專利名稱：：莰非醇的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及莰非醇的制備方法，其中使用酸、堿、酶或者產(chǎn)生上述酶的微生物從莰非醇糖苷分離莰非醇。莰非醇，具有如下化學式l，是黃酮醇(一種類黃酮)的代表性成分，其廣泛分布于植物的花或葉中。已知有ioo或ioo余種黃酮醇，并且已知其中莰非醇、五羥黃酮以及楊梅黃酮存在最多。具體而言，莰非醇是一種抗氧化活性和抗炎活性等生理活性優(yōu)良的物質(zhì)。因此，進行了莰非醇各種功效的研究，并將莰非醇應(yīng)用于各種領(lǐng)域。但是，當前所使用的莰非醇大部分都是植物提取物，其含有莰非醇的量僅為數(shù)ppm至數(shù)十ppm，因此，難以揭示莰非醇的實質(zhì)功效。另外，由于難以發(fā)現(xiàn)包含大量莰非醇的植物，而且用于制備大量莰非醇的分離和純化沒有經(jīng)濟價值，因此，幾乎沒有開展有關(guān)莰非醇的大量生產(chǎn)的研究。綠茶是世界上歷史最悠久的飲料。近年來，隨著對于綠茶的關(guān)注的不斷增加，對茶的成分及其藥理效果也進行了大量的研究。與其他食品相比，綠茶含有大量的異丙醇胺(threamine)和多酚。已知綠茶的功能成分為屬
背景技術(shù)：
：化學式l于多葉多酚類的基于黃酮-3-醇(flavan-3-ol)的兒茶素(catechin)，且兒茶素的主要成分為(+)-兒茶素、(-)-表兒茶素(epicatechin)、(-)-表沒食子兒茶素-3-沒食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate)禾Q(-)-沒食子兒茶素(gallocatechin)等。特別地，有報道稱，綠茶中所含的多酚類降低了血液中的膽固醇，并具有抗氧化作用、抗癌、解毒、抗菌功能、預(yù)防蛀牙、抑制老化作用、美白效果及芳香成分等。另外還報道了，綠茶中所含的多酚類預(yù)防痛風、抑制脂類過氧化物和中性脂質(zhì)的產(chǎn)生并延緩衰老，由此防止肥胖、增進毛細血管的抵抗力。但是，具有各種功效的綠茶大多數(shù)以葉子的形式使用，包含相似的有效成分的綠茶種子除了用于栽培之外，就沒有得到利用。另外，幾乎所有的關(guān)注和研究都集中在綠茶的兒茶素類，特別是表沒食子兒茶素沒食子酸酯(印igallocatechingallate，EGCG)上。
發(fā)明內(nèi)容技術(shù)問題本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)未用于特殊用途的綠茶種子以及關(guān)注EGCG的綠茶葉含有大量的具有莰非醇母核的莰非醇糖苷，特別是在莰非醇上連接有3個糖的山茶苷A(camelliasideA)、山茶苷B等糖苷。由此發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明人完成了大量生產(chǎn)生理活性優(yōu)良的葡糖苷配基(aglycone)型的莰非醇的方法。因此，本發(fā)明的目的為提供一種使用酸、堿、酶或者產(chǎn)生上述酶的微生物從莰非醇糖苷分離莰非醇的方法。換言之，本發(fā)明的目的為提供一種從綠茶種子或綠茶葉中大量含有的莰非醇糖苷，特別是山茶苷A、山茶苷B等糖苷分離制備莰非醇的方法。技術(shù)方案為了實現(xiàn)所述目的，本發(fā)明提供了一種莰非醇的制備方法，該方法包括使用酸、堿、酶或者產(chǎn)生上述酶的微生物從莰非醇糖苷分離莰非醇。更具體地說，上述莰非醇的制備方法包括第一階段，使用水或有機溶劑從植物中獲得含有莰非醇糖苷的植物提取物；以及第二階段，使用酸、堿、酶或者產(chǎn)生上述酶的微生物水解上述植物提取物，以分離莰非醇。所述莰非醇糖苷包括山茶苷A或者山茶苷B。根據(jù)本發(fā)明的實施方式，在所述第一階段中，所述植物提取物可來源于綠茶種子或者綠茶葉。另夕卜，根據(jù)本發(fā)明的實施方式，所述有機溶劑可以為選自乙醇、甲醇、丁醇、醚、乙酸乙酯及氯仿中的至少一種有機溶劑，或者這些有機溶劑與水的混合溶劑，優(yōu)選使用80%的乙醇。根據(jù)本發(fā)明的實施方式，所述酸可以為選自鹽酸、硫酸及硝酸中的至少一種，酸或者這些酸與選自乙醇、甲醇及丁醇中的至少一種醇的混合溶劑。這時，根據(jù)本發(fā)明的實施方式，所述酸的優(yōu)選濃度范圍為0.1N2N，混合溶劑的醇含量可為1050%,反應(yīng)溫度可為5010(TC，且反應(yīng)時間可為0.58小時。根據(jù)本發(fā)明的實施方式，所述堿可以是選自氫氧化鈉及氫氧化鉀中的至少一種堿，或者這些堿與選自乙醇、甲醇及丁醇中的至少一種醇的混合溶劑。這時，根據(jù)本發(fā)明的實施方式，所述堿的濃度可為0.1N2N，混合溶劑的醇含量可為1050%，反應(yīng)溫度可為5010(TC，反應(yīng)時間可為0.524小日寸。根據(jù)本發(fā)明的實施方式，所述酶或者產(chǎn)生上述酶的微生物可為分解糖鍵的酶或者產(chǎn)生上述分解糖鍵的酶的微生物，并且所酶可從莰非醇糖苷除去糖部分而分離莰非醇。優(yōu)選地，所述莰非醇糖苷可包括山茶苷A或者山茶苷B。另外，根據(jù)本發(fā)明的實施方式，更優(yōu)選地，所述酶可為選自葡糖苷酶(glucosidase)、阿拉伯糖苷酶(arabinosidase)、鼠李糖苷酶(rhamnosidase)、木糖苷酶(Xylosidase)、纖維素酶(cellulase)、橙皮苷酶(hesperidinase)、柚苷酶(naringinase)、葡萄糖醛酸酶(glucuronidase)、果膠酶(pectinase)、半乳糖苷酶(galactosidase)、及淀粉葡糖苷酶(amyloglucosidase)中的至少一禾中酶。另外，根據(jù)本發(fā)明的實施方式，所述產(chǎn)生上述酶的微生物可為選自曲霉屬(aspergillussp.)、芽胞桿菌屬(bacillussp.)、青霉菌屬(penicilliumsp.)、根霉菌屬(rhizopussp.)、根毛霉屬(rhizomucorsp.)、踝節(jié)菌屬(talaromycessp.)、雙歧桿菌屬(bifidobacteriumsp.)、被孢霉屬(mortierellasp.)、隱球菌屬(cryptococcussp.)、及微桿菌屬(microbacteriumsp.)中的至少一種微生物。有益效果根據(jù)本發(fā)明，當使用酸、堿、酶或者產(chǎn)生上述酶的微生物從莰非醇糖苷分離莰非醇的方法時，能夠從植物，特別是從綠茶種子或者綠茶葉得到含有莰非醇糖苷、特別是山茶苷A或者山茶苷B的植物提取物，然后通過使用酸、堿、酶或者產(chǎn)生上述酶的微生物進行水解，大量制備作為主要的生理活性成分之一的莰非醇。圖1及圖2顯示通過高效液相色譜法測量使用酶按照實施例3的方法對實施例1的綠茶種子提取物進行水解前后的變化的結(jié)果；圖1表示測量水解前的綠茶提取物中的山茶苷A及山茶苷B的含量的圖，圖2表示測量水解后的綠茶提取物中的莰非醇的含量的圖。最佳實施方式根據(jù)本發(fā)明的莰非醇的制備方法包括第一階段，使用水或有機溶劑從植物中獲得含有莰非醇糖苷的植物提取物；以及第二階段，使用酸、堿、酶或者產(chǎn)生上述酶的微生物水解上述植物提取物以分離莰非醇。在上述第一階段中，為了使用水或有機溶劑得到含有作為莰非醇糖苷的山茶苷A或者山茶苷B的植物提取物，向植物傾注大約16倍、優(yōu)選大約3倍的水或者選自乙醇、甲醇、丁醇、醚、乙酸乙酯及氯仿中的至少一種有機溶劑，或者傾注這些有機溶劑與水的混合溶劑。然后，在常溫下攪拌15次的同時提取植物以脫脂。向脫脂的植物傾注大約18倍、優(yōu)選大約4倍的水或者有機溶劑。在回流條件下萃取混合物15次，并在1020'C的溫度下沉淀13天。其后，通過過濾和離心分離，分離殘留物與濾液，并將通過對所分離的濾液進行減壓濃縮得到的提取物懸浮于水中，然后使用醚等除去色素。接著，使用丁醇等除去水層15次。其后，通過對所得到的有機溶劑層進行減壓濃縮得到提取物，并將提取物溶于少量的甲醇等。接著，干燥通過向混合物加入大量的乙酸乙酯等產(chǎn)生的沉淀物，以得到本發(fā)明的植物提取物。在上述第二階段中，通過使用酸、堿、酶或者產(chǎn)生上述酶的微生物水解上述植物提取物，制備莰非醇。這時，當使用酸時，在植物提取物中加入0.1N2N、優(yōu)選1N的酸、或者酸及醇的混合溶劑(優(yōu)選50%的乙醇混合溶劑)，然后通過在50100°C、優(yōu)選8(TC的水浴中加熱148小時、優(yōu)選8小時進行水解，得到反應(yīng)溶液。當使用堿時，溶解植物提取物，然后加入0.1N2N、優(yōu)選1N的堿、或者堿及醇的混合溶劑(優(yōu)選50%的丁醇混合溶劑)，并通過在50100°C、優(yōu)選100'C的水浴中加熱回流148小時、優(yōu)選8小時進行水解，得到反應(yīng)溶液。當使用酶時，將植物提取物溶解于520倍、優(yōu)選大約10倍的酸性緩沖溶液中，加入酶，然后在大約37'C的水浴中攪拌大約4055小時、優(yōu)選大約48小時。同時，通過薄層色譜法檢測底物的去除率。當?shù)孜锿耆コ齾迹ㄟ^在熱水(80100°C)中加熱混合物515分鐘，終止水解反應(yīng)，得到反應(yīng)溶液。當使用產(chǎn)生上述酶的微生物時，將植物提取物溶解于510倍、優(yōu)選大約10倍的離子水中，然后在大約12rC的溫度下滅菌30分鐘，并冷卻至大約3(TC。其后，使用基于液體量510%的預(yù)先培養(yǎng)的微生物接種混合物，然后在30'C的溫度下培養(yǎng)25天、優(yōu)選5天。然后，通過薄層色譜法檢測底物的去除率。當?shù)孜锿耆コ龝r，終止水解反應(yīng)，以500010000rpm離心分離培養(yǎng)液，用蒸餾水將回收的沉淀物洗滌3次，然后離心，得到沉淀物形式的反應(yīng)溶液。如上所述，在使用酸、堿、酶、或者產(chǎn)生上述酶的微生物進行水解反應(yīng)。之后，通過減壓濃縮所得到的反應(yīng)溶液除去溶劑，在殘留物中加入醇，并攪拌混合物15次。過濾除去所沉淀的鹽，減壓濃縮所過濾的濾液，得到粗產(chǎn)物。然后使用硅膠柱色譜法(氯仿甲醇=8:14:1)純化所得到的粗產(chǎn)物，得到莰非醇。具體實施方式下面，通過實施例和實驗例對本發(fā)明進行更具體的說明，但是本發(fā)明并不受到這些實施例的限制。綠茶種子提取物的制備在2kg綠茶種子中加入6L己垸，然后在常溫下攪拌混合物3次進行脫脂。然后在lkg經(jīng)過脫脂的種子中加入4L80X的甲醇，回流萃取混合物3次，接著，在15匸下沉淀1天。然后，通過使用濾布的過濾和離心分離殘留物和濾液，減壓濃縮所分離的濾液，得到提取物，將該提取物懸浮于水中，然后使用1L醚萃取5次以除去色素。用500mLl—丁醇萃取水層3次，對這樣得到的整個l一丁醇層進行減壓濃縮得到l一丁醇提取物，將其溶于少量的甲醇中，然后加入大量的乙酸乙酯，得到沉淀物。干燥所生成的沉淀物，得到250g綠茶種子提取物。綠茶葉提取物的制備在2kg綠茶葉中加入6L己烷，然后在常溫下攪拌混合物3次進行脫脂。然后在lkg經(jīng)過脫脂的葉中加入4L80%的甲醇，回流萃取混合物3次，接著，在15-C下沉淀1天。然后，通過使用濾布的過濾或者離心分離殘留物和濾液，減壓濃縮所分離的濾液，得到提取物，將該提取物懸浮于水中，然后使用1L醚萃取5次以除去色素。加入用500mLl—丁醇萃取水層3次。對這樣得到的整個l一丁醇層進行減壓濃縮得到l一丁醇提取物，將其溶于少量的甲醇中，然后加入大量的乙酸乙酯。干燥所生成的沉淀物，得到150g綠茶葉提取物。利用酸解法制備莰非醇在10g按照上述實施例1得到的綠茶種子提取物中加入20倍(v/w)的1NHC1—50X的甲醇溶液(v/v)，然后在8(TC的水浴中回流加熱8小時，水解與山茶苷A與山茶苷B結(jié)合的糖。接著，減壓濃縮反應(yīng)溶液，除去溶劑，在殘留物中加入乙醇(200mL)并攪拌混合物(3次)，通過過濾除去所得的沉淀的鹽，減壓濃縮過濾的濾液，得到粗產(chǎn)物，通過硅膠柱色譜法(氯仿甲醇=8:14:1)純化所得到的粗產(chǎn)物，得到0.95g莰非醇。利用堿水解法制備莰非醇將10g按照上述實施例1得到的綠茶種子提取物溶解于干燥批啶(500mL)中，向其中加入甲醇鈉(粉末、10g)，并在水浴中回流加熱8小時，水解與山茶苷A與山茶苷B結(jié)合的糖。接著，通過減壓濃縮反應(yīng)溶液除去溶劑，在殘留物中加入乙醇(200mL)，并攪拌混合物(3次)。通過過濾除去所得的沉淀的鹽。減壓濃縮過濾得到的濾液得到粗產(chǎn)物。通過硅膠柱色譜法(氯仿甲醇=8:14:1)純化所得到的粗產(chǎn)物，得到0.25g莰非醇。通過酶解法制備莰非醇將10g按照上述實施例1得到的綠茶種子提取物溶解于lOOmL的O.IM醋酸緩沖液(pH4.5)中。向混合物加入2.5g酶(橙皮苷酶0.5g、柚苷酶0.5g、纖維素酶0.5g、|3—葡萄糖醛酸酶0.2g、卩一半乳糖苷酶0.5g、淀粉葡糖苷酶0.3g;Sigma公司制造)，并在37。C的水浴中攪拌48小時，同時通過薄層色譜法周期性地進行檢查。當?shù)孜?山茶苷A和山茶苷B)完全去除時，通過在熱水(80100°C)中加熱10分鐘終止反應(yīng)，然后通過減壓濃縮反應(yīng)溶液除去溶劑。將殘留物加入乙醇(200mL)，并攪拌(3次)。通過過濾除去所得的沉淀物。然后，減壓濃縮過濾得到的濾液，得到粗產(chǎn)物。通過硅膠柱色譜法(氯仿一甲醇=8:14:1)純化所得到的粗產(chǎn)物，得到1.02g莰非醇。使用微生物制備莰非醇將10g按照上述實施例2得到的綠茶葉提取物溶解于100mL的離子水中，在12rC下滅菌30分鐘，冷卻至3(TC，使用基于液體量510%的預(yù)培養(yǎng)的黑曲霉(^;^g///^w'gw)KCCM11885進行接種，并在30'C下培養(yǎng)5天。通過薄層色譜法檢査底物的去除率。當?shù)孜锿耆コ龝r終止反應(yīng)，以500010000rpm離心分離培養(yǎng)液，通過蒸餾水洗滌回收的沉淀物3次，然后離心，得到沉淀物形式的反應(yīng)溶液。在上述沉淀物中加入乙醇(200mL)，然后攪拌混合物(3次)。然后通過過濾除去沉淀物，減壓濃縮過濾得到的濾液，以得到粗產(chǎn)物。通過硅膠柱色譜法(氯仿一甲醇二8:14:1)純化所得到的粗產(chǎn)物，得到0.62g莰非醇。山茶苷A及山茶苷B的鑒定通過硅膠柱色譜法(填充100g硅膠)純化10g按照上述實施例1得到的綠茶種子提取物。這時，使用氯仿和甲醇作為展開劑，將氯仿與甲醇之比從10:l提高到2:1，從而提高濃度梯度，得到餾分。從這些餾分獲得0.82g山茶苷A和1.24g山茶苷B。對這樣得到的產(chǎn)物進行鑒定(VarianGemini2000,300MHz，Varian公司)。結(jié)果，由于產(chǎn)物顯示出如下表1所示的特性，因而鑒定為山茶苷A及山茶苷B。<山茶苷人的物理化學性質(zhì)>性狀淺綠黃色微晶正離子FAB—MS:756.9[M+H]<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>[實驗例2]莰非醇的鑒定由于按照上述實施例36所制備的產(chǎn)物顯示出如下特性，因此被鑒定為莰非醇(VarianGemini2000，300MHz，Varian公司制造)。<莰非醇的物理化學性質(zhì)〉性狀淺綠黃色微晶正離子FAB—MS:287[M+H]+!H-NMR:6.1(1H，d，1.8Hz)，6.3(1H,d，1.8Hz)，6.8(2H,dd,9Hz),8.0(2H，dd，9Hz)13C-NMR:94.467，99.248,104.518,116.265,123.710,130.649,137.069,147.970,158.200,160.480，162.446，165,519,177.285水解(酶消化)后莰非醇的含量變化按照上述實施例1的方法制備綠茶種子提取物，然后通過上述實施例3的方法進行酶解反應(yīng)。然后通過高效液相色譜法測量酶解反應(yīng)前后的變化。這時，酶解反應(yīng)前的綠茶種子提取物中所含的山茶苷A及山茶苷B的含量的測量結(jié)果如圖1所示，酶解反應(yīng)后的莰非醇的含量的測量結(jié)果如圖2所示。如圖l及圖2所示，山茶苷A及山茶苷B幾乎都轉(zhuǎn)化為莰非醇。工業(yè)實用性根據(jù)本發(fā)明，當使用酸、堿、酶或者產(chǎn)生上述酶的微生物從莰非醇糖苷分離莰非醇的方法時，能夠從植物，特別是綠茶種子或者綠茶葉得到含有莰非醇糖苷、特別是包含山茶苷A或者山茶苷B的植物提取物，然后通過使用酸、堿、酶或者產(chǎn)生上述酶的微生物的水解法，大量生產(chǎn)作為主要的生理活性成分之一的莰非醇。權(quán)利要求1、莰非醇的制備方法，該方法包括使用酸、堿、酶或者產(chǎn)生所述酶的微生物從莰非醇糖苷分離莰非醇。2、權(quán)利要求1所述的方法，其包括使用水或有機溶劑從植物獲得含有莰非醇糖苷的植物提取物；以及使用酸、堿、酶或者產(chǎn)生所述酶的微生物水解所述植物提取物以分離莰非醇。3、權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述莰非醇糖苷包括山茶苷A或者山茶苷B。4、權(quán)利要求2所述的方法，其中所述植物提取物來源于綠茶種子或者綠茶葉。5、權(quán)利要求2所述的方法，其中所述有機溶劑為選自乙醇、甲醇、丁醇、醚、乙酸乙酯及氯仿中的至少一種有機溶劑，或者這些有機溶劑與水的混合溶劑。6、權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述酸為選自鹽酸、硫酸及硝酸中的至少一種酸，或者是這些酸與選自乙醇、甲醇及丁醇中的至少一種醇的混合溶劑。7、權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述堿為選自氫氧化鈉及氫氧化鉀中的至少一種堿，或者是這些堿與選自乙醇、甲醇及丁醇中的至少一種醇的混合溶劑。8、權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述酶從莰非醇糖苷除去糖部分以分離莰非醇。9、權(quán)利要求8所述的方法，其中所述莰非醇糖苷包含山茶苷A或者山茶苷B。10、權(quán)利要求8所述的方法，其中所述酶為選自葡糖苷酶、阿拉伯糖苷酶、鼠李糖苷酶、木糖苷酶、纖維素酶、橙皮苷酶、柚苷酶、葡萄糖醛酸酶、果膠酶、半乳糖苷酶、及淀粉葡糖苷酶中的至少一種酶。11、權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述產(chǎn)生所述酶的微生物為選自曲霉屬、芽胞桿菌屬、青霉菌屬、根霉菌屬、根毛霉屬、踝節(jié)菌屬、雙歧桿菌屬、被孢霉屬、隱球菌屬、及微桿菌屬中的至少一種微生物。全文摘要本發(fā)明涉及一種莰非醇的制備方法，該方法包括使用酸、堿、酶或者產(chǎn)生上述酶的微生物從莰非醇糖苷分離莰非醇。更具體地說，所述方法包括使用水或有機溶劑從植物獲得含有莰非醇糖苷的植物提取物；以及使用酸、堿、酶或者產(chǎn)生上述酶的微生物水解上述植物提取物，以分離莰非醇。上述莰非醇糖苷包括山茶苷A或者山茶苷B。上述植物提取物來源于綠茶種子或者綠茶葉。當使用本發(fā)明的方法時，能夠從植物、特別是綠茶種子和綠茶葉大量生產(chǎn)作為主要的生理活性成分的莰非醇。文檔編號C12P17/06GK101103119SQ200580046808公開日2008年1月9日申請日期2005年5月30日優(yōu)先權(quán)日2005年1月18日發(fā)明者廬浩植,廉明勳,張利燮,朱璟美,樸元錫,樸葰星,李玉燮,金德姬申請人:株式會社太平洋