專利名稱：：編碼植物脂肪酸去飽和酶基因的核酸分子及其使用方法編碼植物脂肪酸去飽和酶基因的核酸分子及其使用方法本發(fā)明要求于2004年12月20日遞交的美國臨時申請60/637531的優(yōu)先權(quán)，此處整體引用作為參考。發(fā)明領(lǐng)域此處描述了植物遺傳工程領(lǐng)域的發(fā)明，包括編碼脂肪酸去飽和酶2樣(E4D2樣)多肽的分離的核酸分子，以提高其農(nóng)藝、園藝和品質(zhì)性狀，本發(fā)明一般性涉及與植物中種子貯存化合物的存在相關(guān)的蛋白質(zhì)的編碼核酸序列。更具體而言，本發(fā)明涉及脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的/^2X2樣編碼核酸序列，及這些序列在轉(zhuǎn)基因植物中的用途。具體而言，本發(fā)明涉及脂質(zhì)代謝相關(guān)化合物的操作方法，以及在植物和種子中提高油水平和改變脂肪酸組成的方法。本發(fā)明還涉及應(yīng)用這些新植物多肽刺激植物生長和/或提高產(chǎn)率和/或種子貯存化合物組成的方法。發(fā)明背景對植物進(jìn)行研究和遺傳操作的歷史已久，甚至始于格里戈.孟德爾(GregorMendel)的著名研究之前.從提高土豆塊莖的淀粉含量到提高或改變油料種子植物如蕓苔(canola)和向日葵的脂肪酸含量，在該學(xué)科的完善中，科學(xué)家們已經(jīng)實現(xiàn)了對植物特定性狀的改良，隨著植物油的消費和使用不斷增加，對于種子油含量和種子油水平的改良也日益廣泛(如T6pfer等，1995，Science268:681-686)。對轉(zhuǎn)基因植物中生物合成路徑的操作為分子生物學(xué)家及植物生化學(xué)家們提供了影響植物代謝從而產(chǎn)生特定的更高價值產(chǎn)品的許多機(jī)會.已改變了許多傳統(tǒng)油料種子植物和非傳統(tǒng)油料種子植物的種子油的產(chǎn)量或組成，傳統(tǒng)油料種子植物如大豆(美國專利No.5,955,650)、蕓苔(美國專利No.5,955,650)、向日葵(美國專利No.6,084,164)和油菜籽(T6pfer等人，1995,Science268:681-686)，非傳統(tǒng)油料種子植物如煙草(Cahoon等，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:11184-11188).植物種子油同時含有中性及極性脂質(zhì)(見表1)。中性脂質(zhì)主要包括甘油三酯，為種子油體中累積的主要貯存脂質(zhì)。極性脂質(zhì)則主要見于種子細(xì)胞的多種膜內(nèi)，如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、#^立體膜和細(xì)胞膜，中性和極性脂質(zhì)含有幾種常見的脂肪酸(見表2)以及一系列較少見的脂肪酸。膜脂質(zhì)中脂肪酸的組成受到高度調(diào)節(jié)，其中僅存在有限幾種脂肪酸。另一方面，許多植物物種種子的中性貯存脂質(zhì)中含有大量的少見脂肪酸(VandeLooF.J.等人，1993，UnusualFattyAcidsinLipidMetabolisminPlants,第91-126頁，編輯TSMooreJr.CRCPress;Millar等，2000，TrendsPlantSci.5:95-101)。脂質(zhì)由脂肪酸合成且其合成可分為兩部分原核路徑和真核路徑(Browse等人，1986，BiochemicalJ.235:25-31;Ohlrogge&Browse,1995，PlantCell7:957-970)。原核路徑位于質(zhì)體中，后者為脂肪酸生物合成的初始位點，通過乙酰輔酶A羧化酶(ACCase)將乙酰輔酶A轉(zhuǎn)化為丙二酰輔酶A，起始脂肪酸的生物合成。丙二酰輔酶A隨后由丙二酰輔酶A:ACP酰基轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)移到丙二酰酖基栽體蛋白(ACP)上.P-酮?；鵄CP合酶III(KASIII)催化縮合反應(yīng)，其中將來自乙跣輔酶A的g基團(tuán)轉(zhuǎn)移到丙二酰ACP上形成3-酮丁酰ACP。在隨后系列的縮合、還原以及脫水反應(yīng)中，ACP輔因子上新生的脂肪酸鏈通過一步步地添加(縮合)由丙二酰ACP所提供的兩個碳原子而得以延長，直至形成16或18碳的飽和脂肪酸鏈.質(zhì)體A9?；鵄CP去飽和酶將第一個非飽和的雙鍵引入脂肪酸。硫酯酶將脂肪酸從ACP輔因子上切下，而游離脂肪酸被輸出到胞質(zhì)中，在那里作為脂肪酰基輔酶A酯參與真核路徑。在該路徑中，脂肪酸分別通過甘油-3-磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶和溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶酯化甘油-3-磷酸的sn-1和sn-2位，產(chǎn)生磷脂酸(PA)。PA是其他極性和中性脂質(zhì)的前體，其中后者生成于Kennedy路徑(Voelker，1996，GeneticEngineering，Setlow編18:111-113;Shanklin&Cahoon,1998，Annu.Rev.PlantPhysiol.PlantMol.Biol.49:611-641;Frentzen，1998，Lipids100:161-166;Millar等人，2000，TrendsPlantSci.5:95-101)。種子中的貯存脂質(zhì)由糖類衍生的前體合成。植物胞質(zhì)溶膠中具有完整的糖酵解路徑(Plaxton，1996，Annu.Rev.PlantPhysiol.PlantMol.Biol.47:185-214)，且業(yè)已表明油菜籽質(zhì)體中也存在完整的路徑(Kang&Rawsthorne,1994，PlantJ.6:795-805)。蔗糖是碳和能源的主要來源，其從葉轉(zhuǎn)移至發(fā)育的種子中。在種子貯存期間，蔗糖轉(zhuǎn)化進(jìn)胞質(zhì)溶膠，提供代謝前體葡萄糖-6-磷酸和丙酮酸。它們被轉(zhuǎn)運進(jìn)質(zhì)體并轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A，作為脂肪酸合成的主要前體。質(zhì)體中的乙酰輔酶A是脂質(zhì)生物合成的中心前體。乙酰輔酶A可通過不同的反應(yīng)在質(zhì)體中形成，且各反應(yīng)的確切作用仍在討論中(Ohlrogge&Browse,1995，PlantCell7:957-970)。然而人們認(rèn)可大部分乙酰輔酶A來自從細(xì)胞質(zhì)輸入質(zhì)體的葡萄糖-6-磷酸和丙酮酸。蔗糖產(chǎn)生于源器官(葉或光合作用發(fā)生的任何地方)并被轉(zhuǎn)運至發(fā)育的種子，后者也稱為庫器官。在發(fā)育的種子中，蔗糖是所有貯存化合物即淀粉、脂質(zhì)和部分種子貯存蛋白質(zhì)的前體。因此，顯然蔗糖在其中起重要作用的糖類代謝對于種子貯存化合物的積累非常重要.貯存化合物如三SL基甘油(種子油)是發(fā)芽和幼苗生長時使用的碳和能量儲備.種子(植物)油也是人類飲食的重要成分和為化學(xué)工業(yè)提供原料的有價值的商品。雖然傳統(tǒng)植物育種方法可以改變種子油的脂質(zhì)和脂肪酸含量和/或組成，重組DNA技術(shù)的來臨使得對植物種子油含量的操作更為簡單，某些情況下能通過僅靠育種法不能完成的方法改變種子油(見如T6pfer等人，1995，Science268:681-686)。例如，向轉(zhuǎn)基因煙草中引入A"羥化酶核紗列，導(dǎo)致煙草種子油中引入新脂肪酸蓖麻油酸(VandeLoo等人，1995，Proc.Natl.Acad.SciUSA92:6743-6747)。也通過引入和表達(dá)來自茺荽的?；鵄CP去飽和酶，遺傳改造煙草植物，使之產(chǎn)生低水平的巖芽酸(Cahoon等人，1992，Proc.Natl.Acad.SciUSA89:11184-11188)。改變植物的種子油含量具有重大的醫(yī)學(xué)、營養(yǎng)和經(jīng)濟(jì)價值。就醫(yī)學(xué)價值而言，可見于許多種子油的長鏈脂肪酸(C18及更長)與高膽固醇血癥和其他冠心病相關(guān)臨床疾病的減少相關(guān)(Brenner，1976，Adv.Exp.Med.Biol.83:85-101),因此，消耗這些類型脂肪酸水平增高的植物可能會降低心臟疾病的風(fēng)險。種子油含量的水平增高也增加了種子油的大M^莫生產(chǎn)，從而降低這些油的成本。為了提高或改變植物中化合物如種子油的水平，必須鑒定調(diào)節(jié)脂質(zhì)和脂肪酸代謝的核酸序列和蛋白質(zhì)。如早先所述，已經(jīng)克隆了若干去飽和酶核酸如^去飽和酶核酸、AU去飽和酶核酸和跣基ACP去飽和酶核酸，并證實其編碼多種植物物種中脂肪酸合成必需的酶((Miquel&Browse，inSeedDevelopmentandGermination,Galili等人編，MarcelDekker，NewYork,169-193頁，1994;Ohlrogge&Browse,1995，PlantCell7:957-970).還克隆了來自不同物種如蕓苔、大豆、胡蘿卜、松樹和擬南芥Ura6iVto/;as/s^d/Za"a)的油體蛋白(oleosin)核酸序列，并確定其編碼與這些植物中油體磷脂單層膜相關(guān)的蛋白質(zhì)。盡管已知若干廣泛影響植物和種子發(fā)育的化合物，仍明確需要特異地鑒定對于貯存化合物積累的發(fā)育調(diào)節(jié)更為特異的因子以及鑒定能夠賦予其宿主植物和其他植物物種油產(chǎn)量改變或提高的基因。本發(fā)明涉及的另一問題在于提供使脂肪酸去飽和酶沉默的更有效方法.本發(fā)明涉及的另一問題在于特異性修飾種子油的脂肪酸含量。本發(fā)明涉及的另一問題在于提高種子油的油酸含量。本發(fā)明涉及的另一問題在于降低種子油的亞油酸含量。本發(fā)明公開了來自擬南芥、大豆(G/yc/"e附似,、稻(0/^fl做ftVfl)、玉米(附fl^s)、亞麻(ZJ"mwwsi/a^s:si附i/挑X大麥(^oiYitewwvw/g<we)或小麥(7W/i'c"加m幼V"w)的核酸序列。這些核酸序列可用于改變或提高植物中種子貯存化合物如蛋白質(zhì)、糖和油的水平，所述植物包括轉(zhuǎn)基因植物，例如蕓苔、亞麻子、大豆、向日葵、玉米、燕麥、棵麥、大麥、小麥、稻、胡椒、萬壽菊、棉花、油椰、椰樹、亞麻、蓖麻和花生，它們是含有大量脂質(zhì)化合物的油料種子植物。發(fā)明概述本發(fā)明提供了與植物種子貯存化合物代謝相關(guān)的新的分離的核酸和氨基酸序列，具體而言涉及i^Z)2樣序列。本發(fā)明的另一主題為包含選自如下的M酸序列的分離的多肽a.XWmUxSx^XWYL,其中Xt不為M，且X3不為T，且X7不為FV，b.gx"x"x"x"x"x"x"x"hx"x2。px"x22x"x24x2Wx28er，其中X"不為G,且X20不為F，且X"X22不為NA，c.HX29X3°PX31X32X33X34X3SX36X37X38ER，其中X^不為F，且X"X32不為NA，d.LX39X4flX41X42X43X44X4SGX46X47X48X49X50X51XS2YXS3XS4P，其中X41不為Y，且X"不為Q，且X"不為S，且X"不為M，且X^不為I，e.TXSSXS6XS7XS8HXS9X60X"X62X"X64X6SX66X67X68X69X7。X"T，其中X"不為N，f.PX72X73X74X7SX76X77X78X79X80X81X82X83X84X8sX86，其中X84X85X86不為WYV,且其中若無上述其他限定，x可代表任何氨基酸.優(yōu)選利用VectorNTISuite9.0的AlignX(2003年8月22日)生成確定權(quán)利要求1中共有肽序列a至f的序列比對。用于多重比對的M優(yōu)選如下空位開放罰分10;空位衍生罰分0.05;空位分離(s印aration)罰分范圍8;比對延遲(delay)的同一性百分比40。在本發(fā)明優(yōu)選實施方案中，要求包含選自如下的JLA^^列的分離的多肽a.AWYPYX87YX88NPX89GRLVHIX90VQLTLGWPLYLAX91NX92SGRPYPRFACHFDPYGPIYNDRER，b.FISDVGV,c.ALX"KLX外SX"FGFWWVVRVYGVP，d.ILGEYYQFDX96TPVAKAT，且其中X代表任意氨基酸。優(yōu)選利用VectorNTISuite9.0的AlignX(2003年8月22日)生成確定權(quán)利要求2中共有肽序列a至d的序列比對。用于多重比對的M優(yōu)選如下空位開放罰分10;空位延伸罰分0.05;空位分離罰分范圍8;比對延遲的同一性百分比40。本發(fā)明分離的多肽可包括l個、2個、3個、4個、5個或6個權(quán)利要求l的M酸序列.本發(fā)明分離的多肽可包括l個、2個、3個或4個權(quán)利要求2的^^酸序列.若權(quán)利要求1中未另行指定，X可代表任意氨基酸，特別是G、A、V、L、I、F、Y、W、P、D、E、N、Q、S、T、C、M、K、R、H。^不為M。在優(yōu)選實施方案中W為選自G、A、V、L、I、F、Y、W、P、D、E、N、Q、S、T、C、K、R和H的氬基酸，在更優(yōu)選的實施方案中選自F、T和H，而在甚至更優(yōu)選的實施方案中為H。乂3不為T。在優(yōu)選實施方案中乂3為選自G、A、V、L、I、F、Y、W、P、D、E、N、Q、S、C、M、K、R和H的氨基酸，在更優(yōu)選的實施方案中選自L、A、V、F，而在甚至更優(yōu)選的實施方案中為V或F。乂6不為F且X"不為V。在優(yōu)選實施方案中乂6和乂7為分別獨立選自G、A、L、I、Y、W、P、D、E、N、Q、S、T、C、M、K、R和H的氨基酸，在更優(yōu)選的實施方案中分別獨立選自P、L和T，而在甚至更優(yōu)選的實施方案中XS為P或L,而X"為L或T，而在更優(yōu)選的實施方案中乂6為L而X7為T。X"不為G。在優(yōu)選實施方案中X"為空白或選自A、V、L、I、F、Y、W、P、D、E、N、Q、S、T、C、M、K、R和H的M酸，在更優(yōu)選的實施方案中X"為R或空白，更優(yōu)選的XS為R。空白是指該位點上沒有氨基酸。X"不為F。在優(yōu)選實施方案中X^為選自G、A、V、L、I、Y、W、P、D、E、N、Q、S、T、C、M、K、R和H的^J^酸，在更優(yōu)選的實施方案中為N或D，而在甚至更優(yōu)選的實施方案中為D。X21不為N且X"不為A。在優(yōu)選實施方案中X"和X"為分別獨立選自G、V、L、I、F、Y、W、P、D、E、Q、S、T、C、M、K、R和H的氬基酸。在更優(yōu)選的實施方案中分別獨立選自D、Y、H、S、G、I。在甚至更優(yōu)選的實施方案中X"為D、Y或H，更優(yōu)選Y,而X"為S或G,更優(yōu)選G。X鄧不為F。在優(yōu)選實施方案中X鄧為選自G、A、V、L、I、Y、W、P、D、E、N、Q、S、T、C、M、K、R和H的氨基酸，在更優(yōu)選的實施方案中X"為N或D，而在甚至更優(yōu)選的實施方案中X"為D。X"不為N且X"不為A。在優(yōu)選實施方案中X"和X"為分別獨立選自G、V、L、I、F、Y、W、P、D、E、Q、S、T、C、M、K、R和H的氨基酸，在更優(yōu)選的實施方案中分別獨立選自D、Y、H、S、G.在甚至更優(yōu)選的實施方案中X"為D、Y或H,更優(yōu)選Y，而X"為S或G，更優(yōu)選G。X"不為Y。在優(yōu)選實施方案中X"為選自G、A、V、L、I、F、W、P、D、E、N、Q、S、T、C、M、K、R和H的氨基酸，在更優(yōu)選的實施方案中X"為L。X必不為Q。在優(yōu)選實施方案中X"為選自G、A、V、L、I、F、Y、W、P、D、E、N、S、T、C、M、K、R和H的絲酸，在更優(yōu)選的實施方案中選自M、K和F，而在甚至更優(yōu)選的實施方案中X"為F。X"不為S，且X"不為M且X^不為I。在優(yōu)選實施方案中X48、X49和X幼為分別獨立選自G、A、V、L、F、Y、W、P、D、E、N、Q、T、C、K、R和H的氨基酸，在更優(yōu)選的實施方案中分別獨立選自Q、W、L和V。在甚至更優(yōu)選的實施方案中X"為Q或W，更優(yōu)選X"為W，而X49、X^分別獨立選自L或V，更優(yōu)選X49、乂5()分別獨立選自V.X"不為N。在優(yōu)選實施方案中X"為選自G、A、V、L、I、F、Y、W、P、D、E、Q、S、T、C、M、K、R和H的絲酸，在更優(yōu)選的實施方案中X67為H或R，而在甚至更優(yōu)選的實施方案中X67為H。乂84不為W，且XM不為Y且X"不為V。在優(yōu)選實施方案中X84、X85和X86為分別獨立選自G、A、L、I、F、P、D、E、N、Q、S、T、C、M、K、R和H的氨基酸，在更優(yōu)選的實施方案中X"XS5XM分別獨立選自S、F、V、P、M、A、L、K和G，而在甚至更優(yōu)選的實施方案中X84X85X86為VAK。本發(fā)明也提供了編碼含有上述(權(quán)利要求1或權(quán)利要求2中)氨基酸序列的蛋白質(zhì)的分離的核^f列，以及由(權(quán)利要求3中)此類核^f列編碼的分離的多肽。在本發(fā)明的另一實施方案中，上述(權(quán)利要求1或權(quán)利要求2中)分離的多肽作為種子貯存化合物的調(diào)節(jié)物在微生物或植物中發(fā)揮作用。在本發(fā)明的另一實施方案中，上述(權(quán)利要求1或權(quán)利要求2中)分離的多肽用于提高轉(zhuǎn)基因植物中的油酸水平，相對該植物野生型品種提高1重量％、2.5重量％、5重量％、7.5重量％、10重量％、12.5重量％、15重量％、17.5重量％、20重量％、22.5重量％、25重量％或更多。在優(yōu)選實施方案中，上述(權(quán)利要求1或權(quán)利要求2中)分離的多肽具有如SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18、SEQIDNO:20、SEQIDNO:22、SEQIDNO:24、SEQIDNO:26、SEQIDNO:28、SEQIDNO:30、SEQIDNO:32、SEQIDNO:34或SEQIDNO:36中所公開的多肽序列。在更優(yōu)選的實施方案中，上述(權(quán)利要求1或權(quán)利要求2中)分離的多肽選自a.如SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18、SEQIDNO:20、SEQIDNO:22、SEQIDNO:24、SEQIDNO:26、SEQIDNO:28、SEQIDNO:30、SEQIDNO:32、SEQIDNO:34或SEQIDNO:36中所公開的多肽序列b.由如SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33或SEQIDNO:35中公開的多核苷酸序列所編碼的多肽序列；c.與上述a)或b)中多肽具有至少70%序列同一性的多肽序列。本發(fā)明還提供包含選自如下的多核苷酸序列的分離的核酸a.如SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33或SEQIDNO:35中所公開的多核b.編碼如SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18、SEQIDNO:20、SEQIDNO:22、SEQIDNO:24、SEQIDNO:26、SEQIDNO:28、SEQIDNO:30、SEQIDNO:32、SEQIDNO:34或SEQIDNO:36中所公開的多肽的多核苷酸序列；c.與上述a)或b)中核酸具有至少70%序列同一性的多核苷酸序列；d.與上述a)或b)中核酸互補的多核苷酸序列；以及e.在嚴(yán)緊條件下與上述a)或b)中核酸雜交的多核苷酸.本發(fā)明還提供選自如下的分離的多肽a.如SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33或SEQIDNO:35中公開的多核苷酸序列所編碼的多肽序列；b.如SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18、SEQIDNO:20、SEQIDNO:22、SEQIDNO:24、SEQIDNO:26、SEQIDNO:28、SEQIDNO:30、SEQIDNO:32、SEQIDNO:34或SEQIDNO:36中所公開的多肽序列；c.與上述a)或b)中多肽具有至少70%序列同一性的多肽序列。本發(fā)明也提供了來自擬南芥、大豆、稻、玉米、亞麻、大麥或小麥的分離的編碼脂質(zhì)代謝蛋白(LMP)或其部分的核酸。這些序列可用于改變或提高微生物及植物中脂質(zhì)和脂肪酸、輔因子和酶，例如提高油酸水平1重量％、2.5重量％、5重量％、7.5重量％、10重量％、12.5重量％、15重量％、17.5重量％、20重量％、22.5重量％、25重量％或更高。已知擬南芥植物中產(chǎn)生大量的脂肪酸如亞油酸和亞麻酸(參見例如表2)，并且它們與蕓苔屬(Brassica)油料作物植物在許多方面(基因同源性等)非常近似。因此，來自植物如擬南芥、歐洲油菜(丑/YIM/Cfl/lfl/Wtf)、大豆、稻、玉米、亞麻、大麥或小麥或相關(guān)生物的核酸分子特別適合于改變宿主特別是微生物和植物中的脂質(zhì)和脂肪酸代謝。另外，來自植物擬南芥、歐洲油菜、大豆、稻、玉米、亞麻、大麥或小麥或相關(guān)生物的核酸可用于鑒定其他物種中的那些DNA序列和酶，這些DNA序列和酶可用于改變相應(yīng)生物中脂肪酸前體分子的生物合成.本發(fā)明還提供了分離的核酸，其包含來自植物(擬南芥、大豆、稻、玉米、亞麻、大麥或小麥)的編碼LMP或其部分的核酸的至少15個核普酸的片段.本發(fā)明還提供了所述核酸編碼的多肽，包含由所述核酸編碼的多肽的異源多肽以及這些多肽的抗體。另外，本發(fā)明涉及并提供了LMP核酸產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的用途，所述轉(zhuǎn)基因植物種子貯存化合物的水平或組成發(fā)生改變。至于改變的組成，本發(fā)明可用于如提高油酸相對于其他植物油(如亞麻酸或亞油酸)的百分比，如提高1重量％、2.5重量％、5重量％、7.5重量％、10重量％、12.5重量％、15重量％、17.5重量％、20重量％、22.5重量％、25重量°/?；蚋?。產(chǎn)生種子貯存化合物水平或組成發(fā)生改變的轉(zhuǎn)基因植物的方法包括用含有LMP核酸的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，并從植物細(xì)胞產(chǎn)生種子貯存化合物水平或組成發(fā)生改變的植物的步驟。在優(yōu)選的實施方案中，植物為產(chǎn)油物種，例如選自蕓苔、亞麻子、大豆、向日葵、玉米、燕麥、棵麥、大麥、小麥、稻、胡椒、萬壽菊、棉花、油椰、椰樹、亞麻、蓖麻和花生。根據(jù)本發(fā)明，本文描述的組合物和方法可用于改變轉(zhuǎn)基因植物的LMP組成，以及提高或降低轉(zhuǎn)基因植物的LMP水平，包括增加或減少該植物中LMP核酸的表達(dá)?？梢酝ㄟ^轉(zhuǎn)基因過表達(dá)、共抑制方法、反義抑制方法或LMP核酸的體內(nèi)誘變來增加或減少LMP核酸的表達(dá)。本發(fā)明也可用于提高或降低種子油中的脂質(zhì)水平(如1重量％、2.5重量％、5重量％、7.5重量％、10重量％、12.5重量％、15重量％、17.5重量％、20重量％、22.5重量％、25重量％或更多)、提高或降低種子油中的脂肪酸水平(如l重量％、2.5重量％、5重量％、7.5重量％、10重量％、12.5重量％、15重量％、17.5重量％、20重量％、22.5重量％、25重量％或更多)，或提高或降低種子或植物中的淀粉水平(如1重量％、2.5重量％、5重量％、7.5重量％、10重量％、12.5重量％、15重量％、17.5重量％、20重量％、22.5重量％、25重量％或更多)。微RNA(miRNA)是進(jìn)化保守的植物和動物基因表達(dá)的基于RNA的調(diào)節(jié)物。MiRNA(21至25nt)來自較大的具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的前體，所述前體由非蛋白質(zhì)編碼基因轉(zhuǎn)錄而來。miRNA尋靶特定的mRNA，在轉(zhuǎn)錄后水平(即降解mRNA)或翻譯水平(即抑制蛋白質(zhì)合成)上抑制基因表達(dá)(BartelD2004，Cell116，281-297)。可以設(shè)計微RNA前體(前miRNA)，使由前miRNA編碼的內(nèi)源性miRNA能被某miRNA取代，以尋靶目的基因如dsRed報告基因。本發(fā)明還提供了產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述轉(zhuǎn)基因植物的油酸水平與其野生型相比提高，所述方法包括，a.第一步用RNA前體構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，且b.第二步從該植物細(xì)胞產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物，其中所述構(gòu)建體含有在植物細(xì)胞中驅(qū)動表達(dá)的啟動子，該啟動子有效連于編碼前體微RNA序列的核苷酸序列，其中編碼所述微RNA前體序列的核苷酸序列選自a.如SEQIDNO:47所示的核苷酸序列b.與上述a)中核酸具有至少70%序列同一性的多核苷酸序列；c.與上述a)中核酸互補的多核苷酸序列；以及d.在嚴(yán)緊條件下與上述a)中核酸雜交的多核苷酸序列。編碼脂肪酸去飽和酶的玉米基因表達(dá)于許多組織包括種子中。與玉米去飽和酶mRNA的編碼區(qū)或5，UTR和3，UTR互補的19至21nt(如SEQIDNO:40所述的ACCAGACCCCGAACGCCGC),可用于取代如SEQIDNO:37描述的ZmmiR166(5，tcggaccaggcttcattcccc3，)，以及SEQIDNO:38的ZmmiR166前體.該轉(zhuǎn)基因隨后可轉(zhuǎn)化入玉米。遺傳改造的ZmmiR166基因的表達(dá)可受玉米種子特異性啟動子(例如胚乳特異性IOKD玉米醇溶蛋白啟動子或Globl胚特異性啟動子)的控制.微RNA(例如SEQIDNO:40所述的ACCAGACCCCGAACGCCGC)一般在加工遺傳改造的Zmm股166前體時在種子中產(chǎn)生。該miRNA可特異性結(jié)合于玉米脂肪酸去飽和酶mRNA中與該miRNA互補的區(qū)域，從而通過基因沉默機(jī)器在轉(zhuǎn)錄或翻譯水平導(dǎo)致種子中所靶向的玉米去飽和酶的表達(dá)下降。因此，轉(zhuǎn)基因植物優(yōu)選玉米能夠具有期望的脂肪酸水平和組成，例如種子中低亞油酸和/或中或高油酸重量百分比。本發(fā)明還提供了通過產(chǎn)生油酸水平相對于野生型提高的轉(zhuǎn)基因植物，改變、優(yōu)選降^f氐脂肪酸去飽和酶表達(dá)的方法，所述脂肪酸去飽和酶尤其是由FAD2直向同源物編碼，更優(yōu)選由附錄A中核酸編碼，在優(yōu)選實施方案中如SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33或SEQIDNO:35所述，該方法包括a.第一步用RNA前體構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，且b.第二步從該植物細(xì)胞產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物，其中所述構(gòu)建體含有在植物細(xì)胞中驅(qū)動表達(dá)的啟動子，該啟動子有效連于編碼前體微RNA序列的核苷酸序列，其中編碼所述微RNA前體序列的核苷酸序列選自a.如SEQIDNO:47所示的核苷酸序列b.與上述a)中核酸具有至少70%序列同一性的多核苷酸序列；c.與上述a)中核酸互補的多核苷酸序列；以及d.在嚴(yán)緊條件下與上述a)中核酸雜交的多核苷酸序列。在優(yōu)選實施方案中，設(shè)計編碼前體微RNA序列的核苷酸序列，使編碼SEQIDNO:37所示微RNA的核苷酸序列被編碼SEQIDNO:40所示微RNA的核苷酸序列所取代。，設(shè)計的微RNA前體和微RNA在調(diào)節(jié)基因表達(dá)中的用途眾所周知，敘述于如US2004/0268441中，后者在此處整體引用。設(shè)計的微RNA前體可用于調(diào)節(jié)一個或數(shù)個乾基因的表達(dá)，例如1個、2個、3個、4個或5個如SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33或SEQIDNO:35所示的核苷紗列。設(shè)計的微RNA前體和微RNA在調(diào)節(jié)基因表達(dá)中的用途可與其他本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的基因工程方法聯(lián)合使用，啟動子可為普遍表達(dá)的的或組織特異性的，例如種子特異性和胚乳特異性的。啟動子優(yōu)選為種子特異性啟動子，該方法可用于有效提高種子中的油酸水平，如提高1重量％、2.5重量％、5重量％、7.5重量％、10重量％、12.5重量％、15重量％、17.5重量％、20重量％、22.5重量％、25重量％或更多。設(shè)計的微RNA前體和微RNA在調(diào)節(jié)基因表達(dá)中的用途可用于各種植物，特別是用于此處所述的植物，在優(yōu)選實施方案中用于單子葉植物，而在更優(yōu)選實施方案中用于玉米。本發(fā)明的另一目的在于分離的核酸，其含有選自如下的多核苷酸序列a.如SEQIDNO:47所示的核苷酸序列b.與上述a)中核酸具有至少70%序列同一性的多核苷酸序列；c.與上述a)中核酸互補的多核苷酸序列；以及e.在嚴(yán)緊條件下與上述a)中核酸雜交的多核苷酸序列。該核苷酸序列可用于調(diào)節(jié)目的基因的表達(dá)，特別是用于下調(diào)靼基因的表達(dá)，尤其是用于上述核苷酸序列。本發(fā)明的另一目的在于微RNA前體，由選自如下的核苷酸序列編碼a.如SEQIDNO:47所示的核苷酸序列b.與上述a)中核酸具有至少70%序列同一性的多核苷酸序列；c.與上述a)中核酸互補的多核苷酸序列；以及d.在嚴(yán)緊條件下與上述a)中核酸雜交的多核苷酸序列。本發(fā)明的另一目的在于如SEQIDNO:40所示的微RNA。更具體而言，本發(fā)明包括并提供了提高種子中總油含量的方法，包括:用核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物，所述構(gòu)建體中含有作為有效連接組分的啟動子和能調(diào)節(jié)i^"2樣mRNA或FAD2樣蛋白質(zhì)水平的核酸序列，并種植該植物。此外，本發(fā)明包括并提供了提高種子中油酸水平的方法，包括用核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物，所述構(gòu)建體中含有作為有效連接組分的啟動子、能提高油酸水平的結(jié)構(gòu)核酸序列，并種植該植物.本文也包括由LMPDNA序列轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物所產(chǎn)生的種子，其中所述種子含有LMPDNA序列且該植物是用于改變種子j^存化合物水平的真實育種.本發(fā)明還包括上述種子產(chǎn)生的種子油，本發(fā)明還提供了含有所述核酸的栽體、含有所述載體的宿主細(xì)胞，以及用所述核酸和/或載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞所產(chǎn)生的子代植物材料。根據(jù)本發(fā)明，本文所述的化合物、組合物以及方法可用于提高或降低種子油中的脂質(zhì)相對百分比，提高或降低種子油中的脂質(zhì)水平，或提高或降低種子油中的脂肪酸水平，或提高或降低種子或植物中的淀粉或其他糖類水平，或提高或降低種子或植物中的蛋白質(zhì)水平，例如提高或降低l重量％、2.5重量％、5重量％、7.5重量％、10重量％、12.5重量％、15重量％、17.5重量％、20重量％、22.5重量％、25重量％或更多。本文所述的操作方法也可用于促進(jìn)種子發(fā)芽和幼苗及植物的生長，以及提高植物中種子貯存化合物的產(chǎn)率。還提供了在轉(zhuǎn)基因植物中產(chǎn)生高于或低于正?；蛞话闼降馁A存化合物的方法，所述轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)來自擬南芥、歐洲油菜、大豆、稻、玉米、亞麻、大麥或小麥的LMP核酸，其中轉(zhuǎn)基因植物為擬南芥、歐洲油菜、大豆、稻、玉米、亞麻、大麥、小麥、向日葵(flW/朋^附朋"附)或甜菜(v"/gw/s)，或與擬南芥、歐洲油菜、大豆、稻、玉米、亞麻、大麥或小麥不同的物種。本文也包括改變種子貯存化合物生產(chǎn)效率的組合物和方法。本文所用短語擬南芥、歐洲油菜、大豆、稻、玉米、亞麻、大麥、小麥、向日葵或甜菜時，也是指擬南芥和/或歐洲油菜和/或大豆和/或稻和/或玉米和/或亞麻和/或大麥和/或小麥和/或向日葵和/或甜菜。因此，本發(fā)明的一個目的在于提供來自大豆、稻、玉米、亞麻、大麥或小麥的新的分離的LMP核酸及分離的LMPM酸，以及其活性片段、類似物和直系同源物.這些活性片段、類似物和直系同源物可來自不同的植物物種，因為本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解其他植物物種也含有這些或相關(guān)核酸。本發(fā)明的另一目的在于提供種子貯存化合物水平改變的轉(zhuǎn)基因植物，特別是脂質(zhì)、脂肪酸或糖水平的改變。本發(fā)明的多核苷酸及多肽，包括其激動劑和/或其片段，^具有如下用途，包括調(diào)節(jié)植物生長，及潛在地調(diào)節(jié)植物產(chǎn)率，優(yōu)選提高在逆境*(干旱、寒冷、光、紫外線)下的植物生長.此外，本發(fā)明的拮抗劑可能具有包括調(diào)節(jié)植物生長和/或產(chǎn)率的用途，優(yōu)選通過提高植物生長和產(chǎn)率來實現(xiàn)。而在另一實施方案中，利用組成型啟動子it^達(dá)的本發(fā)明多肽可用于通過調(diào)節(jié)光利用效率，提高植物在應(yīng)激條件(千旱、光、寒冷、紫外線)下的產(chǎn)量。此外，本發(fā)明的多核苷酸和多肽能促進(jìn)種子萌發(fā)和種子休眠，從而改善植物生長和/或種子貯存化合物的產(chǎn)率。本發(fā)明的分離的核酸分子還含有有效連接的啟動子或部分啟動子區(qū)域。該啟動子可為組成型啟動子、i秀導(dǎo)型啟動子或組織特異性啟動子。組成型啟動子的實例如超級啟動子(Ni等人，PlantJ.7:661-676，1995;US5955646)。組織特異性啟動子可以在營養(yǎng)組織或繁殖組織中具有活性。在繁殖組織中具有活性的組織特異性啟動子可為種子特異性啟動子。在營養(yǎng)組織中具有活性的組織特異性啟動子可為根特異性、芽特異性、分生組織特異性或葉特異性啟動子。本發(fā)明分離的核酸分子還可含有5，非翻譯序列、3，非翻譯序列、內(nèi)含子或它們的組合。本發(fā)明也提供了提高植物中一種或多種植物器官的數(shù)量和/或大小的方法，所J^4達(dá)來自擬南芥、歐洲油茱、大豆、稻、玉米、亞麻、大麥或小麥的編碼LMP或其部分的分離的核酸.更具體而言，可操作種子大小和/或種子數(shù)量和/或重量。本發(fā)明的另一目的在于提供生產(chǎn)這類前述轉(zhuǎn)基因植物的方法，本發(fā)明的另一目的在于提供這類前述轉(zhuǎn)基因植物的種子和種子油。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在閱讀以下詳迷的公開實施方案和附加權(quán)利要求書后，可清楚了解本發(fā)明的這些及其他目的、特征和優(yōu)勢。附圖簡述根據(jù)以下詳述以及構(gòu)成本申請一部分的所附圖表和序列表，可更充分地理解本發(fā)明。圖1A-D.SEQIDNO:1-4一擬南芥基因y^E4Z)-W的核酸序列、核酸的開放讀框和M酸序列，圖2A-C.SEQIDNO:5-8一大豆基因C附F/1D-W的核紗列、核酸的開放讀框和^J^酸序列。圖3A-C.SEQIDNO:9-12-大豆基因G附E4D-0的核酸序列、核酸的開放讀框和氨基酸序列。圖4A-C.SEQIDNO:13-16-大豆基因G附/^IM^的核i^f列、核酸的開放讀框和氨基酸序列，圖5A-C.SEQIDNO:17-20-玉米基因Zw/MZ)-W的核酸序列、核酸的開放讀框和氨基酸序列。圖6A-C.SEQIDNO:21-24-稻基因Osi^D-W的核紗列、核酸的開放讀框和氨基酸序列。圖7A-C.SEQIDNO:25-28-亞麻基因Iw7^Z)-W的核酸序列、核酸的開放讀框和氨基酸序列。圖8A-C.SEQIDNO:29-32-大麥基因Fvi^Z)-W的核紗列、核酸的開放讀框和M酸序列。圖9A-C.SEQIDNO:33-36-小麥基因Tlii^2)-W的核酸序列、核酸的開放讀框和氨基酸序列.圖io.由usp啟動子驅(qū)動且轉(zhuǎn)化入yiw/2擬南芥突變林(該轉(zhuǎn)化林的遺傳背景為Columbia-2,每一欄代表用5mg個體植物的群體種子得到的脂肪酸數(shù)據(jù))的OsFAD-01得到的T2種子脂肪酸數(shù)據(jù)。圖11.由USP啟動子驅(qū)動且轉(zhuǎn)化入/似/2擬南芥突變抹(該轉(zhuǎn)化林的遺傳背景為Columbia-2，每一欄代表用5mg個體植物的群體種子得到的脂肪酸數(shù)據(jù))的HvFAD-01得到的T2種子脂肪酸數(shù)據(jù).圖12.圖示了公開的AtFAD-01、GmFAD-01、GmFAD-02、GmFAD-03、LuFAD-Ol、HvFAD-Ol、TaFAD-Ol、OsFAD-01及ZmFAD-01M酸序列間的相對同源性.該圖表是利用VectorNTISuite9.0的AlignX(2003年8月22日)所產(chǎn)生.用于該多重比對的參數(shù)如下空位開放罰分10;空位延伸罰分0.05;空位分離罰分范圍8;比對延遲的同一性百分比40,圖13.表格顯示了AtFAD-Ol、GmFAD-Ol、GmFAD-02、GmFAD-03、LuFAD-Ol、HvFAD誦Ol、TaFAD國Ol、OsFAD-01及ZmFAD-01^J^^jf列間的相似性，該表格是利用VectorNTISuite9.0的AlignX(2003年8月22曰)所產(chǎn)生.其他參數(shù)參見圖12的圖例。圖14.圖示了公開的AtFAD-01、GmFAD-01、GmFAD-02、GmFAD-03、LuFAD-Ol、HvFAD國Ol、TaFAD-Ol、OsFAD-01及ZmFAD-01核酸序列間的相對同源性。該圖表是利用VectorNTISuite9.0的AlignX(2003年8月22日)所產(chǎn)生。用于該多重比對的參數(shù)如下空位開放罰分15;空位延伸罰分6.66;空位分離罰分范圍8;比對延遲的同一性百分比40。圖15.表格顯示了AtFAD-Ol、GmFAD-Ol、GmFAD-02、GmFAD-03、LuFAD-Ol、HvFAD-Ol、TaFAD-Ol、OsFAD-Ol及ZmFAD-Ol核酸序列間的相似性。該表格是利用VectorNTISuite9.0的AlignX(2003年8月22日)所產(chǎn)生。其他參數(shù)參見圖14的圖例。圖16.AtFAD-01、GmFAD-Ol、GmFAD-02、GmFAD-03、LuFAD-Ol、HvFAD-Ol、TaFAD-Ol、OsFAD-Ol及ZmFAD-Ol^J^酸序列的序列比對。該比對是利用VectorNTISuite9.0的AlignX(2003年8月22日)所產(chǎn)生。用于該多重比對的參數(shù)如下空位開放罰分15;空位延伸罰分6.66;空位分離罰分范圍8;比對延遲的同一性百分比40。一般定義應(yīng)當(dāng)認(rèn)識到本發(fā)明并不僅限于此處所述的具體方法、方案、細(xì)胞系、植物物種或?qū)?、?gòu)建體及試劑。也應(yīng)當(dāng)認(rèn)識到本文所用的術(shù)語僅為描述具體的實施方案所需，并不在于限制本發(fā)明的范圍，后者只受附加權(quán)利要求書的限制。應(yīng)當(dāng)注意到此處及附加權(quán)利要求書中所用的單數(shù)形式包括復(fù)數(shù)指代，除非上下文中另有清楚說明.因此，例如提及"栽體"是指一種或多種栽體，并包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其等效物，等等。本文所用的術(shù)語"約"，是指大約、粗略、左右或在此范圍內(nèi).當(dāng)術(shù)語"約"與數(shù)字范圍聯(lián)合使用時，在所列數(shù)值邊界上下延伸而修飾其范圍.一般而言，本文使用術(shù)語"約"來修飾數(shù)值為所列值的上下波動20%、優(yōu)選10%、更優(yōu)選上下(高低)5%。本文所用的詞"或"，是指具體列單內(nèi)的任一成員，并且也包括該列單中成員的任意組合。本文所用的術(shù)語"M酸序列"是指代表氨基酸殘基的縮寫、字母、字或詞語的序列。此處可用氨基酸的通用3個字母符號或由IUPAC-IUB生物化學(xué)命名委員會推薦的單字母符號來指代氨基酸。與之類似，用通用的單字母代碼指代核苷酸。本文所用的縮寫為常規(guī)的氨基酸單字母代碼A，丙氨酸；B,天冬酰胺或天冬氨酸；C，半胱氨酸；D天冬氨酸；E，谷氨酸；F，苯丙氨酸；G，甘氨酸；H組氨酸；I異亮氨酸；K,賴氨酸;L,亮氨酸；M，甲硫氨酸；N，天冬酰胺；P，脯氨酸；Q，谷胺酰胺；R，精氨酸；S，絲氨酸；T，蘇氨酸；V，纈氨酸；W，色氨酸；Y，酪氨酸;Z，谷胺酰胺或谷氨酸(見L.Stryer，Biochemistry,1988，W.H.FreemanandCompany,NewYork)。此處用于^tj^,列中的字母"x"可以代表任一氨基酸殘基。術(shù)語"核酸"指單鏈或雙鏈、正義或反義形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物或雜交物。此次所用的短語"核酸序列"是指代表核苷酸的縮寫、字母、字或詞語的連續(xù)序列.在一個實施方案中，核酸可為相對短核酸的"探針"，通常長度少于100個核苷酸。通常核酸探針的長度為約50個核苷酸至約100個核苷酸。核酸的"靶區(qū)"為核酸中鑒定為目標(biāo)的部分.核酸的"編碼區(qū)"為核酸的一部分，所述部分當(dāng)處于合適調(diào)控序列的控制下時可通過序列特異性方式轉(zhuǎn)錄并翻譯，以產(chǎn)生特定的多肽或蛋白質(zhì)。此編碼區(qū)被表述為編碼此多肽或蛋白質(zhì)。除非另有說明，除了明確顯示的序列之外，特定的核酸序列也隱含地包括其經(jīng)保守性修飾的變體(例如，筒并密碼子取代)及互補序列。此處術(shù)語"核酸"可與"基因"、"cDNA"、"mRNA"、"寡核苷酸"和"多核苷酸"交換使用。本文所用的術(shù)語"互補"或"互補性"是指通it^配對原則相關(guān)的核苷酸序列。例如，序列5，-AGT-3，與序列5，-ACT-3，互補?；パa可為"部分"或"全部"互補."部分"互補是指一個或多個核酸威基并未根據(jù)^配對原則配對，核酸之間的"全部"或"完全"互補是指每一個核酸g都根據(jù)堿基配對原則與另一戚基配對。核酸鏈間的互補程度對核酸鏈雜交的效率和強度都有顯著影響，本文所用的核酸序列的"互補物"是指其核酸與本發(fā)明核酸序列的核酸完全互補的核苷酸序列。術(shù)語"基因組"或"基因組DNA"是指宿主生物的可遺傳遺傳信息。所述基因組DNA包括核DNA(也稱為染色體DNA)，也包括質(zhì)體(例如葉綠體)及其他細(xì)胞器(如線粒體)DNA。優(yōu)選術(shù)語基因組或基因組DNA指核染色體DNA。術(shù)語"染色體DNA"或"染色體DNA序列"應(yīng)理解為獨立于細(xì)胞周期狀態(tài)的細(xì)胞核基因組DNA.因此，染色體DNA可被組織為染色體或染色單體，它們可為壓縮或未解旋的形式。可以通過多種本領(lǐng)域已知的方法證實并分析染色體DNA中的插入，例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)分析、Southern印跡分析、原位熒光雜交(FISH)及原位PCR。術(shù)語"野生型"、"天然"或"天然來源"的是指生物、多肽或核^f列，其中所述生物天然存在，或可獲自至少一種天然存在的未經(jīng)人改變、突變或其他操作的生物。術(shù)語"異源核酸序列"或"異源DNA"可交換使用，是指連接或經(jīng)操作后連接于其天然并不連接的核酸序列的核苷酸序列，或連接于核酸序列上的位置不同于其天然連接位點.異源DNA并非其引入細(xì)胞內(nèi)源產(chǎn)生的，而是來自另一細(xì)胞。一般而言，盡管并非必需，此類異源DNA編碼表達(dá)其的細(xì)胞通常不產(chǎn)生的RNA和蛋白質(zhì).如果啟動子、轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列或其他遺傳元件與另一序列(例如編碼標(biāo)記序列或農(nóng)藝相關(guān)性狀)在其天然環(huán)境中并非組合或有效連接，則所述啟動子、轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列或其他遺傳元件相對于另一序列為"異源".優(yōu)選所述序列在其天然環(huán)境中并非有效連樹即來自不同基因)。最優(yōu)選所述調(diào)控序列共價連接并鄰接其天然環(huán)境中并不鄰接的核酸.本文所用的術(shù)語"轉(zhuǎn)基因"是指任何引入細(xì)胞基因組或經(jīng)人試驗^Mt的核酸序列。優(yōu)選所述序列產(chǎn)生于與天然存在生物不同的基因組中(例如，若所述序列為所述生物的內(nèi)源序列，則將其引入與其天然位置不同的位置，或提高或減少其拷貝數(shù)目)。轉(zhuǎn)基因可為"內(nèi)源DNA序列"、"外源DNA序列"(如外源基因)或"異源DNA序列"，術(shù)語"內(nèi)源DNA序列"指天然地見于其所引入的細(xì)胞的核苷酸序列，只要其相對于天然存在序列并不含有某些改變(如點突變、存在選擇標(biāo)記基因等)。當(dāng)術(shù)語"轉(zhuǎn)基因"或"重組"用于細(xì)胞或生物(例如對于大麥植物或植物細(xì)胞而言)時，指含有轉(zhuǎn)基因或其基因組已被引入的轉(zhuǎn)基因改變的細(xì)胞或生物。轉(zhuǎn)基因生物或組織可以含有一個或多個轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。優(yōu)選該生物或組織主要由轉(zhuǎn)基因細(xì)胞組成(即所述生物或組織中多于80%,優(yōu)選90%，更優(yōu)選95%,最優(yōu)選99%的細(xì)胞為轉(zhuǎn)基因細(xì)胞)。"重組多肽，，為非天然存在的多肽，其序列與天然存在的多JIM目差至少一個氨基酸殘基.產(chǎn)生此類重組多肽和/或核酸的優(yōu)選方法包括直接或非直接誘變、DNA改組或其他遞歸重組(recursiverecombination)的方法，相對于目的雜交條件而言的術(shù)語"等同"雜交條件指該雜交條件及目的雜交條件下，具有相同范圍的同源性百分比(％)的核酸序列能夠雜交，例如，如果目的雜交條件下，第一核酸序列能與與第一核酸序列同源性為80%-卯％的其他核酸序列雜交，則另一雜交條件與目的雜交條件等同是指在該另一雜交務(wù)泮下，第一核酸序列也能與與第一核酸序列同源性為80%_90%的其他核酸序列雜交。在本發(fā)明優(yōu)選實施方案中，除非另有說明，兩個核酸或多肽序列間的序列同一性百分比是利用VectorNTI7.0(PC)軟件包(InforMax，7600WisconsinAve.,Bethesda，MD20814)確定的。優(yōu)選使用空位開放罰分15及空位延伸罰分6.66來確定兩個核酸間的同一性百分比.優(yōu)選使用空位開放罰分10及空位延伸罰分0.1來確定兩個多肽間的同一性百分比。所有其他#優(yōu)選設(shè)為默認(rèn)設(shè)置。為進(jìn)行多重比對(ClustalW算法)，在優(yōu)選實施方案中，blosum62矩陣的空位開放罰分為10而空位延伸罰分為0.05。應(yīng)當(dāng)理解為了確定DNA序列和RNA序列比較時的序列同一性，胸腺嘧咬核苷等同于尿嘧啶核苷，本領(lǐng)域已充分了解核酸雜交中可使用多種等同條件以包含低或高嚴(yán)緊條件；需考慮的因素如探針長度和性質(zhì)(DNA、RNA、威基組成)、靶標(biāo)性質(zhì)(DNA、RNA、堿基組成、存在于溶液之中或固定化等)，以及鹽和其他成分的濃度(例如甲酰胺、葡聚糖硫酸鹽、聚乙二醇的存在與否)，且雜交溶液可變動，以產(chǎn)生與上述條件有別但等同的低或高嚴(yán)緊性雜交的條件。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知優(yōu)選使用較高嚴(yán)緊性來減少或消除非特異性結(jié)合，而優(yōu)選較低嚴(yán)緊性來檢測同源性不同的較大數(shù)目的核#列。術(shù)語"基因，，指編碼區(qū)，其有效連接于能以某種方式調(diào)控多肽表達(dá)的合適調(diào)控序列。基因包括處于編碼區(qū)(開放讀框ORF)前(上游)或后(下游)的DNA非翻譯調(diào)控區(qū)(例如啟動子、增強子、阻遏物等)，以及適用的情況下位于單個編碼區(qū)(即外顯子)之間的間隔序列(即內(nèi)含子)。本文所用的術(shù)語"結(jié)構(gòu)基因"是指可轉(zhuǎn)錄為mRNA隨后翻譯為特定多肽特征性^J^l亭列的DNA序列。本文所用的術(shù)語"編碼區(qū)"當(dāng)用于結(jié)構(gòu)基因時，是指編碼氨基酸的核苷酸序列，所述氨基酸見于mRNA分子翻譯所得到的新生多肽。在真核細(xì)胞中，編碼區(qū)5，端為編碼起始甲硫氨酸的三聯(lián)核苷酸"ATG，，，3，端為定義終止密碼子的3種三聯(lián)核苷酸(即TAA、TAG、TGA)之一。除了含有內(nèi)含子，基因的基因組形式還包括RNA轉(zhuǎn)錄物序列中位于5，-和3，-末端的序列。這些序列纟皮稱為"側(cè)翼"序列或"側(cè)翼"區(qū)域(這些側(cè)翼序列位于mRNA轉(zhuǎn)錄物上非翻譯序列的5，-或3，-端)。5，側(cè)翼區(qū)可含有調(diào)控序列如啟動子和增強子，控制或影響基因的轉(zhuǎn)錄。3，側(cè)翼區(qū)可含有指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄終止、轉(zhuǎn)錄后切割和多聚腺苷化的序列，此處術(shù)語"多肽"、"肽"、"寡肽"、"多肽"、"基因產(chǎn)物"、"表達(dá)產(chǎn)物"和"蛋白質(zhì)"可交換使用，指連續(xù)氨基酸殘基的多聚物或寡聚物。本文所用的術(shù)語"分離的"是指材料從其初始環(huán)境中分離出來，例如，活體動物中天然存在的多核苷酸或多肽并非分離的，但與某些或所有其天然系統(tǒng)中共存材料分離開的同一多核苷酸或多肽是分離的.此類多核苷酸可為載體的部分，和/或此類多核苷酸或多肽可為組合物的一部分，若該載體或組合物不為其原始環(huán)境的一部分，則所述多核苷酸或多肽為分離的，術(shù)語"遺傳修飾生物"或"GMO"是指含有轉(zhuǎn)基因DNA的任何生物。示例性生物包括植物、動物和微生物。本文所用的單數(shù)形式的術(shù)語"細(xì)胞"或"植物細(xì)胞，，指單個細(xì)胞。復(fù)數(shù)形式的術(shù)語"細(xì)胞"指細(xì)胞群，細(xì)胞群可為含有一種細(xì)胞類型的純細(xì)胞群。同樣，細(xì)胞群也可含有一種以上的細(xì)胞類型。在本發(fā)明中，對細(xì)胞群中可包括的細(xì)胞類型數(shù)目并無限制。細(xì)胞可為同步化或非同步化。本發(fā)明意義上的植物細(xì)胞可為分離的(例如處于懸浮培養(yǎng)物中)或含于任意發(fā)育階段的植物組織、植物器官或植物中。對于植物而言的術(shù)語"器官"(或"植物器官")是指植物的一部分，可包括(但不限于)例如根、果實、芽、莖、葉、花藥、萼片、花瓣、花粉、種子等.對于植物而言的術(shù)語"組織"(或"植物組織")是多個植物細(xì)胞的排布，包括植物的分化和未分化組織。植物組織可構(gòu)成植物器官的部分(例如植物葉的上皮)，也可構(gòu)成腫瘤組織(例如愈傷組織)及多種類型的培養(yǎng)細(xì)胞(例如單個細(xì)胞、原生質(zhì)體、胚、愈傷組織、原始球莖樣體等)。植物組織可為植物原位、器官培養(yǎng)物、組織培養(yǎng)物或細(xì)胞培養(yǎng)物。本文所用的術(shù)語"植物"是指高度分化為植物發(fā)育中任何階段存在的結(jié)構(gòu)的一群植物細(xì)胞。此類結(jié)構(gòu)包括一個或多個植物器官包括(但不僅限于)果實、芽、莖、葉、花瓣等，術(shù)語"染色體DNA"或"染色體DNA序列，，指獨立于細(xì)胞周期狀態(tài)的細(xì)胞核基因組DNA。因此，染色體DNA可被組織為染色體或染色單體，它們可為壓縮或未解旋的?？梢酝ㄟ^多種本領(lǐng)域已知的方法證實并分析染色體DNA中的插入，例如PCR分析、Southern印跡分析、原位熒光雜交(FISH)及原位PCR,本文所用的術(shù)語"結(jié)構(gòu)基因"是指可轉(zhuǎn)錄為mRNA隨后翻譯為特定多肽特征性氨基酸序列的DNA序列。術(shù)語"表達(dá)"指基因產(chǎn)物的生物合成.例如，在結(jié)構(gòu)基因的情況下，表達(dá)包括將結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄為mRNA，并任選隨后將mRNA翻譯為一個或多個多肽.本文所用的術(shù)語"表達(dá)盒"或"表達(dá)構(gòu)建體"是指將任意待表達(dá)核酸序列有效連接于啟動子序列和(任選)有助于所述核酸序列表達(dá)的其他元件(例如像終止子和/或多聚腺苷化序列)的組合。本文所用的術(shù)語"啟動子"、"啟動子元件"或"啟動子序列"是指位于核苷酸序列5，端的指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄起始的核苷酸序列(即能控制該核苷酸序列轉(zhuǎn)錄為mRNA)。啟動子一般(但不必須)位于核苷酸序列的5，端(即上游，例如鄰近結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄起始位點)，其調(diào)控所述核苷酸序列向mRNA的轉(zhuǎn)錄，并提供RNA聚合酶和其他轉(zhuǎn)錄因子特異結(jié)合的位點以起始轉(zhuǎn)錄。啟動子序列為驅(qū)動下游基因表達(dá)所必需(但并不充分)。一般而言，真核啟動子包括位于轉(zhuǎn)錄起始(帽子)位點5，端10-30bp處、與共有序列5，-TATAAT-3，(TATA)盒同源的特征性DNA序列，方便起見將所述轉(zhuǎn)錄起始位點編號為+1。位于帽子位點3，端的堿基用正數(shù)表示，而位于帽子位點5，端的g用負(fù)數(shù)表示，分別反映其遠(yuǎn)離帽子位點的距離.另一啟動子成分CAAT盒，常見于TATA盒5，端30至70bp處，與經(jīng)典形式的5，-CCAAT-3，(Breathnach1981)具有同源性.植物中CAAT盒有時被稱為AGGA盒的序列所取代，后者為三聯(lián)G(或T)NG側(cè)翼具有對稱性分布腺苷殘基的區(qū)域(Messing1983).其他對轉(zhuǎn)錄有調(diào)控作用的序列可見于啟動子區(qū)域內(nèi)，并延伸至帽子位點5，端以外多達(dá)1000bp處或更遠(yuǎn)，當(dāng)術(shù)語"組成型"用于啟動子時，表示該啟動子能夠在缺乏刺激(例如熱休克、化學(xué)物質(zhì)、光等)的情況下指導(dǎo)有效連接的核酸序列進(jìn)行轉(zhuǎn)錄.一般而言，組成型啟動子能夠指導(dǎo)轉(zhuǎn)基因在基本任何細(xì)胞和任何組織中表達(dá)。調(diào)節(jié)控制指通過主要(但不全)位于轉(zhuǎn)錄起始位點上游(5，端)的DNA序列元件來調(diào)節(jié)基因表達(dá),調(diào)節(jié)可能會造成對環(huán)境剌激的全有或全無應(yīng)答，或可能造成基因表達(dá)水平的多樣化.本發(fā)明中，熱休克調(diào)控元件能在應(yīng)答突發(fā)溫度上升時發(fā)揮作用，瞬時增強下游基因表達(dá)的水平.多聚腺苷化信號是指任何能影響mRNA加工的核酸序列，通常以向mRNA前體的3，端添加多聚腺苷酸為特征。多聚腺苷化信號DNA片段自身可為若干來源(天然存在或合成的)的片段組合物，可來自基因組DNA或RNA衍生的cDNA。多聚腺苷化信號通常因典型形式5'-AATAA-3，同源物的存在而被識別，盡管距離的差異、部分"通讀"和多重串聯(lián)典型序列并不少見(Messing1983)。應(yīng)當(dāng)認(rèn)識到典型的"多聚腺苷化信號"可能實際上導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄的終止而并非僅僅多聚腺苷化本身(Montell1983)。熱休克元件是指調(diào)控應(yīng)答突發(fā)溫度升高應(yīng)激的基因表達(dá)的DNA序列。在該應(yīng)答中可見到下游基因表達(dá)水平突發(fā)但短暫的增強。關(guān)于熱休克基因的初步工作是在果蠅中完成的，但許多其他物種包括植物(Barnett1980)對應(yīng)激也表現(xiàn)出類似的應(yīng)答。已描述果蠅熱休克元件的關(guān)鍵主要成分具有共有序列5，-CTGGAATNTTCTAGA-3，(其中N=A、T、C或G)，并定位于轉(zhuǎn)錄起始位點上游-66至-47bp的殘基之間(Pelham1982)?；瘜W(xué)合成的該共有序列的寡核苷酸拷貝可以取代天然序列，賦予熱休克誘導(dǎo)性。前導(dǎo)序列指包括位于轉(zhuǎn)錄起始位點和翻譯起始位點間的約100個核苷酸的DNA序列。前導(dǎo)序列中包括的是指定核糖體結(jié)合位點的區(qū)域。本文的內(nèi)含子或間隔序列指與編碼序列(外顯子)一同翻譯、但形成成熟mRNA時被移除的那些DNA序列區(qū)域，內(nèi)含子可位于轉(zhuǎn)錄序列中的任何部位一一位于相同或不同基因的編碼序列之間，位于基因的編碼序列中(中斷并分開其A^酸序列)，以及位于啟動子區(qū)(翻譯起始位點5，端)。初級轉(zhuǎn)錄物中的內(nèi)含子被切割出來，而編碼序列,皮同步且精確連接以形成成熟mRNA。內(nèi)含子和外顯子的連接處構(gòu)成剪接位點。內(nèi)含子的g序列以GU開始，以AG結(jié)束。相同的剪接信號見于許多高等真核細(xì)胞中。術(shù)語"有效連接"或"有效連接的"應(yīng)理解為，例如調(diào)控元件(如啟動子)與待表達(dá)的核酸序列的有序排列(若合適，還包括調(diào)控元件.(如終止子))，從而使每一調(diào)控元件都能完成其預(yù)期的功能，即允許、修飾、促進(jìn)或以其他方式影響所述核酸序列的表達(dá).造成的表達(dá)可能取決于核,列相對正義或反義RNA的排列。此處，并不必需化學(xué)意義上的直接連接。遺傳控制序列如增強子序列也可從遠(yuǎn)處的位點或?qū)嶋H上在其他DNA分子上對靼序列施加影響。優(yōu)選的排列為將待重組表達(dá)的核酸序列置于作為啟動子起作用的序列之后，從而這兩個序列彼此共價連接。啟動子序列和待重組表達(dá)的核酸序列之間的距離優(yōu)選少于200個g對，尤其優(yōu)選少于100個4^&對，特別優(yōu)選少于50個堿基對?？梢酝ㄟ^(如見于Maniatisl989;Silhavy1984;Ausubel1987;Gelvin1990)所述的常規(guī)重組和克隆技術(shù)產(chǎn)生有效連接及表達(dá)盒。然而，作為具有限制性酶特異切割位點的接頭序列或信號肽起作用的其他序列，也可置于兩個序列之間。序列的插入也可導(dǎo)致表達(dá)融合蛋白質(zhì)。優(yōu)選，由啟動子和待表達(dá)核酸連接組成的表達(dá)盒，可以載體整合形式存在，通過如轉(zhuǎn)化插入植物基因組中。本文所用的術(shù)語"轉(zhuǎn)化"是指將遺傳物質(zhì)(例如轉(zhuǎn)基因)引入細(xì)胞。細(xì)胞的轉(zhuǎn)化可為穩(wěn)定的或瞬時性的。術(shù)語"瞬時轉(zhuǎn)化"或"瞬時轉(zhuǎn)化的"是指將一個或多個轉(zhuǎn)基因引入細(xì)胞，但轉(zhuǎn)基因并不整合于宿主細(xì)胞基因組中?？赏ㄟ^例如酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測瞬時轉(zhuǎn)化，ELISA試驗可檢測是否存在由所述一個或多個轉(zhuǎn)基因編碼的多肽?；蛘?，通過如此處所示檢測由轉(zhuǎn)基因(如uidA基因)編碼的蛋白質(zhì)(如p-葡萄糖苷酸酶)活性〔例如通過用X-gluc染色組化測定GUS酶活性，當(dāng)存在GUS酶時X-gluc可表現(xiàn)出藍(lán)色沉淀；利用GUS-Light試劑盒(Tropix)對GUS酶活性進(jìn)行化學(xué)發(fā)光測定〕來檢測瞬時轉(zhuǎn)化.術(shù)語"瞬時轉(zhuǎn)化林"指瞬時摻入一個或多個轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞.與之相對，術(shù)語"穩(wěn)定轉(zhuǎn)化"或"穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的"指一個或多個轉(zhuǎn)基因引入并整合于細(xì)胞的基因組中，優(yōu)選形成染色體整合和減數(shù)分裂下的穩(wěn)定遺傳力。可以通過將細(xì)胞基因組DNA與能結(jié)合所述一個或多個轉(zhuǎn)基因的核^列進(jìn)行Southern印跡雜交，檢測細(xì)胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化。或者也可通過細(xì)胞基因組DNA的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因序列來檢測穩(wěn)定的細(xì)胞轉(zhuǎn)化.術(shù)語"穩(wěn)定轉(zhuǎn)化林"指將一個或多個轉(zhuǎn)基因穩(wěn)定整合于基因組DNA(包括質(zhì)體DNA和核DNA)，優(yōu)選整合入核內(nèi)染色體DNA的細(xì)胞。因此，穩(wěn)定轉(zhuǎn)化林與瞬時轉(zhuǎn)化林的不同之處在于，穩(wěn)定轉(zhuǎn)化林的基因組DNA含有一個或多個轉(zhuǎn)基因，而瞬時轉(zhuǎn)化林的基因組DNA中不含轉(zhuǎn)基因.轉(zhuǎn)化也包括以植物病毒栽體的形式將遺傳物質(zhì)引入植物細(xì)胞，包括染色體外復(fù)制以及減數(shù)分裂穩(wěn)定性性質(zhì)不同的基因表達(dá)。轉(zhuǎn)化也包括以植物病毒載體的形式將遺傳物質(zhì)引入植物細(xì)胞，涉及減數(shù)分裂穩(wěn)定性不同的染色體外復(fù)制及基因表達(dá)。優(yōu)選術(shù)語"轉(zhuǎn)化"包括將遺傳物質(zhì)引入植物細(xì)胞，從而導(dǎo)致染色體整合和減數(shù)分裂所致的穩(wěn)定遺傳力。術(shù)語細(xì)菌"感染"和"侵染，，指在一定條件下將靶生物樣品(例如細(xì)胞、組織等)與細(xì)菌共孵育，從而使細(xì)菌中所含的核^f列被引入靶生物樣品的一個或多個細(xì)胞中。術(shù)語"農(nóng)桿菌"指存于土壤中可導(dǎo)致冠癭病的革蘭氏陰性桿狀植物致病細(xì)菌。術(shù)語"農(nóng)桿菌"包括但不僅限于根瘤農(nóng)桿菌(Jgra6flcteW"附似we/^^附)菌林(一般可導(dǎo)致感染植物的冠癭病)，以及發(fā)根農(nóng)桿菌(Jgro6acteWw附r似z化e"M)菌林(導(dǎo)致感染宿主植物的發(fā)根病)。農(nóng)桿菌感染植物細(xì)胞一般會導(dǎo)致感染細(xì)胞產(chǎn)生冠櫻堿(例如胭脂堿、農(nóng)桿堿、章魚堿等)，因此，導(dǎo)致產(chǎn)生胭脂堿的農(nóng)桿菌菌林(例如菌林LBA4301、C58、A208)被稱為"胭脂堿型"農(nóng)桿菌；導(dǎo)致產(chǎn)生章魚堿的農(nóng)桿菌菌林(例如菌林LBA4404、Ach5、B6)被稱為"章魚堿型"農(nóng)桿菌；而導(dǎo)致產(chǎn)生農(nóng)桿堿的農(nóng)桿菌菌株(例如菌林EHA105、EHAIOI、A281)被稱為"農(nóng)桿堿型"農(nóng)桿菌.術(shù)語"轟擊"和"基因槍轟擊"指向耙生物樣品(如細(xì)胞、組織等)加速引入顆粒的方法，從而導(dǎo)致靶生物樣品中細(xì)胞的細(xì)胞膜損傷，和/或顆粒進(jìn)入該靶生物樣品中。基因槍轟擊的方法為本領(lǐng)域已知(例如US5，584，807，其內(nèi)容在此次引用作為參考)，并可購得(例如氦氣驅(qū)動顯微投射加速器(PDS-1000/He)(BioRad)),本文所用的術(shù)語"雜交"包括"使一條核酸鏈通ii^配對與互補鏈結(jié)合的任意方法"(Coombs1994),雜交及雜交強度(即核酸間結(jié)合的強度)受以下因素影響，如核酸間的互補程度、涉及務(wù)ff的嚴(yán)緊性、所形成雜合體的Tm，以及核酸內(nèi)的G:C比率。本文所用的術(shù)語"Tm"用于指"解鏈溫度"。解鏈溫度為雙鏈核酸分子群半解離形成單鏈的溫度。計算核酸Tm的方程式為本領(lǐng)域所公知。如標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)所提示，可通過方程式Tm=81.5+0.41(%G+C)簡單估算Tm值，其中核酸處于1MNaCl的7JC溶液中見如Anderson和Young,QuantitativeFilterHybridization,NucleicAcidHybridization(1985)。其他參考包括在Tm計算中考慮結(jié)構(gòu)和序列特點的更復(fù)雜的計算。除非另有說明，核酸雜交的低嚴(yán)緊性條件包括等同于如下的條件于68。C在含5xSSPE(43.8g/LNaCl、6.9g/LNaH2P04.H20和1.85g/LEDTA,用NaOH調(diào)節(jié)pH為7.4)、1%SDS、5xDenhardt，s試劑[50xDenhardt's,其中每500mL含有5gFicoll(Type400，Pharmacia)、5gBSA(FractionV;Sigma)，以及100ng/mL變性鮭精DNA的溶液中進(jìn)行結(jié)合或雜交，然后于室溫在含0.2xSSPE和0.1%SDS的溶液中洗滌，其中使用長約100至1000個核苷酸的DNA探針。除非另有說明，核酸雜交的高嚴(yán)緊性條件包括等同于如下的務(wù)ff:于68X:在含5xSSPE、1%SDS、5xDenhardt's試劑和100照/mL變性鮭精DNA的溶液中進(jìn)行結(jié)合或雜交，然后于68X:在含0.1xSSPE和0.1%SDS的溶液中洗滌，其中使用長約100至1000個核苷酸的DNA探針。相對于目的雜交條件而言的術(shù)語"等同"雜交條件指該雜交條件及目的雜交條件下，具有相同范圍同源性百分比(％)的核酸序列能夠雜交。例如，如果目的雜交條件下，第一核酸序列能與與第一核酸序列同源性為80%-卯％的其他核酸序列雜交，則另一雜交條件與目的雜交務(wù)降等同是指在該另一雜交條件下，第一核酸序列也能與與第一核酸序列同源性為80%—卯％的其他核酸序列雜交.本領(lǐng)域已充分了解核酸雜交中可使用多種等同條件以包含低或高嚴(yán)緊條件；需考慮的因素如探針長度和性質(zhì)(DNA、RNA、堿基組成)、靶標(biāo)性質(zhì)(DNA、RNA、堿基組成、存在于溶液之中或固定化等)，以及鹽和其他成分的濃度(例如甲酰胺、葡^l疏酸鹽、聚乙二醇存在與否)，且雜交溶液可變動，以產(chǎn)生與上述條件有別但等同的低或高嚴(yán)緊性雜交的條件。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知優(yōu)選使用較高嚴(yán)緊性來減少或消除非特異性結(jié)合，而優(yōu)選較低嚴(yán)緊性來檢測同源性不同的較大數(shù)目的核酸序列。發(fā)明詳述參考以下對本發(fā)明優(yōu)選實施方案的詳細(xì)描述及所附的實施例，可更容易地理解本發(fā)明。在/>開并描述本發(fā)明的化合物、組合物及方法之前，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明不僅限于特定核酸、特定多肽、特定細(xì)胞類型、特定宿主細(xì)胞、特定條件或特定方法等，因為這些理所當(dāng)然可以有所變化，其多種修飾和變化對于本領(lǐng)域沖支術(shù)人員而言是顯而易見的。還應(yīng)當(dāng)理解本文所用的術(shù)語僅出于描述具體實施方案的目的而并非旨在限制。如說明書和權(quán)利要求書中所用，"一個"或"一種"可以表示一個/一種或多個/多種，視上下文而定。從而，例如，述及"一個/一種細(xì)胞"可以表示能夠利用至少一個/一種細(xì)胞。本發(fā)明部分基于對編碼FAD2樣LMP的核酸分子的分離和表征，所述核酸分子來自植物包括擬南芥、大豆、稻、玉米、亞麻、大麥和小麥及其他相關(guān)作物物種如玉米、大麥、亞麻、甜菜或向日葵。根據(jù)本文所體現(xiàn)和詳細(xì)描述的本發(fā)明目的，本發(fā)明一方面提供了來自植物(擬南芥、大豆、玉米、稻、亞麻、大麥或小麥)的編碼脂質(zhì)代謝蛋白(LMP)或其部分的分離的核酸。本發(fā)明的一方面涉及編碼LMP多肽或其生物學(xué)活性部分的分離的核酸分子，也涉及足以作為鑒定或擴(kuò)增LMP編碼核酸(如LMPDNA)的雜交探針或引物的核酸片斷.如本文所用的術(shù)語"核酸分子"旨在包括DNA分子(如cDNA或基因組DNA)和RNA分子(如mRNA)，以及利用核苷酸類似物產(chǎn)生的DNA或RNA類似物。該術(shù)語也包括基因編碼區(qū)3，和5，端的非翻譯序列基因編碼區(qū)5，端上游序列至少約1000個核苷酸以及編碼區(qū)3，端下游序列至少約200個核苷酸。核酸分子可以為單鏈或雙鏈，但優(yōu)選雙鏈DNA."分離"的核酸分子為與所述核酸天然來源中存在的其他核酸分子充分分離開的核酸分子.優(yōu)選"分離"的核酸中基本不含在其來源生物基因組DNA中天然位于所述核酸兩側(cè)的序列(即位于所述核酸5，和3，端的序列).例如，在多個實施方案中，分離的LMP核酸分子可含有少于約5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的核苷酸序列，所述核苷酸序列在該核酸來源的細(xì)胞(如擬南芥、大豆、稻、玉米、亞麻、大麥或小麥細(xì)胞)基因組DNA中與之天然側(cè)接.此外，"分離"的核酸分子如cDNA分子中基本不含有使用重組技術(shù)生產(chǎn)時的其他細(xì)胞材料或培養(yǎng)基，或釆用化學(xué)合成時的化學(xué)前體或其他化學(xué)物?？梢允褂脴?biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)及本文提供的序列信息分離本發(fā)明的核酸分子，例如具有附錄A所示核苷酸序列，如優(yōu)選實施方案中公開的SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33或SEQIDNO:35或其部分的核酸分子。例如，可以使用附錄A所示序列之一，如優(yōu)選實施方案中公開的SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33或SEQIDNO:35的全部或部分作為雜交探針，利用標(biāo)準(zhǔn)雜交技術(shù)(如Sambrook等所述,1989，Afo/簡/flf爿1fl^r她/yAfa/iwa/笫二版，CV>/</S/iW"g^fiTflrAor丄a6wato/j，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY)，從擬南芥、大豆、稻、玉米、亞麻、大麥或小麥文庫中分離擬南芥、大豆、玉米、稻、亞麻、大麥或小麥的LMPcDNA。此外，可以使用根據(jù)相同核酸序列設(shè)計的寡核苷酸引物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)分離包含附錄A所示序列之一，如優(yōu)選實施方案中公開的SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33或SEQIDNO:35的全部或一部分的核酸分子(例如可以利用根據(jù)附錄A所示相同序列，如優(yōu)選實施方案中公開的SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33或SEQIDNO:35設(shè)計的寡核苷酸引物，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)分離包含附錄A所示序列之一，如優(yōu)選實施方案中公開的SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33或SEQIDNO:35的全部或一部分的核酸分子)。例如，可以從植物細(xì)胞中分離mRNA(如通過Chirgwin等，1979，Biochemistry18:5294-5299所述的胍鹽-硫氰酸鹽萃取法)，并且可以利用逆轉(zhuǎn)錄酶制備cDNA(如獲自Gibco/BRL，Bethesda，MD的MoloneyMLV逆轉(zhuǎn)錄酶；或獲自SeikagakuAmerica,Inc.,St.Petersburg,FL的AMV逆轉(zhuǎn)錄酶)?？梢愿鶕?jù)附錄A所示核苷酸序列，如優(yōu)選實施方案中公開的SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33或SEQIDNO:35之一設(shè)計用于聚合Sl^式反應(yīng)擴(kuò)增的合成寡核苷酸引物?？筛鶕?jù)標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增技術(shù)選擇合適的寡核苷酸引物，以cDNA或基因組DNA為模板擴(kuò)增本發(fā)明的核酸。將如此擴(kuò)增的核酸克隆至合適的栽體中，并通過DNA序列分析進(jìn)行表征。此外，可以通過標(biāo)準(zhǔn)合成技術(shù)，如使用自動DNA合成儀，制備與LMP核苷^列相應(yīng)的寡核苷酸。在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的分離的核酸包含附錄A所示核苷酸序列之一，如優(yōu)選實施方案中公開的SEQIDNO:5、SEQIDNO:9、SEQIDNO:13、SEQIDNO:17、SEQIDNO:21、SEQIDNO:25、SEQIDNO:29或SEQIDNO:33。附錄A所示序列，如優(yōu)選實施方案中公開的SEQIDNO:5、SEQIDNO:9、SEQIDNO:13、SEQIDNO:17、SEQIDNO:21、SEQIDNO:25、SEQIDNO:29或SEQIDNO:33對應(yīng)于本發(fā)明的擬南芥、大豆、稻、玉米、亞麻、大麥或小麥LMPcDNA。這些cDNA中含有編碼LMP的序列(即附錄A所示的"編碼區(qū)")以及5，非翻譯序列及3，非翻譯序列.可選地，核酸分子可只包含附錄A所示任何序列，如優(yōu)選實施方案中公開的SEQIDNO:7、SEQIDNO:11、SEQIDNO:15、SEQIDNO:19、SEQIDNO:23、SEQIDNO:27、SEQIDNO:31或SEQIDNO:35的編碼區(qū)，或者可包含分離自基因組DNA的完整基因組片段。就本申請的目的而言，應(yīng)該理解附錄A中公開的每個序列具有標(biāo)識記錄號(例如7Jii^Z)-W)。這些序列中每一個通常各包含三個部分5，上游區(qū)、編碼區(qū)和下游區(qū)。這些序列的編碼區(qū)標(biāo)記為"ORF位置"(表3)。在另一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的分離的核酸分子含有這樣的核酸分子，所述核酸分子為附錄A所示核苷酸序列，如優(yōu)選實施方案中4S開的SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33或SEQIDNO:35之一或其部分的互補序列。與附錄A所示核苷酸序列，如優(yōu)選實施方案中公開的SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33或SEQIDNO:35之一互補的核酸分子是這樣的核酸分子，它們與附錄A所示核苷酸序列充分互補，從而能夠與附錄A所示核苷酸序列之一雜交，由此形成穩(wěn)定的雙鏈體.又在另一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的分離的核酸分子含有核苷^列，所述核苷酸序列與附錄A所示核苷酸序列，如優(yōu)選實施方案中爿^開的SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33或SEQIDNO:35或其部分之間具有至少約50-60%,優(yōu)選至少約60-70%,更優(yōu)選至少約70-80%、80-90%或90-95%，也優(yōu)選至少約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%或94%，甚至更優(yōu)選至少約95%、96%、97%、98%、99%或更高的同源性。優(yōu)選利用VectorNTISuite9.0的AlignX(2003年8月22日)確定核苷酸序列的同源性，設(shè)定參數(shù)如下空位開》文罰分15;空位延伸罰分6.66;空位分離罰分范圍8;比對延遲的同一性百分比40。在另一優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的分離的核酸分子含有核苷酸序列，所述核苷酸序列可與附錄A所示核苷酸序列之一或其部分雜交，例如在嚴(yán)緊條件下雜交。這些雜交條件包括用鹽濃度為約0.02M的溶液于pH7約60C洗滌。此外，本發(fā)明的核酸分子可僅含有附錄A所示序列，如優(yōu)選實施方案中公開的SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33或SEQIDNO:35之一的編碼區(qū)的一部分，例如可用作探針或引物的片斷，或編碼LMP生物學(xué)活性部分的片斷。通過克隆擬南芥、大豆、稻、玉米、亞麻、大麥或小麥的LMP基探針和引物。因此本發(fā)明也提供含有本文公開的核酸或其片斷的化合物。這些化合物包含附著于其他部分的核酸。其他部分包括但不僅限于檢測部分、雜交部分、純化部分、遞送部分、反應(yīng)部分、結(jié)合部分等.探針/引物一般含有基本上純的寡核苷酸.所述寡核苷酸一般含有可在嚴(yán)格條件下與附錄A所公開序列，如優(yōu)選實施方案中公開的SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33或SEQIDNO:35之一的正義鏈、附錄所A公開序列，如優(yōu)選實施方案中公開的SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33或SEQIDNO:35之一的反義序列或其天然突變體中至少約12個，優(yōu)選約25個，更優(yōu)選約40、50或75個連續(xù)核苷酸雜交的核苷酸序列區(qū)?；诟戒汚所示核苷酸序列，如優(yōu)選實施方案中公開的SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33或SEQIDNO:35的引物可用于PCR反應(yīng)以克隆LMP同源物。基于LMP核苷^f列的探針可用于檢測轉(zhuǎn)錄物或編碼相同或同源蛋白質(zhì)的基因組序列。在優(yōu)選的實施方案中，探針還含有與W目連的標(biāo)記基團(tuán)，例如，標(biāo)記基團(tuán)可為放射性同位素、熒光化合物、酶或酶輔因子.此類探針可作為基因組標(biāo)記物測試試劑盒的一部分，用于如通過測量細(xì)胞樣品中LMP編碼核酸的水平(如檢測LMPmRNA水平)鑒定表達(dá)LMP的細(xì)胞，或確定基因組LMP基因是否發(fā)生了突變或缺失。在一個實施方案中，本發(fā)明的核酸分子編碼蛋白質(zhì)或其部分，所述蛋白質(zhì)或其部分含有與附錄A所示序列，如優(yōu)選實施方案中公開的SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33或SEQIDNO:35之一所編碼的絲酸序列基本同源的M酸序列，從而使蛋白質(zhì)或其部分能保持與野生型蛋白質(zhì)相同或相似的功能。本文所用的"基本同源"，是指蛋白質(zhì)或其部分具有的M酸序列中包括最小數(shù)目的與某M,列同一或等同的^Jl酸殘基(例如，與附錄A所示序列，如優(yōu)選實施方案中公開的SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33或SEQIDNO:35中ORF之一的氨基酸殘基具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基)，從而使蛋白質(zhì)或其部分能夠參與植物中種子貯存化合物的產(chǎn)生、微生物或植物中細(xì)胞膜的構(gòu)建、或分子的跨膜轉(zhuǎn)運所必需的化合物代謝。調(diào)節(jié)蛋白如DNA結(jié)合蛋白、轉(zhuǎn)錄因子、激酶、磷酸酶，或代謝路徑如脂質(zhì)、淀粉和蛋白質(zhì)生物合成路徑的蛋白質(zhì)成員、或膜轉(zhuǎn)運系統(tǒng)可能在種子貯存化合物的生物合成中起作用。本文描述了此類活性的實例(見表3的推定注釋)。LMP編碼核酸序列的實例在附錄中A公開，如優(yōu)選實施方案中公開的SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33或SEQIDNO:35。由于在多種植物如玉米、小麥、棵麥、燕麥、黑小麥、稻、大麥、大豆、花生、棉花、蕓苔、油菜籽、木薯、胡椒、向日葵、甜菜和萬壽菊、茄屬植物如馬鈴薯、煙草、茄子及番茄、蠶豆屬物種、豌豆、紫花苜蓿、灌木植物(咖啡、可可樹、茶樹)、柳樹屬物種、樹(油棕、椰樹)以及多年生草本和飼料作物中，改變或提高糖和/或脂肪酸的產(chǎn)量是希望得以遺傳的主要性狀，這些作物植物也是本發(fā)明另一實施方案中用于基因工程的優(yōu)選耙植物。本發(fā)明的LMP核酸分子編碼的蛋白質(zhì)部分優(yōu)選為LMP之一的生物學(xué)活性部分。本文所用的術(shù)語"LMP的生物學(xué)活性部分"旨在包括這樣的部分，如參與種子貯存脂質(zhì)的生物合成、微生物或植物中細(xì)胞膜的構(gòu)建或分子的跨膜轉(zhuǎn)運所必需的化合物代謝、或具有表3所列活性的LMP結(jié)構(gòu)域/基序。為確定LMP或其生物學(xué)活性部分是否能夠參與種子貯存化合物的產(chǎn)生及細(xì)胞膜所需的化合物代謝，可進(jìn)行酶活測定。此類測定法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，并描述于實施例14。LMP的生物學(xué)活性部分包括含有M酸序列的肽，所述M酸序列來源于LMP^酸序列(如由附錄A所示核酸序列，如優(yōu)選實施方案中公開的SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33或SEQIDNO:35編碼的^J^絲列或與LMP同源的蛋白質(zhì)的^J^M列，其包括比全長LMP或與LMP同源的全長蛋白質(zhì)更少的氨基酸)，且表現(xiàn)出至少一種LMP活性。通常，生物學(xué)活性部分(如長度為如5、10、15、20、30、35、36、37、38、39、40、50、100或更多個氛基酸的肽)含有具有至少一種LMP活性的結(jié)構(gòu)域或基序。此外，可以通過重組技術(shù)制備蛋白質(zhì)其他區(qū)域缺失的其他生物學(xué)活性部分，并評估本文所述的一種或多種活性。優(yōu)選地，LMP生物學(xué)活性部分包括一個或多個選擇的結(jié)構(gòu)域/基序或其具有生物學(xué)活性的部分?？梢灾苽渚幋aLMP生物活性部分的其他核酸片斷，分離這些序列之一的部分、表達(dá)LMP或肽的編碼部分(如通過體外重組表達(dá))并評估LMP或肽編碼部分的活性。本發(fā)明還包括由于遺傳密碼簡并而有別于附錄A所示核苷酸序列，如優(yōu)選實施方案中公開的SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33或SEQIDNO:35之一(及其部分)的核酸分子，因而也編碼與附錄A所示核苷酸序列，如優(yōu)選實施方案中公開的SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33或SEQIDNO:35編碼的LMP相同的LMP。在另一實施方案中，本發(fā)明的核酸分子編碼全長蛋白質(zhì)，其與附錄A所示開放讀碼框編碼的多肽的JL&酸序列基本同源。在一個實施方案中，全長核酸或蛋白質(zhì)或者核酸或蛋白質(zhì)的片斷來自擬南芥、大豆、稻、玉米、亞麻、大麥或小麥。除本文附錄A所示的擬南芥、大豆、稻、玉米、亞麻、大麥或小麥LMP核苷酸序列外，本領(lǐng)域技術(shù)人員會理解種群(如擬南芥、歐洲油菜、大豆、稻、玉米、亞麻、大麥或小麥種群)中可能存在導(dǎo)致LMP氮基酸序列改變的DNA序列多態(tài)性。由于天然變異，種群個體間可能存在此類LMP基因的遺傳多態(tài)性，本文所用的術(shù)語"基因"和"重組基因"是指含有編碼LMP的開放讀框的核酸分子，其中LMP優(yōu)選為擬南芥、大豆、稻、玉米、亞麻、大麥或小麥LMP。此類天然變異一般會造成LMP基因的核苷酸序列1-40%的變異。任何及所有此類天然變異導(dǎo)致的且不會改變LMP功能性活性的核苷酸變異及其所產(chǎn)生的LMP氣基酸多態(tài)性，均在本發(fā)明的范圍內(nèi)。對應(yīng)于天然變異體和本發(fā)明擬南芥、大豆、稻、玉米、亞麻、大麥或小麥LMPcDNA的非擬南芥、大豆、稻、玉米、亞麻、大麥或小麥直向同源物的核酸分子，可以根據(jù)其與本文公開的擬南芥、大豆、稻、玉米、亞麻、大麥或小麥LMP核酸的同源性，以擬南芥、大豆、稻、玉米、亞麻、大麥或小麥cDNA或其部分為雜交探針，根據(jù)嚴(yán)格雜交條件下的標(biāo)準(zhǔn)雜交技術(shù)進(jìn)行分離，本文所用的術(shù)語"直向同源物"是指來自不同物種的兩種核酸，但其系自共同祖先基因通過物種形成進(jìn)化而來，通常直向同源物編碼具有相同或相似功能的蛋白質(zhì).因此，在另一實施方案中，本發(fā)明分離的核酸分子長度至少為15個核苷酸，且可在嚴(yán)緊條件下與含有附錄A所示核苷酸序列，如優(yōu)選實施方案中公開的SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33或SEQIDNO:35的核酸分子雜交，在其他實施方案中，核酸長度至少為30、50、100、250或更多個核苷酸。本文所用的術(shù)語"在嚴(yán)緊條件下雜交"用以描述雜交和洗滌4H，，在所述條件下彼此間至少有60%同源性的核苷酸序列通?？扇匀槐舜穗s交。優(yōu)選的條件可使彼此具有至少約65%，更優(yōu)選至少約70%，甚至更優(yōu)選至少約75%或更高同源性的序列通常仍然彼此雜交.此類嚴(yán)緊條件為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，可見于《CurrentProtocolsinMolecularBiology》，JohnWiley&Sons,N.Y.，1989，6.3.1-6.3.6。優(yōu)選的嚴(yán)緊雜交條件的非限制性實例為在6x氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中于約45X:雜交，隨后在0.2xSSC、0.1%SDS中于50-65X:洗滌一次或多次。優(yōu)選地，可在嚴(yán)緊條件下與附錄A所示序列，如優(yōu)選實施方案中公開的SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33或SEQIDNO:35雜交的本發(fā)明的分離的核酸分子對應(yīng)于天然存在的核酸分子。本文所用的術(shù)語"天然存在的"核酸分子是指具有天然存在(如編碼天然蛋白質(zhì))的核苷酸序列的RNA或DNA分子。在一個實施方案中，核酸編碼天然存在的擬南芥、大豆、稻、玉米、亞麻、大麥或小麥LMP。除了種群中可能存在的LMP序列天然變體之外，技術(shù)人員還理解可以通過突變向附錄A所示核普酸序列，如優(yōu)選實施方案中公開的SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33或SEQIDNO:35之一引入變化，由此改變所編碼LMP的M酸序列，而不改變LMP的功能活性，例如，可以對附錄A所示序列，如優(yōu)選實施方案中公開的SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33或SEQIDNO:35進(jìn)行核苷酸取代，從而引起"非必需"氨基酸殘基的M酸取代。"非必需"氨基酸殘基是指LMP(附錄A，如優(yōu)選實施方案中公開的SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33或SEQIDNO:35)之一的野生型序列中可以改變而不改變所述LMP活性的殘基，而"必需"氬基酸殘基則是LMP活性所必需的。然而，其他氣基酸殘基(如那些LMP活性結(jié)構(gòu)域中非保守或僅為半保守的殘基)對于其活性可能是非必需的，因此這些殘基可能適于,皮改變而不改變LMP活性。因此，本發(fā)明的另一方面涉及編碼LMP的核酸分子，所述LMP含有LMP活性非必需的氨基酸殘基改變。此類LMP在Jl^酸序列上與還保留本文所述的至少一種LMP活性的序列有所不同。在一個實施方案中，分離的核酸分子包含編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列，其中所述蛋白質(zhì)含有與附錄A，如優(yōu)選實施方案中公開的SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33或SEQIDNO:35所示核酸序列編碼的M酸序列具有至少約50%同源性的氛基酸序列，且能夠參與擬南芥、大豆、稻、玉米、亞麻、大麥或小麥中種子貯存化合物的產(chǎn)生或細(xì)胞膜所必需的化合物代謝，或具有表3列出的一種或多種活性。優(yōu)選地，核酸分子編碼的蛋白質(zhì)與附錄A所示的核酸，如優(yōu)選實施方案中公開的SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33或SEQIDNO:35之一所編碼的序列具有至少約50-60%的同源性，更優(yōu)選與附錄A所示的核酸，如優(yōu)選實施方案中公開的SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33或SEQIDNO:35之一所編碼的序列具有至少約60-70%的同源性，甚至更優(yōu)選與附錄A所示的核酸，如優(yōu)選實施方案中公開的SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33或SEQIDNO:35之一所編碼的序列具有至少約70-80Q/。、80-卯％、卯-95%的同源性，還優(yōu)選與附錄A所示的核酸,如優(yōu)選實施方案中公開的SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33或SEQIDNO:35之一所編碼的序列具有至少約85%、86%、87%、88%、89%、卯％、91%、92%、93%、94%或95%的同源性，并且最優(yōu)選與附錄A所示的核酸，如優(yōu)選實施方案中公開的SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33或SEQIDNO:35之一所編碼的序列具有至少約96%、97%、98%或99%的同源性。優(yōu)選利用VectorNTISuite9.0的AlignX(2003年8月22日)確定多肽序列的同源性，設(shè)定參數(shù)如下空位開放罰分10;空位延伸罰分0.05;空位分離罰分范圍8;比對延遲的％—致性40。為確定兩個M酸序列(如附錄A所示核酸，如優(yōu)選實施方案中公開的SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33或SEQIDNO:35之一所編碼的序列與其突變形式)之間或兩個核酸之間的同源性百分比，將所述序列按最佳比較目進(jìn)行比對(例如，可在一蛋白質(zhì)或核酸序列中引入空位以便與另一蛋白質(zhì)或核酸進(jìn)行最佳比對)。然后比較相應(yīng)氨基酸位置或核苷酸位置的M酸殘基或核苷酸。如果其中一個序列(如由附錄A所示核酸，如優(yōu)選實施方案中公開的SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33或SEQIDNO:35所編碼的序列之一)中某一位置被與另一序列(如選自附錄A所示核酸序列，如優(yōu)選實施方案中公開的SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33或SEQIDNO:35所編碼多肽的序列的突變形式)相應(yīng)位置上相同的氛基酸殘基或核苷酸所占據(jù)，則兩個分子在該位置上同源(即本文所用的氨基酸或核酸"同源性"與氨基酸或核酸"同一性"的意義等同)。兩個序列之間的同源性百分比為這兩個序列所共有的相同位置數(shù)的函數(shù)(即，同源性％-相同位置粉總位置數(shù)x100),可以通過向附錄A所示核苷酸序列，如優(yōu)選實施方案中公開的SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33或SEQIDNO:35中引入一個或多個核苷酸取代、添加或缺失，來產(chǎn)生編碼與附錄A所示核酸，如優(yōu)選實施方案中公開的SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33或SEQIDNO:35所編碼蛋白質(zhì)序列同源的LMP的分離的核酸分子，從而可向編碼蛋白質(zhì)中引入一個或多個M酸取代、添加或缺失?？梢酝ㄟ^標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)如定點誘變和PCR介導(dǎo)的誘變，向附錄A所示序列，如優(yōu)選實施方案中公開的SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33或SEQIDNO:35之一引入突變。優(yōu)選在一個或多個預(yù)測的非必需M酸殘基上進(jìn)行保守氨基酸取代。"保守JL^酸取代"是指一個氨基酸殘基由另一個具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基代替。本領(lǐng)域中已經(jīng)確定了具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基家族。這些家族包括具有堿性側(cè)鏈(如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側(cè)鏈(如天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電的極性側(cè)鏈(如甘氨酸、天冬酰胺、谷胺酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性側(cè)鏈(如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、p-支鏈側(cè)鏈(如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)以及芳香側(cè)鏈(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)的氨基酸殘基。因此，優(yōu)選用來自相同側(cè)鏈家族的另一M酸殘基代替LMP中預(yù)測的非必需M酸殘基，或者，在另一個實施方案中，可以通過諸如飽和誘變的方法向所有或部分LMP編碼序列中隨機(jī)引入突變，并篩查所得突變體中本文所述的LMP活性，以鑒定保留LMP活性的突變體。誘變附錄A所示序列，如優(yōu)選實施方案中公開的SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33或SEQIDNO:35之一后，可以重組表達(dá)編碼的蛋白質(zhì)，并通過如本文描述的測定法(見實施例11-13)測定蛋白質(zhì)的活性.優(yōu)選通過重組DNA技術(shù)產(chǎn)生LMP。例如，將編碼蛋白質(zhì)的核酸分子克隆到表達(dá)栽體(如本文所述)中，將表達(dá)載體引入宿主細(xì)胞(如本文所述)，并在宿主細(xì)胞中表達(dá)LMP。隨后可利用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)純化技術(shù)、通過合適的純化策略將LMP從細(xì)胞中分離出來。作為重組表達(dá)的備選方案，還可使用標(biāo)準(zhǔn)肽合成技術(shù)化學(xué)合成LMP或其肽。此外，可以例如卩吏用抗LMP抗體從細(xì)胞中分離天然LMP，所述抗體可通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，利用本發(fā)明的LMP或其片斷制備。本發(fā)明也提供了LMP嵌合或融合蛋白質(zhì)，本文所用的LMP"嵌合蛋白質(zhì)"或"融合蛋白質(zhì)"包括與非LMP多肽有效連接的LMP多肽。"LMP多肽"或"LMP蛋白質(zhì)"是指具有LMP相應(yīng)M酸序列的多肽，而"非LMP多肽"是指具有與LMP非基本同源的蛋白質(zhì)對應(yīng)的氨基M列的多肽，例如與LMP不同且來源于相同或不同生物的蛋白質(zhì)。就融合蛋白質(zhì)而言的術(shù)語"有效連接"旨在表明LMP多肽與非LMP多^bf目互融合，從而使二者都能刊Y吏屬于所用序列的預(yù)期功能?？梢詫⒎荓MP多肽融合于LMP多肽的N-末端或C-末端。例如，在一個實施方案中，融合蛋白質(zhì)為GST-LMP(谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶)融合蛋白質(zhì)，其中LMP序列融合于GST序列的C-末端。此類融合蛋白可促進(jìn)重組LMP的純化。在另一實施方案中，融合蛋白為在其N-末端含有異源信號序列的LMP。在某些宿主細(xì)胞(如哺乳動物宿主細(xì)胞)中，使用異源信號序列能夠提高LMP的表達(dá)和/或分泌。優(yōu)選通過標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)生產(chǎn)本發(fā)明的LMP嵌合或融合蛋白質(zhì)。例如，根據(jù)常規(guī)技術(shù)將編碼不同多肽序列的DNA片斷于讀框內(nèi)連接在一起，如使用平末端或粘性末端進(jìn)行連接、限制性酶消化以提供合適的末端、必要時填平粘性末端、堿性磷酸酶處理以避免不期望的連接，以及酶促連接。在另一個實施方案中，可以通過常規(guī)技術(shù)包括自動化DNA合成儀合成融合基因。或者可以使用錨定引物進(jìn)行基因片斷的PCR擴(kuò)增，所述錨定引物能夠在兩個連續(xù)基因片斷之間產(chǎn)生互補突出端，使其可隨后退火并再擴(kuò)增產(chǎn)生嵌合基因序列(例如參見CurrentProtocolsinMolecularBiology,Ausubel等編，JohnWiley&Sons:1992),此外，許多已經(jīng)編碼融合部分的表達(dá)栽體(如GST多肽)為商業(yè)可得，可以將LMP編碼核酸克隆到這樣的表達(dá)載體中，從而使融合部分與LMP同讀框相連.除了上述編碼LMP的核酸分子之外，本發(fā)明另一方面涉及與其反義的分離的核酸分子。"反義"核酸含有與編碼蛋白質(zhì)的"正義"核酸互補的核苷酸序列，例如與雙鏈cDNA分子的編碼鏈互補或與mRNA序列互補。因此，反義核酸可以與正義核酸形成氫鍵。反義核酸可以與整個LMP編碼鏈互補，也可僅與其中一部分互補。在一個實施方案中，反義核酸分子與LMP編碼核苷酸序列的編碼鏈"編碼區(qū)"反義，術(shù)語"編碼區(qū)"是指含有能夠翻譯為氨基酸殘基的密碼子的核苷酸序列區(qū)域(例如7iiE4Z)-w的完整編碼區(qū)包含核苷酸165-1325)。在另一實施方案中，反義核酸分子與LMP編碼核苷酸序列的編碼鏈"非編碼區(qū)"反義。術(shù)語"非編碼區(qū)"是指編碼區(qū)兩側(cè)不被翻譯成氨基酸的5，和3，序列(即也稱為5，和3，非翻譯區(qū))。給定本文公開的編碼LMP的編碼鏈序列(例如附錄A所示序列，如優(yōu)選實施方案中7>開的SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33或SEQIDNO:35)，可以按照Watson和Crick堿基配對原則設(shè)計本發(fā)明的反義核酸.反義核酸分子可以與LMPmRNA的整個編碼區(qū)互補，但更優(yōu)選為僅與LMPmRNA編碼區(qū)或非編碼區(qū)的一部分反義的寡核苷酸。例如，反義寡核苷酸可以與LMPmRNA翻譯起始位點周圍區(qū)域互補.反義寡核苷酸長度可為如5、10、15、20、25、30、35、40、45或50個核苷酸?？梢允褂没瘜W(xué)合成以及酶促連接反應(yīng)，通過本領(lǐng)域已知的方法構(gòu)建本發(fā)明的反義或正義核酸.例如，可以使用天然存在的核苷酸或多種修飾核苷酸化學(xué)合成反義核酸(如反義寡核苷酸)，所述修飾核苷酸是設(shè)計為了提高分子的生物學(xué)穩(wěn)定性或提高反義和正義核酸間所形成的雙鏈體的物理穩(wěn)定性，如可使用減，代磷酸酯衍生物和吖咬取代的核普酸，可用于產(chǎn)生反義核酸的修飾核苷酸實例包括5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧咬、次黃嘌呤、黃嘌呤、4-乙酰胞嘧咬核苷、5-(羧基羥甲基)尿嘧啶、5-氯基甲基JL^-甲基-2-硫代尿普、5-羧基甲基氨基曱基尿嘧啶、雙氫尿嗜咬、P-D-半乳糖Q核苷、肌苷、N-6-異戊烯基腺嘌呤、1-甲基鳥嘌呤、l-甲基肌苷、2，2-二甲基鳥嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-曱基鳥嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-曱基-胞嘧啶、N-6-腺噤呤、7-甲基鳥嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基-甲基-2-硫尿嘧啶、p-D-甘露糖Q核苷、5'-曱氧基絲甲基尿嘧啶、嘧啶、2-甲硫基-N-6-異戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧基乙酸(v)、wybutoxosine、假尿嘧咬、Q核苷、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧基乙酸(v)、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶、(acp3)w和2,6-二氨基噤呤?；蛘?，可以使用表達(dá)載體生物產(chǎn)生反義核酸，RNA為目的靶核酸的反義方向，在以下部分將進(jìn)一步說明)。在反義技術(shù)的另一種變化形式中，可以使用雙鏈千擾RNA構(gòu)建體引起轉(zhuǎn)基因植物中LMPmRNA水平以及LMP活性的下調(diào)。這需要用嵌合構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物，所述構(gòu)建體中含有正義方向的LMP序列部分，其與相同的LMP序列部分的反義序列融合，可以利用長度不等的DNA接頭區(qū)來分隔該構(gòu)建體中LMP序列的正義及反義片斷。本發(fā)明的反義核酸分子一般施用于細(xì)胞或原位產(chǎn)生，以使其能夠與編碼LMP的細(xì)胞mRNA和/或基因組DNA雜交或與之結(jié)合，從而抑制所述蛋白質(zhì)的表達(dá)，如通過抑制轉(zhuǎn)錄和/或翻譯，可以通過常規(guī)的核苷酸互補而形成穩(wěn)定的雙鏈體進(jìn)行雜交，或者，如在反義核酸分子結(jié)合于DNA雙鏈體的情況下，通過在雙螺旋大溝內(nèi)的特定相互作用進(jìn)行雜交。通過如將反義核酸分子與可結(jié)合于細(xì)胞表面受體或抗原的肽或抗體相連，可以對反義分子進(jìn)行修飾而使其能夠特異性地與所選擇細(xì)胞表面的受體或抗原結(jié)合，也可使用本文描述的栽體將反義核酸分子遞送到細(xì)胞中，為達(dá)到胞內(nèi)反義分子的足夠濃度，優(yōu)選將反義核酸分子置于原核、病毒或真核(包括植物)的強啟動子調(diào)控下的栽體構(gòu)建體。又在另一個實施方案中，本發(fā)明的反義核酸分子為端基異構(gòu)核酸分子。端基異構(gòu)核酸分子與互補RNA形成特殊雙鏈雜合體，其鏈不同于通常的單元而是相互平行的(Gaultier等人，1987，NucleicAcidsRes.15:6625-6641)。反義核酸分子也可含有2，-0-甲基核糖核苷(Inoue等人，1987，NucleicAcidsRes.15:6131-6148)或嵌合型RNA-DNA類似物(Inoue等人，1987，F(xiàn)EBSLett.215:327-330)。又在另一個實施方案中，本發(fā)明的反義核酸為核酶。核酶為具有核糖核酸酶活性的催化性RNA分子，能夠裂解與之具有互補區(qū)域的單鏈核酸如mRNA。因此，可以使用核酶(如錘頭狀核酶(描述于Haselhoff&Gerlach，1988，Nature334:585-591))催化裂解LMPmRNA轉(zhuǎn)錄物，由此抑制LMPmRNA的翻譯。可以根據(jù)本文公開的LMPcDNA核苷紗列(即附錄A的BnOl，如優(yōu)選實施方案中公開的SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33或SEQIDNO:35)或根據(jù)本發(fā)明教導(dǎo)方法分離的異源序列，設(shè)計對LMP編碼核酸具有特異性的核酶.例如，可以構(gòu)建四膜蟲(7^Yi^附e/m)L-19IVSRNA的衍生物，其中活性位點的核苷酸序列與LMP編碼mRNA中待切割的核苷酸序列互#(見如Cech等人的美國專利號4，987，071和Cech等人的美國專利號5,116,742)。或者，可以使用LMPmRNA從RNA分子庫中選出具有特異性核糖核酸酶活性的催化性RNA(見如Bartel，D.&SzostakJAV.1993，Science261:1411-1418)?；蛘?，可以通過尋靶與LMP核苷酸序列調(diào)節(jié)區(qū)(例如LMP啟動子和/或增強子)互補的核苷酸序列，形成可阻斷靶細(xì)胞中LMP基因轉(zhuǎn)錄的三螺旋結(jié)構(gòu)，從而抑制LMP的基因表達(dá)(一般參見HeleneC.1991，AnticancerDrugDes.6:569-84;HeleneC.等人，1992，Ann.N.Y.Acad.Sci.660:27-36;以及Maher，L.J.1992，Bioassays14:807-15)。又在另一實施方案中，可使用微RNA技術(shù)(BartelD.，Cell,116:281-297,2004)。可設(shè)計微RNA前體使其尋靼并下調(diào)目的基因的表達(dá)。所述前體可顯著表達(dá)于種子或其他組織中。miRNA(~21-25nt)衍生自較大前體，具有轉(zhuǎn)錄自非蛋白質(zhì)編碼基因的莖環(huán)結(jié)構(gòu)。miRNA尋靶特定的mRNA以在轉(zhuǎn)錄后水平(即降解mRNA)或翻譯水平(即抑制蛋白質(zhì)合成)上抑制基因表達(dá)。本發(fā)明的另一方面涉及含有編碼LMP(或其部分)的核酸的載體，優(yōu)選表達(dá)載體。本文所用的術(shù)語"載體"是指能夠轉(zhuǎn)運與之相連的其他核酸的核酸分子。一類載體為"質(zhì)粒"，是指可以連入額外DNA片斷的環(huán)形雙鏈DNA環(huán)。另一類載體為病毒載體，其中額外DNA片斷可以連入病毒基因組。某些載體能夠在引入的宿主細(xì)胞中自主復(fù)制(例如，具有細(xì)菌復(fù)制起點的細(xì)菌載體以及游離型哺乳動物載體)。其他載體(如非游離型哺乳動物載體)則在進(jìn)入宿主細(xì)胞后整合入宿主細(xì)胞的基因組，從而可隨著宿主基因組一同復(fù)制。此外，某些載體能夠指導(dǎo)與之有效連接的基因的表達(dá)。這類載體在本文被稱為"表達(dá)栽體"，一般而言，用于重組DNA技術(shù)的表達(dá)栽體通常以質(zhì)粒的形式存在。在本說明書中，"質(zhì)粒"和"栽體"可以互換使用，因為質(zhì)粒是最常用的栽體形式。然而，本發(fā)明旨在包括此類具有等同功能的其他形式的表達(dá)載體，例如病毒載體(如復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺相關(guān)病毒)，本發(fā)明的重組表達(dá)栽體包含以適于在宿主細(xì)胞中表達(dá)的形式存在的本發(fā)明的核酸，這意味著重組表達(dá)栽體中包含一個或多個與待表達(dá)的核^列有效連接的調(diào)節(jié)序列，所述調(diào)節(jié)序列的選擇根據(jù)用于表達(dá)的宿主細(xì)胞而定。就重組表達(dá)栽體而言的"有效連接"，是指目的核苷酸序列與調(diào)節(jié)序列以允許所述核苷酸序列表達(dá)的形式連接，從而兩個序列互相融合而各自行使其預(yù)期功能(如在體外轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)或在引入載體的宿主細(xì)胞中)。術(shù)語"調(diào)節(jié)序列"包括啟動子、增強子以及其他表達(dá)控制元件(例如多聚腺普化信號)。這些調(diào)節(jié)序列描述于如Goeddel;GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185，AcademicPress,SanDiego,CA(1990)或見于Gruber和Crosby的MethodsinPlantMolecularBiologyandBiotechnolgy，CRCPress,BocaRaton,Florida編輯Glick&Thompson,第7章，89-108頁，包括其中的參考文獻(xiàn)。調(diào)節(jié)序列包括那些能夠在許多類型宿主細(xì)胞中指導(dǎo)核苷酸序列組成型表達(dá)的序列，以及那些只在某些宿主細(xì)胞中或某些條件下指導(dǎo)核苷酸序列表達(dá)的序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會意識到，表達(dá)栽體的設(shè)計取決于所要轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的選擇、期望達(dá)到的蛋白質(zhì)表達(dá)水平等因素?？梢詫⒈景l(fā)明的表達(dá)栽體引入宿主細(xì)胞中，從而產(chǎn)生本文所述核酸所編碼的蛋白質(zhì)或肽，包括融合蛋白質(zhì)或肽(例如LMP、LMP的突變形式、融合蛋白質(zhì)等)?？稍O(shè)計本發(fā)明的重組表達(dá)載體用于在原核或真核細(xì)胞中表達(dá)LMP。例如，可將LMP基因表達(dá)于細(xì)菌細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞(使用桿狀病毒表達(dá)栽體)、酵母及其他真菌細(xì)胞(見Romanos等人，1992，F(xiàn)oreigngeneexpressionmyeast:areview,Yeast8:423國488;在MoreGeneManipulationsinFungi,Bennet&Lasure編，396-428頁AcademicPress:anDiego中的vandenHondel，C.A.M.J.J.等人，1991，"Heterologousgeneexpressioninfilamentousfungi";以及AppliedMolecularGeneticsofFungi，Peberdy等人編，1-28頁，CambridgeUniversityPress:Cambridge中的vandenHondel和Punt，1991，"Genetransfersystemsandvectordevelopmentforfilamentousfungi");藻類(Falciatore等人，1999，MarineBiotechnology1:239-251);全毛亞綱(Holotrichia)、緣毛亞綱(Peritrichia)、旋唇亞綱(Spirotrichia)、吸管蟲類綱(Suctoria)、四膜蟲(Tetrahymena)、草履蟲(Paramecium)、豆形蟲(Colpidium)、瞬目蟲(Glaucoma)、匙口蟲(Platyophrya)、Potomacus、假康纖蟲(Pseudocohnilembus)、游4卜蟲(Euplotes)、Engelmaniella以^S^J^蟲(Stylonychia)屬的纖毛蟲，尤其是遵循WO98/01572所述轉(zhuǎn)化方法的帶有栽體的浮萍棘尾蟲(5^/<w>^/fe附朋e)屬的纖毛蟲；以及多細(xì)胞植物細(xì)胞(見Schmidt&Willmitzer，1988，PlantCellRep.:583-586;PlantMolecularBiologyandBiotechnology,CPress,BocaRaton，F(xiàn)lorida,6/7章，S.71-119(1993);發(fā)表于TransgenicPlants,巻1,EngineeringandUtilization,Kung和Wu編，AcademicPress1993，128-43的White,Jenes等人，"TechniquesforGeneTransfer";Potrykus，1991，Annu.Rev.PlantPhysiol.PlantMol.Biol.42:205誦225(及其中引用的參考文獻(xiàn)))或哺乳動物細(xì)胞.在Goeddel，GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185，AcademicPress,SanDiego，CA1990中有對合適宿主細(xì)胞的進(jìn)一步討論?；蛘撸梢栽隗w外轉(zhuǎn)錄并翻譯重組表達(dá)載體，例如使用T7啟動子調(diào)節(jié)序列和T7聚合酶。通常使用含有能夠調(diào)控融合或非融合蛋白質(zhì)表達(dá)的組成型或謙導(dǎo)型啟動子的載體在原核細(xì)胞中表達(dá)蛋白質(zhì)。融合載體向其所編碼蛋白質(zhì)中添加若干氨基酸，通常是添加在重組蛋白質(zhì)的氨基端，但也可以添加到c-末端或融合入蛋白質(zhì)的適宜區(qū)域。這樣的融合載體一般可以實現(xiàn)以下一種或多種目的l)提高重組蛋白的表達(dá)；2)提高重組蛋白的溶解性；以及3)作為親和純化中的配體協(xié)助重組蛋白的純化。在融合表達(dá)載體中，通常在融合部分與重組蛋白的連接處引入蛋白水解裂解位點，以使重組蛋白能夠在融合蛋白純化后與融合部分分離。此類酶及其同源識別序列包括Xa因子、凝血酶和腸激酶。典型的融合表達(dá)載體包括分別將谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、麥芽糖E結(jié)合蛋白或蛋白質(zhì)A與目的重組蛋白融合的pGEX(PharmaciaBiotechInc;Smith和Johnson,1988，Gene67:31-40)、pMAL(NewEnglandBiolabs，Beverly,MA)以及pRIT5(Pharmacia,Piscataway，NJ)。在一個實施方案中，將LMP編碼序列克隆到pGEX表達(dá)載體中以產(chǎn)生編碼融合蛋白的載體，所述融合蛋白從N-末端到C-末端包括GST-凝血酶裂解位點-X蛋白質(zhì)?？梢允褂霉入赘孰?瓊脂糖樹脂，通過親和層析法純化融合蛋白。可以利用凝血酶裂解融合蛋白來回收與GST去融合的重組LMP,合適的非融合大腸桿菌(Eoi/i)誘導(dǎo)型表達(dá)載體的實例包括pTrc(Amann等人，1988，Gene69:301-315)和pETlid(Studier等人，19卯，GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185，AcademicPress,SanDiego，California60-89),pTrc栽體中的把基因表達(dá)有賴于雜合trp-lac融合啟動子啟動的宿主RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄。而pETlid栽體中的把基因表達(dá)則有賴于共表達(dá)病毒RNA聚合酶(T7gnl)介導(dǎo)的T7gnl0-lac融合啟動子啟動的轉(zhuǎn)錄。此病毒聚合酶由宿主林BL21(DE3)或HMS174(DE3)從具有處于lacUV5啟動子轉(zhuǎn)錄控制下的T7gnl基因的定居噬菌體提供。最大化重組蛋白表達(dá)的策sM^—是在對所述重組蛋白質(zhì)的蛋白水解裂解能力缺陷的宿主細(xì)菌中表達(dá)所述蛋白質(zhì)(GottesmanS.，19卯，GeneExpressionTechnology:iVi￡""矽附</<^185:119-128，AcademicPress,SanDiego，California),另一策略則為改變欲插A^達(dá)載體的核酸的核酸序列，使每一氨基酸的個體密碼子為選用于表達(dá)的細(xì)菌中偏好使用的密碼子(Wada等人，1992，NucleicAcidsRes.20:2111-2118)?？梢酝ㄟ^標(biāo)準(zhǔn)DNA合成技術(shù)完成對本發(fā)明核酸序列的此類改動。在另一實施方案中，LMP表達(dá)載體為酵母表達(dá)載體?？捎糜谠卺劸平湍窸S."rev/w'fle)中表達(dá)的載體實例包括pY印Secl(Baldari等人，1987,EmboJ.6:229-234)、pMFa(Kurjan和Herskowitz，1982，Cell30:933-943)、pJRY88(Schultz等人，1987，Gene54:113誦123)以及pYES2(InvitrogenCorporation,SanDiego,CA)'載體以及構(gòu)建適用于其他真菌(如絲狀真菌)的載體的方法，包括詳述于AppliedMolecularGeneticsofFimgi，Peberdy等人編，1-28頁，CambridgeUniversityPress:Cambridge中vandenHondel和Punt，1991，"Genetransfersystemsandvectordevelopmentforfilamentousfungi"中的載體和方法，或者，可使用桿狀病毒表達(dá)載體于昆蟲細(xì)胞中表達(dá)本發(fā)明的LMP?？稍谂囵B(yǎng)的昆蟲細(xì)胞(如Sf9細(xì)胞)中表達(dá)的桿狀病毒載體包括pAc系列(Smith等人，1983，Mol.CellBiol.3:2156-2165)和pVL系列(Lucklow和Summers,1989，Virology170:31-39),而在另一實施方案中，使用哺乳動物表達(dá)載體在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)本發(fā)明的核酸。哺乳動物表達(dá)載體的實例包括pCDM8(Seed,1987，Nature329:840)和pMT2PC(Kaufman等人，1987，EMBOJ.6:187-195).當(dāng)用于哺乳動物細(xì)胞時，通常使用病毒調(diào)節(jié)元件來提供表達(dá)栽體的控制功能。例如，常用啟動子來源于多瘤病毒、腺病毒2、巨細(xì)胞病毒以及猿病毒40。其他可同時用于原核及真核細(xì)胞的合適表達(dá)系統(tǒng)，見Sambrook，F(xiàn)ritsh和Maniatis，MolecularCloning:ALaboratoryManual,第二版，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,1989第16及17章。在另一實施方案中，可在單細(xì)胞植物細(xì)胞(如藻類，見Falciatore等人，1999，MarineBiotechnology1:239-251及其中的參考文獻(xiàn))和高等植物的植物細(xì)胞(例如種子植物，如作物植物)中表達(dá)本發(fā)明的LMP,植物表達(dá)載體的實例包括Becker,Kemper,Schell和Masterson(1992，"Newplantbinaryvenctorswithselectablemarkerslocatedproximaltotheleftborder",PlantMol.Biol.20:1195-1197)以及Bevan(1984，"BinaryAgrobacteriumvectorsforplanttransformation,NucleicAcidsRes.12:8711-8721;TransgenicPlants,巻1，EngineeringandUtilization,Kung和R.Wu編輯，AcademicPress,1993，S.15-38中的VectorsforGeneTransferinHigherPlants)中詳述的那些.植物表達(dá)盒中優(yōu)選含有有效連接的能夠驅(qū)動植物細(xì)胞中基因表達(dá)的調(diào)節(jié)序列，從而使各序列可行使其功能(如終止轉(zhuǎn)錄)，包括多聚腺苷化信號.優(yōu)選的多聚腺苷化序列來源于才艮癌農(nóng)桿菌(^gro6flcter/w附似nie/tfcie/M)的t-DNA，如Ti-質(zhì)粒pTiACH5章魚堿合成酶的基因3(Gielen等人，l訴4，EMBOJ.3:835)或其功能等效物，而且在植物中具有功能活性的所有其他終止子也適用.由于植物基因表達(dá)常常并不僅限于轉(zhuǎn)錄水平，植物表達(dá)盒優(yōu)選含有其他有效連接的序列如翻譯增強子，如含有煙草花葉病毒5，非翻譯前導(dǎo)序列的超驅(qū)動序列，從而提高蛋白質(zhì)/RNA比率(Gallie等人，1987，NucleicAcidsRes.15:8693-8711)。植物基因表達(dá)必須與合適的啟動子有效連接，所述啟動子使基因以適時的、細(xì)胞或組織特異性方式表達(dá).優(yōu)選可驅(qū)動組成型表達(dá)的啟動子(Benfey等人，1989，EMBOJ.8:2195-2202)，如那些來源于植物病毒的啟動子，如35SCAMV(Franck等人，1980，Cell21:285-294)、19SCaMV(也見US5,352,605及WO84/02913)，或如來源于1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)小亞基的植物啟動子(US4,962,028所述).更優(yōu)選的為能在種子發(fā)育的所有或選擇的階段驅(qū)動LMP蛋白質(zhì)表達(dá)的種子特異性啟動子。種子特異性植物啟動子為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知，并可用種子特異性mRNA文庫及表達(dá)分型技術(shù)對其進(jìn)行鑒定和表征.種子特異性啟動子包括油菜籽的napin基因啟動子(US5，608，152)、蠶豆(USP啟動子(Baeumlein等人，1991，Mol.Gen.Genetics225:459-67)、擬南芥油體蛋白啟動子(WO98/45461)、菜豆(戶力flwo/附vw/gflWs)的菜豆蛋白啟動子(US5，504，200)、蕓莒屬Bce4-啟動子(WO9113980)或豆球蛋白B4啟動子(LeB4;Baeumlein等，1992,PlantJ.2:233-239),以及可賦予單子葉植物如玉米、大麥、小麥、棵麥、稻等種子特異性表達(dá)的啟動子。需要指出的合適啟動子為大麥的Ipt2或lptl基因啟動子(WO95/15389和WO95/23230)，或W099/168卯中所述的啟動子(大麥的大麥醇溶蛋白基因啟動子、稻谷蛋白基因啟動子、稻水稻素基因啟動子、小麥醇溶蛋白基因啟動子、小麥谷蛋白基因啟動子、玉米醇溶蛋白基因啟動子、燕麥谷蛋白基因啟動子、高粱kasirin基因啟動子以及棵麥黑麥堿(secalin)基因啟動子).也可以通過誘導(dǎo)型啟動子促進(jìn)植物基因表達(dá)(綜述可見Gatz1997，Annu.Rev.PlantPhysiol.PlantMol.Biol.48:89-108)?；瘜W(xué)資導(dǎo)型啟動子特別適用于需要以時間特異性方式進(jìn)行基因表達(dá)的情形.此類啟動子的實例為水楊酸i秀導(dǎo)的啟動子(WO95/19443)、四環(huán)素誘導(dǎo)的啟動子(Gatz等人，1992，PlantJ.2:397-404)，以及乙醇誘導(dǎo)的啟動子(W093/21334)。應(yīng)答生物或非生物脅迫條件的啟動子也是適用的啟動子，例如病原誘導(dǎo)的PRP-1基因啟動子(Ward等人，1993，Plant.Mol.Biol.22:361-366)、熱誘導(dǎo)的番茄hsp80啟動子(US5,187,267)、冷誘導(dǎo)的馬鈴薯ct-淀粉酶啟動子(WO96/12814),以及創(chuàng)傷誘導(dǎo)的pinlI-啟動子(EP375091)。其他可用于植物基因表達(dá)盒的優(yōu)選序列為將基因產(chǎn)物定向于其適當(dāng)?shù)募?xì)胞區(qū)室所必需的靶向序列(綜述見Kermode1996，Crit.Rev.PlantSci.15:285-423及其引用的參考文獻(xiàn))，所述細(xì)胞區(qū)室如液泡、細(xì)胞核、所有類型的質(zhì)體如造粉體、葉綠體、有色體、胞外空間、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、油體、過氧化物酶體以及其他植物細(xì)胞區(qū)室.特別合適的啟動子為那些賦予啟動質(zhì)體特異性基因表達(dá)的啟動子，這是因為質(zhì)體是脂質(zhì)生物合成中前體及某些終產(chǎn)物合成的場所.合適的啟動子如病毒RNA聚合酶啟動子，描述于WO95/16783和WO97/06250,而擬南齊的clpP啟動子描述于WO99/46394。本發(fā)明還提供了重組表達(dá)載體，其中含有以反義方向克隆到表達(dá)載體中的本發(fā)明DNA分子。即DNA分子以允許與LMPmRNA反義的RNA分子表達(dá)(通過DNA分子轉(zhuǎn)錄)的方式與調(diào)節(jié)序列有效連接.可以選擇可在多種細(xì)胞類型中指導(dǎo)反義RNA分子持續(xù)表達(dá)的序列，作為與反義方向克隆的核酸有效連接的調(diào)節(jié)序列，如病毒啟動子和/或增強子；也可以選擇指導(dǎo)反義RNA的組成型、組織特異性或細(xì)胞類型特異性表達(dá)的調(diào)控序列。反義表達(dá)載體的形式可為重組質(zhì)粒、噬菌?；驕p毒病毒，其中反義核酸的產(chǎn)生受到高效調(diào)節(jié)區(qū)域的調(diào)控，其活性是由引入載體的細(xì)胞類型決定的。利用反義基因調(diào)節(jié)基因表達(dá)的討論見Wdntraub等人(1986,AntisenseRNAasamoleculartoolforgeneticanalysis,Reviews-TrendsinGenetics,巻l)以及Mol等人(1990，F(xiàn)EBSLett.268:427-430)。本發(fā)明的另一方面涉及引入了本發(fā)明重組表達(dá)載體的宿主細(xì)胞.本文術(shù)語"宿主細(xì)胞"和"重組宿主細(xì)胞"可互換使用。應(yīng)當(dāng)理解這些術(shù)語不僅僅指具體的受試細(xì)胞，也指該細(xì)胞的后代或潛在的后代。在后續(xù)世代中由于突變或環(huán)境影響會產(chǎn)生某些l奮飾，這樣的后代實際上可能與其親代細(xì)胞不相同，但仍包括在本文所用的術(shù)語范圍內(nèi)。宿主細(xì)胞可以為任何原核或真核細(xì)胞，例如，可以在細(xì)菌細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、真菌細(xì)胞、哺乳動物細(xì)胞(如中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)或COS細(xì)胞)、藻類、纖毛蟲或植物細(xì)胞中表達(dá)LMP。其他合適的宿主細(xì)胞為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知?？梢酝ㄟ^常規(guī)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染技術(shù)將載體DNA引入原核或真核細(xì)胞中.本文所用的術(shù)語"轉(zhuǎn)化"、"轉(zhuǎn)染"、"接合"與"轉(zhuǎn)導(dǎo)"是指將外源核酸(如DNA)引入宿主細(xì)胞的多種本領(lǐng)域公認(rèn)的技術(shù)，包括磷酸鈞或氯化鈣共沉淀、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、脂轉(zhuǎn)染法、自然感受態(tài)、化學(xué)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移或電穿孔法。用于轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞包括植物細(xì)胞的合適方法可見于Sambrook等人(1989，MolecularCloning:ALaboratoryManual,第二版，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY)以及其他實驗手冊如MethodsinMolecularBiology，1995,巻44，"Agrobacteriumprotocols",Gartland和Davey編，HumanaPress,Totowa,NewJersey,對于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染哺乳動物及植物細(xì)胞而言，已知取決于所用表達(dá)栽體和轉(zhuǎn)染技術(shù)的不同，僅有一小部分細(xì)胞可能將外源DNA整合進(jìn)自身基因組中。為了鑒定并選出這些整合體，一般將編碼可選擇標(biāo)記(如抗生素抗性)的基因與目的基因一起引入宿主細(xì)胞。優(yōu)選的可選擇標(biāo)記包括那些能賦予藥物如G418、潮霉素、卡那霉素和氨甲蝶呤抗性的標(biāo)記，或能在植物中賦予除草劑如草甘膦或草胺磷抗性的標(biāo)記。可以在編碼LMP的同一載體上向宿主細(xì)胞中引入編碼可選擇標(biāo)記的核酸，或也可使用單獨的載體引入，可以通過如藥物選擇(如整合選擇標(biāo)記基因的細(xì)胞能夠存活，而其他細(xì)胞死亡)的方法鑒定被引入的核酸穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，為產(chǎn)生同源重組微生物，制備含有至少一部分LMP基因的載體，所述LMP基因中引入了缺失、添加或取代，以改變(如功能性破壞)LMP基因。優(yōu)選的LMP基因為擬南芥、大豆、稻、玉米、亞麻、大麥或小麥LMP基因，但也可為相關(guān)植物或甚至哺乳動物、酵母或昆蟲來源的同源物。在優(yōu)選實施方案中，設(shè)計載體使內(nèi)源性LMP基因在同源重組時被功能性破壞(即不再編碼有功能蛋白質(zhì)；也稱為敲除栽體)?；蛘撸梢栽O(shè)計載體，使內(nèi)源性LMP基因在同源重組時發(fā)生突變或其他改變但仍然編碼有功能蛋白質(zhì)(如可以改變上游調(diào)節(jié)區(qū)域而改變內(nèi)源LMP的表達(dá))。為通過同源重組產(chǎn)生點突變，可在嵌合修復(fù)技術(shù)中使用DNA-RNA雜合體(Cole-Strauss等人，1999，NucleicAcidsRes,27:1323-1330以及Kmiec1999，AmericanScientist87:240-247)。擬南芥或其他作物中的同源重組方法也為本領(lǐng)域所公知，是本文考慮使用的.在同源重組載體中，LMP基因改變了的部分在其5，和3，末端側(cè)接額外的LMP基因核酸，從而使同源重組可以發(fā)生在載體所攜帶的外源性LMP基因與微生物或植物的內(nèi)源性LMP基因之間.額外的側(cè)翼LMP核酸的長度足夠與內(nèi)源性基因進(jìn)行成功的同源重組。一般而言，載體中含有數(shù)百g對至數(shù)千堿基對的側(cè)翼DNA(同時在5，和3，末端)(見如Thomas和Capecchi，1987,Cell51:503中有關(guān)同源重組載體的描述)。將載體引入微生物或植物細(xì)胞中(如通過聚乙二醇介導(dǎo)的DNA)。使用本領(lǐng)域公知的技術(shù)選出引入的LMP基因與內(nèi)源性LMP基因發(fā)生了同源重組的細(xì)胞。在另一實施方案中，可以產(chǎn)生含有能夠調(diào)節(jié)性表達(dá)引入基因的選擇系統(tǒng)的重組微生物。例如，將載體中的LMP基因置于lac操縱子的調(diào)控下，可以使LMP基因僅在IPTG存在時表達(dá)。此類調(diào)節(jié)系統(tǒng)為本領(lǐng)域所熟知?？梢允褂帽景l(fā)明的宿主細(xì)胞(如培養(yǎng)中的原核或真核宿主細(xì)胞)生產(chǎn)(即表達(dá))LMP。因此，本發(fā)明還提供利用本發(fā)明的宿主細(xì)胞生產(chǎn)LMP的方法。在一個實施方案中，該方法包括在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細(xì)胞(其中已經(jīng)引入編碼LMP的重組表達(dá)載體，或該細(xì)胞基因組中含有野生型或改變的LMP基因)，直至產(chǎn)生LMP。在另一實施方案中，該方法還包括從培養(yǎng)基或宿主細(xì)胞中分離LMP。本發(fā)明的另一方面涉及分離的LMP及其生物學(xué)活性部分。"分離的"或"純化的"蛋白質(zhì)或其生物學(xué)活性部分基本不含有使用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)時的細(xì)胞材料，或采用化學(xué)合成時的化學(xué)前體或其他化學(xué)物。用語"基本不含有細(xì)胞材料"包括這樣的LMP制品，其中該蛋白質(zhì)與天然或重組產(chǎn)生該蛋白質(zhì)的細(xì)胞的細(xì)胞成分分開.在一個實施方案中，用語"基本不含有細(xì)胞材料"包括這樣的LMP制品，其中非LMP(本文也稱為"雜質(zhì)蛋白質(zhì)")含量少于約30%(干重)，更優(yōu)選非LMP含量少于約20。/。，更優(yōu)選非LMP含量少于約10%,而最優(yōu)選非LMP含量少于約5。/。.當(dāng)重組生產(chǎn)LMP或其生物活性部分時，也優(yōu)選其基本不含有培養(yǎng)基，即培養(yǎng)基少于蛋白質(zhì)制品總量的約20%,更優(yōu)選少于約10%,而最優(yōu)選少于約5%。用語"基本不含有化學(xué)前體或其他化學(xué)物"包括這樣的LMP制品，其中該蛋白質(zhì)與該蛋白質(zhì)合成中涉及的化學(xué)前體或其他化學(xué)物分開。在一個實施方案中，用語"基本不含有化學(xué)前體或其他化學(xué)物"包括這樣的LMP制品，其中含有少于約30V。(干重)化學(xué)前體或非LMP化學(xué)物，更優(yōu)選化學(xué)前體或非LMP化學(xué)物少于約20%,更優(yōu)選化學(xué)前體或非LMP化學(xué)物少于約10%,而最優(yōu)選化學(xué)前體或非LMP化學(xué)物少于約5%。在優(yōu)選實施方案中，分離的蛋白質(zhì)或其生物活性部分中不含有LMP來源相同生物的雜質(zhì)蛋白質(zhì)。一般而言，通過如在擬南芥、大豆、稻、玉米、亞麻、大麥或小麥以外的植物或微生物、藻類或真菌中重組表達(dá)擬南芥、大豆、稻、玉米、亞麻、大麥或小麥LMP，來制備此類蛋白質(zhì).本發(fā)明的分離LMP或其生物活性部分能夠參與產(chǎn)生擬南芥、大豆、稻、玉米、亞麻、大麥或小麥中種子貯存化合物或細(xì)胞膜所必需的化合物代謝，或具有表3列出的一種或多種活性。在優(yōu)選實施方案中，蛋白質(zhì)或其部分包含與附錄A所示的核酸，如優(yōu)選實施方案中公開的SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33或SEQIDNO:35編碼的絲醋列基本同源的^ij^^列，從而使該蛋白質(zhì)或其部分保留了參與擬南芥、大豆、稻、玉米、亞麻、大麥或小麥細(xì)胞膜構(gòu)建或跨膜分子轉(zhuǎn)運所必需的化合物代謝。蛋白質(zhì)部分優(yōu)選如本文所述的生物活性部分。在另一優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的LMP具有由附錄A所示核酸，如優(yōu)選實施方案中公開的SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33或SEQIDNO:35編碼的M紗列。在另一優(yōu)選實施方案中，LMP具有由核苷酸序列編碼的Jl^酸序列，所述核苷酸序列可與附錄A所示核苷酸序列，如優(yōu)選實施方案中公開的SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33或SEQIDNO:35雜交，例如在嚴(yán)緊條件下雜交。在另一優(yōu)選實施方案中，LMP具有由核苷酸序列編碼的JL&酸序列，所述Jl^酸序列與附錄A所示核酸，如優(yōu)選實施方案中公開的SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33或SEQIDNO:35編碼的M酸序列之間的同源性至少為約50-60%,優(yōu)選至少約60-70%，更優(yōu)選至少約70-80%、80-90%或90-95%，也優(yōu)選至少約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%，甚至最優(yōu)選與附錄A所示核酸，如優(yōu)選實施方案中公開的SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33或SEQIDNO:35編碼的M斷列之間的同源性至少約96%、97%、98%、99%或更高，優(yōu)選利用VectorNTISuite9.0的AlignX(2003年8月22日)確定多肽序列的同源性，設(shè)定參數(shù)如下空位開放罰分10;空位延伸罰分0.05;空位分離罰分范圍8;比對延遲的％—致性40。本發(fā)明的優(yōu)選LMP也優(yōu)選具有本文所述的至少一種LMP活性。例如，本發(fā)明的優(yōu)選LMP包括由可與附錄A所示核苷酸序列，如優(yōu)選實施方案中公開的SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33或SEQIDNO:35雜交，例如在嚴(yán)格條件下雜交的核苷酸序列編碼的M酸序列，且能夠參與擬南芥、大豆、稻、玉米、亞麻、大麥或小麥細(xì)胞膜構(gòu)建或跨膜分子轉(zhuǎn)運所必需的化合物代謝，或具有表3列出的一種或多種活性，在其他實施方案中，LMP與附錄A所示核酸，如優(yōu)選實施方案中公開的SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33或SEQIDNO:35編碼的^J^絲列基本上同源，正如前文所詳述，雖然在^J^酸序列上由于天然變異或^秀變有所不同，但還是保留了由附錄A核紗列，如優(yōu)選實施方案中公開的SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33或SEQIDNO:35之一編碼蛋白質(zhì)的功能活性。因此，在另一實施方案中，LMP為含有4^^列的蛋白質(zhì)，所述氨基酸序列與附錄A所示核酸序列，如優(yōu)選實施方案中公開的SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33或SEQIDNO:35之一的同源性至少為約50-60%，優(yōu)選至少約60-70%,更優(yōu)選至少約70-80%、80-90%或卯-95%,也優(yōu)選至少約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91°/o、92%、93%、94%或95%,甚至更為優(yōu)選與完整ji^酸序列之編碼核酸所編碼的序列之間的同源性至少約96%、97%、98%、99%或更高，并具有本文所述的至少一種LMP活性。優(yōu)選利用VectorNTISuite9.0的AlignX(2003年8月22日)確定多肽序列的同源性，設(shè)定^如下空位開放罰分10;空位延伸罰分0.05;空位分離罰分范圍8;比對延遲的％—致性40。在另一實施方案中，本發(fā)明涉及全長擬南芥、大豆、稻、玉米、亞麻、大麥或小麥蛋白質(zhì)，其與附錄A所示的核酸序列，如優(yōu)選實施方案中公開的SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33或SEQIDNO:35編碼的完整m酸序列基本上同源?？梢允褂蔑@性失活突變或反式顯性抑制來降低LMP在轉(zhuǎn)基因種子中的活性，以改變種子ji&存化合物的水平。為此，產(chǎn)生能夠消除LMP活性的突變，并在轉(zhuǎn)基因植物中過表達(dá)無活性的非功能性LMP基因。無活性的反式顯性LMP蛋白質(zhì)與活性內(nèi)源性LMP蛋白質(zhì)竟?fàn)幍孜锘蚺c其他蛋白質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，而稀釋活性LMP的活性。通過這一途徑可以降低LMP的生物學(xué)活性而不必實際改變內(nèi)源性LMP的基因表達(dá)。Pontier等人使用這一策略以調(diào)節(jié)植物轉(zhuǎn)錄因子的活性(PontierD，MiaoZH,LamE，PlantJ.2001Sep.27(6):529-38，Trans-dominantsuppressionofplantTGAfactorsrevealstheirnegativeandpositiverolesinplantdefenseresponses)。LMP同源物可以通過誘變產(chǎn)生，例如不連續(xù)點突變或截短LMP。本文所用的術(shù)語"同源物"是指用作LMP活性激動劑或拮抗劑的LMP變體形式。LMP激動劑能夠保留與LMP基本相同的生物學(xué)活性或其活性的子集。LMP拮抗劑能夠通過如竟?fàn)幮越Y(jié)合包括LMP在內(nèi)的細(xì)胞膜成分代謝級M應(yīng)中的上游或下游成員、或通過與介導(dǎo)化合物跨膜轉(zhuǎn)運的LMP結(jié)合來抑制LMP天然形式的一種或多種活性，從而阻止易位的發(fā)生。在可選的實施方案中，可以通過在LMP突變體(如截短突變體)組合文庫中篩查LMP激動劑或拮抗劑活性，確定LMP的同源物。在一個實施方案中，通過在核酸水平組合誘變構(gòu)建LMP變體雜合文庫，該LMP變異體雜合文庫由一個雜合的基因文庫編碼而成，例如，可以通過將合成寡核苷酸混合物以酶連接于基因序列的方法產(chǎn)生LMP變體雜合文庫，從而使一系列簡并的潛在LMP序列以單個多肽的形式表達(dá)，或者以一系列更大的含所述系列LMP序列的融合蛋白(如對于噬菌體展示文庫而言)的形式表達(dá)。有很多種方法可以用于從簡并的寡核苷酸序列中產(chǎn)生潛在的LMP同源物文庫，可以在自動DNA合成儀中完成簡并基因序列的化學(xué)合成，然后將合成基因連入合適的表達(dá)栽體中。使用基因的簡并集合可以在一個混合物中提供編碼所需潛在LMP序列集合的所有編碼序列。合成簡并寡核苷酸的方法為本領(lǐng)域所公知(見如Narang，1983，Tetrahedron39:3;Itakura等人，1984，Annu.Rev.Biochem.53:323;Itakura等人，1984，Science198:1056;Ike等人，1983，NucleicAcidsRes.11:477).此外，可以利用LMP編碼序列的片斷文庫建立LMP片斷的雜合群，用于篩選及隨后選擇LMP的同源物。在一個實施方案中，可以用核酸酶在每分子僅發(fā)生約一次切口形成的條件下處理LMP編碼序列的雙鏈PCR片斷，將該雙鏈DNA變性，復(fù)性DNA以形成含有來自不同切口產(chǎn)物正義/反義對的雙鏈DNA，用Sl核酸酶處理去除再形成雙鏈體中的單鏈部分，并將所產(chǎn)生的片斷文庫連入表達(dá)載體，從而建立編碼序列的片斷文庫。通過這種方法，可以產(chǎn)生編碼LMPN-末端、C-末端及大小不等的內(nèi)部片斷的表達(dá)文庫。已知本領(lǐng)域有若干技術(shù)可用于篩選通過點突變或截短產(chǎn)生的組合文庫的基因產(chǎn)物，以及在cDNA文庫中篩選具有所選性質(zhì)的基因產(chǎn)物。這些技術(shù)適用于快速篩選由組合誘變LMP同源物產(chǎn)生的基因文庫，最廣泛用于高通量分析篩查大型基因庫的技術(shù)一般包括將基因文庫克隆到可復(fù)制的表達(dá)載體中，用所得的栽體文庫轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)募?xì)胞，并在一定條件下表達(dá)組合基因，所述條件下，目的活性的檢測有助于分離編碼其產(chǎn)物被檢測的基因的載體。遞歸整體誘變(recursiveensemblemutagenesis,REM),—項負(fù)巨夠增加文庫中功能性突變體頻率的新技術(shù)，也可與篩查測定法組合使用鑒定LMP同源物(Arkin&Yourvan，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:7811-7815;Delgrave等人，1993，ProteinEngineering6:327-331)'在另一實施方案中，可以使用本領(lǐng)域熟知的方法，利用基于細(xì)胞的測定法分析雜合LMP文庫。本文所述的核酸分子、蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)同源物、融合蛋白質(zhì)、引物、載體以及宿主細(xì)胞可以用于以下一種或多種方法鑒定擬南芥、大豆、稻、玉米、亞麻、大麥或小麥及相關(guān)生物；繪制擬南芥、大豆、稻、玉米、亞麻、大麥或小麥相關(guān)生物的基因組圖鐠；鑒定并定位擬南芥、大豆、稻、玉米、亞麻、大麥或小麥目的序列；進(jìn)化研究；確定LMP功能所需的區(qū)域；調(diào)控LMP活性；調(diào)控一種或多種細(xì)胞功能的代謝；調(diào)控一種或多種化合物的跨膜轉(zhuǎn)運；以及調(diào)控種子貯存化合物的積累。植物擬南芥代表了高等(或種子)植物的一員。它與如歐洲油菜、大豆、稻、玉米、亞麻、大麥或小麥等其他植物相關(guān)，都需要光來驅(qū)動光合作用及生長，植物如擬南芥、歐洲油菜、大豆、稻、玉米、亞麻、大麥或小麥在DNA序列和多肽水平上具有高度同源性，從而能夠利用其他植物或生物來源的探針對DNA分子進(jìn)行異源篩選，進(jìn)而能夠?qū)С龉灿行蛄?，其適于在第三物種中異源篩選或解釋功能并預(yù)測基因功能。因此，鑒定這類功能的能力具有重要實用性，如預(yù)測酶的底物特異性。此外，這些核酸分子可以用作繪制擬南芥基因組或相關(guān)生物基因組圖鐠的參照點。本發(fā)明的LMP核酸分子具有多種用途。首先，本發(fā)明的核酸及蛋白質(zhì)分子可作為基因組特定區(qū)域的標(biāo)志。這不僅可用于繪制基因組圖諳，也可用于擬南芥、歐洲油菜、大豆、稻、玉米、亞麻、大麥或小麥蛋白質(zhì)的功能研究，例如，為了鑒定某一特定的擬南芥、歐洲油菜、大豆、稻、玉米、亞麻、大麥或小麥DNA結(jié)合蛋白的基因組結(jié)合區(qū)域，可以消化擬南芥、歐洲油菜、大豆、稻、玉米、亞麻、大麥或小麥的基因組，并將其片斷與DNA結(jié)合蛋白孵育.可另外用本發(fā)明的核酸分子(優(yōu)選具有易檢測標(biāo)記的核酸分子)作為探針與那些與蛋白質(zhì)結(jié)合的片斷雜交；此類核酸分子與基因組片斷的結(jié)合能夠在擬南芥、歐洲油菜、大豆、稻、玉米、亞麻、大麥或小麥的基因組圖譜上定位該片斷，而且當(dāng)用不同的酶進(jìn)行多次重復(fù)時，還有助于快速確定蛋白質(zhì)結(jié)合的核酸序列。此外，本發(fā)明的核酸分子可能與相關(guān)物種的序列有充分的同源性，使得這些核酸分子可以用作構(gòu)建相關(guān)植物基因組圖鐠的標(biāo)記物，本發(fā)明的LMP核酸分子也可用于進(jìn)化和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究。多種原核及真核細(xì)胞使用本發(fā)明分子所參與的代謝和轉(zhuǎn)運過程；通過比較本發(fā)明的核酸分子序列與其他生物中那些編碼相似酶的核酸分子序列，能夠評價生物之間的進(jìn)化相關(guān)性，與之類似，這樣的比較能夠評價序列中哪些為保守區(qū)域而哪些不是，可能有助于確定那些對于酶功能至關(guān)重要的蛋白質(zhì)區(qū)域。這類確定對于蛋白質(zhì)遺傳工程研究具有一定價值，可能會提示該蛋白質(zhì)在不喪失功能的前提下能夠耐受怎樣的誘變。對于本發(fā)明LMP核酸分子的操作可能會導(dǎo)致產(chǎn)生與野生型LMP功能有所差異的LMP。這些蛋白質(zhì)可能在效用或活性上有所改善、可能在細(xì)胞中以高于正常的量存在，也可能效用或活性有所降低。本發(fā)明LMP的改變可以通過幾種機(jī)制直接影響種子儲存化合物的累積和/或成分。在表達(dá)LMP的植物中，轉(zhuǎn)運的增加會導(dǎo)致化合物累積的改變和/或植物組織及器官中的溶質(zhì)分配(partitioning)，最終在種子發(fā)育過程中影響一種或多種種子貯存化合物的累積。Mitsukawa等人(1997，Proc.Natl.Acad.Sci.USA94:7098-7102)提供了一個實例，其中在煙草培養(yǎng)細(xì)胞中過表達(dá)擬南芥高親和力磷酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白基因，增強了磷酸鹽限制條件下的細(xì)胞生長。磷酸鹽的可利用性也顯著影響糖和代謝中間物的產(chǎn)生(Hurry等人，2000，PlantJ.24:383-396)以及葉和根中的脂質(zhì)組成(Hartel等人，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:10649-10654)。與之類似，已經(jīng)證實植物乙酰輔酶A羧化酶(ACCase)的活性受到磷酸化調(diào)節(jié)(Savage和Ohlrogge，1999，PlantJ.18:521-527)，且作用于ACCase的激酶和磷酸酶(LMP)的活性改變，會導(dǎo)致種子脂質(zhì)累積水平的提高或降低，此外，葉綠體包膜上存在脂質(zhì)激酶活性提示信號轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑和/或膜蛋白質(zhì)的調(diào)節(jié)發(fā)生在包膜上(見如Mttller等人，2000，J.Biol.Chem.275:19475-19481及其中所引文獻(xiàn)),^Bi7和基因編碼的兩個蛋白質(zhì)絲氨^/蘇氨酸磷酸酶2C為脫落酸代謝途徑的調(diào)節(jié)物，因此見于種子發(fā)育的早期和晚期階段(如Merlot等人，2001，PlantJ.25:295-303),更多實例也可見前文"發(fā)明背景"章節(jié)。本發(fā)明也提供了可與本文公開或描述的核酸編碼的LMP多肽或其部分特異性結(jié)合的抗體.可以通過許多眾所周知的方法制備抗體(見如Harlow和Lane,Antibodies;ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NewYork,1988)。簡言之，可將純化抗原以足以亂《免疫反應(yīng)的量和間隔注射到動物體內(nèi).可直接純化抗體，也可從動物中獲取脾細(xì)胞。然后將這些細(xì)胞與永生化細(xì)胞系融合并篩查其抗體分泌.這些抗體可以用于篩選核酸克隆文庫以尋找分泌該抗原的細(xì)胞.隨后可對陽性克隆進(jìn)行測序(見如Kelly等人，1992，Bio/Technology10:163-167;Bebbington等人，1992，Bio/Technology10:169-175)。短語與多肽"選擇性結(jié)合"是指能對蛋白質(zhì)在異源蛋白質(zhì)和其他生物制品群中是否存在具有確定性的結(jié)合反應(yīng)。因此，在指定的免疫測定條件下，與特定蛋白質(zhì)結(jié)合的具體抗體并不會與該樣品中的其他蛋白質(zhì)發(fā)生顯著量的結(jié)合。在此類條件下與抗體的選擇性結(jié)合可能需要選擇一種對特定蛋白質(zhì)有特異性的抗體。有很多免疫測定方法可用于選擇能夠與特定蛋白質(zhì)選擇性結(jié)合的抗體。例如，常規(guī)〗吏用固相ELISA免疫測定法逸擇可與蛋白質(zhì)發(fā)生選擇性免疫反應(yīng)的抗體。見Harlow和Lane，"Antibodies,ALaboratoryManual"ColdSpringHarborPublications,NewYork(1988)中關(guān)于可用于測定選擇性結(jié)合的免疫測定方法和條件的描述。某些情況下需要從多種宿主中制備單克隆抗體。制備此類單克隆抗體的技術(shù)描述可見于Stites等人編"BasicandClinicalImmunology,"(LangeMedicalPublications,LosAltos，Calif"第四版)及其所引參考文獻(xiàn)，以及Harlow和Lane("Antibodies,ALaboratoryManual"ColdSpringHarborPublications,NewYork,1988),本申請參考了多種出版物。所有這些出版物及其中所引用的參考文獻(xiàn)的公開內(nèi)容在此申請中全文引用作為參考，以便更詳細(xì)地說明本發(fā)明所屬領(lǐng)域的狀況.對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，顯然可以對本發(fā)明進(jìn)行多種修飾和改變而不背離本發(fā)明的范圍或精神。參考本文公開的說明和本發(fā)明的實施，本發(fā)明的其他實施方案對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的，應(yīng)當(dāng)理解說明書和實施例均為例示性的，本發(fā)明的確切范圍和精神參見本文的權(quán)利要求書。實施例實施例l:一般步驟a)—般克隆步驟根據(jù)Sambrook等人(1989，ColdSpringHarborLaboratoryPress:ISBN0-87969-309-6)或Kaiser、Michaelis和Mitchell(1994，MethodsinYeastGenetics,ColdSpringHarborLaboratoryPress:ISBN0-87969-451-3)中所述進(jìn)行克隆步驟，例如限制性切割、瓊脂糖凝膠電泳、DNA片斷純化、轉(zhuǎn)運核酸至硝化纖維素和尼龍膜上、DNA片斷連接、大腸桿菌和酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化、細(xì)菌生長以及重組DNA的序列分析。b)化學(xué)物質(zhì)若非文中另有說明，所用化學(xué)物為來自Fluka(Neu-Ulm)、Merck(Darmstadt)、Roth(Karlsruhe)、Serva(Heidelberg)以及Sigma(Deisenhofen)公司的p.a.級產(chǎn)品。使用來自Milli-Q水系統(tǒng)水純化工廠(Millipore，Eschborn)的純化的無致熱原的水(下文稱為1120)配制溶液。限制性內(nèi)切酶、DNA修飾酶以及分子生物學(xué)試劑盒獲自AGS(Heidelberg)、Amersham(Braunschweig)、Biometra(G8ttingen)、Boehringer(Mannheim)、Genomed(BadOeynnhausen)、NewEnglandBiolabs(Schwalbach/Taunus)、Novagen(Madison,Wisconsin,USA)、Perkin嗎Elmer(Weiterstadt)、Pharmacia(Freiburg)、Qiagen(Hilden)及Stratagene(Amsterdam,Netherlands)公司.除非另有說明，均根據(jù)生產(chǎn)商的說明使用它們。c)植物材料和生長擬^不孩游對于該研究，使用擬南芥野生型和/m/2突變體(如Miquel&Browse,1992，JBiolChem267:1502-1509中所述)植物的根材料、葉、長角果和種子。將野生型和/</2突變體擬南芥種子在4t:黑暗中預(yù)溫育三天后置于60-80nmolnr、J光子通量密度、16小時(22t！)光照期和8小時黑暗期(18匸)的培養(yǎng)箱(AR-75，PercivalScientific,Boone，IA)中，所有的植物在pH6.2、2%蔗糖和1.2。/。瓊脂的半濃度MS培養(yǎng)基(Murashige&Skoog，1962，i^"io/:/V朋t15:473-497)上發(fā)芽。種子在20%漂白劑0.5%tritonx100中滅菌20分鐘并用過量的無菌水沖洗6次。植物如上所述或在如Klaus等人(2002，PlantPhysiol.128:885-895)所述標(biāo)準(zhǔn)條件下在土壤中生長。M究使用大豆變種Resnick創(chuàng)建cDNA文庫。從某些情況下經(jīng)暗、鹽、熱和旱處理的植物中收集種子、種莢、花、葉、莖及根組織。在某些情況下，植物也經(jīng)線蟲感染。然而，本研究集中研究種子和種莢組織在cDNA文庫中的用途。對植物打上標(biāo)簽，在開花期后固定日期收獲種子5-15天、15-25天、25-35天及33-50天。潛本研究使用粳稻日本晴變種(Oiyztfsflft'vflssp.Japonicacv.Nippon-barre)創(chuàng)建cDNA文庫。從某些情況下經(jīng)暗、鹽、熱和旱處理的植物中收集種子、種莢、花、葉、莖及根組織。本研究集中研究種子胚組織在cDNA文庫中的用途。分別收集胚和胚乳以防胚乳組織可能干擾RNA提取。植物生長于85。F溫室Wisconsin土壤中(高有機(jī)物含量)，光周期為14h,從發(fā)育的種子中切下稻胚，使用玉米雜交林B73xMo17及B73近交系(雜交抹B73xMo17的雌性近交親本)創(chuàng)建cDNA文庫.收集植物的果實或種子(受粉后1至9天的受精卵/幼粒；受粉后23天的乳熟期谷粒R3，早期淀粉生成；大田生長植物受粉后30天的蠟熟初期谷粒(R4),具有淀粉顆粒及發(fā)育良好的胚；發(fā)泡期(blister)的極幼粒R2，水胚乳I;受粉后36天的頂凹初期(earlydentstage)谷粒(R5)，胚乳變得堅實；B73近交，受粉后9天及19天的谷粒)、花(穗發(fā)育6cm(V10)及以上的穗，包括開花，受粉后44至70天；耳穗發(fā)育耳穗抽穗2cm(V13)及以上，包括抽穗絲(未受粉)，受粉后51至70天)、葉/芽/花結(jié)(所有種子填充前的混合期；包括大田中抽穗前的a)3葉植物(V3)、b)6葉植物(V6)及c)較老葉源(地面第3)的葉)、莖(2至5葉植物的地下部分；受粉后13至29天的大田生長植物，除去根和大部分葉組織；大田生長植物受粉后56至84天，抽穗期和種子填充期(乳熟期)穗附近的莖組織)和根組織(從幼年至中年植物來自受粉后12至35天的幼苗、6葉植物和9葉植物)。亞4^研究使用亞麻變種00-44427及變種00-44338(來自Sval6fWeibull收藏)創(chuàng)建cDNA文庫。植物在19t;生長于冷卻溫室腔內(nèi)2升罐的罐裝土壤內(nèi)，其中含有5ml奧綠肥Osmocote/升土壤。在15daa(胚處于急速增長期，約占據(jù)種子的2/3;魚雷晚期胚為綠色)、25daa(胚完全伸長且寬度增加，整個種子變得充實；胚仍為復(fù)綠色)及33daa(種子開始成熟；胚的顏色變?yōu)榈G且尖部為黃色)時從發(fā)育的種子中收集材料。義老;Mf究使用大麥變種Morex創(chuàng)建cDNA文庫。植物在15h光周期下生長于溫室的metromix中，日間溫度23X:而夜間18X:。谷粒處于水熟期至乳熟晚期.谷穗中至上部基本被收獲.在種植75天后收集種子材料。小老^研究使用小麥變種Galeon創(chuàng)建cDNA文庫.從某些情況下經(jīng)暗、鹽、熱和旱處理的植物中收集種子、花、果實、葉、莖及根組織。植物在12h光周期下生長于溫室的metromix中，日間溫度72°F而夜間65°F.實施例2:從植物中分離總DNA分離總DNA的細(xì)節(jié)涉及處理lg鮮重的植物材料.CTAB緩沖液2%(w/v)N-鯨蠟基-N，N，N-三甲基溴化銨(CTAB);100mMTrisHC1pH8.0;1.4MNaCl;20mMEDTA.N-十二烷基肌氨酸緩沖液10%(w/v)N-十二烷基肌氨酸；100mMTrisHC1pH8.0;20mMEDTA。將植物材料于液氮中用研缽研磨為細(xì)粉，并將其轉(zhuǎn)移至2mlEppendorf管中。隨后用一層1ml的分解緩沖液(lmlCTAB緩沖液，100piN-十二烷基肌氨酸緩沖液，20filp-巰基乙醇以及10mg/ml的蛋白酶K溶液10覆蓋冰凍植物材料，并在60X:連續(xù)振蕩孵育1小時。將所得勻漿分裝到兩個Eppendorf管(2ml)中，并用相同體積的氯仿/異戊醇(24:l)振蕩抽提兩次。每次均在8000g、室溫離心15分鐘，使兩相分開。然后使用水冷的異丙醇在-70t:沉淀DNA30分鐘。將沉淀的DNA在4X:、10,000g離心30分鐘沉淀，并重懸于180plTE緩沖液中(Sambrook等人，1989，ColdSpringHarborLaboratoryPress:ISBN0-87969-309-6)。為進(jìn)一步純化，用NaCl(終濃度1.2M)處理DNA，并用兩倍體積的無水乙醇在-70X:再次沉淀30分鐘。用70%乙醇洗滌后，干燥DNA并隨即溶于50piH20+RNAse(終濃度50mg/ml)。DNA在4t:溶解過夜，并于其后在37匸進(jìn)行RNAse消化1小時，41C保存DNA。實施例3:從植物中分離總RNA及poly-(A)+RNA分離總RNA及poly-(A)+RNA以研究轉(zhuǎn)錄物。根據(jù)以下方法從擬南芥植物的長角果中分離RNA:從擬南芥種子中制備RNA——"熱"提取緩沖液、酶及溶液2MKC1蛋白酶K笨酚(RNA用)氯仿:異戊醇(苯酚:氯仿1:1;調(diào)節(jié)pH適于RNA)4MLiCl，DEPC處理的DEPC處理水3MNaOAc，pH5，DEPC處理的異丙醇70%乙醇(DEPC處理水配制)重懸浮緩沖液0.5%SDS，10mMTrispH7.5，DEPC處理水配制的1mMEDTA(因為該溶液無法用DEPC處理)提取緩沖液0.2M硼酸鈉30mMEDTA30mMEGTA1%SDS(每2.5ml緩沖液250pi10%SDS溶液)1%脫氧膽酸鹽(2.5ml緩沖液25mg)2%PVPP(不可溶——每2.5ml緩沖液50mg)2。/。PVP40K(每2.5ml緩沖液50mg)10mMDTT100mMp-巰基乙醇(現(xiàn)配，煙熏罩下處理——每5ml緩沖液使用35jill4,3M的溶液)提取加熱提取緩沖液至80C在液氮冷卻的研缽中研磨組織，并將組織粉末轉(zhuǎn)移到1.51111管中.冷凍保存組織直至加入緩沖液；轉(zhuǎn)移樣品應(yīng)當(dāng)使用預(yù)冷的匙突；而管應(yīng)當(dāng)時刻保留在液氮中。然后向管中加入350pl預(yù)熱的提取援沖液(對于較大樣品，每100mg組織加入緩沖液體積可大至500Hl)，振蕩，將管加熱至801C約1分鐘后置于冰上。振蕩樣品并用電研缽再次研磨。消化加入蛋白酶K(0.15mg/100mg組織)，振蕩并在37匸放置1小時。一次純化加入27pl2MKC1，在水上冰凍10分鐘，隨后以12,000rpm于室溫離心10分鐘。然后將上清液轉(zhuǎn)移到不含RNAase的新管中，并進(jìn)行一次苯酚抽提，然后用氯仿:異戊醇抽提。向上清液中加入l體積異丙醇，在冰上水凍混合物10分鐘。通過離心(室溫7000rpm，10分鐘)沉淀RNA。振蕩混合物10至15分鐘，將沉淀溶解于1ml4MLiCl溶液中。離心5分鐘沉淀RNA。二次純化將沉淀重懸于500jd重懸緩沖液中。加入500jil苯酚并振蕩之。然后加入250jil氯仿:異戊醇并振蕩；離心5分鐘，將上清液轉(zhuǎn)移至新管中。重復(fù)氯仿:異戊醇抽提直至界面清晰。將上清液轉(zhuǎn)移到新管中并加入1/10體積pH為5的3MNaOAc以及600fil異丙醇。在-20t!保存混合物20分鐘或更久。離心10分鐘沉淀RNA，并用70%乙醇將沉淀洗滌一次。除去所有剩余乙醇后將沉淀溶解在15至20filDEPC處理水中。在260nm和280nm處測量1:200稀釋液的吸光度，對RNA定量定性(40照RNA/ml=1OD雄)。如(Hosein，2001，PlantMol.Biol.Rep.19，65a國65e;Ruuska,S.A.，Girke，T"Benning，C.，&Ohlrogge，J.B.，2002，戶/朋-Ce//14，1191-1206)所述，分離來自野生型擬南芥的RNA.利用AmershamPharmaciaBiotechmRNA純4匕試劑盒(運用oligo(dT)-纖維素柱)從總RNA中制備mRNA。按照生產(chǎn)商說明使用DynaBeads(Dynal，Oslo,Norway)分離poIy-(A)+RNA。確定RNA或poly-(A)+RNA的濃度后，加入1/10體積pH4.6的3M醋酸鈉及2倍體積乙醇沉淀RNA,并于-70XM呆存。義_^、裙，；^、亞4、義^-戈V、老從種莢中分離出大豆和亞麻的種子以產(chǎn)生種子和種莢cDNA文庫所需的勻漿材料。在液氮下用研缽和研杵將組織研磨為細(xì)粉，并轉(zhuǎn)移到50ml管中。將組織樣品貯存于-8ox:直至進(jìn)行提取。對于稻而言，通過切割分離5K-10K胚和胚乳。切割時將組織置于冰上的小管或petri盤中。容器置于干冰上，然后保存于-80'C。對于玉米而言，在液氮下用研缽和研桿將組織研磨為細(xì)粉，并轉(zhuǎn)移到50ml管中。將組織樣品貯存于-80lC直至進(jìn)行提取。對于大麥而言，割下麥穗(約2英寸部分)以得到指定階段的小花。修整去掉所有的芒。所選的階段為種子填充早/中期。種子組織cDNA文庫麥?；蛱幱谒炱诨蛱幱谌槭炱冢瑢τ谛←湺?，將Galeon小麥種子的種子萌發(fā)樣品種植于20"x12"的metromix上深度2"處。土壤充分吸收水分，然后每天施水兩次.當(dāng)3-4天后胚芽鞘為約lcm時，用水洗滌幼苗并吸干水分(blotted),為建立花cDNA文庫，于麥穗從鞘中出現(xiàn)30%、60%及100%時的兩天中每一天均收集等數(shù)量的麥穗。此時尚未出現(xiàn)花粉嚢。為了建立種子組織cDNA文庫，麥粒為水熟期或乳熟期，才艮據(jù)麥粒在麥穗上的位置而定；對于晚期種子發(fā)育階段僅收集麥穗。對于根文庫僅收集根.植物具有一主干和三根堅實的分蘗，植物生長于罐中，洗去培養(yǎng)基并保留根作為樣品。對植物不作處理。根據(jù)生產(chǎn)商說明利用RNeasyMaxi試劑盒(Qiagen)從組織中提取總RNA，同時也根據(jù)生產(chǎn)商說明利用OligotexmRNA純化系統(tǒng)試劑盒(Qiagen)從總RNA中加工出mRNA,mRNA送往HyseqPharmaceuticalsIncorporated(Sunnyville，CA)，以進(jìn)一步將每一組織類型來源的mRNA加工為cDNA文庫，并用于其特有的方法，其中基于雜交類型對于類似的質(zhì)粒插入物進(jìn)行聚類化，實施例4:構(gòu)建cDNA文庫為構(gòu)建cDNA文庫，使用鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(Roche，Mannheim,Germany)以及oligo(dT)引物合成第一鏈，于12匸(2小時)、16"(l小時)和22'C(1小時)與DNA聚合酶I、Klenow酶和RNA酶H消化產(chǎn)物孵育，制備第二鏈。在651C孵育(10分鐘)終止反應(yīng)后轉(zhuǎn)移至水上。利用T4DNA聚合酶(Roche，Mannheim)在(30分鐘)鈍化雙鏈DNA分子。通過酚/氯仿抽提以及SephadexG50旋轉(zhuǎn)柱除去核苷酸。用T4DNA連接敏Roche，12匸過夜賄EcoRI接納體(Pharmacia，F(xiàn)reiburg,Germany)連接到cDNA末端上，并與多核苷酸激酶孵育(Roche，37匸，30分鐘)進(jìn)行磷酸化。用低熔點瓊脂糖凝膠分離該混合物。從凝膠中洗脫大于300#對的DNA分子、苯酚抽提、在Elutip-D柱(Schleicher和Schuell，Dassel，Germany)上濃縮、與載體臂連接，并根據(jù)生產(chǎn)商的說明，利用GigapackGold試劑盒(Stratagene，Amsterdam,Netherlands)及材料將之裝入kZAPII噬菌體或XZAP表達(dá)噬菌體。大豆、稻、玉米、亞麻、大麥和小麥cDNA文庫產(chǎn)生于HyseqPharmaceuticalsIncorporated(Sunnyville，CA)。文庫建立中未使用擴(kuò)增步驟以保留表達(dá)信息。Hyseq的基因組方法包括將這些基因分組聚類，并測序每一聚類的代表成員.從oligodT柱純化的mRNA中產(chǎn)生cDNA文庫.隨機(jī)挑取cDNA文庫轉(zhuǎn)化大腸桿菌的菌落，通過PCR擴(kuò)增其cDNA插入物，并點樣于尼龍膜上，用一套"-P放射性標(biāo)記的寡核苷酸與克隆雜交，并確定產(chǎn)生雜交的類型中特定的克隆屬于哪一聚類.獲取cDNA克隆及其DNA序列，用于在轉(zhuǎn)基因植物中過表達(dá)及本文所述的其他分子生物學(xué)方法。實施例5:鑒定E4Z)2樣目的LMP基因擬弟不使用擬南芥野生型和擬南芥/fl^突變體鑒定LMP編碼基因，i^D2基因已克隆并描述(JOkuley，JLightner，KFeldmann，NYadav，ELark，&JBrowse,PlantCell6:147-158，1994)。/^4ZX2編碼微粒體脂肪酸A6-去飽和酶，所述酶向油酸(C18:1^)結(jié)合卵磷脂的A12位插入雙鍵以產(chǎn)生亞油酸(C18:2A9，12),因此也稱為12-去飽和酶.i^LD2是擬南芥基因組中的單個基因。義i、萄、^^、亞4、義^和小老本實施例說明了如何鑒定并分離編碼大豆、稻、玉米、亞麻、大麥和小麥FAD2樣多肽的cDNA克隆。為在適當(dāng)數(shù)據(jù)庫中鑒定樣基因，利用BLAST軟件(BasicLocalAlignmentSearchTool,2.2.6版本,Altschul等人，1997，NucleicAcidRes.25:3389-3402)進(jìn)行相似性分析。除e值閾值(le-10)外均使用默認(rèn)設(shè)置，所有蛋白質(zhì)搜索均利用BLOSUM62矩陣完成。使用擬南芥FAD2多肽的氨基酸序列為搜索查詢條件，并利用TBLASTN算法比對大豆、稻、玉米、亞麻、大麥及小麥中在所有六個讀框中翻譯的DNA數(shù)據(jù)，此類對BPS內(nèi)部數(shù)據(jù)庫的相似性分析鑒定到眾多的EST和cDNA重疊群。使用從Hyseq聚類方法得到的RNA表達(dá)謙數(shù)據(jù)確定器官特異性。選擇種子文庫相對其他組織文庫表達(dá)更多的克隆為LMP候選基因。才艮據(jù)其表達(dá)鐠，選擇大豆、稻、玉米、亞麻、大麥和小麥克隆在擬南芥以及特定作物植物中過表達(dá)。實施例6:克隆鑒定的LMP基因的全長cDNA及直系同源物已在內(nèi)部專有Hyseq數(shù)據(jù)庫中鑒定了對應(yīng)擬南芥、大豆、稻、玉米、亞麻、大麥或小麥全長序列和部分cDNA的克隆。利用ABI377板式凝膠測序儀及BigDyeTerminatorReadyReaction試劑盒(PEBiosystems，F(xiàn)osterCity,CA)對大豆、稻、玉米、亞麻、大麥及小麥的Hyseq克隆中DNA標(biāo)志處進(jìn)行測序.進(jìn)行序列比對以確定Hyseq克隆是否為全長或部分克隆。當(dāng)確定Hyseq克隆為部分cDNA時，使用以下方法分離全長序列。利用在5，和3，端均可進(jìn)行cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)的Clontech的SMARTRACEcDNA擴(kuò)增試劑盒，通過RACEPCR分離全長cDNA。根據(jù)Hyseq克隆序列設(shè)計RACEPCR引物。根據(jù)生產(chǎn)商的條件進(jìn)行全長cDNA的分離和RACEPCR方法的使用，利用QIAquick凝膠提取試劑盒(Qiagen)從瓊脂糖凝膠中提取RACE產(chǎn)物片斷，并按照生產(chǎn)商的說明連入TOPOpCR2.1載體(Invitrogen)。在標(biāo)準(zhǔn)條件(Sambrook等人，1989)下將重組載體轉(zhuǎn)化入TOP10細(xì)胞(Invitrogen)。轉(zhuǎn)化細(xì)胞在37t:、含50jig/ml卡那霉素的LB瓊脂中生長過夜，并涂布40jil40mg/mlX-gal的二甲基曱酰胺貯液，進(jìn)行藍(lán)白篩選。選擇單個白色菌落并用其接種3ml含50ng/ml卡那霉素的液體LB，在37t:生長過夜。才艮據(jù)生產(chǎn)商說明，使用QIAprepSpinMiniprep試劑盒(Qiagen)提取質(zhì)粒DNA。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行后續(xù)的克隆分析和限制性酶切圖鐠繪制(Sambrook等人，1989)。通過使用下列方法分離全長cDNA并克隆進(jìn)二元載體使用得自Hyseq克隆的全長序列或后來的RACE擴(kuò)增產(chǎn)物設(shè)計基因特異引物。以Hyseq克隆或cDNA文庫為DNA模板使用降落PCR(touch-downPCR)擴(kuò)增全長序列和基因。在一些情況下，設(shè)計引物向基因起始密碼子緊鄰上游添加"AACA"Kozak樣序列，且在一些情況下下游的兩個堿基改變?yōu)镚C以促進(jìn)提高基因表達(dá)水平(Chandrashekhar等人，1997，PlantMolecularBiology35:993-1001)。PCR反應(yīng)循環(huán)為94X2，5分鐘；94X3，1分鐘,65^,1分鐘，721C，4分鐘，9個循環(huán)，其中退火溫度每循環(huán)降低ir;;94匸，1分鐘，55X:,1分鐘,72X:，4分鐘,20個循環(huán)；72;10分鐘結(jié)束PCR循環(huán)。使用GenElute-EtBr旋轉(zhuǎn)柱(Sigma)在1%瓊脂糖凝膠上凝膠純化擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物，并在標(biāo)準(zhǔn)酶促消化后連接至植物二元載體pBPS-GBl上，用于轉(zhuǎn)化擬南芥。二元栽體通過在LB培養(yǎng)基和合適的抗生素中在大腸桿菌DH5中過夜培養(yǎng)擴(kuò)增，并使用QiagenMiniPr印DNA制備試劑盒制備質(zhì)粒用于后續(xù)步驟。在多個克隆步驟中均通過用限制性消化確定插入物大小來確認(rèn)插入物，并測序插入物以保證擬南芥轉(zhuǎn)化中使用預(yù)期的基因。基因序列可用于鑒定cDNA或基因組文庫中的同源或異源基因(直向同源物，來自其他植物的相同LMP基因)。可以通過設(shè)計由多重序列比對確定的保守序列的PCR引物完成該鑒定。常通過設(shè)計目的基因的全長或部分序列的簡并引物鑒定直向同源物.基因序列可用于鑒定cDNA或基因組文庫中的同源物或直向同源物。利用如cDNA文庫等通過核酸雜交，可以分離同源基因(如全長cDNA克隆)才艮據(jù)目的基因的豐度不同，鋪板100,000至1，000，000個重組噬菌體并轉(zhuǎn)移至尼龍膜。堿變性后，通過如紫外線交聯(lián)將DNA固定在膜上。在高度嚴(yán)緊條件下進(jìn)行雜交。在1MNaCl離子強度、溫度68n進(jìn)行水性溶液雜交和洗滌。通過如放射性("P)缺刻轉(zhuǎn)錄標(biāo)記制備雜交探針(HighPrime,Roche,Mannheim,Germany)。自顯影法檢測信號?？梢酝ㄟ^類似上述的方法，在低嚴(yán)緊雜交和洗滌條件下鑒定相關(guān)但不相同的部分同源或異源基因。對于水相雜交，離子強度一般保持在1MNaCl，而溫度則逐漸從68t:降至42X:?？梢允褂煤铣傻姆派湫詷?biāo)記寡核苷酸探針，分離僅在一個截然不同的結(jié)構(gòu)域(如10-20個氨基酸)上具有同源性(或序列同一性/相似性)的基因序列。通過用T4多核苷酸激酶砩酸化兩條互補的寡核苷酸的5-引物端，制備放射性標(biāo)記的寡核苷酸。退火并連接互補的寡核苷酸以形成串聯(lián)體。然后通過如缺刻轉(zhuǎn)錄放射性標(biāo)記雙鏈串聯(lián)體，通常使用高寡核苷酸濃度，在低嚴(yán)緊條件下進(jìn)行雜交。jT祐夯磁染it溶濕.-6xSSCM磷酸鈉mMEDTA(pH8)0.5%SDS100ng/ml變性鮭精DNA0.1%脫脂奶粉在雜交過程中，逐步將溫度降至估算的寡核苷酸Tm以下5-10C或降至室溫，然后進(jìn)行洗滌步驟和放射自顯影。在低嚴(yán)緊條件下洗滌，例如使用4xSSC進(jìn)行3步洗滌.更多細(xì)節(jié)述于Sambrook等人(1989，MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress),或Ausubel等人(1994，"CurrentProtocolsinMolecularBiology",JohnWiley&Sons)。實施例7:用抗體篩選表達(dá)文庫來鑒定目的基因cDNA克隆可用于在如大腸桿菌(如QiagenQIAexpresspQE系統(tǒng))中產(chǎn)生重組蛋白。然后一般使用Ni-NTA親和層析(Qiagen)對重組蛋白進(jìn)行親和純化。通過使用如兔免疫標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，可將重組蛋白用于產(chǎn)生特異性抗體。使用以重組抗原飽和的Ni-NTA柱(如Gu等人，1994，BioTechniques17:257-262所述)，對抗體進(jìn)行親和純化。此后可通過免疫篩選(Sambrook等人，1989，"MolecularCloning:ALaboratoryManual",ColdSpringHarborLaboratoryPress;或Ausubel等人，1994，"CurrentProtocolsinMolecularBiology,"JohnWiley&Sons)，將抗體用于篩選表達(dá)cDNA文庫以鑒定同源或異源基因。實施例8:Northern雜交為進(jìn)行RNA雜交，如Amasino(1986，Anal.Biochem.152:304)所述，使用甲醛在1.25%的瓊脂糖凝膠中電泳分離20嗎總RNA或1Jigpoly-(A)+RNA，使用10><SSC，通過毛細(xì)吸引將其轉(zhuǎn)移到帶正電的尼龍膜(HybondN+，Amersham，Braunschweig)上，用紫外線固定，并使用雜交緩沖液(10%硫酸右旋糖酐w/v，1MNaCl，1%SDS，100jig/ml鯡精DNA)在68匸預(yù)雜交3小時.在預(yù)雜交中使用a-32PdCTP(Amersham，Braunschweig,Germany)、HighprimeDNA標(biāo)記試劑盒(Roche，Mannheim,Germany)標(biāo)記DNA探針。在相同緩沖液中加入經(jīng)標(biāo)記的DNA探針，于68C雜交過夜。68XM吏用2xSSC、15分鐘洗滌兩次，1xSSC、1%SDS、30分鐘洗滌兩次。密封濾膜于-70X:膝光，為期1至14天。實施例9:DNA測序和計算機(jī)功能分析cDNA文庫可用于根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行DNA測序，特別是通過使用ABIPRISMBigDyeTerminatorCycleSequencingReadyReaction試劑盒(Perkin-Elmer，Weiterstadt，Germany)的鏈終止法，從cDNA文庫回收制備質(zhì)粒后通過體內(nèi)大量切割進(jìn)行隨機(jī)測序、重轉(zhuǎn)化，隨后在瓊脂平板上涂布DH10B(材料和方案細(xì)節(jié)來自Stratagene，Amsterdam,Netherlands).可從用含氨爺青霉素的Luria-Broth培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)的大腸桿菌培養(yǎng)物中制備質(zhì)粒DNA(參閱Sambrook等人(1989，ColdSpringHarborLaboratoryPress:ISBN0-87969-309-6)關(guān)于根據(jù)生產(chǎn)商方案的QiageneDNA制備機(jī)器人(Qiagen，Hilden))。可使用由Bio-Max(Munich,Germany)商業(yè)提供的軟件包EST-MAX處理并注釋序列。該程序包含了所有對蛋白質(zhì)序列功能及結(jié)構(gòu)表征有重要意義的生物信息學(xué)方法。參見/t加.v/pgfto/iA附/卵,A/fc/;g抓/M/lg.fife.EST-MAX中并入的最為重要的算法有FASTA:高度敏感的蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫檢索，附統(tǒng)計學(xué)顯著性評價(PearsonW.R.19卯，RapidandsensitivesequencecomparisonwithFASTPandFASTA.MethodsEnzymol.183:63-98);BLAST:高度敏感的蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫檢索，附統(tǒng)計學(xué)顯著性評價(AltschulS.F.，GishW.，MillerW.，MyersE.W.和LipmanD丄Basiclocalalignmentsearchtool.J.Mol.Biol.215:403-410);PREDATOR:高精確度單個及多個序列的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測(Frishman和Argos1997，75%accuracyinproteinsecondarystructureprediction.Proteins27:329-335);CLUSTALW:多重序列比對(Thompson，J.D.，Higgins，D.G和Gibson,T.J.1994，CLUSTALW:improvingthesensitivityofprogressivemultiplesequencealignmentthroughsequenceweighting,positions-specificgappenaltiesandweightmatrixchoice,NucleicAcidsRes.22:4673-4680);TMAP:多重比對序列的跨膜區(qū)域預(yù)測(PerssonB.和ArgosP.1994，Predictionoftransmembranesegmentsinproteinsutilizingmultiplesequencealignments,J.Mol.Biol.237:182-192);ALOM2:單個序列的跨膜區(qū)域預(yù)測(KleinP"KanehisaM.和DeLisiC.1984，Predictionofproteinfunctionfromsequenceproperties:Adiscriminantanalysisofadatabase.Biochim.Biophys.Acta787:221-226.Dr.K.Nakai第2版)；PROSEARCH:PROSITE蛋白質(zhì)序列模式檢測(KolakowskiL.F.Jr.,LeunissenJ.A.M.和SmithJ.E.1992，ProSearch:fastsearchingofproteinsequenceswithregularexpressionpatternsrelatedtoproteinstructureandfunction.Biotechniques13:919-921);BLIMPS:針對無空位構(gòu)件(ungappedblocks)數(shù)據(jù)庫的相似性搜索(Wallace和Henikoff1992,PATMAT:Asearchingandextractionprogramforsequence,patternandblockqueriesanddatabases,CABIOS8:249-254.BillAlford執(zhí)筆)'實施例10:進(jìn)行植物轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒可4吏用諸如pBinAR的二元載體轉(zhuǎn)化植物(H6fgen&Willmitzer1990，PlantSci.66:221-230)。將cDNA以正義或反義方向連入T-DNA，構(gòu)建二元載體。cDNA5，端的植物啟動子激活cDNA的轉(zhuǎn)錄。多聚腺苷化序列定位于cDNA的3，端?？墒褂媒M織特異性啟動子進(jìn)行組織特異性表達(dá)。例如將napin或LeB4或USP啟動子克隆入cDNA5，端，可進(jìn)行種子特異性表達(dá)。也可使用其他任何種子特異性啟動子元件.整個植物中的組成型表達(dá)也可使用CaMV35啟動子.也可以使用信號肽將表達(dá)蛋白質(zhì)定位于細(xì)胞區(qū)室內(nèi)，如質(zhì)體、線粒體或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(Kermode，1996，Crit.Rev.PlantSci.15:285-423)。信號肽于讀框內(nèi)克隆入cDNA5，端以實現(xiàn)融合蛋白的亞細(xì)胞定位。使用的植物二元載體實例為克隆進(jìn)LMP候選基因的pBPS-GBl、pSUN2-GW或pBPS-GB047栽體。這些二元栽體包含AtAct2-I啟動子控制下的抗生素抗性基因和候選基因前的USP或其他種子特異性啟動子或組成型啟動子，所述候選基因后帶有NOSpA終止子或OCS終止子。將部分或全長LMPcDNA以正義或反義方向克隆入植物二元載體USP或種子特異性的、或其他種子特異性的或組成型啟動子后的多克隆位點。可用于不同作物物種的其他啟動子見實施例11.在標(biāo)準(zhǔn)條件下將含有目的基因的重組栽體轉(zhuǎn)化到Topl0細(xì)胞(Invitrogen)中。在含有50ng/ml卡那霉素的LB瓊脂上選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞，并使細(xì)胞在37X:生長過夜。按照生產(chǎn)商說明使用QIAprepSpinMiniprepKit(Qiagen)提取質(zhì)粒DNA。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行后續(xù)克隆的分析以及限制性圖鐠的繪制(Sambrook等人，1989，MolecularCloning,ALaboratoryManual,第二版，ColdSpringHarborLaboratoryPress.ColdSpringHarbor,NY)。實施例ll:農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化可以使用標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)化和再生技術(shù)(Gelvin，StantonB.&SchilperoortR.APlantMolecularBiologyManual，第二版.Kl鼎erAcademicPubl"Dordrecht1995，見于Sect"RingbucZentraleSignatur:BTll-P;Glick，BernardR.和Thompson,JohnE.MethodsinPlantMolecularBiologyandBiotechnology,S.360，CRCPress,BocaRaton1993)，利用本文所述的LMP核酸進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化。例如，可以使用GV3(pMP卯)(Koncz&Schell，1986，Mol.Gen.Genet.204:383-396)或LBA4404(Clontech)根癌農(nóng)桿菌菌抹進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化。在標(biāo)準(zhǔn)條件下(Bechtold，1993，Acad.Sci.Paris.316:1194-1199;Bent等人，1994，Science265:1856-1860)種植并轉(zhuǎn)化擬南芥。此外，可以通過子葉或胚軸轉(zhuǎn)化(Moloney等人，1989，PlantCellR印ort8:238-242;DeBlock等人，1989，PlantPhysiol.91:694-701)，利用本發(fā)明的LMP核酸轉(zhuǎn)化油菜籽，選擇農(nóng)桿菌及植物的抗生素使用取決于轉(zhuǎn)化所用的二元栽體和農(nóng)桿菌菌林，通常使用可選拷r植物標(biāo)記進(jìn)行油菜籽選擇，此外，可以使用如Mlynarova等人所述的技術(shù)(1994，PlantCellR印ort13:282-285)，進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)至亞麻的基因轉(zhuǎn)移.擬南芥尸/lZ)2或/^D2樣基因可被克隆入二元栽體，轉(zhuǎn)化并通過以下啟動子表達(dá)組成型啟動子如超啟動子(StantonB.Gelvin，USP#5，428，147和USP然，217，卯3)、或種子特異性啟動子如蠶豆USP(未知種子蛋白質(zhì))(Baeumlein等人.1991，Mol.Gen.Genetics225:459-67)、或豆球蛋白B4啟動子(LeB4;Baeumlein等人.1992，PlantJ.2:233-239)以及可導(dǎo)致單子葉植物如玉米、大麥、小麥、棵麥、稻進(jìn)行種子特異性表達(dá)的啟動子.擬南芥AHAS(AtAHAS)基因可用作這些構(gòu)建體的可選擇標(biāo)記?？墒褂萌鏓P0424047、美國專利號5,322,783(PioneerHi-BredInternational)或EP0397687、美國專利號5,376,543或美國專利號5,169,770(UniversityToledo)所述的技術(shù)、或利用本領(lǐng)域所公知的多種其他轉(zhuǎn)化方法中的任一種轉(zhuǎn)化大豆。用70%乙醇在室溫對大豆種子連續(xù)振蕩表面消毒4分鐘，然后加入補充有0.05%(v/v)Tween的20%(v/v)Clorox連續(xù)振蕩20分鐘。用蒸餾水漂洗種子4次，并將其置于Petri盤中的潤濕無菌濾紙上，室溫留置6至39小時。剝?nèi)シN皮，將子葉從胚軸上分離下來。檢查胚軸確保分生組織區(qū)沒有損傷。收集切下的胚軸于半開無菌Petri盤中，并風(fēng)千至濕度小于20%(鮮重)，置于密封Petri盤中備用。這一植物轉(zhuǎn)化方法也適用于歐洲油菜、亞麻和其他作物。具體而言，用70%乙醇在室溫對蕓莒的種子連續(xù)振蕩表面消毒4分鐘，然后加入補充有0.0S%(v/v)Tween的加％(v/v)Clorox連續(xù)振蕩20分鐘。用蒸餾水漂洗種子4次，并將其置于Petri盤中的潤濕無菌濾紙上，室溫留置18小時。剝?nèi)シN皮，種子于半開無菌Petri盤中風(fēng)干過夜。在此期間，種子喪失了約85%水分。然后將種子保存于室溫密封Petri盤中備用。取含適當(dāng)抗生素(如100mg/l鏈霉素、50mg/l卡那霉素)的LB固態(tài)培養(yǎng)基中的單菌落，在液態(tài)LB培養(yǎng)基中長至600nm處光密度為0.8,制務(wù)根癌農(nóng)桿菌培養(yǎng)物.然后在室溫、7000rpm、7分鐘離心沉淀細(xì)菌培養(yǎng)物，并重懸浮于補加100mM乙酰丁香酮的MS培養(yǎng)基(Murashige&Skoog:1962,Physiol.Plant.15:473-497)中，在此預(yù)誘導(dǎo)培養(yǎng)基中室溫孵育細(xì)菌培養(yǎng)物2小時，之后使用.大豆合子種子的胚軸在約44%濕度、室溫用預(yù)誘導(dǎo)的農(nóng)桿菌懸浮培養(yǎng)物吸脹2小時(干胚在農(nóng)桿菌培養(yǎng)物中吸脹對于玉米胚軸也適用)。將胚從吸脹培養(yǎng)物中取出并轉(zhuǎn)移到含有固態(tài)MS培養(yǎng)基(補加2%蔗糖)的Petri盤中，在室溫暗處孵育2天。還可以將胚置于Petri盤中的潤濕(液態(tài)MS培養(yǎng)基)無菌濾紙上，在前i^目同條件下粹育。此后將胚轉(zhuǎn)移到固態(tài)或液態(tài)含有500mg/l羧節(jié)青霉素或300mg/1頭孢參將的MS培養(yǎng)基中以殺死農(nóng)桿菌。使用液態(tài)培養(yǎng)基潤濕無菌濾紙.將胚在25"C、440junoln^s"和12小時光周期中孵育4周。一旦幼苗生根，將其轉(zhuǎn)移到無菌metromix土壤中.轉(zhuǎn)移植物至土壤之前洗去體外植物的培養(yǎng)基。植物在塑料罩下維持l周以促進(jìn)累積過程。隨后將植物轉(zhuǎn)移到生長室內(nèi)，在25X:、440jimolm、"光強度和12小時光周期下孵育大約80天。通過PCR分析初級轉(zhuǎn)基因植物(T。)樣品以證實T-DNA的存在。Southern雜交證實了這些結(jié)果，其中在1%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行DNA電泳并轉(zhuǎn)移到帶正電的尼龍膜(RocheDiagnostics)上。使用PCRDIG探針合成試劑盒(RocheDiagnostics),按照生產(chǎn)商建議通過PCR制備地高辛標(biāo)記的探針。作為單子葉植物轉(zhuǎn)化的實例，可使用組成型或種子特異性啟動子以及玉米泛素內(nèi)含子和/^2X2或尸A02樣核酸分子。例如，用和ATmiI消化pUC中的Pfc^4-F/ia2直系同源物基因構(gòu)建體。用和ATmaI消化pBPSMM348,以分離玉米泛素內(nèi)含子(ZmUbi內(nèi)含子)，然后進(jìn)行電泳和QIAEXII凝膠提取試劑盒(cat弁20021)處理。將ZmUbi內(nèi)含子連接于pUC中的PtxA->K42)2或F/1D2樣核酸分子，產(chǎn)生基于pUC的PtxA-ZmUbi內(nèi)含子-7^D2或Z^D2樣核酸分子構(gòu)建體，然后以J/el和尸wd進(jìn)行限制性酶消化。電泳后將PtxA-ZmUbi內(nèi)含子/^/X2或E4D2樣基因盒從Seaplaque低熔點瓊脂糖凝膠(SeaPlaque⑧GTGAgarose目錄號50110)中切下。用i^el消化含有可選擇標(biāo)記盒(單子葉型載體)的單子葉植物型栽體。將含有種子特異性啟動子—ZmUW內(nèi)含子的FAD2或i^ZX樣核酸分子表達(dá)盒連于單子葉型載體。隨后，根據(jù)本領(lǐng)域常規(guī)方法，利用電穿孔法將該構(gòu)建體轉(zhuǎn)化入含有pSBl(超級v/r質(zhì)粒)的重組LBA4404菌林中.根據(jù)US5,591,616所述的方法使用未成熟胚進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米轉(zhuǎn)化。應(yīng)用咪唑酮除草劑選擇獲得轉(zhuǎn)基因玉米林系。用于玉米的啟動子實例也是玉米醇溶蛋白，后者為一組見于玉米胚乳的貯存蛋白質(zhì)。已經(jīng)分離了玉米醇溶蛋白基因的基因組克隆(Pedersen等人，Cell29:1015-1026，1982)，并且也可使用來自這些克隆的啟動子，包括15kD、16kD、19kD、22kD、27kD基因。已知在玉米中起作用的其他啟動子為淀粉合酶、分支酶、去分支酶、油體蛋白、谷蛋白和蔗糖合酶啟動子。特別優(yōu)選用于玉米胚乳表達(dá)的啟動子為稻的谷蛋白基因的啟動子，特別是Osgt-l啟動子(Zheng等人，Mole.CellBiol.13:5829-5842,1993)。適用于小麥中表達(dá)的啟動子實例包括ADP葡萄糖焦磷酸化酶(ADPgluscosepyrosynthase)亞基啟動子、淀粉粒結(jié)合淀粉合酶及其他淀粉合酶啟動子、分支和去分支酶啟動子、胚胎發(fā)生豐富蛋白啟動子、麥醇溶蛋白啟動子和谷蛋.白啟動子。適用于大麥中表達(dá)的啟動子實例包括ADP葡萄糖焦磷酸化酶亞基啟動子、淀粉粒結(jié)合淀粉合酶及其他淀粉合酶啟動子、分支和去分支酶啟動子、蔗糖合酶啟動子、大麥醇溶蛋白啟動子、胚球蛋白啟動子和糊粉特異性蛋白質(zhì)啟動子。適用于大豆中表達(dá)的啟動子實例包括本文已經(jīng)提及的啟動子。然而，其他可用的啟動子為大豆7S啟動子和大豆7S，P伴大豆球蛋白啟動子.一般而言，可將植物啟動子如USP控制下的稻(或其他單子葉植物)E4D2基因或E4D2樣基因可轉(zhuǎn)化入玉米或另一作物植物中，以在其他單子葉植物中產(chǎn)生單子葉/^2)2基因的功能，或在其他雙子葉植物中產(chǎn)生雙子葉i^2X基因的功能，或在雙子葉植物中產(chǎn)生單子葉基因的功能，或反之亦然?？赏ㄟ^與本文所述構(gòu)建其他質(zhì)粒方法類似的方法構(gòu)建含有這些/^D2或FJ/)2樣編碼序列、5，端為啟動子和3，端為終止子的質(zhì)粒。適用于稻中表達(dá)的啟動子實例包括ADP葡萄糖焦磷酸化酶亞基啟動子、淀粉粒結(jié)合淀粉合酶及其他淀粉合酶啟動子、分支酶啟動子、去分支酶啟動子、蔗糖合酶啟動子、谷蛋白啟動子。特別優(yōu)選的啟動子為稻谷蛋白啟動子，Osgt-l。實施例12:體內(nèi)誘變可以通過用大腸桿菌或其他微生物(如芽孢桿菌屬(5flci7/附印p.)或酵母，如釀酒酵母)摻入并傳代質(zhì)粒(或其他載體)DNA，進(jìn)行微生物的體內(nèi)誘變，其中所述微生物保持其遺傳信息完整性的能力受損。典型的突變菌林中DNA修復(fù)系統(tǒng)的基因有突變(如mutHLS，mutD，mutT等；參考RuppW.D.1996，DNArepairmechanisms,in:Esc/rer/由Vicd'and^Ww^ie//",第2277-2294頁，ASM:Washington),此類菌株為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，其用途在例如Greener和Callahan,1994，Strategies7:32-34中有所闡釋。優(yōu)選在微生物中選擇并檢測之后再將突變DNA分子轉(zhuǎn)移到植物中。根據(jù)本文件中的多個實施例產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物。實施例13:評估轉(zhuǎn)化生物中的mRNA表達(dá)和重組基因產(chǎn)物的活性轉(zhuǎn)化宿主生物中重組基因產(chǎn)物的活性可在轉(zhuǎn)錄水平或/和翻譯水平上測量。確定基因轉(zhuǎn)錄水平(可翻譯為基因產(chǎn)物的mRNA量的指標(biāo))的有效方法之一是進(jìn)行Northern印跡(參見如Ausubel等人，1988，CurrentProtocolsinMolecularBiology,Wiley:NewYork),其中用可檢測的標(biāo)簽(通常具有放射活性或可化學(xué)發(fā)光)標(biāo)記為結(jié)合目的基因而設(shè)計的引物，從而使得在生物培養(yǎng)物總RNA提取、膠上電泳、轉(zhuǎn)移到穩(wěn)定基質(zhì)并與該探針孵育時，探針的結(jié)合和結(jié)合量能夠提示該基因mRNA的存在和量。這一信息至少部分汪實了轉(zhuǎn)化基因的轉(zhuǎn)錄程度?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的若干方法，例如Bormann等人，1992，Mol.Microbiol.6:317-326所述的方法，從植物細(xì)胞、組織或器官中制備總細(xì)胞RNA?？梢允褂弥T如Western印跡的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(見如Ausubel等人，1988，CurrentProtocolsinMolecularBiology,Wiley:NewYork)，評估從mRNA翻譯的蛋白質(zhì)的存在或相對量。這一方法中，提取總細(xì)胞蛋白質(zhì)，通過凝膠電泳分離之，轉(zhuǎn)移到諸如硝化纖維的基質(zhì)上，并與可特異性結(jié)合于目的蛋白質(zhì)的探針(如抗體)一同孵育.通常使用易于檢測的化學(xué)發(fā)光物或比色標(biāo)記標(biāo)記此探針。觀測到的標(biāo)記存在與否及其數(shù)量提示了細(xì)胞中期望突變蛋白的存在與否及其數(shù)量?？梢酝ㄟ^若干充分確立的方法，如DNA條帶移位測定法(也稱為凝膠遲滯測定法)，測量結(jié)合于DNA的LMP活性.可以使用報告基因測定法(如KolmarH.等人，1995，EMBOJ.14:3895-3卯4及其引用參考文獻(xiàn)所述)測量此類LMP對其他分子表達(dá)的影響。報告基因檢測系統(tǒng)眾所周知，使用如P-半乳糖苷酶、綠色熒光蛋白以及其他酶，在原核和真核細(xì)胞中都可應(yīng)用該系統(tǒng)。根據(jù)如GennisR.B.所述的技術(shù)(1989Pores，ChannelsandTransporters,inBiomembranes，MolecularStructureandFunction,Springer:Heidelberg,85-137、199-234和270-322頁)，進(jìn)行脂質(zhì)代謝膜轉(zhuǎn)運蛋白活性的測定。實施例14:轉(zhuǎn)基因植物中擬南芥、大豆、稻、玉米、亞麻、大麥或小麥中F^"2或E4Z)2樣基因功能的體外分析確定酶的活性和動力學(xué)參數(shù)是本領(lǐng)域的成熟技術(shù)。確定任何給定的改變蛋白質(zhì)活性的實驗必須根據(jù)野生型酶的特異性活性量體而做，這也完全在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi).為確定多種酶的活性，酶的大致情況以及涉及其結(jié)構(gòu)、動力學(xué)、原則、方法、應(yīng)用和實例的具體細(xì)節(jié)可見于以下參考文獻(xiàn)，如Dixon，M.&Webb,E.C.1979，Enzymes.Longmans:London;Fersht，(1985)EnzymeStructureandMechanism.Freeman:NewYork;Walsh(1979)EnzymaticReactionMechanisms.Freeman:SanFrancisco;Price,N.C.，Stevens,L.(1982)FundamentalsofEnzymology.OxfordUniv.Press:Oxford;Boyer，P.D.編.(1983)TheEnzymes,第三版.AcademicPress:NewYork;Bisswanger,H.，1994，Enzymkinetik,第二版，VCH:Wdnheim(ISBN3527300325);Bergmeyer，H.U.，Bergmeyer，J.，GraBl,M.編，(1983-1986)MethodsofEnzymaticAnalysis,第三版，I-XII巻，VerlagChemie:Weinheim;以及UllmannEncyclopediaofIndustrialChemistry(1987)巻A9，Enzymes.VCH:Weinheim，352-363頁。實施例15:分析重組蛋白對期望種子貯存化合物產(chǎn)量的影響作為種子油改變的實例，以氣相色鐠(GC)分析經(jīng)轉(zhuǎn)化擬南芥植物種子的脂肪酸謙，圖10和11中的每一柱形代表從野生型植物或突變體或突變體背景上獨立的轉(zhuǎn)基因事件的5mg大量種子中得到的數(shù)值。如圖10所示，擬南芥的/flrf2突變體中油酸(C18:1)含量從野生型的16%增加至/iw/2突變體的約60%,與之類似，亞油酸(C18:2)的比例大幅下降，從野生型的約31%降至/"突變體的2%。用稻基因OsFAD-01(SeqIDNo.17)轉(zhuǎn)化的擬南芥/似/2突變體種子中出現(xiàn)了由若干/似^突變體背景上獨立轉(zhuǎn)基因抹系的脂肪酸模式(見圖10的事件FAD1172、FAD1214、FAD1246和FAD1294)向野生型組成的重建，即使在分離的T2種子群中也是如此。使用大麥基因HvFAD-01(SeqIDNo.23)得到了相似的反應(yīng)，如圖11中事件FAD0503、FAD0483、FAD0475和FAD0465所示。這一結(jié)果提示，稻基因(OsFAD-01)和大麥基因(HvFAD-01)均能夠互補(complement)擬南芥突變體中種子脂肪酸鐠，提示其作為脂肪酸去飽和酶的功能。本申請中提及的不同作物的所有其他脂肪酸去飽和酶基因在擬南芥突變體背景中也均顯示類似的表現(xiàn)(數(shù)據(jù)未顯示)。通過在合適的條件下種植經(jīng)修飾的植物，并分析其種子或其他任何植物器官中期望產(chǎn)物(即脂質(zhì)或脂肪酸)產(chǎn)量的增加，可以評價植物中遺傳修飾對期望種子貯存化合物(如糖、脂質(zhì)或脂肪酸)的影響。此類分析技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，包括質(zhì)語法、薄層層析法、多種染色法、酶學(xué)和微生物學(xué)方法以及分析色鐠法，如高效液相色鐠法(見如Ullman，1985，EncyclopediaofIndustrialChemistry,巻A2，第89-卯及443-613頁，VCH:Weinheim;Fallon,A.等人，1987,ApplicationsofHPLCinBiochemistryin:LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology,巻17;Rehm等人，1993Productrecoveryandpurification,Biotechnology,巻3，第III章，469-714頁，VCH:Weinheim;Belter,P.A.等人，1988Bioseparations:downstreamprocessingforbiotechnology,JohnWiley&Sons;KennedyJ.F.&CabralJ.M.S.，1992,Recoveryprocessesforbiologicalmaterials,JohnWileyandSons;ShaeiwitzJ.A.&HenryJ.D.，1988，"Biochemicalseparations",見Ulmann，sEncyclopediaofIndustrialChemistry,"Separationandpurificationtechniquesinbiotechnology",巻B3，第11章1畫27頁，VCH:Weinheim;以及DechowF.J.1989)。除上述方法外，如Cahoon等人(1999，Proc.Natl.Acad.Sci.USA96，22:12935-12940)和Browse等人(1986，Anal.Biochemistry442:141-145)所述，從植物材料中提取植物脂質(zhì)。脂質(zhì)或脂肪酸的定性及定量分析描述于Christie,WilliamW.AdvancesinLipidMethodology,Ayr/Scotland:OilyPress.-(OilyPressLipidLibrary;Christie,WilliamW"GasChromatographyandLipids.APracticalGuide-Ayr,Scotland:OilyPress,1989Repr.1992.-IX,307S.-(OilyPressLipidLibrary;以及ProgressinLipidResearch,Oxford:PergamonPress,1(1952)-16(1977)ProgressintheChemistryofFatsandOtherLipidsCODEN)?？梢园凑諛?biāo)準(zhǔn)分析方法GC、GC-MS或TLC,通過分析轉(zhuǎn)基因植物，獲取脂肪酸產(chǎn)物存在的明確證據(jù)，分別見于Christie的不同論述及其參考文獻(xiàn)(1997，AdvancesonLipidMethodology,第4版Christie,OilyPress,Dundee,119-169頁；1998)。以葉為例的詳細(xì)方法見于Lemieux等人(1990，Theor.Appl.Genet.80:234-240),以種子為例的見于Focks&Benning(1998，PlantPhysiol.118:91-101)。通過脂酶消化對甘油主鏈的sn-l、sn-2或sn-3位進(jìn)行脂肪酸組成的位置分析(見如Siebertz&Heinz1977，Z.Naturforsch.32c:193-205，以及Christie,1987，《LipidAnalysis》第2版，PergamonPress,Exeter，ISBN0畫08-023791-6).可通過任何適當(dāng)?shù)姆椒y量總種子油水平。通常使用常規(guī)方法如近紅外分析(NIR)或核磁共振成像(NMR)進(jìn)行種子油含量的定量.NIR光譜法業(yè)已成為用于篩選種子樣品的標(biāo)準(zhǔn)方法，只要目的樣品適用于該技術(shù)即可。研究的樣品包括蕓苔、大豆、玉米、小麥、稻等等.可使用單個種子的NIR分析(參見例如Velasco等人"Estimationofseedweight,oilcontentandfattyacidcompositioninintactsingleseedsofrapeseed(丑,"柳'caw"j9附L)bynear-infraredreflectancespectroscopy",Euphytica，巻106，1999，79-85頁)。NMR也用于分析種子的油含量(參見例如Robertson&Morrison,"Analysisofoilcontentofsunflowerseedbywide-lineNMR，"JournaloftheAmericanOilChemistsSociety,1979，巻56，1979，961-964頁，其整體在本文引用作為參考)。收集蛋白質(zhì)活性增加或減少對脂質(zhì)和糖生物合成路徑影響的相關(guān)信息的典型方法是例如用"c-醋酸鹽或"c-丙酮酸鹽的標(biāo)記，研究分析葉或種子的碳流通(見如Focks&Benning，1998，PlantPhysiol.118:91-101;Eccleston&Ohlrogge，1998，PlantCell10:613-621)。包括標(biāo)準(zhǔn)物如"C-蔑糖和"C-蘋果酸的相應(yīng)分離(如在TLC板上)后，通過液體閃爍計數(shù)可以確定14C在脂質(zhì)和水性可溶成分間的分布(Eccleston&Ohlrogge,1998，PlantCell10:613-621)?？梢酝ㄟ^聲波破碎、玻璃磨、液氮和研磨或其他適用的方法碎裂待分析的材料.碎裂后的材料需進(jìn)行離心。將沉淀重懸于蒸餾水中，在100'c加熱io分鐘，冰上冷卻并再次離心后，卯t;用含o.sM硫酸、2%二甲氧基丙烷的甲醇提取1小時，產(chǎn)生可生成轉(zhuǎn)曱基脂質(zhì)的水解油和脂質(zhì)化合物，在petrolether中抽提這些脂肪酸甲酯，并最終使用毛細(xì)柱(Chrompack，WCOTFusedSHica，CP-Wax-52CB，25m,0.32mm)在1701C-2401C的溫度梯度下進(jìn)行20分鐘GC分析，并于240C進(jìn)行5分鐘。通過使用商業(yè)來源可得的標(biāo)準(zhǔn)(即Sigma)，鑒定產(chǎn)生的脂肪酸甲酯。當(dāng)無法得到脂肪酸的標(biāo)準(zhǔn)物時，通過衍生化以及此后的GC-MS分析完成分子鑒定。例如，在4，4-二甲氧基噁唑啉衍生物衍生反應(yīng)后，通過GS-MS顯示三鍵脂肪酸的定位(Christie，OilyPress,Dundee,1998)。分析糖(特別是淀粉)的常用標(biāo)準(zhǔn)方法，由StittM.，LilleyR.Mc.C.，GerhardtR.和HeldtM.W,發(fā)表(1989，"Determinationofmetabolitelevelsinspecificcellsandsubcellularcompartmentsofplantleaves,"MethodsEnzymol.174:518-552;其他方法也可見Hartel等人，1998，PlantPhysiol.Biochem.36:407-417及Focks&Benning,1998，PlantPhysiol.118:91-101),為抽提可溶性糖和淀粉，在1.5ml聚丙烯試管中將50粒種子于500jil80%(v/v)乙醇中勻漿，在701C孵育卯分鐘。16，000g離心5分鐘后，將上清液轉(zhuǎn)移至新的試管中。用500jU80。/。乙醇抽提沉淀兩次。真空室溫蒸發(fā)混合上清液中的溶劑.將殘留物溶解于50nl水，即為可溶性糖類級分.乙醇抽提后留下的沉淀中含有包括淀粉在內(nèi)的不可溶性糖類，在200jil0.2NKOH中勻漿，將懸浮物在95X:孵育1小時以溶解淀粉。加入35jil1N醋酸后，在16，000g離心5分鐘，使用上清液進(jìn)行淀粉定量。為量化可溶性糖，向含有100mM咪唑、pH6.9、5mMMgCl2、2mMNADP、1mMATP和2單位2ml"葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的990jil反應(yīng)緩沖液中加入10fil糖提取物。依次向其中加入4.5單位己糖激酶、l單位葡萄糖磷酸異構(gòu)酶以及2nl飽和果糖苷酶溶液，以酶促測定葡萄糖、果糖和蔗糖。在波長340nm處光度法監(jiān)測NADPH的產(chǎn)生.與之相似，使用BoehringerMannheim的試劑盒分析30jil不可溶糖類級分中的淀粉。分析葉和種子中蛋白質(zhì)含量的實例可見于BradfordM.M.(1976，"Arapidandsensitivemethodforthequantificationofmicrogramquantitiesofproteinusingtheprincipleofproteindyebinding"Anal.Biochem.72:248-254)。為定量總種子蛋白質(zhì)，在1.5ml聚丙烯試管中將15-20粒種子于250jil丙酮中勻漿。16，000g離心后棄去上清液，將真空干燥的沉淀重懸于250jil含有50mMTris畫HCl(pH8.0)、250mMNaCl、1mMEDTA和l。/。(w/v)SDS的提^^沖液中。25X:孵育2小時后，將勻漿在16,000g離心5分鐘，使用200ml上清液進(jìn)行蛋白質(zhì)測量。在該測定中用，球蛋白進(jìn)行校準(zhǔn)。使用LowryDC蛋白質(zhì)測定法(Bio-Rad)或Bradford測定法(Bio-Rad)進(jìn)行蛋白質(zhì)測量，根據(jù)Renz等人(1993，Planta1卯:156-165)，分光光度法酶法測定己糖激酶和果糖激酶；根據(jù)Burrell等人(1994，Planta194:95-101)，酶法測定葡萄糖磷酸異構(gòu)酶、ATP依賴性6^酸果糖激酶、焦磷酸鹽依賴性6^酸果糖激酶、果糖-l，6-二磷酸醛縮酶、丙糖磷酸異構(gòu)酶、甘油-3-磷酸脫氫酶、磷酸甘油激酶、磷酸甘油變位酶、烯醇酶和丙酮酸激酶；根據(jù)Zrenner等人(1995，PlantJ.7:97-107),酶法測定UDP-葡萄糖-焦磷酸化酶。如H3rtel等人所述(1998,PlantPhysiol.Biochem.36:407-417)，測量糖類代謝的中間產(chǎn)物，如葡萄糖-l-磷酸、葡萄糖-6-磷酸、果糖-6-磷酸、磷酸烯醇丙酮酸、丙酮酸和ATP;根據(jù)Jelitto等人(1992，Planta188:238-244)，測量代謝產(chǎn)物。除測量最終種子貯存化合物(即脂質(zhì)、淀粉或貯存蛋白質(zhì))外，也可以分析產(chǎn)生期望種子貯存化合物所用的代謝路徑的其他成分(如中間產(chǎn)物和副產(chǎn)物)，以確定化合物產(chǎn)生的總效率(Fiehn等人，2000，NatureBiotech.18:1447-1161)'例如，可使用標(biāo)準(zhǔn)程序構(gòu)建含有本文公開的核酸或其片斷的酵母表達(dá)載體，并將其轉(zhuǎn)化至釀酒酵母中?？煞治霎a(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞在糖、油、脂質(zhì)或脂肪酸含量上的變化。與之相似，可使用標(biāo)準(zhǔn)程序構(gòu)建含有本文公開的核酸或其片斷的植物表達(dá)載體，并將其轉(zhuǎn)化至合適的植物細(xì)胞中，如擬南芥、大豆、油菜籽、稻、玉米、小麥、蒺藜狀苜蓿(ikfe必cagofrM/ica似/fl)等，可分析產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞和/或其衍生植物在糖、油、脂質(zhì)或脂肪酸含量上的變化。此外，本文公開的序列或其片斷可用于在多種生物基因組中產(chǎn)生敲除突變，如細(xì)菌、哺乳動物細(xì)胞、酵母細(xì)胞和植物細(xì)胞(Girke等人，1998，PlantJ.15:39-48)。然后可評價產(chǎn)生的敲除細(xì)胞中種子貯存化合物的組成和含量，以及突變對表型和/或基因型的影響。其他基因失活的方法包括US6，004，804"非嵌合突變栽體"和Puttaraju等人(l"9，"Spliceosome-mediatedRNA加附-splicingasatoolforgenetherapy"NatureBiotech.17:246-252)所述的那些。實施例16:從轉(zhuǎn)化生物中純化期望產(chǎn)物可以通過本領(lǐng)域已知的多種方法從植物材料中回收LMP.從植物器官中分離種子貯存化合物前，先將植物器官與其他組織或器官機(jī)械分離。組織勻漿后，離心除去細(xì)胞碎片，保留含有可溶性蛋白質(zhì)的上清液級分，以進(jìn)一步純化期望化合物。若產(chǎn)物是由培養(yǎng)的細(xì)胞分泌的，則通過低速離心將細(xì)胞從培養(yǎng)物中去除，保留上清液級分，作進(jìn)一步純化。在適當(dāng)?shù)臉渲蠈碜匀我环N純化方法的上清液級分進(jìn)行色鐠分析，其中期望分子而非樣品中的多種雜質(zhì)留存于色i普樹脂上，或雜質(zhì)而非樣品留存于樹脂上。必要時可使用相同或不同的色鐠樹脂重復(fù)此類色譜步驟。本領(lǐng)域技術(shù)人員擅長選擇適當(dāng)?shù)纳玦普樹脂，并將其最有效地運用于純化具體的待純化分子?？梢酝ㄟ^過濾或超濾法濃縮純化產(chǎn)物，并于可最大化產(chǎn)物穩(wěn)定性的溫度保存。本領(lǐng)域公知多種純化方法，因而前述純化方法并非限制性的。此類純化方法的描述見于如Bailey&Ollis，1986，BiochemicalEngineeringFundamentals,McGraw-Hill:NewYork,根據(jù)本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)鑒定分離化合物并評估其純度。這些技術(shù)包括高效液相色譜法(HPLC)、分光光度法、染色法、薄層層析法、分析色譜法如高效液相色鐠法、NIRS、酶法測定或微生物學(xué)測定。此類分析方法可見于Patek等人(1994，Appl.Environ.Microbiol.60:133-140)、Malakhova等人(1996，Biotekhnologiya11:27-32)，以及Schmidt等人(1998，BioprocessEngineer19:67-70)、Ulmann，sEncyclopediaofIndustrialChemistry(1996，巻A27，VCH:Weinheim，第89-90、521-540、540-547、559-566、575-581和581-587頁)，以及MichalG(1999，BiochemicalPathways:AnAtlasofBiochemistryandMolecularBiology,JohnWileyandSons;Fallon,A.等人，1987，ApplicationsofHPLCinBiochemistry,LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology，巻17)。實施例17:通過設(shè)計微RNA前體下調(diào)基因表達(dá)微RNA(miRNA)是植物和動物中進(jìn)化保守的基于RNA的基因表達(dá)調(diào)節(jié)物,miRNA(~21至25nt)來源于轉(zhuǎn)錄自非蛋白質(zhì)編碼基因的具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的較大前體.miRNA尋靶特定的mRNA，以在轉(zhuǎn)錄后水平(即降解mRNA)或翻譯水平(即抑制蛋白質(zhì)合成)上抑制基因表達(dá)(BartelD2004，Cell116，281-297).可以設(shè)計m股NA前體(前miRNA)，使由前miRNA編碼的內(nèi)源miRNA能被miRNA取代，以尋靶目的基因如dsRed報告基因。選用玉米m股166前體進(jìn)行設(shè)計。編碼miR166前體的核苷酸序列如SEQIDNO:47所示。通過多點通路克隆方法(multi-siteGatewaycloingapproach)(Invitrogen，Carlsbad,CA)產(chǎn)生兩個二元表達(dá)構(gòu)建體。如SEQIDNO:41所示的RLM323用作對照，即處于ScBV(甘蔗桿狀病毒)啟動子及NOS(胭脂堿合酶)終止子調(diào)控下的天然玉米miR166表達(dá)。如SEQIDNO:42所示的RLM325與RLM323相同，只是前體中如SEQIDNO:37和SEQIDNO:38所述的天然miR166(5，tcggaccaggcttcattcccc3，)被如SEQIDNO:39所示的miRNA乾向dsRed(5，ttgtagatgaagcagccgtcc3，)所取代。MiRdsRed與dsRedmRNA的3，區(qū)域互補。通過農(nóng)桿菌將RLM323及RLM325轉(zhuǎn)化入純合子玉米SDM10828中，其中已經(jīng)攜有二元載體RLM185,以在ScBV啟動子和NOS終止子的調(diào)控下表達(dá)dsRed。收集3個攜帶RLM323的獨立TO事件和29個攜帶RLM325的獨立T0事件的葉樣品，然后使用Typhoon9400(GeneralEngineering,配套的成像系統(tǒng))分析該樣品，以檢測dsRed熒光。RLM325事件的熒光強度與對照RLM323事件的強度相比，降低了卯％以上.在Northern印跡分析中證實了RLM325事件中miRdsRed的產(chǎn)生，利用與miRdsRed互補的放射活性標(biāo)記探針，能在RLM325事件中檢測到~21nt的特異性條帶，而RLM323事件(對照)中則沒有.通過qRT-PCR證實了RLM325事件中dsRedmRNA相對于對照RLM323的減少(近卯％).總之，這些數(shù)據(jù)證實可以設(shè)計miRNA前體以尋把目的基因。在包括種子在內(nèi)的多種組織中表達(dá)編碼脂肪酸去飽和酶的玉米基因。使用19至21nt(如SEQIDNO:40所述的ACCAGACCCCGAACGCCGC)的玉米去飽和酶編碼區(qū)或mRNA中5，UTR及3，UTR互補物，取代ZmmiR166前體中如SEQIDNO:37及SEQIDNO:38所述的ZmmiR166(5，tcggaccaggcttcattcccc3，)。然后將該轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化入玉米，該基因改造的ZmmiR166基因的表達(dá)受玉米種子特異性啟動子(如胚乳特異性10KD玉米醇溶蛋白啟動子或Globl胚特異性啟動子)的調(diào)控，當(dāng)處理基因改造的ZmmiR166前體時，在種子中產(chǎn)生了微RNA(如SEQIDNO:40所述的ACCAGACCCCGAACGCCGC).該miRNA特異性結(jié)合玉米脂肪酸去飽和酶mRNA中與該miRNA互補的區(qū)域，從而通過基因沉默機(jī)制導(dǎo)致種子中轉(zhuǎn)錄或翻譯水平上該靶定玉米去飽和酶的表達(dá)減少。從而使轉(zhuǎn)基因玉米具有期望的脂肪酸水平和組成，例如種子中l(wèi)氐亞麻酸和/或中等或高油酸水平。實施例18:有關(guān)種子大小增加的篩選i^ZX和作物樣基因的條件性表達(dá)可導(dǎo)致種子大小增加。將會產(chǎn)生表達(dá)i^2)2或E4i)2樣基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥或作物植物。利用顯微鏡確定種子大于野生型的轉(zhuǎn)基因植物。此外，還測量轉(zhuǎn)基因株系的種子重量。例如，/iw/2突變體種子與野生型相比種子重量減少了20%。在獨立的擬南芥轉(zhuǎn)基因林系pFAD2RT-7及pFAD2RT-5的分離T2種子世代中，100粒種子的重量分別增加了30%及40%。純合子T3種子中，種子重量與空載體對照相比增加高達(dá)60%(數(shù)據(jù)未示)。種子重量的增加體現(xiàn)在擬南芥中MZ)2基因過表達(dá)種子大小的增加。種子大小的增加使得多種經(jīng)濟(jì)上重要的作物植物的產(chǎn)率增加。因此，種子大小的增加是使用本申請所述的/^D2或Z^D2樣核酸分子進(jìn)行遺傳工程和選擇的目標(biāo)之一.表l.植物脂質(zhì)類別<table>tableseeoriginaldocumentpage96</column></row><table>表2.常見植物脂肪酸<table>tableseeoriginaldocumentpage97</column></row><table>這些脂肪酸不常規(guī)見于植物種子油中，但其在轉(zhuǎn)基因植物種子油中的產(chǎn)生在植物生物技術(shù)中至關(guān)重要。表3.推定的i^D2樣LMP功能表(全長核酸序列可使用序列代號在附錄A中找到)<table>tableseeoriginaldocumentpage98</column></row><table>本領(lǐng)域技術(shù)人員通過常規(guī)試驗，能識別或能確定本文所述本發(fā)明具體實施方案的多種等效物。此類等效物旨在涵蓋于本文公開和要求的本發(fā)明權(quán)利要求書中。附錄A圖1A:SEQIDNO:1-AtFAD-01的核酸序列圖IB:SEQIDNO:3-AtFAD-01開放讀才匡的核酸序列圖1C:SEQIDNO:4-AtFAD-01開放讀框的絲酸序列圖2A:SEQIDNO:5-GmFAD-01的核酸序列圖2B:SEQIDNO:7-GmFAD-01開-文讀框的核酸序列圖2C:SEQIDNO:8-GmFAD-01開放讀框的氨基紗列圖3A:SEQIDNO:9-GmFAD-02的核酸序列圖3B:SEQIDNO:11-GmFAD-02開放讀框的核酸序列圖3C:SEQIDNO:12-GmFAD-02開放讀沖匡的氨基酸序列圖4A:SEQIDNO:12-GmFAD-03的核酸序列圖4B:SEQIDNO:15-GmFAD-03開放讀框的核絲列圖4C:SEQIDNO:16-GmFAD-03開放讀框的氨基酸序列圖5A:SEQIDNO:17-ZmFAD-01的核酸序列圖5B:SEQIDNO:19-ZmFAD-01開放讀框的核酸序列圖5C:SEQIDNO:20-ZmFAD-01開放讀框的氨基酸序列圖6A:SEQIDNO:21-OsFAD-01的核財列圖6B:SEQIDNO:23-OsFAD-01開放讀框的核酸序列圖6C:SEQIDNO:24腸OsFAD-01開放讀框的M斷列圖7A:SEQIDNO:25-LuFAD-01的核狄列圖7B:SEQIDNO:27-LuFAD-01開放讀框的核酸序列圖7C:SEQIDNO:28國LuFAD-01開放讀框的氨基酸序列圖8A:SEQIDNO:29-HvFAD-01的核酸序列圖8B:SEQIDNO:31-HvFAD-01開放讀框的核酸序列圖8C:SEQIDNO:32-HvFAD-01開放讀框的氨基酸序列圖9A:SEQIDNO:33國TaFAD-01的核酸序列圖9B:SEQIDNO:35-TaFAD-01開放讀框的核酸序列圖9C:SEQIDNO:36-TaFAD-01開放讀框的氨基,列。權(quán)利要求1.分離的多肽，包含選自如下的氨基酸序列X1X2X3LX4X5X6X7LX8X9PX10YL，其中X1不為M，且X3不為T，且X6不為F，且X7不為V，GX11X12X13X14X15X16X17X18HX19X20PX21X22X23X24X25X26X27X28ER，其中X15不為G，且X20不為F，且X21不為N，且X22不為A，HX29X30PX31X32X33X34X35X36X37X38ER，其中X30不為F，且X31不為N，且X32不為A，LX39X40X41X42X43X44X45GX46X47X48X49X50X51X52YX53X54P，其中X41不為Y，且X45不為Q，且X48不為S，且X49不為M，且X50不為I，TX55X56X57X58HX59X60X61X62X63X64X65X66X67X68X69X70X71T，其中X67不為N，以及PX72X73X74X75X76X77X78X79X80X81X82X83X84X85X86，其中X84不為W，且X85不為Y，且X86不為V，且其中若無上述其他限定，X代表任何氨基酸。2.分離的多肽，包含選自如下的氨基財列AWYTPYX87YNNPX88GRLVHIX89VQLTLGWPLYLAX90NX91SGRPYPRFACHFDPYGPIYNDRER，F(xiàn)ISDVGV，ALX92KLX93SX94FGFWWVVRVYGVP,ILGEYYQFDX9STPVAKAT,且其中X代表任意氨基酸。3.分離的核酸序列，編碼包含權(quán)利要求1或2的^酸序列的蛋白質(zhì)。4.分離的多肽，由權(quán)利要求3的核M列編碼。5.分離的核酸，包含選自如下的多核苷酸序列如SEQIDN0:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33或SEQIDNO:35所示的多核苷酸序列；編碼如SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18、SEQIDNO:20、SEQIDNO:22、SEQIDNO:24、SEQIDNO:26、SEQIDNO:28、SEQIDNO:30、SEQIDNO:32、SEQIDNO:34或SEQIDNO:36所示多肽的多核苷酸序列；與上述a)或b)中核酸具有至少70%序列同一性的多核苷酸序列；與上述a)或b)中核酸互補的多核苷酸序列；以及在嚴(yán)緊條件下與上述a)或b)中核酸雜交的多核苷酸序列。6.分離的多肽，由權(quán)利要求5的多核苷酸序列編碼。7.權(quán)利要求5的分離的核酸，其中所述分離的核酸編碼作為微生物或植物中種子貯存化合物調(diào)節(jié)物起作用的多肽。8.權(quán)利要求6的分離的核酸，其中分離的LMP多肽序列作為孩t生物或植物中種子貯存化合物調(diào)節(jié)物.9.表達(dá)載體，含有權(quán)利要求3或5的核酸，其中所述核酸有效連接于選自種子特異性啟動子、根特異性啟動子及非組織特異性啟動子的啟動子。10.產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述轉(zhuǎn)基因植物的種子貯存化合物重量百分比的水平與野生型相比發(fā)生改變，所述方法包括a.第一步將含有核酸的表達(dá)栽體引入植物細(xì)胞，和b.第二步從該植物細(xì)胞產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物，且其中所述核酸包含選自如下的多核苷酸序列a.如SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33或SEQIDNO:35所示的多核苷酸序列；b.編碼如SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18、SEQIDNO:20、SEQIDNO:22、SEQIDNO:24、SEQIDNO:26、SEQIDNO:28、SEQIDNO:30、SEQIDNO:32、SEQIDNO:34或SEQIDNO:36所示多肽的多核苷酸序列；c.與上述a)或b)中核酸具有至少70%序列同一性的多核苷酸序列；d.與上述a)或b)中核酸互補的多核苷酸序列；以及e.在嚴(yán)緊條件下與上述a)或b)中核酸雜交的多核苷酸序列。11.權(quán)利要求10的方法，其中的核酸包含與權(quán)利要求5中a)或b)的多核苷酸序列具有至少卯％序列同一性的多核苷酸序列。12.權(quán)利要求10的方法，其中轉(zhuǎn)基因植物的油酸水平與該植物野生型品種相比提高.13.產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述轉(zhuǎn)基因植物的油酸重量百分比水平與野生型相比提高，所述方法包括第一步用RNA前體構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，和第二步從該植物細(xì)胞產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物，其中所述構(gòu)建體含有在植物細(xì)胞中驅(qū)動表達(dá)的啟動子，該啟動子有效連于編碼前體微RNA序列的核苷酸序列，其中編碼所述微RNA前體序列的核苷酸序列選自a.如SEQIDNO:47所示的核苷酸序列b.與上述a)中核酸具有至少70%序列同一性的多核苷酸序列；c.與上述a)中核酸互補的多核苷酸序列；以及d.在嚴(yán)緊條件下與上述a)中核酸雜交的多核苷酸序列。14.權(quán)利要求13的方法，其中設(shè)計編碼前體微RNA序列的核苷^列，從而使編碼SEQIDNO:37所示微RNA的核苷酸序列被編碼SEQIDNO:40所示微RNA的核苷酸序列所取代。括:15.分離的核酸，包含選自如下的多核苷酸序列如SEQIDNO:47所示的核苷酸序列；與上述a)中核酸具有至少70%序列同一性的多核苷酸序列；與上述a)中核酸互補的多核苷酸序列；以及在嚴(yán)緊條件下與上述a)中核酸雜交的多核苷酸序列。16.調(diào)節(jié)植物中種子貯存化合物重量百分比水平的方法，所述方法包a.第一步將含有核酸的表達(dá)載體引入植物細(xì)胞，和b.第二步從該植物細(xì)胞產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物，且其中所述核酸包含權(quán)利要求5的多核苷酸序列。17.權(quán)利要求16的方法，其中油酸重量百分比的水平改變。18.通過權(quán)利要求IO、13或16的方法制備的轉(zhuǎn)基因植物。19.權(quán)利要求18的轉(zhuǎn)基因植物，其中轉(zhuǎn)基因植物的油酸重量百分比水平與該植物野生型品種相比提高。20.權(quán)利要求18的轉(zhuǎn)基因植物，其中植物選自油菜籽、蕓苔、亞麻籽、大豆、向日葵、玉米、燕麥、棵麥、大麥、小麥、胡椒、萬壽菊、棉花、油椰、椰樹、亞麻、蓖麻、甜菜、稻和花生。21.由權(quán)利要求18的轉(zhuǎn)基因植物所產(chǎn)生的種子，其中所述植物表達(dá)作為種子貯存化合物調(diào)節(jié)物起作用的多肽，且其中所述植物為種子貯存化合物重量百分比水平與該植物野生型品種相比改變的真實遺傳.全文摘要本發(fā)明一般性涉及與植物中種子貯存化合物的存在相關(guān)的蛋白質(zhì)的編碼核酸序列。更具體而言，本發(fā)明涉及脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的FAD2樣編碼核酸序列，及這些序列在轉(zhuǎn)基因植物中的用途。具體而言，本發(fā)明涉及脂質(zhì)代謝相關(guān)化合物的操作方法，以及在植物和種子中提高油水平和改變脂肪酸組成的方法。本發(fā)明還涉及應(yīng)用這些新的植物多肽刺激植物生長和/或提高產(chǎn)率和/或種子貯存化合物組成的方法。文檔編號C12N9/02GK101120091SQ200580048074公開日2008年2月6日申請日期2005年12月19日優(yōu)先權(quán)日2004年12月20日發(fā)明者H·黑特爾,J·吉布森,P·任申請人:巴斯福植物科學(xué)有限公司