專利名稱：：Pcv2免疫原性組合物和產(chǎn)生這種組合物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明一方面涉及回收2型豬圓環(huán)病毒(PCV2)的開放閱讀框2(ORP2)表達(dá)的蛋白質(zhì)。更具體說，所述蛋白是轉(zhuǎn)染病毒表達(dá)的含有2型豬圓環(huán)病毒開放閱讀框2的重組編碼序列的重組蛋白。更具體說，使該轉(zhuǎn)染病毒感染培養(yǎng)生長的細(xì)胞，并從上清液中、而非細(xì)胞內(nèi)回收開放閱讀框2表達(dá)的蛋白質(zhì)。更具體說，該方法包括以下步驟擴(kuò)增2型豬圓環(huán)病毒開放閱讀框2基因，將此擴(kuò)增部分克隆入第一種載體，從此第一種載體上切下開放閱讀框2部分并將其克隆入轉(zhuǎn)運(yùn)載體，將該轉(zhuǎn)運(yùn)載體與病毒載體共同轉(zhuǎn)染入培養(yǎng)生長的細(xì)胞中，使該病毒載體感染細(xì)胞，表達(dá)開放閱讀框2，回收上清液中表達(dá)的開放閱讀框2編碼的重組蛋白。另一方面，本發(fā)明涉及有效誘導(dǎo)對PCV2的免疫應(yīng)答的免疫原性組合物和制備這些免疫原性組合物的方法。更具體說，本發(fā)明涉及有效保護(hù)接受該組合物的動物和減輕PCV2感染相關(guān)臨床癥狀嚴(yán)重程度的免疫應(yīng)答的免疫組合物。更具體說，本發(fā)明涉及對PCV2感染產(chǎn)生有效保護(hù)力的基于蛋白質(zhì)的免疫組合物。更具體說，本發(fā)明涉及包含PCV2的ORF2的免疫組合物，其中給予PCV2-ORF2會產(chǎn)生抵抗PCV2感染的保護(hù)力。最具體說，本發(fā)明涉及能在接受該免疫組合物的豬中有效產(chǎn)生免疫力的免疫組合物，該組合物包含PCV2的ORF2表達(dá)的蛋白質(zhì)?，F(xiàn)有技術(shù)的描述2型豬圓環(huán)病毒(PCV2)是一種小的(直徑17-22nm)二十面體無包膜DNA病毒，它含有單鏈環(huán)狀基因組。PCV2與1型豬圓環(huán)病毒(PCV1)的序列相同性約為80%。然而，與通常無毒性的PCV1相反，感染PCV2的豬顯示出一種常見綜合征，稱為斷奶后多系統(tǒng)消瘦性綜合征(PMWS)。PMWS的臨床特征為消瘦、皮膚蒼白、不健康、呼吸窘迫、腹瀉、黃疸(icterus和jaundice)。在一些患病豬中，可出現(xiàn)所有癥狀的組合，而另一些豬僅有這些癥狀中的一種或兩種。尸檢過程中，許多組織和器官也出現(xiàn)了微觀和宏觀病損，淋巴器官是最常見的病損部位。觀察到PCV2核酸或抗原含量與微觀淋巴病損嚴(yán)重性之間強(qiáng)烈相關(guān)。感染PCV2的豬的死亡率可達(dá)到80%。除了PMWS以外，PCV2與幾種其它感染相關(guān)，包括偽狂犬病、豬生殖和呼吸道綜合征(PRRS)、Glasser病、鏈球菌性腦膜炎、沙門菌病、斷奶后大腸桿菌病、飲食性肝機(jī)能障礙和化膿性支氣管肺炎。PCV2的開放閱讀框2(ORF2)蛋白在SDS-PAGE凝膠上跑電泳時分子量約為30kDa，過去曾將該蛋白用作PCV2疫苗的抗原性組分。獲得用于這種疫苗的ORF2的一般方法通常由以下步驟組成擴(kuò)增編碼ORF2的PCV2DNA，用ORF2DNA轉(zhuǎn)染病毒載體，用含有ORF2DNA的病毒載體感染細(xì)胞，使該病毒在細(xì)胞中表達(dá)ORF2蛋白，裂解細(xì)胞提取細(xì)胞中的ORF2蛋白。在病毒載體感染細(xì)胞后，這些方法通常需要約4天。然而，這些方法的缺點(diǎn)是，提取步驟昂貴且耗時。此外，從細(xì)胞回收的ORF2的量不很高；因此，需要用大量病毒載體感染大量細(xì)胞，才能獲得疫苗所需足量的重組表達(dá)蛋白質(zhì)等。PCV2免疫的現(xiàn)有方法包括基于DNA的疫苗，如美國專利6,703,023所述。然而，這種疫苗不能有效產(chǎn)生抵抗PCV2感染和與其相關(guān)臨床癥狀的保護(hù)性免疫力。因此，本領(lǐng)域需要一種獲得ORF2蛋白的方法，該方法不需要從感染細(xì)胞內(nèi)提取ORF2蛋白。還需要獲得足夠量的有效制備疫苗組合物的重組ORF2蛋白的方法。還需要不用現(xiàn)有ORF2蛋白提取方法所需的復(fù)雜的勞動密集型方法獲得ORF2蛋白的方法。最后，關(guān)于組合物，本領(lǐng)域需要能產(chǎn)生抵抗PCV2感染的保護(hù)性免疫力并降低其嚴(yán)重性或防止其相關(guān)臨床癥狀的免疫原性組合物。發(fā)明概述本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)的固有問題，提供了優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)水平的顯著進(jìn)步。具體說，本發(fā)明一方面提供了產(chǎn)生和/或回收重組PCV2ORF2蛋白的改進(jìn)方法，即i)用含有PCV2ORF2DNA編碼序列的重組病毒載體感染培養(yǎng)的易感細(xì)胞，在細(xì)胞0中由所述重組病毒載體表達(dá)ORF2蛋白，和ii)隨后回收上清液中的ORF2。出人意料地發(fā)現(xiàn)，如果感染和隨后培育感染細(xì)胞而不用原先從細(xì)胞內(nèi)提取PCV20RF2的經(jīng)典PCV20RF2回收過程，將會有大量ORF2釋放入上清液中。而且，令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，PCVORF2蛋白能強(qiáng)烈抵抗原先在生產(chǎn)細(xì)胞以外的降解。這兩個發(fā)現(xiàn)使得能夠從用含有PCV2ORF2DNA和表達(dá)PCV2ORF2蛋白的重組病毒載體感染的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中大量回收PCV2ORF2蛋白。大量產(chǎn)生PCV2ORF2蛋白指高于約20ng/mL上清，優(yōu)選高于約25pg/mL，更優(yōu)選高于約30)ig/mL，更優(yōu)選高于約40pg/mL，更優(yōu)選高于約50jiig/mL，更優(yōu)選高于約60pg/mL，更優(yōu)選高于約80pg/mL，更優(yōu)選髙于約100pg/mL，更優(yōu)選高于約150pg/mL，最優(yōu)選高于約190ng/mL。也可通過(例如)實(shí)施例l-3所述方法實(shí)現(xiàn)這些表達(dá)率。優(yōu)選所述細(xì)胞培養(yǎng)物中的細(xì)胞計數(shù)約為0.3-2.0xl06個細(xì)胞/mL，更優(yōu)選約為0.35-1.9xl()6個細(xì)胞/mL，更優(yōu)選約為0.4-1.8xl()6個細(xì)胞/mL，更優(yōu)選約為0.45-1.7xl06個細(xì)胞/mL，最優(yōu)選約為0.5-1.5xl(^個細(xì)胞/mL?？捎杀绢I(lǐng)域技術(shù)人員確定優(yōu)選細(xì)胞。優(yōu)選細(xì)胞是易被含有PCV2ORF2DNA和表達(dá)PCV2ORF2蛋白的合適重組病毒載體感染的細(xì)胞。細(xì)胞優(yōu)選為昆蟲細(xì)胞，更優(yōu)選包括以商標(biāo)Sf+昆蟲細(xì)胞出售的昆蟲細(xì)胞(ProteinSciencesCorporation,Meriden，CT)。本領(lǐng)域技術(shù)人員也可確定合適的生長培養(yǎng)基，優(yōu)選的生長培養(yǎng)基是無血清昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基，如Excell420(JRHBiosciences,Inc.,Lenexa，KS)等。優(yōu)選的病毒載體包括桿狀病毒，如BaculoGold(BDBiosciencesPharmingen，SanDiego，CA)，具體說，如果生產(chǎn)細(xì)胞是昆蟲細(xì)胞。雖然優(yōu)選桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，其它表達(dá)系統(tǒng)也可用于本發(fā)明目的，即須使PCV20RF2表達(dá)到細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中。其它表達(dá)系統(tǒng)可能需要采用信號序列，以使ORF2表達(dá)到培養(yǎng)基中。令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，當(dāng)用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生ORF2時，不需要任何信號序列或進(jìn)一步修飾ORF2即能表達(dá)到培養(yǎng)基中。故認(rèn)為，此種蛋白可獨(dú)立地形成病毒樣顆粒(JournalofGeneralVirology,第81巻，第2281-2287頁(2000)和分泌入培養(yǎng)物上清液中。用含有PCV20RF2DNA序列的重組病毒載體感染易感細(xì)胞時，感染復(fù)數(shù)(MOI)優(yōu)選約為0.03-1.5，更優(yōu)選約為0.05-1.3，更優(yōu)選約為0.09-1.1，最優(yōu)選約為0.1-1.0。上述MOI優(yōu)選指1mL細(xì)胞培養(yǎng)液。本文所述方法優(yōu)選包括感染0.35-1.9><106個細(xì)胞/mL，更優(yōu)選約0.4-1.8xl(^個細(xì)胞/mL，更優(yōu)選約0.45-1.7xl(^個細(xì)胞/mL，最優(yōu)選約0.5-1.5xl()6個細(xì)胞/mL，含有PCV2ORF2DNA和表達(dá)PCV2ORF蛋白的重組病毒載體的MOI(感染復(fù)數(shù))約為0.03-1.5，更優(yōu)選約為0.05-1.3，更優(yōu)選約為0.09-1.1,最優(yōu)選約為0.1-1.0。然后，培養(yǎng)感染細(xì)胞長達(dá)10天，優(yōu)選約2-10天，更優(yōu)選約4-9天，最優(yōu)選約5-8天。優(yōu)選的培養(yǎng)條件包括溫度約22-32°C，更優(yōu)選約24-30°C，更優(yōu)選約25-29°C，更優(yōu)選約26-28'C，最優(yōu)選約27i:。優(yōu)選觀察接種后Sf+細(xì)胞受到桿狀病毒誘導(dǎo)的特征性變化。這種觀察可包括在感染后期間監(jiān)測細(xì)胞密度的變化趨勢和活力降低。發(fā)現(xiàn)在感染3-5天后觀察到病毒效價達(dá)到峰值，第5-8天和/或當(dāng)細(xì)胞活力降低到10%以下時獲得細(xì)胞向上清液中釋放0RF2達(dá)到峰值。因此，本發(fā)明一方面提供了產(chǎn)生和/或回收重組PCV2ORF2蛋白(優(yōu)選以上述含量)的改進(jìn)方法，即i)用重組病毒載體以上述MOI感染培養(yǎng)的大量易感細(xì)胞(見上)，ii)由所述重組病毒載體表達(dá)PCV2ORP2蛋白，和iii)然后在感染后5-8天和/或細(xì)胞活力降低到10"/。以下時收獲細(xì)胞上清液中的PCV2ORF2。所述重組病毒載體優(yōu)選為含有PCV20RF2DNA編碼序列的重組桿狀病毒，所述細(xì)胞優(yōu)選Sf+細(xì)胞。此外，優(yōu)選在感染后期間定時監(jiān)測培養(yǎng)細(xì)胞有無宏觀和微觀污染證據(jù)或非典型細(xì)胞形態(tài)改變。應(yīng)棄去顯示污染的任何培養(yǎng)物。優(yōu)選細(xì)胞將表達(dá)的ORF2重組蛋白分泌入維持細(xì)胞活力的周圍生長培養(yǎng)基中。然后，從細(xì)胞周圍的上清液中而非細(xì)胞本身回收ORF2?；厥者^程優(yōu)選開始于分離步驟，即分離細(xì)胞碎片與培養(yǎng)基中表達(dá)的ORF2。優(yōu)選的分離步驟包括過濾、以約20，000xg的轉(zhuǎn)速離心、連續(xù)流離心、用離子交換或凝膠過濾進(jìn)行色譜分離和常規(guī)的免疫親和法。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知這些方法，例如(Harris和Angel(編)，《蛋白質(zhì)純化方法-實(shí)踐方法》(Proteinpurificationmethods-apracticalapproach),IRLpressOxford1995)。最優(yōu)選的分離方法包括以高達(dá)約20，000xg的轉(zhuǎn)速離心和過濾。優(yōu)選的過濾方法包括死封端微量過濾和切向流(或交叉流)過濾，包括中空纖維過濾和死封端微量過濾。在這些方法中，優(yōu)選死封端微量過濾。死封端微量過濾的孔徑優(yōu)選約為0.30-1.35pm，更優(yōu)選約為0.35-1.25|im，更優(yōu)選約為0.40-1.10pm，最優(yōu)選約為0.45-1.0nm。認(rèn)為常規(guī)濾膜可用于本發(fā)明目的，優(yōu)選聚醚砜膜。此過濾步驟去除了任何低分子量的核酸物質(zhì)。因此，本發(fā)明另一方面提供了產(chǎn)生和/或回收重組PCV20RF2蛋白(優(yōu)選以上述含量)的改進(jìn)方法，即i)用重組病毒載體以上述MOI感染培養(yǎng)的大量易感細(xì)胞(見上)，ii)使所述重組病毒載體表達(dá)PCVORF2蛋白，iii)回收感染后5-8天和/或細(xì)胞活力降低到10%以下時收獲的細(xì)胞上清液中的PCV2ORF2，和iv)通過分離步驟分離細(xì)胞碎片與表達(dá)的PCV2ORF2。所述重組病毒載體優(yōu)選含有ORF2DNA編碼序列的桿狀病毒，所述細(xì)胞優(yōu)選Sf+細(xì)胞。優(yōu)選的分離步驟如上所述。最優(yōu)選是用孔徑約0.30-1.35pm，更優(yōu)選約0.35-1.25|nm，更優(yōu)選約0.40-1.10pm，最優(yōu)選約0.45-1.0jim的膜進(jìn)行的死封端微量過濾。為了回收用于免疫原性或免疫組合物如疫苗的PCV2ORF2，優(yōu)選包括滅活步驟，以滅活病毒載體。"免疫原性或免疫組合物"指包含至少一種抗原的組合物，所述抗原能在宿主中引發(fā)針對感興趣的組合物或疫苗的細(xì)胞和/或抗體介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。通常，"免疫應(yīng)答"包括但不限于以下一種或多種作用產(chǎn)生或激活抗體、B細(xì)胞、輔助T細(xì)胞、抑制T細(xì)胞和/或細(xì)胞毒性T細(xì)胞和/或ydT細(xì)胞，其特異性針對感興趣組合物或疫苗中包含的抗原。優(yōu)選地，宿主將顯示治療性或保護(hù)性免疫應(yīng)答，而提高對新發(fā)感染的抵抗力和/或降低疾病的臨床嚴(yán)重程度?？赏ㄟ^感染宿主通常所顯示癥狀的減輕或缺失、恢復(fù)時間較短和/或感染宿主中病毒效價降低來表明這種保護(hù)作用。因此，本發(fā)明也涉及產(chǎn)生和/或回收重組PCV20RF2蛋白(優(yōu)選以上述含量)的方法，即i)用重組病毒載體以上述MOI感染培養(yǎng)的大量易感細(xì)胞(見上)，ii)由所述重組病毒載體表達(dá)PCVORF2蛋白，iii)回收感染后5-8天和/或細(xì)胞活力降低到10%以下時收獲的細(xì)胞上清液中的PCV2ORF2，iv)通過分離步驟分離細(xì)胞碎片與表達(dá)的PCV20RF2，和v)滅活所述重組病毒載體。優(yōu)選地，恰好在過濾步驟之前或之后完成此滅活，過濾步驟后是優(yōu)選的滅活時機(jī)。任何常規(guī)滅活方法均可用于本發(fā)明目的。因此，可通過化學(xué)和/或物理處理進(jìn)行滅活。在優(yōu)選方式中，測定收獲液體的體積，加熱使溫度提高到約32-42'C，更優(yōu)選約34-4(TC，最優(yōu)選約35-39'C。優(yōu)選的滅活方法包括加入環(huán)化的雙氮丙啶(BEI)，濃度優(yōu)選約為1-20mM，優(yōu)選約為2-10mM，更優(yōu)選約為2-8mM，更優(yōu)選約為3-7mM，最優(yōu)選約為5mM。例如，此滅活包括將優(yōu)選約0.4M的氫溴酸2-溴乙胺溶液(它在0.3NNaOH中環(huán)化成0.2M雙氮丙啶(BEI))加入該液體中，得到終濃度約為5mM的BEI。優(yōu)選地，隨后連續(xù)攪拌該液體72-96小時，可將滅活的收獲液體凍存于-4(TC或更低，或者保存在約1-7'C。滅活完成后，優(yōu)選加入l.OM硫代硫酸鈉溶液，以中和任何殘留的BEI。優(yōu)選加入與滅活前所加入的BEI等價含量的硫代硫酸鈉。例如，在加入的BEI終濃度為5mM的情況下，加入l.OM硫代硫酸鈉溶液使其最終最低濃度為5mM，以中和任何殘留的BEI。因此，本發(fā)明另一方面涉及產(chǎn)生重組PCV2ORF2蛋白(優(yōu)選以上述含量)的方法，即i)用重組病毒載體以上述MOI感染培養(yǎng)的大量易感細(xì)胞(見上)，ii)由所述重組病毒載體表達(dá)PCVORF2蛋白，iii)回收感染后5-8天和/或細(xì)胞活力降低到10%以下時收獲的細(xì)胞上清液中的PCV2ORF2，iv)通過分離步驟分離細(xì)胞碎片與表達(dá)的PCV2ORF2,和v)滅活所述重組病毒載體。所述重組病毒載體優(yōu)選為含有ORF2DNA編碼序列的桿狀病毒，所述細(xì)胞優(yōu)選為Sf+細(xì)胞。優(yōu)選的分離步驟如上所述，最優(yōu)選是過濾步驟。優(yōu)選的滅活步驟如上所述。優(yōu)選在約35-39'C和2-8mMBEI存在下，更優(yōu)選在約5mMBEI存在下進(jìn)行滅活。令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，較高濃度的BEI會對PCV2ORF2蛋白產(chǎn)生負(fù)面影響。本發(fā)明另一方面，上述方法在步驟v)之后還包括中和步驟。此步驟vi)包括加入等價含量的能中和溶液中滅活劑的物質(zhì)。如果滅活劑是BEI，優(yōu)選加入等價含量硫代硫酸鈉。因此，根據(jù)另一方面，步驟vi)包括滅活劑是BEI時，加入終濃度約為1-20mM，優(yōu)選約為2-10mM，更優(yōu)選約為2-8mM，更優(yōu)選約為3-7mM，最優(yōu)選約為5mM的硫代硫酸鈉溶液。在用于免疫原性組合物如疫苗的優(yōu)選形式，尤其是重組PCV2ORF2蛋白形式中，通過在固定的依賴桿狀病毒的易感性Sf+細(xì)胞中傳代監(jiān)測各批次收獲的ORF2的滅活情況。在此測試的優(yōu)選形式中，用1.0mL滅活的PCV2液接種1500112合適的單層培養(yǎng)細(xì)胞，維持25-29'C14天，至少兩代。在該維持末期，檢測該單層細(xì)胞所受到的PCV2ORF2桿狀病毒細(xì)胞病變作用(CPE)。優(yōu)選地，也采用陽性病毒對照。這種對照包括用未滅活的參比PCV2ORF2桿狀病毒接種一瓶Sf+培養(yǎng)細(xì)胞和保持未接種的一瓶Sf+細(xì)胞。培育和傳代后，BEI處理的病毒液中不存在病毒感染細(xì)胞表明滅活測試令人滿意。接種參比病毒的對照細(xì)胞應(yīng)顯示PCV2ORF2桿狀病毒的典型CPE，未接種的培養(yǎng)瓶應(yīng)不顯示有任何PCV20RF2桿狀病毒CPE的跡象?；蛘?，在維持培養(yǎng)末期，可收集上清樣品接種到加有Sf+細(xì)胞的Sf+96孔板上，然后25-29匸維持培育5-6天。然后固定該平板，用偶聯(lián)FITC的抗PCV20RF2抗體染色。用IFA顯微鏡檢測BEI處理的病毒液若沒有CPE和ORF2表達(dá)表明滅活測試令人滿意。接種參比病毒的對照細(xì)胞應(yīng)顯示出CPE和IFA活性，未接種的培養(yǎng)瓶應(yīng)不顯示有任何PCV20RF2桿狀病毒CPE的跡象，并且沒有IFA活性。因此，本發(fā)明另一方面涉及一種測定重組病毒載體滅活效果的滅活測試，所述滅活測試包括以下步驟i)使至少一部分含有該重組病毒載體的培養(yǎng)液接觸優(yōu)選的上述滅活劑，ii)加入中和劑以中和優(yōu)選的上述滅活劑，和iii)用上述試驗檢測殘留的感染力。滅活后，可以多種方式測定樣品中重組PCV20RF2蛋白的相對含量。優(yōu)選的定量方法包括SDS-PAGE密度測定法、ELISA和使己知量的疫苗與臨床效果(血清學(xué)等)關(guān)聯(lián)起來的動物疫苗接種研究。當(dāng)SDS-PAGE用于定量時，在凝膠上電泳含有未知量重組PCV2ORF2蛋白的樣品以及含有不同已知量重組PCV2ORF2蛋白的樣品。然后，可根據(jù)已知樣品產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線，可通過與此標(biāo)準(zhǔn)曲線作比較確定未知樣品中重組PCV2ORF2的含量。因為ELISA通常被認(rèn)為是抗原定量的工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，所以優(yōu)選用ELISA進(jìn)行定量。因此，按照另一方面，本發(fā)明也涉及用于定量重組PCV20RF2蛋白的ELISA。本文提供的優(yōu)選ELISA法開始時通常從用包被緩沖液以1:6000或合適的工作稀釋度稀釋捕獲抗體。優(yōu)選的捕獲抗體是純化的豬抗-PCV2Pab蛋白G，優(yōu)選的包被緩沖液是0.05M碳酸鹽緩沖液，該緩沖液可將2.93gNaHC03(Sigma目錄號S-6014，或等效物)和1.59gNaC03(Sigma目錄號S-6139,或等效物)混合來制備。將該混合物與蒸餾水或等效物混合，制備pH9.6士0.1的一升溶液。下一步，用包被緩沖液以1:6000或任何其它合適的工作稀釋度稀釋捕獲抗體。例如，對于四塊平板，一塊需要42mL包被緩沖液和7)LiL捕獲抗體。采用反向吸移法，將100pL稀釋的捕獲抗體加入所有孔中。為了獲得均勻包被，應(yīng)溫和拍打各平板的側(cè)面。然后用平板密封條密封該平板，然后疊加平板并用空96孔板加蓋。將平板在35-39"C培育過夜(14-24小時)。然后用ultrawashplus微量滴定板洗滌器以洗滌緩沖液洗滌各平板3次，設(shè)定為250|_iL/洗滌、洗滌3次、無浸泡時間。最后一次洗滌后，在紙巾上拍打平板。用反向吸移技術(shù)再次將250pL封閉溶液加入所有孔中。應(yīng)密封測試平板，35-37'C培育約1小時(±5分鐘)。優(yōu)選此步驟后不疊加平板。在封閉步驟期間，應(yīng)拿出所有測試樣品室溫解凍。下一步，應(yīng)準(zhǔn)備四個獨(dú)立的稀釋平板，將200稀釋劑溶液加入除A和H行l(wèi)-3列以外的所有剩余孔中。下一步，應(yīng)如下標(biāo)記六個試管低效價、中效價、高效價、滅活/過濾(1:240)、滅活/過濾(l:480)和內(nèi)標(biāo)。在標(biāo)示的試管中，合適地稀釋以下測試樣品。應(yīng)在臨用前渦旋振蕩解凍的測試樣品。在四塊平板中，制作以下稀釋液A)不預(yù)先稀釋的低效價液3.0mL低效價；B)l:30稀釋的陰性對照(Sf+細(xì)胞)3.77mL稀釋劑+130陰性對照；C)l:30稀釋的中效價液(8pg/mL):3.77mL稀釋劑+130中效價；D)l:90稀釋的高效價液(16嗎/mL):2.967mL稀釋劑+33|iL高效價；E)l:240稀釋的滅活/過濾液2.39mL稀釋劑+10pL滅活/過濾樣品；F)l:480稀釋的滅活/過濾液1.0mL稀釋劑+1.0mL上述E的完整/過濾(l:240)制備樣品；G)l:30稀釋的內(nèi)標(biāo)3.77mL稀釋劑+130)iL內(nèi)標(biāo)。下一步，在1-4號板的稀釋平板中將300制備樣品加入相應(yīng)的空孔中。然后，將多通道移液器設(shè)定為100pL，通過上下吹打至少5次混合A行的內(nèi)容物，然后用反向吸移技術(shù)將100pL轉(zhuǎn)移到B行。應(yīng)該更換尖頭，重復(fù)此相同步驟至G行?，F(xiàn)在用ultrawashplus微量滴定板洗滌器(設(shè)定為250iaL/洗滌、洗滌3次、無浸泡時間)以洗滌緩沖液洗滌測試平板3次后，即可將這些稀釋平板中的樣品轉(zhuǎn)移到測試平板中。最后一次洗滌后，在紙巾上拍打平板。下一步，用簡單的轉(zhuǎn)移步驟將稀釋平板的內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到測試平板中。更具體說，從H行開始，用反向吸移技術(shù)將100pL/孔從稀釋平板轉(zhuǎn)移到測試平板的相應(yīng)孔中。每次轉(zhuǎn)移后，應(yīng)更換移液器尖頭。從G行開始，用反向吸移技術(shù)將稀釋平板中的100pL/孔轉(zhuǎn)移到測試平板的相應(yīng)孔中。同組的移液器尖頭可用于其余轉(zhuǎn)移。為了保證轉(zhuǎn)移均一的溶液，應(yīng)上下吹打該溶液至少3次再轉(zhuǎn)移。下一步，密封測試平板并在37。C士2.0。C培育1.0小時±5分鐘。也優(yōu)選不疊加平板。然后用ultrawashplus微量滴定板洗滌器(設(shè)定為250pL/洗滌、洗滌3次、無浸泡時間)以洗滌緩沖液洗滌平板3次。最后一次洗滌后，在紙巾上拍打平板。用反向吸移技術(shù)將1:300稀釋或合適的工作稀釋度稀釋的100pL檢測抗體加入測試平板的所有孔中。例如，對于四塊平板，需要42mL稀釋劑溶液和140)iL捕獲抗體。然后密封測試平板，并在37"C士2.(TC培育1.0小時±5分鐘。再用ultrawashplus微量滴定板洗滌器(設(shè)定為250pL/洗滌、洗滌3次、無浸泡時間)以洗滌緩沖液洗滌平板3次。最后一次洗滌后，在紙巾上拍打平板。下一步，通過將1%正常兔血清加入稀釋劑中制備偶聯(lián)稀釋劑。例如，對于四塊平板，將420正常兔血清加入42mL稀釋劑中。用新鮮制備的偶聯(lián)抗體稀釋溶液在測試平板的所有孔中將偶聯(lián)抗體稀釋至1:10,000或者其它合適的工作稀釋度。用反向吸移技術(shù)，將100pL這種稀釋的偶聯(lián)抗體加入所有孔中。然后密封測試平板，37"士2.(TC培育45±5分鐘。優(yōu)選不疊加平板。用ultrawashplus微量滴定板洗滌器(設(shè)定為250pL/洗滌、洗滌3次、無浸泡時間)以洗滌緩沖液洗滌平板3次。最后一次洗滌后，在紙巾上拍打平板。下一步，臨用前混合等體積的TMB過氧化物酶底物(試劑A)與過氧化物酶溶液B(試劑B)?；旌狭咳Q于平板數(shù)量，但每一平板需要10mL+2mL。因此，4塊平板需要21mL試劑A+21mL試劑B。用反向吸移技術(shù)將100底物加入測試平板的所有孔中。然后室溫培育該平板15分鐘±15秒。用反向吸移技術(shù)將1001NHC1溶液加入所有孔中終止反應(yīng)。然后打開ELISA平板閱讀器，以常規(guī)方式進(jìn)行診斷和測試。本發(fā)明另一方面涉及構(gòu)建含有PCV2ORF2DNA的重組病毒載體和用其感染易感細(xì)胞大量表達(dá)PCV20RF2蛋白的方法。令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，本文提供的重組病毒載體在感染易感細(xì)胞后可表達(dá)大量上述PCV20RF2。因此，本發(fā)明也涉及產(chǎn)生和/或回收PCV2ORF2蛋白的改進(jìn)方法，所述方法優(yōu)選包括以下步驟構(gòu)建含有PCV2ORF2DNA的重組病毒載體和表達(dá)PCV2ORF2蛋白。所述病毒載體優(yōu)選重組桿狀病毒。本文所述構(gòu)建含有PCV2ORF2DNA的重組病毒載體和表達(dá)PCV2ORF2蛋白的詳細(xì)方法如下在優(yōu)選形式中，用其中克隆有ORF2基因的轉(zhuǎn)運(yùn)載體轉(zhuǎn)染病毒載體，產(chǎn)生用于感染細(xì)胞的含有PCV2ORF2DNA的重組病毒載體和表達(dá)PCV2ORF2蛋白。優(yōu)選地，僅將轉(zhuǎn)運(yùn)載體中含有的ORF2DNA部分轉(zhuǎn)染到病毒載體中。術(shù)語"轉(zhuǎn)染入病毒載體"指(用作)將異源DNA"引入"或"克隆"入病毒載體，如桿狀病毒載體的同義詞。所述病毒載體優(yōu)選(但不必是)桿狀病毒。因此，按照本發(fā)明另一方面，通過含有異源PCV2ORF2DNA的轉(zhuǎn)運(yùn)載體和病毒載體(優(yōu)選桿狀病毒，更優(yōu)選線性化的復(fù)制缺陷型桿狀病毒(如BacuIoGoldDNA))之間重組而產(chǎn)生所述重組病毒載體。"轉(zhuǎn)運(yùn)載體"指一種DNA分子，其包含至少一個復(fù)制起點(diǎn)、異源基因(在本文中是PCV2ORF2)和允許將所述異源基因克隆入病毒載體的DNA序列。允許將所述異源基因克隆入病毒載體的DNA序列優(yōu)選側(cè)接于該異源基因。更優(yōu)選的是，這些側(cè)接序列至少與該病毒載體序列部分同源。這種序列同源性可允許病毒載體和轉(zhuǎn)運(yùn)載體的分子之間發(fā)生重組，而產(chǎn)生含有該異源基因的重組病毒載體。一種優(yōu)選的轉(zhuǎn)運(yùn)載體是pVL1392載體(BDBiosciencesPharmingen)，設(shè)計用于與BaculoGoldDNA共同轉(zhuǎn)染入優(yōu)選的Sf+細(xì)胞系中。所述轉(zhuǎn)運(yùn)載體優(yōu)選包含PCV20RF2DNA。共同轉(zhuǎn)染的構(gòu)建物的長度約為10,387個堿基對。在更優(yōu)選的形式中，本發(fā)明方法將從分離PCV2ORP2DNA開始。通常，該DNA可來自已知或未知菌株，因為ORF2DNA似乎在不同分離物中高度保守，序列相同性至少約為95%。本領(lǐng)域已知可表達(dá)到上清中的任何PCV2ORF2基因可用于本發(fā)明目的。優(yōu)選用PCR法擴(kuò)增PCVORF2DNA，更優(yōu)選與引入的5'側(cè)接Kozak共有序列(CCGCCAUG)(SEQIDNO1)和/或3'側(cè)接￡co/l位點(diǎn)(GAATTC)(SEQIDNO2)同時擴(kuò)增。引入5'Kozak共有序列優(yōu)選去除了PCV2ORF2中的天然產(chǎn)生的起始密碼子AUG。優(yōu)選將3'&oil位點(diǎn)引入PCV20RF2終止密碼子下游。更優(yōu)選地，將其引入聚A轉(zhuǎn)錄終止序列下游，聚A轉(zhuǎn)錄終止序列本身位于PCV2ORF2終止密碼子下游。已發(fā)現(xiàn)，采用Kozak共有序列，具體是上述序列，能提高隨后PCV20RF2的蛋白表達(dá)水平。將含有這些額外序列的擴(kuò)增的PCV2ORF2DNA克隆入載體中。用于此初步克隆步驟的優(yōu)選載體是pGEM-T-Easy載體(Promega，威斯康星州麥迪遜)。優(yōu)選在限制性位點(diǎn)處從載體上切下含有一些pGEM載體序列(SEQIDNO:7)的PCV2ORF2DNA。然后將得到的DNA克隆入轉(zhuǎn)運(yùn)載體。因此，本發(fā)明一個方面提供了構(gòu)建含有PCV2ORF2DNA的重組病毒載體的方法。此方法包括以下步驟i)將重組PCV20RF2克隆入轉(zhuǎn)運(yùn)載體；和ii)將含有重組PCV20RF2的轉(zhuǎn)運(yùn)載體部分轉(zhuǎn)染到病毒載體中，產(chǎn)生重組病毒載體。優(yōu)選地，該轉(zhuǎn)運(yùn)載體是如上所述的載體，或通過上述方法構(gòu)建，或如圖1所示。因此，按照另一方面，用于構(gòu)建本文所述重組病毒載體的轉(zhuǎn)運(yùn)載體含有SEQIDNO:7序列。另一方面，此方法在步驟i)之前還包括以下步驟體外擴(kuò)增PCV20RF2DNA，其中如上所述修飾PCV2ORF2DNA的側(cè)接序列。擴(kuò)增PCV2ORP2DNA和修飾側(cè)接序列、將擴(kuò)增的PCV2ORF2DNA體外克隆入轉(zhuǎn)運(yùn)載體的體外方法和合適轉(zhuǎn)運(yùn)載體如上所述，如圖1所示，或為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知。因此，另一方面，本發(fā)明涉及構(gòu)建含有PCV2ORf2DNA的重組病毒載體和表達(dá)PCV2ORF2蛋白的方法，所述方法包括以下步驟i)體外擴(kuò)增PCV2ORF2DNA，其中包括修飾所述PCV2ORF2DNA的側(cè)接序列，ii)將擴(kuò)增PCV20RF2DNA克隆入轉(zhuǎn)運(yùn)載體中；和iii)將轉(zhuǎn)運(yùn)載體中含有的重組PCV2ORF2DNA部分轉(zhuǎn)染入病毒載體中，產(chǎn)生重組病毒載體。優(yōu)選如上所述進(jìn)行PCV2ORF2DNA側(cè)接序列的修飾，例如引入5，Kozak序列和/或五co/1位點(diǎn)，優(yōu)選如上所述。另一方面，本發(fā)明提供產(chǎn)生和/或回收PCV2開放閱讀框2表達(dá)的重組蛋白的方法。該方法通常包括以下步驟i)將重組PCV2ORF2克隆入轉(zhuǎn)運(yùn)載體中；ii)將轉(zhuǎn)運(yùn)載體中含有重組PCV20RF2的部分轉(zhuǎn)染到病毒中；iii)用轉(zhuǎn)染病毒感染培養(yǎng)的細(xì)胞；W)使轉(zhuǎn)染病毒由PCV2ORF2表達(dá)重組蛋白；v)分離上清液與細(xì)胞；和vi)從上清液中回收表達(dá)的PCV2ORF2蛋白。上面描述了如何將重組PCV2ORF2DNA克隆入轉(zhuǎn)運(yùn)載體的方法。該轉(zhuǎn)運(yùn)載體優(yōu)選含有序列SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:7。然而，該轉(zhuǎn)運(yùn)載體可含有任何未修飾或修飾的PCV2ORF2DNA，只要轉(zhuǎn)染到重組病毒載體中的該P(yáng)CV2ORF2DNA能在培養(yǎng)細(xì)胞中表達(dá)。所述重組病毒載體優(yōu)選包含序列SEQIDNO:8。而且，上面詳細(xì)描述了如何用確定量的含有PCV2ORF2DNA的重組桿狀病毒感染細(xì)胞，優(yōu)選如何感染昆蟲細(xì)胞和表達(dá)PCV20RF2蛋白的方法。而且，上面也詳細(xì)描述了分離上清液與細(xì)胞的步驟以及回收表達(dá)的PCV2ORF2蛋白的步驟。本文所述的這些特定加工步驟都是上述產(chǎn)生和/或回收PCV2開放閱讀框2表達(dá)重組蛋白方法的一部分。所述細(xì)胞優(yōu)選Sf+細(xì)胞。更優(yōu)選地，細(xì)胞培養(yǎng)物的細(xì)胞數(shù)約為0.3-2.0xl()6個細(xì)胞/mL，更優(yōu)選約為0.35-1.9xl()6個細(xì)胞/mL，更優(yōu)選約為0.4-1.8><106個細(xì)胞/mL，更優(yōu)選約為0.45-1.7xl(^個細(xì)胞/mL，最優(yōu)選約為0.5-1.5xl(^個細(xì)胞/mL。優(yōu)選用含有PCV2ORF2DNA的重組病毒載體感染易感細(xì)胞，感染復(fù)數(shù)(MOI)優(yōu)選約為0.03-1.5，更優(yōu)選約為0.05-1.3,更優(yōu)選約為0.09-1.1，更優(yōu)選約為0.1-1.0，最優(yōu)選約為0.5。優(yōu)選回收感染后5-8天和/或細(xì)胞活力降低到10%以下時收獲的細(xì)胞上清液中的PCV20RF2蛋白。優(yōu)選地，產(chǎn)生PCV20RF2蛋白時，在25-29°。培養(yǎng)細(xì)胞。分離步驟優(yōu)選為離心或過濾步驟。任選地，此方法可包括以下步驟擴(kuò)增PCV2菌株的PCV2ORF2DNA，然后將該P(yáng)CV2ORF2DNA克隆入轉(zhuǎn)運(yùn)載體。在優(yōu)選形式中，也可在擴(kuò)增之前或期間，優(yōu)選將5'Kozak序列、3'fco/l位點(diǎn)和其組合加入擴(kuò)增序列中。優(yōu)選的5'Kozak序列包含SEQIDNO:1。優(yōu)選的3'五co/l位點(diǎn)包含SEQIDNO:2。優(yōu)選的PCV2ORF2DNA包含核苷酸序列Genbank登錄號AF086834(SEQIDNO:3)和SEQIDNO:4。優(yōu)選的重組PCV20RF2蛋白包含SEQIDNO:5和SEQIDNO:6的氨基酸序列，SEQIDNO:5是SEQIDNO:3(Genbank登錄號AF086834)編碼的蛋白質(zhì)，SEQIDNO:6是SEQIDNO:4編碼的蛋白質(zhì)。優(yōu)選培養(yǎng)基包括無血清昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基，更優(yōu)選Excell420培養(yǎng)基。當(dāng)進(jìn)行任選的擴(kuò)增步驟時，優(yōu)選先將擴(kuò)增的開放閱讀框2克隆入第一載體中，從第一載體上切下開放閱讀框2，將切下的開放閱讀框克隆入轉(zhuǎn)運(yùn)載體中。用于共同轉(zhuǎn)染的優(yōu)選細(xì)胞系是SF+細(xì)胞系。用于共同轉(zhuǎn)染的優(yōu)選病毒是桿狀病毒。在此方法的優(yōu)選形式中，轉(zhuǎn)運(yùn)載體的轉(zhuǎn)染部分包含SEQIDNO:8。最后，在此方法中，優(yōu)選在用該病毒感染細(xì)胞至少5天后回收細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的PCV2開放閱讀框2(ORF2)編碼的蛋白。因此，本發(fā)明另一方面涉及產(chǎn)生和/或回收PCV2開放閱讀框2的方法，所述方法包括以下步驟i)體外擴(kuò)增PCV20RF2DNA，優(yōu)選加入5'Kozak序列和/或加入3'限制性位點(diǎn)，ii)將擴(kuò)增的PCV20RF2克隆入轉(zhuǎn)運(yùn)載體中；iii)將轉(zhuǎn)運(yùn)載體中含有的重組PCV20RF2部分轉(zhuǎn)染入病毒中；iv)用轉(zhuǎn)染病毒感染培養(yǎng)的細(xì)胞；v)使轉(zhuǎn)染病毒由PCV20RF2表達(dá)重組蛋白；vi)分離上清液與細(xì)胞；和vii)從上清液中回收表達(dá)的PCV2ORF2蛋白。本發(fā)明另一方面涉及制備含有PCV2ORF2蛋白和滅活病毒載體的組合物的方法。該方法包括以下步驟i)將擴(kuò)增的PCV2ORF2克隆入轉(zhuǎn)運(yùn)載體中；ii)將轉(zhuǎn)運(yùn)載體中含有的重組PCV2ORF2部分轉(zhuǎn)染入病毒中；iii)用轉(zhuǎn)染病毒載體感染培養(yǎng)的細(xì)胞；iv)使轉(zhuǎn)染病毒載體由PCV20RF2表達(dá)重組蛋白；v)分離上清液與細(xì)胞；vi)從上清液中回收表達(dá)的PCV2ORF2蛋白；和vii)滅活該重組病毒載體。所述重組病毒載體優(yōu)選含有ORF2DNA編碼序列的桿狀病毒，所述細(xì)胞優(yōu)選Sf+細(xì)胞。優(yōu)選的分離步驟如上所述，最優(yōu)選過濾步驟。優(yōu)選的滅活步驟如上所述。優(yōu)選在約35-39C和2-8mMBEI存在下，更優(yōu)選在約5mMBEI存在下進(jìn)行滅活。令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，較高濃度的BEI會對PCV2ORF2蛋白產(chǎn)生負(fù)面影響，而較低濃度在24-72小時滅活期間不能有效滅活病毒載體。滅活優(yōu)選進(jìn)行至少24小時，更優(yōu)選進(jìn)行24-72小時。另一方面，是上述制備含有PCV20RF2蛋白的組合物和滅活病毒載體的方法在步驟vii)之后還包括中和步驟。此步驟viii)包括加入等價含量的能中和溶液中滅活劑的物質(zhì)。優(yōu)選地，如果滅活劑是BEI，優(yōu)選加入等價含量硫代硫酸鈉。因此，另一方面，步驟viii)包括滅活劑是BEI時加入硫代硫酸鈉溶液，使其終濃度約為l-20mM，優(yōu)選約為2-10mM，更優(yōu)選約為2-8mM，更優(yōu)選約為3-7mM，最優(yōu)選約為5mM。另一方面，是上述制備含有PCV2ORF2蛋白的組合物和滅活病毒載體的方法在步驟i)之前包括以下步驟體外擴(kuò)增PCV2ORF2DNA，其中如上所述修飾PCV2ORF2DNA的側(cè)接序列。體外擴(kuò)增PCV20RF2DNA和修飾側(cè)接序列，將體外擴(kuò)增的PCV2ORF2DNA克隆入轉(zhuǎn)運(yùn)載體的方法和合適的轉(zhuǎn)運(yùn)載體如上所述，如圖l所示，或為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知。因此，另一方面，此方法包括以下步驟i)體外擴(kuò)增PCV2ORF2DNA，其中包括修飾所述PCV2ORF2DNA的側(cè)接序列，ii)將擴(kuò)增的PCV2ORF2DNA克隆入轉(zhuǎn)運(yùn)載體中；和iii)將含有重組PCV2ORF2DNA的轉(zhuǎn)運(yùn)載體或其一部分轉(zhuǎn)染入病毒載體中，產(chǎn)生重組病毒載體，iv)用轉(zhuǎn)染病毒感染培養(yǎng)的細(xì)胞；v)使轉(zhuǎn)染病毒由PCV2ORF2表達(dá)重組蛋白；vi)分離上清液與細(xì)胞；vii)從上清液中回收表達(dá)的PCV20RF2蛋白；viii)優(yōu)選在約l-20mMBEI的存在下，最優(yōu)選在約5mMBEI的存在下，滅活所述重組病毒載體；和ix)加入等價含量的能中和溶液中滅活劑的物質(zhì)，滅活劑是BEI時優(yōu)選加入硫代硫酸鈉溶液，使其終濃度約為1-20mM，優(yōu)選約為5mM。在本發(fā)明另一方面，提供了制備一種用于引發(fā)抗PCV2免疫應(yīng)答的組合物、優(yōu)選抗原性組合物如疫苗的方法。通常，此方法包括將構(gòu)建物轉(zhuǎn)染入病毒中的步驟，其中所述構(gòu)建物包含i)PCV2的ORF2的重組DNA，ii)用轉(zhuǎn)染病毒感染培養(yǎng)生長的細(xì)胞，iii)使該病毒由PCV2ORF2表達(dá)重組蛋白，iv)從上清液中回收表達(dá)的ORF2蛋白，和v)通過混合回收的蛋白質(zhì)與合適的佐劑和/或其它藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體制備該組合物。本文所用"佐劑"可包括氫氧化鋁和磷酸鋁，皂苷如QuilA、QS-21(CambridgeBiotechInc.，CambridgeMA)、GPI-0100(GalenicaPharmaceuticals,Inc.,Birmingham,AL)，油包水乳液，水包油乳液，水包油包水乳液。具體說，乳液可基于輕質(zhì)(lightliquid)石蠟油(歐洲藥典類型)；類異戊二烯油如角鯊?fù)榛蚪酋徬?；鏈烯，具體是異丁烯或癸烯硫代寡聚化(theoligomerization)產(chǎn)生的油；含有直鏈烷基的酸或醇的酯，更具體是植物油、油酸乙酯、二(辛酸/癸酸)丙二醇酯、三(辛酸/癸酸)甘油酯或二油酸丙二醇酯；支鏈脂肪酸或醇的酯，具體是異硬脂酸酯。將油與乳化劑聯(lián)用以形成乳液。乳化劑優(yōu)選非離子性表面活性劑，具體是山梨聚糖、二縮甘露醇(如油酸脫水甘露醇酯)、甘油、聚甘油、丙二醇和油酸、異硬脂酸、蓖麻油酸或羥基硬脂酸的酯(任選乙氧基化)，以及聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物，具體是普朗尼克產(chǎn)品，尤其是L121。參見Hunter等，《佐劑的理論和實(shí)際應(yīng)用》(TheTheoryandPracticalApplicationofadjuvants)(Stewart-Tull，D.E.S.編)，JohnWiley&Sons,NY，第51-94頁(1995)和Todd等，Vaccine15:564-570(1997)。例如，可采用M.Powell和M.Newman,PlenumPress,1995所編的《疫苗設(shè)計，亞基和佐劑方法》(VaccineDesign,TheSubunitandAdjuvantApproach)的第147頁所述SPT乳液和該書第183頁所述的MF59乳液。佐劑的另一個例子是選自丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物的或者順丁烯二酸酐與烯基衍生物共聚物的化合物。佐劑化合物宜為交聯(lián)的、尤其是與糖或多元醇的聚烯基醚交聯(lián)的丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物。這些化合物稱為卡波姆(carbomer)(Phameuropa第8巻，第2期，1996年6月)。本領(lǐng)域技術(shù)人員也可參見美國專利2,909,462描述的與含有至少3個羥基，優(yōu)選不多于8個羥基的多羥基化合物交聯(lián)的這種丙烯酸聚合物，其至少三個羥基的氫原子被含有至少2個碳原子的不飽和脂族基團(tuán)取代。優(yōu)選基團(tuán)是含有2-4個碳原子的基團(tuán)，如乙烯基、烯丙基和其它烯鍵式不飽和基團(tuán)。不飽和基團(tuán)本身可含有其它取代基，如甲基。以名稱卡巴浦爾(carbopol)出售的產(chǎn)品(BFGoodrich,Ohio,USA)尤其合適。它們與烯丙基蔗糖或與烯丙基戊赤蘚醇交聯(lián)。其中，可提及的有卡巴浦爾974P、934P和971P。最優(yōu)選采用卡巴浦爾971P。在馬來酸酐和烯基衍生物的共聚物中，共聚物EMA(Monsanto)是馬來酸酐和乙烯的共聚物。這些聚合物在水中的溶解產(chǎn)生的酸溶液應(yīng)予中和，優(yōu)選中和至生理pH，以產(chǎn)生其中可摻入免疫原性、免疫或疫苗組合物本身的佐劑溶液。其它合適佐劑包括但不限于RIBI佐劑系統(tǒng)(RibiInc.)、嵌段共聚物(CytRx，AtlantaGA)、SAF-M(Chiron，EmeryvilleCA)、單磷?；|(zhì)A、阿夫立定(Avridine)脂質(zhì)-胺佐劑、大腸桿菌(K②//)的熱不穩(wěn)定性腸毒素(重組或其它)、霍亂毒素、IMS1314或胞壁酰二肽等等。優(yōu)選每劑量加入約100mg量的佐劑。更優(yōu)選每劑量加入約100)ag-lOmg量的佐劑。更優(yōu)選每劑量加入約500mg量的佐劑。更優(yōu)選每劑量加入約750pg-2.5mg量的佐劑。最優(yōu)選每劑量加入約lmg量的佐劑。因此，另一方面，制備用于引發(fā)抗PCV2免疫應(yīng)答的抗原性組合物如疫苗的方法包括i)制備和回收PCV20RF2蛋白，和ii)將其與合適佐劑混合。優(yōu)選地，該佐劑為卡巴浦爾971P。更優(yōu)選每劑量加入約500iig-5mg量的卡巴浦爾971P，更優(yōu)選每劑量加入約750|Lig-2.5mg量的卡巴浦爾971P，最優(yōu)選每劑量加入約1mg量的卡巴浦爾971P。優(yōu)選地，該方法的步驟i)包括制備和回收PCV2ORF2所述的加工步驟。例如，在此方法的優(yōu)選形式中，獲得轉(zhuǎn)運(yùn)載體中包含PCV2ORF2DNA的構(gòu)建物。合適的轉(zhuǎn)運(yùn)載體和制備它們的方法如上所述。任選地，該方法可包括以下步驟通過PCR擴(kuò)增PCV2毒株的ORF2，然后將ORF2克隆入轉(zhuǎn)運(yùn)載體中。優(yōu)選的開放閱讀框序列、Kozak序列、3'五o)/l位點(diǎn)序列、重組蛋白序列、轉(zhuǎn)染的構(gòu)建序列、培養(yǎng)基、細(xì)胞和病毒參見前述方法。用于此方法的另一任選步驟包括將擴(kuò)增的PCV2ORF2DNA克隆入第一載體中，從此第一載體上切下ORF2DNA，將此切下的PCV2ORF2DNA克隆入轉(zhuǎn)運(yùn)載體中。如同其它方法那樣，優(yōu)選在用轉(zhuǎn)染的桿狀病毒感染細(xì)胞后等待至少5天，再從上清液中回收重組ORF2蛋白。優(yōu)選地，此方法的回收步驟也包括分離培養(yǎng)基與細(xì)胞和細(xì)胞碎片的步驟?？赏ㄟ^各種容易和方便的方法完成此步驟，優(yōu)選通過孔徑范圍約為0.45pM-1.0iiM的濾器過濾細(xì)胞、細(xì)胞碎片和生長培養(yǎng)基。最后，此方法優(yōu)選在將回收的重組PCV20RF2蛋白混合到組合物中之前包括一病毒滅活步驟?？赏ㄟ^各種方法完成此步驟，但優(yōu)選采用BEI實(shí)施本發(fā)明。因此，另一方面，此方法包括以下步驟i)體外擴(kuò)增PCV20RF2DNA，其中包括修飾所述PCV2ORF2DNA的側(cè)接序列，ii)將擴(kuò)增的PCV2ORF2DNA克隆入轉(zhuǎn)運(yùn)載體中；和iii)將含有重組PCV2ORF2DNA的轉(zhuǎn)運(yùn)載體或其一部分轉(zhuǎn)染入病毒載體中，產(chǎn)生重組病毒載體，iv)用轉(zhuǎn)染病毒感染培養(yǎng)的細(xì)胞；v)使轉(zhuǎn)染病毒由PCV2ORF2表達(dá)重組蛋白；vi)分離上清液與細(xì)胞；vii)從上清液中回收表達(dá)的PCV20RF2蛋白；viii)優(yōu)選在約l-20mMBEI的存在下，最優(yōu)選在約5mMBEI的存在下，滅活所述重組病毒載體；ix)加入等價含量的能中和溶液中滅活劑的物質(zhì)，滅活劑是BEI時優(yōu)選加入硫代硫酸鈉溶液，使其終濃度約為1-20mM，優(yōu)選約為5mM，和x)加入適當(dāng)量的佐劑，優(yōu)選加入卡巴浦爾，更優(yōu)選卡巴浦爾971P,更優(yōu)選加入上述量(如每劑量約500化-5mg，更優(yōu)選每劑量約750pg-2.5mg，最優(yōu)選每劑量約1mg)的佐劑。此外，該組合物可包含一種或多種藥學(xué)上可接受的載體。本文所用術(shù)語"藥學(xué)上可接受的載體"包括任何和所有溶劑、分散介質(zhì)、包衣、穩(wěn)定劑、稀釋劑、防腐劑、抗菌劑和抗真菌劑、等滲劑、吸收延遲劑等。最優(yōu)選地，本文所述組合物含有從體外培養(yǎng)細(xì)胞上清液中回收的PCV2ORF2蛋白，其中所述細(xì)胞已用含有PCV2ORF2DNA的重組病毒載體感染并表達(dá)PCV20RF2蛋白，并用約2-8mMBEI，優(yōu)選約5mMBEI處理所述細(xì)胞培養(yǎng)物，以滅活該病毒載體，還加入相同濃度的中和劑、卡巴浦爾和生理鹽水；所述中和劑優(yōu)選硫代硫酸鈉溶液，終濃度約為2-8mM，優(yōu)選約5mM，卡巴浦爾更優(yōu)選卡巴浦爾971P，其優(yōu)選用量為每劑量約500pg-5mg，更優(yōu)選每劑量約750mg，最優(yōu)選每劑量約1mg;所述生理鹽水用量優(yōu)選約50-90%(v/v)，更優(yōu)選約60-80%(v/v)，更優(yōu)選約70%(v/v)。因此，另一方面涉及制備引發(fā)抗PCV2免疫應(yīng)答的抗原性組合物如疫苗的方法，所述方法包括以下步驟i)體外擴(kuò)增PCV2ORF2DNA，其中包括修飾所述PCV2ORF2DNA的側(cè)接序列，ii)將擴(kuò)增的PCV2ORF2DNA克隆入轉(zhuǎn)運(yùn)載體中；和iii)將含有重組PCV2ORF2DNA的轉(zhuǎn)運(yùn)載體或其一部分轉(zhuǎn)染入病毒載體中，產(chǎn)生重組病毒載體，iv)用轉(zhuǎn)染病毒感染培養(yǎng)的細(xì)胞；v)使轉(zhuǎn)染病毒由PCV2ORF2表達(dá)重組蛋白；vi)分離上清液與細(xì)胞；vii)從上清液中回收表達(dá)的PCV2ORF2蛋白；viii)優(yōu)選在約l-20mMBEI的存在下，最優(yōu)選在約5mMBEI的存在下，滅活所述重組病毒載體；ix)加入等價含量的能中和溶液中滅活劑的物質(zhì)，滅活劑是BEI時優(yōu)選加入硫代硫酸鈉溶液，使其終濃度約為0.5-20mM，優(yōu)選約為5mM，x)加入適當(dāng)量的佐劑，優(yōu)選加入卡巴浦爾，更優(yōu)選卡巴浦爾971P，更優(yōu)選加入上述量(如每劑量約500pg-5mg，更優(yōu)選每劑量約750pg-2.5mg，最優(yōu)選每劑量約1mg)的卡巴浦爾971P;和xi)加入生理鹽水，優(yōu)選以約50-90%(v/v),更優(yōu)選約60-80%(v/v)，更優(yōu)選約70。/。(v/v)的量加入。任選地，此方法也可包括加入保護(hù)劑。本文所用保護(hù)劑指抗微生物活性劑，如慶大霉素、硫柳汞等。具體說，在制備多劑量組合物中最優(yōu)選加入保護(hù)劑。加入抗微生物活性劑的濃度應(yīng)有效防止感興趣組合物中產(chǎn)生任何微生物污染或抑制感興趣組合物中的任何微生物生長。而且，此方法也可包括加入任何穩(wěn)定劑，如糖、海藻糖、甘露醇、蔗糖等，以增加和/或維持產(chǎn)品的保存期。然而，令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)生的制劑在不添加任何其它穩(wěn)定劑的情況下至少在24個月中免疫有效。本發(fā)明另一方面涉及用上述方法產(chǎn)生的產(chǎn)品。具體說，本發(fā)明涉及含有重組表達(dá)的PCV20RF2蛋白的組合物。而且，本發(fā)明也涉及含有從昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中回收的重組表達(dá)PCV20RF2蛋白的組合物。而且，本發(fā)明也涉及含有從昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中回收的重組表達(dá)PCV2ORF2蛋白的組合物。這種組合物也優(yōu)選含有適合滅活該病毒載體的物質(zhì)。所述滅活劑優(yōu)選BEI。而且，本發(fā)明也涉及含有從昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中回收的重組表達(dá)PCV2ORF2蛋白、適合滅活該病毒載體的物質(zhì)(優(yōu)選BEI)，以及用于中和滅活劑的中和劑的組合物。當(dāng)BEI用作滅活劑時，所述中和劑優(yōu)選硫代硫酸鈉。在本發(fā)明的另一方面，提供了誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，更優(yōu)選產(chǎn)生抵抗PCV2感染臨床癥狀的保護(hù)性免疫力的免疫原性組合物。該組合物通常包含PCV2的開放閱讀框2(ORF2)表達(dá)的多肽或其片段，作為該組合物的抗原性組分。本文中用于制備所述組合物、也可用于本文所述方法的PCV2ORF2DNA和蛋白質(zhì)是PCV2分離物內(nèi)的高度保守結(jié)構(gòu)域，因此，任何PCV2ORF2與本文所用的PCVORF2DNA和/或多肽的來源同樣有效。優(yōu)選的PCV20RF2蛋白是SEQIDNO:11的蛋白。本文提供的優(yōu)選PCVORF2多肽是SEQIDNO:5，但本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，此序列的序列同源性可改變多至6-10%而仍能保留使其可用于免疫原性組合物的抗原性特征。免疫組合物的這種抗原性特征可以通過(例如)實(shí)施例4提供的攻擊實(shí)驗來估計。而且，與多核苷酸序列SEQIDNO:3或SEQIDNO:4編碼的PCV2ORF2蛋白相比，當(dāng)某修飾的抗原產(chǎn)生至少70%，優(yōu)選80%，更優(yōu)選90。/。保護(hù)性免疫力時，即仍然保留了該修飾抗原的抗原性特征。本文所用"免疫原性組合物"指在宿主中引發(fā)對PCV2ORF2蛋白的細(xì)胞和/或抗體-介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的PCV2ORP2蛋白。優(yōu)選此免疫原性組合物能夠產(chǎn)生抵抗PCV2感染和與其相關(guān)的臨床癥狀的保護(hù)性免疫力。在一些形式中，PCV20RF2蛋白的免疫原性部分可用作該組合物的抗原性組分。本文所用術(shù)語"免疫原性部分"分別指PCV2ORF2蛋白和/或多核苷酸的截短和/或取代形式，或其片段。優(yōu)選地，這種截短和/或取代形式或片段將包含全長ORF2多肽的至少6個連續(xù)氨基酸。更優(yōu)選地，截短和/或取代形式，或片段將含有全長ORF2多肽的至少10個，優(yōu)選至少15個，更優(yōu)選至少19個連續(xù)氨基酸。在這方面，本文提供了兩種優(yōu)選序列，即SEQIDNO:9和10。還應(yīng)理解，這些序列可以是較大片段或截短形式的一部分。本文提供的另一優(yōu)選PCV2ORF2多肽由核苷酸序列SEQIDNO:3或SEQIDNO:4編碼。但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，此序列的序列同源性可改變多至6-20y。而仍能保留使其可用于免疫原性組合物的抗原性特征。在一些形式中，ORF2的截短或取代形式或其片段用作該組合物中的抗原性組分。這種截短或取代形式或其片段優(yōu)選包含全長ORF2核苷酸序列，如SEQIDNO:3或SEQIDNO:4的至少18個連續(xù)核苷酸。更優(yōu)選地，該截短或取代形式或其片段將含有全長ORF2核苷酸序列，如SEQIDNO:3或SEQIDNO:4的至少30個，更優(yōu)選至少45個，更優(yōu)選至少57個連續(xù)核苷酸。本領(lǐng)域所稱"序列相同性"指兩條或多條多肽序列或兩條或多條多核苷酸序列，即參比序列與給定序列之間與參比序列相比的關(guān)系。序列經(jīng)優(yōu)化比對產(chǎn)生最高程度的序列相似性后，通過比較給定序列與參比序列之間的匹配程度來確定序列相同性。比對后，根據(jù)位置-位置來確定序列相同性，例如，如果在某具體位置上核苷酸或氨基酸殘基相同，則稱此序列在此具體位置上"相同"。然后，將這種相同位置的數(shù)目除以參比序列中的核苷酸或殘基總數(shù)，得到序列相同性％。不難用己知方法計算序列相同性，所述方法包括但不限于以下文獻(xiàn)所述方法《計算分子生物學(xué)》(ComputationalMolecularBiology),Lesk，A.N.編，OxfordUniversityPress，紐約(1988)，《生物計算信息學(xué)和基因組計戈1」》(Biocomputing:InformaticsandGenomeProjects),Smith,D.W.編，AcademicPress,紐約(1993);《序列數(shù)據(jù)的計算機(jī)分析》(ComputerAnalysisofSequencedata),第I部分，Griffin,A.M.和Griffin,H.G.編，HumanaPress,新澤西(1994);《分子生物學(xué)中的序列分析》(S叫uenceAnalysisinMolecularBiology),vonHeinge，G.，AcademicPress(1987);《序歹ll分析引物》(SequenceAnalysisPrimer),Gribskov，M.禾口Devereux，J.編，M.StocktonPress,紐約(1991);Carillo，H.禾口Lipman，D.，SIAMJ.AppliedMath.，48:1073(1988)，將其內(nèi)容納入本文作參考。設(shè)計的用于測定序列相同性的優(yōu)選方法是給出測試序列之間的最大匹配。公眾可得的測定給定序列之間序列相同性的計算機(jī)程序中編纂了用于測定序列相同性的方法。這些程序的例子包括但不限于GCG程序包(Devereux，J.等，TVwc/e/cJc/<iyiewarc/z，12(1):387(1984))、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul，S.R等，Mo/ec,，215:403-410(1990)。公眾可從NCBI和其它來源獲得BLASTX程序(BLAST手冊，Altschul，S.等，NCVINLMNIHBethesda，MD20894，Altschul，S.R等，Mo/ec.編.，215:403-410(1990)，將其內(nèi)容納入本文作參考)。這些程序采用默認(rèn)的缺口權(quán)重最優(yōu)地比對序列，以產(chǎn)生給定序列與參比序列之間的最高水平序列相同性。例如，當(dāng)某多核苷酸的核苷酸序列與參比核苷酸序列之間的"序列相同性"至少為(例如)85%、優(yōu)選90%、更優(yōu)選95%時，稱給定多核苷酸的核苷酸序列與參比序列相同，除了每100個核苷酸中，與參比核苷酸序列相比給定多核苷酸序列可包含多達(dá)15個、優(yōu)選多達(dá)10個、更優(yōu)選多達(dá)5個點(diǎn)突變。換言之，多核苷酸的核苷酸序列相對于參比核苷酸序列的相同性至少為85%、優(yōu)選90%、更優(yōu)選95%時，參比序列中多達(dá)15%、優(yōu)選10%、更優(yōu)選5%的核苷酸可缺失或用另一核苷酸取代，或者可將占參比序列核苷酸總數(shù)量的15%、優(yōu)選10%、更優(yōu)選5%的核苷酸插入該參比序列中。參比序列的這些突變可發(fā)生在參比核苷酸序列的5'或3'末端位置，或者這些末端位置之間的任何位置，或單個散布于參比序列的核苷酸中或散布于參比序列的一個或多個毗連基團(tuán)中。類似地，當(dāng)某多肽的給定氨基酸序列與參比氨基酸序列的序列相同性至少為(例如)85%、優(yōu)選90%、更優(yōu)選95%時，稱該多肽的給定氨基酸序列與參比序列相同，除了每100個氨基酸中，與參比氨基酸序列相比給定多肽序列可包含多達(dá)15個、優(yōu)選多達(dá)10個、更優(yōu)選多達(dá)5個氨基酸改變。換言之，為了獲得與參比氨基酸序列的序列相同性至少為85%、優(yōu)選90%、更優(yōu)選95%的給定多肽序列，參比序列中多達(dá)15%、優(yōu)選多達(dá)10%、更優(yōu)選多達(dá)5%的氨基酸殘基可缺失或用另一核苷酸取代，或者可將占參比序列氨基酸殘基總數(shù)的15%、優(yōu)選10%、更優(yōu)選5%的氨基酸插入?yún)⒈刃蛄兄小⒈刃蛄械倪@些改變可發(fā)生在參比氨基酸序列的氨基或羧基末端位置，或者這些末端位置之間的任何位置，或單個散布于參比序列的殘基中或散布于參比序列的一個或多個毗連基團(tuán)中。優(yōu)選地，不相同的殘基位置的區(qū)別在于保守性氨基酸取代。然而，測定序列相同性時匹配不包括保守性取代。本文所用"序列同源性"指測定兩條序列相關(guān)性的方法。為了測定序列同源性，應(yīng)最優(yōu)比對兩條或多條序列，如果需要可引入缺口。然而，與"序列相同性"相反，測定序列同源性時將保守性氨基酸取代計為匹配。換言之，為了獲得與參比序列的序列同源性為95%的多肽或多核苷酸，參比序列中85%、優(yōu)選90%、更優(yōu)選95%的氨基酸殘基或核苷酸必須匹配或包含另一種氨基酸或核苷酸的保守性取代，或者可將占參比序列總氨基酸殘基或核苷酸(不包括保守性取代)總數(shù)的15%、優(yōu)選10%、更優(yōu)選5%的氨基酸或核苷酸插入?yún)⒈刃蛄兄小Ｍ葱蛄袃?yōu)選包含至少一段50個、更優(yōu)選100個、更優(yōu)選250個、更優(yōu)選500個核苷酸。"保守性取代"指用具有相似特征或特性，包括大小、疏水性等的另一氨基酸殘基或核苷酸取代某氨基酸殘基或核苷酸，以使其整體功能不顯著改變。本文所用術(shù)語"分離"指"人工"改變其天然狀態(tài)，即，如果其天然存在，從其原始環(huán)境改變或取得，或二者。例如，天然存在于活生物體中的多核苷酸或多肽不是"分離"的，但使其與天然狀態(tài)共存物質(zhì)分離得到的同一多核苷酸或多肽則是"分離"的。因此，本發(fā)明另一方面涉及有效減輕PCV2感染相關(guān)臨床癥狀嚴(yán)重性的包含PCV20RF2蛋白的免疫原性組合物。優(yōu)選地，該P(yáng)CV2ORF2蛋白是上述任何一種蛋白。所述PCV20RF2蛋白優(yōu)選為i)包含序列SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10或SEQIDNO:11的多肽；ii)與i)所述多肽至少80%同源的任何多肽；iii)i)和/或ii)所述多肽的任何免疫原性部分；iv)m)所述的免疫原性部分，包含序列SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:9、SEQIDNO:IO或SEQIDNO:11中的至少10個H比連氨基酸；v)包含序列SEQIDNO:3或SEQIDNO:4的DNA編碼的多肽；Vi)與V)所述多核苷酸至少80%同源的多核苷酸編碼的任何多肽；Vii)V)和/或Vi)所述多核苷酸編碼的多肽的任何免疫原性部分；viii)vii)所述的免疫原性部分，其中編碼所述免疫原性部分的多核苷酸包含序列SEQIDNO:3或SEQIDNO:4中的至少30個田比連核苷酸。優(yōu)選具有序列SEQIDNO:3或SEQIDNO:4編碼的PCV2ORF2蛋白免疫原性特征的任何免疫原性部分。另一方面，該免疫組合物提供了有效誘導(dǎo)所需免疫應(yīng)答，即降低PCV2感染所致臨床癥狀的發(fā)生率或減輕其嚴(yán)重性的PCV20RF2蛋白抗原水平。優(yōu)選地，包含的PCV2ORF2蛋白水平至少為0.2pg抗原/ml最終免疫原性組合物0ig/ml)，更優(yōu)選約0.2-400pg/ml，更優(yōu)選約0.3-200ng/ml，更優(yōu)選約0.35-100|iig/ml，更優(yōu)選約0.4-50Hg/ml，更優(yōu)選約0.45-30|ig/ml，更優(yōu)選約0.6-15ng/ml，更優(yōu)選約0.75-8pg/ml，更優(yōu)選約1.0-6pg/ml，更優(yōu)選約1.3-3.0pg/ml，更優(yōu)選約1.4-2.5pg/ml，更優(yōu)選約1.5-2.0pg/ml，最優(yōu)選約1.6jig/ml。另一方面，包含的ORP2抗原水平至少為每劑量最終抗原性組合物含0.2pg上述PCV2ORF2蛋白(iig/劑量)，更優(yōu)選約0.2-400pg/劑量，更優(yōu)選約0.3-200ng/劑量，更優(yōu)選約0.35-100pg/劑量，更優(yōu)選約0.4-50^g/劑量，更優(yōu)選約0.45-30pg/劑量，更優(yōu)選約0.6-15pg/劑量，更優(yōu)選約0.75-8pg/劑量，更優(yōu)選約1.0-6pg/劑量，更優(yōu)選約1.3-3.0ing/劑量，更優(yōu)選約1.4-2.5ng/劑量，更優(yōu)選約1.5-2.0pg/劑量，最優(yōu)選約1.6(ig/劑量。可通過任何方式產(chǎn)生本發(fā)明免疫原性組合物中所用的PCV2ORF2多肽，包括分離和純化PCV2ORF2、標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)合成方法和重組方法。獲得PCV2ORF2多肽的優(yōu)選方法如上所述，也可參見美國專利申請序列號11/034,797，將其內(nèi)容納入本文作參考。簡言之，用含有PCV20RF2DNA編碼序列的重組病毒載體感染易感細(xì)胞，由重組病毒表達(dá)PCV2ORF2多肽，通過過濾從上清液中回收表達(dá)的PCV2ORF2多肽，用任何常規(guī)方法、優(yōu)選用雙氮丙啶滅活，然后中和該物質(zhì)以終止滅活過程。因此，另一方面，所述免疫原性組合物含有i)任何上述PCV20RF2蛋白，濃度優(yōu)選上述濃度，和ii)至少一部分表達(dá)所述PCV20RF2蛋白的病毒載體、優(yōu)選重組桿狀病毒。而且，另一方面，所述免疫原性組合物含有i)任何上述PCV20RF2蛋白，濃度優(yōu)選上述濃度，ii)至少一部分表達(dá)所述PCV20RF2蛋白的病毒載體、優(yōu)選重組桿狀病毒，和iii)一部分細(xì)胞培養(yǎng)上清液。根據(jù)PCV2ORF2蛋白產(chǎn)生和回收方法的一個具體實(shí)施方式，通過孔徑優(yōu)選約為0.45-1iam的膜過濾細(xì)胞培養(yǎng)上清液。因此，另一方面涉及包含以下組分的免疫原性組合物i)任何上述PCV2ORF2蛋白，濃度優(yōu)選上述濃度，ii)至少一部分表達(dá)所述PCV20RF2蛋白的病毒載體、優(yōu)選重組桿狀病毒，禾口iii)一部分細(xì)胞培養(yǎng)上清液；其中約90%的組分大小小于1pm。另一方面，本發(fā)明涉及包含以下組分的免疫原性組合物i)任何上述PCV2ORF2蛋白，濃度優(yōu)選上述濃度，ii)至少一部分表達(dá)所述PCV20RF2蛋白的病毒載體，iii)一部分細(xì)胞培養(yǎng)物，和iv)滅活該重組病毒載體的滅活劑，優(yōu)選BEI，其中i)-iii)所述組分中約90%的大小小于1jLim。優(yōu)選地，BEI存在的濃度能有效滅活桿狀病毒。有效濃度如上所述。另一方面，本發(fā)明涉及包含以下組分的免疫原性組合物i)任何上述PCV2ORF2蛋白，濃度優(yōu)選上述濃度，ii)至少一部分表達(dá)所述PCV20RF2蛋白的病毒載體，iii)一部分細(xì)胞培養(yǎng)物，iv)滅活該重組病毒載體的滅活劑，優(yōu)選BEI，和v)終止滅活劑介導(dǎo)滅活的中和劑，其中i)-iii)所述組分中約90。/。的大小小于1pm。優(yōu)選地，如果滅活劑是BEI，所述組合物包含與BEI等價含量的硫代硫酸鈉。將多肽摻入可給予易受PCV2感染的動物的組合物中。在優(yōu)選形式中，該組合物也可包含本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它組分(也參見《雷明頓藥物科學(xué)》(Remington'sPharmaceuticalSciences)(1990)，第18版，MackPubl.，Easton)。此外，該組合物可包含一種或多種獸醫(yī)可接受的載體。本文所用"獸醫(yī)可接受的載體"包括任何和所有溶劑、分散介質(zhì)、包衣、佐劑、穩(wěn)定劑、稀釋劑、防腐劑、抗菌劑和抗真菌劑、等滲劑、吸收延遲劑等。在一優(yōu)選實(shí)施方式中，該免疫原性組合物包含本文提供的PCV2ORF2蛋白作為抗原性組分，其濃度優(yōu)選為上述濃度，將所述組合物與佐劑，優(yōu)選卡巴浦爾和生理鹽水混合。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，本文所述組合物可制成己知的可注射、生理可接受的無菌溶液。對于制備用于胃腸道外注射或輸注的即用型溶液而言，易于獲得等滲水溶液，如鹽水或相應(yīng)的血漿蛋白質(zhì)溶液。此外，本發(fā)明的免疫原性和疫苗組合物可包含稀釋劑、等滲劑、穩(wěn)定劑或佐劑。稀釋劑可包括水、鹽水、右旋糖、乙醇、甘油等。等滲劑可包括氯化鈉、右旋糖、甘露醇、山梨糖醇和乳糖等。穩(wěn)定劑包括白蛋白和乙二胺四乙酸的堿金屬鹽等。合適的佐劑如上所述。最優(yōu)選采用卡巴浦爾，具體是采用卡巴浦爾971P，用量優(yōu)選上述量(如每劑量約500|ig-5mg，更優(yōu)選每劑量約750pg-2.5mg，最優(yōu)選每劑量約1mg)。因此，本發(fā)明也涉及的免疫原性組合物含有以下組分i)任何上述PCV20RF2蛋白，濃度優(yōu)選上述濃度，H)至少一部分表達(dá)所述PCV20RF2蛋白的病毒載體，iii)一部分細(xì)胞培養(yǎng)物，iv)滅活該重組病毒載體的滅活劑，優(yōu)選BEI，和v)終止滅活劑介導(dǎo)的滅活作用的中和劑，優(yōu)選與BEI等價含量的硫代硫酸鈉；和vi)合適佐劑，優(yōu)選上述用量的卡巴浦爾971;其中i)-iii)所述組分中約90n/o的大小小于lpm。另一方面，此免疫原性組合物還含藥學(xué)上可接受的鹽，優(yōu)選生理可接受濃度的磷酸鹽。優(yōu)選將所述免疫原性組合物的pH調(diào)整到生理pH，即約6.5-7.5。因此，本發(fā)明涉及的免疫原性組合物，每1ml也含有i)至少1.6(ig上述PCV2ORF2蛋白，ii)至少一部分表達(dá)所述PCV20RF2蛋白的桿狀病毒，iii)一部分細(xì)胞培養(yǎng)物，iv)約2-8mMBEI，v)與BEI等價含量的硫代硫酸鈉；vi)約1mg卡巴浦爾971，和vii)生理上可接受濃度的磷酸鹽；其中i)-iii)所述組分中約90%的大小小于1|im，以及將所述免疫原性組合物的pH調(diào)整到約6.5-7.5。該免疫原性組合物還可包含一種或多種其它免疫調(diào)節(jié)劑，如白介素、干擾素或其它細(xì)胞因子。該免疫原性組合物也可含慶大霉素和硫柳汞。雖然本領(lǐng)域技術(shù)人員不難確定用于本發(fā)明的佐劑和添加劑的用量和濃度，但本發(fā)明考慮的組合物包含約50pg-2000pg佐劑和優(yōu)選約250ng/ml劑量的疫苗組合物。在另一優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明考慮的疫苗組合物含有約1Fig/ml-60pg/ml抗生素，更優(yōu)選低于約30pg/ml抗生素。因此，本發(fā)明也涉及含有以下組分的免疫原性組合物i)任何上述PCV2ORF2蛋白，其濃度優(yōu)選上述濃度，ii)至少一部分表達(dá)所述PCV20RF2蛋白的病毒載體，iii)一部分細(xì)胞培養(yǎng)物，iv)滅活該重組病毒載體的滅活劑，優(yōu)選BEI，和v)終止滅活劑介導(dǎo)的滅活作用的中和劑，優(yōu)選與BEI等價含量的硫代硫酸鈉；vi)合適佐劑，優(yōu)選上述用量的卡巴浦爾971;vii)藥學(xué)上可接受濃度的鹽水緩沖液，優(yōu)選磷酸鹽緩沖液，和viii)抗微生物活性劑；其中i)-iii)所述組分中約卯％的大小小于1pm。令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，本文提供的免疫原性組合物在24個月中非常穩(wěn)定。也發(fā)現(xiàn)本文提供的含有本文所述桿狀病毒表達(dá)的重組PCV2ORF2蛋白的免疫原性組合物能非常有效地減輕PCV2感染相關(guān)臨床癥狀。令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，含有本文所述重組桿狀病毒表達(dá)的PCV2ORF2蛋白的的免疫原性組合物比含有完整PCV2病毒滅活形式或分離的病毒PCV20RF2抗原的免疫原性組合物更有效。具體說，令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，重組桿狀病毒表達(dá)的PCV2ORF2蛋白在極低濃度，即至多0.25)ig/劑量時就有效。加入卡巴浦爾還可進(jìn)一步提高PCV2ORF2蛋白的這種出乎意料的高免疫原性潛能。另一方面涉及裝有至少一個劑量本文所述PCV2ORF2蛋白免疫原性組合物的容器，其中一個劑量包含至少2(agPCV2ORF2蛋白，優(yōu)選2-16嗎PCV2ORF2蛋白。所述容器可含有1-250劑量的該免疫原性組合物，優(yōu)選含有l(wèi)、10、25、50、100、150、200或250劑量的PCV2ORF2蛋白免疫原性組合物。優(yōu)選地，每個容器裝有一個劑量以上的PCV20RF2蛋白免疫原性組合物，還裝有抗微生物活性劑。這些活性劑為(例如)抗生素，包括慶大霉素和硫柳汞等。因此，本發(fā)明一方面涉及裝有1-250劑量的PCV2ORF2蛋白免疫原性組合物的容器，其中每個劑量包含至少2pgPCV2ORF2蛋白和慶大霉素和/或硫柳汞，優(yōu)選約1pg/ml-60^ig/ml抗生素，更優(yōu)選低于約30|ag/ml。另一方面涉及一種藥盒，其裝有上述容器和說明手冊，包括將至少一個劑量的PCV20RF2蛋白免疫原性組合物經(jīng)肌肉內(nèi)注射應(yīng)用于小豬，以減輕PCV2感染相關(guān)臨床癥狀的嚴(yán)重性的信息。而且，另一方面，所述說明手冊包括第二次或再次給予至少一個劑量的PCV2ORF2免疫原性組合物的信息，其中第二次給藥或再次給藥在初次或前次給藥的至少14天后進(jìn)行。優(yōu)選地，所述說明手冊也包括給予免疫刺激劑的信息。優(yōu)選地，給予所述免疫刺激劑至少兩次。優(yōu)選地，第一次與第二次或再次給予免疫刺激劑之間間隔至少3天，更優(yōu)選至少5天，更優(yōu)選至少7天。優(yōu)選地，在初次給予PCV20RF2蛋白免疫原性組合物至少10天，優(yōu)選15天，更優(yōu)選20天，更優(yōu)選至少22天后給予該免疫刺激劑。優(yōu)選的免疫刺激劑是(例如)鑰孔血藍(lán)素(KLH)，優(yōu)選用不完全弗氏佐劑(KLH/ICFA)乳化。然而應(yīng)理解，也可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員己知的任何其它免疫刺激劑。本文所用"免疫刺激劑"指可觸發(fā)免疫應(yīng)答，優(yōu)選不啟動或增強(qiáng)特異性免疫應(yīng)答，如對某特定病原體的免疫應(yīng)答的任何物質(zhì)或組合物。該手冊還說明應(yīng)以合適劑量給予免疫刺激劑。而且，該藥盒也可裝有容器，包括至少一個劑量的免疫刺激劑，優(yōu)選一個劑量的KLH或KLH/ICFA。而且，也令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，可通過給予IngelVacPRRSMLV疫苗優(yōu)選與卡巴浦爾組合進(jìn)一步增強(qiáng)含重組桿狀病毒表達(dá)的PCV2ORF2蛋白的該免疫原性組合物的免疫原性潛能(參見實(shí)施例5)。PRRS感染存在時，PCV2的臨床癥狀和疾病表現(xiàn)被顯著放大。然而，本文所述的免疫原性組合物和疫苗接種方案大大減輕了這種作用，出乎意料。換言之，用本文所述的任何PCV2ORF2免疫原性組合物和IngelvacPRRSMLV疫苗(Boehringerlngelheim)治療動物、優(yōu)選豬時，觀察到出乎意料的協(xié)同作用。因此，本發(fā)明另一方面涉及上述藥盒，其裝有本文所述的PCV2ORF2免疫原性組合物和說明手冊，該說明手冊還包括與含PRRS抗原、優(yōu)選佐劑化PRRS抗原的免疫原性組合物一起給予PCV2ORF2免疫原性組合物的信息。PRRS抗原優(yōu)選為IngelVacPRRSMLV(BoehringerIngelheim)。本發(fā)明另一方面也涉及一種藥盒，其包括i)裝有至少一個劑量本文所述PCV2ORF2免疫原性組合物的容器，和ii)裝有含PRRS抗原、優(yōu)選佐劑化PRRS抗原的免疫原性組合物的容器。PRRS抗原優(yōu)選IngelVacPRRSMLV(BoehringerIngelheim)。更優(yōu)選地，該藥盒還裝有說明手冊，包括給予藥物組合物的信息。優(yōu)選裝有在含PRRS的組合物之前臨時給予含PCV2ORF2的組合物的信息。另一方面涉及將本文所述任何組合物用作藥物，優(yōu)選用作獸用藥物，更優(yōu)選用作疫苗的應(yīng)用。而且，本發(fā)明也涉及本文所述任何組合物用于制備能減輕PCV2感染相關(guān)性臨床癥狀的嚴(yán)重性的藥物的應(yīng)用。優(yōu)選地，所述藥物用于預(yù)防PCV2感染，更優(yōu)選用于小豬。另一方面涉及用于(i)預(yù)防PCV2感染或再次感染或(ii)減少或消除PCV2所致對象臨床癥狀的方法，所述方法包括將本文所述任何免疫原性組合物給予需要的對象。所述對象優(yōu)選豬。優(yōu)選通過肌肉內(nèi)給予該免疫原性組合物。優(yōu)選給予一個劑量或兩個劑量的該免疫原性組合物，其中一個劑量優(yōu)選含有至少約2)igPCV2ORF2蛋白，更優(yōu)選約2-16pg和至少約0.1-5mg卡巴浦爾，優(yōu)選約lmg卡巴浦爾。另一方面涉及上述治療方法，包括第二次給予該免疫原性組合物。優(yōu)選用含有相同量的PCV2ORF2蛋白的免疫原性組合物進(jìn)行第二次給藥。第二次給藥也優(yōu)選通過肌肉內(nèi)給予。優(yōu)選地，在首次給藥至少14天后，更優(yōu)選在首次給藥至少4周后完成第二次給藥。另一方面，所述治療方法也包括給予免疫刺激劑。優(yōu)選地，至少給予所述免疫刺激劑兩次。優(yōu)選地，第一次和第二次給予免疫刺激劑之間間隔至少3天，更優(yōu)選至少5天，更優(yōu)選至少7天。優(yōu)選地，在初次給予PCV2ORF2免疫原性組合物至少10天，優(yōu)選15天，更優(yōu)選20天，更優(yōu)選至少22天后給予免疫刺激劑。優(yōu)選的免疫刺激劑是(例如)鑰孔血藍(lán)素(KLH)，優(yōu)選用不完全弗氏佐劑(KLH/ICFA)乳化。然而應(yīng)理解，也可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何其它免疫刺激劑。本領(lǐng)域技術(shù)人員通常知道給予免疫刺激劑的合適劑量。另一方面，上述治療方法也包括給予PRRS抗原。PRRS抗原優(yōu)選IngelVacPRRSMLV(BoehringerIngelhdm)。優(yōu)選在給予PCV2ORF2蛋白免疫原性組合物之前臨時給予所述PRRS抗原。附圖簡要說明圖1是PCV2ORF2重組桿狀病毒的優(yōu)選構(gòu)建過程流程圖；和圖2a和2b是如何產(chǎn)生本發(fā)明組合物的流程圖。優(yōu)選實(shí)施方式詳述以下實(shí)施例列出了本發(fā)明的優(yōu)選材料和方法。然而應(yīng)理解，僅以說明方式提供這些實(shí)施例，不應(yīng)認(rèn)為其中有任何內(nèi)容限制了本發(fā)明的整體范圍。實(shí)施例1本實(shí)施例比較了用本發(fā)明方法與現(xiàn)有技術(shù)已知方法獲得的ORF2相對產(chǎn)率。在四個1000mL轉(zhuǎn)瓶各接種300mL昆蟲無血清培養(yǎng)基Excell420(JRHBiosciences,Inc.，Lenexa，KS)，含有約1.0xl06Sf+細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸液。該主細(xì)胞培養(yǎng)物稱為SF+(草地夜蛾(&oA/^ra/n^》mfe))主細(xì)胞母液，第19代，批號N112-095W。用于產(chǎn)生該SF+主細(xì)胞母液的細(xì)胞獲自ProteinSciencesCorporation,Inc.,Meriden，CT。此實(shí)施例的SF+細(xì)胞系限定在第19和59代之間。其它代次將用于本發(fā)明目的，但為了將該方法擴(kuò)大為大規(guī)模生產(chǎn)，可能需要傳代至少19代，超過59代可能影響表達(dá)，但并未就此進(jìn)行研究。更詳細(xì)說，在無菌轉(zhuǎn)瓶中，用Excell420培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)從液氮儲存取出的初始SF+細(xì)胞培養(yǎng)物，其間恒速振蕩。在含有25-150mLExcell420無血清培養(yǎng)基的100mL-250mL轉(zhuǎn)瓶中培養(yǎng)該培養(yǎng)物。當(dāng)細(xì)胞倍增至細(xì)胞密度為1.0-8.0xl(^個細(xì)胞/mL時，將它們分接種至新容器中，接種密度為0.5-1>106個細(xì)胞/mL。在體積高達(dá)36升的轉(zhuǎn)瓶或高達(dá)300升的不銹鋼生物反應(yīng)器中25-29'C培養(yǎng)基序擴(kuò)增培養(yǎng)物2-7天。接種后，27"C培育轉(zhuǎn)瓶4小時。然后，用含有PCV2ORF2基因(SEQIDNO:4)的重組桿狀病毒接種各轉(zhuǎn)瓶。如下所述產(chǎn)生含有PCV2ORF2基因的重組桿狀病毒PCR擴(kuò)增PCV2北美毒株的PCV2ORF2基因，其含有5'Kozak序列(SEQIDNO:l)和3'位點(diǎn)(SEQIDNO:2)，將其克隆入pGEM-T-Easy載體(Promega，威斯康星州麥迪遜)。然后，切下該基因并亞克隆入轉(zhuǎn)運(yùn)載體pVL1392(BDBiosciencesPharmingen，SanDiego，CA)中。本文中該亞克隆部分由SEQIDNO:7代表。將含有PCV2ORF2基因的pVL1392質(zhì)粒命名為N47-064Y，然后與BaculoGold(BDBiosciencesPharmingen)桿狀病毒DNA共轉(zhuǎn)染入SF+昆蟲細(xì)胞(ProteinSciences,Meriden，CT)中，產(chǎn)生含有PCV2ORF2基因的重組桿狀病毒。本文所述的新構(gòu)建物為SEQIDNO:8。將含有PCV2ORF2基因的重組桿狀病毒經(jīng)噬斑純化(plaque-purified),在SF+細(xì)胞系上增殖主種子病毒(MSV)，分成等分，并儲存于-7(TC。用桿狀病毒特異性引物作PCR-RFLP，MSV經(jīng)鑒定為陽性PCV2ORF2桿狀病毒。經(jīng)間接熒光抗體試驗的多克隆血清或單克隆抗體檢測，用PCV2ORF2桿狀病毒感染的昆蟲細(xì)胞產(chǎn)生的MSV或工作種子病毒表達(dá)PCV20RF2抗原。此外，通過N-末端氨基酸測序確認(rèn)了對PCV2ORF2桿狀病毒的鑒定。也按照9C.F.R.113.27(c)、113.28,和113.55檢測PCV2ORF2桿狀病毒MSV的純度。接種到轉(zhuǎn)瓶中的各重組桿狀病毒具有不同的感染復(fù)數(shù)(MOI)。用7.52mL0.088MOI接種轉(zhuǎn)瓶1;用3.01mL0.36MOI接種轉(zhuǎn)瓶2;用1.5mL0.18MOI接種轉(zhuǎn)瓶3;用0.75mL0.09MOI接種轉(zhuǎn)瓶4。本文提供的圖1是說明用于構(gòu)建PCV2ORF2重組桿狀病毒的基本步驟的流程圖。接種桿狀病毒后，27i2'C培育該轉(zhuǎn)瓶7天，該期間也以100rpm振蕩。該轉(zhuǎn)瓶采用通風(fēng)蓋子允許空氣流動。在接下來的7天中，每24小時各瓶取樣。提取后，離心各樣品，分離沉淀和上清液，然后通過0.45-1.0nm孔徑濾膜進(jìn)行微量過濾。得到的樣品中所含ORF2量通過ELISA試驗定量。用0.05M碳酸鹽緩沖液(pH9.6)1:6000稀釋經(jīng)蛋白G純化的捕獲抗體豬抗-PCV2PabIgG(用PBS以1:250稀釋)進(jìn)行ELISA試驗。然后，將100nL抗體加入微量滴定板諸孔中，密封，37X:培育過夜。然后用含0.5mL吐溫20(Sigma，St.Louis，MO)、100mL10XD-PBS(GibcoInvitrogen，加利福尼亞州卡爾斯巴德)和899.5mL蒸餾水的洗滌溶液洗滌該平板三次。然后，將250pL封閉溶液(用蒸餾水將10mLD-PBSQS稀釋至100mL，其中溶解5gCarnation脫脂奶粉(Nestle，Glendale，CA))加入各孔中。下一步驟是洗滌該測試平板，然后加入預(yù)先稀釋的抗原。通過將200稀釋劑溶液(999.5mLD-PBS中加入0.5mL吐溫20)加入稀釋平板上的各孔中，產(chǎn)生預(yù)先稀釋的抗原。然后，以1:240和1:480稀釋樣品，然后將100pL各稀釋樣品加入稀釋平板上最上面的孔中(即一個最上面孔接受100)iL1:240稀釋樣品，其它孔接受1001:480稀釋樣品)。然后在該平板的其余部分孔中進(jìn)行連續(xù)稀釋從各孔中取出100^L，連續(xù)轉(zhuǎn)入平板的下一個孔中。各孔在先混合再進(jìn)行下一次轉(zhuǎn)移。測試平板的洗滌包括用洗滌緩沖液洗滌平板三次。然后密封該平板，37'C培育1小時，然后用洗滌緩沖液洗滌三次或更多次。所用檢測抗體是PCVORF2的單克隆抗體。用稀釋劑溶液1:300稀釋，然后將100pL稀釋的檢測抗體加入各孔。然后密封平板，37。C培育1小時，然后用洗滌緩沖液洗滌三次。然后，將正常兔血清(JacksonImmunoresearch，WestGrove，PA)加入稀釋劑溶液至1%濃度制備偶聯(lián)物稀釋劑。用偶聯(lián)物稀釋劑以I:IO，OOO稀釋偶聯(lián)抗體山羊抗小鼠(H+l)-HRP(JacksonImmunoresearch)。然后，將100(iL稀釋的偶聯(lián)抗體加入各孔中。然后密封該平板，37。C培育45分鐘，然后用洗滌緩沖液洗滌三次。將100jliL底物(TMB過氧化物酶底物，Kirkgaard禾卩PerryLaboratories(KPL)，Gaithersberg,MD)與等體積過氧化物酶底物B(KPL)混合，加入各孔中。室溫培育該平板15分鐘。然后，將100pLlNHCL溶液加入所有孔中終止反應(yīng)。然后，通過ELISA閱讀器讀數(shù)。該試驗的結(jié)果見下表l:表l<table>complextableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>這些結(jié)果表明，培育時間延長時，ORF2在離心細(xì)胞和培養(yǎng)基后上清液中的表達(dá)高于離心細(xì)胞和培養(yǎng)基后沉淀物中的表達(dá)。因此，與表達(dá)少于5天從細(xì)胞中回收的ORF2相比，使ORF2表達(dá)進(jìn)行至少5天從上清液中回收能顯著提高ORF2產(chǎn)率，與現(xiàn)有方法相比有顯著的改進(jìn)。實(shí)施例2本實(shí)施例提供了本文聲稱的本發(fā)明效果的有關(guān)數(shù)據(jù)。用300mLExcell420培養(yǎng)基含約1.0xl(^Sf+細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸液接種1000mL轉(zhuǎn)瓶。然后，27。C培育該轉(zhuǎn)瓶，100rpm振蕩。培育24小時后，以0.1MOI的10mLPCV2ORF2/Bacp+6(含有PCV2ORF2基因的重組桿狀病毒，在Sf9昆蟲細(xì)胞中再傳代6次)病毒接種該轉(zhuǎn)瓶。然后，27'C培育該轉(zhuǎn)瓶共6天。培育后，離心該轉(zhuǎn)瓶，收獲三個得到的上清液樣品并滅活。將溫度設(shè)置為37士2'C滅活上清液。對于第一個樣品，將已在0.3NNaOH中環(huán)化成0.2M雙氮丙啶(BEI)的0.4M氫溴酸2-溴乙胺(bromoethyleneamine)溶液加入該上清液中，使BEI終濃度為5mM。對于第二個樣品，將10mMBEI加入上清液。對于第三個樣品，不將BEI加入上清液。然后，連續(xù)攪拌樣品48小時。加入1.0M硫代硫酸鈉溶液，使最終最低濃度為5mM，以中和任何殘留的BEI。然后，用實(shí)施例1所述的同一ELISA試驗方法定量各樣品中的ORF2含量。此實(shí)施例的結(jié)果見下表2:表2<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>本實(shí)施例證明，用BEI中和不會去除或降解大量重組PCV2ORF2蛋白產(chǎn)品。加入BEI或升高溫度時上清液中沒有大量損失ORF2證明了這點(diǎn)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到，回收的ORF2是穩(wěn)定的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。實(shí)施例3本實(shí)施例證明，本發(fā)明的規(guī)?？梢詮男∫?guī)模生產(chǎn)重組PCV2ORF2擴(kuò)大到大規(guī)模生產(chǎn)重組PCV2ORF2。將7000mLExCe11420培養(yǎng)基含5.0x105個細(xì)胞/ml的Sf+細(xì)胞接種到20000mLApplikon生物反應(yīng)器中。然后，在接下來的68個小時中27"C培育該培養(yǎng)基和細(xì)胞并以100RPM振蕩。在第68小時時，將41.3mLPCV20RF2桿狀病毒MSV+3加入7000mLExCdl420培養(yǎng)基中。然后，將得到的混合物加入該生物反應(yīng)器中。在接下來的7天中，27'C培育該混合物并以100RPM振蕩。從感染后第4天開始，每24小時從生物反應(yīng)器中提取一次樣品，離心各樣品。保存樣品上清液，然后用SDS-PAGE光密度法定量ORF2含量。結(jié)果見下表3:表3<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>實(shí)施例4本實(shí)施例測試了七種PCV2候選疫苗的效果，進(jìn)一步確定了接觸PCV2強(qiáng)毒株后的效率參數(shù)。將一百零八(108)只剖腹產(chǎn)不喝初乳(CDCD)的9-14日齡小豬隨機(jī)分成相同大小的9組。表4列出了此實(shí)施例的總體研究設(shè)計。表4.總體研究設(shè)計<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>vORF2-分離的病毒ORF2;rORF2-重組桿狀病毒表達(dá)的ORF2;殺死的全細(xì)胞病毒=在合適細(xì)胞培養(yǎng)物中培養(yǎng)的PCV2病毒七組(第u組)接受某些劑量的PCV2ORF2多肽，其中一組用作攻擊對照，不接受PCV20RF2;另一組用作嚴(yán)謹(jǐn)性陰性對照，也不接受PCV20RF2。在第0天，用指定疫苗治療第1-7組。在第14天對第7組的小豬進(jìn)行加強(qiáng)治療。在免疫接種后和第19天觀察小豬的不良反應(yīng)和注射部位反應(yīng)，將小豬轉(zhuǎn)移到第二研究地點(diǎn)。在第二研究地點(diǎn)，在一個建筑物中分組飼養(yǎng)第1-8組，而在另一建筑物中單獨(dú)詞養(yǎng)第9組。所有豬在第21和27天以及第24天接受鑰孔血藍(lán)素(KLH)/不完全弗氏佐劑(ICFA)，用強(qiáng)毒株P(guān)CV2攻擊第1-8組。攻擊之前和之后，收集血樣進(jìn)行PCV2血清學(xué)分析。攻擊后，收集用于確定平均每日體重增量(ADWG)和臨床癥狀的體重數(shù)據(jù)，以及用于測定PCV2鼻排出的鼻拭子樣品。在第49天，對所有存活的豬處死后進(jìn)行尸檢，對肺病損進(jìn)行評分，用福爾馬林保存選擇的組織，用于隨后的免疫組織化學(xué)(IHC)檢測。材料和方法這是在第0天對9-14日齡CDCD豬進(jìn)行的部分盲法(partiallyblinded)疫苗接種-攻擊可行性研究。該研究所包括的母豬PCV2IFA效價應(yīng)^1:1000。此外，母豬的血清學(xué)狀態(tài)得自已知的PRRS-陰性畜群。檢測了28頭母豬的PCV2血清學(xué)狀態(tài)。14頭母豬的PCV2效價S1000，將它們轉(zhuǎn)移到第一研究地點(diǎn)。通過剖腹產(chǎn)手術(shù)分娩IIO只小豬，試驗前4天用于此研究。在試驗前3天，將第一研究地點(diǎn)的108只CDCD豬稱重，用耳標(biāo)簽作標(biāo)記，根據(jù)體重分區(qū)，隨機(jī)分配到l-9組，如表4所示。如果此研究編入了符合標(biāo)準(zhǔn)的任何受試動物但后來因某種原因而排除，則研究者和監(jiān)測者應(yīng)進(jìn)行商議，以確定是否在最終分析中采用從該動物收集的數(shù)據(jù)。討論是否排除該編入小豬的數(shù)據(jù)和排除理由。最初，不排除任何母豬。在試驗前3天，將可用的110頭豬中共108頭隨機(jī)分配到9組中。不將兩頭最小的豬(17和19號)分配到任何組中，如果需要，用作額外實(shí)驗動物。在研究期間，去除了幾只動物。攻擊前發(fā)現(xiàn)以下各豬死亡試驗前1天82號豬(第9組)，第3天56號豬(第6組)，第4天53號豬(第9組)，第8天28號豬(第8組)，第7天69號豬(第8組)，第9天93號豬(第4組)。這六頭豬不包括在最終研究結(jié)果中。將17號豬(額外豬之一)分配到第9組。研究中排除了另一個額外豬，19號豬。給予各組的制劑如下設(shè)計給予第1組含有16pg0RP2/ml的1ml病毒ORF2(vORF2)，將10.24ml病毒ORF2(256|ig/ml=10.24mlvORF2)與3.2ml0.5%卡巴浦爾和2.56ml磷酸鹽緩沖鹽水(pH7.4)混合制備此溶液，這產(chǎn)生16ml用于第1組的制劑。設(shè)計給予第2組含有8pgvORF2/ml的1mlvORF2，將5.12mlvORF2(128|ig/25pg/ml=5.12mlvORF2)與3.2ml0.5%卡巴浦爾和7.68ml磷酸鹽緩沖鹽水(pH7.4)混合制備此溶液，這產(chǎn)生16ml用于第2組的制劑。設(shè)計給予第3組含有4ngvORF2/ml的1mlvORF2，將2.56mlvORF2(64)ig/25pg/ml=2.56mlvORF2)與3.2ml0.5%卡巴浦爾和10.24ml磷酸鹽緩沖鹽水(pH7.4)混合制備此溶液，這產(chǎn)生16ml用于第3組的制劑。設(shè)計給予第4組含有16pgrORF2/ml的1ml重組ORF2(rORF2)，將2.23mlrORF2(512(ig/230|ag/ml=2.23mlrORF2)與6.4ml0.5%卡巴浦爾和23.37ml磷酸鹽緩沖鹽水(pH7.4)混合制備此溶液，這產(chǎn)生32ml用于第4組的制劑。設(shè)計給予第5組含有8jigrORF2/ml的1mlrORF2，將1.11mlrORF2(256(ig/230pg/ml=l.llmlrORF2)與6.4ml0.5%卡巴浦爾和24.49ml磷酸鹽緩沖鹽水(pH7.4)混合制備此溶液，這產(chǎn)生32ml用于第5組的制劑。設(shè)計給予第6組含有8pgrORF2/ml的1mlrORF2，將0.56mlrORF2(128|ig/230(ig/ml=0.56mlrORF2)與6.4ml0.5%卡巴浦爾和25.04ml磷酸鹽緩沖鹽水(pH7.4)混合制備此溶液，這產(chǎn)生32ml用于第6組的制劑。設(shè)計給予第7組含有MAXPCV2KV的2mlPCV2殺死的全細(xì)胞疫苗(PCV2KV)，將56mlPCV2KV與14ml0.5%卡巴浦爾混合制備此溶液，這產(chǎn)生70ml用于第7組的制劑。最后，設(shè)計給予第8組每2ml劑量0.5ng/ml或1.0ng/ml的KLH，將40.71mlKLH(7.0ng蛋白質(zhì)/m1，0.5pg/ml=570ml(7.0pg/ml)(x)K0.5)(570ml))、244.29ml磷酸鹽緩沖鹽水(pH7.4)和285ml弗氏佐劑混合制備此溶液。表5描述了本實(shí)施例關(guān)鍵事項的時間框圖。表5.研究事項<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>49收集所有豬的血樣和鼻拭子樣品；稱量所有豬的體重；對所有豬進(jìn)行尸檢；觀察總病損，著重觀察黃疽和胃潰瘍；評價肺病損；保存新鮮的和福爾馬林固定的組織樣品；存活期研究完成存活期研究完成后，病理學(xué)家用免疫組織化學(xué)(IHC)檢測福爾馬林固定組織中的PCV2抗原，評價血樣的PCV2血清學(xué)變化，評價鼻拭子樣品的PCV2排出，觀啶第24天-第49天的平均每日體重增量(ADWG)。在第一研究地點(diǎn)，在五間豬舍中分籠詞養(yǎng)動物，從出生飼養(yǎng)至大約11日齡(大約是研究的第0天)。各豬舍的設(shè)計相同，由層疊的單個不銹鋼籠組成，該設(shè)計可以將加熱和過濾的空氣單獨(dú)供應(yīng)給各分離單元。各豬舍分別有加熱和通風(fēng)裝置，從而防止豬舍之間空氣的交叉污染。在第二研究地點(diǎn)，在兩個不同的建筑物中飼養(yǎng)動物。在改造的配料建筑物(fumisherbuilding)中單獨(dú)飼養(yǎng)第9組(嚴(yán)謹(jǐn)性陰性對照組)，在改造的養(yǎng)殖建筑物(nurserybuilding)中飼養(yǎng)第1-8組。在單獨(dú)豬圈中飼養(yǎng)各組(每圈11-12頭豬)，各豬圈為每頭豬提供約3.0平方英尺空間。各豬圈位于具有塑料漏縫地板的高架平臺上。豬圈下的地坑用作糞便和廢物的儲存罐。各建筑物具有其自身獨(dú)立的加熱和通風(fēng)系統(tǒng)，建筑物之間空氣交叉污染的可能性很小。在第一研究地點(diǎn)，從出生至約3周齡，給小豬飼喂特制的奶詞料。到第19天(約4K周齡)，所有小豬都進(jìn)食特制的固體混合飼料。在第二研究地點(diǎn)，隨意給所有小豬飼喂適合其年齡和體重的定制不含藥物的市售混合飼料。在兩個研究地點(diǎn)，可隨意飲水。在試驗前2天用維生素E治療所有受試豬，在試驗前1天注射鐵劑，在第16、17、18禾n19天注射NAXCEL⑧(1.0mL，IM，兩側(cè)臀部交替注射)。此外，第3天給52號豬(第9組)注射鐵劑，第11天給45號豬(第6組)注射鐵劑，第6天用NAXCEL治療69號豬(第8組)，第14天用地塞米松(dexamethazone)和青霉素治療74號豬(第3組)，第13天用地塞米松和青霉素治療51號豬(第1組)，第14天因為各種健康原因用NAXCEL②治療。在兩處研究地點(diǎn)，豬都處在獸醫(yī)照料下。在第O天進(jìn)行動物體檢，將結(jié)果記錄于體檢記錄表中。通過第0天的觀察確定，所有動物在疫苗接種前健康和營養(yǎng)狀況良好。攻擊前觀察到所有受試動物的健康和營養(yǎng)狀況良好。以歸還(rendering)治療畜體和組織。在動物治療記錄上記載研究動物的最終治療。第0天，分配到第1-6組的豬分別接受1.0mLPCV2疫苗1-6,用無菌3.0mLLuer-lock注射器和無菌20gx'力"針頭將其IM注射在左側(cè)頸部。分配到第7組的豬接受2.0mLPCV2疫苗7，用無菌3.0mLLuer-lock注射器和無菌20gx'/2"針頭將其IM注射在左側(cè)頸部。第14天，分配到第7組的豬接受2.0mLPCV2疫苗7，用無菌3.0mLLuer-lock注射器和無菌20gx'/2"針頭將其IM注射在右側(cè)頸部。第21天，所有受試豬都接受2.0mLKLH/ICFA，用無菌3.0mLLuer-lock注射器和無菌20gxl"針頭將其IM注射在右側(cè)臀部。第27天，所有受試豬都接受2.0mLKLH/ICFA，用無菌3.0mLLuer-lock注射器和無菌20gxl"針頭將其注射在左側(cè)臀部。第24天，分配到第1-8組的豬接受1.0mLPCV2ISUVDL攻擊病毒株(5.11log10TCID5Q/mL),用無菌3.0mLLuer-lock注射器和無菌20gx1"針頭將其IM注射在左側(cè)頸部。用無菌3.0mLLuer-lock注射器和鼻導(dǎo)管將另外1.0mL相同病毒株IN給予各豬(每鼻孔0.5mL)。在試驗前4天和第0天至第9天每日觀察受試豬的總體健康狀況和不良反應(yīng)。在臨床觀察記錄上記錄觀察結(jié)果。自第0天至第7天觀察所有受試豬，還在第14-21天觀察第7組的注射部位反應(yīng)。在試驗前3天、第24天和第49天，或在攻擊后發(fā)現(xiàn)豬死亡的那天用校準(zhǔn)天平稱取各豬的體重，確定平均每日體重增量。在體重表上記錄體重。利用試驗前3天的體重將豬分區(qū)，然后隨機(jī)分組。利用第24天和第49天的體重數(shù)據(jù)確定這些時間點(diǎn)期間各豬的平均每日體重增量(ADWG)。對于攻擊后和第49天前死亡的豬，調(diào)整ADWG，以代表第24天至死亡日的ADWG。為了測定PCV2血清學(xué)變化，在試驗前3天和第14天，從各小豬的眼窩靜脈竇收集靜脈全血。對于各小豬，通過將無菌毛細(xì)管插入一只眼睛的內(nèi)眼角并將大約3.0mL全血放入4.0mL血清分離管(SST)中，從眼窩靜脈竇收集血液。在第24、31和49天，用無菌lSgxl1/'Vacutainer針頭(BectonDickinson&Company,FranklinLakes,新澤西州)、Vacutainer針托和13mLSST從上腔靜脈收集各豬的靜脈全血。在樣品收集記錄上記錄各時間點(diǎn)的血液收集。使各SST中的血液凝結(jié)，然后，離心各SST，收獲血清。將收獲的血清轉(zhuǎn)移到無菌有蓋試管(snaptube)中，儲存于-70土10。C，直到將來進(jìn)行測試。由BIVI-R&D職員檢測血清樣品中是否存在PCV2抗體。在第20天至第49天每天觀察一次豬的臨床癥狀，在臨床觀察記錄上記錄臨床觀察結(jié)果。為了檢測第24天、第25天，和隨后直到(包括)第49天的奇數(shù)研究日時的PCV2鼻排出，將無菌滌綸拭子以鼻內(nèi)方式插入各豬的左鼻孔或右鼻孔(每頭豬一個拭子)，盡可能無菌繞圈擦拭數(shù)秒后取出。然后將各拭子放入一個無菌有蓋試管中，其中含有1.0mLEMEM培養(yǎng)基與2%IFBS，500單位/mL青霉素，500pg/mL鏈霉素和2.5!ig/mL兩性霉素B。在管中折斷該拭子，加蓋密封試管，適當(dāng)標(biāo)出動物編號、研究編號、收集日期、研究日和"鼻拭子"。將密封試管貯存于-40il(TC，直到用冰過夜轉(zhuǎn)送至BIVI-St.Joseph。在鼻拭子樣品收集表上記錄鼻拭子收集物。BIVI-R&D對鼻拭子樣品上的PCV2進(jìn)行定量病毒分離(VI)測試。結(jié)果表示為logu)值。1.3log或更小的值認(rèn)為是陰性，大于1.3log的任何值認(rèn)為是陽性。對第一研究地點(diǎn)死亡的豬(28、52、56、69、82和93號豬)尸檢至確定診斷所必需的水平。記錄總病損，不保留這些豬的組織。在第二研究地點(diǎn)，對第49天之前死亡的豬(45、23、58、35號豬)，對發(fā)現(xiàn)在安樂死之前第49天死亡的豬(2、43號豬)和第49天實(shí)施安樂死的豬進(jìn)行尸檢。觀察有無任何總病損，在尸檢報告表上記錄含病損的肺葉百分?jǐn)?shù)。將第二研究地點(diǎn)尸檢的103頭豬的扁桃腺、肺、心臟、肝臟、腸系膜淋巴結(jié)、腎臟和腹股溝淋巴結(jié)的組織樣品放入一個裝有10%緩沖福爾馬林液的容器中；同時將上述同一器官的另一份組織樣品放入Whirl-pak(M-TechDiagnosticsLtd.，Thelwall，UK)中，將各Whirl-pak置于冰上。適當(dāng)?shù)貥?biāo)記各容器。在尸檢報告表上記錄樣品收集。然后，對福爾馬林固定的組織樣品和診斷請求表進(jìn)行IHC測試。按照接受樣品、制備樣品和玻片以及染色技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)ISU實(shí)驗室步驟進(jìn)行IHC測試。用冰盒將Whirl-paks中的新鮮組織運(yùn)輸?shù)窖芯繖z測處儲存(-70士l(TC)待用。病理學(xué)家用IHC檢測福爾馬林固定組織中的PCV2，并用以下評分系統(tǒng)評分0=無；1=少量陽性染色，幾個位點(diǎn)；2=中等陽性染色，多個位點(diǎn)；3=大量陽性染色，散布于整個組織中。由于病理學(xué)家不能明確區(qū)分腹股溝LN與腸系膜LN，所以將這些組織的結(jié)果僅僅標(biāo)為淋巴結(jié)，評分給出了每個動物各兩種組織的最高評分。結(jié)果本實(shí)施例的結(jié)果見下。應(yīng)注意，第9組的一頭豬在第0天之前死亡，還有5頭豬在接種疫苗后死亡(第4組1頭；第6組1頭；第8組2頭；第9組1頭)。死后檢驗表明，所有六頭豬都死于與疫苗接種或PMWS無關(guān)的感染。此外，在任何組中都沒有觀察到不良反應(yīng)或注射部位反應(yīng)。平均每日體重增量(ADWG)結(jié)果見下表6。嚴(yán)謹(jǐn)性陰性對照組第9組的ADWG最高(1.06士0.17磅/天)，其次是接受一個劑量8pgrORF2的第5組(0.94士0.22磅/天)。接受一個劑量4)igvORF2的第3組的ADWG最低(0.49±0.21磅/天)，其次是接受2次劑量死疫苗的第7組(0.50±0.15磅/天)。表6.組間平均每日1沐重增量(ADWG)的小結(jié)<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>vORF2-分離的病毒ORF2;rORF2:重組桿狀病毒表達(dá)的ORF2;殺死的全細(xì)胞病毒=在合適細(xì)胞培養(yǎng)物中培養(yǎng)的PCV2病毒PCV2血清學(xué)結(jié)果見下表7。在試驗前3天所有九組都是PCV2血清陰性。第14天，接受vORF2疫苗的各組效價最高，其范圍是187.5-529.2。接受死病毒疫苗的豬效價第二高，其次是接受rORF2疫苗的各組。此時第8組和第9組仍為血清陰性。第24天和第31天，接受vORF2疫苗的豬繼續(xù)顯示出強(qiáng)烈的血清應(yīng)答，緊隨其后的是接受兩個劑量死病毒疫苗的小組。接受rORF2疫苗的豬血清學(xué)應(yīng)答較慢，第8組和第9組繼續(xù)保持血清陰性。第49天，接受vORF2疫苗、2次劑量死病毒疫苗和最低劑量的rORF2的豬顯示出最強(qiáng)的血清應(yīng)答。接受16pg和8rORF2疫苗的豬的IFA效價略高于攻擊對照。第9組在第49天顯示出強(qiáng)烈的血清應(yīng)答。表7.組間PCV2IFA效價的小結(jié)<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>vORF2-分離的病毒ORF2;rORF2-重組桿狀病毒表達(dá)的ORF2;殺死的全細(xì)胞病毒=在合適細(xì)胞培養(yǎng)物中培養(yǎng)的PCV2病毒*出于計算目的，將IFA效價S100指定為效價"50";將IFA效價^6400指定為效價"12,800"。**攻擊日***尸檢日攻擊后臨床觀察的結(jié)果見下表8。此結(jié)果的小結(jié)包括對異常行為、異常呼吸、咳嗽和腹瀉的觀察。表9包括組間臨床癥狀總體發(fā)生率的小結(jié)結(jié)果，表10包括攻擊后組間死亡率的小結(jié)結(jié)果。本研究中最常見的臨床癥狀是行為異常，該行為被記錄為輕微至嚴(yán)重嗜睡。接受2次較低劑量vORF2的豬、接受16pgrORF2的豬和接受2次劑量的KV疫苗的豬發(fā)病率227.3%。接受8嗎rORF2的豬和嚴(yán)謹(jǐn)性陰性對照組沒有異常行為。本研究中沒有豬顯示出任何異常呼吸。所有組中頻繁觀察到咳嗽(0-25%)以及腹瀉(0-20%)。沒有發(fā)現(xiàn)有PMWS病理性臨床癥狀。臨床癥狀總體發(fā)生率因組而異。接受任何vORF2疫苗的小組、接受16pgrORF2的小組、接受2次劑量KV疫苗的小組和攻擊對照組的總體臨床癥狀發(fā)生率最高(236.4%)。嚴(yán)謹(jǐn)性陰性對照組，接受8嗎rORF2的小組和接受4嗎rORF2的小組的總體臨床癥狀發(fā)生率分別為0%、8.3%禾口9.1%?？傮w死亡率也因組而異。接受2次劑量KV疫苗的小組的死亡率最高(16.7%);而接受4pgvORF2、16pgrORF2或8pgrORF2的小組和嚴(yán)謹(jǐn)性陰性對照組的死亡率均為0%。表8.組間異常行為、異常呼吸、咳嗽和腹瀉的觀察結(jié)果小結(jié)<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>vORF2-分離的病毒ORF2;rORF2-重組桿狀病毒表達(dá)的ORF2;殺死的全細(xì)胞病毒=在合適細(xì)胞培養(yǎng)物中培養(yǎng)的PCV2病毒'各組中顯示有任何異常行為至少一天的豬總數(shù)2各組中顯示有任何異常呼吸至少一天的豬總數(shù)3各組中顯示有咳嗽至少一天的豬總數(shù)4各組中顯示有腹瀉至少一天的豬總數(shù)表9.組間臨床癥狀總體發(fā)生率的小結(jié)<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>vORF2-分離的病毒ORF2;rORF2-重組桿狀病毒表達(dá)的ORF2;殺死的全細(xì)胞病毒=在合適細(xì)胞培養(yǎng)物中培養(yǎng)的PCV2病毒1各組中顯示有任何臨床癥狀至少一天的豬總數(shù)表10.攻擊后組間死亡率的小結(jié)<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>vORF2-分離的病毒ORF2;rORF2:重組桿狀病毒表達(dá)的ORF2;殺死的全細(xì)胞病毒=在合適細(xì)胞培養(yǎng)物中培養(yǎng)的PCV2病毒PCV2鼻排出結(jié)果見下表11。第24天攻擊后，第7組的1頭豬在第27天開始排出PCV2。其他組直到第33天才開始排出。從第35天至第45天觀察到有大量病毒經(jīng)鼻排出。接受三種vORF2疫苗之一的小組和接受4或8pgrORF2的小組PCV2鼻排出發(fā)生率最低(￡9.1%)。攻擊對照組(第8組)的排出率最高(80%)，其次是嚴(yán)謹(jǐn)性陰性對照組(第9組)，其發(fā)生率為63.6%。表ll.小組PCV2鼻排出的發(fā)生率小結(jié)<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>vORF2-分離的病毒ORF2;rORF2-重組桿狀病毒表達(dá)的ORF2;殺死的全細(xì)胞病毒-在合適細(xì)胞培養(yǎng)物中培養(yǎng)的PCV2病毒組間黃疸發(fā)生率、組間胃潰瘍發(fā)生率、組間平均肺病損評分和組間肺病損發(fā)生率的小結(jié)見下表12。本研究疫苗接種后，六頭豬在第一測試地點(diǎn)死亡(第4組，N=l;第6組，N=l;第8組，N=2;第9組，N=2)。六頭豬中的四頭在一個或多個體腔中有纖維化病灶，一頭豬(第6組)的病灶與梭菌病相一致，一頭豬(第9組)大體上沒有病損。本研究疫苗接種后死亡的豬均沒有與PMWS相一致的病損。對攻擊后死亡的豬和第49天實(shí)施安樂死的豬進(jìn)行尸檢。在尸檢中，任何組中都不存在黃疸和胃潰瘍。在平均％肺病損中，第9組的平均％肺病損最低(0%)，其次是第1組的0.40±0.50%和第5組的0.68±1.15%。第2、3、7和8組的平均％肺病損最高(^7.27%)。這四組中各自有一頭豬的肺病損271.5%，此豬使這四組的結(jié)果變得較高。除了第9組的肺病損為0%以外，其余8組的肺病損536%。觀察到的幾乎所有肺病損都可描述為紅色/紫色和緊實(shí)。表12.觀察到的組間黃疽發(fā)生率、組間胃潰瘍發(fā)生率、<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>vORF2-分離的病毒ORF2;rORF2-重組桿狀病毒表達(dá)的ORF2;KV或殺死的全細(xì)胞病毒=在合適細(xì)胞培養(yǎng)物中培養(yǎng)的PCV2病毒表15.攻擊后組間數(shù)據(jù)小結(jié)-第2部分<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>vORF2-分離的病毒ORF2;rORF2:重組桿狀病毒表達(dá)的ORF2;KV或殺死的全細(xì)胞病毒=在合適細(xì)胞培養(yǎng)物中培養(yǎng)的PCV2病毒本研究的結(jié)果表明，所有有效的疫苗應(yīng)集中于rORF2疫苗?？傮w來看，在攻擊后都檢測到PCV2鼻排出，用PCV2疫苗進(jìn)行接種導(dǎo)致排出減少。對所選淋巴組織的免疫組織化學(xué)檢測也是疫苗效果的良好參數(shù)，而沒有檢測到各組之間在ADWG、臨床癥狀和總體病損上有大的差異。如嚴(yán)謹(jǐn)性陰性對照組第9組的PCV2鼻排出、PCV2血清轉(zhuǎn)化和陽性IHC組織證明的那樣，由于在該研究期間的某些時間點(diǎn)上引入了外來的PCV2，而使本研究復(fù)雜化。討論本研究中評價了七種PCV2疫苗，包括在第0天給予一次三種不同劑量水平的vORF2抗原，在第0天給予一次三種不同劑量水平的rORF2抗原，在第0天和第14天給予一種劑量水平全細(xì)胞PCV2死疫苗?？傮w來看，接受1次劑量含有8pgrORF2抗原的疫苗的第5組獲得最佳結(jié)果。第5組的ADWG最高，異常行為發(fā)生率最低，異常呼吸發(fā)生率最低，咳嗽發(fā)生率第二低，總體臨床癥狀發(fā)生率最低，死亡率最低，PCV2鼻排出比率最低，平均％肺病損比率第二低，陽性IHC組織發(fā)生率最低。令人感興趣的是，接受比第5組更高劑量的rORF2抗原的第4組的表現(xiàn)不如第5組或不比第5組更好。與第5組相比，第4組的ADWG略低，異常行為發(fā)生率較高，總體臨床癥狀發(fā)生率較高，PCV2鼻排出比率較高，平均％肺病損比率較高，陽性IHC組織比率較高。沒有對這些數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，統(tǒng)計學(xué)分析可能表明這兩組之間的差異沒有統(tǒng)計學(xué)顯著性，但觀察到第4組的表現(xiàn)不如第5組好的傾向。免疫接種后，6頭豬在第一研究地點(diǎn)死亡。六頭豬中四頭來自第8組或第9組，沒有接受疫苗。六頭豬沒有一頭顯示有與PMWS相符的病損，沒有報告不良反應(yīng)，總體來看，所有七種疫苗給予約ll日齡的豬時，看起來是安全的。在該研究的接種后期間，在各疫苗組中，接受三種劑量水平vORF2疫苗或全細(xì)胞死疫苗的豬的IFAT水平最高，而第5組在攻擊前IFAT水平最低。雖然沒有正式證明，但相信PCV2傳播給剛斷奶不久的小豬的主要途徑是口鼻直接接觸，能在豬同窩生產(chǎn)過程中減少PCV2鼻排出的有效疫苗將有助于控制感染的傳播。接受三種vORF2抗原水平之一的小組和接受8|igrORF2的小組中PCV2鼻排出的發(fā)生率最低(8.3%)。不出所料，攻擊對照組的病毒鼻排出發(fā)生率最高(80%)。PCV2感染后繼發(fā)PMWS的豬的總病損通常包括全身性淋巴結(jié)病與以下一種或多種疾病(l)間質(zhì)性肺炎伴有小葉間水腫、(2)皮膚蒼白或黃疸、(3)斑點(diǎn)狀肝萎縮、(4)胃潰瘍和(5)腎炎。尸檢時，在任何小組中都沒有觀察到黃疸、肝炎、腎炎和胃潰瘍，沒有專門檢測淋巴結(jié)病。平均％肺病損評分因組而異。接受16pgvORF2抗原的小組的平均％肺病損評分最低(0.40±0.50%)，其次是接受8pgrORF2的小組(0.68±1.15%)。不出所料，攻擊對照組的平均％肺病損評分最高(9.88±29.2%)。在所有四組中，由于各組中一頭豬的肺病損評分非常高而使平均％肺病損評分升高。大多數(shù)肺病損都可描述為紅色/紫色和緊實(shí)。一般將與PMWS相關(guān)的肺病損描述為棕褐色、非塌陷伴小葉間水腫。本研究觀察到的肺病損與PCV2感染無關(guān)，或者可能已存在第二種肺感染因子。在本研究內(nèi)容中，M肺病損評分可能不能真實(shí)衡量PCV2引起的肺感染量。其它研究人員己經(jīng)用IHC證明了PCV2抗原的存在與組織病理學(xué)之間直接相關(guān)。此研究沒有進(jìn)行對選擇組織的組織病理學(xué)分析。第1組(16pgvORF2)和第5組(8pgrORF2)PCV2抗原陽性的豬發(fā)生率最低(8.3%)，而第9組(嚴(yán)謹(jǐn)性陰性對照組-90.9%)和第8組(攻擊對照組-90.0%)的PCV2抗原陽性的豬發(fā)生率最高。由于此測試具有非主觀性，IHC結(jié)果可能是判斷疫苗效力依據(jù)的最佳參數(shù)之一。因此，本發(fā)明一方面是確定了面對PCV2攻擊的CDCD豬模型中最小保護(hù)劑量(MPD)是含有提取的PCV20RF2(rORF2)抗原的1ml/1次劑量的重組產(chǎn)品。在接受不同水平rORF2抗原的三組中，第5組(8pgrORF2抗原)的保護(hù)水平顯然最高。在所檢測的所有參數(shù)中，第5組或者具有最佳結(jié)果，或者獲得了最想要的結(jié)果。將第5組與其它六個疫苗組攻擊后作比較時，第5組的ADWG最高(0.94士0.22磅/天)，異常行為發(fā)生率最低(0%)，咳嗽發(fā)生率第二低(8.3%)，總體臨床癥狀發(fā)生率最低(8.3%)，死亡率最低(0%)，PCV2鼻排出比率最低(8.3。/。)，平均％肺病損第二低(0.68±1.15%)，陽性IHC組織的發(fā)生率最低(16.7%)。本發(fā)明另一方面是確定了面對PCV2攻擊的CDCD豬模型中常規(guī)產(chǎn)品MPD是部分純化的PCV2ORF2(vORF2)抗原為1ml/1次劑量。在接受不同水平vORP2抗原的三組中，第1組(16pgvORF2)的保護(hù)水平最高。就ADWG、平均％肺病損和IHC而言，第1組的表現(xiàn)超過第2組和第3組。第1組和第2組(8pgvORF2抗原)在總體臨床癥狀發(fā)生率方面表現(xiàn)相同，第3組(4pgvORF2抗原)的死亡率最低，所有這三組在病毒鼻排出方面表現(xiàn)相同?？傊?，vORF疫苗的表現(xiàn)不如rORF疫苗好。本發(fā)明又一方面是確定了面對PCV2攻擊的CDCD豬模型中2ml/2次劑量常規(guī)PCV2死疫苗最大劑量的效果。在本研究評價的七種疫苗中，全細(xì)胞PCV2死疫苗的表現(xiàn)最差。接受兩次劑量全細(xì)胞PCV2死疫苗的小豬ADWG最低，異常行為比率第二高(58.3%)，總體臨床癥狀發(fā)生率第二高(58.3%)，死亡率最高(16.7%)，鼻排出發(fā)生率第二高(41.7%)，平均％肺病損最高(9.88±29.2%)，觀察到的肺病損發(fā)生率高(75%)，組織中IHC發(fā)生率中等(41.7。/。)。然而，它可以是引發(fā)免疫應(yīng)答的有效疫苗。本發(fā)明又一方面，PCV2鼻排出被評價為一種效力參數(shù)，再次驗證先前研究的前述PCV2效力參數(shù)。本研究的結(jié)果表明，PCV2鼻排出發(fā)生在鼻內(nèi)攻擊后，而PCV2疫苗能減少攻擊后的PCV2鼻排出。而且，本研究的結(jié)果和文獻(xiàn)報道表明，在未來的PCV2疫苗試驗中，應(yīng)繼續(xù)評價IHC。本研究產(chǎn)生的一些其它結(jié)論是淋巴結(jié)病是PMWS的標(biāo)志之一。PMWS的另外一種標(biāo)志是淋巴耗盡和產(chǎn)生多個核/巨大的組織細(xì)胞。此外，在7種PCV2疫苗中沒有觀察到不良反應(yīng)或注射部位反應(yīng)，所有7種PCV2疫苗給予小豬時看來都是安全的。實(shí)施例5本實(shí)施例檢測了八種PCV2候選疫苗的效果，并再次驗證了接觸PCV2強(qiáng)毒株后得自早先攻擊研究的PCV2攻擊參數(shù)。將一百五十(150)只剖腹產(chǎn)不喝初乳CCDCD)的6-16日齡小豬以體重分區(qū)，并隨機(jī)分成數(shù)目相同的IO組。表16列出了此實(shí)施例的總體研究設(shè)計。表16.總體研究設(shè)計<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>vORF2-分離的病毒ORF2;rORF2-重組桿狀病毒表達(dá)的ORF2:KV或殺死的全細(xì)胞病毒=在合適細(xì)胞培養(yǎng)物中培養(yǎng)的PCV2病毒給予各組的疫苗制劑如下以lx2ml劑量給予第l組的PCV2疫苗l是以IMS1314為佐劑的高劑量(16|ng/2ml劑量)滅活的重組ORF2抗原(16嗎rORF2-IMS1314)。以1x2ml劑量給予第2組的PCV2疫苗2是以卡巴浦爾為佐劑的高劑量(16嗎/2ml劑量)部分純化的VIDOR-1產(chǎn)生的PCV2ORF2抗原(16嗎vORF2-卡巴浦爾)。以1><2ml劑量給予第3組的PCV2疫苗3是以卡巴浦爾為佐劑的高劑量(16pg/2ml劑量)滅活重組ORF2抗原(16嗎rORF2-卡巴浦爾)。以blml劑量給予第4組的PCV2疫苗4是以卡巴浦爾為佐劑的高劑量(16嗎/1ml劑量)部分純化的VIDOR-1產(chǎn)生的PCV2ORF2抗原(16嗎vORF2-卡巴浦爾)。以lx2ml劑量給予第5組的疫苗編號5是以卡巴浦爾為佐劑的4嗎/2ml劑量的滅活重組ORF2抗原(4嗎rORF2-卡巴浦爾)。以1><2ml劑量給予第6組的PCV2疫苗6是以卡巴浦爾為佐劑的1pg/2ml劑量的滅活重組ORF2抗原(1pgrORF2-卡巴浦爾)。以lx2ml劑量給予第7組的PCV2疫苗7是以卡巴浦爾為佐劑的低劑量(0.25嗎/2ml劑量)滅活重組ORF2抗原(0.25嗎rORF2-卡巴浦爾)。以1x2ml劑量給予第8組的PCV2疫苗8是以卡巴浦爾為佐劑的高劑量(滅活前效價〉8.0log/2ml劑量)常規(guī)滅活的死VIDOR-l產(chǎn)生的PCV2Struve抗原(〉8.01ogKV-卡巴浦爾)。在第0天，用指定疫苗治療第l-8組。在第14天第l-3組和第5-8組接受其各自疫苗的加強(qiáng)免疫。在第14天對未接受加強(qiáng)免疫的第4組檢測單一劑量16嗎vORF2-卡巴浦爾的效果。觀察小豬在接受兩次疫苗接種后有無不良反應(yīng)和注射部位反應(yīng)。第21天，將小豬轉(zhuǎn)移到第二研究地點(diǎn)，在此處的一個建筑物中分組飼養(yǎng)第l-9組，而在另一建筑物中單獨(dú)飼養(yǎng)第IO組。所有豬在第22和28天接受不完全弗氏佐劑乳化的鑰孔血藍(lán)素(KLH/ICFA)。第25天，用約41og強(qiáng)毒株P(guān)CV2病毒攻擊第l-9組。到第46天，攻擊對照組死亡的動物非常少。在嘗試免疫攻擊豬和提高PCV2攻擊病毒的毒力時，在第46天用INGELVAC⑧PRRSVMLV(豬生殖和呼吸道疫苗，修飾的活病毒)治療所有小組。收集攻擊之前和之后的血樣，進(jìn)行PCV2血清學(xué)分析。攻擊后，收集用于確定平均每日體重增量(ADWG)和觀察臨床癥狀的體重數(shù)據(jù)。第50天，對所有存活的豬處死后進(jìn)行尸檢，記錄總病損，對肺進(jìn)行病理學(xué)評分，用福爾馬林保存所選組織，用于隨后以免疫組織化學(xué)(IHC)檢測PCV2抗原。材料和方法這是在第0天以6-16日齡CDCD豬進(jìn)行的部分盲法疫苗接種-攻擊可行性研究。此研究所包括的母豬PCV2IFA效價應(yīng)^1:1000。此外，母豬的血清學(xué)狀態(tài)得自已知的PRRS-陰性畜群。檢測了十六頭(16)母豬的PCV2血清學(xué)狀態(tài)，所有這16頭(16)母豬的PCV2效價均$1000，將它們轉(zhuǎn)移到第一研究地點(diǎn)。通過剖腹產(chǎn)手術(shù)分娩150只小豬，在試驗前3天可用于此研究。在試驗前3天,將第一研究地點(diǎn)的150只CDCD豬稱重，用耳標(biāo)簽作標(biāo)記，根據(jù)體重分區(qū)，隨機(jī)分配到1-10組，如表16所示。收集所有豬的血樣。如果此研究采用了符合標(biāo)準(zhǔn)的任何受試動物但后來因某種原因而排除，則研究者和監(jiān)測者應(yīng)進(jìn)行商議，以確定最終分析中是否采用從該動物收集的數(shù)據(jù)。記錄編入小豬被排除的日期和排除理由。沒有排除符合加入標(biāo)準(zhǔn)、選擇用于本研究并轉(zhuǎn)移到第一研究地點(diǎn)的母豬。本研究沒有排除任何小豬，在終止前沒有從研究中去除任何受試動物。表17描述了本實(shí)施例中關(guān)鍵事項的時間框圖。表17.研究事項l研究曰~~l實(shí)際日期l研究事項I<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>存活期研究完成后，病理學(xué)家用免疫組織化學(xué)(IHC)檢測福爾馬林固定組織中的PCV2抗原，評價血樣的PCV2血清學(xué)變化，測定第25天-第50天的平均每日體重增量(ADWG)。在第一研究地點(diǎn)，在七間豬舍中分籠飼養(yǎng)動物，從出生飼養(yǎng)至大約11日齡(大約是研究的第0天)。各豬舍的設(shè)計相同，由層疊的單個不銹鋼籠組成，該設(shè)計可以將加熱和過濾的空氣單獨(dú)供應(yīng)給各分離單元。各豬舍分別有加熱和通風(fēng)裝置，從而防止豬舍之間空氣的交叉污染。在第二研究地點(diǎn)，在兩個不同的建筑物中飼養(yǎng)動物。在改造的養(yǎng)殖建筑物中單獨(dú)飼養(yǎng)第10組(嚴(yán)謹(jǐn)性陰性對照組)，在改造的母豬分娩建筑物(farrowingbuilding)中飼養(yǎng)第1-9組。在單獨(dú)豬圈中飼養(yǎng)各組(每圈14-15頭豬)，各豬圈為每頭豬提供約3.0平方英尺空間。第2、4和8組圈養(yǎng)在走道一側(cè)的三個相鄰豬圈中，第1、3、5、6、7和9組圈養(yǎng)在走道另一側(cè)的六個相鄰豬圈中。由于研究監(jiān)測者的關(guān)心，將各組間分隔開，給予第2、4和8組的疫苗沒有完全滅活。各豬圈位于具有塑料漏縫地板的高架平臺上。豬圈下的地坑用作糞便和廢物的儲存罐。各建筑物具有其自身獨(dú)立的加熱和通風(fēng)系統(tǒng)，建筑物之間空氣交叉污染的可能性很小。在第一研究地點(diǎn)，從出生至約3周齡，給小豬飼喂特制的奶飼料。到第19天(約4'/2周齡)，所有小豬都進(jìn)食特制的固體混合飼料。在第二研究地點(diǎn)，隨意給所有小豬飼喂適合其年齡和體重的定制不含藥物的市售混合飼料。在兩個研究地點(diǎn)，可隨意飲水。在第19、20和21天用l.OmLNAXCEL,IM治療所有受試豬，兩側(cè)臀部交替注射。此外，第10天用0.5mLNAXCELIM治療11號豬(第1組)，第10天用1mL青霉素和1mLPREDEF2X治療13號豬(第1組0)，第11天用1.0mLNAXCELIM治療4號豬(第9組)，第14天因為各種健康原因用1.0mLNAXCEL⑧分別治療1號豬(第1組)、4號豬和11號豬。在兩處研究地點(diǎn)，豬都處在獸醫(yī)照料下。在試驗前3天進(jìn)行動物體檢，將結(jié)果記錄于體檢記錄表中。通過第0天的觀察確定，所有動物在疫苗接種前健康和營養(yǎng)狀況良好。攻擊前觀察到所有受試動物的健康和營養(yǎng)狀況良好。以歸還(rendering)治療畜體和組織。在動物治療記錄上記載研究動物的最終治療。第0天和第14天，分配到第1-3和5-8組的豬分別接受2.0mL指定的PCV2疫苗1-4，分別用無菌3.0mLLuer-lock注射器和無菌20gx'/2"針頭將其IM注射于右側(cè)和左側(cè)頸部。分配到第4組的豬僅在第0天接受1.0mLPCV2疫苗2，用無菌3.0mLLuer-lock注射器和無菌20gxy2"針頭將其IM注射在右側(cè)頸部。第22天，所有受試豬接受2.0mLKLH/ICFA，用無菌3.0mLLuer-lock注射器和無菌20gxl"針頭將其IM注射在左側(cè)頸部。第28天，所有受試豬接受2.0mLKLH/ICFA，用無菌3.0mLLuer-lock注射器和無菌20gxl"針頭將其IM注射在右側(cè)臀部。第25天，分配到第1-9組的豬接受1.0mLPCV2ISUVDL攻擊病毒株(3.98log10TCID5。/mL)，用無菌3.0mLLuer-lock注射器和無菌20gxl"針頭將其IM注射在右側(cè)頸部。用無菌3.0mLLuer-lock注射器和鼻導(dǎo)管將另外1.0mL同一病毒株IN給予各頭豬(每鼻孔0.5mL)。第46天，所有受試豬都接受2.0mLINGELVACPRRSMLV，用無菌3.0mLLuer-lock注射器和無菌20gxl"針頭將其IM注射在右側(cè)頸部。給予PRRSVMLV是為了試圖提高PCV2攻擊病毒株的毒力。在試驗前3天和第0天至第21天每日觀察受試豬的總體健康狀況和不良反應(yīng)。對各頭豬的正?；虍惓Ｐ袨椤⒑粑蚩人赃M(jìn)行評分。在臨床觀察記錄上記錄觀察結(jié)果。自第0天至第7天觀察所有受試豬，還觀察第7組第14-21天的注射部位反應(yīng)。在試驗前3天、第25天和第50天，或在攻擊后發(fā)現(xiàn)豬死亡的那天用校準(zhǔn)天平稱取各豬的體重，確定平均每日體重增量。在體重表上記錄體重。利用試驗前3天的體重將豬分區(qū)，然后隨機(jī)分組。利用第25天和第50天的體重數(shù)據(jù)確定這些時間點(diǎn)期間各豬的平均每日體重增量(ADWG)。對于攻擊后和第50天前死亡的豬，調(diào)整ADWG，以代表第25天至死亡日的ADWG。為了測定PCV2血清學(xué)變化，在試驗前3天和第14天，從各小豬的眼窩靜脈竇收集靜脈全血。對于各小豬，通過將無菌毛細(xì)管插入一只眼睛的內(nèi)眼角并將大約3.0mL全血放入4.0mL血清分離管(SST)中，從眼窩靜脈竇收集血液。在第25、32和50天，用無菌20gxi;/2"Vacutainer⑧針頭(BectonDickinson&Company,FranklinLakes,新澤西州)、Vacutainer(g)針托和13mLSST從上腔靜脈收集各豬的靜脈全血。在樣品收集記錄上記錄各時間點(diǎn)的血液收集。使各SST中的血液凝結(jié)，然后，離心各SST，收獲血清。將收獲的血清轉(zhuǎn)移到無菌有蓋試管(snaptube)中，儲存于-70士10'C,直到將來進(jìn)行測試。由BIVI-R&D職員檢測血清樣品中是否存在PCV2抗體。在第22天至第50天每天觀察一次豬的臨床癥狀，并對正?；虍惓Ｐ袨?、呼吸或咳嗽進(jìn)行評分。在臨床觀察記錄上記錄臨床觀察結(jié)果。46號豬(第1組)和98號豬(第9組)在第一研究地點(diǎn)死亡。二者死亡都被歸類為出血性死亡，沒有對這兩頭豬進(jìn)行尸檢。在第二研究地點(diǎn)，對攻擊后和第50天之前死亡的豬和第50天實(shí)施安樂死的豬進(jìn)行尸檢。觀察有無任何總病損發(fā)生，在尸檢報告表上記錄有病損的肺葉百分?jǐn)?shù)。將第二研究地點(diǎn)尸檢的各頭豬的扁桃腺、肺、心臟和腸系膜淋巴結(jié)的組織樣品放入一個裝有10%緩沖福爾馬林液的容器中；同時將上述同一器官的另一份組織樣品放入Whirl-pak(M-TechDiagnosticsLtd.,Thelwall，UK)中，將各Whirl-pak⑧置于冰上。適當(dāng)?shù)貥?biāo)記各容器。在尸檢報告表上記錄樣品收集。然后，對福爾馬林固定的組織樣品和診斷請求表進(jìn)行IHC測試。按照接受樣品、制備樣品和玻片以及染色技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗室步驟進(jìn)行IHC測試。用冰盒將Whirl-paks⑧中的新鮮組織運(yùn)輸?shù)窖芯繖z測處儲存(-70il(TC)待用。病理學(xué)家用IHC檢測福爾馬林固定組織中的PCV2，并用以下評分系統(tǒng)評分0=無；1=少量陽性染色，幾個位點(diǎn)；2=中等陽性染色，多個位點(diǎn)；3=大量陽性染色，散布于整個組織中。出于分析目的，評分為0認(rèn)為是"陰性"，評分大于0認(rèn)為是"陽性"。結(jié)果本實(shí)施例的結(jié)果見下。應(yīng)注意，46和98號豬分別在第14天和第25天死亡。這些死亡歸類為出血性死亡。第15天11號豬(第1組)氣喘伴呼吸急促。另外，在此觀察期間所有豬的行為、呼吸和咳嗽都正常，在任何小組中都沒有觀察到全身不良反應(yīng)。第0天接種疫苗后沒有觀察到注射部位反應(yīng)。第14天接種疫苗后，第15天第1組14頭豬中7頭(50.0%)發(fā)生腫脹，評分為"2"。第1組14頭豬中4頭(28.6%)在第16天仍然腫脹，評分為"2"。其他組在疫苗接種后沒有發(fā)生注射部位反應(yīng)。平均每日體重增量(ADWG)結(jié)果見表18。將死于出血的46和98號豬排除在小組結(jié)果之外。接受一個劑量16iugvORF2-卡巴浦爾的第4組的ADWG最高(1.16士0.26磅/天)，其次是ADWG范圍在1.07±0.23磅/天至1.11±0.26磅/天的第1、2、3、5、6和10組。第9組的ADWG最低(0.88士0.29磅/天)，其次是ADWG分別為0.93±0.33磅/天和0.99±0.44磅/天的第8組和第7組。表18.組間平均每日體重增量(ADWG)的小結(jié)<table>complextableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table>vORF2-分離的病毒ORF2;rORF2-重組桿狀病毒表達(dá)的ORF2:KV或殺死的全細(xì)胞病毒=在合適細(xì)胞培養(yǎng)物中培養(yǎng)的PCV2病毒PCV2血清學(xué)結(jié)果見下表19。在試驗前3天所有十組都是PCV2血清陰性。第14天，所有十組的PCV2效價仍然很低(范圍是50-113)。第25天，接受全細(xì)胞病毒死疫苗的第8組PCV2效價最高(4617)，其次是接受16pgvORF2-卡巴浦爾的第2組，接受一次劑量16貼vORF2-卡巴浦爾的第4組和接受16pgrORF2-卡巴浦爾的第3組，其效價分別為2507、1920和1503。第32天(攻擊一周后)，第1-6組和第8組的效價為2360-7619;而第7組(0.25嗎rORF2-卡巴浦爾)、第9組(攻擊對照)和第10組(嚴(yán)謹(jǐn)性陰性對照)的效價分別為382、129和78。第50天(尸檢日)，所有十組都顯示出PCV2高效價G1257)。第25、32和50天，接受兩次劑量16pgrORF2-卡巴浦爾的第3組的抗體效價高于接受兩次劑量16i!grORF2-IMS1314的第1組。第25、32禾B50天，接受兩次劑量16pgvORF2的第2組的抗體效價高于僅接受一次劑量同一疫苗的第4組。分別接受16、4、1禾B0.25ng水平遞減的rORF2-卡巴浦爾的第3、5、6、7組，在第25天和第32天顯示出相應(yīng)地遞減的抗體效價。表19.組間PCV2IFA效價的小結(jié)<table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table>vORF2-分離的病毒ORF2;rORF2-重組桿狀病毒表達(dá)的ORF2;KV或殺死的全細(xì)胞病毒=在合適細(xì)胞培養(yǎng)物中培養(yǎng)的PCV2病毒*出于計算目的，將IFA效價S100指定為效價"50";將IFA效價^6400指定為效價"12,800"。**攻擊日***尸檢日攻擊后臨床觀察結(jié)果見下。表20包括對異常行為、異常呼吸、咳嗽和腹瀉的觀察。表21包括組間臨床癥狀總體發(fā)生率的小結(jié)結(jié)果，表22包括攻擊后組間死亡率的小結(jié)結(jié)果。對于接受16pgrORF2-IMS1314(第1組)、16pgrORF2-卡巴浦爾(第3組)、1)igrORF2-卡巴浦爾(第6組)、0.25pgrORF2-卡巴浦爾(第7組)的豬和攻擊對照組(第9組)的豬，攻擊后異常行為、呼吸和咳嗽的發(fā)生率低。接受16pgvORF2-卡巴浦爾(第2組)、一次劑量16ngvORF2-卡巴浦爾(第4組)、4pgrORF2-卡巴浦爾(第5組)、>8logKV-卡巴浦爾(第8組)的豬和嚴(yán)謹(jǐn)性陰性對照組(第10組)的豬的攻擊后異常行為、呼吸和咳嗽的發(fā)生率為零。臨床癥狀總體發(fā)生率因組而異。接受16pgvORF2-卡巴浦爾(第2組)、一次劑量16叫vORF2-卡巴浦爾(第4組)的豬和嚴(yán)謹(jǐn)性陰性對照組(第10組)的豬發(fā)生率為0%;接受16嗎rORF2-卡巴浦爾(第3組)和1pgrORF2-卡巴浦爾(第6組)的豬發(fā)生率為6.7%;接受16pgrORF2-IMS1314(第1組)的豬總體發(fā)生率為7.1%;接受4pgrORF2-卡巴浦爾(第5組)、0.25pgrORF2-卡巴浦爾(第7組)和>8logKV疫苗的豬發(fā)生率為13.3%;攻擊對照組(第9組)的豬的發(fā)生率為14.3%?？傮w死亡率也因組而異。接受2次劑量KV疫苗的第8組死亡率最高，為20.0%;其次是攻擊對照組第9組和接受0.25)igrORF2-卡巴浦爾的第7組，其死亡率分別為14.3%和13.3%。接受1次劑量16pgvORF2-卡巴浦爾的第4組的死亡率為6.7%。所有其它組，即第i、2、3、5、6和10組的死亡率為0%。表20.攻擊后組間異常行為、異常呼吸和咳嗽的觀察結(jié)果小結(jié)<table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table>1各組中顯示有任何異常行為至少一天的豬總數(shù)2各組中顯示有任何異常呼吸至少一天的豬總數(shù)3各組中顯示有咳嗽至少一天的豬總數(shù)表21.攻擊后組間臨床癥狀總體發(fā)生率的小結(jié)<table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table>vORF2-分離的病毒ORF2;rORF2-重組桿狀病毒表達(dá)的ORF2;KV或殺死的全細(xì)胞病毒=在合適細(xì)胞培養(yǎng)物中培養(yǎng)的PCV2病毒1各組中顯示有任何臨床癥狀至少一天的豬總數(shù)表22.攻擊后組間死亡率的小結(jié)<table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table>vORF2-分離的病毒ORF2;rORF2-重組桿狀病毒表達(dá)的ORF2;KV或殺死的全細(xì)胞病毒=在合適細(xì)胞培養(yǎng)物中培養(yǎng)的PCV2病毒組間平均肺病損百分?jǐn)?shù)和推測診斷的小結(jié)見下表23。攻擊對照組第9組的肺病損百分?jǐn)?shù)最高，其平均值為10.81±23.27%，其次是接受0.25pgrORP2-卡巴浦爾的第7組，其平均值為6.57±24.74%，接受4pgrORF2-卡巴浦爾的第5組，其平均值為2.88±8.88%，接受KV疫苗的第8組，其平均值為2.01±4.98%。其余六組的平均肺病損百分?jǐn)?shù)較低，范圍是0.11±0.38%至0、90±0.15%。推測診斷為肺炎因組而異。接受兩次劑量16pgrORF2-卡巴浦爾的第3組推測診斷為肺炎的最低，為13.3%。攻擊對照組第9組50%推測診斷為肺炎，其次是嚴(yán)謹(jǐn)性陰性對照組第10組和接受兩次劑量16pgvORF2-卡巴浦爾的第2組，分別有46.7%和40%推測診斷為肺炎。第l、2、3、5、9和10組中被推測診斷為PCV2感染的占0。/。；而接受兩次劑量KV疫苗的第8組中推測診斷為PCV2感染的比率最高，為20%。接受兩次劑量0.25ngrORF2-卡巴浦爾的第7組和接受一次劑量16iagvORF2-卡巴浦爾的第4組中推測診斷為PCV2感染的分別占各組的13.3%和6.7%。僅有第7組的一頭豬(6.7%)診斷為胃潰瘍；而另外9組都沒有胃潰瘍。<table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table>vORF2-分離的病毒ORF2;rORF2-重組桿狀病毒表達(dá)的ORF2;KV或殺死的全細(xì)胞病毒=在合適細(xì)胞培養(yǎng)物中培養(yǎng)的PCV2病毒組間IHC陽性發(fā)生率結(jié)果的小結(jié)見下表24。第1組(16pgrORF2-IMS1314)的IHC陽性結(jié)果比率最低，其中0。/。的豬為PCV2陽性，其次是第2組(16嗎vORF2-卡巴浦爾)和第4組(一次劑量的16(igvORF2-卡巴浦爾)，它們的IHC比率分別為6.7。/。和13.30/0。攻擊對照組第9組的IHC陽性發(fā)生率最高，其中100y。的豬為PCV2陽性，其次是嚴(yán)謹(jǐn)性陰性對照組第10組和第8組(KV疫苗)，分別有93.3yo和80。/。的豬為PCV2陽性。表24.組間IHC陽'<table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table>vORF2-分離的病毒ORF2;rORF2-重組桿狀病毒表達(dá)的ORF2;KV或殺死的全細(xì)胞病毒=在合適細(xì)胞培養(yǎng)物中培養(yǎng)的PCV2病毒討論在本實(shí)施例中評價了七種PCV2疫苗，包括以IMS1314為佐劑的高劑量(16嗎)rORF2抗原給予兩次，以卡巴浦爾為佐劑的高劑量(16pg)vORF2抗原給予一組豬一次、給予第二組豬兩次，以卡巴浦爾為佐劑的高劑量(16嗎)rORF2抗原給予兩次，以卡巴浦爾為佐劑的4嗎劑量的rORF2抗原給予兩次，以卡巴浦爾為佐劑的1嗎劑量的rORF2抗原給予兩次，以卡巴浦爾為佐劑的低劑量(0.25嗎)rORF2抗原給予兩次，和以卡巴浦爾為佐劑的高劑量(〉81og)全細(xì)胞PCV2死疫苗?？傮w來看，接受兩次劑量16嗎rORF2-IMS1314的第1組表現(xiàn)略好于接受含卡巴浦爾佐劑的不同水平vORF2或rORF2抗原的疫苗的第2-7組，比接受兩次劑量的全細(xì)胞PCV2死疫苗的第8組好得多。第1組的ADWG第三高(1.80士0.30磅/天)，異常行為發(fā)生率最低(0%)，異常呼吸發(fā)生率最低(0%)，咳嗽發(fā)生率低(7.1%)，總體臨床癥狀發(fā)生率低(7.1%)，死亡率最低(0%)(與另外三組一致)，平均％肺病損比率第二低(0.15±0.34%)，肺炎比率第二低(21.4%)，陽性IHC組織發(fā)生率最低(0y。)。然而，第l組是觀察到有注射部位反應(yīng)的唯一一組，包括在第二次免疫接種1天后有50%接種者有注射部位反應(yīng)。給予第2-7組其它疫苗的表現(xiàn)優(yōu)于死疫苗，與給予第1組的疫苗幾乎同樣好。在所有疫苗組中，接受兩次劑量的以卡巴浦爾為佐劑的PCV2死疫苗的第8組結(jié)果最差。第8組的ADWG最低(0.93士0.33磅/天)，異常行為比率第二高(6.7%)，異常呼吸比率最高(6.7%)，總體臨床癥狀發(fā)生率最高(13.3%)(與另外三組一致)，在所有組中死亡率最高(20%)，在所有疫苗組中陽性IHC比率最高(80%)。要關(guān)注的是，全細(xì)胞PCV2死疫苗在給予第8組之前可能未完全滅活，這可以解釋該組的結(jié)果為何差。不幸的是，未能獲得明確數(shù)據(jù)來證實(shí)這種考慮?？傊?，在本實(shí)施例內(nèi)容中，常規(guī)PCV2死疫苗不能幫助減輕PCV2相關(guān)性疾病。如前所述，沒有與測試疫苗相關(guān)的不良反應(yīng)，除了以IMS1314為佐劑的疫苗外。用IMS1314配制的疫苗第二次接種1天后，在50.0%豬中觀察到有注射部位反應(yīng)，第二次接種2天后，在28.6%豬中觀察到有注射部位反應(yīng)。在接受以卡巴浦爾為佐劑的疫苗的任何豬中都沒有觀察到這種反應(yīng)。包括用以IMS1314為佐劑的疫苗接種豬的進(jìn)一步研究應(yīng)該繼續(xù)嚴(yán)密監(jiān)測豬的注射部位反應(yīng)。試驗前3天，所有豬都是PCV2血清陰性，第14天僅第2組的效價大于100。第25天(攻擊日)，第8組的PCV2抗體效價最高(4619)，其次是第2組(2507)。除第7、9和10組外，所有組到第32天都顯示了強(qiáng)烈的抗體應(yīng)答。到第50天，包括第7、9和IO組在內(nèi)的所有組都顯示了強(qiáng)烈的抗體應(yīng)答。晚期PCV2感染和隨后發(fā)生PMWS的標(biāo)志之一是斷奶豬的生長阻滯，在嚴(yán)重的情況下，觀察到體重下降。各組的平均每日體重增量是證明生長阻滯或體重下降的定量方法。本實(shí)施例中，組間ADWG沒有大的差異。第8組的ADWG最低，為0.88±0.29磅/天，而第4組的ADWG最高，為1.16±0.26磅/天。在本研究內(nèi)容中，各組間沒有足夠的差異(顯示)將來的疫苗效力判斷可以ADWG為基礎(chǔ)。除了體重下降以外，呼吸困難、嗜睡、皮膚蒼白，有時還有黃疸都是PMWS相關(guān)的臨床癥狀。本實(shí)施例中，各組未經(jīng)常觀察到異常行為和異常呼吸和咳嗽。如本研究所證明的那樣，此攻擊模型和攻擊毒株不導(dǎo)致壓倒性臨床癥狀，故這不是作為疫苗效力基礎(chǔ)的主要參數(shù)?？傮w來看，本實(shí)施例中死亡率不高，攻擊對照組死亡率不高使此參數(shù)作為疫苗效力(判斷)基礎(chǔ)受到限制。在第46天之前，第4組和第7組的15頭豬中，各有一頭豬死亡，第9組的15頭豬中有兩頭死亡，第8組的15頭豬中有三頭死亡。由于攻擊對照組第9組并未顯示PCV2臨床癥狀到第46天該組僅有兩頭死亡，所以在第46天將豬呼吸和生殖道綜合征病毒(PRRSV)MLV疫苗給予所有豬。較早的研究利用INGELVACPRRSMLV作為免疫刺激劑來引發(fā)PCV2-相關(guān)性PMWS疾病，故這些早期研究中死亡率較高。第46天給予PRRS疫苗后不久，發(fā)生兩例死亡第46天第4組中一頭死亡，第47天第7組中一頭死亡，這些死亡可能與給予PRRS疫苗無關(guān)。到第50天，接受兩次劑量死疫苗的第8組死亡率最高(20%)，其次是第9組(攻擊對照)和第7組(0.25嗎rORF2-卡巴浦爾)，死亡率分別為14.3%和13.3%?？傮w來看，在本實(shí)施例的攻擊后觀察期的晚期將PRRS疫苗給予該攻擊模型不顯著提高死亡率。PCV2感染后繼發(fā)PMWS的豬總病損通常包括全身性淋巴結(jié)病與以下一種或多種疾病(l)間質(zhì)性肺炎伴有小葉間水腫、(2)皮膚蒼白或黃疸、(3)斑點(diǎn)狀肝萎縮、(4)胃潰瘍和(5)腎炎。但尸檢時(第50天)，在任何小組中都沒有觀察到黃疸、肝炎和腎炎。第7組一頭豬觀察到胃潰瘍，但沒有專門檢査淋巴結(jié)病。根據(jù)存在與PCV2感染相符的病損，三組中至少有一頭豬推測診斷有PCV2(PMWS)感染。接受兩次劑量死疫苗的第8組有20%推測診斷有PCV2感染，而第7組和第4組分別有13.3%和6.7M推測診斷有PCV2感染。尸檢時平均％肺病損評分因組而異。第l、2、3、4、6和10組的％肺病損評分低，范圍是0.11±0.38%至0.90±0.15%。不出所料，攻擊對照組第9組的平均％肺病損評分最高(10.81±23.27%)。在這四組中，由于各組中有1-3頭豬的肺病損評分非常高，所以提高了平均％肺病損評分。這種肺病損是紅色/紫色和緊實(shí)的。一般將與PMWS相關(guān)的肺病損描述為棕褐色、非塌陷伴小葉間水腫。本研究觀察到的肺病損與PCV2感染無關(guān)，或者可能已存在第二種肺感染因子。在本研究內(nèi)容中，M肺病損評分可能不能真實(shí)衡量PCV2引起的肺感染量。同樣，也可能過度利用了肺炎的推測診斷。用患有肺炎的推測診斷列出了發(fā)生肺病損(一些發(fā)生率少至0.10%)的豬。本實(shí)施例中，就作為疫苗效力判斷基礎(chǔ)的總病損率和％肺病損而言，各組之間沒有足夠差異。IHC結(jié)果顯示各組之間有最大差異。第1組(16嗎rORF2-IMS1314)的PCV2抗原陽性IHC結(jié)果最低(0%);而第9組和第10組的陽性IHC結(jié)果最高，發(fā)生率分別為100%和93.3%。分別接受以卡巴浦爾為佐劑的16、4、l或0.25嗎rORF2抗原的第3、5、6和7組IHC陽性比率分別為20%、20%、40%和46.7%。接受兩次劑量的以卡巴浦爾為佐劑的16pgvORF2的第2組IHC陽性比率為6.7%，僅接受一次劑量同一疫苗的第4組IHC陽性比率為13.3%。事實(shí)上，由于此測試具有客觀性以及IHC結(jié)果與預(yù)計結(jié)果相關(guān)，故IHC檢測可能是作為疫苗效力判斷基礎(chǔ)的最佳參數(shù)之一。因此，本發(fā)明一方面是確定了面對PCV2攻擊的CDCD豬模型中以卡巴浦爾為佐劑的PCV2rORF2抗原的最小保護(hù)劑量(MPD)。第3、5、6和7組各自接受兩次劑量的以卡巴浦爾為佐劑的rORF2抗原，但rORF2抗原水平因組而異。第3、5、6和7組分別各自接受16、4、1或0.25pgrORF2抗原。通常，降低rORF2抗原水平會降低PCV2抗體效價，而提高死亡率、平均％肺病損和IHC陽性組織發(fā)生率。在接受不同水平rORF2-卡巴浦爾的四組中，分別接受兩次劑量的16或4嗎rORF2抗原的第3組和第5組各自的IHC陽性比率僅為20%，各自的抗體效價相似。總體來看，根據(jù)IHC陽性結(jié)果，給予兩次rORF2抗原時最小保護(hù)劑量約為4pg。本發(fā)明另一方面評價了重組(rORF2)和VIDOR-1(vORF2)PCV2抗原的抗原性。第2組接受兩次劑量16嗎vORF2，第3組接受兩次劑量16嗎rORF2。這兩種疫苗皆以卡巴浦爾為佐劑。發(fā)現(xiàn)這兩種疫苗是安全的，死亡率為0%。第25天第2組的PCV2抗體效價為2507，而第3組的PCV2抗體效價為1503。第3組的平均％肺病損評分低于第2組(0.11±0.38%與0.90士0.15%)，但第2組的IHC陽性發(fā)生率低于第3組(6.7%與20%)?？傊?，兩種疫苗的抗原性相似，但vORF2所伴有的IHC結(jié)果略好。本發(fā)明又一方面測定了兩種不同佐劑(卡巴浦爾和IMS1314)的合適性。第1組和第3組都接受兩次劑量16pgrORF2抗原的疫苗，但第1組接受以IMS1314為佐劑的抗原，而第3組接受以卡巴浦爾為佐劑的抗原。兩組的ADWG基本相同，攻擊后臨床癥狀發(fā)生率基本相同，死亡率相同，平均％肺病損基本相同；但第1組的IHC陽性比率為0%，而第3組的IHC陽性比率為20。/。。然而，第25、32和50天，接受以卡巴浦爾為佐劑的抗原的第3組的IFATPCV2效價高于接受以IMS1314為佐劑的抗原的第1組。總體來看，雖然以IMS1314為佐劑的PCV2疫苗提供較佳的IHC結(jié)果，但對PCV2感染提供的保護(hù)力并非顯著更好，而且誘導(dǎo)注射部位反應(yīng)。而以卡巴浦爾為佐劑的PCV2疫苗表現(xiàn)幾乎與以IMS1314為佐劑的疫苗一樣，但不伴有任何不良反應(yīng)。在本發(fā)明的又一方面，確定了PCV2ORF2的1個劑量為lml產(chǎn)品的可行性。在第0天，第2組和第4組都接受以卡巴浦爾為佐劑的16嗎vORF2疫苗，但第14天，第2組接受第二個劑量。與第2組相比，第4組的ADWG略高、平均％肺病損較低，但在第25、32和50天第2組的IFATPCV2效價較高，IHC陽性組織發(fā)生率略低。這兩組的所有其它結(jié)果都相似?？傊?，以卡巴浦爾為佐劑的一次劑量的vORF2的表現(xiàn)與同一疫苗兩次劑量相似。權(quán)利要求1.一種回收PCV2的開放閱讀框2表達(dá)的重組蛋白的方法，所述方法包括以下步驟A)將所述PCV2的重組開放閱讀框2克隆入轉(zhuǎn)運(yùn)載體中；B)將所述轉(zhuǎn)運(yùn)載體中含有所述重組開放閱讀框2的部分轉(zhuǎn)染入病毒中；C)用所述病毒感染培養(yǎng)基中的細(xì)胞；D)使所述病毒由所述開放閱讀框2表達(dá)所述蛋白；E)分離細(xì)胞與上清液中的所述載體；和F)回收所述上清液中所述開放閱讀框2表達(dá)的蛋白。2.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述方法還包括由PCV2毒株擴(kuò)增所述開放閱讀框2，然后將所述開放閱讀框克隆入所述轉(zhuǎn)運(yùn)載體的步驟。3.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述重組開放閱讀框2還包含選自5'Kozak序列、3'五co/H位點(diǎn)的序列或其組合。4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述5'Kozak序列包含SEQIDNO:1。5.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述3'五coiH位點(diǎn)包含SEQIDNO:2。6.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述PCV2開放閱讀框包含SEQIDNO:4。7.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述重組蛋白包含SEQIDNO:6。8.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基包括無血清昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基。9.如權(quán)利要求l所述的方法，還包括以下步驟i)在步驟A之前，將所述擴(kuò)增的開放閱讀框2克隆入第一載體；ii)從所述第一載體上切下所述開放閱讀框2;和iii)將所述切下的開放閱讀框2用于步驟A。10.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞包括SF+細(xì)胞。11.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述病毒包括桿狀病毒。12.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)染部分包括SEQIDNO:4。13.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，用所述病毒感染細(xì)胞至少5天后回收所述上清液中的所述開放閱讀框2蛋白。14.一種制備引發(fā)對PCV2免疫應(yīng)答的組合物的方法，所述方法包括以下步驟:i)將一構(gòu)建物轉(zhuǎn)染入病毒中，所述構(gòu)建物包含PCV2開放閱讀框2的重組DNA;ii)用所述轉(zhuǎn)染的病毒感染細(xì)胞，在生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細(xì)胞；iii)使所述病毒由所述開放閱讀框2表達(dá)所述重組蛋白；iv)回收上清液中所述表達(dá)的開放閱讀框2蛋白；和v)將所述回收蛋白與合適佐劑或其它藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體或賦形劑混合。15.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，所述方法還包括由轉(zhuǎn)運(yùn)載體中獲得所述構(gòu)建物的步驟。16.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，所述方法還包括由PCV2毒株擴(kuò)增所述開放閱讀框2，然后將所述開放閱讀框2克隆入所述轉(zhuǎn)運(yùn)載體的步驟。17.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，所述重組開放閱讀框2還包含選自5'Kozak序列、3'￡co/l位點(diǎn)的序列或其組合。18.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述5'Kozak序列包含SEQIDNO:1。19.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述3'五coil位點(diǎn)包含SEQIDNO:2。20.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，所述PCV2開放閱讀框2包含SEQIDNO:4。21.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，所述重組蛋白包含SEQIDNO:6。22.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基包括無血清昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基。23.如權(quán)利要求16所述的方法，還包括以下步驟i)將所述擴(kuò)增的開放閱讀框2克隆入第一載體中；ii)從所述第一載體上切下所述開放閱讀框2;和iii)用所述切下的開放閱讀框2克隆入所述轉(zhuǎn)運(yùn)載體中。24.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞包括SF+細(xì)胞。25.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，所述病毒包括桿狀病毒。26.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)染構(gòu)建物包含SEQIDNO:4。27.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，用所述病毒感染所述細(xì)胞至少5天后回收所述開放閱讀框2蛋白。28.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，所述回收步驟還包括使所述培養(yǎng)基與所述細(xì)胞和細(xì)胞碎片相分離的步驟。29.如權(quán)利要求28所述的方法，其特征在于，所述分離步驟包括通過孔徑范圍約0.45pM-l.O的濾器過濾所述細(xì)胞、細(xì)胞碎片和生長培養(yǎng)基的步驟。30.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，所述方法還包括滅活所述病毒，然后將所述回收的蛋白質(zhì)與合適佐劑混合的步驟。31.—種回收PCV2開放閱讀框2表達(dá)的蛋白的方法，所述方法包括以下步驟i)用含有所述開放閱讀框2的重組病毒載體感染培養(yǎng)基中生長的細(xì)胞；ii)使所述載體表達(dá)所述蛋白；和iii)回收上清液中表達(dá)的所述蛋白。32.如權(quán)利要求31所述的方法，其特征在于，所述回收在用所述病毒載體感染所述細(xì)胞至少5天后進(jìn)行。33.—種用權(quán)利要求l、14、31所述方法或其組合獲得的組合物。34.權(quán)利要求33所述組合物作為藥物的應(yīng)用。35.權(quán)利要求33所述組合物在制備預(yù)防PCV2感染的藥物中的應(yīng)用。36.—種生產(chǎn)檢測樣品中PCV2感染的診斷試劑盒的方法，所述方法包括i)用權(quán)利要求l、14、31所述方法或其組合產(chǎn)生重組蛋白；ii)和將所述重組蛋白包裝到合適容器中。37.如權(quán)利要求36所述的方法，還包括在包裝所述重組蛋白的容器中加入說明手冊的步驟。38.—種包含PCV20RF2蛋白或其免疫原性部分的免疫原性組合物，它能有效降低PCV2感染相關(guān)臨床癥狀的嚴(yán)重性，其中，所述免疫原性部分含有PCV2ORF2蛋白的至少IO個毗連氨基酸。39.如權(quán)利要求38所述的免疫原性組合物，其特征在于，所述PCV20RF2蛋白是i)含有選自序列SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:9、SEQIDNO:IO或SEQIDNO:ll序列的多肽；ii)與i)所述多肽至少80%同源的任何多肽，iii)i)和/或ii)所述多肽的任何免疫原性部分，iv)iii)所述的免疫原性部分，其含有SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:9、SEQIDNO:IO或SEQIDNO:11序列中的至少10個毗連氨基酸v)由含SEQIDNO:3或SEQIDNO:4序列的DNA所編碼的任何多肽。vi)由與v)所述多核苷酸至少80%同源的多核苷酸所編碼的任何多肽，vii)由v)和/或vi)所述多核苷酸編碼的多肽的任何免疫原性部分，viii)vii)所述的免疫原性部分，其中編碼所述免疫原性部分的多核苷酸包含SEQIDNO:3或SEQIDNO:4序列中所含的至少30個毗連核苷酸。40.如權(quán)利要求38所述的免疫原性組合物，還包含滅活的病毒載體和細(xì)胞培養(yǎng)物上清。41.如權(quán)利要求40所述的免疫原性組合物，其特征在于，所述滅活的病毒載體是編碼PCV2ORF2蛋白的重組桿狀病毒。42.如權(quán)利要求40所述的免疫原性組合物，其特征在于，所述組合物包含BEI。43.如權(quán)利要求42所述的免疫原性組合物，其特征在于，所述組合物包含硫代硫酸鈉。44.如權(quán)利要求39所述的免疫原性組合物，包含選自下組的其它成分運(yùn)載體、佐劑、培養(yǎng)基、病毒滅活劑、稀釋劑、等滲劑、免疫調(diào)節(jié)劑、抗生素和其組合。45.如權(quán)利要求44所述的免疫原性組合物，其特征在于，所述組合物含有佐劑，優(yōu)選卡巴浦爾。46.如權(quán)利要求45所述的免疫原性組合物，其特征在于，所述組合物含有藥學(xué)上可接受的鹽，優(yōu)選鹽水。47.如權(quán)利要求38所述的免疫原性組合物，其特征在于，所述組合物含有至少0.2mcg/mlPCV2ORF2蛋白。48.如權(quán)利要求38所述的免疫原性組合物，其特征在于，所述組合物含有至少2|igPCV2ORF2蛋白。49.一種容器，其裝有至少一個劑量權(quán)利要求38所述免疫原性組合物，其中一個劑量包含至少2)tigPCV2ORF2蛋白。50.—種容器，其裝有10-250個劑量權(quán)利要求38所述免疫原性組合物，其中一個劑量包含至少2pgPCV2ORF2蛋白。51.如權(quán)利要求49所述的容器，還裝有抗微生物活性劑。52.—種藥盒，其裝有權(quán)利要求49所述容器和說明手冊，所述說明手冊包括將至少一個劑量的所述免疫原性組合物經(jīng)肌肉內(nèi)注射應(yīng)用于小豬，以減輕PCV2感染相關(guān)臨床癥狀嚴(yán)重性的信息。53.如權(quán)利要求52所述的藥盒，其特征在于，所述說明手冊包括第二次或再次給予至少一個劑量的所述免疫原性組合物的信息，所述第二次給藥或再次給藥在最后一次給藥前至少14天進(jìn)行。全文摘要本發(fā)明提供了回收2型豬圓環(huán)病毒開放閱讀框2表達(dá)的蛋白質(zhì)的改進(jìn)方法。該方法通常包括以下步驟將含有開放閱讀框2編碼序列的重組病毒轉(zhuǎn)染到培養(yǎng)基中生長的細(xì)胞中，使該病毒表達(dá)開放閱讀框2，回收上清液中表達(dá)的蛋白質(zhì)。應(yīng)該在感染細(xì)胞約5天后開始回收，以表達(dá)足量的重組蛋白表達(dá)并從細(xì)胞分泌到生長培養(yǎng)基中。這種方法避免了分離和回收細(xì)胞內(nèi)重組蛋白所需的昂貴和耗時的提取步驟。文檔編號C12Q1/68GK101180406SQ200580047741公開日2008年5月14日申請日期2005年12月29日優(yōu)先權(quán)日2004年12月30日發(fā)明者G·尼策爾,M·艾希梅厄,M·謝弗申請人:勃林格殷格翰動物保健有限公司