專利名稱：通過在衣藻中異源表達(dá)ⅱ型nad(p)h脫氫酶來生產(chǎn)氫氣的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種提高萊茵衣藻(CWaw;;cfowcw氾"z'w/za^to')制氫的技術(shù)。
背景技術(shù)：
氫氣是化學(xué)工業(yè)的基本原材料，并且也是一種據(jù)稱將在下一個(gè)十年扮演主要角色的燃料。 注氫燃料電池有可能通過氫氣與空氣中的氧反應(yīng)，從而以不產(chǎn)生污染的方式來產(chǎn)生電能，同 時(shí)產(chǎn)生的廢物僅僅是水蒸汽。在燃料電池領(lǐng)域的技術(shù)進(jìn)步使得它們的大規(guī)模應(yīng)用可日益預(yù)見。
然而，當(dāng)前使用的大多數(shù)氫氣是從礦物能資源比如石油或碳制造出來的，該技術(shù)本身會 產(chǎn)生污染，比如由天然氣或者裂解石油或碳來催化轉(zhuǎn)化碳?xì)浠衔铩?br> 所以人們渴望提供一種有成本效率的工藝，用于從可更新的并且是清潔的一次能源來生 產(chǎn)氫氣(不釋放溫室氣體)。
某些屬于柵藻屬(Sce"eA^mw)、綠球藻屬(C7z/oracocciW7)、小球藻屬(C/z/we〃a)(綠 球藻目(order Chlorococcales))、葉被藻屬(丄o6oc/z/a，)禾口衣藻屬(C/z/薩少(io腳腿)(團(tuán) 藻目(order Volvocales))的單細(xì)胞綠藻，比如萊茵衣藻(C/z/awycfowo"cw w/"/za^to')，能夠 使用水作為電子和質(zhì)子供體從太陽能生產(chǎn)氫氣。
在這些藻類中，通過具有很強(qiáng)的特異活性的鐵氫化酶生產(chǎn)出氫氣。該酶經(jīng)由通用的電子 傳送體鐵硫蛋白與PSI光合電子傳遞鏈相聯(lián)系。制氫所需電子可以通過PSII活性(路徑A)、 或者通過經(jīng)由質(zhì)體醌的非光化學(xué)還原使用碳儲備(路徑B)而提供給PSI。這兩個(gè)路徑如

圖1 所示。
圖l說明實(shí)線所示為依賴PSII的路徑A;虛線所示為非PSII依賴性的基于質(zhì)體醌還 原的路徑B。
PSI:光系統(tǒng)I; PSII:光系統(tǒng)II; RuBP:核酮糖1，5-二磷酸酯；LHC:集光復(fù)合體； FNR:鐵硫蛋白NADP還原酶；Fd:鐵硫蛋白；Pc:質(zhì)體藍(lán)素；Cytb6:細(xì)胞色素b6; cytf:
細(xì)胞色素F; NDH: NADH-脫氫酶；PQ(H)2:質(zhì)體醌醇；Qa:苯醌a; P680和P700: PSI和 PSII的反應(yīng)中心。
在自然條件下，H2生產(chǎn)僅僅是瞬時(shí)現(xiàn)象。實(shí)際上，氫化酶對02很敏感?，F(xiàn)在，水的光 解作用發(fā)生在光系統(tǒng)II內(nèi)部，其供給電子用于經(jīng)由路徑A的H2生產(chǎn)，也產(chǎn)生02，這會導(dǎo)致
氫化酶的快速抑制。
為了解決這些問題，人們提出了多種解決方案。第一種方案是在黑暗中生產(chǎn)，其余的方 案是基于部分路徑B使用光進(jìn)行生產(chǎn)，其不同于路徑A，不會導(dǎo)致氧的產(chǎn)生。
例如，美國專利4,532,210描述了一種工藝，交替進(jìn)行光照和黑暗階段。在光照期間，藻 類產(chǎn)生02，并且累積通過光合作用產(chǎn)生的烴基儲備物。然后在黑暗階段在缺氧狀態(tài)下使用這 些儲備物，以便生產(chǎn)氫氣。該方法要求用氮?dú)獯祾?，以便完成厭氧生活。在黑暗中生產(chǎn)H2 的效率也受到限制，比在光下生產(chǎn)低一個(gè)數(shù)量級。
美國專利申請2001/0053543描述了一種基于利用缺硫?qū)崿F(xiàn)光系統(tǒng)II可逆抑制的工藝。 該工藝包含光照下于具有普通含硫量的培養(yǎng)基中培養(yǎng)綠藻、以便使得基于碳?xì)浠衔锏膬?物形成累積的步驟，以及包含在密封容器內(nèi)于缺硫培養(yǎng)基中進(jìn)行光照培養(yǎng)的步驟。光系統(tǒng)II 的抑制導(dǎo)致通過光合作用產(chǎn)生氧氣的延滯。當(dāng)藻類(其呼吸不受缺硫抑制)耗盡所有培養(yǎng)基 中的氧時(shí)，它們變?yōu)閰捬跣?，并且消耗由于光合作用而產(chǎn)生的基于碳?xì)浠衔锏膬湮?，?br> 而生產(chǎn)出H2。存在硫和缺硫的培養(yǎng)階段的交替，使得暫時(shí)分離產(chǎn)生02和產(chǎn)生H2的光照階段
成為可能。
美國專利申請2003/0162273提出了一種用于導(dǎo)致缺硫而抑制光系統(tǒng)II的交替方法；其 包括使用葉綠素體硫酸鹽滲透酶表達(dá)不足的基因修飾藻類。
如上所述的方法使得通過分離02的生產(chǎn)和H2的生產(chǎn)來防止鐵氫化酶抑制成為可能。然 而，通過如上所述三種方法制氫有一定限制。第一方法是基于藻類在黑暗中的發(fā)酵活力，是 一種導(dǎo)致僅有勉強(qiáng)夠格產(chǎn)量氫氣的相對無效的現(xiàn)象。第二和第三種方法是基于路徑A和B的 并列功能。路徑A伴隨有氧氣釋放，必須保持在低于呼吸的02消耗水平，以便保持缺氧狀 態(tài)。路徑A因此受藻類呼吸量的限制。路徑B的貢獻(xiàn)顯著但有限。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提高第二路徑(B)的產(chǎn)率。為此目的，本發(fā)明人想到在葉綠體中使用 II型NADH脫氫酶用于促進(jìn)質(zhì)體醌還原反應(yīng)。
I和II型NADH脫氫酶是能夠還原電子傳遞鏈的醌類的酶。它們與線粒體和細(xì)菌呼吸鏈 相聯(lián)系(KERSCHER， Biochim. Biophys. Acta 1459: 274-283， 2000)。
I型NADH脫氫酶(NDH-I)是多體跨膜復(fù)合物，包括14至約50個(gè)亞基。該類復(fù)合物 僅氧化NADH，并且具有相關(guān)聯(lián)的質(zhì)子泵活性。
II型NAD(P)H脫氫酶(NDH-II)是氧化還原酶類的單體酶，分子量在30和60 kDa之
間，并且通過氧化NADH或NADPH，能夠還原植物和酵母細(xì)菌呼吸鏈或線粒體鏈的醌類。 也有人建議將它們與植物和藻類的光合鏈相結(jié)合，但迄今為止未見描述。該類酶在動物界不 曾有描述。
在高等植物葉綠體中，功能性NDH-I復(fù)合物的存在已經(jīng)被論證(BURROWS等，EMBO J. 17: 868-876， 1998; SAZANOV等，Proc. Natl. Acad. Sci. 95: 1319-1324， 1998; HORVATH 等，Plant Physiol.123: 1337-1349， 2000)，并且也有人建議了 NDH-II型活性的存在 (CORNEILLE等，Biochim. Biophys. Acta 1363: 59-69， 1998)。在萊茵衣藻中，缺乏編碼葉 綠體NDH-I復(fù)合物的基因。然而，有人建議了 NDH-II型活性的存在(COURNAC等，Int. J. Hydrog. Energy 27: 1229-1237， 2002; PELTIER禾卩COURNAC， Annu. Rev. Plant Biol. 53: 523-550， 2002)。
因此本發(fā)明的一個(gè)目的在于使用II型NAD(P)H脫氫酶(NDH-II)，或者使用編碼所述 蛋白質(zhì)的多聚核苷酸，以提高綠藻生產(chǎn)氫氣的能力。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式，所述綠藻是單細(xì)胞綠藻，優(yōu)選選自綠球藻目，進(jìn)一步 優(yōu)選為柵藻屬(&e"ec/e^z^)、綠球藻屬(CWoracocawz)和小球藻屬(CWwe〃a)，以及團(tuán) 藻目(Fo/wca/es)，更進(jìn)一步優(yōu)選為葉被藻屬(丄o6ocWaww)和衣藻屬(CWam少ctowo"tw)。 根據(jù)本實(shí)施方式的一個(gè)優(yōu)選方案，所述藻類屬于衣藻屬。優(yōu)選所述藻類屬于萊茵衣藻 (CWamjY/omo/itxs1 reZn//(m//7/)。
"NDH-II"定義為任何一種下述黃素酶，其具有
a) 對所有NAD(P)H脫氫酶通用的特性，即i)能夠使用FAD (黃素腺嘌呤二核苷酸)或 者FMN (黃素單核苷酸)作為黃素輔助因子，通過NADH或NAD(P)H的氧化來催化電子傳 遞鏈的醌類的還原，以及ii)其序列中存在至少一個(gè)拷貝的共同基序(consensus motif) GxGxxG，其對應(yīng)于黃素輔助因子和NAD(P)H的結(jié)合部位，其中"G"代表甘氨酸，而"x" 代表任何氨基酸；
b) 對II型NAD(P)H脫氫酶特異的特性，即呈30 60kDa單體形式或同源二聚體的活性， 不進(jìn)行任何跨膜質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)的行為，以及具有對魚藤酮不敏感的活性。
關(guān)于NDH-II的詳細(xì)文獻(xiàn)，尤其可以參考YAGI的文獻(xiàn)(J. Bioenergetics Biomembranes 23: 211-224， 1991)、 KERSCHER的文獻(xiàn)(Biochim. Biophys. Acta 1459: 274-283， 2000)，以 及MELO等的文獻(xiàn)(Microbiol Mol Biol Rev. 68: 603-616， 2004)。
因此本發(fā)明人使用了來源于根癌農(nóng)桿菌(NCBI的登記編號AI2824; SWISSPROT登記 號Q8UDU6)的NDH-II、也是指下文中的Agtundh2。編碼該酶的核苷酸序列表示為附后
的序列表中編號SEQIDNO: l所示序列，并且編號SEQIDNO:2所示為推導(dǎo)的多肽序列。 實(shí)施本發(fā)明可以使用的其它NDH-II，該NDH-II源于但不限于下述例子安氏嗜酸兩
面菌(爿c/A'a"i^ aw6/va/e/w， AJ489504 )、 谷氣酸棒桿菌 (Gorj^e6tfcfc〃.WAw g/wZ"m/cw/n,
CAB41413.1)、大腸桿菌(&c/zmWz/aco//，NP_415627)、集胞藻(Sywec/wc^fe平，HOWITT
等，J. Bacteriol 181 (13): 3994-4003， 1999; ORF slrl743: BAA17783)、莫氏單胞發(fā)酵菌 (Zymowo"cw wo6/fc， AAD56918)、枯草桿菌(5ac/〃w ra6"to， NP_389111)、葡萄固氮菌 (v4zoto6a"er W"e/a滅，AAK19737)、布氏錐蟲(7)"，膽o扁6潔e/， AAM95239.1)、馬鈴
著(So/anwm rt/6eraswm， CAB52796.1， CAB52797.1)、酉良酒酵母(Sacc/ aram少ces cerevWae， (YML120C (NP—013586)、 YMR145c (NP—013865.1 )、 YDL085w (NP—010198.1 ))、粗糙
鏈孢霉(A^wm^oracra^a， CAB41986、 EAA27430)和解脂耶氏酵母(:FamnWa/*o/_y"ca，
XP一505856)。
有利的是，也可以使用內(nèi)源性萊茵衣藻NDH-II。編碼假定的NDH-II的序列已經(jīng)在萊 茵衣藻基因組的完整序列中得到鑒定，該完整序列參見網(wǎng)址 "http:〃genome,jgi-psf.org/chlre2/chlre2.home.html" ， NDH-II序列標(biāo)識符為C—310108 、 C—1170009、 C_5950001、 C_1890016、 C_1450028、 C—1450029和C—270109。以該序列為基 礎(chǔ)，本發(fā)明人鑒定了有效編碼NDH-II的序列。以下簡稱該序列為N2Cr2，在附后的序列表 中由編號SEQIDNO: 3表示，并且推導(dǎo)的多肽序列，稱作N2Cr2，由編號SEQ ID NO: 4 表示。
本發(fā)明人克隆并表達(dá)了對應(yīng)于序列SEQ ID NO: 3第199-1857位核苷酸的N2Cr2片段(因 此編碼對應(yīng)于序列SEQ ID NO: 4的第67-619位氨基酸的多肽)，并且顯示出由該相應(yīng)于定 位于葉綠體的NDH-II的片段編碼的多肽。
NDH-II的N2Cr2和顯示出NAD(P)H脫氫酶活性的任何蛋白質(zhì)片段，以及編碼所述 NDH-II或者所述片段的多聚核苷酸，也是本發(fā)明主題的一部分。
如上所述的某些NDH-II具有對NADH的優(yōu)先親和性。雖然NADH和NADPH都存在 于葉綠體中，但NADPH為主要表現(xiàn)形式。為了提高在葉綠體的環(huán)境中優(yōu)先使用NADH的 NDH-II效率，本發(fā)明人想到對這些酶進(jìn)行修飾，以便提高它們的用于NADPH的效率。
本發(fā)明人進(jìn)行了對Agtundh2的定點(diǎn)突變，并且顯示出在優(yōu)先使用NADH的酶中，用中 性的極性殘基取代酸性殘基(對Agtimdh2而言為谷氨酸)的取代物定位于吡啶-核苷酸結(jié)合 的卩-a-(3基序(也稱為"Rossman motif (羅斯曼基序)")的第二卩-折疊(卩-sheet)末端， 正如在優(yōu)先使用NADH的酶中于相同位置遇到的情況，這使得提高它對NADPH的親合力成
因此本發(fā)明的一個(gè)主題也是從優(yōu)先使用NADH的NDH-II得到的NDH-II突變體，該突 變是通過用中性的極性殘基取代位于吡啶-核苷酸結(jié)合的(3-a-|3基序的第二 P-折疊末端的谷氨 酸或天冬氨酸殘基而實(shí)現(xiàn)，優(yōu)選谷氨酰胺或者天門冬酰胺殘基。
這些殘基例如對應(yīng)于Agtundh2序列(SEQIDNO: 2)的201位，并且對應(yīng)于N2Cr2序 列(SEQIDNO: 4)的285位。
圖2所示為在吡啶-核苷酸結(jié)合位點(diǎn)水平上的多種NDH-II的序列對比。(3-a-P基序的共 有序列(consensus sequence)表示在序列對比下面；①代表親水殘基；A代表疏水殘基，#代 表位于第二P-折疊末端的殘基；正是NDH-II中的酸性殘基優(yōu)先使用NADH，并且NDH-II 中的中性極性殘基優(yōu)先使用NADPH (例如，如圖2對比所示，NDH-II如ST - NDB1和 NC-NDE1在該位置具有谷氨酰胺殘基)。
本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供了一種用于提高綠藻生產(chǎn)氫氣的能力的方法，其特征在于， 包括用編碼如上限定的NDH-II的多聚核苷酸對所述藻類進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化，以及在所述藻類中 表達(dá)所述NDH-II。
為了實(shí)施本發(fā)明，將使用普通的基因工程技術(shù)。 一般通過將編碼希望表達(dá)的NDH-II的 多聚核苷酸設(shè)置于合適的表達(dá)調(diào)控序列(特別是轉(zhuǎn)錄啟動子和終止子)支配之下，從而構(gòu)造 出表達(dá)盒(expression cassette)。優(yōu)選將所述編碼NDH-II的多聚核苷酸融合于葉綠體靶向序 列。
另外，該表達(dá)盒也可以包含轉(zhuǎn)錄和/或翻譯調(diào)控元件，其中，特別提到由轉(zhuǎn)錄加強(qiáng)基因或
者沉默子、前導(dǎo)序列、聚腺苷酸化序列等制成的調(diào)控元件。
然后將這樣得到的表達(dá)盒插入到合適的載體中，用來轉(zhuǎn)化選擇的宿主生物體或細(xì)胞。 可以用來轉(zhuǎn)化綠藻的多種工具和方法已知在它們本身之內(nèi)，并且可以用于實(shí)施本發(fā)明(請
參照ROCHAIX等，衣藻中葉綠體和線粒體的分子生物學(xué)，KluwerAcademic出版社，荷蘭，
1998)。
作為可用于本發(fā)明的表達(dá)調(diào)控序列(啟動子、終止子等)和葉綠體耙向序列的非限制性
實(shí)施例，將由下述成員制成
-對于細(xì)胞核表達(dá)，有啟動子、終止子和編碼RUBISCO (二磷酸核酮糖羧化酶/氧合酶) 的RbcS2基因的耙向肽小亞基(GOLDSCHMIDT-CLERMONT和RAHIRE， J. Mol. Biol. 191: 421-432， 1986)、編碼葉綠體ATP合成酶的Y亞基的AtpC基因(QUINN和MERCHANT, Plant Cell 7: 623-638， 1995; KINDLE禾卩LAWRENCE Plant Physiol. 116: 1779-1791， 1998)
和編碼質(zhì)體藍(lán)素的Pe伍基因(QUINN和MERCHANT, 1995，同上；KINDLE, Plant Mol. Biol. 38: 365-377， 1998)，它們可以進(jìn)行不同的組合；并且
-對于在葉綠體內(nèi)表達(dá)，有啟動子、終止子和編碼RUBISCO大亞基的RbcL基因的靶向 肽、編碼ATP合成酶的p亞基的AtpB基因和編碼光系統(tǒng)II的Dl亞基的PsbA基因 (BATEMAN和PURTON， Mol. Gen. Genet 263: 404-410， 2000)。
作為可以用于本發(fā)明的可選擇標(biāo)記的非限制性實(shí)施例，將由下述成員制成 -對于細(xì)胞核表達(dá)，有編碼衣藻精氨琥珀酸裂解酶的Arg7基因，其與缺乏精氨酸因此是 精氨酸營養(yǎng)缺陷型的突變體互補(bǔ)(DEBUCHY等，EMBOJ. 8: 2803-2809, 1989);編碼衣藻 硝酸還原酶的Nit 1基因，其與因缺乏而因此不能用硝酸鹽作為唯一氮源生長的突變體互補(bǔ) (KINDLE等，J. Cell Biol. 109: 2589-2601， 1989);編碼源于衣藻的煙酰胺涉及生物合成的 酶的Nic7基因，其與因缺乏而因此為煙酰胺營養(yǎng)缺陷型的突變體互補(bǔ)(FERRIS， Genetics 141: 543-549， 1995);編碼衣藻光系統(tǒng)II的亞基的Oeel基因，其與嚴(yán)格異養(yǎng)型的突變體互補(bǔ) (MAYFIELD和KINDLE, Proc. Natl, Acad. Sci. USA. 87: 2087-2091， 1990);編碼源于大腸 桿菌的氨基糖苷腺嘌呤轉(zhuǎn)移酶的aadA基因，其使任何衣藻屬菌株具有大觀霉素和鏈霉素抗性 (CERUTTI等，Genetics. 145: 97-110， 1997);編碼源于辛氏鏈異壁菌(S,豐oa脅Zc/m /n'm/^tom^)的博來霉素結(jié)合蛋白的ble基因，其使任何衣藻屬菌株具有腐草霉素抗性 (STEVENS等，Mol. Gen. Genet. 251: 23-30， 1996);而編碼抗生素抗性的基因必須是在源 于衣藻的調(diào)控序列比如RbcS2的支配下表達(dá)；并且
-對于在葉綠體內(nèi)表達(dá)，有突變體補(bǔ)體，該突變體通過在編碼光合鏈蛋白質(zhì)的基因中刪 除或者插入嵌合DNA片段所攜帶的天然基因而得到，例如編碼PSII亞基的psbH基因 (BATEMAN和PURTON， Mol. Gen. Genet. 263: 404-410， 2000);編碼源于大腸桿菌的氨 基糖苷類腺嘌呤轉(zhuǎn)移酶的aadA基因，其使菌株具有鏈霉素和大觀霉素抗性；和編碼源于鮑曼 不動桿菌"c/"Wo^"w 6做m朋/0的氨基糖苷類磷酸轉(zhuǎn)移酶的a-6基因，其使菌株具有卡那 霉素和氨丁卡霉素抗性。
綠藻的轉(zhuǎn)化可以通過多種方法進(jìn)行，例如，通過玻璃珠轉(zhuǎn)化將DNA插入細(xì)胞核基因組 (KINDLE, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87: 1228-1232， 1990)，通過基因槍法(biolistics) 轉(zhuǎn)化(DEBUCHY等，EMBOJ. 8: 2803-2809， 1989)，以及通過電穿孔法(electroporation) 轉(zhuǎn)化(SHIMOGAWARA等，Genetics, 148: 1821-1828， 1998)。
對于葉綠體DNA的轉(zhuǎn)化以及在葉綠體內(nèi)表達(dá)，使用由與葉綠體基因組序列同源的序列 所決定、并且對應(yīng)于基因組中性區(qū)(neutral zones,非編碼和非調(diào)控性區(qū))的DNA，該插入
物可以優(yōu)選通過同源重組制備，并且使用如上所述轉(zhuǎn)化技術(shù)用于插入細(xì)胞核基因組中，特別 是使用基因槍法產(chǎn)生了最好的收率。
本發(fā)明還涉及用編碼如上限定的NDH-II的多聚核苷酸轉(zhuǎn)化的綠藻。
根據(jù)本發(fā)明的綠藻可以在與未轉(zhuǎn)化的綠藻相同的條件下用于制氫。它們例如可以用于比 如是如上所述專利US4,532,210或者專利申請US2001/0053543所描述的工藝。
通過以下附加的描述，可以更徹底地理解本發(fā)明，以下內(nèi)容是指非限制性實(shí)施例，其顯 示了農(nóng)桿菌"gra6""en'ww)的NDH-II與萊茵衣藻光合作用電子傳遞鏈的互相作用能力， 以及還原質(zhì)體醌的能力，并且闡明了用編碼所述NDH-II的多聚核苷酸轉(zhuǎn)化萊茵衣藻的技術(shù)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例l:在大腸桿菌中克隆和表達(dá)根癌農(nóng)桿菌NDH-II I-分離NDH-II基因
使用下述引物對，從根癌農(nóng)桿菌(菌株C58)基因組DNA擴(kuò)增編碼根癌農(nóng)桿菌 (Agrobacterium tumefaciens， NCBI登記號No.: AI2824; SWISSPROT登記號No.: Q8UDU6) 的NDH-II的Agtundh2基因 上游N2Ag.mfe.F
CGCC^r7UATGCAAGAACATCATGTT (SEQIDNO: 5) 下游N2Ag.6His.PstR
6)
將m/el和尸Wl (斜體)限制性酶切位點(diǎn)插入上游和下游引物中，分別位于起始和終止密 碼子(粗體)的上游和下游。由6個(gè)組氨酸密碼子(下劃線)組成的標(biāo)簽插入終止密碼子上 游。在下列條件下進(jìn)行擴(kuò)增 -疲源她
含有1.5 mM MgCl2的特定反應(yīng)緩沖液
引物終濃度0.5 ^iM
dNTP混合物終濃度200 pM
300 ng的DNA
1.5單位的高保真耐高溫Taq聚合酶(Expand High Fidelity Taq polymerase)(羅氏公司)
-r譜條伴，
95 。C下3 min， 80 。C下1 min: 1個(gè)循環(huán)
95。C下lmin， 70 。C下1 min (每循環(huán)-0.5。C)， 72 。C下2 min: 20個(gè)循環(huán) 95 。C下1 min， 60 。C下1 min， 72 。C下2 min: 10個(gè)循環(huán) 72。C下6min: 1個(gè)循環(huán)。
擴(kuò)增產(chǎn)品包括編碼NDH-II的序列，以及，6個(gè)組氨酸密碼子所組成的標(biāo)簽的編碼序列 的3'端。
II-在大腸桿菌中表達(dá)和純化
1- 克隆
用m/e/和尸W/消化擴(kuò)增產(chǎn)品(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室(New England Biolab)，供應(yīng)商的推 薦方案)并且通過連接反應(yīng)(連接酶購自新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，供應(yīng)商的推薦方案)導(dǎo)入用 五coi /禾Q尸W/消化的表達(dá)載體。
該載體pSD80，攜帶有氨芐抗性盒(ampicillin-resistance cassette),強(qiáng)有力的Taq啟動子 和LaqiQ抑制基因(Laq iQ repressor gene) (PATEL禾P DUNN， J. Bacteriol. 177: 3917-3922， 1995; SMITH等，Biochem.35: 8805-8814， 1996)。
然后通過電穿孔將連接反應(yīng)產(chǎn)品導(dǎo)入大腸桿菌E co//DH10p。
然后通過使用如上所述相同引物和相同條件的PCR篩選氨芐抗性轉(zhuǎn)化體證實(shí)，以便證實(shí) 爿g加"W2基因的存在。
然后使用對pSD80載體具有特異性的引物以及^g/w"^2基因內(nèi)的引物，通過測序來檢 驗(yàn)該構(gòu)建體。
pSD80.F 5'陽GAGCTGTTGACAATTAAT-3' (SEQIDNO: 7)
pSD80.R 5'-AGGACGGGTCACACGCGC - 3' (SEQIDNO: 8)
N2Ag.307.F 5'-TGGCCACCGGCGCGCGT陽3' (SEQIDNO: 9) N2Ag.650.f 5'-TGCGAAGGAAGCGCTTGA-3' (SEQIDNO: 10) N2Ag.901.R 5'-TTCCTGATTGACCGCGG陽3' (SEQIDNO: 11)
在證實(shí)序列并且校正插入物后，將該質(zhì)粒命名為pSDN2Ag6H，并且用來通過電穿孔方 法，與攜帶有6條大腸桿菌中最稀有的tRNAs的載體(pRare， Novagen) —起共轉(zhuǎn)化 (cotransform) co//DH10(3菌株。
挑選出一種有氨芐青霉素和氯霉素抗性的共轉(zhuǎn)化體(cotransformant)，用于表達(dá)并且純化 NDH-II6His蛋白質(zhì)。
2- 表達(dá)
在2.5 L錐形燒瓶中裝入體積為1 L的含氨芐青霉素和氯霉素LB(LuriaBertani)培養(yǎng)基， 將預(yù)培養(yǎng)15 h的培養(yǎng)物按1/50的體積比接種，并于37 °C下振蕩培養(yǎng)，直至0.5倍的光密度。 用0.5 mM異丙基-(3-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)NDH-II 6His表達(dá)，進(jìn)行2h。 然后通過離心收集細(xì)胞，并且用新培養(yǎng)基沖洗，并在-80。C下儲藏。 3-純化
純化方案已由BJOERKLOEF等公布(FEBS Letts.， 467: 105-110， 2000)。 細(xì)胞解凍并且再懸浮于2.5mMEDTA、 0.2 mM PMSF (苯基亞甲基磺?；?、200
mMpH8的Tris-Cl中，濃度大約為1 g每10 ml。添加300嗎/ml溶菌酶，并且在冰浴中將
混合物保溫1 h。
然后將懸浮液在120 000 x g下離心60 min。通過在10 mM磷酸鉀緩沖液，pH 8中再懸 浮，對所得小粒進(jìn)行滲透性振蕩處理，該緩沖液含有2 mM EDTA和0.2 mM PMSF，并且用 珀特勻漿器(Potterhomogenizer)勻漿，然后再次離心(60min， 120 000xg)。
細(xì)胞膜部分在上述緩沖液中被吸收，并且被珀特勻漿器珀特均質(zhì)化。然后通過添加十二 垸基麥芽糖苷(DM)使細(xì)胞膜溶液化，終濃度為0.2% (重量/體積)，并且清潔劑/蛋白質(zhì)比 率為0.1 ，并且NaCl終濃度為500 mM。攪拌懸浮液并且冰浴保溫30 min，然后離心(60 min， 120 000 x g)。
在4。C下，利用色譜系統(tǒng)(Ak仏FPLC， Amersham Biosciences, Uppsala)，通過在鎳柱 (HiTrap螯合柱5 ml， Amersham Biosciences， Uppsala)上的中壓親和色譜法進(jìn)行酶的純化。 用含有500 mMNaCl、 0.2% DM和20 mM咪唑的50 mM磷酸鉀緩沖溶液(pH7.5)對該柱 進(jìn)行第一次預(yù)平衡。加載樣品后，用不含咪唑的上述溶液沖洗該柱(溶液A)，以便除去全部 未結(jié)合的蛋白質(zhì)。最后用濃度提高的含有250 mM咪唑的溶液(溶液B)洗脫柱子。在多種 比例的濃縮咪唑溶液(10%、 15%、 50%、 100%)下，各收集5ml洗脫液。
通過熒光檢測到的蛋白質(zhì)峰出現(xiàn)在咪唑濃度125 mM的色譜上(圖3A)。通過13%丙烯 酰胺凝膠電泳，在變性條件(SDS-PAGE)下，分析了各收集組分(26-29)的蛋白質(zhì)含量(圖 3B)。為了作對比，也分析了對應(yīng)于起始總洗脫組分(T)并且也對應(yīng)于可溶性組分(S)和 細(xì)胞膜(M)組分的樣品。
然后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上，并且用指示聚組氨酸(polyhistidine sequence)序 列的單克隆第一抗體(Sigma公司)，通過免疫印跡作標(biāo)記，標(biāo)記lh，然后用指示小鼠IgGs 的第二抗體與堿性磷酸酶偶聯(lián)，也偶聯(lián)1 h。
在圖3B (29)中，可觀察到有用抗體標(biāo)記的明顯條帶存在，其分子量中小于50kDa，相
應(yīng)于預(yù)期大小的蛋白質(zhì)(44 kDa)。該蛋白質(zhì)發(fā)現(xiàn)于細(xì)胞膜組分(M)，并且不存在于可溶性 組分(S)中。
通過超濾將組分29濃縮至體積900)^1。添加220ial體積的純甘油，并且將酶在-80 °C下 儲藏。在SDS-PAGE凝膠上，通過與BSA (牛血清白蛋白)標(biāo)準(zhǔn)范圍相比，估計(jì)出酶濃度。 III-酶的表征 1 -輔酶分析
通過FANG和BEATTIE描述的熒光測定法(Biochem. 41: 3065-3072， 2002)測定輔酶 的性質(zhì)。將純化的酶加熱至沸騰保持3 4min，然后離心。
使用150 x 4.6 mm的Supelcosil LC-DP柱(Supelco)，通過高壓液相色譜分析上清液。流 動相由80%含0.1% TFA的水和20%含0.1% TFA的40%乙腈組成。室溫下在柱中的流量是1 ml/min。將熒光檢測器的激發(fā)和發(fā)射波長分別調(diào)節(jié)在450和525 nm。平行分析了 FAD (Sigma 公司)和FMN (Sigma公司)標(biāo)準(zhǔn)樣。
在圖4中可見，酶樣(N2Ag)的發(fā)射峰精確地對應(yīng)于FAD標(biāo)準(zhǔn)樣的峰。
這些結(jié)果表明，根癌農(nóng)桿菌NDH-II的輔助因子是FAD (黃素腺嘌呤二核苷酸)。 2-測量細(xì)菌細(xì)胞膜上的酶活性
在接下來的實(shí)驗(yàn)中，測定該酶把電子轉(zhuǎn)運(yùn)到大腸桿菌呼吸鏈的能力。
使用來源于缺乏NDH-I和NDH-II的大腸桿菌菌株細(xì)胞膜，分析根癌農(nóng)桿菌NDH-II的 活性"wo5::豐7)。
在50 ml LB-四環(huán)素中培養(yǎng)大腸桿菌菌株ANN0222(親本AN398; WALLACE和YOUNG， Biochim.Biophys. Acta. 461: 84-100， 1977)，直至指數(shù)生長期結(jié)束(OD = l)。然后通過離心 (15 min， 3200 x g)收集細(xì)胞，并且用10 ml含有200 mM pH 8的Tris-Cl、 2.5 mM EDTA 和0.2 mM PMSF的溶液洗滌兩次。然后使它們在16 000 psi的壓力下兩次通過French壓機(jī)， 使其破壁。
通過離心(30 min， 48 500 x g)回收細(xì)胞膜組分，并且再懸浮于200 分析用緩沖液(50 mM磷酸鹽緩沖液，pH7.5，禾B 150mMNaCl)。
通過克拉克電極(Clark electrode, DW2/2， Hansatech， King's Lynn，英國)的手段測量 大腸桿菌ANN0222細(xì)胞膜的O2消耗。在添加純化酶后，該方法使得測定其特異活性成為可 能。
含有10 |al細(xì)菌細(xì)胞膜和1.5 pi純化酶(保持在1 mg/ml)的反應(yīng)混合物在用990 ^分析 用緩沖液(50mM磷酸鹽緩沖液，pH7.5，和150 mM NaCl)稀釋前，在冰浴中預(yù)保溫lOmin，
并且由吸量管導(dǎo)入電極的分析腔。在提高作為電子供體的NADH或NADPH濃度情況下，25 °C下進(jìn)行反應(yīng)。
通過以下無細(xì)菌細(xì)胞膜時(shí)的反應(yīng)，可以看出該酶顯示出了直接的02攝取活性。在SOD 和過氧化氫酶存在情況下進(jìn)行了較大程度還原的后者，與活性氧種類的形成有關(guān)系(圖5)。
為了僅僅測量細(xì)胞膜相關(guān)聯(lián)的呼吸性氧化酶活性，在反應(yīng)混合物中添加了過氧化氫酶 (1000U/ml)和超氧化物歧化酶(SOD) (500U/ml)。當(dāng)存在酶-細(xì)胞膜混合物時(shí)，在冰浴中 保溫10 min后，使二苯撐碘翁(DPI)的抑制效果定量化。在200 NADH或者2 mM NADPH 存在情況下，測定抑制動力學(xué)。
農(nóng)桿菌NDH-II的最大活性(Vmax二5(^Tiol02.min".mg-'蛋白質(zhì))是在文獻(xiàn)中描述的其 它NDH-II的相同數(shù)量級范圍之內(nèi)。在生理pH下，該酶具有對NADH較強(qiáng)的親合力(Km = lOpM)(圖6A)，和對NADPH并非無關(guān)緊要的親合力(Km=50pM)(圖6B)，這對于細(xì) 菌酶來說很少見。就在葉綠體中產(chǎn)生該酶功能而言，這一特性是有利的，因?yàn)樵摷?xì)胞室含有 豐富的NADPH。顯然酶受到普通的NDH-II抑制劑的影響，并且特別是受具有I5o的10 |iM DPI影響(圖6C)。
實(shí)施例2:通過農(nóng)桿菌NDH-II驗(yàn)證萊茵衣藻質(zhì)體醌的還原
通過測量葉綠素?zé)晒庑苑治隽宿r(nóng)桿菌NDH-Il還原質(zhì)體醌的活性。在存在弱的無光化性 照明情況下，葉綠素?zé)晒庑缘臏y量提供了質(zhì)體醌氧化還原態(tài)指示信號。 I -制備類囊體膜
在指數(shù)生長期(大約5xl()S個(gè)細(xì)胞.mr1)取樣200ml萊茵衣藻(野生型137c)培養(yǎng)液， 然后離心(5min， 1000xg)。將細(xì)胞在35 mM HEPES-NaOH緩沖液(pH7.2)中洗滌，再懸 浮于10ml溶菌緩沖液(50mMTricine-NaOH， pH8; 10mMNaCl; 5mMMgCl2; 1。/。BSA; 1 mM苯甲脒和1 mMPMSF)，并且冷卻黑暗下儲藏，用于下述步驟。
使懸浮液在2000 psi下兩次通過French壓機(jī)。溶菌液進(jìn)行首次離心(5 min， 4 。C， 500 x g)，以便除去未溶解的細(xì)胞，然后在10 000xg下離心10min將類囊體膜制成粒狀物，并且 再懸浮于250 500 |al的分析用緩沖液(50 mM Tricine-NaOH， pH 7.2; 10 mM NaCl和5 mM MgCl2)。 II-質(zhì)體醌還原
通過使用調(diào)制光熒光計(jì)(modulated light fluorimeter， PAM 101-103， Walz， Effeltrich，德
國)測量光系統(tǒng)II熒光性。
使用無光化性調(diào)制光(650 nm， 1.6千赫茲)以測定葉綠素?zé)晒庑运紽。。在1秒鐘飽 和閃光下測量葉綠素?zé)晒庑宰罡咚紽m (大約1000 nmol光子.m—2.5—1)。為了防止質(zhì)體醌再 次氧化，實(shí)驗(yàn)在厭氧條件下進(jìn)行，該厭氧條件是通過向反應(yīng)混合物添加葡萄糖(20mM)、葡 萄糖氧化酶(2mg.mr1)和過氧化氫酶(1000單位.mr1)形成的。
在有或者沒有NDH-II (終濃度1.5嗎.1111")情況下，將類囊體膜在冰浴中保溫10min， 并且在添加200 pM的NADH前后比較質(zhì)體醌還原速率。其結(jié)果如圖7所示(圖中，NDH2Ag =有農(nóng)桿菌NDH-II;對照樣=僅有天然酶；DPI-DPI的抑制效果)。
圖7顯示，在添加NADH后，測量的源于衣藻的類囊體膜上葉綠素?zé)晒庑蕴岣吡?。這種 提高相應(yīng)于PQs被藻類天然酶的非光化學(xué)還原。然而，當(dāng)存在純化的農(nóng)桿菌NDH-II (NHD2Ag)時(shí)，熒光性增加更快并且更強(qiáng)。因此質(zhì)體醌的還原比僅有天然酶(對照樣)來 得強(qiáng)。這證明了農(nóng)桿菌NDH-II與光合電子傳遞鏈相互作用的能力。
為了定量這種農(nóng)桿菌NDH-II對于從NAD(P)H到PSI受體的電子流的影響，在甲基紫 精(PSI受體)、DCMU (二氯苯基二甲脲，PSII的一種抑制劑)和NADH (200 )或NADPH (2mM)電子供體存在時(shí)進(jìn)行氧消耗測量。
將衣藻屬類囊體(50(^1，對應(yīng)于85嗎.ml"葉綠素)置于克拉克電極(Clark electrode) 中，該電極含有900 |al分析用緩沖液(50 mM Tricine-NaOH， pH 7.2; 10 mM NaCl和5 mM MgCl2; 25|aMDCMU; 50)aM甲基紫精；SOD (500U.ml");過氧化氫酶(1000U.ml"); 4
粘噻唑菌醇(myxothiazol)禾B 800 SHAM (水楊基氧肟酸)。添加后兩個(gè)化合物是為 了抑制呼吸性02攝取。
在這些條件下，對細(xì)胞色素b6f抑制劑DNP-INT (2-碘-6-異丙基-3-甲基-2',4,4'-三硝基二 苯基醚；lO^M)敏感的光子引起的氧攝取部分，與NAD(P)H和光合鏈之間的電子傳遞成比 例。
當(dāng)NADPH用作供體時(shí)，添加1.5嗎純化根癌農(nóng)桿菌NDH-II促進(jìn)了這種電子傳遞由20 增加到45 nmol.min".mg"葉綠素，并且當(dāng)NADH用作供體時(shí)，電子傳遞由21增加到67 nmol.min".mg"葉綠素。
由于根癌農(nóng)桿菌NDH-II的添加，因此該實(shí)驗(yàn)使得NADPH (或者NADH)和類囊體質(zhì) 體醌之間電子傳遞促進(jìn)作用定量化成為可能。對NADPH而言，該促進(jìn)作用的因子數(shù)約為2， 并且就NADH而言，因子數(shù)約為3。
這些體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果使得在萊茵衣藻(并且一般地說，在任何能夠生產(chǎn)氫氣的藻類)中異 源表達(dá)NDH-II這一設(shè)想成為可能，其是否是葉綠體性NDH-II、或具有耙向葉綠體的細(xì)胞
核性NDH-II，都可以提高葉綠體內(nèi)部(intrachlor叩last)質(zhì)體醌還原酶活性，并且關(guān)聯(lián)到H2 的生產(chǎn)。
實(shí)施例3:用編碼根癌農(nóng)桿菌NDH-II的序列轉(zhuǎn)化萊茵衣藻 I -質(zhì)粒pSADN2Ag的構(gòu)建
使用下述引物，通過PCR從根癌農(nóng)桿菌U. ^附e/ac7'era，菌株C58)基因組擴(kuò)增^g加"W2 基因
ndhAgTu.F
5' -TCCCCCGGGATGCAAGAACATCATGTT- 3' (SEQ ID NO: 12) (Tm 66.5 °C)
禾口
ndhAgTu.R
5' -CCGCAATTGTCAGGCCTCGTCCTTCAG- 3' (SEQ ID NO: 13) (Tm69.5 °C)
并且在下列條件下進(jìn)行
含有1.5 mM MgCl2的特定反應(yīng)緩沖液
引物終濃度0.5
dNTP混合物終濃度200
300 ng的DNA
1.5單位的高保真耐高溫Taq聚合酶(Expand High Fidelity Taq polymerase)(羅氏公司) -f譜姿伴，
95 °C下3 min， 80 °C下1 min: 1個(gè)循環(huán)
95 。C下1 min， 60 。C下1 min， 72 °C下2 min: 30個(gè)循環(huán)
72 °C下6 min: 1個(gè)循環(huán)
用Smal/w/el消化擴(kuò)增產(chǎn)品。
用iVaeIAEcoRI消化質(zhì)粒pGEND2 (FISHER和ROCHAIX， Mol, Genet. Genomics. 265: 888-894， 2001)，以便切除編碼除葉綠體靶向肽之外的PsaD蛋白的序列。切除的片段替換為 從N2Ag基因擴(kuò)增產(chǎn)品得到的Sm"I/m/el片段。
得到的質(zhì)粒稱為pSADN2Ag，因此其含有編碼根癌農(nóng)桿菌NDH-II的序列，受PsaD基
因啟動子的調(diào)控，并且與PsaD蛋白的葉綠體靶向肽進(jìn)行翻譯融合。
II-轉(zhuǎn)化萊茵衣藻
使用因缺乏精氨琥珀酸裂合酶而因此為精氨酸營養(yǎng)缺陷型的萊茵衣藻突變體(CC-2852 arg7cwl5mt+，衣藻屬中心，杜克大學(xué)，達(dá)拉謨，美國)。將該藻類置入200 ml的TAP培養(yǎng) 基(HARRIS,衣藻原始資料，學(xué)術(shù)出版社，圣地亞哥，1989)中，培養(yǎng)基中補(bǔ)充有100 mg/L 精氨酸，在25。C溫度下、并且在大約35pmol光子.m^"的連續(xù)光照下進(jìn)行振蕩培養(yǎng)。
在指數(shù)生長期末尾(濃度為大約107個(gè)細(xì)胞/1111)，通過離心濃縮藻類，并且取出后置于 TAP培養(yǎng)基中，得到3xl()8個(gè)細(xì)胞/ml的懸浮液。
質(zhì)粒pSADN2Ag與質(zhì)粒p389 (衣藻中心，杜克大學(xué)，達(dá)拉謨，美國； http:〃chlamy.org/strains/plasmids.html) —起使用，其中質(zhì)粒p389由衣藻的核DNA片段組成， 大小7.1kb，包含有Jrg7基因，并且將它們克隆于載體pBR329內(nèi)的BamHI，以便共轉(zhuǎn)化藻 類。在試管內(nèi)混合300 mg的0.5 mm玻璃珠(Sigma公司)、10 |al質(zhì)粒pSADN2Ag (= 1嗎)、 2 (al質(zhì)粒p389 (= 0.2 pg)和350 pl藻類懸浮液(=大約108個(gè)細(xì)胞)。將試管在最大速度下 旋轉(zhuǎn)振動15秒。然后添加650 ^ TAP，在攪勻后，該懸浮液用于接種到兩個(gè)含有無精氨酸 TAP培養(yǎng)基U5g/L瓊脂)的陪氏培養(yǎng)皿(Petri dish)上(每皿450mu1)。
在連續(xù)光照G5pm0l.m2.S")和25。C下培育10天后，將藻類在相同的培養(yǎng)基上繼代培 養(yǎng)。在2次繼代培養(yǎng)后，獲得在無精氨酸下生長的轉(zhuǎn)化體。
通過PCR法檢測基因來挑選具有整合iVZ4g基因的轉(zhuǎn)化體。
根據(jù)下面的方案溶化菌落
挑取每個(gè)菌落置于100 |al無菌水(milliQ⑧過濾)。在1.5 ml試管中混合5 pl的10 x PCR 緩沖液、1 ^的0.01% SDS、 1 |al的200 mM DTT (二硫蘇糖醇)、3 pl細(xì)胞和39的H20。 進(jìn)行5個(gè)冷凍/解凍循環(huán)(在液氮和55 。C水浴之間進(jìn)行)。 添加2 nl的10 |ag/ml蛋白酶K，并且將混合物在55 。C下保溫1 h。 95 。C下處理5分鐘使蛋白酶K失活。
使用ndhAgTu.F和ndhAgTu.R為引物、并且在下列條件下進(jìn)行PCR: -反應(yīng)混合物假定終體積為25mull時(shí) 2.5 pl的10X緩沖液 2mul的dNTP混合物 每個(gè)引物1.25mul
2.5 nl的10XBSA
3 pi細(xì)胞菌溶液
0.3 (x的Taq聚合酶(Qiagen公司) 12.2 pl的H20 -f譜姿伴，
95 °C下3 min， 80 °C下1 min: 1個(gè)循環(huán)
95 。C下1 min， 60 。C下1 min， 72 。C下2 min: 30個(gè)循環(huán)
72 °C下6 min: 1個(gè)循環(huán)
通過用已用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒替換衣藻基因組DNA,來進(jìn)行陽性對照。 通過1%瓊脂糖凝膠遷移分析了擴(kuò)增產(chǎn)品，并且用溴乙錠(ethydium bromide)染膠后顯
像(圖8)。將分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物(marker)平行載于凝膠上，以便出估計(jì)得到的擴(kuò)增產(chǎn)品大小。
具有整合NDH-II基因的轉(zhuǎn)化體顯示出大約1.2 kb的條帶，在陽性對照上也觀察到該條 帶。共轉(zhuǎn)化體的比例(=整合了兩個(gè)質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)化體)是大約50%。 III-NDH-II表達(dá)
通過對6個(gè)共轉(zhuǎn)化體進(jìn)行RT-PCR(實(shí)時(shí)定量PCR)，證實(shí)了農(nóng)桿菌NDH-II基因的表達(dá)。 根據(jù)供應(yīng)商的說明(Qiagen公司)，用脂^盯@試劑盒從25 ml指數(shù)生長期的培養(yǎng)物中提取總 RNA。根據(jù)供應(yīng)商(Quigen公司)的推薦方案，使用Omniscript⑧試劑盒，制備互補(bǔ)DNA (cDNA)，調(diào)節(jié)各種RNAs體積，以便在每個(gè)反應(yīng)中得到2 ^g。
使用ndhAgTu.F和ndhAgTu.R為引物，并且在下列條件下進(jìn)行PCR: -f應(yīng)船激，
含有1.5 mM MgCl2的特定反應(yīng)緩沖液
引物終濃度0.5 pM
dNTP混合物終濃度200
300 ng的cDNA
1.5單位的高保真耐高溫Taq聚合酶(Expand High Fidelity Taq polymerase)(羅氏公司)
-r譜餘-
95 °C下3 min， 80 °C下1 min: 1個(gè)循環(huán)
95 。C下1 min， 60 。C下1 min， 72 °C下2 min: 30個(gè)循環(huán)
72 °C下6 min: 1個(gè)循環(huán)
進(jìn)行陰性對照，以便證實(shí)觀察到的擴(kuò)增子不是來自于在RNA提取方案所包含的消化步驟 后存留的細(xì)胞核DNA的擴(kuò)增。為進(jìn)行對照，將逆轉(zhuǎn)錄酶步驟后得到的300 ng cDNA反轉(zhuǎn)錄 酶用5 ^該步驟前的RNA溶液來替換。
為了控制提取方案的效率和NDH-II表達(dá)水平，對組成性并且大量表達(dá)的肌動蛋白1 (actin 1)的cDNA進(jìn)行平行擴(kuò)增。
通過1%瓊脂糖凝膠電泳分析了擴(kuò)增產(chǎn)品，并且通過溴乙錠染膠進(jìn)行顯像(圖9)。將分 子量標(biāo)準(zhǔn)參照物(marker)平行載于凝膠上，以便出估計(jì)得到的擴(kuò)增產(chǎn)品大小。
表達(dá)NDH-II基因的共轉(zhuǎn)化體顯示出大約1.2kb的條帶，對應(yīng)于插入物大小。陰性對照 未顯示任何條帶，這意思著RNA制備品未被基因組DNA污染，反之清楚地顯示出肌動蛋白 擴(kuò)增產(chǎn)品。所有測試的共轉(zhuǎn)化體在不同水平上表達(dá)NDH-II基因，但與表達(dá)肌動蛋白是在相 同數(shù)量級上。
實(shí)施例4:缺乏NDH的大腸桿菌菌株的功能性互補(bǔ) I-互補(bǔ)生長(complementation-growth)試驗(yàn)
通過測定其復(fù)原缺乏NDH-1和NDH-2的突變體大腸桿菌菌株ANN 0222生長的能力， 測試異源宿主內(nèi)Agtundh2蛋白質(zhì)的體內(nèi)功能性。該菌株在LB培養(yǎng)基上正常生長，但不能在 補(bǔ)充甘露醇作為唯一碳源的基本培養(yǎng)基M9上生長。
用化學(xué)方法(CaCl2)將質(zhì)粒pSDN2Ag6H轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株ANN 0222。在含有氨節(jié)青 霉素(100ng/ml) LB瓊脂培養(yǎng)基(補(bǔ)充有1%胰蛋白胨、0.5%酵母抽提物和0.5%NaCl， pH 7)上挑選轉(zhuǎn)化體。在37。C下于液體含有氨芐青霉素(100pg/ml)的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化 體和原始菌株，直至指數(shù)生長期中間階段。用無菌的補(bǔ)充有甘露醇作為唯一碳源的M9培養(yǎng) 基(1XM9鹽、2 (10—3MMgSO4、 10—4 M CaCl2、 0.4%甘露醇)沖洗細(xì)胞。然后在M9培養(yǎng) 基/甘露醇中稀釋細(xì)胞，并且接種在含有氨芐青霉素和多種濃度IPTG (異丙基-P-D-硫代半乳 糖苷)的固體M9/甘露醇/瓊脂培養(yǎng)基上。將陪氏培養(yǎng)皿在37 。C下保溫2天。作為對照，將 相同的細(xì)胞平行接種于含有氨芐青霉素和多種濃度IPTG的LB瓊脂培養(yǎng)基的皿上，并且在 37。C下保溫過夜。
結(jié)果顯示于10A,圖中顯示了富集培養(yǎng)基(LB)和補(bǔ)充有甘露醇的基本培養(yǎng)基(M9 + 甘露醇)上形成的ANN0222菌落和表達(dá)Agtundh2的轉(zhuǎn)化體菌落(注圖上的AtuNdh2)。 IPTG 濃度指示于上述每個(gè)相應(yīng)欄。
未轉(zhuǎn)化突變株的在基本培養(yǎng)基上的生長頗受限制，不論有沒有IPTG (0.1 mM)。另一方
面，表達(dá)Agtiindh2的菌株在基本培養(yǎng)基上的生長，在用0.1 mMIPTG誘導(dǎo)后得到恢復(fù)。甚至 在無IPTG時(shí)，可觀察到突變體的部分互補(bǔ)，這意味著有一定水平的蛋白質(zhì)非IPTG依賴性表 達(dá)。
II- 細(xì)胞膜NADH脫氫酶活性
由對照菌株的LB培養(yǎng)基培養(yǎng)物、和導(dǎo)入質(zhì)粒pSDN2Ag6H的菌株在含有0.1 mM IPTG 的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)的培養(yǎng)物，制備出兩批大腸桿菌ANN 0222膜組分。培養(yǎng)一直進(jìn)行到600 nm下光密度為1 。然后通過離心(15 min， 3200 x g)收集細(xì)胞，并且用10 ml緩沖液A (200 mMTris-Cl， pH8; 2.5 mM EDTA和0.2 mM PMSF; (30))再懸浮并沖洗兩次。然后使該細(xì) 胞在16 000 psi壓力下兩次通過French壓機(jī)，使其破壁。將通過離心(30min， 4 。C， 48 500 x g)收集的細(xì)胞膜組分，取出后置入200 pl的緩沖液B (50mM磷酸鹽緩沖液，pH 7.5和 150mMNaCl)。用1 ml緩沖液A稀釋該膜組分的2 )al等分，在25 °C并且存在NADH下， 通過使用克拉克電極(DW2/2， Hansatech， King's Lynn，英國)測量02攝取量。
結(jié)果如圖10B所示，圖上顯示了當(dāng)NADH存在時(shí)，由參考菌株(對照樣)和由表達(dá) Agtundh2的菌株制備的腸桿菌ANN0222細(xì)胞膜的02攝取量。
雖然在響應(yīng)于添加NADH的對照樣菌株細(xì)胞膜中未檢測到02攝取活性，但另一方面， 在同樣的條件下，在用pSDN2Ag6H轉(zhuǎn)化的菌株細(xì)胞膜上檢測到相當(dāng)高的02攝取量(圖IOB)。 當(dāng)在大腸桿菌細(xì)胞膜中表達(dá)時(shí),Agtundh2能夠以同數(shù)量級的最大速率氧化NADH和NADPH， 但其對于NADH的親合力要大得多。
III- 蛋白質(zhì)表達(dá)
通過免疫檢測，證實(shí)了 Agtundh2蛋白質(zhì)在轉(zhuǎn)化的ANN 0222菌株中表達(dá)。 制造兔血清用于抗純化的Agtundh2蛋白質(zhì)(Agro-Bio公司，Villeny，法國)。按如上所 述方法提取可溶性蛋白組分和膜蛋白組分。將這些蛋白質(zhì)組分以及等分的純化Agtimdh2蛋白 質(zhì)加載到10y。SDS-PAGE凝膠上進(jìn)行電泳，然后轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上。然后將硝酸纖維素 膜在牛乳(3%脫脂奶粉分散于水中，添加0.P/。TBST)中，孵育30分鐘，然后用0.1%TBST 沖洗，接著再次與稀釋至1/10 000的抗Agtundh2抗體一起孵育1 h30min。然后用0.1%TBST 沖洗纖維素膜三次，每次10分鐘，接著然后用稀釋至1/10 000的接合有堿性磷酸酶的抗兔第 二抗體孵育lh。根據(jù)供應(yīng)商(Sigma公司)的推薦方案檢測反應(yīng)。
結(jié)果如圖11所示左邊的區(qū)域大腸桿菌菌株ANN0222的可溶性蛋白質(zhì)組分(S)和 細(xì)胞膜(Mb)蛋白質(zhì)組分的免疫檢測，該菌株或者用"空的"pSD80載體轉(zhuǎn)化，或者用攜帶 有^g加"W2的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化，并且用O、 0.1或者0.5 mM IPTG誘導(dǎo)。加載于凝膠上的量最終
相當(dāng)于在OD6(K) = 1時(shí)獲得的50 ml培養(yǎng)物的可溶性組分和膜組分稀釋至1/400 (即對應(yīng)于膜 組分泳道上的2.5 ng蛋白質(zhì)和對應(yīng)于可溶性組分條帶上的30 pg蛋白質(zhì))。右側(cè)區(qū)域純化 Agtundh2的免疫檢測，從左至右為O.l、 0.2和0.3嗎/泳道。
發(fā)現(xiàn)大多數(shù)蛋白質(zhì)存在于膜組分，可溶性組分中僅檢測到少量蛋白質(zhì)。甚至在無IPTG 時(shí)也檢測到顯著表達(dá)的Agtundh2，這與這些條件下觀察到的部分互補(bǔ)情況相一致(參見圖 IOA)。
為了測定在大腸桿菌中表達(dá)Agtundh2的催化效率，從通過Western blotting (蛋白質(zhì)印跡 法)測定的含量來估計(jì)特異活性。
根據(jù)得到的純化Agtundh2蛋白信號和膜組分信號的相對強(qiáng)度，將10B所示實(shí)驗(yàn)中 Agtundh2蛋白含量估計(jì)為0.6嗎蛋白質(zhì)。在這些條件下，這樣估計(jì)的最大02攝取量為13.2/0.6 二22nmol02min".嗎"蛋白質(zhì)，即44 nmol NADH min".ng"蛋白質(zhì)。
實(shí)施例5: Agtundh2對于NADH和NADPH的相對特異性的修飾 I-Agtundh2基因的擴(kuò)增
使用下述引物對，從質(zhì)粒pSDN2Ag6H擴(kuò)增^g^m^2基因 *上游N2Ag.Nco1
v47X7Gyi4GAACATCATGTTGTCGTC (SEQIDNO: 14)
引物中如此插入Ncol (斜體)限制性酶切位點(diǎn)并且改變序列的第四個(gè)堿基(將C變成G) 是為了重疊基因的起始密碼子(粗體)。 *下游N2Ag.Xbal
CCGrCM 04TCAGGCCTCGTCCTTCAGCGT (SEQ ID NO: 15)
將XbaI (斜體)限制性酶切位點(diǎn)插入基因的終止密碼子(粗體)下游引物下游。
在下列條件下進(jìn)行擴(kuò)增
IX特定反應(yīng)緩沖液 MgS04終濃度1.5 (iM 引物終濃度0.5 pM dNTP混合物終濃度200 |aM 200 ng的DNA
1單位的Pfx鉑(Invitrogen公司)
2-，姿氛-
94 °C下2 min: 1個(gè)循環(huán)
94 。C下30 sec， 55 。C下1 min， 68 。C下3 min: 25個(gè)循環(huán) 68。C下10min: 1個(gè)循環(huán)。 II- E201O突變子導(dǎo)入Agtundh2基因序列
通過'TCR融合"定點(diǎn)突變技術(shù)，將Agtundh2基因的E201Q突變子導(dǎo)入基因序列。使用 質(zhì)粒pSDN2Ag6H作為模板，得到了對應(yīng)于第一擴(kuò)增步驟的片段。使用的引物對如下所示 *上游N2Ag.Ncol; *下游N2Ag.E201Q.R
AGGGCCGGCCTGCACAAGCAA (SEQIDNO: 16)。 該N2Ag.E201Q.R引物使得導(dǎo)入E201Q突變子(粗體)成為可能。 這兩個(gè)引物使得得到含有E201Q突變子的5'端片段成為可能。 *下游N2Ag.Xbal; *上游N2Ag.E201Q.F
TTGCTTGTGCAGGCCGGCCCT (SEQIDNO: 17)。 該N2Ag.E201Q.F引物使得導(dǎo)入E201Q突變子(粗體)成為可能。 這兩個(gè)引物使得得到含有E201Q突變子的3'端片段成為可能。 -《應(yīng)船激，
IX特定反應(yīng)緩沖液 MgS04終濃度1.5 pM 引物終濃度0.5 nM dNTP混合物終濃度200 pM 200 ng的DNA
1單位的Pfk鉑(Invitrogen公司)
-r潛姿伴，
94 。C下2 min: 1個(gè)循環(huán)
94 。C下30 sec， 55 。C下1 min， 68 。C下3 min: 25個(gè)循環(huán) 68 。C下10min: 1個(gè)循環(huán)。
這兩個(gè)擴(kuò)增片段含有借助于引物N2Ag.E201Q.F和N2Ag.E201Q.R導(dǎo)入的相關(guān)突變子。 通過混合前一步驟得到的兩個(gè)擴(kuò)增片段，進(jìn)行第二擴(kuò)增步驟。這兩個(gè)片段借助于它們的共有序列(TTGCTTGTGCAGGCCGGCCCT) (SEQIDNO: 17)進(jìn)行雜交，這樣構(gòu)成了模板。 使用兩個(gè)引物N2Ag.Nco1和N2Ag.Xbal，在下列條件下進(jìn)行擴(kuò)增 -友細(xì)合激，
IX特定反應(yīng)緩沖液
MgS04終濃度1.5 pM
引物終濃度0.5 (aM
dNTP混合物終濃度200
200 ng N2Ag.NcoI/N2Ag.E201Q.R片段
200 ng N2Ag.Xbal/N2Ag.E201Q.F片段
1單位的Pfx鉬(Invitrogen公司)
94 °C下2 min: 1個(gè)循環(huán)
94。C下30sec， 55 。C下1 min， 68。C下6min: 30個(gè)循環(huán) 68 。C下10min: 1個(gè)循環(huán)。 m-構(gòu)建體克隆
用NcoI和XbaI消化擴(kuò)增產(chǎn)品(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，供應(yīng)商的推薦方案)，并且通過連 接反應(yīng)(T4DNA連接酶購自新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，供應(yīng)商的推薦方案)導(dǎo)入用NcoI和XbaI 消化的載體pBAD24。該載體攜帶有氨芐抗性盒、以及阿拉伯糖誘導(dǎo)的pBAD型啟動子。然 后通過電穿孔法將擴(kuò)增產(chǎn)品導(dǎo)入大腸桿菌E co//DH10(3。挑選氨芐抗性轉(zhuǎn)化體，并且通過質(zhì) 粒DNA的提取和Ncol與Hindm的消化，證實(shí)了插入體的存在。
然后通過使用Agtundh2基因內(nèi)的引物(N2Ag.E201Q.F; N2Ag.NcoI; N2Ag.E201Q.R; N2Ag.Xbal)的測序，證實(shí)了這兩個(gè)構(gòu)建體。
該測序顯示，預(yù)期的突變子(E201Q)的確己經(jīng)導(dǎo)入。將該質(zhì)粒稱為E201Qcl。 IV-修飾蛋白質(zhì)的活性
測定修飾蛋白質(zhì)對于NADH和NADPH的親合力。
結(jié)果如圖12所示。野生型蛋白質(zhì)(A)顯示出，與使用200 nMNADPH記錄的活性相比 較，使用200 ^MNADH明顯具有更大的活性；而修飾蛋白質(zhì)(B)顯示出對于兩個(gè)底物具有 類似的活性。
實(shí)施例6:來源于萊茵衣藻的定位于葉綠體的NDH2的鑒定
I- 基因的擴(kuò)增
根據(jù)供應(yīng)商的指導(dǎo)，使用QIAGENRNeaSy 植物微型試劑盒，從萊茵衣藻TAP培養(yǎng)基的 培養(yǎng)物(在1"06和lxlO"個(gè)細(xì)胞/ml之間取出)分離總RNA。使用具有寡聚dT引物的 OmniscriptTM逆轉(zhuǎn)錄酶系統(tǒng)(Qiagen公司)，進(jìn)行cDNA合成。使用turbo pfu聚合酶，在PCR 機(jī)器OmniGene Hybrid thermocycler上擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物。 -cD崩^潛條伴，
94。C下變性5min
94。C下30s， 72。C下40s禾n72。C下2min: 5個(gè)循環(huán) 94。C下30s， 68。C下40s禾P 72。C下2min: 5個(gè)循環(huán) 94。C下30s， 65。C下40s禾B72。C下2min: 5個(gè)循環(huán) 94。C下30s， 62。C下40s和72。C下2min: 15個(gè)循環(huán) 72。C下延伸5min。 用于N2Cr2擴(kuò)增的引物是
5'-ATGCATAGCCTTGATGGCCAAAAC-3' (SEQIDNO: 18)和 5'-TCACACTCGCGAGATGTCGCG-3' (SEQIDNO: 19)。
這兩個(gè)引物使得通過RT-PCR擴(kuò)增cDNA (1662 bp)成為可能。這樣鑒定出的新序列命 名為N2Cr2。對應(yīng)于N2Cr2的cDNA編碼一個(gè)有533個(gè)氨基酸的多肽，預(yù)測質(zhì)量為60.5 kDa。
在將該序列cDNA與商業(yè)購買的萊茵衣藻基因組序列相比較時(shí)，記錄到事實(shí)上該序列相 應(yīng)于在N-端第65位氨基酸截?cái)嗟牡鞍踪|(zhì)。
N2Cr2的完整cDNA序列在附后的序列表中由編號SEQIDNO: 3表示，并且推導(dǎo)的多 肽序列編號為SEQIDNO: 4。克隆的cDNA相應(yīng)于序列SEQIDNO: 3的第196-1857位核 苷酸，并且編碼對應(yīng)于序列SEQIDNO: 4第67-619位氨基酸的多肽。
通過克隆的1662bp的cDNA序列編碼的蛋白質(zhì)，雖然在N-末端被截?cái)?，仍然編碼出一 有效地顯示出NADH脫氫酶活性的蛋白質(zhì)，并且如下所述，該蛋白質(zhì)使產(chǎn)生識別衣藻N2Cr2 蛋白質(zhì)的抗體成為可能。
II- pSD80中的基因克隆
使用對應(yīng)于N-末端和C末端部分的序列的引物，通過PCR擴(kuò)增1662 bp的cDNA序列 的N2Cr2編碼區(qū)，通過具有Ecoi /和Sw"/限制性酶切位點(diǎn)性能的附加堿基和6-組氨酸編碼 序列而使N2Cr2編碼區(qū)延伸。將五coi /和Sma/位點(diǎn)(下劃線)插入正向(F)和反向(R) 引物中，分別位于起始和終止密碼子的上游和下游。將6-組氨酸編碼序列(斜體)插入N2Cr2
編碼區(qū)起始密碼子的引物下游。因此低聚核苷酸的序列是
* F-EcoRI:
NO: 20)和
* R - Smal:
5'-TCCCCCGGGTCACACTCGCGAGATGTCGCG-3' (SEQIDNO: 21)。 擴(kuò)增的cDNA用五coR/和Sm"/消化，并且將其插入有羧芐青霉素抗性的、預(yù)先用五coi / 和Swa/消化的pSD80表達(dá)載體中(Patel和Dunn， 1995)。將得到的質(zhì)粒稱為pSD80-N2Cr2， 通過測序進(jìn)行證實(shí)，然后用來通過電穿孔法轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株DH10(5。將帶有pSD80-N2Cr2 的細(xì)胞稱為DH10(3 (pSD80-N2Cr2)。在2公升LB培養(yǎng)基接種10 ml DH10(3 (pSD80-N2Cr2) 的過夜培養(yǎng)物，然后放置于搖床(140rpm)，在37。C下和存在羧芐青霉素(50)^g.mr1)時(shí)， 進(jìn)行6-His標(biāo)記的N2Cr2的表達(dá)。大約在接種4 h后，對達(dá)到ODeoo nm 0.5的細(xì)胞，通過添 加100 |aM異丙基硫代-(3-D-半乳糖苷(IPTG)而啟動6-His標(biāo)記的N2Cr2的表達(dá)。在誘導(dǎo)5 h 后，收獲細(xì)胞，用25 ml LB培養(yǎng)基沖洗細(xì)胞(在4355 g下4 。C離心1 min)，并且在-80 。C 下儲藏。
III-標(biāo)記蛋白質(zhì)的柱純化
根據(jù)BJOERKLOEF等的方案(2000，如上所述)，進(jìn)行N2Cr2-6His的分離和鎳親合純 化。在冰上解凍DH10P (pSD80-N2Cr2)細(xì)胞，并且取出后置入含有2.5 mM EDTA、 0.2 mM PMSF和200 mM pH 8的Tris-Cl的緩沖液，濃度大約為1 g每10 ml。添加溶解酶，并且將混 合物在冰上攪拌lh。此后，使該細(xì)胞兩次通過French壓機(jī)(16 000 psi)而破壁。溶菌液在 12 000g下離心lh，然后收集上清液，并且用于純化N2Cr2-6His，該純化使用Histr叩HP樹 脂(愛默生生命科學(xué)公司(Amersham Bioscience))通過鎳親合色譜法而進(jìn)行。使用含有20 mM 三乙醇胺、500mMNaCl和25mM咪唑、pH二7.5的緩沖液(緩沖液A)使柱預(yù)平衡。在加載 樣品后，用兩個(gè)柱容積的緩沖液A將柱沖洗兩次，并且用相近體積的50 mM Tris-Cl、 0.2% (w/v)十二烷基麥芽糖苷、pH二7.5緩沖液(緩沖液B)沖洗，并且最后，用一個(gè)柱容積的 50mMTris-Cl、 0.2% (w/v)十二基麥芽糖苷、10 mM CaCl2、 pH = 7.5緩沖液(緩沖液C) 沖洗。在該"鈣洗"后，再次用三個(gè)容積的緩沖液B和兩個(gè)容積的緩沖液A沖洗柱子。然后使 用由20mM三乙醇胺、500 mMNaCl、 300 mM咪唑、pH = 7.5制備的梯度咪唑溶液，洗脫 N2cr2-6His。在大約180 mM的咪唑時(shí)從柱上分離出N2Cr2-6His;使用"Amicon Ultra 30 kDa" 系統(tǒng)(Millipore公司)通過超濾濃縮相應(yīng)組分。添加甘油至終濃度50% (v/v)，并且將酶在
-80 °C下儲藏。
IV- 抗重組蛋白的抗體的生產(chǎn)
使用上述純化方案，得到了2mg蛋白質(zhì)。在考馬斯亮藍(lán)染色凝膠上檢驗(yàn)蛋白質(zhì)純度，并 且通過將該材料免疫兔，用于指示N2Cr2的血清的生產(chǎn)。
V- 細(xì)胞分級分離 取得總的、線粒體的可溶性組分
為了測定萊茵衣藻細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞位置，進(jìn)行細(xì)胞分級分離，使得我們能夠分離 碎片組分、線粒體組分和可溶性蛋白質(zhì)組分。為此，我們使用無細(xì)胞壁的菌株(CW15)，使 得通過葉達(dá)加壓溶菌(Yeda-press lysis)進(jìn)行"溫和的"細(xì)胞分級分離成為可能。
將400 ml的萊茵衣藻指數(shù)生長期的CW15培養(yǎng)物在4 °C、 500 g下離心5 min;然后將顆 粒狀物取出后加入50 ml的35 mM HEPES， pH 7.2中，并且在4 °C、 500 g下再次離心5 min。 將顆粒狀物取出后加入12.5 ml溶菌緩沖液(50 mM Tricine-NaOH、 10 mM NaCl、5 mM MgCl2， pH = 8)中，導(dǎo)入Yeda壓機(jī)(Yeda press),以便進(jìn)行分級分離。將細(xì)胞在8 bar的N2氣壓下 保溫6min，并且逐滴回收。
然后將樣品在4 °C、 500 g下離心5 min。收集顆粒狀物，并且取出后置入2 ml的1% SDS 中。在4。C、 3220 g下，將上清液離心8min。該顆粒狀物含有類囊體，因?yàn)樗鼈儽痪€粒體膜 污染，因而其未被回收。在4。C、 100000g下將上清液離心1小時(shí)。該顆粒狀物含有線粒體， 并且用lml的iy。SDS取出。上清液構(gòu)成了可溶性組分。用丙酮(80%丙酮用于總蛋白和膜 蛋白，并且60%丙酮用于可溶性組分)沉淀這三個(gè)組分。使用二辛可寧酸技術(shù)(BC分析試 劑盒，UptimaUP40840A， INTERCHIM公司)分析樣品的每個(gè)組分。 類囊體提取
為了得到未被線粒體膜污染的葉綠體組分，進(jìn)行Percoll密度梯度(Percoll gradient)純 化(COURNAC等，J.Biol. Chem.， 275， 23， 17256-17262， 2000)。
為此，將600ml在指數(shù)生長期中期的CW15培養(yǎng)物在4。C、 500g下離心5min。將顆粒 狀物在50 ml的35 mM HEPES， pH = 7.2中洗滌一次，并且在4 。C、 500 g下再次離心5 min。 將顆粒狀物取出后置入12.5 ml緩沖液A(0.3 M山梨糖醇，50 mM HEPES-KOH、pH 8.2， 2 mM EDTA， 5 mM MgCl2)中，并且導(dǎo)入Yeda壓機(jī)中3 min，壓力4.5 bar。所得材料加載到Percoll 密度梯度溶液(40 60%)上，并且在4000 g下離心20 min。收集對應(yīng)于完整葉綠體的梯線 (ring),并且用10倍體積的緩沖液A稀釋。將樣品在3220g下離心15min，并且將顆粒狀 物取出后置入3.5 ml的0.2% SDS中，然后用80%丙酮沉淀。
根據(jù)二辛可寧酸法分析樣品。 VI - Western blotting:
通過在10 000 rpm時(shí)將合適體積的液體離心10 min，并且將顆粒狀物再懸浮于IX的加 載緩沖液，制備出每個(gè)組分各100pg。將5pl (即5iag)每個(gè)組分加載到10。/。SDS-PAGE凝 膠上。而對照樣，大約O.l ng純化蛋白質(zhì)也被加載到凝膠上。電泳后，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到(半 干轉(zhuǎn)印)到硝酸纖維素膜(Life sciences, BioTrace NT公司)上。
然后通過使用抗重組體蛋白(AGRO-BIO)而得到的抗體作為第一抗體進(jìn)行免疫印跡， 從而將蛋白質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記。室溫下孵育持續(xù)1小時(shí)。然后添加偶聯(lián)于熒光染料的第二抗體(兔 抗IgG)保持一個(gè)小時(shí)。使用LICOR公司的Odyssey紅外掃描儀進(jìn)行檢測。
結(jié)果如圖13所示。
反應(yīng)最明顯的條帶位于類囊體組分中。其比生產(chǎn)的重組體N2Cr2體積稍大。該大小差異 可能是因?yàn)榕c預(yù)測的衣藻成熟蛋白質(zhì)序列相比較，重組蛋白N-末端發(fā)生截?cái)嘀省?br> 實(shí)施例7:將Agtimdh2克隆入用于轉(zhuǎn)化萊茵衣藻的質(zhì)粒PXX6 I-待克隆片段的構(gòu)建
為了能在萊茵衣藻中表達(dá)Agtundh2蛋白，創(chuàng)造出從萊茵衣藻RbcS2基因與根癌農(nóng)桿菌 Agtimdh2基因融合而得到的產(chǎn)品。為此，使用融合PCR技術(shù)，將RbcS2的轉(zhuǎn)位肽(transit peptide)序列設(shè)置于Agtundh2起始密碼子上游，而將3'非翻譯區(qū)(3' UTR region)序列設(shè)置 于Agtundh2終止密碼子下游。 rbcS2轉(zhuǎn)位肽的擴(kuò)增
首先，使用下述引物對，由萊茵衣藻基因組DNA擴(kuò)增rbcS2轉(zhuǎn)位肽
* N2Ag.XhoI:
CGGC7m4GATGGCCGCCGTCATTGCCAAG (SEQ ID NO: 22)。 將XhoI酶的限制性酶切位點(diǎn)(斜體)導(dǎo)入RbcS2基因起始密碼子上游(粗體)。
* TP.ndh.R:
23)。
對應(yīng)于RbcS2轉(zhuǎn)位肽序列的區(qū)域以斜體顯示，并且對應(yīng)于Agtimdh2延伸序列的區(qū)域以 常規(guī)字符顯示。 -反應(yīng)混合物
IX特定反應(yīng)緩沖液 MgS04終濃度1.5 (^M 引物終濃度0.5 pM dNTP混合物終濃度200 nM 200 ng的DNA
1單位的Pfx鉑(Invitrogen公司) -擴(kuò)增條件
94 。C下2 min: 1個(gè)循環(huán)
94。C下30sec， 60。C下lmin， 68 。C下3 min: 30個(gè)循環(huán) 68 。C下10min: 1個(gè)循環(huán) Agtundh2基因的擴(kuò)增
使用下述引物對，從質(zhì)粒pSDN2Ag6H擴(kuò)增Agtundh2基因
* TP.ndh.F:
24) 。
將對應(yīng)于轉(zhuǎn)位肽rbcS2序列末端的延伸區(qū)(斜體)導(dǎo)入Agtimdh2的起始密碼子上游(粗體)。
* rbcs2.3',R:
25) 。
將對應(yīng)于rbcS2的3'非翻譯區(qū)序列開始部分的延伸區(qū)(斜體)導(dǎo)入Agtundh2的終止密碼 子的下游(粗體)。 -度應(yīng)凝合激，
IX特定反應(yīng)緩沖液
MgS04終濃度1.5 nM
引物終濃度0.5
dNTP混合物終濃度200 pM
200 ng的DNA
1單位的Pfx鉬(Invitrogen公司)94 。C下2 min: 1個(gè)循環(huán)
94 °C下30 sec， 55 °C下1 min， 68 °C下3 min: 30個(gè)循環(huán) 68。C下10min: 1個(gè)循環(huán) rbcS2的3'非翻譯區(qū)的擴(kuò)增
使用下述引物對，由從基因組DNA擴(kuò)增rbcS2的3'非翻譯區(qū) rbcS2.3'.F
26)
N2Ag.Kpni:
CGGGGZ4CCCTGCAAATGCTGTCTCCA (SEQIDNO: 27)。
對于rbcs2.3'.F引物，將對應(yīng)于Agtundh2的C末端區(qū)域的延伸區(qū)(斜體)導(dǎo)入rbcS2 3' 非翻譯序列開始部分上游(常規(guī)字體)。
對于N2Ag.Kpnl引物，將對應(yīng)于KpnI酶的限制性酶切位點(diǎn)(斜體)導(dǎo)入rbcS2 3'非翻譯 序列末端下游(常規(guī)字體)。 -疲潔合激，
IX特定反應(yīng)緩沖液
MgS04終濃度1.5 nM
引物終濃度0.5 nM
dNTP混合物終濃度200 pM
200 ng的DNA
1單位的Pfx鉬(Invitrogen公司) -^譜餘'
94 。C下2 min: 1個(gè)循環(huán)
94。C下30sec， 60 。C下1 min， 68 。C下3 min: 30個(gè)循環(huán) 68。C下10min: 1個(gè)循環(huán) rbcS2轉(zhuǎn)位肽與Agtimdh2基因的融合片段的擴(kuò)增
將對應(yīng)于rbcS2轉(zhuǎn)位肽擴(kuò)增片段和對應(yīng)于Agtiindh2基因的擴(kuò)增片段混合，并用作模板， 使用下述引物對(參見上面)，進(jìn)行融合片段擴(kuò)增 N2Ag.Xho1 rbcs2.3'.R
反應(yīng)混合物
IX特定反應(yīng)緩沖液
MgS04終濃度1.5 pM
引物終濃度0.5 pM
dNTP混合物終濃度200 (aM
200 ngrbcs2轉(zhuǎn)位肽片段
200 ng Agtundh2基因片段
1單位的Pfx鉬(Invitrogen公司) -f潛條伴，
94 。C下2 min: 1個(gè)循環(huán)
94。C下30sec， 55 。C下1 min， 68。C下6min: 30個(gè)循環(huán) 68。C下10min: 1個(gè)循環(huán)。 rbcS2轉(zhuǎn)位肽、Agtundh2基因和rbcS2的3'非翻譯區(qū)之間融合片段的擴(kuò)增
將上述得到的融合片段(rbcS2轉(zhuǎn)位肽+ Agtimdh2基因)與對應(yīng)于rbcS2的3'非翻譯區(qū) 的片段混合，以便用作模板用于使用下述引物對的最后擴(kuò)增步驟N2Ag.XhoI; N2Ag.Kpnl。 -厳船激.-
IX特定反應(yīng)緩沖液
MgSO4終濃度1.5 pM
引物終濃度0.5 )iM
dNTP混合物終濃度200
200 ng"轉(zhuǎn)位肽+ Agtundh2基因"片段
200 ng rbcS2的3'非翻譯區(qū)片段
1單位的Pfx鉬(Invitrogen公司)
-r譜姿伴，
94 °C下2 min: 1個(gè)循環(huán)
94 °C下30 sec 55 °C下1 min， 68 °C下6min: 30個(gè)循環(huán) 68。C下10 min: 1個(gè)循環(huán)。 II-將融合片段克隆入質(zhì)粒PXX6:
用lo/和/^"/消化融合產(chǎn)物(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，供應(yīng)商的推薦方案)，并且通過連 接反應(yīng)(T4DNA連接酶購自新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，供應(yīng)商的推薦方案)導(dǎo)入預(yù)先用^zo/和
A:pw/消化的載體pXX6。
FUHRMANNM等(Plant Mol. Biol.， 55， 6， 869-881， 2004)對質(zhì)粒PXX6進(jìn)行了描述。 其攜帶有氨芐抗性盒、優(yōu)化設(shè)置于下游的基因轉(zhuǎn)錄的萊茵衣藻強(qiáng)力的Hsp啟動子區(qū)域、萊茵 衣藻rbcS2基因的組成性啟動子、和萊茵衣藻rbcS2基因的第一內(nèi)含子。
然后通過電穿孔將連接反應(yīng)產(chǎn)品導(dǎo)入大腸桿菌E. coli DH10(3。
挑選氨芐抗性轉(zhuǎn)化體,并且通過xhoi的提取和^zo/與ig^/酶的消化，證實(shí)了插入體的存在。
然后使用下述引物N2Ag.XhoI; N2Ag.Kpnl; TRndh.R; TP.ndh.F; rbcs2.3'.F，通過測
序檢驗(yàn)構(gòu)建體。
在證實(shí)了序列和插入體正確后，將該質(zhì)粒稱為pXX6N2Ag，將其通過玻璃珠技術(shù)，用于 與有巴龍霉素抗性的aphVIII質(zhì)粒一起共轉(zhuǎn)化衣藻菌株CW15，并且與攜帶編碼精氨琥珀酸 裂解酶的Arg7基因的pArg —起共轉(zhuǎn)化衣藻菌株388 (精氨酸營養(yǎng)缺陷型)。
權(quán)利要求
1.一種II型NAD(P)H脫氫酶(NDH-II)或者編碼所述NDH-II的多聚核苷酸的用途，其用于提高綠藻生產(chǎn)氫氣的能力。
2. 如權(quán)利要求l所述的用途，其特征在于，所述NDH-II是NDH-II突變體，所述突變 體是來自NDH-II且位于吡啶-核苷酸結(jié)合的p-oH3基序的第二卩-折疊末端的谷氨酸或谷氨酸 被中性的極性殘基取代而得到的，所述NDH-II優(yōu)先使用NADH。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述NDH-II選自-來自根癌農(nóng)桿菌并由序列SEQ ID NO: 2所限定的NDH-II Agtundh2，或者來自 Agtimdh2且序列SEQ ID NO: 2第201位處的谷氨酸殘基被谷氨酰胺殘基取代而得到的 NDH-II突變體；-來自萊茵衣藻、由序列SEQIDNO: 4或其含有序列SEQIDNO: 4第67-619位氨基 酸的片段所限定的NDH-II N2Cr2，或者來自N2Cr2、且序列SEQIDNO: 4第285位處的谷 氨酸殘基被谷氨酰胺殘基取代而得到的NDH-II突變體。
4. 一種用于提高綠藻生產(chǎn)氫氣的能力的方法，其特征在于，包括用編碼如權(quán)利要求l 3中任一項(xiàng)所限定的NDH-II的多聚核苷酸轉(zhuǎn)化所述藻類，以及在所述藻類中表達(dá)所述 NDH-II。
5. —種用編碼如權(quán)利要求1 3中任一項(xiàng)所限定的NDH-II的多聚核苷酸所轉(zhuǎn)化的綠藻。
6. 如權(quán)利要求5所述的綠藻用于制氫的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及到II型NAD(P)H脫氫酶(NDH-II)或者編碼所述NDH-II的多聚核苷酸的用途，其用于提高綠藻生產(chǎn)氫氣的能力。特別是將所述多聚核苷酸用于轉(zhuǎn)化所述綠藻，從而提高其制氫能力。
文檔編號C12N9/02GK101103117SQ200580040697
公開日2008年1月9日 申請日期2005年10月11日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月11日
發(fā)明者利蒂希婭·貝爾納, 卡里納·西蒙德普拉, 吉勒·佩爾蒂埃, 弗洛朗斯·米斯, 斯特凡·屈內(nèi), 洛朗·庫爾納克 申請人:法國原子能總署