專利名稱：微生物檢測(cè)與定量的制作方法
相關(guān)申請(qǐng)本申請(qǐng)是2004年12月16日提交的PCT/US2004/042461號(hào)國(guó)際申請(qǐng)的部分繼續(xù)申請(qǐng)，該國(guó)際申請(qǐng)要求2003年12月16日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)第10/737,574號(hào)的優(yōu)先權(quán)。
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及檢測(cè)微生物如細(xì)菌、酵母、霉菌和病毒的方法和產(chǎn)品。
在我們的日常生活中，我們不知不覺地暴露于受微生物污染的物體表面，這會(huì)導(dǎo)致發(fā)生疾病。已有研究表明，具體的細(xì)菌污染“熱點(diǎn)”包括公用電話、門把手、醫(yī)生候診室和兒童看護(hù)場(chǎng)所中的玩具、干手用熱風(fēng)干燥機(jī)、廚房中使用的毛巾和海綿、進(jìn)行日?；颊咦o(hù)理的醫(yī)護(hù)人員的手以及混合生肉和蔬菜的食品制作表面和刀具的交叉污染。
最近單在美國(guó)幾個(gè)地方發(fā)生的細(xì)菌污染爆發(fā)事件，就已導(dǎo)致一些兒童和老年人死亡和其它人得病。食品的微生物污染也是全世界的主要問題。沙門氏菌、大腸桿菌和其它食品傳染細(xì)菌每年造成數(shù)不清的病例。急性癥狀包括惡心、嘔吐、腹部絞痛、腹瀉、發(fā)燒和頭痛。急性癥狀發(fā)作后接著可能就是慢性后果。由于物體表面的交叉污染會(huì)引起細(xì)菌從肉、魚和家禽向未煮熟食品如蔬菜的轉(zhuǎn)移，容易地檢測(cè)出細(xì)菌在食品制作表面上的存在的能力將具有極大益處。
同樣，食品加工企業(yè)中對(duì)有害水平的微生物的檢測(cè)，對(duì)于保持各個(gè)家庭和消費(fèi)者的健康是十分重要的。在食品加工工業(yè)中，細(xì)菌監(jiān)測(cè)是至關(guān)重要的。幾乎所有的食品的加工，無(wú)論從肉類包裝到干酪生產(chǎn)，都涉及到監(jiān)測(cè)微生物水平，以確保食品供應(yīng)的安全性。
微生物污染帶來的災(zāi)難不僅限于食品工業(yè)。最近幾十年見證了“超級(jí)細(xì)菌(superbug)”的急劇增多，這個(gè)問題就集中出現(xiàn)在醫(yī)院和保健機(jī)構(gòu)中?？股氐倪^度使用和醫(yī)院清潔的不足已催生了甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌(S.aureus)(MRSA)和艱難梭菌(Clostridiumdifficile)以及萬(wàn)古霉素耐藥腸球菌和其它革蘭氏陰性桿菌(Dancer，2004)。最近英國(guó)廣播公司(BBC)的報(bào)告說到，MRSA每年估計(jì)奪走5000條生命。報(bào)告文章接著斷言“清潔仍然是主要的患者關(guān)注問題，MRSA是個(gè)越來越嚴(yán)重的問題?！痹囅脶t(yī)院里的許多患者已經(jīng)無(wú)免疫應(yīng)答作用，因此發(fā)生感染的風(fēng)險(xiǎn)更高，醫(yī)院環(huán)境中的惡毒細(xì)菌所造成的威脅會(huì)變得越加險(xiǎn)惡。
有許多報(bào)告和研究在探討醫(yī)院清潔和醫(yī)院傳染防治的課題。
同樣，已知霉菌如麥角菌能在某些谷物如黑麥中生長(zhǎng)，它們由于會(huì)產(chǎn)生與麥角酸相似的毒性生物堿而具有潛在的危害性。已知黑曲霉(Aspergillus niger)和其它霉菌產(chǎn)生的孢子會(huì)造成過敏反應(yīng)及加重呼吸道病癥如哮喘。如果黑曲霉在潮濕墻壁上或者在家庭或商業(yè)建筑中的空調(diào)設(shè)備中開始生長(zhǎng)，就會(huì)特別成問題。
某些酵母如白色念珠菌(Candida albicans)可代表另一類討厭的微生物。已將白色念珠菌與嬰兒尿布疹、兒童和無(wú)免疫應(yīng)答成人的鵝口瘡以及陰道酵母感染聯(lián)系起來。酵母還會(huì)感染身體的口咽區(qū)以及胃腸道。
目前的細(xì)菌檢測(cè)方法涉及到從設(shè)備表面采集樣品。在食品加工環(huán)境中，設(shè)備可能是切肉機(jī)械，而在食品制作環(huán)境如餐館中或在家庭里，表面可能是桌子、砧板、冰箱內(nèi)部或工作表面。然后將樣品溫育過夜以生長(zhǎng)出培養(yǎng)物。過夜生長(zhǎng)培養(yǎng)是讓樣品在瓊脂平板上于適當(dāng)?shù)臏囟群蜐穸认律L(zhǎng)，使細(xì)菌生長(zhǎng)和繁殖至形成大得足以肉眼可見的菌落。在溫育了規(guī)定的時(shí)間和讓細(xì)菌菌落生長(zhǎng)出來后，由經(jīng)過訓(xùn)練的技術(shù)人員人工檢查瓊脂平板樣品并估計(jì)菌落形成單位(CFU)。這個(gè)方法花費(fèi)有些高，且時(shí)間上極大滯后；在滯后時(shí)間當(dāng)中污染產(chǎn)品可能已被運(yùn)輸出去或者人們已暴露于所存在的微生物。
由上可知，需要有便于快速檢測(cè)有害微生物的方法和產(chǎn)品。
發(fā)明概述為應(yīng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員碰到的前述困難，我們開發(fā)出了一種指示組合物，它包括流動(dòng)相和在微生物存在下會(huì)發(fā)生明顯可檢測(cè)變化的微生物靈敏色料(colorant)。所述組合物可施加到表面以顯示微生物的存在。流動(dòng)相可以是消毒劑。色料在微生物存在下提供肉眼可見的顏色變化。流動(dòng)性可以是液體或凝膠，色料可以是染料(dye)。在一些實(shí)施方案中，色料改變顏色的程度與微生物的濃度成比例。在其它實(shí)施方案中，所存在的微生物的數(shù)量與發(fā)生顏色變化的色料的量成比例。
合適的染料的實(shí)例包括份菁染料、4-[2-N-取代-1，4-氫化吡啶-4-亞基)亞乙基]環(huán)己-2，5-二烯-1-酮、紅吡唑啉酮染料、偶氮甲堿染料、靛苯胺染料、二氮雜份菁染料、以Reichardt染料為例的兩性離子染料和其它染料以及它們的混合物。特別適合的染料是兩性離子染料，其中兩性離子包含在構(gòu)成染料色原的毗鄰π電子體系當(dāng)中。另一類似乎特別適用作微生物指示劑的染料是份菁染料。
還可將染料以溶劑基或水基溶液的形式施加到表面并讓其干燥，留下所施加染料溶液的干燥殘余物。干燥殘余物當(dāng)接觸到微生物時(shí)會(huì)變色，因此可用在包裝如擦面紙盒子上、在隨身醫(yī)療用具如手套上和在其它表面上，這些表面在使用前先與染料一起制作，以便以后可指示微生物污染情況。令人驚訝的是，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)當(dāng)將這些染料施加到表面上并讓其干燥時(shí)，用以制作涂層(coating)的溶劑與所用的添加劑如羥丙基-β-環(huán)糊精和表面活性劑都對(duì)涂層的微生物檢測(cè)能力具有顯著的影響。
已發(fā)現(xiàn)羥丙基-β-環(huán)糊精能有效提高色料在其涂敷在紙巾或類似的擦拭材料上后的光亮度。雖然不想受理論的約束，但我們還是認(rèn)為染料的顏色因所添加的環(huán)糊精衍生物抑制染料的結(jié)晶而得以改進(jìn)?？蓪⑵渌瘜W(xué)藥品加入到擦拭物(wipe)中，以幫助防止因漂白劑(已發(fā)現(xiàn)它會(huì)干擾染料)的存在所導(dǎo)致的假陽(yáng)性讀出結(jié)果。
結(jié)合了微生物指示色料的側(cè)向流動(dòng)裝置也包括在本發(fā)明的教導(dǎo)內(nèi)容之內(nèi)。這些裝置具有帶檢測(cè)區(qū)和對(duì)照區(qū)的膜，其中檢測(cè)區(qū)對(duì)細(xì)菌的存在作出響應(yīng)而變色，對(duì)照區(qū)仍保持原來的染料顏色以表明測(cè)試是正確運(yùn)行的。
本文還描述檢測(cè)物體表面上的微生物的方法，這種方法將含有微生物靈敏色料的溶液施加到表面，并觀察是否出現(xiàn)表明微生物存在的明顯可檢測(cè)變化。
本發(fā)明的其它特征和方面在下文中有更為詳細(xì)的討論。
附圖簡(jiǎn)述在本說明書的剩余部分，更加具體地面向本領(lǐng)域普通技術(shù)人員闡述本發(fā)明的詳盡且可實(shí)施的公開內(nèi)容，包括最佳實(shí)施方式，闡述中涉及到以下附圖

圖1是五種基本的細(xì)菌細(xì)胞形狀的示意圖。
圖2是細(xì)菌細(xì)胞排列的示意圖。
圖3是一種份菁染料的結(jié)構(gòu)。
圖4-5說明一種合成份菁染料的方法。
圖6A-D是用陳放雞肉所作的表明微生物污染情況的示意圖。
圖7A-G是并列對(duì)比表明微生物污染情況和清潔情況的示意圖。
圖8A-D是用不同濃度細(xì)菌所作的表明微生物污染情況的示意圖。
圖9A-E是用細(xì)菌和指示染料滴定所作的表明和定量微生物污染情況的示意圖。
圖10A-C是表明計(jì)算機(jī)鍵盤上的微生物污染情況的示意圖。
圖11A-D是用有和沒有表面活性劑的溶液表明微生物污染情況的示意圖。
圖12A-F是表明取決于溶劑的微生物污染指示速度的示意圖。
圖13A-C是在色料干燥到基材(substrate)上的情形中表明微生物污染情況的示意圖。
圖14是實(shí)施例30所得結(jié)果的圖示說明，其中ΔE對(duì)已知濃度的金黃色葡萄糖球菌作圖。
圖15是實(shí)施例30所得結(jié)果的圖示說明，其中ΔE對(duì)已知濃度的綠膿桿菌(P.aeuruginosa)作圖。
圖16是實(shí)施例30所得結(jié)果的圖示說明，其中ΔE對(duì)已知濃度的大腸桿菌作圖。
圖17是可用于本發(fā)明的側(cè)向流動(dòng)測(cè)定裝置的一個(gè)實(shí)施方案的頂視圖。
在本說明書和附圖中多次使用的參引字符意指代表本發(fā)明的相同或類似特征或要素。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及細(xì)菌和其它微生物的檢測(cè)，本文所用術(shù)語(yǔ)“微生物”應(yīng)理解為包括細(xì)菌、真菌(如酵母和霉菌)以及病毒。
有千千萬(wàn)萬(wàn)種不同種類的細(xì)菌存在。有些種類差別很小，需要訓(xùn)練有素的人員才能鑒定它們。還有些種類在生長(zhǎng)習(xí)性和外觀上差別很大，很容易就鑒別出來。如不考慮細(xì)小的差別，則大多數(shù)細(xì)菌可按圖1所示的五種基本細(xì)胞形狀進(jìn)行分類。圖1從左到右，形狀分別為圓形或球菌、桿狀或桿菌、螺旋狀或螺旋狀菌、逗號(hào)狀或弧菌以及絲狀。
除形狀不同外，它們的細(xì)胞排列也不同，圖2從左到右分別為雙球菌、鏈球菌和葡萄球菌。例如，一些球菌往往成雙聚集(雙球菌)。其它則排列成鏈(鏈球菌)。還有其它排列成串(葡萄球菌)。雙球菌已知會(huì)引起肺炎。鏈球菌則經(jīng)常與“膿毒性咽炎(strep throat)”有關(guān)。葡萄球菌因其在“葡萄球菌感染”和某些類型的食品中毒中的作用而為眾人所熟悉。
細(xì)菌在大小方面也有一定的不同，但單個(gè)細(xì)菌平均大小約為1/25,000英寸(1英寸＝2.54cm)。換句話說，25,000個(gè)細(xì)菌并排在一起也就只占1英寸直線。一立方英寸足以容納9萬(wàn)億個(gè)平均大小的細(xì)菌，即地球上每個(gè)人可分?jǐn)偞蠹s3,000個(gè)細(xì)菌。
雖然基于現(xiàn)代分子生物學(xué)概念對(duì)細(xì)菌的細(xì)致分類的理論基礎(chǔ)有很多論述，但對(duì)于微生物工程師來說，快速細(xì)分方法是以革蘭氏反應(yīng)(對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分類的染色方法)和形態(tài)學(xué)為基礎(chǔ)的。
革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌在酒精或丙酮存在下能保持結(jié)晶紫染色。它們包括以下重要的屬放線菌屬(Actinomyces)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、纖維單胞菌屬(Cellulomonas)、梭菌屬(Clostridium)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、微球菌屬(Micrococcus)、分枝桿菌屬(Mycobacterium)、諾卡氏菌屬(Nocardia)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus)和鏈霉菌屬(Streptomyces)。一些革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，特別是棒狀桿菌屬、分枝桿菌屬和諾卡氏菌屬的細(xì)菌，甚至在酸的存在下也能將染料保持。它們被稱為抗酸細(xì)菌。
革蘭氏陰性細(xì)菌在酒精或丙酮存在下不能保持結(jié)晶紫染色。它們包括以下重要的屬醋桿菌屬(Acetobacter)、土壤桿菌屬(Agrobacterium)、產(chǎn)堿菌屬(Alcaligenes)、包特氏菌屬(Bordetella)、布氏桿菌屬(Brucella)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)、柄桿菌屬(Caulobacter)、腸桿菌屬(Enterobacter)、歐文氏菌屬(Erwinia)、埃希氏菌屬(Escherichia)、螺桿菌屬(Helicobacterium)、軍團(tuán)菌屬(Legionella)、奈瑟氏菌屬(Nesseria)、硝化桿菌屬(Nitrobact)、巴斯德氏菌屬(Pasteurelia)、假單胞桿菌屬(Pseudomonas)、根瘤菌屬(Rhizobium)、立克次體屬(Rickettsia)、沙門氏菌屬(Salmonella)、志賀氏菌屬(Shigella)、硫桿菌屬(Thiobacilus)、韋榮氏球菌屬(Veiellonealla)、弧菌屬(Vibrio)、黃單胞菌屬(Xanthomonas)和耶耳辛氏菌屬(Yersinia)。
細(xì)菌細(xì)胞膜通常由脂多糖的脂質(zhì)雙層構(gòu)成。革蘭氏陰性細(xì)菌和革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的細(xì)胞膜之間有差別(即細(xì)胞壁)。革蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)較薄，具有明顯的幾層。外層與典型的三片層結(jié)構(gòu)組合更像細(xì)胞質(zhì)膜。
革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分是脂多糖。另外還存在磷脂、蛋白質(zhì)、脂蛋白和少量的肽聚糖。脂多糖由核心區(qū)和連接于其上的多糖部分(moiety)重復(fù)單位組成。大多數(shù)革蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁中有某種成分與內(nèi)毒性活性有關(guān)，而這種內(nèi)毒性活性則關(guān)系到革蘭氏陰性細(xì)菌感染的熱原反應(yīng)。側(cè)鏈上攜帶著這些細(xì)菌的菌體抗原特異性的基礎(chǔ)物質(zhì)。這些側(cè)鏈的化學(xué)組成(關(guān)系到各成分以及不同糖類排列)決定了菌體抗原或者說O抗原決定簇的性質(zhì)，這是在血清學(xué)上對(duì)許多革蘭氏陰性細(xì)菌種屬進(jìn)行分類的非常重要的手段。在許多情況下，已證實(shí)某些細(xì)菌歸屬甚為不同的種卻會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)烈的血清學(xué)交叉反應(yīng)性的原因，就在于它們將化學(xué)上類似的碳水化合物部分作為它們的脂多糖側(cè)鏈的一部分，通常具有約30個(gè)重復(fù)單位。
革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的特征是它們將肽聚糖以及多糖和/或磷壁酸作為它們的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的一部分。肽聚糖有時(shí)也稱胞壁質(zhì)，是多條聚糖鏈通過短肽交聯(lián)而成的雜聚物。
胞壁質(zhì)的基礎(chǔ)是交替的N-乙酰葡糖胺殘基和N-乙酰胞壁酸殘基通過β-1，4鍵連接而成的多條鏈。胞壁酸是細(xì)菌細(xì)胞壁的獨(dú)特物質(zhì)。這些鏈通過L-和D-氨基酸組成的短多肽鏈交聯(lián)在一起。在革蘭氏陰性細(xì)菌中，肽聚糖結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，在大多數(shù)屬中都比較一致，而在革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌中，其結(jié)構(gòu)和組成差別很大。一般來說，肽聚糖是多層的。還有記載說，一些微生物類群在組成上有些小的差別。因此，在分支桿菌屬和諾卡氏菌屬中，胞壁酸的N-乙酰部分被氧化形式N-乙醇酰部分取代。不同類群在交聯(lián)多肽和主干多肽的氨基酸組成上都可能差別甚大。這些差別構(gòu)成了這些細(xì)菌的分類法的基礎(chǔ)。
霉菌和酵母屬于真菌屆。雖然很多霉菌和真菌對(duì)人類有益，但有些具有病原性，能釋放出有害真菌毒素而導(dǎo)致中毒或死亡。酵母也會(huì)導(dǎo)致發(fā)生感染，最廣為人知的大概是酵母陰道炎。
接合菌門(Zygomycota)是一類真菌，包括黑面包霉和其它霉菌，與植物和動(dòng)物存在著共生關(guān)系。這些霉菌能夠發(fā)生融合而形成堅(jiān)實(shí)的“接合孢子”。子囊菌門(Ascomycota)是另一類真菌，包括酵母、白粉菌、黑霉和藍(lán)綠霉以及一些會(huì)引起疾病例如荷蘭榆病、蘋果黑星病和麥角癥的種。這些真菌的生活史組合了有性繁殖和無(wú)性繁殖，菌絲細(xì)分成允許細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)通過的多孔壁。半知菌門(Deuteromycota)是又一類真菌，不能肯定適合上述類別的各種真菌或擔(dān)子菌綱(Basidiomycota，包括大多數(shù)蘑菇、多孔菌和馬勃菌)全部包括在此類當(dāng)中。這些半知菌綱(deuteromycetes)既包括制造干酪和青霉素的種屬，也包括致病的種屬，如導(dǎo)致香港腳和癬菌病的種屬。
近年來，染料在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的使用在研究興趣和技術(shù)重要性方面都有非凡的增長(zhǎng)。染料在例如分析生物化學(xué)、醫(yī)學(xué)診斷學(xué)的許多領(lǐng)域，甚至在疾病的治療和預(yù)防上，都得到使用。染料的顏色對(duì)于某些應(yīng)用來說是必需的，所述應(yīng)用從用于分光檢測(cè)(美國(guó)專利第5,036,000號(hào))和體液分析物測(cè)量(歐洲專利第0 250 700號(hào))的簡(jiǎn)單有機(jī)反應(yīng)到用于腫瘤檢測(cè)的高清晰度成像技術(shù)(Motohashi，Med.Res.Rev.，11，239，1991)。染料還可在臨床上用于治療疾病(美國(guó)專利第5,468,469號(hào))。光動(dòng)力療法(Sedlacek，“The change in research for the therapy oftumors”，Chimia，45，52，1991)被成功用于治療某些種類的癌癥，如皮膚、頭部、頸部、肺和食道的惡性腫瘤。其它治療性應(yīng)用涉及到染料的抗病毒和殺細(xì)菌性能。染料在組織學(xué)、熒光生物標(biāo)記和熒光生物探針這些重要領(lǐng)域中也是關(guān)鍵的物質(zhì)。相關(guān)的技術(shù)非常復(fù)雜，需要進(jìn)行染色、洗滌和交叉染色(Blum，Photodynamic action and diseasecaused by light”Reinhold，New York，3，1941)。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，用特定的色料可制備出微生物指示噴劑及開發(fā)出快速微生物定量方法。該技術(shù)的潛在應(yīng)用包括但不限于檢測(cè)以下固體表面上的微生物柜臺(tái)頂面、手、醫(yī)療區(qū)域、浴室、床欄桿、醫(yī)療設(shè)備、手術(shù)臺(tái)、器皿、廚房、食品、食品制作表面、食品加工設(shè)備、門把手、電話和計(jì)算機(jī)鍵盤。該有色染料涂層、噴劑或溶液對(duì)有害水平的細(xì)菌和其它微生物靈敏，其顏色變化充當(dāng)著視覺指示工具，用以證實(shí)表面的清潔和/或凈化是否有效。
對(duì)指示技術(shù)的要求是相當(dāng)嚴(yán)格的，因?yàn)樗玫娜玖媳仨殞?duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌株和革蘭氏陰性細(xì)菌株都靈敏。染料應(yīng)能快速地與微生物或微生物代謝物發(fā)生相互作用。對(duì)于最大的多功能性，染料還應(yīng)對(duì)其它微生物如酵母和霉菌靈敏。
如前所述，染料長(zhǎng)時(shí)間以來已被用作細(xì)胞和細(xì)菌鑒定的染色劑。染色溶液與細(xì)胞或細(xì)菌發(fā)生反應(yīng)或者優(yōu)選被細(xì)胞或細(xì)菌保持，從而通過提高它和所存在的背景或其它成分之間的反差來幫助進(jìn)行鑒定(Johnson，1995)。通常，須將染色劑施加到表面，然后通過振動(dòng)或漂洗除去過量染色劑，以突出顯示微生物的存在。本發(fā)明人沒有聽說以前有任何關(guān)于在暴露于微生物或與微生物發(fā)生相互作用時(shí)會(huì)變色的色料的報(bào)道。
溶劑化變色(solvatochromism)現(xiàn)象可能是造成所看見的顏色變化的原因，不過本發(fā)明人不想受到一個(gè)具體理論的限制。溶劑化變色染料在分子環(huán)境如溶劑極性和/或氫鍵合傾向出現(xiàn)變化時(shí)就會(huì)發(fā)生顏色變化。舉例說，染料在極性環(huán)境如水中顏色可能為藍(lán)色，但在非極性環(huán)境如富含脂質(zhì)的溶液中可能是黃色或紅色。這種“合適染料”所產(chǎn)生的顏色取決于染料的基態(tài)和激發(fā)態(tài)之間的分子極性差異，這在下文有更為全面的討論。Reichardt染料被選為研究用模型染料。
本發(fā)明人想知道，通過對(duì)某些細(xì)胞成分(如細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)等)和細(xì)胞外部之間的極性差別作出響應(yīng)，一些溶劑化變色染料是否可用于檢測(cè)微生物。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，當(dāng)微生物與某些涂敷在基材(如紙巾)上的這些染料接觸時(shí)，的確觀察到顏色變化——不單單是顏色變化，而且在大多數(shù)情況下染料是在被細(xì)菌接觸到的區(qū)域發(fā)生脫色。令本發(fā)明人驚奇的是，進(jìn)一步的研究還提示，這當(dāng)中的機(jī)制并不完全歸于溶劑化變色現(xiàn)象。事實(shí)上，本發(fā)明的發(fā)明人在此報(bào)告，出乎他們意料的是，他們發(fā)現(xiàn)以下事實(shí)i)可將被細(xì)菌或其它微生物脫色的染料的量與暴露于染料的微生物的濃度進(jìn)行關(guān)聯(lián)，提示該方法是定量方法和定性方法，ii)能被檢測(cè)的微生物的范圍包括革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性細(xì)菌、酵母和霉菌，iii)所試驗(yàn)的染料可作為干膜涂層的形式、或作為添加到含細(xì)菌液體中的溶液的形式、或作為噴霧型檢測(cè)系統(tǒng)的形式使用，iv)當(dāng)作為例如紙巾或搪瓷表面上的干涂層的形式使用時(shí)，據(jù)以施加這種染料的溶劑的性質(zhì)對(duì)檢測(cè)用染料的性能(脫色時(shí)間、脫色區(qū)域和非脫色區(qū)域之間的反差以及靈敏度)產(chǎn)生顯著影響，v)當(dāng)以例如紙巾上的干涂層的形式使用時(shí)，與染料一起包括在涂層中的添加劑可影響檢測(cè)用染料的性能(脫色施加、脫色區(qū)域和非脫色區(qū)域之間的反差以及靈敏度)。例如，羥丙基-β-環(huán)糊精可增強(qiáng)檢測(cè)用染料的性能，vi)細(xì)菌引起的這些染料的脫色可用強(qiáng)堿來逆轉(zhuǎn)。
雖然溶劑化變色現(xiàn)象會(huì)促成所觀察到的顏色變化，但這些觀察結(jié)果可能還符合于其它看似有理的機(jī)制。例如，這些觀察結(jié)果可能還符合某種類型酸-堿相互作用或某種類型給質(zhì)子反應(yīng)，該反應(yīng)可促成細(xì)菌存在導(dǎo)致的染料顏色變化。本發(fā)明人也還沒有完全排除這種可能性，即當(dāng)某些染料暴露于多種微生物時(shí)，氧化還原類型的反應(yīng)也可能促成所察覺到的顏色變化。其它因素可能也會(huì)促成所觀察到的某些染料在微生物存在下的顏色變化，例如，可能細(xì)胞膜的一部分與某些染料存在相互作用而導(dǎo)致顏色變化。還有一種可能性是細(xì)菌細(xì)胞壁上的高度組織化酸部分(moiety)可能能夠使某些指示染料質(zhì)子化，導(dǎo)致失去顏色。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了一種不尋常且目前還未能解釋的現(xiàn)象，并利用這種現(xiàn)象開發(fā)出可用于檢測(cè)和定量多種微生物的方法。
一般來說，就顏色變化的目視檢測(cè)而言，“顏色”是一種感覺類型，是當(dāng)人眼機(jī)構(gòu)察覺到視野中的物體所反射或發(fā)射的各種波長(zhǎng)光線的存在或不存在而產(chǎn)生的。由三種類型的對(duì)可見光譜特定區(qū)域敏感的視錐細(xì)胞對(duì)進(jìn)入眼睛的光線進(jìn)行光譜分析。來自這些細(xì)胞的刺激然后又被視網(wǎng)膜神經(jīng)元、視神經(jīng)神經(jīng)元和視皮質(zhì)所加工，結(jié)果體驗(yàn)到顏色的感覺。雖然存在著數(shù)種顏色賦予機(jī)制(例如吸收、發(fā)射、熒光、磷光、折射、衍射等)，但合適的研究焦點(diǎn)限于吸收性顏色(absorptive color)。換句話說，本發(fā)明涉及因吸收某些波長(zhǎng)的光線而產(chǎn)生顏色的染料。
由于人眼運(yùn)作方式的原因，所感知到的顏色通常是物體所吸收光線的波長(zhǎng)對(duì)應(yīng)的顏色的互補(bǔ)色。例如在白光下觀看時(shí)看起來是紅色的物體，實(shí)際上在選擇性吸收490-500nm波長(zhǎng)范圍的淺藍(lán)色光線。類似地，在白光下看起來黃色的物體實(shí)際上在吸收435-480nm范圍的藍(lán)光。
分子對(duì)可見光的吸收涉及到分子當(dāng)中的電子躍遷，并導(dǎo)致激發(fā)態(tài)的產(chǎn)生。根據(jù)以下普朗克關(guān)系，分子的基態(tài)和相應(yīng)激發(fā)態(tài)之間能量差異決定著所吸收光線的波長(zhǎng)E＝hv式中E＝能量，h＝普朗克常數(shù)，v是所吸收光線的光子的頻率，與波長(zhǎng)λ和光速c的關(guān)系如下v＝c/λ可用狀態(tài)圖來繪示電子躍遷
顯然，所吸收的光子的能量與光子的波長(zhǎng)成反比。因此，藍(lán)光(435-480nm)的光子具有比黃光(580-595nm)更高的能量。所以，當(dāng)在白光下觀看時(shí)，溶液中或物體上的染料的顏色由染料分子的基態(tài)和第一容許激發(fā)態(tài)間的躍遷能所決定。
染料的吸光部分慣常稱為染料的色原。色原包括發(fā)色團(tuán)和其所連接的共軛體系。發(fā)色團(tuán)是產(chǎn)生染料的顏色的主要基團(tuán)，例如偶氮染料中的偶氮基團(tuán)、胡蘿卜素中的多烯基團(tuán)、蒽醌染料中的羰基基團(tuán)。還有許多其它發(fā)色團(tuán)。助色團(tuán)通過作用于共軛色原來影響染料的顏色和強(qiáng)度。助色團(tuán)可與或可不與色原共軛。例如，通過例如苯環(huán)與偶氮基團(tuán)(發(fā)色團(tuán))共軛的氨基會(huì)形成氨基偶氮色原。共軛氨基助色團(tuán)可將偶氮基團(tuán)的吸收譜帶偏移向更長(zhǎng)的波長(zhǎng)，增加吸收譜帶的強(qiáng)度。但是，有意將磺酸基團(tuán)加入氨基偶氮色原中并不發(fā)生共軛，不過吸電子效應(yīng)使吸收偏移向更長(zhǎng)的波長(zhǎng)。
基態(tài)極性比激發(fā)態(tài)極性更大的染料的實(shí)例是如下所示的份菁染料1。左手邊的電荷分離的正則結(jié)構(gòu)1是基態(tài)的主要促成結(jié)構(gòu)，而右手邊的正則結(jié)構(gòu)1′是第一激發(fā)態(tài)的主要促成結(jié)構(gòu)。
如下所示的靛藍(lán)2是基態(tài)極性顯著小于激發(fā)態(tài)極性的染料的實(shí)例。左手邊的正則結(jié)構(gòu)2是該染料基態(tài)的主要促成結(jié)構(gòu)，而右手邊的正則結(jié)構(gòu)2′是激發(fā)態(tài)的主要促成結(jié)構(gòu)。
可供實(shí)施本發(fā)明的合適染料包括上述染料以及Reichardt染料、份菁染料、兩性離子染料(其中形式正電荷和負(fù)電荷包含在毗鄰π電子體系當(dāng)中)、4-[2-N-取代-1，4-氫化吡啶-4-亞基)亞乙基]環(huán)己-2，5-二烯-1-酮、紅吡唑啉酮染料、偶氮甲堿染料、靛苯胺染料、二氮雜份菁染料和它們的混合物。
份菁染料屬于“Colour and Constitution of Organic Molecules”Academic Press(London)1976中討論的供體-簡(jiǎn)單受體色原Griffiths分類，其中羰基充當(dāng)電子受體部分。該電子受體共軛到能夠供給電子的給電子基團(tuán)如羥基或氨基。份菁染料是相對(duì)較廣的一類染料，這類染料包括結(jié)構(gòu)3，其中雜環(huán)體系中所包含的氮原子充當(dāng)供體，n可為包括0在內(nèi)的任何整數(shù)值。份菁染料具有電荷分離的(兩性離子)共振形式。
無(wú)環(huán)份菁染料也是公知的，包括vinylalogous amide。
已研究了份菁染料使鹵化銀對(duì)光的某些波長(zhǎng)具有感光性的能力，以便用于照相軟片中。許多份菁染料結(jié)構(gòu)已為人所知。結(jié)構(gòu)4-14顯示份菁染料的幾個(gè)非限制性實(shí)例。注意對(duì)于每種這些染料，可畫出電荷分離的共振結(jié)構(gòu)。文獻(xiàn)提出，電荷分離的(兩性離子)形式是染料基態(tài)的重要促成結(jié)構(gòu)。

其中R可以是甲基、烷基、芳基、苯基等。
兩性離子色原可制備永久為兩性離子形式的某些染料。也就是說，這些染料具有涉及到π電子體系的永久電荷，不能獲得色原的中性共振結(jié)構(gòu)。這種染料包括Reichardt染料15，其符合一般結(jié)構(gòu)16。
除了Reichardt染料外，帶適當(dāng)負(fù)電荷的溶劑化變色吡啶N-酚酸甜菜堿(pyridinium N-phenolate)染料的另外其它實(shí)例由以下結(jié)構(gòu)16-21給出 其中R是氫、-C(CH3)3、-CF3或C6F13。


另外的非限制性結(jié)構(gòu)24-32可包括以下結(jié)構(gòu)，它們符合一般結(jié)構(gòu)23
染料的量必須足夠，使得當(dāng)與微生物接觸時(shí)發(fā)生顏色的變化，而該變化是肉眼可察覺到的，這取決于染料的靈敏度。發(fā)現(xiàn)以無(wú)水計(jì)，足夠的染料量通常在0.001至20重量百分比之間，在一些實(shí)施方案中在0.01至10重量百分比之間，在一些實(shí)施方案中在0.05至5重量百分比之間，在一些實(shí)施方案中在0.1至3重量百分比之間。顏色變化發(fā)生得非?？欤⒉蝗Q于微生物的濃度和類型。
組合物包括如上所述的微生物靈敏色料和流動(dòng)相。屬于“流動(dòng)相”包括可用作色料載體的液體和氣體。雖然可以使用任何有效的載體，但發(fā)現(xiàn)乙腈、四氫呋喃、二甲苯、甲醛(例如二甲基甲酰胺)和醇(例如甲醇、乙醇、正丙醇和異丙醇)是合適的載體。流動(dòng)相還可以是消毒劑或殺細(xì)菌組合物。
色料染料可以是液體的形式，該液體可噴灑或擦拭到表面上，以指示微生物的存在。可將含有染料的液體施加到表面上，并讓所施加的液體干燥，形成染料干燥殘余物，以便以后暴露于微生物污染。當(dāng)暴露于微生物時(shí)，干燥殘余物會(huì)變色，從而指示微生物的存在。根據(jù)本發(fā)明，顏色變化可能發(fā)生得很快。例如，色原可在不到約30分鐘就開始變色，在一些實(shí)施方案中不到約5分鐘，在一些實(shí)施方案中不到約1分鐘，在一些實(shí)施方案中不到約30秒，在一些實(shí)施方案中不到約10秒。
這種使用溶液施加染料的干燥殘余物的指示方法可用于固體表面上，例如包裝物如擦面紙盒子、背膠標(biāo)簽(sticker)、紙張、衛(wèi)生紙、隨身醫(yī)療用具如手術(shù)手套、手術(shù)衣和消毒蓋布(drape)、面罩、頭罩如圓帽(bouffant cap)、手術(shù)帽和頭巾、檢查手套和外科手套、鞋類如鞋套、靴套和拖鞋、傷口敷料、繃帶、滅菌圍巾(sterilization wrap)、手帕、服裝如實(shí)驗(yàn)服、連褲的工作服、圍裙和夾克、患者被褥、擔(dān)架和搖籃被單、食品制作圍巾、擦碗碟海綿、布料、門把手、電話、計(jì)算機(jī)鍵盤、計(jì)算機(jī)鼠標(biāo)、鋼筆、鉛筆、記事本、盥洗室把手、傷口敷料、繃帶和玩具(例如在醫(yī)生候診室、日托場(chǎng)所)。
因此，溶劑化變色染料可涂敷于其上的基材包括擦拭物以及可能會(huì)暴露于例如上述細(xì)菌的其它物品。溶劑化變色染料還可摻入到用以檢查手的微生物污染的洗液或霜膏中。染料還可摻入到海綿或擦盤巾，以警示污染。
適合用作擦拭物以用色料涂敷的基材包括任何傳統(tǒng)上用作擦拭物的基材，包括薄膜、織造布和非織造布、纖維質(zhì)基材如衛(wèi)生紙、紙巾和共形成(coform)材料、氣流成網(wǎng)材料、粘結(jié)梳理纖網(wǎng)(web)等等。有關(guān)基材的非排他性實(shí)例可在美國(guó)專利第4,775,582號(hào)、第4,853,281號(hào)、第4,833,003號(hào)和第4,511,488號(hào)中找到，這些專利都轉(zhuǎn)讓給了Kimberly-Clark Corporation。
非織造布可按照例如紡粘成網(wǎng)法、熔噴成網(wǎng)法、氣流成網(wǎng)法、粘解成網(wǎng)法和梳理成網(wǎng)法等方法進(jìn)行制造。非織造布可由熱塑性樹脂，包括但不限于聚酯、尼龍和聚烯烴來制造。烯烴包括乙烯、丙烯、丁烯、異戊二烯等以及它們的組合。
“紡粘纖維”是小直徑纖維，其形成方法是將熔融熱塑性材料作為細(xì)絲從噴絲頭的多個(gè)微小、通常圓形的毛細(xì)管擠出，然后通過例如以下專利使擠出細(xì)絲的直徑快速降低Appel等的美國(guó)專利第4,340,563號(hào)、Dorschner等的美國(guó)專利第3,692,618號(hào)、Matsuki等的美國(guó)專利第3,802,817號(hào)、Kinney等的美國(guó)專利第3,338,992號(hào)和第3,341,394號(hào)、Hartman等的美國(guó)專利第3,502,763號(hào)和Dobo等的美國(guó)專利第3,542,615號(hào)。紡粘纖維當(dāng)沉積在收集表面上時(shí)通常不具粘著性。紡粘纖維通常是連續(xù)的，平均直徑(至少10個(gè)樣品的平均值)大于7微米，更適宜在約10至20微米之間。
“熔吹纖維”是指以下纖維將熔融熱塑性材料作為熔融絲線或細(xì)絲通過多個(gè)微小的、通常圓形的型模毛細(xì)管(die capillary)擠出到會(huì)聚、高速、通常熱的氣體(例如空氣)流中，該氣體流將熔融熱塑性材料的細(xì)絲減細(xì)，使它們的直徑減少，可達(dá)到微纖維直徑。之后，熔吹纖維被高速氣體流攜帶而沉積在收集表面上，形成隨機(jī)散布的熔吹纖維纖網(wǎng)。這個(gè)方法在例如Butin等的美國(guó)專利第3,849,241號(hào)中公開。熔吹纖維是微纖維，可連續(xù)或不連續(xù)，通常平均直徑小于10微米，且當(dāng)沉積在收集表面上時(shí)通常具有粘著性。
本文所用術(shù)語(yǔ)“共形成”是指這種方法，其將至少一個(gè)熔吹模頭(diehead)安排在斜槽的旁邊，這樣纖網(wǎng)當(dāng)在形成時(shí)可通過斜槽加入其它材料。這些其它材料可以是紙漿、高吸收顆粒、天然聚合物(例如人造絲或棉纖維或其它纖維質(zhì)材料)和/或合成聚合物(例如聚丙烯或聚酯)纖維，其中纖維可以具有短纖維長(zhǎng)度。共形成方法在共同受讓的美國(guó)專利第4,818,464號(hào)(Lau)和第4,100,324號(hào)(Anderson等)中有說明。通過共形成方法生產(chǎn)的纖網(wǎng)通常被稱為共形成材料。
粘結(jié)梳理纖網(wǎng)是從短纖維制造的，將短纖維輸送通過梳理裝置，該裝置將短纖維打散并沿機(jī)器方向排列，形成通常以機(jī)器方向?yàn)槿∠虻姆强椩炖w網(wǎng)。纖網(wǎng)一形成，就用數(shù)種方法如粉末粘結(jié)法、型式粘結(jié)法(pattern bonding)、吹風(fēng)粘結(jié)法和超聲波粘結(jié)法中的一種或多種將它粘結(jié)起來。
在氣流成網(wǎng)法中，具有約3至約52毫米的典型長(zhǎng)度的短纖維束在送氣流中分離并被帶走，然后通常在抽真空幫助下沉積在成形篩上。隨機(jī)沉積的纖維然后互相粘結(jié)在一起。氣流成網(wǎng)方法的教導(dǎo)實(shí)例包括Laursen等的美國(guó)專利第4,640,810號(hào)(轉(zhuǎn)讓給了Scan Web ofNorth America Inc)中描述的DanWeb方法、Kroyer等的美國(guó)專利第4,494,278號(hào)和Soerensen的美國(guó)專利第5,527,171號(hào)(轉(zhuǎn)讓給了NiroSeparation a/s)中描述的Kroyer方法、Appel等的美國(guó)專利第4,375,448號(hào)(轉(zhuǎn)讓給了Kimberly-Clark Corporation)的方法或者其它類似的方法。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，用以清潔物體表面的漂白劑，例如次氯酸鈉溶液、氯和亞硫酸氫鈉可能會(huì)對(duì)溶劑化變色染料產(chǎn)生不利影響，即使細(xì)菌不存在也會(huì)引起顏色變化。因此，本發(fā)明的另一個(gè)方面包括擦拭物中與溶劑化變色染料一起的漂白劑檢測(cè)色料。指示劑可例如是2，2′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺，它正常情況下是無(wú)色的，當(dāng)暴露于氯或次氯酸鈉時(shí)變紅色。指示劑也可是淀粉和碘的組合，其在氯或次氯酸鹽存在下變黑色。還另一種指示劑品紅可用于檢測(cè)亞硫酸鹽，如焦亞硫酸鈉。品紅呈粉紅色，當(dāng)暴露于亞硫酸鹽時(shí)變成無(wú)色。這樣，可將擦拭物某些區(qū)域指定為對(duì)細(xì)菌靈敏，其它區(qū)域指定為對(duì)漂白劑和防腐劑靈敏，使得含活性漂白劑的表面會(huì)產(chǎn)生顏色變化組合，讓使用者能將細(xì)菌污染與漂白劑區(qū)分開來。漂白劑指示劑可印成隱藏在擦拭物上的“漂白劑”文字拼寫圖案，使得只要將擦拭物擦過漂白劑，文字“漂白劑”就會(huì)顯現(xiàn)，同時(shí)伴隨著漂白劑可能引起溶劑化變色染料發(fā)生的任何其它顏色變化。漂白劑指示劑的量只需足以引起可被肉眼察覺的顏色變化，和溶劑化變色染料的數(shù)量范圍相同。
本發(fā)明人還認(rèn)為，也有可能將例如以下物質(zhì)的少量樣品包含在指示條(indicating strip)上a)檢測(cè)細(xì)菌的溶劑化變色染料；b)氯/次氯酸鹽檢測(cè)材料，如四甲基聯(lián)苯胺；c)氧化劑檢測(cè)劑，如淀粉和碘化鉀的混合物；d)亞硫酸氫鹽指示劑如品紅；e)亞硝酸鹽檢測(cè)試劑。這樣，可有多種質(zhì)量指示劑來給出例如食品的狀態(tài)或質(zhì)量。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，可在基材上使用涂層，以阻止檢測(cè)染料發(fā)生結(jié)晶，從而獲得對(duì)微生物具有更高靈敏度的涂層。理想的是，表面上具有單一染料分子的涂層會(huì)對(duì)微生物具有更高的靈敏度。每個(gè)染料分子都可自由地與微生物細(xì)胞膜發(fā)生相互作用。相反，染料小晶體首先得溶解，然后才能穿透細(xì)胞膜。雖然不想受理論的約束，但我們還是認(rèn)為羥丙基-β-環(huán)糊精、羥乙基-β-環(huán)糊精、γ-環(huán)糊精、羥丙基-γ-環(huán)糊精、羥乙基-γ-環(huán)糊精(下文統(tǒng)稱為“環(huán)糊精”，均獲自Cerestar International of Hammond，IN，USA)能阻礙染料的結(jié)晶化，使基材上得以顯現(xiàn)更為鮮艷的染料顏色。發(fā)現(xiàn)環(huán)糊精的有效量在0.001-2重量百分比之間，適宜0.01-1重量百分比之間，還更適宜在0.025-0.5重量百分比之間。
還發(fā)現(xiàn)某些表面活性劑能幫助染料檢測(cè)微生物。特別適宜的表面活性劑是非離子型表面活性劑，如乙氧基化烷基酚、乙氧基化和丙氧基化脂肪醇、環(huán)氧乙烷-環(huán)氧丙烷嵌段共聚物、(C8-C18)脂肪酸的乙氧基化酯、環(huán)氧乙烷與長(zhǎng)鏈胺或酰胺的縮合產(chǎn)物、環(huán)氧乙烷與醇、炔二醇的縮合產(chǎn)物以及它們的混合物。合適的非離子型表面活性劑的各個(gè)具體實(shí)例包括但不限于甲基葡糖聚醚-10、PEG-20甲基葡萄糖二硬脂酸酯、PEG-20甲基葡萄糖倍半硬脂酸酯、C11-15pareth-20、ceteth-8、ceteth-12、dodoxynol-12、laureth-15、PEG-20蓖麻油、聚山梨醇酯20、steareth-20、聚氧乙烯-10十六烷基醚、聚氧乙烯-10十八烷基醚、聚氧乙烯-20十六烷基醚、聚氧乙烯-10油基醚、聚氧乙烯-20油基醚、乙氧基化壬基酚、乙氧基化辛基酚、乙氧基化十二烷基酚或乙氧基化(C6-C22)脂肪醇(包括3-20個(gè)環(huán)氧乙烷部分)、聚氧乙烯-20異十六烷基醚、聚氧乙烯-23甘油月桂酸酯、聚氧乙烯-20甘油月硬脂酸酯、PPG-10甲基葡萄糖醚、PPG-20甲基葡萄糖醚、聚氧乙烯-20脫水山梨糖醇單酯、聚氧乙烯-80蓖麻油、聚氧乙烯-15十三烷基醚、聚氧乙烯-6十三烷基醚、laureth-2、laureth-3、laureth-4、PEG-3蓖麻油、PEG 600二油酸酯、PEG 400二油酸酯以及它們的混合物。市售的非離子型表面活性劑可包括獲自Air Products and Chemicals ofAllentown，Pennsylvania的SURFYNOL系列炔二醇表面活性劑和獲自Fischer Scientific of Pittsburgh，Pennsylvania的TWEEN系列聚氧乙烯表面活性劑。
還可采用膠粘劑，以促進(jìn)色料在基材上的固定。例如，可采用水溶性有機(jī)聚合物作為膠粘劑。一類合適的水溶性有機(jī)聚合物包括多糖及其衍生物。多糖是含有碳水化合物重復(fù)單位的聚合物，重復(fù)單位可以是陽(yáng)離子型、陰離子型、非離子型和/或兩性離子型重復(fù)單位。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，多糖是非離子型、陽(yáng)離子型、陰離子型和/或兩性離子型纖維素醚。合適的非離子型纖維素醚可包括但不限于烷基纖維素醚如甲基纖維素和乙基纖維素；羥基烷基纖維素醚如羥乙基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙基將丁基纖維素、羥乙基羥丙基纖維素、羥乙基羥丁基纖維素和羥乙基羥丙基羥丁基纖維素；烷基羥基烷基纖維素醚如甲基羥乙基纖維素、甲基羥丙基纖維素、乙基羥乙基纖維素、乙基羥丙基纖維素、甲基乙基羥乙基纖維素和甲基乙基羥丙基纖維素等等。
根據(jù)本發(fā)明的又一方面，發(fā)現(xiàn)染料還可提供其所暴露的微生物的數(shù)量信息。例如，Reichardt染料顯示強(qiáng)烈的負(fù)溶劑化變色現(xiàn)象。即Reichardt染料在一種或多種微生物存在下可發(fā)生從藍(lán)色到無(wú)色的顏色變化。染料變色的程度可目測(cè)檢查或用儀器測(cè)定，以提供與微生物濃度的半定量和/或定量相關(guān)性。例如，可將已反應(yīng)的試驗(yàn)染料的顏色與對(duì)照染料的顏色進(jìn)行比較(例如目測(cè)或借助儀器)，對(duì)照染料由在對(duì)微生物的響應(yīng)性方面與試驗(yàn)染料相同或類似的化合物形成。還可采用多種對(duì)照染料，它們對(duì)應(yīng)于不同的微生物濃度。例如，可采用五種對(duì)照染料，它們分別與每毫升103、104、105、106和107個(gè)菌落形成單位(CFU)的微生物濃度發(fā)生反應(yīng)。在進(jìn)行比較時(shí)，可選擇一種或多種顏色相同于或基本類似于與試驗(yàn)樣品反應(yīng)的試驗(yàn)染料的對(duì)照染料。然后可由選定的對(duì)照染料和對(duì)應(yīng)的已知微生物濃度，測(cè)定出試驗(yàn)樣品當(dāng)中的微生物濃度(或濃度范圍)。用該技術(shù)從而可獲得定量(即具體的濃度)或半定量(濃度范圍)結(jié)果。
如有需要，可測(cè)量染料的顏色強(qiáng)度，以更好地確定試驗(yàn)樣品中存在的一種或多種微生物的實(shí)際數(shù)量。在一個(gè)實(shí)施方案中，用光學(xué)讀數(shù)器來測(cè)量顏色強(qiáng)度。光學(xué)讀數(shù)器的實(shí)際構(gòu)造和結(jié)構(gòu)一般有多種，本領(lǐng)域技術(shù)人員容易理解。通常，光學(xué)讀數(shù)器具有能夠發(fā)射電磁輻射的照明源和能夠記錄信號(hào)(例如透射光或反射光)的檢測(cè)器。照明源可以是任何本領(lǐng)域公知的能夠提供電磁輻射的裝置，所述電磁輻射如可見或近可見范圍的光線(例如紅外光或紫外光)。例如，可用于本發(fā)明的合適照明源包括但不限于發(fā)光二極管(LED)、閃光燈、冷陰極熒光燈、電場(chǎng)發(fā)光燈等。照明可以是多路傳輸和/或準(zhǔn)直傳輸。在一些情況下，照明進(jìn)行脈沖，以減少任何背景干擾。此外，照明可以是連續(xù)的，或者可將連續(xù)波(CW)和脈沖照明結(jié)合，其中多個(gè)照明光束多路傳輸(例如脈沖光束與CW光束多路傳輸)，使得可以區(qū)別CW源所誘導(dǎo)的信號(hào)和脈沖源所誘導(dǎo)的信號(hào)。例如，在一些實(shí)施方案中，將LED(例如砷化鋁鎵紅色二極管、磷化鎵綠色二極管、磷化砷化鎵綠色二極管或氮化銦鎵紫色/藍(lán)色/紫外(UV)二極管)用作脈沖照明源。適用于本發(fā)明的合適UV LED激發(fā)二極管的一個(gè)市售實(shí)例是Model NSHU55OE(Nichia Corporation)，它在10毫安(3.5-3.9伏)的正向電流下將750-1000微瓦的光功率發(fā)射成半峰全寬為10度、峰值波長(zhǎng)為370-375納米和光譜半寬度為12納米的光束。
在一些情況下，照明源可給染料提供漫射照明。例如，可簡(jiǎn)單地采用多點(diǎn)光源陣列(例如LED)，來提供相對(duì)漫射的照明。另一種能夠以相對(duì)廉價(jià)的方式提供漫射照明的特別適宜的照明源是電場(chǎng)發(fā)光(EL)裝置。EL裝置通常是電容器結(jié)構(gòu)，它利用了夾入電極之間的發(fā)光材料(例如磷顆粒)，至少一個(gè)電極是透明的，以讓光線射出。在電極間施加電壓，就會(huì)在發(fā)光材料當(dāng)中產(chǎn)生變化的電場(chǎng)，引起發(fā)光材料發(fā)射光線。
檢測(cè)器通?？梢允侨魏伪绢I(lǐng)域公知的能夠感測(cè)信號(hào)的裝置。例如，檢測(cè)器可以是配置成可進(jìn)行空間辨別的電子成像檢測(cè)器。這種電子成像傳感檢測(cè)器的一些實(shí)例包括高速線性電荷耦合器件(CCD)、電荷注入器件(CID)、互補(bǔ)型金屬氧化物半導(dǎo)體(CMOS)器件等等。這種成像檢測(cè)器例如通常是電子光傳感器的二維陣列，不過也可使用包括單線探測(cè)器象素或光傳感器的線性成像檢測(cè)器(例如線性CCD檢測(cè)器)，例如用于掃描圖像的檢測(cè)器。每個(gè)陣列包括一套已知的獨(dú)特位置，可將其稱為“地址”。圖像檢測(cè)器中的每個(gè)地址由覆蓋一定區(qū)域(例如通常定形為正方形或長(zhǎng)方形的區(qū)域)的傳感器所占據(jù)。這個(gè)區(qū)域通常被稱為“象素”或象素區(qū)。檢測(cè)器象素例如可以是CCD、CID或CMOS傳感器，或者任何其它能檢測(cè)或測(cè)量光線的器件或傳感器。各檢測(cè)象素的尺寸可大為不同，在一些情況下直徑或長(zhǎng)度可低至0.2微米。
在其它實(shí)施方案中，檢測(cè)器可以是缺乏空間辨別能力的光傳感器。例如，這種光傳感器的實(shí)例可包括光電倍增器件、光電二極管如雪崩光電二極管或硅光電二極管等等。硅光電二極管有時(shí)比較有利，因?yàn)樗鼈兗葍r(jià)廉又靈敏，能夠高速運(yùn)行(上升時(shí)間短/帶寬高)，容易整合到大多數(shù)的其它半導(dǎo)體技術(shù)和單片電路中。另外，硅光電二極管形體微小，這能使它們?nèi)菀椎卣系礁鞣N類型的檢測(cè)系統(tǒng)中。如果使用硅光電二極管，那么發(fā)射信號(hào)的波長(zhǎng)范圍可在它們的靈敏度范圍內(nèi)，為400-1100納米。
光學(xué)讀數(shù)器通常可采用任何公知的檢測(cè)技術(shù)，包括例如發(fā)光(例如熒光、磷光等)、吸收(例如熒光吸收或非熒光吸收)、衍射等。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，光學(xué)讀數(shù)器將顏色強(qiáng)度作為吸光度的函數(shù)來測(cè)量。在一個(gè)實(shí)施方案中，吸光度讀數(shù)是用DynexTechnologies of Chantilly，Virginia的Model#MRX微量滴度板讀數(shù)器測(cè)量的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，吸光度讀數(shù)是用稱之為“CIELAB”的常規(guī)試驗(yàn)測(cè)量的，所述試驗(yàn)在F.Cost著Pocket Guide to DigitalPrinting，Delmar Publishers，Albany，NY.ISBN 0-8273-7592-1的第144和145頁(yè)中有討論。這個(gè)方法定義了三個(gè)變量L*、a*和b*，它們對(duì)應(yīng)于基于顏色感知相對(duì)論(opponent theory of color perception)的感知顏色的三個(gè)特性。三個(gè)變量的含義如下L*＝光亮度(或發(fā)光度)，范圍從0至100，其中0＝黑暗，100＝光亮；a*＝紅/綠軸，大約從-100至100；正值為紅色，負(fù)值為綠色；b*＝黃/藍(lán)軸，大約從-100至100；正值為黃色，負(fù)值為藍(lán)色。
由于CIELAB顏色空間在一定程度上具有視覺均勻性，可計(jì)算出單個(gè)數(shù)值，這個(gè)數(shù)值代表人所感知到的兩種顏色之間的差別。該差別稱為ΔE，通過對(duì)兩種顏色之間的三個(gè)差值(ΔL*、Δa*和Δb*)的平方和取平方根來計(jì)算。在CIELAB顏色空間中，每個(gè)ΔE單位大約等于兩種顏色之間“剛好可察覺的”差別。CIELAB因此是客觀的不依賴于儀器裝置的表色系統(tǒng)的良好度量，可用作參考顏色空間用于顏色管理和顏色變化表達(dá)的目的。使用該試驗(yàn)法，顏色強(qiáng)度(L*、a*和b*)就可例如用日本大阪Minolta Co.Ltd.的手提式分光光度計(jì)(型號(hào)CM2600d)進(jìn)行測(cè)量。該儀器采用符合CIE No.15、ISO 7724/1、ASTME1164和JIS Z8722-1982(漫射照明/8度角觀察系統(tǒng))的D/8幾何形狀。樣品表面以偏離該表面的法線8度的角度反射的D65光線由樣品測(cè)量光學(xué)系統(tǒng)接受。又一個(gè)合適的光學(xué)讀數(shù)器是Kaylor等的美國(guó)專利申請(qǐng)出版物第2003/0119202號(hào)中描述的反射式分光光度計(jì)，為了所有目的將所述專利申請(qǐng)通過引用整體結(jié)合到本文中。同樣，也可將透射式檢測(cè)系統(tǒng)用于本發(fā)明中。
不管顏色強(qiáng)度用何種方式測(cè)量，在一些實(shí)施方案中可將結(jié)果與預(yù)先確定的檢測(cè)曲線進(jìn)行比較。檢測(cè)曲線是通過將各種已知微生物濃度下的染料強(qiáng)度進(jìn)行繪圖產(chǎn)生的。這樣，就可以測(cè)量出發(fā)生反應(yīng)的試驗(yàn)染料的顏色，并容易地用檢測(cè)曲線將其與微生物濃度相關(guān)聯(lián)，以給使用者提供定量或半定量結(jié)果。雖然可針對(duì)廣泛的微生物制作檢測(cè)曲線，但還設(shè)想可針對(duì)單一類型的微生物制作檢測(cè)曲線。因此，可將顏色強(qiáng)度與針對(duì)特定應(yīng)用的目的微生物的檢測(cè)曲線相關(guān)聯(lián)。例如，可選擇出顯示對(duì)大腸桿菌的特殊反應(yīng)性的染料。一旦發(fā)生顏色變化，然后就可將顏色的強(qiáng)度與預(yù)先確定的大腸桿菌檢測(cè)曲線相關(guān)聯(lián)。另外，還可針對(duì)多種類型的微生物制作多個(gè)檢測(cè)曲線。
關(guān)聯(lián)方法如上述的關(guān)聯(lián)方法可自動(dòng)和/或手工執(zhí)行。例如，可任選采用微處理器來自動(dòng)選擇所需的關(guān)聯(lián)技術(shù)，并將得自檢測(cè)器的測(cè)量值轉(zhuǎn)換成定量或半定量指示微生物濃度的結(jié)果。微處理器可包括存儲(chǔ)能力，以讓使用者能召回最后幾個(gè)結(jié)果。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，可使用任何合適的計(jì)算機(jī)可讀存儲(chǔ)設(shè)備，如RAM、ROM、EPROM、EEPROM、閃存卡、數(shù)字視頻光、Bernoulli磁帶機(jī)等等。如有需要，可用液晶顯示(LCD)或LED顯示將結(jié)果傳送給使用者。
上述關(guān)聯(lián)技術(shù)按照本發(fā)明可用多種方式來執(zhí)行。例如，可采用具有檢測(cè)區(qū)的基材，檢測(cè)區(qū)提供任何數(shù)量的獨(dú)立檢測(cè)區(qū)域(例如線條、點(diǎn)等)，這使得使用者可更好地測(cè)定試驗(yàn)樣品當(dāng)中的一種或多種微生物的濃度。每個(gè)區(qū)域可含有相同的試驗(yàn)染料，或者可含有不同的染料以與不同類型的微生物反應(yīng)。比如說，一些染料對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌更為靈敏，而一些染料則對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌更為靈敏。這樣，就可檢測(cè)到不止一種類型的微生物。還可對(duì)試驗(yàn)染料濃度進(jìn)行選擇性控制，以提供所需水平的檢測(cè)靈敏度。例如，當(dāng)懷疑微生物水平較低時(shí)，用較高的濃度可提供較高水平的檢測(cè)靈敏度。如有需要，基材還可具有施加了對(duì)照染料的對(duì)照區(qū)，對(duì)照染料與試驗(yàn)染料相同或相似。對(duì)照區(qū)在試驗(yàn)過程中通常不變色，這樣它可用于進(jìn)行定量和/或半定量比較。與檢測(cè)區(qū)相似，對(duì)照區(qū)也可提供任何數(shù)量的獨(dú)立區(qū)域。例如，對(duì)照區(qū)可具有對(duì)應(yīng)于不同的預(yù)定微生物濃度(例如如上所述的濃度)的區(qū)域。另外，所述區(qū)域可含有對(duì)不同類型的微生物有不同靈敏度水平的染料。
基材可由能夠施加染料的任何各種材料來形成。例如，基材可由薄膜、紙張、非織造布、針織物、織造布、泡沫等形成。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，基材是通常用于標(biāo)簽制造的面紙材料，如紙張、聚酯、聚乙烯、聚丙烯、聚丁烯、聚酰胺等?？蓪⒛z粘劑如壓敏膠粘劑、熱激活膠粘劑、熱熔膠粘劑等應(yīng)用于面紙材料的一個(gè)或多個(gè)表面上，以幫助將它粘附到所需的物品上。壓敏膠粘劑的合適實(shí)例包括例如丙烯酸基膠粘劑和彈性體膠粘劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，壓敏膠粘劑是基于丙烯酸酯(例如丙烯酸2-乙基己酯)與極性共聚單體(例如丙烯酸)的共聚物。膠粘劑的厚度可在約0.1至約2密耳(2.5-50微米)的范圍。還可采用在膠粘劑使用前與其接觸的隔離襯墊。隔離襯墊可包括本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任何各種材料，如硅酮涂料紙或薄膜基材。在使用過程中，將受處理的基材和膠粘劑從隔離襯墊上剝離下來。隨后，將膠粘劑放在所需的位置近鄰，以使受處理的基材暴露于環(huán)境。
參考圖17說明本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，其中基材是側(cè)向流動(dòng)裝置20。更具體的說，裝置20具有充當(dāng)流體介質(zhì)的多孔膜23，它任選由剛性材料(未顯示)支撐著。一般來說，多孔膜23可由試驗(yàn)樣品能夠通過其中的任何各種材料來制作。例如，用以形成多孔膜23的材料可包括但不限于天然材料、合成材料或經(jīng)過合成修飾的天然材料，如多糖(例如纖維素材料如紙和纖維素衍生物如乙酸纖維素和硝基纖維素)；聚醚砜；聚乙烯；尼龍；聚偏氟乙烯(PVDF)；聚酯；聚丙烯；二氧化硅；無(wú)機(jī)材料如失活氧化鋁、硅藻土、MgSO4，或其它無(wú)機(jī)微細(xì)材料，所述無(wú)機(jī)材料均勻分布在多孔聚合物基質(zhì)中，所述聚合物為氯乙烯、氯乙烯-丙烯共聚物和氯乙烯-乙酸乙烯酯共聚物；布料，天然出現(xiàn)的(例如棉花)和合成的(例如尼龍或人造絲)；多孔凝膠如硅膠、瓊脂糖、葡聚糖和明膠；高分子膜如聚丙烯酰胺等等。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，多孔膜23由硝基纖維素和/或聚醚砜材料形成。應(yīng)認(rèn)識(shí)到，術(shù)語(yǔ)“硝基纖維素”指纖維素的硝酸酯，可以單單是硝基纖維素，或者也可以是硝酸和其它酸(如具有1-7個(gè)碳原子的脂族羧酸)的混合酯。裝置20也可具有吸收墊28。吸收墊28通常接收已遷移通過整個(gè)多孔膜23的流體。本領(lǐng)域公知，吸收墊28可幫助促進(jìn)穿過膜23的毛細(xì)管作用和流體流動(dòng)。
使用者在開始檢測(cè)試驗(yàn)樣品中的微生物時(shí)，可直接將試驗(yàn)樣品施加到多孔膜23的一部分上，然后試驗(yàn)樣品就可移動(dòng)通過該部分?；蛘撸墒紫葘⒃囼?yàn)樣品施加到與多孔膜23成流體連通的取樣墊(未顯示)和/或配合墊(未顯示)?？捎糜谛纬扇訅|和配合墊的一些合適材料包括但不限于硝基纖維素、纖維素、多孔聚乙烯墊和玻璃纖維濾紙。不管試驗(yàn)樣品施加到哪里，它都會(huì)遷移到由多孔膜23所界定的檢測(cè)區(qū)31，檢測(cè)區(qū)能夠發(fā)出信號(hào)顯示微生物的存在。具體的說，如圖17所示，檢測(cè)區(qū)31包括當(dāng)與一種或多種微生物接觸時(shí)顯示可檢測(cè)顏色變化的試驗(yàn)染料。測(cè)定裝置20還采用了對(duì)照區(qū)32，它施加有對(duì)照染料，任選放置在檢測(cè)區(qū)31的下游。對(duì)照區(qū)20在試驗(yàn)過程中通常不變色，因此它可用于半定量和/或定量比較。
有時(shí)試驗(yàn)染料和對(duì)照染料的施加方式使得它們基本上不會(huì)擴(kuò)散通過多孔膜23的基質(zhì)。這使得使用者能容易地在所需的反應(yīng)時(shí)間后檢測(cè)染料的顏色。例如，染料可與多孔膜23的表面上存在的官能團(tuán)形成離子鍵和/或共價(jià)鍵，這樣它們就固定保持在膜上。在一個(gè)實(shí)施方案中，帶正電荷的染料可與一些多孔膜(例如硝基纖維素)表面上存在的帶負(fù)電荷羧基基團(tuán)形成離子鍵?；蛘?，可將某些可基本阻止染料向多孔膜23的基質(zhì)擴(kuò)散的成分加入到染料溶液中。在其它情況下，可能不需要固定化，相反染料可擴(kuò)散到多孔膜23的基質(zhì)中與試驗(yàn)樣品發(fā)生反應(yīng)。
以下實(shí)施例幫助說明本發(fā)明的各個(gè)實(shí)施方案。
實(shí)施例材料除非另有指明，所有試劑和溶劑均獲自Aldrich ChemicalCompany Inc.(Milwaukee，WI)，且不經(jīng)進(jìn)一步純化即使用。研究中使用的微生物是1.革蘭氏陰性(活)大腸桿菌(Escherichia coli)(ATCC#8739)綠膿假單胞菌(Psuedomonas aeruginosa)(ATCC#9027)豬霍亂沙門菌(Salmonella choleraesuis)陰道加德納菌(Gardnerella vaginalis)2.革蘭氏陽(yáng)性(活)金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(ATCC#6538)木糖葡萄球菌(S.Xylosis)嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)3.革蘭氏陽(yáng)性(死)金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(ATCC#6538)木糖葡萄球菌(S.Xylosis)4.酵母(活)白色念珠菌(Candida Albicans)5.霉菌(活)黑曲霉(Aspergillus Niger)6.病毒-1型脊髓灰質(zhì)炎病毒-1型單純皰疹病毒(HSV-1)
-鼻病毒-麻疹病毒-痘苗病毒-A型流感病毒所有的病毒均獲自美國(guó)新澤西州Fairfield市的GibraltarLaboratories，Inc.。Reichardt染料(酚酸2，6-二苯基-4-(2，4，6-三苯基-1-吡啶))和溴化1-二十二烷基-4-(4-羥基苯乙烯基)-吡啶購(gòu)自美國(guó)威斯康星州Milwaukee市的Aldrich Chemical Company。本研究所用的其它份菁在公司內(nèi)合成，下文詳細(xì)描述。
份菁染料的合成溴化1-二十二烷基-4-(4-羥基苯乙烯基)-吡啶市售獲自AldrichChemical Co.(Milwaukee，WI)，直接使用。
份菁染料的另外的實(shí)例在實(shí)驗(yàn)室用兩步反應(yīng)合成。
用合成方法合成制備得到的染料在圖3中顯示。
如圖4所示，將甲基碘慢慢加入到冰浴中攪拌下的δ-甲基吡啶的50ml異丙醇溶液中。加入完畢后，將反應(yīng)加熱至回流并繼續(xù)回流2小時(shí)。接著在冰浴中冷卻溶液，將沉淀過濾出，在布氏漏斗中用冷酒精洗滌。然后將粉末在通風(fēng)櫥中干燥2小時(shí)。粗產(chǎn)物的收率是18.6克。粗產(chǎn)物不作進(jìn)一步純化，直接用于下一步。
如圖5所示，將N-甲基-δ-甲基吡啶(9.4g，0.04摩爾)和香蘭素(6.1g，0.04摩爾)在攪拌下全部溶于50ml乙醇中。向此溶液加入哌啶(3.4g，0.04mole)，所得混合物回流16小時(shí)。接著將反應(yīng)混合物在冰浴中冷卻，用布氏漏斗濾出產(chǎn)物，用冷乙醇洗滌。
然后將上述結(jié)構(gòu)13的粗染料(其中R＝甲基)的250ml 0.2摩爾濃度氫氧化鉀溶液攪拌60分鐘，形成兩性離子，用布氏漏斗濾出。然后將染料從最低量的1∶1水/甲醇混合物中結(jié)晶。收率為9.4g(98％)。
其它染料從相應(yīng)的烷基碘出發(fā)按類似的方式進(jìn)行合成。下表1顯示所獲得的三種不同R基團(tuán)的染料結(jié)構(gòu)13的化合物和收率。
表1.所合成的烷基衍生物和所獲得的收率
實(shí)施例1Reichardt染料(乙腈溶劑中)施加到預(yù)先污染的表面為研究這些染料作為噴劑的用途，制備Reichardt染料的溶液(160mg于10mL乙腈中)。利用帶氣溶膠推進(jìn)劑的噴霧瓶產(chǎn)生噴霧機(jī)制。
將生雞腿在室溫下陳放幾天，以確保高細(xì)菌水平。如圖6所示，將雞腿放在陶瓷板的表面上幾秒鐘后撤去(6A)，然后將該表面吸干以除去任何雞汁痕跡(6B)。接著，用噴霧瓶將Reichardt染料溶液噴到該表面上(6C)。用另一塊雞肉重復(fù)試驗(yàn)以確證可重復(fù)性，得出了類似的結(jié)果。
將指示染料溶液噴到該表面上后，整個(gè)接觸過雞肉的區(qū)域脫色(也就是說，指示噴劑的顏色從藍(lán)色變成非常暗淡或無(wú)色)，產(chǎn)生雞肉的輪廓(6D)。染料在該表面上放過雞肉的準(zhǔn)確位置被快速脫色。
實(shí)施例2Reichardt染料(異丙醇中)施加到污染的表面對(duì)作為載體的異丙醇進(jìn)行研究，異丙醇因其消毒能力可能會(huì)具有另外的好處。將Reichardt染料溶于異丙醇中(160mg染料溶于10mL異丙醇)。用塑料門把手作為“實(shí)際”表面，試驗(yàn)其上的細(xì)菌污染情況。用陳放雞肉的汁液沾污其中一個(gè)門把手的表面。其它門把手保持未受污染，以作對(duì)照。對(duì)兩種門把手都加以擦拭。將染料的異丙醇溶液噴在兩種表面上。由Reichardt染料從藍(lán)色脫色成無(wú)色，就容易觀察出門把手的污染區(qū)域。
實(shí)施例3指示噴劑試驗(yàn)中異丙醇中的Reichardt染料在污染表面上的假陽(yáng)性已證實(shí)Reichardt染料指示劑對(duì)來自雞肉的細(xì)菌具有很高的靈敏度。為試驗(yàn)指示劑的假陽(yáng)性情況，使用了雞汁的其它成分如脂質(zhì)和蛋白質(zhì)。采用了雞湯，目的是利用其無(wú)細(xì)菌的特性和含潛在干擾物質(zhì)的高度可能性。
將剛打開的罐頭中的Swanson雞湯(Campbell Soup Co.，NJ，可從零售雜貨店市售獲得)用移液管吸取到陶瓷表面上，用SCOTT紙巾擦干。還將陳化雞肉的汁液用移液管吸取到陶瓷表面的不同位置上，擦干，用作已知的陽(yáng)性對(duì)照。將Reichardt染料指示劑(160mg于10ml異丙醇中)噴在陶瓷表面上，清楚看到只有含陳放雞汁(并因此含細(xì)菌)的一邊被脫色。從這個(gè)實(shí)驗(yàn)可得出結(jié)論，在雞肉的情況下，的確是細(xì)菌引發(fā)了脫色響應(yīng)，而不是一些二級(jí)成分如雞肉脂肪或蛋白質(zhì)。
實(shí)施例4Reichardt染料指示噴劑作為污染表面上的清潔助劑還試驗(yàn)了Reichardt染料在異丙醇噴劑中作為清潔助劑的用途。如圖7所示，將陳放雞汁縱向施加到正方形陶瓷表面的左右兩半邊上(7A)。A半邊除了用SCOTT紙巾大力擦拭表面外，不進(jìn)行清潔。對(duì)于B半邊，則將Kimberly-Clark Professional Moisturizing Instant HandAntiseptic(60％乙醇溶液，Roswell GA)施加到毛巾上，用以清潔該表面(7B)。然后施加Reichardt染料噴劑，以確定清潔是否產(chǎn)生差別(7C)。清楚發(fā)現(xiàn)，雖然清潔劑所有幫助，但還是有些區(qū)域“被錯(cuò)過”(7D)。接著，再次用K-C Professional Antiseptic大力清潔兩個(gè)條紋區(qū)域的底部半部分。再噴這些區(qū)域時(shí)(7F)，沒有發(fā)生脫色，這證實(shí)了表面被清潔(7G)。
實(shí)施例5Reichardt染料涂敷的紙材料的脫色這個(gè)實(shí)驗(yàn)測(cè)試Reichardt染料的表面涂層響應(yīng)細(xì)菌污染的能力。如圖8所示，用Reichardt染料溶液(80mg/10mL乙腈)涂刷一張紙。向這張紙加入107、106、105和104CFU/mL大腸桿菌或金黃色葡萄球菌溶液的100μL等分試樣(8B)。水用作陰性對(duì)照。當(dāng)被這兩種類型的細(xì)菌污染時(shí)，染料顏色快速消除，對(duì)于金黃色葡萄球菌來說更快(8D)。后來確定，雖然兩種細(xì)菌溶液的確是107CFU/mL濃度，但金黃色葡萄球菌溶液的實(shí)際濃度是7×107CFU/mL，相比之下大腸桿菌溶液是1×107CFU/mL。與細(xì)菌溶液所觀察到的快速脫色(不到1分鐘)相比，水在幾分鐘后才引起染料稍微脫色。
將一張自粘背膠標(biāo)簽紙(Avery-Dennison)也用兩種不同濃度的Reichardt染料溶液(160mg/10mL乙腈，80mg/10mL乙腈)涂刷。將背膠標(biāo)簽施加到Huggies濕巾盒的蓋閂機(jī)構(gòu)(lid and latchmechanism)。戴上手套將107CFU/mL金黃色葡萄球菌轉(zhuǎn)移到背膠標(biāo)簽的表面上。雖然兩種濃度都被快速脫色，但染料濃度較低的表面上顏色消失得更為明顯，表明存在提供檢測(cè)和強(qiáng)烈視覺對(duì)比的最佳涂敷濃度。背膠標(biāo)簽可為多種應(yīng)用提供容易和快速檢測(cè)細(xì)菌污染的手段。
實(shí)施例6用Reichardt染料進(jìn)行細(xì)菌濃度的定量通過用Reichardt染料液體測(cè)試基材上的細(xì)菌，而不是讓結(jié)合到基材上的染料接觸液體中的細(xì)菌(實(shí)施例5)，認(rèn)識(shí)到基于Reichardt染料的細(xì)菌指示劑的潛在新用途。這個(gè)實(shí)驗(yàn)的焦點(diǎn)在于確定染料溶液如何響應(yīng)位于表面上的已知濃度的細(xì)菌。將100μl的108CFU/ml革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌點(diǎn)滴SCOTT毛巾上(圖9A)。向此斑點(diǎn)加入一滴溶于乙腈的Reichardt染料(160mg于10ml乙腈中)(9B)。
為進(jìn)行比較，在毛巾上點(diǎn)滴一染料斑點(diǎn)并干燥，加入相同量的細(xì)菌。一加到細(xì)菌斑點(diǎn)Reichardt染料就立即脫色。與此對(duì)比，置于含染料的纖維質(zhì)毛巾上的細(xì)菌的反應(yīng)要數(shù)分鐘才發(fā)生脫色。向該細(xì)菌斑點(diǎn)再加入數(shù)滴染料(9C)，脫色現(xiàn)象繼續(xù)到第四滴，此時(shí)就一直是紫色(9D)。試圖通過用移液管添加乙腈來恢復(fù)涂布染料的SCOTT毛巾上的染料顏色，但未能成功(9E)。
實(shí)施例7用Reichardt染料進(jìn)行細(xì)菌指示劑滴定試驗(yàn)粘附于基材的細(xì)菌使染料溶液快速脫色的該發(fā)現(xiàn)，以及反應(yīng)會(huì)達(dá)到終點(diǎn)的該事實(shí)，激發(fā)我們探究染料給出細(xì)菌CFU/ml定量信息的能力。這個(gè)實(shí)驗(yàn)的目的是用染料滴定各種濃度的粘附于基材的細(xì)菌，確定為穩(wěn)定顏色所需的染料的量是否隨細(xì)菌CFU/ml而變化。
在SCOTT紙巾上點(diǎn)滴各100μl的金黃色葡萄球菌系列稀釋懸浮液。然后用移液管將數(shù)滴(10μl)Reichardt染料的乙腈溶液((40mg/10ml)吸取到點(diǎn)滴有細(xì)菌的每個(gè)斑點(diǎn)上。染料溶液一開始還有顏色，但差不多即刻(不到一秒鐘)就脫色，再向同一斑點(diǎn)點(diǎn)滴幾滴染料，直到染料不再脫色和紫色/藍(lán)色不減弱。在對(duì)應(yīng)于有不同濃度細(xì)菌的每個(gè)斑點(diǎn)上重復(fù)進(jìn)行這種操作。
結(jié)果顯示與表面或基材上的細(xì)菌污染水平的良好相關(guān)性。
實(shí)施例8老年婦女尿液的細(xì)菌滴定為說明這種新方法的實(shí)際用途，將匯集的老年婦女尿液取樣品(100μl)點(diǎn)滴在纖維質(zhì)毛巾上，產(chǎn)生幾個(gè)斑點(diǎn)，每個(gè)斑點(diǎn)有100μl體積的尿液。滴定研究中使用了兩種染料溶液40mg染料/10ml乙腈和160mg染料/10ml乙腈。然后將染料溶液以10μl等分試樣點(diǎn)滴到尿液斑點(diǎn)上，繼續(xù)點(diǎn)滴至藍(lán)色/紫色染料顏色得以保持(即將染料加入到尿液，直到顏色持續(xù)保持)。表2給出了每種染料溶液為使染料顏色保持穩(wěn)定(即不再脫色)所需的體積。已知老年婦女尿液具有高細(xì)菌污染水平，該初步研究證實(shí)該具體樣品中的高污染水平。
表2匯集的婦女尿液的細(xì)菌定量
值得注意的是，使用的較稀(四倍稀釋)的染料溶液是較濃(濃四倍)的染料溶液的四倍。這樣，通過使用最大染料濃度以使達(dá)到飽和所需的量最小，可讓指示系統(tǒng)適應(yīng)不同行業(yè)(食品、保健等)中所見的不同CFU水平。例如，視時(shí)間和保藏條件而定，雞塊無(wú)論在哪里都可產(chǎn)生102-109細(xì)菌水平。但是，出于對(duì)發(fā)生疾病的擔(dān)憂，食品制作者和處理者可能只關(guān)心107及以上的細(xì)菌水平。另一方面，醫(yī)院通常治療因疾病、病患或手術(shù)可能已經(jīng)在某種程度上免疫受損的患者。因此，醫(yī)院工作人員可能比大多數(shù)其它行業(yè)關(guān)心低得多的細(xì)菌水平，可潛在地受益于適應(yīng)他們的特定需要的指示染料濃度，以便減少易感患者的感染風(fēng)險(xiǎn)。
實(shí)施例9用包括細(xì)菌、霉菌和酵母的多種微生物試驗(yàn)細(xì)菌指示劑按前文描述的相同方式，將纖維質(zhì)毛巾用作基材，用移液管吸取細(xì)菌和其它微生物于其上。用移液管將107CFU/ml的金黃色葡萄球菌、白色念珠菌(酵母)、陰道加德納菌、大腸桿菌、綠膿假單胞菌和嗜酸乳桿菌吸取到毛巾上(各100μl)。另外，還用移液管將105的黑曲霉(一種普通霉菌)吸取到毛巾上。然后將Reichardt染料溶液(160mg于10ml乙腈中)以10μl等分試樣加入到每個(gè)斑點(diǎn)，計(jì)數(shù)引起持久顏色所需的滴數(shù)。
表3給出對(duì)于每種微生物為保持持續(xù)紫色所需的染料的量。用嗜酸乳桿菌觀察到最強(qiáng)的反應(yīng)，其次是金黃色葡萄球菌、陰道加德納菌、大腸桿菌、綠膿假單胞菌、白色念珠菌，最后是黑曲霉。雖然看起來革蘭氏陽(yáng)性金黃色葡萄球菌和革蘭氏陰性陰道加德納菌的反應(yīng)一樣強(qiáng)，但對(duì)于各種類型的細(xì)菌和病原體來說，為達(dá)到穩(wěn)態(tài)反應(yīng)所需的數(shù)量是不同的。
表3用Reichardt染料對(duì)各種微生物的滴定
實(shí)施例10.用細(xì)菌細(xì)胞壁成分試驗(yàn)Reichardt染料指示劑利用常見于細(xì)菌細(xì)胞壁的分子，可洞悉這種指示劑技術(shù)是如何起作用的。雖然構(gòu)成革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌和革蘭氏陰性細(xì)菌的表面的化合物具有一定的共性，但它們的排列和化學(xué)組成各不相同。革蘭氏陰性細(xì)菌的外膜包被著脂多糖(LPS)。LPS給革蘭氏陰性細(xì)菌的表面帶來凈負(fù)電荷，有助于其發(fā)病機(jī)制。革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌包被著厚厚的肽聚糖或者說胞壁質(zhì)片狀層。這種片層是由交替相連的N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸分子形成的。在革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌中還存在磷壁酸，它可連接到N-乙酰胞壁酸。雖然革蘭氏陰性細(xì)菌也有肽聚糖，但革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌上的肽聚糖層要厚得多。此外，革蘭氏陰性細(xì)菌的肽聚糖層位于LPS層的下面，這使得它不易從表面接近。
將大腸桿菌來源的脫毒脂多糖(除去脂質(zhì)A成分)、糞鏈球菌(Streptococcus faecalis)來源的脂磷壁酸、大腸桿菌來源的脂多糖和胞壁酸的溶液點(diǎn)滴到SCOTT紙巾上。除了純LPS之外，所有的溶液都制備成5％(wt/wt)、1％(wt/wt)和0.2％(wt/wt)濃度。為安全起見，LPS制備成0.1％(wt/wt)、0.02％(wt/wt)和0.004％(wt/wt)濃度。然后將Reichardt染料(160mg于10ml乙腈中)以10μl等分試樣加入到每個(gè)斑點(diǎn)，記錄產(chǎn)生持久顏色所需的染料數(shù)量。同時(shí)進(jìn)行反轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)，即將細(xì)胞壁成分點(diǎn)滴到紙巾上的染料斑點(diǎn)上。
胞壁酸產(chǎn)生最強(qiáng)的反應(yīng)，在兩種實(shí)驗(yàn)情況下都導(dǎo)致染料幾乎即刻脫色。其它化合物的確也最終引起染料脫色，但似乎反應(yīng)不如胞壁酸強(qiáng)烈。由于胞壁酸在革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌中存在的濃度更高，這些結(jié)果不僅證明了這種染料給出CFU/mL數(shù)據(jù)的潛力，而且證明了根據(jù)反應(yīng)的強(qiáng)度和速度區(qū)分革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性細(xì)菌的潛力。
實(shí)施例11雞肉相關(guān)成分的試驗(yàn)已證實(shí)Reichardt染料指示劑對(duì)生長(zhǎng)于已在室溫下保藏過的生雞肉上的微生物具有高靈敏度。但是，考慮到存在假陽(yáng)性的潛在可能，有必要試驗(yàn)指示劑對(duì)雞汁的其它成分如脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的響應(yīng)情況。將含有雞肉衍生產(chǎn)物如脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等的罐裝雞湯用作對(duì)照，以核查這些天然出現(xiàn)的材料所引起的潛在干擾。
用移液管將剛開罐的Swanson雞湯吸取到電烤盤表面上，用SCOTT毛巾擦干。也用移液管將來自常溫下保藏?cái)?shù)天的生雞肉的汁液吸取到電烤盤上并擦干，作為陽(yáng)性對(duì)照。將Reichardt染料指示劑(160mg于10ml異丙醇中)噴在表面上，清楚看到只有含陳放雞汁(從而含細(xì)菌)的那一邊脫色。從這個(gè)試驗(yàn)可以得出結(jié)論，在雞肉的情況下，的確是微生物的存在引發(fā)了脫色響應(yīng)，而不是其它一些成分如雞肉脂肪或蛋白質(zhì)。
實(shí)施例12強(qiáng)堿對(duì)Reichardt染料脫色的影響Reichardt染料與細(xì)胞壁成分如胞壁酸的相互作用的初步結(jié)果，以及旨在鑒定潛在的假陽(yáng)性的工作，提示可能是與酸發(fā)生的反應(yīng)促發(fā)了Reichardt染料的脫色。這導(dǎo)致這種推測(cè)，即酸-堿反應(yīng)可能在所觀察到的顏色變化中起到作用。故計(jì)劃進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以測(cè)試強(qiáng)堿對(duì)脫色的Reichardt染料的影響。
用移液管吸取數(shù)滴Reichardt染料(160mg于10ml乙腈中)到SCOTT毛巾上，讓其變干。將兩種已知會(huì)引起顏色變化的化合物(乙酸和Aldrich緩沖液pH2.0)分別點(diǎn)滴在這些斑點(diǎn)中的兩個(gè)上，這導(dǎo)致染料快速脫色。用移液管各吸取一滴1N NaOH到每個(gè)斑點(diǎn)上，造成快速再著色(re-colorization)。加入1N NaOH后Reichardt染料的藍(lán)色/紫色恢復(fù)。
用指示噴劑進(jìn)行第二個(gè)實(shí)驗(yàn)，以確證這些結(jié)果。用移液管將陳放生雞肉汁吸取到電烤盤表面上，點(diǎn)滴的式樣要易于辨認(rèn)。將表面吸干，噴上Reichardt染料指示噴劑(160mg于10ml乙腈中)，造成染料脫色，表面外形為雞汁的式樣。然后將一滴1N NaOH點(diǎn)滴在脫色的區(qū)域，導(dǎo)致該小斑點(diǎn)再著色。對(duì)另一區(qū)域也重復(fù)這種操作。
為驗(yàn)證是否可能是1N NaOH僅僅作用于細(xì)菌而不是作用于染料，將陳放雞汁和1摩爾濃度的NaOH等比例混合，并讓混合物靜置30秒鐘。然后用該混合物點(diǎn)滴出另一個(gè)完全相同(不過小一點(diǎn))的式樣。該溶液也造成Reichardt染料的快速脫色，但是在加入1N NaOH時(shí)顏色恢復(fù)。
實(shí)施例13用正常的和細(xì)菌性陰道病(BV)感染的陰道液測(cè)試Reichardt染料涂敷的背膠標(biāo)簽鑒于細(xì)菌性陰道感染的廣泛流行，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以研究Reichardt染料包覆的背膠標(biāo)簽對(duì)健康(低pH，無(wú)細(xì)菌感染)、pH陽(yáng)性/細(xì)菌性陰道病(BV)陰性(無(wú)細(xì)菌感染，但pH高出正常)和pH陽(yáng)性/BV陽(yáng)性(pH高出正常，已知有細(xì)菌感染)的陰道液樣品的響應(yīng)情況。一張背膠標(biāo)簽涂刷上兩種不同濃度的Reichardt染料溶液(160mg/10mL乙腈，80mg/10mL乙腈，40mg/10mL乙腈，20mg/10mL乙腈)。用正常、BV陽(yáng)性/pH陽(yáng)性和BV陰性/pH陽(yáng)性的陰道液樣品測(cè)試每個(gè)濃度的背膠標(biāo)簽。
正常陰道液產(chǎn)生最明顯的染料脫色，推測(cè)起來是由于乳酸桿菌和低pH這兩個(gè)因素組合所致。BV陽(yáng)性/pH陽(yáng)性樣品的脫色情況其次，可能是因?yàn)榇嬖谥罅康腂V細(xì)菌。BV陰性/pH陽(yáng)性樣品只使染料微弱脫色，可能是因?yàn)槿樗釛U菌的數(shù)量比正常樣品少。三種脫色狀態(tài)很容易區(qū)別，提示這種技術(shù)在陰道健康領(lǐng)域具有診斷潛力。
實(shí)施例14用Reichardt染料指示噴劑測(cè)試普通表面眾所周知，細(xì)菌能在干燥表面上存活數(shù)小時(shí)，甚至數(shù)天。鑒定普通表面上的細(xì)菌和其它微生物并提醒消費(fèi)者或工人注意污染情況的能力，將有助于清潔和消毒工作，有助于使傳染擴(kuò)散減至最低。
如圖10所示，用舊計(jì)算機(jī)鍵盤作為模型“實(shí)際”表面來測(cè)試微生物指示噴劑(10A)。將Reichardt染料溶于異丙醇(160mg于10mL異丙醇中)，添加到基于氣溶膠的噴霧裝置。然后將鍵盤噴以指示溶液(10B)。
鍵盤噴以Reichardt染料指示溶液導(dǎo)致在某些區(qū)域染料快速脫色(10C)。有趣的是，只有一些按鍵或區(qū)域顯示有污染，這使得可以具體鑒別出高度沾污的按鍵，如數(shù)字鍵盤。由于鍵盤經(jīng)常使用而又很少清潔，該表面的確讓人瞥見實(shí)際表面上的微生物水平。
實(shí)施例15用表面活性劑提高細(xì)菌指示劑的靈敏度制備Reichardt染料(80mg/10mL乙腈)和TWEEN80(200μL)聚氧乙烯表面活性劑(獲自Fischer Scientific，Pittsburgh，PA)的溶液。然后用此溶液涂敷陶瓷表面(圖11)，讓其風(fēng)干。將不含表面活性劑的另一Reichardt染料(80mg/10mL乙腈)溶液點(diǎn)滴在表面上，同樣讓其風(fēng)干(11A)。干燥后，在每個(gè)涂敷區(qū)域上點(diǎn)滴一滴已知具有很高細(xì)菌數(shù)的陳放雞汁(11B)。含TWEEN80表面活性劑的區(qū)域(11C)與不含TWEEN表面活性劑的區(qū)域(11D)相比，脫色速度要快得多(＞20-30秒)。此外，加入TWEEN表面活性劑還使染料容易從表面上除去。加入少量的水可使從表面上完全除去，而加水到不含表面活性劑的斑點(diǎn)并不使從表面上的除去變得容易。
實(shí)施例16溶劑選擇的重要性對(duì)用各種不同溶劑制得的Reichardt染料涂層的性能進(jìn)行評(píng)估。
制備Reichardt染料在乙腈、異丙醇和二甲苯中的溶液，用這些溶液涂敷SCOTT廚房用卷毛巾，讓其風(fēng)干(圖12A和12D)。在受處理的毛巾上點(diǎn)滴100μl金黃色葡萄球菌等分試樣(12B，E)，觀察涂層的顏色變化。只有基于乙腈溶液的涂層在點(diǎn)滴細(xì)菌懸浮液處快速脫色(12C)。觀察到Reichardt染料當(dāng)溶于乙腈時(shí)顏色均勻。其它兩種溶劑涂層沒有觀察到可見的顏色變化(12F)。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，可對(duì)Reichardt染料的濃度加以調(diào)整，使得異丙醇可用作染料的溶劑。雖然此時(shí)染料的顏色不如乙腈時(shí)那么強(qiáng)烈，但還是快速容易地觀察到響應(yīng)微生物污染而發(fā)生的脫色。
實(shí)施例17N-二十二烷基份菁染料涂敷在棉織物上將聚苯乙烯盤上覆蓋著透明薄膜的半只新鮮雞(獲自超市)在室溫下保藏三周。用移液管收集聚苯乙烯盤中匯集的淺黃色汁液，用于試驗(yàn)。
將47mg的溴化1-二十二烷基-4-(4-羥基苯乙烯基)吡啶(獲自Aldrich Chemical)與10g的二甲基甲酰胺混合。振搖后有少量的固形物剩余，讓其沉淀下來。將橙色的上清液點(diǎn)滴到定量(29.2cm×20.3cm＝6.888g)的棉織物上，形成橙黃色圓圈。將一滴1N氫氧化鈉溶液加入到棉織物上的一個(gè)橙黃色斑點(diǎn)，使顏色從橙黃色變成桃紅橙色。
將陳放雞汁點(diǎn)滴到棉織物上的橙黃色斑點(diǎn)上，使顏色變成很淺的黃色。顏色變化在棉織物上很快。同樣，將陳放雞汁點(diǎn)滴到棉織物上的桃紅橙色區(qū)域(染料+NaOH溶液)，造成的顏色變化類似，即從桃紅橙色變成很淺的黃色。
實(shí)施例18N-甲基份菁涂敷在廚房用紙巾和陳放尿液上收集女性尿液，在玻璃瓶中室溫下保藏8天。如上所述合成以下結(jié)構(gòu)的N-甲基份菁染料。將0.5g溶于20ml去離子水中，涂敷到SCOTT廚房用卷紙巾上(通過將紙巾浸入溶液)，讓過量的溶液瀝掉，然后讓涂敷的紙巾在環(huán)境條件下干燥。用染料將紙巾染成深橙色。
將陳放尿液點(diǎn)滴到橙色紙巾上，立即產(chǎn)生顏色變化，從深橙色變成淺黃色。作為對(duì)照，將陳放尿液濾過0.2微米過濾器，以除去細(xì)菌和其它微生物。陳放尿液過濾后點(diǎn)滴到紙巾上并不引起顏色變化，這提示是陳放尿液中的微生物而不是其它成分造成顏色變化。
實(shí)施例19N-甲基份菁涂敷在廚房用紙巾和陳放尿液上收集女性尿液，在37℃下保藏24小時(shí)。匯集的女性尿液在這些條件下保藏后預(yù)計(jì)細(xì)菌負(fù)荷大約為1×105CFU/ml。如上所述合成以下結(jié)構(gòu)33的N-甲基份菁染料。將0.5g溶于20ml去離子水中，涂敷到SCOTT廚房用卷紙巾上(通過將紙巾浸入溶液)，讓過量的溶液瀝掉，然后讓涂敷的紙巾在環(huán)境條件下干燥。用染料將紙巾染成深橙色。
將陳放尿液點(diǎn)滴到橙色紙巾上，立即產(chǎn)生顏色變化，從深橙色變成淺黃色。作為對(duì)照，將陳放尿液濾過0.2微米過濾器，以除去細(xì)菌和其它微生物。陳放尿液過濾后點(diǎn)滴到紙巾上并不引起顏色變化，這提示是陳放尿液中的微生物而不是其它成分造成顏色變化。
實(shí)施例20N-甲基份菁涂敷在廚房用紙巾和寵物鳥大便上由鳥籠里的相思鸚鵡收集糞便，放入大約10ml亞特蘭大市家用自來水中振搖。如上所述合成以上結(jié)構(gòu)33的N-甲基份菁染料。將0.5g溶于20ml ml去離子水中，涂敷到SCOTT廚房用卷紙巾上(通過將紙巾浸入溶液)，讓過量的溶液瀝掉，然后讓涂敷的紙巾在環(huán)境條件下干燥。用染料將紙巾染成深橙色(圖13A)。
將數(shù)滴相思鸚鵡糞便于自來水中的懸浮液點(diǎn)滴到涂敷紙巾上(13B)，在加入懸浮液的地方立即產(chǎn)生顏色變化，從深橙色變成淺黃色。作為對(duì)照，將亞特蘭大市的家用自來水點(diǎn)滴到紙巾的不同區(qū)域，雖然顏色被水稍微稀釋，但該區(qū)域仍為橙色。
實(shí)施例21(預(yù)示性)用于涂層的指示染料在良好攪拌下，1克羥丙基甲基纖維素、0.5克結(jié)構(gòu)33的N-甲基份菁可溶于10克水和10克異丙醇的混合物中。可將此溶液涂敷到聚酯膜上并讓其在室溫下干燥，以產(chǎn)生能夠檢測(cè)微生物存在的涂敷柔韌性薄膜。
實(shí)施例22(預(yù)示性)涂層中的指示染料可將1g乙基纖維素、0.25g結(jié)構(gòu)33的N-甲基份菁溶于20克四氫呋喃中?？蓪⒋巳芤和糠蟮骄埘ツど喜⒆屍湓谑覝叵赂稍铮援a(chǎn)生能夠檢測(cè)微生物存在的涂敷柔韌性薄膜。
實(shí)施例23側(cè)向流動(dòng)裝置將Millipore硝基纖維素HF75膜(獲自Millipore Corporation ofBillerica，MA，USA)疊覆在長(zhǎng)度大約30厘米的塑料支持卡片(獲自Millipore Corp.)上。用手將5重量百分比Reichardt染料的異丙醇溶液在檢測(cè)區(qū)和對(duì)照區(qū)上劃條紋。將薄膜在實(shí)驗(yàn)室烘箱中37.5°下干燥1小時(shí)。從烘箱取出薄膜卡片后，將纖維質(zhì)芯材料墊(獲自MilliporeCorp.，目錄號(hào)CFSP203000)聯(lián)結(jié)到薄膜上靠近對(duì)照區(qū)的一端。將卡片用以聯(lián)結(jié)樣品墊的另一端切下。然后將卡片切成4mm條帶，形成半條狀物(half stick)。
制作出半條狀物后，將細(xì)菌溶液施加到檢測(cè)薄膜的末端。毛細(xì)管作用將溶液和細(xì)菌吸到檢測(cè)區(qū)中，在檢測(cè)區(qū)可看到顏色變化。對(duì)照線條的顏色在整個(gè)試驗(yàn)過程中保持一樣。
實(shí)施例24環(huán)糊精增強(qiáng)首先將SCOTT紙巾浸蘸涂敷羥丙基-β-環(huán)糊精(獲自CerestarInternational，Hammond，IN，USA)的水溶液(1克于20ml中)，并在環(huán)境溫度下風(fēng)干。涂敷紙巾干后，用Reichardt染料的異丙醇溶液(1重量百分比)處理，讓其風(fēng)干。干燥的紙巾顏色為紫色/藍(lán)色。正是環(huán)糊精阻礙了染料的結(jié)晶，使染料顏色更為鮮艷地顯現(xiàn)在紙巾上。用該涂敷紙巾與革蘭氏陰性細(xì)菌(大腸桿菌)進(jìn)行試驗(yàn)，當(dāng)將含10,000CFU/ml的培養(yǎng)基的100微升等分試樣施加到紙巾時(shí)，發(fā)現(xiàn)不到5秒鐘就變成無(wú)色。發(fā)現(xiàn)細(xì)菌濃度低至500CFU/ml也會(huì)出現(xiàn)該脫色現(xiàn)象，當(dāng)然這需要長(zhǎng)達(dá)15秒的時(shí)間。因此，據(jù)認(rèn)為通過阻礙染料結(jié)晶，染料就會(huì)以單分子存在于基材上，從而染料對(duì)細(xì)菌水平的靈敏度提高。本發(fā)明人認(rèn)為，在紙巾上仔細(xì)應(yīng)用涂料(例如環(huán)糊精)，就會(huì)在基材表面上產(chǎn)生染料的單分子涂層，就會(huì)獲得最大的靈敏度。
實(shí)施例25干樣品試驗(yàn)用Reichardt染料涂敷的紙巾與“干”細(xì)菌樣品(不在溶液中)進(jìn)行試驗(yàn)。從含有一系列大腸桿菌生長(zhǎng)培養(yǎng)物的瓊脂培養(yǎng)皿中挑取菌落，制成干樣品來使用。將此干樣品擦涂到預(yù)潤(rùn)濕的染料涂敷SCOTT紙巾上。擦涂有菌落的區(qū)域在1-5秒內(nèi)變成無(wú)色。這與濕擦巾的使用方式類似，且表現(xiàn)很好。
實(shí)施例26漂白指示劑試驗(yàn)將Reichardt染料和3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)的混合物涂敷在SCOTT紙巾上，讓其風(fēng)干。將稀釋的漂白溶液施加到紙巾上，導(dǎo)致Reichardt染料脫色和TMB變成橙色/黃色。這表明可將漂白指示劑組合到細(xì)菌指示擦拭物中。
在最后的試驗(yàn)中，向具有Reichardt染料和TMB涂層的SCOTT紙巾滴加大腸桿菌懸浮液，而使其暴露于細(xì)菌。紙巾接觸到細(xì)菌的區(qū)域不到10秒鐘就脫色成白色斑點(diǎn)。沒有觀察到橙色/黃色產(chǎn)生。
實(shí)施例27份菁和兩性離子染料的紫外-可見光吸收光譜Reichardt染料不經(jīng)進(jìn)一步純化即使用。N-正己基和N-正十二烷基份菁染料按有關(guān)上述合成。所用的溶劑獲自Aldrich Chemical，為HPLC級(jí)。用Shimadzu UV-1601紫外-可見光分光光度計(jì)(ShimadzuCorporation)測(cè)量染料在400-800nm范圍的最長(zhǎng)波長(zhǎng)峰吸收，所述染料溶于三種不同的溶劑中，裝在適應(yīng)比色皿里。下表是左邊的溶劑與上方的染料進(jìn)行試驗(yàn)的結(jié)果。
份菁染料除較長(zhǎng)波長(zhǎng)吸收外，在近400nm處也顯示有吸收，這會(huì)改變所感知到的顏色。
明顯地，根據(jù)分光光度測(cè)量結(jié)果，這些微生物檢測(cè)染料當(dāng)溶于不同的溶劑中時(shí)，它們顯示出最大波長(zhǎng)峰吸收有大的偏移(＞10nm)。
實(shí)施例28病毒檢測(cè)證實(shí)色原根據(jù)本發(fā)明檢測(cè)病毒存在的能力。制備1型脊髓灰質(zhì)炎病毒、1型單純皰疹病毒(HSV-1)、鼻病毒、麻疹病毒、痘苗病毒和A型流感病毒，并將它們接種到用補(bǔ)加胎牛血清至5％濃度的Dulbecco′s Modified Ealge培養(yǎng)基(DMEM)繁殖飼養(yǎng)的MA-104胎猴腎細(xì)胞，在37℃±1℃、5％CO2下溫育6天。通過顯微鏡觀察感染細(xì)胞片層(cell sheet)的細(xì)胞蛻變情況(致細(xì)胞病變效應(yīng)，CPE)，如在至少50％的細(xì)胞片層中觀察到變圓、皺縮、裂解、固縮等，檢測(cè)病毒繁殖。細(xì)胞毒性測(cè)量為無(wú)病毒時(shí)物質(zhì)所產(chǎn)生的細(xì)胞蛻變的程度。用十倍DMEM系列稀釋液進(jìn)行病毒的滴定，每個(gè)稀釋4個(gè)重復(fù)MA 104培養(yǎng)物，每個(gè)重復(fù)樣用0.1毫升病毒稀釋液接種。按Reed和Muench的方法測(cè)定，病毒復(fù)制的程度計(jì)算為半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(TCID50)。
用Reichardt染料涂敷的背膠標(biāo)簽(160毫克/10毫升乙腈、80毫克/10毫升乙腈、40毫克/10毫升乙腈和20毫克/10毫升乙腈)作為試驗(yàn)表面。將50毫升于培養(yǎng)基中的未稀釋病毒(TCID5010-8脊髓灰質(zhì)炎病毒/mL；TCID5010-7HSV-1/mL；TCID5010-7鼻病毒/mL；TCID5010-6麻疹病毒/mL；TCID5010-6痘苗病毒/mL和TCID5010-7流感病毒/mL)滴加到每張背膠標(biāo)簽上，讓其靜止3分鐘，然后用棉簽拭去液滴。對(duì)于稀釋于培養(yǎng)基和鹽水中的鼻病毒和脊髓灰質(zhì)炎病毒，將單獨(dú)培養(yǎng)基、無(wú)病毒細(xì)胞培養(yǎng)基和無(wú)病毒細(xì)胞培養(yǎng)鹽水的等分試樣用作對(duì)照樣品，同樣讓其靜止3分鐘，然后拭去。對(duì)于其余的病毒(在其原始培養(yǎng)基中不加稀釋進(jìn)行使用)，只采用培養(yǎng)基對(duì)照。
對(duì)于脊髓灰質(zhì)炎病毒，鹽水對(duì)照似乎會(huì)干擾染料，而培養(yǎng)基則不引起顏色變化。因此實(shí)驗(yàn)的其余部分使用脊髓灰質(zhì)炎病毒于培養(yǎng)基中的稀釋液。將該病毒在培養(yǎng)基中作十倍系列稀釋，取50微升等分試樣施加到每張背膠標(biāo)簽。讓液滴靜止3分鐘后，將其從背膠標(biāo)簽拭去。對(duì)于鼻病毒，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基對(duì)照會(huì)產(chǎn)生干擾，而鹽水對(duì)照則不導(dǎo)致染料顏色變化。因此，將該病毒于鹽水中的十倍系列稀釋液以50微升等分試樣施加到背膠標(biāo)簽，3分鐘后拭去。對(duì)于脊髓灰質(zhì)炎病毒和鼻病毒，低至10-6(十倍系列稀釋的第六次稀釋)時(shí)背膠標(biāo)簽都會(huì)變色，這表明染料涂敷背膠標(biāo)簽具有檢測(cè)這些病毒的靈敏度(脊髓灰質(zhì)炎病毒所致脫色稍強(qiáng))。對(duì)于HSV-1、A型流感病毒、麻疹病毒和痘苗病毒，只將50微升的(未稀釋)病毒液滴點(diǎn)滴在背膠標(biāo)簽上。將隨后所觀察到的脫色情況與無(wú)病毒對(duì)照培養(yǎng)基和沙門氏菌(108CFU/mL)陽(yáng)性對(duì)照所觀察到的脫色情況進(jìn)行比較。雖然暴露于未稀釋的HSV-1病毒時(shí)脫色不如沙門氏菌所觀察到的脫色那么強(qiáng)烈，但所導(dǎo)致的背膠標(biāo)簽脫色比鼻病毒和脊髓灰質(zhì)炎病毒所觀察到的脫色強(qiáng)烈。響應(yīng)A型流感病毒、痘苗病毒和麻疹病毒而發(fā)生的脫色比其它病毒所觀察到的脫色要弱。
還制備了兩種Reichardt染料溶液(80毫克/10毫升乙腈，加或不加400毫升TWEEN 80表面活性劑)。用移液管吸取脊髓灰質(zhì)炎病毒或鼻病毒(均在培養(yǎng)基中未稀釋)100微升液滴到折疊的SCOTT紙巾上，并向每個(gè)含病毒斑點(diǎn)加入Reichardt染料液滴。對(duì)于含表面活性劑和不含表面活性劑的兩種溶液，顏色都是快速消失。繼續(xù)加入染料至顏色持續(xù)(大約9滴)。還對(duì)前述的相同培養(yǎng)基和鹽水對(duì)照進(jìn)行試驗(yàn)。培養(yǎng)基的確顯示出一定的染料脫色能力，而鹽水所呈現(xiàn)的滴定行為與前述用水所觀察到的一樣。
實(shí)施例29細(xì)菌污染的半定量對(duì)Reichardt染料提供細(xì)菌濃度半定量信息的能力進(jìn)行證實(shí)。將紙類基材(Neenah BondTM)(獲自美國(guó)喬治亞州Alpharetta市的NeenahPaper，Inc.)先用Reichardt染料溶液(80毫克/10毫升乙腈)如下進(jìn)行處理將紙浸蘸到涂料中或者在紙上涂刷涂料，然后將紙晾干。將七滴已知濃度的金黃色葡萄球菌(101、102、103、104、105、106和107CFU/毫升)點(diǎn)滴在每張紙的頂部。大約2分鐘后，將液滴吸去，顯示在金黃色葡萄球菌濃度為105CFU/mL或以上時(shí)顏色變化明顯。較低濃度時(shí)顏色差異不是那么明顯，特別是對(duì)于涂刷的紙張。
然后進(jìn)行盲研究。出于試驗(yàn)?zāi)康?，?00微升濃度為106CFU/mL的第一液滴點(diǎn)滴在浸蘸涂敷紙張含Reichardt染料的部分上。將100微升濃度為105CFU/mL的第二液滴點(diǎn)滴在涂刷紙張含Reichardt染料的部分上。最后，將含104CFU/mL濃度的金黃色葡萄球菌的第三液滴點(diǎn)滴在浸蘸涂敷紙張含Reichardt染料的部分上。兩名實(shí)驗(yàn)參與者不知道這三個(gè)液滴的濃度。大約2分鐘后，將液滴吸去。使用對(duì)照區(qū)域，這兩名實(shí)驗(yàn)參與者各自目測(cè)估計(jì)每個(gè)樣品的濃度。兩個(gè)人都正確地估計(jì)到第一樣品的濃度為106CFU/mL。他們還正確地猜測(cè)到第二樣品的濃度為105CFU/mL。但他們都不正確地將第三樣品的濃度估計(jì)為103CFU/mL。據(jù)認(rèn)為該錯(cuò)誤至少部分是由于在低于105CFU/mL的濃度下對(duì)照區(qū)域的顏色差異相對(duì)較低所致。不過本發(fā)明人認(rèn)為，可容易地選定色原的濃度和涂層的均勻性，以在這種低濃度下獲得準(zhǔn)確結(jié)果。在任何情況下，由于對(duì)照區(qū)域在較高濃度下(例如105CFU/mL或以上)可提供更為明顯的顏色差異，因此認(rèn)為在臨床更相關(guān)的高濃度下會(huì)獲得準(zhǔn)確的結(jié)果。
實(shí)施例30細(xì)菌污染的定量對(duì)Reichardt染料提供細(xì)菌濃度定量信息的能力進(jìn)行證實(shí)。將紙類基材(Neenah BondTM)(獲自美國(guó)喬治亞州Alpharetta市的NeenahPaper，Inc.)和標(biāo)簽(獲自Avery-Dennison)先用Reichardt染料溶液(80毫克/10毫升乙腈)進(jìn)行涂敷并晾干。使用金黃色葡萄球菌、綠膿假單胞菌和大腸桿菌的已知濃度等分試樣(100微升)，制作各種細(xì)菌的對(duì)照曲線。更具體地說，將涂敷Reichardt染料的指示條暴露于數(shù)量漸減的細(xì)菌等分試樣。在施加每個(gè)等分試樣后，用手提式分光光度計(jì)測(cè)定每個(gè)CFU/mL濃度的ΔE值(用L*、A*和B*值計(jì)算)。結(jié)果在下表4(對(duì)紙)和表5(對(duì)標(biāo)簽)中給出。
表4紙類基材的結(jié)果
表5標(biāo)簽基材的結(jié)果
由以上數(shù)據(jù)分別產(chǎn)生金黃色葡萄球菌、綠膿假單胞菌和大腸桿菌的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)曲線，如圖5-7所示。圖中可見，每種類型細(xì)菌以稍不相同的方式改變?nèi)玖咸幚磉^的基材的顏色，產(chǎn)生獨(dú)特的標(biāo)準(zhǔn)曲線。之后，將未知細(xì)菌濃度的液滴點(diǎn)滴在背膠標(biāo)簽上，用分光光度計(jì)測(cè)量所產(chǎn)生顏色的ΔE值。每個(gè)未知樣品所獲得的數(shù)值在下表6-7中給出。
表6紙類基材的結(jié)果
表7標(biāo)簽基材的結(jié)果
從數(shù)據(jù)可以看出，通過確定未知濃度的ΔE值最接近哪個(gè)已知ΔE值，可預(yù)測(cè)出該未知濃度。雖然一些結(jié)果不完全準(zhǔn)確，但本發(fā)明人認(rèn)為改進(jìn)涂層的均勻性會(huì)進(jìn)一步提高檢測(cè)準(zhǔn)確度。
比較實(shí)施例(非本發(fā)明實(shí)施例)將陳放雞肉用作比較實(shí)施例的細(xì)菌來源。將聚苯乙烯盤上覆蓋著透明薄膜的半只新鮮雞肉(獲自超市)在室溫下保藏三周。用移液管收集聚苯乙烯盤中匯集的淺黃色汁液，用于試驗(yàn)。
比較實(shí)施例1將陳放雞汁點(diǎn)到SCOTT紙巾上。將以下結(jié)構(gòu)34的CI Acid Green41(獲自Aldrich Chemical)溶液(0.008mol/l)(羥基蒽醌染料的實(shí)例)點(diǎn)滴到陳放雞汁上。沒有觀察到顏色變化。作為對(duì)照，將100mgReichardt染料懸浮于10ml乙腈中。將此懸浮液點(diǎn)滴到陳放雞汁上，立即脫色。
比較實(shí)施例2將陳放雞汁點(diǎn)滴到SCOTT紙巾上。將以下結(jié)構(gòu)35的CI AcidGreen 25溶液(0.008mol/l)(蒽醌染料的實(shí)例)點(diǎn)滴到陳放雞汁上。沒有觀察到顏色變化。作為對(duì)照，將100mg Reichardt染料懸浮于10ml乙腈中。將此懸浮液點(diǎn)滴到陳放雞汁上，立即脫色。
比較實(shí)施例3將陳放雞汁點(diǎn)滴到SCOTT紙巾上。將50mg的以下結(jié)構(gòu)36的CI Acid Red 37(獲自Aldrich Chemical)(氨基偶氮染料的實(shí)例)溶于10ml去離子水中。將此染料溶液點(diǎn)滴到紙巾上的陳放雞汁上。沒有觀察到顏色變化。作為對(duì)照，將100mg Reichardt染料懸浮于10ml乙腈中。將此懸浮液點(diǎn)滴到陳放雞汁上，立即脫色。
比較實(shí)施例4將陳放雞汁點(diǎn)滴到SCOTT紙巾上。將50mg的以下結(jié)構(gòu)37的CI Acid Yellow 23(也稱食用色素檸檬黃)(獲自Aldrich Chemical)(苯基吡唑酮染料的實(shí)例)溶于10ml去離子水中。將此染料溶液點(diǎn)滴到紙巾上的陳放雞汁上。沒有觀察到顏色變化。作為對(duì)照，將100mgReichardt染料懸浮于10ml乙腈中。將此懸浮液點(diǎn)滴到陳放雞汁上，立即脫色。
比較實(shí)施例5將陳放雞汁點(diǎn)滴到SCOTT紙巾上。將以下結(jié)構(gòu)38的CI AcidRed 52(磺酰羅丹明B)(呫噸染料的實(shí)例)的水溶液點(diǎn)滴到紙巾上的陳放雞汁上。沒有觀察到顏色變化。作為對(duì)照，將100mg Reichardt染料懸浮于10ml乙腈中。將此懸浮液點(diǎn)滴到陳放雞汁上，立即脫色。
比較實(shí)施例6將陳放雞汁點(diǎn)滴到SCOTT紙巾上。將30mg的以下結(jié)構(gòu)39的CI Acid Blue 74(也稱靛藍(lán)胭脂紅)(獲自Aldrich Chemical)(靛類染料的實(shí)例)溶于10ml去離子水中。將此染料溶液點(diǎn)滴到紙巾上的陳放雞汁上。沒有觀察到顏色變化。作為對(duì)照，將100mg Reichardt染料懸浮于10ml乙腈中。將此懸浮液點(diǎn)滴到陳放雞汁上，立即脫色。
本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，對(duì)本發(fā)明作出各種變化和改動(dòng)可認(rèn)為在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。這種變化的實(shí)例包含在上文確定的本專利中，每個(gè)實(shí)施例通過引用整體結(jié)合到本文中，結(jié)合的程度與本說明書相符合。本發(fā)明人意圖是這種變化和改動(dòng)落入本發(fā)明的范圍之內(nèi)。還要認(rèn)識(shí)到，當(dāng)根據(jù)以上公開內(nèi)容閱讀時(shí)，不能將本發(fā)明的范圍解釋為限于本文公開的具體實(shí)施方案，本發(fā)明范圍只應(yīng)根據(jù)所附的權(quán)利要求書解釋。
權(quán)利要求
1.一種半定量或定量檢測(cè)樣品中微生物存在的方法，所述方法包括使試驗(yàn)染料與樣品接觸，使得試驗(yàn)染料發(fā)生可檢測(cè)的顏色變化；然后，將試驗(yàn)染料的顏色與對(duì)照染料的顏色進(jìn)行比較，其中對(duì)照染料的顏色對(duì)應(yīng)于已知的微生物濃度。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述試驗(yàn)染料、對(duì)照染料或兩者是溶劑化變色染料。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述試驗(yàn)染料、對(duì)照染料或兩者是份菁染料。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述份菁染料具有以下結(jié)構(gòu)
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述試驗(yàn)染料、對(duì)照染料或兩者是兩性離子染料。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述兩性離子染料是N-酚酸甜菜堿染料。
7.權(quán)利要求5的方法，其中所述兩性離子染料是Reichardt染料。
8.權(quán)利要求5的方法，其中所述兩性離子染料具有以下結(jié)構(gòu) 其中，n為0或更大；X為氧、碳、氮或硫。
9.權(quán)利要求1的方法，其中將所述試驗(yàn)染料的顏色與多種對(duì)照染料的顏色進(jìn)行比較，其中所述對(duì)照染料各自具有對(duì)應(yīng)于不同的已知微生物濃度的顏色。
10.一種半定量或定量檢測(cè)樣品中微生物存在的方法，所述方法包括使溶劑化變色試樣染料與樣品接觸，使得試驗(yàn)染料發(fā)生可檢測(cè)的顏色變化；然后，將所述試驗(yàn)染料的顏色與多種溶劑化變色對(duì)照染料的顏色進(jìn)行比較，其中所述對(duì)照染料各自具有對(duì)應(yīng)于不同的已知微生物濃度的顏色。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述試驗(yàn)染料和對(duì)照染料是份菁染料、N-酚酸甜菜堿染料或它們的組合。
12.權(quán)利要求10的方法，其中所述試驗(yàn)染料和對(duì)照染料是Reichardt染料。
13.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，所述方法進(jìn)一步包括測(cè)量試驗(yàn)染料、一種或多種對(duì)照染料或它們的組合的顏色強(qiáng)度。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述試驗(yàn)染料的顏色強(qiáng)度與試驗(yàn)樣品當(dāng)中微生物的濃度成比例。
15.權(quán)利要求13的方法，所述方法進(jìn)一步包括通過將一種或多種對(duì)照染料的顏色強(qiáng)度對(duì)多個(gè)已知的微生物濃度作圖，產(chǎn)生檢測(cè)曲線。
16.權(quán)利要求15的方法，所述方法進(jìn)一步包括將所述試驗(yàn)染料的顏色強(qiáng)度與所述檢測(cè)曲線上的微生物濃度進(jìn)行關(guān)聯(lián)。
17.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中基材限定含有試驗(yàn)染料的檢測(cè)區(qū)和含有一種或多種對(duì)照染料的對(duì)照區(qū)。
18.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述顏色變化在小于約5分鐘內(nèi)發(fā)生，優(yōu)選在小于1分鐘內(nèi)發(fā)生。
19.一種供半定量或定量檢測(cè)樣品中微生物存在的基材，所述基材限定檢測(cè)區(qū)和對(duì)照區(qū)，其中試驗(yàn)染料包含在檢測(cè)區(qū)中，所述試驗(yàn)染料在微生物存在下能夠發(fā)生可檢測(cè)的顏色變化，且其中多種對(duì)照染料包含在對(duì)照區(qū)中，每種對(duì)照染料的顏色對(duì)應(yīng)于不同的已知微生物濃度。
20.權(quán)利要求19的基材，其中所述試驗(yàn)染料、對(duì)照染料或它們的組合是溶劑化變色染料。
21.權(quán)利要求19的基材，其中所述試驗(yàn)染料、對(duì)照染料或它們的組合是份菁染料、N-酚酸甜菜堿染料或它們的組合。
22.權(quán)利要求19的基材，其中所述試驗(yàn)染料、對(duì)照染料或它們的組合是Reichardt染料。
全文摘要
本發(fā)明提供一種半定量或定量檢測(cè)樣品中微生物的存在的方法。該方法采用了在一種或多種微生物的存在下能夠發(fā)生可檢測(cè)的顏色變化的試驗(yàn)染料。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，試驗(yàn)染料是能對(duì)微生物各成分(例如細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)等)與細(xì)胞外部環(huán)境之間的極性差異作出響應(yīng)的溶劑化變色染料(例如Reichardt染料)。或者，還可能有其它機(jī)制全部或部分上是染料與微生物之間的相互作用的原因，如酸－堿反應(yīng)、氧化還原反應(yīng)等等。不管怎樣，可將試驗(yàn)染料的顏色與對(duì)照染料的顏色進(jìn)行比較，其中對(duì)照染料的顏色對(duì)應(yīng)于已知的微生物濃度。
文檔編號(hào)C12Q1/06GK101080497SQ200580042821
公開日2007年11月28日 申請(qǐng)日期2005年10月24日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月16日
發(fā)明者J·G·麥唐納, S·M·馬丁, J·利 申請(qǐng)人:金伯利-克拉克環(huán)球有限公司