專利名稱：：用于預(yù)測(cè)或監(jiān)測(cè)病人對(duì)于ErbB受體藥物的響應(yīng)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種用于預(yù)測(cè)或監(jiān)測(cè)病人對(duì)于ErbB受體藥物，例如以表皮生長因子受體(EGFR)為靶點(diǎn)的吉非替尼(gefitinib),的響應(yīng)的方法。該方法提供了用于基因組DNA突變的敏感的和特異的篩選，該突變以低濃度出現(xiàn)在生物流體例如血清中。該方法適于檢測(cè)那些已知增加ErbB酪氨酸激酶受體活性和看來似乎與對(duì)ErbB受體藥物治療的響應(yīng)相關(guān)的突變。
背景技術(shù)：
：ErbB受體是蛋白酪氨酸激酶(TKs)，屬于TK超家族，該超家族成員調(diào)控控制細(xì)胞生長和生存的信號(hào)傳導(dǎo)途經(jīng)。ErbB受體家族由四種密切相關(guān)的亞型構(gòu)成ErbBl(表皮生長因子受體[EGFR])、ErbB2(HER2/neu),ErbB3(HER3),和ErbB4(HER4)(Cell.2000;103:211-225)。例如，來自EGFR的信號(hào)是由生長因子例如表皮生長因子(EGF)的結(jié)合引發(fā)的，造成EGFR分子的二聚化或與其它密切相關(guān)的受體例如HER2/neu的異二聚化。該受體通過它們的酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域進(jìn)行的自體磷酸化和轉(zhuǎn)磷酸作用導(dǎo)致下游效應(yīng)器的招募以及增生和細(xì)胞存活信號(hào)的激活(Exp.Cell.Res.2003;284:31-53)。當(dāng)ErbB受體TKs被過表達(dá)或由突變激活時(shí)，其可以導(dǎo)致乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)、結(jié)腸直腸癌、頭部和頸部癌癥、和許多其它實(shí)體腫瘤的發(fā)展(Exp.Cell.Res.2003;284:122-130)。EGFR在40-80%的非小細(xì)胞肺癌和許多其它上皮癌中被過表達(dá)(N.Engl.J.Med.2004;350(21):2129-2139)。以這樣的基因的產(chǎn)物為靶點(diǎn)的抗癌治療已經(jīng)被設(shè)計(jì)出來用于抑制它們的活性。例如，藥物吉非替尼是EGFR酪氨酸激酶家族例如ErbBl的強(qiáng)力抑制劑，并且于2002年7月5日在日本被批準(zhǔn)用于不宜手術(shù)的或再發(fā)性NSCLC的治療中。病人在其對(duì)于任一種處方藥的應(yīng)答上有所不同，包括其作用如何好(藥物的有效性)和對(duì)它的不良反應(yīng)(副作用)兩方面。對(duì)于吉非替尼的情況，病人對(duì)于酪氨酸激酶抑制劑治療顯示出不同的響應(yīng)，包括在一個(gè)小組中大約10%的病人顯示出快速的和經(jīng)常是明顯的臨床響應(yīng)(N.Engl.J.Med.2004;350(21):2129-2139)。因此需要在治療前對(duì)那些將會(huì)對(duì)藥物作出響應(yīng)的病人進(jìn)行識(shí)別，并且還需要治療后對(duì)那些正在對(duì)藥物進(jìn)行響應(yīng)的病人進(jìn)行識(shí)別，從而使藥物更加有效地被耙向。最近發(fā)現(xiàn)，在患有非小細(xì)胞肺癌的病人的小組中，病人EGFR基因中攜帶特定的突變，其看來似乎與對(duì)于酪氨酸激酶抑制劑吉非替尼的臨床響應(yīng)相關(guān)聯(lián)(Science2004;304:1497-1500)。這些突變導(dǎo)致了生長因子信號(hào)的增長，使其對(duì)于抑制劑敏感。人們認(rèn)為，篩選肺癌中的這些突變可以識(shí)別出那些將會(huì)對(duì)于吉非替尼有響應(yīng)的病人(J.Clin.Oncol.23;2493-2501)。然而，至今為止，可靠地測(cè)量這些突變的唯一方法是通過取出病人腫瘤活組織檢查樣品對(duì)實(shí)體組織樣品進(jìn)行分析。這是一個(gè)困難的程序，對(duì)病人而言是非常不愉快的，并且有些時(shí)候當(dāng)肺瘤不宜手術(shù)時(shí)是行不通的。另一個(gè)篩選病人突變的問題在于在過多的野生型基因中檢測(cè)出突變基因的困難性。這是一個(gè)本領(lǐng)域公知的問題，并且在低濃度突變DNA的識(shí)別對(duì)于腫瘤的早期檢測(cè)或者對(duì)于早期病人適當(dāng)治療時(shí)程的識(shí)另'J可能非常重要的前提下，這顯得尤為重要(ClinCancerRes.2004;10(7):2379-85)。因此，需要較少侵入性的和更加可靠的方法來監(jiān)測(cè)和預(yù)測(cè)病人對(duì)于ErbB受體藥物的響應(yīng)，例如在治療中4吏用它們之前，該治療可能是非常有效的，但只對(duì)一小部分病人有效。
發(fā)明內(nèi)容我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一種能夠可靠地檢測(cè)采自病人的生物流體樣品中ErbB受體突變的方法，該方法可用于預(yù)測(cè)病人對(duì)ErbB受體藥物的響應(yīng)或生存優(yōu)勢(shì)(survivalbenefit)。具體而言，那些改變ErbB受體的酪氨酸激酶活性的突變的存在指出病人可能對(duì)藥物有陽性應(yīng)答，同時(shí)僅僅存在野生型等位基因指出病人可能不會(huì)對(duì)ErbB受體藥物有響應(yīng)。按照本發(fā)明的第一方面，提供了一種用于檢測(cè)ErbB突變的方法，包括步驟-(a)提供來自病人的生物流體樣品(b)從所述樣品中提取DNA;和(c)針對(duì)該受體中一個(gè)或多個(gè)突變(oneormoremutations)的存在情況篩選所述DNA。優(yōu)選地，如上所述的用于檢測(cè)ErbB突變的方法包括在ErbB受體中一個(gè)或多個(gè)能夠改變所述受體中酪氨酸激酶活性的突變的檢測(cè)。最優(yōu)選地，上述方法描述的ErbB受體是EGFR。本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)病人生物流體樣品中的突變的測(cè)量可被用于預(yù)測(cè)和監(jiān)測(cè)ErbB受體藥物在體內(nèi)的效果。在一個(gè)優(yōu)選的方面，本發(fā)明提供了一種用于預(yù)測(cè)病人對(duì)于ErbB受體藥物的響應(yīng)的方法，包括步驟-(a)提供來自病人的生物流體樣品(b)從所述樣品中提取DNA(c)針對(duì)該受體中改變酪氨酸激酶活性的一個(gè)或多個(gè)突變的存在情況篩選所述DNA在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種用于監(jiān)測(cè)病人對(duì)于ErbB受體藥物的響應(yīng)的方法，包括步驟(a)提供來自病人的生物流體樣品(b)從所述樣品中提取DNA(c)針對(duì)該受體中能夠改變酪氨酸激酶活性的一個(gè)或多個(gè)突變的存在情況篩選所述DNA。正如將會(huì)被該領(lǐng)域技術(shù)人員所知的，對(duì)于ErbB受體藥物的響應(yīng)的監(jiān)測(cè)允許對(duì)已經(jīng)被給予藥物的病人的應(yīng)答做出評(píng)價(jià)；因此，它可被用于治療后的病人。然而，響應(yīng)的預(yù)測(cè)是在未接觸ErbB受體藥物的病人中進(jìn)行的，并且是治療前進(jìn)行的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括如上所述的步驟，其中癌癥病人對(duì)于ErbB受體藥物的響應(yīng)的預(yù)測(cè)預(yù)測(cè)了病人的生存優(yōu)勢(shì)。優(yōu)選地，如上所述的對(duì)于ErbB藥物的響應(yīng)的預(yù)測(cè)方法進(jìn)一步包括步驟(d)做出結(jié)論被檢測(cè)出攜帶突變型和野生型等位基因的病人對(duì)ErbB受體藥物的響應(yīng)將為陽性，而被檢測(cè)出僅攜帶野生型等位基因的病人對(duì)該藥物不會(huì)啦文出陽性的響應(yīng)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，如上所述的篩選方法包括使用聚合酶鏈反應(yīng)，該聚合酶鏈反應(yīng)使用檢測(cè)單堿基突變、小的框內(nèi)缺失或堿基替換的等位基因特異性引物。優(yōu)選地，篩選方法涉及使用實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(realtime-PCR),該實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)使用檢測(cè)單堿基突變、小的框內(nèi)缺失或堿基替換的等位基因特異性引物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)于ErbB藥物的響應(yīng)的預(yù)測(cè)方法如上所述，其中第一個(gè)引物對(duì)被用于檢測(cè)野生型等位基因，第二個(gè)引物對(duì)被用于檢測(cè)突變等位基因；并且其中每對(duì)中的一個(gè)引物包括-(a)具有對(duì)特定突變有等位基因特異性的3'末端核苷酸的引物；和(b)該引物3'末端的可能的附加的錯(cuò)配。優(yōu)選地，如上所述每對(duì)中的一個(gè)引物進(jìn)一步包括-鏈體(duplex)探針；(b)在所述單分子或核酸雙鏈體之內(nèi)的與淬火劑(quencher)分子相近的附著于探針5'末端的熒光報(bào)道染料；(c)在所述探針一末端的一個(gè)或多個(gè)非編碼核苷酸殘基；(d)其中，所述報(bào)道染料和淬火劑分子在靶序列的擴(kuò)增期間分離。有利的是，該探針是Scorpioi^探針。優(yōu)選地，如本發(fā)明所述的方法使用能夠檢測(cè)到以野生型序列10%水平存在的突變序列的技術(shù)。更優(yōu)選地，該技術(shù)可以檢測(cè)到占野生型序列9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.1%或0.01%水平的突變序列。如上所述的熒光探針系統(tǒng)的好處在于不需要單獨(dú)的探針與擴(kuò)增的耙相結(jié)合，使得檢測(cè)比其它系統(tǒng)更迅速又更加有效。本發(fā)明證明在ARMS擴(kuò)增系統(tǒng)中使用Scorpioi^引物提高了用于檢測(cè)EGFR突變的方法的敏感性(見實(shí)施例4)。優(yōu)選地，上述方法描述的生物流體是血液、血清、血漿、汗液或唾液中的任一種。有利的是，生物流體是血清。用于回顧研究，大多數(shù)以前的著眼于EGFR突變和NSCLC進(jìn)展相關(guān)性的研究證明了在開始治療以后取得的手術(shù)切除的腫瘤樣品中這樣的突變的存在。然而從早期病人的不宜手術(shù)的NSCLC腫瘤中取樣的困難已經(jīng)妨礙了在治療開始以前進(jìn)行具有選擇病人潛力的預(yù)期研究的努力。然而，本發(fā)明提供了一種用于檢測(cè)來自癌癥病人樣品的突變EGFR的方法，該樣品不是腫瘤樣品。生物流體的采樣比以前的分析癌癥病人EGFR突變的方法的侵入性更小。與收集腫瘤樣品相比，例如血清樣品可以容易地被采集，以及試驗(yàn)可以被重復(fù)。此外已知腫瘤細(xì)胞釋放DNA進(jìn)入循環(huán)，富集于血清和血漿中，從而允許在癌癥病人的血清DNA中才全測(cè)到突變和微小的改變(microsatellitealterations)(CancerRes.1999;59(1):67-70)。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，ErbB受體藥物是ErbB受體酪氨酸激酶抑制劑。優(yōu)選地，ErbB受體藥物是EGFR酪氨酸激酶抑制劑。在優(yōu)選的方法中，EGFR酪氨酸激酶抑制劑選自由吉非替尼、埃羅替尼(erlotinib)(特羅凱(Tarceva)，OSI-774,CP-358774)、PKI-166、EKB-569、HKI-272(WAY國177820)、拉帕替尼(lapatinib)(GW2016,GW-572016,GSK572016)、canertinib(CI-1033,PD183805)、AEE788、XL647、BMS5599626、ZD6474(Zactima)或WO2004/006846或WO2003/082290中乂^開的任一種化合物構(gòu)成的組。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，ErbB受體藥物是EGFR抑制劑。優(yōu)選地，EGFR抑制劑是選自由西妥昔單抗(cetuximab)(愛必妥(Erbitux),C225)、曲妥珠單抗(matuzumab)(EMD-72000)、帕尼單抗(panitumumab)(ABX國EGF/rHuMAb國EGFR)、MR1-1、IMC-11F8或EGFRL11構(gòu)成的組的抗EGFR抗體。優(yōu)選地，任何之前的權(quán)利要求的方法包括用作單一治療或與其他藥物耳關(guān)合〗吏用的ErbB受體藥物。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，EFGR酪氨酸激酶抑制劑藥物選自由吉非替尼、埃羅替尼(特羅凱，OSI-774,CP-358774)、PKI-166、EKB-569、HKI-272(WAY-177820)、拉帕替尼(GW2016,GW-572016，GSK572016)、canertinib(CI-1033，PD183805)、AEE788、XL647、BMS5599626、ZD6474(Zactima)或WO2004/006846或WO2003/082290公開的任一種化合物構(gòu)成的組。已發(fā)現(xiàn)本發(fā)明中的突變是作為核酸的插入、缺失或替換而發(fā)生的。突變優(yōu)選地發(fā)生于ErbB受體的酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域。優(yōu)選地，突變發(fā)生于EGFR的酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域。優(yōu)選地，突變選自列在表5中的EGFR突變的組。有利的是，突變簇集在EGFR外顯子18、19、20或21的ATP結(jié)合位點(diǎn)附近。優(yōu)選地，突變選自列在表5中的EGFR突變的組。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，突變是EGFR外顯子19中的E746—A750del和EGFR外顯子21中的L858R。EGFR外顯子18-21中的大約30個(gè)突變已經(jīng)在肺腫瘤樣本中被檢測(cè)出來。在腫瘤樣本中檢測(cè)出來的NSCLC-相關(guān)的EGFR突變中，外顯子19中的15-bp核苷酸的框內(nèi)缺失(E746—A750del)和在外顯子21中的密碼子858的亮氨酸被精氨酸替換的點(diǎn)突變(L858R)占這些突變的大約90%(CancerRes.2004;64:8919隱8923,Proc.Natl.Acad.SciUSA2004;101:13306-13311)。有利的是，病人所患的癌癥選自由非實(shí)體腫瘤例如白血病、多發(fā)性骨髓瘤或淋巴瘤，以及實(shí)體腫瘤例如膽管、骨、膀胱、腦/CNS、惡性膠質(zhì)瘤、乳房、結(jié)腸直腸、子宮頸、子宮內(nèi)膜、胃、頭和頸、肝、肺、肌肉、神經(jīng)元、食管、卵巢、胰腺、胸膜/腹膜、前列腺、腎、皮膚、睪九、曱狀腺、子宮和外陰腫瘤構(gòu)成的組。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，如上所述的方法進(jìn)一步包括步驟(e)針對(duì)ErbB受體下游信號(hào)傳導(dǎo)途徑的元件中的一個(gè)或多個(gè)突變的存在情況篩選所述DNA。本發(fā)明的第二方面包括組合物，其包括用于檢測(cè)ErbB受體野生型等位基因的第一個(gè)引物對(duì)和用于檢測(cè)ErbB受體突變等位基因的第二個(gè)引物對(duì)，其中，每對(duì)中的一個(gè)引物進(jìn)一步包括(a)具有3'末端核普酸的引物，其對(duì)于特定突變是等位基因特異的；(b)該引物3'末端的可能的附加的錯(cuò)配；(c)包括引物序列和特異于靶序列的另外的序列的單分子或核酸雙鏈體探針；(d)在所述單分子或核酸雙鏈體之內(nèi)的與淬火劑分子相近的附著于5'末端探針的熒光報(bào)道染料；(e)在所述探針一末端的一個(gè)或多個(gè)非編碼核苷酸殘基；(f)其中，所述報(bào)道基染料和淬火劑分子在靶序列擴(kuò)增期間分離。本發(fā)明的第三個(gè)方面包括特異于ErbB受體的引物在生物流體中進(jìn)行的分析中的用途，用于預(yù)測(cè)病人對(duì)于ErbB藥物的響應(yīng)。優(yōu)選地，如上所述的用途包括用于測(cè)試生物流體的組合物的制造，其用于預(yù)測(cè)病人對(duì)于ErbB藥物的響應(yīng)。有利的是，上述描述的用途進(jìn)一步包括步驟(a)從所述樣品中提取DNA(b)針對(duì)該受體中改變酪氨酸激酶活性的一個(gè)或多個(gè)突變的存在情況篩選所述DNA。圖1使用EGFRScorpion試劑盒檢測(cè)E746—A750del和L858R突變的敏感性。(a)使用不同的量的具有E746—A750del的標(biāo)準(zhǔn)DNA:10,000pg(104)、1,000pg(103)、100pg(102)、10pg(IOM和1pg(10。)。在同一個(gè)試^r中，野生型標(biāo)準(zhǔn)DNA(野生)和蒸餾水(D.W.):故用作陰性對(duì)照。(b)濃度為1pg到10,000pg的具有E746—A750del的標(biāo)準(zhǔn)DNA與10，000pg的野生型標(biāo)準(zhǔn)DNA在1:1(10°)、1:10(1(T1)、1:100(10-2)、1:1,000(10-3)和1:10,000(1(T4)的比例下混合。(c)原始曲線和第二衍生曲線代表10,000pg的量的具有E746—A750del的標(biāo)準(zhǔn)DNA。第二衍生代表生長曲線斜率的變化速率。閾循環(huán)被定義為在第二衍生曲線的最高峰值的循環(huán)數(shù)(圖lc中的垂直線)。(d)標(biāo)準(zhǔn)曲線來自每條曲線(如圖1A和1B所示)的Ct對(duì)標(biāo)準(zhǔn)DNA量的log值作圖。圖2采自肺癌細(xì)胞系的基因組DNA中的E746—A750del的檢測(cè)。(a)具有E746—A750del的PC-9和野生型A431。(b)具有L858R和A431的11—18圖3關(guān)于非小細(xì)胞肺癌的EGFR突變狀態(tài)的無進(jìn)展生存(Progressionfreesurvival)(A)和總體生存(overallsurvival)(B)。(*)Log-rank測(cè)試。具體實(shí)施例方式除非另外定義，否則這里使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語的含義都與本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義相同(例如在細(xì)胞培養(yǎng)、分子遺傳學(xué)、核酸化學(xué)、雜交技術(shù)和生物化學(xué)中)。標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)用于分子、基因和生物化學(xué)方法中。一般性地參見Sambrook等人，MolecularCloning:ALaboratoryManual,2ded.(1989)ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor，N.Y.以及Ausubel等人,ShortProtocolsinMolecularBiology(1999)4thEd,JohnWiley&Sons,Inc.;以及Guthrie等人，GuidetoYeastGeneticsandMolecularBiology,MethodsinEnzymology,Vol.194，AcademicPress,Inc.,(1991)，PCRProtocols:AGuidetoMethodsandApplications(Innis,等人1990.AcademicPress,SanDiego,Calif.)，McPherson等人，PCRVolume1N.Y.),以及GeneTransferandExpressionProtocols,pp.109-128，ed.E.J.Murray,TheHumanaPressInc.,Clifton，N.J.)。這些文獻(xiàn)通過引用方式包含在此。OxfordUniversityPress,(1991)，CultureofAnimalCells:AManualofBasicTechnique,2ndEd.(R.I.Freshney.1987.Liss,Inc.NewYork,N.Y.),andGeneTransferandExpressionProtocols,pp.109-128,ed.E.J.Murray,TheHumanaPressInc.,Clifton,N丄)。這些文獻(xiàn)通過引用方式包含在此。生物一示志被稱為生物標(biāo)志的多種生物學(xué)標(biāo)志已經(jīng)在將生物化學(xué)和分子生物學(xué)應(yīng)用到醫(yī)學(xué)和毒理學(xué)狀態(tài)的過程中被識(shí)別和研究。生物標(biāo)志可以被發(fā)現(xiàn)于組織和生物流體中，其中血液是生物標(biāo)志研究中最常見的生物流體(Proteomics2000;1:1-13,Physiol.2005;563:23-60)。生物標(biāo)志可以被描述為"作為正常生物過程、致病過程、或?qū)χ委煾缮娴乃幚眄憫?yīng)的指示劑而被客觀地測(cè)量和評(píng)估的特征"。生物標(biāo)志是任何可被識(shí)別和測(cè)量的、與特定的狀態(tài)或疾病相關(guān)聯(lián)的指示劑，其中在此生物標(biāo)志的存在或水平與該狀態(tài)或疾病的某一方面之間有關(guān)聯(lián)(包括所述狀態(tài)或疾病的存在、水平或改變水平、類型、階段、敏感性、或?qū)τ谟糜谥委熕鰻顟B(tài)或疾病的藥物的響應(yīng))。該關(guān)聯(lián)可以是定性的、定量的、或既定性又定量的。典型地，生物標(biāo)志是化合物、化合物片段或蛋白質(zhì)(和肽)、核酸和其它化合物。生物標(biāo)志可以具有預(yù)言性的能力，如此可以被用于預(yù)測(cè)或檢測(cè)特定的狀態(tài)或疾病的存在、水平、類型或階段(包括特定的微生物或毒素的存在或水平)、對(duì)特定的狀態(tài)或疾病的敏感性(包括遺傳的敏感性)、或?qū)μ囟ǖ闹委煹捻憫?yīng)(包括藥物治療)。人們認(rèn)為生物標(biāo)志在未來將會(huì)通過改進(jìn)研究和開發(fā)項(xiàng)目的效率而對(duì)藥物的發(fā)現(xiàn)和發(fā)展起到日益重要的作用。生物標(biāo)志可被用作診斷劑、疾病發(fā)展的監(jiān)視器、治療的監(jiān)視器和臨床結(jié)果的預(yù)測(cè)器。例如，不同的生物標(biāo)志研究計(jì)劃正在嘗試識(shí)別特定的癌癥以及特定的心血管和免疫疾病的標(biāo)志。此處使用的術(shù)語"ErbB受體藥物"包括對(duì)erbB受體酪氨酸激酶家族包括EGFR、ErbB2(HER)、ErbB3和ErbB4起作用的藥物。在一個(gè)實(shí)施方案中，該ErbB受體藥物是ErbB受體酪氨酸激酶抑制劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該ErbB受體藥物是EGFR酪氨酸激酶抑制劑。EGF受體酪氨酸激酶抑制劑的例子包括但是不局限于吉非替尼、埃羅替尼(OSI-774,CP畫358774)、PKI-166、EKB-569、HKI-272(WAY畫177820)、拉帕替尼(GW2016,GW-572016)、canertinib(CI畫1033，PD183805)、AEE788、XL647、BMS5599626或在WO2004/006846、WO2003/082831、或WO2003/082290中公開的任何化合物。具體而言，在國際專利申請(qǐng)WO96/33980中公開的吉非替尼(又名易瑞沙TM(Iressa),代號(hào)為ZD1839和ChemicalAbstracts登記號(hào)碼為184475國35-2)是酪氨酸激酶的表皮生長因子受體(EGFR)家族例如ErbBl的強(qiáng)力抑制劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該ErbB受體藥物是抗EGFR抗體例如cetuximab(C225)、matuzumab(EMD-72000)、帕尼單抗(ABX誦EGF/rHuMAb畫EGFr)、MR1-1、IMC國11F8或EGFRL11中的一種。此處提及的ErbB受體藥物可以被用作單一治療或與其他的同類或不同類別的藥物結(jié)合使用。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，該EGF受體酪氨酸激酶抑制劑是吉非替尼。"生存"包括病人的"總體生存"和"無進(jìn)展生存"。"總體生存"(OS)被定義為從開始給予吉非替尼到由任何原因引起的死亡的時(shí)間。"無進(jìn)展生存(PFS)"被定義為從開始給予吉非替尼到第一次出現(xiàn)進(jìn)行性疾病或由任何原因引起的死亡的時(shí)間。"響應(yīng)"由按照"實(shí)體瘤的響應(yīng)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)(ResponseEvaluationCriteriainSolidTumours)"(RECIST)而進(jìn)行的測(cè)量所定義，涉及將病人分成兩個(gè)主要的組那些顯示出部分響應(yīng)或穩(wěn)定疾病的病人和那些顯示出進(jìn)4亍性疾病的體征的病人。"擴(kuò)增"反應(yīng)是那些導(dǎo)致靶核酸而不是非-靶核酸的特定的擴(kuò)增的核酸反應(yīng)。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)是眾所周知的擴(kuò)增反應(yīng)。此處使用的"癌癥"是指由細(xì)胞向腫瘤表型(neoplasticphenotype)的轉(zhuǎn)化而導(dǎo)致的腫瘤生長。這樣的細(xì)胞轉(zhuǎn)化經(jīng)常涉及基因突變；在本發(fā)明的上下文中，如此所述，轉(zhuǎn)化涉及由一個(gè)或多個(gè)Erb基因的改變引起的基因突變。術(shù)語"探針"是指單鏈的序列特異性寡核苷酸，其序列和待檢測(cè)的等位基因的靶序列完全互補(bǔ)。術(shù)語"引物"是指單鏈DNA寡核苷酸序列或特異引物，其能夠作為與待復(fù)制的核酸鏈互補(bǔ)的《I物延伸產(chǎn)物的合成起始點(diǎn)。引物的長度和序列必須使得它們能夠啟動(dòng)延伸產(chǎn)物的合成。本申請(qǐng)描述了ErbB核酸突變。如此處使用的術(shù)語"ErbB受體突變體，，用于表示編碼任何一種ErbB酪氨酸激酶受體家族成員的核酸。術(shù)語"ErbB受體"因此包括全部已知的人類ErbB受體同源物和變異體，以及其它核酸分子，該核酸分子顯示出與將被識(shí)別為ErbB受體同源物的ErbB受體家族成員的足夠的同源性。優(yōu)選地，EGFR被識(shí)別為具有SEQIDNO.l所示EGFR序列的核酸。術(shù)語"核酸"包括那些在嚴(yán)格雜交條件下能夠與上述被識(shí)別的天然存在核酸或其互補(bǔ)物雜交的多核苷酸。"嚴(yán)格雜交條件"是指在包括50%曱酰胺、5xSSC(750mMNaCl、75mM檸檬酸鈉)、50mM磷酸鈉(pH7.6)、5xDenhardt's溶液、10%石危酸葡聚糖和20pg/ml變性并剪切的鮭魚精DNA的溶液中42°C隔夜培養(yǎng)，然后再在O.lxSSC中在大約65。C洗滌過濾器。用于^r測(cè)核酸的方法在本發(fā)明的上下文中，編碼ErbB受體的突變體核酸的檢測(cè)可以被用于預(yù)測(cè)對(duì)于藥物治療的響應(yīng)。因?yàn)镋rbB受體基因中的突變通常發(fā)生在DNA水平，本發(fā)明的方法可以是基于對(duì)基因組DNA中的突變以及轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物和蛋白質(zhì)它們自己的才企測(cè)。為了保證^皮;險(xiǎn)測(cè)到的突變的確:帔表達(dá)于受試者中，通過轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物和/或多肽的分析來確認(rèn)基因組DNA中的突變可能是令人期待的?；蚪M核酸中的突變有利地通過基于遷移率改變(mobilityshift)的4支術(shù)從擴(kuò)增的核酸片l爻中4企測(cè)出來。例如，Chenetal.，AnalBiochem1996Jul15;239(1):61-9描述了通過竟?fàn)幮赃w移率改變分析來沖企測(cè)單堿基突變。此外，從市場(chǎng)上還可以得到基于Marcelinoetal.,BioTechniques26(6):1134-1148(June1999)的技術(shù)的分析。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，毛細(xì)管異源雙鏈體分析可以用來檢測(cè)突變的存在，這基于由于錯(cuò)配的存在導(dǎo)致的毛細(xì)管系統(tǒng)中的雙鏈核酸的遷移率改變。從樣品中產(chǎn)生用于分析的核酸通常需要核酸的擴(kuò)增。許多擴(kuò)增方法依靠酶催化的鏈反應(yīng)(例如聚合酶鏈反應(yīng)、連接酶鏈反應(yīng)、或自維持的序列復(fù)制(self-sustainedsequencereplication))或取決于已^皮克隆進(jìn)去的載體的全部或者一部分的復(fù)制。優(yōu)選地，本發(fā)明所述的擴(kuò)增是指數(shù)擴(kuò)增，正如例如聚合酶鏈反應(yīng)所顯示的。許多^^點(diǎn)和信號(hào)的擴(kuò)增方法已在文獻(xiàn)中^皮弟又述，例如，Landegren，U.，etal.,Science242:229-237(1988)和Lewis,R.，GeneticEngineeringNews10:1，54-55(1990)中給出了這些方法的一般性綜述。這些擴(kuò)增方法可被用于我們的發(fā)明的方法中，包括聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、原位PCR(PCRinsitu)、連接酶擴(kuò)增反應(yīng)(LAR)、連接酶雜交、Qbeta噬菌體復(fù)制酶、基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增系統(tǒng)(Transcription-basedAmplificationSystem)(TAS)、基因組擴(kuò)增轉(zhuǎn)錄同步測(cè)序法(genomicamplificationwithtranscripts叫uencing)(GAWTS)、基于核酸序列的擴(kuò)增4支術(shù)(nucleicacidsequencebasedamplification)(NASBA)和原位雜交。適行準(zhǔn)備。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)PCR是核酸擴(kuò)增方法，在美國專利No.4,683,195和4,683,202等之中被描述。PCR由DNA聚合酶產(chǎn)生的引物延伸反應(yīng)的重復(fù)循環(huán)構(gòu)成。靶DNA被熱變性，在待擴(kuò)增DNA的相對(duì)鏈上的將靶序列夾在中間的兩個(gè)寡核苷酸被雜交。這些寡核苷酸成為引物，與DNA聚合酶共同使用。DNA通過引物延伸獲得雙鏈的第二個(gè)副本來復(fù)制。通過重復(fù)熱變性、引物雜交和延伸的循環(huán)，靶DNA可以在大約兩至四小時(shí)內(nèi)#:擴(kuò)增一百萬倍或更多。PCR是一種分子生物學(xué)工具，其必須與檢測(cè)技術(shù)聯(lián)用來確定擴(kuò)增結(jié)果。PCR的優(yōu)越性在于它通過在大約4小時(shí)內(nèi)將靶DNA的數(shù)量擴(kuò)增一百萬到十億倍從而提高靈敏度。在診斷的環(huán)境中，PCR可用于擴(kuò)增《壬一種已^口的核酸(Moketal.(1994)，GynaecologicOncology,52:247-252)。自維持的序列復(fù)制(3SR)自維持的序列復(fù)制(3SR)是TAS的變體，其涉及通過連續(xù)的幾輪反轉(zhuǎn)錄酶(RT)、聚合酶和核酸酶活性來進(jìn)行核酸模版的等溫?cái)U(kuò)增，這些活性通過酶雞尾酒(cocktail)和適當(dāng)?shù)墓押塑账嵋飦斫閷?dǎo)(Guatellietal.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:1874)。使用RNA/DNA異源雙鏈中的RNA的酶促降解代替加熱變性。將RNaseH和其它所有的酶加入反應(yīng)中，所有的步驟發(fā)生在相同的溫度下，沒有加入其它試劑。遵循這個(gè)過程，106到109的擴(kuò)增在42°Cl小時(shí)內(nèi)就已經(jīng)完成。連接擴(kuò)增(LAR/LAS)連接擴(kuò)增反應(yīng)或連接擴(kuò)增系統(tǒng)使用DNA連接酶和四種寡核苷酸，每條耙鏈兩種寡核香酸。該方法在Wu，D.Y.和Wallace,R.B.(1989)Genomics4:560中描述。寡核普酸雜交到粑DNA的相鄰序列上，并通過連接酶相連。該反應(yīng)^皮加熱變性，循環(huán);故重復(fù)。013復(fù)制酶在這個(gè)技術(shù)中，復(fù)制單鏈RNA的噬菌體Q卩的RNA復(fù)制酶被用于擴(kuò)增靶DNA，如Lizardietal.,(1988)Bio/Technology6:1197中所述。首先，耙DNA被雜交到包含T7啟動(dòng)子和Q卩5'序列區(qū)域的引物上。在該過程中，使用這個(gè)引物，反轉(zhuǎn)錄酶產(chǎn)生連接該引物到它的5'末端的cDNA。這兩步類似于TAS試驗(yàn)方案。生成的異源雙鏈被加熱變性。接下來，使用包含Q卩3'序列區(qū)域的第二個(gè)引物開始笫二輪cDNA的合成。這一步產(chǎn)生了包含Q卩噬菌體5'和3'末端以及活性T7RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)的雙鏈DNA。T7RNA聚合酶然后轉(zhuǎn)錄該雙鏈DNA為新的模擬Q卩的RNA。在經(jīng)過充分地洗滌除去任何未雜交的探針以后，從該靶中洗提出新的RNA,通過Q卩復(fù)制酶進(jìn)行復(fù)制。后面的反應(yīng)在大約20分鐘內(nèi)產(chǎn)生了107倍的擴(kuò)增。備選的擴(kuò)增技術(shù)可以用于本發(fā)明中。例如，滾環(huán)擴(kuò)增(rollingcircleamplification)(Lizardi等人，(1998)NatGenet19:225)是一種商業(yè)上可用的擴(kuò)增技術(shù)(RCATTM),由DNA聚合酶驅(qū)動(dòng)，可以在等溫情況下采用線性的或幾何動(dòng)力學(xué)復(fù)制環(huán)形的寡核苷酸探針。在兩個(gè)合適地設(shè)計(jì)的引物存在的情況下，通過DNA鏈置換和高分枝(hyperbranching)在1小時(shí)內(nèi)產(chǎn)生每一個(gè)環(huán)的1012或更多份拷貝，從而實(shí)現(xiàn)幾何學(xué)擴(kuò)增。如果使用單個(gè)引物，RCAT在幾分鐘內(nèi)就產(chǎn)生成千上萬的依次連接耙的DNA拷貝的線性鏈，其以共價(jià)鍵銜接到該靶。此外的才支術(shù)，鏈置才灸擴(kuò)增(stranddisplacementamplification)(SDA;Walker等人，(1992)PNAS(USA)80:392)從特定的耙獨(dú)有的特殊定義的序列開始。但是不同于其他的依靠熱循環(huán)的技術(shù)，SDA是一種使用一系列引物、DNA聚合酶和限制性內(nèi)切酶來指數(shù)擴(kuò)增獨(dú)特的核酸序列的等溫過程。SDA包括靶生成階段和指數(shù)擴(kuò)增階段。在產(chǎn)生靶的時(shí)候，加熱雙鏈DNA使其變性來產(chǎn)生兩個(gè)單鏈拷貝。一系列特殊制造的引物與DNA聚合酶(用于復(fù)制堿基序列的擴(kuò)增引物和用于置換新生成的鏈的緩沖器引物(bumperprimers))相結(jié)合產(chǎn)生能夠指數(shù)擴(kuò)增的改變的靶。別位點(diǎn)的部分單鏈DNA鏈)為起點(diǎn)。擴(kuò)增引物結(jié)合于每一條鏈上的它的互補(bǔ)DNA序列上。然后DNA聚合酶使用？1物來識(shí)別從它的3'末端延伸引物的位點(diǎn)，使用改變的靶作為模板用于增加各核苷酸。因此延伸的引物形成雙鏈DNA片段，包括每個(gè)末端的完整的限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)。然后限制性內(nèi)切酶與雙鏈DNA片段在其識(shí)別位點(diǎn)相結(jié)合。在切掉雙邊片段的僅一條鏈形成缺口(nick)以后，限制性內(nèi)切酶從識(shí)別位點(diǎn)脫離。DNA聚合酶識(shí)別缺口并且從該位點(diǎn)延伸鏈，置換以前形成的鏈。因此該識(shí)別位點(diǎn)通過限制性內(nèi)切酶和DNA聚合酶被重復(fù)地形成缺口和復(fù)原，含有靶片段的DNA鏈被連續(xù)置換。然后每一個(gè)置換的鏈可以用來與擴(kuò)增引物進(jìn)行退火，如上所述。該過程持續(xù)進(jìn)行重復(fù)的形成缺口、延伸和新DNA鏈的置換，結(jié)果形成原始DNA耙的指數(shù)擴(kuò)增。一旦核酸被擴(kuò)增，就可以使用許多技術(shù)來檢測(cè)單堿基對(duì)的突變。其中一種此類技術(shù)是單鏈構(gòu)象多態(tài)性(singlestrandedconformationalpolymorphism)(SSCP)。SCCP檢測(cè)基于電泳中單鏈突變DNA相對(duì)于參考DNA的異常的遷移。突變?cè)趩捂淒NA中產(chǎn)生構(gòu)象變化，導(dǎo)致遷移率改變。熒光SCCP使用熒光標(biāo)記的引物用于輔助檢測(cè)。因此，使用焚光標(biāo)記的引物來擴(kuò)增參考和突變DNA。被擴(kuò)增DNA被變性和驟冷以產(chǎn)生單鏈DNA分子，其通過非變性凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。化學(xué)錯(cuò)配裂解法(chemicalmismatchcleavage)(CMC)基于通過羥胺、四氧化鋨和哌啶的組合對(duì)DNA4昔配石咸基對(duì)的識(shí)別和裂解。因此，參考DNA和突變DNA通過焚光標(biāo)記的引物擴(kuò)增。擴(kuò)增子被雜交，然后使用與錯(cuò)配的T堿基結(jié)合的四氧化鋨，或者與錯(cuò)配的C堿基結(jié)合的羥胺進(jìn)行裂解，然后是哌啶在被修飾的堿基位點(diǎn)進(jìn)行裂解。然后裂解的片段通過電泳^皮才企測(cè)出。還可以使用基于限制性片段多態(tài)性(restrictionfragmentpolymorphism)(RFLPs)的技術(shù)。盡管許多單核普酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphisms)(SNPs)不允許使用傳統(tǒng)的RFLP分析，但引物誘導(dǎo)的限制性分析PCR(PIRA-PCR)可用于使用PCR引物以SNP-依賴的方式引入限制性位點(diǎn)。引入適當(dāng)?shù)南拗菩晕稽c(diǎn)的用于PIRA-PCR的引物可以通過計(jì)算分析設(shè)計(jì)，例如如Xiaiyietal.,(2001)Bioinfo腿tics17:838—839所述。此外，基于WAVE分析的技術(shù)可被使用(MethodsMol.Med.2004;108:173-88)。這種DNA片段分析體系可用于檢測(cè)單核普酸多態(tài)性，其基于溫度調(diào)控的液相色譜和高分辨率矩陣(GenetTest.1997-98;1(3):201-6)實(shí)時(shí)PCR(亦稱定量PCR、實(shí)時(shí)定量PCR、或RTQ-PCR)是一種同時(shí)的DNA量化和擴(kuò)增的方法(ExpertRev.Mol.Diagn.2005(2:209-19)。通過聚合酶鏈反應(yīng)，DNA被特定地?cái)U(kuò)增。在每一輪擴(kuò)增以后，DNA被量化。量化的常見方法包括使用那些插入雙鏈DNA的焚光染料和那些與互補(bǔ)DNA雜交時(shí)發(fā)熒光的被修飾的DNA寡核香酸(被稱為探針)。被稱為"Scorpion引物"的特定的引物能夠被用于高靈敏度的和快速的DNA擴(kuò)增系統(tǒng)。這樣的引物在單個(gè)分子中將探針與特定的靶序列結(jié)合，產(chǎn)生具有單分子動(dòng)力學(xué)的熒光片全測(cè)系統(tǒng)(Nucl.AddsRes.2000;28:3752-3761)。這個(gè)系統(tǒng)優(yōu)于其它的焚光4笨針系統(tǒng)例如分子燈標(biāo)(MolecularBeacons)和TaqMan⑧之處在于不需要與擴(kuò)增耙相結(jié)合的單獨(dú)的探針，使得檢測(cè)既更迅速又更高效。三種檢測(cè)方法的直接比較(Nucl.AcidsRes2000;28:3752-3761)指出Scorpion⑧比分子間探針系統(tǒng)運(yùn)行更優(yōu)，特別是在快速的循環(huán)條件下。某一版本的Scorpioi^引物的結(jié)構(gòu)是這樣的，它通過大約六個(gè)堿基的互補(bǔ)莖序列(stems叫uences)被約束在發(fā)夾環(huán)(hairpinlo叩)構(gòu)象中，互補(bǔ)莖序列側(cè)面是所關(guān)心靶的特異探針序列(Nat.Biotechnol.1999;17:804-807)。莖還用來將熒光報(bào)告染料(附著于5'末端)與淬火劑分子定位于非常接近的區(qū)域內(nèi)。在這種構(gòu)象中，不產(chǎn)生信號(hào)。PCR-阻斷劑將發(fā)夾環(huán)與引物序列分離開，形成Scorpior^的3'末端。該阻斷劑防止通讀，在沒有特定的耙的情況下，通讀將會(huì)導(dǎo)致發(fā)夾環(huán)的解折疊。在PCR期間，延伸通常從引物開始。在隨后的變性和退火步驟后，發(fā)夾環(huán)解折疊，并且如果正確的產(chǎn)物已經(jīng)被擴(kuò)增的話，在新合成的鏈中，探針序列與特定的靶序列在引物下游相結(jié)合。這個(gè)新結(jié)構(gòu)在熱力學(xué)上比原來的發(fā)夾環(huán)更加穩(wěn)定?，F(xiàn)在熒光信號(hào)被產(chǎn)生，因?yàn)闊晒馊玖喜辉俜浅＝咏诖慊饎?。熒光信?hào)與靶DNA的數(shù)量成正比。另一個(gè)Scorpioi^引物包括兩個(gè)標(biāo)記的互補(bǔ)寡核酸雙鏈體。雙鏈中的一條寡核苷酸被5'末端報(bào)告染料標(biāo)記，并攜帶阻斷劑非編碼核苷酸和PCR引物元件，而另一條寡核苦酸;波3'末端淬火劑染料標(biāo)記。作用的原理則本質(zhì)上與上面描述的Scorpioi^發(fā)夾引物相同在實(shí)時(shí)定量PCR期間，5'末端報(bào)告染料和3'末端淬火劑染料彼此分離，導(dǎo)致熒光發(fā)射的顯著增加。Scorpion⑧可與擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)(AmplificationRefractoryMutationSystem,ARMS)(Nucl.AcidsRes.1989;17:2503-2516,NatBiotechnol.1999;17:804-807)聯(lián)合使用使得單堿基突變能夠被檢測(cè)到。在適當(dāng)?shù)腜CR條件下，位于引物3'末端的單堿基錯(cuò)配足以滿足完全匹配的等位基因的優(yōu)先擴(kuò)增(Newton等人，1989),允許非常相關(guān)物種間的區(qū)分。使用上面描述的引物的擴(kuò)增系統(tǒng)的基礎(chǔ)是在適當(dāng)情況下那些帶有錯(cuò)配的3'殘基的寡核苷酸不會(huì)在PCR中起引物作用。這個(gè)擴(kuò)增系統(tǒng)允許僅僅通過在瓊脂糖凝膠電泳以后對(duì)反應(yīng)混合物的檢查來進(jìn)行基因分型。它是簡單的和可靠的，并且能夠明確地將任一等位基因在某一基因座的雜合子與純合子區(qū)別開來。ARMS不需要限制性內(nèi)切酶消化、通常應(yīng)用的等位基因特異性寡核普酸或PCR產(chǎn)物的序列分析。實(shí)施例1-臨床試驗(yàn)和血清樣品的收集進(jìn)行本研究，作為吉非替尼單一治療的多中心臨床II期試驗(yàn)的相關(guān)研究。該研究的進(jìn)行，基于涉及人類受試者的生物醫(yī)學(xué)研究Helsinki聲明的推薦，得到了適當(dāng)?shù)膫惱韺彶槲瘑T會(huì)(ethicalreviewboards)的批準(zhǔn)。IIIB或IV階段的組織學(xué)或細(xì)胞學(xué)證實(shí)為化療-nai'veNSCLC的日本病人參與這個(gè)試驗(yàn)。全部病人口服給予吉非替尼，固定劑量為每天250毫克。4吏用"實(shí)體瘤的響應(yīng)評(píng)^f介標(biāo)準(zhǔn)(ResponseEvaluationCriteriainSolidTumours,RECIST)，，的指導(dǎo)方針評(píng)估有效性(J.Natl.CancerInst.2000;92:205-216)。28位病人在2002年10月23日到2003年8月3日之間被登記(表1)。全部病人的響應(yīng)^皮評(píng)估，并且其無進(jìn)展生存和總體生存纟皮追蹤。來自27位病人的血液樣品(2毫升)在開始給予吉非替尼之前被采集。在所有27份樣品中提取的血清DNA濃度最高達(dá)1720ng/ml。樣品采集和DNA提取。來自26位NSCLC病人的血液樣品在開始給予吉非替尼之前被采集。分離的血清于-80°C存放直至使用。使用QiampBlood試劑盒(Qiagen,Hilden，德國)提取并純化血清DNA,按照以下修改的試驗(yàn)方案進(jìn)行。一個(gè)柱子被反復(fù)使用，直到全部樣品已經(jīng)被處理。得到的DNA通過50pi無菌雙蒸餾緩沖液洗提出。提取的DNA的濃度和純度通過分光光度測(cè)定法確定。提取的DNA保存于-20°C直至使用。實(shí)施例2-利用Scorpion引物和擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)(ARMS)來檢測(cè)E746A750del和L858REGFR突變EGFRScorpion試劑盒的敏感性通過初步試驗(yàn)來評(píng)估EGFRScorpion試劑盒的敏感性(圖1)。當(dāng)達(dá)到最多45個(gè)循環(huán)時(shí)，量從lpg到10,000pg的E746—A750del標(biāo)準(zhǔn)DNA的全部曲線增長(圖la)。當(dāng)野生型標(biāo)準(zhǔn)DNA和水被用作陰性對(duì)照時(shí)，曲線不是增長的，并且在達(dá)到50循環(huán)數(shù)之前保持平坦(圖la)。使用稀釋的E746—A750del標(biāo)準(zhǔn)DNA和野生型標(biāo)準(zhǔn)DNA,比例為10°到l(T5，當(dāng)達(dá)到最多45循環(huán)數(shù)時(shí)，表明存在E746—A750del的全部曲線增長(圖lb)。在這個(gè)研究中的測(cè)量量范圍內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)曲線是線性的，rM直為0.997和0.987。兩曲線斜率幾乎平行(圖lc)。稀釋的E746—A750del標(biāo)準(zhǔn)DNA與野生型DNA的Ct和那些僅僅是E746—A750del標(biāo)準(zhǔn)DNA的Ct相比，在每個(gè)量的E746—A750del標(biāo)準(zhǔn)DNA中都接近。盡管在比例小于l(T3時(shí)，稀釋的E746—A750del標(biāo)準(zhǔn)DNA與野生型DNA的峰值熒光水平比沒有野生型DNA標(biāo)準(zhǔn)的低，但E746一A750del的存在可以被清楚地檢測(cè)到。最多達(dá)到1pg量的E746_A750delDNA的曲線不受野生型EGFRDNA混入的影響。在使用人類癌細(xì)胞系基因組DNA的基于細(xì)胞的試驗(yàn)中，正如所料，使用來源于PC-9細(xì)胞的DNA的信號(hào)祐^企測(cè)到，來自A431細(xì)力包的未纟皮;險(xiǎn)測(cè)到。我們使用結(jié)合了ARMS和Scorpion這兩種技術(shù)的EGFRScorpion試劑盒(DxS有限公司，曼徹斯特，英國)來檢測(cè)實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)中的突變。用于檢測(cè)在外顯子19和外顯子21中的E746—A750del、L858R和野生型的四種scorpion引物被DxSLtd.(曼徹斯特，英國)設(shè)計(jì)且合成出。用于E746—A750del和L858R的scorpion引物的序列基于GenBank-存檔的人類EGFR序列(登記號(hào)碼AY588246)。所有反應(yīng)在25jul體積中進(jìn)行，包括ljul模板DNA、7.5jul反應(yīng)緩沖混合液、0.6ml引物混合液和0.1mlTaq聚合酶。全部的試劑都包含在這個(gè)試劑盒中。實(shí)時(shí)PCR使用SmartCyclerII(Cepheid,Sunnyvale,CA)進(jìn)行，按照下述條件在95。C進(jìn)行初始變性10分鐘，50循環(huán)的95。C30秒、62°C60秒以及每個(gè)循環(huán)末的焚光讀數(shù)(設(shè)置在FAM,允許光激發(fā)在480nm以及在520nm測(cè)量)。使用CepheidSmartCycler軟件(Ver.1.2b)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。閾循環(huán)(thresholdcycle)(Ct)被定義為在第二衍生曲線的最高峰值的循環(huán)，其代表了生長曲線的最大曲率點(diǎn)。Ct和最大熒光(Fl)用于結(jié)果的分析。陽性結(jié)果被定義為Ct^45和F1^50。每個(gè)樣品中的這些分析進(jìn)行兩份。為了證實(shí)檢測(cè)E746—A750del的靈敏度，我們使用EGFRScorpion試劑盒中包括的標(biāo)準(zhǔn)DNA。使用量為1、10、100、1,000或10,000pg的具有E746—A750del的標(biāo)準(zhǔn)DNA，以及10,000pg的野生型標(biāo)準(zhǔn)DNA和量分別為1、10、100、1,000或10,000pg的E746—A750del標(biāo)準(zhǔn)DNA的混合物。為了量化，將Ct循環(huán)數(shù)對(duì)已知標(biāo)準(zhǔn)的DNA量的log值作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。線性相關(guān)系數(shù)(R2)的數(shù)值和斜率的公式被計(jì)算。用于陽性對(duì)照的DNA提取自已知包含E746—A750del的日本人腺癌PC-9細(xì)胞系和已知包含外顯子19野生型的人類上皮癌A431細(xì)胞系，10,000pgDNA^K吏用。通過ARMS檢測(cè)血清DNA的EGFR突變狀態(tài)采自27位NSCLC病人的血清DNA的E746—A750del或L858R被檢查。外顯子19和外顯子21的野生型在全部的血清樣品中都被檢測(cè)出來。E746—A750del在12位病人的樣品中被檢測(cè)出來。L858R在一位病人中被檢測(cè)出來(表2)。全部地，EGFR突變?cè)?7位病人的13位(48.1%)中被檢測(cè)出來。23位血清中攜帶EGFR突變的病人的原始腫瘤的組織學(xué)亞型被總結(jié)在表3a中。23個(gè)腺癌病例中的11個(gè)(47.8%)、2個(gè)鱗狀細(xì)胞癌病例中的1個(gè)、和2個(gè)大細(xì)胞癌病例中的1個(gè)對(duì)于EGFR突變呈陽性。統(tǒng)計(jì)上EGFR突變狀態(tài)與組織學(xué)類型無關(guān)。來源于女性病人的EGFR突變比來源于男性的更經(jīng)常在樣品中被檢測(cè)到(IO位中的7位，70%;對(duì)應(yīng)于17位中的6位，29.4%,表3b)。血清中EGFR突變狀態(tài)和對(duì)于吉非替尼的響應(yīng)來自顯示部分響應(yīng)(PR)或穩(wěn)定疾病(SD)(17個(gè)病例中的11個(gè)，75%)的病人樣品中的EGFR突變比來自進(jìn)行性疾病(PD，10個(gè)病例中的2個(gè)，18%)的病人樣品中的顯著更頻繁地被觀測(cè)到(p=0.046，F(xiàn)isher'sexact煩'J試，表3c)。實(shí)施例3:血清中EGFR突變狀態(tài)和對(duì)于生存的影響統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。Fisher'sexact測(cè)試用于比較具有不同特性，包括性別、胂瘤類型和對(duì)于吉非替尼的響應(yīng)，的NSCLC病人中EGFR突變的存在。關(guān)于對(duì)于吉非替尼的響應(yīng)的分析，根據(jù)RECIST標(biāo)準(zhǔn)，病人被分為部分響應(yīng)或穩(wěn)定疾病(PR/SD)和進(jìn)行性疾病(PD)兩個(gè)組。我們使用標(biāo)準(zhǔn)log-rank測(cè)試，比較總體生存和無進(jìn)展生存的Kaplan-Meier曲線。"總體生存，，(OS)被定義為從開始給予吉非替尼到由任何原因引起的死亡的時(shí)間；在分析的時(shí)候已知仍然存活的病人在他們最后一次追蹤調(diào)查的時(shí)候被檢查。"無進(jìn)展生存(PFS)"被定義為從開始給予吉非替尼到已知存活且沒有進(jìn)行性疾病的病人在他們最后一次追蹤調(diào)查的時(shí)候祐:檢查。0.05的P值在統(tǒng)計(jì)學(xué)上被認(rèn)為是顯著的。使用版本5.0的StatView程序包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。接受吉非替尼治療的全部病人的PFS中值是98天，OS中值是306天。血清中攜帶EGFR突變的病人與沒有EGFR突變的病人相比，具有顯著更長的PFS中值(200天對(duì)比于46天，P=0.005,圖3a)。攜帶EGFR突變的病人與沒有EGFR突變的病人相比，具有更長的OS中值，盡管沒有統(tǒng)計(jì)顯著性(611天相對(duì)于232天，P=0.078,圖3b)。這些結(jié)果提示血清EGFR突變對(duì)于無進(jìn)展生存和總體生存起到預(yù)后因子的作用，同時(shí)還可以作為病人對(duì)于吉非替尼治療的響應(yīng)的預(yù)測(cè)器(predictor)。實(shí)施例4:通過直接測(cè)序和與ARMS的比較來分析血清中的EGFR突變通過從27位病人中的10位(37.0%)中提取的血清DNA的直接測(cè)序(directsequence)來檢測(cè)刪除突變(E746—A750del)。PCR擴(kuò)增和直接測(cè)序。對(duì)從血清和組織樣本中獲得的每一個(gè)樣品進(jìn)行兩份擴(kuò)增和直接測(cè)序。在25jul體積中進(jìn)行PCR，使用15jal模板DNA、0.75單位的AmpliTaqGoldDNA聚合酶(Perkin畫Elmer,RocheMolecularSystemsInc.,Bmnchburg,NJ)、2.5m1PCR緩沖液、0.8mMdNTP、0.5juM的每種引物、以及取決于多態(tài)性標(biāo)志的不同濃度的MgCl2。成套引物的序列和擴(kuò)增的程序遵循如以前所描述的(Nuc.AcidsRes.1989;17:2503-2516)進(jìn)行。使用熱循環(huán)儀(Perkin-Elmer,FosterCity,CA)進(jìn)4亍擴(kuò)增。4吏用ABIprism310(AppliedBiosystems，F(xiàn)osterCity,CA)進(jìn)行測(cè)序。序列與GenBank存檔的人類序列(登記號(hào):AY588246)針對(duì)EGFR進(jìn)行比專交。外顯子18、19、20和21中的點(diǎn)突變未在來自血清樣品的PCR產(chǎn)物中檢測(cè)到。通過直接測(cè)序檢測(cè)出來的血清EGFR狀態(tài)與組織學(xué)類型、性別、對(duì)于吉非替尼的響應(yīng)(表3)和生存優(yōu)勢(shì)(PFS:P=0.277,OS:P=0.859,補(bǔ)充數(shù)據(jù)2)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上都不相關(guān)聯(lián)。通過直接測(cè)序得到的EGFR突變狀態(tài)與27個(gè)成對(duì)樣品(pairedsamples)中的15個(gè)(55.6%)通過ARMS得到的相一致。4個(gè)病例中的EGFR突變(E746—A750del)通過直接測(cè)序呈陽性，通過ARMS呈陰性。8個(gè)病例通過直接測(cè)序呈陰性，通過ARMS呈陽性。實(shí)施例5:肺瘤中EGFR突變與血清中EGFR突變的比專交回顧來看，20個(gè)腫瘤樣品/人15位病人中獲得。組織樣品采集和DNA提取。腫瘤標(biāo)本的獲得按照經(jīng)倫理委員會(huì)(InstitutionalReviewBoard)批準(zhǔn)的試驗(yàn)方案進(jìn)行。回顧來看，在治療以前，來自15位病人的腫瘤材料的20個(gè)石蠟塊被收集起來用于診斷。通過經(jīng)支氣管肺活組織檢查(transbronchiallungbiopsy),11個(gè)原發(fā)癌的腫瘤樣品被采集，1個(gè)被手術(shù)切除，9個(gè)來自于轉(zhuǎn)移性位點(diǎn)(4個(gè)來自于骨、3個(gè)來自于淋巴結(jié)、1個(gè)來自于腦和1個(gè)來自于結(jié)腸)。全部樣本經(jīng)過組織學(xué)檢查以證實(shí)NSCLC的診斷。使用DEXPA丁TM試劑盒(TaKaRaBiomedicals,Shiga,日本)進(jìn)行胂瘤樣品的DNA提取。EGFR外顯子19和21的測(cè)序在相同的PCR條件下進(jìn)行。來自12位病人的腫瘤樣品一皮測(cè)序(表4)。在4個(gè)病例中4全測(cè)到EGFR突變(25.0%);其中的3個(gè)病例中外顯子9中被刪除了15bp(E746—A750del),以及1個(gè)病例中外顯子21是L858R。具有EGFR突變的病人的組織學(xué)類型3個(gè)是腺癌和1個(gè)是大細(xì)胞癌。這4個(gè)病人對(duì)于吉非替尼的響應(yīng)2位病人是PR,1位病人是SD,以及1位病人是PD。其他的3個(gè)樣品由于PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增太低而沒有被評(píng)估?；仡檨砜?，數(shù)對(duì)腫瘤樣品和血清樣品采自于11位病人(表4)。在成對(duì)的樣品中，8/11(72.7%)的腫瘤的EGFR突變狀態(tài)與血清中的相一致。兩位病人肺瘤中的E746_A750del呈陽性以及血清中的呈陰性，一位病人腫瘤中的E746A750del呈陰性以及血清中的呈陽性。表1病人特征PS,行為狀態(tài)；Ad，腺癌；Scc,鱗狀細(xì)胞癌；Large,大細(xì)胞癌;PR,部分響應(yīng)；SD，穩(wěn)-定疾?。籔D,進(jìn)4亍性疾病。(n)286444-871810197232523229811病人人數(shù)年齡(歲)性別PS階段組織學(xué)響應(yīng)值圍Bc中范男女012psp表2病人特征和使用EGFRARMS-Scorpion方法從血清DNA中檢測(cè)的EGFR突變狀態(tài)<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>SD,穩(wěn)定疾病；PD,進(jìn)4亍性疾病；PR，部分響應(yīng)；M,男性；F，女性；Ad,腺癌；Large,大細(xì)胞癌；Sec,鱗狀細(xì)胞癌；+,SmartCycler檢測(cè)到的曲線；-，不是SmartCycler檢測(cè)到的曲線；表3根據(jù)組織學(xué)(a)、性別(b)、和對(duì)于吉非替尼的響應(yīng)(c),肺癌病人血清DNA中的EGFR突變的頻率。總體27個(gè)樣品來源于治療以前的28^f立病人。a組織學(xué)和EGFR突變狀態(tài)EGFRScorpion試劑盒直接測(cè)序+-+一Ad1112815非Ad22P>0.99922P>0.999b性別和EGFR突變狀態(tài)EGFRScorpion試劑盒直接測(cè)序+-+一女性7355男性611P=0.120512P=0.415c對(duì)于吉非替尼的響應(yīng)和EGFR突變狀態(tài)EGFRScorpion試劑盒直接測(cè)序+-+-PR/SD11689PD28P=0.04628P=0.231Ad，腺癌PR，部分響應(yīng)；SD,穩(wěn)定疾病；PD，進(jìn)行性疾病;說明書第24/27頁表4肺瘤樣品和血清樣品中的EGFR突變狀態(tài)。數(shù)對(duì)腫瘤和血清樣品來源于12位病人。EGFR突變狀態(tài)_EGFRScorpion試劑盒外顯子19外顯子21<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>M,男性；F,女性；SD,穩(wěn)定疾??；PD,進(jìn)行性疾病；PR，部分響應(yīng)；Sec,鱗狀細(xì)月包癌；Ad腺癌；Large,大細(xì)月包癌*具有來自腫瘤來源的DNA和血清來源的DNA的不同狀態(tài)EGFR突變的病人。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>核苷酸2063208020812118212521262142214421532155215621592169217021882198220322252236del2247一22622252del2268—227522812303230523082314pNATRMRTQD仏KESMTQGIPcTTTTATAGcPcTTATTAcATAGcATT-HVIGLLA.LGAEGPWAHSVRccccGAGTTGGccGccGTGcGTGGC701378894555555588888880024637o::!.IC667788999588888888889-235700-ooI——；TTCTTTTCTTATTGAAATTTATACTTAATTAAAACATATATAATAGAGCCTCCCCTCCGCCAGGGCCCGCCTCAGGGGCGTGT&CGCGCGGCCAGAWWKIWW2222C^^I^l^l^-^l22222222222222222222222222222222權(quán)利要求1.用于檢測(cè)ErbB受體中一個(gè)或多個(gè)突變的方法-(a)提供來自病人的生物流體樣品；(b)從所述樣品中提取DNA；和(c)針對(duì)該受體中一個(gè)或多個(gè)突變的存在篩選所述DNA。2.如權(quán)利要求l所述的方法，包括檢測(cè)ErbB受體中一個(gè)或多個(gè)突變，該突變改變所述受體中酪氨酸激酶的活性。3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中該ErbB受體是EGFR。4.如之前任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，用于預(yù)測(cè)病人對(duì)于ErbB受體藥物的響應(yīng)，包括步驟-(a)提供來自病人的生物流體樣品；(b)從所述樣品中提取DNA;和(c)針對(duì)該受體中改變酪氨酸激酶活性的一個(gè)或多個(gè)突變的存在情況篩選所述DNA。5.如權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的方法，用于監(jiān)測(cè)病人對(duì)于ErbB受體藥物的響應(yīng)，包括步驟-(a)提供來自病人的生物流體樣品；(b)從所述樣品中提取DNA;和(c)針對(duì)該受體中改變酪氨酸激酶活性的一個(gè)或多個(gè)突變的存在情況篩選所述DNA。6.如權(quán)利要求4所述的方法，其中癌癥病人對(duì)于ErbB受體藥物的響應(yīng)的預(yù)測(cè)預(yù)言了該病人的生存優(yōu)勢(shì)。7.如權(quán)利要求4所述的方法，進(jìn)一步包括步驟(d)做出結(jié)論被檢測(cè)出攜帶突變型和野生型等位基因的病人對(duì)于ErbB受體藥物的響應(yīng)將為陽性，而僅被檢測(cè)出野生型等位基因的病人對(duì)該藥物不會(huì)啦文出陽性的響應(yīng)。8.如之前任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中篩選方法包括使用聚合酶鏈反應(yīng)，該聚合酶鏈反應(yīng)使用用于檢測(cè)單堿基突變、小的框內(nèi)缺失或堿基替換的等位基因特異性引物。9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中篩選方法涉及使用實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(realtime-PCR)，該實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)使用檢測(cè)單堿基突變、小的框內(nèi)缺失或堿基替換的等位基因特異性引物。10.如權(quán)利要求8或9所述的方法，其中第一個(gè)引物對(duì)被用于檢測(cè)野生型等位基因，第二個(gè)引物對(duì)被用于檢測(cè)突變等位基因；其中每對(duì)中的一個(gè)引物包括_(a)具有對(duì)特定突變?yōu)榈任换蛱禺愋缘?'末端核苷酸的引物；和(b)該引物3'末端的可能的附加的錯(cuò)配。11.如權(quán)利要求10所述的方法，其中每對(duì)中的一個(gè)引物包括-(a)含有引物序列和對(duì)靶序列特異的其他序列的單分子或核酸雙鏈體探針；(b)在所述單分子或核酸雙鏈體之內(nèi)的與淬火劑分子相近的附著于探針5'末端的熒光報(bào)道染料；(c)在所述探針一末端的一個(gè)或多個(gè)非編碼核苷酸殘基；(d)其中，所述報(bào)道染料和淬火劑分子在靶序列的擴(kuò)增期間分離。12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中該探針是Scorpior^探針。13.如之前任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中通過使用能夠檢測(cè)以野生型序列10%水平存在的突變序列的技術(shù)來檢測(cè)突變。14.如之前任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中該生物流體是血液、血清、血漿、汗液或唾液中的任何一種。15.如權(quán)利要求11所述的方法，其中該生物流體是血清。16.如之前任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中該ErbB受體藥物是ErbB受體酪氨酸激酶抑制劑。17.如之前任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中該ErbB受體藥物是EGFR酪氨酸激酶抑制劑。18.如權(quán)利要求16所述的方法，其中藥物選自由吉非替尼、埃羅替尼(特羅凱,OSI-774,CP國358774)、PKI國166、EKB畫569、HKI-272(WAY-177820)、拉帕替尼(GW2016,GW-572016，GSK572016)、canertinib(CI-1033,PD183805)、AEE788、XL647、BMS5599626、ZD6474(Zactima)或WO2004/006846或WO2003/082290中公開的任^H匕合物構(gòu)成的組。19.如權(quán)利要求15所述的方法，其中最優(yōu)選的EGFR酪氨酸激酶抑制劑是吉非替尼或厄洛替尼。20.如權(quán)利要求14所述的方法，其中ErbB受體藥物是抗EGFR抗體，選自由西妥昔單抗(愛必妥，C225)、曲妥珠單抗(EMD-72000)、帕尼單抗(ABX-EGF/rHuMAb-EGFR)、MR1-1、IMC-11F8或EGFRL11構(gòu)成的組。21.如之前任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中ErbB受體藥物被用作單一治療或與其它藥物的聯(lián)合使用。22.如之前任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中突變是核酸的插入、缺失或替換。23.如權(quán)利要求22所述的方法，其中突變發(fā)生于ErbB受體的酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域。24.如之前任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中突變發(fā)生于EGFR的酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域。25.如權(quán)利要求22所述的方法，其中突變簇集于EGFR外顯子18、19、20或21的ATP結(jié)合位點(diǎn)附近。26.如權(quán)利要求22所述的方法，其中突變選自列在表5中的EGFR突變的組。27.如權(quán)利要求24所述的方法，其中突變是EGFR外顯子19中的E746—A750del和EGFR外顯子21中的L858R。28.如之前任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中病人所患的癌癥選自由非實(shí)體腫瘤例如白血病、多發(fā)性骨髓瘤或淋巴瘤，以及實(shí)體腫瘤例如膽管、骨、膀胱、腦/CNS、惡性膠質(zhì)瘤、乳房、結(jié)腸直腸、子宮頸、子宮內(nèi)膜、胃、頭和頸、肝、肺、肌肉、神經(jīng)元、食管、卵巢、胰腺、胸膜/腹膜、前列腺、腎、皮膚、睪丸、曱狀腺、子宮和外陰腫瘤構(gòu)成的組。29.如權(quán)利要求4所述的方法，進(jìn)一步包括步驟(d)針對(duì)ErbB受體下游信號(hào)傳導(dǎo)途徑的元件中的一個(gè)或多個(gè)突變的存在情況篩選所述DNA。30.組合物，其包括用于檢測(cè)ErbB受體野生型等位基因的第一個(gè)引物對(duì)和用于檢測(cè)突變等位基因的第二個(gè)引物對(duì)，其中，每對(duì)中的一個(gè)引物進(jìn)一步包括(a)具有對(duì)特定突變有等位基因特異性的3'末端核苷酸的引物；(b)該引物3'末端的可能的附加的錯(cuò)配；(c)包括引物序列和對(duì)靶序列特異的另外的序列的單分子或核酸雙鏈體探針；(d)在所述單分子或核酸雙鏈體之內(nèi)的與淬火劑分子相近的附著于5'末端的熒光報(bào)道染料；(e)在所述探針一末端的一個(gè)或多個(gè)非編碼核苷酸殘基；(f)其中，所述報(bào)道染料和淬火劑分子在靶序列擴(kuò)增期間分離。31.特異于ErbB受體的引物在用于預(yù)測(cè)病人對(duì)于ErbB藥物的響應(yīng)的在生物流體中進(jìn)行的分析中的用途。32.特異于ErbB受體的引物在制造組合物中的用途，該組合物用于測(cè)試生物流體乂人而預(yù)測(cè)病人對(duì)于ErbB藥物的響應(yīng)。33.如權(quán)利要求31所述的用途，進(jìn)一步包括步驟(a)從所述樣品中提取DNA;和(b)針對(duì)ErbB受體中改變酪氨酸激酶活性的一個(gè)或多個(gè)突變的存在情況篩選所述DNA。全文摘要本發(fā)明提供了一種用于檢測(cè)ErbB受體突變的方法，包括步驟提供來自病人的生物流體樣品；提取來自所述樣品的DNA；和針對(duì)受體中改變酪氨酸激酶活性的一個(gè)或多個(gè)的突變的存在情況篩選所述DNA。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101351563SQ200580051783公開日2009年1月21日申請(qǐng)日期2005年10月20日優(yōu)先權(quán)日2005年10月5日發(fā)明者H基穆拉,K·卡薩哈拉,K·尼施奧申請(qǐng)人:阿斯利康(英國)有限公司;國家癌癥中心