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      生產(chǎn)類鞘氨醇?jí)A或其衍生物的微生物菌株的制作方法

      文檔序號(hào):440757閱讀:856來(lái)源:國(guó)知局

      專利名稱::生產(chǎn)類鞘氨醇?jí)A或其衍生物的微生物菌株的制作方法生產(chǎn)類鞘氨醇?jí)A或其衍生物的微生物菌株術(shù)語(yǔ)"鞘脂(sphingolipids)"指衍生自諸如鞘氨醇(sphingosine)的類鞘氨醇?jí)A(sphingoidbase)的一組脂類物質(zhì)。鞘脂經(jīng)常發(fā)現(xiàn)于動(dòng)物、植物和微生物細(xì)胞的膜中。神經(jīng)酰胺是一組特別的鞘脂,其含有鞘氨醇、植物鞘氨醇或者二氫鞘氨醇(dihydrosphingosine,也稱作二氫神經(jīng)鞘氨醇(sphinganine)),在與月旨肪酸的酰胺連接中作為堿部分(類鞘氨醇?jí)A)。神經(jīng)酰胺是皮膚上層角質(zhì)層的主要脂類組分。包含鞘脂(例如神經(jīng)酰胺)的組合物的局部應(yīng)用能改善皮膚的屏障功能和水分保持性質(zhì)(Curratolo,1987,Pharm.Res.4,271-277;Kerscheretal.,1991,Eur.J.Dermatol.1,39-43)。此外,上述類鞘氨醇?jí)A已知能介導(dǎo)若干生理作用,例如抑制蛋白質(zhì)激酶C的活性,因此由于其抗炎和抗微生物活性被包括進(jìn)化妝品或皮膚護(hù)理組合物。因?yàn)榍拾贝际侨祟愔星手闹饕惽拾贝級(jí)A,人們對(duì)其有著相當(dāng)大的商業(yè)興趣,以生產(chǎn)鞘氨醇和含鞘氨醇的鞘脂,用于食品、制藥和化妝品應(yīng)用。目前,己開發(fā)了用于化學(xué)合成鞘氨醇(以及二氫神經(jīng)鞘氨醇)的若干途徑。但是,由于這些分子中存在兩個(gè)立體異構(gòu)中心,化學(xué)合成產(chǎn)生外消旋混合物,其中僅有25%是天然存在的立體異構(gòu)化學(xué)構(gòu)型。此外,由于在這些分子中存在三個(gè)功能基團(tuán),必須要應(yīng)用大量的化學(xué)保護(hù)方法。因此,通過(guò)化學(xué)合成生產(chǎn)的鞘氨醇和二氫神經(jīng)鞘氨醇非常昂貴,使其無(wú)法被包括進(jìn)食物和化妝品配方。對(duì)于從天然來(lái)源(例如腦或雞蛋)分離的純鞘氨醇和二氫神經(jīng)鞘氨醇而言,也是這樣。還可獲得從動(dòng)物來(lái)源提取的異源鞘脂制劑。雖然這比純的化合物便宜,但是它們存在組成異源性的缺點(diǎn),因?yàn)榭赡芎胁≡锒赡懿粔虬踩?。與哺乳動(dòng)物相反,在微生物中,植物鞘氨醇(而非鞘氨醇)才是鞘脂的主要的類鞘氨醇?jí)A性組分。通常,植物鞘氨醇不在微生物中積累,但是其是鞘脂的從頭生物合成途徑的一部分。酵母巧c&aay^rZz'(WickerhamandStodola,1960,J.Bacteriol.80,484-491)顯示出能生產(chǎn)相當(dāng)高水平的類鞘氨醇?jí)A及其衍生物,但全部是以C18-鞘氨醇及其乙?;苌镒鳛橹饕M成成分的植物鞘氨醇。其生產(chǎn)水平遠(yuǎn)高于對(duì)鞘脂從頭進(jìn)行生物合成所必須的。該鞘氨醇可從酵母中提取,并且化學(xué)轉(zhuǎn)化為,例如,神經(jīng)酰胺,由此獲得純的化妝品成分(見(jiàn),例如WO93/20038)。WO00/01839公開了通過(guò)經(jīng)典誘變獲得的尸/c/n'aczy^r/z'菌株,其展示出對(duì)類鞘氨醇?jí)A植物鞘氨醇的提高的生產(chǎn)水平。但是,還沒(méi)有獲得用于生產(chǎn)鞘氨醇和二氫神經(jīng)鞘氨醇純化合物的天然存在的立體異構(gòu)體的經(jīng)濟(jì)上更可行的方法,人們對(duì)其非常需要。Barenholzetal(1973,BiochimicaetBiophysicaActa306:341-345)描述了通過(guò)不含細(xì)胞的提取物進(jìn)行的對(duì)少量經(jīng)放射性標(biāo)記的人工底物向二氫鞘氨醇(二氫神經(jīng)鞘氨醇)的轉(zhuǎn)化。但是,整個(gè)細(xì)胞幾乎專門生產(chǎn)植物鞘氨醇,如作者在第344頁(yè)所述"該工作僅測(cè)量了對(duì)二氫鞘氨醇的合成,而高產(chǎn)者主要積累乙?;闹参锴拾贝?。已通過(guò)針對(duì)丁香假單胞霉素E(syringomycinE)抗性突變體的篩選,通過(guò)在單倍體^cc/wframyc^細(xì)胞中擾亂SYR2基因(Grilleyetal.,1998,JBiolChem273:11062-11068),獲得了積累二氫神經(jīng)鞘氨醇的酵母。但是,這些酵母生產(chǎn)非常低水平的二氫神經(jīng)鞘氨醇,其不足以高效生產(chǎn)。Baeetal.(2004,Yeast,21:437-443)描述了缺少C4-二氫神經(jīng)鞘氨醇羥化酶的^ccAaramyc^ce^W^ze犯"空突變體的二氫神經(jīng)鞘氨醇生產(chǎn)水平。其顯示為僅346pmol/mg蛋白質(zhì),這對(duì)應(yīng)于大約10微克/g生物質(zhì)。這對(duì)于商業(yè)化工藝來(lái)說(shuō)太低了。因此,本發(fā)明的一個(gè)目的是提供下述微生物菌株,它們能生產(chǎn)不是C-18植物鞘氨醇的類鞘氨醇?jí)A,特別是二氫神經(jīng)鞘氨醇和/或鞘氨醇。因此,在第一個(gè)方面,本發(fā)明提供了一種微生物菌株,特別是酵母菌株,其能生產(chǎn)對(duì)每g生物質(zhì)干重而言至少0.1mg的根據(jù)結(jié)構(gòu)式I:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>的類鞘氨醇?jí)A或其鹽或酯,其中,A-B選自CH2-CH2和CKNCH構(gòu)成的組,并且,其中,R選自下述構(gòu)成的組a)(CH2)m-X-(CH2)n-CH3,其中m和n每個(gè)獨(dú)立地在0至18(含)之間,X是CH2隱CH2、CH=CH、C三C、CHOH-CH2、HC=0-CH2,前提條件是m+n應(yīng)當(dāng)在0至18(含)之間,以及b)(CH2)p-CH=CH-(CH2)q-CH=CH-(CH2)w-CH3,其中p、q和w每個(gè)獨(dú)立地在0至16(含)之間,前提條件是p+q+w應(yīng)當(dāng)在0至16(含)之間。優(yōu)選地,本發(fā)明的酵母菌株能生產(chǎn)對(duì)每g生物質(zhì)干重而言至少1mg的根據(jù)結(jié)構(gòu)式I的類鞘氨醇?jí)A,更優(yōu)選地,每g生物質(zhì)干重至少10mg。技術(shù)人員將理解,類鞘氨醇?jí)A生產(chǎn)率的上限可能是每g生物質(zhì)干重大約500mg。優(yōu)選地,當(dāng)在下述條件下培養(yǎng)能生產(chǎn)類鞘氨醇?jí)A的微生物菌株時(shí),測(cè)量本發(fā)明的微生物菌株的類鞘氨醇?jí)A生產(chǎn)率。從瓊脂平板將微生物細(xì)胞接種進(jìn)500ml搖瓶中的100mlYEPD培養(yǎng)基,在30°C和280rpm培養(yǎng)72小時(shí)。隨后,將該培養(yǎng)物的1%轉(zhuǎn)移到裝有100mlLCBNB生產(chǎn)培養(yǎng)基的帶擋板500ml搖瓶中,在30°C和280rpm培養(yǎng)96小時(shí)。通過(guò)HPLC或MS來(lái)方便地測(cè)量鞘氨醇生產(chǎn)率。本發(fā)明的微生物菌株優(yōu)選是酵母菌株,更優(yōu)選地是Ac/^的菌株,最優(yōu)選地是CZ/^T"的菌株。在另一種實(shí)施方式中,根據(jù)結(jié)構(gòu)式I的類鞘氨醇?jí)A是?;バ问降?。?;ㄟ^(guò)羥基連接到類鞘氨醇?jí)A上,即"真正的"酯連接,和/或通過(guò)氨基連接,即,酰胺連接。優(yōu)選地,酰基是1-4個(gè)碳原子的直短鏈?;?,更優(yōu)選地,是乙?;?。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中,根據(jù)結(jié)構(gòu)式I的類鞘氨醇?jí)A具有根據(jù)結(jié)構(gòu)式II的D-赤-(2R,3S)-構(gòu)型<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>其中,A-B和R如上文定義。還優(yōu)選的是根據(jù)結(jié)構(gòu)式I或II的化合物,其中,R是(CH2)m-X-(CH2)n-CH3,其中,更優(yōu)選地,m是0,X是CH2-CH2或CHOH-CH2,最優(yōu)選地,X是CH2-CH2,n在8至12之間,最優(yōu)選地,n是10。尤其優(yōu)選的是其中A-B是CH2-CH2或CH=CH并且R是(012)12-0^3的根據(jù)結(jié)構(gòu)式I或II的化合物。技術(shù)人員將理解,通過(guò)微生物生產(chǎn)的類鞘氨醇?jí)A可組成具有不同鏈長(zhǎng)(即不同長(zhǎng)度的R基團(tuán))的類鞘氨醇?jí)A的混合物。一些情況下,一種鏈長(zhǎng)可能占優(yōu)勢(shì)地存在,但是包含大致等量的不同鏈長(zhǎng)的混合物也是可能的。在第二個(gè)方面,本發(fā)明提供了一種方法,用于分離根據(jù)第一個(gè)方面的微生物菌株。所述方法包括在存在合適濃度的毒素的情況下,培養(yǎng)微生物細(xì)胞的群體,選擇對(duì)于所述毒素具有抗性的細(xì)胞亞群,從對(duì)毒素具有抗性的細(xì)胞亞群中分離出能生產(chǎn)對(duì)每g生物質(zhì)干重而言至少0.1mg的結(jié)構(gòu)式(I)的類鞘氨醇?jí)A的細(xì)胞。在根據(jù)本發(fā)明的方法中,在存在合適濃度的毒素的情況下,培養(yǎng)微生物細(xì)胞的群體,分離(選擇)出對(duì)于所述毒素具有抗性的細(xì)胞亞群。應(yīng)用的毒素應(yīng)當(dāng)對(duì)微生物細(xì)胞的起始群體具有毒性,即,所述毒素應(yīng)當(dāng)具有使得當(dāng)細(xì)胞在合適濃度的該毒素存在的情況下被培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞不能生長(zhǎng)或存活的作用。當(dāng)在存在合適濃度的毒素的情況下培養(yǎng)時(shí),分離出對(duì)毒素展示出抗性的細(xì)胞亞群,即能在存在毒素的情況下能生長(zhǎng)的細(xì)胞亞群。這些毒素抗性細(xì)胞的亞組可能已獲得了一種或多種突變,所述突變例如提供對(duì)根據(jù)結(jié)構(gòu)式I的類鞘氨醇?jí)A的提高的生產(chǎn)水平??蓱?yīng)用于此類選擇的典型的毒素是丁香假單胞霉素E,它在二氫神經(jīng)鞘氨醇羥化酶的作用下成為有毒性的(Grilleyetal.(1998),J,Biol.Chem.273,11062-11068),因此抗性細(xì)胞可能是二氫神經(jīng)鞘氨醇羥化酶陰性突變體;非乙?;念惽拾贝?jí)A,例如二氫神經(jīng)鞘氨醇、植物鞘氨醇和鞘氨醇,它們作為生長(zhǎng)抑制劑或者作為凋亡誘導(dǎo)化合物發(fā)揮毒性作用(Chimgetal.(2001),J.Biol.Chem.276,35614-35621;Chengetal.(2003),Mol.Cell.Biol.23,163-177),抗性細(xì)胞可能是非敏感型類鞘氨醇?jí)A過(guò)量生產(chǎn)細(xì)胞;伏馬毒素(fumonisin),其是(二氫)神經(jīng)酰胺合酶的抑制劑,抗性細(xì)胞可能是具有增加的經(jīng)歷類鞘氨醇?jí)A生物合成途徑通量的細(xì)胞(Merill(2002),J.Biol.Chem.277,25843-25846);AAL(乂temahaWfemato)毒素,其是類鞘氨醇?jí)A的類似物,抗性細(xì)胞可能是產(chǎn)生具有改變的水平和/或改變的組成的類鞘氨醇?jí)A的細(xì)胞(Abbasetal.(1994),PlantPhysiol.106,1086-1093)。毒素的合適濃度典型地為針對(duì)將被用于進(jìn)行本發(fā)明方法的微生物細(xì)胞發(fā)現(xiàn)的最小抑制濃度(MIC值)左右。MIC值將取決于所用的微生物細(xì)胞,其可能在例如2至10/xg/ml之間。從具有毒素抗性的細(xì)胞亞群分離出下述微生物菌株,所述菌株能生產(chǎn)對(duì)每g生物質(zhì)干重而言至少O.lmg的根據(jù)結(jié)構(gòu)式I的類鞘氨醇?jí)A。令人吃驚地,我們發(fā)現(xiàn),毒素抗性細(xì)胞中有很高百分比能生產(chǎn)對(duì)每g生物質(zhì)干重而言至少0.1mg的根據(jù)結(jié)構(gòu)式I的類鞘氨醇?jí)A。特別地,我們吃驚地發(fā)現(xiàn),使用毒素丁香假單胞霉素E獲得了能生產(chǎn)高水平二氫神經(jīng)鞘氨醇的丁香假單胞霉素E抗性乃'c/nhczy^rzY。這之所以令人吃驚是因?yàn)槿藗冋J(rèn)為針對(duì)單倍體物種的方法,例如&ce^v^'^描述的方法(上文Grilleyetal.,)不可能對(duì)二倍體物種例如尸z'c/n'ac(/^n7有用(WickerhamandBurton,1962,BacteriolRev.26:382-397),尤其是如果此類二倍體物種還具有高的類鞘氨醇?jí)A通量的話。有多個(gè)例子證明基于對(duì)毒素的抗性來(lái)分離特定突變體對(duì)二倍體物種很麻煩。例如Noseketal.,(2002,CurrGenet,42:27-35)描述了即使在存在毒素的情況下培養(yǎng)之前對(duì)細(xì)胞進(jìn)行誘變處理,也不能分離出二倍體酵母菌株Camfe/a/ara戸z7a^SR23的5-氟乳清酸(5-FOA)抗性克隆。在另一公開文獻(xiàn)(WellingtonandRustchenko,2005,Yeast,22:57-70)中,報(bào)導(dǎo)了對(duì)二倍體酵母菌株C"^fefaa/^'o^的5-FOA-抗性克隆的分離。但是,這些克隆保留為尿嘧啶原營(yíng)養(yǎng)型。因此,在單倍體酵母物種中,例如Sacc/wramycecewWw'ae的實(shí)驗(yàn)室菌株中容易進(jìn)行的通過(guò)處理5-FOA對(duì)編碼乳清苷-5'-磷酸脫羧酶的基因的定位失活在二倍體酵母菌株中看起來(lái)是不可能的。類鞘氨醇?jí)A,例如二氫神經(jīng)鞘氨醇,已知能誘導(dǎo)凋亡(Chengetal.,2003,MolCellBiol,23:163-177)。P.q&mY明顯地通過(guò)高效乙酰化以及隨后植物鞘氨醇的分泌回避了該問(wèn)題。但是,當(dāng)細(xì)胞被驅(qū)動(dòng)以積累二氫神經(jīng)鞘氨醇來(lái)代替植物鞘氨醇的時(shí)候此類生物將如何反應(yīng)卻是不可預(yù)測(cè)的。用本發(fā)明的方法處理的微生物群體可以是從一種特定的親本菌株獲得的相同細(xì)胞的群體。以這種方式,典型地,可分離自發(fā)突變體。用本發(fā)明的方法處理的微生物細(xì)胞的群體還可以是先經(jīng)過(guò)誘變處理以將遺傳變異有意引入到所述群體中的細(xì)胞群體。典型地,誘變處理可包含所謂的經(jīng)典處理,其還可包括DNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。經(jīng)典處理包括原生質(zhì)體融合和/或用UV放射或某些化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行的處理。在一種實(shí)施方式中,生產(chǎn)根據(jù)結(jié)構(gòu)式I的類鞘氨醇?jí)A的微生物細(xì)胞是從下述細(xì)胞群體分離的,所述細(xì)胞群體被誘變處理,但在誘變處理前并不經(jīng)過(guò)毒素處理。當(dāng)誘變處理是DNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化時(shí),該實(shí)施方式特別有用,更特別地,為了對(duì)鞘脂代謝途徑加以工程改造的目的時(shí)。在另一種實(shí)施方式中,誘變處理在毒素抗性細(xì)胞上進(jìn)行,優(yōu)選地,在能生產(chǎn)對(duì)每g生物質(zhì)干重而言至少0.1mg的根據(jù)結(jié)構(gòu)式I的類鞘氨醇?jí)A的毒素抗性細(xì)胞上進(jìn)行。當(dāng)誘變處理是DNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化以便對(duì)鞘脂代謝途徑加以工程改造時(shí),該實(shí)施方式也特別有用。對(duì)鞘脂代謝途徑進(jìn)行工程改造可以以多種方式進(jìn)行。例如,通過(guò)對(duì)來(lái)自代謝途徑的一種或多種酶的表達(dá)水平加以改變,即增加或減少,來(lái)進(jìn)行。例如通過(guò)對(duì)編碼感興趣的酶的基因進(jìn)行靶向失活,可由此實(shí)現(xiàn)表達(dá)水平的減少。此外,或或者,通過(guò)修飾代謝途徑的一種或多種單個(gè)的酶,例如,以獲得對(duì)于特定底物具有改變的底物特異性或更高的親和性的酶。對(duì)鞘脂代謝途徑進(jìn)行工程改造的一個(gè)例子是增加二氫神經(jīng)酰胺去飽和酶的表達(dá)水平,即過(guò)量表達(dá)編碼二氫神經(jīng)酰胺去飽和酶的基因,特別地,這提供于本發(fā)明的另一方面中。對(duì)鞘脂代謝途徑進(jìn)行工程改造的另一個(gè)例子是以下述方式對(duì)去飽和酶的底物范圍加以修飾,所述方式使得,類鞘氨醇?jí)A(例如二氫神經(jīng)鞘氨醇)代替神經(jīng)酰胺(特別是二氫神經(jīng)酰胺)成為該酶的優(yōu)選底物,這提供了二氫神經(jīng)鞘氨醇向鞘氨醇的直接原位轉(zhuǎn)化。對(duì)鞘脂代謝途徑進(jìn)行工程改造的其它例子是對(duì)類鞘氨醇?jí)A的乙?;闆r的改變,對(duì)類鞘氨醇?jí)A的鏈長(zhǎng)組成的改變和/或類鞘氨醇?jí)A增加或減少的分泌。具有經(jīng)改變的乙?;闆r的類鞘氨醇?jí)A可通過(guò)下述手段獲得,例如,篩選出以及(可能地)富集具有經(jīng)修飾乙?;钚院?或經(jīng)修飾的分泌活性的突變體菌株,這以下述方式來(lái)進(jìn)行,所述方式使得較之親本菌株能生產(chǎn)更多或更少的、根據(jù)結(jié)構(gòu)式I的類鞘氨醇?jí)A的乙?;问降木瓯环蛛x出來(lái)。本發(fā)明還包括對(duì)二氫祌經(jīng)酰胺去飽和酶活性的修飾,可選地,結(jié)合對(duì)神經(jīng)酰胺酶活性的修飾,可選地,結(jié)合對(duì)乙酰化酶的修飾,可選地,結(jié)合對(duì)分泌機(jī)制的酶的修飾,這以下述方式來(lái)進(jìn)行,所述方式使得從細(xì)胞內(nèi)二氫神經(jīng)鞘氨醇經(jīng)由神經(jīng)酰胺到分泌的鞘氨醇的通量增加。在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中,分離出下述微生物菌株,較之親本菌株,所述微生物菌株展示出對(duì)根據(jù)結(jié)構(gòu)式I的類鞘氨醇?jí)A的提高的生產(chǎn)率,和/或鞘脂代謝途徑中的酶表達(dá)水平和/或細(xì)胞內(nèi)定位的變化。類鞘氨醇?jí)A的提高的生產(chǎn)率由此包括較之親本菌株的生產(chǎn)率增加和/或?qū)τH本菌株基本不生產(chǎn)的類鞘氨醇?jí)A的生產(chǎn)。鞘脂代謝途徑中的酶的表達(dá)水平的變化由此包括較之親本菌株表達(dá)水平的增加和/或親本菌株不表達(dá)的酶活性的表達(dá)。在本發(fā)明的上下文中,親本菌株是基本不產(chǎn)生根據(jù)結(jié)構(gòu)式I的類鞘氨醇?jí)A的菌株。例如,合適的親本菌株可以是下述菌株在特定條件下,其以低于每g生物質(zhì)干重0.1mg的水平產(chǎn)生根據(jù)結(jié)構(gòu)式I的類鞘氨醇?jí)A。親本菌株還可以是下述菌株,其生產(chǎn)大量的并非是根據(jù)結(jié)構(gòu)式I的類鞘氨醇?jí)A的類鞘氨醇?jí)A,例如,優(yōu)選地,尸/c/n'acz/wnYNRRLY-1031F-60-10禾口/或WO95/12683公開的任何ft'c/n'ac^rn'菌株,所有這些都主要產(chǎn)生C18-植物鞘氨醇。在第三個(gè)方面,本發(fā)明提供了具有二氫神經(jīng)酰胺去飽和酶活性的多肽,優(yōu)選地,可從酵母Ac/^cz/^777獲得。特別地,本發(fā)明的具有二氫神經(jīng)酰胺去飽和酶的多肽具有根據(jù)SEQIDNO:1的氨基酸序列和/或具有與SEQIDNO:1至少67%的百分比同一性的氨基酸序列,優(yōu)選地,與SEQIDNO:1至少70%,更優(yōu)選地,至少80%,最優(yōu)選地,至少90%的同一性(同源多肽)。同源多肽可以是可從其它微生物(特別是酵母)菌株獲得的變體,或者可以是經(jīng)過(guò)工程改造的變體。我們吃驚地發(fā)現(xiàn),生產(chǎn)大量植物鞘氨醇而非鞘氨醇的巧c/n'ac^rn'〖含有與來(lái)自O(shè)z"^/fla/Zn'ca/u的二氫神經(jīng)酰胺去飽和酶的序列相似的多肽。技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到下述事實(shí),可獲得多種不同的計(jì)算程序來(lái)確定兩條序列間的百分比同一性。例如,使用NeedlemanandWunsch(J.Mol.Biol.(48):444-453(1970))算法來(lái)確定兩條氨基酸序列間的百分比同一性,該算法己被并入GCG軟件包的GAP程序(可從h加:〃www.gcg.com獲得),其中使用Blossom62矩陣或PAM250矩陣,以及16、14、12、10、8、6或4的缺口權(quán)重以及1、2、3、4、5或6的長(zhǎng)度權(quán)重。技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到,所有這些不同參數(shù)可能產(chǎn)生略有不同的結(jié)果,但是使用不同算法時(shí)兩條序列間的整體百分比同一性不會(huì)有顯著改變。方便地,采用缺省設(shè)置(缺口權(quán)重為12,長(zhǎng)度權(quán)重為l),使用Blossom62矩陣。本發(fā)明令人吃驚地顯示較之親本菌株展示出對(duì)本發(fā)明多肽的更高的表達(dá)水平的微生物細(xì)胞展示出了對(duì)根據(jù)結(jié)構(gòu)式I的類鞘氨醇?jí)A的提高的生產(chǎn)率。特別是下述根據(jù)結(jié)構(gòu)式I的類鞘氨醇?jí)A,其中,A-B是CI^CH,R是(CH^-X-(CH2)n-CH3,其中,更優(yōu)選地,m是0,X是CHrCH2或CHOH-CH2,以及n在8至12之間,最優(yōu)選地,n是10。在第四個(gè)方面,本發(fā)明提供了一種多核苷酸,其包含編碼第三個(gè)方面的多肽的核苷酸序列。優(yōu)選地,多核苷酸包含編碼SEQIDNO:1的氨基酸序列的核苷酸序列。更優(yōu)選地,編碼SEQIDNO:1的氨基酸序列的核苷酸序列是SEQIDNO:2或者被SEQIDNO:3包含。特別地,本發(fā)明涉及一種同源多核苷酸,其包含編碼第三個(gè)方面的多肽的核苷酸序列,在嚴(yán)謹(jǐn)條件下,優(yōu)選在高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下,能與根據(jù)SEQIDNO:2的核苷酸序列或其亞序列雜交。有利地,此類同源多核苷酸可從生產(chǎn)類鞘氨醇?jí)A的微生物菌株獲得,特別地,從生產(chǎn)類鞘氨醇?jí)A的酵母菌株獲得,更特別地,從乃'c/^菌株獲得。例如,使用SEQIDNO:2或其亞序列的核酸序列作為雜交探針,可使用標(biāo)準(zhǔn)雜交和克隆技術(shù)(例如,如Sambrook,J.,Fritsh,E.F.,andManiatis,T.MolecularCloning:ALaboratoryManual.2nd,ed"ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,1989所述)分離出本發(fā)明的核酸分子。本文中使用的術(shù)語(yǔ)"雜交"意欲描述下述雜交和洗滌條件,在所述條件下,典型地,互相至少大約50%,至少大約60%,至少大約70%,更優(yōu)選至少大約80%,進(jìn)一步更優(yōu)選至少大約85%至90%,更優(yōu)選至少95%相同的核苷酸序列保持為互相雜交。此類雜交條件的一種優(yōu)選非限制性例子是大約45°C時(shí)在6X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中雜交,接著在1XSSC、0.1%SDS中于50。C洗一次或多次,優(yōu)選在55。C,優(yōu)選在60。C,進(jìn)一步更優(yōu)選在65。C洗。高度嚴(yán)謹(jǐn)條件包括,例如,在68。C時(shí),在5xSSC/5xDenhardt's溶液/0.1%SDS中雜交,在0.2xSSC/0.1%SDS中于室溫洗滌。或者,可在42。C洗。技術(shù)人員將知道用何種條件作為嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件和高度嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件。關(guān)于此類條件的額外指導(dǎo)可從現(xiàn)有技術(shù)容易地獲得,例如,在Sambrooketal.,1989,MolecularCloning,ALaboratoryManual,ColdSpringHarborPress,N.Y.;andAusubeletal.(eds.),1995,CurrentProtocolsinMolecularBiology,(JohnWiley&Sons,N.Y.)中。在一種典型的方法中,使用從SEQIDNO:2獲得的探針,從由選用與SEQIDNO:2同源的多核苷酸。探測(cè)到與SEQIDNO:2同源的轉(zhuǎn)錄子后,可從由合適的菌株分離的RNA來(lái)構(gòu)建cDNA文庫(kù),這利用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來(lái)進(jìn)行?;蛘?,可篩選全基因組DNA文庫(kù)。還可例如通過(guò)使用基于本文教導(dǎo)的核苷酸序列設(shè)計(jì)的兩個(gè)(簡(jiǎn)并)寡核苷酸引物庫(kù)進(jìn)行PCR來(lái)分離同源基因序列。用于反應(yīng)的模板可以是染色體DNA,或通過(guò)對(duì)制備自已知能表達(dá)或懷疑能表達(dá)根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸的菌株的mRNA的反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA。PCR產(chǎn)物可被亞克隆并測(cè)序,以確保擴(kuò)增的序列代表了本發(fā)明的序列。此外,可使用基于SEQIDNO:2含有的序列信息設(shè)計(jì)的合成寡核苷酸引物,通過(guò)PCR來(lái)分離包括SEQIDNO:2的全部或一部分的核酸分子。然后可通過(guò)多種己知方法,將獲得的PCR片段用于分離全長(zhǎng)cDNA。例如,可對(duì)PCR片段加以標(biāo)記,將其用于篩選cDNA文庫(kù)或基因組文庫(kù)?;蛘?,可使用獲得的PCR片段的DNA序列,應(yīng)用反向PCR反應(yīng)。還可以通過(guò)誘變技術(shù)來(lái)獲得同源基因序列,優(yōu)選地,應(yīng)用于SEQIDNO:2。合適的誘變技術(shù)包括隨機(jī)誘變(例如,易錯(cuò)PCR)、定點(diǎn)誘變和/或基因改組(geneshuffling)。例如,誘變可用于獲得較之競(jìng)爭(zhēng)性羥化酶而言對(duì)其底物具有更高的親和性的去飽和酶多肽,和/或具有更高的的比酶活性和/或具有改變的底物特異性的去飽和酶多肽,例如,關(guān)于類鞘氨醇?jí)A的烴鏈長(zhǎng)的方面。本發(fā)明還提供了包含第四個(gè)方面的多核苷酸的載體,包括克隆載體和表達(dá)盒。向其中插入本發(fā)明多核苷酸的載體可以是可方便地應(yīng)用于重組DNA方法的任何載體,對(duì)載體的選擇通常將取決于其將引入的宿主細(xì)胞。因此,載體可以是自主復(fù)制載體,即,作為染色體外實(shí)體存在的載體,其復(fù)制不依賴于染色體復(fù)制,例如質(zhì)粒、粘粒、病毒或噬菌體載體,通常提供有復(fù)制起點(diǎn)?;蛘?,載體可以是下述這樣的當(dāng)引入宿主細(xì)胞時(shí),其整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因組,并且與它被整合進(jìn)其中的染色體一起復(fù)制。載體可以是環(huán)狀的,例如,質(zhì)粒,或者線性的,例如表達(dá)盒。優(yōu)選地,本發(fā)明的多核苷酸可被插入表達(dá)盒。在表達(dá)盒中,本發(fā)明的多核苷酸與調(diào)控序列可操作地相連,所述調(diào)控序列能提供宿主細(xì)胞從其編碼序列對(duì)多肽的表達(dá)。術(shù)語(yǔ)"可操作地相連"指下述并置,其中,所述組件以允許它們以其期望的方式發(fā)揮作用的關(guān)系存在。調(diào)控序列,例如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子或與編碼序列"可操作地相連"的另一表達(dá)調(diào)控信號(hào)以下述方式定位,所述方式使得在與調(diào)控序列相容的條件下獲得多肽從其編碼序列的表達(dá)。用于給定宿主細(xì)胞的表達(dá)盒可包含從相對(duì)于編碼第一個(gè)方面的多肽的序列的編碼鏈而言5'末端至3'末端以適當(dāng)?shù)捻樞蚧ハ嗫刹僮飨噙B的下述元件啟動(dòng)子序列,其能指導(dǎo)編碼多肽的DNA序列在給定宿主細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄;可選地,信號(hào)序列,其能指導(dǎo)多肽從給定宿主細(xì)胞分泌進(jìn)培養(yǎng)基;可選地,靶向序列,其用于將多肽引導(dǎo)至某亞細(xì)胞區(qū)室,編碼多肽的成熟形式以及優(yōu)選活性形式的DNA序列;以及優(yōu)選地,還有轉(zhuǎn)錄終止區(qū)域(終止子),其能在編碼多肽的DNA序列下游終止轉(zhuǎn)錄。除編碼本發(fā)明多肽(的天然存在的前體)的基因天然的啟動(dòng)子之外,可使用其它啟動(dòng)子來(lái)指導(dǎo)本發(fā)明多肽的表達(dá)??筛鶕?jù)其指導(dǎo)本發(fā)明多肽在表達(dá)宿主中表達(dá)的效率來(lái)選擇啟動(dòng)子??蛇x擇與為其設(shè)計(jì)表達(dá)盒或載體的宿主細(xì)胞相容的啟動(dòng)子/增強(qiáng)子和其它表達(dá)調(diào)控信號(hào)。優(yōu)選地,啟動(dòng)子序列從可誘導(dǎo)的或高度表達(dá)的基因獲得。在本發(fā)明的上下文中,高度表達(dá)的基因是其mRNA占細(xì)胞總mRNA的至少0.01%(w/w)的基因,例如,在誘導(dǎo)條件下的,或者其基因產(chǎn)物占細(xì)胞總蛋白的至少0.2%(w/w)的基因,或者,在分泌出的基因產(chǎn)物的情況下,可分泌至至少0.05g/1的水平。優(yōu)選的高度表達(dá)的基因(從中優(yōu)選獲得啟動(dòng)子,和/或其被包含于用于整合表達(dá)盒的優(yōu)選的預(yù)定靶基因座中)包括但不限于,編碼糖分解酶(例如磷酸三糖異構(gòu)酶(TPI)、磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)、磷酸甘油酯激酶(PGK)、丙酮酸激酶(PYK)、醇脫氫酶(ADH))的基因以及編碼/5-半乳糖苷酶、醇(甲醇)氧化酶、延伸因子和核糖體蛋白的基因。合適的高度表達(dá)的基因的具體例子包括,例如,來(lái)自《/M_yVeram;;cM平的丄JC4基因,來(lái)自//a"化腦/a和A'c/n'a的甲醇氧化酶基因(JOZ禾n,或者來(lái)自Fa"se"M/a"(ymorp/ia的質(zhì)膜H(+)-ATP酶基因(PA"7)。其它酵母啟動(dòng)子包括可從乳糖酶或丙酮酸脫氫酶亞基1獲得的強(qiáng)酵母啟動(dòng)子,或者來(lái)自鞘脂生物合成途徑的基因的啟動(dòng)子,例如SYR2(二氫神經(jīng)鞘氨醇羥化酶)、LCB1(絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶亞基1)、LCB2(絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶亞基2)、TSC10(酮-二氫鞘氨醇還原酶)、LAC1(神經(jīng)酰胺合酶/二氫神經(jīng)鞘氨醇N?;D(zhuǎn)移酶,CoA依賴型)、LAG1(神經(jīng)酰胺合酶/二氫神經(jīng)鞘氨醇N?;D(zhuǎn)移酶,CoA依賴型)、DES1(去飽和酶)、YDH1(二氫神經(jīng)酰胺酶)、YPC1(植物神經(jīng)酰胺酶)、LCB4(鞘氨醇類脂激酶)、LCB5(鞘氨醇類脂激酶)。編碼多肽的多核苷酸序列下游可以是含有一處或多處轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)(例如終止子)的3'非翻譯區(qū)域。終止子的起點(diǎn)并不重要。終止子可以是對(duì)于編碼多肽的多核苷酸來(lái)說(shuō)天然的。但是,優(yōu)選地,在酵母宿主細(xì)胞中使用酵母終止子,在有絲真菌宿主細(xì)胞中使用有絲真菌終止子。更優(yōu)選地,終止子是宿主細(xì)胞(其中編碼多肽的多核苷酸序列待表達(dá)的)內(nèi)源的。載體可以含有一種或多種選擇標(biāo)記基因,以便能從占大多數(shù)的未轉(zhuǎn)化細(xì)胞中選出經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。優(yōu)選的選擇標(biāo)記包括但不限于補(bǔ)償宿主細(xì)胞中的缺陷或賦予對(duì)藥物的抗性的那些。它們包括,例如,可用于轉(zhuǎn)化大多數(shù)真菌(包括酵母)的通用選擇標(biāo)記,例如乙酰胺酶(amJ幻基因或cDNA,或者提供對(duì)抗生素(例如G418、潮霉素B、博來(lái)霉素、醒腦thricin、腐草霉素、zeocin、殺稻瘟菌素S、aureobasidinA、雙丙氨膦(bialaphos)或環(huán)己酰胺)抗性的基因?;蛘撸墒褂锰禺愋缘倪x擇標(biāo)記,例如營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記,其需要相應(yīng)的突變體宿主菌株,例如17^43(來(lái)自S.cwev&'fle的,或來(lái)自其它酵母的類似基因)、F/W或7TPh在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中,在將表達(dá)構(gòu)建體引入之后,從經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞除去選擇標(biāo)記,以獲得能生產(chǎn)不含選擇標(biāo)記基因的多肽的經(jīng)轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。編碼多肽的核苷酸序列優(yōu)選作為表達(dá)載體或表達(dá)盒的一部分引入合適的宿主。關(guān)于用表達(dá)載體或表達(dá)盒對(duì)合適宿主的轉(zhuǎn)化,轉(zhuǎn)化程序是可獲得的,其為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知。表達(dá)盒可作為攜帶有選擇標(biāo)記的載體的一部分用于對(duì)宿主的轉(zhuǎn)化,或者表達(dá)盒可作為單獨(dú)的分子與攜帶有選擇標(biāo)記的載體一起進(jìn)行共轉(zhuǎn)化。載體可包含一種或多種選擇標(biāo)記基因。對(duì)于大多數(shù)有絲真菌和酵母而言,載體或表達(dá)構(gòu)建體優(yōu)選整合進(jìn)宿主細(xì)胞的基因組,以獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子。但是,對(duì)于某些酵母而言,還可獲得合適的游離載體,其中可以包括表達(dá)構(gòu)建體以穩(wěn)定和高水平表達(dá)。其例子包括從&cc/"row_yc^和K/w少vm附y(tǒng)c^各自的禾卩pKDl質(zhì)粒獲得的載體。當(dāng)表達(dá)構(gòu)建體整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因組的情況下,構(gòu)建體整合進(jìn)基因組的隨機(jī)基因座,或者使用同源重組整合進(jìn)預(yù)定的靶基因座,在這種情況下,耙基因座優(yōu)選包含高度表達(dá)的基因。合適的高度表達(dá)的基因的大量例子在前文中提供。優(yōu)選的整合靶位點(diǎn)是rRNA基因座(Baeetal,2003)或者PDA1、ENOl、GAPDH、SYR2的啟動(dòng)子區(qū)域。在另一方面,提供了包含本發(fā)明的多核苷酸的宿主細(xì)胞。多核苷酸可以是宿主細(xì)胞基因組異源的。在本發(fā)明的上下文中,術(shù)語(yǔ)"異源"表示該多核苷酸并非天然存在于宿主細(xì)胞(以其重組形式被引入宿主)基因組中,或者宿主細(xì)胞天然不生產(chǎn)該多肽。合適的宿主細(xì)胞是原核微生物,例如細(xì)菌,或真核生物,例如真菌,例如酵母或有絲真菌。優(yōu)選的宿主是酵母。用于表達(dá)編碼本發(fā)明的多肽的DNA序列的優(yōu)選酵母宿主細(xì)胞是5^cc/zfl^omyc^y、X/M,yve^om_yc&s*、//awse"M/a、戶z'c/n'a、Ya廠廠ovWa、Om^/a、五^mo^ec/!^屬的。更優(yōu)選地,酵母宿主細(xì)胞選自QmfizWaw&7&、£>emo《Aea'wmgawy^p"禾中構(gòu)成的組。最〈尤選的是酉孝母Pi'c/u'a在本發(fā)明的一種尤其優(yōu)選的實(shí)施方式中,宿主細(xì)胞是本發(fā)明前文所述的毒素抗性細(xì)胞。本發(fā)明的另一個(gè)方面因此提供了宿主細(xì)胞,它們是經(jīng)本發(fā)明的多核苷酸或載體轉(zhuǎn)化的,或包含本發(fā)明的多核苷酸或載體。優(yōu)選地,所述多核苷酸被攜帶于用于復(fù)制多核苷酸和/或表達(dá)本發(fā)明的多肽的載體中。將選擇與選用的宿主細(xì)胞相容的載體。在其中宿主細(xì)胞是本發(fā)明前文所述毒素抗性細(xì)胞的本發(fā)明實(shí)施方式中,毒素抗性表型可在轉(zhuǎn)化事件之前或之后獲得。如果本發(fā)明的多核苷酸被包括進(jìn)重組可復(fù)制載體,該載體可用于在相容的宿主細(xì)胞中復(fù)制多核苷酸。因此,在另一方面,本發(fā)明提供了一種方法,用于生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸,所述方法通過(guò)將本發(fā)明的多核苷酸引入可復(fù)制載體,將所述載體引入相容的宿主細(xì)胞以及在能使得所述載體復(fù)制的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞來(lái)實(shí)現(xiàn)。可從宿主細(xì)胞回收含有根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸的載體。合適的宿主細(xì)胞包括細(xì)菌,例如五.C(//。在另一個(gè)方面,本發(fā)明提供了一種方法,用于制備根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸,這是通過(guò)將宿主細(xì)胞(例如,用前文所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化過(guò)的)在能提供本發(fā)明多肽表達(dá)的條件下培養(yǎng),以及可選地,回收表達(dá)的多肽來(lái)實(shí)現(xiàn)的。優(yōu)選地,多肽作為分泌蛋白生產(chǎn),在該情況下,表達(dá)構(gòu)建體中編碼多肽的成熟形式的多核苷酸序列與編碼信號(hào)肽的多核苷酸序列可操作地相連。在另一個(gè)方面,本發(fā)明提供了一種方法,用于制備結(jié)構(gòu)式I的類鞘氨醇?jí)A,這是通過(guò)在能提供類鞘氨醇?jí)A表達(dá)的條件下,以及如果必要的話,能提供本發(fā)明的多肽表達(dá)的條件下,培養(yǎng)根據(jù)本發(fā)明第一個(gè)方面的微生物細(xì)胞和/或經(jīng)根據(jù)本發(fā)明第四個(gè)方面的多核苷酸(例如,克隆于前文所述表達(dá)盒中的)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞以及可選地回收類鞘氨醇?jí)A來(lái)實(shí)現(xiàn)的??墒褂帽绢I(lǐng)域已知的手段來(lái)培養(yǎng)根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞。對(duì)于啟動(dòng)子和宿主細(xì)胞的每種組合來(lái)說(shuō),可獲得有益于本發(fā)明的多肽表達(dá)的培養(yǎng)條件。在達(dá)到理想的細(xì)胞密度后,終止培養(yǎng),使用已知手段來(lái)回收本發(fā)明的多肽或類鞘氨醇?jí)A。發(fā)酵培養(yǎng)基可包含含有碳源(例如葡萄糖、麥芽糖、糖蜜)、氮源(例如,氨、硫酸銨、硝酸銨、氯化銨、有機(jī)氮源(例如酵母提取物、麥芽提取物、蛋白胨))以及其它無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)源(例如磷酸鹽、鎂、鉀、鋅、鐵等)的已知培養(yǎng)基。可選地,可包括誘導(dǎo)劑。對(duì)合適培養(yǎng)基的選擇可基于對(duì)表達(dá)宿主的選擇和/或基于表達(dá)構(gòu)建體的調(diào)控序列和/或基于與本發(fā)明的類鞘氨醇?jí)A的最優(yōu)表達(dá)相關(guān)的需要。此類培養(yǎng)基是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。發(fā)酵可進(jìn)行0.5至30天的時(shí)間。其可以是分批、連續(xù)或補(bǔ)料分批過(guò)程,合適地,在0至45。C范圍內(nèi)的溫度下進(jìn)行,以及,例如,在2至10之間的pH下進(jìn)行。優(yōu)選的發(fā)酵條件是在20至37°C的范圍內(nèi)的溫度和/或3至9之間的pH。通常基于選用的表達(dá)宿主以及待表達(dá)的蛋白質(zhì)來(lái)選擇合適的條件。發(fā)酵之后,如果必要的話,可通過(guò)離心或過(guò)濾手段將細(xì)胞從發(fā)酵培養(yǎng)液中移出。然后可通過(guò)傳統(tǒng)方法回收(以及,如果想要的話,純化以及分離)本發(fā)明的多肽和/或類鞘氨醇?jí)A。本發(fā)明有利地表明根據(jù)結(jié)構(gòu)式I的類鞘氨醇?jí)A的生產(chǎn)可完全通過(guò)發(fā)酵來(lái)進(jìn)行。特別地,其表明,鞘氨醇可通過(guò)發(fā)酵生產(chǎn)?;蛘?,鞘氨醇可通過(guò)下述手段產(chǎn)生從根據(jù)本發(fā)明的發(fā)酵方法生產(chǎn)的二氫神經(jīng)鞘氨醇通過(guò)化學(xué)方法生產(chǎn);或使用經(jīng)修飾以表達(dá)上文所述活性二氫神經(jīng)鞘氨醇去飽和酶多肽的合適生物并且補(bǔ)料根據(jù)本發(fā)明發(fā)酵生產(chǎn)的二氫神經(jīng)鞘氨醇通過(guò)生物轉(zhuǎn)化進(jìn)行;或使用經(jīng)穩(wěn)定分離以及可選地經(jīng)配制的活性二氫神經(jīng)鞘氨醇去飽和酶,并且補(bǔ)料根據(jù)本發(fā)明發(fā)酵生產(chǎn)的二氫神經(jīng)鞘氨醇通過(guò)應(yīng)用生物轉(zhuǎn)化來(lái)進(jìn)行;或通過(guò)上述手段的任何組合來(lái)生產(chǎn)。方便地,本發(fā)明的類鞘氨醇?jí)A可與合適的賦形劑組合,以生產(chǎn)類鞘氨醇?jí)A組合物。本發(fā)明的類鞘氨醇?jí)A可作為起始材料使用,以制備其它類鞘氨醇?jí)A、或鞘脂,例如神經(jīng)酰胺、神經(jīng)節(jié)苷脂或腦苷脂。圖1A和1B圖示了三步法,其導(dǎo)致對(duì)整個(gè)乃'c/^cz/em'/i^:w基因座的分離。對(duì)尸c^&S7(I.)內(nèi)部部分?jǐn)U增之后,進(jìn)行兩輪反向PCR(II.和III.)。用于各個(gè)步驟的寡核苷酸被標(biāo)出,不同陰影代表的序列展示了各個(gè)步驟中確定的DNA序列所屬的ZVlO&S7基因座的部分。與實(shí)驗(yàn)程序相關(guān)的限制性位點(diǎn)也被標(biāo)出。圖2圖示了質(zhì)粒pCR-PcDESl上A'c/n'"ci/^r"基因座。箭頭表示開放讀碼框尸c/)^&S7(陰影箭頭,從朽c/n》cz/m7'/獲得)、bla(氨節(jié)青霉素抗性基因)以及卡納霉素抗性基因(陰影線箭頭,從載體pCR4-T0PC^獲得)的定位和方向。灰色的條帶表示Eco/Z復(fù)制起點(diǎn)的定位。還顯示了克隆和限制性分析相關(guān)的限制性位點(diǎn)。圖3顯示了對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)液進(jìn)行LC-UV分析之后的典型色譜,這驗(yàn)證了三乙?;渖窠?jīng)鞘氨醇TriAsa的存在。圖4顯示了通過(guò)從丁香假單胞霉素E抗性菌落的十種穩(wěn)定分離菌生產(chǎn)的類鞘氨醇?jí)A的組成(TAPS=四乙酰化植物鞘氨醇;Sa二二氫神經(jīng)鞘氨醇;DiASa=二乙酰化二氫神經(jīng)鞘氨醇;TriASa=三乙酰化二氫神經(jīng)鞘氨醇)。圖5顯示了用于在乃'c/n'acz/ew7中同源過(guò)量表達(dá)il&S7的質(zhì)粒pDB007。顯示了尸c尸ZM7啟動(dòng)子(垂直陰影線的),尸ci)^S7基因(水平陰影線的),經(jīng)修飾的Pc丄4"基因,其介導(dǎo)環(huán)己酰亞胺(cycloheximide)抗性(黑色的),5S-26SrDNA基因間間隔序列,其具有內(nèi)部的識(shí)別位點(diǎn)(IS;格狀的);氨芐青霉素抗性基因(Wfl;淺灰)以及£."http://復(fù)制起點(diǎn)(pUC0h;深灰)。還顯示了克隆程序相關(guān)的限制性位點(diǎn)。圖6圖示了對(duì)有或沒(méi)有的丁香假單胞霉素E抗性尸/c/nVz^/^777突變體中鞘氨醇-N-?;サ亩?。以棕櫚酸(白)、硬脂酸(垂直陰影線的)、"皿羥基硬脂酸(深灰)、不飽和二十四烷酸(lignocericacid)(水平陰影線的)、二十四垸酸(淺灰)以及a-羥基蜂蠟酸(黑)作為脂肪酸側(cè)鏈的鞘氨醇-N-?;サ慕^對(duì)濃度針對(duì)如下菌株顯示在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)階段(log;24小時(shí)培養(yǎng))和穩(wěn)定階段(stat;%小時(shí)培養(yǎng)),有(syrEpDB007)和沒(méi)有尸c"^S7過(guò)量表達(dá)(syrE)的丁香假單胞霉素E抗性cz/erh,突變體。實(shí)施例1從尸/c/n'ac/fen^'F-60-10ANRRL1031分離基因組DNA在250mlErlenmeyer瓶中的50mlYEPD培養(yǎng)基(蛋白胨2%(w/v)、酵母提取物1%(w/v)和葡萄糖2%(w/v))中,于200rpm禾Q30°C培養(yǎng)P/c/n'""/emYF-60-10ANRRL1031,18小時(shí)后,OD,為1.5時(shí)收獲。使用用于酵母和革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的PUREGENEDNAPurificationKit(GentraSystemsInc.,cat.#D-6000A)按照廠商說(shuō)明書來(lái)分離染色體DNA。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳對(duì)分離出的DNA的定性檢測(cè)展示了其高分子量(〉16kbp)。實(shí)施例2擴(kuò)增乃'c/n'ad/^n'z'D£>S7基因的內(nèi)部部分首先,通過(guò)用Camiz'c/aa/Zn'cawsDeslp蛋白(GenBankacc.弁EAL03178)作為模板進(jìn)行TBLASTN檢索,從完全的和未完成的真核基因組的NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(www.ncbi.nlm.nih.gov/sutils/genom—table.cgi)提取來(lái)自子囊菌物種的可能的二氫神經(jīng)酰胺^去飽和酶的氨基酸序列。該蛋白質(zhì)已經(jīng)過(guò)生化分析,其被證明代表神經(jīng)酰胺A"去飽和酶(Temesetal.,TheJoumalofBiologicalChemistry,277:25512-25518,2002)。使用ClustalW程序(www.ebi.ac.uk/clustalw)比對(duì)提取的序列(所有E值<2x10—52的入口)。通過(guò)在考慮具有高度偏好性的乃'c/z/ac(/br"密碼子使用的情況下,將Deslp序列中高度保守的氨基酸片斷翻譯回去,來(lái)獲得用于擴(kuò)增c^m7'Z)^S/基因的內(nèi)部部分的合適的寡核苷酸。然后通過(guò)MWGBiotech(Ebersberg,Germany)合成下述寡核苷酸des1-deg-fw-2LeuT:desl-deg-rv:這些寡核苷酸用于按照Innis"a/.,(PCRprotocols.Aguidetomethodsandapplications,1990,AcademicPress)建立PCR反應(yīng),其中按照廠商說(shuō)明書使用HerculaseHotstartDNA聚合酶(Stratagene,cat.弁600312)。應(yīng)用該方法可獲得350bp的片段。按照廠商說(shuō)明書,使用QIAquickPCRPurificationKit(Qiagen,cat.弁28106)來(lái)純化該片段。實(shí)施例3對(duì)P/c/'fla'/^nYD五W基因的內(nèi)部部分的DNA序列進(jìn)行測(cè)定使用Sangere,a/.(ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,U.S.A.,74:5463-5467)開發(fā)的雙脫氧鏈終止法來(lái)測(cè)定經(jīng)純化PCR產(chǎn)物的DNA序列。實(shí)施例1中用于PCR擴(kuò)增的引物作為測(cè)序引物使用。通過(guò)Sequiserve(Vaterstetten,Germany)來(lái)進(jìn)行DNA領(lǐng)!J序。使用CloneManager7軟件(Scientific&EducationalSoftware)將產(chǎn)生的序列信息(341bp,對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:3的1336-1676位核苷酸,圖1A)翻譯成蛋白質(zhì),得到的氨基酸序列用作為模板,用于用NCBI的非重復(fù)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行的BLASTP檢索(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)。檢索使得將Omt/^aa仿z'ca似Deslp(NCBIacc.#EAL03178)鑒定為數(shù)據(jù)庫(kù)中最接近新序列的蛋白質(zhì),這證實(shí)了事實(shí)上已擴(kuò)增出了尸/c/n'acz/^r"D五W直向同源體的部分。實(shí)施例4擴(kuò)增整條乃'c/^cz'fgm'z'Z)五S7基因以及測(cè)定其DNA序列為測(cè)定整條A'cA/a"y^r"Z)五W基因(編碼序列、啟動(dòng)子區(qū)域以及3,非翻譯區(qū)域)的DNA序列,接著進(jìn)行反向PCR方法。按照廠商說(shuō)明書,用Ndel(MBIF畫entas,cat.#ER0581)對(duì)來(lái)自P油aF-60-10ANRR11031的染色體DNA(300ng)(按照實(shí)施例1分離的)進(jìn)行過(guò)夜消化,這以總體積100Ad進(jìn)行。按照廠商說(shuō)明書,使用QIAquickPCRPurificationKit(Qiagen,cat.#28106),對(duì)經(jīng)消化的DNA進(jìn)行純化。按照廠商說(shuō)明書,使用1UT4DNA鏈接酶,以200/xl的總體積,使用RapidDNALigationKit(RocheDiagnostics,cat.#1635379)對(duì)洗脫的DNA(50pi)進(jìn)行過(guò)夜連接。按照廠商說(shuō)明書,使用MinEluteGelExtractionKit(Qiagen,cat.#28604)對(duì)連接的DNA加以純化。將1^洗出物用作模板用于反向PCR反應(yīng),這按照Innis"a/.,(PCRprotocols.Aguidetomethodsandapplications,1990,AcademicPress)來(lái)進(jìn)行。為此應(yīng)用革巴向P/c/n'acz/e/r"i)五W基因的已知部分(見(jiàn)實(shí)施例3)的兩條寡核苷酸desl-IP-fw:desl-IP-rv:擴(kuò)增用HerculaseHotstartDNA聚合酶按照廠商說(shuō)明書來(lái)進(jìn)行。使用該程序,可獲得1.6kbp的PCR產(chǎn)物。使用QIAquickPCRPurificationKit按照廠商說(shuō)明書來(lái)純化片段。按照實(shí)施例3所述測(cè)定該片段的DNA序列,其中使用寡核苷酸desl-IP-fw、desl-IP-rv和SSc-IPfwl:TTTTTACTTTTGCGAATCG(SEQIDNO:8)作為測(cè)序引物。新獲得的序列信息覆蓋了SEQIDNO:3的1-1681位核苷酸,其側(cè)翼有兩個(gè)A^el位點(diǎn),這與預(yù)期一致,因?yàn)閷?duì)模板DNA進(jìn)行了7W/el消化。實(shí)施例3中獲得的DNA序列下游沒(méi)能獲得新的序列信息,因?yàn)?'iV&I位點(diǎn)恰好直接位于該部分的下游(圖IB)。為了獲得尸z'c/n'"cz/^r"D五W基因編碼區(qū)域的3'末端及其3,非翻譯區(qū)域的DNA序列,必須要再進(jìn)行一輪反向PCR。因此,上述實(shí)驗(yàn)方案重復(fù)進(jìn)行,不同之處在于用(NewEnglandBiolabs,cat.#R0132S)來(lái)消化尸z'c/n'aa/ern7染色體DNA,在反向PCR期間使用下述寡核苷酸,它們是MWGBiotech(Ebersberg,Germany)合成的desl-IP-fw:desl-RP-Bamffl:使用該程序,可獲得1.2kbp的PCR產(chǎn)物。按照廠商說(shuō)明書使用QIAquickPCRPurificationKit對(duì)片段進(jìn)行純化。按照實(shí)施例3中所述,使用寡核苷酸desl-IP-fw和desl-RP-BamHI作為測(cè)序引物,測(cè)定該片段的DNA序列??色@得852bp的新序列信息(SEQIDNO:3中的1682-2534位核苷酸),其延伸至3'7V^el位點(diǎn)的下一個(gè)限制性位點(diǎn)下游(圖IB)。使用上述三步程序,可分離出總共2534bp的乃'c/n'ac^^YD五67基因座,并可對(duì)其DNA序列進(jìn)行測(cè)序(見(jiàn)SEQIDNO:3和圖1)。圖2描述的P/c/n'flc"b77'z'基因座編碼長(zhǎng)度為351個(gè)氨基酸的PcDeslp蛋白(SEQIDNO1)。PcDeslp與來(lái)自O(shè)mAc/aa/Wcaws(GenBankacc.#EAL03178)禾口Sc/n.zos^ccAarawj/ces/函6e(GenBankacc.#059715)的Deslp蛋白分別具有62%(76%)和53%(70%)的位置氨基酸同一性(相似性)。來(lái)自O(shè)wcfe/aa/^caw禾B來(lái)自Sc/^aracc/zarawycespomZ^的Deslp蛋白已被生化分析過(guò),其在體內(nèi)展示出二氫神經(jīng)酰胺A"去飽和酶活性。PcDeslp含有對(duì)于脂肪去飽和酶/羥化酶來(lái)說(shuō)典型的氨基酸序列基元(Sperling&Heinz,BiochimicaandBiophysicaActa,2003,1632:1-15):HXXHH(149-153位氨基酸)和HXXHH(291-295位氨基酸)。此外,PcDeslp被預(yù)計(jì)攜帶有三個(gè)跨膜片斷(87-109、171-193以及205-227位氨基酸;這是TMHMM工具預(yù)測(cè)的,www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/),其具有二賴氨酰基元作為其C末端,這可能用作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留信號(hào)(Anderssonetal.,1999,TheJournalofBiologicalChemistry,274:15080-4)。生物信息學(xué)分析強(qiáng)烈表明,尸cD^S/編碼尸z'c/n'ac^rn'/二氫神經(jīng)酰胺A"去飽和酶。實(shí)施例5分離丁香假單胞霉素E抗性乃W^突變體為了分離出能高效生產(chǎn)二氫神經(jīng)鞘氨醇的尸/c&"cz/wn7菌株,進(jìn)行下述程序。首先,通過(guò)將不同濃度的丁香假單胞霉素E加入到瓊脂平板中,來(lái)測(cè)定尸/c/n'acz/e^T"菌株對(duì)于&w/tom;;cM^n'wgae產(chǎn)生的毒性化合物丁香假單胞霉素E(GrossDC,1985,RegulationofsyringomycinsynthesisinPseudomonassyringaepv.syringaeanddefinedconditionsforitsproduction.JApplBacteriol.58:167-174)的天然敏感性。通過(guò)將3.5mg丁香假單胞霉素E(從J.Takemoto,UtahStateUniversity獲得的)溶解于1.0ml0.001NHCl中來(lái)制備其貯液。為了穩(wěn)定,將pH保持為低于7,貯藏于-20。C。使用含有0.1至20)Ug/ml之間不同濃度的丁香假單胞霉素E的YEPD平板(每升酵母提取物,10g;蛋白胨,20g;葡萄糖,20g;瓊脂,20g),測(cè)定針對(duì)尸z'c/n'aa/wn7菌株的最小抑制濃度(=MIC值)。在具有不同濃度的丁香假單胞霉素E的每塊平板上,涂布100pi新鮮培養(yǎng)物(OD6。Qnm=0.4),在30。C培養(yǎng)5天。取決于菌株,在有2至10Mg/ml丁香假單胞霉素E的平板上沒(méi)有出現(xiàn)菌落,表明MIC值在2至10ptg/ml之間。為分離出丁香假單胞霉素E抗性P.a/ew"變體,選用具有10/ig/ml的選擇性平板,因?yàn)樵摑舛缺蛔C實(shí)為對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)P."/wn7菌株是致死性的,在這些平板上能存活的菌株將被命名為"抗性菌株"。如果使用了更低的濃度,這將導(dǎo)致非抗性菌落的背景生長(zhǎng),從而妨礙對(duì)真正的抗性突變體的分離。為分離丁香假單胞霉素E抗性尸.ci/^777變體,US6204006(DeBoerLandVanderWildtIFC,Microbialstrainsproducingsphingolipidbases)所述的P.czy^77'/的植物鞘氨醇生產(chǎn)菌株被預(yù)先培養(yǎng)于液體YEPD培養(yǎng)液中,直到OD6(K)^^1.0,將其分為不同的小份,涂布到10Mg/ml的丁香假單胞霉素E平板上,在30°C培養(yǎng)5天。將這些平板上表現(xiàn)為自發(fā)的丁香假單胞霉素E抗性分離菌的25個(gè)菌落轉(zhuǎn)移到標(biāo)準(zhǔn)YEPD平板,這些平板將作為所謂的主平板(masterplate)。在這些YEPD平板上進(jìn)行非選擇性生長(zhǎng)之后,再在具有10Mg/ml或15Aig/ml丁香假單胞霉素E的YEPD平板上對(duì)所有分離菌進(jìn)行再次驗(yàn)證。最初的分離菌中能在10yg/ml甚至在15/ig/ml丁香假單胞霉素E上生長(zhǎng)的十種分離菌被命名為真正的"抗性"分離菌。這十種分離菌是在標(biāo)準(zhǔn)YEPD平板上純化的菌落,其被貯藏以待后用。實(shí)施例6通過(guò)丁香假單胞霉素E抗性朽c&ac/fern7突變體對(duì)二氫神經(jīng)鞘氨醇進(jìn)行搖瓶生產(chǎn)為評(píng)價(jià)按照實(shí)施例5所述分離的Ac;^a/wn'/的丁香假單胞霉素E突變體對(duì)類鞘氨醇?jí)A的生產(chǎn),將所有十種真正的抗性分離菌的預(yù)培養(yǎng)物接種進(jìn)25mlYEPD(在100mlErlenmeyer瓶中,無(wú)擋板),在30°C和280轉(zhuǎn)/分鐘下培養(yǎng)3天。隨后,將1%的預(yù)培養(yǎng)物用于接種100mlLCBNB(在500mlErlenmeyer瓶中,有擋板),在30°C和280轉(zhuǎn)/分鐘下培養(yǎng)4天。表1.LCBNB(=長(zhǎng)鏈堿營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)液)培養(yǎng)基的組成<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>表2.痕量和維生素貯液的組成<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>或二氫神經(jīng)鞘氨醇),將2.5克總培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至25ml容量瓶中。然后加入2.5ml經(jīng)純化的水以及12ml丙酮?;旌显撊萘科?0分鐘,以萃取脂肪,之后用丙酮填裝至25ml。在10,000rpm對(duì)2ml該溶液加以10分鐘離心。將10Ad注射到柱上。使用Waters2695HPLC系統(tǒng)和來(lái)自GLScience的柱(InertsilODS-80A,4.6x250mm)分析樣品。流動(dòng)相由乙腈中的0.05%TFA構(gòu)成。流速為1ml/分鐘,在200nm處進(jìn)行UV檢測(cè)。所用條件如下<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>商業(yè)可獲得的LCBs作為對(duì)照物被乙酰化并使用。在發(fā)酵培養(yǎng)液中可探測(cè)到表示為TriASa的三乙酰化二氫神經(jīng)鞘氨醇(圖3)。選出的丁香假單胞霉素E抗性突變體生產(chǎn)的(乙酰化)二氫神經(jīng)鞘氨醇的典型濃度被發(fā)現(xiàn)為每g生物質(zhì)干重10-100mg的范圍內(nèi)。實(shí)施例7通過(guò)LC-MS鑒定二氫神經(jīng)鞘氨醇為驗(yàn)證乙?;渖窠?jīng)鞘氨醇的存在,使用LC-MS。用乙酰化試劑對(duì)標(biāo)準(zhǔn)二氫神經(jīng)鞘氨醇和植物鞘氨醇(作為對(duì)照)進(jìn)行乙?;R阴;噭┖?0mg4-二甲基氨基吡啶、0.6ml乙酸酐以及0.2ml三乙胺,它們?nèi)芙庥?0ml不含乙醇的氯仿中。大約3-4mg類鞘氨醇?jí)A溶解于10ml乙腈中作為標(biāo)準(zhǔn)物。向0.8ml類鞘氨醇?jí)A溶液中加入0.2ml乙?;噭?。室溫下20-25分鐘的反應(yīng)時(shí)間后,注射5yl??商綔y(cè)到二氫神經(jīng)鞘氨醇的三乙酰化形式(TriASa)。LC-UV-MS細(xì)節(jié)儀器LC-ZQ,來(lái)自Waters(CV18)MSESI/pos毛細(xì)電壓3.66kV錐孔電壓24V提取器(extractor)電壓2VRF鏡(lens)電壓0.1V去溶劑化溫度350°C源溫度130°C去溶劑化氣流600L/小時(shí)錐孔氣流120L/小時(shí)km能量0.1增效器650V掃描MS模式m/z400-800UV200nm柱YMCJ,sphereODS-H80,4m250*4.6mm條件流速1.0ml/分鐘注射體積5Ad滿環(huán)(fullloop)柱溫20°C槽溫環(huán)境切換閥1分鐘至廢料流動(dòng)相乙腈中的0.05%TFA稀釋緩沖液水/丙酮(10:90)表3.對(duì)三乙?;渖窠?jīng)鞘氨醇(TriASa)的MS鑒定<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>實(shí)施例8尸z'c/n'adfCT77'z'產(chǎn)生的二氫神經(jīng)鞘氨醇變體的鏈長(zhǎng)分離出的菌株能生產(chǎn)和排出Sa和/或其乙?;问剑鐚?shí)施例6和7所示。LCB的鏈長(zhǎng)可根據(jù)脂肪酸合成的效率變化。已用LC-MS測(cè)定了從發(fā)酵培養(yǎng)液獲得的二氫神經(jīng)鞘氨醇(Sa)及其乙?;问降逆滈L(zhǎng)。Sa及其衍生物主要以C18的最優(yōu)鏈長(zhǎng)存在。表4.(乙酰化)Sa和TAPS的駐留時(shí)間<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>表5.不同鏈長(zhǎng)的(乙?;?Sa和TAPS的比例<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>nd=未檢領(lǐng)!j實(shí)施例9尸z'c/n'ac//^r"產(chǎn)生的二氫神經(jīng)鞘氨醇變體的組成分離出的菌株能生產(chǎn)和排出Sa和/或其乙?;问?。乙?;潭瓤稍?至3之間變動(dòng),這分別產(chǎn)生*二氫神經(jīng)鞘氨醇(Sa)*單乙酰二氫神經(jīng)鞘氨醇(NASa)二乙酰二氫神經(jīng)鞘氨醇(DiASa)*三乙酰二氫神經(jīng)鞘氨醇(TriASa)己用LC-MS測(cè)定了從典型的發(fā)酵培養(yǎng)液獲得的二氫神經(jīng)鞘氨醇(Sa)及其乙酰化形式的相對(duì)組成。樣品包含50%完全乙?;腡riASa。第二主要部分是DiASa,較少組分是游離的Sa。表6.兩種樣品中不同(乙?;?組分的相對(duì)貢獻(xiàn)<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>實(shí)施例10分離穩(wěn)定的、生產(chǎn)二氫神經(jīng)鞘氨醇的尸Z'C/^C/Z^7^'突變體因?yàn)镃Zy^77'/是二倍體物種,導(dǎo)致對(duì)丁香假單胞霉素E抗性的突變可能是不穩(wěn)定的。為了分離出穩(wěn)定的生產(chǎn)二氫鞘氨醇的戶/c/2/a"y^r"菌株,進(jìn)行下述程序。在非選擇性YEPD瓊脂上對(duì)選出的丁香假單胞霉素E抗性菌落進(jìn)行菌落純化,以誘導(dǎo)良好生長(zhǎng)。隨后,按照實(shí)施例6所述,在搖瓶中對(duì)兩種不同的最初丁香假單胞霉素E抗性菌落中的10種分離菌加以檢驗(yàn)。分離菌顯示了產(chǎn)生的類鞘氨醇?jí)A具有的不同光譜,包括仍生產(chǎn)四乙?;参锴拾贝嫉募?xì)胞系(見(jiàn)圖4;SYR2l-2H)。使用該方法,可能分離出穩(wěn)定并且專門性的二氫神經(jīng)鞘氨醇生產(chǎn)細(xì)胞系。實(shí)施例11構(gòu)建過(guò)量表達(dá)二氫神經(jīng)酰胺去飽和酶基因的丁香假單胞霉素E抗性Ac/u.flc(fer"7菌株為構(gòu)建過(guò)量表達(dá)乃'c/n'aa/wn7二氫神經(jīng)酰胺去飽和酶基因的丁香假單胞霉素E抗性突變體,我們首先構(gòu)建整合型D^S7表達(dá)載體,其含有選擇標(biāo)記——用于將線性化載體同源整合進(jìn)乃'c/n'acz/ernY染色體DNA的DNA序列。選擇核糖體DNA基因間間隔序列作為染色體整合位點(diǎn)。為插入核糖體DNA基因間間隔序列,以及在整合位點(diǎn)中間產(chǎn)生獨(dú)特的Pmel識(shí)別序歹U,按照Innis&(PCRprotocols.Aguidetomethodsandapplications,1990,AcademicPress),通過(guò)PCR來(lái)擴(kuò)增5S-26SrDNA基因間間隔序列(IS)白勺兩個(gè)片段(Baeetal.,Integrativetransformationsystemforthemetabolicengineeringofthesphingoidbase-producingyeast尸z.c/n'flcz/em'/.2003.AppliedandEnvironmentalMicrobiology;美國(guó)專利6,638,735),其中使用200ng尸/c/n'flc7/^777F-60-10ANRRL1031的染色體DNA作為模板,以及使用下述寡核苷酸片段l:pIS-Ndel-rev:5'-TATATACATATGGCTAGATTGACAGAAGTCGATCAG-3'[包括5,末端的MfeI識(shí)別序列(下劃線表示)](SEQIDNO:11)Pmel-rv:5'-(SEQIDNO:12)片段2:p-IS-Ndel-for:括5'末端的Mfel識(shí)別序列(下劃線表示)](SEQIDNO:13)Pmel-fw:(SEQIDNO:14)使用QIAquickPCRPurificationKit按照廠商說(shuō)明書對(duì)獲得的PCR片段(分別為503禾卩519bp)進(jìn)行純化。隨后,按照Innis"a/.(PCRprotocols.Aguidetomethodsandapplications,1990,AcademicPress),代表尸/c/u'acz>m5S-26SrDNA基因間間隔序列的5,和3'部分的兩種PCR產(chǎn)物中的每種取10ng作為模板,通過(guò)建立PCR來(lái)獲得片段1和片段2的融合,其中使用下述寡核苷酸p-IS-Ndel-for:5'-TATATACATATGCTAATCACAACAGAACATTCTCTAACG-3,[包括5'末端的M^I識(shí)別序列(下劃線表示)](SEQIDNO:15)pIS-Ndel畫rev:5'-TATATACATATGGCTAGATTGACAGAAGTCGATCAG-3'[包括5,末端的MfeI識(shí)別序列(下劃線表示)](SEQIDNO:16)得到的1kbpPCR片段在其兩個(gè)末端都含有Mfcl識(shí)別序列,在片段中間含有識(shí)別序列。使用QIAquickPCRPurificationKit按照廠商說(shuō)明書對(duì)片段進(jìn)行純化。用iVdel對(duì)PCR產(chǎn)物和載體pAG25(Goldsteinetal.,ThreenewdominantgenedisruptioncassettesforgenedisruptioninSaccharomycescerevisiae,1999,Yeast)加以切割(按照限制性內(nèi)切酶的廠商說(shuō)明書NewEnglandBiolabs,Schwalbach,Germany)。進(jìn)行連接,產(chǎn)生載體pTH-IS2-Pmel。插入的定向和正確性通過(guò)DNA測(cè)序來(lái)驗(yàn)證。對(duì)化學(xué)感受態(tài)五^^en'c^aco//細(xì)胞的連接、制備和轉(zhuǎn)化通過(guò)技術(shù)人員已知的方法來(lái)進(jìn)行。為構(gòu)建D^S/過(guò)量表達(dá)盒,使A'c/u'aa/err"的Z)£W基因處于Ac/u'ac^rn'z'丙酮酸脫氫酶亞基A基因(尸ZMJ)啟動(dòng)子區(qū)域的控制下。首先,使用200ng尸/c/n'""/emYF-60-10ANRRL1031的染色體DNA作為模板用于按照Innisa/.(PCRprotocols.Aguidetomethodsandapplications,1990,AcademicPress)的PCR,擴(kuò)增出尸cD五W,其中使用下述寡核苷酸:DESl-fw:GGCTACAATTACACATAGAAAAAACCCTTCACAAC-3'[包括5'末端與寡核苷酸PDAl-rv互補(bǔ)的50個(gè)堿基的序列(斜體表示)](SEQIDNO:17)DESl陽(yáng)rv:TA-3'[包括5,末端的/^I識(shí)別序列(下劃線表示)](SEQIDNO:18)接著,用下述寡核苷酸來(lái)擴(kuò)增乃'c/n'a"y^77'/丙酮酸脫氫酶亞基A基因(PA4/)的啟動(dòng)子區(qū)域PDAl-fw:5'-TATACTGCAGTGTGCTCTAAATTTGCCCGGTTCGCGACG-3'[包括5'末端的/^I識(shí)別序列(下劃線表示)](SEQIDNO:19)PDAl-rv:TA-3'(與寡核苷酸DESl-fw的5'末端互補(bǔ))(SEQIDNO:20)使用QIAquickPCRPurificationKit按照廠商說(shuō)明書對(duì)獲得的PCR片段(分別為687bp禾Q1596bp)進(jìn)行純化。隨后,按照Innis"a/.(PCRprotocols.Aguidetomethodsandapplications,1990,AcademicPress),代表P〖c/u'aa/em'ZZ)£W基因和A'c/u'aa/emYPZM7啟動(dòng)子區(qū)域的兩種PCR產(chǎn)物中的每種取10ng作為模板,通過(guò)建立PCR來(lái)獲得尸A47啟動(dòng)子區(qū)域和Z)^W基因的融合,其中使用下述寡核苷酸PDAl-fw:5'-TATACTGCAGTGTGCTCTAAATTTGCCCGGTTCGCGACG-3'[包括5'末端的尸WI識(shí)別序列(下劃線表示)](SEQIDNO:21)DESl-rv:TA-3'[包括5'末端的/^I識(shí)別序列(下劃線表示)](SEQIDNO:22)使用該程序,可獲得2.2kbp的PCR產(chǎn)物。使用QIAquickPCRPurificationKit按照廠商說(shuō)明書對(duì)片段進(jìn)行純化。然后,用限制性內(nèi)切酶尸WI對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行消化(按照限制性內(nèi)切酶的廠商說(shuō)明書NewEnglandBiolabs,Schwalbach,Germany),將其連接進(jìn)尸Wl切割過(guò)的載體pTH-IS2-Pmel(見(jiàn)上文),得到pTH-DESl-IS2-Pmel。插入的定向和正確性通過(guò)DNA測(cè)序來(lái)驗(yàn)證。對(duì)化學(xué)感受態(tài)^&c力en'c/n'aco/z'細(xì)胞的連接、制備和轉(zhuǎn)化通過(guò)技術(shù)人員已知的方法來(lái)進(jìn)行。構(gòu)建賦予環(huán)己酰亞胺抗性的抗性表達(dá)盒作為選擇性標(biāo)記,它基于編碼核糖4本蛋白L41的A'c/n'aa/e/r"基因(Baea/"Integrativetransformationsystemforthemetabolicengineeringofthesphingoidbase-producingyeast/^c/'acz/ern'/.2003.AppliedandEnvironmentalMicrobiology;美國(guó)專禾U6,638,735)。按照Innis&(PCRprotocols.Aguidetomethodsandapplications,1990,AcademicPress)通過(guò)PCR擴(kuò)增編碼核糖體蛋白L41的乃'c/n'ac^m7基因的兩條片段,以獲得經(jīng)修飾的L4P基因,其中使用尸/c/n'aci/br//F-60-10ANRRL1031的染色體DNA作為模板,使用下述寡核苷酸片段l:PcL41隱SalI-fW:5'-TATAGTCGACGAATTCTCTTAAATGATGTTGG-3'[包括5'末端的&/1識(shí)別序列(下劃線表示)](SEQIDNO:23)PcL41-internal陽(yáng)rvGG-3'[與寡核苷酸PcL41-intemal-fW的5'末端互補(bǔ),并且插入點(diǎn)突變(C到A,粗體),代替來(lái)自A'c/n'ac^bT7'Z的L41蛋白的第56位氨基酸(脯氨酸到谷氨酰胺),產(chǎn)生環(huán)己酰亞胺抗性(Bae"fl/.,Integrativetransformationsystemforthemetabolicengineeringofthesphingoidbase-producingyeast尸/cAz'a2003.AppliedandEnvironmentalMicrobiology;美國(guó)專利6,638,735)〗(SEQIDNO:24)片段2:PcL41-internal-fw:CCAAAAAAGTTGTTTTACG-3'[包括5'末端與寡核苷酸PcL41-internal-rv互補(bǔ)的49bp的序列,插入點(diǎn)突變(C到A,粗體),代替來(lái)自乃'c/^ci/^r//的L41蛋白的第56位氨基酸(脯氨酸到谷氨酰胺),產(chǎn)生環(huán)己酰亞月安,亢個(gè)生)(Baea/.,Integrativetransformationsystemforthemetabolicengineeringofthesphingoidbase-producingyeast尸z'c/n'a"/em.2003.AppliedandEnvironmentalMicrobiology;美國(guó)專利6,638,735)](SEQIDNO:25)PcL41-SacI-rv:5'-TATAGAGCTCAATTCCAATGTTTTGATCTGTC-3'[包括5'末端的^cl識(shí)別序列(下劃線表示)](SEQIDNO:26)使用QIAquickPCRPurificationKit按照廠商說(shuō)明書對(duì)獲得的PCR片段(分別為1222bp和753bp)進(jìn)行純化。然后,兩種PCR產(chǎn)物每種取IOng進(jìn)行PCR,來(lái)獲得代表經(jīng)修飾的L4P基因(介導(dǎo)環(huán)己酰亞胺抗性)的兩條片段的融合,其中使用下述寡核苷酸PcL41隱SalI隱fw:5'-TATAGTCGACGAATTCTCTTAAATGATGTTGG-3'(包括5'末端的識(shí)別序列)(SEQIDNO:27)PcL41-SacI-rv:5'-TATAGAGCTCAATTCCAATGTTTTGATCTGTC-3'(包括5'末端的識(shí)別序列)(SEQIDNO:28)使用QIAquickPCRPurificationKit按照廠商說(shuō)明書對(duì)獲得的1.9kbp的PCR片段進(jìn)行純化。然后,用限制性內(nèi)切酶&ZI^7&cI對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行消化(按照限制性內(nèi)切酶的廠商說(shuō)明書NewEnglandBiolabs,Schwalbach,Germany),將其分別連接進(jìn)pTH-DESl-IS2-Pmel(見(jiàn)上文),產(chǎn)生載體pDB007(圖4)。插入的定向和正確性通過(guò)DNA測(cè)序來(lái)驗(yàn)證。對(duì)化學(xué)感受態(tài)^cAen'c/n'aco/z'細(xì)胞的連接、制備和轉(zhuǎn)化通過(guò)技術(shù)人員已知的方法來(lái)進(jìn)行。用Pmel對(duì)載體pDB007進(jìn)行線性化(按照限制性內(nèi)切酶的廠商說(shuō)明書NewEnglandBiolabs,Schwalbach,Germany),貪《后"f吏用QIAquickPCRPurificationKit按照廠商說(shuō)明書進(jìn)行純化。對(duì)乃'c/u'ac(fern'!'F-60-10ANRRL1031細(xì)胞的轉(zhuǎn)化按照近來(lái)所描述的來(lái)進(jìn)4亍(Bae&a/.,Integrativetransformationsystemforthemetabolicengineeringofthesphingoidbase-producingyeast尸z'c/n'aczy^r".2003.ApplEnvironMicrobiol.;美國(guó)專利6,638,735)。將丁香假單胞霉素E抗性朽c/^cz/^t//(實(shí)施例5中所述的)培養(yǎng)于YEPD培養(yǎng)基中,至600nm處的光學(xué)密度為1至1.5。通過(guò)離心收獲細(xì)胞,將其懸浮于0.1倍培養(yǎng)液體積的50mM磷酸鹽緩沖液(pH7.5)中,使用之前該緩沖液中已加入25mM二硫蘇糖醇。在37°C培養(yǎng)15分鐘后,用一倍培養(yǎng)液體積的冷穩(wěn)定溶液[270mM蔗糖、10mMTris-HCl(pH7.5)、1mMMgCy對(duì)細(xì)胞洗兩次,將其重新懸浮于0.01倍培養(yǎng)液體積的穩(wěn)定溶液中。將5;xl線性化載體pDB007(含有1.6jLtgDNA)與50jul細(xì)胞混合,在冰上放置10分鐘。然后將轉(zhuǎn)化混合物轉(zhuǎn)移到2mm電穿孔管中。電穿孔用GenePulserX細(xì)胞(Bio-RadLaboratories,Mtinchen,Germany)在500V、50jLtF和700(]下按照廠商說(shuō)明書來(lái)進(jìn)行。電穿孔之后,將細(xì)胞重新懸浮于500Ad穩(wěn)定溶液中,轉(zhuǎn)移至含有2mlYPD培養(yǎng)基的培養(yǎng)管中。細(xì)胞在30。C過(guò)夜再生后,將再生培養(yǎng)物的小份涂布到含有每ml0.5Mg環(huán)己酰亞胺的YPD平板上。在30。C培養(yǎng)7天后,出現(xiàn)數(shù)十個(gè)菌落。實(shí)施例12驗(yàn)證二氫神經(jīng)酰胺去飽和酶基因表達(dá)盒的存在進(jìn)行菌落PCR,以驗(yàn)證用攜帶有乃'c/^aa/^777二氫神經(jīng)酰胺去飽和酶基因(D£W)的質(zhì)粒pDB007對(duì)丁香假單胞霉素E抗性朽c/n'fl"/^77'z'突變體的轉(zhuǎn)化,所述基因處于乃'c/n》c^w'/的丙酮酸脫氫酶亞基A基因CP工X4"的啟動(dòng)子區(qū)域控制下。為達(dá)到該目的,在PCR中將來(lái)自實(shí)施例10的環(huán)己酰亞胺抗性菌落直接用作為模板,其中使用在PIM7啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合的一條寡核苷酸(PDAl-DESl-fw),以及在DES1基因結(jié)合的另一條(PDA1-DES1-rv),僅在攜帶有處于PiX47啟動(dòng)子控制下的D五W基因的轉(zhuǎn)化子中產(chǎn)生402bp的片段PDAl-DESl-fw:5'-CTAGGAAAGATAGGGGACAATCAAG-3'(SEQIDNO:29)PDAl-DESl-rv:5'-AAGGTTCAGGTCCACAAAGTTCTG-3'(SEQIDNO:30)通過(guò)PCR,可在檢驗(yàn)的所有環(huán)己酰亞胺抗性菌落中證實(shí)巧c/n'aa/er"'PA4/啟動(dòng)子和A'c/nhq'/^m7D五57之間融合的存在。實(shí)施例13通過(guò)過(guò)量表達(dá)cz'/^r"二氫神經(jīng)酰胺去飽和酶基因的丁香假單胞霉素E抗性乃'c/nVzd/^77'/突變體對(duì)鞘氨醇-N-?;ミM(jìn)行搖瓶生產(chǎn)為檢驗(yàn)過(guò)量表達(dá)ci/^r"二氫神經(jīng)酰胺去飽和酶基因的丁香假單胞霉素E抗性突變體對(duì)鞘氨醇-N-?;サ脑黾拥纳a(chǎn),按照實(shí)施例6中關(guān)于通過(guò)丁香假單胞霉素E抗性朽c/n力"/^777突變體對(duì)二氫神經(jīng)鞘氨醇進(jìn)行的搖瓶生產(chǎn)的部分所述(不同之處在于在攜帶載體pDB007的丁香假單胞霉素E抗性突變體的情況下加入每ml培養(yǎng)基2/xg的環(huán)己酰亞胺),培養(yǎng)攜帶有載體pDB007(二氫神經(jīng)酰胺去飽和酶基因表達(dá)載體)的丁香假單胞霉素E抗性突變體的一個(gè)克隆以及丁香假單胞霉素E抗性親本菌株,用于對(duì)鞘氨醇-N-?;ミM(jìn)行搖瓶生產(chǎn)。24小時(shí)(對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期)和4天(穩(wěn)定期)后取樣。將10ml總發(fā)酵培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至10ml離心管中,在5300xg于4°C離心10分鐘,沉淀重新懸浮于1ml0.9%(w/v)氯化鈉(含有10mg/mlGlucanex(Sigma-Aldrich,Taufkirchen,Germany))中。細(xì)胞懸浮液在室顯培養(yǎng)1小時(shí),隨后使用SoniprepMSE對(duì)細(xì)胞懸浮液進(jìn)行3次超聲波處理,每次10秒,中間間隔冷卻。在5300xg對(duì)細(xì)胞懸浮液進(jìn)行離心,使用BCA試驗(yàn),按照Smitha/.(Measurementofproteinusingbicinchoninicacid.AnalBiochem.1985Oct;150(l):76-85),用牛血清清蛋白作為對(duì)照來(lái)測(cè)定上清液中的蛋白質(zhì)濃度。向800Ml含有300Mg蛋白質(zhì)的上清液中,加入3ml氯仿/乙醇混合物(1:2的比例)。劇烈混合達(dá)成單相之后,將樣品在室溫保持1小時(shí)。然后通過(guò)加入1ml氯仿和1ml蒸餾水使相分離。劇烈混合之后,在13000xg于室溫下對(duì)樣品進(jìn)行15分鐘的離心。分離出較低的含脂肪氯仿相,通過(guò)真空離心進(jìn)行蒸發(fā)(ChristVakuumzentrifuge,ChristAG,Osterode)。實(shí)施例14通過(guò)ESI-MS/MS在過(guò)量表達(dá)二氫神經(jīng)酰胺去飽和酶基因的丁香假單胞霉素E抗性尸z'W/acz'/^t/z'突變體中定量和表征鞘氨醇-N-酰基酯使用電噴霧離子化串聯(lián)質(zhì)譜(ESI-MS/MS)測(cè)定按照實(shí)施例12制備的細(xì)胞提取物中鞘氨醇-N-?;臐舛取SI-MS/MS細(xì)節(jié)儀器QuattroUltima(Micromass)MSESI/pos毛細(xì)電壓3.5kV錐孔電壓50VRF1鏡電壓0.1V孔電壓0.0VRF2鏡電壓0.6V去溶劑化溫度300°C源溫度100°C去溶劑化氣流660L/小時(shí)錐孔氣流100L/小時(shí)碰撞能量25eV碰撞氣壓l.(r3Torrlon能量10.51on能量21.0增效器650V親本離子掃描m/z400-800范圍內(nèi),m/z264.2LC條件流速0.05ml/分鐘注射體積20Ml滿環(huán)槽溫7°C流動(dòng)相含10mM甲酸銨的甲醇使用該方法,可展示過(guò)量表達(dá)乃'c力z'aa/em'/二氫神經(jīng)酰胺去飽和酶基因的丁香假單胞霉素E抗性突變體較之相應(yīng)的親本菌株能生產(chǎn)出至少兩倍的鞘氨醇-N-?;?圖5)。?;鶜埢粶y(cè)定為幾乎排他性地代表ce-羥基硬脂酸和蜂蠟酸(圖5)。N-a-羥基-硬脂酰-鞘氨醇以163ng/mg細(xì)胞蛋白質(zhì)的量存在,a-羥基-蜂蠟酰-鞘氨醇以392ng/mg細(xì)胞蛋白質(zhì)的量存在。加起來(lái),我們發(fā)現(xiàn)相對(duì)于每mg蛋白質(zhì)有至少550ng的鞘氨醇-N-?;ァS捎诘鞍踪|(zhì)相對(duì)總細(xì)胞干重的比例被測(cè)定為每g細(xì)胞千重520mg蛋白質(zhì),鞘氨醇-N-?;サ目偭繛槊縢細(xì)胞干重0.29mg。權(quán)利要求1.一種微生物菌株,其能生產(chǎn)對(duì)每g生物質(zhì)干重而言至少0.1mg的根據(jù)結(jié)構(gòu)式I的類鞘氨醇?jí)A或其鹽或酯,其中,A-B選自CH2-CH2和CH=CH構(gòu)成的組,并且,其中,R選自下述構(gòu)成的組a)(CH2)m-X-(CH2)n-CH3,其中m和n每個(gè)獨(dú)立地在0至18(含)之間,X是CH2-CH2、CH=CH、C≡C、CHOH-CH2、HC=O-CH2,前提條件是m+n應(yīng)當(dāng)在0至18(含)之間,以及b)(CH2)p-CH=CH-(CH2)q-CH=CH-(CH2)w-CH3,其中p、q和w每個(gè)獨(dú)立地在0至16(含)之間,前提條件是p+q+w應(yīng)當(dāng)在0至16(含)之間。2.如權(quán)利要求1所述的微生物菌株,其中所述類鞘氨醇?jí)A具有D-赤-(2R,3S)-構(gòu)型。3.如權(quán)利要求1或2所述的微生物菌株,其中R是(CH2)m-X-(CH2VCH3,優(yōu)選地,其中,m是O,X是CHrCH2或CHOH-CH2,n在8至12之間。4.如權(quán)利要求3所述的微生物,其中,m是O,X是CEb-CH2,n在8至12之間。5.如權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)所述的微生物菌株,其中,所述微生物菌株是酵母菌株,優(yōu)選地,是A'c/n'fl的菌株,更優(yōu)選地,是"/em'z'的菌株。6.—種方法,用于獲得前述任意權(quán)利要求所述的微生物菌株,所述方法包括在存在合適濃度的毒素的情況下,培養(yǎng)微生物細(xì)胞的群體,選擇對(duì)于所述毒素具有抗性的細(xì)胞亞群,從對(duì)毒素具有抗性的所述細(xì)胞亞群中分離出能生產(chǎn)對(duì)每g生物質(zhì)干重而言至少0.1mg的結(jié)構(gòu)式I的類鞘氨醇?jí)A的細(xì)胞。7.如權(quán)利要求6所述的方法,其中,所述毒素是丁香假單胞霉素E。8.如權(quán)利要求6或7所述的方法,還包括用編碼鞘脂代謝途徑的酶的多核苷酸,對(duì)下述對(duì)毒素具有抗性的微生物細(xì)胞群體進(jìn)行DNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化,所述對(duì)毒素具有抗性的微生物細(xì)胞群體能生產(chǎn)對(duì)每g生物質(zhì)干重而言至少0.1mg的結(jié)構(gòu)式I的類鞘氨醇?jí)A。9.如權(quán)利要求6或7所述的方法,還包括在與所述毒素一起培養(yǎng)之前,用編碼鞘脂代謝途徑的酶的多核苷酸,對(duì)所述微生物細(xì)胞群體進(jìn)行DNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。10.如權(quán)利要求8或9所述的方法,其中,所述鞘脂代謝途徑的酶是可從a;/b777獲得的二氫神經(jīng)酰胺去飽和酶。11.如權(quán)利要求8或9所述的方法,其中,所述鞘脂代謝途徑的酶是選自下述多肽構(gòu)成的組的二氫神經(jīng)酰胺去飽和酶a.具有如SEQIDNO:1所示的氨基酸序列的多肽,b.具有下述氨基酸序列的多肽,所述氨基酸序列與SEQIDNO:1具有至少67%的序列同一性。12.—種多肽,其具有二氫神經(jīng)酰胺去飽和酶活性,其選自下述多肽構(gòu)成的組a.具有如SEQIDNO:1所示的氨基酸序列的多肽,b.具有下述氨基酸序列的多肽,所述氨基酸序列與SEQIDNO:1具有至少67%的序列同一性。13.編碼權(quán)利要求12所述的多肽的多核苷酸。14.如權(quán)利要求13所述的多核苷酸,其是SEQIDNO:2。15.經(jīng)轉(zhuǎn)化的微生物菌株,其能生產(chǎn)對(duì)每g生物質(zhì)干重而言至少0.1mg的結(jié)構(gòu)式I的類鞘氨醇?jí)A,其可由權(quán)利要求8-10中任意一項(xiàng)所述的方法獲得。16.—種方法,用于生產(chǎn)根據(jù)結(jié)構(gòu)式I的類鞘氨醇?jí)A,所述方法包括將權(quán)利要求1-5或15中任意一項(xiàng)所述的微生物菌株在有益于生產(chǎn)所述類鞘氨醇?jí)A的條件下發(fā)酵,以及從發(fā)酵培養(yǎng)液中回收所述類鞘氨醇?jí)A。全文摘要本發(fā)明提供了微生物菌株,特別是酵母菌株,所述菌株能生產(chǎn)對(duì)每g生物質(zhì)干重而言至少0.1mg的類鞘氨醇?jí)A。本發(fā)明還提供了一種方法,用于獲得能生產(chǎn)類鞘氨醇?jí)A的微生物菌株,所述方法包括在存在合適濃度的毒素的情況下,培養(yǎng)微生物細(xì)胞的群體,選擇對(duì)于所述毒素具有抗性的細(xì)胞,從對(duì)毒素具有抗性的細(xì)胞群體中分離出能生產(chǎn)對(duì)每g生物質(zhì)干重而言至少0.1mg的結(jié)構(gòu)式(I)的類鞘氨醇?jí)A的細(xì)胞??蛇x地,所述方法還包括用編碼鞘脂代謝途徑的酶的多核苷酸對(duì)能生產(chǎn)相對(duì)于每g生物質(zhì)干重而言至少0.1mg的結(jié)構(gòu)式(I)的類鞘氨醇?jí)A的、對(duì)毒素具有抗性的細(xì)胞群體進(jìn)行DNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。本發(fā)明還提供了具有二氫神經(jīng)酰胺去飽和酶活性的多肽,其可從Pichiaciferrii獲得。文檔編號(hào)C12P13/02GK101098968SQ200580045976公開日2008年1月2日申請(qǐng)日期2005年11月7日優(yōu)先權(quán)日2004年11月5日發(fā)明者斯特芬·舍弗爾,馬爾科·亞歷山大·范德勃戈申請(qǐng)人:科斯莫費(fèi)爾姆有限公司
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