專利名稱：：重鏈和結(jié)構(gòu)域抗體的制作方法重鏈和結(jié)構(gòu)域抗體發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及適于處置導(dǎo)致腸道疾病的微生物感染的VHH或VNAR型重鏈免疫球蛋白，或免疫球蛋白重鏈或輕鏈的結(jié)構(gòu)域抗體(dAbs)或其片段。本發(fā)明也涉及含這些VHH或VNAR型重鏈免疫球蛋白，或免疫球蛋白重鏈或輕鏈的結(jié)構(gòu)域抗體(dAbs)或其片段的遞送系統(tǒng)，及含編碼這些VHH或VNAR型重鏈免疫球蛋白，或免疫球蛋白重鏈或輕鏈的結(jié)構(gòu)域抗體(dAbs)或其片段的表達載體的宿主。本發(fā)明進一步涉及含將抗體遞送到胃腸道(GIT)的遞送系統(tǒng)的食品或藥物制劑，其中抗體在腸道中是有活性的。發(fā)明背景免疫球蛋白(也稱為抗體)是糖蛋白，可特異識別外源分子。這些被識別的外源分子稱為抗原。當抗原侵入人體或動物時，啟動免疫應(yīng)答，包括由B淋巴細胞產(chǎn)生抗體。通過免疫應(yīng)答，可使微生物、較大的寄生蟲、病毒和細菌毒素成為無害的。抗體特異識別并以高親和力結(jié)合與各種類型抗原的特性使其成為醫(yī)學(xué)和科學(xué)研究中的有用分子。在脊椎動物中有5種免疫球蛋白類型，包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE，其在免疫系統(tǒng)中的功能各不相同。IgGs是血液中最豐富的免疫球蛋白。其基本結(jié)構(gòu)是含有2個相同的重(H)鏈多肽和兩個相同的輕(L)鏈多肽。H和L鏈通過二硫橋和非共價鍵結(jié)合在一起。鏈本身可分為可變區(qū)和恒定區(qū)。氨基酸序列高度變化的重鏈和輕鏈可變區(qū)(VH和VL)位于抗體分子的N末端部分。VH和VL—起形成特異的抗原識別位點。其余的C末端區(qū)的氨基酸序列變化較小，稱為CHl、CH2、CH3和CL?？贵w分子的非抗原結(jié)合部分稱為恒定區(qū)Fc,具有幾個免疫功能，例如與耙細胞上的受體結(jié)合及補體固定功能?？贵w的特異抗原結(jié)合位點包括重鏈和輕鏈可變區(qū)(VH和VL)。每個結(jié)構(gòu)域含4個框架區(qū)(FR)和3個稱為CDRs(互補決定區(qū))的區(qū)域或高變區(qū)。CDRs序列高度變化，決定抗體的特異性。VL和VH區(qū)一起形成與特異抗原結(jié)合的結(jié)合位點?？赏ㄟ^抗體的蛋白水解作用，例如通過木瓜蛋白酶消化、胃蛋白酶消化或其它酶學(xué)方法來產(chǎn)生幾種具有功能的抗原結(jié)合抗體片段。這種技術(shù)可用于產(chǎn)生Fab、Fv或單結(jié)構(gòu)域片段。Fab片段是抗體分子的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域?？赏ㄟ^木瓜蛋白酶消化整個抗體的來制備Fab片段。Fv片段是含整個IgG抗體的完整抗原結(jié)合位點的最小片段(~30kDa)。Fv片段由可變重鏈(VH)和可變輕鏈(VL)結(jié)構(gòu)域組成。這個稱為Fv片段(即可變片段)的異源二聚體仍可與抗原結(jié)合。重鏈抗體構(gòu)成了由camelids——例如駱駝和美洲駝所產(chǎn)生的IgG抗體的約四分之一部分(Hamers-CasternianC，etal.(1993))。這些抗體由兩個重鏈形成，但不含輕鏈。因此，可變抗原結(jié)合部分是指VHH結(jié)構(gòu)域，是最小的天然發(fā)生的完整的抗原結(jié)合位點，長度約120個氨基酸((Desmyter,A.，etal.(2001))?？赏ㄟ^免疫作用產(chǎn)生針對各種抗原的具有高特異性和親和性的重鏈抗體(vanderLinden,R.H"etal.(1999)),VHH部分可在酵母中克隆和表達(Frenken，L,G.J"etal.(2000))。其表達水平、可溶性和穩(wěn)定性比傳統(tǒng)的F(ab)或Fv片段高((Ghahroudi，M.A.etal.(1997))。鯊魚也在其抗體中也有單VH樣結(jié)構(gòu)域，稱為VNAR(Nuttalletal.(2003));(Dooleyetal.(2003));(Nuttalletal.(2004))。Holt等(2003)綜述了稱為"結(jié)構(gòu)域抗體"或dAbs的抗原結(jié)合片段，它僅含抗體的VH或VL結(jié)構(gòu)域，因此比例如Fab和scFv更小。DAbs是已知最小的抗體的抗原結(jié)合片段，從llkDa到"kDa。它們在微生物細胞培養(yǎng)物中高度表達。每個dAb含抗體的6個天然存在的互補決定區(qū)(CDRs)中的3個。由于單克隆抗體技術(shù)的發(fā)展，生成用于傳統(tǒng)免疫治療的抗體成為可能。因此抗體可應(yīng)用于包括研究、醫(yī)學(xué)及最近的消費者應(yīng)用在內(nèi)的多種領(lǐng)域。遺憾的是，傳統(tǒng)的免疫治療存在很多問題。這種應(yīng)用依賴于抗體的大規(guī)模生產(chǎn)并涉及作為從例如抗體表達系統(tǒng)收獲的蛋白的抗體或抗體片段本身的使用。因此，包括在給藥前需要進行抗體純化等的相關(guān)生產(chǎn)花費都是非常昂貴的，從而阻礙了其作為免疫制劑的廣泛應(yīng)用。另外，為了治療大部分群體，需要大量傳統(tǒng)的免疫治療產(chǎn)物。例如，如果治療基于初乳和/或免疫的雞蛋，則很難得到大規(guī)模所需量的免疫治療產(chǎn)物。另夕卜，在最近的一篇文獻中"Insitudeliveryofpassiveimmunitybylactobacilliproducingsingle-chainantibodies"NatureBiotechnol.(2002)20，702-706,Kruger等報道了通過革蘭氏陽性食品級細菌玉米乳桿菌產(chǎn)生針對變異鏈球菌的scFv抗體。該治療包括在口腔勦膜部位通過被動免疫而進行原位遞送，其中只有遞送的單鏈抗體片段在大鼠中產(chǎn)生針對齲齒的保護作用。從1960年代，已報道乳桿菌具有抗腹瀉特征(Beck，C，etal.BeneficialeffectsofadministrationofLactobacillusacidophilusindiarrhoealandotherintestinaldisorders.Am.J.Gastroenterol(1961)35，522-30)。最近有限的可控試驗已表明乳桿菌的特定種在急性病毒性腸胃炎中具有治療和預(yù)防特性(Mastretta，E"etal.EffectofLactobacillusCGandbreast-feedinginthepreventionofrotavirusnosocomialinfection.J.Pediatr.Gastroenterol.Nutr.(2002)35，527-531)。已表明植物乳桿菌和干酪乳桿菌的選擇菌林在黏膜和全身免疫應(yīng)答中具有強烈的佐劑作用。乳桿菌是一種已知用于產(chǎn)生食品的細菌。例如，酸奶酪通常是通過用乳酸菌發(fā)酵牛奶而制備的。然后在合適的時間將仍含活乳酸菌的發(fā)酵的酸性產(chǎn)物冷卻消耗。乳酸菌在食品中的另一個用途是生成肉類食品例如香腸。在包裝前將乳酸菌加到肉中，然后通過一段時間進行發(fā)酵過程而成熟。乳酸菌在食品生產(chǎn)中的另一個用途是腌制諸如巻心菜(泡茱)、胡蘿卜、橄欖或甜菜這樣的蔬菜?？赏ㄟ^加入適量的乳酸菌起始培養(yǎng)物來控制天然的發(fā)酵過程。乳酸菌在食品中的用途通常與幾種健康效果相關(guān)，參見例如A.C.Ouwehand等在Int.DairyJournal8(1998)749-758中的描述。特別是食品的用途與幾種健康效果相關(guān)，例如與諸如IBS(腸易激綜合征)、降低乳糖消化不良、腹瀉的臨床癥狀、免疫刺激、抗腫瘤活性和增強礦物質(zhì)吸收這樣的腸道健康相關(guān)。WO99/23221描述了使抗菌素失活的多價抗原結(jié)合蛋白。宿主是用于產(chǎn)生此后收獲并使用的抗體結(jié)合片段的乳酸菌。WO99/23211描述了加入收獲的抗體片段而產(chǎn)生抗腹瀉作用。WO00/6S057是通過單價抗原結(jié)合蛋白抑制病毒感染?？乖Y(jié)合蛋白可以是來源于諸如WO94/04678中所述的來源于camelids的這樣的天然無輕鏈的免疫球蛋白的重鏈可變結(jié)構(gòu)域。WO00/65057描述了用編碼單價抗原結(jié)合蛋白的基因來轉(zhuǎn)化宿主。合適的宿主可包括乳酸菌。該發(fā)明涉及發(fā)酵過程領(lǐng)域及阻礙發(fā)酵的噬菌體感染問題。具體地，美洲駝VHH片段本身可通過中和乳酸菌噬菌體P2來用于解決噬菌體感染問題。WO00/65057和WO99/23221涉及從細菌表達系統(tǒng)所收獲的抗體片段的用途。US6,605,286涉及用革蘭氏陽性菌向機體遞送諸如細胞因子這樣的有生物活性的多肽的用途。US6，190，662和EP0848756Bl涉及獲得所需蛋白或多肽的表面表達的方法。Monedero等2004涉及關(guān)于通過玉米乳酸菌表達識別輪狀病毒VP8和外部衣殼片段，從而體外阻斷輪狀病毒感染的單鏈抗體(scFv)的體外研究。但這些文獻均沒有揭示VHH或VNAR型治療免疫球蛋白或其片段或結(jié)構(gòu)域抗體的用途。這些已知系統(tǒng)的一個主要不利之處是在治療人類疾病時使用抗體或抗體片段本身(即收荻的蛋白)，這可能造成抗體在提供所需的健康用途前，甚至在到達所需部位前被降解或消化。另外，需要保證抗體或抗體片段在機體的特定部位具有活性。這依賴于所治療的特定感染類型。導(dǎo)致腸道疾病的微生物是在腸道產(chǎn)生疾病的微生物。這種微生物的例子包括大腸桿菌和沙門氏菌。導(dǎo)致腸道疾病的病原菌的另一個例子是輪狀病毒。輪狀病毒是世界上嬰兒腹瀉唯一的最常見原因，多數(shù)兒童在最初5年被感染。在發(fā)展中國家，輪狀病毒誘導(dǎo)的腹瀉每年導(dǎo)致600，000到8<70，000例死亡，在發(fā)達國家，輪狀病毒疾病造成極大的經(jīng)濟損失。在1999年七月腸套疊相關(guān)的恒河猴輪狀病毒四價疫苗取消之后，已通過幾種策略來發(fā)展安全的疫苗。目前有5種口服活性衰減的輪狀病毒疫苗正在進行應(yīng)用于兒童的臨床試驗，例如Barnes,G.L.eta1.(1997)。但特別是在發(fā)展中國家的年幼的、營養(yǎng)不良的兒童中，這種免疫的效果可能會受到限制。已通過被動免疫治療進行了幾項研究，例如Offit，P.A.etal.(1985)。分泌性免疫球蛋白是指抵抗包括輪狀病毒在內(nèi)的多種黏膜病原體感染的第一道防線。已表明臨床疾病的保護作用主要依賴于產(chǎn)生抗外部殼蛋白VP4或VP7的中和抗體(Ruggeri，F(xiàn).M.atal.(1998));(Giammarioli，A-M.etal.(1996))。但最近已表明非中和性VP6特異IGA抗體可抑制輪狀病毒復(fù)制(Feng,N.etal.(2002));Schwartz-Cornil，I.etal.(2002))。已表明超免疫牛初乳和雞蛋黃來源的抗體可有效治療輪狀病毒腹瀉(Davidsonetal.(1989));(Sarker,S.A"etal.(2001))。已證明用來源于免疫的牛初乳免疫球蛋白可成功治療兒童的輪狀病毒腹瀉(SarkerS.A.etal.(1998))。但生產(chǎn)這些免疫球蛋白制劑的高額費用限制了其作為免疫治療法的廣泛的大規(guī)模應(yīng)用。至今仍沒有獲得廣泛處置導(dǎo)致腸道疾病的微生物和病毒的特異治療方法。例如，當前處置輪狀病毒誘導(dǎo)的腹瀉主要包括預(yù)防和口服再水合。因此，需要通過治療和/或預(yù)防來提供處置導(dǎo)致腸道疾病的微生物的替代方法。本發(fā)明涉及治療和/預(yù)防導(dǎo)致腸道疾病的微生物的新方法。參考文獻Acedo-F6〗ix,E.，&P6rez-Martinez，G.SignificantdifferencesbetweenLactobacilluscaseisubsp.caseiATCC393Tandcommonlyusedplasmid-curedderivativerevealedbyapolyphasicstudy.Int.J.System.Evol.Microbiol.53，67-75(2003).Barnes,G丄.etal.PhaseItrialofacandidaterotavirusvaccine(RV3)derivedfromahumanneonate.J.Paediatr.ChildHealth.33,300-304(1997).Beck,C.,etal.BeneficialeffectsofadministrationofLactobacillusacidophilusindiarrlioealandotherintestinaldisorders.Am.J.Gastroenterol.35，522-530(1961).Bernstein,D.,etal.Efficacyoflive,attenuated,humanrotavirusvaccine89-12ininfants:arandomisedplacebo-controlledtrial.Lancet.354，287-290(1999).BoshuizenIA,HeimerinkJH,Korteland-vanMaleAM,vanH咖V),Koop邊ansMP,BullerHA,DekkerJ，Einediand人評.Changesinsmallintestinalhomeostasis,邁oiphology，andgeneexpressionduringrotavirusinfectionofinfantmice.JVirol,77,13005-16(2003),Clem咖-M咖,M-L,，etal.Safetyandimmunogenicityofliveattenuatedhuman-bovine(UK)reassortantrotavirusvaccineswithVP7-specificityforserotypes1,2，3or4inadults,childrenandinfants.Vaccine.17,2715-2725(l柳).Cook,S.M.etal.Globalseasonalityofrotavirusinfections.BullWHO.68，171-177(1990).Davidsonetal"'^Passiveimmunisationofchildrenwithbovinecolostrumcontainingantibodiestoh她anrotavirus"Lancet(1989)334:709-712.Desmyter，A.，Decanniere,K,，Muyldermans,S.,&Wyns,L.Antigenq)ec迅cityandtd扭affinitybindingprovidedbyonesingleloopofacamelsingle"domainantibody.J,Biol.Ch咖.276，26285-262卯(2001).Dooleyetal."Selectionandcharacterizationofnaturallyoccurringsingle-domain(IgNAR)antibodyfragmentsfro邁immunizedsharksbyphagedisplay"^MolecularImmunology(2003)40,25-33.Feng,N.改al.Inhibitionofrotavirusreplicationbyanon-neutralizingrotavirusVP6-specificIgAmAb.J.Clin.Invest.109，1203-1213(2002).Frenken，L.G丄，etal.IsolationofantigenspecificLl咖aVHHantibodyfragmentsandtheirhighlevelsecretionbySaccharomycescerevisiae.J.Biotecbnol.78，11-21(2000).Ghahroudi,M.A,，Desmyter,A.,Wyns,L"Hamers,R.&MuyldermansS.Selectionandidentificationofsingledomainantibodyfragmentsfromcamelheavy-chainantibodies.FEBSLett.414,521-526(1997).Giammarioli,A-M.,Mackow,E.R.,Fiore，L.，Greenberg,H.B.&Ruggeri,F.M.ProductionandcharacterizationofmurineIgAmonoclonalantibodiestothesurfaceantigensofrhesusrotavirus.Virol.225，97-110(1996).Guarino，A.etal.Enteralimmunoglobulinsfortreatmentofprotractedrotaviraldiarrhoea.Pediatr.Infect.Dis.J.10,612-614(1991).Hamers-CastermanC.,etal.Naturallyoccurringantibodiesdevoidoflight-chains.Nature.363，446-448(1993).Holt,L丄etal.Domainantibodies:proteinsfortherapy.TrendsinBiotechnology(2003)Vol.21,No.11:484-490.Isolauri,E"Jo咖叫J"So咖alainen,H.,Luo邁ala，M.&Vesikari,T.ImprovedimmunogenicityoforalDxRRVreassortantrotavirusvaccinebyLactobacilluscasdGG.Vaccine.13,310-312(1995).Kirkwood,C.D"JimButtery.Rotavirusvaccines-anupdate"ExpertOpinBiolTher.3(1),97-105(2003).Krttger，C"etal.Insitudeliveryofpassiveimmunitybylactobacilliproducingsingle-chainantibodies.NatureBiotechnol.20,702-706(2002).Kriiger,C.,Hultberg，A.，Marcotte,H.,Hermans,P.,Frenken,L.G.J.&Hammarstr6m，L.PassiveimmunizationagainstcariesusingllamaderivedVHHfragmentsagainstStreptococcusmutans.(submitted)Nuttalletal."IsolationandcharacterizationofanIgNARvariabledomainspecificforthehumanmitochondrialtranslocasereceptorTom70"Eur.J.Biochem.(2003)270,3543-3554.Nuttalletal."SelectionandaffinitymaturationofIgNARvariabledomainstergetingPlasmodiumfalciparumAMAl"Proteins:Structure,Function加dBioinfo加atics(2004)55,187-197),Ma>J.K，SmithjC.R.，&Lehner，T,UseofmonoclonalantibodiesinlocalpassiveimnrardzationtopreventcolonizationofhumanteethbyStreptococcusmut咖.InfectImmun:55,1274-1278(1987).Maassei^C.B"etal.Instrumentsfororaldisease-interventionstrategies:recombinantLactobacilluscaseiexpressingtetairastoxinfragmentCforvaccinationormyelinproteinsfororaltoleranceinductioninmultiplesclerosis.Vaccine.17，2117-2128(1999).MastretojE.,etal.EffectofLactobacillusGGandbreast-feedinginthepreventkmofrotavirusnosocomialinfection.J.Pediatr,Gastroenterol.Nutr.35,527-531(2002).Monderoetal.Selectionofsingle^chainantibodiesa琴ainsttheVPSSubunitofrotavirusVP4outercapsidproteinandtiieiiexpressicminL.casei.AppliedandEnvironmentalMicrobiologyNo.4(2004)6936-6939.OffitjP.A.etal.Protectionagainstrotavirus-inducedgastroenteritisinamurinemodelbypassivelyacquiredgastrointestinalhutnotcirculatingantibodies.J.Virol.54,58-64(1985).Overber^hL,ValckxD，WaerM,MathieuC.QuantificationofmwinecytokineniRNAsusingrealtimequantitativereversetranscriptasePCR.Cytokine.11,305-312(脂).Parashar,U.D.,Hummelman,E.G.,Bresee,J,S.,Miller,M.A.,Glass,RI.Globalillnessanddeathscausedbyrotavirusdiseaseinchildren.Emerg.Infect.Dis.9,565-572(2003).Perdigon,G"deMarcias,M.E.，Alvarez,S.,Oliver,G.&deRuizHolgado,A.P.SystemicaugmentationoftheimmuneresponseinmicebyfeedingfermentedmilkswithLactobacilluscaseiandLactobacillusacidophilus.Immunology.63,17-23(1988).Pouwels，P.H.,Leer,R丄&Boersma,W丄ThepotentialofLactobacillusasaca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后，EP-A-0584421描述了從camelids獲得的治療免疫球蛋白區(qū)。Nuttal等(2003and2004)和Dooley等(2003)描述了各種VNAR抗體的分離。Holt等(2003)描述了與VHH免疫球蛋白具有相同特性的結(jié)構(gòu)域抗體(dAbs)的分離和鑒定。優(yōu)選地，抗體是美洲駝重鏈抗體，更優(yōu)選地是VHH抗體或其片段。1993年，Hamers-Casterman等在camelids，即駱鳥它、單峰駱鳥它和美洲駝中發(fā)現(xiàn)了新型的IgG抗體("Naturallyoccurringantibodiesofdevoidlight-chains"Nature(1993)363,446-448)。重鏈抗體構(gòu)成了camdids的美洲駝所產(chǎn)生的IgG抗體的四分之一。這些抗體由兩條重鏈形成，但沒有輕鏈。可變的抗原結(jié)合部分是指VHH結(jié)構(gòu)域，它是最小的天然發(fā)生的完整的抗原結(jié)合位點(Desmyter，A.，etal."Antigenspecificityandhighaffinitybindingprovidedbyonesingleloopofacamelsingle-domainantibody"J.Biol.Chem.(2001)276，26285-26290)?？僧a(chǎn)生針對各種抗原具有高特異性和親和性的重鏈抗體，這些抗體易于在細菌和酵母中克隆和表達(Frenken，L.GJ.，etal."IsolationofantigenspecificllamasVHHantibodyfragmentsandtheirhighlevelsecretionbySaccharomycescerevisiae".J.Bioteehnol.(2000)78,11-21)。其表達水平、可溶性和穩(wěn)定性比傳統(tǒng)的F(ab)或Fv片段高(Ghahroudi，M.A.etal"Selectionandidentificationofsingledomainantibodyfragmentsfromcamelheavy-chainantibodies"FEBSLett.(1997)414，521-526)。重鏈抗體的另一個較好的來源是鯊魚。最近表明鯊魚在其抗體中具有單獨的VH類似的結(jié)構(gòu)域，稱為VNAR(Nuttalletal."IsolationandcharacterizationofanIgNARvariabledomainspecificforthehumanmitochondrialtranslocasereceptorTom70"Eur.J.Biochem.(2003)270，3543-3554;Dooleyetal."Selectionandcharacterizationofnaturallyoccurringsingle-domain(IgNAR)antibodyfragmentsfromimmunizedsharksbyphagedisplay"MolecularImmunology(2003)40，25-33;Nuttalletal."SelectionandaffinitymaturationofIgNARvariabledomainstergetingPlasmodiumfalciparumAMA1"Proteins:Structure,FunctionandBioinformatics(2004)55，187-197)?？墒褂肰NAR型免疫球蛋白的片段。Holt等"Domainantibodies:proteinsfortherapy"TrendsinBiotechnology(2003):Vol.21，No.11:484-490綜述了稱為"結(jié)構(gòu)域抗體"或dAbs的抗原結(jié)合片段，它僅含有抗體的VH或VL結(jié)構(gòu)域，因此比例如Fab和scFv更小。Dabs是抗體最小的已知的抗原結(jié)合片段，從llkDa到15kDa。它們在微生物細胞培養(yǎng)物中高度表達。每個dAb含抗體5個天然存在的互補決定區(qū)(CDRs)中的3個。免疫球蛋白可以是多價的，即二價、三價、四價，其中含有多個可以結(jié)合位點。抗原結(jié)合位點可以來源于相同的親本抗體或其片段或來源于結(jié)合相同抗原決定簇的不同抗體。如果所有結(jié)合位點具有相同的特異性，則可產(chǎn)生單特異性的免疫球蛋白。選擇性地，可產(chǎn)生與相同抗原的不同抗原決定簇或甚至與不同抗原結(jié)合的多特異性免疫球蛋白。VHH或VNAR型重鏈免疫球蛋白或其片段，或免疫球蛋白重鏈或輕鏈的結(jié)構(gòu)域抗體(dAbs)或其片段可天然產(chǎn)生，即對用所需抗原免疫的動物體內(nèi)采血或通過基因工程技術(shù)合成。可篩選對多種不同抗原，包括微生物、較大的寄生蟲、病毒和細菌毒素有活性的抗體。也設(shè)計了VHH、VNAR和dAbs的功能等價物。功能等價物是指與全長序列有相同抗原結(jié)合親和性的序列。例如，功能等價物包括添加或缺失不引起功能改變的氨基酸。合成基因、將其整合到微生物宿主中并在微生物中表達基因的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，技術(shù)人員可通過常用的通用技術(shù)實現(xiàn)本發(fā)明?？紤]了復(fù)制或整合載體的用途。根據(jù)本發(fā)明的一個技術(shù)方案，一種包括將抗體遞送到GIT的遞送系統(tǒng)的食品或藥物制劑，其中抗體是VHH或VNAR型重鏈免疫球蛋白或其片段，或免疫球蛋白重鏈或輕鏈的結(jié)構(gòu)域抗體(dAbs)或其片段，它們在腸道中是有活性的。優(yōu)選地，遞送系統(tǒng)是微生物，免疫球蛋白是美洲駝來源的抗體或其片段。我們驚奇的發(fā)現(xiàn)這些轉(zhuǎn)化的微生物可在其表面表達駱駝重鏈抗體或其片段，能降低病毒裝載，使病理學(xué)規(guī)范化，并在輪狀病毒感染的動物模型中減輕腹瀉。另外，駱駝的重鏈抗體或其片段可在輪狀感染的體外和體內(nèi)模型中有效降低感染。本發(fā)明也包含不表現(xiàn)出抗原結(jié)合親和性的整個抗體片段或部分的用途。片段優(yōu)選地是功能片段。重鏈的功能片段是指免疫球蛋白重鏈的片段，該片段對同全長序列類似的抗原具有結(jié)合親和性。當解離常數(shù)大于10exp5時具有結(jié)合親和性。這種片段可利于治療。例如，它可能具有很小的免疫原性，如果需要，它由于具有更小的體積而可以穿過組織。抗體適于遞送到GIT中，而且必須在胃和/和腸道中是有活性的。本發(fā)明的遞送系統(tǒng)的一個優(yōu)點包括體內(nèi)產(chǎn)生或釋放含VHH或VNAR型重鏈免疫球蛋白或其片段，或免疫球蛋白重鏈或輕鏈的結(jié)構(gòu)域抗體(dAbs)或其片段，定位于GIT中避免了口腔給藥抗體在胃中降解的實際問題。為了測定VHH或VNAR型重鏈免疫球蛋白或其片段，或免疫球蛋白重鏈或輕鏈的結(jié)構(gòu)域抗體(dAbs)或其片段是否適于本發(fā)明，可進行下列檢驗。產(chǎn)生的抗體在低pH，優(yōu)選地從1.5到3.5，并存在胃蛋白酶(一種在胃中含量豐富的蛋白酶)的特定條件下進行篩選，以獲得在GIT中很好工作的非常有用的分子，從而適于本發(fā)明的用途。本發(fā)明通常用于處置導(dǎo)致腸道疾病的微生物。優(yōu)選地，本發(fā)明涉及處置導(dǎo)致腸道疾病的病毒和/或?qū)е履c道疾病的細菌。處置可理解為包括治療和/或預(yù)防。導(dǎo)致腸道疾病的微生物包括例如沙門氏菌、Campilobacter、大腸桿菌或螺桿菌。導(dǎo)致腸道疾病的病毒包括例如Noro病毒(諾沃克類病毒)、腸道腺病毒、冠狀病毒、杯狀病毒和小病毒。輪狀病毒和諾沃克家族的病毒是病毒性胃腸炎的主要原因，但許多其它病毒也可能與爆發(fā)有關(guān)。最優(yōu)選地，本發(fā)明涉及處置輪狀病毒感染。本發(fā)明也用于治療其它非導(dǎo)致腸道疾病，例如病毒性肝炎。選擇性地，遞送系統(tǒng)包括益生微生物。益生微生物優(yōu)選地可在通過GIT后存活，并在胃/腸道中具有活性。優(yōu)選地，微生物可在GIT中產(chǎn)生短暫克?。辉贕IT中表達基因；并可刺激腸道免疫系統(tǒng)。合適的益生微生物的例子包括諸如釀酒酵母(Saccharomyces)、Debaromyces、克魯維酵母(Kluyveromyces)和畢赤酵母(Pichia)之類的酵母，諸如曲霉(Aspergillus)、根霉(Rhizopus)、毛霉(Mucor)和青霉(Penicillium)之類的霉菌，及諸如雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、丙酸桿菌屬(Propionibacterium)、鏈球菌屬(Streptococcus)、腸球菌屬(Enterococcus)、乳球菌屬(Lactococcus)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、片球菌屬(Pediococcus)、微球菌屬(Micrococcus)、明串球菌屬(Leuconostoc)、魏斯氏菌屬(Weissella)、酒球菌屬(Oenococcus)和乳桿菌屬(Lactobacillus)之類的細菌。合適的益生微生物的特定例子有乳酸克魯維酵母(Kluyveroniyceslactis)、脆壁克魯維酵母(Kluyveromycesfragilis)、巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、布拉第酵母(Saccharomycesboulardii)、黑曲霉(Aspergillusniger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、米赫毛霉(Mucormiehei)、枯草芽孢桿菌(Bac川ussubtilis)、納豆芽孢桿菌(Bacillusnatto)、青春雙岐桿菌(Bifidobacteriumadolescentis)、動物雙岐桿菌(B.animalis)、短雙歧桿菌(B.breve)、兩歧雙歧桿菌(B.bifidum)、嬰兒雙歧桿菌(B.infantis)、乳雙岐桿菌(B.lactis)、長雙岐桿菌(B.loiigiim)、屎腸球菌(Enterococcusfaecium)、糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)、短乳桿菌(L.brevis)、干酪乳桿菌(L.casei)、德氏乳桿菌(L.delbrueckii)、發(fā)酵乳桿菌(L.fermentum)、格氏乳桿菌(L.gasseri)、纖維二糖乳桿菌(L.helveticus)、L.johnsonii、乳酸乳桿菌(L.lactis)、類副干酪乳桿菌/副千酪乳桿菌(L.paracasei)、植物乳桿菌(L.plantarum)、羅伊氏乳桿菌(L.reuteri)、鼠李糖乳桿菌(L.rhamnosus)、米酒乳桿菌(L.sakei)、唾'液享L軒菌(L.salivarius)、專L酸專'L球菌(Lactococcuslactis)、Lactococcuscremoris、腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)、乳明串珠菌(Leuconostoclactis)、乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)、啤酒片球菌(P.cerevisiae)、戊糖片球菌(P.pentosaceus)、費氏丙酸桿菌(Propionibacteriumfreudenreichii)、謝氏丙酸桿菌(Propionibacteri腿shermanii)和唾液鏈球菌(Streptococcussalivarius)。特定益生菌林有布拉第酵母(Saccharomycesboulardii)、干酪乳桿菌代田林(Lactobacilluscaseishirota)、Lactobacilluscase"mmunitas、干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)DN-114001、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)GG(ATCC53103)、羅伊氏乳桿菌(Lactobacillusreuteri)ATCC55730/SD2112、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)HNOOl、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)299v(DSM9843)、LactobacillusjohnsoniiLai(I—1225CNCM)、植物乳桿菌(Lactobacillusplantamm)WCFS1、乳雙岐桿菌(Bifidobacteriumlactis)HN019、動物雙岐桿菌(Bifidobacteriumanimalis)DN—173010、動物雙岐桿菌(Bifidobacteriumanimalis)Bbl2、干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)431、嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)NCFM、羅伊氏乳桿菌(Lactobacillusreuteri)ING1、唾液乳桿菌(Lactobacillussalivarius)UCC118、費氏丙酸桿菌(Propionibacteriumfreudenreichii)JS、大腸桿菌(Escherichiacoli)Nissle1917。實用來說，微生物可以是乳酸細菌(lacticacidbacterium)。更優(yōu)選地，微生物從乳桿菌屬(Lactobacillus)或雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)選擇。更優(yōu)選地，微生物是乳桿菌(Lactobacillus)。具體地，乳桿菌是千酪乳桿菌393pLZ15。干酪乳桿菌最近重新鑒定為類干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)(Perez-Martinez,2003)。微生物也可以是益生菌芽孢桿菌種，如LeH.Dueetal.，AppliedandEnvironmentalMicrobiology,2004，p,2161)所述，更優(yōu)選地是蠟質(zhì)芽孢桿菌(Bacilluscereus)、克勞氏芽孢桿菌(Bacillusdausii)和微小芽孢桿菌(Bacilluspumihis)?；谝嫔南到y(tǒng)是安全的、吸引人的方法，是最便宜的抗體產(chǎn)生系統(tǒng)。微生物——優(yōu)選地是表達的抗體相對較容易的乳桿菌的大規(guī)模應(yīng)用，需要最小的處理和儲存費用，是比較經(jīng)濟的。選擇性地，微生物可以是酵母。合適的酵母包括烘烤用的酵母釀酒酵母。其它的酵母例如博伊丁假絲酵母(Candidaboidinii)、多形漢遜酵母(Hansenulapolymorpha)、甲醇畢赤酵母(Pichiatnethanolica)和巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)，也是已知的產(chǎn)生異源蛋白的系統(tǒng)，可用于本發(fā)明中。絲狀真菌、特別是來自木審和曲審屬的種可在其培養(yǎng)基中分泌大量蛋白、代謝物和有機酸。該特性廣泛應(yīng)用于食品和飲品工業(yè)，其中由這些絲狀真菌種分泌的化合物已使用多年。應(yīng)理解這些微生物可以是遺傳修飾的微生物。根據(jù)本方面的遞送系統(tǒng)包含用編碼VHH或VNAR型重鏈免疫球蛋白或其片段，或免疫球蛋白重鏈或輕鏈的結(jié)構(gòu)域抗體(dAbs)或其片段的基因轉(zhuǎn)化的微生物。這種基于益生菌的系統(tǒng)是一種安全的吸引人的將抗體遞送到GIT的方法。益生菌在本領(lǐng)域是已知的，是一種最便宜的抗體產(chǎn)生系統(tǒng)。因此，大規(guī)模應(yīng)用乳桿菌表達抗體相對較容易，需要最小的處理和儲存費用。另外，益生菌至少可在腸道中產(chǎn)生短暫克隆數(shù)天、數(shù)周或幾個月，可在腸道中保持更長的時間，從而持續(xù)產(chǎn)生抗體，以更持續(xù)并延長對導(dǎo)致腸道疾病的微生物或病毒的保護作用。本發(fā)明基于以下發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的VHH或VNAR型重鏈免疫球蛋白或其片段，或免疫球蛋白重鏈或輕鏈的結(jié)構(gòu)域抗體(dAbs)或其片段可用于治療或預(yù)防由導(dǎo)致腸道疾病的微生物所造成的感染。更具體地，VHH或VNAR型重鏈免疫球蛋白或其片段，或免疫球蛋白重鏈或輕鏈的結(jié)構(gòu)域抗體(dAbs)或其片段可用于治療或預(yù)防由輪狀病毒引起的病毒性胃腸炎或腹瀉。本發(fā)明的進一步優(yōu)點是使用了益生菌微生物表達VHH或VNAR型重鏈免疫球蛋白或其功能片段，或免疫球蛋白重鏈或輕鏈的結(jié)構(gòu)域抗體(dAbs)或其功能片段，可使微生物一一例如乳桿菌能提供與該益生菌微生物相關(guān)的正常的健康益處，并在處置需要進行治療的感染中具有預(yù)防/治療的益處。該"雙重作用，，的治療具有協(xié)同作用，從而比本領(lǐng)域已知的治療方法對病人具有更大的健康益處可。根據(jù)本發(fā)明的一個技術(shù)方案，VHH型重鏈免疫球蛋白或其功能片段來自camelids，包括美洲駝和駱駝。重鏈抗體的選擇性來源是鯊魚。最近表明鯊魚在其抗體中也具有單個VH類似的結(jié)構(gòu)域，稱為VNAR。根據(jù)本發(fā)明可使用VNAR型免疫球蛋白片段。也可考慮使用前述功能等價物。選擇性地，可使用重鏈或輕鏈免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)域抗體(dAbs)或其片段。優(yōu)選地，免疫球蛋白是美洲駝來源的重鏈抗體或其片段。已在本領(lǐng)域發(fā)現(xiàn)多種美洲駝來源的重鏈抗體片段。更優(yōu)選地是對輪狀病毒，特別是輪狀病毒林Wa、CK5、Wal、RRV或CK5的結(jié)合親和性的解離常數(shù)至少為10exp5的重鏈免疫球蛋白或其片段。因為已發(fā)現(xiàn)美洲駝重鏈抗體可有效治療輪狀病毒感染，因此它是特別有利的。已發(fā)現(xiàn)美洲駝VHH抗體片段在輪狀病毒感染過程中可降低病毒裝載、使病理學(xué)規(guī)范化，并可減輕腹瀉。特別優(yōu)選地，在本發(fā)明的序列表，SEQIDNo1到21中提供了對輪狀病毒具有親和性的美洲駝來源的VHH序列。選擇性地，根據(jù)本發(fā)明，與SEQIDNo.1至少有70%、80%、85%、90%、95。/。、98%或99%氨基酸同源性并對輪狀病毒顆粒或抗體具有親和性的VHH序列也是優(yōu)選的技術(shù)方案。如本領(lǐng)域所述，VHH序列可來源于駱駝，通過免疫和/或親和性篩選獲得，也可來源于其它諸如鼠或人這樣的哺乳動物，和/或通過氨基酸替代使其駱駝化。在另一個技術(shù)方案中，VHH序列可被融合而產(chǎn)生具有2、3、4、5或多個VHH單位的多聚體單位，選擇性地通過間隔分子連接。在另一個技術(shù)方案中，可將幾個單獨的或在多聚體分子中的VHH序列組合。優(yōu)選地，VHH序列具有不同的特異性，例如可組合VHH序列而對特定病原體提供廣譜親和性。在特別優(yōu)選的技術(shù)方案中，將對任何一個輪狀病毒林Wa、CK5、Wal、RRV或CK5具有親和性的2、3、4、5或更多的VHH序列組合成單獨的單體單位或載體上——例如在益生菌和/或多聚體分子上一一的組合單位。另外，也出乎意料地發(fā)現(xiàn)美洲駝重鏈抗體適于在GIT中給藥。美洲駝重鏈抗體高度抵抗胃中蛋白酶降解，可抵抗胃中的酸性環(huán)境。盡管蛋白水解系統(tǒng)在GIT中比在例如口中活性更高。腸道中的活性被蛋白水解活性一一包括蛋白酶和肽酶所抑制。我們已驚奇地發(fā)現(xiàn)在GIT中體內(nèi)產(chǎn)生或釋放抗體片段可解決口服抗體在胃中和腸道中降解的實際問題。本發(fā)明是第一個可在GIT中表達抗體的系統(tǒng)，適于治療輪狀病毒感染。當選擇益生菌微生物作為遞送系統(tǒng)時，我們發(fā)現(xiàn)這些轉(zhuǎn)化的微生物可在其表面表達美洲駝重鏈抗體或其片段，從而降低病毒裝載、使病理學(xué)規(guī)范化，并在輪狀病毒感染的動物模型中減輕腹瀉。美洲駝重鏈抗體在GIT中由微生物表達。美洲駝來源的VHH抗體片段可在微生物表面和/或作為微生物的分泌蛋白表達。優(yōu)選地，VHH抗體片段的分泌形式是多聚體形式的，以增強病毒裝載的聚集和清除。優(yōu)選地，微生物或更優(yōu)選地益生菌，是用含美洲駝重鏈抗體或其片段的基因的表達載體來轉(zhuǎn)化的。表達載體可包含組成型啟動子以表達抗體或其片段。這種組成型啟動子可支持在給藥后，抗體由轉(zhuǎn)化的乳桿菌進行持續(xù)的(至少短時間)原位表達。選擇性地，可選擇僅在GIT中和/或胃/腸道中有活性一一例如僅適于GIT特異表達的啟動子。這可保證在GIT中表達和/或分泌美洲駝重鏈抗體或其片段。多種乳桿菌組成型啟動子在本領(lǐng)域是已知的，特異的在GIT中表達的誘導(dǎo)型啟動子的例子是Pldh(Pouwelsetal"Lactobacilliasvehiclesfortargetingantigenstomucosaltissuesbysurfaceexpositionofforeignantigens"MethodsinEnzymology(2001)336:369-389)。實施例中描述的表達載體可在轉(zhuǎn)化的乳桿菌中復(fù)制，并表達抗體片段。應(yīng)理解本發(fā)明不對這些復(fù)制表達載體進行限定。在本領(lǐng)域已知可將整個表達盒插入到所謂的"整合"質(zhì)粒中，從而使表達盒在轉(zhuǎn)化后整合到乳桿菌染色體中。(Pouwels,P.H.andChaillou,S.Geneexpressioninlactobacilli(2003)Geneticsoflacticacidbacteriapage143-188)。根據(jù)選擇的技術(shù)方案，如果選擇膠嚢作為遞送系統(tǒng)，膠嚢方法應(yīng)該在通過胃和GIT后可存活，并可在一段時間內(nèi)持續(xù)釋放抗體。從而保證將美洲駝重鏈抗體或片段隨時間遞送到胃中。美洲駝重鏈抗體或VHH或VNAR片段，或免疫球蛋白重鏈或輕鏈的結(jié)構(gòu)域抗體(dAbs)或其片段，由于在釋放時可在腸中存活的能力，因此特別適于該方法。根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案，抗體遞送到GIT中可通過使用食品和制藥工業(yè)已知的膠嚢而實現(xiàn)?？墒褂锰烊簧锒嗑垠w。例子包括Caalginate、角叉菜膠、結(jié)冷膠或明膠。遞送系統(tǒng)可以是本領(lǐng)域已知的膠嚢方法，將免疫球蛋白或其片段特異地遞送到腸道中。因此膠嚢必須存活，直到進入腸道中，然后進行釋放。這種遞送系統(tǒng)包含通用的保護系統(tǒng)，可避免抗體降解。這種技術(shù)包括脂質(zhì)體引導(dǎo)法、轉(zhuǎn)盤掃描和凝聚過程?？墒褂萌魏斡|發(fā)因子來促進膠嚢化成分的釋放，例如pH改變(腸包被)、機械壓迫、溫度、酶活性。這些技術(shù)在SebastienGouin"Microencapsulation:industrialappraisalofexistingtechnologiesandtrends"FoodScienceandTechnology(2004)15:330-347中進行了擴展。選擇性地，膠嚢化方法可使抗體在腸道和/或胃中緩慢釋放。從而使抗體或其功能片段或等價物在一段時間內(nèi)持續(xù)釋放。美洲駝重鏈抗體或其片段可用于治療或預(yù)防病毒感染，例如病毒性胃腸炎或輪狀病毒感染。具體地，抗體可通過已用美洲駝重鏈抗體轉(zhuǎn)化的微生物遞送到GIT中，包括步驟i)用編碼美洲駝重鏈抗體的基因轉(zhuǎn)化微生物，及ii)對需治療的人或動物的GIT中給藥轉(zhuǎn)化的微生物。遞送系統(tǒng)可包含用在腸道中表達和/或分泌的抗體或抗體片段轉(zhuǎn)化的微生物。因此，使用微生物作為遞送系統(tǒng)具有在GIT環(huán)境中體內(nèi)定位產(chǎn)生抗體片段的優(yōu)點，從而解決了口服抗體在胃中降解的實際問題。這種基于益生菌的系統(tǒng)是一種安全的吸引人的將抗體遞送到GIT中的方法。因此，大規(guī)模使用乳桿菌表達抗體是相對較容易的，需要最小的處理和儲存費用，是非常經(jīng)濟的。另外，益生菌將在腸道中存活更長的時間，從而可持續(xù)產(chǎn)生抗體，以更持續(xù)地抵抗導(dǎo)致腸道疾病的微生物。微生物在本發(fā)明的食品中合適的量是每份106至IO"或者(例如，如果每份體積未知)為100克產(chǎn)物1(^至1011，更優(yōu)選地，這些水平為每份或每lOOg產(chǎn)物108到109。根據(jù)本發(fā)明的抗體必須在腸道/胃中有活性，即它們必須是有功能的，并保持滅活靶標的正常活性。根據(jù)本發(fā)明的活性抗體應(yīng)與其靶標正常結(jié)合，因此，抗體對抗原的結(jié)合親和性應(yīng)該是正常的。當解離常數(shù)大于105時具有結(jié)合親和性。因此，根據(jù)本發(fā)明的食品或藥物制劑可選擇性地針對特定的疾病或疾病癥狀?？贵w的選擇取決于待治療或減輕的疾病或癥狀。應(yīng)理解當產(chǎn)物是食品時可使用任何抗體。但當產(chǎn)物是藥物制劑時，優(yōu)選地是VHH或VNAR型重鏈免疫球蛋白或其片段，或免疫球蛋白重鏈或輕鏈的結(jié)構(gòu)域抗體(dAbs)或其片段。優(yōu)選地，抗體或其片段應(yīng)具有一個或多個以下特征i)在存在于G/I通道的條件下具有較好的結(jié)合親和性和所需的抑制功能；及ii)因為對蛋白水解酶的降解是穩(wěn)定的，因此具有較好的蛋白水解穩(wěn)定性。iii)抗體應(yīng)該是熱穩(wěn)定的，從而使其可包含在各種食品中。可通過巴斯德消毒來制備食品，優(yōu)選地是盡管進行熱處理，但抗體的活性大部分保留?？贵w或其片段應(yīng)可在腸道中表達和分泌。已知本領(lǐng)域中的幾種模菌。在Picot，A.andLacroix，C.(InternationalDairyJournal14(2004)505-515)中描述了測定抗體是否在GIT條件下存活的檢測法。為了測定抗體是否適于本發(fā)明，可使用下述檢測方法。產(chǎn)生的抗體在低pH、優(yōu)選地1.5到3.5，存在胃蛋白酶(一種在胃中含量豐富的蛋白酶)特定的條件下進行篩選，從而得到在G/I通道中工作，適于本發(fā)明的高效分子。本發(fā)明可用于處置導(dǎo)致腸道疾病的微生物。導(dǎo)致腸道疾病的微生物包括病毒或?qū)е履c道疾病的細菌。療處置是指治療和/或預(yù)防。本發(fā)明的進一步的技術(shù)方案是含上述遞送系統(tǒng)的食品或藥物制劑。可根據(jù)本發(fā)明制備幾種食品，例如膳食替代物、湯、面條、冰激凌、調(diào)料、調(diào)味品、涂抹食品、快餐、谷物、飲料、面包、餅干、其它烘烤食品、甜點、bars、巧克力、樹脂、奶制品、減肥食品，例如減肥食品或膳食替代物等。雖然上述類型在食品應(yīng)用中是優(yōu)選的，但本發(fā)明的食品可用作飲食的補充。表1所示各種根據(jù)本發(fā)明制備的產(chǎn)品及典型的一份的大小。表l產(chǎn)品一份的大小人造黃油15g冰激凌150g調(diào)味品30g銀p口10gBar75g膳食替代飲料330ml飲料200ml含用抗體或其功能片段轉(zhuǎn)化的微生物的給藥遞送系統(tǒng)的替代方法包括給藥食品——在其至少一個表面含包被的遞送系統(tǒng)——的分散工具。術(shù)語分散工具包括管、吸管、匙或棒或其它用于向用戶遞送液體或半固體食品的工具。分散工具也用于向用戶遞送固體食品。分散用的管或吸管特別適于特定的飲料，其中過高或過低的pH和/或溫度是指不推薦直接向飲料中加入微生物。當本發(fā)明的遞送系統(tǒng)含膠嚢化抗體或甚至抗體本身時也可使用分散工具。分散工具含至少一個包被微生物、膠嚢化抗體或抗體本身的表面。分散工具用這些顆粒包被后，將工具儲存于不透水和其它污染物的外膜中。含這些顆粒的包被材料是對人和細菌無毒性的，可使用諸如玉米油或蠟這樣的油。在US6,283,294Bl中描述了這方面的內(nèi)容。當含顆粒的分散工具插到飲料或半固體食品中，則顆粒整合到食品中，對一份食品給予所需劑量的抗體。優(yōu)選地，膠嚢化抗體、抗體本身或微生物可懸浮在水中，然后使用分散工具并進行蒸發(fā)干燥。使用該方法可使分散工具包被膠嚢化顆粒、抗體本身或微生物，然后當分散工具與液體或半固體食品接觸時進行釋放。本發(fā)明的進一步技術(shù)方案涉及制備含將抗體遞送到GIT中的遞送系統(tǒng)的食品或藥物制劑的方法，其中抗體在腸道中是有活性的，包括將遞送系統(tǒng)在制備食品時加入到食品或藥物制劑中。微生物在食品中必須是有活性的，因此，例如，如果在加工時對食品加熱，則微生物必須在加熱步驟后加入(后給料)。但如果用微生物對食品進行發(fā)酵，則不能進行發(fā)酵后的加熱步驟。如果產(chǎn)物是液體產(chǎn)物，則可用分散工具例如吸管進行微生物給藥。本發(fā)明的進一步技術(shù)方案涉及含根據(jù)本發(fā)明的遞送系統(tǒng)并在給藥后對病人腸道產(chǎn)生健康效果的食品或藥物制劑的用途。這種健康效果包括抗體提供的特定的健康效果。微生物本身可提供幾種健康效果，例如對腸道有益的IBS(腸道易激綜合征)、降低乳糖消化不良、腹瀉的臨床癥狀、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤活性、佐劑效果及增強礦物質(zhì)吸收。根據(jù)本發(fā)明的食品或藥物制劑可用于處置，包括治療或預(yù)防導(dǎo)致腸道疾病的細菌或病毒引起的感染。其它包括在本發(fā)明中的抗體也可提供多種其它的健康效果。本發(fā)明基于以下認識本發(fā)明的VHH或VNAR型重鏈免疫球蛋白或其片段，或免疫球蛋白重鏈或輕鏈的結(jié)構(gòu)域抗體(dAbs)或其片段可用于治療或預(yù)防由導(dǎo)致腸道疾病的微生物所造成的感染。另外，VHH或VNAR型重鏈免疫球蛋白或其片段，或免疫球蛋白重鏈或輕鏈的結(jié)構(gòu)域抗體(dAbs)或其片段可用于治療或預(yù)防由導(dǎo)致腸道疾病的微生物輪狀病毒引起的病毒性胃腸炎或腹瀉。本發(fā)明的進一步優(yōu)點是含表達VHH或VNAR型重鏈免疫球蛋白或其片段，或免疫球蛋白重鏈或輕鏈的結(jié)構(gòu)域抗體(dAbs)或其片段的益生菌的食品或藥物制劑的用途，可使微生物，例如乳桿菌提供與該微生物相關(guān)的正常健康效果，以及在需要進行治療的感染的處置中提供預(yù)防/治療效果。該"二元效果"治療可對病人提供比本領(lǐng)域已知方法更大的健康效果。根據(jù)本發(fā)明的另一個技術(shù)方案，VHH型重鏈免疫球蛋白或其片段來源于camelids、包括美洲駝和駱駝。已在本領(lǐng)域中發(fā)現(xiàn)許多美洲駝來源的治療抗體片段。更優(yōu)選地是對輪狀病毒，特別是輪狀病毒林Wa、CK5、Wal、RRV或CK5具有解離常數(shù)至少為105的結(jié)合親和性的重鏈免疫球蛋白或其片段。我們驚奇地發(fā)現(xiàn)美洲駝重鏈抗體可有效治療輪狀病毒感染。當使用的抗體是美洲駝重鏈抗體時，產(chǎn)生的健康效果包括抗腹瀉作用。因此，美洲駝重鏈抗體可用于治療輪狀病毒感染，包括治療或預(yù)防輪狀病毒感染。我們發(fā)現(xiàn)美洲駝VHH抗體片段在輪狀病毒感染時可降低病毒滴度，使病理正?；p輕腹瀉。輪狀病毒仍然是世界上嬰兒腹瀉的單一的最常見的原因，大多數(shù)兒童在5歲前感染。在發(fā)展中國家，輪狀病毒誘導(dǎo)的腹瀉每年可造成600,000到870，000例死亡，在發(fā)達國家，輪狀病毒疾病造成大量經(jīng)濟損失。另外，也出乎意料地發(fā)現(xiàn)美洲駝重鏈抗體適于在腸道中給藥。我們驚奇地發(fā)現(xiàn)美洲駝重鏈抗體在胃中高度耐受蛋白酶的降解，而且可耐受胃中的酸性環(huán)境。盡管在腸道/胃中的蛋白水解系統(tǒng)比例如口中的環(huán)境更有活性。在G1T定位體內(nèi)產(chǎn)生抗體片段可解決口服的給藥抗體在胃中降解的實際問題。本發(fā)明是第一個可在GIT中表達抗體的系統(tǒng)，適于治療輪狀病毒感染。因此，含表達美洲駝重鏈抗體的食品或藥物制劑的用途可使乳桿菌提供正常的與該益生菌相關(guān)的健康作用，并在輪狀病毒感染的處置中提供預(yù)防/治療作用。本發(fā)明是第一個可在GIT中表達抗體的系統(tǒng)，適于治療輪狀病毒感染。應(yīng)理解可給藥食品或藥物制劑以對病人提供健康效果和/或?qū)固囟ǖ募膊』蚋腥尽？贵w的選擇依賴于待治療的疾病。優(yōu)選地，用含美洲駝重鏈抗體或其片段的表達載體轉(zhuǎn)化微生物?？墒褂谜闲突驈?fù)制型載體。如果選擇膠嚢作為遞送系統(tǒng)，則膠嚢方法應(yīng)在通過GIT時在胃中存活，應(yīng)該在一段時間內(nèi)提供持續(xù)的抗體釋放。從而保證美洲駝重鏈抗體或片段在一段時間內(nèi)遞送到胃中。美洲駝重鏈抗體或其重鏈由于其在釋放時具有可在腸道中存活的能力，因此特別適于膠嚢化方法。具體地，可使用用美洲駝重鏈抗體轉(zhuǎn)化的微生物將抗體遞送到GIT中，包括步驟i)用編碼美洲駝重鏈抗體的基因轉(zhuǎn)化微生物；及ii)對需治療的人或動物的GIT給藥轉(zhuǎn)化的微生物。人造黃油和其它涂抹食品典型地，它們是水包油或油包水的乳液，也可以是覆蓋的基本不含脂肪的涂抹食品。典型地，這些產(chǎn)品在溫度例如2-iox:是易涂開的，但流動不通暢。脂肪水平在很大范圍變化，即全脂的人造黃油含60-90wt。/。脂肪，中等脂肪的黃油含30-60wt。/n脂肪，低脂肪黃油含10-30wf/。脂肪，更低或無脂肪黃油含0到10wt。/。脂肪。人造黃油和其它涂抹食品的脂肪可以是任何食用脂肪，通常為豆油、葵花籽油和棕櫚油?？墒褂眯揎椥问降闹?，例如氫化、酯化、提純等。其它合適的油是本領(lǐng)域已知的，可根據(jù)需要進行選擇。人造黃油或涂抹食品的pH優(yōu)選地為4.5到6.5。除了人造黃油外的其它涂抹食品的例子是干酪涂抹食品、甜味涂抹食品、酸奶酪涂抹食品等。涂抹食品進一步可選的成分為乳化劑、著色劑、維生素、防腐劑、樹脂、增稠劑等。產(chǎn)物通常在水中平衡。人造黃油或其它涂抹食品平均一份的典型大小是15克。優(yōu)選地，每份人造黃油或涂抹食品中產(chǎn)VHH的乳桿菌是106至1011，更優(yōu)選地為每份108至101G。必須在加熱過程后無菌加入乳桿菌菌林。選擇性地，可向食品中加入膠嚢化VHH。優(yōu)選地每份加入25到5000pg，更優(yōu)選地每份為50到500pg。最優(yōu)選地，每天食用2到3份。冷凍的甜點食品對于本發(fā)明而言，術(shù)語冷凍的甜點食品包括含諸如水淇淋、冷凍黃油、冰凍果子露果汁水糕、水牛奶和冷凍奶油凍、冰水物、格蘭尼它水糕及冷凍的水果湯這樣的冷凍甜點的牛奶。優(yōu)選地，冷凍甜點中固體的水平(例如糖、脂肪、調(diào)料等)為大于3wt%，更優(yōu)選地為10至!)70wto/0，介il如40至i70wt0/0。水激凌典型地含2到20wtY。脂肪、0到20wt"/n甜料、2到20wt%非脂肪奶成分和諸如乳化劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、香料成分、維生素、礦物質(zhì)等這樣的選擇性成分，用水平衡。典型地冰激凌是充氣的，例如使其擴大20到400%，更通常為40到200%，并在-2到-200TC，更優(yōu)選地-IO到-30下冷凍。冰激凌通常含O.lwt"/。的鉀。平均每份冰凍甜點材料的典型大小是150克。優(yōu)選地乳桿菌水平為每份106至IO11，更優(yōu)選地為每份107至101D，最優(yōu)選地為每份108至109。必須在加熱過程后無菌加入乳桿菌菌抹。選擇性地，可向食品中加入膠嚢化VHH。優(yōu)選地每份加入25到5000ng,更優(yōu)選地每份加入50到500pg。最優(yōu)選地，每天食用2到3份。飲料、例如基于茶的產(chǎn)品或食品替代物乳桿菌可有益用于飲料例如果汁、軟飲料等中。根據(jù)本發(fā)明的一種非常有益的飲料是基于茶的產(chǎn)品或食品替代物飲品。這種產(chǎn)品在下面進行詳細描述。顯然可對其它含由乳桿菌細菌產(chǎn)生的維生素的飲料中使用同樣的水平和成分。根據(jù)本發(fā)明的目的，術(shù)語基于茶的產(chǎn)品是指含茶或替代茶的草藥成分_一例如茶包、茶葉、草藥茶包、草藥液、茶粉、草藥茶粉、水茶、水草藥茶、碳酸冰茶、碳酸草藥液等的產(chǎn)品。典型地，本發(fā)明中這些基于茶的產(chǎn)品在使用前需進行制備步驟，例如從茶包、茶葉、草藥茶包或草藥液進行茶的釀造或?qū)Σ璺刍虿菟幉璺圻M行增溶。對這種產(chǎn)品，優(yōu)選地是調(diào)整產(chǎn)品中乳桿菌的水平，以使一份最終產(chǎn)品中含有上述乳桿菌所需的水平。對冰茶、冰草藥茶、碳酸冰茶、碳酸草藥液而言，典型地一份的大小是200ml或200克。食品替代物飲品典型地基于液體堿，可通過樹脂或纖維進行增稠，其中加入礦物質(zhì)和維生素的混合物?？蓪嬃险{(diào)整到所需的口味，例如水果或巧克力口味。典型地一份的大小是330ml或330克。對基于茶的飲料和食品替代物飲料而言，優(yōu)選地乳桿菌水平為每份1(^至1011，更優(yōu)選地為每份107至101()，最優(yōu)選地為每份108至109。選擇性地，可向食品中加入膠囊化VHH。優(yōu)選地每份加入25到5000pg，更優(yōu)選地每份加入50到500pg。最優(yōu)選地，每天食用2到3份。對提取而獲得終產(chǎn)物的食品而言，通常的目標是保證200ml或200克的每份食品含有如上文所述的所需的量。在本文中，應(yīng)理解到，通常存在于基于所提取產(chǎn)品的茶中的乳桿菌僅有一部分最終被提取到最后的茶飲料中。為了補償這種作用，通常向待提取的食品中摻入2倍提取物所需的量。對茶葉或茶包而言，典型地使用l-5克茶來制備一份200ml的飲料。如果使用茶包，可將乳桿菌摻入到茶成分中。但對某些用途而言，將茶與乳桿菌分離是有利的，例如插入單獨的茶包間隔或在茶包紙上使用。色拉調(diào)味品或蛋黃醬通常調(diào)味品或蛋黃醬是水包油乳液，乳液中的油相通常占產(chǎn)物的0到80wt%。對非脂肪還原產(chǎn)物來說，脂肪水平典型地為60到80%,對色拉調(diào)味品而言，脂肪水平通常為10-60wt%，更優(yōu)選地為15-40wt%，低或無脂肪調(diào)味品可含例如甘油三酸酯的水平為重量的0、5、10、15%。調(diào)味品和蛋黃醬通常是低pH產(chǎn)物，優(yōu)選地pH為2-6。調(diào)味品或蛋黃醬選擇性地可含有其它成分，例如乳化劑(例如蛋黃)、穩(wěn)定劑、成酸劑、多聚物、散裝成分、香料、著色劑等。成分的平衡液是水，存在的水平是0.1到99，9wt%，更優(yōu)選地為20-99wt%，最優(yōu)選地為50到98wt%。平均一份調(diào)味品或蛋黃醬的典型大小是30克。在這種產(chǎn)品中優(yōu)選地乳桿菌水平為每份106至IO11，更優(yōu)選地為每份107至101G，最優(yōu)選地為每份108至109。必須在加熱過程后無菌加入乳桿菌菌林。選擇性地，可向食品中加入膠嚢化VHH。優(yōu)選地每份加入25到5000pg，更優(yōu)選地每份加入50到500pg。最優(yōu)選地，每天食用2到3份。食品替代物快餐或bars這些產(chǎn)物通常含各種可食用的材料混合物，其中可摻入乳桿菌。例如混合物可以是基于脂肪的(例如巧克力層或巧克力)或基于面包產(chǎn)物的(面包、生面團、餅干等)或基于成塊顆粒的(大米、谷粒、堅果、葡萄干、水果顆粒)?？觳突蛩教娲颾ar的典型大小是20到200克。通常為40到IOO克。在這種產(chǎn)品中優(yōu)選地乳桿菌水平為每份106至IO11，更優(yōu)選地為每份107至101()，最優(yōu)選地為每份108至109。必須在加熱過程后無菌加入乳桿菌菌林。選擇性地，可向食品中加入膠嚢化VHH。優(yōu)選地每份加入25到5000ng，更優(yōu)選地每份加入50到500pg。最優(yōu)選地，每天食用2到3份?？上虍a(chǎn)物加入其它成分，例如調(diào)味材料、維生素、礦物質(zhì)等。對每種上述食品，每份乳桿菌的量作為優(yōu)選實施例給出。應(yīng)理解到作為選擇，任何合適的益生菌均可以該水平存在。檸檬粉乳桿菌也可以以小袋用于千粉中，通過速溶在水中而得到?jīng)鏊臋幟仕＿@種粉末可含有基于食品的載體，例如麥芽糊精或其它載體。選擇性的其它成分可以是著色劑、維生素、礦物質(zhì)、防腐劑、樹脂、增稠劑等。平均一份食品或人造黃油或其它調(diào)味品的典型大小是30到50克。優(yōu)選地產(chǎn)VHH的乳桿菌在檸檬粉中為每份1(^至1011，最優(yōu)選地為每份108至101()。根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，必須將乳桿菌菌林噴灑在載體上，從而使其保持活性。選擇性地，可向食品中加入膠嚢化VHH。優(yōu)選地每份加入25到5000pg，更優(yōu)選地每份加入50到500pg。在所有上述食品中，可加入作為活體培養(yǎng)的(濕的)生物量或作為千燥成分——但仍含本領(lǐng)域已知的活微生物——的轉(zhuǎn)化微生物。本發(fā)明將通過以下實施例進行描述。實施例實施例1到3:抗體片段產(chǎn)生及隨后的體外和體內(nèi)檢測。實施例1從美洲駝免疫噬菌體展示文庫中篩選輪狀病毒特異的重鏈抗體片段并在酵母中生產(chǎn)。如前所述對恒河猴輪狀病毒林RRV(血清型為G3)進行純化、擴增和濃縮(SvenssonL"FinlayB.B.，BassD.，VonbonsdorffC.H.，GreenbergH.B."Symmetricalinfectiononpolarisedhumanintestinalepithelial(CaCo-2)cells".JVirol.(1991)65，4190-4197。在O、42、63、97和153天用5xlO"pfu輪狀病毒林RRV對美洲駝進行皮下和肌肉內(nèi)免疫。在免疫前，將病毒顆粒放在油乳液中(1:9WV，溶在PBS中的抗原Specol(Bokhout，B.A.，VanGaalen，C，andVanDerHeijden，Ph.J."Aselectedwater-in-oilemulsion:compositionandusefulnessasanimmunologicaladjuvant".Vet.Immunol.Immunopath.(1981)2:491-500andBokhout,B.A.，Bianchi,A.T.J.，VanDerHeijden,Ph.J.，Scholten，J.W.andStok，W."Theinfluenceofawater-in-oilemulsiononhumoralimmunity".Comp.Immun.Microbiol.Infect.Dis.(1986)9:161-168。如前所述(Frenken,L.G.J"etal."IsolationofantigenspecificLlamaVHHantibodyfragmentsandtheirhighlevelsecretionbySaccharomycescerevisiae，'.J.Biotechnol.(2000)78，11-21)。然后通過前述的程序，用溶在0.9%NaCl中滴度為4xl()S的RRV輪狀病毒由ELISA滴定血清樣品中的免疫反應(yīng)(DeHaard，HJ.，vanNeer，N.，Reurs，A.，Hufton，S.E.，Roovers，R.C.，HenderikxP.，deBruineA.P"ArendsJ.W.，andHoogenboom,H.R."Alargenon-immunizedhumanFabfragmentphagelibrarythatpermitsrapidisolationandkineticanalysisofhighaffinityantibodies".J.Biol.Chem.(1999)274:18218-18230.;Frenken，LG.J.,etal."IsolationofantigenspecificLlamaVHHantibodyfragmentsandtheirhighlevelsecretionbySaccharomycescerevisiae",J.Biotechnol.(2000)78，11-21)。從約150ml153天的血樣品通過Ficoll(Pharmacia)不連續(xù)梯度離心獲得豐富的淋巴細胞.從這些細胞中，通過硫氰酸胍提取方法提取總RNA(250至寸400)，Chomczynski，P,andSacchi，N."Single—stepmethodofRNAisolationbyacidguanidiniumthiocyanate-phenol-chloroformextraction".Anal.Biochem.(1987)162:156-159。然后用Amersham第一鏈cDNA試劑盒(RPN1266)合成cDNA的第一條鏈。在20jal反應(yīng)混合液中使用0.4-l^igmRNA。用6-mer隨機引物擴增第一條鏈。合成cDNA后，將反應(yīng)混合物直接進行PCR擴增。VHH基因擴增使用的引物是Lam-16:(GAGGTBCARCTGCAGGASAGYGG);Lam-17:(GAGGTBCARCTGCAGGASTCYGG);Lam-07(起始短的鉸鏈區(qū))；和Lam-08(長鉸鏈區(qū)特異的)(Frenken，LG.J.，etal."IsolationofantigenspecificLlamaVHHantibodyfragmentsandtheirhighlevelsecretionbySaccharomycescerevisiae".J.Biotechnol.(2000)78，11-21)。DNA的擴增如DeHaard，H.J.，vanNeer,N"Reurs，A"Hufton，S.E"Roovers，R.C.，HenderikxP.，deBruineA.P.，ArendsJ.W.andHoogenboomH.R."Alargenon-immunizedhumanFabfragmentphagelibrarythatpermitsrapidisolationandkineticanalysisofhighaffinityantibodies".J.Biol.Chem.(1999)274:18218-18230所述進行。擴增產(chǎn)物用PstI和NotI消化(NewEnglandBiolabs，US)，并克隆到基于pHENl(Hoogenboom,H.R"Griffiths,A.D"Johnson,K.S"Chiswell，D.J"Hudson,P.andWinter,G."Multi-subunitproteinsonthesurfaceoffilamentousphage:methodologiesfordisplayingantibody(Fab)heavyandlightchains".NucleicAcidsRes.(1991)19:4133-4137)的喧菌體粘粒載體pUR5071中，該載體含有可進行免疫親和色i普的6組氨酸尾(Hochuli，E"Bannwarth，W"Diibeli，H"Gentz，R.andStiiber，D."Geneticapproachtofacilitatepurificationofrecombinantproteinswithanovelmetalchelateadsorbent".Bio/Technol.(1988)6:1321—1325)和用于檢效'J的c—myc來》源的才示i己(MunroS.andPelhamH.R."AnHsp70-likeproteinintheER:identitywiththe78kdglucose-regulatedproteinandimmunoglobulinheavychainbindingprotein".Cell(1986)46:291-300)。連接和轉(zhuǎn)化如前所述進4亍(DeHaard.H.J"vanNeer，N"Reurs，A"Hufton，S.E"Roovers,R.C"HenderikxP"deBruineA.P.，ArendsJ.W.andHoogenboomH.R."Alargenon-immunizedhumanFabfragmentphagelibrarythatpermitsrapidisolationandkineticanalysisofhighaffinityantibodies".J.Biol.Chem.(1999)274:18218-18230.)。通過輔助噬菌體VCS-M13的補救及PEG沉淀如Marks,J.D"Hoogenboom，H.R.，Bonnert,T.P.，McCafferty，J"Griffiths,A.D.andWinter,G."Bypassingimmunization:HumanantibodiesfromV-genelibrariesdisplayedonphage".J.Mol.Biol.(1991)222:581-597所述進行。通過包被輪狀病毒林RRV(第一輪為2.5xio7pfu/ml;第二輪為5xl04pfu/ml;第三輪為500pfu/ml)利用生物淘洗的方法篩選輪狀病毒特異的喧菌體(MarksJ.D.，Hoogenboom,H.R.，Bonnert,T.P.，McCafferty,J.，Griffiths,A.D.andWinter,G."By-passingimmunization:HumanantibodiesfromV-genelibrariesdisplayedonphage".J.Mol.Biol.(1991)222:581-597.)。用在碳酸緩沖液(16%(v/v)0.2MNaHC03+9%(v/v)0.2MNa2C03)中1:1000稀釋的抗輪狀病毒兔血清或抗輪狀病毒的豚鼠血清包被免疫管(Nunc,Roskilde，Denmark)于41C過夜。通過多克隆抗輪狀病毒血清捕獲病毒顆粒。除了標準的篩選外，也在酸性環(huán)境中篩選了抗體片段展示的噬菌體。通過稀釋的HC1溶液(pH2.3)進行篩選。在該合適的篩選過程后，進行標準的流程。通過單個大腸桿菌TGI克隆來產(chǎn)生可溶性VHH，如MarksJ.D.，Hoogenboom,H.R.，Bonnert,T.P.，McCafferty，J.，Griffiths,A.D.andWinter,G."By-passingimmunization:HumanantibodiesfromV-genelibrariesdisplayedonphage".J.Mol.Biol.(1991)222:581-597所述。用ELISA檢測培養(yǎng)上清。用50pl/孔在碳酸緩沖液(16%(v/v)0.2MNaHC03+9%(v/v)0.2MNa2C03)中1:1000稀釋的抗輪狀病毒兔多克隆血清或抗輪狀病毒豚鼠多克隆血清包被MicrolonF(GreinerBio-OneGmbH,Germany)平板，然后與輪狀病毒林RRV或CK5(約109pfu/ml)溫育。含VHH的上清溫育后，用鼠抗myc單克隆抗體9E10(500ng/ml，內(nèi)部產(chǎn)品)和抗鼠HRP耦聯(lián)物(250ng/ml，Dako，Denmark)的混合物檢測VHH。選擇性地，可用抗6xHis-HRP抗體耦聯(lián)物(1000ng/ml，RocheMolecular,US)進行檢測。用限制性酶HinFI(NewEnglandBiolabs,US)對所有克隆進行指紋分析(Marks，J.D"Hoogenboom,H.R.，Bo匿rt，T.P.，McCafferty,J"Griffiths,A.D.andWinter,G."By-passingimmunization:HumanantibodiesfromV-genelibrariesdisplayedonphage".J.Mol.Biol.(1991)222:581_597)。在BaseclearB.V.(Leiden,TheNetherlands)進行測序。篩選到一組輪狀病毒特異的抗體片段。從pUR5071(Pstl/BstEII，NewEnglandBiolabs,US))分離編碼這些抗體片段的DNA序列，將其克隆到與前述pUR4548(Frenken，L.G.J.，etal."IsolationofantigenspecificLlamaVHHantibodyfragmentsandtheirhighlevelsecretionbySaccharomycescerevisiae".J.Biotechnol.(2000)78，11-21)相同、但不編碼任何C末端標記序列的pUR4547中。該附加型酵母表達載體含GAL7啟動子，用于高效表達和分泌到生長培養(yǎng)基中的SUC2信號序列。如前所述轉(zhuǎn)化釀酒酵母林VWK18ga11，并誘導(dǎo)抗體片段的產(chǎn)生(VanderVaart,J.M.，"ExpressionofVHHantibodyfragmentsinSaccharomycescerevisiae".InMethodsinMolecularBiology(2001)Vol.178，p359-366，EditedbyP.M.O'BrienandR.Aiken，HumanaPressInc.,Totowa，NJ)。通過截留為10kDa的微孔過濾器(Amicon，US)純化和濃縮抗體片段。結(jié)果下表中列出抗輪狀病毒VHH片段的總結(jié)情況，VHH片段的序列列在序列表和圖12中。配體原始的大腸桿菌克隆酵母克隆附加體的產(chǎn)生SEQIDNo:中和作用Antkota畫2B10+++1+++(體內(nèi))AntkotaVHH21D3++2++沐內(nèi))AntkotaVHH31F6++3++(體內(nèi))AntkotaVHH41H4++4++沐內(nèi))Anti-rataVHH5GP-P3A-6E+++5-Anti-rotaVHH61B5+++6-Anti-rotaVHH7RAB-P3A-6C+7-AntkotaVHH81B2++8-Anti-roteVHH9菌+9-Anti-rota翻10RAB-P1-2G+10+(體內(nèi))A麵a翻11G6+++11+/-(體外)AntkotaVHH122E4+++12"(體內(nèi))Anti-ro固H132F11++13她ota畫4RAB-P1-1F+++14++(體內(nèi))AnlkotaVHH151B8+15+/-(體外)Anti-rote薩63E7+++16-AntkotaVHH171D2++17+++(體外)Anti-rota畫81E4+++18+(體外)Anti-rotaVHH191D4+/-19++(體外)Antkota窗01A1+20++(體外)AntkoteVHH211E1++++21-實施例2體外抑制輪狀病毒從蘇格蘭中洛錫安郡Moredun研究所獲得牛輪狀病毒ComptonCK5，BS-C1細胞購自歐洲動物細胞保藏中心(EuropeanAnimalCellCultureCollection)。將BS-CI細胞培養(yǎng)在補加10%熱滅活的胎牛血清、1%MEM氨基酸溶液(100x)、20mmolI-1L-谷氨酸、100I.U.ml-1青霉素、100pgml"鏈霉素和2.5ngml-l兩性霉素B(均購自Sigma，US)的Earles改進基本培養(yǎng)基中。將CK5輪狀病毒儲液在添加1%MEM氨基酸溶液(lOOx)、20mmol1-1L-谷氨酸和0.5ng/ml結(jié)晶胰島素的無血清的培養(yǎng)基(SFM)EMEM中稀釋，然后將稀釋的5ml種液加到培養(yǎng)在162cm2組織培養(yǎng)燒瓶(Costar，UK)中的BS-CI細胞的匯合細胞單層中。在"XM吏病毒在細胞上吸收1小時，然后將培養(yǎng)基加到75ml。將燒瓶在37TC溫育至觀察到完全的細胞病變作用。將培養(yǎng)物凍(-70TC)融2次，然后集中并于1450g，4TC離心15分鐘，除去細胞碎片。將上清輕輕倒出，并等份儲存在-70TC。將單層BS-C1細胞于371C，95%空氣和5%二氧化碳下在12孔組織培養(yǎng)板中培養(yǎng)。在使用前至少2小時的時候，除去培養(yǎng)基，用SFM替代。在SFM中稀釋CK5病毒至50pfu/ml。在SFM中稀釋篩選的抗輪狀病毒片段，然后將等體積病毒和片段稀釋液混合(總體積為200pl)，于37TC溫育1小時。然后將病毒片段混合物鋪在單層細胞上(每種重復(fù)3個孔)。將平板于37TC，95%空氣和5%二氧化碳下溫育1小時。然后，除去病毒，并加入含IOOI.U.ml"青霉素、H)Oiagml"鏈霉素、2.5pgml"兩性霉素B和0.1pg/ml結(jié)晶胰烏素，及0.75。/"SeaPlaque瓊脂(FMC)的EMEM覆蓋層。然后將平板于37<€，95%空氣和5%二氧化碳下溫育4天。用溶在10%甲醛中的1%結(jié)晶紫染色后，除去瓊脂糖，用水洗滌孔，并對斑進行計數(shù)。根據(jù)上述方法，從23個檢測的克隆中得到9個可產(chǎn)生中和該輪狀病毒林的抗體片段。在斑檢測實驗中，片段2B10和1D3中和輪狀病毒的作用最有效(圖1)。圖1所示的是通過體外斑檢測法測定的輪狀病毒CK5的病毒中和作用。在每個數(shù)據(jù)點顯示了4個測定值的平均中和速率。如果在數(shù)據(jù)點的伸展超過10%，則表示有兩個較大的測定值(虛線)。將檢測的抗體片段分為2個圖，A和B。A的陰性對照是或者省略病毒(無病毒)，或者沒有加入非輪狀病毒特異的VHH。非特異VHH片段對人孕激素hCG是特異的。該片段的分離如(Spinelli，S.，F(xiàn)renken，L"Bourgeois,D"deRon,L.，Bos，W.，Verrips，T.，Anguille，C，Cambillau，C.andTegoni，M."ThecrystalstructureofaLlamaheavychaindomain",Nat.Struct.Biol.(1996)3:752-757;Frenken,LG.J.，etal."IsolationofantigenspecificUamaVHHantibodyfragmentsandtheirhighlevelsecretionbySaccharomycescerevisiae".J.Biotechnol.(2000)78，11-21)所述。因此，通過本方法可鑒定多種可在體外系統(tǒng)中抑制輪狀病毒感染的VHH片段。實施例3輪狀病毒在鼠體內(nèi)的抑制將某些通過實施例2所述的方法篩選的VHH片段用于體內(nèi)實驗中，以研究這些抗體片段在鼠中預(yù)防或治療輪狀病毒誘導(dǎo)的腹瀉的效率。該模型系統(tǒng)常用于研究輪狀病毒感染(Ebina，T，Ohta，M，Kanamaru，Y，Yamamotoosumi,Y，Baba,K."Passiveimmunisationsofsucklingmiceandinfantswithbovinecolostrumcontainingantibodiestohumanrotavirus".JMedVirol.(1992)38:117-123)。從丹麥M61Ieg^rd獲得懷孕14天、無輪狀病毒的BALB/c鼠。將鼠在Huddinge醫(yī)院的動物中心進行單獨培養(yǎng)。從瑞典Huddinge醫(yī)院Karolinska研究所的當?shù)貍惱砦瘑T會獲得批準。正常的塊狀食物和水隨意提供。為了檢測片段在輪狀病毒(RV)結(jié)合后是否可抑制感染，將篩選的VHH片段在用于感染的一天前與滴定量的RRV(2x107ffu)預(yù)混合。用VHH片段每天處理4天齡的幼鼠，包括第0天(感染前一天)到第四天(圖2)，對腹瀉進行評估。對抗體片段2810觀察到腹瀉發(fā)生明顯降低，如圖2所示。與未處理組相比較，用片段2B10處理的組在第二天產(chǎn)生腹瀉的幼鼠數(shù)目顯著降低。另外，與其它RRV處理的組的多數(shù)幼鼠相比較，在第3、4、5天，2B10處理組的幼鼠沒有一只表現(xiàn)出腹瀉癥狀(圖2)。與未處理組相比較，沒有發(fā)現(xiàn)無關(guān)VHH片段RR6(針對含氮染料；Frenken,LG.J.，etal."IsolationofantigenspecificLlamaVHHantibodyfragmentsandtheirhighlevelsecretionbySaccharomycescerevisiae".J.Biotechnol.(2000)78，11-21)具有統(tǒng)計學(xué)顯著的作用。另外，對每個處理組計算了每只幼鼠腹瀉的平均天數(shù)，以每只幼鼠的腹瀉天數(shù)除以每個處理組幼鼠的總數(shù)目表示。與未處理組2.87±0.29天相比較，片段2B10處理的組為0.33±0.21天，是顯著降低的。需要注意的是，從現(xiàn)在開始，在以下實施例中，含編碼片段2B10的plJR5071來源的質(zhì)粒命名為pUR655，編碼的抗體重新命名為VHH1。實施例4(a到k)如下進行分別與實施例1到3類似的進一步實驗a)構(gòu)建抗輪狀病毒scFv—2A10和VHH1的表達載體。從抗輪狀病毒mAb2A10(IgA類型)分泌雜交瘤(Giammariolietal.(1996)Virol.225:97-110))中提取總RNA。用5'RACE試劑盒(5'RACESystemforRapidAmplificationofcDNAEnds(第二版，InvitrogenTMlifetechnologies,Carlsbad,CA)擴增編碼重鏈(VH)和輕鏈(VK)可變區(qū)的序列。VH5，RACE的引物如下ACRACE1:5，-CAGACTCAGGATGGGTAAC-3，，ACRACE2:5，-CACTTGAATGATGCGCCACTGTT-3，，ACRACE3:5，-GAGGGCTCCCAGGTGAAGAC-3，，而引物，mkRACEl(5，-TCATGCTGTAGGTGCTGTCT-3，)，mkRACE2(5，-TCGTTCACTGCCATCAATCT-3，)和mkRACE3(5，-TGGATGGTGGGAAGATGGAT-3，)用于擴增輕鏈可變區(qū)。將得到的帶A尾的PCR產(chǎn)物克隆到帶3'-T突出的pGEMA-Teasy載體中，并進行測序。將VH和VK序列與編碼基因(含氨基酸序列為(G4S)3)融合。將兩條鏈重新從克隆的5，RACE產(chǎn)物中擴增出來，使用以下引物Clal-VHs(5，-TTTTATCGATGTGCAGTTGGTGGAGTCTGG-3，)和Linker-VHas(5，-CGATCCGCCACCGCCAGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCTGAGGAGACGGTGACCGTGG-3，)；Linker-VKs(5,-GGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGGACATTGTGATGACCCAGTC-3，)和EcoRI-Vkas(5，-TTTTGAATTCTTTTATTTCCAGCCTGGTCC-3，).將得到的VH和VKCPR產(chǎn)物混合，作為融合PCR的模板，使用CIaI-VHs和EcoRI-VKas進行擴增。將融合的PCR產(chǎn)物通過TaqDNA聚合酶加上突出的A后克隆到pGEMA-Teasy載體中。最后用EcoRI及Clal從質(zhì)粒中切下融合的scFv-2A10編碼序列，將其亞克隆到含E標記(pBS—E—tag)的pBluescriptIISK(+)(Stratagene，LaJolla，CA)中。用含Clal限制性位點的正向引物和含EcoRI限制性位點的反向引物從pUR655擴增VHH1，然后將其插入到pBS-E-tag載體中。為了產(chǎn)生表面表達的抗體片段，將scFv-2A10-E-tag和VHH1-E-tag從pBS-E-tag載體上通過Clal和Xhol限制性位點切割，并與干輅乳桿菌蛋白酶P蛋白的最后244個氨基酸編碼的錨定序列融合(Kriigeretal，NatureBiotechnol(2002)20:702-706)，然后插入到乳桿菌表達載體pLP502中(圖3A和3C)。為了產(chǎn)生分泌的抗體片段，通過PCR擴增在E標記后插入一個終止密碼子(TAA)，將產(chǎn)物插入到pLP502的Clal和Xhol限制性位點之間(圖3B和3D)。pLP502載體含乳糖脫氫酶基因的組成型啟動子(Pldh)(Pouwelsetal."Lactobacilliasvehiclesfortargetingantigenstomucosaltissuesbysurfaceexpositionofforeignantigens"MethodsinEnzymology(2001)336:369-389)。對類干酪乳桿菌的轉(zhuǎn)化如前所述進4亍(上述Kriigeretal(2002))。b)比較轉(zhuǎn)化的乳桿菌中抗體特異的轉(zhuǎn)基因的表達水平。從培養(yǎng)至OD600為0.8的不同乳桿菌構(gòu)建體中提取總RNA(QIAGEN)，用RQ1DNase(Promega)消化殘余的DNA后進4亍反轉(zhuǎn)錄。通過qPCRcore試劑盒及SYBRgreenI(MedProbe，Oslo,Norway)和ABIPRISM7000序列檢測系統(tǒng)(PEAppliedBiosystems，F(xiàn)osterCity,CA)測定不同抗體片段的mRNA的量。典型的時間分布為起始步驟95"C，10分鐘，然后進行第二個步驟，95TC15秒，58TC1分鐘，40個循環(huán)。產(chǎn)生的cDNA用于產(chǎn)生16SrRNA和抗體插入片段的標準曲線，對16SrRNA使用引物p0(5'GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG3')和p6(5'CTACGGCTACCTTGTTACGA3')，對插入片段使用引物prtpsp(5TCTTGCCAGTCGGCGAAAT3')和XhoI-VHH(5'CCGCTCGAGTGCGGCACGCGGTTCC3')。c)分泌的抗體片段的純化。將含構(gòu)建體的類干酪乳桿菌培養(yǎng)至OD600為0.8，以純化分泌的VHH1抗體片段。離心后，將上清的pH調(diào)整為7，并通過0.45]am過濾器進行過濾。隨后根據(jù)RPAS純化系統(tǒng)(Amersham-Bioscience,LittleChalfont，Buckinghamshire,UK)提供的說明書將分泌的抗體片段進行純化。用Spectra/Porjn膜MWCO6-8000(SpectrumMedicalIndustries,Inc.,LosAngeles,CA)對1xPBS于8t:進行過夜透才斤。將純化的抗體片段進行15%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，驗證樣品的純度，并通過BioRad蛋白效'J定法(BioRadLaboratories,Hercules,CA)測定總蛋白的濃度。d)蛋白提取和蛋白濃度測定。將含構(gòu)建體2A10-錨定物、VHHl-錨定物、分泌型2A10、分泌型VHH1、分泌型無關(guān)物質(zhì)及無關(guān)物質(zhì)錨定物的類干酪乳桿菌在含3pg/ml紅霉素的MRS肉湯中培養(yǎng)至ODG00為0.8。將細菌在含10mg/ml溶菌酶的10mMTris-HCl，pH8.0中，于37匸裂解1小時，然后通過占空比為60%的超聲進行破碎(6x30s開/關(guān)循環(huán))(DigitalSonifier，model250，BransonUltrasonicscoorporation，Danbury，CT)。通過離心除去碎片。通過超濾(Amicon，Beverly,MA)將上清濃縮50倍。通過BioRad蛋白測定法如上所述測定蛋白濃度。e)酶聯(lián)免疫吸收測定法和流式細胞技術(shù)。用兔抗人輪狀病毒血清(1/1000)包被ELISA96孔板。用1:100稀釋的恒河猴輪狀病毒儲液(RRV)進行第二次包被。封閉后，將平板與蛋白提取液或濃縮的上清一起溫育。加入鼠抗E標記的抗體(AmershamPharmaciaBiotech,Bucks,UK)或兔抗美洲駝抗體、辣根過氧化物酶耦聯(lián)的羊抗鼠抗體或豬抗兔抗體(DAKOAJS，Glostmp，Denmark)和3，3'，5，5'-四曱基聯(lián)苯胺(TMB)，用Vmax微板讀數(shù)儀(MolecularDevices,Sunnyvale,CA)測定630nm處的吸收值。所有抗體進行1/1000稀釋。以純化的VHH1-E-標記和單克隆2A10抗體為標準，測定不同乳桿菌轉(zhuǎn)化子產(chǎn)生的抗體片段的濃度。根據(jù)標準程序用抗E標記抗體進行流式細胞計數(shù)，通過FACS計數(shù)儀(BectonDickinson,Stockholm,Sweden)分析樣品。結(jié)果如圖4a所示。f)電子顯微技術(shù)SEMTEM。對掃描電子顯微鏡(SEM)而言，將在表面表達VHH1的乳桿菌轉(zhuǎn)化子和未轉(zhuǎn)化類干酪乳桿菌與RRV混合，溫育后，固定并加到包被RC58聚L-賴氨酸包被的玻片上。通過SEM(JEOLJSM—820，Tokyo,Japan)在lSkV分析玻片。對透射電子顯微鏡(TEM)而言，將RRV加到載網(wǎng)上，滴加來自表達分泌型VHH1的上清(25倍濃縮)或來自未轉(zhuǎn)化的類干酪乳桿菌的上清。然后加入鼠抗E標記抗體(1:1000)和10nm金標記的羊抗鼠IgG抗體(1:1000)(AmershamBiosciences)。通過TEM在80KV分析載網(wǎng)(Tecnai10透射電子顯微鏡，F(xiàn)eiCompany,TheNetherlands)。結(jié)果如圖4b和圖11所示。g)病毒的產(chǎn)生和純化。將恒河猴輪狀病毒如前所述培養(yǎng)在MA104細胞中。在整個研究中使用斑純化的RRV。通過用RRV在每亳升含0.5jag胰島素(SigmaChemicalCo"St.Louis,Mo.)的無血清M199培養(yǎng)基(GibcoLaboratories,GrandIsland,N.Y.)以0.1的感染復(fù)數(shù)(MOI)感染MA104細胞，從而產(chǎn)生用于整個研究過程的單個病毒儲液。當細胞病變作用達到單層的75%時，將細胞凍融兩次，并通過低速離心除去細胞裂解物。將病毒上清分成小份，儲存在-801C備用。通過免疫過氧化物酶聚焦還原實驗測定病毒的滴度。產(chǎn)生單個病毒儲液用于整個實驗中。h)體外中和檢測法。通過如前所述的微中和檢測法(Giammariolietall"6，如上)對表達抗體的乳桿菌進一步檢測其對輪狀表達的抑制作用。對錨定的抗體片段，將細菌在MEM培養(yǎng)基中系列稀釋，并與200ffu胰島素激活的RRV(100于37X:溫育1小時。溫育完畢后，通過離心除去細菌，用上清接種到培養(yǎng)在96孔板上的MA104細胞單層。將純的或稀釋在MEM中的濃縮的來自分泌抗體片段的乳桿菌的培養(yǎng)上清與RRV溫育，并接種MA104細胞單層。將接種的平板于31C溫育1小時，用MEM培養(yǎng)基洗滌，補充含抗生素(慶大霉素和青霉素/鏈霉素)的新鮮MEM培養(yǎng)基，并在37TC，在C02環(huán)境下培養(yǎng)1S小時。將細胞單層固定，并用免疫過氧化物酶如(Svenssonetal1991，如上)所述進行染色。與對照孔數(shù)目相比較，RRV感染的細胞數(shù)目降低大于60%說明具有中和作用。以乳桿菌產(chǎn)生的純化VHH1片段作為陽性對照。結(jié)果如圖5所示。i)體內(nèi)檢測法。所有動物實驗由瑞典Huddinge醫(yī)院Karolinskainstitutet的當?shù)貍惱砦瘑T會批準。懷孕的BALB/c雌鼠購自丹麥Mollegard。研究中使用4天齡的幼鼠。對幼鼠每天喂養(yǎng)一次lOpl不同的處理物，從第一天直到第三天。乳桿菌在輪狀病毒感染前一天給藥一次。在第0天用10pl體積的2xl0(7)pfu的RRV口服進行感染。每天記錄腹瀉的發(fā)生，直到第四天。在第五天對幼鼠進行腹腔內(nèi)注射戊巴比妥使其安樂死。將小腸切片在RNAlater(QIAGEN)中固定進行RNA提取，或在中性的緩沖福爾馬林中固定進行組織病理學(xué)分析，或懸浮在無菌PBS中進行乳桿菌存活率分析。用各種lactobodies進行四個獨立的實驗，最初檢測了產(chǎn)VHH1錨定的VHH1片段的細菌的劑量應(yīng)答行為，然后檢測了在合適劑量的其它lactobodies。在每個實驗中包括表達無關(guān)抗體片段的對照lactobodies或未中和的乳桿菌。在每個實驗中也包括只進行感染的組。為了估計乳桿菌在鼠腸道中的存活率，將幼鼠在第一天喂食一次表達錨定的VHH1的乳桿菌，其中一半在第0天用RRV感染。在第1、3、7、14天對每組的2只幼鼠進行安樂死，并除去形成切片。通過將腸道提取物培養(yǎng)在含紅霉素(3pg/ml)的Rogosa平板上來測定轉(zhuǎn)化子的存在。用PCR檢測VHH1的插入。結(jié)果如圖6所示。j)腸道樣品的分析。在第四天獲得小腸切片，并用4%中性緩沖的福爾馬林灌注，在切片后根據(jù)標準程序進行蘇木伊紅染色。每個玻片進行輪狀病毒感染的典型跡象的盲測。從小腸只分離總細胞RNA，并在用無RNase的DNase⑧消化后進4亍實時分析。用EZRT-PCRcore試劑盒(PEAppliedBiosystems,FosterCity,CA，USA)進行實時PCR。用含克隆在Ncol和Xhol限制性位點的RRVvp7基因的pet28a(+)載體繪制標準曲線。在581C，存在600nM引物、300nM探針、5mMMn的條件下擴增輪狀病毒vp7mRNA或病毒的基因組RNA(ABI7000cycler，AppliedBiosystems)，得到一個長121bp的擴增產(chǎn)物。正向引物為(VP7f:5'-CCAAGGGAAAATGTAGCAGTAATTC-3，)核苷酸(nt)791-815)，反向引物為(VP7r:5，-TGCCACCATTCTTTCCAATTAA-3，)(nt891-912)，探針為(5，-6FAM-TAACGGCTGATCCAACCACAGCACC-TAMRA-3，(nt843-867)，根據(jù)恒河猴輪狀病毒vp7基因序列(登錄號AF295303設(shè)計這些引物和探針。PCR檢測的最低水平是10個病毒RNA拷貝。對來自每個動物的RNA樣品以內(nèi)部的持家基因?qū)φ誈APDH進行歸一化(Overberghetal，(1999)Cytokine11:305-312)。無病毒和少于10個病毒的檢測表示感染被清除。結(jié)果如圖7所述。k)糞便中VHH1片段在乳桿菌表面的原位表達。在每天結(jié)束時收集來自獲得表達VHH1錨定片段的乳桿菌的組、無轉(zhuǎn)化的乳桿菌的組和未處理組的3只動物的糞便樣品。將樣品在Superfrost的包被玻片上涂片，并用甲醇丙酮(l:l)在水上固定IO分鐘。加入鼠抗E標記抗體(1/200)，然后向玻片上加入cy2標記的猴抗鼠抗體(1/200)，在濕潤條件下溫育1小時。通過熒光顯微鏡檢測表面表達的VHH1片段。統(tǒng)計根據(jù)糞便的一致性估計幼鼠中腹瀉情況。水樣腹瀉的分值為2，松散的糞便分值為l，無糞便或正常糞便分值為0。每天計算腹瀉分值的百分比。在處理組的總的分值與未處理組進行Fisher's精確檢驗。烈度定義為在研究過程中每組的腹瀉分值的總和，持續(xù)時間定義為腹瀉的總天數(shù)。烈度和持續(xù)時間通過KruskalWallis和Dunn檢驗進行分析。結(jié)果圖和表的討論表2.不同處理組腹瀉的持續(xù)時間和烈度。<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>圖4a所示的是2A10-scFv和VHH1由乳桿菌進行表面表達，以抗E標記抗體進行的流式細胞計數(shù)表示。與表達錨定的VHH1和無關(guān)scFv及VHH對照片段的細菌相比較，在產(chǎn)2A10錨定片段的乳桿菌中可觀察到更低水平的E標記的檢測(數(shù)據(jù)未顯示)。通過ELISA和電子顯微技術(shù)分析抗體片段的結(jié)合活性。對于ELISA,用E標記檢測2A10-錨定和VHHl-錨定的轉(zhuǎn)化乳桿菌的勻漿和來自分泌2A10和分泌VHH1的轉(zhuǎn)化乳桿菌的上清。從乳桿菌表達的VHH1-錨定、VHH1-分泌和2A10-錨定的抗體片段，結(jié)合到包被輪狀病毒的平板上。對錨定型和分泌型美洲駝VHH1片段(純化或來自上清)可觀察到更高水平的結(jié)合作用。分泌型2A10的量太低，不能用ELISA檢測。未轉(zhuǎn)化的類干酪乳桿菌、來自表達錨定型或分泌型scFv及錨定型或分泌型VHH的轉(zhuǎn)化乳桿菌的無關(guān)抗體片段不與輪狀表達結(jié)合(數(shù)據(jù)未顯示)。由錨定型VHH1轉(zhuǎn)化子產(chǎn)生的抗體片段的量計算為約104VHH1片段/細菌，及6002A10片段/細菌(胞內(nèi)和表面)。VHH1分泌型轉(zhuǎn)化子在上清中產(chǎn)生約1pg/mlVHH1片段。圖4b和lla所示的是其表面表達VHHl抗體片段的乳桿菌，將其與輪狀病毒溫育，然后通過SEM進行分析。結(jié)果表明病毒在細菌表面結(jié)合(圖4ba和lib)，但未轉(zhuǎn)化的類干酪乳桿菌菌林沒有結(jié)合(圖lib)。通過TEM(負染色)，可驗證來自用分泌型VHH1載體轉(zhuǎn)化的乳桿菌上清的美洲駝抗體片段與病毒的結(jié)合，其中未轉(zhuǎn)化的類干酪乳桿菌菌株對照上清不與病毒結(jié)合(數(shù)據(jù)未顯示)。產(chǎn)抗體片段的乳桿菌在輪狀病毒中和檢測法中的作用如圖5進行分析。該圖的實線表示產(chǎn)E標記純化的VHH1抗體(20pg/ml)的乳桿菌達到的中和水平。點線表示2A10單克隆雜交瘤上清(147ng/ml)的中和水平。通過不同濃度的錨定型VHH1乳桿菌(■)，2A10錨定的乳桿菌(四)和未轉(zhuǎn)化乳桿菌(□)獲得的中和作用。圖5所示的是存在表達表面結(jié)合的VHH1的乳桿菌或存在含分泌型VHH1的上清時，劑量依賴型感染的顯著降低。也觀察到來自未轉(zhuǎn)化乳桿菌的上清的輕微的中和能力。即使含150ng/ml抗體的2A10單克隆雜交瘤細胞的上清具有95%的保護性，2A10轉(zhuǎn)化的乳桿菌(分泌型和錨定型)也沒有保護作用。圖6所示的是用表達VHH1錨定片段的乳桿菌處理的鼠腹瀉的傳播。與未轉(zhuǎn)化乳桿菌的組相比較，表面VHH1表達的乳桿菌在第二天顯著地降低腹瀉的傳播(P-0.0172)。圖7所示的是在未處理組中，十二指腸和空腸切片的組織化學(xué)揭示了輪狀病毒感染的典型跡象；絨毛頂端擴大、液泡化、絨毛基部收縮及細胞中的細胞核不極化(a)。獲得類千酪乳桿菌的組(b)或病毒錨定型VHH1的乳桿菌(c)及未感染組(d)表現(xiàn)出相當歸一化的組織化學(xué)特性。圖8所示的是錨定型VHH1處理組的平均病毒載量至少比未處理組低200倍。也觀察到無關(guān)乳桿菌對照的益生菌作用(病毒載量降低IO倍)。病毒的清除定義為未檢測到vp7或少于10個vp7RNA分子。與未處理組的9%相比較，錨定型VHH1處理組中有27%動物清除了病毒。圖9所示的是，在第二天，與未處理組相比較，劑量為108和1(^CFU表達錨定型VHH1片段的乳桿菌對腹瀉傳播有顯著降低，P<0.0001及P=0.0024。每組的幼鼠數(shù)目為在107和108CFU/劑量每組有7只，在109和未處理組各有8只。圖IO所示的是用表達錨定型VHH1片段的乳桿菌與RRV溫育而產(chǎn)生感染的組也包括在內(nèi)。在該組中處理按常規(guī)進行。與未處理組相比較，在第二天，凍干形式的表面表達VHH1的乳桿菌可顯著降低腹瀉的傳播(P=0.0317)。在笫三天，與未處理組相比較(n=10)，在獲得預(yù)溫育的表達錨定型VHH1的乳桿菌的組(11=7;P=0.0004)、凍干的表達錨定型VHH1的乳桿菌的組(n=7;P=0.0072)、表達錨定型VHH1的乳桿菌的組(n=10;P=0.0022)中腹瀉的傳播顯著降低。與未處理組相比較，當給藥凍干形式的表面表達VHH1的乳桿菌(n-10;P〈0.01)時，或當用RRV與新鮮的細菌培養(yǎng)物預(yù)溫育2小時而進行感染(P<0.05)時，疾病的烈度也降低了，在糞便中于乳桿菌表面原位表達VHH1片段(實施例4(k)的結(jié)果)在笫四天結(jié)束，收集用表達錨定型VHH1片段的乳桿菌處理的組、未處理組和陰性對照鼠的3只動物的糞便樣品，測定錨定型VHH1片段的原位表達，可通過熒光抗E標記抗體在處理的鼠中檢測乳桿菌表達的VHH1。在對照組中沒有觀察到染色(數(shù)據(jù)未顯示)。小鼠腸道中乳桿菌的存活對幼鼠喂食表達抗輪狀病毒的錨定型VHH1乳桿菌一次(在第0天)，其中一半在笫一天用RRV感染。在各自的第二天，將每組中的兩只幼鼠殺死，通過培養(yǎng)腸道物質(zhì)來檢測乳桿菌轉(zhuǎn)錄子的存在。處理48小時后，可在十二指腸和回腸檢測到細菌，而且輪狀病毒感染組和未感染組沒有差異，而在處理后96小時，沒有檢測到轉(zhuǎn)化子(數(shù)據(jù)未顯示)。乳桿菌轉(zhuǎn)化子在輪狀病毒感染模型中降低腹瀉的效率。在輪狀病毒誘導(dǎo)的腹瀉的幼鼠模型中檢測了轉(zhuǎn)化的乳桿菌的治療效果。幼鼠在5天內(nèi)(第一天到第三天)口服表達2入10-scFv或分泌型或錨定型的VHH1的乳桿菌，并在第0天用RRV感染。對照組包括未轉(zhuǎn)化的類干酪乳桿菌和表達無關(guān)的錨定型VHH抗體片段的細菌。108CFU作為腹瀉干涉的合適劑量(圖9)。與用未轉(zhuǎn)化類干酪乳桿菌處理的鼠相比較，表面表達VHH1的細菌縮短了約0.9天(P<0.01)和0.7天(P<0.05)的疾病持續(xù)時間(通常持續(xù)1.2天)。在用表面表達VHH1的乳桿菌處理的鼠中，與未處理的幼鼠相比較，腹瀉的烈度也從3.7降低到1.7(P<0.001)，與用非轉(zhuǎn)化的類干酪乳桿菌處理的幼鼠相比較，降低了1.2倍(P<0.01)。也觀察到非轉(zhuǎn)化乳桿菌輕微的益生菌作用(表2)。另外，在第二天和第三天，用表面表達VHH1的乳桿菌處理的鼠與未處理的鼠相比較(對這兩天，P<0.0001)或與非轉(zhuǎn)化類干酪乳桿菌處理的鼠相比較(對笫二天，P<0.02)，腹瀉的傳播顯著降低(圖6a)。表達分泌型或錨定型2A10和分泌型VHH1的構(gòu)建體并不比未轉(zhuǎn)化的乳桿菌組誘導(dǎo)出顯著更高的保護作用(圖6a，b)。當給藥凍干形式的表面表達VHH的乳桿菌(P〈0.01)或當通過RRV與細菌的新鮮培養(yǎng)預(yù)溫育2小時而產(chǎn)生感染時(P<0.05)，與未處理組相比較，疾病的烈度也降低了(表2和圖5)。在第四天，近端小腸切片的組織學(xué)檢驗表明，在用表面表達VHH1的乳桿菌處理的輪狀病毒感染的動物中，病理學(xué)改變顯著降低，而且在某些鼠中，組織學(xué)是完全歸一化的。在沒有乳桿菌處理的組中的組織學(xué)表明具有典型的輪狀表達感染跡象，絨毛頂端擴大、絨毛基部收縮、液泡化及細胞核不規(guī)則排列(圖7a、b、c、d)。為了估計是否在腸細胞中病毒的復(fù)制降低了，進行實時PCR檢測輪狀病毒vp基因的表達。在獲得表面表達VHH1抗體片段的乳桿菌處理的動物中的平均病毒載量比未處理的鼠低至少250倍。表達無關(guān)的VHH片段的乳桿菌也降低了病毒vp7的載量(達10倍)。在獲得表面表達錨定型VHH1的乳桿菌的組中的清除速率是27%，未處理組為9%(圖8)。這些實驗表明在干酪乳桿菌393pLZ15表面和成功表達了作為分泌蛋白的抗輪狀病毒的美洲駝來源的VHH抗體片段(VHH1)和scFv(scFv-2A10)。也揭示了這些重組的乳桿菌在幼鼠感染模型中通過體外中和來治療輪狀病毒的效果。實施例5:抗輪狀病毒的VHH的藻酸鈣膠嚢化將2%藻酸鈉溶液逐滴加到含1%VHH的0.1M氯化鈣溶液中，結(jié)果會形成藻酸鈣小珠(體積約為2mm)。將分散的液體靜置30分鐘，使藻酸鈣小珠沉到燒杯底部。然后用濾網(wǎng)收集小珠，并用水洗滌一次。實施例6:含膠嚢化抗輪狀病毒VHH或產(chǎn)VHH的乳桿菌的水洪淋的組成和制備。制備含以下配方的水激凌成分重量％蔗糖13.000脫脂奶粉10.000黃油脂肪8.000麥芽糊精404.000棕櫚酸單甘油酯(MGP)(UOO刺槐豆膠0.144卡拉膠L1000.016香料0.012每份含5到5000微克VHH的膠嚢化VHH溶液水至100總可溶性固體占重量的35%冰含量在-18X::占重量的54%所有水淇淋的成分用高速混合儀混合3分鐘。在SOTC加入水。冰水混合物的溫度在混合后約為55-65"C。然后將混合物勻漿化(2000psi)，并在81TC通過板式熱交換器25秒，使其進行巴斯德消毒。然后將混合物在板式熱交換器中冷卻至4匸備用。選擇性地，可加入產(chǎn)抗輪狀病毒的VHH的乳桿菌菌林來代替膠嚢化VHH溶液，優(yōu)選地是每份的濃度為109或更高。然后將水淇淋預(yù)混合物通過TechnohoyMF75刮板式熱交換器進行冷凍，在冰淇淋中不引入膨脹率。將冰淇淋在4.4TC到-5.4匸下進行擠壓成形。然后將產(chǎn)物放在-35"C的急速冷凍箱中進行硬化，然后儲存在-25TC。含以下成分的水水溶液如下制備重量％蔗糖25刺槐豆膠0.5每份含5到5000微克VHH的膠嚢化VHH溶液水至100總可溶性固體占重量的25.5%冰含量在-18n:占重量的62%所有冰水成分用高速混合儀混合3分鐘。在801C加入水。冰水混合物的溫度在混合后約為55-65匸。然后將混合物勻漿化(2000psi)，并在811C通過板式熱交換器25秒，使其進行巴斯德消毒。然后將混合物在板式熱交換器中冷卻至4x:備用。此時可加入產(chǎn)抗輪狀病毒的VHH的乳桿菌菌林來代替膠嚢化VHH溶液，優(yōu)選地是每份的濃度為109或更高。然后將水淇淋溶液通過具有30%膨脹率(空氣的體積百分比)的TechnohoyMF75刮板式熱交換器進行冷凍。將水淇淋在-3.8"C到—4.51C下進行擠壓成形。然后將產(chǎn)物放在-351C的急速冷凍箱中進行硬化，然后儲存在-25TC。實施例7:含膠嚢化抗輪狀病毒VHH或產(chǎn)VHH的乳桿菌的涂抹食品的成分。根據(jù)本領(lǐng)域已知的標準程序用表3中的成分制備涂抹食品。表3:涂抹食品的成分<table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table>在最后加熱步驟之后，可無菌加入產(chǎn)抗輪狀病毒的VHH的乳桿菌來代替膠嚢化VHH溶液，優(yōu)選地是每份的濃度為109或更高。實施例8:含膠嚢化抗輪狀病毒VHH的調(diào)味品的成分和制備。為了制備調(diào)味品，將細菌菌林培養(yǎng)在合適的食品生料(例如牛奶)中，以獲得高密度培養(yǎng)，并充分產(chǎn)生VHH。將培養(yǎng)的生料與調(diào)味品的典型成分(例如油、醋、蛋黃、鹽)于可保持VHH作用的條件下混合，并進行蛋黃醬的標準制備過程，例如混合和勻漿化。選擇性地，首先將調(diào)味品的典型成分例如油、醋、蛋黃、鹽進行混合，然后進行加熱處理，然后加入培養(yǎng)的生料進行勻漿化。可根據(jù)實施例5加入膠嚢化抗輪狀病毒的VHH來代替產(chǎn)VHH的微生物。權(quán)利要求1.一種將抗體遞送到GIT的遞送系統(tǒng)，其包含VHH或VNAR型重鏈免疫球蛋白、或免疫球蛋白重鏈或輕鏈的結(jié)構(gòu)域抗體(dAbs)或其片段，其中的免疫球蛋白或其片段在腸道中是有活性的。2.權(quán)利要求l的遞送系統(tǒng)，其中遞送系統(tǒng)是通過膠嚢提供的。3.權(quán)利要求2的遞送系統(tǒng)，其中免疫球蛋白在腸道中釋放。4.權(quán)利要求1的遞送系統(tǒng)，其含有用編碼VHH或VNAR型重鏈免疫球蛋白、或免疫球蛋白重鏈或輕鏈的結(jié)構(gòu)域抗體(dAbs)或其片段的基因所轉(zhuǎn)化的微生物。5.權(quán)利要求4的遞送系統(tǒng)，其中VHH或VNAR型重鏈免疫球蛋白、或免疫球蛋白重鏈或輕鏈的結(jié)構(gòu)域抗體(dAbs)或其片段于腸道中表達和/或分泌。6.權(quán)利要求5的遞送系統(tǒng)，其中免疫球蛋白或其片段是來源于camelids的重鏈抗體，優(yōu)選美洲駝重鏈抗體。7.權(quán)利要求4-6任一項的遞送系統(tǒng)，其中的微生物是益生菌微生物，優(yōu)選地是乳酸細菌、霉菌或酵母。8.權(quán)利要求7的遞送系統(tǒng)，其中的微生物是乳酸菌(Z^"o6fld〃w)或雙歧桿菌(說yiV/o6a"en."附)。9.權(quán)利要求8的遞送系統(tǒng)，其中的乳酸菌是干酪乳酸菌10.權(quán)利要求1-9任一項的遞送系統(tǒng)，其中VHH或VNAR型重鏈免疫球蛋白、或免疫球蛋白重鏈或輕鏈的結(jié)構(gòu)域抗體(dAbs)或其片段特異針對導(dǎo)致腸道疾病的微生物。11.一種表達載體，其包含編碼VHH或VNAR型重鏈免疫球蛋白、或免疫球蛋白重鏈或輕鏈的結(jié)構(gòu)域抗體(dAbs)或其片段的基因。12.權(quán)利要求11的表達載體，其中VHH型重鏈免疫球蛋白是美洲駝重鏈抗體或其功能片段。13.權(quán)利要求11或12的表達栽體，其中表達載體包含組成型啟動子或適于GIT特異表達的啟動子，優(yōu)選地是pldh。14.一種微生物，其是用權(quán)利要求11到13任一項的表達載體進行轉(zhuǎn)化的微生物，優(yōu)選是乳酸菌。15.—種通過用編碼VHH或VNAR型重鏈免疫球蛋白、或免疫球蛋白重鏈或輕鏈的結(jié)構(gòu)域抗體(dAbs)或其片段的基因轉(zhuǎn)化的微生物，將抗體遞送到腸道中，從而處置導(dǎo)致腸道疾病的微生物感染的方法，包括步驟i)用含VHH或VNAR型重鏈免疫球蛋白、或免疫球蛋白重鏈或輕鏈的結(jié)構(gòu)域抗體(dAbs)或其片段的表達載體轉(zhuǎn)化微生物，及ii)對需要治療的人和動物的腸道給藥轉(zhuǎn)化的微生物，從而使VHH或VNAR型重鏈免疫球蛋白、或免疫球蛋白重鏈或輕鏈的結(jié)構(gòu)域抗體(dAbs)或其片段在腸道中表達和/或分泌。16.權(quán)利要求15的方法，其中VHH或VNAR型重鏈免疫球蛋白或其片段、或免疫球蛋白重鏈或輕鏈的結(jié)構(gòu)域抗體(dAbs)特異針對導(dǎo)致腸道疾病的微生物。17.權(quán)利要求15或16的方法，其中VHH型重鏈免疫球蛋白是美洲駝重鏈抗體或其片段。18.權(quán)利要求17的方法，其中導(dǎo)致腸道疾病的微生物是輪狀病毒。19.VHH或VNAR型重鏈免疫球蛋白、或免疫球蛋白重鏈或輕鏈的結(jié)構(gòu)域抗體(dAbs)或其片段，或者權(quán)利要求l到IO任一項的遞送系統(tǒng)在治療中的用途。20.VHH或VNAR型重鏈免疫球蛋白、或免疫球蛋白重鏈或輕鏈的結(jié)構(gòu)域抗體(dAbs)或其片段，或者權(quán)利要求l到IO任一項的遞送系統(tǒng)，在制備用于治療導(dǎo)致腸道疾病的微生物感染、特別是輪狀病毒感染的藥物中的用途。21.用VHH或VNAR型重鏈免疫球蛋白、或免疫球蛋白重鏈或輕鏈的結(jié)構(gòu)域抗體(dAbs)或其片段轉(zhuǎn)化的微生物，特別是乳酸菌，在制備用于治療導(dǎo)致腸道疾病的微生物感染、特別是輪狀病毒感染的藥物中的用途。22.—種食品，其含有權(quán)利要求l到ll任一項的遞送系統(tǒng)。23.—種制備權(quán)利要求22的食品的方法，包括在制備食品時向食品中加入所述的遞送系統(tǒng)。24.—種用于分散食品的工具，其中分散工具至少一個表面包被了用于將抗體或抗體片段本身遞送到胃腸道中的遞送系統(tǒng)。25.權(quán)利要求24的分散工具，其中遞送系統(tǒng)含膠嚢化抗體或用抗體或其片段轉(zhuǎn)化的微生物。26.—種權(quán)利要求24或25的分散工具，其中分散工具是匙、管、吸管或棒。全文摘要本發(fā)明涉及VHH或VNAR型重鏈免疫球蛋白或其片段，或免疫球蛋白重鏈或輕鏈的結(jié)構(gòu)域抗體(dAbs)或其片段，適于處置感染，特別是胃腸道感染。本發(fā)明也涉及含VHH或VNAR型重鏈免疫球蛋白或其功能片段，或免疫球蛋白或其片段的重鏈或輕鏈結(jié)構(gòu)域抗體(dAbs)的遞送系統(tǒng)，及含編碼這些VHH或VNAR型重鏈免疫球蛋白或其功能片段，或免疫球蛋白或其片段的重鏈或輕鏈結(jié)構(gòu)域抗體(dAbs)的表達載體的宿主。本發(fā)明也涉及含該遞送系統(tǒng)的食品和藥物制劑，及制備本發(fā)明的食品的方法。文檔編號A23L1/24GK101128182SQ200580040337公開日2008年2月20日申請日期2005年11月3日優(yōu)先權(quán)日2004年11月25日發(fā)明者A·M·勒德博爾,L·G·J·弗倫肯,L·漢馬斯特龍申請人:荷蘭聯(lián)合利華有限公司