專利名稱：：賦予除草劑抗性的基因的制作方法賦予除草劑抗性的基因發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明提供了編碼5-烯醇丙酮酰莽草酸鹽-3-磷酸鹽(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate，EPSP)合酶的新穎基因及其變體。該基因及其變體可用于植物生物學(xué)、作物育種和植物細(xì)胞培養(yǎng)。發(fā)明背景通常被稱為草甘膦的N-膦酰曱基甘氨酸是重要的農(nóng)業(yè)化學(xué)品。草甘膦抑制將磷酸烯醇丙酮酸(PEP)和3-磷酰莽草酸(3-phosphoshikimicacid)轉(zhuǎn)化為5-烯醇丙酮酰-3-磷酰莽草酸的酶。對(duì)該酶(5-烯醇丙酮酰莽草酸鹽-3-磷酸鹽合酶，在本文中凈皮稱為"EPSP合酶")的抑制通過(guò)阻斷莽草酸鹽途徑殺死植物細(xì)胞，由此抑制芳香族氨基酸的生物合成。因?yàn)椴莞熟㈩惓輨┠芤种品枷阕灏被嵘锖铣桑运鼈儾粌H殺死植物細(xì)胞，還對(duì)細(xì)菌細(xì)胞有毒性。草甘膦抑制很多細(xì)菌EPSP合酶，由此對(duì)這些細(xì)菌有毒性。但是，某些細(xì)菌EPSP合酶具有對(duì)草甘膦的高度耐受性?？赏ㄟ^(guò)對(duì)植物細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，以表達(dá)抗草甘膦的細(xì)菌EPSP合酶，來(lái)生產(chǎn)對(duì)革甘膦毒性有抗性的植物細(xì)胞。尤其地，來(lái)自根癌農(nóng)桿菌(/^ro6fl"er/咖"邁e/"ac/e/2s)菌林CP4的細(xì)菌基因已用于在植物中表達(dá)之后對(duì)植物細(xì)胞賦予除草劑抗性。來(lái)自鼠傷寒沙門氏菌(5^/邁0/6//30^力^耵/咖)菌林CT7的經(jīng)突變EPSP合酶在細(xì)菌細(xì)胞中賦予草甘膦抗性，并且在植物細(xì)胞上賦予草甘膦抗性(美國(guó)專利號(hào)4，535，060、4，769，061和5，094，945)。但是，仍然需要其它的除草劑抗性基因。發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明提供了用于對(duì)細(xì)菌、植物、植物細(xì)胞、組織和種子賦予除草劑抗性的組合物和方法。組合物包括編碼除草劑抗性多肽的序列的核酸分子，包含這些核酸分子的載體，以及包含所述載體的宿主細(xì)胞。本發(fā)明提供了包含下述多肽的編碼序列的組合物，所述多肽賦予對(duì)草甘膦除草劑的抗性或耐受性，還提供了針對(duì)這些多肽的抗體。本發(fā)明的組合物包括編碼除草劑抗性多肽的合成核酸分子。編碼序列可用于DNA構(gòu)建體或表達(dá)盒，用于在生物體(包括微生物和植物)中轉(zhuǎn)化和表達(dá)。組合物還包含經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)菌、植物、植物細(xì)胞、組織和種子。此外，提供了生產(chǎn)下迷多肽的方法，所述多肽由本發(fā)明的合成核苷酸所編碼。特別地，提供了對(duì)應(yīng)于賦予除草劑抗性的核酸序列的經(jīng)分離核酸分子。此外，本發(fā)明包括對(duì)應(yīng)于所述多核苷酸的氨基酸序列。特別地，本發(fā)明提供了經(jīng)分離的核酸分子，其包含SEQIDNO:1或2所示的核苷酸序列、編碼SEQIDNO:3所示的氨基酸序列的核苷酸序列、以編號(hào)No.B-30804在細(xì)菌宿主中保藏的草甘膦抗性核苷酸序列，以及它們的變體和片段。與本發(fā)明的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列或與本發(fā)明的序列雜交的核苷酸序列也包括在本發(fā)明中。附圖簡(jiǎn)述圖1顯示了《i^8的核苷酸序列(SEQIDNO:1)。開放讀碼框從第296位核苷酸開始，在第1555位核苷酸結(jié)束(SEQIDNO:2)。圖2顯示了GRG8蛋白的氨基酸序列(SEQIDNO:3)。圖3顯示了對(duì)GRG8(SEQIDN0:3)、GRG8邁1畫(C22)(SEQIDN0:5)、GRG8m3—(N24)(SEQIDNO:9)、GRG8m2-(N15)(SEQIDNO:7)、GRG8m4_(Al)(SBQIDNO:11)、GRG8m5-(B2)(SEQIDNO:13)、GRG8m6-(B7)(SEQIDNO:15)、GRG8m7-(Bl1)(SEQIDNO:17)、GRG8m8-(CU)(SEQIDNO:19)、GRG8m9-(E3)卿IDN0:21)和GRG8mlO—(E4)(SEQIDNO:23)的氨基酸序列的比對(duì)。發(fā)明詳述現(xiàn)在將參考附圖，在下文中對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更完全的描述，附圖中顯示了一些但并非全部的發(fā)明實(shí)施方式。事實(shí)上，這些發(fā)明可以以很多不同的形式實(shí)施，其不應(yīng)當(dāng)被限制為本文示出的實(shí)施方式；其實(shí)，提供這些實(shí)施方式是為了使本公開文本滿足適用的法律要求。上下文中，相似的編號(hào)指相似的元件。對(duì)于上述發(fā)明所涉及的領(lǐng)域的技術(shù)人員(從前述說(shuō)明書和相關(guān)附圖的教導(dǎo)受益的)而言，能想到本文示出的本發(fā)明的很多改變和其它實(shí)施方式。因此，應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明不僅限于公開的特定實(shí)施方式，改變和其它實(shí)施方式也將被包括在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。雖然本文使用了特定的術(shù)語(yǔ)，但是它們僅用作普通描述，并非用于限制目的。本發(fā)明涉及在生物(特別是植物或植物細(xì)胞)中調(diào)控除草劑抗性的組合物和方法。所述方法包括用編碼本發(fā)明草甘膦抗性基因的核苷酸序列對(duì)生物加以轉(zhuǎn)化。本發(fā)明的核苷酸序列可用于制備展示出對(duì)除草劑草甘膦具有提高的耐受性的植物。因此，本發(fā)明提供了經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)菌、植物、植物細(xì)胞、植物組織和種子。組合物包括與微生物和植物中除草劑耐受性相關(guān)的核酸和蛋白質(zhì)，以及經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)菌、植物、植物組織和種子。本文公開了草甘膦抗性基因(gr^!)的核苷酸序列以及由此編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列。所述序列可用于構(gòu)建表達(dá)載體，以隨后轉(zhuǎn)化進(jìn)感興趣的植物，或者可用作為探針，用于分離其它草甘膦抗性基因，或者可用作為選擇標(biāo)記等。含有本發(fā)明的除草劑抗性核苷酸序列的質(zhì)粒于2004年12月21曰被保藏于AgriculturalResearchServiceCultureCollection,NorthernRegionalResearchLaboratory(NRRU，編號(hào)為No.廳LB-30804,永久保藏。該保藏物將按照布達(dá)佩斯條約關(guān)于國(guó)際承認(rèn)的用于專利程序目的的微生物保藏的規(guī)定被保持。該保藏物僅作為本領(lǐng)域技術(shù)人員提供便利之用，并非對(duì)按照35U.S.C.§112要求保藏物的認(rèn)可。"草甘膦"意指N-膦酰甲基甘氨酸(包括其任何鹽)的任何除草劑形式，以及其它能導(dǎo)致在植物中(//2W^")產(chǎn)生草甘膦陰離子的形式。"除草劑抗性蛋白"或從"編碼除草劑抗性的核酸分子，，產(chǎn)生的蛋白包括向細(xì)胞賦予下述能力的蛋白，所述能力是較之不表達(dá)該蛋白的細(xì)胞而言，能耐受更高濃度的除草劑，或者較之不表達(dá)該蛋白的細(xì)胞而言，在更長(zhǎng)的時(shí)間耐受某濃度的除草劑。"草甘膦抗性蛋白"包括向細(xì)胞賦予下述能力的蛋白，所述能力是較之不表達(dá)該蛋白的細(xì)胞而言，能耐受更高濃度的草甘膦，或者較之不表達(dá)該蛋白的細(xì)胞而言，在更長(zhǎng)的時(shí)間耐受某濃度的草甘膦。"耐受"或"耐受性"意指存活，或以不易與未經(jīng)處理細(xì)胞分辨的方式進(jìn)行重要的細(xì)胞功能，例如蛋白合成和呼吸。經(jīng)分離的核酸分子及其變體和片段本發(fā)明的一個(gè)方面涉及經(jīng)分離的核酸分子，其包含編碼除草劑抗性蛋白和多肽或其生物活性部分的核苷酸序列，以及涉及足以作為雜交探針以鑒定編碼除草劑抗性的核酸的核酸分子。本文中使用的術(shù)語(yǔ)"核酸分子"意在包括DNA分子(例如cDM或基因組DNA)和RNA分子(例如mRNA)以及使用核苷酸類似物產(chǎn)生的DM或RNA的類似物。核酸分子可以是單鏈的或雙鏈的。編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)的核苷酸序列包括SEQIDN0s:1和2所示的序列，以編號(hào)No.NRRLB-30804在細(xì)菌宿主中保藏的除草劑抗性核苷酸序列以;5L它們的變體、片段和互補(bǔ)序列。"互補(bǔ)序列"意指下述核苷酸序列，其與給定的核苷酸序列足夠互補(bǔ)，使得其可與給定的核苷酸序列雜交，由此形成穩(wěn)定雙鏈體。這些核苷酸序列編碼的除草劑抗性蛋白的相應(yīng)氨基酸序列示于SEQIDNO:3中。本發(fā)明還包括包含下述核普酸序列及其互補(bǔ)序列的核酸分子，所述核苷酸序列編碼部分長(zhǎng)度的除草刑抗性蛋白."經(jīng)分離的"或"經(jīng)純化的"核酸分子或蛋白質(zhì)或其生物活性部分，基本(substantially)不含其它細(xì)胞物質(zhì)或培養(yǎng)基(當(dāng)通過(guò)重組技術(shù)生產(chǎn)時(shí))，或基本不含化學(xué)品前體或其它化學(xué)品(當(dāng)化學(xué)合成時(shí))。優(yōu)選地，"經(jīng)分離的"核酸不含在獲得所述核酸的生物基因組DNA中天然連接于所述核酸側(cè)翼的序列(優(yōu)選地，蛋白質(zhì)編碼序列)(即，位于所述核酸5，和3，末端的序列)。就本發(fā)明的目的而言，當(dāng)用于指代核酸分子時(shí)，"經(jīng)分離的"排除了經(jīng)分離的染色體。例如，在多種實(shí)施方式中，經(jīng)分離的編碼草甘膦抗性的核酸分子可含有少于大約5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的下述核苷酸序列，所述核苷酸序列在獲得所述核酸的細(xì)胞的基因組DNA中天然連接于所述核酸側(cè)翼?；静缓?xì)胞物質(zhì)的除草劑抗性蛋白質(zhì)包括下述蛋白質(zhì)制劑，所述制劑具有少于大約30%、20°/。、10%或5%(以干重計(jì))的非除草劑抗性蛋白(也被稱為"污染性蛋白")。是上述編碼除草劑抗性的核苷酸序列的片段的核酸分子也包括在本發(fā)明內(nèi)。"片段"指編碼除草劑抗性蛋白的核苷酸片段。核苷酸序列的片段可編碼除草劑抗性蛋白的生物活性部分，或者其可以是使用下文公開的方法可用作雜交探針或PCR引物的片段。是除草劑抗性核苷酸序列的片段的核酸分子包含至少大約15、20、50、75、100、200、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550、1600、1650、1700、1750、1800、1850、1900、1950個(gè)連續(xù)的核苷酸，或者多達(dá)本文公開的編碼除草劑抗性的全長(zhǎng)核苷酸序列中存在的核苷酸數(shù)量(例如，對(duì)SEQIDNO:1而言，2000個(gè)核苷酸，對(duì)SEQIDNO:2而言，1257個(gè)核苷酸)。"連續(xù)的"核苷酸意指互相緊鄰的的核苷酸殘基。本發(fā)明的核苷酸序列的片段通常將編碼保留了全長(zhǎng)草甘膦抗性蛋白的生物活性(即，除草劑抗性活性)的蛋白片段。"保留了除草劑抗性活性"舉指該片段將具有本文中作為SEQIDNO:3公開的全長(zhǎng)草甘膦抗性蛋白的除草劑抗性活性的至少大約30%，至少大約50%，至少大約70%或者至少大約80%。用于測(cè)量除草劑抗性活性的方法是本領(lǐng)域公知的。見，例如，美國(guó)專利Nos.4，535，060和5,188,642，它們每份都通過(guò)引用整體并入本文。編碼本發(fā)明蛋白的生物活性部分的、除草劑抗性編碼核苷酸序列的片段將編碼至少大約15、25、30、50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400個(gè)連續(xù)的氨基酸，或者多達(dá)本發(fā)明的全長(zhǎng)除草劑抗性蛋白中存在的氨基酸的總數(shù)(例如對(duì)于本發(fā)明的蛋白質(zhì)而言，419個(gè)氰基酸)。本發(fā)明的除草劑抗性蛋白由與SEQIDNO:1或2的核苷酸序列足夠相同的核苷酸序列編碼。術(shù)語(yǔ)"足夠相同"意指采用標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)，使用本文所述的比對(duì)程序之一，較之參照序列具有至少大約60%或65%序列相同性，大約70%或75%序列相同性，大約80%或85%序列相同性,大約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列相同性的氨基酸或核苷酸序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，可以考慮到密碼子簡(jiǎn)并性、氨基酸相似性、讀碼框位置等，對(duì)這些值適當(dāng)?shù)卣{(diào)節(jié)，以確定兩條核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)的對(duì)應(yīng)相同性。為確定兩條氨基酸序列或兩條核酸序列的百分比相同性，針對(duì)最優(yōu)比較的目的，對(duì)序列加以比對(duì)。兩條序列間的百分比相同性是序列共有的相同位置數(shù)的函數(shù)(即，百分比相同性-相同的位置數(shù)/總位置數(shù)(例如重疊的位置)x100)。在一種實(shí)施方式中，兩條序列長(zhǎng)度相同?？墒褂门c下文所述類似的技術(shù)，允許或不允許存在缺口，來(lái)測(cè)定兩條序列間的百分比相同性。在對(duì)百分比相同性的計(jì)算中，典型地，計(jì)算完全的匹配。對(duì)兩條序列間百分比相同性的測(cè)定可使用數(shù)學(xué)算法來(lái)完成。用于比較兩條序列的數(shù)學(xué)算法的非限制性例子是按照KarlinandAltschul(1993)Jcad.S"',USA90:5873-5877改良的KarlinandAltschul(1990)戶roc.Sc/.USA87:2264-2268算法。此算法被并入Altschuletal.(1990)JMol.Biol.215:403-410的BLASTN和BLASTX程序?？捎肂LASTN程序,分?jǐn)?shù)-100，字長(zhǎng)-12，進(jìn)行BLAST核苷酸搜索，以獲得與本發(fā)明的GDC樣核酸分子同源的核苷酸序列。可以用BLASTX程序，分?jǐn)?shù)-50，字長(zhǎng)t3,來(lái)進(jìn)行BLAST蛋白質(zhì)搜索，以獲得與本發(fā)明的除草劑抗性蛋白分子同源的氨基酸序列。為獲得有缺口的比對(duì)用于比較目的，可使用有缺口BLAST,如Altschulef".(1997)腸/e7c爿c油紋25:3389-3402所述?；蛘?，可以用PSI-Blast進(jìn)行迭代搜索，以探測(cè)分子之間較遠(yuǎn)的關(guān)系。見上文所述的Altschulefa人(1997)。當(dāng)利用BLAST、有缺口BLAST和PSI-Blast程序時(shí)，可使用各程序(例如BLASTX和BUSTN)的缺省參數(shù)。見www,ncbi.nlm.nih.gov。用于比較序列的數(shù)學(xué)算法的另一非限制性例子是ClustalW算法(Higgins"(1994)細(xì)7e/c22:4673-4680)。ClustalW對(duì)序列加以比較，對(duì)氨基酸或DNA序列的整體加以比對(duì)，因此能提供關(guān)于整個(gè)氨基酸序列的序列保守性的數(shù)據(jù)。ClustalW算法用于多種可商業(yè)獲得的DM/氨基酸分析軟件包，例如VectorNTI程序套裝(InvitrogenCorporation,Carlsbad,CA)的AUGNX模塊。用ClustalW對(duì)氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)之后，可以估計(jì)出氨基酸百分比相同性。可用于ClustalW比對(duì)分析的軟件程序的一個(gè)非限制性例子是GeneDocTM。GeneDoc(KarlNicholas)允許對(duì)多個(gè)蛋白質(zhì)之間的氨基酸(或DM)相似性或相同性加以評(píng)估。用于比較序列的數(shù)學(xué)算法的另一非限制性例子是MyersandMiller(1988)"丑/(^4:11-17的算法。此算法被并入ALIGN程序(版本2.0)，該程序是GCG序列比對(duì)軟件包(可從Accelrys，Inc.，SanDiego，CA獲得)的一部分。當(dāng)利用ALIGN程序用于比較氨基酸序列時(shí)，可以使用PAM120權(quán)重殘基表(weightresiduetable)、12的缺口長(zhǎng)度懲罰以及4的缺口懲罰。除非另有指明，使用NeedlemanandWunsch(1970)A/o/.48(3):443-453算法的GAP版本10將用于確定序列相同性或相似性，其中使用下述參數(shù)對(duì)于核苷酸序列的％相同性和％相似性，使用50的GAP權(quán)重，3的長(zhǎng)度權(quán)重，以及nwsgapdna.cmp計(jì)分矩陣；對(duì)于氨基酸序列的％相同性或％相似性，使用8的GAP權(quán)重，2的長(zhǎng)度權(quán)重以及BL0SUM62計(jì)分程序。還可使用等同程序。"等同程序"意指下述任何序列比較程序，對(duì)于用于比對(duì)的任何兩條序列而言，較之GAP版本IO產(chǎn)生的對(duì)應(yīng)比對(duì)，其能產(chǎn)生出具有相同核苷酸殘基匹配的比對(duì)以及相同的百分比序列相同性。本發(fā)明還包括變體核酸分子。編碼除草劑抗性的核苷酸序列的"變體"包括下述這些序列，它們編碼本文公開的除草劑抗性蛋白，但是由于遺傳密碼簡(jiǎn)并性它們有一定程度的不同，"變體"還包括上文所述足夠相同的那些。可以用公知的分子生物學(xué)技術(shù)來(lái)鑒定天然存在的等位變體，例如用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和雜交技術(shù)，如下文所概述的。變體核苷酸序列還包括通過(guò)合成獲得的核苷酸序列，它們是例如用定點(diǎn)誘變產(chǎn)生的，但是將仍然編碼本發(fā)明公開的除草劑抗性蛋白，如下文所討論。本發(fā)明包括的變體蛋白是具有生物活性的，即，它們保留有人們想要的天然蛋白的生物活性，即保留了除草劑抗性活性。"保留了除草劑抗性活性"意指變體將具有天然蛋白除草劑抗性活性的至少大約30%，至少大約50%，至少大約70%，或者至少大約80%。用于測(cè)量除草劑抗性活性的方法是本領(lǐng)域公知的。見，例如，美國(guó)專利Nos.4，535，060和5，188，642，它們每份都通過(guò)引用整體并入本文。本領(lǐng)域技術(shù)人員還將知道，可通過(guò)突變向本發(fā)明的核苷酸序列引入變化，由此導(dǎo)致被編碼的除草劑抗性蛋白的氨基酸序列中的改變，而不改變蛋白的生物活性。因此，可以這樣制造經(jīng)分離的核苷酸分子的變體向本文公開的對(duì)應(yīng)的核苷酸序列引入一個(gè)或多個(gè)核苷酸取代、添加或缺失，使得向被編碼的蛋白中引入一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代、添加或缺失。可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，例如定點(diǎn)誘變和PCR介導(dǎo)的誘變來(lái)引入突變。此類變體核苷酸序列也被本發(fā)明所包括。例如，可在一個(gè)或多個(gè)預(yù)定的、非關(guān)鍵的氨基酸殘基制造保守氨基酸取代。"非關(guān)鍵的"氨基酸殘基是下述殘基，其可從除草劑抗性蛋白的野生型序列改變，但不改變生物活性，而"關(guān)鍵"氨基酸殘基是生物活性所需要的。"保守氨基酸取代"是這樣的其中氨基酸殘基被具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基代替.具有相似側(cè)鏈的氨基酸家族在本領(lǐng)域中已被定義。這些家族包括具有堿性側(cè)鏈(例如，賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側(cè)鏈(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電荷的極性側(cè)鏈(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性側(cè)鏈(例如，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、帶P-支鏈的側(cè)鏈(例如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳香族側(cè)鏈(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)的氨基酸。氨基酸取代可在保留功能的非保守區(qū)域發(fā)生。通常，此類取代將不對(duì)保守氨基酸殘基，或處于保守基元(motif)(在該處的此類殘基對(duì)于蛋白質(zhì)活性來(lái)說(shuō)是很重要的)中的氨基酸殘基進(jìn)行。但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，功能性變體可能在保守殘基處具有較少保守性的或非保守性的改變。或者，可通過(guò)在編碼序列的全部或部分上隨機(jī)引入突變來(lái)產(chǎn)生變體核苷酸序列，例如，通過(guò)飽和誘變來(lái)產(chǎn)生，可針對(duì)賦予除草劑抗性活性的能力對(duì)得到的突變體加以篩選，以鑒定出保留有活性的突變體。誘變之后，被編碼的蛋白質(zhì)可在細(xì)胞中表達(dá)，可使用標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)技術(shù)來(lái)測(cè)定蛋白活性。使用PCR、雜交等方法，可鑒定出對(duì)應(yīng)的除草劑抗性序列，此類序列具有與本發(fā)明序列的基本相同性。見，例如SambrookandRussell(2001)^Zo7ecw7arr/ofl/z2g.'JZa6orafor/J/4/2i/a/(ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY)和Iimis，etal.(1990)戶CA戶rofoco/夕.'JCw/f/etoVet力oc^a"f/Jp/7/2.caf/o/2s(AcademicPress,St.Louis,M0)。在雜交方法中，除草劑抗性核苷酸序列的全部或部分可用于篩選cDNA或基因組文庫(kù)。用于構(gòu)建此類cDNA和基因組文庫(kù)的方法通常是本領(lǐng)域已知的，并在上文所述的SambrookandRussell(2001)中有所描述。所謂的雜交探針可以是基因組DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其它寡核苷酸，可用可探測(cè)基團(tuán)，例如"P或任何其它可探測(cè)標(biāo)志(marker)，例如其它放射同位素、熒光化合物、酶或酶輔助因子對(duì)其進(jìn)行標(biāo)記?？苫诒疚墓_的編碼除草劑抗性的已知核苷酸序列，對(duì)合成的寡核苷酸加以標(biāo)記，來(lái)制造用于雜交的探針?？深~外使用基計(jì)的簡(jiǎn)并引物。探針典型地包含下述核苷酸序列區(qū)域，所述區(qū)域在嚴(yán)謹(jǐn)條件下能與本發(fā)明的除草劑抗性編碼核苷酸序列或其片段或變體的至少大約12，至少大約25，至少大約50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、500、600、700、800、900、1000、1200、1400、1600或1800個(gè)連續(xù)核苷酸雜交。用于制備雜交用探針的方法通常是本領(lǐng)域已知的，其公開于上文的SambrookandRussell(2001)和Sambrooketal.(1989)船/ecw/arC/o"2'w^Za6or"or/it/is/2ua/(2ded.,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarborNY)中，這兩者都通過(guò)引用并入本文。例如，本文公開的整個(gè)除草劑抗性序列或其一個(gè)或多個(gè)部分可用作探針，所述探針能與相應(yīng)的除草劑抗性序列和信使RNA特異性雜交。為在多種條件下獲得特異性雜交，此類探針包括獨(dú)特的(imiQue)以及至少大約10個(gè)核苷酸長(zhǎng)的序列，以及至少大約20個(gè)核苷酸長(zhǎng)的序列。此類探針可用于通過(guò)PCR從選定的生物擴(kuò)增相應(yīng)的除草劑抗性序列。該技術(shù)可用于從想要的生物中分離額外的編碼序列，或者作為診斷試驗(yàn)，用于探測(cè)生物體中編碼序列的存在。雜交技術(shù)包括對(duì)鋪板的(plated)DM文庫(kù)進(jìn)行雜交篩選(噬菌斑或菌落，見，例如Sambrooketal.(1989)etal.(1989)MolecularCloning:ALaboratoryManual(2ded.，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY))。此類序列的雜交可在嚴(yán)謹(jǐn)條件下進(jìn)行。"嚴(yán)謹(jǐn)條件"或"嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件"意指下述條件，在所述條件下，探針將與其靶序列雜交至較之其它序列而言探測(cè)到的更高的程度(例如背景的至少2倍)。嚴(yán)謹(jǐn)條件是序列依賴性的，在不同環(huán)境下將有所不同。通過(guò)控制雜交和/或洗滌條件的嚴(yán)謹(jǐn)度，可以鑒定出與探針100%互補(bǔ)的靶序列(同源探查)。或者，可將嚴(yán)謹(jǐn)度條件調(diào)節(jié)為允許序列中有一些錯(cuò)配，從而探測(cè)到更低的相似性程度(異源探查)。通常，探針長(zhǎng)度小于大約1000個(gè)核苷酸，奉者長(zhǎng)度小于大約500個(gè)核普酸。典型地，嚴(yán)謹(jǐn)條件將是下述這些，其中，在pH7.0至8.3下，鹽濃度小于大約1.5MNa離子，典型地，大約0.01至1.0MNa離子濃度(或其它鹽)，對(duì)短的探針(例如10至50個(gè)核苷酸)而言溫度為至少大約30°C，對(duì)長(zhǎng)的探針(例如超過(guò)50個(gè)核苷酸)而言溫度為至少大約60。C。嚴(yán)謹(jǐn)條件還可以通過(guò)加入去穩(wěn)定劑(例如甲酰胺)來(lái)獲得。示例性低嚴(yán)謹(jǐn)度條件包括用30至35°/。甲酰胺、1MNaCl、1%SDS(十二烷基硫酸鈉)的緩沖溶液在37°C進(jìn)行雜交，在IX至2XSSC(20XSSC=3.0MNaC1/0.3M檸檬酸三鈉)中于50至55。C進(jìn)行洗滌.示例性中等嚴(yán)謹(jǐn)度條件包括在40至45%甲酰胺、l.OMNaCl、1%SDS中在37°C進(jìn)行雜交，在0.5X至IXSSC中于55-60。C進(jìn)行洗滌。示例性高嚴(yán)謹(jǐn)度條件包括在50%甲酰胺、1MNaCl、1%SDS中在37。C進(jìn)行雜交，在0.1XSSC中于60至65°C進(jìn)行洗滌?？蛇x地，洗滌緩沖液可以含有大約0.1%至大約1%的SDS。雜交持續(xù)通常短于大約24小時(shí)，通常為大約4至大約12小時(shí)。典型地，特異性是雜交后洗滌的函數(shù)，關(guān)鍵因子是最后的洗滌溶液的離子強(qiáng)度和溫度。對(duì)于DNA-DNA雜交體而言，Tm可以從MeinkothandWahl(1984)J/a/.A/oc力e邁.138:267-284的等式估算:Tm=81.5。C+16.6(logM)+0.41(%GC)-0.61(%曱酰胺)-500/L;其中，M是單價(jià)陽(yáng)離子的摩爾濃度，％GC是DNA中鳥苷和胞嘧啶的百分比，%甲酰胺是雜交溶液中曱酰胺的百分比，L是以堿基對(duì)表示的雜交體長(zhǎng)度。Tm是(在給定的離子強(qiáng)度和pH下)互補(bǔ)靶序列的50%與完全匹配的探針雜交的溫度。對(duì)于每1°/。的錯(cuò)配，Tm減少大約1°C;因此，可對(duì)Tm、雜交和/或洗滌條件加以調(diào)節(jié)，以與具有想要的相同性的序列雜交。例如，如果想要>90%相同性的序列，Tm可降低10°C。通常，對(duì)嚴(yán)謹(jǐn)條件加以選擇，使得比給定的離子強(qiáng)度和pH下特定序列及其互補(bǔ)序列的熱解鏈溫度(Tm)低大約5°C。但是，嚴(yán)格的嚴(yán)謹(jǐn)度條件可利用比熱解鏈溫度(Tm)低1、2、3或4。C的雜交和/或洗滌；中等嚴(yán)謹(jǐn)度條件可利用比熱解鏈溫度(Tm)低6、7、8、9或10°C的雜交和/或洗滌；低嚴(yán)謹(jǐn)度條件可利用比熱解鏈溫度(Tm)低11、12、13、14、15或20°C的雜交和/或洗滌條件。使用該等式、雜交和洗滌組合物以及想要的Tm，本領(lǐng)域技術(shù)人員將能理解，雜交和/或洗滌溶液的嚴(yán)謹(jǐn)度可以固有地變化。如果想要的錯(cuò)配程度導(dǎo)致Tm低于45。C(水溶液)或32。C(甲酰胺溶液)，優(yōu)選增加SSC濃度，以便可以使用更高的溫度。對(duì)于核酸分子雜交的詳細(xì)指導(dǎo)可在Tijssen(1993)^/6r/cf/z"io/jV"c/e/c爿c/dro6es，PartI，Chapter2(Elsevier,NewYork);和Ausubeletal，eds.(1995)Ci/rre/fProfoco/s7力#o/ecw/ar》2.0/0^7，Chapter2(GreenePublishingandWiley-Interscience，NewYork)中找到。見Sambrooka人(1989)#o/ecw/s_r"0/7/跟.爿L360r"or7(2ded.,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY)。經(jīng)分離的蛋白質(zhì)及其變體和片段除草劑抗性蛋白也包括在本發(fā)明中。"除草劑抗性蛋白"意指具有SEQIDN0:3所示氨基酸序列的蛋白。還提供了其片段、生物活性部分和變體，它們也可用于實(shí)施本發(fā)明的方法。"片段"或"生物活性部分"包括下述多肽片段，所述多肽片段包含編碼SEQIDNO:3所示的除草劑抗性蛋白的氨基酸序列的部分，并且保留有除草劑抗性活性。除草劑抗性蛋白的生物活性部分可以是長(zhǎng)度為例如IO、25、50、IOO或更多個(gè)氨基酸的多肽。此類生物活性部分可通過(guò)重組技術(shù)來(lái)制備，并針對(duì)除草劑抗性活性加以評(píng)估。用于測(cè)量除草劑機(jī)性活性的方法是本領(lǐng)域公知的。見，例如，美國(guó)專利號(hào)4，535，060和5,188,642，每一專利都通過(guò)引用整體并入本文。如在本文中所用的，片段包含SEQIDNO:3的至少8個(gè)連續(xù)氨基酸。但是，本發(fā)明也包括其它片段，例如，蛋白質(zhì)中超過(guò)大約IO、20、30、50、100、150、200、250、300、350或400個(gè)氨基酸的任何片段。"變體"意指下述蛋白質(zhì)或多肽，它們具有與SEQIDNO:3的氨基酸序列至少大約60%、65%,至少大約70%、75%，至少大約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸20200580047922.7說(shuō)明書第12/31頁(yè)合物以及想要的Tm序列。變體還包括下述核酸分子編碼的多肽，所述核酸分子能在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQIDN0S:l或2或其互補(bǔ)序列雜交。變體包括由于誘變導(dǎo)致氨基酸序列有所不同的多肽。本發(fā)明包括的變體蛋白具有生物活性，即，它們繼續(xù)擁有天然蛋白的想要的生物活性，即，保留有除草劑抗性活性。用于測(cè)量除草劑抗性活性的方法是本領(lǐng)域公知的。見，例如，美國(guó)專利Nos.4，535，060和5，188，642，它們每份都通過(guò)引用整體并入本文。本發(fā)明的細(xì)菌基因，例如^^基因，相當(dāng)通常地，擁有與開放讀碼框的起點(diǎn)鄰近的多個(gè)甲硫氨酸起始密碼子。通常，在這些起始密碼子的一個(gè)或多個(gè)起始翻譯將導(dǎo)致功能性蛋白的產(chǎn)生。這些起始密碼子可以包括ATG密碼子。但是，細(xì)菌，例如芽孢桿菌屬物種還能將密碼子GTG識(shí)別為起始密碼子，在GTG密碼子起始翻譯的蛋白在笫一個(gè)氨基酸含有甲硫氨酸。此外，通常不能預(yù)先確定這些密碼子中的哪些天然在細(xì)菌中使用。因此，應(yīng)當(dāng)理解，使用備選的曱硫氨酸密碼子之一可能導(dǎo)致產(chǎn)生賦予除草劑抗性的gi^《變體。這些除草劑抗性蛋白也包括在本發(fā)明中，并且可用于本發(fā)明的方法。本發(fā)明的多肽、其變體或片段的抗體也包括在本發(fā)明內(nèi)。用于生產(chǎn)抗體的方法是本領(lǐng)域公知的(見，例如，HarlowandLane(1988)Antibodies:ALaboratoryManual(ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY);美國(guó)專利No.4，196，265)。改變的或改進(jìn)的變體應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，g/^的DNA序列可被多種方法改變，這些改變可能導(dǎo)致產(chǎn)生編碼具有與grg8所編碼的不同的氨基酸序列的蛋白的DM序列?？梢砸远喾N途徑對(duì)該蛋白加以改變，包括氨基酸取代、缺失、截短和插入。用于此類操作的方法通常是本領(lǐng)域已知的。例如，GRG8蛋白的氨基酸序列變體可通過(guò)DNA中的突變來(lái)制備。這可通過(guò)若干形式的i秀變之一和/或通過(guò)定點(diǎn)進(jìn)化(directedevolution)來(lái)完成。在一些方面，氨基酸序列中編碼的變化將不會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)功能造成實(shí)質(zhì)性影響。此類變體將具有想要的除草劑抗性活性。但是，應(yīng)當(dāng)理解，可通過(guò)在本發(fā)明的組合物上使用此類技術(shù)來(lái)改進(jìn)GRG8賦予除草劑抗性的能力。例如，GRG8可在下述宿主細(xì)胞中表達(dá)，所述細(xì)胞在DNA復(fù)制期間展示出高比侈寸的械基錯(cuò)誤加入(misincorporation)，命J:it口XL—1Red(Stratqgene，LaJolla，CA)。在此類菌抹中擴(kuò)增之后，可以對(duì)^rg《DNA加以分離(例如通過(guò)制備質(zhì)粒DNA，或者通過(guò)PCR進(jìn)^f亍擴(kuò)增以及將得到的PCR片段克隆進(jìn)載體)，并在非誘變菌林中培養(yǎng)?？赏ㄟ^(guò)測(cè)量對(duì)于除草劑(例如草甘膦)的提高的抗性，例如通過(guò)在增加的濃度的草甘膦中培養(yǎng)細(xì)胞，以及對(duì)賦予對(duì)增加的濃度的草甘膦的耐受性的克隆加以測(cè)試，來(lái)鑒定出含有g(shù)rg8中的突變的克隆?；蛘?，可以在氨基或羧基末端對(duì)很多蛋白的蛋白序列加以改變，而不實(shí)質(zhì)性影響活性。這些改變可包括通過(guò)現(xiàn)代分子方法引入的插入、缺失或改變，所述方法例如PCR，包括改變或延伸蛋白質(zhì)編碼序列的PCR擴(kuò)增，這利用了將氨基酸編碼序列包括進(jìn)PCR擴(kuò)增中利用的寡核普酸的過(guò)程。或者，加入的蛋白序列可包括整個(gè)蛋白質(zhì)編碼序列，例如通常用于本領(lǐng)域中產(chǎn)生蛋白質(zhì)融合物的那些。此類融合蛋白通常用于(1)增加感興趣蛋白的表達(dá)；(2)引入結(jié)合結(jié)構(gòu)域，酶活性，或表位，以協(xié)助蛋白質(zhì)純化、蛋白質(zhì)檢測(cè)或者本領(lǐng)域已知的其它實(shí)驗(yàn)用途；或(3)將蛋白質(zhì)靶向分泌或翻譯進(jìn)亞細(xì)胞細(xì)胞器，例如，革蘭氏陰性細(xì)菌的周質(zhì)空間，或真核細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，后者通常導(dǎo)致蛋白質(zhì)糖基化。本發(fā)明的變體核苷酸和氨基酸序列還包括從誘變和重組程序(例如DNA改組(shuffling))獲得的序列。采用此類程序，一種或多種不同的除草劑抗性蛋白編碼區(qū)域可用于制造擁有想要的性質(zhì)的新的除草劑抗性蛋,白。以這種方式，從一群相關(guān)序列多核苷酸(包含具有高度序列相同性，并可被體外或體內(nèi)同源重組的序列區(qū)域)產(chǎn)生重組多核普酸的文庫(kù)。例如，使用該手段，可在本發(fā)明的除草劑抗性基因和其它已知除草劑抗性基因之間對(duì)編碼感興趣結(jié)構(gòu)域的序列基元進(jìn)行改組，以獲得編碼具有改進(jìn)的感興趣的性質(zhì)(例如增加的草甘膦抗性活性)的蛋白的新基因。用于此類DNA改組的策略是本領(lǐng)域已知的。見，例如Stemmer(1994)5W.91:10747-10751;Stemmer(1994)#"z/re370:389-391;Cramerie"/.(1997)A""wre》/c^ec力.15:436—438;Moorea人(1997)/A/o/.272:336—347;Zhanga/.(1997)戶roc.^〃.Jcad.Jc/.94:4504-4509;Cramerie"/.(1998)A""re391:288-291和美國(guó)專利Nos.5，605，793和5，837，458。轉(zhuǎn)化細(xì)菌或植物細(xì)胞本發(fā)明提供了新穎的經(jīng)分離基因，其賦予對(duì)除草劑的抗性。本發(fā)明還提供了GRG8蛋白的氨基酸序列。從翻譯該基因得到的該蛋白允許細(xì)胞在存在對(duì)細(xì)胞(包括植物細(xì)胞和細(xì)菌細(xì)胞)有害的濃度的除草劑的情況下發(fā)揮功能。在本發(fā)明的一方面，^^《基因可用作標(biāo)志，以評(píng)估細(xì)菌或植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。通過(guò)對(duì)gr^進(jìn)行下述工程改造——(1)從已知能在待測(cè)試生物中刺激轉(zhuǎn)錄的細(xì)菌啟動(dòng)子表達(dá)，(2)正確翻譯，以產(chǎn)生完整GRG8肽，和(3)將細(xì)胞放置于除草劑毒性濃度下，利用它們對(duì)除草劑的抗性可以鑒定出已被DNA轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。"啟動(dòng)子"意指功能是指導(dǎo)下游編碼序列的轉(zhuǎn)錄的核酸序列。啟動(dòng)子以及其它轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控核酸序列(也稱為"控制序列")對(duì)于表達(dá)感興趣的DNA序列來(lái)說(shuō)是必要的。對(duì)細(xì)菌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化通過(guò)本領(lǐng)域已知的若干技術(shù)之一來(lái)完成，所述技術(shù)包括但不限于電穿孔或化學(xué)轉(zhuǎn)化(見，例如，Ausubel(ed.)(1994)Cwrre刀f戶rotoco7s2."#o/ecu/arA/0/c^7(JohnWileyandSons,Inc.,Indianapolis,IN))。賦予對(duì)毒性物質(zhì)的抗性的標(biāo)志可用于從未經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞(不含或不表達(dá)測(cè)試DM的那些)鑒定經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞(已具有并表達(dá)測(cè)試DNA)。在本發(fā)明的一個(gè)方面，gi^《基因可用作標(biāo)志，以評(píng)估對(duì)細(xì)菌或植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。對(duì)植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化可以以相似的方式來(lái)進(jìn)行。"植物"意指整林植物、植物器官(例如，葉、莖、根等)、種子、植物細(xì)胞、繁殖體、胚及它們的后代。植物細(xì)胞可以是分化的或未分化的(例如，愈傷組織、懸浮培養(yǎng)細(xì)胞、原生質(zhì)體、葉細(xì)胞、根細(xì)胞、韌皮部細(xì)胞、花粉)。"轉(zhuǎn)基因植物"或"經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物"或"穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的"植物、細(xì)胞或組織表示已將外源核酸序列或DNA片段包括或整合進(jìn)植物細(xì)胞的植物。"穩(wěn)定轉(zhuǎn)化"意指引入植物的核苷酸構(gòu)建體整合進(jìn)植物基因組，并且能被其后代所遺傳?？蓪?duì)本發(fā)明的《r^!基因加以修飾，以獲得或增強(qiáng)在植物細(xì)胞中的表達(dá)。本發(fā)明的除草劑抗性序列可被提供于表達(dá)盒中，用于在感興趣的植物中的表達(dá)。"植物表達(dá)盒"包括能導(dǎo)致蛋白質(zhì)在植物細(xì)胞中從開放讀碼框表達(dá)的DNA構(gòu)建體。表達(dá)盒將包括以5，-3，轉(zhuǎn)錄的方向而言，在植物中具有功能的、與本發(fā)明的DNA序列可操作地相連的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域(即，啟動(dòng)子)以及翻譯和轉(zhuǎn)錄終止區(qū)域(即，終止區(qū)域)。表達(dá)盒可額外含有至少一種額外的基因，其將被共轉(zhuǎn)化進(jìn)生物，所述額外的基因例如選擇標(biāo)志基因。或者，額外的基因可以在多個(gè)表達(dá)盒上提供。此類表達(dá)盒提供有多個(gè)限制性位點(diǎn)，用于插入將處于調(diào)控區(qū)域的轉(zhuǎn)錄調(diào)控下的除草劑抗性序列。啟動(dòng)子相對(duì)植物宿主和/或本發(fā)明的DNA序列來(lái)說(shuō)可以是天然的或類似的，或者外源的或異源的。此外，啟動(dòng)子可以是天然序列，或者備選地，合成序列。啟動(dòng)子對(duì)于植物宿主來(lái)說(shuō)是"天然的"或"同源的"的情況下，這表示，在將引入該啟動(dòng)子的天然植物中能找到該啟動(dòng)子。啟動(dòng)子對(duì)于本發(fā)明的DNA序列來(lái)說(shuō)是"外源的"或"異源的"的情況下，這表示，啟動(dòng)子不是天然的，或者不是用于本發(fā)明的可操作地相連的DNA序列的天然存在的啟動(dòng)子。"異源的"通常指下述核酸序列，它們并非其存在的天然基因組的一部分或是細(xì)胞內(nèi)源的，其通過(guò)感染、轉(zhuǎn)染、微注射、電穿孔、顯微操作等加入進(jìn)細(xì)胞。"可操作地相連"意指啟動(dòng)子和第二序列間的功能性連接，其中，啟動(dòng)子序列起始和介導(dǎo)對(duì)應(yīng)于第二序列的DM序列的轉(zhuǎn)錄。通常，可操作地相連表示，相連的核酸序列是連續(xù)的，并且，需要將兩個(gè)蛋白編碼區(qū)域連接時(shí)，其是連續(xù)的、按讀碼框連接的。通常，此類構(gòu)建體還將含有5，和3，非翻譯區(qū)域。此類構(gòu)建體可含有"信號(hào)序列"或"前導(dǎo)序列"，以協(xié)助感興趣的肽向某些細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)(例如，葉綠體(或其它質(zhì)體)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或高爾基體(Golgiapparatus))的共翻譯或翻譯后轉(zhuǎn)運(yùn)，或被分泌。例如，可對(duì)基因進(jìn)行工程改造，以含有信號(hào)肽，以協(xié)助將肽轉(zhuǎn)移進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。"信號(hào)序列"意指下述序列，該序列已知或被懷疑能導(dǎo)致共翻譯或翻譯后的、經(jīng)過(guò)細(xì)胞膜的肽轉(zhuǎn)運(yùn)。在真核細(xì)胞中，該轉(zhuǎn)運(yùn)典型地涉及向高爾基體中的分泌，其中某些導(dǎo)致糖基化。"前導(dǎo)序列"意指下述任何序列當(dāng)其翻譯時(shí)，產(chǎn)生足以觸發(fā)肽鏈向亞細(xì)胞細(xì)胞器的共翻譯轉(zhuǎn)運(yùn)的氨基酸序列。因此，這包括引導(dǎo)轉(zhuǎn)運(yùn)和/或糖基化的前導(dǎo)序列，這通過(guò)進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，進(jìn)入液泡，質(zhì)體(包括原生質(zhì)體、線粒體等)來(lái)實(shí)現(xiàn)。還可對(duì)植物表達(dá)盒進(jìn)行工程改造，使其含有內(nèi)含子，從而對(duì)內(nèi)含子的mRNA加工是表達(dá)所需要的。"3，非翻譯區(qū)域"意指定位于編碼序列下游的核苷酸序列。聚腺苷酸化信號(hào)序列和編碼調(diào)控信號(hào)(能影響聚腺苷酸片斷向mRM前體的3，末端的加入)的其它序列是3，非翻譯區(qū)域。"5，非翻譯區(qū)域"意指定位于編碼序列上游的核苷酸序列。其它上游或下游非翻譯元件包括增強(qiáng)子。增強(qiáng)子是發(fā)揮作用以增強(qiáng)啟動(dòng)子區(qū)域的表達(dá)的核苷酸序列。增強(qiáng)子是本領(lǐng)域已知的，其包括但不限于，SV40增強(qiáng)子區(qū)域和35S增強(qiáng)子元件。終止區(qū)域可以是相對(duì)轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域天然的，可以是相對(duì)本發(fā)明的除草劑抗性序列天然的，或者可以從另外的來(lái)源獲得?？梢詮母┺r(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒獲得方便的終止區(qū)域，例如章魚堿合酶以及胭脂堿合酶終止區(qū)域。還見Guerineauefa厶(1991)^Zo/.Ce/.6^力e"262:14卜144;Proudfoot(1991)Ce7764:671-674;Sanfaconetal.(1991)fe/3es"er.5:141—149;Mogenefa/.(1990)/Vfl/zfCe//2:1261-1272;Munroeefa7.(1990)fe/e91:151-158;Ballaseta/.(1989)腸7e/cJ".&組17:7891-7903和Joshi"".(1987)腸/e/ck.15:9627-9639。合適的情況下，可對(duì)基因加以優(yōu)化，以提高在經(jīng)轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞中的表達(dá)。即，可使用宿主細(xì)胞偏愛(ài)的密碼子來(lái)合成基因，用于提高的表達(dá)，或者可以使用宿主偏愛(ài)的密碼子使用頻率來(lái)合成基因。通常，基因的GC含量將增加。關(guān)于對(duì)宿主偏愛(ài)的密碼子使用的討論，見，例:i口，CampbellandGowri(1990)/Va/^尸力j^/o厶92:l—ll。用于合成宿主偏愛(ài)的基因的方法是本領(lǐng)域已知的。見，例如，美國(guó)專利Nos.6,320,100、6，075,185、5,380,831和5，436，391，美國(guó)公開的申請(qǐng)Nos.20040005600和20010003849，以及Murray"a人(1989)腸/e/c爿c油紐17:477-498，它們通過(guò)引用并入本文。在一種實(shí)施方式中，感興趣的核酸耙向葉綠體，用于表達(dá)。以這種方式，當(dāng)感興趣的核酸不直接插入葉綠體時(shí)，表達(dá)盒將額外含有編碼轉(zhuǎn)移肽(transitpeptide)的核酸，以將感興趣的基因產(chǎn)物指導(dǎo)向葉綠體。此類轉(zhuǎn)移肽是本領(lǐng)域已知的。見，例如，VonHeijneefa/.(1991)P/a/^Vo/.S/o/.Rep.9:104-126;ClarkWa/.(1989)/."2'o/.C力e邁.264:17544-17550;Della-Cioppaefa/.(1987)戶/a;^戶力7^7o厶84:965—968;Romerefa/.(1993)A/oc力e瓜Co2Z/邁"".196:1414-1421和Shaheta人(1986)Sc/e/7ce233:478—481?？蓪?duì)將靶向葉綠體的感興趣的核酸加以優(yōu)化，以在葉綠體中表達(dá)，以解決植物的核與該細(xì)胞器之間密碼子使用不同的問(wèn)題。以這種方式，可使用葉綠體偏愛(ài)的密碼子來(lái)合成感興趣的核酸。見，例如，美國(guó)專利No.5,380,831，其通過(guò)引用并入本文。典型地，該"植物表達(dá)盒"將被插入"植物轉(zhuǎn)化載體"。"轉(zhuǎn)化載體"意指對(duì)于細(xì)胞的有效轉(zhuǎn)化來(lái)說(shuō)必要的DNA分子。此類分子可由一個(gè)或多個(gè)表達(dá)盒構(gòu)成，其可被組織為多于一個(gè)"載體"DNA分子。例如，二元載體是下述植物轉(zhuǎn)化載體，它們利用兩個(gè)非鄰接的DNA載體，編碼轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞必需的所有順式和反式作用功能(HellensandMullineaux(2000)7>e/7C^/'/z尸7a/7f5"c/e/ce5:446—451)。"載體"指設(shè)計(jì)來(lái)在不同宿主細(xì)胞之間轉(zhuǎn)移的核酸構(gòu)建體。"表達(dá)載體"指下述載體，其具有在外源細(xì)胞中并入、整合和表達(dá)異源DM序列或片段的能力。該植物轉(zhuǎn)化載體可包含實(shí)現(xiàn)植物轉(zhuǎn)化所需的一種或多種DNA載體。例如，利用包含超過(guò)一條的鄰接的DM片斷的植物轉(zhuǎn)化載體在本領(lǐng)域中是常見的操作。這些載體在本領(lǐng)域中通常被稱為"二元載體"。二元載體以及具有輔助質(zhì)粒(helperplasmid)的載體最常用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，這種轉(zhuǎn)化中，實(shí)現(xiàn)有效轉(zhuǎn)化需要的DNA片斷的大小和復(fù)雜度相當(dāng)大，并且將不同功能分開到不同DNA分子上是有利的。典型地，二元栽體含有下述質(zhì)粒載體，所述質(zhì)粒載體含有T-DNA轉(zhuǎn)移所需要的順式作用序列(例如左邊界和右邊界)、選擇標(biāo)志(被工程改造為能在植物細(xì)胞中表達(dá))以及"感興趣的基因"(被工程改造為能在下述植物細(xì)胞中表達(dá)的基因，對(duì)所述植物細(xì)胞來(lái)說(shuō)，轉(zhuǎn)基因植物的產(chǎn)生是想要的)。在該質(zhì)粒載體上還存在細(xì)菌復(fù)制所需要的序列。順式作用序列以允許有效轉(zhuǎn)移進(jìn)植物細(xì)胞并且在其中表達(dá)的方式排列。例如，選擇標(biāo)志基因和感興趣的基因定位于左右邊界之間。通常，第二質(zhì)粒載體含有反式作用因子，其介導(dǎo)從農(nóng)桿菌向植物細(xì)胞的T-DNA轉(zhuǎn)移。該質(zhì)粒通常含有毒力(virulence)功能(Vir基因)，這允許通過(guò)農(nóng)桿菌感染植物細(xì)胞，以及允許通過(guò)在邊界序列進(jìn)行的切割來(lái)轉(zhuǎn)移DNA，以及Vir介導(dǎo)的DM轉(zhuǎn)移，如本領(lǐng)域所理解的那樣(HellensandMullineaux(2000)7^e油//7戶/a/7fSc/e/7ce，5:446-451)。若干種類型的農(nóng)桿菌菌林(例如LBA4404、GV3101、EHAIOI、EHA105等)可以用于植物轉(zhuǎn)化。第二質(zhì)粒載體對(duì)于通過(guò)其它方法(例如顯孩吏操作、微注射、電穿孔、聚乙二醇等)轉(zhuǎn)化植物來(lái)說(shuō)并非必需的。植物轉(zhuǎn)化本發(fā)明的方法涉及將核苷酸構(gòu)建體引入植物。"引入"意指將核苷酸構(gòu)建體以下述方式植入，所述方式使得該構(gòu)建體能夠進(jìn)入植物細(xì)胞的內(nèi)部。本發(fā)明的方法不需要使用將核苷酸構(gòu)建體引入植物的特定方法，僅需要核苷酸構(gòu)建體能進(jìn)入植物的至少一個(gè)細(xì)胞的內(nèi)部。用于將核苷酸構(gòu)建體引入植物的方法是本領(lǐng)域已知的，其包括但不限于穩(wěn)定轉(zhuǎn)化方法、瞬時(shí)轉(zhuǎn)化方法和病毒介導(dǎo)的方法。通常，植物轉(zhuǎn)化方法涉及將異源DNA轉(zhuǎn)移進(jìn)靶植物細(xì)胞(例如，未成熟或成熟的胚、懸浮培養(yǎng)物、未分化的愈傷組織、原生質(zhì)體等)，接著通過(guò)應(yīng)用最大閾值水平的合適選擇物(取決于選擇標(biāo)志基因，在本情況下是"草甘膦")，從一組未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞物質(zhì)回收經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞。典型地，外植體被轉(zhuǎn)移進(jìn)新鮮提供的同樣的培養(yǎng)基，進(jìn)^f亍常規(guī)培養(yǎng)。隨后，在放置到補(bǔ)充有最大閾值水平的選擇試劑(例如"草甘膦")的尋生培養(yǎng)基上之后，經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞分化為芽。然后將芽轉(zhuǎn)移至選擇性生根培養(yǎng)基，用于得到生根的芽或小植林(plantlet)。然后轉(zhuǎn)基因小植抹生長(zhǎng)為成熟植物，產(chǎn)生能繁殖的種子(例如，HieiWa7.(1994)f力e戶/s/^/oi/r/a/6:271—282;Ishidaefa/.(1996)iVa"re"/ofec/wo/o^r14:745-750)。典型地，將外植體轉(zhuǎn)移至新鮮提供的同樣的培養(yǎng)基，進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。關(guān)于用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的技術(shù)和方法的一般性描述見AyresandPark(1994)6W〃ca"e".,//7尸/a/7f5We/7ce13:219-239和BommineniandJauhar(1997)#<27&'ca42:107-120。因?yàn)榻?jīng)轉(zhuǎn)化的材料含有很多細(xì)胞；在經(jīng)處理的任何耙愈傷組織或組織或細(xì)胞群中，經(jīng)轉(zhuǎn)化的和未經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞兩者都存在。殺死未經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞以及允許細(xì)胞增殖的能力產(chǎn)生了經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物培養(yǎng)物。通常，去除未經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的能力是迅速回收經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞以及成功生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物的限制。可以使用分子及生物化學(xué)方法，以驗(yàn)證轉(zhuǎn)基因植物基因組中整合進(jìn)來(lái)的異源感興趣的基因的存在?？梢酝ㄟ^(guò)下述若干方法之一來(lái)進(jìn)行對(duì)轉(zhuǎn)基因植物的生產(chǎn)，所述方法包括但不限于通過(guò)農(nóng)桿菌將異源DNA引入植物細(xì)胞(農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化)、用附著到微粒上的異源外來(lái)DM轟擊植物細(xì)胞，以及若千其它非顆粒式的直接介導(dǎo)方法(例如，HieiefaA(1994)r力e戶/a/^/ou772a/6:271-282;Ishidaefa人(1996)5yotec力/zo7c^/14:745-750;AyresandPark(1994)Cr/〃c"^/ew//7/a/7f5We"ce13:219—239;BommineniandJauhar(1997)y^7力'cfl42:107-120)來(lái)轉(zhuǎn)移DM。用于轉(zhuǎn)化葉綠體的方法是本領(lǐng)域已知的。見，例如，Svabefa/.(1990)戶roc.^a〃.Sc/.^^87:8526-8530;SvabandMaliga(1993)戶roc.Jca^脫90:913-917;SvabandMaliga(1993)/.12:601-606。該方法依賴于對(duì)于含有選擇性標(biāo)志的DNA的微粒槍遞送，以及通過(guò)同源重組將DM靶向到質(zhì)體基因組。此成，這通過(guò)核編碼的、質(zhì)體介導(dǎo)的RM聚合酶的組織偏愛(ài)性表達(dá)來(lái)進(jìn)行。此類體系報(bào)道于McBridea/.(1994)尸roc.W"/.Sc/.咖91:7301-7305中?？捎脗鹘y(tǒng)方法將已^皮轉(zhuǎn)化的細(xì)胞培養(yǎng)成植物。見，例如，McCormickera7.(1986)尸/a力fCe//Ae;or"5:81-84。然后可對(duì)這些植物力口以培養(yǎng)，以及用同樣的經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化的抹系或不同抹系對(duì)其進(jìn)行授粉，鑒定出具有組成性表達(dá)的想要的表型特征的、得到的雜交體?？膳囵B(yǎng)兩代或更多代，以確保想要的表型特征的表達(dá)穩(wěn)定保持并遺傳，然后收獲種子，以確保獲得了想要的表型特征表達(dá)。以這種方式，本發(fā)明提供了下述經(jīng)轉(zhuǎn)化的種子(也被稱為"轉(zhuǎn)基因種子")，其具有穩(wěn)定并入其基因組的本發(fā)明核苷酸構(gòu)建體(例如，本發(fā)明的表達(dá)盒)。植物本發(fā)明可用于轉(zhuǎn)化任何植物物種，其包括但不限于單子葉植物和雙子葉植物。感興趣的植物的例子包括但不限于，玉米、高粱、小麥、向日葵、番茄、十.字花科植物、胡椒、土豆、棉花、水稻、大豆、甜菜、甘蔗、煙草、大麥和油菜籽(oilseedrape)、"raw/cfl、紫花苜蓿、罵麥、栗、紅花、花生、甘薯、木薯、咖啡、椰子、菠蘿、柑橘樹、可可、茶、香蕉、鱷梨、無(wú)花果、番石榴、芒果、橄欖、番木瓜、腰果、澳大利亞堅(jiān)果(macadamia)、杏仁、燕麥、蔬菜、裝飾用植物和針葉樹。蔬菜包括但不限于番茄、萵苣、青豆(greenbean)、利馬豆、豌豆和Curcumis屬的成員，例如黃瓜、甜瓜(cantaloupe)和香瓜(muskmelon)。裝飾用植物包括但不限于，杜鵑、八仙花(hydrangea)、芙蓉、玫瑰、郁金香、水仙、矮牽牛、康乃馨、猩猩木和菊花。優(yōu)選地，本發(fā)明的植物是作物植物(例如，玉米、高粱、小麥、向日葵、番茄、十字花科植物、胡椒、土豆、棉花、水稻、大豆、甜菜、甘蔗、煙草、大麥、油菜籽等)。本發(fā)明特別適合用于單子葉植物家族的任何成員，其包括但不限于玉米、水稻、大麥、燕麥、小麥、高粱、黑麥、蔗糖、菠蘿、山藥(yam)、洋蔥、香蕉、椰子和棗。對(duì)植物轉(zhuǎn)化的評(píng)估將異源外來(lái)DNA引入植物細(xì)胞之后，通過(guò)多種方法，例如，對(duì)與整合的基因相關(guān)的核酸、蛋白質(zhì)和代謝產(chǎn)物的分析，來(lái)驗(yàn)證植物基因組中異源基因的轉(zhuǎn)化或整合。PCR分析是針對(duì)在種植進(jìn)土壤之前的早期階段并入的基因的存在，篩選經(jīng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞、組織或芽的快速方法(SambrookandRussel1(2001)#o/eci//arC/o/2//7f^Za6or"or/(ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY))。使用特異于感興趣的基因或農(nóng)桿菌載體背景等的寡核苷酸引物來(lái)進(jìn)行PCR?？梢酝ㄟ^(guò)對(duì)基因組DM進(jìn)行Southern印跡分析來(lái)驗(yàn)證植物轉(zhuǎn)化(上文所述的SambrookandRussell(2001))。通常，從轉(zhuǎn)化子提取總DNA，用合適的限制性酶消化，在瓊脂糖凝膠中分級(jí)分離，并轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜或尼龍膜。然后可以按照標(biāo)準(zhǔn)方法(上文所述的SambrookandRussell,2001)，用，例如，經(jīng)放射性標(biāo)記的32P靶DM片段對(duì)膜或"印跡"加以探測(cè)，以驗(yàn)證引入的基因在植物基因組中的整合。在Northern分析中，按照本領(lǐng)域中常規(guī)使用的標(biāo)準(zhǔn)程序(如上文所述的SambrookandRussell(2001))，從轉(zhuǎn)化子的特定組織分離RM，在甲醛瓊脂糖凝膠上進(jìn)行分級(jí)分離，然后印到尼龍濾膜上.然后按照本領(lǐng)域已知的方法(如上文所述的SambrookandRussell(2001)),通過(guò)用濾膜與從GDC獲得的放射性探針雜交，對(duì)grg8編碼的RNA的表達(dá)加以檢測(cè)。Western印跡和生物化學(xué)試驗(yàn)等可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法(如上文所述的SambrookandRussell(2001))在轉(zhuǎn)基因植物上進(jìn)行，以確定除草劑抗性基因編碼的蛋白質(zhì)的存在，其中使用與除草劑抗性蛋白上存在的一種或多種表位結(jié)合的抗體。下述實(shí)施例以闡述方式提供，而不作限制之用。實(shí)驗(yàn)實(shí)施例1:分離ATX4145通過(guò)將土壤樣品分散到含有草甘膦作為唯一磷源的EnrichedMinimalMedia(EMM)上來(lái)分離ATX4145。因?yàn)镋MM不含芳香族氨基酸，菌林為了在該培養(yǎng)基上生長(zhǎng)必須對(duì)草甘膦有抗性。將兩克土壤懸浮于大約30ml水中，在超聲波水浴中超聲波處理30秒。旋轉(zhuǎn)震蕩(vortex)樣品5秒，令其靜置60秒。該過(guò)程重復(fù)3次。取100W該懸浮液，加入到含有4mM草甘膦的3mlEMM(pH6.0)中。EMM含有(每900ml):10g蔗糖、2gNaN03、1.0ml0.8MMgSO"1.0ml0.1MCaCh、1.0ml痕量元素溶液(在100mllOOOx溶液中0.1gFeS047H20、0.5mgCuS045H20、1.0mgH萬(wàn)、1.0mgMnS045H20、7.0mgZnS04.7H20、1.0mgMo03、4.0gKC1)。于21。C在組織培養(yǎng)輥筒(rollerdrum)上對(duì)培養(yǎng)物振蕩16天，然后用100Ml接種3ml新鮮的E醒，其中含有作為唯一磷源的4mM草甘膦。5天后，用100Hi接種另外的新鮮的3ml培養(yǎng)物。足夠的培養(yǎng)之后，通過(guò)用1W的環(huán)劃線到瓊脂平板(含有E醒瓊脂，其中含有5mM草甘膦作為唯一的磷源)表面上，來(lái)將培養(yǎng)物涂布到固體培養(yǎng)基上，J^藏于-21。C。然后對(duì)培養(yǎng)物重復(fù)涂板，以進(jìn)行分離。由于其在存在高濃度草甘膦的情況下生長(zhǎng)的能力，選出被稱為ATX"45的一種特定菌林，在LuriaBertani(LB)瓊脂上，菌落是白色的、圓形的，大小(pinsize)為1mm，革蘭氏染色陰性。實(shí)施例2.制備及篩選粘粒文庫(kù)使用本領(lǐng)域公知的方法，從ATX4145的培養(yǎng)物提取總DNA。按照廠商說(shuō)明書，用限制性酶i^w^7對(duì)DNA進(jìn)行部分消化，與SuperCos(Stratagene)載體片段連接。使用GigaPackIIIXL包裝提取物(Stratagene)將連接產(chǎn)物包裝進(jìn)噬菌體顆粒，轉(zhuǎn)染進(jìn)大腸桿菌細(xì)胞，涂布到含有50Pg/ml卡那霉素的LB瓊脂上，篩選含有粘粒的菌落。撿出大約1100個(gè)菌落用于篩選。在含有50fxg/ml卡那霉素的豐富液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)菌落，然后用針挑到M63瓊脂培養(yǎng)基上，該培養(yǎng)基含有50Pg/邁1卡那霉素和7mM草甘膦。M63瓊脂培養(yǎng)基含有100mMKH2P04、15mM(NH4)2S04、50MMCaCl2、1MMFeS04、50MMMgCh、55niM葡萄糖、25mg/升的L-脯氨酸、10mg/升的鹽酸硫胺素、足夠的NaOH以將pH調(diào)節(jié)為7.0，以及15g/升的瓊脂。鑒定出在存在7mM草甘膦時(shí)生長(zhǎng)的若干個(gè)菌落。從這些菌落中的每個(gè)制備粘粒，再次轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌XL1BlueMRF細(xì)胞。在每種情況下，經(jīng)過(guò)粘粒DNA再轉(zhuǎn)化的細(xì)胞在存在5mM草甘膦時(shí)能在M63培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，而含有空的SuperCos載體的細(xì)胞則不長(zhǎng)。被稱為3-M5的一個(gè)粘粒被選用來(lái)進(jìn)行進(jìn)一步分析。該粘粒后來(lái)被重新命名為pAX298。實(shí)施例3.在粘粒pAX298中鑒定gr《《為鑒定出負(fù)責(zé)粘粒PAX298所顯示出來(lái)的草甘膦抗性的基因，用可轉(zhuǎn)座元件對(duì)來(lái)自該克隆的DNA進(jìn)行誘變。用這種方法，鑒定出已經(jīng)歷轉(zhuǎn)座子插入并且丟失了賦予草甘膦抗性的能力的克隆。轉(zhuǎn)座子插入的定位鑒定出負(fù)責(zé)草甘膦抗性表型的開放讀碼框。使用EZ::TN插入試劑盒(Epicentre,Madison,WI)和廠商的方案，對(duì)粘粒pAX298進(jìn)行體外轉(zhuǎn)座子誘變。該方法向粘粒DNA中隨機(jī)插入轉(zhuǎn)座子片段，由此隨機(jī)破壞粘粒中基因的功能。這種特別的轉(zhuǎn)座子含有編碼對(duì)三甲氧節(jié)二氨嘧啶抗性的基因，因此可以通過(guò)在存在該抗生素時(shí)生長(zhǎng)的能力來(lái)選出轉(zhuǎn)座子插入克隆?？梢酝ㄟ^(guò)繪制限制性片段圖譜或者通過(guò)用在轉(zhuǎn)座子中退火的引物進(jìn)行測(cè)序，來(lái)測(cè)定轉(zhuǎn)座子插入的定位。將PAX298的轉(zhuǎn)座子插入克隆涂布到含有草甘膦的M63培養(yǎng)基上。發(fā)現(xiàn)有三個(gè)克隆丟失了在存在草甘膦時(shí)生長(zhǎng)的能力，這表明轉(zhuǎn)座子已破壞了負(fù)責(zé)抗性的基因。使用本領(lǐng)域公知的測(cè)序方法，對(duì)含有轉(zhuǎn)座子插入的pAX298區(qū)域測(cè)定DNA序列，其如下文所示。鑒定出了開放讀碼框(0RF，SEQIDN0:1的從第296至第1555堿基)。對(duì)來(lái)自丟失了對(duì)草甘膦的抗性的四個(gè)轉(zhuǎn)座子插入檢出菌落的序列信息的分析揭示所有四個(gè)插入都在0RF中。這表明ORF編碼了粘粒賦予的抗性。實(shí)施例4.GRG8與其它蛋白的同源性該0RF的推斷氨基酸序列與EPSP合酶具有同源性，這表明該0RF編碼EPSP合酶。將粘粒pAX298轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌ar"-，這是其中天然ard基因(編碼EPSP合酶)已缺失的菌抹。該菌林不能在M63培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，因?yàn)槠湫枰庠刺峁┑姆枷阕灏被?。粘粒pAX298的存在補(bǔ)全wW-表型，即，其允許該菌株在M63培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，而無(wú)須外源提供的芳香族氨基酸。這是粘粒含有EPSP合酶基因的進(jìn)一步證據(jù)。該基因被稱為grg《。對(duì)推斷出的氨基酸序列(SEQIDN0:3)的檢查揭示其不含II類EPSP合酶所典型的四個(gè)結(jié)構(gòu)域。因此，這是新穎的、非II類、草甘膦抗性EPSP合酶。實(shí)施例5.對(duì)gr^y進(jìn)行工程改造，用于在大腸桿菌中表達(dá)GRG8蛋白通過(guò)PCR擴(kuò)增grg《開放讀碼框(0RF)，將其克隆進(jìn)質(zhì)粒栽體pCR-Blunt-II(來(lái)自Invitrogen)，轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌菌抹DH5oc,制備質(zhì)粒DNA，通過(guò)限制性消化來(lái)測(cè)定插入物的存在和定向。一個(gè)克隆含有相對(duì)于載體中的lac啟動(dòng)子而言正向的0RF。該質(zhì)粒被稱為pAX299。對(duì)該插入物進(jìn)行測(cè)序，針對(duì)賦予對(duì)草甘膦的抗性的能力對(duì)該質(zhì)粒加以測(cè)試。于2004年12月21日將含有fW0RF的質(zhì)粒pAX299保藏于AgriculturalResearchServiceCultureCollection(證U，分配的編號(hào)為No.NRRLB-30804。實(shí)施例6.gi^《賦予對(duì)高水平草甘膦的抗性使用含有空載體的細(xì)胞作為對(duì)照，針對(duì)在存在草甘膦時(shí)在M63培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的能力，對(duì)pAX299加以測(cè)試。將宿主菌林DH5ot中的質(zhì)粒pAX296用作陰性對(duì)照。該質(zhì)粒含有克隆進(jìn)載體pCR-Blunt-II的煙草基因組DM的片段。結(jié)果概括于表l中。兩種菌林的起始培養(yǎng)物生長(zhǎng)于含有50Hg/ml卡那霉素的M63培養(yǎng)液中，以維持質(zhì)粒。將起始培養(yǎng)物稀釋至大約相等的細(xì)胞密度(通過(guò)測(cè)量0D600測(cè)定的)，然后按照1至200稀釋進(jìn)3mlM63培養(yǎng)液(含有0至200mM草甘膦)。每種濃度的每種菌林取重復(fù)的三份3ml培養(yǎng)物進(jìn)行培養(yǎng)。在恒定振蕩下于37。C對(duì)培養(yǎng)物加以培養(yǎng)。大約46小時(shí)后，回收0.3ml的小份，測(cè)量OD,。結(jié)果示于表1中。數(shù)值代表平均值+標(biāo)準(zhǔn)偏差。這些結(jié)果顯示，GRG8賦予對(duì)高水平的草甘膦的抗性。表l.含有g(shù)rg8的pAX299的草甘膦抗性<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>實(shí)施例7.純化在大腸桿菌中作為6xHis標(biāo)簽化蛋白質(zhì)表達(dá)的GRG8使用PfuUltra脇polymerase(Stratagene),通過(guò)PCR擴(kuò)增g7^編碼區(qū)域。設(shè)計(jì)用于引導(dǎo)PCR的寡核苷酸，以在得到的PCR產(chǎn)物的5，和3，末端附近引入限制性酶識(shí)別位點(diǎn)。用消化得到的PCR產(chǎn)物。將經(jīng)消化的產(chǎn)物克隆進(jìn)通過(guò)用5WI消化制備的6xHis標(biāo)簽表達(dá)載體pRSFlb(Novagen)。得到的克隆含有處于與6xHis標(biāo)簽同一翻譯讀碼框中的GRG8，并且在該標(biāo)簽的恰好C-末端。用于產(chǎn)生此類克隆，以及用于表達(dá)含有6xHis標(biāo)簽的蛋白的一般性策略是本領(lǐng)域已知的。通過(guò)將細(xì)胞涂布到含有5mM草甘膦的M63培養(yǎng)基上來(lái)驗(yàn)證該克隆賦予草甘膦抗性的能力。確定含有g(shù)rg《的克隆在該濃度的草甘膦上生長(zhǎng)的能力?？稍赟DS-PAGE蛋白質(zhì)凝膠上測(cè)定GRG8蛋白的表達(dá)水平?？梢园凑諒S商說(shuō)明書，通過(guò)色譜(例如，在Ni-NTASuperflowResin(Qiagen)上進(jìn)行的)，對(duì)謙導(dǎo)的GRG8蛋白進(jìn)行純化，來(lái)分離GRG8蛋白。實(shí)施例8.對(duì)gM《的誘變以及對(duì)功能性變體的分離使用本領(lǐng)域已知的基于PCR的誘變，對(duì)g/^開放讀碼框進(jìn)行誘變。使用變化的量的輸入DNA，使用Genemorph誘變?cè)噭┖?Stratagene),對(duì)含有g(shù)rg《的質(zhì)粒pAX700進(jìn)行擴(kuò)增。純化得到的PCR產(chǎn)物，用5a威I和治'/k/HI進(jìn)行消化，重新純化，并連接進(jìn)經(jīng)修飾pRSFlb載體(Novagen)。將得到的文庫(kù)轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌，挑進(jìn)384孔板，在37。C培養(yǎng)至飽和。將得到的384貯板(stockplate)印到最小培養(yǎng)基(M63plus)上，該培養(yǎng)基補(bǔ)充有卡那霉素并且具有不同濃度的草甘膦。選出賦予對(duì)50mM草甘膦的抗性的經(jīng)誘變克隆(如表2所示)。對(duì)于這些克隆的亞組，制備DNA，測(cè)定wg《變體的DM序列。表2.表達(dá)gr^變體的大腸桿菌在存在草甘膦時(shí)的生長(zhǎng)<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>實(shí)施例9.對(duì)ffr^P進(jìn)行功能改造，用于植物轉(zhuǎn)化通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，從全長(zhǎng)cDNA模板擴(kuò)增^rg《開放讀碼框(0RF)。PCR期間向0RF的每個(gè)末端都加上#//7cnn限制性位點(diǎn)。此外，在基因的起始密碼子的恰好5，處加入核苷酸序列ACC,以增加翻譯效率(Kozak(1987)15:8125-8148;Joshi(1987)^f/c7e/ciesearc力15:6643-6653)。使用本領(lǐng)域公知的技術(shù)，對(duì)PCR產(chǎn)物克隆并測(cè)序，以確保PCR期間沒(méi)有引入突變。用例如iW/^in消化含有^rg《PCR產(chǎn)物的質(zhì)粒，分離含有完整0RF的片段。在該實(shí)施例中，將片段克隆進(jìn)質(zhì)粒(例如pAX200，這是含有7jc稻肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子(McElroyets厶(1991)#o/ec.Ce仏Ce/7e"231:150-160)和PinII終止子(Anefa/(1989)r力e戶7a/^Ce/71:115-122)的植物表達(dá)載體)的W/2cfni位點(diǎn)。然后將來(lái)自該中間質(zhì)粒的啟動(dòng)子-基因-終止子片段亞克隆進(jìn)質(zhì)粒，例如pSBll(JapanTobacco,Inc.)，以形成最終的質(zhì)粒，其在本文中被稱為pSBllGRG8。對(duì)pSBllGRG8加以組織，使得含有啟動(dòng)子-^^《-終止子構(gòu)建體的DNA片段可通過(guò)合適的限制性酶進(jìn)行的雙消化被切割，并還用于通過(guò)例如氣溶膠膠束注射轉(zhuǎn)化進(jìn)植物。通過(guò)限制性消化和凝膠電泳，以及通過(guò)跨越多個(gè)克隆連接處的測(cè)序，來(lái)驗(yàn)證pSBllGRG8的結(jié)構(gòu)。使用本領(lǐng)域公知的三親林交配方案，并涂布到含有壯觀霉素的培養(yǎng)基上，將質(zhì)粒移入根癌農(nóng)桿菌菌林LBA4404，其還含有質(zhì)粒pSBl(JapanTobacco,Inc.)。質(zhì)粒pSBllGRG8攜帶有抗生素抗性，但是其是窄宿主范圍的質(zhì)粒，并且不能在農(nóng)桿菌中復(fù)制。當(dāng)pSBllGRG8通過(guò)同源重組整合進(jìn)廣宿主范圍的質(zhì)粒，例如pSBl中時(shí)，產(chǎn)生抗生素抗性菌落。通過(guò)Southern雜交驗(yàn)證得到的共整合產(chǎn)物。攜帶有共整合物的農(nóng)桿菌菌抹然后可用于轉(zhuǎn)化玉米，例如，通過(guò)Purelntro方法(JapanTobacco)進(jìn)行。實(shí)施例10.將《r^轉(zhuǎn)化進(jìn)植物細(xì)胞在授粉后8-12天的最好時(shí)機(jī)收集玉米穗。從穗上分離胚，大小為0.8-1.5mm的胚優(yōu)選用于轉(zhuǎn)化。以盾片側(cè)朝上的方式將胚分布到合適的孵育培養(yǎng)基上，例如DN62A5S培養(yǎng)基(3.98g/LN6鹽；1mL/L(的1000xHi液)N6維生素；800mg/LL-天冬酰胺；100mg/LMyo-肌醇；1.4g/LL-脯氨酸；100mg/L酪蛋白氨基酸；50g/L蔗糖；1mL/L(的1mg/mL貯液)2，4-D)。但是，非DN62A5S的培養(yǎng)基和鹽也是合適的，并且是本領(lǐng)域已知的。在黑暗中于25。C對(duì)胚進(jìn)行過(guò)夜培養(yǎng)。但是，對(duì)胚進(jìn)行過(guò)夜培養(yǎng)本身并非必須。將得到的外植體轉(zhuǎn)入方形篩網(wǎng)(每板30-40)，轉(zhuǎn)到滲透培養(yǎng)基上，大約30-45分鐘，然后轉(zhuǎn)入膠束處理(beaming)板(見，例如PCT發(fā)明者P·E·哈默,T·K·欣森申請(qǐng)人:阿則耐克斯公司