專利名稱：堿基多態(tài)性的鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及核酸序列的分析方法。更詳細(xì)說，涉及可以同時(shí)檢測樣品中含有的多種堿基多態(tài)性的核酸序列分析方法。本發(fā)明的核酸序列分析方法，適用于基因工程或分子生物學(xué)，以及與此有關(guān)的產(chǎn)業(yè)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
本發(fā)明中，所謂堿基多態(tài)性是指具有與野生型不同序列的基因形態(tài)，多態(tài)性基因在藥物代謝中的副作用以及由于個(gè)體差異造成的治療失敗中起著重要作用。此外已知也是作為體質(zhì)所知的基礎(chǔ)代謝等的個(gè)體差異的原因。而且這些是以多個(gè)病態(tài)基因標(biāo)記而起作用的。因此，查明這些突變在臨床上是重要的，在臨床研究中，常規(guī)的表現(xiàn)型分類特別對于精神病患者和自發(fā)志愿者受到推崇(例如參見非專利文獻(xiàn)1和2)。為此，伴隨著作為其根源的多態(tài)性基因的鑒定，用于檢測各種基因類型的核酸序列分析方法就成為一種需要。
以往的核酸序列分析方法，有如核酸序列確定法(Sequencing法)。核酸序列確定法可以檢測出包含在核酸序列中的堿基多態(tài)性，并加以鑒定，但要進(jìn)行模板核酸的制備、多聚酶反應(yīng)、聚丙烯酰胺凝膠電泳、核酸序列的解析等操作，必需很多的勞力和時(shí)間。而近年來使用的自動序列分析儀可以節(jié)省勞力，但是有需要貴昂的設(shè)備這樣的問題。
其他方法還有Southern雜交法(例如參見非專利文獻(xiàn)3)。如果采用這種方法，可以鑒定具有與標(biāo)記DNA探針互補(bǔ)的堿基序列的DNA區(qū)域。即采用Southern雜交法時(shí)，將核酸片段在瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠的平板上進(jìn)行電泳，根據(jù)片段大小(長度)分離后，使其變性成為單鏈，再將硝化纖維素等膜平鋪在該平板上，將核酸片段以電泳原樣進(jìn)行轉(zhuǎn)移，固定后，與用RI(放射性同位素)等標(biāo)記的對堿基多態(tài)性的有特異性的DNA探針形成雜交體，然后用放射性自顯影等方法檢測膜上與探針互補(bǔ)的核酸片段。
如果采用Southern雜交法，可以確定目的核酸片段的電泳位置和分子量，但存在如下的問題在電泳或放射性自顯影等操作中需要耗費(fèi)長時(shí)間，不能快速進(jìn)行分析；因?yàn)闇y定只取決于是否與對堿基多態(tài)性的有特異性的DNA探針形成雜交體，因此探針的特異性并不嚴(yán)密，難以識別用于檢測有無堿基多態(tài)性的類似序列。
另外，作為利用酶來識別核酸序列的方法，已知采用連接酶的方法(例如參見專利文獻(xiàn)1和2)、采用核酸酶的方法(例如參見專利文獻(xiàn)3)等。在作為采用連接酶的方法所熟知的寡核苷酸連接分析法(OLA)中，跨越所確定目的區(qū)域的兩個(gè)探針或探針元件在目的區(qū)域發(fā)生雜交。探針元件一旦與鄰接的目的堿基形成堿基對，探針元件相對的末端通過連接反應(yīng)，例如用連接酶處理，即可結(jié)合。檢測連接的探針元件，即可了解目的序列的存在。
近年來對于用于檢測目的基因中多個(gè)序列各自存在與否(例如在基因篩查領(lǐng)域)的方法的需求度增大。例如有多達(dá)400種的變異與囊胞性纖維癥有關(guān)。為了對相應(yīng)于該疾病的基因進(jìn)行前處理而進(jìn)行的篩查中，為了更有效鑒定“囊胞性纖維癥”，最好是檢查待檢測人的基因組DNA中全部可能發(fā)生的異常基因序列變異。理想的檢測是一次檢測出所有可能發(fā)生變異的部位的存在與否。
這種解析多種堿基多態(tài)性的方法，是把多種檢測用的寡核苷酸探針結(jié)合在固相上，采用稱為DNA微陣列(DNA芯片)作為固相的雜交分析方法。但是，在固相的雜交分析方法中，必須采用多次液體處理操作，為了保存對于識別單一核苷酸錯(cuò)配所必要的嚴(yán)謹(jǐn)性，必須慎重控制每一步驟的保溫和洗滌溫度。由于最適雜交條件因探針序列不同而變化很大，這種方法的復(fù)雜程序是其難點(diǎn)。
針對這一問題，提出了針對一種多態(tài)性序列使用數(shù)十條寡核苷酸經(jīng)DNA微陣列，從而得以解析多態(tài)性的方法(例如參見專利文獻(xiàn)4)。如果采用這種方法，則采用一種根據(jù)各種多態(tài)性的形態(tài)而特制成疊瓦狀(tiled)探針的陣列來進(jìn)行分析。疊瓦方式(tiling)可以使用一組相關(guān)的固定化探針，其中若干個(gè)探針表現(xiàn)對參照序列完全互補(bǔ)的特性，而其它的則表現(xiàn)與參照序列發(fā)生錯(cuò)配(例如參見專利文獻(xiàn)5)。不過這種方法由于相對于一種多態(tài)性要使用數(shù)十條寡核苷酸，因而是非常昂貴的方法。
已知有為檢測細(xì)胞色素P450的一種多態(tài)性而采用240條探針的技術(shù)，這種方法必須制造許多探針，花費(fèi)很大。此外，要用這種方法鑒定多種多態(tài)性，就必須用更多探針，難保出現(xiàn)意想不到的非特異反應(yīng)。為了減少非特異反應(yīng)，就必須設(shè)計(jì)嚴(yán)密的探針，這就不得不研究龐大的排列組合。
對于多種多態(tài)性，還已經(jīng)公開了利用連接酶，連接上對多態(tài)性特異的寡核苷酸，再以DNA微陣列進(jìn)行測定的方法(例如參見專利文獻(xiàn)6)。雖然這種方法中DNA微陣列上的寡核苷酸可以減少，由于只用連接酶連接寡核苷酸，因此必需使用在末端結(jié)合了磷酸基寡核苷酸，費(fèi)用較高，而且磷酸基與寡核苷酸連接時(shí)，不知究竟和哪個(gè)寡核苷酸發(fā)生連接反應(yīng)，容易發(fā)生非特異性連接。因此在專門用于解析多態(tài)性時(shí)，多態(tài)性越多，危險(xiǎn)性就越高。
專利文獻(xiàn)1日本特公平6-44880號專利文獻(xiàn)2日本專利第2622255號專利文獻(xiàn)3日本特開平3-43098號專利文獻(xiàn)4日本特開2002-514091號專利文獻(xiàn)5EP730663號專利文獻(xiàn)6日本特開2000-511060號非專利文獻(xiàn)1European Consensus Conference onPharmacogenetics.Commission of the EuropeanCommunities，Luxembourg第87-96頁，(1990年發(fā)行)非專利文獻(xiàn)2European Journal of Clinical Pharmacology，第36卷，第551-554頁，(1989年發(fā)行)非專利文獻(xiàn)3實(shí)驗(yàn)手冊，基因工程，增補(bǔ)版，第70～75頁，(1996年發(fā)行)附圖的簡單說明

圖1是表示本發(fā)明反應(yīng)機(jī)制的部分實(shí)例的圖。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明所要解決的問題以往的技術(shù)中，為了解析堿基的多態(tài)性，都存在必需使用高價(jià)儀器，探針的特異性必需嚴(yán)謹(jǐn)，操作需要時(shí)間長的問題。另外，在同時(shí)解析多種堿基多態(tài)性的情況下，還有操作必須格外小心，會發(fā)生非特異性連接反應(yīng)等問題。因此，本發(fā)明的目的，在于提供一種優(yōu)越的核酸序列分析方法，以便容易地同時(shí)檢測出含于樣品中的多種堿基多態(tài)性的種類。
為解決問題所采用的手段由于本發(fā)明集體精心研究，采用以下所述手段，解決了上述課題，實(shí)現(xiàn)了本發(fā)明。即本發(fā)明涉及同時(shí)鑒定多種堿基多態(tài)性的方法。
1.一種多個(gè)堿基多態(tài)性的鑒定方法，是同時(shí)鑒定含于樣品中的多種堿基多態(tài)性的方法，其特征是，將待測的多種堿基多態(tài)性種類的樣品，與多種第一種寡核苷酸和多種第二種寡核苷酸進(jìn)行雜交，用含核酸酶活性的酶及含連接酶活性的酶將第一種寡核苷酸和第二種寡核苷酸連接，使其形成連接的寡核苷酸，采用與該連接后的寡核苷酸具有互補(bǔ)序列的檢測用探針鑒定該連接的寡核苷酸的種類。
2.上述1所述的多個(gè)堿基多態(tài)性的鑒定方法，其特征是，含有與第一種寡核苷酸中堿基多態(tài)性序列部分互補(bǔ)的序列。
3.上述1所述的多個(gè)堿基多態(tài)性的鑒定方法，其特征是，含有與第二種寡核苷酸中推測有堿基多態(tài)性的序列部分不互補(bǔ)的序列。
4.上述1～3中任一項(xiàng)所述的多個(gè)堿基多態(tài)性的鑒定方法，其特征是，含有與第二種寡核苷酸的5’末端推測有堿基多態(tài)性的序列部分不互補(bǔ)的序列。
5.上述1～3中任一項(xiàng)所述的多個(gè)堿基多態(tài)性的鑒定方法，其特征是，將第一種寡核苷酸及第二種寡核苷酸與含有推測有堿基多態(tài)性的序列部分的目的核酸相接觸時(shí)，在推測有堿基多態(tài)性的序列部分中，設(shè)計(jì)成至少有一個(gè)以上的堿基重疊。
6.上述1～3中任一項(xiàng)所述的多個(gè)堿基多態(tài)性的鑒定方法，其特征是，第一種寡核苷酸預(yù)先被標(biāo)記。
7.上述6所述的多個(gè)堿基多態(tài)性的鑒定方法，其特征是，標(biāo)記從包括酶、生物素、熒光物質(zhì)、肝素、抗原、抗體、放射性物質(zhì)、發(fā)光基團(tuán)及特定的核酸序列在內(nèi)的一群物質(zhì)中選定的任一種方法。
8.上述6或7所述的多個(gè)堿基多態(tài)性的鑒定方法，其特征是，用于檢測野生型的第一種寡核苷酸和用于檢測堿基多態(tài)性的第一種寡核苷酸分別用具有不同熒光波長的熒光物質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記。
9.上述1～3中任一項(xiàng)所述的多個(gè)堿基多態(tài)性的鑒定方法，其特征是，以檢測用探針檢測連接的寡核苷酸的方法為雜交。
10.上述1～3中任一項(xiàng)所述的多個(gè)堿基多態(tài)性的鑒定方法，其特征是，檢測用探針含有至少與第二種寡核苷酸的一部分互補(bǔ)的序列。
11.上述1～3中任一項(xiàng)所述的多個(gè)堿基多態(tài)性的鑒定方法，其特征是，檢測用探針含有至少與第一種寡核苷酸和第二種寡核苷酸的一部分互補(bǔ)的序列。
12.上述1～3中任一項(xiàng)所述的多個(gè)堿基多態(tài)性的鑒定方法，其特征是，檢測用探針含有多態(tài)性序列的一部分。
13.上述12所述的多個(gè)堿基多態(tài)性的鑒定方法，其特征是，檢測用探針的多態(tài)性序列部分為混合堿基。
14.上述1～3中任一項(xiàng)所述的多個(gè)堿基多態(tài)性的鑒定方法，其特征是，有一種以上的檢測用探針被固定于固相上。
15.上述14所述的多種堿基多態(tài)性的鑒定方法，其特征是，固定有檢測用探針的固相為DNA微陣列。
16.上述1～3中任一項(xiàng)所述的多個(gè)堿基多態(tài)性的鑒定方法，其特征是，通過擴(kuò)增反應(yīng)使連接的寡核苷酸擴(kuò)增后進(jìn)行檢測。
17.上述16所述的多個(gè)堿基多態(tài)性的鑒定方法，其特征是，擴(kuò)增方法為從包括PCR、NASBA、LCR、SDA、RCR和TMA在內(nèi)的一群方法中選定的任一種方法。
18.上述1～3中任一項(xiàng)所述的多種堿基多態(tài)性的鑒定方法，其特征是，樣品為預(yù)先擴(kuò)增的核酸。
19.上述18所述的多個(gè)堿基多態(tài)性的鑒定方法，其特征是擴(kuò)增方法為從包括PCR、NASBA、LCR、SDA、RCR和TMA在內(nèi)的一群方法中選定的任一種方法。
20.上述1～3中任一項(xiàng)所述的多個(gè)堿基多態(tài)性的鑒定方法，其特征是，順次和/或同時(shí)采用含核酸酶活性的酶和含連接酶活性的酶。
21.上述1～3中任一項(xiàng)所述的多種堿基多態(tài)性的鑒定方法，其特征是，含核酸酶活性的酶和含連接酶活性的酶是同一種酶。
22.上述1～3中任一項(xiàng)所述的多個(gè)堿基多態(tài)性的鑒定方法，其特征是，含核酸酶活性的酶為從包括綠豆核酸酶、S1核酸酶、核酸外切酶I～VII在內(nèi)的一群酶中選定的至少一種酶。
23.上述1～3中任一項(xiàng)所述的多個(gè)堿基多態(tài)性的鑒定方法，其特征是，含連接酶活性的酶為從包括T4DNA連接酶、Ecoli DNA連接酶、RNA連接酶在內(nèi)的一群酶中選定的至少一種酶。
24.上述1～3中任一項(xiàng)所述的多個(gè)堿基多態(tài)性的鑒定方法，其特征是，含核酸酶活性的酶和含連接酶活性的酶為耐熱性酶。
25.上述24所述的多個(gè)堿基多態(tài)性的鑒定方法，其特征是，耐熱性酶來自Tth、Taq、KOD或Pfu。
26.上述1～3中任一項(xiàng)所述的多個(gè)堿基多態(tài)性的鑒定方法，其特征是，含核酸酶活性的酶為DNA聚合酶。
27.上述26所述的多種堿基多態(tài)性的鑒定方法，其特征是DNA聚合酶為從包括來自Tth的耐熱性DNA聚合酶、來自Taq的耐熱性DNA聚合酶、來自KOD的耐熱性DNA聚合酶和來自Pfu的耐熱性DNA聚合酶在內(nèi)的一群酶中選定的1種或2種以上的DNA聚合酶28.上述1～3中任一項(xiàng)所述的多種堿基多態(tài)性的鑒定方法，堿基多態(tài)性包括一個(gè)堿基的多態(tài)性、插入、缺失多態(tài)性的任何一種。
29.一種多個(gè)堿基多態(tài)性的鑒定方法，是同時(shí)鑒定含于樣品中的多種堿基多態(tài)性的方法，其特征如下(1)制備含有該堿基多態(tài)性序列部分的多種第一種寡核苷酸，制備含有與該第一種寡核苷酸相鄰并與該堿基多態(tài)性序列部分不發(fā)生雜交的序列的多種第二種寡核苷酸；(2)將該第一種寡核苷酸和該第二種寡核苷酸與含于樣品中的染色體或核酸片段進(jìn)行雜交；(3)在各種寡核苷酸發(fā)生了雜交時(shí)，用含核酸酶活性的酶除去堿基多態(tài)性序列部分沒有在該第二種寡核苷酸上形成堿基對的堿基序列，然后用含連接酶活性的酶作用，使該寡核苷酸相連接，形成連接的寡核苷酸；(4)采用含有至少與該第二種寡核苷酸的一部分互補(bǔ)的多種堿基檢測用探針，或/和含有至少與該第二種寡核苷酸和第一種寡核苷酸的一部分互補(bǔ)的多種堿基檢測用探針檢測該連接的寡核苷酸。
30.一種試劑盒，是同時(shí)鑒定含于樣品中的多種堿基多態(tài)性的試劑盒，其特征是至少包括以下(i)～(v)(i)兩種以上包含堿基多態(tài)性序列部分的第一種寡核苷酸；(ii)兩種以上包含與第一種寡核苷酸相鄰并與該堿基多態(tài)性序列部分不雜交的序列的第二種寡核苷酸；(iii)至少一種含有核酸酶活性的酶；(iv)至少一種含有連接酶活性的酶；(v)至少與第二種寡核苷酸的一部分互補(bǔ)的檢測用探針，和/或至少與第二種寡核苷酸和第一種寡核苷酸的一部分互補(bǔ)的檢測用探針。
31.一種試劑盒，是同時(shí)鑒定含于樣品中的多種堿基多態(tài)性的試劑盒，其特征是至少包括以下(i)～(vi)(i)在推測有堿基多態(tài)性的序列部分中，含有與顯示多態(tài)性的堿基互補(bǔ)的序列的兩種以上的多態(tài)性第一種寡核苷酸；(ii)在推測有堿基多態(tài)性的序列部分中，含有與顯示野生型的堿基互補(bǔ)的序列的兩種以上的野生型第二種寡核苷酸；(iii)兩種以上含有與多態(tài)性和/或野生型第一種寡核苷酸相鄰并與該推測有堿基多態(tài)性序列部分不雜交的序列的第二種寡核苷酸；(iv)至少一種含有核酸酶活性的酶；(v)至少一種含有連接酶活性的酶；(vi)至少與第二種寡核苷酸的一部分互補(bǔ)的檢測用探針，和/或至少與第二種寡核苷酸和第一種寡核苷酸的一部分互補(bǔ)的檢測用探針。
32.上述30或31所述的試劑盒，含有預(yù)先固定有檢測用探針的固相。
33.上述30或31所述的試劑盒，其特征是，固相為DNA微陣列。
本發(fā)明的效果借助順次和/或同時(shí)采用含核酸酶活性的酶和含連接酶活性的酶，以與堿基多態(tài)性特異連接的寡核苷酸，特異檢測基因，能夠便利地檢測多種堿基多態(tài)性。
實(shí)施發(fā)明的最佳方式以下詳細(xì)說明本發(fā)明。樣品中所含的含有有特定的堿基多態(tài)性部位的染色體或其片段，只要是包含著承載所要檢測的基因信息的具有堿基多態(tài)性的目的核酸即可，并無特別限定。該目的核酸，可舉Alu序列、編碼蛋白質(zhì)的基因外顯子或內(nèi)含子、啟動子等為例。更具體而言，可舉與包括遺傳病在內(nèi)的各種疾病、以及與藥物代謝和生活習(xí)慣性疾病(高血壓、糖尿病等)有關(guān)的基因?yàn)槔＠缗c高血壓有關(guān)的ACE基因。
本發(fā)明中，所謂染色體或核酸片段的多態(tài)性核酸，是指野生型核酸中至少有一個(gè)核苷酸發(fā)生了點(diǎn)突變而被另外的核苷酸置換的核酸，或者在野生型核酸的一部分中含有插入序列或缺失序列的核酸。
通過這種堿基多態(tài)性可以闡明體質(zhì)差異，本發(fā)明的方法是檢測樣品中的核酸是否存在推測的堿多態(tài)性。
本發(fā)明中的檢測堿基多態(tài)性的方法，以順次和/或同時(shí)采用含核酸酶活性的酶和含連接酶活性的酶為特征。該活性，可以通過單個(gè)酶，也可以通過同時(shí)具備兩種活性的酶來實(shí)現(xiàn)。
具體而言，含核酸酶活性的酶可舉綠豆核酸酶、S1核酸酶、核酸外切酶I～VII等。含連接酶活性的酶可舉T4DNA連接酶、大腸桿菌DNA連接酶、RNA連接酶等。含核酸酶活性的酶和含連接酶活性的酶因是耐熱性酶而優(yōu)選。例如耐熱性酶可以是來自Tth、Taq、KOD、Pfu的酶。而含核酸酶活性的酶也可以是DNA聚合酶。例如可使用來自Tth、Taq、KOD、Pfu的耐熱性DNA聚合酶。
本發(fā)明的檢測堿基多態(tài)性方法的具體形式，是鑒定含于樣品中多種堿基多態(tài)性方法(1)制備包含堿基多態(tài)性的序列部分的第一種寡核苷酸，通過與該第一種寡核苷酸雜交的鏈的核酸互補(bǔ)，與該第一種寡核苷酸相鄰進(jìn)行雜交，制備含有與該堿基多態(tài)性序列部分的任何序列都不形成互補(bǔ)鏈的序列的第二種寡核苷酸。
(2)使該第一種寡核苷酸及第二種寡核苷酸與核酸進(jìn)行雜交(3)在寡核苷酸各自進(jìn)行了雜交時(shí)產(chǎn)生的堿基多態(tài)性序列部分中，用含有核酸酶活性的酶除去未形成第二種寡核苷酸所具有的堿基對的堿基。此時(shí)，殘留有磷酸基的堿基被除去。
即，通過含有核酸酶活性的酶的作用，開始產(chǎn)生磷酸基，通過含有連接酶活性的酶的作用將第一種寡核苷酸和第二種寡核苷酸連接起來。通過檢測這種連接的寡核苷酸，鑒定含于樣品中的特定核酸序列中的堿基多態(tài)性的方法。
具體而言，第一種寡核苷酸是含有與推測有堿基多態(tài)性的序列部分互補(bǔ)的堿基的寡核苷酸。該堿基多態(tài)性的推測部分優(yōu)選是第一種核苷酸的3’末端。
第二種寡核苷酸較之第一種寡核苷酸更傾向于3’一側(cè)的位置。第二種寡核苷酸的特征在于較好是含有與推測有堿基多態(tài)性的序列部分不互補(bǔ)的堿基的寡核苷酸。優(yōu)選是與推測有堿基多態(tài)性的序列部分不互補(bǔ)的堿基存在于第二種寡核苷酸的5’末端。
現(xiàn)對第一種寡核苷酸與第二種寡核苷酸的設(shè)計(jì)方法作更詳細(xì)的說明。在含有推測有堿基多態(tài)性序列部分的目的核酸中使第二種寡核苷酸與第一種寡核苷酸相接觸時(shí)，較好是設(shè)計(jì)成在推測有堿基多態(tài)性的序列部分中至少有一個(gè)以上的堿基發(fā)生重疊。為了使之重疊，可以把第一種寡核苷酸的3’末端設(shè)計(jì)成能與推測有堿基多態(tài)性的序列部分發(fā)生雜交；而把第二種寡核苷酸的5’末端設(shè)計(jì)成不能與推測有堿基多態(tài)性的序列部分發(fā)生雜交。在第二種寡核苷酸的5’末端，不能與推測有堿基多態(tài)性的序列部分發(fā)生雜交的結(jié)構(gòu)的長度，至少有一個(gè)堿基即可。這個(gè)在第二種寡核苷酸的5’末端，當(dāng)用核酸酶活性除去不能與推測有堿基多態(tài)性序列部分發(fā)生雜交的堿基時(shí)，設(shè)計(jì)成能借助含有連接酶活性的酶將第一種寡核苷酸和第二種寡核苷酸連接起來即可。
本發(fā)明中第一種寡核苷酸及第二種寡核苷酸的長度，為13～35個(gè)堿基，優(yōu)選是16～30個(gè)堿基。例如，把第一種寡核苷酸的3’末端堿基設(shè)計(jì)成推測有堿基多態(tài)性部位的寡核苷酸，野生型的第一種寡核苷酸則配置與該野生型核酸的該堿基互補(bǔ)的堿基，同時(shí)，多態(tài)性的第一種寡核苷酸則配置與多態(tài)性核酸的該堿基互補(bǔ)的堿基。而再把第二種寡核苷酸的5’末端設(shè)計(jì)成與第一種寡核苷酸有一個(gè)堿基相重疊時(shí)，該第二種寡核苷酸的重疊堿基，則選擇不互補(bǔ)的堿基，不管是野生型還是多態(tài)性的。通過選擇與野生型或多態(tài)性都不互補(bǔ)的堿基，在檢測一種堿基多態(tài)性時(shí)，可以只制備一種第二種寡核苷酸。
在進(jìn)行了這樣的設(shè)計(jì)時(shí)，只有在野生型的第一種寡核苷酸/第二種寡核苷酸/野生型核酸、以及多態(tài)性第一種核苷酸/第二種寡核苷酸/多態(tài)性核酸的組合中，第二種寡核苷酸的重疊部分被除去，由于完全一致，用含核酸酶活性的酶可以除去第二種寡核苷酸的重疊堿基。此時(shí)為了除去殘留的磷酸基，可以通過用含連接酶活性的酶對它作用，使第一種寡核苷酸與第二種寡核苷酸相連接成為一條鏈；而在野生型的第一種寡核苷酸/第二種寡核苷酸/多態(tài)性核酸、以及多態(tài)性第一種核苷酸/第二種寡核苷酸/野生型核酸的組合中，第一種寡核苷酸的3’末端由于不能互補(bǔ)，用含連接酶活性的酶作用不能連接起來。
含核酸酶活性的酶及含連接酶活性的酶本發(fā)明中，同時(shí)使其作用于上述野生型第一種寡核苷酸和多態(tài)性第一種寡核苷酸。
i)使上述第一種寡核苷酸及第二種寡核苷酸與含有堿基多態(tài)性的的染色體或核酸片段進(jìn)行雜交。雜交條件可為通用條件。例如可以根據(jù)《分子克隆》(1989年版)所述方法進(jìn)行。
ii)然后用含核酸酶活性的酶將第二種寡核苷酸的重疊部分切斷。可以使用的酶活性如上所述。優(yōu)選是外切核酸酶活性，還優(yōu)選是DNA聚合酶等外切核酸酶。
第二種寡核苷酸的5’末端與第一種寡核苷酸發(fā)生重疊的情況下，采用5’外切核酸酶，將第二種寡核苷酸的重疊部分切斷，并暴露出磷酸基。
iii)同時(shí)，用含連接酶活性的酶，將暴露在第二種寡核苷酸5’端的磷酸基與第一種寡核苷酸的3’端連接，成為一條寡核苷酸。
在本發(fā)明中，如果對應(yīng)于第一種寡核苷酸中的堿基多態(tài)性部位不互補(bǔ)，即使用內(nèi)切核酸酶切斷對應(yīng)于堿基多態(tài)性的部位也不互補(bǔ)，所以用連接酶活性作用，也不能連接成一條核苷酸。
當(dāng)對使用了野生型第一種寡核苷酸樣品核酸采用含核酸酶活性的酶及含連接酶活性的酶的情況下，樣品核酸如果是野生型的，則形成一條鏈，如果是多態(tài)性的，則不發(fā)生反應(yīng)。相反，當(dāng)對使用了多態(tài)性第一種寡核苷酸檢測樣品核酸采用含核酸酶活性的酶及含連接酶活性的酶的情況下，樣品核酸如果是多態(tài)性的，則形成一條鏈，如果是野生型的，則不發(fā)生反應(yīng)。特別是以人類為代表的高等生物，一種基因分別有來自父親的基因和母親的基因各一個(gè)，如果采用這種方法，能夠區(qū)分樣品基因是野生型同源或多態(tài)性同樣，抑或異源。
本發(fā)明也提供了一種在同一反應(yīng)體系中使含核酸酶活性的酶和含連接酶活性的酶作用于待檢測的多種堿基多態(tài)性的方法。本發(fā)明中的多種，意指檢測至少一種或兩種以上的堿基多態(tài)性。在鑒定多種堿基多態(tài)性時(shí)，也可以采用在不同的反應(yīng)體系中使含核酸酶活性的酶和含連接酶活性的酶作用，但在同一反應(yīng)體系中，則更為簡便，也更有利于節(jié)省開支。在至少一種反應(yīng)體系中使含核酸酶活性的酶和含連接酶活性的酶同時(shí)作用于多種堿基多態(tài)性的情況下，用于野生型和用于多態(tài)性的第一種寡核苷酸優(yōu)選為不同的標(biāo)記，例如加上能用熒光波長加以區(qū)別的熒光標(biāo)記。標(biāo)記用于野生型和用于多態(tài)性的第一種寡核苷酸的熒光標(biāo)記不同，至少在鑒定多種堿基多態(tài)性時(shí)，即使第一種寡核苷酸和第二種寡核苷酸混合在一起，也不會帶來不便。
當(dāng)待檢測的目的核酸含量不充分的情況下，在上述雜交之前，可事先通過下述擴(kuò)增反應(yīng)，將上述含多態(tài)性序列的核酸片段進(jìn)行擴(kuò)增。上述擴(kuò)增方法并無特別限定，如PCR(Polymerase chain reaction；日本特公平4-67960號公報(bào)、日本特公平4-67957號公報(bào))、NASBA(Nucleic acid sequence-based amplification method；Nature第350卷、第91頁(1991))、LCR(WO89/12696、日本特開平2-2934號等)、SDA(Strand Displacment Amplification；Nucleic Acids Res.第20卷、第691頁(1992))、RCR(WO90/01069)、TMA(Transcription Mediatedamplification Method；J.Clin.Microbiol.第31卷、第3270頁(1993))等都可以采用。
此外，使含核酸酶活性的酶和含連接酶活性的酶作用，并將寡核苷酸連接以后，也可以用上述所示擴(kuò)增反應(yīng)擴(kuò)增其結(jié)合產(chǎn)物來進(jìn)行檢測。此時(shí)第一種寡核苷酸的5’末端側(cè)與第二種寡核苷酸的3’末端側(cè)可以添加用于擴(kuò)增反應(yīng)的擔(dān)負(fù)啟動子作用的序列。
檢測采用檢測用探針，按以下所述對通過上述反應(yīng)得到的連接的寡核苷酸進(jìn)行檢測。
第一種寡核苷酸優(yōu)選預(yù)先加上標(biāo)記。在這種情況下，可以在合成時(shí)導(dǎo)入有生物素、合成連接劑、熒光物質(zhì)等的核苷酸，或在5’末端加上寡聚dGTP、寡聚dATP、寡聚dTTP、寡聚dCTP等修飾基團(tuán)。或者可通過用有生物素、合成連接劑、熒光物質(zhì)等的核苷酸替換寡核苷酸序列中的核苷酸進(jìn)行合成，以導(dǎo)入修飾基團(tuán)。還可以在合成核苷酸后，向其中導(dǎo)入32P、35S等放射性物質(zhì)、ALP、POD等酶、FITC、HEX、6-FAM、TET等熒光物質(zhì)這些公知的寡核苷酸的標(biāo)記物。還可以在野生型第一種寡核苷酸與堿基多態(tài)性第一種寡核苷酸中分別附加上不同的寡核苷酸序列。
試舉具體方法例子如下使采用了第二種寡核苷酸的特定核酸與經(jīng)熒光物質(zhì)等標(biāo)記的第一種寡核苷酸進(jìn)行雜交，順次和/或同時(shí)用含連接酶的酶和含核酸酶活性活性的酶作用后，使之解離，再用結(jié)合再固相上的對多態(tài)性特異的檢測用探針，以及對野生型特異的檢測用探針與其雜交，洗出未雜交的核酸，根據(jù)與各種檢測用探針雜交后的核酸的第一種寡核苷酸的標(biāo)記檢測是否發(fā)生了雜交，再通過各檢測用探針的檢測信號比，鑒定堿基多態(tài)性是否野生型、多態(tài)性或混合態(tài)型。
由于用于野生型與用于多態(tài)性的第一種寡核苷酸中有不同標(biāo)記，例如附加了不同顏色的熒光標(biāo)記，可以用一種采用混合堿基的檢測用探針在堿基多態(tài)性序列中進(jìn)行野生型和多態(tài)性的檢測。
用于野生型及用于多態(tài)性的第一種寡核苷酸上附加有不同的標(biāo)記，例如可以區(qū)別熒光波長的熒光標(biāo)記，可以在至少一種反應(yīng)系統(tǒng)中，同時(shí)使含核酸酶活性的酶及含連接酶活性的酶作用于多種堿基多態(tài)性。此時(shí)，如果至少標(biāo)記用于野生型及多態(tài)性的第一種寡核苷酸上的熒光標(biāo)記不同，則用于鑒定多種堿基多態(tài)性時(shí)，即使混合存在第一種寡核苷酸和第二種寡核苷酸也不會有問題。標(biāo)記用于野生型及用于多態(tài)性的第一種寡核苷酸的熒光標(biāo)記，只要能區(qū)別熒光波長即可，而采用產(chǎn)生不同顏色熒光色素則更好。此點(diǎn)并無特別限定，例如可以在用于野生型的第一種寡核苷酸的5’末端標(biāo)記Cy3，在用于多態(tài)性的第一種寡核苷酸的5’末端標(biāo)記Cy5，也可以作相反的標(biāo)記。
用圖可以說明本發(fā)明的反應(yīng)機(jī)制的一部分例子，但本發(fā)明并不受此圖限定。圖1中，表示以目的核酸為多態(tài)性核酸，采用5’末端用Cy3修飾了的野生型的第一種寡核苷酸和5’末端用Cy5修飾了的多態(tài)性的第一種寡核苷酸。
在本例子的情況下，設(shè)定第二種寡核苷酸中的5’末端為“推測有堿基多態(tài)性序列部分”，同時(shí)設(shè)定與“推測有堿基多態(tài)性序列部分”不互補(bǔ)的堿基。另外，在此情況下，還可以位于第二種寡核苷酸的5’末端的堿基還可設(shè)定為在目的核酸為野生型時(shí)也不與該堿基互補(bǔ)。同時(shí)，在這種情況下，還設(shè)計(jì)成多態(tài)性的第一種寡核苷酸的3’末端的A與第二種寡核苷酸的5’末端的G發(fā)生重疊。還可設(shè)計(jì)成野生型的第一種寡核苷酸的3’末端的C與第二種寡核苷酸的5’末端的G發(fā)生重疊。
圖1的(1)表示多態(tài)性核酸中多態(tài)性的第一種寡核苷酸與第二種寡核苷酸發(fā)生作用的情況。在這種情況下，多態(tài)性的第一種寡核苷酸的3’末端的A在多態(tài)性部位發(fā)生雜交，與其鄰接的部位上，從第二種寡核苷酸的5’末端算起的第二個(gè)T發(fā)生雜交。而第二種寡核苷酸的5’末端的G由于和多態(tài)性部位不互補(bǔ)，便處于不發(fā)生雜交的狀態(tài)。此時(shí)用含核酸酶活性的酶作用，則第二種寡核苷酸的5’末端的G被切斷，同時(shí)生成磷酸基。用含連接酶活性的酶作用于此，則兩條寡核苷酸發(fā)生連接。
圖1的(2)表示多態(tài)性核酸中野生型的第一種寡核苷酸與第二種寡核苷酸發(fā)生作用的情況。在這種情況下，野生型的第一種寡核苷酸的3’末端由于和多態(tài)性部位不互補(bǔ)，因此不發(fā)生雜交。而第二種寡核苷酸的5’末端的G也由于和多態(tài)性部位不互補(bǔ)，處于不發(fā)生雜交的狀態(tài)。此時(shí)含核酸酶活性的酶不能切斷第二種寡核苷酸的5’末端的G。因此含連接酶活性的酶不能起作用，兩條寡核苷酸也不發(fā)生連接。
圖上沒有表示目的核酸為野生型核酸的情況，與圖1表示的結(jié)果相反，多態(tài)性的第一種寡核苷酸與第二種寡核苷酸不連接，而野生型第一種寡核苷酸與第二種寡核苷酸發(fā)生連接。
在圖1所示的情況下，當(dāng)目的核酸僅與多態(tài)性核酸同源時(shí)，可以只得到多態(tài)性的第一種寡核苷酸與第二種寡核苷酸的連接物；當(dāng)目的核酸僅與野生型核酸同源時(shí)，則只得到野生型的第一種寡核苷酸與第二種寡核苷酸的連接物；當(dāng)目的核酸為異源的多態(tài)性核酸和野生型核酸時(shí)，則得到比率接近1∶1的兩種連接物的混合物。
為了便于說明問題，圖1對一種堿基多態(tài)性的情況進(jìn)行了說明，本申請發(fā)明提供了至少一種或2種以上堿基多態(tài)性的測定方法。即，如果至少標(biāo)記用于野生型的和用于多態(tài)性的第一種寡核苷酸的熒光標(biāo)記不同，將用于鑒定多種堿基多態(tài)性的第一種寡核苷酸與第二種寡核苷酸混合，在同一反應(yīng)系統(tǒng)中，使含核酸酶活性的酶和含連接酶活性的酶作用于它們。這樣，在同一反應(yīng)系統(tǒng)進(jìn)行有關(guān)多種堿基多態(tài)性檢測時(shí)，可以按下述方法進(jìn)行檢測。
要檢測多種堿基多態(tài)性，用于檢測這些堿基多態(tài)性的多種檢測用探針，可以采用每種探針各自固定的固相而不發(fā)生彼此干涉的方法。為了測定在少至一種的反應(yīng)系統(tǒng)中同時(shí)用含核酸酶活性的酶和含連接酶活性的酶作用于多種堿基多態(tài)性所產(chǎn)生的反應(yīng)生成物，可以采用固定了上述檢測用寡核苷酸的DNA微陣列。從成本和操作簡便性的方面考慮，采用DNA微陣列也有其優(yōu)點(diǎn)。
本發(fā)明提供了便利而花費(fèi)上也有長處的利用DNA微陣列的檢測系統(tǒng)。為了制備這種DNA微陣列，現(xiàn)就檢測用探針的設(shè)計(jì)方法加以說明。本發(fā)明所采用的探針含有的堿基多態(tài)性部分，必須至少有連續(xù)15個(gè)堿基以上，更優(yōu)選是由連續(xù)的至少18個(gè)堿基組成的堿基序列?？梢院信c第二種寡核苷酸的部分序列互補(bǔ)的序列，或者是同時(shí)含有與含有第一種寡核苷酸的堿基多態(tài)性部位的部分序列和第二種寡核苷酸的部分序列互補(bǔ)的序列。如果檢測用探針與特定核酸序列形成互補(bǔ)鏈，無論是DNA、RNA或PNA，都可以用化學(xué)合成方法或生物學(xué)方法制備。例如利用perkinelmer公司的DNA致敏物391性可以借助亞磷酰胺法進(jìn)行合成。純化則可以在高效液相儀上用MONO-Q柱或逆相柱上進(jìn)行。其他合成方法還有磷酸三酯法、H-磷酸酯法、硫代亞磷酰法等。
檢測用探針的多態(tài)性序列部分即使是混合堿基也無妨。所謂混合堿基，意指包含有與野生型或多態(tài)性都能互補(bǔ)的堿基的堿基。具體來說，在多態(tài)性序列部分，當(dāng)野生型為C，多態(tài)性的為A時(shí)，多態(tài)性序列的部分可以是T或G堿基。現(xiàn)舉例說明具體的調(diào)整方法如下用亞磷酰胺法等合成時(shí)，可以將T和G混合進(jìn)行合成。檢測用探針中的堿基的存在比率隨混合物合成比率不同而不同，選擇希望得到的信號的比率即可。其比率以1∶1為宜。可以舉野生型為C，多態(tài)性為A的情況為例來說明，但當(dāng)多態(tài)性為多種時(shí)，混合堿基即使有3種以上也沒有問題。
使用在本發(fā)明中所使用的檢測用探針制備DNA微陣列時(shí)，可使用現(xiàn)有的方法。DNA微陣列的制備方法，已知有在固相載體表面直接合成探針的方法(on-chip法)和把預(yù)先制備好的探針固定在固相基質(zhì)表面的方法，本發(fā)明的DNA微陣列則最好是用后一種方法制備的。當(dāng)把預(yù)先制備好的探針固定在固相基質(zhì)表面時(shí)，則合成出導(dǎo)入了功能基的探針，再將探針點(diǎn)在表面經(jīng)過處理的固相基質(zhì)表面，使其發(fā)生共價(jià)結(jié)合(例如Lamture，J.B.et al.Nucl.Acids Res.222121-2125，1994；Guo，Z.et al.Nucl.Acids Res.225456-5465，1994)。探針一般通過間隔團(tuán)或交聯(lián)劑作共價(jià)結(jié)合在表面經(jīng)過處理的固相基質(zhì)上。還知道有在玻璃表面上使微小片的聚丙烯酰胺凝膠整齊排列，再將探針共價(jià)結(jié)合在上面的方法(Yershov，G.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 944913，1996)、或?qū)⑻结樈Y(jié)合在被聚L-賴氨酸覆蓋的固相基質(zhì)上的方法(日本特開2001-186880號公報(bào))。此外，還知道有在硅質(zhì)微陣列上制備微小電極的陣列，電極上設(shè)有含有鏈霉親和素的瓊脂糖滲透層作為反應(yīng)部位，使該部位帶上正電荷而固定住生物素化的探針，通過控制某部位的電荷，有可能高速嚴(yán)密的進(jìn)行雜交的方法(Sosnowski，R.G.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 941119-1123，1997)。本發(fā)明的DNA微陣列，可以用上述任何方法制備。另外，在將探針滴在固相基質(zhì)表面上進(jìn)行點(diǎn)樣時(shí)，可以通過針方式(pin方式)來進(jìn)行、也可以采用在日本特開2001-116750號公報(bào)或日本特開2001-186881號公報(bào)中發(fā)表的噴墨方式。點(diǎn)樣后，通過冷卻，在點(diǎn)滴上添加水分(在80％左右的濕度下保持一定時(shí)間)，燃燒燒干燥進(jìn)行固定化處理等，使各點(diǎn)固定在固體基質(zhì)上，即可完成DNA微陣列的制備。此外，DNA微陣列的固相基質(zhì)，除通常在DNA微陣列上使用的玻璃(載玻片)外，還可以使用塑料、硅膠和陶瓷等。
本發(fā)明提供的DNA微陣列和由連接酶連接的第一種及第二種寡核苷酸由于至少有26到70個(gè)堿基左右，所以它有和檢測探針的反應(yīng)性好，并且在DNA微陣列上容易操作的特點(diǎn)。
按照過去所用方法的一個(gè)例子，為了檢測一個(gè)堿基的多態(tài)性，必須制備240條探針。而采用本發(fā)明的方法，為鑒定一個(gè)堿基的多態(tài)性，如果準(zhǔn)備好用有不同熒光波長的熒光物質(zhì)標(biāo)記的用于野生型的第一種寡核苷酸和用于多態(tài)性的第一種寡核苷酸、以及第二種寡核苷酸各一種，只要僅制備至少一種含有混合堿基的檢測用探針即可。因此，在同時(shí)測定多種堿基多態(tài)性時(shí)，本發(fā)明遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)越于過去所用的方法。同時(shí)，由于探針數(shù)目減少，還有減少了非特異反應(yīng)的發(fā)生幾率的優(yōu)點(diǎn)。非特異反應(yīng)常常成為產(chǎn)業(yè)化的障礙，本發(fā)明對本行業(yè)的產(chǎn)業(yè)領(lǐng)域在高速化、高效化等方面作出了較大貢獻(xiàn)。
試劑盒本發(fā)明中，試劑盒可包含(i)含有堿基多態(tài)性的序列部分的2種以上的第一種寡核苷酸；(ii)含有與第一種寡核苷酸連接，并與該堿基多態(tài)性序列部分不雜交的序列的2種以上的第二種寡核苷酸；(iii)含有核酸酶活性的至少一種酶；(iv)含有連接酶活性的至少一種酶；(v)至少與第二種寡核苷酸的一部分互補(bǔ)的兩種以上的檢測用探針，和/或至少與第二種寡核苷酸和第一種寡核苷酸的有一部分互補(bǔ)的兩種以上的檢測用探針。
另外，本發(fā)明中，試劑盒還可包含(i)兩種以上多態(tài)性的第一種寡核苷酸，它們在推測的該堿基多態(tài)性序列部分中含有與顯示多態(tài)性的堿基互補(bǔ)的序列；(ii)兩種以上野生型的第二種寡核苷酸，它們在推測的該堿基多態(tài)性序列部分中含有與顯示野生型的堿基互補(bǔ)的序列；(iii)兩種以上第二種寡核苷酸，它們與多態(tài)性及/或野生型的第一種寡核苷酸相鄰并與推測有該堿基多態(tài)性的序列部分不進(jìn)行雜交的序列；(iv)含有核酸酶活性的至少一種酶；(v)含有一種含連接酶活性的至少一種酶；(vi)至少與第二種寡核苷酸的一部分互補(bǔ)的兩種以上的檢測用探針，和/或至少與第二種寡核苷酸和第一種寡核苷酸的一部分互補(bǔ)的兩種以上的檢測用探針檢測用DNA微陣列上的檢測探針具有如下特征用核酸酶活性除去那些當(dāng)寡核苷酸雜交時(shí)在堿基多態(tài)性序列部分不形成堿基對的堿基序列后，再檢測用連接酶活性作用連接成的第一種寡核苷酸和第二種寡核苷酸結(jié)合物。同時(shí)，第一種和第二種寡核苷酸還可預(yù)先用上述酶、生物素、熒光物質(zhì)、肝素、抗原、抗體、放射性物質(zhì)及發(fā)光基團(tuán)等標(biāo)記。
實(shí)施例以下用實(shí)施例具體說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不限于實(shí)施例。
(1)基因擴(kuò)增用的PCR引物及探針的合成測定的基因和SNP(single nucleotide polymophism，單核苷酸多態(tài)性)部位表示在表1中。為了同時(shí)解析這5種單核苷酸多態(tài)性，借助DNA合成委托公司(日本Bioservice、サヮディ一、GENSET KK、AmershamPharmacia、Biotech等公司)合成了序列編號1～30(參見表2)所示的堿基序列的寡核苷酸(以下簡稱寡1～30)。
表1

表2



(2)用多次PCR(Multi-PCR)擴(kuò)增基因以苯酚-氯仿法從人白血球中抽提的DNA溶液用作樣品，加入下述試劑，按下述條件進(jìn)行多次PCR擴(kuò)增含有5種基因多態(tài)性部位的核酸片段。
試劑制備含有以下試劑的25μl溶液。
bTaq DNA聚合酶反應(yīng)液寡1～10 各2.5pmol×10緩沖液 2.5μl2mM dNTP2.5μlbTaqDNA聚合酶(東洋紡織(株) 1.25U提取的DNA溶液 20ng擴(kuò)增條件94℃-5分鐘94℃-30秒鐘、60℃-30秒鐘、72℃-30秒鐘(40個(gè)循環(huán))72℃-2分鐘
(3)核酸酶/連接酶反應(yīng)在步驟(2)中擴(kuò)增的反應(yīng)液20μl中，加入以下試劑10μl組成反應(yīng)混合液。
寡11～25各 2.5pmol×10bTaq緩沖液 1μl200mM MgCl21.2μl100mM NAD 0.3μlTth DNA連接酶(Epicentre Technology)5UrTaq DNA聚合酶(東洋紡織(株)) 0.625U堿性磷酸酯酶(東洋紡織(株)) 3U反應(yīng)條件37℃-30分鐘94℃-5分鐘94℃-30秒鐘、60℃-2分鐘(15個(gè)循環(huán))(4)檢測(a)DNA微陣列的制備將寡16～20分別與點(diǎn)樣液(松波玻璃工業(yè)公司DSP0050)以1∶1混合。將混合后的寡核苷酸溶液點(diǎn)在制備DNA微陣列的載波片(松波玻璃工業(yè)公司SDA0011)上。在恒濕箱中放置一夜。干燥后，小心用水洗滌，在1％BSA水溶液中放置一夜。反復(fù)兩次用水小心洗滌后，用離心機(jī)(2000rpm、2分鐘)離心干燥。
(b)雜交在步驟(3)的反應(yīng)液2.5μl中加入0.6N NaOH溶液2.5μl混勻。在混合液中加入20μl雜交用溶液[(200mM檸檬酸-磷酸緩沖液(pH6.0)、2％SDS(十二烷基硫酸鈉)、750mM NaCl、0.1％NaN3)，充分混合，在步驟(a)制備的DNA微陣列上加蓋玻片，將混合液從兩玻片的間隙中注入。55℃保溫2小時(shí)。
(c)洗凈保溫2小時(shí)后，在事先保溫于55℃的洗滌液1(2×SSC(pH 7.0)、1％SDS)中放置20分鐘。再在洗滌液2(250μl 50mM Tris-鹽酸緩沖液(pH7.5)、0.025％Tween20溶液)中于室溫下放置15分鐘。最后用離心機(jī)(2000rpm、2分鐘)離心干燥。
(d)測定用富士膠片公司出品的ァレィスキャナFLA8000測定后。用ァレィゲィジ軟件(富士膠片公司出品)分析，測定斑點(diǎn)的熒光值。由表3可見，可以同時(shí)解析5種SNP，并判定其堿基多態(tài)性。
表3

產(chǎn)業(yè)上應(yīng)用可能性本發(fā)明提供了一種判定堿基多態(tài)性序列部分的方法，該方法是使第一種和第二種寡核苷酸與特定核酸雜交，在用連接酶活性和核酸酶活性順次或同時(shí)作用后，用結(jié)合了檢測用探針的陣列檢測是否存在連接的第一種和第二種寡核苷酸進(jìn)行判定的方法。由于借助核酸酶的活性，可以使第二種寡核苷酸的5’末端的磷酸基暴露，在制備寡核苷酸時(shí)可以省略使磷酸基結(jié)合的反應(yīng)。同時(shí)，由于核酸酶活性的作用而只有在5’末端暴露出磷酸基的第二種寡核苷酸發(fā)生連接反應(yīng)，因此減少了非特異的連接反應(yīng)。本發(fā)明還提供了一個(gè)在至少一種的反應(yīng)系統(tǒng)中同時(shí)用核酸酶活性和連接酶活性作用多種堿基多態(tài)性的方法。更由于連接酶連接的第一種和第二種寡核苷酸至少有26到70個(gè)堿基左右，所以具有檢測探針的反應(yīng)性良好，在陣列上可以便利操作的特點(diǎn)。通過本發(fā)明能夠容易的檢測多種堿基多態(tài)性，可望在產(chǎn)業(yè)界有較大貢獻(xiàn)。
權(quán)利要求
1.一種多個(gè)堿基多態(tài)性的鑒定方法，是同時(shí)鑒定含于樣品中的多種堿基多態(tài)性的方法，其特征是，將待測的多種堿基多態(tài)性的樣品，與多種第一種寡核苷酸和多種第二種寡核苷酸進(jìn)行雜交，用含核酸酶活性的酶及含連接酶活性的酶將第一種寡核苷酸和第二種寡核苷酸連接，使其形成連接的寡核苷酸，采用與該連接后的寡核苷酸具有互補(bǔ)序列的檢測用探針鑒定該連接的寡核苷酸的種類。
2.權(quán)利要求1所述的多個(gè)堿基多態(tài)性的鑒定方法，其特征是，含有與第一種寡核苷酸中堿基多態(tài)性序列部分互補(bǔ)的序列。
3.權(quán)利要求1所述的多個(gè)堿基多態(tài)性的鑒定方法，其特征是，含有與第二種寡核苷酸中推測有堿基多態(tài)性的序列部分不互補(bǔ)的序列。
4.權(quán)利要求1～3中任一項(xiàng)所述的多個(gè)堿基多態(tài)性的鑒定方法，其特征是，含有與第二種寡核苷酸的5’末端推測有堿基多態(tài)性的序列部分不互補(bǔ)的序列。
5.權(quán)利要求1～3中任一項(xiàng)所述的多個(gè)堿基多態(tài)性的鑒定方法，其特征是，將第一種寡核苷酸及第二種寡核苷酸與含有推測有堿基多態(tài)性的序列部分的目的核酸相接觸時(shí)，在推測有堿基多態(tài)性的序列部分中，設(shè)計(jì)成至少有一個(gè)以上的堿基重疊。
6.權(quán)利要求1～3中任一項(xiàng)所述的多個(gè)堿基多態(tài)性的鑒定方法，其特征是，第一種寡核苷酸預(yù)先被標(biāo)記。
7.權(quán)利要求6所述的多個(gè)堿基多態(tài)性的鑒定方法，其特征是，標(biāo)記是從包括酶、生物素、熒光物質(zhì)、肝素、抗原、抗體、放射性物質(zhì)、發(fā)光基團(tuán)及特定的核酸序列在內(nèi)的一群物質(zhì)中選定的任一種方法。
8.權(quán)利要求6或7所述的多個(gè)堿基多態(tài)性的鑒定方法，其特征是，用于檢測野生型的第一種寡核苷酸和用于檢測堿基多態(tài)性的第一種寡核苷酸分別用具有不同熒光波長的熒光物質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記。
9.權(quán)利要求1～3中任一項(xiàng)所述的多個(gè)堿基多態(tài)性的鑒定方法，其特征是，以檢測用探針檢測連接的寡核苷酸的方法為雜交。
10.權(quán)利要求1～3中任一項(xiàng)所述的多個(gè)堿基多態(tài)性的鑒定方法，其特征是，檢測用探針含有至少與第二種寡核苷酸的一部分互補(bǔ)的序列。
11.權(quán)利要求1～3中任一項(xiàng)所述的多個(gè)堿基多態(tài)性的鑒定方法，其特征是，檢測用探針含有至少與第一種寡核苷酸和第二種寡核苷酸的一部分互補(bǔ)的序列。
12.權(quán)利要求1～3中任一項(xiàng)所述的多個(gè)堿基多態(tài)性的鑒定方法，其特征是，檢測用探針含有多態(tài)性序列的一部分。
13.權(quán)利要求12所述的多個(gè)堿基多態(tài)性的鑒定方法，其特征是，檢測用探針的多態(tài)性序列部分為混合堿基。
14.權(quán)利要求1～3中任一項(xiàng)所述的多個(gè)堿基多態(tài)性的鑒定方法，其特征是，一種以上的檢測用探針被固定于固相上。
15.權(quán)利要求14所述的多個(gè)堿基多態(tài)性的鑒定方法，其特征是，固定有檢測用探針的固相為DNA微陣列。
16.權(quán)利要求1～3中任一項(xiàng)所述的多個(gè)堿基多態(tài)性的鑒定方法，其特征是，通過擴(kuò)增反應(yīng)使連接的寡核苷酸擴(kuò)增后進(jìn)行檢測。
17.權(quán)利要求16所述的多個(gè)堿基多態(tài)性的鑒定方法，其特征是，擴(kuò)增方法為從包括PCR、NASBA、LCR、SDA、RCR和TMA在內(nèi)的一群方法中選定的任一種方法。
18.權(quán)利要求1～3中任一項(xiàng)所述的多個(gè)堿基多態(tài)性的鑒定方法，其特征是，樣品為預(yù)先擴(kuò)增的核酸。
19.權(quán)利要求18所述的多個(gè)堿基多態(tài)性的鑒定方法，其特征是，擴(kuò)增方法為從包括PCR、NASBA、LCR、SDA、RCR和TMA在內(nèi)的一群方法中選定的任一種方法。
20.權(quán)利要求1～3中任一項(xiàng)所述的多個(gè)堿基多態(tài)性的鑒定方法，其特征是，順次和/或同時(shí)采用含核酸酶活性的酶和含連接酶活性的酶。
21.權(quán)利要求1～3中任一項(xiàng)所述的多個(gè)堿基多態(tài)性的鑒定方法，其特征是，含核酸酶活性的酶和含連接酶活性的酶是同一種酶。
22.權(quán)利要求1～3中任一項(xiàng)所述的多個(gè)堿基多態(tài)性的鑒定方法，其特征是，含核酸酶活性的酶為從包括綠豆核酸酶、S1核酸酶、核酸外切酶I～VII在內(nèi)的一群酶中選定的至少一種酶。
23.權(quán)利要求1～3中任一項(xiàng)所述的多個(gè)堿基多態(tài)性的鑒定方法，其特征是，含連接酶活性的酶為從包括T4DNA連接酶、Ecoli DNA連接酶、RNA連接酶在內(nèi)的一群酶中選定的至少一種酶。
24.權(quán)利要求1～3中任一項(xiàng)所述的多個(gè)堿基多態(tài)性的鑒定方法，其特征是，含核酸酶活性的酶和含連接酶活性的酶為耐熱性酶。
25.權(quán)利要求24所述的多個(gè)堿基多態(tài)性的鑒定方法，其特征是，耐熱性酶來自Tth、Taq、KOD或Pfu。
26.權(quán)利要求1～3中任一項(xiàng)所述的多個(gè)堿基多態(tài)性的鑒定方法，其特征是，含核酸酶活性的酶為DNA聚合酶。
27.權(quán)利要求26條所述的多個(gè)堿基多態(tài)性的鑒定方法，其特征是，DNA聚合酶為從包括來自Tth的耐熱性DNA聚合酶、來自Taq的耐熱性DNA聚合酶、來自KOD的耐熱性DNA聚合酶和來自Pfu的耐熱性DNA聚合酶在內(nèi)的一群酶中選定的1種或2種以上的DNA聚合酶。
28.權(quán)利要求1～3中任一項(xiàng)所述的多個(gè)堿基多態(tài)性的鑒定方法，堿基多態(tài)性包括一個(gè)堿基的多態(tài)性、插入、缺失多態(tài)性的任何一種。
29.一種多個(gè)堿基多態(tài)性的鑒定方法，是同時(shí)鑒定含于樣品中的多種堿基多態(tài)性的方法，其特征如下(1)制備含有該堿基多態(tài)性序列部分的多種第一種寡核苷酸，制備含有與該第一種寡核苷酸相鄰并與該堿基多態(tài)性序列部分不發(fā)生雜交的序列的多種第二種寡核苷酸；(2)將該第一種寡核苷酸和該第二種寡核苷酸與含于樣品中的染色體或核酸片段進(jìn)行雜交；(3)在各種寡核苷酸發(fā)生了雜交時(shí)，用含核酸酶活性的酶除去堿基多態(tài)性序列部分沒有在該第二種寡核苷酸上形成堿基對的堿基序列，然后用含連接酶活性的酶作用，使該寡核苷酸相連接，形成連接的寡核苷酸；(4)采用含有至少與該第二種寡核苷酸的一部分互補(bǔ)的多種堿基檢測用探針，或/和含有至少與該第二種寡核苷酸和第一種寡核苷酸的一部分互補(bǔ)的多種堿基檢測用探針檢測該連接的寡核苷酸。
30.一種試劑盒，是同時(shí)鑒定含于樣品中的多種堿基多態(tài)性的試劑盒，其特征是至少包括以下(i)～(v)(i)兩種以上包含堿基多態(tài)性序列部分的第一種寡核苷酸；(ii)兩種以上包含與第一種寡核苷酸相鄰并與該堿基多態(tài)性序列部分不雜交的序列的第二種寡核苷酸；(iii)至少一種含有核酸酶活性的酶；(iv)至少一種含有連接酶活性的酶；(v)至少與第二種寡核苷酸的一部分互補(bǔ)的檢測用探針，和/或至少與第二種寡核苷酸和第一種寡核苷酸的一部分互補(bǔ)的檢測用探針。
31.一種試劑盒，是同時(shí)鑒定含于樣品中的多種堿基多態(tài)性的試劑盒，其特征是至少包括以下(i)～(vi)(i)在推測有堿基多態(tài)性的序列部分中，含有與顯示多態(tài)性的堿基互補(bǔ)的序列的兩種以上的多態(tài)性第一種寡核苷酸；(ii)在推測有堿基多態(tài)性的序列部分中，含有與顯示野生型的堿基互補(bǔ)的序列的兩種以上的野生型第二種寡核苷酸；(iii)含有與多態(tài)性和/或野生型第一種寡核苷酸相鄰并在該推測有堿基多態(tài)性序列部分不雜交的序列的兩種以上的第二種寡核苷酸；(iv)至少一種含有核酸酶活性的酶；(v)至少一種含有連接酶活性的酶；(vi)至少與第二種寡核苷酸的一部分互補(bǔ)的檢測用探針，和/或至少與第二種寡核苷酸和第一種寡核苷酸的一部分互補(bǔ)的檢測用探針。
32.權(quán)利要求30或31所述的試劑盒，含有預(yù)先固定有檢測用探針的固相。
33.權(quán)利要求30或31所述的試劑盒，其特征是，固相為DNA微陣列。
全文摘要
本發(fā)明的目的在于提供一種優(yōu)異的核酸序列分析方法，以便容易地同時(shí)檢測出樣品中所含的多個(gè)堿基多態(tài)性的種類。將待測多種的堿基多態(tài)性的樣品，與多種第一種寡核苷酸和多種第二種寡核苷酸進(jìn)行雜交，用含核酸酶活性的酶及含連接酶活性的酶將第一種寡核苷酸和第二種寡核苷酸連接，形成連接的寡核苷酸，使用與該連接后的寡核苷酸具有互補(bǔ)序列的檢測用探針，鑒定該連接后的寡核苷酸的核苷酸種類，實(shí)現(xiàn)同時(shí)鑒定含于樣品中的多種的堿基多態(tài)性的種類。
文檔編號C12N15/02GK101065483SQ20058004039
公開日2007年10月31日 申請日期2005年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月17日
發(fā)明者寶田裕 申請人:東洋紡織株式會社