專利名稱：抗生腱蛋白c的抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及指向生腱蛋白C(tenascin-C)的特異性結(jié)合成員，特別是抗生腱蛋白C的人抗體。這些特異性結(jié)合成員具有治療應(yīng)用范圍，例如在癌癥的診斷和治療中應(yīng)用。
背景技術(shù)：
生腱蛋白C為一種調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附的細(xì)胞外基質(zhì)的六聚化糖蛋白。它參與例如細(xì)胞增殖和細(xì)胞遷移這樣的過(guò)程，并且與作為在形態(tài)發(fā)生和胚胎發(fā)生過(guò)程中以及腫瘤發(fā)生或血管發(fā)生中出現(xiàn)的組織結(jié)構(gòu)改變相關(guān)。
生腱蛋白C的示意性結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)如圖1所示。作為可變剪接的結(jié)果，可以產(chǎn)生幾種生腱蛋白C的同種型，所述的可變剪接可以導(dǎo)致在這種從結(jié)構(gòu)域A 1到結(jié)構(gòu)域D的蛋白質(zhì)的中心部分中包含(多個(gè))結(jié)構(gòu)域[Borsi L等Int J Cancer 1992；52688-692，Carnemolla B等EurJ Biochem 1992；205561-567]。預(yù)先推定可以通過(guò)可變剪接機(jī)制將結(jié)構(gòu)域A1-D插入生腱蛋白C分子“塊”或在其中無(wú)該分子，從而產(chǎn)生“生腱蛋白C大”(tenscin-C large)和“生腱蛋白C小”(tenscin-Csmall)的分子[Borsi L等J Biol Chem 1995；2706243-6245]。已經(jīng)報(bào)導(dǎo)在許多腫瘤中存在生腱蛋白C的大同種型的強(qiáng)的超表達(dá)[Borsi1992，文獻(xiàn)同上]，并且已經(jīng)在臨床上廣泛表征了分別對(duì)結(jié)構(gòu)域A1和D具有特異性的兩種單克隆抗體[Riva P等Int J Cancer 1992；517-13，Riva P等Cancer Res 1995；555952s-5956 s，Paganelli G等EurJ Nucl Med 1994；21314-321，Reardon DA等J Clin Oncol 2002；201389-1397，Bigner DD等J Clin Oncol 1998；162202-2212。
然而，近來(lái)已經(jīng)清楚的是通過(guò)更復(fù)雜調(diào)節(jié)的可變剪接機(jī)制可以導(dǎo)致生腱蛋白C的大同種型中的分子不均勻性增加。例如，據(jù)報(bào)導(dǎo)生腱蛋白C的額外結(jié)構(gòu)域C展示出比生腱蛋白C的其它可變剪接結(jié)構(gòu)域更受限的表達(dá)模式[Carnemolla B等Am J Pathol 1999；1541345-1352]，其中使用免疫組織化學(xué)而顯示的主要血管周圍的染色。生腱蛋白C的C結(jié)構(gòu)域在大部分正常成年人組織中檢測(cè)不到，而在高級(jí)星形細(xì)胞瘤[Carnemolla B等Am J Pathol 1999；1541345-1352]和其它腫瘤類型中超表達(dá)。對(duì)大生腱蛋白C同種型之間的不均勻性的進(jìn)一步的支持來(lái)源于轉(zhuǎn)錄分析，它證實(shí)大生腱蛋白C轉(zhuǎn)錄物的特征在于異質(zhì)性組成[Katenkamp K等J Pathol 2004；203771-779]。翻譯后修飾(例如糖基化)的存在或不存在均可以提供額外水平的復(fù)雜性，它們可以改變各蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域表面上的某些表位，并且使得它們無(wú)法在體外或體內(nèi)被特異性單克隆抗體進(jìn)行特異性分子識(shí)別。
盡管使用現(xiàn)有的方法可以在體外對(duì)抗體特異性的、實(shí)際所關(guān)注的任何蛋白質(zhì)進(jìn)行快速分離，但是這類抗體識(shí)別表位在生物樣本或疾病動(dòng)物模型中并非顯而易見(jiàn)。在體內(nèi)不能結(jié)合的可能原因包括表位的翻譯后修飾，從而掩蔽表位和抗體特異性或穩(wěn)定性不足。由此難以評(píng)價(jià)在僅基于常規(guī)用于篩選單克隆抗體的典型固相測(cè)定法，例如酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)中的與重組抗原(或抗原片段)的反應(yīng)性的單克隆抗體適合實(shí)際應(yīng)用。
由此需要分別分析對(duì)生腱蛋白C的大同種型的各結(jié)構(gòu)域的單克隆抗體，以便評(píng)價(jià)它們?cè)谠\斷和治療應(yīng)用中的適合性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明者已經(jīng)分離了對(duì)在生腱蛋白C中可變剪接區(qū)內(nèi)的不同表位具有特異性的人單克隆抗體片段。這些抗體的特征在于其識(shí)別生物樣本中生腱蛋白C大同種型的能力與在ELISA測(cè)定法中的高度特異性結(jié)合相當(dāng)，而且該能力對(duì)極為相近似的抗原具有顯著差異。
本發(fā)明的一個(gè)方面提供了結(jié)合人生腱蛋白C，特別是生腱蛋白C大同種型的特異性結(jié)合成員。
優(yōu)選的特異性結(jié)合成員為腫瘤特異性的，并且與正常組織相比，優(yōu)先結(jié)合腫瘤組織。特異性結(jié)合成員可以例如，與正常組織相比，優(yōu)先結(jié)合腫瘤組織的基質(zhì)和/或新血管和血管周圍結(jié)構(gòu)。
與生腱蛋白C小同種型相比，特異性結(jié)合成員可以優(yōu)先結(jié)合生腱蛋白C大同種型。
在某些實(shí)施方案中，所述的特異性結(jié)合成員可以結(jié)合生腱蛋白C的A1結(jié)構(gòu)域。合適的特異性結(jié)合成員可以包括抗體VH結(jié)構(gòu)域，其選自SEQ ID NO.2的4A1-F16 VH結(jié)構(gòu)域；SEQID NO.12的3A1-D5 VH結(jié)構(gòu)域和包含具有選自SEQ ID NO.5、SEQ IDNO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO13的氨基酸序列的一個(gè)或多個(gè)VH CDR的VH結(jié)構(gòu)域；和/或抗體VL結(jié)構(gòu)域，其選自SEQ ID NO.4或SEQ ID NO49)的VL結(jié)構(gòu)域；和包含具有選自SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10的氨基酸序列的一個(gè)或多個(gè)VL CDR的VL結(jié)構(gòu)域。
4A1-F16在本文中也稱作F16。
例如，合適的特異性結(jié)合成員可以包括SEQ ID NO.4或SEQ ID NO49的4A1-F16/3A1-D5 VL結(jié)構(gòu)域和/或SEQ ID NO.2的4A1-F16 VH結(jié)構(gòu)域或SEQ ID NO12的3A1-D5 VH結(jié)構(gòu)域。
在其它實(shí)施方案中，所述的特異性結(jié)合成員可以結(jié)合生腱蛋白C的C結(jié)構(gòu)域。合適的特異性結(jié)合成員可以包括抗體VH結(jié)構(gòu)域，其選自E10 VH結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO.15或SEQ IDNO48)；A12 VH結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO25)；F4和G11 VH結(jié)構(gòu)域(SEQID NO29或SEQ ID NO45)；和包含具有選自SEQ ID NO.18、SEQID NO.19、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.26和SEQ ID NO.27的氨基酸序列的一個(gè)或多個(gè)VH CDR的VH結(jié)構(gòu)域；和/或抗體VL結(jié)構(gòu)域，其選自SEQ ID NO.17或SEQ ID NO 81的VL結(jié)構(gòu)域；具有SEQ ID NO31或SEQ ID NO83的氨基酸序列的F4 VL結(jié)構(gòu)域；具有SEQ ID NO35或SEQ ID NO47的氨基酸序列的G11 VL結(jié)構(gòu)域；和包含具有選自SEQ ID NO21、SEQ ID NO22、SEQ ID NO23、SEQ ID NO32和SEQ ID NO33的氨基酸序列的一個(gè)或多個(gè)VLCDR的VL結(jié)構(gòu)域。
因此，在一個(gè)實(shí)例中，所述的特異性結(jié)合成員可以包括抗體VH結(jié)構(gòu)域，其選自E10 VH結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO.15或SEQ IDNO48)；A12 VH結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO25)；和包含具有選自SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.26和SEQ ID NO.27的氨基酸序列的一個(gè)或多個(gè)VH CDR的VH結(jié)構(gòu)域；和/或抗體VL結(jié)構(gòu)域，其選自SEQ ID NO.17或SEQ ID NO81的VL結(jié)構(gòu)域和包含具有選自SEQ ID NO21、SEQ ID NO22和SEQ ID NO23的氨基酸序列的一個(gè)或多個(gè)VL CDR的VL結(jié)構(gòu)域。
例如，合適的特異性結(jié)合成員可以包括SEQ ID NO.17或SEQ IDNO81的E10/A12 VL結(jié)構(gòu)域和/或SEQ ID NO.15或SEQ ID NO48)的E10 VH結(jié)構(gòu)域或SEQ ID NO.25的A12 VH結(jié)構(gòu)域。
在另一個(gè)實(shí)例中，所述的特異性結(jié)合成員可以包括抗體VH結(jié)構(gòu)域，其選自F4和G11 VH結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO29或SEQ ID NO45)和包含具有選自SEQ ID NO18、SEQ ID NO19和SEQ ID NO20的氨基酸序列的一個(gè)或多個(gè)VH CDR的VH結(jié)構(gòu)域；和/或抗體VL結(jié)構(gòu)域，其選自F4 VL結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO31或SEQ ID NO83)；G11 VL結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO35或SEQ ID NO47)和包含具有選自SEQ ID NO32、SEQ ID NO33，SEQ ID NO22和SEQ ID NO23的氨基酸序列的一個(gè)或多個(gè)VL CDR的VL結(jié)構(gòu)域。
例如，合適的特異性結(jié)合成員可以包括SEQ ID NO29或SEQ IDNO45的F4/G11 VH結(jié)構(gòu)域和/或SEQ ID NO31或SEQ ID NO83的F4 VL結(jié)構(gòu)域或SEQ ID NO35或SEQ ID NO47的G11 VL結(jié)構(gòu)域。
在另一個(gè)實(shí)例中，所述的特異性結(jié)合成員結(jié)合生腱蛋白C的結(jié)構(gòu)域D。優(yōu)選所述的特異性結(jié)合成員結(jié)合人結(jié)構(gòu)域D。它可以與小鼠同種型發(fā)生交叉反應(yīng)。我們分離了對(duì)結(jié)構(gòu)域D具有特異性的抗體分子。將原始克隆命名為F4S。我們還研發(fā)了親和成熟的F4S變體，將其命名為D11。我們進(jìn)一步研發(fā)了親和成熟的D11的變體，將其命名為P12。因此，合適的特異性結(jié)合成員可以包括抗體VH結(jié)構(gòu)域，其選自SEQ ID NO.58的F4S VH結(jié)構(gòu)域；SEQ IDNO.55的D11 VH結(jié)構(gòu)域；SEQ ID NO52的P12 VH結(jié)構(gòu)域；和包含具有選自SEQ ID NO.61、SEQ ID NO.62、SEQ ID NO.63、SEQ ID NO64、SEQ ID NO65和SEQ ID NO66的氨基酸序列的一個(gè)或多個(gè)VHCDR的VH結(jié)構(gòu)域；和/或抗體VL結(jié)構(gòu)域，其選自SEQ ID NO.53的P12和D11 VL結(jié)構(gòu)域；SEQ ID NO60的F4S VL結(jié)構(gòu)域；和包含具有選自SEQ ID NO.67、SEQ ID NO.68、SEQ ID NO69、SEQ ID NO70和SEQ ID NO.71的氨基酸序列的一個(gè)或多個(gè)VL CDR的VL結(jié)構(gòu)域。
一般而言，使VH結(jié)構(gòu)域與VL結(jié)構(gòu)域配對(duì)以便提供抗體抗原結(jié)合部位，不過(guò)如下所述，可以將VH結(jié)構(gòu)域單獨(dú)用于結(jié)合抗原。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，使本文所述的VH結(jié)構(gòu)域(即SEQ ID NO 2，12，15，25，29，45，48，52，56或58)與相應(yīng)的VL結(jié)構(gòu)域(即SEQ ID NO4或SEQ ID NO50(用于4A1-F16和3A1-D5)，SEQ ID NO17或SEQ IDNO81(用于A12和E 10)，用于F4和G11的SEQ ID NO31，SEQ IDNO83，SEQ ID NO35或SEQ ID NO47)，用于P12和D11的SEQ IDNO54或用于F4S的SEQ ID NO60配對(duì)，以便形成包含VH和VL結(jié)構(gòu)域的抗體抗原結(jié)合部位(例如包含4A1-F16 VH和VL結(jié)構(gòu)域，3A1-D5VH和VL結(jié)構(gòu)域，E10 VH和VL結(jié)構(gòu)域，A12 VH和VL結(jié)構(gòu)域，F(xiàn)4 VH和VL結(jié)構(gòu)域，G11 VH和VL結(jié)構(gòu)域，P12 VH和VL結(jié)構(gòu)域，D11 VH和VL結(jié)構(gòu)域或F4S VH和VL結(jié)構(gòu)域的部位)。在其它實(shí)施方案中，可以使VH結(jié)構(gòu)域與VL結(jié)構(gòu)域，而非相應(yīng)的VL結(jié)構(gòu)域，優(yōu)選來(lái)自結(jié)合生腱蛋白C的相同結(jié)構(gòu)域的特異性結(jié)合成員的VL結(jié)構(gòu)域配對(duì)。本領(lǐng)域中充分確立了輕鏈的混雜性。
一個(gè)或多個(gè)CDR可以取自如本文披露的VH或VL結(jié)構(gòu)域并且將它們整合到合適的構(gòu)架中。這種情況在下文中進(jìn)一步討論。一般根據(jù)Kabat定義CDR。優(yōu)選VH結(jié)構(gòu)域和/或VL結(jié)構(gòu)域包含CDR1、CDR2和CDR3。4A1-F16 VH CDR1如SEQ ID NO5中所示。3A1-D5 VH CDR1如SEQ ID NO13中所示。4A1-F16和3A1-D5 VH CDR 2和3分別如SEQ ID NO 6和7中所示。4A1-F16和3A1-D5 VL CDR1，2和3分別如SEQ ID NO 8，9和10中所示。E10 VH CDR 1和2如SEQ ID NO 18和19中所示。A12 VH CDR 1和2如SEQ ID NO 26和27中所示。E10和A12 VH CDR3如SEQ ID NO23中所示。E 10和A12 VL CDR1，2和3分別如SEQ ID NO21，22和23中所示。F4和G11 VH CDR1，2和3分別如SEQ ID NO18，19和20中所示。F4 VL CDR1，2和3分別如SEQ ID NO32，33和23中所示。G11 VL CDR1，2和3分別如SEQ ID NO32，22和23中所示。P12 VH CDR分別如SEQ ID NO61，63和66中所示。P12 VL CDR分別如SEQ ID NO67，69和71中所示。D11 VH CDR分別如SEQ ID NO62，64和66中所示。D11 VLCDR分別如SEQ ID NO67，69和71中所示。F4S VH CDR分別為SEQID NO62，65和66。F4S VL CDR分別為SEQ ID NO68，70和71。
在某些實(shí)施方案中，特異性結(jié)合成員可以包括包含具有SEQ ID NO.7的氨基酸序列的CDR3，具有SEQ ID NO.6的氨基酸序列的CDR2和包含具有SEQ ID NO.5，或更優(yōu)選SEQ ID NO.13的氨基酸序列的CDR1中的一個(gè)或多個(gè)的抗體VH結(jié)構(gòu)域。
在其它實(shí)施方案中，特異性結(jié)合成員可以包括具有SEQ ID NO20的氨基酸序列的CDR3，具有SEQ ID NO27，更優(yōu)選SEQ ID NO19的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO26，或更優(yōu)選SEQ ID NO18的氨基酸序列的CDR 1中的一個(gè)或多個(gè)的抗體VH結(jié)構(gòu)域。
特異性結(jié)合成員可以包括包含具有SEQ ID NO23的氨基酸序列的CDR3，具有SEQ ID NO22或SEQ ID NO33的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO21或SEQ ID NO32的氨基酸序列的CDR1中的一個(gè)或多個(gè)的抗體VL結(jié)構(gòu)域。
優(yōu)選特異性結(jié)合成員為如在下文更具體地描述的scFv。VH和VL結(jié)構(gòu)域可以通過(guò)肽接頭連接，例如具有如SEQ ID NO37中所示的氨基酸序列的接頭。一般而言，這些接頭具有包含一個(gè)或多個(gè)串連重復(fù)基序的氨基酸序列。該基序一般為5個(gè)殘基的序列，并且優(yōu)選殘基中的至少4個(gè)為Gly或Ser。如果5個(gè)殘基中的4個(gè)為Gly或Ser，那么其它殘基可以為Ala。更優(yōu)選5個(gè)殘基各自為Gly或Ser。優(yōu)選的基序?yàn)镚GGGS，SSSSG，GSGSA和GGSGG(分別為SEQ ID NO76，77，78和79)。優(yōu)選這些基序在序列中相鄰，其中在重復(fù)部分之間無(wú)間隔核苷酸。接頭序列可以包含1-5個(gè)，優(yōu)選3或4個(gè)重復(fù)基序或由它們組成。例如，帶有三個(gè)處理重復(fù)的接頭可以具有下列氨基酸序列之一GGGGSGGGGSGGGGS-SEQ ID NO39SSSSGSSSSGSSSSG-SEQ ID NO41GSGSAGSGSAGSGSA-SEQ ID NO42GGSGGGGSGGGGSGG-SEQ ID NO43。
可以通過(guò)序列改變或突變和篩選的方法獲得其序列如本文所示的并且可以用于與生腱蛋白C特異性結(jié)合的成員的VH和VL結(jié)構(gòu)域和CDR的變體。本發(fā)明也提供這類方法。
可以如所述的按照本發(fā)明使用其序列特別如本文披露的任何VH和VL結(jié)構(gòu)域的可變結(jié)構(gòu)域氨基酸序列變體。具體的變體可以包括一個(gè)或多個(gè)氨基酸序列改變(氨基酸殘基的添加、缺失、取代和/或插入)，可以少于20個(gè)改變，少于約15個(gè)，少于約10個(gè)改變或少于約5個(gè)，4個(gè)，3個(gè)，2個(gè)或1個(gè)改變?？梢栽谝粋€(gè)或多個(gè)框架區(qū)和/或一個(gè)或多個(gè)CDR中進(jìn)行改變。特別地，改變可以在VH CDR1，VH CDR2和/或VH CDR3，尤其是在VH CDR3中進(jìn)行。
本發(fā)明的特異性結(jié)合成員可以是與任何能結(jié)合生腱蛋白C大同種型，特別是其A1或C結(jié)構(gòu)域的特異性結(jié)合成員競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗原的一種特異性結(jié)合成員，并且包括特異性結(jié)合成員、本文披露的VH和/或VL結(jié)構(gòu)域或本文披露的VH CDR或任何它們的變體?？梢栽隗w外很容易地對(duì)結(jié)合成員之間的競(jìng)爭(zhēng)進(jìn)行檢測(cè)，例如，使用ELISA和/或通過(guò)用特異性報(bào)導(dǎo)分子標(biāo)記可以一個(gè)特異性結(jié)合成員，其在有其它未標(biāo)記的結(jié)合成員存在下檢測(cè)，能夠鑒定特異性結(jié)合相同或重疊表位的特異性結(jié)合成員。
因此，本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了特異性結(jié)合成員，包括人抗體抗原結(jié)合部位，它與4A1-F16，3A1-D5，E10，A12，F(xiàn)4，G11，P12，D11和F4S中的一個(gè)或多個(gè)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合生腱蛋白C。
本領(lǐng)域可以利用各種方法獲得可以與4A1-F16，3A1-D5，E10，A12，F(xiàn)4 G11，P12，D11或F4S競(jìng)爭(zhēng)的抗生腱蛋白C大同種型的抗體。與生腱蛋白C小同種型相比較，優(yōu)選這類抗體優(yōu)先結(jié)合生腱蛋白C大同種型。
本發(fā)明在另一個(gè)方面中提供了獲得一個(gè)或多個(gè)能夠結(jié)合抗原的特異性結(jié)合成員的方法，該方法包括使本發(fā)明的特異性結(jié)合成員文庫(kù)和所述的抗原接觸，并且篩選文庫(kù)中能夠結(jié)合所述抗原的一個(gè)或多個(gè)特異性結(jié)合成員。
文庫(kù)可以是展示在噬菌體顆粒的表面的，各顆粒含有編碼在其表面上展示的抗體VH可變結(jié)構(gòu)域的核酸，并且另外任選地展示的VL結(jié)構(gòu)域(如果存在的話)。
在選擇能夠結(jié)合抗原并且在噬菌體顆粒上展示的特異性結(jié)合成員后，可以從展示所述選擇的特異性結(jié)合成員的噬菌體顆粒中提取核酸。這類核酸可以用于隨后的特異性結(jié)合成員或抗體VH可變結(jié)構(gòu)域(任選抗體VL可變結(jié)構(gòu)域)的生產(chǎn)，所述的生產(chǎn)通過(guò)由具有取自展示所述選擇的特異性結(jié)合成員的噬菌體顆粒的核酸序列的核酸表達(dá)而進(jìn)行。
具有所述選擇的特異性結(jié)合成員的抗體VH可變結(jié)構(gòu)域氨基酸序列的抗體VH可變結(jié)構(gòu)域可以以分離的形式提供，也可以是作為包含這類VH結(jié)構(gòu)域的特異性結(jié)合成員的形式提供。
可以進(jìn)一步測(cè)試結(jié)合生腱蛋白C的能力，還可以測(cè)試與4A1-F16，3A1-D5，E10，A12，F(xiàn)4，G11，P12，D11或F4S競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合生腱蛋白C的能力。
本發(fā)明的特異性結(jié)合成員可以以4A1-F16，3A1-D5，E10，A12，F(xiàn)4，G11，P12，D11或F4S或中的一個(gè)或多個(gè)的親和力或以較大或較小親和力結(jié)合生腱蛋白C。
可以在適當(dāng)條件下比較不同特異性結(jié)合成員的結(jié)合親和力。
除抗體序列外，本發(fā)明的特異性結(jié)合成員還可以包括其它氨基酸，例如形成肽或多肽，例如折疊的結(jié)構(gòu)域的氨基酸，或除了結(jié)合抗原的能力之外，賦予該分子另一種功能性特征傳的氨基酸。
本發(fā)明的特異性結(jié)合成員可以攜帶可檢測(cè)標(biāo)記，例如有利于腫瘤檢測(cè)的試劑，例如放射性核素或熒光團(tuán)，或可以與能夠引起殺生物效果的試劑，例如放射性核素、光敏劑、藥物、細(xì)胞因子、前凝血因子、毒素或酶綴合(例如通過(guò)肽基鍵或接頭)，以用于治療。
本發(fā)明在另一個(gè)方面中提供了包含編碼本發(fā)明特異性結(jié)合成員的分離的核酸，本發(fā)明的VH或VL結(jié)構(gòu)域的序列，制備本發(fā)明的特異性結(jié)合成員，VH結(jié)構(gòu)域和/或VL結(jié)構(gòu)域的方法，該方法包括在使所述特異性結(jié)合成員，VH結(jié)構(gòu)域和/或VL結(jié)構(gòu)域產(chǎn)生的條件下表達(dá)所述的核酸并且回收它。
本文所述的特異性結(jié)合成員可以用于人或動(dòng)物體的治療或診斷方法，例如治療人類患者的疾病或病癥，特別是增殖性病癥，例如癌癥的方法(可以包括預(yù)防性治療)，該方法包括對(duì)所述的患者給予有效量的特異性結(jié)合成員。
本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了一般為分離的編碼本文披露的抗體VH可變結(jié)構(gòu)域和/或VL可變結(jié)構(gòu)域的核酸。
本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了一般為分離的編碼本文披露的VH CDR或VL CDR序列的核酸，所述的VH CDR或VL CDR序列尤其是選自SEQID NO 5，6，7，13，18，19，20，26和27的VH CDR或選自SEQ IDNO 8，9，10，21，22，23，32和33的VL CDR。
另一個(gè)方面提供了用本發(fā)明核酸轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
另一個(gè)方面提供了生產(chǎn)抗體VH可變結(jié)構(gòu)域的方法，該方法包括由編碼核酸產(chǎn)生表達(dá)。這類方法可以包括在生產(chǎn)所述抗體VH可變結(jié)構(gòu)域的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞。
還提供了用于生產(chǎn)包含VH和/或VL結(jié)構(gòu)域的VL可變結(jié)構(gòu)域和特異性結(jié)合成員的類似方法作為本發(fā)明的另一個(gè)方面。
生產(chǎn)方法可以包括分離和/或純化產(chǎn)物的步驟。
生產(chǎn)方法可以包括將產(chǎn)物配制成包括至少一種額外成分，例如藥學(xué)上可接受的賦形劑的組合物。
本發(fā)明的這些和其它方面在下文中進(jìn)一步詳細(xì)描述。
術(shù)語(yǔ)特異性結(jié)合成員該術(shù)語(yǔ)描述了彼此具有結(jié)合特異性的分子對(duì)中的成員。特異性結(jié)合對(duì)中的成員可以天然衍生或完全或部分合成產(chǎn)生。分子對(duì)中的一個(gè)成員在其表面上具有一定面積或腔，其特異性地結(jié)合于且由此與分子對(duì)中的另一個(gè)成員的特定空間和極性構(gòu)成互補(bǔ)。因此，該對(duì)中的成員具有彼此特異性結(jié)合的特性。特異性結(jié)合對(duì)的類型的實(shí)例為抗原-抗體，生物素-抗生物素蛋白，激素-激素受體，受體-配體，酶-底物。本申請(qǐng)涉及抗原-抗體類反應(yīng)。
抗體該術(shù)語(yǔ)描述了無(wú)論是天然，還是部分或完全合成產(chǎn)生的免疫球蛋白。該術(shù)語(yǔ)還涵蓋了具有抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域或基本上與之同源的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的任何多肽或蛋白質(zhì)?？贵w的實(shí)例為免疫球蛋白同種型及其同種型亞類；包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的片段，例如Fab、scFv、Fv、dAb、Fd；和雙抗體。也可以是用單克隆和其它抗體并使用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)保留原始抗體特異性的其它的抗體或嵌合分子。這類技術(shù)可以包括導(dǎo)入編碼免疫球蛋白可變區(qū)或不同免疫球蛋白的恒定區(qū)或恒定區(qū)加上框架區(qū)的抗體的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的DNA。例如，參見(jiàn)，EP-A-184187、GB 2188638A或EP-A-239400。可以使產(chǎn)生抗體的雜交瘤或其它細(xì)胞進(jìn)行遺傳突變或其它改變，它們可以改變產(chǎn)生的抗體的結(jié)合特異性，也可以不改變產(chǎn)生的抗體的結(jié)合特異性。
抗體可以用多種方式修飾，應(yīng)將術(shù)語(yǔ)“抗體”解釋為包括任何具有具備所需特異性的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的特異性結(jié)合成員或物質(zhì)。因此，該術(shù)語(yǔ)包括抗體的抗體片段、衍生物、功能等效物和同源物，包括包含免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的任何多肽，無(wú)論是天然的還是完全或部分合成的。由此包括包含與另一種多肽融合的免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域或等效物的嵌合分子?？贵w的克隆和表達(dá)描述在EP-A-0120694和EP-A-0125023中。
已經(jīng)證實(shí)完整抗體的片段可以執(zhí)行結(jié)合抗原的功能。結(jié)合片段的實(shí)例為(i)由VL、VH、CL和CH1結(jié)構(gòu)域組成的Fab片段；(ii)由VH和CH1結(jié)構(gòu)域組成的Fd片段；(iii)由單一抗體的VL和VH結(jié)構(gòu)域組成的Fv片段；(iv)由VH結(jié)構(gòu)域組成的dAb片段(Ward，E.S.等Nature 341，544-546(1989))；(v)分離的CDR區(qū)；(vi)F(ab′)2片段，即一種包含兩個(gè)Fab片段的二價(jià)片段；(vii)單鏈Fv分子(scFv)，其中VH結(jié)構(gòu)域和VL結(jié)構(gòu)域通過(guò)使得兩種結(jié)構(gòu)域結(jié)合成抗原結(jié)合部位的肽接頭連接(Bird等，Science，242，423-426，1988；Huston等，PNAS USA，85，5879-5883，1988)；(viii)雙特異性單鏈Fv二聚體(PCT/US92/09965)；和(ix) “雙抗體”，即通過(guò)基因融合構(gòu)建的多價(jià)或多特異性片段(WO94/13804；P.Holliger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 906444-6448，1993)。Fv、scFv或雙抗體分子可以通過(guò)摻入連接VH和VL結(jié)構(gòu)域的二硫鍵來(lái)穩(wěn)定(Y.Reiter等Nature Biotech 14 1239-1245 1996)。還制備了包含與CH3結(jié)構(gòu)域連接的scFv的Minibodies(S.Hu等，Cancer Res.56 305 5-30611996)。
雙抗體(diabody)為多肽類的多聚體，多肽各自包括包含免疫球蛋白輕鏈結(jié)合區(qū)的第一結(jié)構(gòu)域和包含免疫球蛋白重鏈結(jié)合區(qū)的第二結(jié)構(gòu)域，這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域是連接的(例如通過(guò)肽接頭)，但不能彼此結(jié)合成抗原結(jié)合部位抗原結(jié)合部位通過(guò)多聚體中的一個(gè)多肽的第一結(jié)構(gòu)域與多聚體內(nèi)的另一個(gè)多肽的第二結(jié)構(gòu)域結(jié)合而形成(WO94/13804)。
如果使用雙特異性抗體，那么它們可以為可以按照各種方式制備，例如以化學(xué)方式或由雜種雜交瘤制備的常用的雙特異性抗體(Holliger，P.和Winter G.Current Opinion Biotechnol.4，446-449(1993))或可以為上述雙特異性抗體片段中的任何一種。可以僅使用可變結(jié)構(gòu)域構(gòu)建不含F(xiàn)c區(qū)的雙抗體和scFv，從而能夠減少抗獨(dú)特型反應(yīng)的作用。
與雙特異性完整抗體相反，雙特異性雙抗體也可能特別有用，因?yàn)樗鼈円子跇?gòu)建并且在大腸桿菌中表達(dá)。易于使用來(lái)自文庫(kù)的噬菌體展示(WO94/13804)選擇具有適當(dāng)?shù)慕Y(jié)合特異性的雙抗體(和許多其它多肽類，例如抗體片段)。例如，如果抗體的一條臂保持指向抗原X的特異性恒定，那么可以制作另一條臂可變的文庫(kù)，然后選擇具有適當(dāng)特異性的抗體?？梢酝ㄟ^(guò)結(jié)進(jìn)孔(knobs-into-holes)工程制備雙特異性完整抗體(J.B.B.Ridgeway等，Protein Eng.9616-621，1996)。
抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域該術(shù)語(yǔ)描述了包含特異性結(jié)合抗原的部分或整體并且與之互補(bǔ)的區(qū)的抗體部分。如果抗原較大，那么抗體可能僅結(jié)合抗原的特定部分，該部分稱作表位。抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以由一個(gè)或多個(gè)抗體可變結(jié)構(gòu)域提供(例如，所謂的由VH結(jié)構(gòu)域組成的Fd抗體片段)。優(yōu)選抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含抗體輕鏈可變區(qū)(VL)和抗體重鏈可變區(qū)(VH)。
特異性該術(shù)語(yǔ)指特異性結(jié)合對(duì)中的一個(gè)成員不會(huì)對(duì)任何它的特異性結(jié)合伴侶之外的分子表現(xiàn)出顯著的結(jié)合的狀態(tài)。例如，對(duì)生腱蛋白C具有特異性的抗體表現(xiàn)出很弱的或者沒(méi)有對(duì)胞外基質(zhì)的其它成分，例如纖連蛋白的結(jié)合。類似地，對(duì)生腱蛋白C大同種型具有特異性的抗體表現(xiàn)出很弱的或未表現(xiàn)出對(duì)生腱蛋白C小同種型的結(jié)合。該術(shù)語(yǔ)還有另外的應(yīng)用，其中，例如抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)芏鄠€(gè)抗原所攜帶的特定表位具有特異性，在這種情況中，攜帶抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的特異性結(jié)合成員將能夠結(jié)合攜帶所述表位的各種抗原。
包含該術(shù)語(yǔ)一般以包括的含義使用，即允許一個(gè)或多個(gè)特征或成分存在。
分離的該術(shù)語(yǔ)是指本發(fā)明的特異性結(jié)合成員或編碼這類結(jié)合成員的核酸的狀態(tài)將符合本發(fā)明。成員和核酸為游離的或基本上不含它們與之天然結(jié)合的物質(zhì)，例如它們?cè)谄涮烊画h(huán)境或通過(guò)在體外或體內(nèi)實(shí)施重組DNA技術(shù)進(jìn)行制備時(shí)的環(huán)境中(例如細(xì)胞培養(yǎng)物)被發(fā)現(xiàn)的與之結(jié)合的其它多肽類或核酸?？梢允褂糜糜诜蛛x的實(shí)際目的的稀釋劑或佐劑配制成員和核酸，例如，一般會(huì)將所述的成員與明膠或其它載體混合，如果將它們用于包被用來(lái)免疫測(cè)定的微量滴定板，或在用于診斷或療法時(shí)將它們與藥學(xué)上可接受的載體或稀釋混合的話。特異性結(jié)合成員可以是天然或通過(guò)異源真核細(xì)胞系統(tǒng)(例如CHO或NS0(ECACC85110503)細(xì)胞)糖基化的，或它們可以是非糖基化的(例如如果通過(guò)在原核細(xì)胞中表達(dá)產(chǎn)生)。
所謂“基本上如所示的”是指本發(fā)明的相關(guān)CDR或VH或VL結(jié)構(gòu)域與如本文所示的指定區(qū)域的序列相同或非常類似?！胺浅ｎ愃啤笨梢暈榭稍贑DR和/或VH或VL結(jié)構(gòu)域中進(jìn)行1-5個(gè)，優(yōu)選1-4個(gè)，例如1-3或1或2或3或4個(gè)取代。
攜帶本發(fā)明CDR的結(jié)構(gòu)一般是抗體的重鏈或輕鏈序列或其主要部分，其中CDR位于相當(dāng)于天然存在的由重排免疫球蛋白基因編碼的VH和VL抗體可變結(jié)構(gòu)域的CDR的位置上?？梢詤⒄?Kabat，E.A.等，Sequences of Proteins of Immunological Interest.4th Edition.US Department of Health and Human Services.1987，及其補(bǔ)充的最新資料，目前可以在互聯(lián)網(wǎng)上得到(http://immuno.bme.nwu.edu))測(cè)定免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)和位置。
優(yōu)選在人可變結(jié)構(gòu)域或其主要部分中攜帶基本上如本文所示的CDR氨基酸序列作為CDR。
可以由任何種系或重排的人的可變結(jié)構(gòu)域獲得用于本發(fā)明的可變結(jié)構(gòu)域，或其可以為基于已知的人可變結(jié)構(gòu)域的共有序列的合成可變結(jié)構(gòu)域。可以使用重組DNA技術(shù)將本發(fā)明的CDR序列(例如CDR1、CDR2或CDR3)導(dǎo)入缺乏CDR(例如相應(yīng)的CDR1、CDR2或CDR3)的可變結(jié)構(gòu)域的常在性組成中(repertoire)。
例如，Marks等(Bio/Technology，1992，10779-783)描述了生產(chǎn)抗體可變結(jié)構(gòu)域的常在性組成的方法，其中指向或鄰近于可變結(jié)構(gòu)域區(qū)的5′末端的共有引物用于連接人VH基因第三框架區(qū)的共有引物，以提供缺乏CDR3的VH可變結(jié)構(gòu)域。Marks等進(jìn)一步描述了如何將這種常在性組成與特定抗體的CDR3結(jié)合。使用類似技術(shù)，可以使用缺乏CDR的VH或VL結(jié)構(gòu)域常在性組成改組的本發(fā)明的CDR衍生的序列，并且可以將完成改組的VH或VL結(jié)構(gòu)域與同源的VL或VH結(jié)構(gòu)域結(jié)合成本發(fā)明的特異性結(jié)合成員。然后可以在合適的宿主系統(tǒng)，例如WO92/01047的噬菌體展示系統(tǒng)中展示常在性組成，以選擇合適的特異性結(jié)合成員。常在性組成可以由來(lái)自104個(gè)以上的各成員，例如106-108或1010個(gè)成員的任何個(gè)組成。
類似的改組或重組技術(shù)還由Stemmer(Nature，1994，370389-391)披露，他描述了與β-內(nèi)酰胺酶基因相關(guān)的技術(shù)，并且觀察到這種手段可以用于抗體的生成。
另一種備選是產(chǎn)生攜帶本發(fā)明CDR-衍生的序列的新VH或VL區(qū)，其是通過(guò)在完整可變結(jié)構(gòu)域內(nèi)對(duì)一個(gè)或多個(gè)選擇的VH和/或VL基因使用隨機(jī)誘變以產(chǎn)生突變而得到的。這類技術(shù)由Gram等(1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，893576-3580)描述，他使用了易錯(cuò)PCR。
可以使用的另一種方法對(duì)VH或VL基因的CDR區(qū)進(jìn)行定向誘變。這類技術(shù)由Barbas等(1994，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，913809-3813)和Schier等(1996，J.Mol.Biol.263551-567)披露。
所有上述技術(shù)照此在本領(lǐng)域中均為已知的并且其自身并不構(gòu)成本發(fā)明的組成部分。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠應(yīng)用這類技術(shù)來(lái)使用本領(lǐng)域中的常規(guī)方法提供本發(fā)明的特異性結(jié)合成員。
本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了用于獲得對(duì)生腱蛋白C具有特異性的抗體抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的方法，該方法包括通過(guò)在本文所示的VH結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列中添加、缺失、取代或插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸提供了作為VH結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列變體的VH結(jié)構(gòu)域；任選將由此提供的VH結(jié)構(gòu)域與一個(gè)或多個(gè)VL結(jié)構(gòu)域結(jié)合，并且測(cè)試VH結(jié)構(gòu)域或VH/VL的組合或多種組合以鑒定對(duì)生腱蛋白C具有特異性的特異性結(jié)合成員或抗體抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。所述的VL結(jié)構(gòu)域可以具有基本上如本文所示的氨基酸序列。
在某些實(shí)施方案中，可以向VH結(jié)構(gòu)域的一個(gè)或多個(gè)CDR，例如CDR1、CDR2和/或CDR3中添加、缺失、取代或插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸。
可以使用類似的方法，包括通過(guò)在本文所示的VL結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列中添加、缺失、取代或插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸以提供作為VL結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列變體的VL結(jié)構(gòu)域；將由此提供的VL結(jié)構(gòu)域與一個(gè)或多個(gè)VH結(jié)構(gòu)域結(jié)合，并且測(cè)試VH結(jié)構(gòu)域或VH/VL的組合或多種組合以鑒定對(duì)生腱蛋白C具有特異性的特異性結(jié)合成員或抗體抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。所述的VH結(jié)構(gòu)域可以具有基本上如本文所示的氨基酸序列，或可以為基本上如本文所示的如上所述獲得的VH結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列變體。
在某些實(shí)施方案中，可以向VL結(jié)構(gòu)域的一個(gè)或多個(gè)CDR中添加、缺失、取代或插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸。
本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了制備對(duì)生腱蛋白C具有特異性的特異性結(jié)合成員的方法，該方法包括(a)提供編碼VH結(jié)構(gòu)域的起始常在性組成的核酸，所述的VH結(jié)構(gòu)域包括將被取代的CDR或缺乏CDR編碼區(qū)；(b)將所述的常在性組成與編碼基本上如本文所所示的用于VHCDR的氨基酸序列的供體核酸結(jié)合，以便將所述的供體核酸插入常在性組成中的CDR區(qū)，從而提供編碼VH結(jié)構(gòu)域的常在性組成產(chǎn)物的核酸；(c)表達(dá)所述常在性組成產(chǎn)物的核酸；
(d)選擇特異于生腱蛋白C抗原的特異性結(jié)合成員；和(e)回收所述的特異性結(jié)合成員或編碼它的核酸。
CDR可以為VH CDR1、CDR2或CDR3。
此外，可以使用類似的方法，其中將本發(fā)明的VL CDR與編碼VL結(jié)構(gòu)域的核酸的常在性組成結(jié)合，所述的VL結(jié)構(gòu)域包括將被取代的CDR或缺乏CDR編碼區(qū)。
CDR可以為VL CDR1、CDR2或CDR3。
類似地，可以將一個(gè)或多個(gè)或所有三個(gè)CDR移植入VH或VL結(jié)構(gòu)域的常在性組成中，所述的VH或VL結(jié)構(gòu)域然后用于篩選特異性結(jié)合成員或?qū)ι斓鞍證，特別是生腱蛋白C大同種型具有特異性的特異性結(jié)合成員。
免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域的主要部分包含至少三種CDR區(qū)域和間隔框架區(qū)。優(yōu)選該部分還包括第一和第四框架區(qū)各自的至少約50％或它們兩者，其中50％為50％的第一框架區(qū)的C-末端和50％的第四框架區(qū)的N-末端。可變結(jié)構(gòu)域主要部分的N-末端或C-末端上的額外殘基可以為并非通常與天然存在的可變結(jié)構(gòu)域區(qū)結(jié)合的那些殘基。例如，通過(guò)重組DNA技術(shù)來(lái)構(gòu)建本發(fā)明特異性結(jié)合成員可以導(dǎo)致引入NB或編碼接頭的C-末端殘基，以便于克隆或其它操作步驟。其它操作步驟包括引入接頭以便如下文更詳細(xì)描述的將本發(fā)明的可變結(jié)構(gòu)域與另一種蛋白質(zhì)序列，包括免疫球蛋白重鏈、其它可變結(jié)構(gòu)域(例如在雙抗體生產(chǎn)中)或蛋白質(zhì)標(biāo)記連接。
盡管在本發(fā)明的優(yōu)選方面中，優(yōu)選包含VH和VL結(jié)構(gòu)域?qū)Φ奶禺愋越Y(jié)合成員，但是基于VH或VL結(jié)構(gòu)域序列的單一結(jié)合結(jié)構(gòu)域(singlebinding domain)形成本發(fā)明的另一個(gè)方面。已知單一免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域，尤其是VH結(jié)構(gòu)域能夠以特異性方式結(jié)合靶抗原。
就單鏈特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域的情況而言，這些結(jié)構(gòu)域可以用于篩選能夠形成能與生腱蛋白C結(jié)合的雙結(jié)構(gòu)域(two-domain)特異性結(jié)合成員的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域。
可以通過(guò)使用WO92/01047中披露的所謂的分級(jí)雙重組合手段(hierarchical dual combinatorial approach)的噬菌體展示篩選方法實(shí)現(xiàn)這一目的，其中將含有單獨(dú)的H或L鏈的各菌落用于感染編碼另一條鏈(L或H)的克隆的完整文庫(kù)，然后按照噬菌體展示技術(shù)，例如參考文獻(xiàn)中所述的那些技術(shù)對(duì)所得到的雙鏈特異性結(jié)合成員進(jìn)行選擇。這種技術(shù)也披露在Marks等上文的相同文獻(xiàn)中。
本發(fā)明的特異性結(jié)合成員可以進(jìn)一步包括抗體恒定區(qū)或其部分。例如，VL結(jié)構(gòu)域可以在其C-末端上與包括人Cκ或Cλ鏈，優(yōu)選Cλ鏈的抗體輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域結(jié)合。類似地，基于VH結(jié)構(gòu)域的特異性結(jié)合成員可以在其C-末端與來(lái)源于任何抗體同種型，例如IgG、IgA、IgE和IgM和任何該同種型的亞類，特別是IgG1和IgG4的免疫球蛋白重鏈的全部或部分結(jié)合。
可以用可檢測(cè)的或功能性的標(biāo)記來(lái)標(biāo)記本發(fā)明的特異性結(jié)合成員。
可檢測(cè)標(biāo)記可以包括放射性核素，例如碘-131、釔-90、銦-111和锝-99，可以使用抗體成像領(lǐng)域中已知的常規(guī)化學(xué)方法使其與本發(fā)明的抗體結(jié)合。用放射性同位素標(biāo)記的特異性結(jié)合成員可以用于將放射物選擇性地遞送至具體的靶標(biāo)，例如腫瘤。它可以用于如下所述使腫瘤成像或遞送毒性劑量的射線。
其它可檢測(cè)標(biāo)記可以包括酶標(biāo)記，例如辣根過(guò)氧化物酶；化學(xué)部分，例如生物素可以通過(guò)結(jié)合特異性相關(guān)的可檢測(cè)部分，例如抗生物素蛋白檢測(cè)；熒光染料，例如熒光素、羅丹明、藻紅蛋白；和德克薩斯紅和近紅外熒光團(tuán)，包括花菁染料衍生物，例如Cy7(AmershamPharmacia)和Alexa750(Molecular probes)。
在其它實(shí)施方案中，可檢測(cè)標(biāo)記可以包括可通過(guò)超聲檢測(cè)的微氣泡衍生物(Joseph S等Pharm Res.2004 Jun；21(6)920-6)或磁性顆粒(Schellenberger EA等Bioconjug.Chem.2004 9月-10月；15(5)1062-7)。
功能性標(biāo)記可以包括能夠引發(fā)殺生物事件或具有抗癌作用的制劑。合適的標(biāo)記包括放射性核素、光敏劑、毒素多肽類、毒性小分子和其它藥物、細(xì)胞因子(例如IL2、IL12、TNF)、趨化因子、前凝血因子(例如組織因子)、酶、脂質(zhì)體和免疫應(yīng)答因子(例如，參見(jiàn)D.Neri(2004)CHIMIA “Tumor Targeting”vol.58，723-726頁(yè))。
放射性核素包括碘-131、釔-90、銦-111和锝-99并且再前述中已經(jīng)進(jìn)行了具體的描述。
毒素多肽或肽具有細(xì)胞毒性或細(xì)胞凋亡活性并且可以來(lái)源于微生物、植物、動(dòng)物或人體來(lái)源。在某些實(shí)施方案中，可以將毒素多肽直接插入特異性結(jié)合成員的恒定區(qū)。毒素多肽類的實(shí)例包括假單胞菌屬外毒素、蓖麻毒素α-鏈和血管生成素。
毒性小分子包括具有細(xì)胞毒性活性的化學(xué)化合物，包括，例如，DNA-復(fù)合劑或細(xì)胞周期抑制劑。在某些實(shí)施方案中，可以通過(guò)裂解pH-或酶-敏感性接頭(例如含有亞胺鍵的接頭)在靶細(xì)胞附近釋放毒性小分子。毒性小分子的實(shí)例包括美登素、calicheamicin、埃坡霉素和異煙肼及其衍生物。
免疫應(yīng)答因子可以包括結(jié)合效應(yīng)細(xì)胞的特異性結(jié)合成員。特異性結(jié)合成員的結(jié)合可以引起對(duì)靶細(xì)胞的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的特異性結(jié)合成員與細(xì)胞因子綴合?？梢陨a(chǎn)包含特異性結(jié)合成員或其多肽成分(例如抗體的重鏈或輕鏈或多鏈抗體片段，例如Fab)和細(xì)胞因子的融合蛋白。因此，例如，本發(fā)明特異性結(jié)合成員的VH結(jié)構(gòu)域或VL結(jié)構(gòu)域可以與細(xì)胞因子融合。一般而言，特異性結(jié)合成員或其成分和細(xì)胞因子通過(guò)肽接頭，例如約5-25個(gè)殘基的肽，例如10-20個(gè)殘基，優(yōu)選約15個(gè)殘基連接。本文中給出了合適的肽接頭的實(shí)例。優(yōu)選細(xì)胞因子為IL2，更優(yōu)選為人IL2。細(xì)胞因子可以為融合的特異性結(jié)合成員或其多肽成分的上游(N-末端)或下游(C-末端)。優(yōu)選的實(shí)施方案為包含本發(fā)明特異性結(jié)合成員(尤其是抗體分子，例如scFv分子)和IL2的融合蛋白。這類融合蛋白的氨基酸序列和包含編碼它們的核苷酸序列的核酸構(gòu)成了本發(fā)明的組成部分。
本發(fā)明的特異性結(jié)合成員可以用于診斷方法，例如腫瘤成像或用于治療人或動(dòng)物受試者，例如用于治療癌癥情況。
因此，本發(fā)明的額外方面提供了包括給予提供的特異性結(jié)合成員的治療方法，包含這類特異性結(jié)合成員的藥物組合物和這類特異性結(jié)合成員在制備給藥用藥劑，例如在制備包含用藥學(xué)上可接受的賦形劑配制的特異性結(jié)合成員的藥劑或藥物組合物中的應(yīng)用。
用于治療方法的特異性結(jié)合成員優(yōu)選與引起抗腫瘤作用的功能性標(biāo)記綴合或與之連接。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，如上所述，特異性結(jié)合成員與細(xì)胞因子，例如IL2綴合或與之連接。
如本文所述的特異性結(jié)合成員可以用于提供治療有益作用的臨床適應(yīng)征包括增殖性病癥，例如惡變前和惡性贅生物和腫瘤(例如組織細(xì)胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、星細(xì)胞瘤、骨瘤)、癌(例如肺癌、小細(xì)胞肺癌、胃腸癌、腸癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、睪丸癌、肝癌、腎癌、膀胱癌、胰腺癌、腦癌、肉瘤、骨肉瘤、卡波西肉瘤、黑素瘤)、白血病和血管生成疾病。
惡變前或惡變情況可以在任何細(xì)胞類型中發(fā)生，包括，但不限于肺、結(jié)腸、乳腺、卵巢、前列腺、肝、胰腺、腦和皮膚。
適合于如本文所述的治療的增殖性病癥的特征在于存在生腱蛋白C大同種型，特別是包含A1或C結(jié)構(gòu)域的大同種型表達(dá)增加或升高的細(xì)胞或組織。
可以對(duì)個(gè)體給予本發(fā)明提供的組合物。優(yōu)選以“治療有效量”給藥，它足以表現(xiàn)出對(duì)患者的有益作用。這類有益作用可以至少是改善至少一種癥狀。實(shí)際的給藥量和給藥時(shí)間過(guò)程取決于所治療情況的性質(zhì)和嚴(yán)重程度。治療處方，例如有關(guān)劑量的決定等屬于一般從業(yè)醫(yī)師和其他醫(yī)生的能力范圍。合適的抗體劑量為本領(lǐng)域眾所周知的；參見(jiàn)Ledermann J.A.等(1991)Int J.Cancer 47659-664；Bagshawe K.D.等(1991)Antibody，Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals4915-922。
精確劑量取決于許多因素，包括抗體是用于診斷，還是用于治療，所治療的面積大小和位置，抗體的確切性質(zhì)(例如完整抗體，片段或雙抗體)和與抗體結(jié)合的任何可檢測(cè)標(biāo)記或其它分子的性質(zhì)。用于全身施用的典型抗體劑量在0.5mg-100g，并且用于局部施用的典型抗體劑量為10μg-1mg。一般而言，抗體為完整抗體，優(yōu)選IgG1或IgG4同種型。這是用于單一治療成年患者的劑量，可以針對(duì)兒童和嬰兒按比例調(diào)整，并且還可以為其它抗體形式按照與分子量的比例調(diào)整?？梢愿鶕?jù)臨床醫(yī)師的判斷，以每天，每周兩次，每周或每月間隔反復(fù)治療。
通常以藥物組合物的形式給予本發(fā)明的特異性結(jié)合成員，該藥物組合物可以包含至少一種成分與特異性結(jié)合成員。
因此，本發(fā)明的藥物組合物和本發(fā)明的應(yīng)用除包括活性組分外，還可以包括藥學(xué)上可接受的賦形劑、載體、緩沖劑、穩(wěn)定劑或其它本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的物質(zhì)。這類物質(zhì)應(yīng)是無(wú)毒性的并且不應(yīng)干擾活性組分的功效。載體或其它物質(zhì)的確切性質(zhì)取決于給藥途徑，可以是口服或通過(guò)注射，例如靜脈內(nèi)。
口服給藥用的藥物組合物可以為片劑、膠囊、粉末或液體形式。片劑可以包含固體載體，例如明膠或佐劑。液體藥物組合物一般包含液體載體，例如水、凡士林、動(dòng)物或植物油、礦物油或合成油?？梢园ㄉ睇}水溶液、葡萄糖或其它糖溶液，或乙二醇類，例如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。
為了靜脈內(nèi)注射或注射在患病部位，活性組分可以為無(wú)熱原并且具有合適的pH、等滲性和穩(wěn)定性的非腸道可接受的水溶液形式。相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)人員能夠很好地使用例如等滲媒介物，例如，例如氯化鈉注射液、乳酸鹽林格注射液制備合適的溶液。如果需要，可以包括防腐劑、穩(wěn)定劑、緩沖劑、抗氧化劑和/或其它添加劑。
可以單獨(dú)或與其它治療方法同時(shí)或依次給予組合物，這取決于所治療的疾病。其它治療可以包括給予合適劑量的疼痛緩解藥物，例如非類固醇抗炎藥(例如阿司匹林、對(duì)乙酰氨基酚、布洛芬或酮洛芬)或阿片類物質(zhì)，例如嗎啡或止吐藥。
本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了檢測(cè)和/或成像腫瘤細(xì)胞的方法，包括對(duì)個(gè)體給予如本文所述的抗體并且檢測(cè)所述抗體與所述個(gè)體腫瘤細(xì)胞的結(jié)合。
用于這類方法的優(yōu)選抗體可以與可檢測(cè)標(biāo)記，例如放射性核素或熒光團(tuán)綴合或與之連接。
本發(fā)明的方法可以包括導(dǎo)致或允許如本文提供的特異性結(jié)合成員與生腱蛋白C結(jié)合。正如注意到的，這類結(jié)合例如可以在給予特異性結(jié)合成員或編碼特異性結(jié)合成員的核酸后在體內(nèi)進(jìn)行。
可以測(cè)定特異性結(jié)合成員與生腱蛋白C結(jié)合的量。在某些實(shí)施方案中，可以測(cè)定特異性結(jié)合成員與獲自個(gè)體的樣品結(jié)合。在其它實(shí)施方案中，例如，可以在對(duì)個(gè)體體內(nèi)的腫瘤成像或檢測(cè)過(guò)程中測(cè)定體內(nèi)特異性結(jié)合成員與抗原的結(jié)合。
可以定量與可能與診斷目的有關(guān)的抗原的量。
可以提供任何合適的方式測(cè)定抗體的結(jié)合。例如，可以使抗體與報(bào)導(dǎo)分子或可檢測(cè)標(biāo)記連接或與之綴合，然后對(duì)樣品測(cè)定所述標(biāo)記或報(bào)導(dǎo)分子的存在、量或定位。
可以測(cè)定體內(nèi)抗體結(jié)合，例如在分子成像方法可以通過(guò)放射性檢測(cè)(例如PET，SPECT)，近紅外熒光成像(例如發(fā)散性光學(xué)斷層攝影術(shù)，內(nèi)窺鏡檢查)，超聲(例如使用靶向的微氣泡衍生物和MRI(使用靶向的磁性顆粒)進(jìn)行測(cè)定。
在其它實(shí)施方案中抗體結(jié)合可以在體外進(jìn)行，例如，可以在ELISA，蛋白質(zhì)印跡，免疫細(xì)胞化學(xué)，免疫沉淀或親和色譜法中進(jìn)行。
檢測(cè)和/或成像腫瘤細(xì)胞的方法由此可以包括使如本文所述的抗體接觸獲自個(gè)體的樣品并且檢測(cè)所述抗體與所述樣品中腫瘤細(xì)胞的結(jié)合。
用于這類體外方法的優(yōu)選抗體可以與報(bào)導(dǎo)分子綴合或與之連接。報(bào)導(dǎo)分子可以為具有光譜分離吸收或發(fā)射特征放射性核素、熒光染料、磷光體或激光染料。合適的熒光染料包括熒光素、羅丹明、藻紅蛋白和德克薩斯紅。合適的發(fā)色染料包括二氨基聯(lián)苯。就體內(nèi)成像而言，優(yōu)選放射性核素或熒光團(tuán)。
其它報(bào)導(dǎo)分子包括大分子膠體顆?；蝾w粒物質(zhì)，例如著色的磁性或順磁性膠乳珠和可以直接或間接產(chǎn)生目視觀察到的、電檢測(cè)到的，否則就是可記錄的可檢測(cè)信號(hào)的和生物或化學(xué)制劑。這些分子可以為酶，例如，它們可以催化顯色或改變顏色或?qū)е码娞匦愿淖兊姆磻?yīng)。它們可以為分子可激發(fā)的，使得能量狀態(tài)之間的電子躍遷產(chǎn)生光譜吸收或發(fā)射。它們可以包括用于與生物傳感器結(jié)合的化學(xué)本體?？梢允褂蒙锼?抗生物素蛋白或生物素/鏈霉抗生物素和堿性磷酸酶檢測(cè)系統(tǒng)。
測(cè)定結(jié)合的方式并非本發(fā)明的特征，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠根據(jù)參考文獻(xiàn)和一般知識(shí)選擇合適的方式。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及與任何特異性結(jié)合成員競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合生腱蛋白C的特異性結(jié)合成員，二者都結(jié)合生腱蛋白C，其包含包括具有基本上如本文所示的氨基酸的CDR的V結(jié)構(gòu)域或者具有基本上如本文所示的氨基酸序列的V結(jié)構(gòu)域(例如如本文所示的特異性結(jié)合成員)。結(jié)合成員之間的競(jìng)爭(zhēng)可以很容易地在體外進(jìn)行測(cè)定，例如，用特異性的報(bào)道分子標(biāo)記一個(gè)結(jié)合成員，在其他未標(biāo)記的結(jié)合成員的存在下對(duì)標(biāo)記的分子進(jìn)行檢測(cè)，從而能夠鑒定結(jié)合于相同表位或重疊表位的特異性結(jié)合成員?？梢允褂脴?biāo)準(zhǔn)技術(shù)，例如ELISA測(cè)定競(jìng)爭(zhēng)。
在測(cè)試競(jìng)爭(zhēng)的過(guò)程中，可以使用抗原的肽片段，尤其是包括所關(guān)注的表位的肽?？梢允褂迷谌我荒┒松霞由弦粋€(gè)或多個(gè)氨基酸的具有表位序列的肽。這類肽可以說(shuō)成是“主要由”指定的序列組成。本發(fā)明的特異性結(jié)合成員對(duì)抗原的結(jié)合可以被具有指定序列或包括指定序列的肽所抑制。在測(cè)試它的過(guò)程中，可以使用具有任一序列再加上一個(gè)或多個(gè)氨基酸的肽。合適的肽類可以獲自生腱蛋白C的D、C和/或A1結(jié)構(gòu)域的序列。
結(jié)合特異性肽的特異性結(jié)合成員可以通過(guò)例如，用肽(類)篩選噬菌體展示文庫(kù)而被分離出來(lái)。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了編碼本發(fā)明特異性結(jié)合成員的分離的核酸。核酸包括DNA和RNA。本發(fā)明在優(yōu)選的方面中提供了編碼如上述定義的本發(fā)明CDR或VH或VL結(jié)構(gòu)域的核酸。
本發(fā)明還提供了包含至少一種上述多核苷酸的質(zhì)粒、載體、轉(zhuǎn)錄或者表達(dá)盒的構(gòu)建體。
本發(fā)明還提供了包含一個(gè)或多個(gè)上述構(gòu)建體的重組宿主細(xì)胞。當(dāng)實(shí)施生產(chǎn)編碼的產(chǎn)物的方法時(shí)，編碼任何的CDR、VH或VL結(jié)構(gòu)域的核酸或作為所提供的特異性結(jié)合成員本身構(gòu)成了本發(fā)明的一方面的內(nèi)容，該方法包括從編碼其核酸進(jìn)行的表達(dá)?？梢员憷卦谶m當(dāng)條件下培養(yǎng)含有所述核酸的重組宿主細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)。在提供表達(dá)生產(chǎn)后，可以使用任何合適的技術(shù)分離和/或純化VH或VL結(jié)構(gòu)域或特異性結(jié)合成員，然后根據(jù)需要使用。
例如，可以從天然環(huán)境中提供，分離和/或純化基本上純的或均質(zhì)形式的本發(fā)明的特異性結(jié)合成員，VH和/或VL結(jié)構(gòu)域和編碼核酸的分子和載體，或在核酸的情況下，除了編碼具有需要的功能的多肽的序列外，不含或基本上不含核酸或基因來(lái)源。本發(fā)明的核酸可以包含DNA或RNA，并且可以全部或部分是合成的。除非上下文中另作要求，否則涉及的本文所述的核苷酸序列包括具有特定序列的DNA分子，并且包括具有特定序列的RNA分子，其中U取代T。
用于克隆和表達(dá)各種不同宿主細(xì)胞的中的多肽的系統(tǒng)是眾所周知的。合適的宿主細(xì)胞包括細(xì)菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、酵母和桿狀病毒系統(tǒng)。本領(lǐng)域中可利用表達(dá)異源多肽的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，包括中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞、Hala細(xì)胞、幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞、NSO小鼠黑素瘤細(xì)胞等。通常優(yōu)選的細(xì)菌宿主為大腸桿菌。
本領(lǐng)域中充分確立了抗體和抗體片段在原核細(xì)胞，例如大腸桿菌中的表達(dá)。就綜述而言，例如，參見(jiàn)Plückthun，A.Bio/Technology9545-551(1991)。本領(lǐng)域技術(shù)人員還可以選擇利用在培養(yǎng)物中的真核細(xì)胞的表達(dá)生產(chǎn)特異性結(jié)合成員，就近期綜述而言，例如，參見(jiàn)Ref，M.E.(1993)Curr.Opinion Biotech.4573-576；Trill J.J.等(1995)Curr.Opinion Biotech 6553-560。
可以選擇或構(gòu)建合適的載體，它們含有合適的調(diào)節(jié)序列，包括啟動(dòng)子序列、終止子序列、聚腺苷酸化序列、增強(qiáng)子序列、標(biāo)記基因和如果合適的其它序列。如果合適，載體可以為質(zhì)粒，病毒，例如，噬菌體或噬菌粒。就進(jìn)一步詳細(xì)內(nèi)容而言，例如，參見(jiàn)Molecular Cloninga Laboratory Manual2nd edition，Sambrook等，1989，Cold SpringHarbor Laboratory Press。在操作核酸，例如在制備核酸構(gòu)建體、誘變、測(cè)序、將DNA導(dǎo)入細(xì)胞和基因表達(dá)和蛋白質(zhì)分析中的任何已知技術(shù)和方案具體地描述在Molecular Biology，Second Edition，Ausubel等eds.，John Wiley&Sons，1992中。將Sambrook等和Ausubel等披露的內(nèi)容引入本文作為參考。
因此，本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了含有如本文所披露的核酸的宿主細(xì)胞。另一個(gè)方面提供了包含將這類核酸導(dǎo)入宿主細(xì)胞的方法。導(dǎo)入可以使用任何可利用的技術(shù)。就真核細(xì)胞而言，合適的技術(shù)可以包括磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE-葡聚糖、電穿孔、使用逆轉(zhuǎn)錄病毒或其它病毒，例如牛痘，或?qū)ハx細(xì)胞而言使用桿狀病毒的脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)導(dǎo)。就細(xì)菌細(xì)胞而言，合適的技術(shù)可以包括氯化鈣轉(zhuǎn)化、電穿孔和使用噬菌體轉(zhuǎn)染。
導(dǎo)入后可以例如通過(guò)在用于基因表達(dá)的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞，從而導(dǎo)致或允許由核酸表達(dá)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，將本發(fā)明的核酸整合入宿主細(xì)胞基因組(例如染色體)?？梢园凑諛?biāo)準(zhǔn)技術(shù)，通過(guò)包含促進(jìn)與所述基因組重組的序列促進(jìn)整合。
本發(fā)明還提供了一種方法，該方法包括在表達(dá)系統(tǒng)中使用如上所述的構(gòu)建體以便表達(dá)上述特異性結(jié)合成員或多肽。
本發(fā)明的其它方法包括使如本文所述的特異性結(jié)合成員與可檢測(cè)標(biāo)記或抗癌劑綴合或與之連接。
合適的標(biāo)記和藥劑如上所述?？梢允褂脴?biāo)準(zhǔn)化學(xué)方式使標(biāo)記和藥劑與特異性結(jié)合成員綴合。


圖1表示小(A)和大(B)生腱蛋白C同種型的圖解表示。使幾種III型纖連蛋白類結(jié)構(gòu)域進(jìn)行在分子中可以包括(B)或不包括(A)的可變剪接。
圖2表示在具有U87腫瘤異種移植物的裸鼠中的4A1-F16-SIP抗體的生物分布。(A)數(shù)值代表注射后3(上部)和6(下部)小時(shí)時(shí)的每組3只小鼠的每克組織中注射劑量的百分比平均值。誤差線代表標(biāo)準(zhǔn)偏差。
圖3表示在具有U87腫瘤異種移植物的裸鼠中的4A1-F16-SIP抗體的生物分布。(A)數(shù)值代表注射后24(上部)和48(下部)小時(shí)時(shí)的每組3只小鼠的每克組織中注射劑量的百分比平均值。誤差線代表標(biāo)準(zhǔn)偏差。
圖4表示圖2和3中所示的生物分布的變化。
圖5表示SIP(P12)的生物分布。將3.5μg SIP(P12)注入具有皮下U87人成膠質(zhì)細(xì)胞瘤的小鼠。每一時(shí)間點(diǎn)代表來(lái)自4只動(dòng)物的結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
現(xiàn)在通過(guò)參照下列實(shí)驗(yàn)解釋本發(fā)明的方面和實(shí)施方案。
根據(jù)本發(fā)明披露的內(nèi)容，本發(fā)明的各種其他方面和實(shí)施方案對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言顯而易見(jiàn)。將本說(shuō)明書中提及的所有對(duì)比文件完整地引入本文作為參考。
本發(fā)明包括上述特征各自和每種的組合和子組合。
現(xiàn)在通過(guò)各實(shí)施例并且參照上述圖和下述表來(lái)解釋本發(fā)明的某些方面和實(shí)施方案。
實(shí)施例1通過(guò)RT-PCR，從mRNA克隆編碼人生腱蛋白C的結(jié)構(gòu)域A1的基因，具體為在沒(méi)有血清存在下在pH 7.5下培養(yǎng)的正常人真皮的成纖維細(xì)胞(NHDF)[16]，通過(guò)PCR，使用寡聚TnC-A1 BamHI ba(cgggatcctccactgaacaagcccctgag)和TnC-A1 Bg1II for(ggagatctttcccctgtggaggcctcagc)從所述細(xì)胞分離得到所述的mRNA。然后將基因克隆入pQE12細(xì)菌表達(dá)載體(Qiagen)并且在大腸桿菌TG-1中表達(dá)。通過(guò)His-標(biāo)記，使用加載了鎳的Ni-NTA瓊脂糖樹(shù)脂(Qiagen)進(jìn)行純化。
使用磺基-NHS-SS-生物素(Pierce)使純化的結(jié)構(gòu)域A1在選擇前進(jìn)行生物素標(biāo)記。如(Viti F，等Methods Enzymol 2000；326480-505)所述進(jìn)行生物篩選(biopanning)。簡(jiǎn)言之，將生物素化的蛋白(終濃度10-7M)與600μl預(yù)封閉的ETH-2文庫(kù)噬菌體一起孵育30分鐘。通過(guò)添加5.3×10-7鏈霉抗生物素包被的磁性珠(Dynal)俘獲結(jié)合的噬菌體。在強(qiáng)洗滌后，通過(guò)還原生物素接頭中的二硫鍵洗脫所選擇的噬菌體。在TG-1中擴(kuò)增分離的噬菌體并且通過(guò)聚乙二醇沉淀從上清液中濃縮。在三輪的孵育后，通過(guò)如Viti F，等Methods Enzymol 2000；326480-505中所述進(jìn)行ELISA，篩選出144個(gè)分離的抗體克隆。將鏈霉抗生物素包被的ELISA平板(StreptaWell High Bind，Roche)與生物素化的抗原一起孵育，加入誘導(dǎo)性表達(dá)scFv抗體的片段的大腸桿菌TG-1單克隆培養(yǎng)物上清液，然后使用M2單克隆抗體，隨后使用抗小鼠免疫球蛋白G-HRP綴合物檢測(cè)結(jié)合的抗體。通過(guò)實(shí)時(shí)相互作用分析，使用BIAcore 3000儀來(lái)分析具有最高信號(hào)的抗體克隆。在蛋白質(zhì)A-瓊脂糖柱上純化三種最佳克隆，并且通過(guò)對(duì)各種腫瘤冷凍切片免疫組織化學(xué)分析進(jìn)行測(cè)試。
在免疫組織化學(xué)中表現(xiàn)出選擇性染色模式的克隆中選擇出一個(gè)克隆scFv(3A1-D5)用于親和成熟(affinity maturation)。通過(guò)PCR，使用寡核苷酸LMB3 long ba(caggaaacagctatgaccatgattac，抗體基因5′末端的引發(fā)上游)和DP47CDR1mut for(agcctggcggacccagctcgcmnnmnnmnngctaaaggtgaatccagaggctgc)在可變重鏈(VH CDR1)的互補(bǔ)性決定區(qū)1內(nèi)31-33位上插入隨機(jī)突變，在質(zhì)粒載體pDN322(Pini A等J Biol Chem 1998；27321769-21776)中構(gòu)建親和成熟文庫(kù)。使用引物DP47CDR1 ba(gagctgggtccgccaggctcc)和fdseq longfor(gacgttagtaaatgaattttctgtatgagg)擴(kuò)增抗體基因的3′末端。通過(guò)使用引物L(fēng)MB3 long ba和fdseq long for裝配兩種片段。
使用生物素化的抗原對(duì)親和成熟文庫(kù)進(jìn)行生物篩選。在兩輪篩選(如上所述，但使用10-8M生物素化的抗原)后，通過(guò)ELISA篩選出總計(jì)382個(gè)抗體克隆。通過(guò)M2-ELISA(Scheuermann J等J Immunol Methods2003；276129-134)進(jìn)一步表征在ELISA中為陽(yáng)性的69個(gè)克隆，以便評(píng)價(jià)各抗體克隆的koff值。簡(jiǎn)言之，將含有scFv抗體的上清液加入到包被了抗Flag M2單克隆抗體(SIGMA)的表面上。在添加生物素化的抗原并且孵育至平衡后，加入過(guò)量的未生物素化的抗原作為競(jìng)爭(zhēng)劑。在0，30，60，90和120分鐘的競(jìng)爭(zhēng)時(shí)間后，使用鏈霉抗生物素-HRP綴合物檢測(cè)剩余的生物素化的抗原級(jí)分。
將BIAcore用于對(duì)基于其解離特性的不同ELISA-陽(yáng)性克隆進(jìn)行分級(jí)。選擇5種最佳克隆用于在抗原包被的瓊脂糖柱上純化。使純化的抗體進(jìn)行大小排阻色譜，并且將所得的單體scFv抗體片段級(jí)分通過(guò)使用BIAcore 3000測(cè)定親和常熟和動(dòng)力學(xué)參數(shù)。
通過(guò)對(duì)編碼人免疫球蛋白E的CH4結(jié)構(gòu)域的基因的5′-末端前的scFv(4A1-F16)序列進(jìn)行基因融合，將具有最佳解離常數(shù)(KD)的抗體4A1-F16克隆成二價(jià)小抗體(bivalent minibody)形式，從而得到小免疫蛋白(SIP)(Borsi L等Int J Cancer 2002；10275-85)，稱作4A1-F16-SIP。CH4結(jié)構(gòu)域促進(jìn)同型二聚化，從而因較高的親和力而增加對(duì)抗體的功能性親和力。
使用生腱蛋白C抗體片段scFv的抗A1結(jié)構(gòu)域(3A1-D5)對(duì)人頭頸癌組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)試驗(yàn)。通過(guò)附加在scFv抗體C-末端上的肽FLAG-標(biāo)記，使用單克隆抗FLAG抗體M2(SIGMA)，隨后使用APAAP系統(tǒng)(DAKO)檢測(cè)一抗。觀察到scFv(3A1-D5)和scFv(4A1-F16)對(duì)不同頭頸癌的冷凍切片上的腫瘤基質(zhì)和新血管結(jié)構(gòu)強(qiáng)烈染色，而它們不與健康供體的正?？谇徽衬し磻?yīng)。
如下評(píng)價(jià)4A1-F16-SIP的腫瘤靶向能力通過(guò)給每只小鼠皮下注射3×106個(gè)U87人成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞(ATCC)在Balb/C裸鼠中誘發(fā)腫瘤。在注射后20-25天，當(dāng)腫瘤達(dá)到300-1500mm3大小時(shí)，注射放射性標(biāo)記的抗體。
抗體的制備包括通過(guò)在superdex 75上的大小排阻色譜對(duì)親和純化的4A1-F16-SIP抗體進(jìn)行進(jìn)一步純化。收集代表同型二聚化形式的級(jí)分(75kDa)且隨后使用非水溶性碘化試劑(Pierce)以碘-125(Amersham)標(biāo)記。
將約5μg抗體通過(guò)靜脈內(nèi)注入具有腫瘤的小鼠尾靜脈。分別在3，6，24和48小時(shí)后，處死3只小鼠，切下器官并且用γ-計(jì)數(shù)器測(cè)定I-125的蓄積。
實(shí)施例2將編碼人生腱蛋白C的結(jié)構(gòu)域C的基因克隆入載體pQE12(Qiagen)[Carnemolla B等Am J Pathol 1999；1541345-1352，Balza E等FEBS Lett 1993；33239-43]并且在大腸桿菌TG-1中表達(dá)。通過(guò)His-標(biāo)記，使用加載鎳的Ni-NTA(Qiagen)進(jìn)行純化。
使用磺基-NHS-SS-生物素(Pierce)在選擇前對(duì)純化的結(jié)構(gòu)域C進(jìn)行生物素標(biāo)記。如[Viti F，等Methods Enzymol 2000；326480-505]所述地進(jìn)行生物篩選，不過(guò)是在鏈霉生物素和抗生物素蛋白包被的平板上使用交替篩選的操作步驟。簡(jiǎn)言之，將生物素化的蛋白(終濃度10-7M)與600μl預(yù)封閉的ETH-2文庫(kù)噬菌體一起孵育30分鐘。在包被了抗生物素蛋白(第1和第3個(gè)孵育周期)或鏈霉抗生物素(第2個(gè)孵育周期)的塑料微量滴定平板上俘獲結(jié)合的噬菌體。在充分洗滌后，通過(guò)還原生物素接頭中的二硫鍵洗脫選擇的噬菌體。在TG-1中擴(kuò)增分離的噬菌體并且通過(guò)聚乙二醇沉淀從上清液中濃縮。在三輪篩選后，通過(guò)如[Viti F，等Methods Enzymol 2000；326480-505]中所述進(jìn)行ELISA篩選，得到幾打的抗體克隆。
將鏈霉抗生物素包被的ELISA平板(StreptaWell High Bind，Roche)與生物素化的抗原一起孵育，加入表達(dá)scFv抗體片段的經(jīng)誘導(dǎo)的單克隆大腸桿菌TG-1的培養(yǎng)物上清液，并且使用M2單克隆抗體，隨后使用抗肽標(biāo)記抗體，隨后使用抗小鼠免疫球蛋白G-HRP綴合物檢測(cè)結(jié)合的抗體。通過(guò)實(shí)時(shí)相互作用分析，使用BIAcore 3000儀來(lái)分析具有最高信號(hào)的抗體克隆。在蛋白質(zhì)A-瓊脂糖柱上純化三種最佳克隆，并且通過(guò)對(duì)各種腫瘤冷凍切片免疫組織化學(xué)分析進(jìn)行測(cè)試。選擇在免疫組織化學(xué)中表現(xiàn)出選擇性染色模式的的克隆之一scFv(A12)用于親和成熟。通過(guò)PCR，使用寡核苷酸LMB3 long ba(caggaaacagctatgaccatgattac，抗體基因的5′末端引發(fā)上游)，DP47CDR1 for(ctggagcctggcggacccagctcatmnnmnnmnngctaaaggtgaatccagaggctgc)，DP47CDR1 ba(tgggtccgccaggctccag)，DP47CDR2for(gcccttcacggagtctgcgtagtatgtmnnaccaccmnnmnnmnnaatagctgagacccactcc)，DP47CDR2 ba(acatactacgcagactccgtgaagggc)和fdseqlong for(gacgttagtaaatgaattttctgtatgagg)在VH CDR1內(nèi)的31-33位和VH CDR2內(nèi)的52，52a，53和56位上插入隨機(jī)突變，在噬菌體載體pHEN1[Hoogenboom HR等Nucleic Acids Res 1991；194133-4137]中構(gòu)建親和成熟文庫(kù)。
使用生物素化的抗原對(duì)親和成熟文庫(kù)進(jìn)行生物篩選。在篩選兩輪(如上所述)后，通過(guò)ELISA篩選出總計(jì)382個(gè)抗體克隆。用BIAcore進(jìn)一步表征在ELISA中為陽(yáng)性的克隆，以便基于其解離特性對(duì)不同ELISA-陽(yáng)性克隆進(jìn)行分級(jí)。在測(cè)試的克隆中，scFv(E10)表現(xiàn)出最有希望的性能。
使用生腱蛋白C抗體片段scFv(A12)的抗C結(jié)構(gòu)域?qū)θ顺赡z質(zhì)細(xì)胞瘤多形組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)試驗(yàn)。通過(guò)附加在scFv抗體C-末端上的肽myc-標(biāo)記，使用單克隆抗myc標(biāo)記抗體E10，隨后使用APAAP系統(tǒng)(DAKO)檢測(cè)一抗。觀察到這些抗體與血管周圍結(jié)構(gòu)發(fā)生特異性反應(yīng)，正如通過(guò)成膠質(zhì)細(xì)胞瘤冷凍切片上的免疫組織化學(xué)所顯示的。
實(shí)施例3使用與實(shí)施例2中所述類似的方案，進(jìn)一步分離針對(duì)生腱蛋白C的C結(jié)構(gòu)域的scFv并且分別命名為F4和G11。F4和G11具有兩種氨基酸不同的VL結(jié)構(gòu)域并且具有相同的VH結(jié)構(gòu)域。VH和VL結(jié)構(gòu)域通過(guò)具有如SEQID NO37或SEQ ID NO39所示的分別由SEQ ID NO36或SEQ ID NO38編碼的氨基酸序列的肽接頭連接。
實(shí)施例4通過(guò)RT-PCR，使用PCR oligos TnC-D BamHI ba(cgggatccgttacagaagccgaaccggaa-SEQ ID NO72)和TnC-D Bg1II for(cgggatccgttacagaagccgaaccggaa-SEQ ID NO73)[16]從分離自人黑素瘤細(xì)胞系SKMe1-28的總RNA中克隆編碼生腱蛋白C的人結(jié)構(gòu)域D(TnC-D)的基因。將擴(kuò)增的片段亞克隆入在蛋白質(zhì)的C-末端引入了His-標(biāo)記的細(xì)菌表達(dá)載體pQE12。通過(guò)PCR，使用引物mmTnC-A1 Eco Ba(agaattcattaaagaggagaaattaactatgagaggatcctccacggaagaagtgccttc-SEQ ID NO74)和mmTnC-A1 Bg1Fo(tgagatcttgtccctgtggaggtctcggc-SEQ ID NO75)從來(lái)源于浸潤(rùn)性管癌組織的表達(dá)的序列標(biāo)記(EST)分離編碼小鼠TnC-A1同種型的基因并且克隆入載體pQE12(Qiagen)。
使用100nM生物素化的人TnC-D篩選ETH-2文庫(kù)[26]，然后使用鏈霉抗生物素包被的磁性珠俘獲結(jié)合的噬菌體。在篩選三輪后，對(duì)生物素化的人TnC-D和生物素化的小鼠-TnC-D進(jìn)行ELISA來(lái)篩選獲自188個(gè)克隆的上清液。能識(shí)別人同種型的大部分克隆也與小鼠TnC-D同種型反應(yīng)。
在第二次ELISA中檢測(cè)ELISA陽(yáng)性克隆上清液，然后通過(guò)BIAcore篩選。充分表征6個(gè)最佳克隆并且將scFv(F4)鑒定為最佳克隆。scFv(F4)以相同的親和力與人和小鼠TnC-D結(jié)合。
scFv(F4)僅識(shí)別在ELISA中包含結(jié)構(gòu)域D的蛋白質(zhì)并且不與在結(jié)構(gòu)上與結(jié)構(gòu)域D相關(guān)的蛋白質(zhì)反應(yīng)。然而，它在免疫組織化學(xué)中與腫瘤結(jié)構(gòu)的反應(yīng)只是極為微弱，從而產(chǎn)生難以與背景區(qū)分的信號(hào)。據(jù)推斷這是因scFv(F4)親和力低所致。
將ScFv(F4)用作通過(guò)CDR環(huán)誘變的親和成熟的模板[26]。選擇殘基VLCDR1 30，31，32位和VHCDR2 50，52和53位(按照Kabat編號(hào)；[30]用于隨機(jī)化。將文庫(kù)克隆入在VLC-末端上附加myc標(biāo)記的噬菌體載體pHEN[31]。
用生物素化的人TnC-D對(duì)親和成熟文庫(kù)噬菌體進(jìn)行第一輪篩選，用生物素化小鼠TnC-D進(jìn)行第二輪篩選。通過(guò)對(duì)生物素化的人TnC-D進(jìn)行ELISA篩選出750個(gè)克隆，其中約5％為陽(yáng)性。在通過(guò)BIAcore和ELISA對(duì)抗體進(jìn)一步表征后，將scFv(D11)鑒定為最佳克隆。ScFv(D11)。通過(guò)BIAcore對(duì)單體級(jí)分進(jìn)行親和力測(cè)定顯示scFv(D11)與親代克隆scFv(F4)相比，親和力提高了2-4倍。以稍高于人同種型的親和力結(jié)合小鼠同種型。
scFv(D11)在對(duì)不同腫瘤組織進(jìn)行的免疫組織化學(xué)試驗(yàn)中取得了良好結(jié)果。均用scFv(D11)染色人口腔鱗狀細(xì)胞癌、人膀胱癌、生長(zhǎng)在裸鼠中的A375人黑素瘤和生長(zhǎng)在SvEv 129小鼠中的F9鼠F9畸胎癌?？贵w與人腫瘤，如頭頸癌或膀胱癌的基質(zhì)以及對(duì)各種人和鼠腫瘤模型起強(qiáng)烈反應(yīng)。
接下來(lái)我們使CDR1和scFv(D11)的VH的CDR1內(nèi)的殘基隨機(jī)化。我們選擇了VHCDR1內(nèi)的31，32，33位殘基和VHCDR2內(nèi)的52，52a，53和56位殘基用于隨機(jī)化(Kabat編號(hào)；[32])。使用10-8M人TnC-D作為抗原，通過(guò)噬菌體展示進(jìn)行兩輪的選擇。為了增加選擇的嚴(yán)格性，在添加第一輪中添加抗原前將10nM純化的可溶性scFv(D11)與噬菌體混合，并且在第二輪的孵育中將1000倍過(guò)量的未生物素化的抗原加入到預(yù)先篩選的抗原-噬菌體混合物中。
在兩輪篩選后的384個(gè)克隆中的25％對(duì)在ELISA中人生物素化的TnC-D而言為陽(yáng)性的。在進(jìn)一步表征后，其為scFv(P12)，將其鑒定為最佳克隆。它對(duì)人TnC-D的親和力與scFv(D11)相比提高4.8倍。
將scFv(P12)克隆成SIP(小免疫蛋白)形式[25]。通過(guò)在具有U87人成膠質(zhì)細(xì)胞瘤異種移植物的裸鼠中的生物分布實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)SIP(P12)的體內(nèi)靶向性能。經(jīng)靜脈內(nèi)注射125I-標(biāo)記的SIP抗體，并且在3，6，24和48小時(shí)后，處死動(dòng)物，切下器官，稱重并且對(duì)放射性進(jìn)行計(jì)數(shù)。大部分器官在距注射后24小時(shí)內(nèi)清除SIP(P12)，并且在24和48小時(shí)后觀察到腫瘤部位的特異性蓄積，其中腫瘤與血液之比達(dá)15(圖5和表1)。
表1.放射性標(biāo)記的P12-SIP在具有U87腫瘤的裸鼠中的生物分布

將結(jié)果表示為每克組織中注射抗體所占的百分比(％ID/g)±SD參考文獻(xiàn)1.Bosslet K等Cancer Res 1998；581195-12012.Jain RK.Adv Drug Deliv Rev 2001；46149-1683.Kohler G，Milstein C Nature 1975；256495-4974.Winter G等Annu Rev Immunol 1994；12433-4555.Halin C等Cancer Res 2003；633202-32106.Halin C等Nat Biotechnol 2002；20264-2697.Nilsson F等Cancer Res 2001；61711-7168.Borsi L等Blood 2003；1024384-43929.Carnemolla B等Blood 2002；991659-166510.Zardi L等Embo J 1987；62337-234211.Castellani P等Am J Pathol 2002；1611695-170012.Castellani P等Int J Cancer 1994；59612-61813.Carnemolla B等.Int J Cancer 1996；68397-40514.Borsi L等Int J Cancer 1992；52688-69215.Carnemol la B等Eur J Biochem 1992；205561-56716.Borsi L等J Biol Chem 1995；2706243-624517.Riva P等Int J Cancer 1992；517-1318.Riva P等Cance r Re s 1995；555952s-5956s19.Paganelli G等Eur J Nucl Med 1994；21314-321
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序列SEQ ID NO1.4A1-F16 VH結(jié)構(gòu)域核苷酸序列GAG GTG CAG CTG TTG GAG TCT GGG GGA GGC TTG GTA CAG CCT GGG GGGTCC CTG AGA CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA TTC ACC TTT AGC CGG TATGGT GCG AGC TGG GTC CGC CAG GCT CCA GGG AAG GGG CTG GAG TGG GTCTCA GCT ATT AGT GGT AGT GGT GGT AGC ACA TAC TAC GCA GAC TCC GTGAAG GGC CGG TTC ACC ATC TCC AGA GAC AAT TCC AAG AAC ACG CTG TATCTG CAA ATG AAC AGC CTG AGA GCC GAG GAC ACG GCC GTA TAT TAC TGTGCG AAA GCG CAT AAT GCT TTT GAC TAC TGG GGC CAG GGA ACC CTG GTCACC GTG TCG AGASEQ ID NO2 4A1-F16 VH結(jié)構(gòu)域氨基酸序列EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS RYGASWVRQA PGKGLEWVSAISGSGGSTYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAKAHNAFDYWGQGT LVTVSREVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS RYGASWVRQAPGKGLEWVSA ISGSGGSTYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAVYYCAKAH NAFDYWGQGT LVTVSRSEQ ID NO3 4A1-F16 & 3A1-D5 VL結(jié)構(gòu)域核苷酸序列TCG TCT GAG CTG ACT CAG GAC CCT GCT GTG TCT GTG GCC TTG GGA CAGACA GTC AGG ATC ACA TGC CAA GGA GAC AGC CTC AGA AGC TAT TAT GCAAGC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA CAG GCC CCT GTA CTT GTC ATC TATGGT AAA AAC AAC CGG CCC TCA GGG ATC CCA GAC CGA TTC TCT GGC TCCAGC TCA GGA AAC ACA GCT TCC TTG ACC ATC ACT GGG GCT CAG GCG GAAGAT GAG GCT GAC TAT TAC TGT AAC TCC TCT GTT TAT ACT ATG CCG CCCGTG GTA TTC GGC GGA GGG ACC AAG CTG ACC GTC CTA GGCSEQ ID NO4 4A1-F16 & 3A1-D5 VL結(jié)構(gòu)域氨基酸序列
SSELTQDPAV SVALGQTVRI TCQGDSLRSY YASWYQQKPG QAPVLVIYGKNNRPSGIPDR FSGSSSGNTA SLTITGAQAE DEADYYCNSS VYTMPPVVFGGGTKLTVLGSEQ ID NO5 4A1-F16 VH CDR1氨基酸序列RYGASSEQ ID NO6 4A1-F16 & 3A1-D5 VH CDR2氨基酸序列AISGSGGSTYYADSVKGSEQ ID NO7 4A1-F16 & 3A1-D5 VH CDR3氨基酸序列AHNAFDYSEQ ID NO8 4A1-F16 & 3A1-D5 VL CDR1氨基酸序列QGDSLRSYYASSEQ ID NO9 4A1-F16 & 3A1-D5 VL CDR2氨基酸序列GKNNRPSSEQ ID NO10 4A1-F16 & 3A1-D5 VL CDR3氨基酸序列NSSVYTMPPVVSEQ ID NO11 3A1-D5 VH結(jié)構(gòu)域核苷酸序列GAG GTG CAG CTG TTG GAG TCT GGG GGA GGC TTG GTA CAG CCT GGG GGGTCC CTG AGA CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA TTC ACC TTT AGC AGC TATGCC GCG AGC TGG GTC CGC CAG GCT CCA GGG AAG GGG CTG GAG TGG GTCTCA GCT ATT AGT GGT AGT GGT GGT AGC ACA TAC TAC GCA GAC TCC GTGAAG GGC CGG TTC ACC ATC TCC AGA GAC AAT TCC AAG AAC ACG CTG TATCTG CAA ATG AAC AGC CTG AGA GCC GAG GAC ACG GCC GTA TAT TAC TGT
GCG AAA GCG CAT AAT GCT TTT GAC TAC TGG GGC CAG GGA ACC CTG GTCACC GTG TCG AGASEQ ID NO12 3A1-D5 VH結(jié)構(gòu)域氨基酸序列EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SYAASWVRQA PGKGLEWVSAISGSGGSTYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAKAHNAFDYWGQGT LVTVSRSEQ ID NO13 3A1-D5 VH CDR1氨基酸序列SYAASSEQ ID NO14 E10 VH結(jié)構(gòu)域核苷酸序列GAG GTG CAG CTG GTG GAG TCT GGG GGA GGC TTG GTA CAG CCT GGG GGGTCC CTG AGA CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA TTC ACC TTT AGC GGT AGTCGT ATG GGC TGG GTC CGC CAG GCT CCA GGG AAG GGG CTG GAG TGG GTCTCA GCT ATT AAT GAG GAG GGT GGT CAG ACA TAC TAC GCA GAC TCC GTGAAG GGC CGG TTC ACC ATC TCC AGA GAC AAT TCC AAG AAC ACG CTG TATCTG CAA ATG AAC AGC CTG AGA GCC GAG GAC ACG GCC GTA TAT TAC TGTGCG AAA CAT CCG CCG CAT CGG CCG TTT GAC TAC TGG GGC CAG GGA ACCCTG GTC ACC GTG TCG AGASEQ ID NO15 E10 VH結(jié)構(gòu)域氨基酸序列EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS GSRMGWVRQA PGKGLEWVSAINEEGGQTYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAKHPPHRPFDYWGQ GTLVTVSRSEQ ID NO16.E10 & A12 VL結(jié)構(gòu)域核苷酸序列TCG TCT GAG CTG ACT CAG GAC CCT GCT GTG TCT GTG GCC TTG GGA CAGACA GTC AGG ATC ACA TGC CAA GGA GAC AGC CTC AGA AGC TAT TAT GCA
AGC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA CAG GCC CCT GTA CTT GTC ATC TATGGT AAA AAC AAC CGG CCC TCA GGG ATC CCA GAC CGA TTC TCT GGC TCCAGC TCA GGA AAC ACA GCT TCC TTG ACC ATC ACT GGG GCT CAG GCG GAAGAT GAG GCT GAC TAT TAC TGT AAC TCC TCT CAT GGG CCC CGT AGG CCTGTG GTA TTC GGC GGA GGG ACC AAG CTG ACC GTC CTA GGCSEQ ID NO17 E10 & A12 VL結(jié)構(gòu)域氨基酸序列SSELTQDPAV SVALGQTVRI TCQGDSLRSY YASWYQQKPG QAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTA SLTITGAQAE DEADYYCNSS HGPRRPVVFGGGTKLTVLGSEQ ID NO18 E10，F(xiàn)4 & G11VH CDR1氨基酸序列GSRMGSEQ ID NO19 E10，F(xiàn)4 & G11 VH CDR2氨基酸序列AINEEGGQTYYADSVKGSEQ ID NO20 E10，A12，F(xiàn)4 & G11 VH CDR3氨基酸序列HPPHRPFDYSEQ ID NO21 E10 & A12 VL CDR1氨基酸序列QGDSLRSYYASSEQ ID NO22 E10，A12 & G11 VL CDR2氨基酸序列GKNNRPSSEQ ID NO23 E10 & A12 VL CDR3氨基酸序列NSSHGPRRPVV
SEQ ID NO24 A12 VH結(jié)構(gòu)域核苷酸序列GAG GTG CAG CTG TTG GAG TCT GGG GGA GGC TTG GTA CAG CCT GGG GGGTCC CTG AGA CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA TTC ACC TTT AGC AGC TATGCC ATG AGC TGG GTC CGC CAG GCT CCA GGG AAG GGG CTG GAG TGG GTCTCA GCT ATT AGT GGT AGT GGT GGT AGC ACA TAC TAC GCA GAC TCC GTGAAG GGC CGG TTC ACC ATC TCC AGA GAC AAT TCC AAG AAC ACG CTG TATCTG CAA ATG AAC AGC CTG AGA GCC GAG GAC ACG GCC GTA TAT TAC TGTGCG AAA CAT CCG CCG CAT CGG CCG TTT GAC TAC TGG GGC CAG GGA ACCCTG GTC ACC GTG TCG AGASEQ ID NO 25 A12 VH結(jié)構(gòu)域氨基酸序列EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SYAMSWVRQA PGKGLEWVSAISGSGGSTYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAKHPPHRPFDYWGQ GTLVTVSRSEQ ID NO26 A12 VH CDR1基酸序列SYAMSSEQ ID NO27 A12 VH CDR2氨基酸序列AISGSGGSTYYADSVKGSEQ ID NO28 F4 & G11 VH結(jié)構(gòu)域核酸序列GAG GTG CAG CTG GTG GAG TCT GGG GGA GGC TTG GTA CAG CCT GGG GGGTCC CTG AGA CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA TTC ACC TTT AGC GGT AGTCGT ATG GGC TGG GTC CGC CAG GCT CCA GGG AAG GGG CTG GAG TGG GTCTCA GCT ATT AAT GAG GAG GGT GGT CAG ACA TAC TAC GCA GAC TCC GTGAAG GGC CGG TTC ACC ATC TCC AGA GAC AAT TCC AAG AAC ACG CTG TATCTG CAA ATG AAC AGC CTG AGA GCC GAG GAC ACG GCC GTA TAT TAC TGTGCG AAA CAT CCG CCG CAT CGG CCG TTT GAC TAC TGG GGC CAG GGA ACC
CTG GTC ACC GTC TCG AGASEQ ID NO29 F4 & G11 VH 結(jié)構(gòu)域氨基酸序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSGSRMGWVRQAPGKGLEWVSAINEEGGQTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHPPHRPFDYWGQGTLVTVSRSEQ ID NO30 F4 VL結(jié)構(gòu)域核酸序列TCG TCT GAG CTG ACT CAG GAC CCT GCT GTG TCT GTG GCC TTG GGA CAGACA GTC AGG ATC ACA TGC CAA GGA GAC AGC CTC AGA CTT TAT TAT GCAAGC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA CAG GCC CCT GTA CTT GTC ATC TATGGT AAA TCT AGT CGG CCC TCA GGG ATC CCA GAC CGA TTC TCT GGC TCCAGC TCA GGA AAC ACA GCT TCC TTG ACC ATC ACT GGG GCT CAG GCG GAAGAT GAG GCT GAC TAT TAC TGT AAC TCC TCT CAT GGG CCC CGT AGG CCTGTG GTA TTC GGC GGA GGG ACC AAG CTG ACC GTC CTA GGCSEQ ID NO31 F4 VL結(jié)構(gòu)域氨基酸序列SSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRLYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKSSRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSSHGPRRPVVFGGGTKLTVLGSEQ ID NO32 F4 & G11 VL CDR1氨基酸序列QGDSLRLYYASSEQ ID NO33 F4 VL CDR2氨基酸序列GKSSRPSSEQ ID NO34 G11 VL結(jié)構(gòu)域核酸序列TCG TCT GAG CTG ACT CAG GAC CCT GCT GTG TCT GTG GCC TTG GGA CAGACA GTC AGG ATC ACA TGC CAA GGA GAC AGC CTC AGA CTT TAT TAT GCAAGC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA CAG GCC CCT GTA CTT GTC ATC TAT
GGT AAA AAC AAC CGG CCC TCA GGG ATC CCA GAC CGA TTC TCT GGC TCCAGC TCA GGA AAC ACA GCT TCC TTG ACC ATC ACT GGG GCT CAG GCG GAAGAT GAG GCT GAC TAT TAC TGT AAC TCC TCT CAT GGG CCC CGT AGG CCTGTG GTA TTC GGC GGA GGG ACC AAG CTG ACC GTC CTA GGCSEQ ID NO35 G11 VL結(jié)構(gòu)域氨基酸序列SSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRLYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSSHGPRRPVVFGGGTKLTVLGSEQ ID NO36肽接頭核酸序列GGT GGA GGC GGT TCA GGC GGA GGT GGC TCT GGC GGT GGC GGASEQ ID NO37肽接頭氨基酸序列GGGGSGGGGSGGGGSEQ ID NO38肽接頭核酸序列GGT GGA GGC GGT TCA GGC GGA GGT GGT TCT GGC GGT GGC GGA TCGSEQ ID NO39肽接頭氨基酸序列GGGGSGGGGSGGGGSSEQ ID NO40肽接頭核酸序列TCT TCC TCA TCG GGT AGT AGC TCT TCC GGC TCA TCG TCC AGC GGCSEQ ID NO41肽接頭氨基酸序列SSSSGSSSSGSSSSGSEQ ID NO42肽接頭氨基酸序列GSGSAGSGSAGSGSA
SEQ ID NO43肽接頭氨基酸序列GGSGGGGSGGGGSGGSEQ ID NO44新F4 & G11VH結(jié)構(gòu)域核酸序列GAG GTG CAG CTG TTG GAG TCT GGG GGA GGC TTG GTA CAG CCT GGG GGGTCC CTG AGA CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA TTC ACC TTT AGC GGT AGTCGT ATG GGC TGG GTC CGC CAG GCT CCA GGG AAG GGG CTG GAG TGG GTCTCA GCT ATT AAT GAG GAG GGT GGT CAG ACA TAC TAC GCA GAC TCC GTGAAG GGC CGG TTC ACC ATC TCC AGA GAC AAT TCC AAG AAC ACG CTG TATCTG CAA ATG AAC AGC CTG AGA GCC GAA GAC ACG GCC GTA TAT TAC TGTGCG AAA CAT CCG CCG CAT CGG CCG TTT GAC TAC TGG GGC CAG GGA ACCCTG GTC ACC GTC TCG AGTSEQ ID NO45新F4 & G11 VH結(jié)構(gòu)域氨基酸序列EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSGSRMGWVRQAPGKGLEWVSAINEEGGQTYYAD SVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHPPHRPFDYWGQGTLVTVSSSEQ ID NO46新G11 VL結(jié)構(gòu)域核酸序列TCT GAG CTG ACT CAG GAC CCT GCT GTG TCT GTG GCC TTG GGA CAG ACAGTC AGG ATC ACA TGC CAA GGA GAC AGC CTC AGA CTT TAT TAT GCA AGCTGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA CAG GCC CCT GTA CTT GTC ATC TAT GGTAAA AAC AAC CGG CCC TCA GGG ATC CCA GAC CGA TTC TCT GGC TCC AGCTCA GGA AAC ACA GCT TCC TTG ACC ATC ACT GGG GCT CAG GCG GAA GATGAG GCT GAC TAT TAC TGT AAC TCC TCT CAT GGG CCC CGT AGG CCT GTGGTA TTC GGC GGA GGG ACC AAG CTG ACC GTC CTA GGCSEQ ID NO47新G11 VL結(jié)構(gòu)域氨基酸序列SELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRLYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDR
FSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSSHGPRRPVVFGGGTKLTVLGSEQ ID NO48新E10 VH結(jié)構(gòu)域氨基酸序列EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS GSRMGWVRQA PGKGLEWVSAINEEGGQTYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAKHPPHRPFDYWGQ GTLVTVSSSEQ ID NO49新4A1-F16 & 3A1-D5 VL結(jié)構(gòu)域核苷酸序列TCT GAG CTG ACT CAG GAC CCT GCT GTG TCT GTG GCC TTG GGA CAG ACAGTC AGG ATC ACA TGC CAA GGA GAC AGC CTC AGA AGC TAT TAT GCA AGCTGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA CAG GCC CCT GTA CTT GTC ATC TAT GGTAAA AAC AAC CGG CCC TCA GGG ATC CCA GAC CGA TTC TCT GGC TCC AGCTCA GGA AAC ACA GCT TCC TTG ACC ATC ACT GGG GCT CAG GCG GAA GATGAG GCT GAC TAT TAC TGT AAC TCC TCT GTT TAT ACT ATG CCG CCC GTGGTA TTC GGC GGA GGG ACC AAG CTG ACC GTC CTA GGCSEQ ID NO50新4A1-F16 & 3A1-D5 VL結(jié)構(gòu)域氨基酸序列SELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSSVYTMPPVVFGGGTKLTVLGSEQ ID NO51 P12 VH結(jié)構(gòu)域核酸序列GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTGGCCAGTATTCTATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTACGGGGACTGGTGGTGAGACATACTACGCAGACTCCGTGGAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGGGCGGCGGATTTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTGTCGAGASEQ ID NO52 P12 VH結(jié)構(gòu)域氨基酸序列
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGQYSMSWVRQAPGKGLEWVSAITGTGGETYYADSVEGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGRRIFDYWGQGTLVTVSRSEQ ID NO53 P12和D11 VL結(jié)構(gòu)域核酸序列TCGAGTGAGCTGACTCAGGACCCTGCTGTGTCTGTGGCCTTGGGACAGACAGTCAGGATCACATGCCAAGGAGACAGCCTCAGACGGCAGCCTGCAAGCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGACAGGCCCCTGTACTTGTCATCTATTATAAAAAGCTGCGGCCCTCAGGGATCCCAGACCGATTCTCTGGCTCCAGCTCAGGAAACACAGCTTCCTTGACCATCACTGGGGCTCAGGCGGAAGATGAGGCTGACTATTACTGTAACTCCTTTTCGCCCAAGCCGAAGCCTGTGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGCSEQ ID NO54 P12和D11 VL結(jié)構(gòu)域氨基酸序列SSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRRQPASWYQQKPGQAPVLVIYYKKLRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSFSPKPKPVVFGGGTKLTVLGSEQ ID NO55 D11 VH結(jié)構(gòu)域核酸序列GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTGGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGGAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGGGCGGCGGATTTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTGTCGAGASEQ ID NO56 D11 VH結(jié)構(gòu)域氨基酸序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVEGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGRRIFDYWGQGTLVTVSRSEQ ID NO57 F4S VH結(jié)構(gòu)域核酸序列GAG GTG CAG CTG GTG GAG TCT GGG GGA GGC TTG GTA CAG CCT GGG GGG
TCC CTG AGA CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA TTC ACC TTT AGC AGC TATGCC ATG AGC TGG GTC CGC CAG GCT CCA GGG AAG GGG CTG GAG TGG GTCTCA GCT ATT AGT GGT AGT GGT GGT AGC ACA TAC TAC GCA GAC TCC GTGAAG GGC CGG TTC ACC ATC TCC AGA GAC AAT TCC AAG AAC ACG CTG TATCTG CAA ATG AAC AGC CTG AGA GCC GAG GAC ACG GCC GTA TAT TAC TGTGCG AAA GGG CGG CGG ATT TTT GAC TAC TGG GGC CAG GGA ACC CTG GTCACC GTG TCG AGASEQ ID NO58 F4S VH結(jié)構(gòu)域氨基酸序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGRRIFDYWGQGTLVTVSRSEQ ID NO59 F4S VL結(jié)構(gòu)域核酸序列TCG TCT GAG CTG ACT CAG GAC CCT GCT GTG TCT GTG GCC TTG GGA CAGACA GTC AGG ATC ACA TGC CAA GGA GAC AGC CTC AGA AGC TAT TAT GCAAGC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA CAG GCC CCT GTA CTT GTC ATC TATGGT AAA AAC AAC CGG CCC TCA GGG ATC CCA GAC CGA TTC TCT GGC TCCAGC TCA GGA AAC ACA GCT TCC TTG ACC ATC ACT GGG GCT CAG GCG GAAGAT GAG GCT GAC TAT TAC TGT AAC TCC TTT TCG CCC AAG CCG AAG CCTGTG GTA TTC GGC GGA GGG ACC AAG CTG ACC GTC CTA GGCSEQ ID NO60 F4S VL結(jié)構(gòu)域氨基酸序列SSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSFSPKPKPVVFGGGTKLTVLGSEQ ID NO61 P12 VH CDR1氨基酸序列QYSMSSEQ ID NO62 D11和F4S VH CDR1氨基酸序列
SYAMSSEQ ID NO63 P12 VH CDR2氨基酸序列AITGTGGETYYADSVEGSEQ ID NO64 D11 VH CDR2氨基酸序列AISGSGGSTYYADSVEGSEQ ID NO65 F4S VH CDR2氨基酸序列AISGSGGSTYYADSVKGSEQ ID NO66 P12，D11和F4S VH CDR3氨基酸序列GRRIFDYSEQ ID NO67 P12和D11 VL CDR1氨基酸序列QGDSLRRQPASSEQ ID NO68 F4S VL CDR1氨基酸序列QGDSLRSYYASSEQ ID NO69 P12和D11 VL CDR2氨基酸序列YKKLRPSSEQ ID NO70 F4S VL CDR2氨基酸序列GKNNRPSSEQ ID NO71 P12，D11和F4S VL CDR3氨基酸序列NSFSPKPKPVV
SEQ ID NO72 PCR寡核苷酸引物TnC-D BamHI bacgggatccgttacagaagccgaaccggaaSEQ ID NO73 PCR寡核苷酸引物TnC-D Bg1II forcgggatccgttacagaagccgaaccggaaSEQ ID NO74 PCR寡核苷酸引物mmTnC-A1 EcoBaagaattcattaaagaggagaaattaactatgagaggatcctccacggaagaagtgccttcSEQ ID NO75 PCR寡核苷酸引物mmTnC-A1 Bg1FotgagatcttgtccctgtggaggtctcggcSEQ ID NO76肽接頭基序GGGGSSEQ ID NO77肽接頭基序SSSSGSEQ ID NO78肽接頭基序GSGSASEQ ID NO79肽接頭基序GGSGGSEQ ID NO80.新E10 & A12 VL結(jié)構(gòu)域核苷酸序列TCT GAG CTG ACT CAG GAC CCT GCT GTG TCT GTG GCC TTG GGA CAG ACAGTC AGG ATC ACA TGC CAA GGA GAC AGC CTC AGA AGC TAT TAT GCA AGCTGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA CAG GCC CCT GTA CTT GTC ATC TAT GGTAAA AAC AAC CGG CCC TCA GGG ATC CCA GAC CGA TTC TCT GGC TCC AGCTCA GGA AAC ACA GCT TCC TTG ACC ATC ACT GGG GCT CAG GCG GAA GAT
GAG GCT GAC TAT TAC TGT AAC TCC TCT CAT GGG CCC CGT AGG CCT GTGGTA TTC GGC GGA GGG ACC AAG CTG ACC GTC CTA GGCSEQ ID NO81新E10 & A12 VL結(jié)構(gòu)域氨基酸序列SELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSSHGPRRPVVFGGGTKLTVLGSEQ ID NO82新F4 VL結(jié)構(gòu)域核酸序列TCT GAG CTG ACT CAG GAC CCT GCT GTG TCT GTG GCC TTG GGA CAG ACAGTC AGG ATC ACA TGC CAA GGA GAC AGC CTC AGA CTT TAT TAT GCA AGCTGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA CAG GCC CCT GTA CTT GTC ATC TAT GGTAAA TCT AGT CGG CCC TCA GGG ATC CCA GAC CGA TTC TCT GGC TCC AGCTCA GGA AAC ACA GCT TCC TTG ACC ATC ACT GGG GCT CAG GCG GAA GATGAG GCT GAC TAT TAC TGT AAC TCC TCT CAT GGG CCC CGT AGG CCT GTGGTA TTC GGC GGA GGG ACC AAG CTG ACC GTC CTA GGCSEQ ID NO83新F4 VL結(jié)構(gòu)域氨基酸序列SELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRLYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKSSRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSSHGPRRPVVFGGGTKLTVLG
權(quán)利要求
1.結(jié)合人生腱蛋白C的特異性結(jié)合成員，且其包括抗體VH結(jié)構(gòu)域，其選自SEQ ID NO.2的4A1-F16 VH結(jié)構(gòu)域；SEQ ID NO12的3A1-D5 VH結(jié)構(gòu)域；和包含具有選自SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO13的氨基酸序列的一個(gè)或多個(gè)VH CDR的VH結(jié)構(gòu)域；和/或抗體VL結(jié)構(gòu)域，其選自SEQ ID NO.4的VL結(jié)構(gòu)域和包含具有選自SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10的氨基酸序列的一個(gè)或多個(gè)VL CDR的VL結(jié)構(gòu)域。
2.權(quán)利要求1的特異性結(jié)合成員，包括包含具有SEQ ID NO.7的氨基酸序列的CDR3的抗體VH結(jié)構(gòu)域。
3.權(quán)利要求2的特異性結(jié)合成員，其中抗體VH結(jié)構(gòu)域包括具有SEQ ID NO.6的氨基酸序列的VH CDR2。
4.權(quán)利要求2或權(quán)利要求3的特異性結(jié)合成員，包括包含具有SEQID NO.5的氨基酸序列的VH CDR1的抗體VH結(jié)構(gòu)域。
5.權(quán)利要求2或權(quán)利要求3的特異性結(jié)合成員，包括包含具有SEQID NO.13的氨基酸序列的VH CDR1的抗體VH結(jié)構(gòu)域。
6.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的特異性結(jié)合成員，包括抗體VL結(jié)構(gòu)域。
7.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的特異性結(jié)合成員，該特異性結(jié)合成員與包含4A1-F16 VH結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO.2)和4A1-F16 VL結(jié)構(gòu)域(SEQ IDNO.4或SEQ ID NO50)的抗體的生腱蛋白C-結(jié)合結(jié)構(gòu)域競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合生腱蛋白C。
8.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的特異性結(jié)合成員，包括4A1-F16 VH結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO.2)。
9.權(quán)利要求8的特異性結(jié)合成員，包括4A1-F16 VL結(jié)構(gòu)域(SEQ IDNO.4或SEQ ID NO50)。
10.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的特異性結(jié)合成員，其以等于或優(yōu)于由4A1-F16 VH結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO.2)和4A1-F16 VL結(jié)構(gòu)域(SEQ I NO.4或SEQ ID NO50)形成的生腱蛋白C抗原結(jié)合部位親和力的親和力結(jié)合生腱蛋白C，所述特異性結(jié)合成員的親和力和抗原結(jié)合部位的親和力是在相同條件下測(cè)定的。
11.結(jié)合人生腱蛋白C的特異性結(jié)合成員，其包括抗體VH結(jié)構(gòu)域，其選自E10 VH結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO.15或SEQ ID NO48)；A12 VH結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO25)；F4和G11 VH結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO29或SEQ ID NO45)；和包含具有選自SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.26和SEQ ID NO.27的氨基酸序列的一個(gè)或多個(gè)VH CDR的VH結(jié)構(gòu)域；和/或抗體VL結(jié)構(gòu)域，其選自SEQ ID NO.17或SEQ ID NO81的VL結(jié)構(gòu)域；具有SEQ ID NO31或SEQ ID NO83的氨基酸序列的F4 VL結(jié)構(gòu)域；具有SEQ ID NO35或SEQ ID NO47的氨基酸序列的G11 VL結(jié)構(gòu)域；和包含具有選自SEQ ID NO21、SEQ ID NO22、SEQ ID NO23、SEQ ID NO32和SEQ ID NO33的氨基酸序列的一個(gè)或多個(gè)VL CDR的VL結(jié)構(gòu)域。
12.權(quán)利要求11的特異性結(jié)合成員，包括包含具有SEQ ID NO20的氨基酸序列的CDR3的抗體VH結(jié)構(gòu)域。
13.權(quán)利要求12的特異性結(jié)合成員，其中抗體VH結(jié)構(gòu)域包括具有SEQ ID NO.19的氨基酸序列的VH CDR2。
14.權(quán)利要求12或權(quán)利要求13的特異性結(jié)合成員，包括包含具有SEQ ID NO.18的氨基酸序列的VH CDR1的抗體VH結(jié)構(gòu)域。
15.權(quán)利要求14的特異性結(jié)合成員，其中VH結(jié)構(gòu)域?yàn)榫哂腥鏢EQID NO29或SEQ ID NO45中所示的氨基酸序列的F4&G11 VH結(jié)構(gòu)域。
16.權(quán)利要求12的特異性結(jié)合成員，包括包含具有SEQ ID NO.27的氨基酸序列的VH CDR2的抗體VH結(jié)構(gòu)域。
17.權(quán)利要求12或權(quán)利要求16的特異性結(jié)合成員，包括包含具有SEQ ID NO.26的氨基酸序列的VH CDR1的抗體VH結(jié)構(gòu)域。
18.權(quán)利要求11-17中任一項(xiàng)的特異性結(jié)合成員，包括抗體VL結(jié)構(gòu)域。
19.權(quán)利要求18的特異性結(jié)合成員，其中VL結(jié)構(gòu)域包括具有如SEQ ID NO21或SEQ ID NO32中所示的氨基酸序列的VL CDR1。
20.權(quán)利要求18或權(quán)利要求19的特異性結(jié)合成員，其中VL結(jié)構(gòu)域包括具有如SEQ ID NO22或SEQ ID NO33中所示的氨基酸序列的VL CDR2。
21.權(quán)利要求18、19或20的特異性結(jié)合成員，其中VL結(jié)構(gòu)域包括具有如SEQ ID NO23中所示的氨基酸序列的VL CDR3。
22.權(quán)利要求21的特異性結(jié)合成員，其中VL結(jié)構(gòu)域?yàn)榫哂腥鏢EQID NO31或SEQ ID NO83中所示的氨基酸序列的F4 VL結(jié)構(gòu)域。
23.權(quán)利要求21的特異性結(jié)合成員，其中VL結(jié)構(gòu)域?yàn)榫哂腥鏢EQID NO35或SEQ ID NO 47中所示的氨基酸序列的G11 VL結(jié)構(gòu)域。
24.權(quán)利要求11-23中任一項(xiàng)的特異性結(jié)合成員，該特異性結(jié)合成員與包含E10 VH結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO.15或SEQ ID NO48)和E10 VL結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO.17或SEQ ID NO81)的抗體的生腱蛋白C-結(jié)合結(jié)構(gòu)域競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合生腱蛋白C。
25.權(quán)利要求11-24中任一項(xiàng)的特異性結(jié)合成員，其以等于或優(yōu)于由E10 VH結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO.15或SEQ ID NO48)和E10 VL結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO.17或SEQ ID NO81)形成的生腱蛋白C抗原結(jié)合部位親和力的親和力結(jié)合生腱蛋白C，所述特異性結(jié)合成員的親和力和抗原結(jié)合部位的親和力是在相同條件下測(cè)定的。
26.權(quán)利要求11-25中任一項(xiàng)的特異性結(jié)合成員，包括E10 VH結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO.15或SEQ ID NO48)。
27.權(quán)利要求2 5的特異性結(jié)合成員，包括E10 VL結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO.17或SEQ ID NO81)。
28.結(jié)合人生腱蛋白C的特異性結(jié)合成員，包括抗體VH結(jié)構(gòu)域，其選自SEQ ID NO.58的F4S VH結(jié)構(gòu)域；SEQ IDNO.55的D11 VH結(jié)構(gòu)域；SEQ ID NO52的P12 VH結(jié)構(gòu)域和包含具有選自SEQ ID NO.61、SEQ ID NO.62、SEQ ID NO63、SEQ ID NO64、SEQ ID NO65和SEQ ID NO66的氨基酸序列的一個(gè)或多個(gè)VH CDR的VH結(jié)構(gòu)域；和/或抗體VL結(jié)構(gòu)域，其選自SEQ ID NO.54的P12和D11 VL結(jié)構(gòu)域；SEQ ID NO60的F4S VL結(jié)構(gòu)域；和包含選自具有SEQ ID NO.67、SEQID NO.68、SEQ ID NO69、SEQ ID NO70和SEQ ID NO.71的氨基酸序列的一個(gè)或多個(gè)VL CDR的VL結(jié)構(gòu)域。
29.權(quán)利要求28的特異性結(jié)合成員，包括包含如SEQ ID NO66中所示的P12、D11和F4S的CDR3序列的抗體VH結(jié)構(gòu)域。
30.權(quán)利要求29的特異性結(jié)合成員，包括包含如SEQ ID NO61，63和66中所示的P12的CDR序列的抗體VH結(jié)構(gòu)域。
31.權(quán)利要求29的特異性結(jié)合成員，包括包含如SEQ ID NO62，64和66中所示的D11的CDR序列的抗體VH結(jié)構(gòu)域。
32.權(quán)利要求29的特異性結(jié)合成員，包括包含如SEQ ID NO62，65和66中所示的F4S的CDR序列的抗體VH結(jié)構(gòu)域。
33.權(quán)利要求28-32中任一項(xiàng)的特異性結(jié)合成員，包括抗體VL結(jié)構(gòu)域。
34.權(quán)利要求33的特異性結(jié)合成員，其中VL結(jié)構(gòu)域包括如SEQ IDNO71中所示的P12、D11和F4S的CDR3序列。
35.權(quán)利要求34的特異性結(jié)合成員，其中VL結(jié)構(gòu)域包括如SEQ IDNO67，69和71中所示的P12的CDR序列。
36.權(quán)利要求34的特異性結(jié)合成員，其中VL結(jié)構(gòu)域包括如SEQ IDNO67，69和71中所示的D11的CDR序列。
37.權(quán)利要求34的特異性結(jié)合成員，其中VL結(jié)構(gòu)域包括如SEQ IDNO68，70和71中所示的F4S的CDR序列。
38.權(quán)利要求1-37中任一項(xiàng)的特異性結(jié)合成員，其包括scFv抗體分子。
39.權(quán)利要求1-37中任一項(xiàng)的特異性結(jié)合成員，其包括抗體恒定區(qū)。
40.權(quán)利要求39的特異性結(jié)合成員，其包括完整抗體。
41.權(quán)利要求1-40中任一項(xiàng)的特異性結(jié)合成員，其與可檢測(cè)標(biāo)記或細(xì)胞因子綴合。
42.權(quán)利要求42的特異性結(jié)合成員，其中該特異性結(jié)合成員的VH結(jié)構(gòu)域或VL結(jié)構(gòu)域與細(xì)胞因子通過(guò)肽接頭綴合成融合蛋白。
43.權(quán)利要求42或權(quán)利要求43的特異性結(jié)合成員，其中所述的細(xì)胞因子為IL2。
44.權(quán)利要求1-41中任一項(xiàng)的特異性結(jié)合成員，其與細(xì)胞毒性劑綴合。
45.分離的核酸，包括編碼權(quán)利要求1-43中任一項(xiàng)的特異性結(jié)合成員或特異性結(jié)合成員的抗體VH或VL結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列。
46.用權(quán)利要求45的核酸轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
47.生產(chǎn)特異性結(jié)合成員或抗體VH或VL結(jié)構(gòu)域的方法，該方法包括在生產(chǎn)所述的特異性結(jié)合成員或抗體VH或VL結(jié)構(gòu)域的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求46的宿主細(xì)胞。
48.權(quán)利要求47的方法，進(jìn)一步包括分離和/或純化所述的特異性結(jié)合成員或抗體VH或VL可變結(jié)構(gòu)域。
49.權(quán)利要求48的方法，包括使所述的特異性結(jié)合成員或抗體VH或VL可變結(jié)構(gòu)域與可檢測(cè)標(biāo)記或細(xì)胞毒性劑綴合。
50.權(quán)利要求49的方法，其中所述的標(biāo)記為放射性核素或熒光團(tuán)。
51.權(quán)利要求47-50中任一項(xiàng)的方法，進(jìn)一步包括將所述的特異性結(jié)合成員或抗體VH或VL可變結(jié)構(gòu)域配制成包括至少一種額外成分的組合物。
52.獲得結(jié)合生腱蛋白C的特異性結(jié)合成員的方法，該方法包括通過(guò)在親代VH結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列上添加、缺失、取代或插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸來(lái)提供各自為所述親代VH結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列變體的一個(gè)或多個(gè)VH結(jié)構(gòu)域，所述的親代VH結(jié)構(gòu)域選自4A1-F16 VH結(jié)構(gòu)域；3A1-D5 VH結(jié)構(gòu)域；E10 VH結(jié)構(gòu)域；A12 VH結(jié)構(gòu)域；F4&G11 VH結(jié)構(gòu)域；P12 VH結(jié)構(gòu)域；D11 VH結(jié)構(gòu)域和F4S VH結(jié)構(gòu)域；任選地，將由此提供的一個(gè)或多個(gè)VH結(jié)構(gòu)域氨基酸序列變體與一個(gè)或多個(gè)VL結(jié)構(gòu)域結(jié)合，以便提供一個(gè)或多個(gè)VH/VL的組合；和/或通過(guò)在親代VL結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列上添加、缺失、取代或插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸來(lái)提供作為親代VL結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列變體的VL結(jié)構(gòu)域，所述的親代VL結(jié)構(gòu)域選自4A1-F16/3A1-D5 VL結(jié)構(gòu)域；E10/A12 VL結(jié)構(gòu)域；F4 VL結(jié)構(gòu)域；G11 VL結(jié)構(gòu)域；P12/D11 VL結(jié)構(gòu)域和F4S VL結(jié)構(gòu)域；將由此提供的一個(gè)或多個(gè)VL結(jié)構(gòu)域氨基酸序列變體與一個(gè)或多個(gè)VH結(jié)構(gòu)域結(jié)合，以便提供一個(gè)或多個(gè)VH/VL結(jié)構(gòu)域的組合；并且測(cè)試VH結(jié)構(gòu)域氨基酸序列變體或VH/VL組合以鑒定結(jié)合生腱蛋白C的特異性結(jié)合成員。
53.獲得結(jié)合生腱蛋白C的特異性結(jié)合成員的方法，該方法包括提供編碼一個(gè)或多個(gè)包含待被取代的CDR或缺乏CDR編碼區(qū)的VH結(jié)構(gòu)域的起始核酸，并且將所述的起始核酸與編碼VH CDR氨基酸序列的供體核酸結(jié)合，所述的VH CDR氨基酸序列選自SEQ ID NO5；SEQ IDNO6；SEQ ID NO7；SEQ ID NO13；SEQ ID NO18；SEQ ID N019；SEQ ID NO20；SEQ ID NO26；SEQ ID NO27；SEQ ID NO61；SEQ IDNO62；SEQ ID NO63；SEQ ID NO64；SEQ ID NO65；和SEQ IDNO66，由此將所述的供體核酸插入起始核酸中的CDR區(qū)，以便提供編碼VH結(jié)構(gòu)域的產(chǎn)物核酸；表達(dá)所述產(chǎn)物核酸的核酸，所述的產(chǎn)物核酸編碼VH結(jié)構(gòu)域并且任選將由此產(chǎn)生的VH結(jié)構(gòu)域與一個(gè)或多個(gè)VL結(jié)構(gòu)域結(jié)合而提供VH/VL組合；和/或表達(dá)所述產(chǎn)物核酸的核酸，所述的產(chǎn)物核酸編碼VL結(jié)構(gòu)域和將由此產(chǎn)生的VL結(jié)構(gòu)域與一個(gè)或多個(gè)VH結(jié)構(gòu)域結(jié)合而提供VH/VL組合；選擇結(jié)合生腱蛋白C的包含VH結(jié)構(gòu)域或VH/VL組合的特異性結(jié)合成員；和回收結(jié)合生腱蛋白C的特異性結(jié)合成員和/或編碼結(jié)合生腱蛋白C的特異性結(jié)合成員的核酸。
54.權(quán)利要求52或權(quán)利要求53的方法，其中結(jié)合生腱蛋白C的特異性結(jié)合成員為包含VH結(jié)構(gòu)域和VL結(jié)構(gòu)域的抗體片段。
55.權(quán)利要求54的方法，其中所述的抗體片段為scFv抗體分子。
56.權(quán)利要求54的方法，其中所述的抗體片段為Fab抗體分子。
57.權(quán)利要求54的方法，進(jìn)一步包括提供完整抗體中抗體片段的VH結(jié)構(gòu)域和/或VL結(jié)構(gòu)域。
58.權(quán)利要求52-57中任一項(xiàng)的方法，進(jìn)一步包括使所述的特異性結(jié)合成員與可檢測(cè)標(biāo)記綴合。
59.權(quán)利要求52-57中任一項(xiàng)的方法，進(jìn)一步包括使所述的特異性結(jié)合成員與抗癌劑綴合。
60.權(quán)利要求52-59中任一項(xiàng)的方法，進(jìn)一步包括將結(jié)合生腱蛋白C的特異性結(jié)合成員或結(jié)合生腱蛋白C的特異性結(jié)合成員的抗體VH或VL可變結(jié)構(gòu)域的特異性結(jié)合成員配制成包括至少一種額外成分的組合物。
61.權(quán)利要求47-60中任一項(xiàng)的方法，進(jìn)一步包括使特異性結(jié)合成員結(jié)合生腱蛋白C或生腱蛋白C的片段。
62.包括使權(quán)利要求1-44中任一項(xiàng)的特異性結(jié)合成員與生腱蛋白C或生腱蛋白C的片段結(jié)合的方法。
63.權(quán)利要求61或權(quán)利要求62的方法，其中所述的結(jié)合在體外進(jìn)行。
64.權(quán)利要求61-63中任一項(xiàng)的方法，包括測(cè)定特異性結(jié)合成員的結(jié)合量。
65.權(quán)利要求1-44中任一項(xiàng)的特異性結(jié)合成員在治療或診斷方法中的應(yīng)用。
66.權(quán)利要求1-44中任一項(xiàng)的特異性結(jié)合成員在制備用于治療方法或增殖性病癥的體內(nèi)診斷的藥物中的應(yīng)用。
67.治療個(gè)體增殖性病癥的方法，包括對(duì)該個(gè)體給予權(quán)利要求1-44中任一項(xiàng)的特異性結(jié)合成員。
68.檢測(cè)和/或成像個(gè)體腫瘤細(xì)胞的方法，包括對(duì)該個(gè)體給予權(quán)利要求1-44中任一項(xiàng)的特異性結(jié)合成員；并且檢測(cè)所述抗體與所述個(gè)體的腫瘤細(xì)胞的結(jié)合。
69.權(quán)利要求68的方法，其中所述的特異性結(jié)合成員與可檢測(cè)標(biāo)記綴合。
全文摘要
本發(fā)明涉及針對(duì)胞外基質(zhì)蛋白生腱蛋白C的特異性結(jié)合成員，尤其是針對(duì)生腱蛋白C的結(jié)構(gòu)域A1、結(jié)構(gòu)域C和結(jié)構(gòu)域D的scFv抗體分子?？股斓鞍證特異性結(jié)合成員與標(biāo)記、細(xì)胞毒性或細(xì)胞因子綴合?？股斓鞍證特異性結(jié)合成員在診斷和治療，尤其是癌癥中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N15/13GK101090913SQ200580044755
公開(kāi)日2007年12月19日 申請(qǐng)日期2005年10月31日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月9日
發(fā)明者S·布拉克, M·西拉齊, D·內(nèi)里 申請(qǐng)人:菲羅根股份公司