕾)產(chǎn)生。這些cDNA文庫可按照實(shí)例2中所述制備。表26.<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>表27提供本文所述許多聚核苷酸和DNA構(gòu)建體的核酸序列。表27.<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table>序列內(nèi)含子序列PDK200580039277.4勢s齒被46/803<table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage63</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage64</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage65</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage66</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage67</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage68</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage69</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage70</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage71</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage72</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage73</column></row><table>序列號(hào)<table>tableseeoriginaldocumentpage74</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage75</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage76</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage77</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage78</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage79</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage80</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage81</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage82</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage83</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage84</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage85</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage86</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage87</column></row><table>權(quán)利要求1、一種DNA構(gòu)建體，其包含以可操作方式連接到第一段DNA片段的啟動(dòng)子，所述第一段DNA片段對(duì)應(yīng)于木質(zhì)素單體生物合成途徑中的基因的至少一部分，間隔區(qū)DNA片段，和與所述第一段DNA片段互補(bǔ)的第二段DNA片段，其中所述第一段和第二段DNA片段在所述DNA構(gòu)建體中分別沿5’至3’方向排列。2、如權(quán)利要求1所述的DNA構(gòu)建體，其中木質(zhì)素單體生物合成途徑中的所述基因選自由4CL、C3H、CCR、C4H和CCoAOMT組成的群組。3、如權(quán)利要求1所述的DNA構(gòu)建體，其中所述啟動(dòng)子是組成型啟動(dòng)子。4、如權(quán)利要求1所述的DNA構(gòu)建體，其中所述啟動(dòng)子是組織特異性啟動(dòng)子。5、如權(quán)利要求4所述的DNA構(gòu)建體，其中所述啟動(dòng)子以維管優(yōu)選方式引導(dǎo)表達(dá)以便在植物木質(zhì)部中發(fā)生表達(dá)。6、如權(quán)利要求1所述的DNA構(gòu)建體，其中所述啟動(dòng)子來自火炬松(P.toMa)的4CL啟動(dòng)子。7、如權(quán)利要求1所述的DNA構(gòu)建體，其中所述基因的所述部分具有選自由約50bp、100bp、200bp、400bp、600bp和1000bp組成群組的片段長度。8、如權(quán)利要求1所述的DNA構(gòu)建體，其中所述基因的所述部分具有約200bp的片段長度。9、如權(quán)利要求1所述的DNA構(gòu)建體，其中所述基因的所述部分具有約334bp的片段長度。10、如權(quán)利要求1所述的DNA構(gòu)建體，其中木質(zhì)素單體生物合成途徑中的所述基因是4CL基因。11、如權(quán)利要求10所述的DNA構(gòu)建體，其中所述基因的所述部分選自由SEQIDNO18、19、20、21、22、23、24和178組成的群組。12、如權(quán)利要求IO所述的DNA構(gòu)建體，其中所述基因的所述部分包括SEQIDNO:18的核苷酸序列。13、如權(quán)利要求10所述的DNA構(gòu)建體，其中所述基因的所述部分包括SEQIDNO:23的核苷酸序列。14、如權(quán)利要求10所述的DNA構(gòu)建體，其中所述基因的所述部分包括SEQIDNO:163的核苷酸序列。15、如權(quán)利要求1所述的DNA構(gòu)建體，其中所述間隔區(qū)DNA片段為內(nèi)含子的至少一部分。16、如權(quán)利要求1所述的DNA構(gòu)建體，其中所述間隔區(qū)DNA片段包含選自由SEQIDNO:9、SEQIDNO:15和SEQIDNO:194組成的群組的核苷酸序列。17、如權(quán)利要求10所述的DNA構(gòu)建體，其中所述啟動(dòng)子為維管優(yōu)選型啟動(dòng)子且所述第一段DNA片段包括SEQIDNO:163的核苷酸序列。18、如權(quán)利要求10所述的DNA構(gòu)建體，其中所述啟動(dòng)子為維管優(yōu)選型啟動(dòng)子且所述第一段DNA片段包括SEQIDNO:18的核苷酸序列。19、如權(quán)利要求IO所述的DNA構(gòu)建體，其中所述啟動(dòng)子為維管優(yōu)選型啟動(dòng)子且所述第一段DNA片段包括SEQIDNO:23的核苷酸序列。20、如權(quán)利要求10所述的DNA構(gòu)建體，其中所述DNA構(gòu)建體選自由pARB345、pWVK158、pWVK154、pWVK143、pWVC46、pWVC40和pWVC44組成的群組。21、如權(quán)利要求1所述的DNA構(gòu)建體，其進(jìn)一步包括至少一個(gè)T-DNA邊界。22、一種DNA構(gòu)建體，其包含以可操作方式連接到第一段DNA片段的啟動(dòng)子，所述第一段DNA片段對(duì)應(yīng)于LIM基因的至少一部分，間隔區(qū)DNA片段，和與所述第一段DNA片段互補(bǔ)的第二段DNA片段，其中所述第一段和第二段DNA片段在所述DNA構(gòu)建體中分別沿5'至3'方向排列。23、一種調(diào)節(jié)植物中木質(zhì)素表達(dá)的方法，其包括將如權(quán)利要求1所述的DNA構(gòu)建體導(dǎo)入所述植物中并使所述植物生長。24、一種抑制植物中木質(zhì)素表達(dá)的方法，其包括將如權(quán)利要求1所述的DNA構(gòu)建體導(dǎo)入所述植物中并使所述植物生長。25、一種減少植物中木質(zhì)素表達(dá)的方法，其包括將如權(quán)利要求1所述的DNA構(gòu)建體導(dǎo)入所述植物中并使所述植物生長。26、一種抑制植物細(xì)胞中木質(zhì)素表達(dá)的方法，所述方法包括將沿5'至3'方向包含下列各部分的DNA構(gòu)建體整合于所述植物細(xì)胞的基因組中啟動(dòng)子、對(duì)應(yīng)于木質(zhì)素單體生物合成途徑中的基因的至少一部分的第一段DNA片段、間隔區(qū)DNA片段和與所述第一段DNA片段互補(bǔ)的第二段DNA片段；及使所述植物細(xì)胞生長。27、如權(quán)利要求26所述的方法，其中木質(zhì)素單體生物合成途徑中的所述基因選自由4CL、C3H、CCR、C4H和CCoAOMT組成的群組。28、如權(quán)利要求26所述的方法，其中所述基因的所述部分具有約50bp、100bp、200bp、400bp、600bp和1000bp的片段長度。29、如權(quán)利要求26所述的方法，其中所述基因的所述部分具有約200bp的片段長度。30、如權(quán)利要求26所述的方法，其中所述基因的所述部分具有約334bp的片段長度。31、如權(quán)利要求26所述的方法，其中木質(zhì)素單體生物合成途徑中的所述基因是4CL。32、如權(quán)利要求31所述的方法，其中所述基因的所述部分選自由SEQEDNO18、19、20、21、22、23、24和178組成的群組。33、如權(quán)利要求31所述的方法，其中所述基因的所述部分包括SEQIDNO:18的核苷酸序列。34、如權(quán)利要求31所述的方法，其中所述基因的所述部分包括SEQIDNO:23的核苷酸序列。35、如權(quán)利要求31所述的方法，其中所述基因的所述部分包括SEQIDNO:163的核苷酸序列。36、如權(quán)利要求31所述的方法，其中所述DNA構(gòu)建體選自由pARB345、pWVK158、pWVK154、pWVK143、pWVC46、pWVC40和pWVC44組成的群組。37、如權(quán)利要求26所述的方法，其中所述整合是使用一個(gè)以上的DNA構(gòu)建體實(shí)現(xiàn)。38、如權(quán)利要求26所述的方法，其中所述植物是裸子植物。39、一種包含如權(quán)利要求1所述的DNA構(gòu)建體的植物。40、一種包含如權(quán)利要求1所述的DNA構(gòu)建體的植物細(xì)胞。41、一種植物細(xì)胞，其沿5'至3'方向包含啟動(dòng)子、對(duì)應(yīng)于木質(zhì)素單體生物合成途徑中的基因的至少一部分的第一段DNA片段、間隔區(qū)DNA片段和與所述第一段DNA片段互補(bǔ)的第二段DNA片段。42、如權(quán)利要求41所述的植物細(xì)胞，其中木質(zhì)素單體生物合成途徑中的所述基因選自由4CL、C3H、CCR、C4H和CCoAOMT組成的群組。43、如權(quán)利要求41所述的植物細(xì)胞，其中所述啟動(dòng)子對(duì)于所述植物細(xì)胞而言是內(nèi)源性的。44、一種包含如權(quán)利要求41所述的植物細(xì)胞的植物。45、一種源自如權(quán)利要求44所述的轉(zhuǎn)基因植物的紙漿和紙漿制品。46、一種源自如權(quán)利要求44所述的轉(zhuǎn)基因植物的實(shí)木制品。47、如權(quán)利要求46所述的木制品，其中所述制品選自由木料(timber)、木材(lumber)和復(fù)合材料組成的群組。48、一種具有減少的木質(zhì)素含量的植物，其通過如權(quán)利要求26所述的方法產(chǎn)生。49、一種源自如權(quán)利要求48所述的轉(zhuǎn)基因植物的紙槳和紙漿制品。50、一種源自如權(quán)利要求44所述的轉(zhuǎn)基因植物的實(shí)木制品。51、如權(quán)利要求50所述的木制品，其中所述制品選自由木料、木材和復(fù)合材料組成的群組。52、一種制造木頭(wood)的方法，其包括將沿5'至3'方向包含下列各部分的DNA構(gòu)建體整合于植物細(xì)胞的基因組中啟動(dòng)子、對(duì)應(yīng)于木質(zhì)素單體生物合成途徑中的基因的至少一部分的第一段DNA片段、間隔區(qū)DNA片段和與所述第一段DNA片段互補(bǔ)的第二段DNA片段；使所述植物細(xì)胞生長及獲得所述木頭。53、如權(quán)利要求52所述的方法，其中木質(zhì)素單體生物合成途徑中的所述基因選自由4CL、C3H、CCR、C4H和CCoAOMT組成的群組。54、一種通過如權(quán)利要求52所述的方法獲得的木頭。55、一種制造木漿的方法，其包括將沿5'至3'方向包含下列各部分的DNA構(gòu)建體整合于植物細(xì)胞的基因組中啟動(dòng)子、對(duì)應(yīng)于木質(zhì)素單體生物合成途徑中的基因的至少一部分的第一段DNA片段、間隔區(qū)DNA片段和與所述第一段DNA片段互補(bǔ)的第二段DNA片段；使所述植物細(xì)胞生長及獲得所述木漿。56、如權(quán)利要求55所述的方法，其中木質(zhì)素單體生物合成途徑中的所述基因選自由4CL、C3H、CCR、C4H和CCoAOMT組成的群組。57、一種通過如權(quán)利要求55所述的方法獲得的木漿。58、一種造紙方法，其包括將沿5'至3'方向包含下列各部分的DNA構(gòu)建體整合于植物細(xì)胞的基因組中啟動(dòng)子、對(duì)應(yīng)于木質(zhì)素單體生物合成途徑中的基因的至少一部分的第一段DNA片段、間隔區(qū)DNA片段和與所述第一段DNA片段互補(bǔ)的第二段DNA片段；使所述植物細(xì)胞生長及獲得所述紙。59、如權(quán)利要求58所述的方法，其中木質(zhì)素單體生物合成途徑中的所述基因選自由4CL、C3H、CCR、C4H和CCoAOMT組成的群組。60、一種通過如權(quán)利要求58所述的方法獲得的紙。61、一種DNA構(gòu)建體，其包含以可操作方式連接到第一段DNA片段的啟動(dòng)子，所述第一段DNA片段對(duì)應(yīng)于木質(zhì)素單體生物合成途徑中的基因的至少一部分，間隔區(qū)DNA片段，和與所述第一段DNA片段互補(bǔ)的第二段DNA片段，其中所述第一段和第二段DNA片段在所述DNA構(gòu)建體中分別沿5'至3'方向排列且木質(zhì)素單體生物合成途徑中的所述基因是4CL基因且其中所述DNA構(gòu)建體選自由pARB1202、pARB675和pARB599組成的群組。62、如權(quán)利要求61所述的DNA構(gòu)建體，其中所述DNA構(gòu)建體是pARB1202。63、如權(quán)利要求61所述的DNA構(gòu)建體，其中所述DNA構(gòu)建體是pARB675。64、如權(quán)利要求61所述的DNA構(gòu)建體，其中所述DNA構(gòu)建體是pARB599。65、一種DNA構(gòu)建體，其包含以可操作方式連接到對(duì)應(yīng)于4CL基因的至少一部分的DNA片段上的啟動(dòng)子以便沿反義方向生成所述DNA片段的轉(zhuǎn)錄本，其中所述DNA構(gòu)建體為pARB1201、pARB598、pARB411和pARB412。66、如權(quán)利要求65所述的DNA構(gòu)建體，其中所述DNA構(gòu)建體是pARB1201。67、如權(quán)利要求65所述的DNA構(gòu)建體，其中所述DNA構(gòu)建體是pARB598。68、一種DNA構(gòu)建體，其包含以可操作方式連接到對(duì)應(yīng)于4CL基因的至少一部分的DNA片段上的啟動(dòng)子以便沿正義方向生成所述DNA片段的轉(zhuǎn)錄本，其中所述DNA構(gòu)建體為pARB368。69、如權(quán)利要求68所述的DNA構(gòu)建體，其中所述DNA構(gòu)建體是pARB1203。70、如權(quán)利要求68所述的DNA構(gòu)建體，其中所述DNA構(gòu)建體是pARB1205。71、如權(quán)利要求68所述的DNA構(gòu)建體，其中所述DNA構(gòu)建體是pARB675。72、如權(quán)利要求68所述的DNA構(gòu)建體，其中所述DNA構(gòu)建體是pARB661。73、如權(quán)利要求68所述的DNA構(gòu)建體，其中所述DNA構(gòu)建體是pARB662。74、一種DNA構(gòu)建體，其包含以可操作方式連接到對(duì)應(yīng)于CAld5H基因的至少一部分的DNA片段上的啟動(dòng)子，其中所述DNA構(gòu)建體選自由pARB1203、pARB1205、pARB675、pARB661、pARB662和pARB374組成的群組。75、一種DNA構(gòu)建體，其包含以可操作方式連接到對(duì)應(yīng)于SAD基因的至少一部分的DNA片段上的啟動(dòng)子，其中所述DNA構(gòu)建體選自由pARB486、pARB487和pARB488組成的群組。76、一種包含如權(quán)利要求61所述的DNA構(gòu)建體的植物細(xì)胞。77、一種包含如權(quán)利要求65所述的DNA構(gòu)建體的植物細(xì)胞。78、一種包含如權(quán)利要求68所述的DNA構(gòu)建體的植物細(xì)胞。79、一種包含如權(quán)利要求74至78中任一項(xiàng)所述的植物細(xì)胞的植物。80、一種源自如權(quán)利要求79所述的植物的紙漿和紙漿制品。81、一種源自如權(quán)利要求79所述的植物的實(shí)木制品。82、如權(quán)利要求81所述的木制品，其中所述制品選自由木料、木材和復(fù)合材料組成的群組。83、一種抑制植物中木質(zhì)素表達(dá)的方法，其包括將如權(quán)利要求61至67中任一項(xiàng)所述的DNA構(gòu)建體整合于所述植物的基因組中。84、一種改變植物中木質(zhì)素組成的方法，其包括將如權(quán)利要求68至73中任一項(xiàng)所述的DNA構(gòu)建體整合于所述植物的基因組中。85、如權(quán)利要求84所述的方法，其中所述木質(zhì)素組成的改變包括調(diào)控轉(zhuǎn)化植物中的愈創(chuàng)木基木質(zhì)素單體:紫丁香基木質(zhì)素單體比率。86、一種制造木頭的方法，其包括將如權(quán)利要求61至68中任一項(xiàng)所述的DNA構(gòu)建體整合于植物細(xì)胞的基因組中、使所述植物細(xì)胞生長及獲得所述木頭。87、一種制造木頭的方法，其包括將如權(quán)利要求68至73中任一項(xiàng)所述的DNA構(gòu)建體整合于植物細(xì)胞的基因組中、使所述植物細(xì)胞生長及獲得所述木頭。88、一種通過如權(quán)利要求86或87所述的方法獲得的木頭。89、一種制造木漿的方法，其包括將如權(quán)利要求61至68中任一項(xiàng)所述的DNA構(gòu)建體整合于植物細(xì)胞的基因組中、使所述植物細(xì)胞生長及獲得所述木頭。90、一種制造木漿的方法，其包括將如權(quán)利要求68至73中任一項(xiàng)所述的DNA構(gòu)建體整合于植物細(xì)胞的基因組中、使所述植物細(xì)胞生長及獲得所述木頭。91、一種通過如權(quán)利要求89或90所述的方法獲得的木漿。92、一種造紙方法，其包括將如權(quán)利要求61至68中任一項(xiàng)所述的DNA.構(gòu)建體整合于植物細(xì)胞的基因組中、使所述植物細(xì)胞生長及獲得所述紙。93、一種造紙方法，其包括將如權(quán)利要求68至73中任一項(xiàng)所述的DNA構(gòu)建體整合于植物細(xì)胞的基因組中、使所述植物細(xì)胞生長及獲得所述紙。94、一種通過如權(quán)利要求92或93所述的方法獲得的紙。全文摘要包含下列各部分的DNA構(gòu)建體可用于減少或調(diào)節(jié)植物中的木質(zhì)素含量對(duì)應(yīng)于木質(zhì)素單體生物合成途徑中的基因的至少一部分的第一段DNA片段、間隔區(qū)DNA片段和與所述第一段DNA片段互補(bǔ)的第二段DNA片段。在某些實(shí)施例中，DNA構(gòu)建體包括4CL、C3H、CCR、C4H、Cald5H、SAD或CCoAOMT基因的至少一部分。維管優(yōu)選型和組成型啟動(dòng)子可用于驅(qū)動(dòng)所述構(gòu)建體的表達(dá)。文檔編號(hào)C12N15/63GK101410521SQ200580039277公開日2009年4月15日申請(qǐng)日期2005年9月22日優(yōu)先權(quán)日2004年9月22日發(fā)明者保羅·桑德斯,克萊爾·伊格爾頓,加里·張,威廉·H·羅特曼,桑德拉·喬安妮·菲茨杰拉德,瑪麗·B·康內(nèi)特,理查德·L·福斯特申請(qǐng)人:阿博根有限公司